Способы амплификации и секвенирования нуклеиновых кислот

1 Настоящее изобретение относится к области амплификации и секвенирования нуклеиновых кислот. Более конкретно, настоящее изобретение касается способов амплификации и секвенирования нуклеиновых кислот, а также устройства и наборов, применимых для крупномасштабных высокопроизводительных амплификации и секвенирования нуклеиновых кислот. Анализ нуклеотидных последовательностей стал краеугольным камнем во многих областях биологии/биотехнологии и медицины. Способность установить последовательности нуклеиновых кислот приобретает все большее значение в связи с тем, что предпринимаются усилия по определению последовательностей крупных геномов человека и других высших организмов, а также, например, при определении нуклеотидного полиморфизма и скрининга и контроля за генной экспрессией. Генетическая информация, получаемая при секвенировании нуклеиновой кислоты, имеет важное практическое значение в таких областях, как, например,установление и подтверждение мишеней для лекарств, диагностика заболеваний и оценка уровней риска, а также идентификация и охарактеризование организмов. Первым шагом в таких практических применениях является определение реального химического состава представляющей интерес нуклеиновой кислоты, более точно - определение последовательности встречаемости четырех нуклеотидов - аденина (А), цитозина (С), гуанина (G) и тимина (Т) или урацила (U), которые составляют нуклеиновые кислоты. Однако такие применения требуют проведения секвенирования нуклеиновых кислот в большом масштабе, и это делает исключительно желательными способы высокопроизводительного секвенирования нуклеиновых кислот. В данной области техники описаны способы секвенирования нуклеиновых кислот. Из них два наиболее широко применяемых способа это метод химического расщепления по Максаму-Джилберту, который основан на нуклеотидспецифичной химии, и в настоящее время более популярный метод секвенирования по Сэйнджеру, который основан на принципе каталитической терминации цепи и теперь применяется для секвенирования нуклеиновых кислот на уровне стандартного метода. При секвенировании по Сэйнджеру каждую нуклеиновую кислоту, секвенирование которой проводится, реплицируют в реакции с участием ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTPs) и дидезоксинуклеотидтрифосфатов (ddNTPs). ДНК-полимераза способна включать и dNTPs, и ddNTPs в растущую цепь ДНК. Однако как только включаетсяddNTP, то 3'-конец растущей цепи ДНК утрачивает гидроксильную группу и более не является субстратом для удлинения цепи, что тем самым останавливает рост цепи нуклеиновой кислоты. 2 Следовательно, в конкретной реакции, включающей один тип ddNTP, образуется смесь нуклеиновых кислот различной длины, причем все они терминированы одинаковым ddNTP. Обычно отдельные реакции выстраивают для каждого из четырех типов ddNTP, а распределение длин образовавшихся фрагментов нуклеиновых кислот анализируют методом электрофореза в денатурирующем геле (который позволяет разрешать фрагменты нуклеиновых кислот по их размеру), или, как более современный подход,методом масс-спектроскопии. Обычно в реакционной смеси один или большее число дезоксинуклеотидтрифосфатов помечают для того,чтобы обеспечить детекцию фрагментов различной длины. Описанные выше способы имеют недостатки потому, что каждая нуклеиновая кислота,секвенирование которой проводится, должна быть в ходе биохимической реакции обработана по отдельности. Гель-электрофорез трудоемок, трудозатратен и по сути своей является очень медленным даже тогда, когда применяется капиллярный электрофорез, и поэтому плохо подходит для крупномасштабного высокопроизводительного секвенирования. Кроме того,последующее определение последовательности является трудоемким. Масс-спектроскопия пока применяется на уровне прототипа, требует очень дорогого оборудования и каждый образец в этом случае должен быть проанализирован по отдельности. Один из путей повышения производительности связан с параллельной обработкой большого числа образцов. Применимы способы с использованием ДНК-гибридизации нуклеотидных зондов, позволяющие мультиплицировать процесс в ходе биохимических и электрофоретических процессов, хотя и за счет очень долгих дополнительных манипуляций. Доступными стали более современные методы, основывающиеся на ДНК-чипах и ДНКгибридизации (ThomasBurke, 1998, Exp.Opinion Ther. Patents, 8, 503-508). Эти методы имеют недостатки, обусловливаемые тем, что для каждого применения должен быть заново сконструирован и изготовлен ДНК-чип: это очень длительная операция, а стоимость отдельного чипа снижается только тогда, когда необходимо очень большое число чипов. Также чипы не могут быть использованы повторно, а для каждого чипа в данный момент времени может быть обработан только один образец нуклеиновых кислот, например, от одного пациента, диагностика которого проводится. Наконец, размер последовательности, которая может быть проанализирована на таком чипе, ограничен менее чем 100 тысячами нуклеотидов, а также ограничен лишь отдельными путями применения, такими как генотипирование ДНК и анализ параметров генной экспрессии. 3 В наиболее известных способах анализа последовательности нуклеиновых кислот амплификация представляющих интерес нуклеиновых кислот является предварительным этапом, необходимым для получения достаточного для анализа количества нуклеиновой кислоты. Некоторые методы амплификации нуклеиновых кислот хорошо известны и описаны в данной области техники. Например, нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы путем встраивания интересующей нуклеиновой кислоты в конструкцию в виде экспрессирующего вектора. Такие векторы могут быть затем внесены в подходящие биологические клеткихозяева, и векторная ДНК, включающая интересующую нуклеиновую кислоту, амплифицируется в результате культивирования биологического хозяина с использованием хорошо разработанных прописей. Амплифицированные в таких методах нуклеиновые кислоты могут быть выделены из клеток-хозяев с помощью методов, хорошо известных и описанных в данной области техники. Однако такие методы имеют недостаток, определяемый затратностью времени, трудоемкостью и трудностью для автоматизации. Метод амплификации ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) был описан в 1985 году (Saiki et al., 1985, Science, 230, 13501354), и в настоящее время этот метод хорошо известен и описан в данной области техники. Представляющий интерес фрагмент нуклеиновой кислоты, являющийся мишенью, может быть амплифицирован с использованием двух коротких олигонуклеотидных последовательностей (обычно называемых праймерами), которые специфичны для известных последовательностей, фланкирующих ту последовательность ДНК, которая должна быть амплифицирована. Праймеры гибридизуют с противоположными цепями двухцепочечного ДНК-фрагмента после того, как он был денатурирован, и ориентируют таким образом, чтобы синтез ДНК под контролем ДНК-полимеразы протекал по участку между двумя праймерами за счет того, что последовательности праймеров достраиваются в результате последовательного включения нуклеотидов с участием полимеразы. Реакции достройки создают два двухцепочечных участка-мишени, каждый из которых может быть вновь денатурирован и стать пригодным для второго цикла гибридизации и достройки. В третьем цикле образуются две двухцепочечные молекулы, которые точно включают участок-мишень в двухцепочечной форме. За счет повторения циклов денатурации, гибридизации праймеров и достройки происходит быстрое экспоненциальное накопление конкретного фрагмента-мишени ДНК. Обычно данный метод осуществляют в растворе, а амплифицированный фрагментмишень нуклеиновой кислоты очищают из раствора с помощью методов, хорошо известных в 4 данной области техники, например, с помощью электрофореза в геле. Однако совсем недавно были представлены методы, в которых используется один праймер, привитый на поверхность, в сочетании со неприкрепленными праймерами в растворе. Эти методы позволяют одновременно амплифицировать и закреплять ПЦР-продукт на этой поверхности (A.A.Oroskar et al., 1996, Clin. Chem.,42, 1547). Международные патентные заявки WO 96/04404 и WO 98/36094 (Mosaic TechnologiesInc. et al.) заявляют способ выявления нуклеиновой кислоты-мишени в образце, который предположительно содержит нуклеиновую кислоту-мишень. Этот способ включает индукцию ПЦР-опосредованной амплификации нуклеиновой кислоты-мишени только тогда, когда нуклеиновая кислота-мишень присутствует в анализируемом образце. Для амплификации последовательности-мишени оба праймера присоединяют к твердой подложке, в результате чего амплифицированные последовательности нуклеиновых кислот-мишеней также оказываются присоединенными к твердой подложке. Способ амплификации, описанный в данном документе,иногда называют методом амплификации с мостиком. В этом способе два праймера, как и в стандартной ПЦР, специфическим образом конструируют так, чтобы они фланкировали конкретную последовательность-мишень ДНК,которая должна быть амплифицирована. Так,если конкретная нуклеиновая кислота-мишень присутствует в образце, то эта нуклеиновая кислота-мишень может прогибридизовать с данными праймерами и быть ПЦРамплифицирована. Первой стадией данного ПЦР-амплификационного процесса является гибридизация нуклеиновой кислоты-мишени с первым специфичным праймером, присоединенным к подложке (праймер 1). Первый продукт амплификации, который комплементарен нуклеиновой кислоте-мишени, получают после этого путем достройки последовательности праймера 1. Подвергая подложку денатурирующему воздействию, высвобождают нуклеиновую кислоту-мишень, и затем она может принять участие в последующих реакциях гибридизации с другими последовательностями праймера 1, которые могут быть присоединены к данной подложке. Первый амплификационный продукт, который присоединен к подложке, может затем быть прогибридизован со вторым специфичным праймером (праймер 2), присоединенным к подложке, и второй амплификационный продукт, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную первому амплификационному продукту, может быть сформирован путем достройки последовательности праймера 2, и он также присоединен к данной подложке. Таким образом, нуклеиновая кислота-мишень и первый и 5 второй амплификационные продукты способны участвовать во множестве процессов гибридизации и достройки, что ограничено лишь исходным присутствием нуклеиновой кислотымишени и числом исходно присутствующих последовательностей праймера 1 и праймера 2, результатом чего является некоторое число копий последовательности-мишени, присоединенных к подложке. Поскольку при осуществлении данного способа амплификационные продукты образуются только тогда, когда присутствуют нуклеиновая кислота-мишень, то анализ подложки на присутствие или отсутствие одного или нескольких амплификационных продуктов является индикатором присутствия или отсутствия конкретной последовательности-мишени. Мозаичный способ может быть применен для достижения уровня множественности таким образом, что несколько различных последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней могут быть амплифицированы одновременно за счет выстраивания различающихся наборов первых и вторых праймеров, специфичных для каждой из разных последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней, на различных участках твердой подложки. Недостатком такого мозаичного способа является то, что он может быть применен для амплификации только известных последовательностей из-за того, что последовательности первых и вторых праймеров должны быть специфичны для каждой из нуклеиновых кислотмишеней, которые должны быть амплифицированы. Кроме того, производительность ограничивается числом различных наборов специфичных праймеров и амплифицируемых в результате молекул нуклеиновых кислот-мишеней, которые могут быть выстроены в конкретных участках данной твердой подложки, а также временем, затрачиваемым на выстраивание нуклеиновых кислот в конкретных участках. Также для мозаичного способа необходимо, чтобы два различных праймера были однотипным образом присоединены своими 5'-концами к подложке в пределах отдельного участка, в котором происходит образование амплификационного продукта. Этого нельзя достичь с применением современной технологии производства ДНК-чипов,поэтому для этого необходимо использование некоторых приемов распределения образца. Таким образом, плотность, которая может быть достигнута в данном способе, имеет то же ограничение, что и в других классических технологиях выстраивания наборов. Другим ограничением является скорость контроля конкретных обособленных участков подложки на присутствие или отсутствие амплифицированных нуклеиновых кислот-мишеней. Выстраивание образцов ДНК в классическом варианте осуществляют на мембранах (например, нейлоновых или нитроцеллюлозных 6 мембранах). Использование подходящих автоматических устройств (например, Q-bot, Genetix Ltd., Dorset BH23 3TG, Великобритания) означает возможность достижения плотности вплоть до 10 образцов на 1 мм 2. В таких способах ДНК ковалентно связывают с мембраной физико-химическими способами (например,путем УФ-облучения) и возможным является выстраивание крупных молекул ДНК (например, молекул длиной более 100 нуклеотидов),равно как и меньших молекул ДНК, таких как олигонуклеотидные праймеры. Известны другие методы, при которых могут быть получены более плотные построения олигонуклеотидов. Например, подходы, основанные на предварительном упорядочивании предметных стекол, на которых выстроенные серии реактивных участков формируют по технологии струйных картриджей (A.P. BlanchardL. Hood, 1996, Microb.Comp. Genomics, 1,225) или выстроенные серии реактивных полиакриламидных гелей (G. Yershov et al., 1996,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 4913-4918), что теоретически позволяет распределять до 100 образцов на 1 мм 2. Более высокие плотности достижимы с использованием ДНК-чипов (S.P.A. Fodor et al.,1991, Science, 251, 767). В настоящее время чипы с 625 олигонуклеотидными зондами на 1 мм 2 используются в молекулярно-биологических методах (D.J. Lockhart et al., 1996, Nature Biotechnol., 14, 1675). Сообщалось о достижении плотности зондов вплоть до 250 тысяч образцов на 1 см 2 (2500 на 1 мм 2) (M. Chee et al., 1996,Science 274:610). Однако сейчас до 132 тысяч различных олигонуклеотидов могут быть выстроены на отдельных чипах площадью 2,5 см 2. Важно то, что эти чипы производят таким образом, что 3'ОН-конец олигонуклеотида присоединен к твердой подложке. Это означает то, что олигонуклеотиды, присоединенные таким путем к чипам, не могут быть использованы в качестве праймеров в реакции ПЦР-амплификации. Важно, что, когда ПЦР-продукты связаны с приспособлением, в котором происходит ПЦРамплификация, плотность образующейся в результате серии ПЦР-продуктов ограничена таким доступным приспособлением. Доступными в настоящее время приспособлениями являются только 96-луночные микротитровальные планшеты. Это позволяет наносить на получаемую поверхность лишь 0,02 образца ПЦР-продуктов в расчете на 1 мм 2. Например, при использовании доступной на коммерческой основе системы Nucleolink(Nunc A/S, Roskilde, Дания) возможным является одновременное достижение амплификации и выстраивания образцов в лунках при плотности 0,02 образца на 1 мм 2 на поверхности, на которой были привиты олигонуклеотидные праймеры. Однако технические проблемы означают,что маловероятным является существенное уве 7 личение плотности образцов, которого можно было бы достичь в данном способе. Таким образом, можно видеть, что с целью увеличения производительности в данной области техники имеется необходимость в новых способах амплификации нуклеиновых кислот,которые бы позволили одновременно амплифицировать и выстраивать образцы нуклеиновых кислот с более высокой плотностью, а, кроме того, позволили бы анализировать образцы с большей скоростью, предпочтительно одновременно. Кроме того, очевидно, что в данной области техники имеется необходимость в новых способах секвенирования, которые бы позволили обрабатывать большие количества образцов и секвенировать их параллельно, т.е. имеется необходимость в способах секвенирования, которые бы позволили существенным образом мультиплицировать данный процесс. Существенное мультиплицирование процесса секвенирования, в свою очередь, должно привести к более высокой производительности по сравнению с той, которая достигается в способах секвенирования, известных в данной области техники. Такие новые способы являются даже более желательными, если в них можно достичь такой высокой производительности секвенирования при разумной цене и с меньшими трудозатратами по сравнению со стандартными методами секвенирования. Настоящее изобретение описывает новые способы твердофазной амплификации нуклеиновых кислот, которые позволяют одновременно выстраивать и амплифицировать при высокой плотности большое количество разных последовательностей нуклеиновых кислот. Также настоящее изобретение описывает способы, с помощью которых большое число различных амплифицированных последовательностей нуклеиновых кислот может быть проконтролировано с высокой скоростью и, если это желательно,одновременно. Также настоящее изобретение описывает способы, с помощью которых последовательности большого числа конкретных нуклеиновых кислот могут быть определены одновременно в течение короткого периода времени. Эти способы, в частности, применимы, причем тем самым не ограничиваясь, в секвенировании целого генома или в тех случаях, когда большое число генов (например, 500) от большого числа индивидуумов (например, от 500) секвенируют одновременно, или при одновременном выявлении большого числа (например, миллионов) полиморфных вариантов, или при одновременном контроле экспрессии большого числа генов(например, 100 тысяч). Таким образом, настоящее изобретение представляет способ амплификации по крайней мере одной нуклеиновой кислоты, включающий следующие стадии:(1) образование по крайней мере одной нуклеиновой кислоты-матрицы, включающей нуклеиновую(ые) кислоту(ы), которая должна быть амплифицирована, причем упомянутая(ые) нуклеиновая(ые) кислота(ы) несет на 5'-конце олигонуклеотидную последовательность Y и на 3'-конце олигонуклеотидную последовательность Z, а дополнительно эта(и) нуклеиновая(ые) кислота(ы) несет на 5'-конце средство для прикрепления нуклеиновой(ых) кислоты(2) смешивание упомянутой(ых) нуклеиновой(ых) кислоты-матрицы с одним или несколькими групповыми праймерами X, которые способны гибридизовать с олигонуклеотидной последовательностью Z и несет на 5'-конце средство для прикрепления групповых праймеров к твердой подложке, в присутствие твердой подложки таким образом, чтобы 5'-концы и нуклеиновой кислоты-матрицы, и групповых праймеров связывались с этой твердой подложкой;(3) проведение одной или большего числа реакций амплификации нуклеиновых кислот на связанной(ых) матрице(ах) таким образом, чтобы образовывались группы (колонии) нуклеиновых кислот. В следующем варианте настоящего изобретения два различных групповых праймера Х смешивают с нуклеиновой(ыми) кислотой(ами)матрицей(ами) на стадии (2) данного способа. Предпочтительно последовательности групповых праймеров Х таковы, что олигонуклеотидная последовательность Z может гибридизовать с одним из групповых праймеров X, а олигонуклеотидная последовательность Y совпадает с одним из групповых праймеров X. В альтернативном варианте настоящего изобретения олигонуклеотидная последовательность Z комплементарна олигонуклеотидной последовательности Y, обозначается как Y', и групповой праймер Х имеет ту же последовательность, что и олигонуклеотидная последовательность Y. Еще в одном варианте настоящего изобретения групповой праймер Х может включать вырожденную праймерную последовательность,а нуклеиновая(ые) кислота(ы)-матрица(ы) включает предназначенную(ые) для амплификации нуклеиновую(ые) кислоту(ы) и не включает олигонуклеотидные последовательности Y или Z на своих 5'- и 3'-концах, соответственно. В следующем аспекте настоящего изобретения данный способ включает дополнительную стадию проведения по крайней мере одной стадии установления последовательности у одной или большего числа колоний нуклеиновых кислот, сформированных на стадии (3). Таким образом, настоящее изобретение также представляет способ секвенирования по крайней мере одной нуклеиновой кислоты,включающий следующие стадии:(1) формирование по крайней мере одной нуклеиновой кислоты-матрицы, включающей предназначенную для секвенирования нуклеиновую(ые) кислоту(ы), причем упомянутая(ые) нуклеиновая(ые) кислота(ы) включает на 5'конце олигонуклеотидную последовательностьY и на 3'-конце олигонуклеотидную последовательность Z, и дополнительно эта(и) нуклеиновая(ые) кислота(ы) несет на 5'-конце средство для присоединения нуклеиновой(ых) кислоты к твердой подложке;(2) смешивание упомянутой(ых) нуклеиновой(ых) кислоты-матрицы с одним или несколькими групповыми праймерами X, которые могут гибридизовать с олигонуклеотидной последовательностью Z и несут на 5'-конце средство для присоединения групповых праймеров к твердой подложке, в присутствие твердой подложки таким образом, чтобы 5'-концы и нуклеиновой кислоты-матрицы, и групповых праймеров связались с твердой подложкой;(3) проведение одной или большего числа реакций амплификации нуклеиновых кислот на связанной(ых) матрице(ах) таким образом, чтобы сформировались колонии нуклеиновых кислот; и(4) проведение по крайней мере одной стадии определения последовательности у по крайней мере одной из сформированных колоний нуклеиновых кислот. В следующем варианте настоящего изобретения 5'-концы нуклеиновой(ых) кислотыматрицы (кислот-матриц) и групповых праймеров несут средство для присоединения последовательностей нуклеиновых кислот к твердой подложке ковалентным образом. Предпочтительно это средство для ковалентного присоединения является химически модифицируемой функциональной группой, такой как, например,фосфатная группа, карбоксильная или альдегидная составляющая, тиол, гидроксил, диметокситритил (DMT) или аминогруппа, а предпочтительно - аминогруппа. Нуклеиновыми кислотами, которые могут быть амплифицированы в соответствии со способами по настоящему изобретению, являются ДНК, например, геномная ДНК, кДНК, рекомбинантная ДНК или любой тип синтетической или модифицированной ДНК, РНК, мРНК или любой тип синтетической или модифицированной РНК. Упомянутые нуклеиновые кислоты могут варьироваться по длине и могут являться фрагментами или меньшими частями более крупных молекул нуклеиновых кислот. Предпочтительно предназначенная для амплификации нуклеиновая кислота состоит по крайней мере из 50 пар нуклеотидов, а более предпочтительно имеет длину 150-4000 пар нуклеотидов. Предназначенная для амплификации нуклеиновая кислота может иметь известную или неизвестную последовательность и может находиться в одноцепочечной или двухцепочечной фор 004271 10 ме. Предназначенная для амплификации нуклеиновая кислота может происходить из любого источника. По использованию в данном тексте термин нуклеиновая кислота-матрица обозначает объект, который включает нуклеиновую кислоту, которая должна быть амплифицирована или секвенирована, в одноцепочечной форме. Как объясняется ниже, предназначенная для амплификации или секвенирования нуклеиновая кислота также может находиться в двухцепочечной форме. Таким образом, нуклеиновые кислоты-матрицы по настоящему изобретению могут быть одно- или двухцепочечными нуклеиновыми кислотами. Нуклеиновые кислотыматрицы, предназначенные для использования в способе по настоящему изобретению, могут иметь различную длину. Предпочтительно они имеют длину по крайней мере 50 пар нуклеотидов, а более предпочтительно - длину 150-4000 пар нуклеотидов. Нуклеотиды, составляющие нуклеиновые кислоты-матрицы, могут быть нативными или не встречающимися в естественных условиях нуклеотидами. Нуклеиновые кислоты-матрицы по настоящему изобретению не только включают нуклеиновую кислоту, которая должна быть амплифицирована, но могут дополнительно включать короткие олигонуклеотидные последовательности на 5'- и 3'-концах. Олигонуклеотидная последовательность, находящаяся на 5'-конце, обозначается здесь как Y. Олигонуклеотидная последовательность Y является известной последовательностью и может иметь различную длину. Олигонуклеотидная последовательность Y для использования в способах по настоящему изобретению предпочтительно имеет длину по крайней мере пять нуклеотидов, предпочтительнее от 5 до 100 нуклеотидов в длину и более предпочтительно - приблизительно 20 нуклеотидов в длину. В олигонуклеотидной последовательности Y могут присутствовать нативные или не встречающиеся в естественных условиях нуклеотиды. Как отмечалось выше, предпочтительно последовательность олигонуклеотида Y совпадает с последовательностью группового праймера X. Олигонуклеотидная последовательность, находящаяся с 3'-конца нуклеиновых кислот-матриц по настоящему изобретению,здесь обозначается как Z. Олигонуклеотидная последовательность Z является известной последовательностью и может иметь различную длину. Олигонуклеотидная последовательностьZ для использования в способах по настоящему изобретению предпочтительно имеет длину по крайней мере пять нуклеотидов, предпочтительнее от 5 до 100 нуклеотидов в длину и более предпочтительно - приблизительно 20 нуклеотидов в длину. В олигонуклеотидной последовательности Z могут присутствовать нативные или не встречающиеся в естественных условиях нуклеотиды. Олигонуклеотидная последова 11 тельность Z конструируется таким образом,чтобы она гибридизовала с одним из групповых праймеров X, а предпочтительно конструируется так, чтобы она была комплементарна олигонуклеотидной последовательности Y, что здесь обозначается как Y'. Олигонуклеотидные последовательности Y и Z, находящиеся на 5'- и 3'концах нуклеиновой кислоты-матрицы, соответственно, необязательно должны быть расположены в самых концах этой матрицы. Например,хотя предпочтительно олигонуклеотидные последовательности Y и Z расположены на 5'- и 3'концах нуклеиновых кислот-матриц, соответственно, или рядом с ними (например, на расстоянии 0-100 нуклеотидов от 5'- и 3'-концов), они могут располагаться еще дальше (например,более чем в 100 нуклеотидах) от 5'- и 3'-концов нуклеиновой кислоты-матрицы. Следовательно,олигонуклеотидные последовательности Y и Z могут располагаться в любом положении в пределах нуклеиновой кислоты-матрицы так, чтобы последовательности Y и Z находились по разные стороны, т.е. фланкировали ту нуклеотидную последовательность, которая должна быть амплифицирована. По использованию в данном тексте нуклеиновая кислота-матрица также охватывает объект, который включает предназначенную для амплификации или секвенирования нуклеиновую кислоту в двухцепочечной форме. Когда нуклеиновая кислота-матрица находится в двухцепочечной форме, олигонуклеотидные последовательности Y и Z находятся на 5'- и 3'концах, соответственно, одной из двух цепей. Другая цепь, исходя из правила комплементарности ДНК, комплементарна цепи, включающей олигонуклеотидные последовательности Y и Z,т.е. включает олигонуклеотидную последовательность Z' на 5'-конце и олигонуклеотидную последовательность Y' на 3'-конце. По использованию в данном тексте термин групповой праймер обозначает объект, который включает олигонуклеотидную последовательность, способную гибридизовать с комплементарной последовательностью и инициировать конкретную полимеразную реакцию. Последовательность, составляющую групповой праймер, выбирают так, чтобы она проявляла максимальную активность по гибридизации с комплементарной ей последовательностью и очень низкую активность по неспецифической гибридизации с любой другой последовательностью. Последовательность, предназначенная для использования в качестве группового праймера,может включать любую последовательность, но предпочтительно включает 5'-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG или 5'-САССААССС АAАССААСССАААСС. Групповой праймер может иметь длину от 5 до 100 нуклеотидов, но предпочтительно длину 15-25 нуклеотидов. В праймер могут входить нативные или не встречающиеся в естественных условиях нуклеоти 004271 12 ды. Один или два разных групповых праймера могут быть использованы для формирования колоний нуклеиновых кислот в способах по настоящему изобретению. Групповые праймеры для использования в настоящем изобретении также могут включать вырожденные праймерные последовательности. По использованию в данном тексте понятие вырожденные праймерные последовательности обозначает короткую олигонуклеотидную последовательность, которая способна гибридизовать с любым фрагментом нуклеиновой кислоты, независимо от последовательности упомянутого фрагмента нуклеиновой кислоты. Такие вырожденные праймеры не требуют присутствия олигонуклеотидных последовательностей Y или Z в нуклеиновой(ых) кислоте(ах)матрице(ах) для того, чтобы произошла гибридизация с матрицей, хотя использование вырожденных праймеров для гибридизации с матрицей, включающей олигонуклеотидные последовательности Х или Y, не исключается. Однако очевидно, что для использования в способах амплификации по настоящему изобретению вырожденные праймеры должны гибридизовать с последовательностями нуклеиновых кислот в матрице по сайтам с любой стороны или фланкировать последовательность нуклеиновой кислоты, которая должна быть амплифицирована. По использованию в данном тексте твердая подложка обозначает любую твердую поверхность, к которой нуклеиновые кислоты могут быть ковалентно присоединены, такую как,например, шарики из латекса, шарики из декстрана, полистирольные, полипропиленовые поверхности, полиакриламидный гель, поверхности из золота, стеклянные поверхности и силиконовые пластинки. Предпочтительно твердой подложкой является стеклянная поверхность. По использованию в данном тексте средство для присоединения нуклеиновых кислот к твердой подложке обозначает любой химический или нехимический способ присоединения,включая химически модифицируемые функциональные группы. Присоединение указывает на иммобилизацию нуклеиновой кислоты на твердые подложки либо за счет ковалентного присоединения, либо за счет необратимой пассивной адсорбции, либо за счет межмолекулярной аффинности (например, иммобилизация биотинилированных молекул на поверхности,покрытой авидином). Присоединение должно иметь достаточную силу, чтобы нельзя было ее преодолеть при промывке водой или водным буфером в условиях денатурации ДНК. По использованию в данном тексте химически модифицируемая функциональная группа обозначает такую группу, как, например,фосфатная группа, карбоксильная или альдегидная составляющая, тиол или аминогруппа. По использованию в данном тексте термин колония нуклеиновых кислот обозначает 13 обособленную область, содержащую множественные копии цепи нуклеиновой кислоты. Множественные копии цепи, комплементарной этой цепи нуклеиновой кислоты, также могут присутствовать в той же колонии. Множественные копии цепей нуклеиновых кислот, образующие эти колонии, обычно иммобилизованы на твердую подложку и могут находиться в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Колонии нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут быть сформированы при их различном размере и плотности в зависимости от используемых условий. Размер колоний предпочтительно составляет от 0,2 до 6 мкм,более предпочтительно от 0,3 до 4 мкм. Плотность колоний нуклеиновых кислот для использования в способе по настоящему изобретению обычно составляет 10000-100000 на 1 мм 2. Можно считать, что могут быть достигнуты и более высокие плотности, например, от 100000 до 1000000 на 1 мм 2 и от 1000000 до 10000000 на 1 мм 2. Способы по настоящему изобретению могут быть использованы для формирования колоний нуклеиновых кислот. Так, в следующем аспекте настоящего изобретения представляются одна или большее число колоний нуклеиновых кислот. Колония нуклеиновых кислот по настоящему изобретению может быть образована от одной иммобилизованной нуклеиновой кислоты-матрицы по настоящему изобретению. Способ по настоящему изобретению позволяет одновременно формировать множество таких колоний нуклеиновых кислот, каждая из которых может включать различные иммобилизованные цепи нуклеиновых кислот. Таким образом, еще в одном аспекте настоящего изобретения представляется множество нуклеиновых кислот-матриц, включающих предназначенные для амплификации нуклеиновые кислоты, причем упомянутые нуклеиновые кислоты включают на своих 5'-концах олигонуклеотидную последовательность Y, а на своих 3'-концах олигонуклеотидную последовательность Z, а также дополнительно нуклеиновая(ые) кислота(ы) несет на 5'-конце средство для прикрепления нуклеиновой(ых) кислоты(кислот) к твердой подложке. Предпочтительно это множество нуклеиновых кислот-матриц смешивают с множеством групповых праймеровX, которые способны гибридизовать с олигонуклеотидной последовательностью Z и несут на 5'-конце средство для присоединения этих групповых праймеров к твердой подложке. Предпочтительно упомянутое множество нуклеиновых кислот-матриц и групповых праймеров ковалентно соединено с твердой подложкой. В следующем варианте настоящего изобретения множество из двух разных групповых праймеров Х смешивают с множеством нуклеиновых кислот-матриц. Предпочтительно, последовательности групповых праймеров Х таковы, 004271 14 что олигонуклеотидная последовательность Z способна гибридизовать с одним из групповых праймеров X, а олигонуклеотидная последовательность Y совпадает с последовательностью одного из групповых праймеров X. В альтернативном варианте олигонуклеотидная последовательность Z комплементарна олигонуклеотидной последовательности Y (Y'),а множество групповых праймеров Х совпадает по последовательности с олигонуклеотидной последовательностью Y. Еще в одном варианте множество групповых праймеров Х может включать вырожденную праймерную последовательность, а множество нуклеиновых кислот-матриц включает нуклеиновые кислоты, предназначенные для амплификации, и не включает олигонуклеотидные последовательности Y или Z на 5'- и 3'концах соответственно. Нуклеиновые кислоты-матрицы по настоящему изобретению могут быть получены с использованием методов, являющихся стандартными или традиционными для данной области техники. В целом, они будут базироваться на методах генной инженерии. Предназначенные для амплификации нуклеиновые кислоты могут быть получены с использованием методов, хорошо известных в данной области техники. Например, путем получения образца нуклеиновых кислот, таких как общая ДНК, геномная ДНК, кДНК, общая РНК,мРНК и т.п. с помощью методов, хорошо известных и описанных в данной области техники,и путем формирования из них фрагментов с помощью, например, ограниченного расщепления рестриктазами или механическим путем. Обычно предназначенную для амплификации нуклеиновую кислоту вначале получают в двухцепочечной форме. Когда нуклеиновая кислота представляется в одноцепочечной форме,например, в виде мРНК, ее вначале переводят в двухцепочечную форму с помощью хорошо известного и описанного в данной области техники способа, например, с использованием олигодТ-праймеров и обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы. Если предназначенную для амплификации нуклеиновую кислоту получают в двухцепочечной форме подходящей длины, то олигонуклеотидные последовательности, соответствующие олигонуклеотидным последовательностям Y и Z, присоединяют к обоим концам, т.е. и к 5'-, и к 3'-концу последовательности этой нуклеиновой кислоты, с получением нуклеиновой кислоты-матрицы. Это можно сделать с использованием методов, хорошо известных и описанных в данной области техники, например, с помощью лигирования или путем встраивания предназначенной для амплификации нуклеиновой кислоты в состав биологического вектора по сайту, который фланкируется подходящими олигонуклеотидными последовательностями. С другой стороны, если, по крайней ме 15 ре, часть последовательности предназначенной для амплификации нуклеиновой кислоты известна, то нуклеиновая кислота-матрица, включающая олигонуклеотидные последовательности Y и Z на своих 5'- и 3'-концах, соответственно, может быть сформирована с помощью ПЦР с использованием подходящих ПЦР-праймеров,которые включают последовательности, специфичные для нуклеиновой кислоты, которая должна быть амплифицирована. Перед присоединением нуклеиновой кислоты-матрицы к твердой подложке она может быть переведена в одноцепочечную форму с использованием методов, которые хорошо известны и описаны в данной области техники, например, путем нагревания до приблизительно 94 С с последующим быстрым охлаждением до 0 С на льду. Олигонуклеотидная последовательность,находящаяся на 5'-конце данной нуклеиновой кислоты, может иметь любую последовательность и любую длину и обозначается здесь как последовательность Y. Подходящие длины и последовательности олигонуклеотида могут быть выбраны с использованием методов, хорошо известных и описанных в данной области техники. Например, олигонуклеотидные последовательности, присоединенные к каждому из концов предназначенной для амплификации нуклеиновой кислоты, в норме являются относительно короткими нуклеотидными последовательностями от 5 до 100 нуклеотидов в длину. Олигонуклеотидная последовательность, находящаяся на 3'-конце данной нуклеиновой кислоты, может иметь любую последовательность и любую длину и обозначается здесь как последовательность Z. Подходящие длина и последовательность олигонуклеотида могут быть выбраны с использованием методов, хорошо известных и описанных в данной области техники. Например, олигонуклеотидные последовательности,находящиеся на каждом из концов предназначенной для амплификации нуклеиновой кислоты, в норме являются относительно короткими нуклеотидными последовательностями от 5 до 100 нуклеотидов в длину. Последовательность олигонуклеотидной последовательности Z такова, что она способна гибридизовать с одним из групповых праймеровX. Предпочтительно последовательность олигонуклеотидной последовательности Y такова, что она совпадает с одним из групповых праймеровX. Более предпочтительно олигонуклеотидная последовательность Z комплементарна олигонуклеотидной последовательности Y (Y'), а групповые праймеры Х совпадают по последовательности с олигонуклеотидной последовательностью Y. Олигонуклеотидные последовательности Y и Z по настоящему изобретению могут быть получены с использованием методов, которые являются стандартными или традиционными 16 для данной области техники, или могут быть приобретены из коммерческих источников. При получении нуклеиновых кислотматриц по настоящему изобретению дополнительные желательные последовательности могут быть внесены с помощью методов, хорошо известных и описанных в данной области техники. Такими дополнительными последовательностями являются, например, рестрикционные сайты или некоторые метки нуклеиновых кислот, дающие возможность идентифицировать амплификационные продукты данной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Другими желательными последовательностями являются складчатые (обратносвязанные) последовательности ДНК (которые образуют выпетленные шпильки или иные вторичные структуры в случае перехода в одноцепочечное состояние), контрольные последовательности ДНК, которые обеспечивают ДНК-белковые взаимодействия, такие как, например, последовательности промоторной ДНК, которые распознаются полимеразой нуклеиновых кислот, или последовательности операторной ДНК, распознаваемые ДНК-связывающим белком. Если имеется множество предназначенных для амплификации последовательностей нуклеиновых кислот, то присоединение олигонуклеотидов Y и Z может быть осуществлено в общей или в разных реакциях. После того как была получена нуклеиновая кислота-матрица, она может быть амплифицирована перед ее использованием в способах по настоящему изобретению. Такая амплификация может быть осуществлена с использованием методов, хорошо известных и описанных в данной области техники, например, путем встраивания нуклеиновой кислоты-матрицы в состав экспрессирующего вектора и его амплификации в подходящем биологическом организмехозяине, или путем амплификации методом ПЦР. Эта амплификационная стадия, однако, не является ключевой, потому что способ по настоящему изобретению позволяет получать множественные копии нуклеиновой кислотыматрицы в составе колонии нуклеиновых кислот, формируемой на основе единственной копии нуклеиновой кислоты-матрицы. Предпочтительно 5'-конец нуклеиновой кислоты-матрицы, полученной в соответствии с описанным выше, модифицируют так, чтобы он нес средство для ковалентного присоединения нуклеиновых кислот-матриц к твердой подложке. Таким средством, например, может быть химически модифицируемая функциональная группа, такая как, например, фосфатная группа,карбоксильная или альдегидная составляющая,тиол или аминогруппа. Наиболее предпочтительно для 5'-модификации нуклеиновой кислоты используют тиоловую, фосфатную или аминогруппу. 17 Групповые праймеры по настоящему изобретению могут быть получены с применением методов, которые являются стандартными или традиционными для данной области техники. В целом, групповые праймеры по настоящему изобретению должны быть синтетическими олигонуклеотидами, сформированными с помощью методов, хорошо известных и описанных в данной области техники, или могут быть приобретены в коммерческих источниках. В соответствии со способом по настоящему изобретению один или два разных групповых праймера Х могут быть использованы для амплификации последовательности любой нуклеиновой кислоты. Это, с одной стороны, контрастирует, а, с другой, указывает на преимущество по отношению к многим методам амплификации, известным в данной области техники,таким как, например, способ, заявленный в международной патентной заявке WO 96/04404, в котором различные специфичные праймеры должны быть сформированы для последовательности каждой конкретной нуклеиновой кислоты, предназначенной для амплификации. Предпочтительно 5'-концы групповых праймеров Х по настоящему изобретению модифицируют так, чтобы они несли средство для ковалентного присоединения групповых праймеров к твердой подложке. Предпочтительно этим средством для ковалентного присоединения является химически модифицируемая функциональная группа в соответствии с описанным выше. Если желательно, групповые праймеры могут быть сконструированы так,чтобы они включали дополнительные желательные последовательности, такие как, например, рестрикционные эндонуклеазные сайты или другие типы сайтов расщепления, такие как сайты рибозимного расщепления. Другими желательными последовательностями являются обратносвязанные последовательности ДНК(которые образуют выпетленные шпильки или другие вторичные структуры в случае перехода в одноцепочечное состояние), контрольные последовательности ДНК, которые обеспечивают ДНК-белковые взаимодействия, такие как,например, последовательности промоторной ДНК, которые распознаются полимеразой нуклеиновых кислот, или последовательности операторной ДНК,распознаваемые ДНКсвязывающим белком. Иммобилизация группового праймера Х на подложке через 5'-конец оставляет его 3'-конец свободным от этой подложки таким образом,что этот групповой праймер доступен для достройки цепи с участием полимеразы после того,как произошла гибридизация с комплементарной олигонуклеотидной последовательностью,находящейся на 3'-конце нуклеиновой кислотыматрицы. После того как были синтезированы нуклеиновые кислоты-матрицы и групповые прай 004271 18 меры по настоящему изобретению, их смешивают друг с другом в подходящих пропорциях таким образом, чтобы, когда они присоединяются к твердой подложке, получалась бы подходящая плотность присоединенных нуклеиновых кислот-матриц и групповых праймеров. Предпочтительно доля групповых праймеров в данной смеси выше, чем доля нуклеиновых кислот-матриц. Предпочтительно отношение групповых праймеров к нуклеиновым кислотамматрицам таково, что, когда групповые праймеры и нуклеиновые кислоты-матрицы иммобилизованы на твердую подложку, образуется газон групповых праймеров, включающий множество групповых праймеров, расположенных при примерно равномерной плотности на всей или конкретной поверхности этой твердой подложки, при том, что одна или большее число нуклеиновых кислот-матриц оказываются иммобилизованными по отдельности с определенным интервалом в пределах этого газона групповых праймеров. Нуклеиновые кислоты-матрицы могут быть представлены в одноцепочечной форме. Однако они также могут быть представлены полностью или частично в двухцепочечной форме так, что либо один 5'-конец, либо оба 5'конца модифицированы для обеспечения присоединения к подложке. В этом случае после завершения процесса присоединения может возникнуть желание разделить цепи с помощью известных в данной области техники методов,например, путем нагревания до 94 С с последующей промывкой высвобожденных цепей. Должно быть понятно, что в том случае, когда обе цепи двухцепочечных молекул прореагировали с поверхностью и обе присоединились,результат будет тот же самый, что и в случае,когда только одна цепь присоединена и один этап амплификации был осуществлен. Другими словами, в случае, когда обе цепи двухцепочечных нуклеиновых кислот-матриц были присоединены, обе цепи неизбежно оказываются присоединенными поблизости друг от друга и неотличимы от результата присоединения только одной цепи и проведения одного этапа амплификации. Таким образом, одноцепочечные и двухцепочечные нуклеиновые кислоты-матрицы могут быть использованы для представления нуклеиновых кислот-матриц, присоединенных к поверхности и пригодных для формирования колоний. Расстояние между отдельными групповыми праймерами и отдельными нуклеиновыми кислотами-матрицами (и, следовательно, плотность групповых праймеров и нуклеиновых кислот-матриц) можно проконтролировать путем изменения концентрации групповых праймеров и нуклеиновых кислот-матриц, которые иммобилизованы на подложку. Предпочтительная плотность групповых праймеров составляет по крайней мере 1 фкмоль/мм 2, предпочтительно 19 по крайней мере 10 фкмоль/мм 2, более предпочтительно от 30 до 60 фкмоль/мм 2. Плотность нуклеиновых кислот-матриц для использования в способе по настоящему изобретению обычно составляет от 10000 до 100000 на 1 мм 2. Предпочтительно могут быть достигнуты и более высокие плотности, например, от 100000 до 1000000 на 1 мм 2 и от 1000000 до 10000000 на 1 мм 2. Контролирование плотности присоединенных нуклеиновых кислот-матриц и групповых праймеров, в свою очередь, позволяет контролировать окончательную плотность колоний нуклеиновых кислот на поверхности подложки. Это определяется тем фактом, что, в соответствии со способом по настоящему изобретению,одна колония нуклеиновых кислот может образовываться в результате присоединения одной нуклеиновой кислоты-матрицы, предусматривая то, что групповые праймеры по настоящему изобретению присутствуют в подходящем месте на твердой подложке (более подробно см. ниже). Плотность молекул нуклеиновых кислот в пределах отдельной колонии также можно контролировать, контролируя плотность присоединенных групповых праймеров. После того как групповые праймеры и нуклеиновые кислоты-матрицы по настоящему изобретению были иммобилизованы на твердую подложку при подходящей плотности, колонии нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут быть затем сформированы путем осуществления подходящего числа циклов амплификации на ковалентно связанной нуклеиновой кислоте-матрице таким образом, чтобы каждая колония включала множественные копии исходной иммобилизованной кислотыматрицы и комплементарной ей последовательности. Один цикл амплификации включает стадии гибридизации, достройки и денатурации, и эти стадии обычно осуществляют с использованием реагентов и условий, хорошо известных в данной области техники для метода ПЦР. Обычная реакция амплификации включает внесение твердой подложки и присоединенной нуклеиновой кислоты-матрицы и групповых праймеров в условия, которые индуцируют праймерную гибридизацию, например, путем внесения их в температуру около 65 С. При таких условиях олигонуклеотидная последовательность Z на 3'-конце данной нуклеиновой кислоты-матрицы будет гибридизовать с иммобилизованным групповым праймером Х и при наличии условий и реагентов для обеспечения праймерной достройки, например, температуры около 72 С, в присутствие полимеразы нуклеиновых кислот, например, молекулы ДНКзависимой ДНК-полимеразы или обратной транскриптазы (т.е. РНК-зависимой ДНКполимеразы), или РНК-полимераз, вкупе с набором молекул нуклеозидтрифосфатов или любых иных предшественников нуклеотидов, на 004271 20 пример, с молекулами модифицированного нуклеозидтрифосфата групповой праймер будет достраиваться за счет добавления нуклеотидов,комплементарных последовательности нуклеиновой кислоты-матрицы. Примерами полимераз нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются ДНК-полимераза (фрагмент Кленова, ДНК-полимераза фага Т 4), термостабильные ДНК-полимеразы различных термоустойчивых бактерий (такие как ДНК-полимеразы Taq, VENT, Pfu, Tfl), равно как и их генетически модифицированные производные (TaqGold, VENTexo, Pfu-exo). Сочетание РНК-полимеразы и обратной транскриптазы также можно использовать для проведения амплификации колонии ДНК. Предпочтительно полимераза нуклеиновых кислот, используемая для достройки групповых праймеров, характеризуется стабильностью в условиях реакции ПЦР, т.е. в повторяющихся циклах нагревания и охлаждения, и стабильностью при используемой температуре денатурации, обычно примерно 94 С. Предпочтительно используемой ДНКполимеразой является ДНК-полимераза Taq. Предпочтительно используемыми молекулами нуклеозидтрифосфатов являются дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, например, dATP,dTTP, dCTP, dGTP или рибонуклеозидтрифосфаты, например, АТР, UTP, СТР, GTP. Молекулы нуклеозидтрифосфатов могут быть нативными или не встречающимися в естественных условиях. После стадий гибридизации и достройки для внесения подложки и присоединенных нуклеиновых кислот в условия денатурации должны присутствовать две иммобилизованные нуклеиновые кислоты - первая из них является исходно иммобилизованной нуклеиновой кислотой-матрицей, а вторая является нуклеиновой кислотой, которая ей комплементарна, будучи достроенной с одного из иммобилизованных групповых праймеров X. И исходная иммобилизованная нуклеиновая кислота-матрица, и иммобилизованный достроенный групповой праймер затем способны инициировать дальнейшие раунды амплификации в результате включения подложки в дальнейшие циклы гибридизации,достройки и денатурации. Эти дальнейшие раунды амплификации будут давать в результате колонию нуклеиновых кислот, включающую множественные иммобилизованные копии нуклеиновой кислоты-матрицы и комплементарных ей последовательностей. Исходная иммобилизация нуклеиновой кислоты-матрицы означает, что нуклеиновая кислота-матрица может гибридизовать только с групповыми праймерами, расположенными на расстоянии в пределах общей длины нуклеиновой кислоты-матрицы. Следовательно, граница образованной колонии нуклеиновых кислот ограничена относительно небольшим участком 21 по отношению к участку, на котором была иммобилизована исходная нуклеиновая кислотаматрица. Ясно, что после того, как большее число копий молекулы-матрицы и ее комплемента оказались синтезированными в результате осуществления дальнейших раундов амплификации, т.е. дальнейших раундов гибридизации,достройки и денатурации, граница уже сформированной колонии нуклеиновых кислот будет способна увеличиваться дополнительно, хотя граница этой сформированной колонии попрежнему будет ограничена относительно небольшим участком по отношению к участку, на котором была иммобилизована исходная нуклеиновая кислота-матрица. Схематическое представление способа образования колоний нуклеиновых кислот в соответствии с вариантом настоящего изобретения показано на фиг. 1. На фиг. 1(а) показаны групповой праймер Х по настоящему изобретению (показан здесь, как имеющий последовательность АТТ) и нуклеиновая кислота-матрица по настоящему изобретению, включающая на 5'конце олигонуклеотидную последовательностьY, показанную здесь как АТТ, а на 3'-конце олигонуклеотидную последовательность Z, показанную здесь как ААТ, которая может гибридизовать с последовательностью группового праймера X. На схематическом представлении групповой праймер Х и олигонуклеотидные последовательности Y и Z показаны, как состоящие всего из трех нуклеотидов. Однако на практике должно быть понятно, что в норме будут использованы более длинные последовательности. 5'-концы и группового праймера, и нуклеиновой кислоты-матрицы несут средство для присоединения нуклеиновой кислоты к твердой подложке. Это средство обозначено на фиг. 1 черным прямоугольником. Это средство присоединения может обусловливать ковалентное или нековалентное присоединение. Для простоты на фиг. 1(а) показаны только один групповой праймер Х и одна нуклеиновая кислота-матрица. Однако на практике будет присутствовать множество групповых праймеров Х и множество нуклеиновых кислот-матриц. Множество групповых праймеров X может включать два разных групповых праймера X. Однако для простоты на схематическом представлении на фиг. 1 показан только один тип группового праймера X, имеющий последовательность АТТ. Множество нуклеиновых кислот-матриц может включать последовательности различных нуклеиновых кислот в центральной части между олигонуклеотидами Y и Z, но включать одинаковые олигонуклеотидные последовательности Y и Z на 5'- и 3'-концах соответственно. Для простоты на фиг. 1 показан только один вид нуклеиновой кислотыматрицы, у которой часть последовательности в центральной области показана как CGG. 22 В присутствии твердой подложки 5'-концы нуклеиновой кислоты-матрицы и группового праймера связаны с этой подложкой. Это показано на фиг. 1(b). Затем подложку и присоединенные к ней нуклеиновую кислоту-матрицу и групповые праймеры вносят в условия, которые индуцируют праймерную гибридизацию. На фиг. 1(с) показана нуклеиновая кислотаматрица, которая гибридизована с групповым праймером. Эта гибридизация определяется тем обстоятельством, что олигонуклеотидная последовательность Z на 3'-конце данной нуклеиновой кислоты-матрицы способна гибридизовать с групповым праймером. На схематическом представлении олигонуклеотидная последовательность Z показана, как комплементарная групповому праймеру, хотя на практике точная комплементарность последовательностей не является обязательной, что предусматривает возможность прохождения гибридизации в условиях, в которые вносят нуклеиновые кислоты-матрицы и групповые праймеры. На фиг. 1(d) показана стадия достройки праймера. Здесь при подходящих температурных условиях и в присутствии ДНК-полимеразы и набора предшественников нуклеотидов, например, dATP, dTTP, dCTP и dGTP, ДНКполимераза достраивает групповой праймер от его 3'-конца, используя нуклеиновую кислотуматрицу в качестве матрицы. По завершении достройки праймера - см. фиг. 1(е) - можно видеть, что была сформирована вторая цепь иммобилизованной нуклеиновой кислоты, которая комплементарна исходной нуклеиновой кислоте-матрице. После разделения двух цепей нуклеиновых кислот, например, действием тепла будут присутствовать две иммобилизованные нуклеиновые кислоты - первая является исходной иммобилизованной нуклеиновой кислотойматрицей, а вторая является комплементарной ей нуклеиновой кислотой, достроенной от иммобилизованных групповых праймеров X: см. фиг. 1(f). Исходная иммобилизованная нуклеиновая кислота-матрица и сформированный в результате достройки иммобилизованный групповой праймер затем способны гибридизовать с другими присутствующими групповыми праймерами (на фиг. 1(g) обозначены как групповые праймеры 2 и 3), и после последующего раунда достройки праймера (фиг. 1(h и разделения цепей (фиг. 1(i образуются четыре одноцепочечные иммобилизованные цепи. Две из них включают последовательности, соответствующие исходной нуклеиновой кислоте-матрице, а две другие - включают комплементарные им последовательности. Дальнейшие раунды амплификации после тех, которые показаны на фиг. 1, могут быть осуществлены с получением колонии нуклеиновых кислот, включающей множественные иммобилизованные копии матричной нуклеино 23 вой кислоты и комплементарной ей последовательности. Таким образом, можно видеть, что способ по настоящему изобретению позволяет формировать колонию нуклеиновых кислот на базе единственной иммобилизованной нуклеиновой кислоты-матрицы и что размер этих колоний можно контролировать путем изменения числа раундов амплификации, которым подвергается нуклеиновая кислота-матрица. Следовательно,число сформированных колоний нуклеиновых кислот на поверхности твердой подложки зависит от числа нуклеиновых кислот-матриц,которые были исходно иммобилизованы на эту подложку, в результате чего имеется достаточное число иммобилизованных групповых праймеров в районе нахождения каждой из иммобилизованных нуклеиновых кислот-матриц. Это соответствует тому, что предпочтительно твердая подложка, на которую были иммобилизованы групповые праймеры и нуклеиновые кислоты-матрицы, включает газон иммобилизованных групповых праймеров при подходящей плотности нуклеиновых кислот-матриц, иммобилизованных с промежутками в пределах этого газона праймеров. Такое так называемое самоупорядочивание колоний нуклеиновых кислот обладает преимуществом над многими предыдущими методами данной области техники в том, что более высокая плотность колоний нуклеиновых кислот может быть получена благодаря тому факту, что эту плотность можно контролировать путем регуляции плотности, с которой осуществляется исходная иммобилизация нуклеиновых кислот-матриц. Следовательно, этот способ не ограничивается, например, наличием специфичности в отношении набора специфичных праймеров в конкретных локальных участках подложки и поэтому инициирует образование колоний за счет нанесения конкретного образца, содержащего нуклеиновую кислотуматрицу, в тот же локальный участок праймера. Число колоний, которые можно выстроить с помощью ранее существовавших в данной области техники способов, например, заявленных в международной патентной заявке WO 96/04404 (Mosaic Technologies Inc.), ограничено отношением плотности и пространства, на которых в начальном этапе могут быть выстроены области специфичных праймеров. За счет возможности контроля исходной плотности нуклеиновых кислот-матриц и, следовательно, плотности колоний нуклеиновых кислот, образующихся на нуклеиновых кислотах-матрицах, наряду с возможностью контролировать размер образующихся колоний нуклеиновых кислот в пределах отдельных колоний может быть обеспечена оптимальная ситуация, при которой высокая плотность отдельных колоний нуклеиновых кислот может быть достигнута на твердой подложке доста 004271 24 точно большого размера и несущей достаточно большое количество амплифицированных последовательностей, обеспечивающих последующий анализ или контроль, которые должны быть проведены в отношении этих колоний нуклеиновых кислот. После того как были сформированы колонии нуклеиновых кислот, желательным может быть осуществление дополнительной стадии, такой как, например, визуализация колоний или секвенирование (см. ниже). Визуализация колоний, например, может требоваться тогда, когда имелась необходимость в скрининге сформированных колоний на присутствие или отсутствие, например, полных или частичных конкретных фрагментов нуклеиновых кислот. В этом случае колония или колонии,которые включают конкретный фрагмент нуклеиновой кислоты, могут быть выявлены в результате конструирования нуклеотидного зонда,который специфическим образом гибридизует с представляющим интерес фрагментом нуклеиновой кислоты. Такой нуклеотидный зонд предпочтительно помечают с помощью выявляемой составляющей, такой как флуоресцентная группа, биотин-включающая составляющая (которая может быть выявлена, например, путем инкубации со стрептавидином, помеченным флуоресцентной группой), радиоактивная метка (которая может быть встроена в нуклеотидный зонд с помощью методов, хорошо известных и описанных в данной области техники, и выявлена путем детекции радиоактивности, например, с помощью инкубации в сцинтилляционной жидкости) или краситель, или иной хромогенный агент. Как альтернатива, такой нуклеотидный зонд может быть непомеченным и сконструированным так, чтобы действовать в качестве праймера для встраивания нескольких помеченных нуклеотидов с помощью полимеразы нуклеиновых кислот. Затем может быть осуществлена детекция встроенной метки и, следовательно, колоний нуклеиновых кислот. Колонии нуклеиновых кислот по настоящему изобретению затем подготавливают для гибридизации. Такое приготовление включает обработку этих колоний таким образом,чтобы все или часть нуклеиновокислотных колоний-матриц, образующих эти колонии,присутствовали в одноцепочечной форме. Этого можно достичь, например, путем денатурации нагреванием любой двухцепочечной ДНК в колониях. С другой стороны, колонии могут быть обработаны рестриктазой, специфичной для двухцепочечной формы последовательности в составе нуклеиновой кислоты-матрицы. Так, эндонуклеаза может быть специфичной либо для последовательности, входящей в состав олигонуклеотидных последовательностейY или Z, либо для иной последовательности,присутствующей в составе нуклеиновой кисло 25 ты-матрицы. После расщепления колонии нагревают так, чтобы молекулы двухцепочечной ДНК разделились, после чего эти колонии промывают с целью удаления неиммобилизованных цепей, тем самым сохраняя присоединенные одноцепочечные ДНК в составе колоний. После получения колоний для гибридизации помеченный или непомеченный зонд добавляют к колониям в условиях, подходящих для гибридизации данного зонда со специфичной для него последовательностью ДНК. Эти условия могут быть определены специалистом в данной области техники с применением известных методов и будут зависеть, например, от последовательности данного зонда. Затем зонд может быть удален путем денатурирующего нагревания и, если это желательно, может быть прогибридизован и детектирован зонд, специфичный в отношении второй нуклеиновой кислоты. Эти стадии могут быть повторены столько раз, сколько это желательно. Помеченные зонды, которые гибридизовали с колониями нуклеиновых кислот, затем можно детектировать с использованием устройства, включая подходящие детекторные устройства. Предпочтительным детекторным устройством для флуоресцентных меток являетсяCCD-видеокамера (устройство с зарядовой связью), которая необязательно может быть объединена с увеличительным устройством, например, с микроскопом. С использованием данного метода возможно одновременно контролировать большое число колоний. Например, с использованием микроскопа вместе с CCD-камерой и 10- или 20-кратного объектива возможно наблюдать колонии на поверхности от 1 до 4 мм 2, что соответствует параллельному контролю от 10 до 200 тысяч колоний. Более того,должно быть понятно, что эта величина может увеличиваться с улучшением параметров оптики и более крупных чипов. Альтернативным методом контроля образованных колоний является сканирование поверхности, покрытой колониями. Например, могут быть использованы системы, в которых вплоть до 100 миллионов колоний могут быть одновременно выстроены и проконтролированы с помощью получения изображения наCCD-камере по всей такой поверхности. В этом случае можно видеть, что за короткое время можно проконтролировать вплоть до 100 миллионов колоний. Любые другие устройства, позволяющие детектировать и предпочтительно количественно оценивать флуоресценцию на поверхности,можно использовать для контроля колоний нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Например, можно использовать флуоресцентные видеоустройства или конфокальные микроскопы. 26 Если метки являются радиоактивными, то могут потребоваться системы для выявления радиоактивности. В способах по настоящему изобретению, в которых осуществляется по крайней мере одна дополнительная стадия определения последовательности по крайней мере одной из сформированных колоний нуклеиновых кислот, упомянутое определение последовательности (секвенирование) может быть проведено с использованием любого подходящего твердофазного метода секвенирования. Например, одним из методов определения последовательности, который можно использовать в настоящем изобретении, является гибридизация подходящего праймера, иногда обозначаемого здесь как секвенационный праймер, с предполагаемой для секвенирования нуклеиновой кислотойматрицей, достройка этого праймера и детекция нуклеотидов, которые были использованы для достройки этого праймера. Предпочтительно нуклеиновую кислоту, использованную для достройки праймера, детектируют до того, как к растущей цепочке нуклеиновой кислоты добавляется следующий нуклеотид, что тем самым позволяет провести секвенирование нуклеиновой кислоты in situ понуклеотидно. Детекция встроенных нуклеотидов облегчается использованием в реакции достройки праймера одного или нескольких помеченных нуклеотидов. Можно использовать любую подходящую выявляемую метку, например, флуорофор, радиоактивную метку и т.п. Предпочтительным является использование флуоресцентной метки. Для каждого из различных типов нуклеотидов можно использовать одинаковую или отличающуюся метку. Когда метка является флуорофором и одинаковые метки используются для каждого из различных типов нуклеотидов, то каждое встраивание нуклеотида может обусловливать накопительное увеличение сигнала, детектируемого при конкретной длине волны. При использовании различных меток эти сигналы могут быть детектированы при различных подходящих длинах волн. Если желательно,предусматривается смесь помеченных и непомеченных нуклеотидов. С целью обеспечения гибридизации подходящего секвенационного праймера с нуклеиновой кислотой-матрицей, которая должна быть секвенирована, в норме нуклеиновая кислотаматрица должна находиться в одноцепочечной форме. Если нуклеиновые кислоты-матрицы,составляющие колонии нуклеиновых кислот,присутствуют в двухцепочечной форме, они могут быть обработаны так, чтобы получить одноцепочечные нуклеиновые кислотыматрицы, с использованием методов, хорошо известных в данной области техники, например,с помощью денатурации, расщепления и т.п. Секвенационные праймеры, которые гибридизуют с нуклеиновой кислотой-матрицей и 27 используются в реакции достройки праймера,предпочтительно являются короткими олигонуклеотидами, например, имеют длину от 15 до 25 нуклеотидов. Последовательность праймеров конструируют таким образом, чтобы они гибридизовали с частью нуклеиновой кислотыматрицы, которая должна быть секвенирована,предпочтительно в жестких условиях. Последовательность используемых для секвенирования праймеров может иметь последовательность,одинаковую или сходную с последовательностью групповых праймеров, использованных для формирования колоний нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Секвенационные праймеры могут быть представлены в растворе или в иммобилизованной форме. После того как секвенационный праймер прошел отжиг на нуклеиновую кислотуматрицу, которая должна быть секвенирована,путем внесения нуклеиновой кислоты-матрицы и секвенационного праймера в подходящие условия, определяемые с помощью методов, хорошо известных в данной области техники, проводят достройку праймера, например, используя полимеразу нуклеиновых кислот и набор нуклеотидов, по крайней мере, некоторые из которых представлены в помеченной форме, и условия, подходящие для достройки праймера в случае наличия подходящих нуклеотидов. Примеры полимераз нуклеиновых кислот и нуклеотидов,которые можно использовать, были описаны выше. Предпочтительно после каждой стадии достройки праймера включают стадию промывки с целью удаления невстроенных нуклеотидов,которые могут являться помехой на последующих стадиях. После осуществления этапа достройки праймера колонию нуклеиновых кислот контролируют с целью определения того,встроился ли помеченный нуклеотид в достроенный праймер. Стадия достройки праймера может быть затем повторена с целью определения следующего и последующих нуклеотидов,встроенных в достроенный праймер. Для определения последовательности может быть использовано любое устройство, позволяющее выявлять и предпочтительно количественно оценивать соответствующую метку,например, флуоресценцию или радиоактивность. Если метка является флуоресцентной, то можно использовать CCD-видеокамеру, необязательно присоединенную к увеличительному устройству (в соответствии с описанным выше). Действительно, устройства, используемые в аспектах настоящего изобретения, связанных с определением последовательности, могут быть теми же, что описаны выше для контроля амплифицированных колоний нуклеиновых кислот. Детекционную систему предпочтительно используют в сочетании с анализаторной системой с целью определения числа и природы нук 004271 28 леотидов, встроенных в каждую колонию после каждой стадии достройки праймера. Этот анализ, который может быть осуществлен непосредственно после стадии достройки каждого праймера или позже, используя регистрационные данные, позволяет определять последовательность нуклеиновой кислоты-матрицы в пределах данной колонии. Если определяемая последовательность неизвестна, то нуклеотиды, вносимые в данную колонию, обычно вносят в определенном порядке, который затем воспроизводят в ходе анализа, например: dATP, dTTP, dCTP, dGTP. Однако если определяемая последовательность известна и проводится ее ресеквенирование,например, с целью анализа того, имеются ли в составе последовательности небольшие отличия от известной последовательности, то процесс определения последовательности может быть ускорен за счет добавления нуклеотидов на каждой стадии в соответствующем порядке, выбранном в соответствии с известной последовательностью. Отличия от данной последовательности в этом случае выявляются по отсутствию встраивания некоторых нуклеотидов на конкретных стадиях достройки праймера. Таким образом, можно видеть, что полные или частичные последовательности амплифицированных нуклеиновых кислот-матриц могут быть определены с использованием методов по настоящему изобретению. В следующем варианте настоящего изобретения полная или частичная последовательность более чем одной нуклеиновой кислоты может быть определена путем установления полной или частичной последовательности амплифицированных нуклеиновых кислот-матриц,присутствующих более чем в одной колонии нуклеиновых кислот. Предпочтительно одновременно определяют множество последовательностей. Осуществление секвенирования нуклеиновых кислот с использованием способа по настоящему изобретению имеет преимущество в том, что оно, по-видимому, может быть очень надежным благодаря тому факту, что в пределах каждой колонии нуклеиновых кислот по настоящему изобретению имеется большое число копий каждой нуклеиновой кислоты, которая должна быть секвенирована. Если желательно,дальнейшее повышение надежности может быть достигнуто путем представления множества колоний нуклеиновых кислот, включающих одни и те же предназначенные для секвенирования нуклеиновые кислоты-матрицы с последующим определением последовательности для каждого такого множества колоний и сравнения установленных таким путем последовательностей. Предпочтительно присоединение группового праймера и нуклеиновой кислоты-матрицы к твердой подложке является термостабильным 29 при температуре, которой может быть повергнута эта подложка в ходе реакции амплификации нуклеиновых кислот, например температуре вплоть до приблизительно 100 С, например приблизительно 94 С. Предпочтительно природа присоединения является ковалентной. Еще в одном варианте по настоящему изобретению ковалентное присоединение групповых праймеров и нуклеиновой(ых) кислотыматрицы (кислот-матриц) к твердой подложке индуцируется перекрестно-сшивающим агентом(EDC), янтарный ангидрид, фенилдиизотиоцианат или малеиновый ангидрид, или гетеробифункциональным сшивателем, таким как, например, сложный эфир m-малеимидобензоил-Nгидроксисукцинимида (MBS), N-сукцинимидил[4-иодацетил]аминобензоат (SIAB), сукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), сложный эфир N-yмалеимидобутирилоксисукцинимида (GMBS),сукцинимидил-4-[р-малеимидофенил]бутират(водорастворимые) соединения. Предпочтительными перекрестно-сшивающими реагентами для использования в настоящем изобретении являются s-SIAB, s-MBS и EDC. Еще в одном варианте настоящего изобретения твердая подложка имеет производную поверхность. В следующем варианте производную поверхность твердой подложки последовательно модифицируют бифункциональными перекрестно-сшивающими группами с получением функционализованной поверхности, предпочтительно используя реактивные перекрестно-сшивающие группы. По использованию в данном тексте производная поверхность обозначает поверхность,которая была модифицирована химически реактивными группами, например, аминогруппами,тиоловыми или акрилатными группами. По использованию в данном тексте функционализованная поверхность обозначает производную поверхность, которая была модифицирована специфическими функциональными группами, например малеиновыми или янтарными функциональными составляющими. В способе по настоящему изобретению при некоторых случаях его применения присоединение групповых праймеров и нуклеиновых кислот-матриц к твердой подложке должно удовлетворять ряду требований. Идеальное присоединение не должно нарушаться ни воздействием высоких температур, ни повторными циклами нагревания-охлаждения, применяемыми в ходе процедуры амплификации нуклеиновых кислот. Более того, подложка должна позволять достигать плотности присоединенных групповых праймеров по крайней мере 1 фкмоль/мм 2,предпочтительно по крайней мере 10 фкмоль/мм 2, более предпочтительно от 30 до 60 30 фкмоль/мм 2. Идеальная подложка должна иметь равномерно плоскую поверхность с низким фоном флуоресценции и также должна быть термостабильной (недеформирующейся). Твердые подложки, которые обеспечивают пассивную адсорбцию ДНК, как в случае некоторых типов пластмассовых и синтетических нитроцеллюлозных мембран, непригодны. Наконец, твердая подложка должна быть доступной и при этом относительно недорогой. Учитывая сказанное, хотя твердая подложка может быть любой твердой поверхностью, к которой могут быть присоединены нуклеиновые кислоты, такой как шарики из латекса, шарики из декстрана, полистирольная, полипропиленовая поверхность, полиакриламидный гель, поверхности из золота, стеклянные поверхности и силиконовые пластинки, предпочтительно такая твердая подложка является стеклянной поверхностью и присоединение нуклеиновых кислот к ней является ковалентным присоединением. Ковалентное связывание групповых праймеров и нуклеиновых кислот-матриц на твердой подложке может быть осуществлено с использованием методов, которые хорошо известны и описаны в данной области техники. Например,эпоксисиланаминовое ковалентное связывание олигонуклеотидов на твердых подложках, таких как шарики из пористого стекла, широко применяется для твердофазного синтеза олигонуклеотидов in situ (при присоединении по 3'концу) и также было адаптировано для присоединения по 5'-концу олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды, модифицированные по 5'-концу карбоксильными или альдегидными составляющими, ковалентно присоединяются к шарикам из гидразин-производного латекса (Kremskyet al., 1987). В других способах присоединения олигонуклеотидов к твердым поверхностям используют сшиватели, такие как янтарный ангидрид,фенилдиизотиоцианат (Guo et al., 1994) или малеиновый ангидрид (Yang et al., 1998). Другим широко используемым сшивателем является 1 этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидгидрохлорид (EDC). Химия EDC впервые была описана у Gilham et al., 1968: они присоединили ДНК-матрицы к бумаге (целлюлозе) через 5'концевую терминальную фосфатную группу. С использованием химии EDC были использованы и другие подложки, такие как шарики из латекса(Wolf et al., 1987; Lund et al., 1988), полистиреновые микролунки (Rasmussen et al., 1991),стекло с контролируемым размером пор (Ghoshal., 1987). Конденсация модифицированных по 5'-аминогруппе олигонуклеотидов с промежуточным карбодиимидным реагентом была описана у Chu et al., 1983 и у Egan et al., 1982 для модифицируемой 5'-концевой фосфатной группы. 31 Выход присоединения олигонуклеотидов через их 5'-концы с использованием карбодиимидов может достигать 60%, однако, существенным ограничением является неспецифическое присоединение через неконцевые нуклеотиды данного олигонуклеотида. Специфичность присоединения через 5'-концы была повышена до 85% (Rasmussen et al., 1991) за счет дериватизации поверхности с использованием вторичных аминогрупп. В более поздних статьях сообщается о преимуществах гетеробифункциональных перекрестно-сшивающих агентов. Гетеро- и монобифункциональные сшиватели широко применяются для получения молекул-конъюгатов,являющихся носителями пептидов (пептидбелок), с целью усиления иммуногенности у животных (Peeters et al., 1989). Для большинства из этих прививающих реагентов было описано образование стабильных ковалентных связей в водном растворе. Эти перекрестно-сшивающие реагенты были использованы для связывания ДНК на твердой поверхности по единственной точке в составе молекулы. Была исследована (Chrisey et al., 1996) эффективность и стабильность присоединения ДНК к твердой фазе с использованием 6 различных гетеробифункциональных сшивателей. В этом примере присоединение происходило только по 5'-концу олигомерной ДНК, модифицированному тиоловой группой. Этот тип присоединения также был описан у O'DonnellMaloney et al., 1996 для присоединения ДНКмишеней при секвенировании по методуF.K. (ЕР заявка А-665293) в связи с определением последовательности нуклеотидов в нуклеиновой кислоте на твердой подложке. Было проведено очень мало исследований,посвященных термостабильности присоединения олигонуклеотидов к твердой подложке. Сообщалось (Chrisey et al., 1996), что при использовании сшивателя сукцинимидил-4-[р-малеимидофенил]бутирата (SMPB) почти 60% молекул высвобождались со стеклянной поверхности при нагревании. Однако термостабильность других реагентов вообще не описана. С целью формирования колоний нуклеиновых кислот с помощью твердофазной реакции амплификации в соответствии с описанным в настоящей заявке на изобретение необходимо, чтобы групповые праймеры и нуклеиновые кислоты-матрицы были специфическим образом присоединены по их 5'-концам к твердой поверхности, предпочтительно к стеклу. Вкратце, стеклянная поверхность может быть дериватизована реактивными аминогруппами путем силанизации с использованием аминоалкоксисиланов. Подходящими силановыми реагентами являются аминопропилтриметоксисилан, аминопропилтриэтоксисилан и 4-аминобутилтриэтоксисилан. Стеклянные поверхности 32 также могут быть дериватизованы другими реактивными группами, такими как акрилат или эпоксигруппа, с использованием эпоксисилана,акрилатсилана и акриламидсилана. После проведения стадии дериватизации молекулы нуклеиновых кислот (групповые праймеры или нуклеиновые кислоты-матрицы), имеющие химически модифицируемую функциональную группу на их 5'-конце, например, фосфатную,тиоловую или аминогруппу, ковалентно присоединяются к производной поверхности с помощью перекрестно-сшивающего реагента, такого как те реагенты, которые были описаны выше. Как альтернатива, после стадии дериватизации может быть проведено присоединение бифункционального перекрестно-сшивающего реагента к находящимся на поверхности аминогруппам, тем самым образуя модифицированную функционализованную поверхность. Молекулы нуклеиновых кислот (групповые праймеры или нуклеиновые кислоты-матрицы), имеющие 5'-концевые фосфатные, тиоловые или аминогруппы, затем реагируют с функционализованной поверхностью, образуя ковалентную связь между нуклеиновой кислотой и стеклом. Потенциальными перекрестно-сшивающими и прививающими реагентами, которые можно использовать для ковалентного присоединения ДНК/олигонуклеотида на твердой поверхности, являются янтарный ангидрид, 1-этил-3[3-диметиламинопропил]карбодиимидгидрохлорид (EDC), сложный эфир m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида (MBS), Nсукцинимидил-[4-иодацетил]аминобензоат(GMBS), сукцинимидил-4-[р-малеимидофенил] бутират (SMPB) и соответствующие сульфопроизводные (водорастворимые) соединения. Предпочтительными перекрестно-сшивающими реагентами для использования в настоящем изобретении являются S-SIAB, s-MBS и EDC. sMBS - это малеимидсукцинимидный гетеробифункциональный сшиватель, a s-SIAB - это иодацетилсукцинимидный гетеробифункциональный сшиватель. Оба они способны образовывать ковалентную связь, соответственно, с группами SH и первичными аминогруппами.EDC - это карбодиимидный реагент, который опосредует ковалентное соединение фосфатных и аминогрупп. Групповые праймеры и нуклеиновые кислоты-матрицы обычно модифицируют по 5'концу фосфатной группой или первичной аминогруппой (для прививающего реагента EDC) или тиоловой группой (для сшивателей s-SIAB или s-MBS). Таким образом, в следующем аспекте настоящего изобретения представляется твердая подложка, к которой присоединено множество 33 групповых праймеров Х в соответствии с описанным выше и по крайней мере одна нуклеиновая кислота-матрица в соответствии с описанным выше, причем упомянутые нуклеиновые кислоты-матрицы включают на своих 5'-концах олигонуклеотидную последовательность Y в соответствии с описанным выше, а на своих 3'концах - олигонуклеотидную последовательность Z в соответствии с описанным выше. Предпочтительно множество нуклеиновых кислот-матриц присоединено к упомянутой твердой подложке, которая предпочтительно является стеклянной. Предпочтительно присоединение нуклеиновых кислот-матриц и групповых праймеров к данной твердой подложке является ковалентным. Путем проведения одного или большего числа раундов амплификации нуклеиновых кислот на иммобилизованной(ых) нуклеиновой(ых) кислоте(ах)-матрице(ах) с использованием описанных выше способов могут быть сформированы колонии нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Следовательно,еще в одном аспекте настоящего изобретения представляется подложка, несущая одну или большее число колоний нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Еще в одном аспекте настоящего изобретения представляется использование твердых подложек по настоящему изобретению в способах амплификации или секвенирования нуклеиновых кислот. Такие способы амплификации или секвенирования нуклеиновых кислот включают способы по настоящему изобретению. В следующем аспекте настоящего изобретения представляется использование производной или функционализованной подложки, полученной в соответствии с описанным выше, в способах амплификации или секвенирования нуклеиновых кислот. Такие способы амплификации или секвенирования нуклеиновых кислот включают способы по настоящему изобретению. Еще в одном аспекте настоящего изобретения представляется устройство для осуществления способов по настоящему изобретению или устройство для получения твердой подложки, несущей колонии нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Такое устройство может включать, например, множество нуклеиновых кислот-матриц или групповых праймеров по настоящему изобретению, связанных, предпочтительно ковалентно, с твердой подложкой в соответствии с описанным выше, вместе с полимеразой нуклеиновых кислот, множеством предшественников нуклеотидов, таких как те,которые были описаны выше, часть из которых может быть помечена, и средство для контроля температуры. С другой стороны, устройство может включать, например, подложку, несущую одну или большее число колоний нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Предпочтительно устройство также включает детек 004271 34 тор для выявления и распознавания сигналов от отдельных колоний нуклеиновых кислот, распределенных на твердой подложке, в соответствии со способами по настоящему изобретению. Например, такой детектор может включать устройство с зарядовой связью, функционально соединенное с увеличительным устройством,таким как микроскоп, в соответствии с описанным выше. Предпочтительно любые устройства по настоящему изобретению представляются как автоматические. Настоящая заявка представляет решение насущных и исключительно важных проблем,которые ученые и биотехнологическая промышленность пытаются решить в таких областях, как геномный анализ, фармакогенетика,разработка лекарств, анализ пищевых продуктов и генотипирование. Так, способ по настоящему изобретению может найти применение, например: в секвенировании и ресеквенировании нуклеиновых кислот, диагностике и скрининге,контроле за экспрессией генов, идентификации генетического разнообразия, выявлении и количественной оценке полногеномного полиморфизма, создании геномных слайдов (представление полного генома индивидуума на одном предметном стекле) и секвенировании полного генома. Таким образом, настоящее изобретение может быть использовано для проведения секвенирования и ресеквенирования нуклеиновых кислот, когда, например, выбранное число генов специфически амплифицируют в колонии для полного секвенирования ДНК. Ресеквенирование генов позволяет идентифицировать все известные или новые случаи генетического полиморфизма анализируемых генов. Пути применения связаны с медицинской диагностикой и генетической идентификацией живых организмов. Для использования настоящего изобретения в диагностике и скрининге полные геномы или фрагменты геномов могут быть амплифицированы в колонии для секвенирования ДНК по известным вариантам мононуклеотидного полиморфизма (SNP). Идентификация SNP имеет значение для медико-генетического анализа при идентификации факторов генетического риска, связанных с заболеваниями. Генотипирование по SNP также будет иметь диагностическое значение для фармакогенетики при идентификации и лечении больных конкретными лекарственными средствами. Для использования настоящего изобретения в изучении генетического разнообразия популяции, например, организмов, клеток или тканей могут быть идентифицированы путем амплификации в колонии образцов ДНК с последующим секвенированием конкретных меток для каждого отдельного генетического объекта. В этом случае генетическое разнообра 35 зие образца может быть определено путем подсчета числа меток у каждого из индивидуальных объектов. Для использования настоящего изобретения в контроле за экспрессией генов молекулы экспрессируемой мРНК у исследуемых ткани или организма превращают в молекулы кДНК,которые амплифицируют в группы колоний для ДНК-секвенирования. Частота колоний,кодирующих данную мРНК, пропорциональна частоте молекул мРНК, присутствующих в исходной ткани. Применение контроля за экспрессией генов найдет применение в медикобиологическом анализе. С использованием способов по настоящему изобретению может быть приготовлен полногеномный слайд, на котором полный геном живого организма представлен множеством колоний ДНК, число которых достаточно для включения всех последовательностей данного генома. Геномный слайд представляет собой генетическую карточку любого живого организма. Генетические карточки найдут применение в медицинских исследованиях и генетической идентификации живых организмов, имеющих промышленное значение. Также настоящее изобретение может быть использовано для осуществления полногеномного секвенирования, в котором геном живого организма целиком амплифицируют в виде наборов колоний для экстенсивного ДНКсеквенирования. Полногеномное секвенирование, например, позволяет: (1) точно идентифицировать генетический штамм любого живого организма; (2) обнаруживать новые гены в составе генома; и (3) выявлять новые варианты генетического полиморфизма. Применение настоящего изобретения не ограничивается анализом образцов нуклеиновых кислот от одиночного организма/пациента. Например, метки нуклеиновых кислот могут быть встроены в нуклеиновые кислоты-матрицы и амплифицированы, а для каждого организма/пациента могут быть использованы разные метки нуклеиновых кислот. Так, когда последовательность амплифицированной нуклеиновой кислоты определена, также можно определить последовательность данной метки и идентифицировать происхождение данного образца. Таким образом, следующий аспект настоящего изобретения представляет использование способов по настоящему изобретению или колоний нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, или множества нуклеиновых кислот-матриц по настоящему изобретению, или твердых подложек по настоящему изобретению для получения молекул нуклеиновых кислот для секвенирования и ресеквенирования, контроля за экспрессией генов, анализа генетического разнообразия,диагностики,скрининга, полногеномного секвенирования,выявления и количественного анализа полноге 004271 36 номного полиморфизма и получения полногеномных слайдов (т.е. полного генома индивидуума на одной подложке), или для любого иного применения, включающего амплификацию нуклеиновых кислот или их секвенирование. Еще в одном аспекте настоящего изобретения представляется набор для использования в секвенировании, ресеквенировании, контроле за экспрессией генов, анализе генетического разнообразия, диагностике, скрининге, полногеномном секвенировании, выявлении и количественном анализе полногеномного полиморфизма или в любом ином применении, включающем амплификацию нуклеиновых кислот или их секвенирование. Этот набор включает ряд нуклеиновых кислот-матриц и групповых праймеров по настоящему изобретению, присоединенных к твердой подложке в соответствии с описанным выше. Далее настоящее изобретение будет описано более подробно в нижеследующих не являющихся ограничивающими примерах при ссылках на следующие чертежи, на которых на фиг. 1 схематически изображен способ образования колоний нуклеиновых кислот в соответствии с вариантом настоящего изобретения; на фиг. 2 - схематическое представление получения матриц и последующего присоединения к твердой подложке; на фиг. 2 а показано получение матриц А, В и В', включающих последовательности групповых праймеров. Матрицу длиной 3200 пар нуклеотидов (п.н.) формируют из геномной ДНК с помощью ПЦР-праймеров ТР 1 и ТР 2. Матрицы А (854 п.н.) и В (927 п.н.) формируют с помощью ПЦР-праймеров ТРА 1/ТРА 2 или ТРВ 1/ТРВ 2 соответственно. Олигонуклеотиды ТРА 1 и ТРВ 1 модифицируют по их 5'-концам либо фосфатной, либо тиоловой группой для последующего химического присоединения . Следует заметить, что полученные матрицы включают последовательности, соответствующие групповым праймерам СР 1 и/или СР 2. Одиннадцать экзонов гена обозначены от Е 1 до Е 11; на фиг. 2b - химическое присоединение групповых праймеров и матриц к стеклянной поверхности. В качестве примера приведена дериватизация аминопропилтриэтоксисиланом(ATS); на фиг. 3 - колонии ДНК, сформированные от группового праймера. Показано число колоний, выявляемых в расчете на область 20 х, как функция концентрация матрицы, связанной с лункой. Наименьшая концентрация выявляемой матрицы соответствует 10-13 М; на фиг. 4 - представление установления различий между колониями, происходящими из двух разных матриц; 37 на фиг. 4 а - изображения колоний, полученных на обеих матрицах, и негативные контроли; на фиг. 4b - колонии с обеих матриц в том же положении в той же лунке, визуализованные двумя разными цветами, и негативные контроли; на фиг. 4 с - координаты обоих типов колоний при делении поля зрения микроскопа; на фиг. 4 с видно, что колонии двух разных матриц не совпадают; на фиг. 5 - схемы реакций присоединения матрицы или олигонуклеотида к стеклу. Стадия А - дериватизация поверхности; предметные стекла обрабатывают кислым раствором для увеличения числа свободных гидроксильных групп на этой поверхности. Предобработанные стекла погружают в раствор аминосилана. ATS аминопропилтриэтоксисилан. Стадия В - В 1 или В 2 функционализация стеклянной поверхности сшивателями с последующим прикреплением олигонуклеотидов. Аминогруппы реагируют с перекрестно-сшивающим агентом через амидную связь; стадия В 1 - s-MBS (сульфированный сложный эфир(сульфированный N-сукцинимидил-[4-иодацетил]аминобензоат). Олигонуклеотиды (олигонуклеотид, модифицированный тиолом по 5'концу) присоединяются к поверхности за счет образования ковалентной связи между тиоловой группой и двойной связью имида малеиновой кислоты. Фосфатно-солевой буфер (ФСБ): 0,1 М NaH2PO4, рН=6,5; 0,15 М NaCl; В 3 - присоединение олигонуклеотидов с использованием EDC и имидазола. Олигонуклеотиды, модифицированные фосфатной группой по 5'-концу,реагируют с имидазолом в присутствии EDC с получением 5'-фосфоимидазолидных производных (не показано). Эти производные образуют фосфоамидатную связь с аминогруппами производной стеклянной поверхности. EDC - 1-этил 3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидгидрохлорид; на фиг. 6 - число колоний, наблюдаемых в области 20 х, как функцию концентрации матрицы, связанной в лунке. ДНК-матрицы были связаны при различных концентрациях либо с помощью сочетающего реагента (EDC) на аминопроизводной стеклянной поверхности (А),либо на функционализованной s-MDS стеклянной поверхности (В). Колонии двухцепочечных ДНК обрабатывали рестриктазой, и выделенные одиночные цепи гибридизовали с комплементарным олигонуклеотидом, флуоресцентно помеченным су 5; на фиг. 7 - пример секвенирования in situ сформированных на стекле колоний ДНК; на фиг. 7 А - результат после инкубации сCy5-dCTP с образцом, который не был проинкубирован в праймером р 181. Должно быть понятно, что может быть выявлено только 5 38 размытых пятен: это указывает на то, что не имело место сколько-нибудь существенное ложное проявление (такое как осаждение с агрегацией Cy5-dCTP, адсорбция или просто неспецифическое встраивание в ДНК в составе колоний или на поверхности); на фиг. 7 В - результат после инкубации сCy5-dUTP с образцом, который был проинкубирован с праймером р 181. Должно быть понятно, что флуоресцентное пятно не может быть получено: это указывает на то, что встраивание флуоресцентно помеченного нуклеотида не могло иметь место в достаточном количестве,когда представленный к включению нуклеотид не соответствует последовательности матрицы после гибридизованного праймера; на фиг. 7 С - результат после инкубации сCy5-dCTP образца, который был проинкубирован с праймером р 181. Должно быть понятно,что может быть выделено большое число флуоресцирующих пятен: это указывает на то, что встраивание флуоресцентно помеченного нуклеотида действительно может иметь место в выявляемом количестве, когда представленный к встраиванию нуклеотид соответствует последовательности матрицы после гибридизовавшего праймера; на фиг. 8 - гибридизация зондов с олигонуклеотидами, присоединенными к Nucleolink, до и после циклов ПЦР. На фигуре показана гибридизация R58 с СР 2 - 5'-(фосфат)TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAAAGGGAAAGGG, незакрашенные треугольники. Примеры Пример 1. Получение ДНК-матриц, пригодных для формирования колоний ДНК. Колонии ДНК формируют из ДНКматриц и групповых праймеров. Термин последовательность группового праймера по использованию в данном тексте обозначает последовательность, соответствующую последовательности группового праймера, а также иногда в других случаях соответствует олигонуклеотидной последовательности Y или олигонуклеотидной последовательности Z. Характеристики групповых праймеров были выбраны, исходя из выбора олигонуклеотидных праймеров, которые проявляют незначительный уровень встраивания неспецифических нуклеотидов в присутствие термостабильных ДНК-полимераз. Групповые праймеры СР (5' 39(5'-р-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) были выбраны благодаря низкой встраиваемости радиоактивного -32P-dCTP в присутствии стабильной ДНК-полимеразы (AmpliTaq: PerkinElmer, Foster City, CA) в стандартном буфере и в условиях температурных циклов (30 с при 94 С,1 мин при 65 С, 2 мин при 72 С - 50 циклов). Фрагмент ДНК длиной 3,2 т.п.н. был взят в качестве модельной системы для того, чтобы продемонстрировать возможность образования колоний с использованием групповых праймеров и ДНК-матриц. Выбранная матрица включает ген человека, кодирующий рецептор конечных продуктов гликозилированияD28769). RAGE-специфичные праймеры показаны в табл. 1. Матрица длиной 3,2 т.п.н. была сформирована путем ПЦР-амплификации на материале 0,1 мкг геномной ДНК человека с 1 мкМ праймеров ТР 1 и ТР 2 и 1 ед. ДНКполимеразы (AmpliTaq: Perkin Elmer, FosterCity, CA) в стандартном буфере и в условиях температурных циклов (30 с при 94 С, 1 мин при 65 С, 5 мин при 72 С - 40 циклов). Этот ДНК-фрагмент длиной 3,2 т.п.н. использовали в качестве матрицы для вторичной ПЦР с получением двух более коротких матриц для образования колоний (матрицы А и В). Праймеры,используемые для формирования более коротких матриц, включают последовательности,специфичные для матрицы, и последовательности групповых праймеров СР 1 и СР 2 с целью амплификации ДНК на твердой поверхности. В целом, ПЦР-праймер, использовавшийся для формирования ДНК-матрицы, модифицировали по его 5'-концу либо фосфатной, либо тиоловой составляющей. Таким образом, после ПЦРамплификации были сформированы фрагменты ДНК, которые включают последовательности групповых праймеров по одному или обоим концам, примыкающим к интересующему ДНКфрагменту гена RAGE (см. фиг. 2 а). Матрица А (двухцепочечная матрица,включающая по обоим концам последовательность группового праймера СР), была сформирована с 0,1 нг матрицы 3,2-т.п.н., 1 мкМ праймеров ТРА 1 и 1 мкМ ТРА 2 и 1 ед. ДНКполимеразы (AmpliTaq: Perkin Elmer, FosterCity, CA) в стандартном буфере и в условиях температурных циклов (30 с при 94 С, 1 мин при 65 С, 1 мин при 72 С - 30 циклов). Затем полученные продукты очищали на колонкахQiagen Qia-quick (Qiagen GmbH, Hilden: Германия). Матрица В (двухцепочечная матрица, которая включает последовательности группового праймера, соответствующие СР) была сформирована с 0,1 нг матрицы 3,2-т.п.н., 1 мкМ праймеров ТРВ 1 и 1 мкМ ТРВ 2 с 1 ед. ДНКполимеразы (AmpliTaq: Perkin Elmer, FosterCity, CA) в стандартном буфере и в условиях температурных циклов (30 с при 94 С, 1 мин при 65 С, 1 мин при 72 С - 30 циклов). Затем полученные продукты очищали на колонкахQiagen Qia-quick (Qiagen GmbH, Hilden: Германия). Матрица В' (двухцепочечная матрица,включающая по любому концу последовательности групповых праймеров, соответствующиеCP и СР) была сформирована с 0,1 нг матрицы 3,2-т.п.н., 1 мкМ праймеров ТРВ 3 и 1 мкМ ТРВ 4 с 1 ед. (AmpliTaq: Perkin Elmer, FosterCity, CA) в стандартном буфере и в условиях температурных циклов (30 с при 94 С, 1 мин при 65 С, 1 мин при 72 С - 30 циклов). Затем полученные продукты очищали на колонкахQiagen Qia-quick (Qiagen GmbH, Hilden: Германия). Все специфические олигонуклеотиды, использовавшиеся для получения ДНК-матриц и для формирования колоний ДНК, представлены в табл. 1 наряду с любыми химическими модификациями. Общая схема, отображающая химическое присоединение групповых праймеров и матриц к стеклянной поверхности, представлена на фиг. 2b, где показана дериватизация ATS (аминопропилтриэтоксисиланом), что не является в чемлибо ограничивающим примером. Таблица 1 Перечень олигонуклеотидов, использованных для получения матриц и формирования колоний Пример 1 а. Получение случайной ДНКматрицы, фланкированной вырожденным праймером. ДНК-фрагмент длиной 3,2 т.п.н. был взят в качестве модельной системы для того, чтобы продемонстрировать возможность формирования колоний путем ПЦР-амплификации со случайным праймером. Эта стратегия может быть применена для секвенирования фрагментов ДНК длиной приблизительно 100 т.п.н., а при сочетании фрагментов - к полному геному. ДНК-фрагмент 3,2-т.п.н. был сформирован с помощью ПЦР на материале геномной ДНК человека с ПЦР-праймерами: ТР 1 - 5'pGAGGCCAGAACAGTTCAAGG, ТР 2 - 5'pCCTGTGACAAGACGACTGAA, в соответствии с описанным в примере 1. Фрагмент 3,2 т.п.н. был разрезан на более мелкие фрагменты с помощью комбинаций рестриктаз (EcoRl иHhal с выходом 4 фрагментов ориентировочной длиной по 800 п.н.). Разрезанные или неразрезанные фрагменты ДНК затем смешивали с вырожденным праймером р 252(5'pTTTTTTTTTTISISISISISIS, где I обозначает инозин, комплементирующий с А, Т и С, a S обозначает G либо С) и ковалентно соединяли с лунками Nucleolink (Nunc, Дания). Затем пробирки подвергали случайной твердофазной ПЦР-амплификации и их визуализовали помеченными ДНК-зондами в соответствии с описанным в примере 2 а. Пример 2. Ковалентное связывание ДНКматриц и групповых праймеров на твердой подложке (пластик) и образование колоний с групповым праймером. 42 Ковалентное связывание матрицы и группового праймера на твердой подложке (пластик). Групповой праймер СР 2 (5'-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG),фосфорилированный по его 5'-концу (Microsynth GmbH, Швейцария), был присоединен к лункам пластикового микротитровального планшета Nucleolink (Nunc, Дания) в присутствие варьирующихся доз матрицы А (полученной в соответствии с описанным в примере 1). Восемь лунок занимали в двух повторностях семью десятикратными разведениями матрицы с СР 2, начиная с наивысшей концентрации в 1 нМ. Микротитровальные лунки, к которым ковалентно присоединяли групповой праймер СР 2 и матрицу, были получены следующим образом. В каждую лунку Nucleolink добавляли по 30 мкл 1 мкМ раствора группового праймера с варьирующимися концентрациями матрицы, разведенными от 1 нМ в 10 мМ 1-метилимидазола(рН=7,0) (Sigma Chemicals). В каждой лунке 10 мкл 40 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (рН=7,0) (Sigma Chemicals) в 10 мМ 1-метилимидазола добавляли к раствору группового праймера и матрицы. Затем лунки запаивали и инкубировали при 50 С в течение ночи. После инкубации лунки дважды промывали 200 мкл RS (0,4N NaOH, 0,25% Твин-20),инкубировали в течение 15 мин с 200 мкл RS,дважды промывали в 200 мкл RS и дважды - в 200 мкл TNT (100 мМ Трис-НСl - рН=7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% Твин-20). Пробирки высушивали при 50 С и хранили в герметично закрытом пластиковом контейнере при 4 С. Формирование колоний. Рост колоний инициировали в каждой лунке добавлением 20 мкл ПЦР-смеси: четыреdNTP (0,2 мМ), 0,1% БСА (бычий сывороточный альбумин), 0,1% Твин-20, 8% ДМСО (диметилсульфоксид, Fluka, Швейцария), 1 х ПЦРбуфер и 0,025 ед./мкл ДНК-полимеразы AmpliTaq (Perkin Elmer, Foster City, CA). Лунки затем помещали в амплификатор и рост колоний обеспечивали путем инкубации запаянных лунок в течение 5 мин при 94 С и 50 циклов при следующих условиях: 30 с при 94 С, 2 мин при 65 С и 2 мин при 72 С. По завершении этой программы лунки выдерживали при 8 С до последующего использования. Перед гибридизацией лунки заполняли 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА - рН=7,4), нагревали до 94 С на 5 мин и охлаждали на льду перед добавлением зонда до 45 С. Визуализация колоний. Зонд. Зондом являлся ДНК-фрагмент из 1405 пар нуклеотидов, включающий последовательность матрицы по его 3'-концу (нуклеотиды 8405-9259). ДНК-зонд был синтезирован с помощью ПЦР с использованием двух праймеров: р 47 (5'-GGCTAGGAGCTGAGGAGGAA), ам 43 плифицированный от нуклеотида 8405, и ТР 2,биотинилированный по 5'-концу, амплифицированный от нуклеотида 9876 антисмысловой цепи. Гибридизация и детекция. Зонд разводили до 1 нМ в "easyhyb" (Boehringer Mannheim, Германия), и в каждую лунку добавляли по 20 мкл. Зонд и колонии денатурировали при 94 С в течение 5 мин и затем инкубировали в течение 6 ч при 50 С. Избыток зонда отмывали при 50 С в 2xSSC с 0,1% Твин. ДНК-зонды связывали с покрытыми авидином флуоресцирующими зеленым светом флуоросферами диаметром 0,04 мкм (Molecular Probes) в TNT в течение 1 ч при комнатной температуре. Избыток шариков отмывали с помощью TNT. Колонии визуализовали с помощью микроскопа, анализ изображения проводили в соответствии с описанным в примере 2 а. На фиг. 3 показано число колоний, полученных в расчете на 20 х область, как функция концентрации матрицы, связанной с лункой. Наименьшая концентрация выявляемой матрицы соответствует 10-13 М. Пример 2 а. Ковалентное связывание ДНКматриц и групповых праймеров на твердой подложке (пластик) и образование колоний с помощью вырожденного праймера. Ковалентное связывание матрицы и группового праймера на твердой подложке (пластик). Микротитровальные лунки с р 252 и фрагментами ДНК-матрицы получали следующим образом. В каждую лунку Nucleolink вносили по 30 мкл 1 мкМ раствора группового праймера р 252 с варьирующейся концентрацией матрицы, разводимой от 0,5 нМ в 10 мМ 1-метилимидазола(рН=7,0) (Sigma Chemicals). В каждой лунке 10 мкл 40 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (рН=7,0) (Sigma Chemicals) в 10 мМ 1-метилимидазола добавляли к раствору группового праймера и матрицы. Затем лунки запаивали и инкубировали при 50 С в течение ночи. После инкубации лунки дважды промывали 200 мкл RS (0,4N NaOH, 0,25% Твин-20),инкубировали в течение 15 мин в 200 мкл RS,дважды промывали в 200 мкл RS и дважды - в 200 мкл TNT (100 мМ Трис-НСl - рН=7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% Твин-20). Пробирки высушивали при 50 С и хранили в герметически закрытом пластиковом контейнере при 4 С. Формирование колоний. Формирование колоний ДНК осуществляли в модифицированном протоколе, чтобы обеспечить случайный прайминг каждой лунки,используя 20 мкл ПЦР-смеси: четыре dNTP (0,2 мМ каждого), 0,1% БСА, 0,1% Твин-20, 8% ДМСО (диметилсульфоксид, Fluka, Швейцария), 1 х ПЦР-буфер и 0,025 ед./мкл ДНКполимеразы AmpliTaq (Perkin Elmer, Foster City,CA). Затем лунки помещали в амплификатор и амплификацию проводили путем инкубации 44 запаянных лунок в течение 5 мин при 94 С и в 50 повторяющихся циклах при следующих условиях: 30 с при 94 С, 2 мин при 65 С и 2 мин при 72 С. По завершении этой программы лунки выдерживали при 8 С до последующего использования. Перед гибридизацией лунки заполняли 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА - рН=7,4), нагревали до 94 С на 5 мин и охлаждали на льду до 45 С перед добавлением зонда. Визуализация колоний. Зонды. Два фрагмента из 546 и 1405 пар нуклеотидов, включающие последовательности одного из концевых участков исходной матрицы, амплифицировали с помощью ПЦР. Антисмысловую цепь данного зонда помечали биотином, для чего использовали 5'-биотинилированный ПЦР-праймер. Нуклеотидные координаты этих зондов таковы: 6550-7113 и 6734-9805. Гибридизация и детекция. Зонды разводили до 1 нМ с помощью "easyhyb" (BoehringerMannheim, Германия) и добавляли по 20 мкл в каждую лунку. Зонд и колонии денатурировали при 94 С в течение 5 мин и затем инкубировали в течение 6 ч при 50 С. Избыток зондов отмывали при 50 С в 2xSSC с 0,1% Твин. ДНКзонды связывали на покрытых авидином флуоресцирующих зеленым светом флуоросферах диметром 40 нанометров (Molecular Probes,Portland, OR) в TNT в течение 1 ч при комнатной температуре. Избыток шариков отмывали сTNT. Флуоресценцию детектировали с использованием инверсионного микроскопа (с использованием просветляющего объектива 20 х/0,400LD Archoplan, микроскоп Axiovert S100TV, с дуговой ртутной лампой НВО 100W/2, CarlInc., Trenton, NJ, США). Экспозиция составила 20 с через систему фильтров XF22 (Ex: 485DF22, Dichroic: 505DRLPO2 Em: 530DF30) иInstruments Inc., Trenton, NJ, США). Количество колоний в расчете на поле зрение подсчитывали в дупликатных лунках с помощью программы для анализа изображений собственной разработки. Пример 3. Разграничение последовательностей различных колоний, происходящих от различных соотношений двух разных ковалентно присоединенных матриц и группового праймера. Ковалентное связывание матриц и группового праймера на твердой подложке (пластик). Групповой праймер СР 2 (5'-pTTTTTT 45 микротитровальным лункам Nucleolink (Nunc,Дания) в присутствии варьирующихся доз двух матриц А и В (полученных в соответствии с описанным в примере 1). Серии по 8 лунок подбирали в трех повторностях с семью десятикратными разведениями обеих матриц, начиная с наивысшей концентрации 1 нМ. Разведения матриц выстраивали в противоположных направлениях таким образом, чтобы наивысшая концентрация одной матрицы совпадала с наименьшей концентрацией другой. Микротитровальные лунки, с которыми были ковалентно связаны праймер СР 2 и обе матрицы, получали следующим образом. В каждую лунку Nucleolink вносили по 30 мкл 1 мкМ раствора праймера СР 2 с варьирующимися концентрациями обеих матриц, разведенных в меньшие концентрации от 1 нМ в 10 мМ 1 метилимидазола (рН=7,0) (Sigma Chemicals). В каждой лунке 10 мкл 40 мМ 1-этил-3-(3 диметиламинопропил)карбодиимида (рН=7,0)(рН=7,0) добавляли к раствору группового праймера и матриц. Затем лунки запаивали и инкубировали при 50 С в течение 4 ч. После инкубации лунки промывали трижды 50 мкл RS(0,4N NaOH, 0,25% Твин-20), инкубировали в течение 15 мин в 50 мкл RS, трижды промывали в 50 мкл RS и трижды - в 50 мкл TNT (100 мМ Трис-НСl - рН=7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% Твин 20). Пробирки хранили в TNT при 4 С. Формирование колоний. Рост колоний инициировали в каждой лунке с 20 мкл ПЦР-смеси: четыре dNTP (0,2 мМ), 0,1% БСА, 0,1% Твин-20, 8% ДМСО (диметилсульфоксид, Fluka, Швейцария), 1 х ПЦРбуфера и 0,025 ед./мкл ДНК-полимеразы AmpliTaq (Perkin Elmer, Foster City, CA). Лунки затем помещали в амплификатор и рост колоний осуществляли путем инкубации запаянных лунок в течение 5 мин при 94 С и 50 повторяющихся циклов при следующих условиях: 30 с при 94 С, 5 мин при 65 С и 5 мин при 72 С. По завершении этой программы лунки выдерживали при 8 С вплоть до последующего использования. Перед гибридизацией лунки заполняли 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА - рН=7,4), нагревали до 94 С на 5 мин и охлаждали на льду до 50 С перед добавлением зонда. Визуализация колоний. Зонд. Два ДНК-фрагмента длиной 546 и 1405 пар нуклеотидов, соответствующих последовательностям ДНК-фрагмента 3,2-т.п.н. по его 5'- и 3'-концам, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием одного биотинилированного праймера (см. пример 2) Два зонда денатурировали нагреванием при 94 С в течение 5 мин, быстро охлаждали в 1 М NaCl, 10 мМ Трис,рН=7,4 и оставляли связываться с покрытыми стрептавидином флуоросферами диаметром 0,04 мкм, помеченными различными цветами, в те 004271 46 чение 2 ч при 4 С. Связанные с шариками зонды разводили 20-кратно в растворе "easyhyb", предварительно нагретом до 50 С. По 20 мкл зондов добавляли в каждую лунку, содержащую денатурированные колонии. Гибридизация и детекция. Гибридизацию проводили при 50 С в течение 5 ч. Избыток зондов отмывали при 50 С в 2xSSC с 0,1% ДСН. Колонии визуализовали под микроскопом с объективом 20 х при 20-секундной экспозицией и анализировали изображения в соответствии с описанным в примере 2 а. На фиг. 4 а показаны изображения колоний, полученные для обеих матриц и негативных контролей. На фиг. 4b показаны колонии для обеих матриц в том же положении той же лунки, визуализованной в двух различных цветах, и негативные контроли. На фиг. 4 с показаны координаты колоний обоих типов при разделении поля зрения микроскопа. Фиг. 4 с показывает, что колонии для разных матриц не совпадают. Пример 4. Ковалентное связывание ДНКматриц и олигонуклеотидов на стеклянных твердых подложках. Аминосилан-производные предметные стекла были использованы в качестве твердой подложки для ковалентного присоединения модифицированных тиоловой группой олигонуклеотидных зондов с использованием гетеробифункциональных перекрестно-сшивающих агентов. Отобранные реагенты имеют тиолреактивные (имид малеиновой кислоты) и амино-реактивные (сложный сукцинимидиловый эфир) группы. Выход присоединения олигонуклеотидов и стабильность иммобилизованных молекул будет в значительной степени зависеть от стабильности сшивателя по отношению к условиям различных проводимых обработок. Схемы реакций ДНК-матриц или прикрепления олигонуклеотидов к стеклу показаны на фиг. 5. Была проведена оценка стабильности при хранении предметных стекол, приготовленных со сшивателями s-MBS и s-SIAB, и их термостабильности. Важным фактором, влияющим на уровень гибридизуемости иммобилизованных олигонуклеотидных зондов, является плотность прикрепленных зондов (Beattie et al., 1995; Josset al., 1997). Авторы изобретения изучили этот эффект путем варьирования концентрации олигонуклеотидов в ходе иммобилизации и оценки плотности прикрепленных олигомеров с помощью гибридизации. Материалы и методы. Кислотная предобработка микроскопных предметных стекол. Микроскопные предметные стекла (Knittel, Merck ABS) замачивали маточным раствором Helmanex в течение 1 ч (HelmanexII 0,25%, 1N NaOH). Стекла промывали водой, погружали на ночь в 1N НСl, опять промывали водой и обрабатывали в течение 1 ч раствором серной кислоты (H2SO4/H2O - 1:1, об/об,с добавлением небольшого количества свежего 47 персульфата аммония). Стекла промывали водой, этанолом и, наконец, чистым ацетоном. Предметные стекла высушивали и хранили под вакуумом для дальнейшего использования. Силанизация поверхности. Предобработанные предметные стекла погружали в 5%-ный раствор ATS (аминопропилтриэтоксисилан: Aldrich) в ацетоне. Силанизацию осуществляли при комнатной температуре в течение 2 ч. После трехкратной промывки в ацетоне (5 мин каждая промывка) стекла один раз промывали этанолом, высушивали и хранили под вакуумом. Прикрепление сшивателей. Сшиватели sMBS и S-SIAB (соответственно, сульфатированный сложный эфир m-малеимидобензоил-Nгидроксисукцинимида и сульфатированный Nсукцинимидил-[4-иодацетил]-аминобензоат:NaH2PO4, pH=7,2, 0,15 М NaCl). Силанизованные предметные стекла, на которые наносили по 80 мкл раствора сшивателя, накрывали чистыми покровными стеклами и реакцию проводили в течение 5 ч при 20 С. Предметные стекла промывали в ФСБ, быстро погружали в воду и промывали этанолом. Затем стекла высушивали и хранили под вакуумом в темноте для дальнейшего использования. Прикрепление олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды синтезировали модифицированными по 5'-концу тиоловой (СР 3 и СР 4: Eurogentec,Brussels) или фосфатной (СН 1 и СР 2: Eurogentec, Brussels) составляющими с применением стандартной фосфоамидитной химии. Олигонуклеотидные праймеры с 5'-тиолом(СР 3 и СР 4) получали как растворы 100 мМ в фосфатно-солевом буфере (NaPi: 0,1 М NaH2PO4,рН=6,6, 0,15 М NaCl) и капли по 1 мкл наносили на функционализованное предметное стекло(функционализованное сшивателем) в течение 5 ч при комнатной температуре. Предметные стекла выдерживали в атмосфере, насыщенной влагой, для предотвращения испарения. Предметные стекла промывали в шейкере в буфереNaPi. Для анализа термостабильности предметные стекла дважды погружали в буфер Трис (10 мМ - рН=8) в течение 5 мин при 100 С и сразу погружали в 5xSSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрата натрия - рН=7) при 4 С в течение 5 мин. Стекла хранили в 5xSSC при 4 С для дальнейшего использования. Олигонуклеотидные праймеры с 5'фосфатом (СР 1 и СР 2) наносили (каплями по 1 мкл) в течение 5 ч при комнатной температуре на аминопроизводные стекла в виде 1 мкМ раствора в 10 мМ 1-метилимидазола (рН=7,0)Pierce, Rockford, IL). Предметные стекла промывали 2 раза при 100 С в буфере Трис (10 мМ рН=8) и сразу погружали в 5xSSC при 4 С на 5NaH2PO4 - рН=6,6, 0,15 М NaCl). Концентрация ДНК-матрицы варьировалась от 0,001 до 1 мкМ и от 0,1 до 100 мкМ праймеров, но была оптимизована на уровне 1 и 100 мкМ, соответственно, для матрицы и праймеров. После этого проводили описанную выше процедуру присоединения СР 3 и СР 4 к функционализованной стеклянной поверхности. Олигонуклеотидные праймеры с 5'фосфатом (СР 1 и СР 2) и матрицу В с 5'фосфатом смешивали в 10 мМ растворе 1 метилимидазола (рН=7,0) (Sigma Chemicals),содержащем 40 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC: Pierce, Rockford,IL). Концентрация ДНК-матрицы варьировалась от 0,001 до 10 нМ, а праймеров - от 0,1 до 1 мкМ, но в конечном счете она была оптимизована на уровне 10 нМ и 1 мкМ, соответственно,для матрицы и праймеров. После этого осуществляли описанную выше процедуру присоединения СР 1 и СР 2 к аминопроизводной стеклянной поверхности. Гибридизация с флуоресцентными зондами. Олигонуклеотидные зонды, флуоресцентно помеченные Су 5 или FITC по их 5'-концам, синтезировали на фирме Eurogentec (Brussels). Для предотвращения неспецифичной гибридизации предметные стекла инкубировали с блокирующим раствором (5xSSC, 0,1% Твин, 0,1% БСА) в течение 1 ч и промывали в шейкере 5xSSC (2 раза по 5 мин). Олигонуклеотидные зонды разбавляли до 0,5 мкМ в 5xSSC, 0,1% Твин и наносили на стеклянную поверхность на 2 ч при комнатной температуре. Предметные стекла промывали в шейкере при 37 С один раз в 5xSSC в течение 5 мин и дважды в 2xSSC, содержащем 0,1% ДСН, в течение 5 мин. Гибридизация с радиоактивными зондами. Радиоактивно помеченные олигонуклеотиды,комплементарные ковалентно связанным олигонуклеотидам, использовали в качестве гибридизационных зондов с целью количественной оценки выхода гибридизации. Олигонуклеотиды ферментативно помечали по их 5'-концам -32PdATP (Amersham, Великобритания) с использованием полинуклеотидкиназы фага Т 4 (NewEngland Biolabs, Beverly, MA). Избыток -32PdATP удаляли на колонке Chroma Spin ТЕ-10(Clontech, Palo Alto, CA). Радиоактивно помеченные олигонуклеотиды (0,5 мкМ в 5xSSC,0,1% Твин) затем наносили на производные предметные стекла на 2 ч при комнатной температуре. Предметные стекла промывали в шейкере один раз в 5xSSC в течение 5 мин и дважды в 49 2xSSC, 0,1% ДСН в течение 5 мин при 37 С. После гибридизации специфическую активность определяли путем подсчета сцинтилляций. Микроскопическое наблюдение. Предметные стекла накрывали раствором 5xSSC и покровными стеклами. Флуоресценцию детектировали с использованием инверсионного микроскопа модели Axiovert S100TV, оснащенного дуговой ртутной лампой НВО 100W/2 (CarlKodak формата 768(Н)х 512(V) пикселей с общей площадью 6,91 х 4,6 мм при размере пикселя 9 х 9 мкм 2 (Princeton Instruments Inc., Trenton, NJ,США). Время экспозиции составляло от 1 до 50 с с использованием просветленного объективаXF47 (Ex: 640DF20, Dichroic: 670DRLPO2 Em: 682DF22) от Omega Optical (Brattleboro, VT) для флуорофоров FITC и Су 5, соответственно. Данные анализировали с помощью программы Winview (Princeton Instruments Inc., Trenton, NJ,США). Результаты Оценка стабильности прикрепления при хранении и термостабильности. Авторы оценили стабильность при хранении предметных стекол, приготовленных с sMBS и s-SIAB. Поскольку эти реагенты чувствительны к гидролизу, эффективность присоединения олигонуклеотидов будет зависеть от их стабильности. Аминопроизводные стеклянные пластины функционализовали свежеполученными перекрестно-сшивающими реагентами - sMBS и s-SIAB. Функциолизованные предметные стекла хранили после присоединения сшивателей в течение 10 дней в эксикаторе под вакуумом в темноте при комнатной температуре. По прошествии этого времени анализировали хранящиеся (в течение 10 дней) стекла и свежеполученные стекла с перекрестно-сшивающими реагентами (время 0). Результаты, полученные после реакции тиоловых олигонуклеотидов и гибридизации с комплементарным флуоресцентным зондом, сравнивали по времени 0 и 10 дней для обоих химических вариантов. После иммобилизации стекла, функционализованные s-SIAB, были полностью стабильными после 10 дней хранения, на что указывает одинаковый выход гибридизации во время 0 и 10 дней. Напротив, соединение s-MBS со стеклом оказалось менее стабильным при 30%-ной потере выхода прикрепления олигонуклеотидов и гибридизации спустя 10 дней хранения. Как заключение, стекла, функционализованные sSIAB, предпочтительны потому, что они могут быть получены заранее и храниться сухими под вакуумом в темноте в течение по крайней мере 10 дней без какого-либо снижения эффективности прикрепления зондов. 50 Для оценки термостабильности олигонуклеотидов, присоединенных к стеклу, предметные стекла подвергали двум пятиминутным воздействиям температуры 100 С в 10 мМ ТрисНСl - рН=8. Остающийся олигонуклеотид, все еще иммобилизованный после этих промывок,анализировали путем гибридизации с флуоресцентно помеченным комплементарным олигонуклеотидом. Примерно 14% присоединенных молекул высвобождается с предметных стекол сs-SIAB и 17% с предметных стекол с s-MBS после первой 5-минутной промывки, однако, при обоих химических реагентах дальнейшего высвобождения после второй промывки отмечено не было (табл. 1 А). Эти данные явились обнадеживающими по сравнению результатами, полученными Chrisey et al., 1996, согласно которым высвобождение превышало 62% от олигонуклеотидов, прикрепленных к слитым силанизованным предметным стеклам через сшиватель(сукцинимидил-4-[р-малеимидофенил] бутират), при измерении после 10-минутной обработки ФСБ при 80 С. Таблица 1 А Результаты гибридизации (в условных единицах, соотнесенных к 100%) СвежеприЧерез 5 мин Через две 5 соединен- промывки при минутные промывный 100 С ки при 100 С Таблица 1 А. Анализ термостабильности. Олигонуклеотиды были присоединены к предметным стеклам, функционализованным либо s-MBS, либо s-SIAB. Присоединенные олигонуклеотиды анализировали путем гибридизации с флуоресцентно помеченным комплементарным олигонуклеотидом. Сигнал флуоресценции был принят за 100 при его наибольшем выявленном уровне. Приведены средние значения по данным анализа в трех повторностях. Гибридизация как функция присоединения зонда. Авторы изобретения исследовали степень гибридизации ковалентно связанных олигонуклеотидных зондов, как функцию покрытия поверхности присоединенными олигонуклеотидами, с использованием сшивателей s-MBS и sSIAB и EDC-опосредованных реакций. Концентрация олигонуклеотидов, используемых для иммобилизации, составила 1 мкМ для EDC и варьировалась от 1 до 800 мкМ для сшивателей,а поверхностную плотность оценивали по гибридизации с 32 Р-помеченными зондами. Оптимальная концентрация для присоединения праймера с использованием гетеробифункциональных сшивателей составила 500 мкМ, что соответствует поверхностной плотности гибридизованных молекул на уровне 60 фкмоль/мм 2 для s-MBS и 270 фкмоль/мм 2 для s-SIAB. Сходная плотность покрытия, как и в случае с s 51MBS, была выявлена с использованием присоединения олигонуклеотидов с 5'-фосфатами к аминосиланированному стеклу, опосредованного EDC-имидазолом. Однако, только растворы олигонуклеотидов 1 мкМ были необходимы для достижения того же выхода прикрепления, что соответствует 500-кратному избытку олигонуклеотида, необходимого для прикрепления с агентом s-MBS по сравнению со стратегией связывания с помощью EDC-имидазола (табл. 1 В). Таблица 1 В Концентрация олигонуклеоти да, используемого для присоединения, мкМ 1 100 500 Таблица 1 В. Гибридизация как функция присоединения зонда. Олигонуклеотиды были присоединены к предметным стеклам, функционализованным либо s-MBS, либо s-SIAB, либо через активацию реагентом EDC. Присоединенные олигонуклеотиды анализировали путем гибридизации с радиоактивно помеченным комплементарным олигонуклеотидом. Специфическую активность и, следовательно, плотность гибридизованных молекул определяли в сцинтилляционной жидкости. NT - не исследовали. Плотность 60 фкмоль/см 2 соответствует среднему молекулярному пространству между связанными олигонуклеотидами в 8 нм. В соответствии с полученными результатами, плотности покрытия в 30 фкмоль/мм 2 (расстояние 20 нм) достаточно для формирования колоний ДНК. Такой выход может быть получен путем иммобилизации праймеров при 100 мкМ с использованием гетеробифункционального сшивателя s-SIAB или 1 мкМ зондов с использованием метода с EDC. Полученные авторами настоящего изобретения плотности гибридизации находятся в диапазоне наивысших плотностей,получаемых на предметных стеклах в других методах прививания, описанных ранее (Guo etal., 1994; Joss et al., 1997; Beattie et al., 1995). Формирование колоний ДНК на стекле: зависимость формирования колоний от длины и концентрации матрицы и от концентрации праймеров. Теоретически для формирования колоний ДНК необходима подходящая плотность праймеров, присоединенных к поверхности, в соответствии с подходящей длиной ДНКматрицы. Для оптимального формирования колоний ДНК важно определить диапазон плотностей связанных праймеров и матриц, равно как и стехиометрическое отношение между матрицей и праймером. 52 Материалы и методы Получение предметных стекол. Предметные стекла были дериватизованы и функционализованы в соответствии с описанным выше (Материалы и методы). Групповыми ДНК-праймерами были СР 1 и СР 2. Матрицы колоний были получены в соответствии с описанным в примере 1 для матрицы В', но с использованием праймеров ТРВ 3 и ТВР 2. Модифицированные групповые праймеры и матрицы наносили на стеклянную поверхность при различных концентрациях группового праймера и групповой матрицы. Формирование колоний. Предметные стекла, хранящиеся в 5xSSC,промывали в микрофильтрованной воде с целью удаления солей. Рост колоний инициировали на стеклянной поверхности ПЦР-смесью: четыре dNTP (0,2 мМ), 0,1% БСА, 0,1% Твин-20, 1 х ПЦР-буфер и 0,05 ед./мкл ДНК-полимеразы(MJ Research, Watertown, MA). Предметные стекла помещали в амплификатор (The DNAEngine, MJ Research, Watertown, MA) и применяли следующие температурные циклы; стадия 1 - 1 мин при 94 С, стадия 2-3 мин при 65 С,стадия 3 - 6 мин при 74 С, и эту программу повторяли 50 раз. По завершении этой программы предметные стекла выдерживали при 6 С до дальнейшего использования. Расщепление колоний двухцепочечных ДНК. Стеклянные поверхности, на которых находится ДНК, расщепляли рестриктазой путем накрытия рестриктазой в расщепляющем буфере 1 х. Реакцию проводили дважды в течение полутора часов при 37 С. Колонии двухцепочечной ДНК денатурировали двукратным погружением предметных стекол в Трис-буфер (10 мМ - рН=8) при 100 С в течение 5 мин с последующим промывали в 5xSSC при 4 С. Предметные стекла хранили в 5xSSC для дальнейшего использования. Гибридизация колоний одноцепочечных ДНК. Для предотвращения неспецифической гибридизации предметные стекла инкубировали с блокирующим раствором (5xSSC, 0,1% Твин,0,1% БСА) в течение 1 ч и стекла споласкивали в 5xSSC (2 раза по 5 мин). Олигонуклеотид, по 5'-концу флуоресцентно помеченный Су 5 (Eurogentec, Brussels), разводили до 0,5 мкМ в 5xSSC,0,1% Твин и наносили на стеклянную поверхность по крайней мере на 2 ч. Предметные стекла один раз промывали в шейкере в 5xSSC в течение 5 мин и дважды в 5xSSC, 0,1% ДСН в течение 5 мин при 37 С. Визуализацию предметных стекол проводили в соответствии с описанным выше. Авторами изобретения ранее было выявлено, что степень гибридизации является функ 53 цией плотности прикрепления олигонуклеотидов. Аналогичный анализ со связанными ДНКматрицами показал, что формирование колоний также является функцией концентрации матрицы, прикрепленной к предметному стеклу. В зависимости от химического агента, использованного для прикрепления олигонуклеотида и матрицы, оптимальная концентрация матрицы составляет 1 мкМ для бифункциональных сшивателей s-MBS (фиг. 6 В) и 1 нМ для EDCкарбодиимида (фиг. 6 А). Интересно, что более высокая концентрация матрицы не приводит к увеличению числа колоний в случае с EDC,т.к. соответствующее максимальному числу колоний плато, по-видимому, уже достигнуто. Авторы исследовали число формирующихся колоний, как функцию концентрации праймеров, концентрации ДНК-матрицы, нанесенной на поверхность, и длины ДНК-матрицы. Также авторы оценили число копий матрицы в каждой колонии. Количественный анализ основывался на анализе флуоресценции помеченных Су 5, Су 3 или флуоресцеином флуорофоров, дополненных противообесцвечивающим реагентом (Prolong, Molecular Probes,Portland, OR). Калибровка была проведена по данным гибридизационных экспериментов на праймерах, присоединенных к поверхности, с точным определением соответствующей плотности по уровню радиоактивности. Пример 5. Секвенирование ДНК в колониях in situ. Предметные стекла (диаметром 5 мм: Verrerie de Carouge, Швейцария) вначале помещали в баню с 0,2% Helmanex (в H2O), 1N NaOH на 1 ч при комнатной температуре, промывали дистиллированной водой, промывали чистым гексаном, промывали вновь дважды дистиллированной водой и обрабатывали 1 М НСl в течение ночи при комнатной температуре. Затем их дважды промывали дистиллированной водой и обрабатывали H2SO4 (50%) + K2S2O8 в течение 1 ч при комнатной температуре. Стекла промывали дистиллированной водой и затем дважды этанолом. Предметные стекла дериватизовали с использованием ATS (в соответствии с описанным в примере 4). Групповые праймеры СР 1 (S'-pTTTTTTAAGGGAAAGGG), которые были 5'-фосфорилированы (Microsynth GmbH, Швейцария), и ДНК-матрицу В (полученная в соответствии с описанным в примере 1) ковалентно присоединяли по 5'-концам к предметным стеклам диаметром 5 мм (Verrerie de Carouge, Швейцария) до конечных концентраций 1 мкМ и 10 нМ, соответственно, следующим образом: 2 нмоль каждого праймера добавляли к 0,2 нмоль матрицы в 1 мл раствора А (41 мкл метилимидазола- Sigma,М-8878, в 50 мл Н 2 О, рН доводится до 7 с помощью НСl) и затем смешивали 1:1 с 54 раствором D (0,2 мМ EDC в 10 мл раствора А). На обе стороны предметного стекла наносили по 3,5 мкл полученной смеси и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Предметные стекла затем быстро промывали буфером 5xSSC и помещали при 100 С в 10 мМ буфера Трис при рН=8,0 дважды по 5 мин. Неспецифические сайты связывания на стекле блокировали бычьим сывороточным альбумином (БСА: Boehringer Mannheim GmbH,Германия:238040) при 1 мг/мл в 5xSSC в течение 1 ч при комнатной температуре и затем промывали дистиллированной водой. Затем предметные стекла по отдельности помещали в реакционную пробирку Microamp(Perkin Elmer), содержащую 170 мкл ПЦРсмеси, а затем колонии ДНК формировали с использованием Taq-полимеразы (AmpliTaq, РЕApplied Biosystems Inc., Foster City, CA) в 50 циклах (60 с при 94 С, 3 мин при 60 С, 6 мин при 72 С) в амплификаторе МТС-200 (MJ Research, Watertown, MA). Каждое предметное стекло дважды обрабатывали 1,3 ед. рестриктазы PvuII (Stratagene) в буфере NEB-2 (New England Biolabs) в течение 45 мин при 37 С. После расщепления рестриктазой пробирки помещали при 100 С в 10 мМ буфера Трис, рН=8,0, на 2 раза по 5 мин, а затем блокировали 1 мг/мл отфильтрованным (Millex GV4, Millipore) БСА в буфере 2xSSC в течение 30 с при комнатной температуре и промывали сначала в 2xSSC,0,1% ДСН и затем - в буфере 5xSSC. Каждое предметное стекло инкубировали в течение ночи при комнатной температуре с буфером 5xSSC, 0,1% Твин-20, содержащем 1 мкМ секвенационного праймера р 181 (CGACAGCCGGAAGGAAGAGGGAGC), в течение ночи при комнатной температуре. Контроли без праймера выдерживали в буфере 5xSSC, 0,1% Твин-20. Предметные стекла 2 раза промывали в 5xSSC, 0,1% ДСН при 37 С в течение 5 мин и промывали в 5xSSC. Праймер р 181 способен гибридизовать с матрицей В', а последовательность после р 181 такова: CAGCT С целью облегчения фокусировки флуоресцирующие зеленым цветом шарики были использованы для адсорбции на дно лунки путем инкубации каждой лунки с 20 мкл разведения 1:2000 200 нм покрытых стрептавидином, флуоресцирующих желтым/зеленым цветом шариков FluoSpheres(Molecular Probes, Eugene, OR) в 5xSSC в течение 20 с при комнатной температуре. После гибридизации с праймером на каждое предметное стекло добавляют 2 мкл раствора, содержащего 0,1% БСА, 6 мМ дитиотреитола (Sigma Chemicals), 5 мкМ Cy5-dCTP или 5 мкМ Cy5-dUTP (Amersham, Великобритания) и 1 х секвеназного реакционного буфера. Присоединение Су 5-нуклеотида инициируют добавлением 1,3 ед. ДНК-полимеразы Т 7 Sequenase (Amersham, Великобритания) на 2 мин при комнатной температуре. Лунки промы 55 вают 2 раза в бане 5xSSC, 0,1% ДСН в течение 15 мин и промывают в буфере 5xSSC. Образцы были проанализированы с использованием инверсионного микроскопа(Axiovert S100TV, Carl Zeiss AG, Oberkochen,Германия), оборудованного CCD-камерой Micromax 512 х 768 пикселей и программой Winview (Princeton Instruments, Trenton, NJ). Для фокусирования использовали объектив 20 х и набор фильтров XF22 (Omega Optical, Brattleboro, VT), а для выявления включения Су 5 в образцы - объектив 20 х и набор фильтров XF47(Omega Optical) с 50-секундной экспозицией с использованием разбиения на участки 2 х 2 пикселя. Шарики FluoSpheres с желтой/ зеленой флуоресценцией (приблизительно 100 на одно поле зрения) не дают выявляемый сигнал при использовании набора фильтров XF47 и при 50-секундной экспозиции (данные не показаны). Фотографии были получены с помощью программы Winview (Princeton Instruments). На фиг. 7 А показаны результаты инкубации с Cy5-dCTP образца, который не был проинкубирован с праймером р 181. Должно быть понятно, что может быть выявлено только 5 размытых пятен: это указывает на то, что существенный отрицательный эффект отсутствует(такой как осаждение Cy5-dCTP с агрегированием, адсорбция или просто неспецифическое встраивание в ДНК в составе колоний или на поверхности). На фиг. 7 В показаны результаты инкубации с Cy5-dUTP образца, который был проинкубирован с праймером р 181. Должно быть понятно, что флуоресцентные пятна не могут быть выявлены: это указывает на то, что встраивание флуоресцирующего нуклеотида не может иметь место в выявляемых количествах,когда нуклеотид, предложенный для встраивания, не соответствует последовательности данной матрицы после гибридизованного праймера. На фиг. 7 С показаны результаты инкубации сCy5-dCTP образца, который был проинкубирован с праймером р 181. Должно быть понятно,что могут быть выявлены множественные флуоресцентные пятна: это указывает на то, что встраивание флуоресцирующего нуклеотида действительно может иметь место, когда нуклеотид, предложенный для встраивания, соответствует последовательности данной матрицы после гибридизовавшего праймера. Суммируя сказанное, авторы изобретения показали, что возможным является встроить по специфичной для последовательности схеме флуоресцирующие нуклеотиды в состав ДНК, имеющейся в колониях, и проконтролировать это встраивание с описанными устройством и способом. Однако это всего лишь пример. Должно быть понятно, что, если это желательно, встраивание флуоресцирующего нуклеотида можно повторить несколько раз. Если это делать в соответствии с последовательностью, то таким образом будет возможным расшифровать часть последо 004271 56 вательности ДНК, входящей в состав колонии. Пример 6. Анализ последовательности 5'мРНК-метки. Наиболее точный путь контроля за экспрессией генов в клетках или тканях связан со снижением числа стадий от сбора образцов до типирования мРНК. Доступными на коммерческой основе являются новые методы быстрого выделения мРНК. Наиболее эффективные методы включают быстрое выделение образца и немедленное разрушение клеток в растворе гуанидингидрохлорида, который полностью разрушает белки и инактивирует РНКазы. После этого проводят очистку мРНК из надосадочной фракции разрушенных клеток с применением аффинной хроматографии на колонках с олиго-дТ. Наконец кэпированные по 5'-концу мРНК могут быть специфическим образом выбраны и трансформированы в кДНК с использованием простого метода (синтез кДНК по методу SMART:Clontech, Palo Alto). Данный метод позволяет синтезировать копии кДНК только трансляционно активных,5'-кэпированных мРНК. Путем сочетания указанных выше быстрых методов выделения мРНК и получения кДНК со способом основанного на прививании матриц формирования колоний ДНК, описанного в настоящей заявке,авторы получили возможность высокопроизводительной идентификации большого числа последовательностей 5'-мРНК-меток. Преимуществом настоящего изобретения является возможность секвенировать большое число кДНК путем прямого прививания продукта реакции синтеза кДНК, амплификации этой кДНК в тысячи копий с последующим одновременным секвенированием этих кДНК in situ. Материалы и методы Синтетические олигонуклеотиды и плазмиды. Олигонуклеотиды были синтезированы с 5'-фосфатами с помощью Eurogentec или Microsynth. Плазмиды, включающие частичные кодирующие и 3'-нетранслируемые последовательности гена мыши mSlo, кодирующего калиевый канал, после которых находится промотор РНКполимеразы фага Т 3, были сформированы с помощью стандартных методов. Синтез мРНК. Плазмиды mSlo были линеаризованы по единственному рестрикционному SalI- или SacI-сайту, находящемуся в данной плазмиде после полиадениловой последовательности. После обработки разрезанной плазмиды протеинкиназой-К, линейную плазмидную ДНК экстрагировали один раз смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта и осаждали этанолом. Преципитат ДНК вновь растворяли в воде до концентрации 10 мкг/мкл. Синтетическую мРНК, кэпированную 5'метилгуанозином, синтезировали на mMessagemMachine с набором реактивов для синтеза 57 мРНК in vitro в соответствии с инструкциями производителя (Ambion, Austin, TX). Синтетическую мРНК хранили при 80 С. Ферменты. Рестриктазы были получены от фирмы New England Biolabs (Beverly, MA). Синтез кДНК. Синтетическую мРНК смешивали с полиаденилированной мРНК из печени мыши при различных молярных отношениях(1:1, 1:10, 1:100), и синтез кДНК в смеси синтетической и мышиной печеночной мРНК осуществляли с использованием набора для метода(Clontech, Palo Alto, CA) с некоторыми небольшими модификациями. В реакции кДНК приблизительно 1 мкг смеси мРНК смешивали с праймером СР 5, имеющим на 5'-конце последовательность СР (5'-p-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTTNN). Этот праймер был использован для проведения синтеза 1-й цепи кДНК. Для синтеза 2-й цепи был применен метод SMART. Основой синтеза по методу SMART является свойство обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони добавлять от трех до пяти остатков дезоксицитозина к 3'-концам первой цепи кДНК тогда, когда эта мРНК включает 5'-метилгуанозиновый кэп (руководство по применению метода SMART: Clontech, Palo Alto, CA). Праймер СР 6, который включает последовательность СР плюс AAAGGGGG на 3'-конце (5'pAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGG),был использован для синтеза 2-й цепи кДНК. Буфер и обратную транскриптазу с РНКазой-НSUPERSCRIPT II от вируса мышиного лейкоза Молони (Life Technologies Ltd.) использовали в соответствии с описанным в инструкциях, и реакцию проводили при 42 С в течение 1 ч. кДНК анализировали с помощью ПЦР с использованием праймера р 251, который включает фрагмент последовательности СР(5'GAGAAGGAAAGGGAAAGG),с ДНКполимеразой Taq (Platinum Taq, Life Technologies Ltd.). Получение колоний ДНК. 5'-р-кДНК смешивали с различными концентрациями группового праймера СР 2 (5'-р-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG),находящегося в твердой фазе и химически связанного с ПЦР-пробирками Nucleolink (Nunc) в соответствии с инструкциями производителя. Колонии ДНК затем формировали с использованием полимеразы Taq (AmpliTaq Gold, РЕApplied Biosystems Inc., Foster City, CA) в 30 циклах (30 с при 94 С, 1 мин при 65 С, 1,5 мин при 72 С) в амплификаторе МТС-200 (MJ Research, Watertown, MA). ДНК-зонды и гибридизация. Биотинилированные и 32P-радиоактивно помеченные ДНКзонды, специфичные для последовательности ДНК гена mSlo, были синтезированы с использованием 5'-биотинилированного праймера и 58 нормального обратного праймера с помощью ПЦР на матрице (плазмидная ДНК с mSlo). Этот зонд включал -32P-dCTP (Amersham, Великобритания) при отношении -32P-dCTP к dCTP 300:1 в реакции ПЦР при конечной концентрации четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов,равной 50 мкМ. Полученный в результате биотинилированный и радиоактивно помеченный ДНК-зонд обессоливали на колонке Chromaspin1000 (Clontech, Palo Alto, CA). ДНК-зонды гибридизовали с образцами в буфере "easyhyb"(Boehringer Mannheim, Германия) с использованием следующего температурного режима (в амплификаторе МТС-200): 5 мин при 94 С, затем снижая 68 этапами пошагово по 0,5 С каждые 30 с (другими словами, температура была снижена до 60 С через 34 мин), используя запаянные лунки. Затем образцы промывали 3 раза в 200 мкл TNT при комнатной температуре. Лунки затем инкубировали в течение 30 мин с 50 мкл TNT, содержащего 0,1 мг/мл БСА (NewEngland Biolabs, Beverly, MA). Затем лунки инкубировали в течение 5 мин с 15 мкл раствора покрытых стрептавидином, флуоресцирующих красным цветом микросфер диаметром 40 нанометров (Molecular Probes, Portland, OR). Раствор микросфер на основе 2 мкл маточного раствора микросфер, который был обработан ультразвуком в течение 5 мин в ультразвуковой водной бане, мощность 50 Вт (Elgasonic, Bienne,Швейцария), разводили в 1 мл раствора TNT,содержащего 0,1 мг/мл БСА, и отфильтровывали на фильтре Millex GV4 с порами 0,22 мкм(Millipore, Bedford, MA). Визуализация колоний ДНК. Окрашенные образцы наблюдают с использованием инверсионного микроскопа Axiovert-10 с объективом 20 х (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Германия),оборудованного CCD-камерой Micromax с разрешением 512 х 768 пикселей (Princeton Instruments, Trenton, NJ) с использованием набора фильтров PB546/FT580/LP590 при 10-секундной световой экспозиции. Полученные файлы превращают в формат TIFF и переформатируют в подходящую программу (PhotoPaint, Corel Corp.Ltd., Dublin, Ирландия). Обработка состояла в инверсии изображения и повышении линейного контраста с целью получения картинки, пригодной для черно-белой распечатки на лазерном принтере. Результаты Синтез синтетических мРНК и кДНК. После синтеза кДНК эту кДНК проверяли в ПЦР с использованием праймера р 251 (сформированного на каждом конце первой цепи кДНК) на точность длины полученных продуктов в соответствии с данными электрофореза в агарозном геле. Синтетическую мРНК mSlo разбавляли в печеночной мРНК, что подтверждали по уменьшению интенсивности специфичного дляmSlo бэнда и увеличению неспецифичной области печеночной кДНК. Выявление и количественный анализ колоний ДНК. Колонии ДНК анализировали с использованием флуоресцентной микроскопии сCCD или путем подсчета сцинтилляций. Число выявляемых по флуоресценции колоний увеличивалось как функция количества привитой матрицы, что показано на фиг. 6. Это увеличение отражалось количеством выявляемой радиоактивной метки 32P. Используя радиоактивно помеченные зонды, возможным является выявление копий мРНК при соотношении примерно 1:100. Однако с применением флуоресцентной микроскопии с анализом CCD-изображения можно детектировать мРНК при разведении 1:10000. Пример 7. Ковалентное связывание праймера на твердой подложке (пластик). Олигонуклеотидные праймеры были присоединены к пластиковым микротитровальным лункам планшета Nucleolink (Nunc, Дания) с целью определения оптимального времени связывания и химических реагентов. Олигонуклеотиды: СР 2 - 5'-фосфат-TTTTTTTTTTAGAAGTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG (Microsynth GmbH, Швейцария) - были присоединены к микротитровальным лункам Nucleolink следующим образом (по 8 лунок в каждом случае): в каждую лунку вносили по 20 мкл раствора, содержащего 0,1 мкМ олигонуклеотида, 10 мМ 1-метилимидазола (рН=7,0) (Sigma Chemicals) и 10 MM 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (рН=7,0) (Sigma Chemicals) в 10 мМ 1-метилимидазола. Затем лунки запаивали и инкубировали при 50 С в течение различных промежутков времени. Реакцию связывания останавливали в конкретный момент времени путем двукратного промывания в 200 мкл RS (0,4N NaOH, 0,25% Твин-20) и двукратного в 200 мкл TNT (100 мМ Трис-НСl - рН=7,5,150 мМ NaCl, 0,1% Твин-20). Пробирки высушивали при 50 С в течение 30 мин и хранили в закрытом пластиковом контейнере при 4 С. 60 Стабильность связанных олигонуклеотидов в условиях формирования ПЦР-колоний. Стабильность анализировали в условиях роста колоний путем добавления ПЦР-смеси: 20 мкл четырех dNTP (0,2 мМ), 0,1% БСА, 0,1% Твин-20, 8% ДМСО (диметилсульфоксид: Fluka,Швейцария), 1 х ПЦР-буфер. Затем лунки помещали в амплификатор и проводили 33 цикла при следующих условиях: 45 с при 94 С, 4 мин при 60 С и 4 мин при 72 С. По завершении этой программы лунки промывали в 5xSSC, 0,1% Твин-20 и выдерживали при 8 С до последующего использования. Перед гибридизацией лунки заполняли 50 мкл 5xSSC, 0,1% Твин-20, нагревали до 94 С в течение 5 мин и хранили при комнатной температуре. Зонд. Олигонуклеотидные зонды R57 - 5'фосфат-GTTTGGGTTGGTTTGGGTTGGTG,контрольный зонд - и R58 - 5'-фосфатСССТТТСССТТТССТТСТССТТСТ, - которые комплементарны праймерам СР 2, СР 8, СР 9,СР 10 и CP11, помечали ферментативно по их 5'концам с помощью -32 Р-dАТР (Amersham, Великобритания) с использованием полинуклеотидкиназы бактериофага Т 4 (New England Biolabs, Beverly, MA). Избыток 32P-dATP удаляли на колонке ChromaSpin TE-10 (Clontech, PaloAlto, CA). Радиоактивно помеченные олигонуклеотиды (0,5 мкл в 5xSSC, 0,1% Твин-20) затем гибридизовали на лунках Nucleolink, олигонуклеотид-производных, при 37 С в течение 2 ч. Лунки промывали 4 раза в 5xSSC, 0,1% Твин-20 при комнатной температуре с последующей промывкой в 0,5xSSC, 0,1% Твин-20 в течение 15 мин при 37 С. Затем лунки анализировали на связывание зонда путем подсчета сцинтилляций. Результаты Имеется отчетливое различие в степени и специфичности связывания олигонуклеотида,зависящих от природы 5'-функциональной группы этого олигонуклеотида. Олигонуклеотиды, несущие 5'-аминогруппу, связывались приблизительно вдвое быстрее по сравнению с олигонуклеотидами, функционализованными 5'фосфатной группой (см. табл. 2 и фиг. 8). Кроме того, все контрольные олигонуклеотиды, функционализованные 5'-гидроксилом, 5'-DMT или 5'-биотином, связывались на уровнях, сходными с таковыми у 5'-фосфата, что ставит под сомнение 5'-специфичность природы химического присоединения с использованием 5'-фосфатной группы.