Новые способы идентификации биомолекул лигандов и мишеней

1 Область изобретения Данное изобретение относится к новому способу идентификации/получения пептидов или рибонуклеиновых кислот, способных модулировать активность in vivo ферментовмишеней в эукариотических клетках. Более конкретно, данное изобретение не обеспечивает способ идентификации/получения неизвестных до настоящего времени активаторов, а также ингибиторов активности ферментов in vivo в эукариотических клетках. Кроме того, данное изобретение относится к способам идентификации неизвестных взаимодействий (т.е. идентификации мишени и/или лиганда, но также неизвестных до настоящего времени взаимодействий между известными лигандами и известными мишенями). Эти новые способы используют структуры ингибиторов ферментов в качестве каркасов для внутриклеточного представления потенциально биологически активных пептидов или рибонуклеиновых кислот в стабильной форме. Здесь описаны также способы получения неизвестных до сих пор лигандов или мишеней,а также способы получения векторов и трансформированных клеток, несущих генетическую трансформацию, кодирующую эти лиганды и мишени. Наконец, данное изобретение относится к способу получения медицинского продукта,который основан на первоначальной идентификации мишеней или лигандов в соответствии с данным изобретением. Предпосылки изобретения Способ CellScreen является способом,который позволяет идентифицировать пептидные последовательности, имеющие биологическую активность in vivo, и который описан вWO 96/38553. Вкратце, библиотеки случайных пептидов экспрессируют внутриклеточно в эукариотических клетках (например, клетках млекопитающих) таким образом, что одна клетка экспрессирует один единственный или несколько гетерологичных коротких пептидов. Клетки,которые изменяют заранее выбранный фенотип при определенных условиях, могут быть выделены и, следовательно, пептид, который они экспрессируют, может быть идентифицирован. Внутримолекулярный компонент, с которым взаимодействует этот пептид, (молекуламишень), может быть затем получен с использованием, например, аффинных колонок, несущих иммобилизованный синтетический пептид. Хотя технология CellScreen проявила себя как многообещающая для идентификации новых лекарственных веществ-мишеней, присущей ей проблемой является то, что внутриклеточная среда является относительно враждебной для многих гетерологичных продуктов экспрессии. Другими словами, представляющие интерес пептиды или последовательности нуклеиновых кислот, которые потенциально способны взаимодействовать с важной молекулоймишенью, могут расщепляться или инактивиро 003637 2 ваться внутри клетки до того, как может быть обнаружено какое-либо влияние на фенотип. Цель изобретения Целью данного изобретения является обеспечение усовершенствований в технологииCellScreen посредством преодоления вышеупомянутых проблем потенциальной нестабильности экспрессируемых последовательностей. Кроме того, целью данного изобретения является расширение применимости технологииCellScreen для включения в нее также скрининга в прокариотических клетках. Сущность изобретения Было описано значительное количество модуляторов ферментативной активности растительного, микробного и эукариотического происхождения, см. ниже. Поскольку многие природно встречающиеся процессы внутри клеток регулируются ферментами, авторы данного изобретения описывают здесь способ экспрессии больших внутриклеточных библиотек таких модуляторов ферментативной активности, в которых активный сайт указанных модуляторов ферментативной активности был изменен введением фрагментов рандомизированных аминокислотных последовательностей или введением случайных нуклеотидов в специфические участки в активном сайте. Это создает библиотеки возможных модуляторов, способных модулировать активность ряда различных ферментов внутри клеток. Путем экспрессии этих модуляторов в клеточных линиях в соответствии с новым вариантом технологии CellScreen ферментативные регуляторные механизмы внутри индивидуальных клеток указанной клеточной линии будут подвергаться воздействию иначе, приводя к отличным фенотипическим свойствам, таким как,например, устойчивость к гипогликемии, убиванию цитокинами, токсическим соединениям,вирусной инфекции и т.д. Основным преимуществом применения известных модуляторов ферментативной активности, таких как ингибиторы ферментов, в качестве молекулярных каркасов является то, что многие из них в их нативной форме являются стабильными во внутриклеточной среде. Проблемой использования, например, фрагментов антител в качестве каркасов для внутриклеточного представления случайных пептидов является то, что многие такие фрагменты антител являются чувствительными к протеолитической и восстанавливающей внутриклеточной среде и,следовательно, являются непригодными в качестве внутриклеточных каркасов. С другой стороны, модуляторы ферментативной активности могут, при тщательном конструировании, сохранять их внутриклеточную стабильность и в то же самое время включать в себя случайные последовательности, которые подвергают скринингу на биологическую активность. Кроме того, эффективность такого скрининга на биоло 3 гически активные вещества будет более высокой, чем при использовании нестабильного каркаса (такого как, например, структура скрученной спирали) или вообще без использования каркаса, так как ни одна из рандомизированных последовательностей не будет расщепляться или только очень ограниченное число рандомизированных последовательностей будут расщепляться до того, как они проявят их действия на эти клетки. Наконец, большинство таких модуляторов ферментативной активности имеют активный сайт, который находится в нужном положении для модификации в молекуле, так как этот активный сайт обычно представлен в стабильной конфигурации в отношении данной окружающей среды. Таким образом, один аспект данного изобретения относится к способу идентификации активного in vivo модулятора активности фермента-мишени, причем этот способ предусматривает стадии (а) приготовления пула экспрессирующих векторов, причем каждый вектор указанного пула содержит, по меньшей мере,один член из библиотеки случайно модифицированных нуклеотидных последовательностей,происходящих из исходной нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный пептид или исходную рибонуклеиновую кислоту,который модулирует активность ферментамишени, (b) трансформация популяции существенно идентичных клеток вышеуказанными векторами вышеуказанного пула таким образом,чтобы получить трансформированные клетки указанных существенно идентичных клеток,которые захватывают фермент-мишень, (с) культивирования указанных трансформированных клеток в условиях, облегчающих экспрессию указанных случайно модифицированных нуклеотидных последовательностей, (d) исследования указанных трансформированных клеток и выделения трансформированной клетки(клеток), в которых активность ферментамишени является модулированной, и (е) идентификации модулятора посредством определения указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательности указанного вектора, присутствующего в клетке (клетках),выделенных в стадии (d), и/или определения аминокислотной последовательности или последовательности рибонуклеиновой кислоты продукта экспрессии, кодируемого указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательностью. В этом аспекте данного изобретения обычно предпочтительно, чтобы случайно модифицированная нуклеотидная последовательность состояла из 1) неизменяемой части исходной нуклеотидной последовательности и 2) случайных нуклеотидов. В соответствии с вышеописанным, неизменяемая часть исходной нуклеотидной последовательности предпочтительно кодирует каркасную часть исходного пептида 4 или исходной рибонуклеиновой кислоты, которая служит для стабилизации указанного полипептидного фрагмента или фрагмента рибонуклеиновой кислоты. Как упоминалось выше, применение в качестве каркасов модуляторов ферментов обеспечивает также экспрессию стабильных биологически активных модуляторов, которые взаимодействуют с другими биомолекулами, иными,чем ферменты. Другими словами, в тех случаях,когда случайные нуклеотиды встраивают в каркасную структуру, результатом будет стабильный продукт экспрессии, активность которого необязательно имеет что-либо общее с модулированием ферментативной активности. Таким образом, другой частью данного изобретения является способ идентификации модулятора в форме биологически активного полипептидного фрагмента или фрагмента рибонуклеиновой кислоты, который способен определяемо модулировать, in vivo, фенотипический признак в клетке, причем этот способ предусматривает стадии:(а) приготовления пула экспрессирующих векторов, причем каждый вектор указанного пула содержит, по меньшей мере, один член из библиотеки случайно модифицированных нуклеотидных последовательностей, полученных из исходной нуклеотидной последовательности,кодирующей исходный пептид или исходную рибонуклеиновую кислоту, который модулируетin vivo активность известного фермента, причем случайно модифицированные нуклеотидные последовательности включают в себя неизменяемую часть, кодирующую каркасную часть исходного пептида или исходной рибонуклеиновой кислоты, причем указанная каркасная часть служит для стабилизации указанного фрагмента полипептида или фрагмента рибонуклеиновой кислоты, и случайные нуклеотиды,(b) трансформации популяции существенно идентичных клеток указанными векторами указанного пула таким образом, чтобы получить трансформированные клетки,(c) культивирования указанных трансформированных клеток в условиях, облегчающих экспрессию указанных случайно модифицированных нуклеотидных последовательностей,(d) исследования указанных трансформированных клеток и выделения трансформированной клетки (клеток), в которых предварительно выбранный фенотипический признак модулирован присутствием экспрессируемой случайно модифицированной нуклеотидной последовательности, и(e) идентификации модулятора посредством определения указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательности указанного вектора, присутствующего в клетке(клетках), выделенных в стадии (d), и/или определения аминокислотной последовательности или последовательности рибонуклеиновой ки 5 слоты продукта экспрессии, кодируемого указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательностью. Наконец, данное изобретение относится также к общему использованию внутриклеточно стабильных каркасных белков, рибонуклеотидов или их фрагментов для представления случайных последовательностей в технологии CellScreen. Как упоминалось выше, хотя концепция использования каркасных молекул обсуждалась в прежнем уровне техники, нерешенный вопрос стабильности каркасной системы не исследовался детально. Стабильность и применимость предполагаемого внутриклеточного каркаса зависит от ряда факторов. Прежде всего, важно, чтобы соответствующая клетка, в которой должен экспрессироваться данный каркас, была способна к экспрессии данной каркасной молекулы в функциональной форме; т.е. в прокариотических системах некоторые эукариотические белки не укладываются правильно, делая, следовательно,применение такого белка непригодным в качестве каркаса в этом типе клетки. Во-вторых,этот каркас должен быть относительно устойчивым в отношении восстанавливающей и каталитической среды внутри интактных клеток. Однако даже когда каркасная молекула является относительно чувствительной к инактивирующей природе внутриклеточной среды,это может быть исправлено, если скорость получения каркасной молекулы является достаточно высокой. В устойчивом состоянии, внутриклеточная концентрация каркасной молекулы будет функцией, определяемой следующей формулой: где Rp представляет собой скорость получения каркасной молекулы (мольс-1) и Rd представляет собой константу инактивации для каркасной молекулы (1 с-1), т.е. скорость инактивации каркасной молекулы определяетсяRp). Другими словами, при оценке пригодности потенциальной каркасной молекулы, в соответствии с данным изобретением, следует испытать, может ли данная молекула сохраняться при достаточно высокой концентрации внутри соответствующей клетки, в которой должен проводиться тест CellScreen. Таким образом, очень широкий аспект данного изобретения относится к способу идентификации модулятора в форме биологически активного полипептидного фрагмента или фрагмента рибонуклеиновой кислоты, который способен определяемо модулировать, in vivo,фенотипический признак клетки, причем этот способ предусматривает стадии:(а) приготовления пула экспрессирующих векторов, причем каждый вектор указанного пула содержит, по меньшей мере, один член из библиотеки случайно модифицированных нуклеотидных последовательностей, полученных их исходной нуклеотидной последовательности,кодирующей исходный пептид или исходную рибонуклеиновую кислоту, который является стабильным внутри клетки, причем случайно модифицированные нуклеотидные последовательности включают в себя неизменяемую часть, кодирующую каркасную часть исходного пептида или исходной рибонуклеиновой кислоты, причем указанная каркасная часть служит для стабилизации указанного фрагмента полипептида или фрагмента рибонуклеиновой кислоты, и случайные нуклеотиды,(b) трансформации популяции существенно идентичных клеток указанными векторами указанного пула таким образом, чтобы получить трансформированные клетки,(c) культивирования указанных трансформированных клеток в условиях, облегчающих экспрессию указанных случайно модифицированных нуклеотидных последовательностей,(d) исследования указанных трансформированных клеток и выделения трансформированной клетки (клеток), в которых предварительно выбранный фенотипический признак модулирован присутствием экспрессируемой случайно модифицированной нуклеотидной последовательности, и(e) идентификации модулятора посредством определения указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательности указанного вектора, присутствующего в клетке(клетках), выделенных в стадии (d), и/или определения аминокислотной последовательности или последовательности рибонуклеиновой кислоты продукта экспрессии, кодируемого указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательностью. В этом аспекте данного изобретения продукт экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует внутриклеточно стабильные исходный пептид или исходную рибонуклеиновую кислоту, при продуцировании, по существу,идентичными клетками, присутствует в эффективной концентрации и в функциональном состоянии. Другими словами, существенно, чтобы пригодность данной каркасной молекулы оценивалась перед проведением стадий технологииCellScreen, для того чтобы иметь подтверждение того, что данная каркасная молекула в немодифицированной форме может экспрессироваться и сохраняться при достаточно высокой концентрации/активности в данной клеточной системе, в которой должен осуществляться способ данного изобретения. Согласно WO 96/38553, выделение молекулы-мишени лекарственного средства может 7 быть осуществлено более эффективно, если случайные пептидные последовательности встроены в более крупные полипептиды, функционирующие в качестве каркасов для представления случайных аминокислотных последовательностей. Такие каркасы, возможно, могли бы приводить к взаимодействию с более высокой аффинностью с молекулой-мишенью. Однако ничего не упоминается об использовании каркасных молекул, произведенных из природно встречающихся белковых ингибиторов ферментов. Ингибирование ферментативной активности такими ингибиторами - в противоположность простому связыванию белкамишени внутри клетки, как предполагается в технологии CellScreen - является гораздо более эффективным путем для воздействия на внутриклеточные биохимические процессы. Подробное описание изобретения Определения Далее будет определен ряд терминов для целей данного описания."Модулятор" обозначает в данном контексте биомолекулу, которая при экспрессии invivo действует на активность другой биомолекулы в данной клетке. Таким образом, модулятор, по существу, может ингибировать или усиливать активность этой биомолекулы. Кроме того, модулятор может взаимодействовать непосредственно с этой биомолекулой, но может также оказывать непрямое действие, т.е. изменение активности биомолекулы может вызываться изменениями в комплексе биохимических механизмов клетки, изменениями, которые в конечном счете являются результатом присутствия продукта экспрессии рандомизированной последовательности нуклеиновой кислоты."Случайно модифицированная нуклеотидная последовательность" является последовательностью нуклеотидов, которая в ряде положений была подвергнута инсерции или замене нуклеотидами, природа которых не может быть предсказана. Во многих случаях встроенные случайные нуклеотиды или нуклеотидные последовательности будут "полностью случайными" (например, как следствие рандомизированного синтеза или ПЦР-опосредованного мутагенеза). Однако, как будет видно из приведенного ниже описания, эти случайные последовательности могут также включать в себя последовательности, которые имеют общий функциональный признак (например, реактивность с лигандом продукта экспрессии), или случайные последовательности могут быть случайными в том смысле, что конечный продукт экспрессии является совершенно случайной последовательностью, например, с равномерным распределением различных аминокислот. Термин "существенно идентичные клетки" предназначен здесь для обозначения клеток,которые все обнаруживают специфический фенотипический признак таким образом, что из 003637 8 менение в экспрессии указанного признака в одной клетке, обусловленное взаимодействием,вызываемым введением случайных нуклеотидов в соответствии со способами данного изобретения, имеет место также в одной из других существенно идентичных клеток, если они были трансформированы тем же самым вектором. Другими словами, важным параметром для оценки при выборе существенно идентичных клеток в способах данного изобретения является определение, может ли наблюдаемое изменение в проявлении фенотипического признака быть принято как указание на то, что любая другая клетка в этой популяции вела бы себя таким же образом вследствие того же самого изменения. Таким образом, существенно идентичные клетки могут, например, быть клональными клетками или клетками клеточной линии или они могут быть клетками культуры клеток или культуры ткани."Фенотипическим признаком" является наблюдаемый результат определенного состава генов в клетке (генотипа), т.е. свойством клетки(детектируемым химическим, физическим, иммунологическим или другим подходящим способом), который зависит от присутствия одного или нескольких генов и скорости их экспрессии. Таким образом, фенотипический признак может быть любым из ряда различных свойств: активностью фермента, эффектами взаимодействия между рецепторами и лигандами, коэффициентом выживаемости клеток, присутствием или отсутствием антигена, скоростью экспрессии и т.д."Пептид" в данном контексте обозначает как короткие пептиды из 2-10 аминокислотных остатков, олигопептиды из 11-100 аминокислотных остатков, так и полипептиды из более,чем 100 аминокислотных остатков. Кроме того,этот термин включает в себя также белки, т.е. функциональные биомолекулы, содержащие, по меньшей мере, один полипептид; при наличии,по меньшей мере, двух полипептидов эти полипептиды могут образовывать комплексы, могут быть ковалентно связанными или могут быть нековалентно связанными. Полипептид (полипептиды) в белке могут быть гликозилированными и/или липидированными и/или содержать простетические группы. При использовании термина "биологически активная" для обозначения молекулы в данном контексте подразумевается, что эта молекула проявляет определяемое действие на живых клетках, т.е. что эта молекула взаимодействует с биологией живой клетки таким образом, что производит эффект, который может распознаваться как изменение фенотипа этой клетки. Термин "in vivo" используется здесь для обозначения условий среды внутри живых клеток (т.е. клеток, которые являются метаболически активными и могут поддерживать их жизненно важные функции); живые клетки могут 9 содержаться в культуре или могут присутствовать в природном микроокружении (например,функционируя как часть более крупного многоклеточного организма). Таким образом, термин"in vivo" относится также к культивированию клеток in vitro, пока наблюдаемый эффект имеет место в живых клетках."Трансформация": способ, при помощи которого генетический материал, содержащийся в отдельной клетке, изменяют включением экзогенной ДНК в ее геном."Трансфекция": поглощение, включение и экспрессия рекомбинантной ДНК клетками."Трансдукция": перенос генетической трансформации от одной клетки к другой при помощи вирусного вектора. Термин "эффективная часть" при применении в контексте с белком, пептидом или рибонуклеиновой кислотой в данном контексте предназначен для обозначения части (например,подпоследовательности или, в случае n-мерного белка, менее-чем-n-мерной молекулы), которая сохраняет желательную функциональность нативной молекулы, из которой произведен данный белок или пептид. Например, в случае CI2A, по-видимому, только укороченная форма этой молекулы является необходимой для обеспечения внутриклеточной экспрессии этого активного ингибитора, и, следовательно, укороченная форма этой молекулы составляет эффективную часть CI-2A; см. также примеры ниже. Если нет иных указаний, нуклеотидные последовательности представлены здесь в направлении 5'3', а аминокислотные последовательности представлены таким образом, что Nконец находится слева. Общие свойства способа данного изобретения В общем, описания в WO 96/38553 и WO 97/27212, относящиеся к получению рандомизированных последовательностей, к выбору партнеров слияния (за исключением выбора каркасных молекул) для случайных последовательностей, к выбору и составу нацеливающих последовательностей, к выбору нуклеиновых кислот, подлежащих случайной модификации, к выбору способа рандомизации, к способам введения нуклеиновых кислот в соответствующий тип клеток, к выбору (ретровирусных) векторов(когда это применимо), к способу получения этих векторов, к выбору промоторов, к выбору упаковывающих клеток (когда это применимо),к способам концентрирования инфекционных вирионов из упаковывающих клеток (когда это применимо), к выбору существенно идентичных клеток для применения в этом способе, к типу детектируемых фенотипических изменений, к способу, в котором такое изменение детектируется, к способам выделения фенотипически измененных клеток, к выделению и определению последовательности случайно модифицированных последовательностей, к выделению и характеристике мишени для рандомизированного 10 продукта, к способам скрининга и к выбору применений этих способов, имеют также отношение к целям данного изобретения. Таким образом, описания этих двух патентных заявок включены здесь в качестве ссылки. Однако поскольку обе эти ссылки сфокусированы на использовании этого общего принципа в высших эукариотических клетках, в данном изобретении будут также подробно описаны варианты, касающиеся применения в прокариотических системах, см. ниже. Однако более общая часть двух вышеуказанных описаний, которые без какихлибо трудностей для специалистов могли бы быть применены в контексте прокариотической системы, рассматриваются также как относящаяся к данному изобретению и важным вариантам данного изобретения до тех пор, пока она относится к использованию способов в прокариотических системах. Обычно является предпочтительным, чтобы трансформированная клетка, которая исследуется в стадии (d), преимущественно несла (и экспрессировала) одну единственную копию вектора. Путем обеспечения этого, интерпретация изменения в фенотипе этих клеток становится более легкой задачей, тогда как интерпретация фенотипического изменения в клетках,экспрессирующих более одной единственной рандомизированной последовательности, делает неясным, какой из трансформирующих векторов является ответственным за это изменение. Для гарантии того, что преимущественно один вектор трансформировал каждую из исследуемых клеток, пригодным способом является, например, то, что стадию трансформации (b) проводят при таких условиях, что трансформированные клетки являются преимущественно трансформированными или самое большее трансформированиям одним единственным вектором из указанного пула (это может быть достигнуто, например, коррекцией концентрации инфекционных вирионов в вариантах данного изобретения, где трансформацию осуществляют посредством трансдукции), или когда, перед проведением стадии (d), клетки, трансформированные более чем одним вектором из указанного пула, по существу, исключают из последующих стадий. Эта последняя возможность требует, чтобы можно было определить количество трансформирующих векторов, и это может быть достигнуто включением определяемого маркера в продукт экспрессии, например, флуоресцентного зонда. Другой возможностью является повторный скрининг клеток, проявляющих изменения в фенотипе, с определением тем самым того, трансформирована ли данная клетка более чем одним вектором. Должно быть понятно, что молекула, выбранная для того, чтобы служить в качестве каркасной молекулы, и в которую в конечном счете вводят случайные последовательности,может быть либо пептидной последовательно 11 стью, либо последовательностью нуклеиновой кислоты, такой как РНК-фрагмент, соответсвующий (антисмысловым образом) мРНК,тРНК или рибозиму. Альтернативно, такой РНК-фрагмент мог бы сам проявлять рибозимную активность, оказывая тем самым непрямое действие на скорость экспрессии других ферментов. Во всяком случае, полученный продукт,т.е. продукт рандомизированной экспрессии,может быть пептидом или рибонуклеиновой кислотой, такой как рибозим. Одним из важных признаков каркаса является, как упоминалось выше, то, что он является устойчивым к протеолитическому разрушению и/или нечувствительным к восстанавливающей среде, такой как среда, которая обнаруживается внутри клеток. В предпочтительных вариантах данного изобретения случайные нуклеотиды вводят в часть (части) исходной нуклеотидной последовательности, которая кодирует (которые кодируют) активный сайт (сайты) исходного пептида или исходной рибонуклеиновой кислоты, или часть (части), которая кодирует (которые кодируют) структуру (структуры), блокирующие активный сайт (сайты). Как обсуждалось выше,активный сайт (так же как другие открытые структуры каркаса) должны быть стабильно представлены окружающей среде, чтобы они были способны взаимодействовать с другими биомолекулами. Таким образом, предпочтительно неизменяемая часть этой нуклеотидной последовательности кодирует части исходного пептида или исходной рибонуклеиновой кислоты, в достаточной степени укороченные для поддержания стабильности рандомизированного продукта. В некоторых вариантах предпочтительно,чтобы неизменяемая часть исходной нуклеотидной последовательности кодировала пептид,который не содержит дисульфидных мостиков. Это обусловлено тем фактом, что дисульфидные мостики не образуются в ядре или в цитозоле. Таким образом, в случаях, когда каркас должен быть в функциональном состоянии, когда он присутствует в ядре или в цитозоле, было бы обычно предпочтительным использовать каркас,который не содержит дисульфидных мостиков или который не использует их для поддержания стабильности и функциональности. С другой стороны, в вариантах, в которых желательным является, чтобы рандомизированный продукт экспрессии был ограничен эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) или другим компартментом,допускающим присутствие стабильных дисульфидных связей, перед тем как рандомизированная последовательность предоставляется окружению удовлетворительным образом, желательно, конечно, чтобы неизменяемая часть исходной нуклеотидной последовательности кодировала пептид, имеющий дисульфидные мостики, так как изменения, заключающиеся в об 003637 12 разовании правильно уложенного и функционального каркаса вне таких компартментов, являются относительно малыми. Должно быть понятно, что случайные нуклеотиды вводят предпочтительно в форме инсерции (вставки) или замены в исходную нуклеотидную последовательность, необязательно в комбинации с делецией (делециями) в исходной нуклеотидной последовательности. Делетированные последовательности в исходном полипептиде могли бы быть, например, частями активного сайта, присутствие которых в неизмененной форме является токсичным или иным образом вредным для трансформированных клеток. Число введенных случайных нуклеотидов может варьироваться в большой степени, но обычно это число находится между 3 и приблизительно 100. В этом диапазоне предпочтительно введение, по меньшей мере, 5, например, по меньшей мере, 7 или лучше, по меньшей мере,9-12 случайных нуклеотидов. С другой стороны,предпочтительно вводить самое большее 90,например, самое большее 70-80 случайных нуклеотидов. Наиболее предпочтительное число вводимых рандомизированных нуклеотидов варьирует между 15-60, предпочтительно 20-55 или 25-50 нуклеотидами. Особенно предпочтительные количества случайных нуклеотидов равны 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59 и 60 нуклеотидам. Случайные нуклеотиды вводят в каркас в форме нуклеотидных последовательностей и/или в форме отдельных случайных нуклеотидов, вводимых в специфических сайтах в исходной нуклеотидной последовательности. Вариацией является замена части каркасной последовательности последовательностью, которая сохраняет части каркасной последовательности(например, части, которые являются незаменимыми для стабильности/функциональности), но в которой другие части являются рандомизированными. Случайные нуклеотиды предпочтительно выбраны из группы, состоящей из синтетических, полностью случайных дезоксирибонуклеотидов; синтетических случайных ДНКпоследовательностей, в которых ограничение рандомизации некоторых нуклеотидов вводят таким образом, чтобы ограничить число доступных последовательностей и/или избежать нежелательных стоп-кодонов и/или облегчить введение посттрансляционных модификаций экспрессируемого пептида (пептидов); синтетических случайных ДНК-последовательностей,таких как описанные в (1) или (2), связанных с последовательностью, кодирующей метку для очистки, и - CDR-кодирующих нуклеотидных последовательностей, выделенных из библиотеки иммунокомпетентных клеток, индуцирован 13 ных против антигена (в этом варианте предпочтительно, чтобы CDR-кодирующие нуклеотидные последовательности кодировали CDR-3 пептидные последовательности). Последний тип "рандомизации" фактически вводит ограничение случайности, которое гарантирует, что введенные последовательности кодируют узнающий антиген район. Однако хорошо известно, что поликлональный иммунный ответ против антигена состоит из большого числа иммунокомпетентных клеток, которые все взаимодействуют в одним и тем же антигеном (или, возможно, даже с одним и тем же эпитопом), но корреляцию между аминокислотными последовательностями этих CDR и узнаванием этого эпитопа (эпитопов) фактически невозможно установить. Альтернативным путем введения ограничений на случайность последовательностей нуклеиновых кислот, которые в конечном счете тестируются в существенно идентичных клетках, является следующий путь: при приготовлении векторов их используют в 1-ом цикле фагового представления, где эти фаги, трансформированные этими векторами, подвергают пэннингу против библиотеки, содержащей выбранный лиганд. Что касается способа применения CDRкодирующих последовательностей, результатом является то, что эти последовательности, которые в конечном счете тестируют в существенно идентичных клетках, являются "непредсказуемыми" (и, следовательно, случайными), но тем не менее выбранными на основе функционального признака. Опять, отсутствие известной корреляции между последовательностями нуклеиновых кислот и взаимодействием в трехмерном пространстве между продуктом экспрессии и выбранным лигандом имеет следствием то,что тестируемая подгруппа последовательностей все еще является рандомизированной. В особом варианте вышеуказанного способа, в котором способ данного изобретения комбинируют с фаговым представлением, обе тестсистемы повторяют чередующимся образом, т.е. чередованием между внутриклеточной экспрессией в существенно идентичных клетках и пэннингом фаговой библиотеки. Для получения регулируемого распределения аминокислот в рандомизированных пептидах, когда модулятор является пептидом, практичным является получение случайных нуклеотидов случайным синтезом кодонов, где определенные кодоны ДНК синтезируются в случайном порядке; подробное описание этого принципа дается в WO 96/38553, см. в нем пример 1. Предпочтительным вариантом в этом контексте является вариант, в котором относительное количество синтезированных кодонов гарантирует, что все кодируемые аминокислоты будут присутствовать по существу с одинаковой частотой во всех кодируемых полипептидных фрагментах, т.е. что шанс встречаемости одной 14 специфической аминокислоты в пептиде библиотеки является, по существу, таким же, что и для любой другой кодируемой аминокислоты. Для введения этих рандомизированных фрагментов в векторы, в соответствии с данным изобретением предпочтительно, чтобы эти случайные нуклеотиды вводились в экспрессирующий вектор по принципу сайтнаправленного ПЦР-опосредуемого мутагенеза. Однако квалифицированным специалистам известны и другие возможности, и, например,можно также встраивать в эти векторы библиотеки синтетических случайных последовательностей. Кроме наличия рандомизированного фрагмента продукта экспрессии, вводимого в каркас в соответствии с данным изобретением, часто является необходимым связывание случайной последовательности с партнером слияния посредством слияния рандомизированной нуклеотидной последовательности с нукле-отидной последовательностью, кодирующей, по меньшей мере, один партнер слияния. Такой партнер слияния может, например, облегчать экспрессию и/или очистку/выделение и/или дополнительную стабилизацию продукта экспрессии. Для целей очистки партнер слияния может включать в себя метку очистки, такую как His6 метка, myc-метка, последовательность-мишень биотинилирования BSP, BirA, flu-метка, lacZ иGST. Кроме того, партнер слияния может включать в себя сигнал сортинга или нацеливающую последовательность, см. обсуждения ниже. В вариантах, в которых модулятор является сам модулятором ферментативной активности, теоретически возможно действовать как на Км, так и/или на Vmax рассматриваемого фермента. Снижение Км приводит к меньшей эффективности рассматриваемого фермента до тех пор, пока увеличенная концентрация субстрата требуется для получения 50% максимальной активности этого фермента. Увеличение Км имеет противоположный эффект. Конечно, воздействие на фермент, которое влияет на Vmax,имеет следствием то, что максимальная возможная интенсивность активности фермента увеличивается (при увеличении Vmax) или уменьшается (при уменьшении Vmax). Во всяком случае, модулятор ферментативной активности будет давать фенотипическое проявление, что активность фермента либо ингибировалась, либо стимулировалась. В этом варианте предпочтительно, чтобы модулятор был ингибитором. Когда способ данного изобретения приводит в конце концов к идентификации модулятора или его мишени, предпочтительным является установление 3-мерной структуры идентифицированного модулятора, так как это сделает возможными осуществление рационального скрининга лекарственных средств и способы компьютерного моделирования лекарственных средств. 15 Применение способов данного изобретения в прокариотических системах Первоначально рассматриваемая технология, описанная в WO 96/38553, фокусировалась на скрининге в отношении взаимодействий в эукариотических клетках. Однако эта технология применима также в прокариотических системах. Например, ожидается, что данное изобретение сделает возможной идентификацию неизвестных до настоящего времени взаимодействий в патогенных бактериях, взаимодействий,которые будут применимы в процессе развития новых антибиотиков. Поскольку способы данного изобретения позволяют идентифицировать как новые лигандные пептиды, так и лигандные рибонуклеиновые кислоты, а также молекулымишени для этих лигандов, исследователь обеспечивается необходимыми инструментами для стимулирования компьютерного моделирования лекарственных средств и выполнения традиционного скрининга лекарственных средств, как только такие лиганды и/или мишени были идентифицированы/выделены. Однако, кроме этого подхода идентификции антибактериальных эффектов и веществ,этот способ открывает доступ к усовершенствованиям промышленных ферментационных процессов. В таких случаях будет, например, возможно идентифицировать биомолекулы, которые являются важными в биохимических путях в молочно-кислых бактериях, и тем самым обеспечить инструменты для получения новых молочных продуктов, таких как сыр, йогурт и другие продукты ферментации молочно-кислых бактерий. В некоторой степени близким этому подходу является использование способов данного изобретения в скрининге, проводимом на бактериальных культурах, используемых в процессах очистки. В области очистки, например, отработанной воды хорошо известно, что микробиологические культуры (активированный шлам),которые проводят деструкцию органического материала, являются относительно уязвимыми в случае изменений в среде, и, следовательно,обеспечение более сильных штаммов бактерий было бы одним из путей усовершенствования подобных систем. Альтернативно, способ данного изобретения позволил бы также индентификацию/выделение лигандов и мишеней в таких бактериях, которые, при взаимодействии с ними, могут приводить, например, к увеличенной эффективности в деструкции специфических органических или неорганических субстратов. Таким образом, как должно быть понятно из вышесказанного, данное изобретение является высоко применимым в прокариотических системах. Для целей применения способа данного изобретения в прокариотических клетках, пред 003637 16 почтительно, чтобы эти прокариотические клетки были бактериями, выбранными из группы,состоящей из Bacillus spp. (например, В. anthracis, B. subtilis и В. cereus), Clostridium spp. (например, С. botulinum, С. difficile, С. perfringens и С. tetani), Corynebacterium spp. (например, С.leprae), Treponema pallidum, Chlamydia trachomatis, Actinomyces spp., Rickettsia spp. и Mycoplasma spp. (например, M. pneumoniae). Этот перечень бактерий включает в себя,следовательно, семейства и виды бактерий, которые участвуют в патологии большого числа заболеваний человека. Из них для промышленной ферментации используются Е. coli и В. subtilis; это имеет также место для молочно-кислых бактерий, особенно Lactococcus spp. и Lactobacillus spp., и, следовательно, предпочтительно также проводить способы данного изобретения,при их использовании в бактериальных системах, на таких непатогенных видах. При применении способов данного изобретения в прокариотической системе, очень часто представляет интерес идентификация клеток, которые имеют ослабленный рост или летально повреждаются вследствие присутствия гетерологичного продукта экспрессии в соответствии с данным изобретением. Однако это совершенно не вызывает проблем, так как основным фенотипическим признаком, связанным, например, со смертью бактерий, является отсутствие данной бактерии. Таким образом, необходимо приспособить экспериментальную программу, которая позволит проводить идентификацию клеток, транс 17 формированных таким образом, что они менее хорошо выживают, чем другие, в других отношениях соответствующие клетки. Одним их преимуществ является то, что экспрессия гетерологичного генетического материала находится под контролем индуцируемого промотора. Таким путем можно размножать колонии клеток, которые были трансформированы генетическим материалом, который при экспрессии является летальным или нарушающим рост для этих клеток. После этого, экспрессия может быть запущена и тщательное исследование размноженных колоний должно выявить те клональные колонии, которые не обнаруживают такого же характера роста, какой наблюдается,например, в нетрансформированном контроле. Одним из способов для выполнения этого является распределение шпателем трансформированных клеток на чашках со средой для выращивания и оставление этих клеток расти до заранее заданного среднего размера. Распределение клеток должно быть таким, чтобы видимые образующиеся колонии состояли, как правило, из одного отдельного клона клеток. По достижении заданного размера колоний все чашки переносят блоттингом на среду-носитель таким образом, чтобы получить "негатив" каждой чашки с агаром. После этого индуцируют экспрессию встроенных случайных последовательностей и этим колониям дают опять расти. Чашки обследуют непрерывно или с подходящими интервалами (например, при помощи системы обработки данных цифрового изображения, хорошо известной специалистам). После этого идентифицируют те колонии, которые обнаруживают нарушенный или остановленный рост в сравнении с остальными колониями или с контролями, так как характер роста каждой колонии может быть прослежен автоматизированным путем. Затем эти колонии могут быть идентифицированы и выделены из блота-"негатива",и после этого относительно простой процедурой является экстракция генетического материала и определение его последовательности. В этом контексте, одной представляющей интерес возможностью выбора является превращение устойчивых к антибиотикам бактерий в неустойчивые. Среда для выращивания либо содержит рассматриваемый антибиотик, либо обогащается им во время культивирования, и колонии, которые при индуцировании экспрессии могут быть выявлены как менее устойчивые к лекарственному средству, чем контроли, исследуются далее. Могут быть также испытаны чистые бактерицидные/бактериостатические эффекты. В таком варианте, эти бактерии, например, культивируют в подходящей среде для выращивания. Те колонии, которые после индуцирования экспрессии обнаруживают доказательство пониженного или остановленного роста, исследуются далее: ожидается, что будет продемонстрировано, что некоторые из этих 18 бактериальных клеток несут генетический материал, кодирующий продукт экспрессии, который взаимодействует с новыми (или известными) мишенями для антибактериальных агентов. Другим, представляющим интерес, фенотипическим признаком является, конечно, превосходящее выживание клеток. В случае применяемых бактерий, представляет интерес идентифицировать мишени, которые будут увеличивать коэффициент выживаемости этих бактерий. Например, бактерии, применяемые в промышленных ферментациях, обычно могут летально повреждаться вследствие их собственного неконтролируемого продуцирования гетерологичных продуктов экспрессии. Если могут быть идентифицированы гены или молекулымишени, которые оказывают положительное действие на выживание таких бактерий, экономический потенциал является огромным, поскольку процесс ферментации будет более экономичным (меньшая необходимость запуска новых ферментации). Подобным образом, бактерии, используемые, например, в очистке сточных вод, могут быть сделаны более устойчивыми к токсичным агентам в их окружающей среде. Построение эксперимента в этом контексте является относительно простым: трансформированные бактерии просто подвергают потенциально летальным условиям, и только колонии,которые обнаруживают лучшее выживание, выделяют и обследуют (и это в типичном случае будут колонии, которые являются детектируемыми). Таким образом, построение эксперимента, подобное описанному выше для идентификации смерти клеток, не является необходимым. Наконец, большой группой фенотипических признаков, которые могут быть исследованы, являются признаки, которые могут детектироваться, например, биохимическими или иммунологическими средствами. Ожидается, что способ данного изобретения позволит идентифицировать системы в бактериальных клетках,которые, при должном модулировании, могут сделать эти бактерии более эффективными в качестве продуцентов в промышленной ферментации. Такие фенотипические признаки могли бы быть, например, изменениями в активности ферментов, изменения в плотности рецептора, изменения в скорости экспрессии и т.д. Особые соображения используются, когда рандомизированный продукт экспрессии слит с партнером слияния, который определяет конечное местоположение продукта экспрессии. Сигнальные последовательности у прокариот являются хорошо известными в данной области, но следует вкратце упомянуть, что известны мембрано-якорные сигналы, и можно также экспортировать продукт экспрессии к периплазматическому пространству бактерий. Наконец, можно также включать сигналы секреции таким образом, чтобы можно было выделить продукт экс 19 прессии из культурального супернатанта. Однако, во многих случаях, конечно, наиболее удобно сохранять продукт экспрессии внутри прокариотической цитоплазмы. Применение способа данного изобретения в эукариотических системах Особенно предпочтительным является использование в способе данного изобретения эукариотических клеток в качестве существенно идентичных клеток для скрининга на активные биомолекулы. Таким образом, эти эукариотические клетки могут быть грибковыми клетками,клетками простейших, клетками животных и клетками растений. Как и в случае для бактерий, ряд грибков являются патогенами в млекопитающих и, следовательно, данная технология будет, параллельно с тем, что было описано выше в отношении антибактериальных агентов, применима для идентификации противогрибковых агентов с использованием патогенных грибков в качестве существенно идентичных клеток в этом способе. Кроме того, грибки (в частности, дрожжевые штаммы), подобно бактериям, также используются в ферментационных процессах (например,в винодельческой и пивоваренной промышленности), и, следовательно, этот способ может быть также использован с использованием таких непатогенных грибков в качестве существенно идентичных клеток, которые трансформированы векторами, посредством чего могут быть получены улучшения в этих штаммах. Предпочтительными примерами грибков,служащих в качестве эукариотической клетки в способах данного изобретения, являются Epidermophyton spp., Trichophyton spp., Microsporum spp., Candida albicans, Philophora spp., Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis,Cryptococcus neoformans, Aspergillus spp., Saccharomyces cerevisiae, Klyveromyces lactis и Piccia pastoris. В противоположность грибковым клеткам,клетки простейших являются только патогенами для человека и других млекопитающих, хотя некоторые простейшие образуют часть биокультур, проводящих биологическую очистку сточных вод. Таким образом, способ данного изобретения рассматривается как применимый в идентификации новых мишеней для агентов против простейших. В этом контексте, предпочтительные клетки простейших, используемые в качестве существенно идентичных клеток в способах данного изобретения, выбраны из группы,состоящей из Giardia lamblia, Trichomonas vaginalis, Dientamoeba fragilis, Trypanosoma spp.,Leishmania spp., Entamoeba histolytica, Naegleriacoli. Клетки растений, в соответствии с данным изобретением, также представляют интерес в качестве эукариотических клеток-мишеней. Клетки растений могут быть клеткой любого растения, которая может быть подвергнута способам генной инженерии, позволяющей экспрессию и рост отдельных клеток. Так, примерами клеток растений, применимых в данном изобретении, являются клетки, полученные,например, из Nicotiana tabacum (растения табака), Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Brassicajuncea, Musa sp. (растения банана), риса и кукурузы. Лицо с квалификацией в данной области сумеет выбрать подходящие клетки растений в подходящей стадии их жизненного цикла, подходящие векторные системы, а также подходящие способы трансформации. Короткое резюме дается здесь. Как и другие организмы, клетки растений могут быть трансформированы чужеродной ДНК. Одна из стратегий трансформации растений использует Agrobacterium tumefaciens, природно встречающуюся патогенную бактерию растений, которая содержит плазмиду (Tiплазмиду), способную входить в клетки растений и встраивать часть ее генома в хромосомы растений. Ti-плазмида была сконструирована при помощи генной инженерии в качестве вектора для трансформации растений путем включения последовательностей для репликации в Е.coli и Agrobacterium, уникальных сайтов рестрикции для встраивания чужеродных генов и селектируемых маркеров. К сожалению, Agrobacterium не является эффективной в трансформации однодольных растений, большой группы растений, которые включают в себя все важные для сельского хозяйства злаки. Бобовые, другую важную группу пищевых культурных растений, также трудно трансформировать и регенерировать с использованием Agrobacterium. Таким образом, была разработана вторая стратегия для трансформации растений, включающая в себя способ "генной пушки", в котором ген встраивают в экспрессирующий вектор и наносят на гранулы. Покрытые ДНК гранулы вводят затем с использованием "генной пушки" в клетки растений,где небольшая фракция поглощается и включается в ДНК. Индивидуальные клетки растений,каллюс, регенерирующие проростки и эмбрионы являются подходящими мишенями в этом способе. Для определения, действительно ли клетки включили чужеродную ДНК и стали трансгенными, используют репортерные гены, такие как ген GUS и ген люциферазы. В любом случае,чужеродные гены могут быть фланкированы промотором растений для возможности экспрессии. Предпочтительным является использование клеток, происходящих из животных. Эти 21 клетки могут быть клетками млекопитающих,клетками членистоногих, такими как клетки насекомых, клетками птиц и клетками рыб. Может быть перечислен ряд причин для использования таких типов клеток, каждый из которых требует соответствующего выбора систем трансформации и экспрессии, условий роста и т.д., причем все они могут быть легко определены и выбраны специалистом в данной области. Достаточно заметить, что, например, некоторые насекомые вызывают огромные проблемы в человеческом обществе (вследствие их прямых повреждающих активностей или вследствие их функций в качестве носителей инфекционных агентов), и, следовательно, способ данного изобретения мог бы дополнять попытки борьбы с такими насекомыми. Что касается млекопитающих, птиц и рыбы, большое число этих животных имеют важное сельскохозяйственное и водохозяйственное значение, где представляет интерес борьба с их заболеваниями. Согласно данному изобретению, клетки млекопитающих, такие как клетки человека/клеточные клоны или клеточные линии человека, являются наиболее предпочтительными. Это обусловлено тем фактом, что большое число заболеваний человека и других млекопитающих этиологически зависит от молекулярных взаимодействий в живой клетке - таким образом, большой интерес представляет собой обеспечение лекарственных средств или соединений-примеров, взаимодействующих in vivo с биомолекулами, которые играют роль в заболеваниях. Предпочтительными клетками млекопитающих являются клетки яичника Китайского хомячка (СНО), клетки Vero, клетки HeLa, клетки W138, клетки ВНК, клетки COS-7 293 и клетки MDCK, все из которых являются хорошо известными в данной области. Таким образом, тестируемые нуклеиновые кислоты вводят в эукариотические клетки в виде части вектора для скрининга на модуляторы активности фермента-мишени. Под термином"вводят в" имеют в виду, что эти нуклеиновые кислоты входят в клетки таким образом, что они являются пригодными для последующей экспрессии этой нуклеиновой кислоты. Способ введения в значительной степени диктуется типом клетки-мишени, см. ниже. Примерные, но не ограничивающие изобретение способы включают в себя преципитацию с фосфатом кальция, слияние с липосомами, способ с использованием липофектина, электропорацию,инфицирование вирусом и т.д. Случайно модифицированные нуклеиновые кислоты предпочтительно интегрируются в геном клетки-хозяина (например, посредством ретровирусной инфекции клетки-хозяина) или могут существовать временно или стабильно в цитоплазме (т.е. посредством использования традиционных плазмид, использующих стан 003637 22 дартные регуляторные последовательности, селектируемые маркеры и т.д.). В настоящее время наиболее производительные методологии переноса генов для клеток млекопитающих используют способность сконструированных генной инженерией вирусов,таких как ретровирусы, для обхода природных клеточных барьеров для поглощения экзогенных нуклеиновых кислот. Этот вектор выбран предпочтительно из группы, состоящей из ретровирусного вектора,вектора-вируса коровьей оспы, аденовирусного вектора, вектора-аденоассоциированного вируса(AAV), вектора-вируса простого герпеса (HSV),альфа-вирусного вектора и вектора-вируса лесов Семлики (semliki forest virus). Ретровирусная трансдукция Поскольку многие фармацевтически важные скрининги требуют в качестве мишеней клеток человека или модельных животных,предпочтительными являются ретровирусные векторы, способные трансфицировать такие мишени. Таким образом, тестируемые нуклеиновые кислоты являются предпочтительно частью ретровирусного вириона, который инфицирует эти клетки. Обычно инфицирование этих клеток является прямым с использованием усиливающего инфицирование реагента полибена. Инфицирование может быть оптимизировано таким образом, что эти клетки преимущественно экспрессируют единственную конструкцию каждая, например, с использованием отношения числа вирусных частиц к числу клеток. Альтернативно, можно "отделять скринингом" клетки,которые были инфицированы более, чем одним единственным вирионом, например, посредством количественной оценки селектируемого маркера и только. Хорошо известно, что скорость инфицирования происходит согласно распределению Пуассона. Предпочтительный вариант данного изобретения, в котором существенно идентичными клетками являются эукариотические клетки,предусматривает стадию (а), проводимую путем 1) трансфекции подходящих упаковывающих клеток векторами, которые содержат случайно модифицированные нуклеотидные последовательности и которые способны интегрироваться в вирионы, продуцируемые указанными упаковывающими клетками,2) культивирования указанных трансфицированных упаковывающих клеток в культуральной среде в условиях, которые облегчают продуцирование упаковывающими клетками вирионов, содержащих случайно модифицированные нуклеотидные последовательности,3) извлечения и необязательно концентрирования указанных вирионов и 4) трансдукции указанных существенно идентичных клеток этими вирионами. 23 Таким образом, предпочтительно тестируемые нуклеиновые кислоты вводят в существенно идентичные клетки с использованием ретровирусных векторов. Это применение является хорошо известным в области хелпердефектных упаковывающих клеточных линий,которые способны продуцировать все необходимые белки (gag, pol и env), требующиеся для упаковки, процессинга, обратной транскрипции и интеграции рекомбинантных геномов, см. ниже обсуждение таких клеточных линий. Те молекулы РНК, которые имеют в цис сигнал для упаковки , упаковываются в созревающие вирионы. В эукариотах, ретровирусы являются предпочтительными по ряду причин. Вопервых, из них довольно легко получить производные. Во-вторых, в противоположность опосредованной аденовирусами доставке генов,экспрессия из ретровирусов является долгосрочной (аденовирусы не способны к интеграции). Аденоассоциированные вирусы имеют ограниченное пространство для генов и регуляторных единиц и существует некоторая полемика в отношении их способности к интеграции. Таким образом, ретровирусы обеспечивают в настоящее время наилучший компромисс в связи с долгосрочной экспрессией, генетической пластичностью и стабильной интеграцией, среди прочих признаков. Основным преимуществом ретровирусов является то, что их интеграция в геном хозяина делает возможной их стабильную передачу посредством клеточного деления. Это гарантирует то, что в типах клеток,которые подвергаются множественным независимым стадиям созревания, такого как развитие гемопоэтических клеток, ретровирусная конструкция будет оставаться резидентной (сохраняющейся в геноме) и продолжать экспрессироваться. Предпочтительные ретровирусные векторы включают в себя векторы, происходящие из ретровируса, выбранного из группы, состоящей из вируса лейкоза-саркомы птиц (ALSV), вируса типа С млекопитающих, вируса типа В млекопитающих и лентивируса, а также векторы,происходящие из MSCV (мышиного вируса стволовых клеток), модифицированного вирусаMFG, и рВАВЕ, и необязательно модифицированные гетерологичными цис-действующими элементами. Как правило, ретровирусные векторы должны содержать так мало, как это только возможно вирусных последовательностей, чтобы минимизировать потенциальные события рекомбинации. Должны быть сохранены только последовательности, необходимые для упаковки, обратной транскрипции и интеграции, так же как последовательности вирусного промотора, энхансера и полиаденилирования. Библиотека случайных нуклеотидов может быть генерирована в каркасе ретровирусной конструкции ДНК, как в общем описано, на 003637 24 пример, в WO 97/27212. Стандартный синтез олигонуклеотидов генерирует случайную часть предполагаемого модулятора с использованием способов, хорошо известных в данной областиPractical Approach, IRL Press At Oxford University Press, 1991); библиотеки олигонуклеотидов могут быть коммерчески доступными. Библиотеки до 109 уникальных последовательностей могут быть легко генерированы в таких ДНКкаркасах. После генерирования этой ДНКбиблиотеки библиотеку клонируют в первый праймер. Первый праймер служит в качестве"кассеты", которую встраивают в ретровирусную конструкцию. Первый праймер обычно содержит ряд элементов, в том числе, например,необходимые регуляторные последовательности(рестриктазы) (клонирования и субклонирования), стоп-кодоны (предпочтительно во всех трех рамках считывания), районы комплементарности для праймирования второй цепи(предпочтительно в конце района стоп-кодона,так как в этом случайном районе могут иметь место делеции или инсерции) и т.д. Затем добавляют второй праймер, который обычно состоит из части или из всего района комплементарности для праймирования первого праймера и необязательно необходимых последовательностей для второго уникального сайта рестрикции для субклонирования. Добавляют ДНК-полимеразу для получения двухцепочечных олигонуклеотидов. Двухцепочечные олигонуклеотиды расщепляют подходящими субклонирующими рестриктазами и субклонируют в ретровирусные векторы-мишени, описанные ниже. Таким образом эти праймеры создают библиотеку фрагментов, каждый из которых содержит случайную нуклеотидную последовательность в каркасной последовательности, полученной из генетического материала, кодирующего модулятор фермента. Затем эти продукты лигирования трансформируют в бактерии, такие как Е. coli, и из полученной библиотеки получают ДНК, как описано в общих чертах в работе Kitamura, PNAS U.S.A. 92:9146-50(1995), включенной здесь в качестве ссылки. Можно использовать любое число подходящих ретровирусных векторов. Обычно ретровирусные векторы могут включать в себя: гены селектируемого маркера под контролем внутренних сайтов вхождения рибосом (IRES), что делает возможным бицистронные опероны и,следовательно, значительно облегчает отбор клеток, экспрессирующих пептиды при однородно высоких уровнях; и промоторы, запускающие экспрессию второго гена, помещенные в смысловой или антисмысловой ориентации 25 относительно 5'-LTR (длинного концевого повтора). Подходящие селектируемые гены включают в себя, но не ограничиваются ими, гены устойчивости к неомицину, бластоцидину, блеомицину, пуромицину и гигромицину, а также самофлуоресцентные маркеры, такие как зеленый флуоресцентный белок, ферментные маркеры, такие как lacZ, и поверхностные белки,такие как CD8, и т.д. Эти ретровирусы могут включать в себя индуцируемые или конститутивные промоторы. Например, имеются ситуации, в которых необходимо индуцировать экспрессию пептидов только во время определенных фаз процесса отбора. Например, схема для обеспечения провоспалительных цитокинов в некоторых случаях должна включать в себя индуцированную экспрессию этих пептидов. Это объясняется тем, что имеется некоторое ожидание, что сверхэкспрессия провоспалительных лекарственных средств может быть в долгосрочном периоде вредной для роста клеток. Поэтому, в этой ситуации конститутивная экспрессия является нежелательной, и синтез этого пептида включается только во время той фазы процесса отбора, когда требуется этот фенотип, и затем этот пептид исключается выключением ретровирусной экспрессии для подтверждения эффекта или гарантии долгосрочного выживания клеток-продуцентов. Квалифицированному специалисту известно большое количество как индуцируемых, так и конститутивных промоторов. Кроме того, можно сконструировать ретровирусный вектор, чтобы сделать возможной индуцируемую экспрессию ретровирусных вставок после интеграции единственного вектора в клетки-мишени; важно, чтобы вся система содержалась внутри единственного ретровируса. Теt-индуцируемые ретровирусы были сконструированы включением самоинактивирующегося признака (SIN) ретровирусного делеционного мутанта 3'-LTR энхансер/промотор (Hoffmann et al., PNAS U.S.A. 93:5185 (1996. Экспрессия этого вектора в клетках является фактически неопределяемой в присутствии тетрациклина или других активных аналогов. Однако, в отсутствие Tet экспрессия включается до максимума в пределах 48 ч после индукции, с однородно увеличенной экспрессией всей популяции клеток, которые захватывают индуцируемый ретровирус, что указывает на то, что экспрессия регулируется однородно в популяции инфицированных клеток. Подобная, родственная система использует мутированный Tet ДНКсвязывающий домен, так что он связывал ДНК в присутствии Tet и удалялся в отсутствие Tet. Любая из этих систем является пригодной. Согласно данному изобретению, наиболее предпочтительные векторы (описанные в примере 1) основаны на мышином ретровирусе 26 таксономии). Вирус Akv имеет высокую гомологию с ретровирусом Молони, обычно используемым в этой области. Краткое описание конструкции этих предпочтительных векторов является следующим: Эти векторы содержат химерный 5'-LTR,делающий возможной экспрессию от сильного промотора цитомегаловируса (CMV), когда транскрипция запускается из плазмиды (как при трансфекциях). После интеграции этого вектора в геном хозяина транскрипция запускается из ретровирусного LTR (как при трансдукциях). Гибкий полилинкер присутствует ниже по ходу транскрипции (справа) от сигнала упаковки. Это делает возможной инсерцию пептидных библиотек, являющуюся частью каркасной молекулы, в этом положении. Сразу же справа от полилинкера находится внутренний сайт вхождения рибосом (IRES),происходящий из вируса энцефаломиокардита(ЕМС), или внутренний промотор, происходящий из вируса SV-40. Это делает возможной эффективную трансляцию от расположенной справа экспрессионной кассеты либо САРнезависимым (IRES) образом, либо САРзависимым (внутренний промотор) образом. Несколько различных маркерных генов могут быть клонированы в эту расположенную справа (ниже по ходу транскрипции) экспрессионную кассету. Например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как Neo и Hygro, гены флуоресцентых белков, таких как EGFR, или поверхностных белков, таких как NGER. Доступность векторов, содержащих различные маркеры, делает возможной селекцию трансдуцированных клеток с использованием либо обработки лекарственными средствами, проточной цитометрии, либо разделения при помощи магнитных бус (гранул). Любой каркасный белок или маркер может быть объединен в бицистронном векторе или в векторе, содержащем внутренний промотор SV40. Таким образом, ввиду вышесказанного,предпочтительным является, чтобы ретровирусный вектор имел неидентичные концы, так чтобы облегчить генерацию на основе ПЦР случайных последовательностей ДНК. Кроме того,предпочтительно, чтобы эти неидентичные концы содержали неидентичные промоторы. Особенно предпочтительный ретровирусный вектор содержит гетерологичный промотор, заменяющий вирусный промотор в 5'-LTR, такой как промотор CMV, промотор RSV, промотор SV40, промотор ТК, промотор МТ или индуцируемую систему, такую как Tet или Ecdysone. Особенно хорошо пригодными ретровирусными системами трансфекции (упаковывающими клетками) являются РЕ 501 (US 4 861 719), Bosc23 (WO 94/19478), 2 (R. Mulligan/D.Schaffer) и EcoPack (Clonetech). Ретровирусная трансдукция зависит от взаимодействия между гликопротеинами оболочки вируса и рецепторами поверхности клетки-хозяина. Несомненно, двумя наиболее часто используемыми рецепторами для доставки ретровирусных генов являются экстренный рецептор (ограниченный мышиными и крысиными клетками) и амфотропный рецептор (широко распространенный как на иммортализованных клеточных линиях, так и на эмбриональных клетках млекопитающих). Существует большое число упаковывающих клеточных линий для генерирования либо экотропных, либо амфотропных вирусов. Кроме того, недавно были разработаны упаковывающие клеточные линии,которые псевдотипируют ретровирусные частицы либо GALV (гликопротеином вируса лейкоза гиббона), либо VSV G (гликопротеином вирусаG везикулярного стоматита). До недавнего времени большинство упаковывающих клеточных линий основывались на клетках NIH-3T3, таких как линии 2 и GP+86(экотропные) и РА 317, GP+AM12 и CRIP (амфотропные). Их использовали интенсивно и они работали хорошо, в частности, при получении стабильных линий-продуцентов. Однако упаковывающие клеточные линии на основе NIH-3T3 дают относительно низкие титры при генерировании вируса из временной трансфекции. На протяжении последних нескольких лет были разработаны несколько упаковывающих клеточных линий на основе высокотрансфицируемой линии клеток 293 (клеток почек эмбрионов человека). Они включают в себя клеточную линию Bosc23 (Pear et al., 1993), экотропную клеточную линию, которая, как было показано, работает очень хорошо в границах данного изобретения, а также клеточную линию EcoPack изClonetech. Преимуществом линий на основе 293 является то, что очень высокие титры (до 107 инфекционных единиц/мл, МЕ/мл) вирусного супернатанта могут быть получены из временных трансфекции всего лишь за 48 ч. В ситуации библиотеки временные трансфекции являются предпочтительными, так как это дает всем членам библиотеки шанс быть одинаково хорошо экспрессированными, без какой-либо неодназначности, вводимой экспрессией от различных сайтов интеграции. Наличие доступа к хорошо охарактеризованным стабильным упаковывающим клеточным линиям является решающим для связанных 28 с генной терапией проектов, однако, для целей данного изобретения не является необходимым использование таких хорошо определенных линий, так как эти библиотеки всегда будут получать из временных трансфекции и нет необходимости получения стабильной"линиипродуцента". Альтернативной стратегией для достижения вхождения в немышиные клетки,которое исследовали авторы данного изобретения, является, таким образом, использование гетерологичного гликопротеина вирусной оболочки для псевдотипирования вирусов, получаемых в экотропных упаковывающих клеточных линиях, например, гликопротеина из вируса везикулярного стоматита (белка G VSV). VSVG-псевдо-типирование ретровирусов представляет интерес по двум причинам. Во-первых,рецепторы клеточной поверхности для VSV G являются вездесущими мембранными компонентами, такими как фосфатидилсерин и ганглиозиды. Таким образом, псевдотипирование при помощи VSV G придает широкий тропизм вирионам. Во-вторых, белок VSV G является чрезвычайно стабильным, как только он включается в вирионы. Это является важным, так как это позволяет концентрировать вирусный супернатант при помощи ультрацентрифугирования, стадии, которая может увеличивать вирусные титры на единицу объема в 10-100 раз. Белок VSV G является высокофузогенным(обладает высокой способностью к слиянию) и,вследствие этого, проявляет цитотоксичность в культуре ткани. Поэтому невозможно получить упаковывающие клетки, которые конститутивно экспрессируют VSV G. Для обхода этой проблемы были разработаны индуцируемые системы (Ory et al., 1996). Однако поскольку ретровирусные библиотеки CellScreen получают с использованием временных трансфекций, очень простой альтернативой является временная трансфекция VSV G, вместе с библиотекой, в экстренную упаковывающую клеточную линию,такую как Воsс 23. Этот подход позволяет получать вирусные супернатанты широкого тропизма и с высокими титрами, до того как в культуре наблюдается тяжелая токсичность. С использованием этого способа авторы данного изобретения испытывали панель не-мышиных линий клеток-мишеней на способность к трансдукции и получали рутинно титры до 107 ИЕ/мл вирусных супернатантов. Недавно сообщенной альтернативой псевдотипированию VSV G является псевдотипирование гликопротеином оболочки вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV) (см. Mileticet al., 1999, J. Virol. 73:6114-6116). Эта альтернатива включена также в качестве варианта данного изобретения. После получения в упаковывающих клетках, концентрирование вируса может быть выполнено следующим образом. Обычно ретровирусы титруют нанесением содержащего ретро 29 вирус супернатанта на индикаторные клетки,такие как NIH-3T3, и затем измерением процента клеток, экспрессирующих фенотипические последствия инфицирования. Концентрацию вируса определяют умножением процента клеток, инфицированных вирусом, на фактор разведения, принимая во внимание число клетокмишеней, доступных для получения относительного титра. Если ретровирус содержит репортерный ген, такой как lacZ, то инфицирование, интеграцию и экспрессию рекомбинантного вируса измеряют гистологическим окрашиванием на экспрессию lacZ или проточной цитометрией (FACS). Обычно ретровирусные титры, получаемые даже из самых лучших клетокпродуцентов, не превышают 107 на мл, если только концентрирование не выполняют на относительно дорогом или экзотическом оборудовании. Однако авторы считают, что такие большие частицы, как ретровирус, не будут перемещаться очень далеко посредством брауновского движения в жидкости, гидроаэродинамические предсказания показывают, что большая часть этого вируса никогда не приходит в контакт с клетками для инициирования инфекции. Однако, если клетки выращивают или помещают на поверхность пористого фильтра и ретровирусу дают проходить через эти клетки при постепенном гравиметрическом протекании, все время может эффективно поддерживаться высокая концентрация вируса вокруг клеток. Таким образом наблюдали в 10 раз более высокую инфекционность путем инфицирования клеток на пористой мембране, давая супернатанту вируса протекать через них. Это должно давать титры 109 после концентрирования. После выделения/концентрирования вируса существенно идентичные клетки-мишени трансдуцировали с использованием способов,хорошо известных в данной области. В применениях, когда эффекторные молекулы с онкогенным потенциалом присутствуют в конкретной библиотеке, важно использовать ретровирусные супернатанты, которые являются неинфекционными для человека. В этих случаях, в представляющую интерес клеткумишень может быть введен экотропный рецептор и вирусы могут быть получены с использованием экотропной системы. Экотропный рецептор представляет собой переносящий катионную аминокислоту белок (mСАТ), который,как было показано, придает чувствительность к инфицированию экстренным вирусом (Albrittonet al., 1989). Экспрессия этого рецептора в различных клетках человека, в том числе лимфоцитах, была документирована в литературе (Hitoshi et al., 1998). Авторы этого изобретения показали, что введение mСАТ, как стабильной трансфекцией, так и трансдукцией (с использованием ретровирусного вектора, кодирующего 30 ются высоковосприимчивыми к инфекции генерируемыми Ваsс 23 вирионами. Таким образом, обсужденные выше клеточные линии и другие способы получения ретровируса применимы для получения вируса временной трансфекцией. Этот вирус может либо использоваться непосредственно, либо использоваться для инфицирования другой клетки-продуцента ретровируса для расширения библиотеки. Партнеры слияния Как упоминалось выше, часто является желательным слияние продукта экспрессии, по меньшей мере, с одним партнером слияния, которое облегчает экспрессию и/или очистку/выделение и/или дополнительную стабилизацию продукта экспрессии. В эукариотах партнер слияния часто является сигналом сортинга или нацеливающей последовательностью. Такой сигнал сортинга будет находиться в форме сигнального пэтча или сигнального пептида. Хорошо известной функцией сигнала сортинга является осуществление экспорта экспрессируемого пептида в эндоплазматический ретикулум, в аппарат Гольджи,в лизосомы, в секреторные пузырьки, в митохондрии, в пероксисомы или в ядро. Конечно,возможными функциями являются также экспорт в мембрану или из клетки. Предпочтительно, сигнал сортинга или нацеливающая последовательность выбраны из группы, состоящей из сигнала ядерной локализации (NLS), такого как Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val (NLS большой Т-антиген SV40), Ala-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro(NFkB р 50), Glu-Glu-Lys-Arg-Lys-Arg-Thr-TyrGlu (NFkB р 65) и Ala-Val-Lys-Arg-Pro-Ala-AlaThr-Lys-Lys-Ala-Gly-Gln-Ala-Lys-Lys-Lys-LeuAsp (NLS нуклеплазмин Xenopus); мембраносвязывающей (якорной) последовательности, такой как полученные из CD8,ICAM-2, IL-8, CD4 и LFA-1, и последовательности липидирования, такой как последовательность миристилирования или пальмитоилирования; лизосомного сигнала сортинга, такого как последовательность лизосомной деградации и последовательность лизосомной мембраны; последовательности митохондриальной локализации, такой как последовательность митохондриального матрикса, последовательность митохондриальной внутренней мембраны, последовательность митохондриального межмембранного пространства и последовательность митохондриальной наружной мембраны; и последовательности локализации в эндоплазматическом ретикулуме, такой как последовательность из калретикулина (KDEL) и последовательность из белка аденовируса Е 3/19 К 31 пероксисомной последовательности, такой как последовательность пероксисомного матрикса из люциферазы; последовательности фарнезилирования,такой как LNPPDESGPGCMSCKCVLS; последовательности геранилгеранилирования, такой как LTEPTQPTRNQCCSN; последовательности расщепления, такой как RTALGDIGN; и секреторной сигнальной последовательности, такой как секреторные сигналы из IL-2, гормона роста, препроинсулина и белка НА вируса гриппа. Модуляторы-ферменты, применимые в данном изобретении В данной области продемонстрировано существование многочисленных эффективных пептидных модуляторов активности ферментов. Особенно хорошо охарактеризованы ингибиторы ферментов. Неограничительные примеры,включенные здесь в качестве ссылки, перечислены ниже: Семейство BPTI/Kunitz ингибиторов протеаз Ингибитор трипсина поджелудочной железы (BPTI) из Bos taurus; Ингибитор трипсина селезенки из Bos taurus; Легкая цепь ингибитора интер-альфатрипсина (бикунин) из Bos taurus, Homo sapiens,Meriones unguiculatus, Mesocricetus auratus, MusManduca sexta; Ингибитор трипсина молозива из Bos taurus; Трипстатин из Rattus norvegicus; Ингибитор протеиназы из Tachypleus tridentatus; Ингибитор сывороточной основной протеазы из Bos taurus; Ингибитор химотрипсина SCI-III из Bombyx mori; Ингибитор сериновой протеазы мужской добавочной железы из Drosophila funebris; Ингибитор протеазы 5 II из Anemonia sulcata; Ингибиторы химотрипсина SCI-I и SCI-II из Bombyx mori; Ингибиторы протеиназы SHPI и SHPI-2 изStoichactis helianthus; Изоингибитор К из Helix pomatia; Ингибитор трипсина IV из Radianthus macrodactylus; Ингибиторы IX и VIIIB щелочной протеазы яда из Bungarus fasciatus; Ингибиторы I и III щелочной протеазы яда из Vipera ammodytes ammodytes; 32 Ингибитор II щелочной протеазы яда изDaboia russelli siamensis, Hemachatus haemachatus и Naja nivea, соответственно; Ингибиторы В и Е щелочной протеазы яда из Dendroaspis polylepis polylepis; Ингибитор химотипсина яда из Naja naja; Ингибиторы I и К щелочной протеазы яда из Dendroaspis polylepis polylepis; Ингибитор К щелочной протеазы яда изDendroaspis angusticeps; Ингибитор трипсина яда из Eristocophismacmahoni и Naja naja, соответственно; Ингибитор протеазы из Sarcophaga bullata; Ингибитор пути тканевого фактора изHomo sapiens, Oryctolagus cuniculus и Rattus norvegicus, соответственно; Ингибитор 2 пути тканевого фактора изRattus norvegicus, соответственно и Орнитодорин из Ornithodoros moubata,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Серпиновое семейство ингибиторов протеаз Ингибиторы альфа-1-протеиназы (альфа-1 антитрипсинов) из Equus caballus, Mus musculus,Cavia porcellus, Oryctolagus cuniculus, Bos taurus,Chinchilla villidera, Didelphis marsupiales virginiana, Homo sapiens, Macropus eugenii, Mus caroli,Papio anubis, Sus scrofa, Rattus norvegicus и Ovissapiens; Контрапсин из Mus musculus и Cavia porcellus; Контрапсин-подобные ингибиторы протеаз из Rattus norvegicus; Ингибитор фактора XIIa из Bos taurus; Полученный из глии нексин (нексин I протеазы) из Homo sapiens, Mus musculus и Rattusmusculus, Oryctolagus cuniculus и Rattus norvegicus, соответственно; Белок теплового шока 47 кДа (ингибитор сериновой протеазы J6) из Mus musculus и Gal 33Homo sapiens; Ингибитор эластазы лейкоцитов из Equuscaballus, Homo sapiens и Sus scrofa, соответственно; Ингибитор протеина С из Homo sapiens; Каллистатин из Homo sapiens; Калликреинсвязывающий белок из MusRattus norvegicus; Ингибитор 1 сериновой протеиназы из поксвируса (вируса группы оспы) коров, поксвируса кроликов, поксвируса свиней, вируса коровьей оспы и вируса оспы, соответственно; Ингибитор 2 сериновой протеиназы из поксвируса кроликов, вируса коровьей оспы и вируса оспы, соответственно; Ингибитор 3 сериновой протеиназы из вируса коровьей оспы и вируса оспы, соответственно; Серпин 1 из вируса миксомы; Ингибитор сериновой протеиназы из Halocynthia roretzi;Ice-ингибитор из вируса коровьей оспы(ингибитор тиоловой протеазы); а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.Kazal-семейство ингибиторов протеаз: Ингибиторы акрозина из Bos taurus, Homosapiens, Sus scrofa и Macaca fascicularis, соответственно; Ингибитор эластазы из Anemonia sulcata; Овоингибитор из Gallus gallus; Родниин из Rhodnius prolixus; Секреторный ингибитор трипсина поджелудочной железы из Rattus norvegicus, Anguillasapiens, Sus scrofa и Ovis aries, соответственно; Секреторный ингибитор II трипсина поджелудочной железы из Rattus norvegicus; Двуголовчатый ингибитор протеазы (подчелюстной железы) из Canis familiaris, Felis silvestris catus, Meles meles, Panthera leo и Vulpes 34 Ингибитор трипсина из Halocynthia roretzi; Ингибитор триптазы из Hirudo medicinalis; Секреторный гликопротеин предстательной железы из Mus musculus; Овомукоид (третий домен) из Aburriaellioti, Syrmaticus humiae, Syrmaticus soemmerringii, Lagopus leucurus и Vultur gryphus, соответственно,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Семейство ингибиторов протеаз, включающее в себя ингибиторы трипсина сои (Kunitz): Ингибитор аспарагиновой протеиназы изSolanum tuberosum; Ингибиторы катепсина D из Solarium tuberosum; Индуцируемый поранением ингибитор аспарагиновой протеиназы из Solarium tuberosum; Предшественник ингибитора 3 химотрипсина из Psophocarpus tetragonolobus; Ингибитор трипсина из Adenanthera pavonina; Ингибитор трипсина из Prosopsis juliflora; Ингибитор трипсина из Erythrina caffra; Ингибитор трипсина из Erythrina latissima; Ингибитор химотрипсина из Erythrina variegata; Ингибиторы трипсина 1 А, 1 В и 2 изAlocasia macrorrhiza; Ингибитор трипсина из Albizzia julibrissin; Ингибитор трипсина из Acacia confusa; Ингибиторы трипсина А, В и С из Glycinemax; Ингибиторы трипсина KTI1 и KTI2 из Glycine max; Ингибитор сериновой протеиназы латекса из Carica papaya; Ингибитор цистеиновой протеиназы PCPI 8.3 из Solanum tuberosum и Ингибиторы 1 и 2 типа ингибиторов Kunitz(PKI-1) из Solanum tuberosum,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Семейство ингибиторов протеаз типа ингибиторов I картофеля Ингибитор трипсина/субтилизина из Amaranthus caudatus; Ингибитор субтилизина из Momordica charantia; Индуцированный поранением ингибитор I протеиназы из Lycopersicon esculentum, Lycopersicon peruvianum и Solanum tuberosum, соответственно; Ингибиторы субтилизина I и II из Phaseolus angularis; Ингибитор I протеиназы из Solanum tuberosum;Hordeum vulgare; Ингибитор I химотрипсина,субъединицы a, b и с из Solanum tuberosum; Ингибитор субтилизина из Vicia faba; Чувствительный к этилену ингибитор протеиназы из Lycopersicon esculentum; Ингибиторы протеиназы I-A и I-B изNicotiana tabacum; Эглин С из Hirudo medicinalis; Ингибитор трипсина и фактора Хагемана из Cucurbita maxima; Ингибитор трипсина MCI-3 из Momordicacharantia и Ингибитор I трипсина из Nicotiana sylvestris,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.Bowman-Birk-семейство ингибиторов протеаз Ингибиторы протеаз типа Bowman-Birk изfaba и Vigna unguiculata, соответственно, и Индуцированные поранением ингибиторы трипсина из Medicago sativa и Zea mays, соответственно, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Семейство Squash ингибиторов протеаз Ингибитор эластазы из Momordica charantia; Ингибиторы I, II и III трипсина из Lagenaria leucantha; Ингибитор трипсина I из Citrullus vulgaris; Ингибиторы I, III и IV трипсина из Cucurbita maxima; Ингибиторы I и II трипсина из Luffa cylindrica; Ингибиторы I и II трипсина из Momordicapepo и Ингибитор трипсина А из Momordica charantia,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Семейство ингибиторов субтилизинаStreptomyces (SSI) Ингибитор субтилизина из StreptomycesStreptomyces griseoincarnatus; Ингибитор протеазы из Streptomyces lividans и Плазминострептин из Streptomyces antifibrinolyticus,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Семейство Bombyx ингибиторов протеаз Ингибитор F грибковой протеазы (FPI-F) из Bombix mori, a также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников,чем Bombyx mori. Ингибиторы wap-типа "Four-disulfide Core"(с четырьмя дисульфидными связями в коре) протеиназ Антилейкопротеиназа 1 из Homo sapiens иMus musculus, соответственно; Элафин из Homo sapiens и Sus scrofa, соответственно, и Хелонианин (ингибитор основной протеазы) из красной морской черепахи, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Гирудиновое семейство ингибиторов протеаз Гирудины из Hirudo medicinalis и Hirudinaria manillensis, соответственно, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. 38 Ингибиторы фактора Ха Антистазин из Haementeria officinalis,Haementeria ghilianii, Hirudo medicinalis, Hirudonipponia и Hydra magnipapillata, соответственно,а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Семейство ингибиторов трипсина Ascaris Ингибиторы химотрипсина/эластазы изAscaris suum и Ингибитор трипсина из Ascarissuum. Цистатиновое семейство ингибиторов протеаз Ингибиторы 1 и 2 цистеиновой протеиназы лейкоцитов из Sus scrofa; Стефины 1, 2 и 3 из Mus musculus; Цистатины А 1, А 5, А 8 и В из Sus scrofa; Цистатины А и В из Bos taurus; Стефин С из Bos taurus; Цистатин В из Ovis aries; Цистатины А, С, D, M, SN, S и SА из Homosciureus, соответственно; Цистатин альфа (ингибитор эпидермальной тиоловой протеиназы) из Rattus norvegicus; Цистатин В (ингибитор тиоловой протеиназы печени) из Homo sapiens и Rattus norvegicus, соответственно; Цистатин (ингибитор тиоловой протеиназы молозива) из Bos taurus; Цистатины из Gallus gallus и Coturnix coturnix japonica, соответственно; Цистатин из Cyprinus carpio; Цистатин из Bitis arientas; Цистатин I из Zea mays; Оризацистатин-I из Oryza sativa; Оризацистатин-II из Oryza sativa; Цистатин А из Helianthus annuus; Цистатин В из Helianthus annuus; Цистатин из Vigna unguiculata; Онхоцистатин из Onchocerca volvulus; Ингибитор цистеиновой протеиназы изRattus norvegicus, соответственно,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Калпаиновое семейство ингибиторов цистеиновых протеаз Калпастатин из Bos taurus, Cercopithecusaries, соответственно, а также ингибиторы, го 39 мологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Тканевый ингибитор семейства металлопротеиназ Ингибитор 1 металлопротеиназы из Bostaurus, Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus и Gallus gallus, соответственно,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Ингибиторы карбоксипептидазы А Ингибитор карбоксипептидазы А из Ascaris suum, а также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников, чемAscaris suum. Ингибиторы металлокарбоксипептидазы Ингибиторы металлокарбоксипептидазы из Lycopersicon esculentum и Solanum tuberosum,соответственно, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников,чем упомянутые конкретно здесь. Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента Ингибитор ангиотензин-превращающего фермента из Thunnus albacares; Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента из Bothrops insularis; Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента из Bothrops jararaca; Ингибитор ангиотензин-превращающего фермента из Agkistrodon halis blomhoffi; Ингибитор ангиотензин-превращающего фермента из Agkistrodon halis pallas и Ингибитор ангиотензин-превращающего фермента из Vipera aspis,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Ингибиторы протеаз, не принадлежащие к конкретному семейству Экотин из Escherichia coli; Ингибитор металлопротеиназ из Streptomyces nigrescens; Ингибитор протеиназ из Erwinia chrysanthemi; Ингибитор протеиназ из Pseudomonascerevisiae; Ингибиторы 1 и 2 протеазы В из Saccharomyces cerevisiae; Ингибитор PI-3 основного пепсина из Ascaris suum; Внутриклеточный ингибитор протеиназ из 40 Ингибитор протеиназ PTI из Solanum tuberosum; Ингибитор протеиназ PTI-I из Solanum tuberosum; Ингибитор протеиназ НА из Solanum tuberosum; Ингибитор протеиназ IIB из Solanum tuberosum; Ингибиторы протеиназ А и В из Sagittariasagittifolia; Ингибитор протеиназ из Solanum melongena; Ингибитор трипсина из Brassica napus; Ингибитор трипсина 2 из Sinapis alba; Ингибитор трипсина из Zea mays; Ингибитор трипсина из Sinapis arvensis; Ингибитор трипсина из Trichosantheskirilowii; Индуцированный поранением ингибитор II протеиназы из Lycopersicon esculentum; Ингибиторы протеазы LCMI I и PMP-D2 из Locusta migratoria; Ингибитор протеазы из Bacillus brevis; Мариностатины С-1, С-2 и D из Alteromonas sp. И Ингибитор протеазы хозяина из бактериофага Т 4, а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Семейство ингибиторов альфа-амилазы/ трипсина злаков Ингибитор альфа-амилазы/трипсина СМ 1 из Triticum aestivum; Ингибитор альфа-амилазы/трипсина СМ 2 из Triticum aestivum; Ингибитор альфа-амилазы/трипсина СМ 3 из Triticum aestivum; Ингибитор альфа-амилазы/трипсина СМ 16 из Triticum aestivum; Ингибитор альфа-амилазы/трипсина СМ 17 из Triticum aestivum; Ингибитор альфа-амилазы 0.19 из Triticummays,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Ингибитор альфа-амилазы/трипсина,гомологичный тауматину Ингибитор альфа-амилазы/трипсина из ZeaHordeum vulgare; Ингибитор альфа-амилазы субтилизина из Triticum aestivum и Ингибитор альфа-амилазы субтилизина из Oryzae sative, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Ингибиторы альфа-амилаз насекомых Небольшой белковый ингибитор альфаамилаз 1, 2 и 3 насекомых из Sorghum bicolorStreptomyces tendae,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Ингибиторы трегалазы Ингибитор трегалазы из Periplaneta americana, а также ингибиторы, гомологичные ему,выделенные из других источников. Ингибиторы полигалактуроназы Ингибиторы галактуроназы из Phaseolusvulgaris и Pyrus communis, а также ингибиторы,гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Ингибиторы фукозилтрансферазы Фуктинины из Rattus norvegicus, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников.norvegicus, соответственно; Белок Hint из Bos taurus, Rattus norvegicus,Homo sapiens, Mus musculus и Oryctolagus cuniculus, соответственно, и Цинксвязывающий белок 14 кДа из Brassica juncea и Zea mays, соответственно,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Ингибиторы цАМФ-зависимой протеинкиназы Ингибитор цАМФ-зависимой протеинкиназы (формы из мышц/головного мозга) изnorvegicus, соответственно,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Ингибитор циклический нуклеотидфосфодиэстеразы Ингибитор циклический нуклеотидфосфодиэстеразы из Dictyostelium discoideum, а также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников. Ингибиторы протеинфосфатазы Ингибитор 1 протеинфосфатазы из Homosubtilis, а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.TCD/MRS6-семейство ингибиторов диссоциации GDP (ГДФ) Ингибитор диссоциации GDP (ГДФ) секреторного пути из Saccharomyces cerevisiae; Ингибитор альфа диссоциации Rab GDP из 43 Ингибитор бета диссоциации Rab GDP изmusculus,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Ингибиторы АТФ-азы Ингибиторы митохондриальной АТФ-азы из Bos taurus, Caenorhabditis elegans, Pichia jadinii, Sus scrofa, Rattus norvegicus и Saccharomyces cerevisiae, соответственно, и Ингибитор натрий/калий-АТФ-азы из Susscrofa,а также ингибиторы, гомологичные им,выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Ингибиторные белки фосфолипазы А 2 Аннексии I из Bos taurus, Homo sapiens,Mus musculus, Sus scrofa, Rattus norvegicus,Oryctolagus cuniculus, Cavia cutleri, Callus gallus и Columba livia, соответственно; Аннексии III из Homo sapiens и Rattus norvegicus, соответственно; Аннексии V из Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus и Gallus gallus, соответственно; Утероглобулин из Oryctolagus cuniculus иLepus capensis, соответственно, и Ингибитор фосфолипазы А 2 из Trimeresurus flavoviridis, a также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Ингибиторы рибонуклеазыBarstar из Bacillus amyloliquefaciens; Ингибитор рибонуклеазы из Homo sapiens,Sus scrofa и Rattus norvegicus, соответственно, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь. Ингибиторы РНК-полимеразы Ингибиторы бактериальной РНКполимеразы из бактериофагов Т 3 и Т 7, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников. Ингибиторы нуклеаз присоединения ДНК Белок компетентности J из Bacillus subtilis,а также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников. Ингибиторы бета-лактамазыclavuligerus, a также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников. К этому списку ингибиторов ферментов могут быть добавлены функционально родственные ингибиторы, такие как ингибитор транспорта кальция семиналплазмин (семенной плазмин) из Bos taurus и Mus musculus, соответственно, а также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников. К приведенному выше перечню пригодных каркасных молекул для применения в данном изобретении, должны быть добавлены другие агенты, влияющие на активность ферментов. Одним представляющим интерес кандидатом является тиоредоксин. Все перечисленные выше каркасные молекулы могут быть заменены эффективной частью полной молекулы. Свойства каркасной молекулы Поскольку библиотека пептидов предположительно может достигать любого компартмента клетки, выгодно, чтобы каркасный белок ингибитора фермента не был слишком большим и чтобы он был стабильным, например, к протеолитическому разрушению и нечувствительным к восстанавливающей среде в эукариотических клетках. Таким образом, его функционирование предпочтительно не должно зависеть от образования дисульфидных связей, так как они не образуются в цитозоле или ядре таких клеток. Кроме того, каркасный белок должен содержать одну или несколько обнаженных петель, в которые пептиды могут быть встроены без заметного изменения структуры или стабильности данного белка. На основе этого ингибитор 2 А химотрипсина (см. обсуждение ниже) является подходящим каркасом, но и другие каркасы,такие как приведенные ниже примеры, могли бы также использоваться. Члены библиотеки пептидов, введенные в клетки-мишени, могут вызывать изменение фенотипа клеток-мишеней либо прямым, либо непрямым (трансдоминантным) взаимодействием. Однако способ данного изобретения не только делает возможной идентификацию последовательности пептида или рибонуклеиновой кислоты, которая ответственна за прямое или опосредованное действие на фенотип, но также позволяет очистить, выделить и идентифицировать молекулу-мишень, с которой взаимодействует этот пептид. В данном описании полученный из ячменя ингибитор 2 А химотрипсина использовали в качестве примера, в основном потому, что этот белок очень хорошо охарактеризован и является чрезвычайно стабильным. Однако должно быть понятно, что применение этого ингибитора фермента в примерах никаким образом не должно ограничивать объем данного изобретения. 45 Ингибитор 2 А химотрипсина из ячменя принадлежит к большому семейству гомологичных ингибиторов протеаз, обнаруживаемых главным образом в растениях. Это семейство включает в себя ингибиторы химотрипсина ячменя 1 А, IB, 2A и 2 В, ингибитор I картофеля,индуцированный поранением ингибитор I томатов, чувствительный к этилену ингибитор томатов, ингибитор I плодов диких томатов, ингибитор субтилизина из конских бобов, ингибитор субтилизина из фасоли угловатой (адзуки), ингибитор трипсина/фактора Хагемана из тыквы,ингибитор горькой тыквы, специфический для протопластов ингибитор трипсина из Nicotianasilvestris, ингибитор субтилизина из табака, ингибитор трипсина/субтилизина из щирицы (амаранта) и ингибитор канавалии мечевидной. Единственным членом этого семейства ингибиторов, который является ингибитором нерастительного происхождения, является ингибитор эглин С эластазы/катепсина G, получаемый из пиявок. Ингибитор 2 А химотрипсина (CI-2A) был первоначально очищен из эндосперма обогащенного лизином ячменя Hiproly, и было показно, что он является прочно связывающим ингибитором микробных субтилизинов Карлсберга и Ново, а также химотрипсина. N-концевой аминокислотный остаток в CI-2A имеет защищенную аминогруппу, так как прямое секвенирование аминокислот было безуспешным. Однако большая часть аминокислотной последовательности CI-2A была определена на уровне белка. Кроме того, было показано, что CI-2A, очищенный из ячменя, процессируется на N-конце либо во время синтеза и накопления в эндосперме,либо в процессе очистки. Отсутствие 17 Nконцевых аминокислотных остатков не влияет на образование комплекса CI-2A с субтилизинами. Путем объединения результатов аминокислотного секвенирования и секвенирования кДНК было установлено, что CI-2A состоит из 83 аминокислотных остатков в единственной полипептидной цепи, не содержащей дисульфидных связей. Блокированным (защищенным)N-концевым аминокислотным остатком является серии. Было определено, что реакционноактивным сайтом в CI-2A является пептидная связь Met59-Glu60, и было показано, что остатки в районе Ilе 56-Аrg62 участвуют в межмолекулярных контактах между ингибитором и протеазой. Трехмерные структуры не находящегося в комплексе CI-2A, а также CI-2A, находящегося в комплексе с субтилизином Novo, известны из рентгеновской кристаллографии. Трехмерная структура CI-2A была также определена при помощи ЯМР-спектроскопии, показавшей, что реакционно-активная петля CI-2A является динамической. CI-2A состоит из одной -спирали,стыкующейся с четырьмя -цепями. Поверхно 003637 46 стная петля простирается поперек свободной стороны этого листа и состоит из восьми остатков: Gly54-Tyr61. В противоположность большинству ингибиторов ферментов, CI-2A не содержит дисульфидных связей, а также сайтов гликозилирования. В определенных структурах,найдены только 64 С-концевых аминокислотных остатка (L20-G83); этот укороченный вариант сохраняет функциональность нативного белка. Сравнение комплексированной формы с двумя некомплексированными формами CI-2A выявляет небольшие различия. Наиболее явным различием является то, что петля реакционноактивного сайта, по-видимому, имеет менее упорядоченную структуру в не находящихся в комплексе формах, чем в комплексированной форме. Трехмерную структуру CI-2A в комплексе с субтилизином Novo сравнивали также с трехмерной структурой эглина С в комплексе с субтилизином Карлсберга. Эти два гомологичных ингибитора имели очень сходные вторичные и третичные структуры. Рекомбинантные варианты укороченного на N-конце CI-2A (CI-2A (L20-G83 и CI-2A сN-концевым Аsp-Рrо-удлинением широко использовали для исследования укладки и стабильности CI-2A. Структура CI-2A в комплексе с субтилизином Novo обнаружила, что число межмолекулярных контактов между ингибитором и протеазой в районе Р 4-Р 1 (Ile56-Met59) этого ингибитора является гораздо большим,чем в районе Pl'-Р 3' (Glu60-Arg62). Дополнительные аспекты изобретения После идентификации модулятора в соответствии с подробно описанными способами данного изобретения, обычно представляет интерес обеспечение его в больших количествах для целей дальнейшего исследования и разработки, в том числе возможной идентификации молекулы-мишени, с которой физически взаимодействует этот модулятор. Таким образом, данное изобретение обеспечивает также способ получения способного к репликации экспрессирующего вектора, причем этот способ предусматривает стадии идентификации модулятора с использованием способов данного изобретения и затем выделения или синтеза последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует этот модулятор, и конструирования реплицируемого экспрессирующего вектора, содержащего оперон,который содержит, в 5'-3'-направлении и в функциональной связи, 1) промотор для запуска экспрессии этой последовательности нуклеиновой кислоты, 2) необязательно нуклеотидную последовательность, кодирующую лидерный пептид, 3) последовательность указанной нуклеиновой кислоты и 4) сигнал терминации. Такие способы широко известны в области генной инженерии и молекулярной биологии. Квалифицированный специалист найдет соот 47 ветствующее руководство, например, в Sambrook, J; Fritsch, EF, Maniatis T. 1989. "MolecularSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N.Y. В этой части данного изобретения предпочтительно, чтобы промотор был индуцируемым; хотя конститутивные промоторы не исключаются. В зависимости от выбора клеткихозяина, предназначенной для несения и экспрессии вектора, промотор выбирают из группы, состоящей из бактериального промотора,грибкового промотора, такого как промотор дрожжей, и промотора млекопитающего. Вектор может быть в форме плазмиды, фага, космиды,минихромосомы или вируса, опять-таки в зависимости от выбора клетки-хозяина и других соображений, применяемых для конкретного случая. Однако, наиболее предпочтительно,чтобы экспрессирующий вектор был способен интегрироваться в геном подходящей клеткихозяина, так как в этом случае экспрессия в ней будет более стабильной во времени, чем в случае нехромосомной трансформации клеткихозяина. Хорошо известные векторные системы основаны на бактериальной плазмиде pBR322, фаге и дрожжевой плазмиде YRp7, но квалифицированному специалисту известны и другие пригодные и осуществимые возможности выбора. После обеспечения подходящего экспрессирующего вектора, как описано выше, предпочтительно, чтобы модулятор получали трансформацией подходящей клетки-хозяина экспрессирующим вектором, полученным, как описано выше. Такой клеткой-хозяином может быть бактериальная клетка (например, Е. coli,Bacillus subtilis или любая другая подходящая бактериальная клетка-хозяин), грибковая клетка(например, дрожжевая клетка, такая как Saccharomyces cerevisiae или Piccia pastoris) или клетка растения, насекомого или млекопитающего (которая может быть любой из клеток или типов клеток, обсужденных выше для использования в качестве "по существу идентичных клеток" в способе данного изобретения). После обеспечения линии клетокпродуцентов, как описано выше, теперь можно получать модулятор данного изобретения путем выращивания трансформированной клетки, полученной, как описано выше, в культуральной среде в условиях, которые облегчают экспрессию этой клеткой случайно модифицированной нуклеотидной последовательности, и затем сбора продукта экспрессии из клетки и/или культуральной среды. Альтернативно, модулятор может быть получен посредством химического синтеза модулятора на основе последовательности, определенной в стадии (е). В том случае,когда модулятор является пептидом, могут быть использованы хорошо известные способы пеп 003637 48 тидного синтеза в твердой или жидкой фазе, и также, если модулятор является рибонуклеиновой кислотой, способы его синтетического получения являются легко доступными. Важная часть данного изобретения относится к выделению/идентификации биомолекулмишеней, на которые направлен модулятор,идентификация, выделение и получение которого описано выше. Таким образом, важная часть данного изобретения относится к способу выделения и/или идентификации биомолекулымишени, предусматривающему обеспечение модулятора в соответствии со способами, описанными здесь, и затем использование этого модулятора в качестве аффинного лиганда в стадии аффинной очистки таким образом, чтобы выделить биомолекулу-мишень из подходящей пробы. Стадией аффинной очистки может быть,например, стадия аффинной хроматографии,стадия аффинной масс-спектрометрии или стадия иммунной копреципитации. Однако может быть использован любой подходящий способ выделения/очистки на основе аффинности. Альтернативно, модулятор может быть использован в качестве зонда в отношении библиотеки кДНК, полученной, по существу, из идентичных клеток или в качестве "наживки" в ди- или тригибридной системе (бактериальной,грибковой системе или системе млекопитающего). Предпочтительно, чтобы биомолекуламишень была пептидом или нуклеиновой кислотой, так как это делает возможным также определение ее последовательности. Потенциальным применением такой биомолекулы-мишени является использование ее в программе разработки лекарственных средств. Для этой цели часто является ценным выяснение или получение информации о 3-мерной структуре биомолекулы-мишени (с использованием доступных способов, например, рентгенографических исследований, ЯМР-анализа, кольцевого дихроизма и т.д.). После выделения биомолекулы-мишени,как описано выше, данное изобретение делает возможным рациональный выбор химического соединения для применения в качестве возможного лекарственного средства-кандидата в разработке лекарственных средств, причем данный способ предусматривает стадии: испытания библиотеки химических соединений на взаимодействие с биомолекулоймишенью, которая была выделена de novo в соответствии со способами данного изобретения,и отбора соединений, которые взаимодействуют в значительной степени с этой биомолекулой-мишенью. Таким идентифицированным кандидатом на лекарственное средство может быть "соединение-пример" или само соединение-кандидат на лекарственное средство. Под термином "со 49 единение-пример" в данной заявке подразумевают соединение, которое само непригодно в качестве лекарственного средства, но которое проявляет ряд свойств, которые представляют интерес в точки зрения медицинской терапии. Причиной того, что такое "соединение-пример" является непригодным, могут быть токсичность,неподходящие фармакокинетические или фарма-кодинамические свойства, трудности в получении и очистке и т.д. В таких случаях, это "соединение-пример" используют в качестве модели для de novo синтеза других химических соединений, которые конструируют таким образом, чтобы они были близкими активной части этого "соединения-примера" в трехмерной (3D) структуре и распределении заряженных, полярных и неполярных групп. Этот подход может быть уточнен первоначальной идентификацией членов библиотеки при помощи способов компьютерного моделирования лекарственных средств, основанных на структуре или основанных не на структуре. Подходящие основанные не на структуре способы описаны в патенте США 5 307 287 и патенте США 5 025 388 (способ, известный какCoMFA). Альтернативой является HASL (гипотетическая решетка активного сайта; программное обеспечение гипотез). Оба эти способа основаны на 3D-QSAR. Пригодный подход на основе структуры описан, например, в WO 95/06293. Наконец, очень важная часть данного изобретения касается способа получения лекарственного продукта, причем этот способ предусматривает стадии:a) выбора химического соединения при помощи вышеописанных способов данного изобретения,b) проведения преклинических испытаний с этим химическим соединением для оценки его пригодности в качестве лекарственного продукта,c) вступления, если химическое соединение признано пригодным в стадии b), в клинические испытания с использованием этого химического соединения для получения разрешения выхода на рынок для лекарственного продукта, включающего в себя это химическое соединение в качестве фармацевтически активного вещества, иd) при получении разрешения выхода на рынок, смешивания данного химического соединения с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или разбавителем и маркетинга полученного таким образом лекарственного продукта. Другими словами, данное изобретение включает в себя способ разработки лекарственного продукта, предусматривающий, что модулятор, идентифицированный в соответствии со способом данного изобретения, служит в качестве соединения-примера в фазе разработки, или 50 способ, в котором биомолекула-мишень, выделенная/идентифицированная в соответствии с данным изобретением, служит в качестве зонда взаимодействия в отношении предполагаемых лекарственных средств-кандидатов в фазе обнаружения лекарственного средства. Вышеописанные способы должны, конечно, учитывать все необходимые требования для удовлетворения стандартов GCP и GMP. Во всяком случае, этот способ полностью зависит от первоначального обеспечения модулятора,идентифицированного в соответствии с данным изобретением. Подписи к чертежам Фиг. 1. Схематическое представлениеpCMVbipep. Сверху представлено схематическое представление pCMVbipep, а район кДНК CI-2A расширен в иллюстрациях ниже, показывающих положение различных сигнальных пептидовpCMVbipepSL/CI-2A, соответственно. Дополнительные аминокислоты, присоединенные в CI2A, написаны в однобуквенном коде с подчеркнутыми незаменимыми аминокислотными последовательностями, необходимыми для функции. Аббревиатуры: сигнал ядерной локализации, NLS; эндоплазматичский ретикулум, ER; секреторная лидерная последовательность, SL; сигнал удерживания, RS. Фиг. 2. Общие экстракты из трансдуцированных CMVbipep/CI-2A клеток способны ингибировать протеазную активность субтилизина. Субтилизин инкубировали с увеличивающимися количествами экстрактов из указанных клеточных линий, трансдуцированных либо(NIH-3T3/CI-2A,U2OSmCAT/CI-2A и 293mCAT/CI-2A), и затем оценивали на остаточную протеолитическую активность. Каждую реакцию с указанной концентрацией экстракта определяли в трех повторностях и представленные скорости основаны на средних величинах. Фиг. 3. Ядерный экстракт из трансдуцированных CMVbipepNLS/CI-2A клеток NIH-3T3,но не из трансдуцированных CMVbipep/CI-2A клеток NIH-3T3, проявляет активность CI-2A. А) Субтилизин инкубировали либо с 2, либо с 10 мкл ядерного экстракта из клеток NIH3T3, трансдуцированных либо CMVbipep (-),CMVbipep/CI-2A (CI-2A), либо CMVbipepNLS/CI-2A (NLS/CI-2A) и затем оценивали на протеолитическую активность. В) Как для А, за исключением того, что использовали 0,4 или 2 мкл общего клеточного экстракта. Каждую реакцию с указанной концентрацией экстракта определяли в трех по 51 вторностях и представленные скорости основаны на средних величинах. Фиг. 4. Схематическое представление конструкций pFAB60. Верхняя панель: pFAB60/CI-2A содержит укороченный вариант CI-2A, который встроен в рамке считывания с лидерной последовательностью pelB на 5'-конце и делетированным геном,кодирующим фрагмент белка III поверхности фага М 13 (gIII), на 3'-конце. Лидер pelB направляет экспрессируемый слитый белок к бактериальной мембране, облегчая включение слитого белка CI-2A/pIII в фаговые частицы. Средняя панель: pFAB60/muCI-2A содержит кДНК CI-2A, включающую в себя сайты узнавания для рестриктаз MunII и SalI. Нижняя панель: pFAB60/muCI-2Arc имеет аминокислоты 58-61 вместо подчеркнутых 19 случайно составленных аминокислот (SEQ IDNO:38, остатки 2-20). Эти аминокислоты показаны в однобуквенных кодах и цифры относятся к немодифицированной аминокислотной последовательности CI-2A (срав. нумерацию в SEQID NO:2). Фиг. 5. CI-2A и СI-2 Аrс могут быть выставлены на поверхности фаговых частиц. Антитела против CI-2A иммобилизовали и инкубировали с 0 или 5 x 1011 фаговых частиц,полученных и очищенных согласно Johansen etal., 1995, Protein Eng. 10, pp. 1063-1067, и их определяли количественно измерением OD269. Использовали СI-2 А-отрицательные (-), CI-2A или СI-2 Аrс несущие фаговые частицы. Удержанные фаговые частицы в конце концов детектировали с использованием антител против фага, конъюгированных с пероксидазой хрена. Представленные результаты являются средними величинами из 4 независимых измерений с указанным стандартным отклонением. Фиг. 6. Конструирование представленнойCI-2A библиотеки с использованием клонирующих сайтов Muni и SalI.(SEQ ID NO:33, остатки 21-46), охватывающий сайты узнавания для MunI и SalI, превращают в двухцепочечную форму в одной реакции удлинения.B) Схематическое представление модифицированной кДНК пептидной библиотеки CI2A.C) Трехмерная структура 64 С-концевых аминокислот. Замененные аминокислоты показаны в виде белых участков с последовательностью рандомизированного гена CI-2A над ними. Фиг. 7. Конструирование представленнойCI-2A библиотеки с использованием клонирующих сайтов BamHI и SalI.A) 5'-часть кДНК CI-2A может быть приготовлена с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, которые после отжига удлиняют с использованием ДНК-полимеразы. Затем 52 полученный фрагмент может быть расщепленB) Другой стратегией является применение рандомизированного олигонуклеотида в ПЦР вместе с расположенным выше по ходу транскрипции прямым праймером. И в этом случае фрагмент BamHI/SalI может быть очищен и лигирован в pCMVbipep/muCI-2A. Предисловие к примерам Далее, данное изобретение иллюстрируется посредством примера, в котором CI-2A использовали в качестве исходной точки для способа CellScreen, приспособленного в соответствии с данным изобретением таким образом,чтобы сделать возможной внутриклеточную экспрессию каркасного белкового ингибитора,который случайным образом модифицирован в активном сайте. Этот пример не является ограничивающим, в том смысле, что другие подходящие белковые ингибиторы ферментов могли бы быть использованы вместо CI-2A. Квалифицированный специалист может легко выполнить необходимые замены и модификации, необходимые для применения принципов, приведенных в примерах ниже, с использованием других белковых ингибиторов ферментов в качестве исходной точки. Пример 1. Материалы и способы. 1-а. Конструирование pCMVbipep/CI-2A. Гибридная плазмида 5788 п.н. pCMVbipepSEQ ID NO:39 и которая показана схематически на фиг. 1 с CI-2A, встроенной справа от сигнала упаковки) состоит из происходящей из AKV ретровирусной вставки, которая была клонирована в клонирующий вектор pUC-19. Эта ретровирусная вставка содержит химерный 5'-LTR(длинный концевой повтор), делающий возможной экспрессию от сильного промотора цитомегаловируса (CMV) при запуске транскрипции из этой плазмиды. После интеграции этого вектора в геном хозяина транскрипция запускается от ретровирусного LTR. Гибкий полилинкер присутствует ниже по ходу транскрипции (справа) от сигнала упаковки. Это делает возможной инсерцию пептидных библиотек в этом положении. Непосредственно справа от полилинкера находится внутренний сайт вхождения рибосом(IRES), происходящий из вируса энцефаломиокардита (EMC) (Koo et al. 1992, фиг. 2A-G). Это делает возможной эффективную трансляцию от этой расположенной справа экспрессионной кассеты САР-независимым (IRES) образом. Маркерный ген Neo находится в расположенной справа экспрессионной кассете.pCMVbipep включает в себя химерный промотор/энхансер CMV и Akv. Он был сконструирован из векторных плазмидных конструкций PUT 649 (CAYLA, toulouse FRANCE) иEcoRI и AscI и фрагмент 2779 п.н. от положения 3293-5670 до 401 выделяли и лигировали с фрагментом 543 п.н., содержащим положения 44-548 энхансера/промотора CMV. Этот фрагмент получали ПЦР-амплификацией продукта расщепления EcoRI и AscI PUT 649 с использованием следующих двух праймеров:CCT (SEQ ID NO:41). Полученный фрагмент расщепляли AscI и лигировали с фрагментомpBiZeo-Neo (Duch et al., Biotechniques, 1999,26(6): 1032-4, 1036) BamHI и StuI. Фрагмент от 1708-6054 до 1240 лигировали с фрагментом ДНК, полученным удлинением двух олигонуклеотидов. Этими олигонуклеотидами были:ACGCGGCCGCCATG (SEQ ID N0:43). После удлинения и перед лигированием этот фрагмент ДНК расщепляли BamHI и Stul. Эта операция удаляет ген Zeo в pBiZeo-Neo и замещает их полилинкером. Для конструирования pCMVbipep/CI-2A 2 мкг pCMVbipep расщепляли BamHI/XhoI, как описано в А-5. Фрагмент 5778 п.н. очищали затем из 0,8% агарозного геля в соответствии с А 7. Фрагмент кДНК CI-2A, кодирующий аминокислоты 21-83 (срав. нумерацию аминокислот вSEQ ID NO:2) белка CI-2A дикого типа, слитые с находящимся в рамке считывания стартовым кодоном метионина, амплифицировали с использованием ПЦР из произведенной из pUC 19 плазмиды, содержащей фрагмент, кодирующий белок CI-2A дикого типа (срав. нумерацию нуклеотидов в SEQ ID NO:1) (любезный подарок от доктора Ib G. Clausen, Novo Nordic A/S, Denmark) - этот фрагмент кДНК включает в себя последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:1,где нуклеотиды 249, 252 и 279 представляют собой Т, С и Т, соответственно. Условия ПЦР в этих 4 проводимых реакциях были такими, какие описаны в А-3, с использованием следующих праймеров: CGGGATCCATGAAGACAGTGCCGACCCTGGGGACCT (SEQ ID NО:4), которые фланкируют описанный район CI-2A с сайтами узнавания для BamHI и XhoI. Эту реакционную смесь использовали для 15 трехступенчатых циклов 94 С в течение 1 мин, 60 С в течение 30 с, 72 С в течение 30 с с последующей очисткой амплифицированного фрагмента ДНК, как описано в А-3, с объемом элюции 100 мкл. Затем очищенный фрагмент ДНК расщепляли (см. раздел А-5) и очищали (см. раздел А 003637 54 7) с использованием 40 единиц BamHI и XhoI с 120 мкл в качестве конечного объема реакции. Этот фрагмент лигировали в расщепленнуюBamHI/XhoI pCMVbipep (см. раздел А-1) и подтверждали ДНК-секвенированием (раздел А-8) с использованием специфического для pCMVbipep праймера CTGTATCTGGCGGCTCCGTGG(SEQ ID NO:5). 1-b. Конструирование pmCATIREShyg. Для трансдукции не мышиных клеток ретровирусными векторами, собранными из упаковывающей клеточной линии Воsc, конструировали вектор (pmCATIREShyg), кодирующий экстренный рецептор. кДНК mСАТ получали изpJET (Albritton et al. (1989) Cell 57, pp. 659-666) и встраивали в pIRESHhyg (ClonTech) с получением pmCATIREShyg. Это выполняли расщеплением pJET в 1x буфере для рестриктазы EcoRI вместе с 2 единицами/мкл EcoRI (см. раздел А 5). Выступающие 5'-концы продукта расщепления EcoRI достаивали с использованием полимеразы Кленова в соответствии с протоколом изготовителя (New England Biolabs). После инкубирования в течение 1 ч пробу очищали экстракцией смесью фенол/СНСl3 (см. раздел А-4) с последующим расщеплением 20 единицамиBamHI в реакционном объеме 20 мкл (см. раздел А-6) и очищали на 1,0% агарозном геле (см. раздел А-7). Этот фрагмент лигировали во фрагмент 5699 п.н. BamHI/BstXI pIREShyg, полученный в виде фрагмента mСАТ, за исключением того, что тупые концы происходили из сайта BstXI. После лигирования и трансформации полученные положительные клоны выделяли и подтверждали ДНК-секвенированием (раздел А-9) с использованием следующих праймеров ACAGCTGGCCCTCGCAGAC (SEQ ID(SEQ ID NO:11). 1-c. Конструирование pCMVbipepNLS/CI2A. Олигонуклеотид, кодирующий сигнал ядерной локализации большого Т-антигена SV40, присоединяли в рамке считывания к N-концу укороченного варианта CI-2A, расположенного в pCMVbipep/CI-2A (фиг. 1). Это конструирование выполняли при помощи ПЦР (см. раздел А 2) с использованием 25 пмоль GAAGATCTATGGCGGCCGCACCAAAAAAGAAGCTGGGGACCT (SEQ ID NO:13) в качестве праймеров и pCMVbipep/CI-2A в качестве матрицы. Эту реакцию проводили в двух повторностях и использовали в 25 циклах, состоящих из 94 С в течение 1 мин, 45 С в течение 1 мин,72 С в течение 1 мин. Раствор осаждали этанолом перед очисткой ДНК-фрагмента 250 п.н. с 55 использованием 2% агарозного геля (см. раздел А-7). Концы этого фрагмента приводили в порядок добавлением 20 единиц BglII и XhoI и 6 мкл NE-буфера 3 к 60 мкл реакционного объема(см. раздел А-6), содержащего 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (New EnglandBiolabs). Продукты расщепления разделяли на 2% агарозном геле и затем очищали фрагмент 240 п.н. (см. раздел А-7) с объемом элюции 50 мкл. Этот фрагмент в конце лигировали в расщепленную BamHI/XhoI pCMVbipep (см. конструирование pCMVbipep/CI-2A) и подтверждали ДНК-секвенированием (см. А-8). 1-d: Конструирование pCMVbipepSL/CI2A и pCMVbipepER/CI-2A. Секреторный лидер (SL) амплифицировали при помощи ПЦР с использованиемpBapePuro, содержащего сигнальный пептид тяжелой цепи иммуноглобулина человекаCCGGTAGCAG (SEQ ID NO:15) в качестве праймеров. Условия реакции были такими же,какие описаны в конструировании pCMVbipepNLS/CI-2A. Амплифицированный продукт 74 п.н. после экстракции смесью фенол/СНСl3(см. раздел А-4) расщепляли BamHI и BglII, как описано в разделе А-5, за исключением того,что реакция включала в себя 1 мкл/мл бычьего сывороточного альбумина (New EnglandBiolabs). После расщепления фрагмент 68 п.н. очищали с использованием 3% плавящегося при низкой температуре агарозного геля (см. раздел А-6) с получением в результате объема 30 мкл. Расщепленный BamHI вектор pCMVbipep/CI-2A готовили по существу, как описано для конструирования pCMVbipep/CI-2A, за исключением того, что 10 единиц кишечной фосфатазы теленка (Boehringer Mannheim) присутствовали во время последнего часа инкубационного периода. Затем очищенный фрагмент, содержащий секреторный лидер, лигировали в расщепленную BamHI pCMVbipep/CI-2A (как описано в разделе А-1) с получением pCMVbipepSL/CI-2A. Положительные клоны подтверждали ДНК-секвенированием (раздел А-8) с использованием(фиг. 1) проводили присоединением сигнала удерживания к С-концу CI-2A в контекстеpCMVbipepSL/CI-2A. Сигнал удерживания присоединяли в рамке считывания с последовательностью CI-2A при помощи ПЦР с использованиемBamHI/XbaI pCMVbipepSL/CI-2A, полученный в виде расщепленной BamHI/XhoI pCMVbipep. Все параметры реакции были аналогичны описанным для конструированияpCMVbipepNLS/CI-2A. 1-е: Конструирование pCMVbipep/muCI2A. Две молчащие мутации вводили в последовательность CI-2A 5-ступенчатой ПЦРпроцедурой. Первая ПЦР производила замену С 192 А (см. нумерацию в SEQ ID NO:1) и этот продукт после очистки использовали в качестве обратного праймера для амплификации кодирующего района CI-2A в pCMVbipep/CI-2A. Этот С 192 А-мутированный фрагмент использовали в качестве матрицы для введения второй мутационной замены Т 300 С (см. нумерацию вSEQ ID NO:1) с получением тем самым ПЦРпродукта, включающего в себя ранее введенную мутацию. Этот продукт с двумя мутациями использовали в качестве прямого праймера для амплификации рамки считывания, определенной pCMVbipep/CI-2A. Все ПЦР проводили в двух повторностях и по существу выполняли,как описано в разделе А-2 с 25 циклами 94 С в течение 30 с, 55 С в течение 30 с и 72 С в течение 30 с. Продукты объединяли перед очисткой. В первой ПЦР использовали 50 нг pCMVbipep/CI-2A в качестве матрицы с 50 пмоль следующих праймеровTACAATTGTGACCATGG (SEQ ID NO:20). Продукт 248 п.н. очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR purification(ПЦР продукт 1). Вторая ПЦР состояла из 12,5 мкл ПЦР-продукта 1 и 50 пмоль CTGTATCTGGCGGCTCCGTGG (SEQ ID NO:21) в качестве праймера с 50 нг pCMVbipep/CI-2A в качестве матрицы. Всю реакционную смесь наносили на 2% агарозный гель и очищали продукт 448 п.н., как описано в разделе А-6 (ПЦР-продукт 2). Затем этот продукт использовали в качестве матрицы в третьей ПЦР, которая, кроме 12,5 мкл ПЦР-продукта 2, состояла из 50 пмольCGCGATCGATGCGATATTCC (SEQ ID NO: 23), приводящей к амплификации фрагмента 248 п.н. (ПЦР-продукт 3). Этот фрагмент очищали, как и ПЦР-продукт 2, перед использованием 12,5 мкл в качестве прямого праймера вместе с 50 пмоль CCGGCCTTATTCCAAGCGGC (SEQ ID NO:24) и 50 нг pCMVbipep/CI-2A в качестве матрицы. ДНК-фрагмент 448 п.н. с двумя мутациями после очистки на геле ПЦР-амплифицировали с использованием 50 пмоль CCGGCCTTATTCCAAGCGGC (SEQG(SEQ ID NO:26). Этот амплифицированный фрагмент с двумя мутациями встраивали вpFAB60/muCI-2A. Фрагмент кДНК CI-2A, который кодирует аминокислоты 21-83 белка дикого типа, встраивали в фагмидный вектор рFАВ 60 (Johansen etal., 1995, Protein Eng. 10, pp. 1063-7). Фрагмент кДНК СI-2 А амплифицировали при помощи ПЦР с использованием pCMVbipep/CI-2A в качестве матрицы с 10 пмоль праймеровNO:28) в 4 реакциях, проводимых в условиях,сходных с условиями, описанными для конструирования pCMVbipep/CI-2A. Очищенный фрагмент 237 п.н. и 2 мкг pFAB60 расщепляли параллельно с использованием 10 единиц NheI иNotI в 50 мл 1 х NE-буфера 4, содержащего 1 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (см. разделы А-5 и А-6). Затем расщепленные фрагменты 225 и 4655 п.н. очищали с использованием 1% агарозного геля и лигировали друг с другом (см. раздел А-7 и А-1, соответственно). Правильность инсерции в конце концов подтверждали ДНК-секвенированием с использованием CACACAGGAAACTATGA (SEQ IDNO:29) в качестве праймера (см. раздел А-8). Идентичный подход использовали для конструирования pFAB60/muCI-2A, за исключением того, что pCMVbipep/muCI-2A использовали в качестве источника кДНК CI-2A. 1-g. Конструирование pFab60/muCI-2Arc. Замену аминокислот 59-62 в полноразмерной последовательности CI-2A 19-мерной случайно составленной аминокислотной последовательностью выполняли в контексте pCMVbipep/muCI-2A и модифицированный CI-2A переносили затем в pFAB60 согласно процедуре,описанной для конструирования pFAB60/CI-2A. Кодирующий район для этой аминокислотной последовательности получали из синтетического олигонуклеотида (олиго), который амплифицировали при помощи ПЦР. Четыре параллельные реакции выполняли с использованием 12,5 пмоль CTGCCGGTGGGTACAATTGTGCTGCCCGGTGGGTACAATTG (SEQ ID NO:32). Эти реакции использовали для 25 циклов 94 С в течение 2,5 мин, 45 С в течение 2 мин и 72 С в течение 2 мин со всеми остальными условиями,описанными в разделе А-2. Продукт очищали экстракцией смесью фенол/СНС 1 з и растворяли 58 в 30 мкл стерильной Н 2O. Для облегчения встраивания в muCI-2A, к 5 мкл этого фрагмента добавляли 20 единиц MunI (Boehringer Mannheim), 5 мкл 10 x SureCut-буфера М (BoehringerMannheim) и стерильную Н 2O для доведения объема до 50 мкл и инкубировали при 37 С в течение 4 ч. После добавления 6 мкл 10 х буфера для рестриктазы SalI инкубацию продолжали в течение 4 ч. Очистку фрагмента 89 п.н. проводили с использованием 2,5% низкотемпературного агарозного геля (см. раздел А-6). Получение расщепленной Muni/Sail pCMVbipep/muCI2A было в принципе сходным с описанной выше процедурой. Четыре мкг pCMVbipep расщепляли 30 единицами MunI в 150 мкл реакционной смеси с последующим добавлением 30 единиц SalI в 50 мкл 4 х буфера для рестриктазыSalI и очищали в 1% геле, как описано в разделе А-7. Процедуры лигирования и подтверждения выполняли так же, как описано для конструирования pCMVbipep/CI-2A. 1-h. Конструирование библиотеки. Вырожденный олигонуклеотид TCTGCCGTCTTTGTCGACAAACTCG (SEQ ID NO:33) превращали в двух-цепочечную форму при помощи реакции удлинения. Этот олигонуклеотид смешивали с 3-кратным избытком CGAGTTTG(Enzyme Technologies Ltd.) и 0,2 мМ dNTP. Нагревание этой смеси до 94 С в течение 1 мин с последующими нагреванием при 45 С в течение 2 мин проводили для гарантии достаточного отжига между олигонуклеотидами перед изменением температуры на 55 С в течение 45 мин для увеличения активности полимеразы. После завершения реакции пробу экстрагировали смесью фенол/СНСl3 перед расщеплением 1/3 этого продукта 100 единицами EcoRI и SalI в 100 мкл 1 х буфера для EcoRI, содержащего 1 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (см. раздел А-6). Полностью расщепленный ДНК-фрагмент 56 п.н. очищали на 2% низкотемпературном агарозном геле (см. раздел А-6) и лигировалиpCMVbipep/muCI-2A, описанный в примере 1-g. Случайно выбранные колонии секвенировали,как описано для конструирования pCMVbipep/CI-2A. 1-i. Определение субтилизина. Клеточные экстракты разбавляли до указанных количеств в 10 мкл ЗФР и добавляли к 25 мкл 0,1 М Трис/HCl рН 8,6, содержащего 5 x 10-8 М субтилизин Карлсберга (Sigma). После инкубирования при 25 С в течение 30 мин, добавляли 25 мкл 0,1 М Трис/HCl рН 8,6, содержащего 5 мМ N-сукцинил-Аlа-Аlа-Pro-Phe-пнитроанилид (Sigma) и превращение субстрата прослеживали путем измерения поглощения при 59 405 нм каждые две минуты, пока реакция не истощалась. 1-j. Клеточные линии и условия культивирования. Все клетки культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла(DMEM), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку или 10% сыворотку новорожденного теленка, 1% L-глутамин и 50 мкг/мл смеси пенициллин/стрептомицин, и инкубировали в стандартных условиях культуры клеток. Клетки 293mСАТ и клетки U20SmCAT получают из 293 (АТССCRL-1573) и U20SpmCAT/IRES-hyg. Клетки 293 трансфицировали по способу копреципитации кальцием, описанным для трансфекции упаковывающих клеток Воsc, и клетки U20S трансдуцировали с использованием набора для трансфекции Fugene в соответствии с протоколом изготовителя (Boehringer Mannheim). Стабильные трансфектанты отбирали культивированием в присутствии 150200 мкг активного гигромицина В/мл (Sigma). После трансдукции 293mСАТ или U20SmCAT ретровирусными векторами отбор проводили в 0,6 мг/мл или 0,4 мг/мл генитицина (GibcoBRL),соответственно. Мышиную линию клеток NIH-3T3 (АТССCRL-165) после трансдукции ретровирусными векторами культивировали в присутствии 0,6 мг/мл генитицина. 1-k. Трансдукция клетокNIH-3T3,293mСАТ и U20SmCAT. Для получения ретровирусных векторных частиц полученные из pCMVbipep конструкции трансфицировали в упаковывающую клеточную линию Воsc с использованием способа СаРO4 копреципитации. Упаковывающие клетки BOSC(известные также как клетки BOSC23, см. WO 94/19478) разбавляли до 5 x 105 клеток/см 2 за день перед трансфекцией и промывали один раз в полной DMEM за 2 ч перед трансфекцией. Копреципитированные СаРO4 смеси готовили разбавлением 10 мг pCMVbipep или полученной из pCMVbipep конструкции с 10 мг ДНК спермы лосося в 450 мл ddH2O и добавлением 50 мл 2,5 М СаСl2. Эти растворы медленно добавляли к 500 мл 2x забуференному HEPES солевому раствору рН 7,05 (280 мМ NaCl, 1,5 мМNa2HPO4, 50 мМ HEPES/NaOH pH 7,05) при осторожном встряхивании с последующими двумя-пятью минутами инкубирования при 25 С перед добавлением этого преципитата к приготовленным клеткам BOSC. После 24 ч инкубации клетки промывали дважды в ЗФР (137 мМ NaCl, 2,7 мМ КСl, 8,3 мМ Na2HPO4, 1,4 мМ КН 2 РO4) и культивировали далее в 10 млDMEM, содержащей добавки, в течение дополнительных 24 ч. Среды от трансформированных клеток BOSC собирали и разбавляли в 10-105 раз в полной DMEM, включающей в себя 6 мг/мл Полибрена (Sigma). Реципиентные клет 003637 60 ки, которые высевали при 104 клеток/см 2 и инкубировали при стандартных условиях культуры клеток в течение 24 ч в полной DMEM, экспонировали в вирус-содержащей среде 24 ч при стандартных условиях. После этого инкубационного периода трансдуцированные клетки промывали дважды в ЗФР и инкубировали в полной DMEM, включающей в себя генетицин. 1-l. Приготовление общих клеточных экстрактов.CMVbipepтрансдуцированные клетки NIH-3T3 собирали из двух колб с конфлюэнтными клетками Т 175 инкубированием с 5 мл 0,5x раствора трипсинЭДТА (GibcoBRL)/чашка. Извлеченные клетки разбавляли 1:1 в полной DMEM и затем собирали центрифугированием, промывали дважды в 10 мл полной DMEM и дважды в 1 мл ЗФР. Наконец, эти клетки суспендировали в 100 мкл ЗФР. Клетки делали проницаемыми тремя циклами замораживания в жидком азоте и оттаиванием путем инкубирования при 37 С и затем центрифугировали при 20000xg в течение 15 мин для удаления клеточного дебриса. Для инактивации эндогенной протеазной активности экстракты инкубировали при 65 С в течение 15 мин и повторно центрифугировали. 1-m: Приготовление ядерных экстрактов. Использовали две колбы приблизительно на 80% конфлюэнтых клеток Т-175 каждой клеточной линии. Клетки собирали добавлением 3 мл раствора трипсин-ЭДТА (GibcoBRL) в каждую колбу с последующим центрифугированием 6 мл клеточных суспензий. Все следующие реакции проводили при 4 С с использованием охлажденных растворов. Собранные клетки промывали в 10 мл полной DMEM, 10 мл ЗФР и 2 раза в 1 мл ЗФР. После последней промывки клетки суспендировали в 1 мл лизисного буфераNP40 (10 мМ Трис/HCl рН 7,4, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2 и 0,5% NP-40), осторожно перемешивали и инкубировали на льду в течение 5 мин. Затем эти клетки собирали центрифугированием при 500xg при 4 С в течение 5 мин и суспендировали в 1 мл буфера NP-40 и ядра немедленно собирали повторением центрифугирования. Белки экстрагировали из ядер суспендированием в 50 мкл низкосолевого буфера (20 мМHEPES рН 7,9, 25% глицерин, 0,02 М КС 1, 1,5 мМ МgСl2, 0,2 мМ ЭДТА), с последующим добавлением 50 мкл высокосолевого буфера (низкосолевой буфер, дополненный 1 М КСl). После 30 мин инкубирования на льду ядерный экстракт осветляли центрифугированием при 20000g в течение 30 мин. Супернатанты хранили при -20 С. 1-n. Электрофорез в ПААГ-ДСН и Вестерн-блоты. Пробы наносили с 1/4 объема ДСН-буфера для нанесения (NOVEX), содержащего 1/10 объема 1 М дитиотрейтола, и нагревали при 95 С в течение 2 мин перед нанесением на 4