Молекула для лечения воспалительного нарушения

МОЛЕКУЛА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО НАРУШЕНИЯ Это изобретение обеспечивает источник L19 в качестве лекарственного средства предпочтительно для предотвращения или лечения воспалительного нарушения в индивидууме. Алонсо Бедате Карлос, Сото Альварес Мануэль, Рамирес Гарсия Лаура,Карнес Санчес Херонимо, Роман Эскутия Марта (ES) Медведев В.Н. (RU) Область техники, к которой относится данное изобретение Это изобретение обеспечивает источник L19 в качестве лекарственного средства, предпочтительно для предотвращения воспалительного нарушения в индивидууме. Уровень техники Иммунные и родственные воспалительные заболевания являются комплексными, часто взаимосвязанными биологическими путями, которые в нормальной физиологии отвечают на инсульт или повреждение стимулирующей репарацией этого инсульта или повреждения и установлением природной и приобретенной реакции. Заболевание или патология встречаются, когда эти физиологические пути вызывают дополнительные инсульт или повреждение, либо ненормально расширенной реакцией, обусловленной аномальной регуляцией или сверхстимуляцией, либо комбинацией этих двух реакций. Несмотря на развитие новых противовоспалительных лекарственных средств, таких как анти-TNF-агенты, воспалительные заболевания продолжают представлять важную неудовлетворенную медицинскую потребность,часто вследствие отсутствия отвечаемости и чувствительности к этим лекарственным средствам. Иммунные и родственные воспалительные заболевания, которые могут быть модулированы применением противовоспалительных агентов, включают в себя аутоиммунный диабет (любые другие, подобные ему), сахарный диабет, увеиты, (1) рассеянный склероз, ревматоидный артрит (RA), синдром раздраженной толстой кишки (IBD) (спастический колит), неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, контролируемое отторжение трансплантата после трансплантации органа, реакцию "трансплантат против хозяина" (GVHD), воспалительные заболевания легких и хроническое обструктивное заболевание легких (COPD) (2), рак (4), системную красную волчанку, SLE, саркоидоз, рак и псориаз.RA считается системным аутоиммунным заболеванием, которое лечится обработкой модифицирующими болезнь противоревматическими лекарственными средствами (DMARDS), обычно в комбинации, для минимизации побочных эффектов, ассоциированных с системными лекарственными средствами. Побочные эффекты этих лекарственных средств включают в себя язвенный стоматит, уменьшенное количество эритроцитов.IBD является термином, который описывает хроническое воспалительное нарушение тонкой кишки и/или толстой кишки. В область IBD включены также язвенный колит и болезнь Крона. Хотя точные причины не установлены твердо, считается, что IBD является аутоиммунным заболеванием. В настоящее время лечение не является доступным, и терапии сосредоточены на супрессии аномальной или ненормально увеличенной воспалительной реакции. Лечения включают в себя кортикостероиды (такие как метотрексат, азотиоприн и меркаптопурин) и аминосалицилаты. Продолжительное использование кортикостероидов ассоциировано с разрежением костей, инфекцией, катарактами и эффектами костного мозга. Аминосалицилаты имеют тенденцию лучшей переносимости, так как они слабо абсорбируются и действуют на пораженную зону локально. Побочные эффекты включают в себя головную боль и редко более серьезные состояния, такие как панкреатит. Псориаз лечат различными путями. Использование кортикостероидов местно является обычным способом лечения, но недостатки включают в себя неэффективность и развитие резистентности. Применение фототерапии (светолечения) является эффективным в лечении псориаза вследствие увеличения апоптоза, которое участвует, по-видимому, в уменьшенном воспалении. Недостатки кратковременного действия увеличивают дискомфорт и зуд, тогда как продолжительные эффекты создают увеличенный риск кожного рака, плоскоклеточного рака и меланомы. Для лечения псориаза используют системные лекарственные средства, которые имеют множество других, часто нежелательных системных эффектов и должны использоваться при тщательном контроле и мониторинге дерматологом. Таким образом, все еще существует потребность в развитии новых терапий для воспалительного заболевания, такого как RA, IBD и псориаз, которые не имеют всех этих недостатков существующих терапий. Описание изобретения Источник L19. В первом аспекте, для применения в качестве лекарственного средства обеспечен источник L19.L19 является рибосомным белком. Рибосомные белки являются сильно консервативными цитозольными белками. Таким образом, источник L19 может быть получен из любого эукариотического организма, будь то растение или животное, например, из млекопитающих, пресмыкающихся, рыб, насекомых или любого другого несущего хромосомы организма, такого как простейшие. Это изобретение не ограничивается специфическим источником L19, пока кодируемый L19-белковый продукт способен индуцировать противовоспалительную реакцию, как определено здесь ниже. Предпочтительные простейшие включают в себя плазмодий и, в частности, члены семейства трипаносоматидов, более конкретно,различные виды трипаносоматических простейших Leishmania. Существуют более 20 известных видовLeishmania, включающих в себя виды подрода Leishmania, содержащие комплекс L. major, включающий в себя L. major, комплекс L. Donovani, включающий в себя L. chagasi, L. donovani и L. infantum, комплексL. Mexicana, включающий в себя L. amazonensis и L. mexicana, a также подвиды Viannia, включающие в себя комплекс L. braziliensis, включающий в себя L. braziliensis и L. peruviana, и комплекс L. guyanensis,включающий в себя L. guyanensis и L. panamensis. Видами Plasmodium, представляющими особый инте-1 025202 рес, являются Plasmodium falciparum и Plasmodium vivax. Альтернативно источник L19 может быть получен из вида Trypanosoma. Видом Trypanosoma может быть Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei. В одном предпочтительном варианте осуществления, источник L19 получают, производят или создают из видов Leishmania, предпочтительно Leishmania major, Leishmania infantum Leishmania donovani, Leishmania chagasi и/или Leishmania braziliensis. Более предпочтительным является источник L19, который получен или произведен или создан из Leishmania major. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что источник L19 может быть также приготовлен смешиванием двух или нескольких источников L19, произведенных из одного и того же организма или из нескольких различающихся организмов, идентифицированных здесь. Здесь было продемонстрировано, что применение источника L19 имеет привлекательные свойства, так как было показано, что кодируемый белковый продукт L19 способен индуцировать продуцирование противовоспалительной реакции в получающем лечение субъекте. Одним предпочтительным источником L19 является молекула нуклеиновой кислоты, олигонуклеотид, белок, фрагмент белка и/или пептид, каждый из которых произведен из белка или полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты L19, описанной здесь. Источник L19 предпочтительно содержит (или состоит из них) белок L19, полипептид L19, произведенный из L19 пептид или фрагмент белка L19 и/или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок L19 или полипептид L-19 или произведенный изL19 пептид или фрагмент белка L19, каждые из которых определены здесь. Предпочтительный белокL19 представлен SEQ ID NO:1. Этот предпочтительный L19, предпочтительно кодируется SEQ ID NO:2. Другой предпочтительный белок L19 представлен SEQ ID NO:5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29. Каждый из этих белков L19 предпочтительно кодируется SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,26, 28, 30, соответственно. В первом варианте осуществления, предпочтительным источником L19 является молекула нуклеиновой кислоты, представленная нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей изi) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 50% идентичность или сходство последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 ,25, 27 или 29,ii) нуклеотидных последовательностей, содержащих нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 50% идентичность или сходство с нуклеотидной последовательностью SEQ IDNO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30,iii) нуклеотидных последовательностей, комплементарная часть которых гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты последовательности (i) или (ii) иiv) нуклеотидных последовательностей, последовательности которых отличаются от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (iii) вследствие вырожденности генетического кода. Во втором варианте осуществления, предпочтительный источник L19 является полипептидом, кодируемым молекулой нуклеиновой кислоты первого варианта осуществления, как идентифицировано выше. В более предпочтительном варианте осуществления, источник L19 является полипептидом, аминокислотная последовательность которого имеет по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичность или сходство последовательности с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 ,25,27, 29 или 31. Авторы идентифицировали несколько белков L19 и соответствующих молекул нуклеиновых кислот. Каждый из этих белков L19 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95% или более с SEQ ID NO:1. Каждая из молекул нуклеиновых кислот, кодирующих каждый из этих белков L19, содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95% или более с SEQ ID NO:2. Каждый из этих белков L19 представляет гомолог белка L19Leishmania major, представленного SEQ ID NO:1. Вкратце, авторы идентифицировали три белка L19 из Leishmania braziliensis, представленных SEQID NO:5, 7 или 9. Каждый из этих белков является предпочтительно кодируемым следующими нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:6, 8 или 10, соответственно. Авторы также идентифицировали два белка L19 из Leishmania infantum, представленных SEQ IDNO:11 или 13. Каждый из этих белков является предпочтительно кодируемым следующими нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:12 или 14, соответственно. Авторы также идентифицировали два белка L19 из Leishmania mexicana, представленных SEQ IDNO:15 или 17. Каждый из этих белков является предпочтительно кодируемым следующими нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:16 или 18, соответственно. Авторы также идентифицировали один белок L19 из Leishmania donovani, представленный SEQ IDNO:19. Этот белок является предпочтительно кодируемым следующей нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:20. Кроме того, авторы идентифицировали четыре белка L19 из Trypanosoma cruzi, представленныхSEQ ID NO:21, 23, 25 или 27. Каждый из этих белков является предпочтительно кодируемым следующи-2 025202 ми нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:22, 24, 26 или 28, соответственно. Авторы также идентифицировали один белок L19 из Trypanosoma brucei, представленный SEQ IDNO:29. Этот белок является предпочтительно кодируемым следующей нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:30. Предпочтительно, указанная аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность, определенные здесь как имеющие по меньшей мере 50% идентичность или сходство со специфической идентифицированной аминокислотной или нуклеотидной последовательностью, охватываются данным изобретением, и говорится, что они являются функциональными, когда этот кодируемый белок, полипептид, фрагмент белка или пептид способны индуцировать противовоспалительную реакцию, такую как реакция, получаемая белком L19, представленным SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21, 23, 25, 27 или 29 по меньшей мере до некоторой степени. "По меньшей мере до некоторой степени" предпочтительно означает, что по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60, 70, 80, по меньшей мере 90% или 100% этой противовоспалительной реакции индуцировалось SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21, 23, 25, 27 или 29. Индуцирование противовоспалительной реакции является или предпочтительно определяется как способность индуцировать детектируемое продуцирование противовоспалительного соединения и/или способность индуцировать уменьшение продуцирования воспалительного соединения в получающем лечение субъекте или индивидууме. Одним противовоспалительным соединением является предпочтительно цитокин. Более предпочтительным цитокином является цитокин IL-10. Воспалительным соединением является предпочтительно цитокин. Более предпочтительным цитокином является IFN и/илиTNF. Продуцирование IL-10 или IFN или TNF предпочтительно оценивают на уровне мРНК с использованием ПЦР или на уровне белка с использованием ELISA, ELISPOT или FACS. Все эти способы известны квалифицированному в данной области специалисту. Многие публикации подразумевают повышение IL-10 с уменьшением воспаления, как результата заболевания. То же самое относится к повышению IFN или TNF и присутствию воспаления. Продуцирование противовоспалительного соединения может оцениваться на получающем лечение субъекте или на пробе, полученной из указанного субъекта. В этом контексте, пробой может быть ткань или жидкость, или клетка. Предпочтительные ткани включают в себя селезенку или кожу или кишку или легкое. Предпочтительная жидкость включает в себя кровь. Предпочтительные клетки включают в себя РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) или клетки кожи, или кишечные клетки и клетки легких. Противовоспалительная реакция может быть индуцирована после по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней лечения источником L19. Предпочтительными источниками являются полипептид, белок, фрагмент белка или пептид L19. Индукцией противовоспалительной реакции может быть также увеличение индукции противовоспалительной реакции. В этом контексте, "увеличение" может означать увеличение по меньшей мере 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%. Эта индукция противовоспалительной реакции может быть также уменьшением количества или качества IFN и/или TNF. В этом контексте, "уменьшение может означать уменьшение по меньшей мере 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90,95, 100%. В одном предпочтительном варианте осуществления, противовоспалительное соединение продуцируется и воспалительные соединения (т.е. IFN и/или TNF) не детектируются. В этом контексте не детектируются IFN и/или TNF. Отсутствие IFN и/или TNF предпочтительно оценивается с использованием PCR или ELISA. Отсутствие воспалительного соединения может оцениваться на получающем лечение субъекте или на пробе, полученной из указанного субъекта на противовоспалительное соединение. В одном предпочтительном анализе, противовоспалительную реакцию, более предпочтительно продуцирование IL-10 или увеличение IL-10 детектируют спустя по меньшей мере 24 ч или 48 ч или 72 ч инкубирования источника L19, предпочтительно полипептида L19 или пептида L19 с РВМС. В этом предпочтительном анализе, уменьшенное количество IFN- и/или уменьшенное количество TNF или недетектируемый IFN- И/ИЛИ отсутствие TNF детектируют спустя по меньшей мере 24 ч или 48 ч, или 72 ч инкубирования источника L19, предпочтительно полипептида L19 или пептида L19 с РВМС. Более предпочтительно, IL-10, IFN и/или TNF оцениваются при помощи ELISA, как описано в экспериментальной части. В следующем предпочтительном варианте осуществления, источник L19, который способен индуцировать противовоспалительную реакцию, также способен предотвращать и/или задерживать развитие воспалительного нарушения или состояния или заболевания и/или быть способным ослаблять один или несколько симптомов и/или одну или несколько характеристик или параметров клетки или ткани из получающего лечение субъекта, как определено здесь ниже. Предпочтительным источником L19 является молекула нуклеиновой кислоты первого варианта осуществления, идентифицированная выше. Эта предпочтительная молекула нуклеиновой кислоты представлена нуклеотидной последовательностью, которая произведена из SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30, или последовательностью, имеющей по меньшей мере 50% идентичность-3 025202 или сходство с SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30 или ее частью, и которая может содержать замены, инсерции, делеции и дополнительные 5'- и/или 3'-концевые нуклеотиды или химические части молекулы для увеличения стабильности, растворимости или нацеливания. В предпочтительном варианте осуществления, источником L19 является молекула нуклеиновой кислоты, нуклеотидная последовательность которой имеет по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92,93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичность или сходство последовательности с SEQ ID NO:2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30, или с ее частью. Молекула нуклеиновой кислоты L19, определенная здесь, является предпочтительно олигонуклеотидом. Предпочтительный олигонуклеотид имеет длину по меньшей мере 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 нуклеотидов и произведен из SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30. Более предпочтительные олигонуклеотиды содержат по меньшей мере 8, 10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более смежных нуклеотидов соответствующей молекулы нуклеиновой кислоты L19, идентифицированной выше, предпочтительно представленной SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 30, и продукт которой способен индуцировать противовоспалительную реакцию, определенную здесь ранее. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления, молекула нуклеиновой кислоты L19, определенная здесь, является предпочтительно олигонуклеотидом, содержащим по меньшей мере 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более смежных нуклеотидов SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,22, 24, 26, 28 или 30. В результате, предпочтительным источником L19 является олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более смежных нуклеотидов SEQ ID NO:2. Другим предпочтительным источником L19 является полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты первого варианта осуществления, идентифицированный выше, и/или полипептид, аминокислотная последовательность которого имеет по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичность или сходство последовательности с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29, или с его частью. Один предпочтительный полипептид представлен аминокислотной последовательностью, которая произведена из SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29 или из ее части, или последовательности, имеющей по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,98, 99 или 100% идентичность или сходство с SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29 или с ее частью, и которая может содержать замены, инсерции, делеции и дополнительные N- или Сконцевые аминокислоты или химические части молекулы для увеличения стабильности, растворимости. Фрагмент белка L19 или произведенный из L19 пептид или полипептид L19 или белок L19, определенные здесь, являются предпочтительно фрагментом, содержащим меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120,130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265 или 267 смежных аминокислот соответствующего белка L19, предпочтительно представленного SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27 или 29, который способен индуцировать противовоспалительную реакцию, как определено здесь ранее. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления, фрагмент белка L19 или произведенный из L19 фрагмент или произведенный из L19 пептид, как определено здесь, является предпочтительно фрагментом, содержащим по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160,170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265 или 267 смежными аминокислотами SEQ ID NO:1, 5,7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29. Источник L19 может также содержать полноразмерный белокL19, такой как белок, представленный SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29, и содержит дополнительные аминокислоты в N-и/или С-конце этого белка L19. В другом предпочтительном варианте осуществления, источник L19 содержит (или состоит из них) белок или полипептид, содержащий по меньшей мере один фрагмент белка этого белка L19. Одним предпочтительным источником L19 является фрагмент белка, содержащий по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 50, 60, 70, 80, 90,100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265 или 267 смежных аминокислот SEQ ID NO:1. В одном варианте осуществления, источником L19 является пептид, произведенный из SEQ IDNO:1, или фрагмент SEQ ID NO:1. Один предпочтительный фрагмент или пептид, содержит по меньшей мере 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 смежных аминокислот SEQ ID NO:1. В примере 3, три района L19 и специфических пептидов, произведенных из L19, были идентифицированы как являющиеся способными индуцировать продуцированиеIL-10. Эти предпочтительные районы L19 являются следующими: район 1 содержит пептиды, имеющие SEQ ID NO:31, 32 и/или 55,район 2, содержит пептиды, имеющие SEQ ID NO:42, 43, 44 и/или 56,район 3 содержит пептиды, имеющие SEQ ID NO:53, 54 и/или 57. Ниже авторы определяют более подробно эти пептиды или фрагменты SEQ ID NO:1. Фрагмент белка SEQ ID NO:1, содержащий по меньшей мере 14 смежных аминокислот SEQ ID NO:1, и содержащий SEQ ID NO:31, 32, 55, 42, 43, 44, 56, 53, 54 и/или 57. Один более предпочтительный фрагмент SEQ ID NO:1 содержит SEQ ID NO:31 или 32 или 42 или 43 или 44 или 53 и содержит до 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 или 20 смежных аминокислот из SEQ ID NO:1. Указанный фрагмент может содержать SEQ ID NO:31 или 32,или 42, или 43, или 44, или 53 и может иметь длину до 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27,26, 25, 24, 23, 22, 21 или 20 аминокислот. Указанный фрагмент предпочтительно состоит из SEQ IDNO:31 или 32, или 42, или 43, или 44, или 53. Другой более предпочтительный фрагмент SEQ ID NO:1 содержит SEQ ID NO:54 и содержит до 40,39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 или 14 смежных аминокислот из SEQ ID NO:1. Указанный фрагмент может содержать SEQ ID NO:54 и может иметь длину до 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 или 14 аминокислот. Указанный фрагмент предпочтительно состоит из SEQ ID NO:54. Один более предпочтительный фрагмент SEQ ID NO:1 содержит SEQ ID NO:57 и содержит до 40,39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25 смежных аминокислот из SEQ ID NO:1. Указанный фрагмент может содержать SEQ ID NO:57 и может иметь длину до 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30,29, 28, 27, 26, 25 аминокислот. Указанный фрагмент предпочтительно состоит из SEQ ID NO:57. Один более предпочтительный фрагмент SEQ ID NO:1 содержит SEQ ID NO:55 и содержит до 40,39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 смежных аминокислот из SEQ ID NO:1. Указанный фрагмент может содержать SEQ ID NO:55 и может иметь длину до 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 аминокислот. Указанный фрагмент предпочтительно состоит из SEQ ID NO:55. Один более предпочтительный фрагмент SEQ ID NO:1 содержит SEQ ID NO:56 и содержит до 50,49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42 смежных аминокислот из SEQ ID NO:1. Указанный фрагмент может содержать SEQ ID NO:56 и может иметь длину до 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42 аминокислот. Указанный фрагмент предпочтительно состоит из SEQ ID NO:56. Каждый из этих предпочтительных фрагментов SEQ ID NO:1, идентифицированных здесь, предпочтительно способен индуцировать противовоспалительную реакцию, как определено здесь ранее. Этот источник L19 может быть белком, продуктом расщепления этого белка и/или его фрагментом,который может быть в очищенной форме или может находиться в неочищенной композиции, предпочтительно биологического происхождения, такой как бактериальный лизат, дрожжевой лизат, грибковый лизат, бактериальный супернатант, дрожжевой супернатант, грибковый супернатант, гомогенат, полученный обработкой ультразвуком, или фиксат. Альтернативно, источник L19 может быть химически синтезирован или ферментативно продуцированным in vitro в бесклеточной системе или в клеточной системе. Источник белка L19 или его фрагмент может быть также нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный белок или фрагмент, из РНК- или ДНК-матрицы. Эти молекулы РНК или ДНК могут быть'голой' ДНК, предпочтительно содержащейся в пузырьках или липосомах, или они могут содержаться в векторе. Этот вектор может быть любым (рекомбинантным) ДНК- или РНК-вектором, известным в данной области, и предпочтительно является плазмидой; где гены, кодирующие антигены латентности,функционально связаны с регуляторными последовательностями, придающими экспрессию и трансляцию кодируемых мессенджеров. Этот вектор может быть также любым ДНК- или РНК-вирусом, таким как, но не ограничивается ими, Аденовирус, Аденоассоциированный вирус (AAV), ретровирус, лентивирус, модифицированный Vaccinia Ankara вирус (MVA) или Вирус Птичьей Оспы, или любой другой вирусный вектор, способный придавать экспрессию указанного полипептида в выбранного субъекта. ДНКвекторы могут быть неинтегрирующимися, такими как эписомно реплицирующиеся векторы, или могут быть векторами, интегрирующимися в геном хозяина случайной интеграцией или гомологичной рекомбинацией. Источник L19 или его композиция, определенные здесь для применения в соответствии с данным изобретением, могут быть подходящими для in vitro введения в клетку, ткань и/или орган индивидуума,пораженного воспалительным нарушением или находящемся при риске развития воспалительного нарушения, и/или могут быть подходящими для введения in vivo или ex vivo в клетку, ткань и/или орган таких индивидуумов и/или могут быть подходящими для введения in vivo таким индивидуумам. В зависимости от типа используемого источника (на основе белка или на основе нуклеиновой кислоты), квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, какой тип препарата является подходящим. Источник L19 может вводиться как таковой (голый белок или голая нуклеиновая кислота). Альтернативно, источник на основе нуклеиновой кислоты может вводиться с использованием конструкта нуклеиновой кислоты, описанного здесь. Указанный источник L19 или композиция, определенные здесь, могут вводиться прямо или опосредованно in vivo, in vitro или ex vivo в клетку, ткань и/или орган индивидуума,-5 025202 пораженного воспалительным нарушением или находящегося при риске развития воспалительного нарушения, или in vivo такому индивидууму. Предпочтительно, указанные клетки являются клетками индивидуума, страдающего от воспалительного нарушения. Предпочтительно указанной тканью является ткань индивидуума, страдающего от воспалительного нарушения. В зависимости от этого воспалительного нарушения, конкретные тип клеток или ткани могут быть более подходящими для лечения источником L19 или композицией этого изобретения. Например, тканью может быть кожа, кровь, кишечник,легкое, и подходящие клетки могут быть получены из этих тканей. Источник L19 или композиция этого изобретения может быть введена опосредованно с использованием подходящих способов, известных в данной области. Молекула нуклеиновой кислоты, определяемая как первый вариант, может быть, например, обеспечена индивидууму или клетке, ткани или органу указанного индивидуума в форме экспрессирующего вектора, где этот экспрессирующий вектор кодирует транскрипт, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты. Этот экспрессирующий вектор предпочтительно вводят в клетку, ткань, орган или в индивидуума посредством вектора доставки генов. В предпочтительном варианте осуществления, обеспечен экспрессирующий вектор на основе вируса,содержащий экспрессионную кассету или транскрипционную кассету, которая запускает экспрессию или транскрипцию молекулы, идентифицированной здесь. Одним предпочтительным вектором доставки является вирусный вектор, такой как аденоассоциированный вирусный вектор (AAV), или ретровирусный вектор, такой как лентивирусный вектор и т.п. Плазмиды, искусственные хромосомы, плазмиды, подходящие для нацеленной гомологичной рекомбинации и интеграции в геноме клеток человека, могут быть подходящим образом применены для доставки молекулы нуклеиновой кислоты, определенной в первом варианте. Ожидаются улучшения способов для обеспечения индивидуума или клетки, ткани, органа указанного индивидуума источником L19 или композицией, определенными здесь, если принять во внимание тот прогресс, который достигнут до сих пор. При введении источника L19 или композиции, предпочтительно указанные источник L19 и композицию растворяют в растворе, который является совместимым с конкретным способом доставки. При внутривенном, подкожном, внутримышечном, внутрикожном,внутриоболочечном и/или внутрижелудочковом введении предпочтительно, чтобы этот раствор был физиологическим солевым раствором. В контексте этого изобретения субъект или индивидуум или пациент или животное обозначает человека или животного. Животное, которое включено в объем этого изобретения, включает в себя млекопитающего. Предпочтительные млекопитающие включают в себя собаку и кошку. В одном предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 1 мкг источника L19 используют для индукции противовоспалительной реакции. Диапазоны дозы источника L19, определенные выше, являются предпочтительными дозами для применений in vitro или ex vivo. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что в зависимости от используемого источника L19, подлежащих лечению клетки, ткани, органа или субъекта, используемой среды и условий трансфекции и инкубирования, используемая доза L19 может дополнительно варьироваться и может нуждаться в дальнейшей оптимизации. Источник L19 является предпочтительно лекарственным средством или служит для использования в виде лекарственного средства. Более предпочтительно, указанное лекарственное средство предназначено для предотвращения, задержки и/или лечения воспалительного нарушения в отношении субъекта,нуждающегося в этом. В контексте данного изобретения, воспалительным нарушением является любое воспалительное заболевание или состояние или любое состояние, в котором воспаление будет встречаться на конкретной стадии. Примеры воспалительных заболеваний или состояний включают в себя, но не ограничиваются ими, ревматоидный артрит (RA), ювенильный ревматоидный артрит, псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, воспалительное заболевание кишечника (IBD) (в том числе болезнь Крона или язвенный колит), синдром раздраженной толстой кишки (спастический колит), гепатит, сепсис, алкогольное поражение печени и неалкогольную себорею, нефрит, такой как гломерулярный нефрит, астму, эндокардит, тяжелую псевдопаралитическую миастению, рассеянный склероз, аутоиммунный склероз, аутоиммунный диабет (любые другие, сходные с ним), сахарный диабет, увеит, (1) контроль отторжения трансплантата после трансплантации органа, реакцию "трансплантат против хозяина"(GVHD), воспалительные заболевания легких, включающие в себя астму и хроническое обструктивное заболевание легких (COPD) (2), рак (4) системную красную волчанку, SLE, индуцируемое УФ воспаление кожи, атопический дерматит и саркоидоз. В данном контексте, термин "гепатит" относится к гастроэнтерологическому заболеванию, состоянию или нарушению, которое характеризуется, по меньшей мере частично, воспалением печени. Примеры гепатита включают в себя, но не ограничиваются ими, гепатит, ассоциированный с вирусом гепатита А, вирусом гепатита В, вирусом гепатита С или воспаление печени, ассоциированное с ишемией/реперфузией. В одном более предпочтительном варианте осуществления, указанное лекарственное средство способно ослаблять один или несколько симптомов из получающего лечение пациента, и/или одна или несколько характеристик или параметров клетки или ткани или органа из получающего лечение пациента-6 025202 улучшаются с использованием источника L19 или композиции этого изобретения. Для каждого воспалительного заболевания, квалифицированному в данной области специалисту будут известны по меньшей мере один симптом, параметр или характеристика, величины указанных параметра или характеристики,ассоциированные с указанным заболеванием, а также будет известно, как оценивать каждый из них. Если лекарственное средство этого изобретения способно индуцировать противовоспалительную реакцию, как описано здесь ранее, говорят, что указанное лекарственное средство способно предотвращать и/или задерживать развитие воспалительного нарушения или состояния или заболевания, и/или улучшать одну или несколько характеристик или один или несколько параметров клетки или ткани из получающего лечение субъекта, как определено здесь позднее. Ниже авторы дают параметр, специфический для ревматоидного артрита, псориаза и воспалительного заболевания кишечника, соответственно. Ревматоидный артрит является системным заболеванием и является одной из наиболее обычных форм артрита. Он характеризуется воспалением мембранной выстилки сустава, вызывающим боль, тугоподвижность, теплоту, покраснение и опухание. Имеются несколько животных-моделей для RA, известных в данной области. Одним примером является модель индуцированного коллагеном артрита (CIA), в которой мыши развивают хронический воспалительный артрит, который очень похож на ревматоидный артрит человека. Поскольку CIA имеет сходные иммунологические и патологические признаки с RA, это делает его подходящей моделью для скрининга потенциальных терапий для RA. Известно, что в этой модели основные механизмы патогенеза с различными иммунологическими и воспалительными параметрами, относящимися к иммуноопосредованному артриту, были определены. Эти параметры могут быть использованы для оценивания эффективности соединения в модели CIA (5).RA предпочтительно диагностируется после оценивания показателя Балла Активности Заболевания(Disease Activity Score (DAS или родственного DAS28 (6), включающего в себя измерения нескольких параметров и симптомов на субъекте. Оценивание указанных показателей может проводиться практикующим врачом (клиницистом), обследующим субъекта. В более предпочтительном варианте осуществления, указанное лекарственное средство способно ослаблять один или несколько симптомов из получающего лечение пациента, и/или одна или несколько характеристик или параметров клетки или ткани или органа из получающего лечение пациента улучшаются с использованием источника L19 или композиции этого изобретения, когда указанное лекарственное средство способно индуцировать значимое изменение в DAS или DAS28. Другие пути оценивания ревматоидного артрита также описаны в (6) и в (7). Определенное здесь лекарственное средство способно улучшать один параметр, если спустя по меньшей мере одну неделю, один месяц, шесть месяцев, один год или более лечения с использованием источникаL19 или композиции этого изобретения, предпочтительно, величина указанного параметра улучшилась по меньшей мере на 1, 2, 5, 10% или более при сравнении величины указанного параметра перед началом этого лечения. Как определено здесь, лекарственное средство способно ослаблять один симптом или одну характеристику пациента или клетки, ткани или органа или указанного пациента, если после по меньшей мере одной недели, одного месяца, шести месяцев, одного года или более лечения с использованием L19 или композиции этого изобретения, указанные симптом или характеристика уже не были детектируемыми. Воспалительное заболевание кишечника (IBD) является группой воспалительных состояний ободочной кишки и тонкой кишки, в том числе язвенного колита и болезни Крона. Язвенный колит характеризуется воспалением ободочной кишки, приводящим к частому опустошению ободочной кишки, приводящему к диарее и ассоциированным спазмам, лихорадке и потери массы. Выстилка ободочной кишки становится разрушенной, образующей язвы, которые выделяют слизь, гной и кровь. Повторяющиеся эпизоды могут приводить к образованию рубцовой ткани и гибели ткани ободочной кишки или сепсису с тяжелым заболеванием. Существующие терапии фокусируются на супрессии аномального воспалительного процесса в выстилке ободочной кишки. Одной хорошо охарактеризованной моделью животных для IBD, язвенного колита и особенно болезни Крона человека является модель колита, индуцированного 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой/этанолом (TNBS). Колит индуцировали интраректальным введением TNBS. Оно индуцирует опосредуемую Т-клетками иммунную реакцию в слизистой оболочке ободочной кишки, приводящую к массивному мукозному воспалению, характеризующемуся инфильтрацией Т-клеток и макрофагов через всю стенку толстой кишки. Этот гистопатологический характер сопровождается прогрессивной потерей массы, кровавым поносом, утолщением стенки толстой кишки (8). Существующие модели животных воспаления ободочной кишки не отражают полностью сложности этого заболевания в людях, однако они являются ценными инструментами для оценивания эффективности терапевтических соединений. Псориаз является обычным, хроническим заболеванием кожи, в котором новые клетки кожи растут аномально, приводя к воспаленным, опухшим и чешуйчатым бляшкам кожи, где старая кожа не слущивается достаточно быстро. Наиболее обычной формой является чешуйчатый псориаз, характеризуемый повреждениями, покрытыми наверху серебристо-белыми чешуйками. Псориаз может ограничиваться небольшим количеством повреждений или может включать в себя обширные зоны кожи, наиболее часто-7 025202 появляющиеся на локтях, коленях, волосистой части кожи головы и на торсе. Мягкие случаи псориаза лечат местными нанесениями. Однако более тяжелые случаи требуют ультрафиолетовой терапии, которая является неудобной, или применения системных иммуносупрессивных терапий, которые, вследствие токсичных побочных эффектов, часто имеют ограниченную ценность при продолжительном применении. Кроме того, псориаз часто рецидивируется, в том числе вскоре после остановки иммуносупрессивной терапии. Несколько моделей заболевания были развиты для оценивания потенциальных модуляторов заболевания. Одной такой моделью является модель ксенотрансплантата in vivo для псориаза с псориатической кожей человека, имплантированной в мышь с тяжелым комбинированным иммунодефицитом(SCID). Терапии, которые удаляют или уменьшают воспаление, могут быть испытаны введением в SCIDмышей, несущих воспаленную ткань человека. Эффективность лечения может оцениваться диапазоном показателей. Псориаз является заболеванием, которое предпочтительно диагностируется после оценивания индекса Площади Псориаза и Индекса Тяжести (PASI), глобального оценивания врачом (PGA) (9) или балла NPF Psoriasis Score (NPF-PS), включающего измерения нескольких параметров и симптомов на субъекте. Это оценивание указанных индексов может проводиться практикующим врачом (клиницистом), обследующим субъекта. В более предпочтительном варианте осуществления, указанное лекарственное средство способно ослаблять один иди несколько симптомов из получающего лечение пациента,и/или одна или несколько характеристик или параметров клетки или ткани или органа из получающего лечение человека улучшились с использованием источника L19 или композиции этого изобретения, когда указанное лекарственное средство способно индуцировать значимое изменение в PASI, PGA илиNPF-PS. Другие пути оценивания псориаза включают в себя индекс качества жизни Dermatology LifeQuality Index (DLQI) (10) и Salford Psoriasis Index (SPI), также описанные в (11). Как определено здесь,лекарственное средство является способным улучшать один параметр, если после по меньшей мере одной недели, одного месяца, шести месяцев, одного года или более лечения с использованием источникаL19 или композиции этого изобретения, предпочтительно, величина указанного параметра улучшалась по меньшей мере на 1, 2, 5, 10% или более в сравнении с величиной указанного параметра перед началом этого лечения. Как определено здесь, лекарственное средство способно ослаблять один симптом или одну характеристику пациента или клетки, ткани или органа или указанного пациента, если после по меньшей мере одной недели, одного месяца, шести месяцев, одного года или более лечения с использованием L19 или композиции этого изобретения, указанные симптом или характеристика уже не были детектируемыми. Предпочтительный источник L19, как определено здесь, способен предотвращать или лечить воспалительное нарушение в индивидууме. Индивидуум, который может лечиться с использованием такого источника, может уже быть диагностированным как имеющий воспалительное нарушение. Альтернативно, индивидуум, который может лечиться с использованием такого источника L19, может быть еще недиагностированным как имеющий воспалительное нарушение, но может быть индивидуумом, имеющим высокий риск развития воспалительного нарушения в будущем при его или ее генетическом фоне. Предпочтительным индивидуумом является человек. Композиция В следующем аспекте, обеспечена композиция, содержащая источник L19, описанная здесь. В одном предпочтительном варианте осуществления, указанная композиция является предпочтительно фармацевтической композицией, причем указанная фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемые носитель, соль, разбавитель и/или эксципиент. Обеспечена также такая фармацевтическая композиция, которая может содержать любой фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель, соль, консервант, солюбилизатор, разбавитель и/или эксципиент. Такие фармацевтически приемлемые носитель, наполнитель, соль, консервант, солюбилизатор, разбавитель и/или эксципиент могут быть найдены в (12). Каждый признак указанной композиции был определен здесь ранее. Если используются источники L19, определенная здесь доза может относиться к общей дозе всех используемых источников L19 или к дозе каждого используемого или добавляемого источника L19. Таким образом, в одном варианте осуществления, обеспечена композиция, в которой каждый используемый источник L19 или общее количество используемого источника L19 вводят в дозах в количестве от 0,1 мг/кг и 100 мг/кг. Особенно предпочтительным в этом изобретении является применение эксципиента, который будет способствовать доставке каждого из компонентов, определенных здесь, к клетке и/или в клетку. Предпочтительными являются эксципиенты, способные образовывать комплексы, наночастицы, мицеллы,везикулы, липосомы, протеолипосомы и/или вирус-подобные частицы (VLP), которые доставляют каждый компонент, определенный здесь, в виде комплекса или в виде компонента, захваченного в везикуле или липосоме, через клеточную мембрану. Многие из этих эксципиентов известны в данной области. Подходящие эксципиенты содержат полиэтиленимин (PEI) или подобные катионные полимеры, включающие в себя сополимеры полипропиленимина или полиэтиленимина (PEC) и производные, синтетические амфифилы (SAINT-18), липофектин, DOTAP и/или вирусные капсидные белки, которые способны-8 025202 самособираться в частицы, которые могут доставлять каждый компонент, определенный здесь, в клетку. В зависимости от их идентичности, квалифицированный в данной области специалист будет знать,какой тип препарата является наиболее подходящим для каждого компонента, определенного здесь. В одном предпочтительном варианте осуществления, это изобретение обеспечивает композицию или препарат, которые находятся в форме набора частей, содержащих источник L19, описанный здесь. Лекарственное средство или лекарственный препарат или фармацевтическая композиция, описанные здесь, могут вводиться локально или системно. Лекарственный препарат предпочтительно вводят парентерально, например, инъекцией или инфузией внутривенным, подкожным, внутрибрюшинным,внутримышечным, внутрикожным, внутриартериальным способом или локальным способом внутрь повреждения. Предпочтительным способом введения является подкожное или чрескожное введение. Одним примером чрескожного введения является применение крема. Это изобретение не ограничивается одним конкретным способом введения лекарственного средства или источника L19 или композиции,определенных здесь. Предпочтительным способом введения является пероральное введение с использованием капсулы или таблетки. Альтернативно, лекарственный препарат или источник L19 или композиция, определенные здесь, могут вводиться локально через катетер или насос, или суппозиторий или крем. Альтернативно, лекарственный препарат или источник L19 или композиция, определенные здесь, могут вводиться местно. Препарат лекарственного средства или источник L19 или композиции, определенные здесь, зависят от предполагаемого способа введения и (терапевтического) применения. Фармацевтический носитель может быть любым совместимым, нетоксичным веществом, подходящим для доставки указанного соединения субъекту. Например, в качестве носителя могут быть использованы стерильная вода или инертные твердые вещества или эксципиенты, обычно дополненные фармацевтически приемлемыми адъювантами, буферными агентами, диспергирующими агентами и т.п. Композиции будут находиться либо в жидкости, например, стабилизированной суспензии указанного соединения, или композиции, содержащей указанное соединение, либо в твердой и/или сухой формах: например, порошке. Для перорального и ректального введения, указанное соединение может быть введено в твердых лекарственных формах, таких как капсулы, таблетки, суппозитории и порошки, или в жидких лекарственных формах, таких как эликсиры, сиропы, крем, мазь и суспензии. Другой формой может быть полутвердая или полужидкая форма, где указанное соединение присутствует в виде жидкой формы в твердом носителе или на твердом носителе, таком как пластырь. Композиция может находиться в жидкой, твердой или полужидкой или полутвердой формах, как уже определено здесь. В одном предпочтительном варианте осуществления, другие соединения используются последовательно или одновременно с источником или композицией L19 для улучшения специфичности терапевтического или профилактического лечения. Например, выгодно использовать другие соединения, которые будут дополнительно усиливать противовоспалительную реакцию получающего лечение субъекта. Более предпочтительно, такие соединения не присутствуют в единой композиции вместе с источником или композицией L19. Таким соединением может быть антитело, DMARD (модифицирующие заболевание противоревматические агенты), NSAID (Нестероидные Противовоспалительные Агенты) и/или индукторIL-10, такой как индукторы, описанные в табл. 1 (13). Индуктор IL-10 включает в себя соединение, выбранное из группы, состоящей из: кордицепина, соли золота, кортикостероида, циклоспорина А, ST1959 3-(2-этилфенил)-5-(3-метоксифенил)-1 Н-1,2,4-триазола, SR 31747 А, SSR 125329 А, апротинина, линомида, монометилфумарата, цАМФ-повышающих агентов, таких как ролипрам или цикапрост, катехоламина, витамина D3, рыбьего жира, содержащего n-3-полиненасыщенную жирную кислоту, полового гормона эстриола, KM 2210 или бестрабуцила, и IFN типа I, такого как IFN-, IFN- или IFN-, мимического аутоантигена, такого как ацетат глатирамера (сополимера I), пиримидилпиперазин или его производное,дихлорид 1-этил-3-(3-диметил аминопропил) мочевины, 5'-метилтиоаденозин и пирфенидон, такой как 5 метил-1-фенил-1 Н-пиридинон. Применение В дополнительном аспекте обеспечено применение источника L19 или композиции, определенных здесь, для изготовления лекарственного средства для предотвращения или лечения воспалительного нарушения в индивидууме. Каждый признак указанного применения был определен здесь ранее. Лечение в применении или в способе по этому изобретению состоит из по меньшей мере одной недели, по меньшей мере одного месяца, по меньшей мере нескольких месяцев, по меньшей мере одного года, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 лет или более. Каждый источник L19, определенный здесь, для применения в соответствии с этим изобретением, может быть подходящим для прямого in vivo, in vitro или exvivo введения в клетку, ткань и/или орган индивидуумов, пораженных воспалительным нарушением или находящихся при риске развития воспалительного нарушения, и может быть введен непосредственно invivo указанным индивидуумам. Частота введения источника L19 или композиции этого изобретения может зависеть от нескольких параметров, таких как возраст пациента, количество молекул (т.е. доза), приготовления указанной молекулы. Эта частота может быть частотой один раз в день, один раз в неделю или находиться в диапазоне между по меньшей мере один раз в две недели или три недели, или четыре недели, или пять недель, или более продолжительным периодом времени. Способ В одном дополнительном аспекте, обеспечен способ для облегчения одного или нескольких симптомов воспалительного нарушения в индивидууме, в клетке, ткани или органе указанного индивидуума или облегчения одной или нескольких характеристик или симптомов индивидуума или клетки, ткани или органа указанного индивидуума, где этот способ предусматривает введение указанному индивидууму источника L19 или композиции, определенных здесь. В одном варианте осуществления указанный способ выполняют in vitro, например, с использованием культуры клеток или культуры ткани. Указанный способ может быть также выполнен ех vivo. Предпочтительно, указанный способ выполняют in vivo. Каждый признак этих способов уже был определен здесь. В одном способе этого изобретения, источник L19 может быть объединен с дополнительным соединением, о котором известно, что оно используется для лечения воспалительного нарушения в индивидууме. Таким соединением может быть антитело, DMARD (модифицирующие заболевание противоревматические агенты), NSAID (Нестероидные Противовоспалительные Агенты) и/или индуктор IL-10,такой как индукторы, описанные в табл. 1 (13). Предпочтительные индукторы IL-10 уже были идентифицированы ранее. Определения Молекула нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть кДНК или синтетической ДНК. Эта ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной и, если она является одноцепочечной, может быть кодирующей цепью или некодирующей (антисмысловой) цепью. ДНК или РНК со скелетом молекулы, модифицированным для стабильности или по другим причинам, являются дополнительной частью этого изобретения. Молекула нуклеиновой кислоты представлена нуклеотидной последовательностью. Нуклеотидная последовательность может быть аллельным вариантом нуклеотидной последовательности по этому изобретению. Если желательно, эта нуклеотидная последовательность может быть приготовлена или изменена синтетически таким образом, что могут быть выгодно использованы известные преференции (предпочтения) кодонов предполагаемой экспрессии хозяина. В зависимости от размера молекулы нуклеиновой кислоты, она могла бы быть идентифицирована как являющаяся олигонуклеотидом. Олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 нуклеотидов. Полипептид. В данном контексте термин "полипептид" относится к любому пептиду, олигопептиду, полипептиду, продукту гена, продукту экспрессии или белку. Полипептид представлен аминокислотной последовательностью. Она может содержать от 2 до 267 (т.е. иметь длину SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21, 23, 25, 27 или 29) или 5-265 или 8-260 или 10-250 аминокислот. Она может содержать более 267 аминокислот. Термин "полипептид" включает в себя природно-встречающиеся или синтетические молекулы. Олигопептид может содержать 2-20 аминокислот. Пептид может содержать 5-10 или 5-20, или 5-30, или 5-50 аминокислот. Идентичность/сходство."Идентичность последовательности" определяется здесь как родство между двумя или более аминокислотными (полипептидом или белком или пептидом или фрагментом белка) последовательностями или двумя или более последовательностями нуклеиновых кислот (полинуклеотидом, нуклеиновой кислотой или нуклеотидом или олигонуклеотидом), как определяется сравнением этих последовательностей. В одном предпочтительном варианте осуществления, идентичность последовательности рассчитывают на основе полной длины двух конкретных SEQ ID NO или их части. "Их часть" предпочтительно означает по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90 или 100% обеих SEQ ID NO. В данной области, "идентичность" также обозначает степень родства последовательности между аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот, в зависимости от того, какие последовательности исследуются, определяемую сопоставлением между цепями таких последовательностей."Сходство" между двумя аминокислотными последовательностями определяют сравнением аминокислотной последовательности и ее консервативных аминокислотных замен одного полипептида с последовательностью второго полипептида. "Идентичность" и "сходство" могут быть легко рассчитаны известными способами, в том числе, но не только, способами, описанными в (Computational MolecularStockton Press, New York, 1991; и Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Разработаны предпочтительные способы для определения идентичности для получения наибольшей совместимости между тестируемыми последовательностями. Способы для определения идентичности и сходства запрограммированы в публично доступных компьютерных программах. Предпочтительные способы компьютерных программ для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включают в себя, например, пакет программ GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research(1990). Программа BLAST X публично доступна из NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul,S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Для определения идентичности может быть также использован хорошо известный алгоритм Smith Waterman. Предпочтительные параметры для сравнения полипептидных последовательностей включают в себя следующие: Algorithm: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Comparison matrix:BLOSSUM62 from Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919 (1992); Gap Penalty: 12; and Gap Length Penalty: 4. Одна программа, применимая с этими параметрами, публично доступна как программа "Ogap" из Genetics Computer Group, находящейся в Madison, WI. Вышеуказанные параметры являются параметрами по умолчанию для сравнения аминокислот (вместе с "no penalty" для конечных гэпов). Предпочтительные параметры для сравнения нуклеиновых кислот включают в себя следующие: Algorithm: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Comparison matrix: matches=+10, mismatch=0; Gap Penalty: 50; Gap Length Penalty: 3. Доступные из программы Gap из Genetics ComputerGroup, расположенные в Madison, Wis. Выше даны параметры по умолчанию для сравнений нуклеиновых кислот. Необязательно, в определении степени сходства аминокислот квалифицированный в данной области специалист может также учитывать так называемые "консервативные" аминокислотные замены, как будет ясно квалифицированному в данной области специалисту. Консервативными аминокислотными заменами называют взаимозаменяемость остатков, имеющих сходные боковые цепи. Например, группой аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, являются глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группой аминокислот, имеющих алифатические-гидроксильные боковые цепи, являются серин и треонин; группой аминокислот, имеющих амидсодержащие боковые цепи, являются аспарагин и глутамин; группой аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, являются фенилаланин, тирозин и триптофан: и группой аминокислот, имеющих щелочные боковые цепи, являются лизин, аргинин и гистидин; и группой аминокислот, имеющих серу-содержащие боковые цепи, являются цистеин и метионин. Предпочтительными консервативными группами аминокислотных замен являются: валин-лейцинизолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин. Варианты с заменами аминокислотной последовательности, описанной здесь, являются варианты, в которых по меньшей мере один остаток в описанных последовательностях был удален, а другой остаток был инсертирован на его место. Предпочтительно, аминокислотная замена является консервативной. Предпочтительные консервативные замены для каждой из природно-встречающихся аминокислот являются следующими: Ala для ser; Arg для lys; Asn для gln или his; Asp для glu; Cys для ser или ala; Gin для asn; Glu для asp;leu или ile; Phe для met, leu или tyr; Ser для thr; Thr для ser; Trp для tyr; Tyr для trp или phe; и Val для ile или leu. Условия гибридизации Условия гибридизации для молекулы нуклеиновой кислоты могут иметь низкую или среднюю, или высокую строгость (процедуры блоттинга по Саузерну). Условия низкой или средней или высокой строгости обозначают предгибридизацию и гибридизацию при 42 С в 5 х SSPE, 0,3% ДСН, 200 пг/мл подвергнутой силе сдвига и денатурированной ДНК спермы лосося, и либо 25%, или 35%, или 50% формамида для низкой или средней или высокой строгостей, соответственно. Затем, реакционную смесь гибридизации промывают три раза в течение 30 минут каждый раз с использованием 2 х SSC, 0,2% ДСН и или 55 С, или 65 С, или 75 С для низкой или средней или высокой строгостей, соответственно. Конструкт нуклеиновой кислоты/экспрессия/регуляторные последовательности Конструкт нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок или фрагмент белка, определенные здесь. Конструкт нуклеиновой кислоты, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты для конкретного белка или фрагмента белка, описанных здесь, будет гарантировать экспрессию этой конкретной молекулы нуклеиновой кислоты и соответствующего белка или фрагмента белка в получающем лечение субъекте. В более предпочтительном варианте осуществления, конструкт нуклеиновой кислоты содержит более одной молекулы нуклеиновой кислоты, причем каждая молекула нуклеиновой кислоты кодирует конкретный белок или фрагмент белка. В еще более предпочтительном варианте осуществления, конструкт нуклеиновой кислоты содержит две, три, четыре молекулы нуклеиновой кислоты, причем каждая молекула нуклеиновой кислоты кодирует конкретный белок или фрагмент белка. В одном предпочтительном варианте осуществления, конструкт нуклеиновой кислоты содержит экспрессионную кассету, причем указанная кассета содержит каждую требуемую молекулу нуклеиновой кислоты. Каждая молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с другой присутствующей молекулой нуклеиновой кислоты. Наиболее предпочтительно, подходящий промотор функционально связан с экспрессионной кассетой для гарантии экспрессии этой молекулы нуклеиновой кислоты в субъекте."Функционально связанная" определяется здесь как конфигурация, в которой регуляторная последовательность подходящим образом помещена в положении относительно нуклеотидной последователь- 11025202 ности, кодирующей полипептид этого изобретения, таким образом, что эта регуляторная последовательность управляет продуцированием/экспрессией полипептида этого изобретения в клетке и/или субъекте. Будет понятно, что экспрессия будет включать в себя любую стадию, участвующую в продуцировании этого полипептида, в том числе, но не только, транскрипцию, пост-транскрипционную модификацию, трансляцию, пост-трансляционные модификации и секрецию. Регуляторная последовательность, как определено здесь, включает в себя все компоненты, которые являются необходимыми или выгодными для экспрессии полипептида. При минимуме, эти регуляторные последовательности включают в себя промотор и стоп-сигналы транскрипции и трансляции. Необязательно, промотор, представленный нуклеотидной последовательностью, присутствующей в конструкте нуклеиновой кислоты, функционально связан с другой нуклеотидной последовательностью, кодирующей молекулу нуклеиновой кислоты, идентифицированной здесь. Экспрессирующим вектором может быть любой вектор, который может быть удобным образом подвергнут процедурам рекомбинантных ДНК и может запускать экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид этого изобретения, в клетке и/или в субъекте. В данном контексте термин "промотор" относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который функционирует для регуляции транскрипции одного или нескольких генов или нуклеиновых кислот, расположенных выше по ходу транскрипции (слева) от сайта инициации транскрипции этого гена, и относится к сайту связывания,идентифицированному присутствием сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов связывания инициации транскрипции и любых других ДНК-последовательностей, включающих в себя,но не ограничивающихся ими, сайты связывания транскрипционного фактора, сайты связывания белка репрессора и активатора и любых других последовательностей нуклеотидов, известных квалифицированному в данной области специалисту, для действия прямо или опосредованно для регуляции величины транскрипции от промотора. В контексте этого изобретения, промотор предпочтительно заканчивается при нуклеотиде-1 стартового сайта транскрипции (TSS). Если нет других указаний, каждый вариант осуществления, описанный здесь, может быть объединен с другим вариантом осуществления, описанным здесь. В этом документе и в его формуле изобретения глагол "содержать" и его спряжения используются в не ограничивающем его смысле, означая, что предметы после этого слова являются включенными, но не упоминаемые предметы не являются исключенными. Кроме того, глагол "состоять" может быть заменен"состоит по существу", что означает, что источник L19 или композиция, определенные здесь, могут содержать дополнительные (другие) компоненты, чем компоненты, идентифицированные специфически,причем указанные дополнительные компоненты не изменяют уникальной характеристики этого изобретения. Кроме того, ссылка на элемент в единственном числе не исключает возможности, что присутствуют более одного из этих элементов, пока этот контекст не требует ясно, чтобы имелся один и только один из этих элементов. Таким образом, единственное число обычно обозначает "по меньшей мере один". Слово "приблизительно" или "около" в применении в ассоциации с численной величиной (приблизительно 10, около 10) предпочтительно означает, что эта величина может быть этой величиной 10 или большей или меньшей на 1% величиной. Все патентные и литературные ссылки, цитируемые в данном описании, включены здесь тем самым посредством ссылок в их полном виде. Каждый вариант осуществления, идентифицированный здесь,может быть объединен вместе с другими, если нет других указаний. Это изобретение дополнительно объясняется в следующих примерах. Эти примеры не ограничивают объем этого изобретения, а служат только для разъяснения этого изобретения. Краткое описание фигур Фиг. 1. Очистка his-LmL19. Гель SDS-PAGE, показывающий различные стадии в очистке белкаrLmL19. (1) Стандарт молекулярной массы. Общие бактериальные экстракты после прохождения колонки (2) и перед прохождением колонки (3). (4) Очищенный белок. Фиг. 2. Продуцирование IFN-гамма и IL-10 спленоцитами не подвергнутых воздействию мышейBALB/c (n=6), стимулированных in vitro LmL19. Показана величина Р, полученная после статистического анализа, выполняемого посредством t-критерия Стьюдента. Различия в продуцировании цитокинов между стимулированными LmL19 или Конканавалином А (ConA) клетками считали значимыми, когда Р 0,05). Фиг. 3. Продуцирование IFN-гамма и IL-10 PBMC здоровых людей-доноров, стимулированных invitro LmL19. Показана величина Р, полученная после статистического анализа выполняемого посредством t-критерия Стьюдента. Различия в продуцировании цитокинов между стимулированными LmL19 или ConA клетками считали значимыми, когда Р 0,05). Фиг. 4. Схематическое представление рекомбинантного белка MBP-LmL19. Фиг. 5. Концентрация TNF в различных группах исследования после 24 ч инкубации (пг/мл). Эти величины представлены в виде среднеестандартное отклонение. ; р 0,005, тест-группы без облучения в сравнении с группой Контроля; р 0,005, облученные тест-группы в сравнении с Контролем/УФ- 12025202 группой. Фиг. 6. Концентрация IL-10 в различных группах исследования после 24 часов инкубации (пг/мл). Эти величины представлены в виде среднеестандартное отклонение. ; р 0,005, тест-группы без облучения в сравнении с группой Контроля; р 0,005, облученные тест-группы в сравнении с Контролем/УФ-группой. Фиг. 7. Продуцирование IL-10 с пептидом LmL19. Клетки получали и культуры обрабатывали, как указано в тексте. Уровень IL-10 в культуральных супернатантах анализировали при помощи ELISA. Этот анализ выполняли один раз с использованием объединенных клеток, полученных из трех не подвергнутых воздействию мышей (анализ выполняли в двух повторностях). р 0,05 при сравнении каждой группы с нестимулированными клетками. Примеры Пример 1. Клонирование и экспрессия. Этот ген характеризовали после поиска in silico в базе данных генома L. major. На основе этой последовательности синтезировали два олигонуклеотида (см. ниже) и использовали в качестве праймера для ПЦР с использованием ДНК, экстрагированной из паразитов L. major [клон VI (MHOM/IL/ 80(Friedlin)]. Полученную ДНК расщепляли BamHI/HindIII, клонировали в соответствующих сайтах плазмиды pBluescript и секвенировали. Полученная последовательность ДНК и расшифрованная аминокислотная последовательность показаны ниже, соответственно. А. Используемые олигонуклеотиды.(подчеркнутый сайт разрезания BamHI был включен для целей клонирования).(подчеркнутый сайт разрезания HindIII был включен для целей клонирования). В. Нуклеотидная последовательность. (Сайты разрезания рестрикционными ферментами включены и помечены курсивом и подчеркнуты: эти сайты не принадлежат к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей L19, из Leishamnia major или Lm) Анализ последовательности LmL19 (SEQ ID NO:2 является последовательностью ниже без подчеркнутой последовательности, добавленной для целей клонирования) С. Расшифрованная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:1) ДНК, кодирующую LmL19, субклонировали в сайты BamHI/HindIII прокариотической экспрессионной плазмиды pQE-30, что позволяет получить рекомбинантный белок, слитый с бх-гистидинами. Культуры Escherichia coli (штамм М 15), трансформированной этой рекомбинантной плазмидой, ис- 13025202 пользовали для экспрессии этого рекомбинантного белка. Первые анализы выполняли при 37 С, но авторы наблюдали, что этот белок деградировался внутри этих бактерий. По этой причине, культуры индуцировали при 30 С для уменьшения деградации белка. При этих условиях авторы наблюдали низкое продуцирование интактного рекомбинантного белка. Таким образом, rLmL19 очищали аффинной хроматографией при денатурирующих условиях. Полученный очищенный белок представляет несколько полос деградации с более низкой молекулярной массой (фиг. 1). Эти рекомбинантные белки пропускали через полимиксин-агарозную колонку для удаления эндотоксинов. Стимуляция клеток селезенки мыши рекомбинантным rLmL19. Препараты отдельных клеток из ткани селезенки высевали в двух повторностях в 24-луночных планшетах при 5106 клетках на мл. Клетки инкубировали в полной среде RPMI, дополненной 2 мМ Lглутамином, пенициллином (100 Е/мл), стрептомицином (100 мкг/мл) и 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сывороткой (отдельно) (фоновый контроль; среда), или стимулировали rLmLl9(12 мкг/мл) или ConA (1 мкг/мл) при 37 С в 5% СО 2 в течение 72 ч. Выделение IFN-гамма и IL-10 в культуральных супернатантах оценивали с использованием сэндвич-ELISA (фиг. 2). Можно было сделать вывод, что рекомбинантный белок LmL19 индуцировал специфическое продуцирование IL-10, без продуцирования IFN-гамма клетками селезенки, полученными из не подвергнутых какому-либо воздействию мышей. Стимуляция мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) из людей с рекомбинантнымrLmL19. РВМС получали из гепаринизированной венозной крови проведением через градиент Ficoll Hypaque. РВМС промывали три раза и ресуспендировали при концентрации 5106 клеток/мл в RPMI, дополненной 2 мМ L-глутамином, пенициллином (100 Е/мл), стрептомицином (100 мкг/мл) (Gibco, NY) 10% инактивированной нагреванием сывороткой АВ человека). Клетки высевали в 24-луночных планшетах для культуры ткани при концентрации 5106 клеток/мл и инкубировали при 37 С, 5% СО 2. Стимуляцию выполняли добавлением rLmL19 (20 мкг/мл и 5 мкг/мл) и ConA (1 мкг/мл) в течение 72 ч. Как описано выше, выделение IFN-гамма и IL-10 в культуральных супернатантах оценивали с использованием сэндвич-ELISA (фиг. 3). Как наблюдали с клетками селезенки мыши, РВМС из здоровых доноров-людей продуцировали IL10 после стимуляции рекомбинантным LmL19. Продуцирование этого цитокина было зависимым от дозы. Экспрессия rLmL19 в виде слитого белка со связывающим мальтозу белком. Эти предварительные результаты показывали, что белок rLmL19 был способен индуцировать высвобождение IL-10 из лейкоцитов мышей и человека. Уровень продуцирования этого рекомбинантного белка был все еще неоптимальным. Для улучшения продуцирования белка ДНК, кодирующую белок LmL9, клонировали в прокариотический экспрессирующий вектор pMal-c2. Этот вектор делает возможным продуцирование гетерологичных белков в Е. coli, слитых с бактериальным белком МВР. Как указано на фиг. 4, этот слитый белок и гетерологичный белок могут быть разделены с использованием специфической протеазы (Ха-фактора) вследствие присутствия сайта разрезания Ха-фактора между обоими белками. Культуры Е. coli (штамм XL1-blue), трансформированные этой рекомбинантной плазмидой, могут быть использованы для экспрессии этого рекомбинантного белка. Белок сверхэкспрессировался в виде растворимого продукта, который очищали аффинной хроматографией при нативных условиях в амилозных колонках. С использованием этой системы был получен более высокий уровень рекомбинантного белка (не показано). Пример 2. Исследование кожи. Целью этого изобретения было оценивание противовоспалителной способности белка, названногоL19, в эксплантатах кожи человека. Это выполняли способом скрининга для исследования защитной эффективности этого белка против ультрафиолетового света (УФ) на коже. Основой этого исследования является выполнение единственного воспалительного исследования на кожных эксплантатах для оценивания противовоспалительной способности указанного продукта против облучения УФ-светом. Это исследование разделяли на следующие задачи для достижения предполагаемой цели. Скрининг фоновой цитотоксичности. Единственный анализ выполняли с использованием способа МТТ для определения максимальной концентрации продукта, подлежащего анализу, в скрининге на эффективность. Этот способ является колориметрическим анализом на основе метаболического уменьшения солей тетразолия (МТТ) вследствие клеточного метаболизма (клеточного дыхания) фибробластов мыши (BALB/3T3). Эта метаболическая редукция МТТ обусловлена митохондриальным ферментом сукцинатдегидрогеназой, который производит синее соединение (формазан) и определяет митохондриальную функциональность обработанных клеток. Количество живых клеток является пропорциональным полученному синему цвету. Этот продукт инкубировали в 8 различных концентрациях (6 повторностях каждой концентрации) в течение 24 ч.- 14025202 Скрининг противовоспалительной эффективности Эффективность оценивали с использованием противовоспалительного исследования в единственном анализе на кожных эксплантатах, который анализировал два интерлейкина, присутствующих в воспалении, вызываемом УФ-облучением, с использованием способа ELISA. Группы этого исследования были следующими. Группа здорового контроля. 3 кожных эксплантата. Они не получали УФ-облучения. Поврежденная группа. 3 кожных эксплантата, облученные УФ-светом. Тест-группа. 9 кожных эксплантатов, облученных и затем инкубированных с Lm L19 (SEQ IDNO:1), экспрессированным в Е. coli. Три различные концентрации продукта, 3 повторности на концентрацию (наивысшую концентрацию определяли скринингом на токсичность продукта). После облучения этих эксплантатов ультрафиолетовым светом, Lm L19 (т.е. SEQ ID NO:1), экспрессированный в Е. coli, инкубировали; спустя 24 часа авторы измеряли два интерлейкина, участвующих в воспалительных действиях, вызываемых ультрафиолетовым светом на коже, IL-10 и TNF. Материалы и способы Культуры клеток. В качестве экспериментальной системы для скрининга цитотоксичности, это исследование использовало культуру клеток иммортализованной линии фибробластов мыши из клеточной линии BALB/3T3 из Европейской Коллекции Культур Клеток (ЕСАСС) Cat. No. 86110401. Иммортализованные фибробласты из ЕСАСС росли в среде DMEM с 10% ФТС (Фетальная Телячья Сыворотка). После оттаивания, эти клетки культивировали в монослое в увлажненной атмосфере с 5% СО 2 при температуре 37 С. Во время этого периода эту культуральную среду сменяли каждые 2-3 дня в соответствии с инструкциями поставщика. После этого периода, когда культуральные колбы достигали конфлюэнтности 80%, эти клетки распределяли на 96-луночных планшетах при концентрации 5000 клеток на лунку. Исследование цитотоксичности с конечной точкой, МТТ. Во время анализа цитотоксичности, клетки обрабатывали различными концентрациями продукта исследования, известного как L19. После 24 часов обработки выполняли окрашивание МТТ. Этот анализ основан на метаболической редукции 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолбромида (МТТ) или солей тетразолия (желтых и растворимых), продуцируемых митохондриальным ферментом сукцинатдегидрогеназой, который генерирует соединение синего цвета (формазан), которое делает возможным определение митохондриальной функциональности обработанных клеток. Этот способ широко используется для измерения выживаемости и пролиферации клеток. Количество живых клеток пропорционально количеству продуцированного фармазана. Поскольку мертвые клетки не дышат, они не предоставляют этот фермент и, следовательно, не могут редуцировать его, так как они не предоставляют сукцинатдегидрогеназу. Чем больше редукция в МТТ, тем более синим является цвет и тем большей является жизнеспособность клеток. Этот эксперимент выполняли на 86-луночных планшетах с клетками 3 Т 3, растущими на монослое с 80% конфлюэнтностью. Эти исследования цитотоксичности позволили авторам изобретения определить величины LC80, LC50 и LC20 (концентрации продукта, которые уменьшают жизнеспособность клеток на 80%, 50% и 20%, соответственно). Во время выполнения этой задачи, планшет иммортализованных фибробластов инкубировали с восемью различными концентрациями белка L19 в течение 24 ч (анализировали 1 планшет с продуктом с 6 повторностями на каждую анализируемую концентрацию) и второй контрольный планшет МТТ-анализа с додецилсульфатом натрия (ДСН) при восьми различных концентрациях (1 планшет с МТТ, с 6 повторностями на анализируемую концентрацию) в качестве ссылочного продукта токсичности. Эти данные использовали для установления стандартной кривой для гибели клеток. Все планшеты исследования также засевали фибробластами по меньшей мере в 12 лунках, которые использовали в качестве здоровых контролей, и культуры ЗТЗ только с культуральной средой, где L19 не добавляли в планшет исследования и ДСН не добавляли к контрольному планшету с гибелью клеток (Данные ДСН: LC20: 0,124 мг/мл;LC50: 0,142 мг/мл; LC80: 0,163 мг/мл). Согласно концентрации белка L19, дополненного LETI, наивысшая анализированная концентрация была 200 мкг/мл при разведениях 1:2. Эти используемые конечные концентрации представлены подробнее ниже: С 2: С 3: С 4: С 5:С 6:С 8: 1,56 мкг/мл. После инкубирования эти планшеты проявляли с использованием МТТ и оптическую плотность измеряли при 540 нм с использованием планшет-ридера ELISA. Полученные результаты использовали для расчета величин летальной концентрации LC80, LC50 и LC20, в культурах фибробластов для исследуемых продуктов. Анализ определения интерлейкина-10 и TNF- 15025202 Количественный анализ интерлейкина-10 и TNF выполняли с супернатантом культуральных сред кожных эксплантатов. Количественное определение как IL-10, так и TNF выполняли с наборами BDOptEIA ELISA, изготовляемыми Becton Drive, Franklin Lakes, NJ, USA): Human TNF ELISA Kit II. Эффективность L19 анализировали по количеству интерлейкинов, индуцированных УФоблучением на кожных эксплантатах человека. Подвергание действию имитирующего солнечный свет источника света. Планшет с пробами кожи подвергали действию УФ/видимого света, испускаемому имитатором солнечного света SOL 500 (Dr. Honle). Интенсивность света измеряли на всем процессе экспонирования измерителем УФ-света. Дозы облучения могут быть установлены (урегулированы) этими величинами с учетом того, что во время 5 мин экспонирования, эти клетки получают приблизительно 1 Дж/см 2 при этой интенсивности. Конечное время экспонирования кожных эксплантатов было 50 минут, при облучении 10 Дж/см 2. Группы, включенные в это исследование. Группа здорового контроля. 3 кожных эксплантата. Они не получали УФ-облучения. Поврежденная группа. 3 кожных эксплантата, облученные УФ-светом. Тест-группа. 9 кожных эксплантатов, облученных и затем инкубированных с Lm L19 (SEQ IDNO:1), экспрессированным в Е. coli. Три различные концентрации продукта, 3 повторности на концентрацию (наивысшую концентрацию определяли скринингом на токсичность продукта). После облучения этих эксплантатов ультрафиолетовым светом (10 Дж/см 2) их инкубировали с продуктом L19. Спустя 24 ч, авторы измеряли два интерлейкина, участвующих в воспалительных действиях, вызываемых ультрафиолетовым светом на коже, IL10 и TNF.IL-10 и TNF определяли количественно добавлением 100 мкл каждого из стандартов IL-10 иTNF, включенных в наборы, изготовляемые BD Biosciencies (BD OptEIA ELISA Sets: IL-10 Cat- No. 555157 and TNF Cat. No. 555212), а также 100 мкл культуральной среды, используемой для инкубирования каждой из этих проб, в каждом случае в виде двух повторностей, и инкубированием на планшетахELISA при температуре окружающей среды в течение 2 ч. Затем эти лунки промывали ЗФР, 200 мкл конъюгированного раствора добавляли и инкубирование выполняли в течение 1 ч. Затем эти лунки промывали опять, 200 мкл раствора субстрата добавляли и инкубирование выполняли в течение 20 мин при температуре окружающей среды. Наконец, добавляли 50 мкл стоп-раствора и оптическую плотность считывали при 450 нм со ссылкой 540 нм. Эту оптическую плотность экстраполировали до величины IL10 и TNF, с использованием кривой, полученной со стандартами обоих цитокинов в качестве ссылки. Результаты и обсуждение Скрининг фоновой цитотоксичности. Исследование цитотоксичности белка L19. Для определения максимальной концентрации продукта исследования в скрининге эффективности,выполняли единственный анализ с использованием способа МТТ на иммортализованной линии фибробластов, BALB/3T3, которые высевали на 96-луночных планшетах с приближенной плотностью 5000 клеток на лунку. Этот продукт инкубировали в 8 различных концентрациях (в 6 повторностях каждой концентрации) в течение 24 ч. Результаты этого анализа использовали для определения концентраций, необходимых для определения LC80, LC50, и LC20. LC является летальной концентрацией этого вещества. LC80 является концентрацией этого вещества, при которой умирают 80% этой популяции клеток. LC50 является концентрацией этого вещества, при которой умирают 50% этой популяции клеток, и LC20 является токсической концентрацией этого вещества, при которой умирают 20% этой популяции культуры клеток. В этих анализах, каждый планшет фибробластов инкубировали с 6 различными активными концентрациями в течение 24 ч: С 2: С 3: С 4: С 5:С 6:С 8: 1,56 мкг/мл. После инкубирования эти планшеты проявляли для анализа с использованием МТТ и оптическую плотность измеряли при 540 нм с использованием планшет-ридера ELISA. Следующая таблица показывает LC80, LC50 и LC20, полученные для каждого продукта (табл. 1) без статистической значимости. Таблица 1. Результаты для LC20, LC50 и LC80 белка L19 из LETI, полученные анализом цитотоксичности, МТТ Величины выражены в виде средней величины (мкг/мл). Результаты этого анализа цитотоксичности получали с учетом величин оптической плотности, полученных в культурах здорового контроля, которые не инкубировали с продуктом L19 в качестве ссылки- 16025202 100% жизнеспособности. Так же как наблюдалось с величинами смерти клеток, жизнеспособность была равна 0% с продуктом ДСН при концентрации 175 мкг/мл (Данные ДСН: LC20: 0,124 мг/мл; LC50: 0,142 мг/мл; LC80: 0,163 мг/мл). Вследствие результатов, полученных в анализе цитотоксичности, было решено, что для следующей задачи скрининга противовоспалительной эффективности белка L19, наивысшей концентрацией для тестирования этого продукта могла бы быть концентрация 25 мкг/мл, а также 12,5 мкг/мл и 6,25 мкг/мл. Выбор наивысшей концентрации, 25 мкг/мл, относится к LC20. Эта величина является достаточной для анализа этого продукта на коже, так как она находится на границе минимальной токсичности для этого продукта. Следует отметить также, что скрининг токсичности выполняли в единственной культуре фибробластов. Монокультуры являются всегда более чувствительными к токсичности продукта, чем органотипическая культура, такая как кожный эксплантат. Скрининг противовоспалительной эффективности. Исследование противовоспалительной способности белка L19 после облучения УФ-светом на кожных эксплантатах человека. Обработку кожных эксплантатов человека белком L19 (25 мкг/мл, 12,5 и 6,25 мкг/мл в течение 24 ч)(Lm L19 или SEQ ID NO:1) выполняли для исследования противовоспалительного эффекта этого белка. Эти группы исследований делили на эксплантаты, которые облучали УФ-светом и затем инкубировали с белком L19, и эксплантаты, которые подвергали действию этого продукта, но не облучали УФ-светом. Это исследование выполняли на органотипических культурах кожных эксплантатов человека из косметической хирургии. Этот анализ использовал две контрольные группы; культуру без белка L19 или солнечного облучения и поврежденную контрольную группу без этого белка, но облучаемую солнечным светом. Концентрации и условия могут быть найдены ниже: Контрольная группа: кожные эксплантаты в условиях нормальной культуры. Группа L19-25 мкг/мл; кожные эксплантаты, инкубированные с 25 мкг/мл белка в течение 24 ч. Группа L19-12,5 мкг/мл; кожные эксплантаты, инкубированные с 12,5 мкг/мл белка в течение 24 ч. Группа L19-6,25 мкг/мл; кожные эксплантаты, инкубированные с 6,25 мкг/мл белка в течение 24 ч. Контроль/УФ-группа: кожные экплантаты в условиях нормальной культуры и облучаемые УФсветом, 10 Дж/см 2. Группа L19-25 мкг/мл/УФ: кожные эксплантаты, облученные УФ-светом (10 Дж/см 2) и затем инкубированные с 25 мкг/мл белка в течение 24 ч. Группа L19-12,5 мкг/мл/УФ: кожные эксплантаты, облученные УФ-светом (10 Дж/см 2) и затем инкубированные с 12,5 мкг/мл белка в течение 24 ч. Группа L19-6,25 мкг/мл/УФ: кожные эксплантаты, облученные УФ-светом (10 Дж/см 2) и затем инкубированные с 6,25 мкг/мл белка в течение 24 ч. В конце инкубационного периода (24 ч) выполняли количественное определение на обоих цитокинах, IL-10 и TNF, со способом ELISA для определения количества этих цитокинов. В этой задаче выполняли единственный анализ, в котором анализировали белок L19 из Лабораторий LETI. Этот анализ использовал 3 повторности каждого условия и каждую повторность анализировали способом ELISA в двух повторностях. Концентрация TNF (фиг. 5) и концентрация IL-10 (фиг. 6) для этих групп исследования показаны ниже, как для кожных эксплантатов, облученных УФ-светом, так и для тех, которые не облучались. Фиг. 5 показывает продуцирование TNF в кожных эксплантатах в условиях, которым они подвергались. Воспалительная реакция, продуцируемая УФ-облучением в группе Контроль/УФ (153,944 пг/мл),является значимо более высокой, чем в контрольной группе без облучения (22,97,3 пг/мл). Это указывает на то, что облучение 10 Дж/см 2 УФ-света (в монокультуре, используемым облучением является нормально 1 Дж/см 2) на кожных эксплантатах запускает воспалительную реакцию в этом случае. Эта реакция является достаточной, чтобы увидеть, имеет ли белок L19 противовоспалительные действия после инкубирования в кожных пробах, экспонированных этому уровню облучения. Как показано на графике, статистическое исследование этого белка показывает, что продуцирование TNF после облучения УФ-светом уменьшается значимо в эксплантатах, которые были инкубированы после этого (в течение 24 ч) с белком L19 при концентрациях 25 и 12,5 мкг/мл (23,32,8 и 25,94,8 пг/мл, соответственно). Группа L19-6,25 мкг/мл/УФ показала незначимое уменьшение в продуцировании указанного цитокина. С другой стороны, этот график показывает также значимое увеличение продуцирования TNF в группах L19-25 мкг/мл, L19-12,5 мкг/мл и L19-6,25 мкг/мл (которые не облучались) в сравнении с этой Контрольной группой. Все вышесказанное приводит авторов к выводу, что белок L19 может влиять на кожу некоторым образом, генерируя воспалительную реакцию. Эта последняя точка должна быть подтверждена дополнительными исследованиями. Это значимое уменьшение в продуцировании TNF в культурах с белком L19, обработанных после этого солнечной радиацией, против группы Контроль/УФ приводит авторов к мысли о том, что этот бе- 17025202 лок может иметь противовоспалительное действие. Фиг. 6 показывает продуцирование IL-10 в кожных эксплантатах в условиях, которым они подвергались. Анализ IL-10 как в облученной, так и в необлученной группах, инкубированных с белком L19,показывает значимое увеличение в продуцировании IL-10 при всех концентрациях этого исследуемого белка в сравнении с необлученной Контрольной группой (; р 0,005). В статистическом исследовании, это увеличение наблюдали в меньшей степени против Контрольной группы, облученной УФ-светом, где только группа L19-12,5 мкг/мл/УФ предоставляет значимое увеличение (; р 0,005), 363,722 пг/мл, против группы Контроль/УФ (203,177). Это обусловлено стандартными отклонениями в двух других группах исследования, L19-6,25 мкг/мл/УФ и L19-25 мкг/мл/УФ(36694 и 724,8288 пг/мл), что заставляет это статистическое исследование определять различия, более высокие, чем статистическая значимость 0,005. Увеличение в количестве повторностей могло бы улучшить эту статистическую значимость. Полученные данные указывают на увеличение в продуцировании IL-10, противовоспалительного цитокина, что подтверждает результаты, полученные для TNF, что приводит к возможности того, что белок L19 запускает противовоспалительный каскад в кожных эксплантатах, с увеличенным продуцированием IL-10. Выводы В исследовании цитотоксичности, токсичность белка L19 была очень низкой при величинах 25 мкг/мл. Выбор 25, 12,5 и 6,25 мкг/мл для выполнения задачи 2 был основан на скрининге цитотоксичности. Облучение УФ-светом при 10 Дж/см 3 производит значимый воспалительный эффект в пробах кожного эксплантата, не инкубированных с белком L19, и значимо увеличивает как уровни TNF, так и уровни IL-10 (внутреннюю противовоспалительную реакцию в коже). Белок L19 вызывает детектируемое уменьшение в продуцировании цитокина TNF в пробах кожи,облученных УФ-светом. Белок L19 производит общее увеличение в уровнях IL-10 во всех группах, инкубированных с этим белком, как в отношении проб, которые подвергаются облучению УФ-светом, так и проб, которые не подвергаются этому облучению. Согласно полученным результатам, способность белка L19 активировать противовоспалительное действие является очень высокой. Пример 3. Обусловленное IL-10 продуцирование LmL19 и произведенных из LmL19 пептидов. Цель этого исследования Определение, какие районы L19 (линейные эпитопы) способны индуцировать продуцирование IL10 в культурах селезенки. Материал Конструировали и химически синтезировали двадцать четыре различных пептидов. Каждый из них соответствует линейному району белка L19 Leishmania major (т.е. SEQ ID NO:1). Каждый пептид содержит 20 аминокислот, произведенных из L19 Leishmania major (т.е. SEQ ID NO:1), за исключением пептида 24, который содержит только 14 аминокислот. Каждый пептид перекрывается с 9 аминокислотами предыдущего пептида. Целый рекомбинантный белок L19 (Lm L19) Leishmania major (т.е. SEQ ID NO:1), экспрессируемый в Escherichia coli, использовали в качестве контроля. Результаты Клетки селезенки из не обработанных никакими воздействиями мышей BALB/c (5106 клеток/мл стимулировали (конечный объем 200 мкл) каждым индивидуальным пептидом (100 мкг/мл), смесью из 24 пептидов (100 мкг/мл), рекомбинантным белком Leishmania major, полученным из бактерии (12 мкг/мл), и не стимулировали. После 48 ч и 72 ч супернатанты собирали и количество IL-10 измеряли при помощи ELISA, как описано здесь ранее. Этот рекомбинантный LmL19, полученный в бактериях, был способен индуцировать синтез IL-10 в клетках селезенки из "необученных (необработанных)" мышей. Ни один из этих пептидов не был способен индуцировать такое же количество IL-10, какое индуцировалось этим белком. Однако статистически значимые количества IL-10 индуцировались пептидами 1, 2, 12, 13, 14, 23 и 24. Уровень индуцированного IL-10 был более высоким спустя 72 ч после стимуляции во всех случаях. Текущие эксперименты с пептидами Авторы этого изобретения повторяют эксперименты с новыми синтезированными пептидами для подтверждения полученных результатов. Согласно этим результатам, авторы этого изобретения используют те же самые пептиды, но включили 3 новых пептида, содержащие последовательности пептидов,которые индуцируют наивысшие уровни IL-10. Композициями этих пептидов являются: Цель Целями этого изобретения являются: тестирование противовоспалительного действия активного вещества авторов изобретения, произведенного из Lm L19 (т.е. SEQ ID NO:1), экспрессируемого в Е. coli и тестированного в ex vivo культурах кишечной ткани, и исследование этого противовоспалительного действия в модели болезни Крона животного. Методология Для достижения этих целей будут предприняты две различные стадии. 1. In vitro анализы с мукозными эксплантатами из пациентов с болезнью Крона, здоровых контролей и здоровых проб, где воспаление было индуцировано in vitro с РМА-иономицином. После 6 ч инкубирования проб с активным веществом, супернатанты будут анализированы на присутствие провоспалительных цитокинов, регуляторных цитокинов и хемокинов, таких как TNF, IL-10 и т.д. РНК будут экстрагированы из различных тканей для анализа экспрессии генов, кодирующих цитокины, хемокины, факторы транскрипции и сигналы воспаления. Ткани будут расщепляться для получения мукозных мононуклеарных клеток, где экспрессия некоторых клеток-маркеров будет изучаться для исследования различных состояний дендритных клеток после инкубирования. Популяция лимфоцитов будет также исследована для определения специфичности реакции на это активное вещество. 2. In vivo исследование противовоспалительного действия этого активного вещества с использованием мышиных воспалительных моделей, в которых хронический колит индуцируется в животных принятием внутрь питьевой воды с декстрансульфатом натрия (DSS) в течение нескольких дней. Активное вещество будет инокулироваться подкожно в животных до и после обработки DSS. Различные параметры, такие как количественное оценивание кишечного воспаления, будут измеряться для оценивания кишечного повреждения (14)-(25).