Биспецифические связывающие молекулы, связывающиеся с vegf и ang2

В изобретении описаны биспецифические связывающие молекулы, которые связываются и с VEGF, и с Ang2, предпочтительно в форме иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов типа VHH и доменных антител, фармацевтические композиции, содержащие их, и их применение для лечения заболеваний, которые ассоциированы с опосредуемыми VEGF и/или опосредуемыми Ang2 воздействиями на ангиогенез. Кроме того, описаны нуклеиновые кислоты,кодирующие биспецифические связывающие молекулы, клетки-хозяева и способы их получения. Гшвинд Андреас, Отт Рене Георг (DE),Букно Жоашен, Бюйз Мари-Анж,Депла Эрик (BE)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: БРИНГЕР ИНГЕЛЬХАЙМ ИНТЕРНАЦИОНАЛЬ ГМБХ (DE) 025148 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к области терапии человека, в частности противораковой терапии, и к агентам и композициям, применяемым в такой терапии. Предпосылки создания изобретения Когда опухоли достигают критического размера, составляющего примерно 1 мм 3, они начинают зависеть от ангиогенеза для обеспечения поступления с кровью кислорода и питательных веществ, позволяющих им продолжать рост. Антиангиогенные терапии стали важным методом лечения при некоторых типах опухолей. Эти терапии сфокусированы на блокаде пути VEGF (Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. 3(5), май 2004 г., p. 391-400) путем нейтрализации VEGF (авастин) или его рецепторов (сутент и сорафиниб). Современные поведенные на мышах исследования продемонстрировали, что ангиопоэтин-2 (Ang2),лиганд Tie2-рецептора, контролирует ремоделирование сосудов, обеспечивая функционирование других ангиогенных факторов, таких как VEGF. Ang2 экспрессируется главным образом эндотелиальными клетками, установлено, что имеет место его сильная индукция под действием гипоксии и других ангиогенных факторов, и было продемонстрировано, что он регулирует пластичность сосудов опухоли, что позволяет сосудам реагировать на VEGF и FGF2 (Augustin et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10(3), март 2009 г., p. 165-177). Установлено, что элиминирование или ингибирование Ang2 приводит к пониженному ангиогенезу (Gale et al., Dev Cell. 3(3), сентябрь 2002 г., p. 302-304; Falcon et al., Am J Pathol. 175(5), ноябрь 2009 г., p. 2159-2170), что согласуется с указанной ролью. Повышенные концентрации Ang2 в сыворотке обнаружены у пациентов с колоректальным раком (CRC), NSCLC и меланомой (Goede et al., Br JCancer. 103(9), 26 октября 2010 г., p. 1407-1414); Park et al., Chest. 132(1), июль 2007 г., p. 200-206; Helfrich et al., Clin Cancer Res. 15(4), 15 февраля 2009 г., p. 1384-1392). При CRC-раке уровни Ang2 в сыворотке коррелируют с терапевтическим ответом на анти-VEGF терапию. Система Ang-Tie состоит из двух рецепторов (Tie1 и Tie2) и трех лигандов (Ang1, Ang2 и Ang4)(Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 10(3), март 2009 г., p. 165-177). Tie2, Ang1 и Ang2 являются наиболее хорошо изученными представителями этого семейства, Tie1 представляет собой сиротский рецептор,а роль Ang4 в ремоделировании сосудов подлежит изучению. Ang2 и Ang1 опосредуют противоположные функции при связывании с Tie2 и активации. Опосредуемая Ang2 активация Tie2 приводит к активации эндотелиальных клеток, диссоциации перицитов, просачиванию из сосудов и индукции и разрастанию сосудов. В отличие от Ang2 передача сигналов Ang1 поддерживает целостность сосудов путем рекрутмента перицитов, поддерживая, тем самым, состояние покоя эндотелиальных клеток. Ангиопоэтин 2 (Ang2) представляет собой секретируемый лиганд для тирозинкиназного Tie2 рецептора с молекулярной массой 66 кДа (Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 10(3), март 2009 г.,p. 165-177.). Ang2 состоит из N-концевого "coiled-coil" домена и С-концевого фибриногенподобного домена, последний необходим для взаимодействия с Tie2. Ang2 экспрессируется главным образом эндотелиальными клетками, было установлено, что имеет место его сильная индукция под действием гипоксии и других ангиогенных факторов, включая VEGF. Tie2 обнаружен в эндотелиальных клетках, гематопоэтических стволовых клетках и опухолевых клетках. Установлено, что Ang2-Tie2 регулирует пластичность сосудов опухоли, что позволяет сосудам реагировать на VEGF и FGF2.In vitro установлено, что Ang2 действует в качестве несильного митогена, хемоаттрактанта и индуктора образования трубочек в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC). Ang2 индуцирует фосфорилирование тирозина при эктопической экспрессии Tie2 в фибробластах и стимулирует передачу сигналов по ходу транскрипции, таких как фосфорилирование ERK-MAPK, AKT и FAK, вHUVEC. Описано антагонистическое воздействие Ang2 на индуцируемые Ang1 ответы эндотелиальных клеток. Установлено, что дефицит Ang2 приводит у мышей к выраженному дефекту лимфатической структуры. Хотя снижение уровня Ang2 не имеет решающего значения для развития эмбриональных сосудов,мыши с дефуцитом Ang2 имели устойчивые дефекты сосудов в сетчатке и почке. В сочетании со схемой динамики экспрессии Ang2 в местах ангиогенеза (например, в яичнике), указанные данные свидетельствуют о том, что Ang2 контролирует ремоделирование сосудов, обеспечивая функции других ангиогенных факторов, таких как VEGF. Система Ang2-Tie2 имеет решающее значение в процессе ангиогенного "переключения" и на последних стадиях ангиогенеза опухоли. Для экспрессии Ang2 характерна сильная повышающая регуляция в ассоциированном с опухолью эндотелии. Замедленный рост опухолей обнаружен при имплантации в мышей с дефицитом Ang2, прежде всего на ранних стадиях роста опухоли. Установлено, что терапевтическая блокада Ang2 с помощью mAb к Ang2 обладает широким спектром эффективности в отношении моделей различных опухолей, созданных с использованием ксенотрансплантатов. Описано дополнительное воздействие mAb к Ang2 с использованием ингибиторов VEGFR2 (mAb и низкомолекулярные ингибиторы). Как обобщено в US 2008/0014196 и WO 2008/101985, ангиогенез принимает участие в патогенезе ряда нарушений, включая плотные (солидные) опухоли и метастазы, а также глазные болезни. Одним из наиболее важных проангиогенных факторов является сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF),который обозначают также как VEGF-A или фактор сосудистой проницаемости (VPF). VEGF принадле-1 025148 жит к семейству генов, включающему плацентарный фактор роста (PLGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D,VEGF-E и VEGF-F. Альтернативный сплайсинг мРНК единичного гена человеческого VEGF приводит к образованию по меньшей мере шести изоформ (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189 иVEGF206), при этом наиболее часто встречающейся изоформой является VEGF165. Идентифицировано два тирозинкиназных рецептора VEGF (VEGFR), которые взаимодействуют сVEGF, а именно VEGFR-1 (который обозначают также как Fit-1) и VEGFR-2 (который обозначают также как KDR или FIK-1). VEGFR-1 обладает наиболее высокой аффинностью к VEGF, a VEGFR-2 характеризуется несколько более низкой аффинностью к VEGF. У Ferrara (Endocrine Rev., 25, 2004, p. 581-611) представлено подробное описание VEGF, данные о его взаимодействии с рецепторами и его функция при нормальных и патологических процессах описаны, например, у Hoeben et al., Pharmacol. Rev., 56,2004, p. 549-580. Известно, что VEGF представляет собой имеющий решающее значение регулятор как нормального,так и аномального ангиогенеза (Ferrara и Davis-Smyth, Endocrine Rev., 18, 1997, p. 4-25; Ferrara, J. Mol.Med., 77, 1999, p. 527-543). По сравнению с другими факторами роста, которые участвуют в процессах формирования сосудов, VEGF является уникальным благодаря его высокой специфичности в отношении эндотелиальных клеток в сосудистой системе. В большинстве человеческих опухолей обнаружена сверхэкспрессия мРНК VEGF. В случае роста опухолей ангиогенез, по-видимому, имеет решающее значение для перехода от гиперплазии к неоплазии и для обеспечения питания, необходимого для роста и метастазирования опухоли (Folkman et al., Nature, 339, 1989, p. 58), что позволяет опухолевым клеткам приобретать преимущества с позиций роста по сравнению со здоровыми клетками. Таким образом, антиангиогенные терапии могут стать важным средством лечения некоторых типов опухолей. Эти терапии сфокусированы на блокаде VEGF-пути (Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov., 3(5), май 2004 г., p. 391-400).VEGF принимает участие также в патогенезе глазных болезней. Обнаружен высокий уровень корреляции между концентрацией VEGF в глазных жидкостях и наличием активной пролиферации кровеносных сосудов у пациентов с диабетическими и другими связанными с ишемией ретинопатиями. Кроме того, в современных исследованиях продемонстрирована локализация VEGF в хороидальных неоваскулярных мембранах у пациентов, страдающих возрастной дегенерацией желтого пятна (AMD). При различных воспалительных заболеваниях обнаружена также повышающая регуляция VEGF. VEGF принимает участие в патогенезе ревматоидного артрита (РА), воспалительного заболевания, в котором ангиогенез играет значительную роль. Раскрытие роли VEGF в ангиогенезе и различных процессах свидетельствует о том, что он представляет собой новую потенциальную мишень для терапевтического вмешательства. Функцию VEGF ингибировали с помощью малых молекул, которые блокируют или предупреждают активацию рецепторных тирозинкиназ VEGF (Schlaeppi и Wood, Cancer Metastasis Rev., 18, 1999, p. 473-481) и, как следствие,оказывают воздействие на путь трансдукции сигнала рецептора VEGF. Цитотоксические конъюгаты,содержащие бактериальные или растительные токсины, могут ингибировать стимулирующее действиеVEGF на ангиогенез опухолей. Например, конъюгаты VEGF-токсин DT385 (домены дифтерийного токсина, слитые или химически конъюгированные с VEGF165), эффективно ингибируют рост опухолей invivo. Ингибирование роста опухолей можно осуществлять также путем введения мутанта Flk-1 или растворимых VEGF-рецепторов с использованием ретровирусов. Разработаны нейтрализующие VEGF антитела, такие как А 4.6.1 и MV833, которые блокируют связывание VEGF с его рецепторами, и в доклинических исследованиях была продемонстрирована их противоопухолевая активность (Kim et al., Nature, 362, 1993, p. 841-844; Folkman Nat. Med., 1, 1995, p. 27-31;Alitalo, Nat. Med., 5, 1999, p. 1359-1364; 320, 340). Обзор исследований с использованием терапевтических подходов, основанных на применении антител к VEGF, представлен у Campochiaro и Hackett,Oncogene, 22, 2003, p. 6537-6548. В клинических исследованиях наиболее изученным является антитело А 4.6.1, которое обозначают также как бевацизумаб (Avastin; фирма Genentech, Сан-Франциско, шт. Калифорния). В WO 2008/101985 описаны иммоноглобулиновые единичные вариабельные домены верблюдовых(VHH или "Nanobodies", представленные в настоящем описании), которые связываются с VEGF, и их применение для лечения состояний и заболеваний, отличающихся чрезмерным и/или патологическим ангиогенезом или неоваскуляризацией. Таким образом, в основу настоящего изобретения была положена задача разработать новые ангиогенные связывающие молекулы, предназначенные для лечения человека. Еще одним объектом изобретения являются способы предупреждения, лечения, облегчения и/или диагностирования указанных заболеваний, нарушений или состояний, заключающиеся в том, что применяют или вводят указанные связывающие молекулы и содержащие их композиции. В частности, объектом изобретения являются указанные фармакологически активные связывающие молекулы, композиции и/или способы, обладающие преимуществами по сравнению с агентами, композициями и/или методами,которые применяют в настоящее время и/или которые известны в данной области. Указанные преимуще-2 025148 ства включают улучшенные терапевтические и/или фармакологические свойства и/или другие обладающие преимуществами свойства, например, для целей изготовления, прежде всего по сравнению с каноническими антителами, описанными выше, или их фрагментами. Краткое изложение сущности изобретения Первым объектом изобретения являются биспецифические связывающие молекулы, предпочтительно биспецифические иммуноглобулины, предпочтительно иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены типа VHH и доменных антител, которые содержат по меньшей мере одинVEGF-связывающий компонент и по меньшей мере один Ang2-связывающий компонент в одной молекуле. Эти биспецифические связывающие молекулы предпочтительно содержат также компонент, связывающий сывороточный альбумин. Более конкретно, биспецифическая связывающая молекула, предлагаемая в изобретении, практически содержит (I) Ang2-связывающий компонент, который специфически связывается по меньшей мере с одним эпитопом Ang2, и (II) VEGF-связывающий компонент, который специфически связывается по меньшей мере с одним эпитопом VEGF, где компоненты сцеплены друг с другом таким образом, что они одновременно связываются с Ang2 и VEGF, или таким образом, что они связываются в определенный момент времени с Ang2 или VEGF. Таким образом, согласно предпочтительным объектам изобретения два компонента содержат один или несколько иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, которые могут независимо друг от друга представлять собой VHH или доменные антитела и/или любой другой вид иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, таких как VL-домены, как они представлены в настоящем описании,при условии, что каждый из указанных иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов должен связываться с антигеном, т.е. Ang2 или VEGF соответственно. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены относятся к одному и тому же типу, в частности, все иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены представляют собой VHH или доменные антитела. Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения все иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены представляют собой VHH, предпочтительно гуманизированныеVHH (анти-Ang2 VHH) и (необязательно гуманизированное или с оптимизированной последовательностью) антитело к VEGF типа VHH (анти-VEGF VHH). Однако, как должно быть очевидно специалисту в данной области, настоящее изобретение аналогичным образом относится к биспецифическим связывающим молекулам, которые включают другие анти-Ang2 или анти-VEGF иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, такие как доменные антитела. Другим объектом изобретения являются нуклеиновые кислоты, кодирующие биспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, а также клетки-хозяева, которые их содержат. Изобретение относится также к продукту или композиции, который/которая содержит или представляет собой по меньшей мере одну биспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, и необязательно один или несколько дополнительных компонентов указанной композиции. Изобретение относится также к способам получения или создания биспецифических связывающих молекул, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, продуктов и композиций, указанных в настоящем описании. Изобретение относится также к вариантам применения биспецифических связывающих молекул,нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, продуктов и композиций, указанных в настоящем описании, а также к способам предупреждения и/или лечения заболеваний и нарушений, которые можно модулировать путем ингибирования Ang2. Было установлено, что Ang2-связывающий компонент биспецифических связывающих молекул,предлагаемых в настоящем изобретении, связывается с Ang2 по меньшей мере в 5000 сильнее, предпочтительно в 10000 раз сильнее, чем с Ang1 или Ang4. Это должно в большой степени позволять избегать блокады активации опосредуемой Ang1 передачи сигналов, что может препятствовать требуемому антиангиогенному действию. Установлено также, что VEGF-связывающий компонент биспецифических свяызвающих молекул,предлагаемых в изобретении, связывается с VEGF-A с аффинностью по меньшей мере в 1000 раз более высокой, предпочтительно по меньшей мере в 5000 раз более высокой, более предпочтительно по меньшей мере в 10000 раз более высокой, чем с VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D или PLGF. Благодаря наиболее выраженному связыванию с VEGF-A не происходит взаимодействия с передачей сигнала VEGFR3, которой модулирует ангиогенез лимфатических сосудов. Предпочтительным вариантом осуществления изобретения являются биспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, в виде сцепленных VHH-доменов. Указанные молекулы существенно меньше канонических антител и поэтому могут глубже проникать в опухоль, чем-3 025148 указанные канонические антитела. Это полезное свойство дополнительно усиливается с помощью специфических последовательностей, указанных в настоящем описании, после элиминиации в них сайтов гликозилирования. Кроме того, благодаря биспецифической природе (VEGF- и Ang2-связывающие компоненты в одной молекуле) проникновение в опухоль обеих функциональностей неизбежно должно быть одинаковым, что должно гарантировать, что благоприятные действия объединенного антагонизма VEGF и Ang2 должно распространяться на всю глубину проникновения в опухоль. Это может являться преимуществом по сравнению с применением комбинации индивидуальных антагонистов к этим мишеням, поскольку глубина проникновения индивидуальных антагонистов всегда может варьироваться в некоторой степени. Другим преимуществом предпочтительных биспецифических связывающих молекул, предлагаемых в настоящем изобретении, является их более продолжительное время полужизни в сыворотке благодаря наличию компонента, связывающего сывороточный альбумин, такого как связывающая сывороточный альбумин молекула, представленная в настоящем описании. Эти и другие объекты, варианты осуществления изобретения, преимущества и варианты применения изобретения должны стать более понятными после ознакомления с дополнительно представленным ниже описанием. Определения Если не указано или определено иное, то все применяемые понятия употребляются в их обычном значении, принятом в данной области, которое очевидно специалистам в данной области. В качестве ссылки можно указать, например, стандартные руководства, такие как Sambrook et al., "MolecularGower Medical Publishing, London, New York, 1989, а также документы, касающиеся общего уровня техники, процитированные в настоящем описании; кроме того, если не указано иное, все методы, стадии,процессы и манипуляции, которые не описаны конкретно в деталях, можно осуществлять (и их осуществляли) хорошо известными методами, что должно быть очевидно специалисту в данной области. И в этом случае также в качестве ссылки можно, например, указать на известные руководства, сведения, касающиеся общего уровня техники, указанные выше, и дополнительные процитированные в них ссылки. Понятие "биспецифическая связывающая молекула" относится к молекуле, которая содержит по меньшей мере одну Ang2-связывающую молекулу (или "Ang2-связывающий компонент") и по меньшей мере одну VEGF-связывающую молекулу (или "VEGF-связывающий компонент"). Биспецифическая связывающая молекула может содержать более одной Ang2-связывающей молекулы и/или более однойVEGF-связывающей молекулы, что имеет место в том случае, когда биспецифическая связывающая молекула содержит бипаратопную (что будет описано ниже) Ang2-связывающую молекулу и/или бипаратопную VEGF-связывающую молекулу, в той части молекулы, которая связывается с Ang2 или с VEGF,т.е. в ее "Ang2-связывающем компоненте" или (анти-Ang2-компоненте) или "VEGF-связывающем компоненте" (или в анти-VEGF-компоненте) соответственно. Однако понятие "биспецифический" в этом контексте не предусматривает, что из биспецифической связывающей молекулы исключаются дополнительные связывающие компоненты, которые имеют связывающую специфичность в отношении молекул,отличных от VEGF и Ang2. Примерами указанных дополнительных связывающих компонентов являются(но не ограничиваясь только ими) связывающие компоненты, которые связываются с сывороточным альбумином. Если не указано иное, то понятия "иммуноглобулин" и "последовательность иммуноглобулина", если их используют в контексте настоящего описания касательно состоящего только из тяжелых цепей антитела или канонического, состоящего из 4 цепей антитела, применяют в качестве общих понятий,которые включают полноразмерное антитело, его индивидуальные цепи, а также все его области, домены или фрагменты (включая (но не ограничиваясь только ими) антигенсвязывающие домены или фрагменты, такие как VHH-домены или VH/VL-домены соответственно). Кроме того, понятие "последовательность" в контексте настоящего описания (например, в понятиях типа "последовательность иммуноглобулина", "последовательность антитела" "последовательность (единичного) вариабельного домена, "последовательность VHH" или "последовательность белка"), как это обычно принято, относится как к соответствующим аминокислотным последовательностям, так и к последовательностям нуклеиновых кислот или нуклеотидным последовательностям, которые их кодируют, если из контекста не следует более ограниченная интерпретация. Понятие "домен (область)" (полипептида или белка) в контексте настоящего описания относится к складчатой белкой структуре, которая обладает способностью сохранять свою третичную структуру, независимо от остального белка. Как правило, домены ответственны за отдельные функциональные свойства белков и во многих случаях их можно добавлять, удалять или переносить в другие белки без потери функции оставшейся части белка и/или домена. Понятие "иммуноглобулиновый домен" в контексте настоящего описания относится к глобулярной области цепи антитела (такой, например, как цепь канонического, состоящего из 4 цепей антитела или состоящего из тяжелых цепей антитела) или к полипептиду, который состоит практически из указанной-4 025148 глобулярной области. Иммуноглобулиновые домены отличаются тем, что они сохраняют присущую иммуноглобулину складчатую структуру молекул антитела, которая представляет собой 2-слойный "сэндвич", состоящий примерно из 7 антипараллельных бета-цепей, упакованных в две бета-складки, необязательно стабилизированных с помощью консервативного дисульфидного мостика. Иммуноглобулиновый домен содержит вариабельный(ые) домен(ы), т.е. один или несколько иммуноглобулиновых вариабельных доменов. Понятие "иммуноглобулиновый вариабельный домен (область)" в контексте настоящего описания относится к иммуноглобулиновому домену, состоящему практически из четырех "каркасных участков", как они определены в данной области, и обозначены ниже как "каркасный участок 1" или"FR4" соответственно; указанные каркасные участки перемежаются тремя "гипервариабельными участками, участками, определяющими комплементарность" или "CDR", как они определены в данной области, и обозначены ниже как "гипервариабельный участок 1" или "CDR1"; "гипервариабельный участок 2" или "CDR2" и "гипервариабельный участок 3" или "CDR3" соответственно. Таким образом, общую структуру или последовательность вариабельного домена иммуноглобулина можно обозначать как FR1CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Именно вариабельный(ые) домен(ы) иммуноглобулина придает(ют) специфичность антителу в отношении антигена, поскольку он(они) несут антигенсвязывающий центр. В контексте настоящего изобретения предпочтительными являются иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены типа VHH и доменных антител. Понятие "иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен" в контексте настоящего описания относится к иммуноглобулиновому вариабельному домену, который обладает способностью специфически связываться с эпитопом антигена без спаривания с дополнительным иммуноглобулиновым вариабельным доменом. Одним из примеров иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов согласно настоящему изобретению являются "доменные антитела", такие как единичные вариабельные доменыVH и VL (VH-домены и VL-домены). Другим примером иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов являются "VHH-домены" (или просто "VHH") из представителей верблюдовых, как указано ниже в настоящем описания. В свете вышеуказанных определений антигенсвязывающий домен канонического, состоящего их 4 цепей антитела (такого как молекула IgG, IgM, IgA, IgD или IgE; известная в данной области) илиFab-фрагмента, F(ab')2-фрагмента, Fv-фрагмента, такого как связанный дисульфидным мостиком Fv илиscFv-фрагмент, или димерного антитела (которые все известны в данной области), выведенный из указанного канонического, состоящего из 4 цепей антитела, не следует рассматривать как иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, поскольку в этих случаях связывание с соответствующим эпитопом антигена в норме не может осуществляться с помощью одного (единичного) иммуноглобулинового домена, а должно происходить посредством спаривания (ассоциации) иммуноглобулиновых доменов,таких как вариабельные области легкой и тяжелой цепей, т.е. с помощью пары VH-VL иммуноглобулиновых доменов, которые совместно связываются с эпитопом соответствующего антигена."VHH-домены", которые обозначают также как VHH, VHH-домены, фрагменты VHH-антитела иVHH-антитела, впервые были описаны как антигенсвязывающие иммуноглобулиновые (вариабельные) домены "состоящих из тяжелых цепей антител" (т.е. "антител, в которых отсутствуют легкие цепи"),Hamers-Casterman С., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers С., Songa E.B., Bendahman N.,Hamers R. в "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 1993, p. 446-448). Понятие"VHH-домен" было выбрано для того, что можно было отличать эти вариабельные домены от вариабельных областей тяжелых цепей, которые присутствуют в канонических, состоящих из 4 цепей антителах(они обозначены далее как "VH-домены (области)" или "VH-домены (области)") и от вариабельных областей легких цепей, которые присутствуют в канонических, состоящих из 4 цепей антителах (они обозначены далее как "VL-домены (области)" или "VL-домены (области)"). VHH-домены могут специфически связываться с эпитопом без дополнительного антигенсвязывающего домена (в отличие от VH- илиVL-доменов в каноническом состоящем из 4 цепей антителе, в котором для распознавания эпитопа требуется присутствие VL-домена в сочетании с VH-доменом). VHH-домены представляют собой небольшие, сильные и эффективные распознающие антиген структуры (единицы), образованные единичным иммуноглобулиновым доменом. В контексте настоящего изобретения понятия VHH-домен, VHH, VHH-домен, фрагментVHH-антитела, VHH-антитело, а также "Nanobody" и "домен Nanobody" ("Nanobody" является товарным знаком компании Ablynx N.V.; Гент, Бельгия) применяют взаимозаменяемо, и они относятся к иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменам (которые имеют следующее строение:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 и которые специфически связываются с эпитопом, не требуя присутствия второго иммуноглобулинового вариабельного домена), и они отличаются от VH-доменов наличием так называемых "отличительных остатков, остатков-маркеров", как они определены, например, вWO 2009/109635, фиг. 1. Аминокислотные остатки иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, напримерVHH, нумеруют согласно общей номенклатуре Кэбота для VH-доменов ("Sequence of proteins of immunological interest", изд-во US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, публикация 91), в том виде, в-5 025148 котором ее применяют для VHH-доменов верблюдовых, например, как продемонстрировано на фиг 2 уFR4 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 103-113. Однако следует отметить, что, как хорошо известно для VH-доменов и для VHH-доменов, общее количество аминокислотных остатков в каждом CDR может варьироваться и может не соответствовать общему количеству аминокислотных остатков, указанных в номенклатуре Кэбота (т.е. одно или несколько положений согласно номенклатуре Кэбота может быть незанятым в фактической последовательности или фактическая последовательность может содержать большее количество аминокислотных остатков,чем количество остатков, которое должно присутствовать согласно номенклатуре Кэбота). Это означает,что, в целом, нумерация по Кэботу может как соответствовать, так и не соответствовать фактической нумерации аминокислотных остатков в фактической последовательности. В данной области известны альтернативные методы нумерации аминокислотных остатковVH-доменов, указанные методы также можно применять аналогичным образом к VHH-доменам. Однако в настоящем описании, формуле изобретения и на чертежах нумерация соответствует номенклатуре Кэбота, и ее применяют к описанным выше VHH-доменам, если специально не указано иное. Общее количество аминокислотных остатков в VHH-домене, как правило, составляет от 110 до 120,чаще от 112 до 115. Однако следует отметить, что для целей настоящего изобретения можно применять также как более короткие, так и более длинные последовательности. Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены (например, VHH и "доменные" антитела),имеют ряд уникальных структурных характеристик и функциональных свойств, которые делают их наиболее предпочтительными для применения в терапии в качестве функциональных антигенсвязывающих молекул. В частности (но не ограничиваясь только ими), VHH-домены (которые "созданы" природой таким образом, что они могут функционально связываться с антигеном без спаривания с вариабельной областью легкой цепи) могут функционировать как единичные относительно мелкие функциональные антигенсвязывающие структурные единицы. Благодаря своим уникальным свойствам иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены,как они определены в настоящем описании, типа VHH или VH (или VL), либо индивидуально, либо в качестве части более крупного полипептида, например бипаратопной молекулы, обладают рядом важных преимуществ: только один домен необходим для связывания антигена с высокой аффинностью и высокой селективностью, поэтому отсутствует как необходимость в наличии двух отдельных доменов, так и необходимость в требовании, чтобы эти два домена находились в правильной пространственной конформации и конфигурации (т.е. необходимость в применении специально созданных линкеров, как в случае scFv); иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены можно экспрессировать с одной молекулы нуклеиновой кислоты, и при этом отсутствует необходимость в какой-либо посттрансляционной модификации (типа гликозилирования); иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены легко можно конструировать в многовалентных и мультиспецифических форматах (что подробно обсуждено ниже в настоящем описании); иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены обладают высокой специфичностью и аффинностью к мишени, низкой присущей им токсичностью, и их можно вводить путями, отличными от инфузии или инъекции; иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены обладают высокой устойчивостью к нагреванию, рН, протеазам и другим денатурирующим агентам или условиям, и поэтому их можно получать,хранить или транспортировать без применения охлаждающего оборудования; иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены можно легко и относительно дешево получать как в лабораторном, так и в промышленном масштабе. Например, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены и полипептиды, содержащие их, можно получать с использованием ферментации микроорганизмов (что более подробно описано ниже), и для этой цели не требуется применения экспрессионных систем млекопитающих, что имеет место в случае канонических антител; иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены являются относительно небольшими (примерно 15 кДа или в 10 раз меньше, чем канонический IgG) по сравнению с каноническими состоящими из 4 цепей антителами и их антигенсвязывающими фрагментами, и поэтому для них характерна высокая(более высокая) способность проникать в ткани (включая (но не ограничиваясь только ими) плотные опухоли и другие плотные ткани), и их можно вводить в более высоких дозах, чем дозы канонических,состоящих из 4 цепей антител и их антигенсвязывающих фрагментов;VHH обладают специфической так называемой "способностью связываться с сайтом, расположенном в расщелине (бороздке)" (в том числе благодаря их удлиненной CDR3-петле, в отличие отVH-доменов состоящих из 4 цепей антител), и поэтому для них являются доступными также мишени и эпитопы, которые не доступны для канонических, состоящих из 4 цепей антител и их антигенсвязывающих фрагментов;VHH обладают важным преимуществом, которое заключается в том, что они обладают высокой растворимостью и очень высокой стабильностью и не имеют тенденцию к агрегации (что имеет место в случае полученных из антител мышей антигенсвязывающих доменов, описанных у Ward et al., Nature,341, 1989, p. 544-546. Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, не ограничены каким-либо конкретным биологическим источником, из которого их получают, или конкретным методом получения. Например, процесс получения VHH может включать следующие стадии:(1) выделение VHH-домена из встречающегося в естественных условиях содержащего (только) тяжелые цепи антитела; или скрининг библиотеки содержащих (только) тяжелые цепи антител или VHH, и выделение из них VHH;(2) экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VHH-домен, имеющий встречающуюся в естественных условиях последовательность;(3) "гуманизация" (или оптимизация последовательности) VHH, необязательно после созревания аффинности, с помощью имеющей встречающуюся в естественных условиях последовательности, или экспрессия нуклеиновой кислоты, которая кодирует гуманизированный VHH;(4) "камелизация" (согласно описанному ниже методу) иммуноглобулинового единичного вариабельного домена тяжелой цепи встречающегося в естественных условиях антитела, полученного из различных видов животных, в частности видов млекопитающих, таких как человек, или экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный камелизированный домен;(5) "камелизация" VH или экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей камелизированный VH;(6) применение методик для получения синтетических или полусинтетических белков, полипептидов или других аминокислотных последовательностей;(7) получение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VHH-домен, с помощью методов синтеза нуклеиновых кислот с последующей экспрессией полученной таким образом нуклеиновой кислоты;(8) подвергание содержащих тяжелые цепи антител или VHH процессу созревания аффинности, мутагенезу (например, неспецифическому мутагенезу или сайтаправленному мутагенезу) и/или любой(ым) другой(им) обработке(ам) для повышения аффинности и/или специфичности VHH; и/или(9) сочетание или выбор некоторых из вышеизложенных стадий. Приемлемые методы и процессы осуществления указанных выше стадий известны в данной области и должны быть очевидны специалисту в данной области. Например, методы полученияVHH-доменов, которые связываются со специфическим антигеном или эпитопом, описаны вWO 2006/040153 и WO 2006/122786. Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, или присутствующие в полипептидах, предлагаемых в изобретении, представляют собой VHH-домены, аминокислотная последовательность которых практически соответствует аминокислотной последовательности встречающегося в естественных условияхVHH-домена, но является гуманизированной (имеет оптимизированную последовательность) необязательно в результате созревания аффинности), т.е. имеет(ют) место замена(ы) одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности указанного встречающегося в естественных условиях VHH на один или несколько аминокислотных остатков, которые находятся в соответствующем(их) положении(ях) в вариабельной области тяжелой цепи канонического, состоящего из 4 цепей человеческого антитела. Для этой цели можно применять методы, известные в данной области, которые являются общепринятыми для специалиста в данной области. Гуманизированный VHH-домен может содержать одну или несколько последовательностей полностью человеческих каркасных участков и в еще более конкретном варианте осуществления изобретения может содержать последовательности человеческих каркасных участков, выведенные из последовательностей человеческой зародышевой линии Vh3, таких как DP-29, DP-47, DP-51, или их части, или обладать высоким уровнем гомологии с ними, необязательно в сочетании с JH-последовательностями, такими как JH5. Так, протокол гуманизации может предусматривать замену любого из остатков VHH на соответствующие остатки каркасного участка 1, 2 и 3 (FR1, FR2 и FR3) генов VH зародышевой линии, таких как DP 47, DP 29 и DP 51 либо индивидуально, либо в комбинации. Приемлемые каркасные участки (FR) иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, предлагаемых в изобретении, можно выбирать из участков, описанных, например, в WO 2006/004678, и, в частности, они включают так называемые классы "KERE" и "GLEW". Наиболее предпочтительными являются иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые имеют аминокислотную последовательность G-L-E-W примерно в положениях 44-47, и их соответствующие гуманизированные копии. Гуманизированный VHH-домен может-7 025148 содержать одну или несколько последовательностей полностью человеческого каркасного участка. Например, применяемая с целью гуманизации замена VHH, принадлежащих к 103 P,R,S-группе и/или GLEW-группе (что описано ниже), представляет собой замену 108Q на 108L. Методы гуманизации иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов известны в данной области. Связывающие иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены с улучшенными с позиций терапевтического применения свойствами, например обладающие повышенной аффинностью или пониженной иммуногенностью, можно получать из индивидуальных связывающих молекул с помощью методик, известных в данной области, таких как созревание аффинности (например используя в качестве исходных синтетические, произвольные или встречающиеся в естественных условиях последовательности иммуноглобулинов), CDR-трансплантация, гуманизация, объединение фрагментов, полученных из различных последовательностей иммуноглобулинов, ПЦР-сборка с использованием перекрывающихся праймеров и аналогичные методики, предназначенные для конструирования последовательностей иммуноглобулинов, которые хорошо известны специалисту в данной области; или любой приемлемой комбинации любых вышеизложенных методов, что обозначают также понятием "оптимизация последовательности", употребляемым в настоящем описании. В качестве ссылки можно указать, например, стандартные руководства, а также можно использовать приведенное ниже описание и сведения, представленные в примерах. При необходимости связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, которая обладает повышенной аффинностью, получают из другой связывающей молекулы путем созревания аффинности,последняя представляет собой "родительскую" связывающую молекулу относительно молекулы с созревшей аффинностью. Ранее были описаны методы получения VHH, которые связываются со специфическим антигеном или эпитопом, см., например, WO 2006/040153 и WO 2006/122786. Как подробно описано в указанных документах, VHH-домены, выведенные из представителей верблюдовых, можно "гуманизировать" (в контексте настоящего описания этот процесс обозначен также как "оптимизация последовательности",при этом "оптимизация последовательности", помимо гуманизации, может включать дополнительную модификацию последовательности с помощью одной или нескольких мутаций, которые позволяют получать VHH с улучшенными свойствами, таких как удаление потенциальных сайтов посттрансляционных модификаций) путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности исходной последовательности VHH на один или несколько аминокислотных остатков,которые находятся в соответствующем(их) положении(ях) в VH-области канонического, состоящего из 4 цепей человеческого антитела. Гуманизированный VHH-домен может содержать одну или несколько последовательностей полностью человеческого каркасного участка и в более конкретном варианте осуществления изобретения может содержать последовательности человеческих каркасных участков, выведенные из DP-29, DP-47, DP-51, или их части, необязательно в сочетании с JH-последовательностями,такими как JH5."Доменные антитела", которые обозначают также как "Dab" или "dAb" (понятия "доменные" антитела" и "dAb" являются товарным знаком группы компаний GlaxoSmithKline), описаны, например, уEscherichia coli", Nature 341, 1989, p. 544-546; у Holt L.J. et al. в "Domain antibodies: proteins for therapy",TRENDS in Biotechnology 21(11), 2003, p. 484-490 и в WO 2003/002609. Доменные антитела в основном соответствуют VH- или VL-доменам антител из представителей млекопитающих, не относящихся к верблюдовым, в частности человеческих, состоящих из 4 цепей антител. Для придания способности связываться с эпитопом в виде единичного антигенсвязывающего домена, т.е. без спаривания с VL- или VH-доменом соответственно, требуется осуществлять специфическую селекцию в отношении указанных антигенсвязывающих свойств, например, с использованием библиотек человеческих последовательностей единичных VH- или VL-доменов. Доменные антитела подобно VHH имеют молекулярную массу, составляющую от примерно 13 до примерно 16 кДа, если их выводят из полностью человеческих последовательностей, и они не нуждаются в гуманизации, например, для терапевтического применения на людях. Так же как и в случаеVHH-доменов, их можно с успехом экспрессировать в прокариотических системах экспрессии, что приводит к существенному снижению общей стоимости производства. Кроме того, что также должно быть очевидно специалисту в данной области, можно "трансплантировать" один или несколько указанных выше CDR в другие "каркасы", включая (но не ограничиваясь только ими) человеческие каркасы или неиммуноглобулиновые каркасы. Приемлемые каркасы и методики такой трансплантации CDR известны в данной области. Понятия "эпитоп" и "антигенная детерминанта", которые можно применять взаимозаменяемо, относятся к участку макромолекулы, такой как полипептид, который распознается антигенсвязывающими молекулами, такими как канонические антитела или полипептиды, предлагаемые в изобретении, и более конкретно антигенсвязывающими центрами указанных молекул. Эпитопы представляют собой минимальный сайт связывания для иммуноглобулина и поэтому представляют собой специфическую мишень для иммуноглобулина.-8 025148 Считают, что полипептид (такой как иммуноглобулин, антитело, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в изобретении, или в целом связывающая молекула или ее фрагмент), который может "связываться с" или "специфически связываться с", который обладает "аффинностью к" и/или "специфичностью к" определенному эпитопу, антигену или белку (или по меньшей мере одному его участку, фрагменту или эпитопу), "действует против" или является "направленным против" указанного эпитопа, антигена или белка, или является "связывающей" молекулой в отношении указанного эпитопа, антигена или белка. В этом контексте VEGF-связывающий компонент можно обозначать также как "VEGF-нейтрализующий" компонент. Как правило, понятие "специфичность" относится к ряду антигенов или эпитопов различных типов,с которыми конкретная антигенсвязывающая молекула или молекула антигенсвязывающего белка (такая как иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в изобретении) может связываться. Специфичность антигенсвязывающей молекулы можно определять на основе ее аффинности и/или авидности. Аффинность, характеризующаяся константной равновесия реакции диссоциации комплекса антиген:антигенсвязывающий белок (KD), является мерой силы связывания между эпитопом и антигенсвязывающим центром антигенсвязывающего белка: чем меньше величина KD, тем выше сила связывания между эпитопом и антигенсвязывающей молекулой (в альтернативном варианте аффинность можно выражать в виде константы аффиннности (KA), которая представляет собой 1/KD). Как должно быть очевидно специалисту в данной области (например, после ознакомления с представленным ниже дополнительным описанием), аффинность можно определять хорошо известным методом в зависимости от специфичности представляющего интерес антигена. Авидность представляет собой меру силы связывания между антигенсвязывающей молекулой (такой как иммуноглобулин, антитело, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или полипептид, содержащий их) и соответствующего антигена. Авидность связана как с аффинностью между эпитопом и его антигенсвязывающем центром антигенсвязывающей молекулы, так и с количеством соответствующих сайтов связывания, которые присутствует в антигенсвязывающей молекуле. Часть антигенсвязывающей молекулы, которая распознает эпитоп, называется паратопом. Если не указано иное, то понятие "VEGF-связывающая молекула" или "Ang2-связывающая молекула" включает антитела к VEGF или к Ang2, фрагменты антитела к VEGF или антитела к Ang2, "молекулы, напоминающие антитело к VEGF" или "молекулы, напоминающие антитело к Ang2", как они определены в настоящем описании, и конъюгаты, включающие любую из них. Антитела представляют собой(но не ограничиваясь только ими) моноклональные и химерные моноклональные антитела. Понятие "антитело" относится к полным иммуноглобулинам, например, моноклональным антителам,которые получают путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах, а также к фрагментам антител или "молекулам, напоминающим антитела", включая одноцепочечные антитела и линейные антитела, так называемые "SMIP" ("Small Modular Immunopharmaceuticals", малые модульные иммунофармацевтические средства), например, описанные в WO 02/056910. Напоминающие антитела молекулы включают иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, представленные в настоящем описании. Другими примерами напоминающих антитела молекул являются антитела из суперсемейства иммуноглобулинов (IgSF) или молекулы с трансплантированными CDR. Понятие "Ang2-связывающая молекула" или "VEGF-связывающая молекула" соответственно относится как к одновалентным мишень связывающим молекулам (т.е. к молекулам, которые связываются с одним эпитопом соответствующей мишени), так и к двух- или многовалентным связывающим молекулам (т.е. связывающим молекулам, которые связываются более чем с одним эпитопом, например "бипаратопным" молекулам, как они описаны ниже). Ang2-(или VEGF)-связывающие молекулы, которые содержат более одного связывающегося с Ang2 (или VEGF) иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, обозначают так же как "форматированные" связывающие молекулы, они могут содержать в мишеньсвязывающем компоненте, помимо иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов,также линкеры и/или фрагменты с эффекторными функциями, например фрагменты, удлиняющие время полужизни, типа альбуминсвязывающих иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, и/или партера по слиянию типа сывороточного альбумина и/или присоединенного полимера типа ПЭГ. Понятие "бипаратопная Ang2-(или VEGF)-связывающая молекула" или "бипаратопный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен" в контексте настоящего описания означает связывающую молекулу, которая содержит первый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен и второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, как они определены в настоящем описании, при этом две молекулы связываются с двумя неперекрывающимися эпитопами соответствующего антигена. Бипаратопные связывающие молекулы состоят из иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, которые обладают различными специфичностями в отношении эпитопа. Паратопом называют часть антигенсвязывающей молекулы (такой как антитело или иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в изобретении), которая распознает эпитоп. Форматированная связывающая молекула может, хотя этот является менее предпочтительным, содержать также два идентичных иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена или содержать два различных иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена, которые распознают один и тот-9 025148 же или перекрывающиеся эпитопы или соответствующий антиген. В этом случае касательно VEGF два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена могут связываться с одним и тем же или перекрывающимся эпитопом в каждом из двух мономеров, которые образуют димер VEGF. Как правило, связывание связывающих молекул, предлагаемых в изобретении, характеризуется значением константы диссоциации (KD), составляющей от 10 Е-5 до 10 Е-14 моль/л (М) или менее, предпочтительно от 10 Е-7 до 10 Е-14 моль/л (М) или менее, более предпочтительно от 10 Е-8 до 10 Е-14 моль/л и еще более предпочтительно от 10 Е-11 до 10 Е-13 моль/л, по данным, полученным, например, с помощью Biacore- или Kinexa-анализа), и/или значением константы ассоциации (KA), составляющей по меньшей мере 10 Е 8 ME-1, более предпочтительно по меньшей мере 10 Е 9 МЕ-1, например по меньшей мере 10 Е 11 ME-1. Как правило, считается, что любое значение величины KD, превышающее 10 Е-4 М, свидетельствует о неспецифическом связывании. Предпочтительно связывание полипептида, предлагаемого в изобретении, с требуемым антигеном, т.е. VEGF или Ang2 соответственно, должно характеризоваться значением KD, составляющим менее 500 нМ, предпочтительно менее 200 нМ, более предпочтительно менее 10 нМ, например менее 500 пМ. Специфическое связывание антигенсвязывающего участка с антигеном или эпитопом можно определять с помощью любого приемлемого хорошо известного метода, такого, например, как анализы, представленные в настоящем описании, анализ Скэтчарда и/или анализы связывания в условиях конкуренции (анализы конкурентного связывания), такие как радиоиммуноанализы (РИА), ферментные иммуноанализы (ФИА) и "сэндвич"-анализы в условиях конкуренции и их различные варианты, хорошо известные в данной области. Аминокислотные остатки обозначают согласно стандартному трехбуквенному или однобуквенному коду аминокислот, что хорошо известно и является общепризнанным в данной области. При сравнении двух аминокислотных последовательностей понятие "различие в аминокислотах" относится к инсерциям,делециям или заменам указанного количества аминокислотных остатков в определенном положении референс-последовательности по сравнению со второй последовательностью. В случае замен(ы) указанные(ая) замены(а) предпочтительно должны(а) представлять собой консервативные(ую) аминокислотные(ную) замены(у), это означает, что аминокислотный остаток заменяют на другой аминокислотный остаток сходного химического строения, который оказывает незначительное влияние или практически не оказывает влияния на функцию, активность или другие биологические свойства полипептида. Указанные консервативные аминокислотные замены хорошо известны в данной области, например они описаны вWO 98/49185, при этом консервативные аминокислотные замены предпочтительно представляют собой замены, при которых одну из аминокислот из следующих групп (I)-(V) заменяют на другой аминокислотный остаток, входящий в эту же группу: (I) небольшие алифатические неполярные или имеющие невысокую полярность остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; (II) полярные отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и Gln; (III) полярные положительно заряженные остатки: His,Arg и Lys; (IV) крупные алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val и Cys и (V) ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp. Наиболее предпочтительными являются следующие аминокислотные замены:Tyr; Tyr на Trp или на Phe; Val на Ile или на Leu. Молекула полипептида или нуклеиновой кислоты рассматривается как "практически выделенная"(находится в "практически выделенной" форме), например, из ее нативного биологического источника и/или реакционный среды или среды для культивирования, из которой ее получают, когда она отделена по меньшей мере от одного компонента, с которым она обычно ассоциирована в указанном источнике или указанной среде, такой как другой белок/полипептид, другая нуклеиновая кислота, другой биологический компонент или макромолекула или по меньшей мере один загрязнитель, примесь или минорный компонент. В частности, молекула полипептида или нуклеиновой кислоты рассматривается как "практически выделенная", когда степень ее чистоты повышена по меньшей мере в 2 раза, в частности по меньшей мере в 10 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз и вплоть до 1000 раз или более. Молекула полипептида или нуклеиновой кислоты, которая находится в "практически выделенной форме", предпочтительно является практически гомогенной, что определяют с помощью приемлемого метода, такого как приемлемый хроматографический анализ, электрофорез в полиакриламидном геле."Идентичность последовательностей" последовательностей двух VEGF-связывающих молекул или последовательностей двух Ang2-связывающих молекул означает процент аминокислот, идентичных для последовательностей. Его можно рассчитывать или определять согласно методу, изложенному в разделеf) на с. 49 и с. 50 WO 2008/020079. "Сходство последовательностей" означает процент аминокислот, которые либо идентичны, либо представляют собой консервативные аминокислотные замены. В данной области известны альтернативные методы нумерации аминокислотных остатковVH-доменов, указанные методы аналогичным образом можно применять для нумерации VHH-доменов. Однако в настоящем описании, формуле изобретения и на чертежах, если не указано иное, используют номенклатуру Кэбота для нумерации VHH-доменов, которая описана выше.VEGF-связывающая молекула или Ang2-связывающая молекула "с созревшей аффинностью", в частности VHH или доменное антитело, несет одно или несколько изменений в одном или несколькихCDR, что приводит к улучшенной аффинности к VEGF или Ang2 по сравнению с соответствующей родительской VEGF-связывающей молекулой или VEGF-связывающей молекулой. VEGF-связывающие молекулы или Ang2-связывающие молекулы с созревшей аффинностью можно получать методами, описанными в данной области, например описанными Marks et al., Biotechnology, 10, 1992, p. 779-783 или"аминокислотные последовательности SEQ ID NO: x" включают, если не указано иное, аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична последовательности, представленной в соответствующей SEQ ID NO: x: а) аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80% идентичны последовательности, представленной в соответствующей SEQ ID NO: х; б) аминокислотные последовательности, которые имеют 3, 2 или 1 различие в аминокислотах относительно последовательности, представленной в соответствующей SEQ ID NO: x. Понятие "рак" и "злокачественный" относится или описывает физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом/пролиферацией клеток. Примерами рака, который можно лечить с помощью биспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, является (но не ограничиваясь только ими) карцинома, лимфома, бластома, саркома и лейкоз. Более конкретными примерами указанных видов рака, которые предложено лечить с помощью антагонистов VEGF согласно US 2008/0014196, являются плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарционома легкого, плоскоклеточная карцинома легкого,рак брюшины, печеночно-клеточный рак, рак кишечно-желудочной системы, рак поджелудочной железы, глиобластома, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатома, рак молочной железы, рак ободочной кишки, колоректальный рак, саркома эндометрия или матки, карцинома слюнных желез, рак почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карцинома печени, рак желудка, меланома и различные виды рака головы и шеи. Нарушение регуляции ангиогенеза может приводить ко многим нарушениям, которые можно лечить с помощью композиций и способов,предлагаемых в изобретении. Эти нарушения включают как ненеопластические, так и неопластические состояния. Неопластические заболевания включают (но не ограничиваясь только ими) описанные выше заболевания. Ненеопластические нарушения включают (но не ограничиваясь только ими) нарушения, которые вUS 2008/0014196 предложено лечить с помощью антагонистов VEGF, а именно, нежелательную или аберрантную гипертрофию, артрит, ревматоидный артрит (РА), псориаз, псориатические бляшки, саркоидоз, атеросклероз, атеросклеротические бляшки, диабетические и другие пролиферативные ретинопатии, включая ретинопатию недоношенных, ретролентальную фиброплазию, неоваскулярную глаукому,возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетический макулярный отек, неоваскуляризацию роговицы,неоваскуляризацию трансплантата роговицы, отторжение трансплантата роговицы, ретинальную/хориоидальную неоваскуляризацию, неоваскуляризацию угла глаза (покраснение), глазное связанное с неоваскуляризацией заболевание, васкулярный рестеноз, артериовенозные пороки развития (AVM),менингиому, гемангиому, ангиофиброму, гиперлазии щитовидной железы (включая болезнь Грейвса),трансплантацию роговицы и другой ткани, хроническое воспаление, воспаление легких, острое легочное повреждение/РДСВ (респираторный дистресс-синдром взрослых), сепсис, первичную легочную гипертензию, злокачественные пульмональные выпоты, отек головного мозга (например, ассоциированный с острым "ударом"/закрытым повреждением головы/травмой), синовиальное воспаление, формирование паннуса при RA, оссифицирующий миозит, гипертрофическое образование костной ткани, остеоартрит(болезнь Крона и неспецифический язвенный колит), отторжение почечного аллотрансплантата, воспалительное заболевание кишечника, нефротический синдром, нежелательный или аберрантный рост тканевой массы (неракового происхождения), суставы при гемофилических артропатиях, гипертрофические рубцы, прекращение роста волос, синдром Ослера-Вебера, гнойную грануломатозную ретролентальную фиброплазию, склеродерму, трахому, васкулярные адгезии, синовиит, дерматит, преэклампсию, асциты,перикардиальный выпот (например, ассоциированный с перикардитом) и плевральный выпот.- 11025148 Подробное описание изобретения Первым объектом настоящего изобретения является биспецифическая связывающая молекула, содержащая по меньшей мере один Ang2-связывающий компонент и по меньшей мере одинVEGF-связывающий компонент. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая связывающая молекула содержит по меньшей мере один VEGF-связывающий компонент и по меньшей мере один Ang2-связывающий компонент, который дополнительно содержит по меньшей мере еще один связывающий компонент, предпочтительно компонент, связывающий сывороточный альбумин (молекула,связывающая сывороточный альбумин). В предпочтительном варианте осуществления изобретения компонент, связывающий сывороточный альбумин, связывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, представляет собой выделенный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или полипептид, содержащий один или несколько указанных иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, где указанный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен состоит из четырех каркасных участков и трех гипервариабельных участков CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно и где указанный CDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQID NO: 257, 260, 263, 266, 269, 272 или 275. Более предпочтительно указанный(ые) один или несколько иммуноглобулиновый(ых) единичный(ых) вариабельный(их) домен(ов) компонента, связывающего сывороточный альбумин, содержит(ат): а) CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из первой группы аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 257, 260, 263, 266, 269, 272 или 275; б) CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из второй группы аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 255, 258, 261, 264, 267, 270 или 273; в) CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из второй группы аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 256, 259, 262, 265, 268, 271 или 274. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный(ые) один или несколько иммуноглобулиновый(ых) единичный(ых) вариабельный(их) домен(ов) компонента, связывающего сывороточный альбумин, представляют собой VHH, которые предпочтительно имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 98 или 254. Согласно предпочтительным вариантам осуществления изобретения указанный Ang2-связывающий компонент и указанный VEGF-связывающий компонент содержат по меньшей мере одинAng2-связывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен и по меньшей мере одинVEGF-связывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен соответственно. В предпочтительном объекте изобретения указанный Ang2-связывающий компонент и указанныйVEGF-связывающий компонент содержат по меньшей мере один Ang2-связывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен и по меньшей мере один VEGF-связывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен соответственно, при этом, каждый из иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов содержит четыре каркасных участка и три гипервариабельных участкаCDR1, CDR2 и CDR3 соответственно. Так, анти- Ang2 и/или анти-VEGF-компонент, входящий в биспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, может включать два (или большее количество) анти-Ang2 (или антиVEGF соответственно) иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, где мишенью иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов являются различные эпитопы в Ang2 (или VEGF). Таким образом, два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена в биспецифической связывающей молекуле должны иметь различную антигенную специфичность и, следовательно, различныеCDR-последовательности. Указанные двухвалентные связывающие молекулы называют также "бипаратопными конструкциями однодоменных антител (если иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены состоят или практически состоят из однодоменных антител) или "бипаратопными VHH-конструкциями" (если иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены состоят или практически состоят из VHH) соответственно, поскольку два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена должны включать два различных паратопа. В биспецифической связывающей молекуле, предлагаемой в изобретении, одна или обе связывающие молекулы могут быть двухвалентными; например VEGF-связывающий компонент может быть бипаратопным и Ang2-связывающий компонент может представлять собой один иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или VEGF-связывающий компонент может представлять собой один иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен и Ang2-связывающий компонент может быть бипаратопным. В биспецифических связывающих молекулах, предлагаемых в изобретении, предпочтительноVEGF-связывающий компонент содержит двухвалентный VEGF-связывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, например, бипаратопный VHH.- 12025148 Указанный VEGF-связывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен может содержать два или большее количество VEGF-связывающих VHH, которые представляют собой: а) идентичные VHH, которые обладают способностью блокировать взаимодействие человеческого рекомбинантного VEGF с человеческим рекомбинантным VEGFR-2 с уровнем ингибирования 60%, или б) различные VHH, которые связываются с неперекрывающимися эпитопами VEGF, где по меньшей мере один VHH обладает способностью блокировать взаимодействие человеческого рекомбинантного VEGF с человеческим рекомбинантным VEGFR-2 с уровнем ингибирования 60% и где по меньшей мере один VHH может блокировать указанное взаимодействие с уровнем ингибирования 60%.VEGF-связывающий компонент содержит по меньшей мере вариабельный домен с четырьмя каркасными участками и тремя гипервариабельными участками CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где указанный CDR3 имеет аминокислотную последовательность Ser Arg Ala Tyr Хаа Ser Xaa Arg Leu Arg при этом указанная VEGF-связывающая молекула обладает способностью блокировать взаимодействие человеческого рекомбинантного VEGF165 с человеческим рекомбинантным VEGFR-2 с уровнем ингибирования 60%. Согласно предпочтительным вариантам осуществления изобретения Хаа в положении 5 обозначает Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения VEGF-связывающая молекула содержит один или несколько иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, каждый из которых содержит: а) CDR3, аминокислотная последовательность которого выбрана из первой группы последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 2-8; б) CDR1 и CDR2, аминокислотные последовательности которых входят, как показано в табл. 3, в число последовательностей, выбранных из второй группы аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 9-46, при этом указанная вторая последовательность содержит соответствующий CDR3, выбранный из указанных в подпункте а). Согласно предпочтительным вариантам осуществления изобретения иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены представляют собой VHH. Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения VHH имеют аминокислотные последовательности, выбранные из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 9-46. Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения VHH имеют аминокислотные последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 25. Изобретение относится также к VEGF-связывающему компоненту, полученному в результате созревания аффинности и/или оптимизации последовательности вышеуказанного VHH, например, к VHH,полученному в результате оптимизации последовательности VHH, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 18. Примерами являются VHH, которые имеют аминокислотные последовательности, выбранные из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 47-57. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения VEGF-связывающий компонент, предлагаемый в изобретении, можно форматировать согласно методу, указанному в настоящем описании,например, он может быть бипаратопным или может содержать два идентичных иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена. Указанные VEGF-связывающие компоненты могут содержать два или большее количество VHH, которые представляют собой: а) идентичные VHH, которые обладают способностью блокировать взаимодействие человеческого рекомбинантного VEGF с человеческим рекомбинантным VEGFR-2 с уровнем ингибирования 60%, или- 13025148 б) различные VHH, которые связываются с неперекрывающимися эпитопами VEGF, где по меньшей мере один VHH обладает способностью блокировать взаимодействие человеческого рекомбинантного VEGF с человеческим рекомбинантным VEGFR-2 с уровнем ингибирования 60%, и где связывание по меньшей мере одного VHH может блокировать указанное взаимодействие с уровнем ингибирования 60%. Процент блокирования указанного взаимодействия с уровнем ингибирования 60 или 60% соответственно относится к уровню ингибирования, определенному с помощью гомогенного анализа усиленной за счет эффекта близости люминесценции (AlphaScreen), конкурентного ELISA, анализа на основе резонанса плазмона (SPR) (Biacore), которые применяли в примерах. Ниже в настоящем описании активность VHH согласно подпункту а), обозначают также как "блокирующая рецептор" активность, а активность VHH согласно подпункту б) обозначают также как "неблокирующая рецептор" активность. Предпочтительно для блокирующих рецептор VHH характерен уровень ингибирования 80%, более предпочтительно 90%; наиболее предпочтительные VHH являются полными блокаторами рецептора, т.е. для них характерен уровень ингибирования, равный 100%.VEGF-связывающий компонент может содержать два или большее количество идентичных VHH,указанных в подпункте а), выбранных из VHH, аминокислотные последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 9-46, или VHH, полученных в результате созревания аффинности и/или оптимизации последовательностей указанных VHH. VHH можно выбирать из VHH, аминокислотные последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 47-57. Согласно предпочтительным вариантам осуществления изобретения форматированныйVEGF-связывающий компонент содержит два VHH, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 57. В форматированных VEGF-связывающих компонентах, которые содержат два различных VHH: а) указанный(ые) один или несколько VHH, для которых характерен уровень ингибирования 60%,выбирают из:I) VHH, которые имеют аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 9-46, илиII) VHH, которые получены в результате созревания аффинности и/или оптимизации последовательности указанных VHH, и где б) указанный(ые) один или несколько VHH, для которых характерен уровень ингибирования 60%,выбирают из:II) VHH, которые получены в результате созревания аффинности и/или оптимизации последовательностей указанных VHH. Согласно предпочтительным вариантам осуществления изобретения два VHH, которые входят в полипептиды, аминокислотные последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 128-168, разделены линкерными последовательностями, указанными в табл. 15. В предпочтительном VEGF-связывающем компоненте VHH, указанный в подпункте а)I), имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, и VHH, указанный в подпункте б)I), имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64. В других предпочтительных VEGF-связывающих компонентах VHH, указанные в подпункте а)II),выбирают из VHH, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную вSEQ ID NO: 47-57, и VHH, указанные в подпункте б)II), выбирают из VHH, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 125-127. Наиболее предпочтительным является бипаратопный VEGF-связывающий компонент, который содержит два VHH, один из которых имеет аминокислотную последовательность, представленную вSEQ ID NO: 57, и один из которых имеет аминокислотную последовательность, представленную вAng2-связывающий компонент содержит, по меньшей мере, вариабельный домен с четырьмя каркасными участками и тремя гипервариабельными участками CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где указанный CDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250 или 253. Согласно второму объекту изобретения указанный Ang2-связывающий компонент представляет собой выделенный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или полипептид, содержащий один или несколько иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, где указанный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит четыре каркасных участка и три гипервариабельных участка CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно и где CDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, которые представлены в- 14025148 Согласно следующему объекту изобретения указанный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен Ang2-связывающего компонента содержит: а) CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из первой группы аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250 или 253 (см. также табл. 49); б) CDR1, имеющий аминокислотные последовательности, которые входят, как показано в табл. 36-А, 38-А, 41-А или 45-А, в качестве частичной последовательности в последовательность, выбранную из второй группы аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 224,227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248 или 251 (см. также табл. 49); в) CDR2, имеющий аминокислотные последовательности, которые входят, как показано в табл. 36-А, 38-А, 41-А или 45-А, в качестве частичной последовательности в последовательность, выбранную из второй группы аминокислотных последовательностей, которые представлены вSEQ ID NO: 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249 или 252 (см. также табл. 49). Предпочтительно иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен Ang2-связывающего компонента представляет собой VHH, предпочтительно имеющий аминокислотную последовательность,выбранную из аминокислотных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 214, 215, 216,217, 218, 219, 220, 221, 222 или 223. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен Ang2-связывающего компонента получали путем созревания аффинности или гуманизации иммуноглобулинового единичного вариабельного домена согласно методу, представленному в настоящем описании. Аналогично этому, настоящее изобретение относится также к VHH, полученному путем созревания аффинности или гуманизации VHH Ang2-связывающего компонента согласно методу, представленному в настоящем описании. Настоящее изобретение относится также к Ang2-связывающему VHH, аминокислотная последовательность которого выбрана из аминокислотных последовательностей, представленных вSEQ ID NO: 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222 или 223. Приемлемыми для осуществления процедуры созревания аффинности родительскимиAng2-связывающими молекулами являются, например, описанные выше VHH, аминокислотные последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 214, 215, 216, 217, 218 или 219. Таким образом, изобретение относится также к Ang2-связывающим молекулам, полученным путем созревания аффинности и/или оптимизации последовательности вышеуказанного VHH, например кVHH, который был получен путем оптимизации последовательности VHH, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 217, 218, 219, 220, 221, 222 или 223. Аминокислотные последовательности, которые представляли собой "источник", применяемый для создания последнихVHH, представлены в SEQ ID NO: 214, 215 или 261. Кроме того, эти аминокислотные последовательности пригодны в качестве Ang2-связывающих компонентов, которые можно применять в связывающих молекулах, предлагаемых в настоящем изобретении. Как указано в настоящем описании, связывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, предпочтительно содержит по меньшей мере один компонент, связывающий сывороточный альбумин. Так, в частности, предпочтительные связывающие молекулы имеют по меньшей мере одинVEGF-связывающий компонент, по меньшей мере один Ang2-связывающий компонент и по меньшей мере один компонент, связывающий сывороточный альбумин. Порядок указанных трех связывающих компонентов может представлять собой любой возможный порядок, например порядок, представленный в табл. 36-Б, 38-Б, 40, 41-Б, 42, 43, 45-Б, 46-А или 47-А или на фиг. 20, 23, 27 или 30, например VEGF-,Ang2- или связывающий сывороточный альбумин компонент может находиться на N-конце или на С-конце. В частности, "1D01" (SEQ ID NO: 214), "11 В 07", "00027" (SEQ ID NO: 216), "00908", "7G08"VEGF-связывающий компонент и "ALB11" обозначает компонент, связывающий сывороточный альбумин. Ни один из них не ограничен конкретной последовательностью, а обозначает Ang2-, VEGF- и связывающий сывороточный альбумин компонент в целом, при применении в контексте возможных конструкций связывающих молекул, предлагаемых в настоящем изобретении. Однако предпочтительно, чтобы компонент, связывающий сывороточный альбумин, находился между VEGF- и Ang2-связывающим компонентом (или наоборот), при этом наиболее предпочтительно,чтобы по меньшей мере один VEGF-связывающий компонент находился на N-конце, за ним следовал по меньшей мере один компонент, связывающий сывороточный альбумин, а затем по меньшей мере одинAng2-связывающий компонент, расположенный на С-конце. Установлено, что такой порядок является наиболее предпочтительным. Таким образом, предпочтительным объектом настоящего изобретения являются связывающие молекулы, которые содержат по меньшей мере один VEGF-связывающий компонент, по меньшей мере- 15025148 один Ang2-связывающий компонент и по меньшей мере один компонент, связывающий сывороточный альбумин, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 180-213,Понятие "по меньшей мере один" связывающий (VEGF, Ang2 или сывороточный альбумин) компонент при применении в контексте настоящего описания указывает на то, что связывающая молекула,предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать один, два, три, четыре или пять связывающихVEGF, Ang2 и/или сывороточный альбумин компонентов (т.е. субстанций/единиц), которые предпочтительно представляют собой иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, указанный в настоящем описании.VEGF- и/или Ang2-связывающие компоненты с улучшенными с позиций терапевтического применения свойствами, например, обладающие повышенной аффинностью или пониженной иммуногенностью, можно получать из индивидуальных VEGF-или Ang2-связывающих компонентов с помощью методик, известных в данной области, таких как созревание аффинности (например используя в качестве исходных синтетические, произвольные или встречающиеся в естественных условиях последовательности иммуноглобулинов), CDR-трансплантация, гуманизация, объединение фрагментов, полученных из различных последовательностей иммуноглобулинов, ПЦР-сборка с использованием перекрывающихся праймеров и аналогичные методики, предназначенные для конструирования последовательностей иммуноглобулинов, которые хорошо известны специалисту в данной области; или любой приемлемой комбинации любых вышеизложенных методов, обозначенных также как "оптимизация последовательностей". В качестве ссылки можно указать, например, стандартные руководства, а также можно использовать приведенное ниже описание и сведения, представленные в примерах. При необходимости VEGF- или Ang2-связывающий компонент, предлагаемый в изобретении, с повышенной аффинностью получают путем созревания другого VEGF- или Ang2-связывающего компонента, последний представляет собой "родительский" VEGF- или Ang2-связывающий компонент относительно молекулы с созревшей аффинностью. В анти-VEGF или анти-Ang2 VHH, предлагаемых в изобретении, начинающихся с EVQ,N-концевой остаток Е можно заменять на D (что часто приводит к оптимизации последовательности) или он может отсутствовать (для экспрессии VHH в E.coli). Для форматированных VEGF-связывающих молекул это применяют, как правило, только для VHH, расположенных на N-конце. Предпочтительная (но не ограничиваясь только ею) применяемая с целью гуманизации замена вVHH-доменах, принадлежащих к 103 P,R,S-группе и/или GLEW-группе (что описано ниже), представляет собой замену 108Q на 108L. Методы гуманизации иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов известны в данной области. Согласно другому варианту осуществления изобретения иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой доменное антитело, представленное в настоящем описании. Согласно еще одному варианту осуществления изобретения репрезентативные представители класса VEGF- и/или Ang2-связывающих иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, предлагаемых в изобретении, имеют аминокислотные последовательности, которые соответствуют аминокислотной последовательности встречающегося в естественных условиях VH-домена, который был "камелизирован", т.е. изменен путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, встречающейся в естественных условиях вариабельной области тяжелой цепи канонического, состоящего из 4 цепей антитела на один или несколько аминокислотных остатков, которые находятся в соответствующем(их) положении(ях) в VHH-домене состоящего из тяжелой цепи антитела. Это можно осуществлять хорошо известным методом, который очевиден специалисту в данной области,и дополнительную информацию о котором можно почерпнуть из WO 1994/04678. Указанная "камелизация" может затрагивать главным образом аминокислотные положения, которые находятся в области контакта VH-VL, и так называемые остатки-маркеры верблюдовых (см., например, также WO 1994/04678). Подробное описание указанных методов "гуманизации" и "камелизации" и предпочтительные последовательности каркасных участков, которые пригодны для осуществления этих методов, можно дополнительно почерпнуть из сведений, представленных на с. 46 и с. 98 WO 2006/040153 и с. 107VEGF-связывающие компоненты, предлагаемые в изобретении, например, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, обладают специфичностью в отношении VEGF, поскольку они содержат один или несколько иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, специфически связывающихся с одним или несколькими эпитопами молекулы VEGF. Вышесказанное относится и к Ang2 связывающим компонентам, предлагаемым в изобретении. Специфическое связывание VEGF-связывающего компонента с антигеном VEGF можно определять с помощью любого приемлемого хорошо известного метода, включая, например, представленные в настоящем описании методы, такие как анализ Скэтчарда и/или анализы связывания в условиях конкуренции, такие как радиоиммуноанализы (РИА), ферментные иммуноанализы (ФИА и ELISA) и конкурентные "сэндвич"-анализы и их различные варианты, хорошо известные в данной области. Это же относится к определению связывания Ang2-связывающего компонента с его антигеном.- 16025148 Касательно антигена VEGF VEGF-связывающий компонент, предлагаемый в изобретении, например, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, не ограничен происхождением из какоголибо конкретного вида. Так, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, предпочтительно связываются с человеческим VEGF, если они предназначены для лечения человека. Однако иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые связываются с VEGF из других видов млекопитающих, также подпадают под объем изобретения. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в изобретении, который связывается с VEGF из одного из видов, может обладать перекрестной реактивностью с VEGF, который имеет последовательность, отличную от человеческой, из одного или нескольких других видов. Например, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, которые связываются с человеческим VEGF,могут обладать перекрестной реактивностью с VEGF из одного или нескольких других видов приматов и/или VEGF из одного или нескольких видов животных, которых применяют в качестве животных, на которых моделируют заболевание, например, обезьян, мышей, крыс, кроликов, свиней, собак, и, в частности из животных, на которых моделируют заболевания и нарушения, ассоциированные с опосредуемыми VEGF действиями на ангиогенез (например, в качестве видов и животных моделей, упомянутых в настоящем описании). Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, которые обладают указанной перекрестной реактивностью, являются важными для исследовательских целей и/или для разработки лекарственных средств, поскольку позволяют тестировать иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, на признанных моделях заболеваний, созданных на таких животных как обезьяны, в частности обезьяны циномолгус или макак резус, или мыши и крысы. В свете перекрестной реактивности с одной или несколькими молекулами VEGF из видов, отличных от человека, которая(ые) предназначена(ны) для применения на животной модели при разработке терапевтического антагониста VEGF, является предпочтительным, когда VEGF-связывающий компонент распознает эпитоп в той области представляющего интерес VEGF, которая обладает высокой степенью идентичности с человеческим VEGF. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в изобретении, распознает эпитоп, который полностью или частично локализован в области VEGF, которая пригодна для связывания с его рецептором, в частности с VEGFR-2, который, как установлено, является рецептором, активация которого обусловливает неоваскуляризацию опухолей. Согласно предпочтительным объектам изобретения иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, блокируют активацию VEGF-рецептора, в частности активацию VEGFR-2, по меньшей мере частично, предпочтительно в значительной степени и наиболее предпочтительно полностью. Как указано выше, способность VEGF-связывающего компонента блокировать взаимодействие между VEGF и его рецепторами, в частности, VEGFR-2, можно определять с помощью гомогенного анализа усиленной за счет эффекта близости люминесценции (AlphaScreen), конкурентного ELISA или анализа на основе резонанса плазмона (SPR) (Biacore), которые описаны в примерах. Предпочтительно связывание иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, предлагаемого в изобретении, с VEGF характеризуется величиной аффинности, составляющей менее 500 нМ,предпочтительно менее 200 нМ, более предпочтительно менее 10 нМ, например менее 500 пМ (что определяют с помощью анализа на основе резонанса поверхностного плазмона, описанного в примере 5.7). Вышесказанное относится и к связыванию иммуноглобулинового единичного вариабельного домена,предлагаемого в изобретении, с ангиопоэтином. Предпочтительно для иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, предлагаемых в изобретении, характерны величины IC50, измеренные с помощью конкурентного ELISA, который описан в примере 5.1, составляющие от 10-6 до 10-10 моль/л или менее, более предпочтительно от 10-8 до 10-10 моль/л или менее и еще более предпочтительно от 10-9 до 10-10 моль/л или менее. Согласно не ограничивающему объем изобретения предпочтительному варианту осуществления изобретения связывание с VEGF VEGF-связывающих иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, предлагаемых в изобретении, характеризуется величиной константы диссоциации (KD), составляющей от 10-5 до 10-12 моль/л (М) или менее и предпочтительно от 10-7 до 10-12 моль/л (М) или менее и более предпочтительно от 10-8 до 10-12 моль/л (М), и/или величиной константы ассоциации (KA), составляющей по меньшей мере 107 М-1, предпочтительно по меньшей мере 108 М-1, более предпочтительно по меньшей мере 109 М-1, например по меньшей мере 1012 М-1; и в частности, величиной KD, составляющей менее 500 нМ, предпочтительно менее 200 нМ, более предпочтительно менее 10 нМ, например менее 500 пМ. Таким образом, можно определять величины KD и KA иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, предлагаемого в изобретении, характеризующие связывание с VEGF. Указанное относится и к связывающему Ang2 иммуноглобулиновому единичному вариабельному домену, предлагаемому в изобретении. Бипаратопные VEGF-связывающие компоненты, которые содержат два или большее количество иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена, практически состоят из или содержат (I) первый- 17025148 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, специфически связывающийся с первым эпитопом VEGF, и (II) второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, специфически связывающийся со вторым эпитопом VEGF, где первый эпитоп VEGF и второй эпитоп VEGF не являются идентичными эпитопами. Другими словами, указанный полипептид, предлагаемый в изобретении, содержит или практически состоит из двух или большего количества иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, мишенью которых являются по меньшей два неперекрывающихся эпитопа, присутствующих в VEGF, при этом указанные иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены связаны друг с другом таким образом, чтобы они могли одновременно связываться с VEGF. В этом плане полипептид, предлагаемый в изобретении, можно рассматривать как "двухвалентную" или "многовалентную" иммуноглобулиновую конструкцию и прежде всего как "многовалентную конструкцию иммуноглобулинового единичного вариабельного домена", если полипептид содержит по меньшей мере два сайта связывания с VEGF. (Указанные конструкции обозначают также как "форматированные" VEGFсвязывающие молекулы, например "форматированные" VHH). С соответствующими изменениями указанное относится также к бипаратопным Ang2-связывающим компонентам. Указанный VEGF- или Ang2-связывающий компонент, предлагаемый в изобретении, включает (по меньшей мере) два анти-VEGF или анти-Ang2 иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена,при этом мишенью (указанных) двух иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов предпочтительно являются неперекрывающиеся эпитопы молекулы VEGF или молекулы ангиопоэтина соответственно. Таким образом, эти два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена должны обладать специфичностью в отношении различных антигенов и поэтому содержать различныеCDR-последовательности. По этой причине указанные полипептиды, предлагаемые в изобретении, в контексте настоящего описания можно обозначать также как "бипаратопные полипептиды" или "бипаратопные конструкции доменных антител" (если иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены состоят или практически состоят из доменных антител), или "бипаратопные VHH-конструкции" (если иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены состоят или практически состоят из VHH) соответственно, поскольку два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена должны включать два различных паратопа. Если полипептид, предлагаемый в изобретении, представляет собой бипаратопную молекулу, указанную в настоящем описании, то по меньшей мере один из компонентов иммуноглобулинового единичного вариабельного домена связывается с эпитопом таким образом, что взаимодействие между рекомбинантным человеческим VEGF и рекомбинантным человеческим VEGFR-2 блокируется, что характеризуется уровнем ингибирования 80%. Как продемонстрировано в экспериментах, описанных в изобретении, определенные форматированные молекулы содержат два VHH, которые оба блокируют рецепторVEGFR2, что характеризуется уровнем ингибирования 80%. Определенные VHH, предлагаемые в изобретении, блокируют VEGFR-2 с уровнем ингибирования 100%, т.е. они являются полными блокаторами. В обоих случаях дополнительные последовательности и фрагменты могут присутствовать в VEGFсвязывающих молекулах, предлагаемых в изобретении, например, на N-конце, С-конце или они могут быть локализованы между двумя иммуноглобулиновыми единичными вариабельными доменами, например линкерные последовательности и последовательности, обеспечивающие эффекторные функции, которые более детально описаны ниже. Согласно другому, хотя и менее предпочтительному варианту осуществления изобретения,VEGF-связывающий компонент, предлагаемый в изобретении, может включать более двух анти-VEGF иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, т.е. три, четыре или даже еще большее количество анти-VEGF VHH. В этом случае по меньшей мере два из анти-VEGF иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов направлены против неперекрывающихся эпитопов внутри молекулы VEGF, а любой дополнительный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен может связываться с любым из двух неперекрывающихся эпитопов и/или дополнительным эпитопом, который присутствует в молекуле VEGF. Согласно изобретению два или большее количество иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов могут независимо друг от друга представлять собой VHH или доменные антитела и/или любой другой вид иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, таких как VL-домены, указанные в настоящем описании, при условии, что эти иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены должны связываться с антигеном, т.е. VEGF или ангиопоэтином соответственно. Подробное описание связывающих компонентов представлено в основном дляVEGF-связывающего компонента. Однако все особенности и характеристики, представленные в настоящем описании для VEGF-связывающего компонента, относятся также (после внесения соответствующих изменений) и к Ang2-связывающему компоненту. Согласно предпочтительным вариантам осуществления изобретения связывающие молекулы, присутствующие в биспецифических связывающих молекулах (Ang2-связывающие молекулы в Ang2 связывающем компоненте или VEGF-связывающие молекулы в VEGF-связывающем компоненте или два- 18025148 смежных Ang2- и VEGF-связывающих компонента), можно соединять друг с другом непосредственно(т.е. без применения линкера) или через линкер. Линкер предпочтительно представляет собой пептидный линкер и его выбирают так, чтобы он давал связываться двум различным связывающим молекулам с каждым из неперекрывающихся эпитопов на мишенях, которые присутствуют либо в одной и той же молекуле-мишени, либо в двух различных молекулах. В случае бипаратопных связывающих молекул выбор линкеров для Ang2-или VEGF-связывающего компонента зависит среди прочего от эпитопов и, в частности, расстояния между эпитопами на мишени,с которыми связываются иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, и очевиден для специалиста в данной области на основе настоящего описания, необязательно после проведения ограниченного количества некоторых рутинных экспериментов. Две связывающие молекулы (два VHH или доменных антитела или VHH и доменное антитело) или два связывающих компонента можно соединять друг с другом через дополнительный VHH или доменное антитело соответственно (в таких связывающих молекулах два или большее количество иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов можно соединять непосредственно с дополнительным иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменом или посредством приемлемых линкеров). Указанные дополнительные VHH или доменные антитела могут, например, представлять собой VHH или доменное антитело, которые обеспечивают увеличенное время полужизни. Например, последний VHH или последнее доменное антитело может представлять собой конструкцию, которая обладает способностью связываться с (человеческим) сывороточным белком, таким как (человеческий) сывороточный альбумин или (человеческий) трансферрин. Альтернативно этому, два или большее количество иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, которые связываются с соответствующей мишенью, можно соединять в серии (либо непосредственно, либо с помощью приемлемого линкера) и дополнительный VHH или дополнительное доменное антитело (которые могут обеспечивать увеличенное время полужизни) можно соединять непосредственно или с помощью линкера с одной из этих двух или большего количества вышеуказанных иммуноглобулиновых последовательностей. Приемлемые линкеры представлены в настоящем описании в сочетании со специфическими полипептидами, предлагаемыми в изобретении, и они могут, например, содержать (но не ограничиваясь только ею) аминокислотную последовательность, при этом аминокислотная последовательность предпочтительно состоит из 9 или большего количества аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере из 17 аминокислот, например, примерно из 20-40 аминокислот. Однако, хотя верхний предел не имеет решающего значения, но его выбирают, исходя из соображений пригодности, например для биофармацевтического производства таких полипептидов. Линкерная последовательность может представлять собой встречающуюся в естественных условиях последовательность или не встречающуюся в естественных условиях последовательность. Для применения в терапевтических целях линкер предпочтительно является неиммуногенным для индивидуума,которому вводят биспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении. Одной из пригодных групп линкерных последовательностей являются линкеры, выведенные из шарнирной области тяжелой цепи антител, описанные в WO 1996/34103 и WO 1994/04678. Другими примерами являются полиаланиновые линкерные последовательности, такие какAla-Ala-Ala. Другими предпочтительными примерами линкерных последовательностей являютсяGly/Se-линкеры различной длины, такие как (glyxsery)z-линкеры, включая (gly4ser)3, (gly4ser)4, (gly4ser),(gly3ser), gly3 и (gly3ser2)3. Некоторые не ограничивающие объем изобретения примеры линкеров представлены в табл. 15 Если биспецифическую связывающую молекулу модифицируют посредством присоединения полимера, например, полиэтиленгликольного (ПЭГ) (полиэтиленгликоль) фрагмента, то линкерная последовательность предпочтительно включает аминокислотный остаток, такой как цистеин или лизин, позволяющий осуществлять модификацию, например, пэгилирование в линкерной области. Кроме того, линкер может представлять собой также поли(этиленгликольный) фрагмент, что описано, например, в WO 2004/081026. В другом варианте осуществления изобретения иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены соединены друг с другом через другой фрагмент (необязательно посредством одного или двух линкеров), такой как другой полипептид, который в предпочтительном, но не ограничивающем объем изобретения, варианте осуществления изобретения может представлять собой дополнительный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, описанный выше. Указанный фрагмент может либо являться практически неактивным, либо может обладать биологической активностью, такой как улучшение требуемых свойств полипептида, либо может придавать полипептиду одно или несколько дополнительных требуемых свойств. Например, фрагмент может (но не ограничиваясь только этим) удлинять время полужизни белка или полипептида и/или снижать их иммуногенность или улучшать любое другое требуемое свойство. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения биспецифическая связывающая молекула, предлагаемая в изобретении, включает, прежде всего, если она предназначена для применения или ее применяют в качестве терапевтического агента, фрагмент, который удлиняет время полужизни полипептида, предлагаемого в изобретении, в сыворотке или другой общей воде организма пациента. Понятие "время полужизни" определяют как время, необходимое для снижения концентрации (модифицированного) полипептида на 50% in vivo, например в результате расщепления полипептида и/или клиренса, и/или секвестрования с помощью естественных механизмов. Более конкретно, указанный удлиняющий время полужизни фрагмент можно ковалентно связывать или сливать с иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменом, и он может представлять собой(но не ограничиваясь только ими) Fc-область, остаток альбумина, фрагмент остатка альбумина, альбуминсвязывающий остаток, такой как иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен антитела к альбумину, трансферринсвязывающий остаток, такой как иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен антитела к трансферрину, полиоксиалкиленовую молекулу, такую как молекула полиэтиленгликоля, альбуминсвязывающий пептид или производное гидроксиэтилкрахмала (HES). В другом варианте осуществления изобретения биспецифическая связывающая молекула, предлагаемая в изобретении, содержит фрагмент, который связывается с антигеном, присутствующим в крови,таким как сывороточной альбумин, сывороточные иммуноглобулины, тироксинсвязывающий белок,фибриноген или трансферрин, что удлиняет время полужизни in vivo образовавшегося полипептида,предлагаемого в изобретении. Согласно конкретному предпочтительному варианту осуществления изобретения указанный фрагмент представляет собой альбуминсвязывающий иммуноглобулин и наиболее предпочтительно альбуминсвязывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, такой как альбуминсвязывающий VHH-домен. Указанный альбуминсвязывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, если он предназначен для применения на людях, предпочтительно связывается с человеческим сывороточным альбумином и предпочтительно представляет собой гуманизированный альбуминсвязывающийVHH-домен. Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые связываются с человеческим сывороточным альбумином, известны в данной области и описаны более подробно, например, вWO 2006/122786. В частности, пригодный для связывания с VHH альбумин представляет собой ALB 1 и его гуманизированную копию ALB 8 (WO 2009/095489). Однако можно также с успехом применять другие альбуминсвязывающие VHH-домены, упомянутые в вышеуказанной патентной публикации. Наиболее приемлемым альбуминсвязывающим VHH-доменом является ALB8, который состоит из или содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 98 или 254. Согласно другому варианту осуществления изобретения два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена, предпочтительно VHH, можно сливать с молекулой сывороточного альбумина, как это описано, например, в WO 2001/79271 и WO 2003/59934. Например, согласно подходу, изложенному вWO 2001/79271, слитый белок можно получать с помощью общепринятой методики рекомбинации: молекулу ДНК, кодирующую сывороточный альбумин, или ее фрагмент связывают с ДНК, кодирующей бипецифическую связывающую молекулу, полученную конструкцию встраивают в плазмиду, которую- 20025148 можно применять для экспрессии в выбранной клетке-хозяине, например в клетке дрожжей типа Pichiapastoris, или в бактериальной клетке, и затем клетку-хозяина трансфектировать слитой нуклеотидной последовательностью и выращивать в приемлемых условиях. Последовательность человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), которую можно применять, представлена в SEQ ID NO: 99. Согласно другому варианту осуществления изобретения приводящая к удлинению времени полужизни модификация полипептида, предлагаемого в изобретении (указанная модификация снижает также иммуногенность полипептида), заключается в присоединении пригодного фармакологически приемлемого полимера, такого как поли(этиленгликоль) (ПЭГ) с прямой или разветвленной цепью или его производные (например, метоксиполи(этиленгликоль) или мПЭГ). Как правило, можно использовать любую приемлемую форму пэгилирования, такую как пэгилирование, известное в данной области для антител и фрагментов антител (включая (но не ограничиваясь только ими) "доменные" антитела иscFv-фрагменты); в качестве ссылки можно указать, например, Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 2002, p. 531-545; Veronese и Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 2003, p. 453-456; Harris и Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2, 2003 и WO 2004/060965. Кроме того, в продажу поступают различные реагенты для пэгилирования полипептидов, например,от фирм Nektar Therapeutics, США или NOF Corporation, Япония, такие как серии Sunbright EA, серииSunbright ME-400MA. Предпочтительно применяют сайт-направленное пэгилирование, в частности, через остаток цистеина (см., например, Yang et al., Protein Engineering, 16, 2003, p. 761-770). Например, для этой цели ПЭГ можно присоединять к остатку цистеина, который в естественных условиях присутствует в полипептиде,предлагаемом в изобретении, полипептид, предлагаемый в изобретении, можно модифицировать так,чтобы в него можно было вводить один или несколько остатков цистеина для присоединения ПЭГ или аминокислотную последовательность, содержащую один или несколько остатков цистеина, предназначенных для присоединения ПЭГ, можно сливать с N- и/или С-концом полипептида, предлагаемого в изобретении, для всех указанных подходов можно применять методики конструирования белков, хорошо известные специалисту в данной области. Предпочтительно для полипептидов, предлагаемых в изобретении, применяют ПЭГ с молекулярной массой, превышающей 5 кДа, например превышающей 10 кДа, но более низкой чем 200 кДа, например более низкой чем 100 кДа; например составляющей от 20 до 80 кДа. Касательно пэгилирования следует указать, что, как правило, изобретение относится также к любой биспецифической связывающей молекуле, которая пэгилирована в одном или нескольких аминокислотных положениях, предпочтительно таким образом, что пэгилирование либо (1) удлиняет время полужизни in vivo; либо (2) снижает иммуногенность; либо (3) обеспечивает одно или несколько дополнительных ценных свойств, хорошо известных для пэгилирования; либо (4) не оказывает существенного воздействия на аффинность полипептида с его мишенью (например, не снижает указанную аффинность более чем на 50% и более предпочтительно более чем на 10% при определении с помощью приемлемого анализа,описанного в данной области); либо (5) не оказывает влияния на любое другое из требуемых свойств биспецифических связывающих молекул, предлагаемых в изобретении. Приемлемые ПЭГ-группы и методы их присоединения, либо специфические, либо неспецифические, хорошо известны специалисту в данной области. Кроме того, в продажу поступают различные реагенты для пэгилирования полипептидов, например, от фирм Nektar Therapeutics, США или NOF Corporation, Япония, такие как серииSunbright EA, серии SH, серии МА, серии СА и серии ME, такие как Sunbright ME-100MA,Sunbright ME-200MA и Sunbright ME-400MA. Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения пэгилированный полипептид, предлагаемый в изобретении, включает один ПЭГ-фрагмент линейного ПЭГ с молекулярной массой 40 или 60 кДа, при этом ПЭГ-фрагмент присоединен к полипептиду в линкерной области и, в частности, к остатку Cys в положении 5 линкерного пептида GS9, представленного в SEQ ID NO: 93, в положении 14 линкерного пептида GS27, представленного в SEQ ID NO: 95, или в положении 15 линкерного пептида GS35, представленного в SEQ ID NO: 96, или в положении 5 линкерного пептида 35GS,представленного в SEQ ID NO: 97. Биспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, можно пэгилировать с помощью одного из указанных выше реагентов для пэгилирования, такого как "Sunbright ME-400MA",химическая формула которого представлена ниже: Биспецифические связывающие молекулы, которые содержат линкер и/или обеспечивающие удлинение времени полужизни функциональные группы, имеют последовательности, представленные вSEQ ID NO: 81 и на фиг. 48. Согласно другому варианту осуществления изобретения иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены представляют собой доменные антитела, как они определены в контексте настоящего описания. Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые присутствуют в биспецифических связывающих молекулах, предлагаемых в изобретении, могут иметь также последовательности,которые соответствуют встречающемуся в естественных условиях VH-домену, который был "камелизирован", т.е. изменен путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, встречающейся в естественных условиях вариабельной области тяжелой цепи канонического, состоящего из 4 цепей антитела на один или несколько аминокислотных остатков, которые находятся в соответствующем(их) положении(ях) в VHH-домене состоящего из тяжелой цепи антитела. Это можно осуществлять хорошо известным методом, который очевиден специалисту в данной области и дополнительную информацию о котором можно почерпнуть из WO 94/04678. Указанная "камелизация" может затрагивать главным образом аминокислотные положения, которые находятся в области контактаVH-VL, и так называемые остатки-маркеры верблюдовых (см., например, также WO 1994/04678). Подробное описание указанных методов "гуманизации" и "камелизации" и предпочтительные последовательности каркасных участков, которые пригодны для осуществления этих методов, можно дополнительно почерпнуть из сведений, представленных на с. 46 и с. 98 WO 2006/040153 и с. 107WO 2006/122786. Связывающие компоненты обладают специфичностью в отношении Ang2 или VEGF соответственно, поскольку они содержат один или несколько иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, специфически связывающихся с одним или несколькими эпитопами молекулы Ang2 или молекулыVEGF соответственно. Специфическое связывание связывающей молекулы с антигеном Ang2 или VEGF можно определять с помощью любого приемлемого хорошо известного метода, включая, например, представленные в настоящем описании методы, такие как анализ Скэтчарда и/или анализы связывания в условиях конкуренции, такие как радиоиммуноанализы (РИА), ферментные иммуноанализы (ФИА и ELISA) и "сэнвич"анализы в условиях конкуренции, и их различные варианты, хорошо известные в данной области. Касательно антигена Ang2 или VEGF соответственно иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен не ограничен происхождением из какого-либо конкретного вида. Так, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены предпочтительно связываются с человеческим Ang2 или человеческимVEGF соответственно, если они предназначены для лечения человека. При этом иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые связываются с Ang2 или VEGF соответственно из других видов млекопитающих, или полипептиды, содержащие их, также подпадают под объем изобретения. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывается с Ang2 или VEGF из одного из видов, может давать перекрестную реакцию с соответствующим антигеном из одного или нескольких других видов. Например, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые связываются с человеческим антигеном, могут обладать перекрестной реактивностью с соответствующим антигеном из одного или нескольких других видов приматов и/или антигеном из одного или нескольких видов животных, которых применяют в качестве животных, на которых моделируют заболевание, например, обезьян (в частности циномолгус или макак резус), мышей, крыс, кроликов, свиней, собак), в частности из животных, на которых моделируют заболевания и нарушения, которые можно модулировать путем ингибирования Ang2 (например, в качестве видов и животных моделей, упомянутых в настоящем описании). Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, которые обладают указанной перекрестной реактивностью, являются важными для исследовательских целей и/или для разработки лекарственных средств, поскольку позволяют тестировать иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предлагаемые в изобретении, на признанных моделях заболеваний,созданных на таких животных как обезьяны, в частности циномолгус или макак резус, или мыши и крысы. Кроме того, связывающие компоненты не ограничены или не определены конкретным доменом или антигенной детерминантой антигена, который/которая является их мишенью. Предпочтительно с позиций перекрестной реактивности с одним или несколькими молекулами антигенов из видов кроме человека, которая(ые) предназначена(ы) для применения в качестве животных моделей при разработке терапевтического антагониста Ang2/VEGF, связывающий компонент распознает эпитоп в области соответствующего антигена, которая обладает высокой степенью идентичности с человеческим антигеном. Например, при применении мышиной модели анти-Ang2 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, входящий в биспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, распознает эпитоп, который полностью или частично локализован в FLD-домене Ang2, для которого характерна высокая идентичность при сравнении человеческой и мышиной последовательности. Предпочтительно VEGF-связывающий компонент связывается с изоформами VEGF VEGF165 и/или- 22025148 Другим объектом изобретения являются молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют биспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении. Указанные молекулы нуклеиновых кислот в контексте настоящего описания обозначают также как "нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении", и они могут иметь также форму генетической конструкции, указанной в настоящем описании. Нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении, может представлять собой геномную ДНК,кДНК или синтетическую ДНК (такую как ДНК с наиболее часто встречающимися кодонами, которая специально адаптирована для экспрессии в выбранной клетке-хозяине или организме-хозяине). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении,находится в практически выделенной форме, как указано выше в настоящем описании. Нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении, может иметь также форму вектора, может присутствовать в векторе и/или представлять собой часть вектора, такого, например, как плазмида, космида или YAC. Вектор может представлять собой прежде всего экспрессионный вектор, т.е. вектор, который может обеспечивать экспрессию биспецифической молекулы in vitro и/или in vivo (т.е. в приемлемой/приемлемом клетке-хозяине, организме-хозяине и/или экспрессионной системе). Указанный экспрессионный вектор, как правило, содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, которая функционально связана с одним или несколькими приемлемыми регуляторными элементами, такими как промотор(ы), энхансер(ы), терминатор(ы) и т.п. Указанные элементы и их отбор с позиций экспрессии конкретной последовательности в конкретном хозяине находятся в компетенции специалиста в данной области. Конкретные примеры регуляторных элементов и других элементов, пригодных или необходимых для экспрессии D114-связывающих молекул, предлагаемых в изобретении,таких как промоторы, энхансеры, терминаторы, факторы интеграции, маркеры для селекции, лидерные последовательности, репортерные гены и т.п., описаны, например, на с. 131-133 WO 2006/040153. Нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, можно создавать или получать хорошо известным методом (например, путем автоматического синтеза ДНК и/или методом рекомбинантной ДНК) на основе информации об аминокислотных последовательностях полипептидов, предлагаемых в изобретении, которая представлена в настоящем описании, и/или их можно выделять из пригодного встречающегося в естественных условиях источника. Следующим объектом изобретения являются клетки-хозяева, которые экспрессируют или в которых может происходить экспрессия одной или нескольких биспецифических связывающих молекул,предлагаемых в изобретении; и/или которые содержат нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении. В одном из конкретных предпочтительных вариантов осуществления изобретения клетки-хозяева представляют собой бактериальные клетки; другими пригодными клетками являются клетки дрожжей,клетки грибов или клетки млекопитающих. Приемлемыми бактериальными клетками являются клетки грамотрицательных штаммов бактерий,таких как штаммы Escherichia coli, Proteus и Pseudomonas, и грамположительных штаммов бактерий, таких как штаммы Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus и Lactococcus. Приемлемыми грибными клетками являются клетки видов Trichoderma, Neurospora и Aspergillus. Приемлемыми клетками дрожжей являются клетки видов Saccharomyces (например, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (например,Schizosaccharomyces pombe), Pichia (например, Pichia pastoris и Pichia methanolica) и Hansenula. Приемлемыми клетками млекопитающих являются, например, СНО-клетки, BHK-клетки,HeLa-клетки, COS-клетки и т.п. Однако можно использовать также клетки амфибий, клетки насекомых,клетки растений и любые другие клетки, которые применяют в данной области для экспрессии гетерологичных белков. Изобретение относится также к способам получения биспецифической связывающей молекулы,предлагаемой в изобретении, как правило, заключающимся в том, что осуществляют стадии, на которых культивируют клетки-хозяева, которые содержат нуклеиновую кислоту, обладающую способностью кодировать биспецифическую связывающую молекулу в условиях, которые обеспечивают экспрессию биспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении; и высвобождают или выделяют из культуры полипептид, экспрессируемый клетками-хозяевами; и необязательно дополнительно очищают, и/или модифицируют, и/или включают в препаративную форму биспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении. Для производства в промышленном масштабе предпочтительными организмами-хозяевами являются штаммы Е.coli, Pichia pastoris и S.cerevisiae, которые пригодны для крупномасштабной экспрессии,производства и ферментации, и прежде всего для крупномасштабной экспрессии, производства и ферментации фармацевтических продуктов. Выбор конкретной экспрессионной системы зависит, в частности, от требований к определенным посттрансляционным модификациям, более конкретно к гликозилированию. Для получения биспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, для которой гликозилирование является желательным или необходимым, требуется применять для экспрессии клетки-хозяева млекопитающих,обладающие способностью гликозилировать белок. В этом плане специалисту в данной области должно быть очевидно, что полученная схема гликозилирования (т.е. вид, количество и положение присоединенных остатков) должна зависеть от клетки или клеточной линии, применяемой для экспрессии.- 23025148 Биспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, можно получать либо в клетке, согласно описанному выше методу, внутриклеточно (например, в цитозоле, периплазме или в тельцах включения), а затем выделять из клеток-хозяев и необязательно дополнительно очищать; либо их можно получать внеклеточно (например, в среде, в которой культивируют клетки-хозяева), а затем выделять из культуральной среды и необязательно дополнительно очищать. Методы и реагенты, которые применяют для получения полипептидов с помощью рекомбинантной ДНК, такие как специфические приемлемые экспрессионные векторы, методы трансформации или трансфекции, маркеры для селекции, методы индукции экспрессии белков, условия культивирования и т.п., известны в данной области. Аналогично этому методики выделения и очистки белков, применяемые в методе производства полипептида, предлагаемого в изобретении, хорошо известны специалисту в данной области. Следующим объектом изобретения является пептид, который имеет аминокислотную последовательность CDR3, входящую в конструкцию анти-VEGF-VHH, которая имеет аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, которые представлены вSEQ ID NO: 9-57 и или SEQ ID NO: 58-127 соответственно, и молекула нуклеиновой кислоты, которая его кодирует. Эти пептиды соответствуют CDR3, выведенным из VHH, предлагаемых в изобретении. Их, в частности, молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют их, можно применять для трансплантации CDR для того, чтобы заменять CDR3 в цепи иммуноглобулина или для инсерции в неимуноглобулиновый каркас, например, ингибитор протеазы, ДНК-связывающий белок, цитохром Ь 562, состоящий из пучка спиралей белок, связанный дисульфидным мостиком пептид, липокаин или антикалин, которые придают указанному каркасу способность связываться с мишенью. Метод трансплантации CDR хорошо известен в данной области и его широко применяли, например, для гуманизации антител (которые, как правило,содержит CDR из антитела грызунов, трансплантированные в каркасные участки Fv человеческого антитела). Для получения иммуноглобулинового или неиммуноглобулинового каркаса, содержащего CDR3,предлагаемый в изобретении, ДНК, которая кодирует указанную молекулу, можно получать с помощью стандартных методов молекулярной биологии, например с помощью синтеза генов, "отжига" олигонуклеотидов или на основе перекрывающихся ПЦР-фрагментов, которые описаны, например, у Daugherty etal., Nucleic Acids Research, т. 19, 9, 1991, p. 2471-2476. Метод инсерции VHH-CDR3 в неиммуноглобулиновый каркас описан у Nicaise et al., Protein Science, 13, 2004, p. 1882-1891. Изобретение относится также к продукту или композиции, содержащему/содержащей по меньшей мере одну биспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, и необязательно один или несколько хорошо известных дополнительных компонентов указанных композиций, т.е. которые зависят от предполагаемого применения композиции. Для фармацевтического применения на основе биспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, или полипептида, который ее содержит, можно приготавливать формы в виде фармацевтического препарата или композиции, содержащего/содержащей по меньшей мере одну биспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и/или адъювант и необязательно один или несколько дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений. Примерами таких препаративных форм являются (но не ограничиваясь только ими) формы, пригодные для орального введения, для парентерального введения (например, с помощью внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекции или внутривенной инфузии), для местного применения, для применения путем ингаляции, с помощью кожного пластыря, с помощью имплантата, суппозитория и т.д. Указанные приемлемые для введения формы, которые могут быть твердыми, полутвердыми или жидкими в зависимости от пути введения, а также методы и носители для их применения в препаратах, должны быть очевидные специалисту в данной области и дополнительно представлены в настоящем описании. Таким образом, следующим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит по меньшей мере одну биспецифическую связывающую молекулу, в частности один иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в изобретении, или полипептид, который его содержит, и по меньшей мере один приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент (т.е. пригодный для фармацевтического применения) и необязательно одну или несколько дополнительных активных субстанций. Биспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, можно включать в препаративную форму и вводить с помощью любого пригодного хорошо известного метода: см. ссылки, прежде всего касающиеся иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, например, в- 24025148 Например, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в изобретении,можно включать в препаративную форму и вводить любым методом, широко применяемым для канонических антител и фрагментов антител (включая ScFv и димерные антитела) и других фармацевтически активных белков. Указанные препаративные формы и методы их получения должны быть очевидны специалисту в данной области и, например, включают препараты, пригодные для парентерального введения(например, внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, внутрипросветного,внутриартериального или внутриоболочечного введения) или для местного (т.е. трансдермального или внутридермального) применения. Препараты для парентерального введения могут представлять собой, например, стерильные растворы, суспензии, дисперсии или эмульсии, которые можно применять для инфузии или инъекции. Приемлемыми носителями или разбавителями для таких препаратов являются, например (но не ограничиваясь только ими), стерильная вода и фармацевтически приемлемые водные буферы и растворы, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, раствор Хэнкса; водные растворы масел; глицерин; этанол; гликоли, такие как пропиленгликоль, или также минеральные масла, животные масла и растительные масла, например арахисовое масло, соевое масло, а также их приемлемые смеси. Как правило, предпочтительными являются водные растворы или суспензии. Так, биспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, можно вводить системно, например орально, в сочетании с фармацевтически приемлемым наполнителем, таким как инертный разбавитель или усвояемый съедобный носитель. Для орального терапевтического применения биспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, можно объединять с одним или несколькими эксципиентами и применять в форме предназначенных для приема внутрь таблеток, трансбуккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п. Указанные композиции и препараты должны содержать связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, в количестве, составляющем по меньшей мере 0,1%. Указанное процентное содержание в композициях и препаратах может, естественно, варьироваться и может, как правило, составлять от примерно 2 до примерно 60% в пересчете на массу указанной стандартной дозы лекарственного средства. Количество биспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, в предназначенных для терапевтического применения композициях является таким, чтобы получать эффективный уровень доз. Таблетки, пилюли, капсулы и т.п. могут содержать также связывающие агенты, эксципиенты, разрыхлители, замасливатели и подслащивающие вещества или корригенты, например, упомянутые на сс. 143-144 WO 2008/020079. Когда стандартная доза лекарственного средства представляет собой капсулу, то она может содержать помимо продуктов указанного выше типа жидкий носитель, такой как растительное масло или полиэтиленгликоль. Различные другие материалы могут присутствовать в виде покрытий или их можно применять для другой модификации физической формы твердой стандартной дозы лекарственного средства. Например, на таблетки, пилюли и капсулы можно наносить покрытие из желатина, воска, шеллака или сахара и т.п. Сироп или эликсир может включать биспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, сахарозу или фруктозу в качестве подслащивающего вещества, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и корригент, такой как вишневая или апельсиновая отдушка. Естественно, любой продукт, применяемый для приготовления любой стандартной дозы лекарственного средства, должен быть фармацевтически приемлемым и практически нетоксичным в применяемых количествах. Кроме того, биспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, можно включать в препараты или устройства с замедленным высвобождением. Препараты и формы для орального введения могут иметь также энтеросолюбильное покрытие, которое позволяет конструкциям, предлагаемым в изобретении, сохраняться в среде желудка и проходить в кишечник. Более конкретно препараты и формы для орального введения можно приготавливать в виде,который позволяет осуществлять введение в требуемый отдел желудочно-кишечного тракта. Кроме того,для введения в желудочно-кишечный тракт можно применять суппозитории. Биспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, можно вводить также внутривенно или внутрибрюшинно с помощью инфузии или инъекции, что более подробно описано на сс. 144 и 145 WO 2008/020079. В случае предназначенных для местного применения биспецифических связывающих молекул,предлагаемых в изобретении, их требуется наносить на кожу в виде композиций или форм в сочетании с приемлемым для дерматологического применения носителем, который может быть твердым или жидким, что более подробно описано на с. 145 WO 2008/020079. Как правило, концентрация биспецифических связывающих молекул, предлагаемых в изобретении,в жидкой композиции, такой как лосьон, должна составлять примерно 0,1-25 мас.%, предпочтительно примерно 0,5-10 мас.%. Концентрация в полутвердой или твердой композиции, такой как гель или порошок, должна составлять примерно 0,1-5 мас.%, предпочтительно примерно 0,5-2,5 мас.%. Количество биспецифических связывающих молекул, предлагаемых в изобретении, которое требуется для лечения, должно варьироваться не только в зависимости от конкретной выбранной биспецифической связывающей молекулы, но также от пути введения, природы состояния, подлежащего лечению,и возраста и состояния пациента, и, в конце концов, оно определяется предписанием лечащего врача или- 25025148 клинициста. Кроме того, доза биспецифических связывающих молекул, предлагаемых в изобретении,варьирует в зависимости от клетки-, опухоли-, ткани-, трансплантата- или органа-мишени. Требуемую дозу, как правило, можно применять в виде однократной дозы или в виде разделенных доз, которые предназначены для введения с соответствующими интервалами, например, в виде двух,трех, четырех или большего количества субдоз в день. Режим введения самих субдоз можно дополнительно разделять, например, на ряд введений, разделенных "пустыми" промежутками без обработки; например, на несколько ингаляций с использованием инсуффлятора, или путем внесения нескольких капель в глаз. Схема введения может включать пролонгированную ежедневную обработку. Под "пролонгированной" подразумевают обработку в течение периода времени, составляющего по меньшей мере две недели и предпочтительно несколько недель, месяцев или лет. Необходимость изменений в этой схеме приема доз может определять обычный специалист в данной области с помощью общепринятых экспериментов,указанных в настоящем описании (см., Remington's Pharmaceutical Sciences, под ред. Martin E.W., 4-е изд.,изд-во Mack Publishing Co., Easton, PA). Дозу может регулировать также каждый лечащий врач в случае любых осложнений. Еще одним вариантом осуществления изобретения является применение биспецифических связывающих молекул, например иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов или содержащих их полипептидов, для следующих терапевтических целей: для предупреждения, лечения и/или облегчения нарушения, заболевания или состояния, прежде всего у человека, которое ассоциировано с опосредуемыми VEGF- и /или Ang2 воздействиями на ангиогенез или которое можно предупреждать, лечить или облегчать посредством модуляции пути передачи сигналов Notch и/или передачи сигналов Tie2 с помощью биспецифической связывающей молекулы,предлагаемой в изобретении,в способе лечения пациента, который нуждается в такой терапии, заключающемся в том, что вводят индивидууму, который нуждается в этом, в фармацевтически активном количестве по меньшей мере одну биспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, например иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, или содержащую их фармацевтическую композицию; для приготовления лекарственного средства, предназначенного для предупреждения, лечения или облегчения нарушений, заболеваний или состояний, ассоциированных с опосредуемыми VEGF и/или опосредуемыми Ang2 воздействиями на ангиогенез; в качестве действующего вещества в фармацевтической композиции или лекарственном средстве,применяемой/применяемом для указанных выше целей. Согласно конкретному объекту изобретения нарушение, заболевание или состояние представляет собой рак или злокачественное заболевание, указанное в настоящем описании. Согласно другому объекту изобретения заболевание представляет собой глазную болезнь, ассоциированную с опосредуемыми VEGF и/или опосредуемыми Ang2 воздействиями на ангиогенез или которую можно лечить или облегчать посредством модуляции пути передачи сигналов Notch и/или передачи сигналов Tie2 с помощью биспецифической связывающей молекулы. В зависимости от подлежащего лечению злокачественного заболевания биспецифическую связывающую молекулу можно применять индивидуально или в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, в частности, выбранными из химиотерапевтических средств типа повреждающих ДНК агентов или терапевтически активных соединений, которые ингибируют ангиогенез, пути трансдукции сигналов или точки контроля митоза в раковых клетках. Дополнительные терапевтические средства можно вводить одновременно, необязательно в виде компонента одного и того же фармацевтического препарата, или до, или после введения биспецифической связывающей молекулы. В конкретных вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство может представлять собой (но не ограничиваясь только ими) один или несколько ингибиторов, выбранных из группы ингибиторов EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK и PI3-киназы,FGFR, PDGFR, Raf, Ras, KSP, PDK1, PTK2, IGF-R или IR. Другими примерами дополнительных терапевтических агентов являются ингибиторы CDK, Akt,src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, антагонисты hedgehog, ингибиторы JAK/STAT, Mek,mTor, NF-B, протеосом, Rho, ингибитор пути передачи сигналов wnt или ингибитор пути убикитинизации или другой ингибитор пути передачи сигналов Notch. Примерами ингибиторов киназы Aurora являются (но не ограничиваясь только ими) РНА-739358,AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735. Примером ингибитора PLK является GSK-461364. Примерами ингибиторов raf являются BAY-73-4506 (который является также ингибиторомVEGFR), PLX 4032, RAF-265 (который является также ингибитором VEGFR), сорафениб (который является также ингибитором VEGFR) и XL 281. Примерами ингибиторов KSP являются испинесиб, ARRY-520, AZD-4877, СК-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, МК-0731 и SB-743921.- 26025148 Примерами ингибиторов src и/или bcr-abl являются дасатиниб, AZD-0530, босутиниб, XL 228 (который является также ингибитором IGF-1R), нилотиниб (который является также ингибитором PDGFR иcKit), иматиниб (который является также ингибитором cKit) и NS-187. Примером ингибитора PDK1 является ВХ-517. Примером ингибитора Rho является ВА-210. Примерами ингибиторов PI3-киназы являются РХ-866, BEZ-235 (который является также ингибитором mTor), XL 418 (который является также ингибитором Akt), XL-147 и XL 765 (который является также ингибитором mTor). Примерами ингибиторов cMet или HGF являются XL-184 (который является также ингибиторомVEGFR, cKit, Flt3), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (который является также ингибитором VEGFR),MGCD-265 (который является также ингибитором VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102 и AV-299. Примером ингибитора с-Мус является СХ-3543. Примерами ингибиторов Flt3 являются АС-220 (который является также ингибитором cKit andPDGFR), KW 2449, лестауртиниб (который является также ингибитором VEGFR, PDGFR, PKC), TG101348 (который является также ингибитором JAK2), XL-999 (который является также ингибитором cKit,FGFR, PDGFR и VEGFR), сунитиниб (который является также ингибитором PDGFR, VEGFR и cKit) и тандутиниб (который является также ингибитором PDGFR и cKit). Примерами ингибиторов HSP90 являются танеспимицин, алвеспимицин IPI-504 и CNF 2024. Примерами ингибиторов JAK/STAT являются CYT-997 (который взаимодействует также с тубулином), TG 101348 (который является также ингибитором Flt3) и XL-019. Примерами ингибиторов Mek являются ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330 и XL 518. Примерами ингибиторов mTor являются темсиролимус, АР-23573 (который действует также как ингибитор VEGF), эверолимус (кроме того, является ингибитором VEGF), XL-765 (который является также ингибитором PI3-киназы) и BEZ-235 (который является также ингибитором PI3-киназы). Примерами ингибиторов Akt являются перифосин, GSK-690693, RX-0201 и трицирибин. Примерами ингибиторов cKit являются АВ-1010, OSI-930 (который действует также в качестве ингибитора VEGFR), AC-220 (который является также ингибитором Flt3 и PDGFR), тандутиниб (который является также ингибитором Flt3 и PDGFR), акситиниб (который является также ингибитором VEGFR иPDGFR), XL-999 (который является также ингибитором Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR), сунитиниб (который является также ингибитором Flt3, PDGFR, VEGFR) и XL-820 (который действует также как ингибитор VEGFR и PDGFR), имиаиниб (который является также ингибитором bcr-abl), нилотиниб (который является также ингибитором bcr-abl и PDGFR). Примерами антагонистов hedgehog являются IPI-609 и CUR-61414. Примерами ингибиторов CDK являются селициклиб, АТ-7519, Р-276, ZK-CDK (который является также ингибитором VEGFR2 и PDGFR), PD-332991, R-547, SNS-032, РНА-690509 и AG 024322. Примерами ингибиторов протеосомы являются бортезомиб, карфилзомиб и NPI-0052 (который является также ингибитором NF-B). Примером ингибитора NF-B-пути является NPI-0052. Примером ингибитора пути убикитинизации является НВХ-41108. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой антиангиогенный агент. Примерами антиангиогенных агентов являются ингибиторы FGFR, PDGFR и VEGFR или соответствующие лиганды (например, ингибиторы VEGF типа пэгаптаниба или антитело к VEGF бевасизумаб) и талидомиды, указанные агенты выбраны из группы, включающей (но не ограничиваясь только ими) бевасизумаб, мотесаниб, CDP-791, SU-14813, телатиниб, KRN-951, ZK-CDK (который является также ингибитором CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiD (иммуномодуляторные лекарственные средства), производное талидомида СС-4047, леналидомид, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, бриваниб, цедираниб, XL-999 (который является также ингибитором cKit и Flt3), 1B3, СР 868596,IMC 3G3, R-1530 (который является также ингибитором Flt3), сунитиниб (который является также ингибитором cKit и Flt3), акситиниб (который является также ингибитором cKit), лестауртиниб (который является также ингибитором Flt3 и PKC), ваталаниб, тандутиниб (который является также ингибиторомFlt3 и cKit), пазопаниб, GW 786034, PF-337210, IMC-1121 В, AVE-0005, AG-13736, Е-7080, CHIR 258,сорафениба тозилат (который является также ингибитором Raf), RAF-265 (который является также ингибитором Raf), вантетаниб, СР-547632, OSI-930, AEE-788 (EGFR и Her2), BAY-57-9352 (который является также ингибитором Raf), BAY-73-4506 (который является также ингибитором Raf), XL 880 (который является также ингибитором cMet), XL-647 (который является также ингибитором EGFR и EphB4), XL 820(который является также ингибитором cKit) и нилотиниб (который является также ингибитором cKit иbrc-abl). Дополнительное терапевтическое средство можно выбирать также из ингибиторов EGFR, оно может представлять собой низкомолекулярный ингибитор EGFR или антитело к EGFR. Примерами антител- 27025148 к EGFR являются (но не ограничиваясь только ими) цетуксимаб, панитумумаб, матузумаб; примером низкомолекулярного ингибитора EGFR является гефитиниб. Другим примером модулятора EGFR является конъюгат EGF с токсином. Из ингибиторов EGFR и Her2, которые можно применять в сочетании с биспецифической связывающей молекулой, предлагаемой в изобретении, следует упомянуть лапатиниб, гефитиниб, эрлотиниб,цетуксимаб, трастузумаб, нимотузумаб, залутумумаб, вандетаниб (который является также ингибиторомVEGFR), пертузумаб, XL-647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514,JNJ-26483327, АЕЕ-788 (который является также ингибитором VEGFR), ARRY-333786, IMC-11F8,Zemab. Другими агентами, которые целесообразно применять для лечения в сочетании с биспецифической связывающей молекулой, предлагаемой в изобретении, являются тоситумумаб и ибритумомаба тиуксетан (два меченных с помощью радиоактивных изотопов антитела к CD20), алемтузумаб (антитело кCD52), деносумаб (ингибитор лиганда фактора дифференцировки остеокластов), галиксимаб (антагонист(SAR153192) или ОМР-21 М 18 (ингибиторы D114). Другими химиотерапевтическими лекарственными средствами, которые можно применять в сочетании с биспецифическими связывающими молекулами, предлагаемыми в настоящем изобретении, являются (но не ограничиваясь только ими) гормоны, аналоги гормонов и антигормональные средства (например, тамоксифен, торемифен, ралоксифен, фулвестрант, мегестрола ацетат, флутамид, нилутамид,бикалутамид, ципротерона ацетат, финастерид, бусерелина ацетат, флудрокортизон, флуоксиместерон,медроксипрогестерон, остреотид, арзоксифен, пасиреотид, вапреотид), ингибиторы ароматазы (например, анастрозол, летрозол, лиарозол, эксеместан, атаместан, форместан), агонисты и антагонисты LHRH(например, госерелина ацетат, леупролид, абареликс, цетрореликс, деслорелин, гистрелин, трипторелин),антиметаболиты (например, антифолаты типа метотрексата, пеметрекседа, аналоги пиримидина типа 5-фторурацила, капецитабина, децитабина, неларабина и гемцитабина, аналоги пурина и аденозина, такие как меркаптопурина тиогуанин, кладрибин и пентостатин, цитарабин, флударабин); противопухолевые антибиотики (например, антрациклины, такие как доксорубицин, даунорубицин, эпирубицин и идарубицин, митомицин-С, блеомицин, дактиномицин, пликамицин, митоксантрон, пиксантрон, стрептозоцин); производные платины (например, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, лобаплатин, сатраплатин); алкилирующие средства (например, эстрамустин, меклорэтамин, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, дакарбазин, циклофосфамид, ифосфамид, гидроксимочевина, темозоломид, нитрозомочевины, такие как кармустин и ломустин, тиотепа); антимитотические средства (например, алкалоиды барвинка типа винбластина, виндесина, винорелбина, винфлунина и винкристина; таксаны, такие как паклитаксел, доцетаксел и их препаративные формы, ларотаксел; симотаксел и эпотилоны типа иксабепилона, патупилона, ZK-EPO); ингибиторы топоизомеразы (например, эпиподофиллотоксины, такие как этопосид и этопофос, тенипосид, амсакрин, топотекан, иринотекан) и химиотерапевтические агенты смешанного типа, такие как амифостин, анагрелид, интерферон альфа, прокарбазин, митотан и порфимер, бексаротен,целекоксиб. Эффективность биспецифических связывающих молекул, предлагаемых в изобретении, или содержащих их полипептидов, или содержащих их композиций можно оценивать с помощью приемлемого анализа in vitro, клеточного анализа, анализа in vivo и/или на хорошо известных животных моделях или с помощью любой их комбинации в зависимости от специфического представляющего интерес заболевания или нарушения. Приемлемые анализы и животные модели очевидны специалисту в данной области,и они представляют собой анализы, представленные в настоящем описании, и применяемые ниже в примерах, например анализ пролиферации. Данные, полученные в экспериментах, проведенных при создании изобретения, подтверждают, что биспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, обладают свойствами, которые превышают свойства связывающих молекул, известных из существующего уровня техники. Одним из указанных свойств является полное ингибирование взаимодействия VEGF165-VEGFR2 и низкое значение IC50, которое можно рассчитывать, например, на основе полученных с помощью ELISA данных,представленных на фиг. 1 и в табл. 5, а также значения IC50 (нМ) для VHH по данным AlphaScreenанализа, которые представлены на фиг. 3, 17, 18 и в табл. 7; и данные об уровне аффинности KD (нМ) очищенных VHH к рекомбинантному человеческому VEGF и мышиному VEGF, которые представлены в табл. 9, 10 и на фиг. 5. Кроме того, что видно из табл. 13, связывающие VEGF агенты, предлагаемые в изобретении, обладают высокой эффективностью, т.е. при применении в концентрациях, находящихся в субнаномолярном диапазоне, при оценке пролиферации клеток линии HUVEC. Эти данные свидетельствуют о том, что биспецифические связывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, являются перспективными кандидатами, которые могут обладать терапевтической эффективностью в отношении заболеваний и нарушений, ассоциированных с опосредуемыми VEGF-воздействиями на ангиогенез, таких как рак.- 28025148 Другим вариантом осуществления изобретения является способ диагностирования заболевания, заключающийся в том, что: а) приводят в контакт образец со связывающей молекулой, предлагаемой в изобретении; и б) определяют связывание указанной связывающей молекулы с образцом; и в) сравнивают связывание, обнаруженное на стадии (б), со стандартом, при этом различие в связывании с указанным образцом является диагностическим в отношении заболевания или нарушения, ассоциированного с опосредуемыми VEGF- и/или Ang2 воздействиями на ангиогенез. Для указанного и других вариантов применения может оказаться целесообразным дополнительно модифицировать биспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, например,путем интродукции функциональной группы, которая является компонентом специфически связывающейся пары, такой как связывающаяся пара биотин-(стрепт)авидин. Указанную функциональную группу можно применять для соединения связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, с другим белком, полипептидом или химическим соединением, который/которое связан/связано с другой половиной связывающейся пары, т.е. посредством формирования связывающейся пары. Например, биспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, можно конъюгировать с биотином и связывать с другим белком, полипептидом, соединением или носителем, который конъюгирован с авидином или стрептавидином. Например, указанную конъюгированную биспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, можно применять в качестве репортера, например, в диагностической системе, в которой выявляемый образующий сигнал агент конъюгирован с авидином или стрептавидином. Краткое описание чертежей На чертежах показано: на фиг. 1 - результаты, демонстрирующие, что очищенные одновалентные VHH блокируют взаимодействие hVEGF165/hVEGFR2-Fc (ELISA); на фиг. 2 - результаты, демонстрирующие, что очищенные одновалентные VHH блокируют взаимодействие hVEGF165/hVEGFR1-Fc (ELISA); на фиг. 3 - результаты, демонстрирующие, что очищенные одновалентные VHH блокируют взаимодействие hVEGF165/hVEGFR2-Fc (AlphaScreen); на фиг. 4 - результаты, демонстрирующие, что очищенные одновалентные VHH блокируют взаимодействие hVEGF165/hVEGFR1-Fc (AlphaScreen); на фиг. 5 - результаты, демонстрирующие связывание одновалентных VHH с рекомбинантным человеческим и мышиным VEGF (ELISA); на фиг. 6 - результаты, демонстрирующие связывание одновалентных VHH с человеческимmVEGF164/mVEGFR2-Fc (AlphaScreen); на фиг. 13 - результаты, демонстрирующие, что форматированные VHH связываются с мышиным и человеческим VEGF; на фиг. 14 - результаты, демонстрирующие, что форматированные VHH не связываются с VEGFB,VEGFC, VEGFD и PLGF; на фиг. 15 - результаты, демонстрирующие, что форматированные VHH связываются с VEGF121; на фиг. 16 - сравнительный анализ последовательности VHH VEGFBII23B04 и человеческой консенсусной последовательности зародышевой линии VH3/JH; на фиг. 17 - результаты, демонстрирующие, что варианты VHH VEGFBII23B04 блокируют взаимодействие hVEGF165/hVEGFR2-Fc (AlphaScreen); на фиг. 18 - результаты, демонстрирующие, что клоны VEGFBII23B04 с оптимизированной последовательностью блокируют взаимодействие hVEGF165/hVEGFR2-Fc (AlphaScreen); на фиг. 19 - сравнительный анализ последовательности VHH VEGFBII5B05 и человеческой консенсусной последовательности зародышевой линии VH3/JH; на фиг. 20 - описание двухвалентных VHH к Ang2; на фиг. 21 - результаты, демонстрирующие, что очищенные двухвалентные VHH к Ang2 блокируют взаимодействие hAng2-hTie2 (25-1), mAng2-mTie2 (25-2) и cAng2-cTie2 (25-3) (ELISA);