Биспецифичные молекулы, связывающие egfr/igfir

Формула / Реферат | Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Код ссылки

Номер патента: 22415

Опубликовано: 30.12.2015

Авторы: Готтардис Марко, Карбони Джоан, Эмануэл Стюарт, Энгл Линда, Райт Мартин С., Рейкстро Джинжер Чао, Кэмпхаузен Рэй

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Димер антителоподобного белка, содержащий десятый домен фибронектина III типа (¹⁰Fn3), который связывается с IGF-IR с K_D менее 500 нМ, ковалентно или нековалентно связанный с ¹⁰Fn3, который связывается с EGFR с K_D менее 500 нМ, где:

(a) IGFIR-связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_aSARLKVAX_b (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_cKNVYX_d (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_eRFRDYQX_f (SEQ ID NO: 50);

EGFR-связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_gWAPVDRYQX_h (SEQ ID NO: 137), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_iRDVYX_j (SEQ ID NO: 138), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_kDYKPHADGPHTYHESX_l (SEQ ID NO: 139); и

X представляет собой любую аминокислоту; а, b, с, d, e, f, g, h, i, j, k и l являются целыми числами, независимо выбранными от 0 до 5;

(b) IGFIR-связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_aSARLKVAX_b (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_cKNVYX_d (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_eRFRDYQX_f (SEQ ID NO: 50);

EGFR-связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_gDSGRGSYQX_h (SEQ ID NO: 40), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_iGPVHX_j (SEQ ID NO: 42), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_kDHKPHADGPHTYHEX_l (SEQ ID NO: 44); и

(c) IGFIR-связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_aSARLKVAX_b (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_cKNVYX_d (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_eRFRDYQX_f (SEQ ID NO: 50);

EGFR-связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_mVAGAEDYQX_n (SEQ ID NO: 34), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_oHDLVX_p (SEQ ID NO: 36), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_qDMMHVEYTEHX_r (SEQ ID NO: 38); и

X представляет собой любую аминокислоту; а, b, с, d, е, f, m, n, о, р, q и r являются целыми числами, независимо выбранными от 0 до 5;

(d) IGFIR-связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_aSARLKVAX_b (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_cKNVYX_d (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_eRFRDYQX_f (SEQ ID NO: 50);

EGFR-связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_sLPGKLRYQX_t (SEQ ID NO: 60), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_uHDLRX_w (SEQ ID NO: 62), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_yNMMHVEYSEYX_z (SEQ ID NO: 64); и

X представляет собой любую аминокислоту; а, b, с, d, e, f, s, t, u, w, у и z являются целыми числами, независимо выбранными от 0 до 5; или

(e) IGFIR-связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_aSARLKVAX_b (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_cKNVYX_d (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_eRFRDYQX_f (SEQ ID NO: 50);

EGFR-связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_gHERDGSRQX_h (SEQ ID NO: 134), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_iGGVRX_j (SEQ ID NO: 135), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_kDYFNPTTHEYIYQTTX_l (SEQ ID NO: 136); и

X представляет собой любую аминокислоту; а, b, с, d, e, f, g, h, i, j, k и l являются целыми числами, независимо выбранными от 0 до 5.

2. Димер антителоподобного белка по п.1, где:

(a) IGF-IR связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); и

EGFR-связывающий ¹⁰Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWWAPVDRYQ (SEQ ID NO: 115), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PRDVYT (SEQ ID NO: 116), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDYKPHADGPHTYHESP (SEQ ID NO: 117);

(b) IGF-IR связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); и

EGFR-связывающий ¹⁰Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWDSGRGSYQ (SEQ ID NO: 39), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PGPVHT (SEQ ID NO: 41), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDHKPHADGPHTYHESP (SEQ ID NO: 43);

(c) IGF-IR связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); ковалентно или нековалентно связанный с EGFR-связывающим ¹⁰Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWVAGAEDYQ (SEQ ID NO: 33), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PUDLVT (SEQ ID NO: 35), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDMMHVEYTEUP (SEQ ID NO: 37);

(d) IGF-IR связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); ковалентно или нековалентно связанный с EGFR-связывающим ¹⁰Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность LPGKLRYQ (остатки 3-13 последовательности SEQ ID NO: 59), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PHDLR (остатки 1-5 последовательности SEQ ID NO: 61), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TNMMHVEYSEY (остатки 1-11 последовательности SEQ ID NO: 63); или

(е) IGF-IR связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); ковалентно или нековалентно связанный с EGFR-связывающим ¹⁰Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWUERDGSRQ (SEQ ID NO: 109), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PGGVRT (SEQ ID NO: 110), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDYFNPTTHEYIYQTTP (SEQ ID NO: 111).

3. Димер антителоподобного белка по п.1 или 2, где:

(a) IGF-IR связывающий ¹⁰Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3, и EGFR-связывающий каркас ¹⁰Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 112;

(b) IGF-IR связывающий ¹⁰Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3, и EGFR-связывающий каркас ¹⁰Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 5;

(c) IGF-IR связывающий ¹⁰Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3, и EGFR-связывающий ¹⁰Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 7;

(d) IGF-IR связывающий ¹⁰Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3, и EGFR-связывающий ¹⁰Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 82; или

(е) IGF-IR связывающий ¹⁰Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3, и EGFR-связывающий ¹⁰Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 107.

4. Димер антителоподобного белка по любому из пп.1-3, где IGF-IR связывающий ¹⁰Fn3 ковалентно связан с EGFR-связывающим ¹⁰Fn3 через полипептидный линкер или группу полиэтиленгликоля.

5. Димер антителоподобного белка по п.4, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 53, 54, 87, 88, 98, 99, 104, 105 или 118-132.

6. Антителоподобный белок, содержащий десятый домен фибронектина III типа (¹⁰Fn3), который связывается с EGFR с K_D менее 500 нМ, где EGFR-связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_gWAPVDRYQX_h (SEQ ID NO: 137), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_iRDVYX_j (SEQ ID NO: 138), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность X_kDYKPHADGPHTYHES_l (SEQ ID NO: 139); где X представляет собой любую аминокислоту; а, b, с, d, e, f, g, h, i, j, k и l являются целыми числами, независимо выбранными от 0 до 5.

7. Антителоподобный белок по п.6, где EGFR-связывающий ¹⁰Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWWAPVDRYQ (SEQ ID NO: 115), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PRDVYT (SEQ ID NO: 116), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDYKPHADGPHTYHESP (SEQ ID NO: 117).

8. Антителоподобный белок по любому из пп.6 или 7, дополнительно содержащий еще один десятый домен фибронектина III типа (¹⁰Fn3).

9. Антителоподобный белок по п.8, где еще один ¹⁰Fn3 связывается с IGF-IR.

10. Антителоподобный белок по пп.8 или 9, где еще один ¹⁰Fn3 ковалентно связан с EGFR-связывающим ¹⁰Fn3 через полипептидный линкер или группу полиэтиленгликоля.

11. Фармацевтическая композиция для лечения гиперпролиферативного заболевания, содержащая терапевтически эффективное количество димера антителоподобного белка или антителоподобного белка по любому из пп.1-10, где указанная композиция является апирогенной.

12. Способ лечения гиперпролиферативного заболевания у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции по п.11.

Текст

Смотреть все

Изобретение относится к биспецифичным молекулам, содержащим EGFR связывающий домен и отличный от него IGFIR связывающий домен для использования в диагностических,исследовательских и терапевтических применениях. Изобретение дополнительно относится к клеткам, содержащим такие белки, полинуклеотиду, кодирующему такие белки, или их фрагментам и векторам, содержащим полинуклеотиды, кодирующие белки по изобретению. Приводимые в качестве примера биспецифичные молекулы включают антителоподобные белковые димеры на основе десятого домена фибронектина III типа. Область техники Настоящее изобретение относится к EGFR связывающим доменам и биспецифичным молекулам,содержащим EGFR-связывающий домен, и отдельному IGFIR связывающему домену для использования в диагностических, исследовательских и терапевтических применениях. Настоящее изобретение дополнительно относится к клеткам, содержащим такие белки, полинуклеотиду, кодирующему такие белки или их фрагменты, и векторам, содержащим полинуклеотиды, кодирующие белки по изобретению. Приводимые в качестве примера EGFR связывающие домены и биспецифичные молекулы включают антителоподобные белковые димеры, основанные на десятом домене фибронектина III типа. Введение Активация сигнального пути рецептора тирозинкиназы является основной для развития злокачественных заболеваний (см., например, Grimberg A. Cancer Biol. Ther. 2003, 2(6):630-5 и Mendelsohn J. J.Clin. Oncol. 2003, 21(14):2787-99). Рецептор тирозинкиназ имеет консервативную доменную структуру,включающую внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный тирозинкиназный домен. Внеклеточный домен может связываться с лигандом, например с полипептидным фактором роста или молекулой, ассоциированной с клеточной мембраной. Обычно либо связывание с лигандом, либо связывание с лигандом, индуцированное димеризацией рецептора тирозинкиназы, активирует внутриклеточный каталитический тирозинкиназный домен рецептора и последующую сигнальную трансдукцию. Примеры рецепторов тирозинкиназ включают, но не ограничиваются рецепторами ERBB (например, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4), эритропоэтин-продуцирующими печеночно-клеточными (ЕРН) рецепторами, рецепторами фактора роста фибробластов (FGF) (например, FGFR1, FGFR2, FGFR3,FGFR4, FGFR5), рецепторы тромбоцитарного фактора роста (PDGF) (например, PDGFR-А, PDGFR-B),рецепторы сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) (например, VEGFR1/FLT1,VEGFR2/FLK1, VEGF3), рецепторы тирозинкиназы с иммуноглобулин-подобными и EGF-подобными доменами (TIE), рецепторы инсулин-подобного фактора роста (IGF) (например, INS-R, IGFIR, IR-R),рецепторы домена дискоидина (DD), рецепторы к c-Met (MET), рецептор recepteur d'origine nantais(RON); также известные как макрофаг-стимулирующий рецептор 1, Flt3 fins-зависимая тирозинкиназа 3(Flt3), рецептор колониестимулирующего фактора 1 (CSF1), рецептор киназного рецетора, связанного с адгезией (например, Axl), рецептор к c-kit (KIT) и рецепторы, родственные рецепторам инсулина (IRR). Выяснилось, что ингибирование рецептора тирозинкиназ является эффективной терапевтической стратегией для некоторых злокачественных заболеваний человека (см. обзор у Roussidis A.E., in vivo. 2002, 16(6):459-69). Тогда как направленная монотерапия может изначально быть эффективной в лечении злокачественного заболевания, зачастую следует терапевтическая резистентность, возможно, как результат положительной регуляции других сигнальных каскадов (см., например, Nahta R. et al., BreastCancer Res. 2006, 8(6):215 и Horn L. et al., Clin. Lung Cancer. 2007, 8:S68-73). В связи с этим существует необходимость в разработке усовершенствованных лекарственных средств для лечения злокачественных заболеваний. Сущность изобретения В одном аспекте настоящее изобретение относится к EGFR связывающим десятым доменам фибронектина III типа (10Fn3), имеющим новые последовательности. Также представленFn3 может быть мономерным или может быть включен как часть слитого белка. В другом аспекте настоящее изобретение относится к биспецифичным молекулам, которые связываются с EGFR и IGFIR, называемыми здесь "E/I-связующие". E/I-связующие, охватываемые изобретением, включают биспецифичные антитела и димеры лигандсвязывающих каркасных белков (например, тендамистат, аффитело, домен фибронектина III типа, аникалин, тетранектин и анкирин). При конструировании в виде одной полипептидной цепи E/I-связующие могут быть сконструированы в любом направлении, например от N-конца к С-концу, либо в E-I положении, либо I-Е положении. В одном аспекте представлены антителоподобные белковые димеры, содержащиеEGFR-связывающий 10Fn3 ковалентно или нековалентно связанный с IGFIR связывающим 10Fn3. 10Fn3 связывают их мишень (EGFR или IGFIR) с KD менее 500 нМ. Каждый из отдельных 10Fn3 независимо имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 32, где n представляет собой целое число от 1 до 20, о представляет собой целое число от 1 до 20 и р представляет собой целое число от 1 до 40. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число от 8 до 12, о представляет собой целое число от 4 до 8 и р представляет собой целое число от 4 до 28. В некоторых вариантах осуществления n равно 10, о равно 6 и р равно 12. В некоторых вариантах осуществления антителоподобные белковые димеры содержат IGFIR связывающий 10Fn3, ковалентно связанный с EGFR связывающим 10Fn3 через полипептидный линкер или группу полиэтиленгликоля. В некоторых вариантах осуществления антителоподобный белковый димер содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95 или 100% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 20-31, 53-58, 87-92, 98-105, 118-133, 149-154, 164-169,-1 022415 179-184, 192-197, 205-210 и 211-216. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее содержит аминокислотную последовательность, содержащую любую из последовательностей SEQ ID NO: 20-31, 53-58, 87-92, 98-105, 118-133,149-154, 164-169, 179-184, 192-197, 205-210 и 211-216, где (i) EGFR-связывающий 10Fn3 и/или IGF-IR связывающий 10Fn3 содержит 10Fn3 каркас, имеющий, где угодно, от 0 до 20, от 0 до 15, от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2 или от 0 до 1 замен, консервативных замен, делеций или добавлений относительно соответствующих каркасных аминокислот последовательности SEQID NO: 1, и/или (ii) EGFR-связывающий 10Fn3 имеет, где угодно, от 0 до 15, от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2 или от 0 до 1 замен, консервативных замен, делеций или добавлений по сравнению с соответствующими петлевыми последовательностями любой из последовательностей SEQ ID NO: 5-8, 52, 66-68, 106-108, 112-114, 140-142, 155-157, 170-172, 182, 185-187,198-200 или 219-327 и/или IGF-IR связывающий 10Fn3 имеет, где угодно, от 0 до 15, от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2 или от 0 до 1 замен, консервативных замен, делеций или добавлений по сравнению с соответствующими петлевыми последовательностями SEQ ID NO: 3. В одном аспекте представлены фарацевтически приемлемые композиции, содержащие антителоподобный белковый димер, описанный в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носительно, где указанная композиция, по существу, является апирогенной. Еще в одном аспекте, представлены способы лечения гиперпролиферативных нарушенвведение указанному пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтически приемлемой композиции, содержащей антителоподобный белковый димер, описанный в настоящем документе. В другом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей антителоподобный белковый димер, описанный в настоящем документе. Также представлен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую антителоподобный димер, описанный в настоящем документе. Подходящие векторы включают, например, векторы экспрессии. Также представлены клеткихозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, вектор или вектор экспрессии, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую антителоподобный белковый димер, описанный в настоящем документе. Подходящие клетки-хозяева включают прокариотические и эукариотические клетки-хозяева. Приводимые в качестве примера прокариотические клетки представляют собой бактериальные клетки, такие как Е.coli. Приводимые в качестве примера эукариотические клетки представляют собой клетки млекопитающих, например клетки СНО. Также представлены способы получения антителоподобного белкового димера, описанного в настоящем документе, предусматривающие культивирование клетки-хозяина,содержащей нуклеиновую кислоту, вектор или вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту,кодирующую антителоподобный белковый димер, и выделение экспрессированного антителоподобного белкового димера из культуры. Краткое описание чертежей Фиг. 1. SDS-PAGE анализ I1-GS10-E2. Образцы, полученные в результате лизиса осадка бактериальных клеток HMS174(DE3), из которых II-GS10-E2 экспрессировали и очищали с помощью колоночной хроматографии HisTrap, пропускали через 4-12% NuPAGE мини-гель, окрашенный красителемSypro-Orange, и визуализировали с помощью STORM. Метка 12 стандартов молекулярной массы (дорожка 1); лизат-растворимый (дорожка 2); лизат-нерастворимый (дорожка 3); HisTrap нагрузка (дорожка 4); HisTrap несвязанный (дорожка 5); объединенный HisTrap элюат (дорожка 6); диализированный в 50 мМ NaOAc, 150 мМ NaCl, pH 4,5 (дорожка 7); диализированный в PBS (дорожка 8); диализированный в Трис, 150 мМ NaCl, pH 8,5 (дорожка 9). Фиг. 2:I1-GS10-E2 элюировали преимущественно в виде одиночных мономерных продуктов в диапазоне молекулярной массы приблизительно 24,6 кДа по сравнению с глобулярными стандартами для гельфильтрации (BioRad). В. SEC анализ E2-GS10-I1. Фиг. 3: А. Дифференциальная сканирующая калориметрия (DSC) I1-GS10-E2 среднего качества очистки вPBS проводили для определения Тпл. 1 мг/мл раствор I1-GS10-E2 сканировали от 5 до 95C со скоростью 1/мин под давлением 3 атм. Данные анализировали в сравнении с контрольным пробегом PBS буфера. В. DSC образца E2-GS10-I1. Фиг. 4. Ингибирование активности IGFR в клетках Н 292. Клетки стимулировали с использованием 100 нг/мл IGF-1 и 100 нг/мл EGF и обрабатывали либоE1-GS10-I1 НТРР препаратами. Фосфорилирование AKT по серину 473 определяли с помощью ELISA. Фиг. 7. Ингибирование пролиферации клеток RH41. Клетки обрабатывали либоE1-GS10-I1 НТРР препаратами и определяли процент ингибирования пролиферации. Фиг. 8. Ингибирование пролиферации клеток Н 292. Клетки обрабатывали либоE1-GS10-I1 НТРР препаратами и определяли процент ингибирования пролиферации. Фиг. 9. Суммированы величины IC50 в клеточных функциональных анализах в отношении выделенных EGFR мононектинов, E/I-связующие на основе 10Fn3 с серином в С-концевом положении без добавления ПЭГ и E/I-связующие на основе 10Fn3 c цистеином в С-концевом положении, конъюгированные с разветвленным ПЭГ 40 кДа. Показаны репрезентативные данные. Фиг. 10. Иммуноблот-анализ пэгилированного E/I-связующего на основе 10Fn3, с Е 2 в N-концевом и С-концевом положении. Несмотря на то что обе конструкции демонстрируют сравнимую активность в исследовании на клетках Н 292 для ингибирования EGFR, E/I-связующее на основе 10Fn3, с Е 2 в С-концевом положении не разрушало EGFR, тогда как E/I-связующее на основе 10Fn3, с Е 2 вN-концевом положении разрушало. Обе конструкции демонстрируют разрушение IGFR от очень слабого до отсутствующего в этой клеточной линии. -актин был включен для демонстрации равной нагрузки по всем дорожкам. Также изучали статус фосфорилирования EGFR, ERK и Shc. Фиг. 11. Ингибирование EGF-стимулированного фосфорилирования EGFR в клетках Н 292. Обе конструкции демонстрировали сравнимую активность в исследовании на клетках Н 292 в отношении ингибирования EGFR. E2-GS10-I1 (с ПЭГ). Фиг. 12. Результаты исследований ксенотрансплантата опухоли. Фиг. 12 А. Доклиническая противоопухолевая активность в модели опухолевого трансплантата человека Н 292. Средние размеры опухоли, вычисленные исходя из групп по 8 мышей, показаны в мг для контрольных животных, панитумумаба, вводимого в дозе 1 мг/мышь или 0,1 мг/мышь Буква а на оси X указывает дозы Е/I вводимых связующих, а р указывает на дозы вводимого панитумумаба. Фиг. 12 В. Изменение средней массы тела показано для каждой группы на протяжении курса исследования. Символы описаны в подписях на фиг. 12 А. Фиг. 13. Фармакодинамические эффекты в модели опухолевого ксенотрансплантата Н 292 NSCLC. Уровни указанных аналитов были определены в опухолевых лизатах, как описано в примере 12.(А) фосфо-EGFR, (В) фосфо-ErbB2, (С) фосфо-IGFR и (D) общие EGFR. Столбцы в клетку = панитумумаб, пустые столбцы = E2-GS10-I1 (с ПЭГ), заштрихованные столбцы = E3-GS10-I1 (с ПЭГ). Фиг. 14. Вестерн-блот анализ клеток MCF7r по сравнению с родительскими клетками MCF7. Фиг. 15. Исследования опухолевых ксенотрансплантатов человека MCF7 (панель А) и MCF7r (панель В) у мышей "nude". Средний размер опухоли показан для обоих исследований, вычисленный исходя из 8 мышей на группу. Фиг. 16. Исследования опухолевого ксенотрансплантата человека GEO у бестимусных мышей. Фиг. 17. Исследования опухолевого ксенотрансплантата человека Н 292 у бестимусных мышей. Фиг. 18. Исследование образования колоний клетками Н 292 NSCLC: А. Репрезентативные данные показаны исходя из одной чашки. В. IC50 исходя из одного E/I-связующего на основе 10Fn3 показана отрезком прямой; характеризующим значения погрешности результата, вычисленные по измерениям в трех повторах. Фиг. 19. Исследование картирования эпитопа. Локализация связывания эпитопа для различных антител, связывающихся с EGFR, показана на панели А. Описание антител представлено в примере 18, в табл. 11. В левой колонке табл. 11 приведен номер для каждого антитела против EGFR, который коррелирует с пронумерованными антителами,показанными на панели А. На Панели В показано иллюстративное исследование картирования эпитопа,как описано в примере 18.-3 022415 Фиг. 20. DSC анализ E/I-связующего на основе 10Fn3, пэгилированного I1-GS10-E5, измеренный с использованием диапазона сканирования 15-95C при концентрации белка 1 мг/мл в PBS, с получением в результате измерения Тпл. 55,2C. Фиг. 21. Оценка E/I-связующих на основе 10Fn3 для ингибирования фосфорилирования AKT в клетках Н 292, как измерено с помощью ELISA. I1-GS10-Е 5-пегилированный был более эффективным, чем отдельно I1-пегилированный или отдельно Е 5-пегилированный для блокирования фосфорилирования AKT, стимулированного IGF1. Фиг. 22. Оценка E/I-связующих на основе 10Fn3 для ингибирования клеточной пролиферации в клетках Н 292. I1-GS10-E5-пэгилированный был более эффективным, чем отдельно I1 пэгилированный и отдельно Е 5-пэгилированный имел только слабые эффекты для ингибирования роста клеток Н 292. Исследования проводили в трех повторах. Показаны репрезентативные данные. Фиг. 23. Оценка E/I-связующих на основе 10Fn3 для ингибирования клеточной пролиферации в клетках RH41. I1-GS10-E5-пэгилированный был несколько более эффективным, чем отдельно I1 и отдельно Е 5-пэгилированный или панитумумаб (пунктирная линия) почти пэгилированный не оказывал действия для ингибирования роста клеток RH41. Исследования проводили в трех повторах. Показаны репрезентативные данные. Фиг. 24. Ингибирование лиганд-стимулированного пути передачи сигнала под действием связующих на основе 10Fn3 (пэгилированные). Действие E/I-связующего на основе 10Fn3 (I1-GS10-E5 пэгилированный) на активацию рецепторов и клеточный путь передачи сигнала в клетках DiFi (панель А),Н 292 (панель В) или ВхРС 3 (панель С). Клетки находились в бессывороточной среде и были обработаны в течение 2 ч 1 мкМ связующих на основе 10Fn3 перед стимуляцией либо EGF, IGF1 либо сочетанием EGF + IGF1. GAPDH зондировали для иллюстрации равной нагрузки во всех дорожках. Фиг. 25. Ингибирование лиганд-стимулированного пути передачи сигнала в клетках Н 292 под действием связующих на основе 10Fn3 (непэгилированные). Действие E/I-связующего на основе 10Fn3(E2-GS10-I1) на активацию рецептора и клеточный путь передачи сигнала в клетках Н 292. Клетки находились в бессывороточной среде и были обработаны в течение 2 ч 1 мкМ связующих на основе 10Fn3 перед стимуляцией либо EGF, IGF1 либо сочетанием EGF + IGF1. GAPDH зондировали для иллюстрации равной нагрузки во всех дорожках Фиг. 26. Исследование конкурентного связывания с E/I-связующими на основе 10Fn3:A. EGFR связующее на основе 10Fn3 не конкурирует за связывание EGFR антител с EGFR. Первоначальное введение EGFR связующего на основе 10Fn3 показывает связывание с EGFR на поверхности чипа. Второе введение EGFR связующего на основе 10Fn3, смешанного с равным количеством цетуксимаба, панитумумаба или нимотузумаба, не показывает конкуренции за связывание антител с EGFREGFR связующим на основе 10Fn3. В. E/I-связующее на основе 10Fn3 может связываться одновременно с EGFR IGF-IR. Первоначальное введение E/I-связующего на основе 10Fn3 показывает связывание с EGFR, иммобилизованным на поверхности чипа. Второе введение E/I-связующего на основе 10Fn3 расторимого IGF-IR показывает связывание sIGF-IR с другим концом иммобилизованного E/I-связующего на основе 10Fn3. Фиг. 27. Плазменные уровни TGF через 4 ч после последнего введения в исследованиях ксенотрансплантата. Образцы плазмы брали в конце обработки из исследований ксенотрансплантатов ВхРС 3 (панель A), GEO (панель В) и Н 441 (панель С), описанных в табл. 24, анализировали на циркулирующие уровни TGF. Фиг. 28. Плазменные уровни TGF и IGF1 у бестимусных мышей, не несущих опухоли, после введения дозы пэгилированного I1-GS10-E5. Мышам, не несущим опухоли, вводили однократную дозу пэгилированного I1-GS10-E5 связующего на основе 10Fn3 и анализировали на циркулирующие уровни, либо вводили дозы три раза в неделю связующих на основе 10Fn3, составленных в композицию в PBS с индивидуальными конструкциями, как описано на фигуре, или дозу вводили каждые три дня внутрибрюшинном с панитумумабом в концентрации 1 мг/мышь или 0,1 мг/мышь. Фактические дозы связующих на основе 10Fn3 и панитумамаба показаны по оси X с дозами панитумумаба, наиболее близкими к оси X ниже треугольников, показывающих дозы связующих на основе 10Fn3. Фиг. 29 А показывает измерения до 43 дня. Фиг. 29 В показывает измерения до 27 дня. Фиг. 30. Профиль фармакокинетических параметров пэгилированного E2-GS10-I1 у мышей. Фиг. 31. Сравнение периода полужизни при 100 и 10 мг/кг внутрибрюшинно и 10 и 64 мг/кг подкожно у различных E/I-связующих на основе 10Fn3. Фиг. 32. Противоопухолевая эффективность пэгилированного E2-GS10-I1 в модели RH41. Фиг. 33. Измерение фармакокинетических конечных точек в опухолях. В конце обработки опухоли удаляли через 4 ч после конечной дозы из модели ксенотрансплантатаDiFi (панель А) и модели ксенотрансплантата Н 292 (панель В) и исследовали на уровни фосфо-EGFR,фосфо-IGFR, общих EGFR и общих IGFR. Равные количества суммарного белкового лизата нагружали на каждую дорожку гелей и блоты также зондировали с использованием GAPDH для демонстрации равной нагрузки по всем дорожкам. Фиг. 34. Последовательность анти-EGFR связующего 679F09 (SEQ ID NO: 490). Остатки петли, которые варьировали, подчеркнуты. Фиг. 35. Анализ последовательности петли ВС I. Частота встречаемости аминокислот в каждом положении в петле ВС из EGFR-связывающих последовательностей. Изображение получено с использованием WebLogo (Crooks G.E., Hon G., ChandoniaJ.M., Brenner S.E. WebLogo: A sequence logo generator. Genome Research, 14:1188-1190, 2004). Фиг. 36. Анализ последовательности петли DE 1. Частота встречаемости аминокислот в каждом положении в петле DE из EGFR-связывающих последовательностей (проанализировано 263 уникальных последовательностей петли DE). Фиг. 37. Петля FG (длина 10 аминокислот), анализ последовательности I. Частота встречаемости аминокислот в каждом положении в петле FG из EGFR-связывающих последовательностей с FG петлями длиной 10 аминокислот (проанализировано 228 уникальных петельFG длиной 10 аминокислот). Фиг. 38. Петля FG (длина 15 аминокислот), анализ последовательности I. Частота встречаемости аминокислот в каждом положении в петле FG из EGFR-связывающих последовательностей с FG петлями длиной 15 аминокислот (проанализировано 349 уникальных петельFG длиной 15 аминокислот). Фиг. 39. Анализ последовательности петли ВС II. Частота встречаемости аминокислот в каждом положении в ВС петле из всех "эффективных" последовательностей (проанализировано 85 уникальных последовательностей петли ВС). Фиг. 40. Анализ последовательности петли DE II. Частота встречаемости аминокислот в каждом положении в DE петле из всех "эффективных" последовательностей (проанализировано 60 уникальных последовательностей петли DE). Фиг. 41. Петля FG (длиной 10 аминокислот) анализ последовательности II. Частота встречаемости аминокислот в каждом положении в FG петле из всех "эффективных" последовательностей с петлями FG длиной 10 аминокислот (проанализировано 6 уникальных петель FG длиной 10 аминокислот). Фиг. 42. Петля FG (длиной 15 аминокислот), анализ последовательности II. Частота встречаемости аминокислот в каждом положении в FG петле из всех "эффективных" последовательностей с петлями FG длиной 15 аминокислот (проанализировано 65 уникальных петель FG длиной 15 аминокислот). Фиг. 43. В таблице суммированы различные характеристики E/I-связующих на основе 10Fn3, описанных в примере 22. Фиг. 44. В Таблице суммированы различные фармакокинетические параметры E/I-связующих на основе 10Fn3, как описано в примере 30. Фиг. 45. Аминокислотные последовательности Е мономеров, как описано в примере 32. Подчеркнуты петли ВС, DE и FG в каждой последовательности. Фиг. 46. Выравнивание коровой последовательности дикого типа (аминокислоты 9-94 последовательности SEQ ID NO: 1) с ядром I1 (SEQ ID NO: 65), ядром E1 (SEQ ID NO: 66), ядром Е 2 (SEQ IDNO: 186) и ядром Е 112 (SEQ ID NO:199). Петли ВС, DE и FG в последовательностях дикого типа показаны жирным шрифтом и подчеркнуты. Аминокислотные остатки, фактически измененные по сравнению с диким типом для ядер I и Е, показаны жирным шрифтом и подчеркнуты. Фиг. 47. Последовательности нуклеиновых кислот мономеров Е и I. Если не указано иное, нуклеотидные последовательности кодируют мономер, имеющий N+10N-концевое удлинение, Ser хвост и his-метку. Фиг. 48. Последовательность нуклеиновой кислоты E/I-связующих на основе 10Fn3. Все нуклеотидные последовательности кодируют E/I-связующие на основе 10Fn3, имеющие N+10N-концевое удлинение на первом мономере в этой конструкции и Cys хвост и his-метку на втором мономере в конструкции. GS10 представляет собой SEQ ID NO: 11; GSGCGS8 представляет собой Подробное описание изобретения Определения. Используемые в контексте настоящего изобретения следующие термины и выражения будут иметь значения, представленные ниже. Если не определено иное, все технические и научные термины,используемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое является общепринятым для специалиста в данной области. Формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явным образом не следует иное. Термины "содержат" и "содержащий" используются исключительно в открытом смысле, означая,что могут быть включены дополнительные элементы. Термин "включающий" используется для обозначения "включающий, но не ограниченный"."Включающий" и "включающий, но не ограниченный" используются взаимозаменяемо. Термин "антителоподобный белок" относится к белку, не являющемуся иммуноглобулином, имеющему "иммуноглобулин-подобную складчатую структуру", т.е. содержит примерно 80-150 аминокислотных остатков, которые структурно организованы в набор бета или бета-подобных цепей, образующих бета слои, где бета или бета-подобные цепи соединены посредством лежащих между петлевых частей. Бета-слои образуют стабильное ядро антителоподобного белка, создавая две "поверхности",состоящие из петель, которые соединяют бета или бета-подобные цепи. Как описано в настоящем документе, эти петли могут быть изменены для создания специализированных лигандсвязывающих сайтов, и такие варианты могут быть получены без нарушения общей стабильности белка. Примером такого антителоподобного белка является "каркасный белок на основе фибронектина", под которым подразумевается полипептид, основанный на домене фибронектина III типа (Fn3). В одном аспекте антителоподобный белок основан на десятом домене фибронектина III типа (10Fn3). Под "полипептидом" подразумевается любая последовательность из двух или более аминокислот,независимо от длины, посттрансляционной модификации или функции. "Полипептид", "пептид" и "белок" в настоящем описании используются взаимозаменяемо."Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей" в настоящем описании определяется как процент аминокислотных остатков в рассматриваемой последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в выбранной последовательности, после выравнивания последовательностей и выделения разрывов, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривая какие-либо консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может достигаться различными путями, которые находятся в компетенции специалиста в данной области, например используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, такое как BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, или программное обеспечение Megalign(DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для определения выравнивания, в том числе любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Для целей настоящего изобретения,однако, значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают, как описано ниже,используя компьютерную программу сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была разработана Genentech, Inc. и была подана с документацией для пользователей в Бюро регистрации авторских прав США, Washington D.C., 20559,где авторские права зарегистрированы под регистрационным номером TXU510087, и является общедоступной через Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Программа ALIGN-2 должна быть составлена для использования на операционной системе UNIX, предпочтительно цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и не изменяются. Для целей настоящего изобретения % идентичности аминокислотных последовательностей заданной аминокислотной последовательности А в отношении, с или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью В (которая альтернативно может быть выражена как заданная аминокислотная последовательность А, которая имеет или содержит определенный % идентичности аминокислотной последовательности в отношении, с или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью В), вычисляют следующим образом: 100X/Y, где X представляет собой число аминокислотных остатков, рассчитанное как идентичные соответствия по данным программы выравнивания последовательностей ALIGN-2 в программном выравнивании А и В; и Y представляет собой суммарное число аминокислотных остатков в В. Будет понятно, что где длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, % идентичности аминокислотной последовательности А по отношению к В не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности В по отношению к А. Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству лекарственного средства, эффективного для лечения заболевания или нарушения у млекопитающего. В случае злокачественного заболевания терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшать число злокачественных клеток; уменьшать размер опухоли; ингибировать (т.е. замедлять до неко-6 022415 торой степени и предпочтительно останавливать) инфильтрацию злокачественных клеток в периферические органы; ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) метастазирование опухолей; ингибировать до некоторой степени рост опухоли и/или облегчать до некоторой степени один или более симптомов, связанных с этим нарушением. Степень, до которой лекарственное средство может предотвращать рост и/или уничтожать существующие злокачественные клетки, может быть цитостатической и/или цитотоксической. Для лечения злокачественного заболевания эффективность in vivo может, например, быть измерена путем оценки времени до прогрессирования заболевания (ТТР) и/или определения скорости ответной реакции (RR). Период полужизни аминокислотной последовательности или соединения может в основном определяться как время, за которое сывороточная концентрация полипептида уменьшается на 50% in vivo вследствие, например, разрушения последовательности или соединения и/или выведения или секвестрации последовательности или соединения природными механизмами. Период полужизни может быть определен любым способом, известным из уровня техники, например с помощью фармакокинетического анализа. См., например, М. GibaldiD. Perron "Pharmacokinetics", опубл. Marcel Dekker, 2nd Rev.EGFR-связывающий домен и отличный от него IGFIR связывающий домен. Два домена могут быть соединены ковалентно или нековалентно. Приводимым в качестве примера E/I-связующим является антителоподобный димер, содержащий EGFR-связывающий 10Fn3 и IGFIR связывающий 10Fn3, т.е.E/I-связующее на основе 10Fn3. Обзор. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и рецептор инсулиноподобного фактора роста(IFGR) играют ключевые роли в генезе опухолей нескольких типов злокачественных опухолей человека. Ингибирование любого рецептора эффективно уменьшает опухолевый рост в доклинических моделях, а также клинически. Блокирование каскада реакций EGFR индуцирует переключение на каскад реакций IGFR для направления роста с моделями опухолей in vitro. Следовательно, блокирование обоих рецепторов одновременно может достигать более высокой эффективности для лучшего блокирования любого отдельно взятого каскада реакций путем преодоления переключения каскадов реакций. В приводимых в качестве примера вариантах осуществления изобретения активность E/I-связующего является синергетической по сравнению с мономерными компонентами E/I-связующего. В описании настоящего изобретения описываются, inter alia, биспецифичные молекулы, которые связывают EGFR и IGFIR, называемые в настоящем изобретении "E/I-связующими". Заявители обнаружили, что такие биспецифичные молекулы ингибируют пролиферацию злокачественной модели клеточной линии с большей эффективностью, чем соответствующие моноспецифичные связующие (см.,например, пример 9 и фиг. 8).E/I-связующие будут использоваться во многих терапевтических применениях, в частности, при лечении злокачественного заболевания. Помимо терапевтических применений, E/I-связующие могут быть использованы при любых обстоятельствах, при которых желательно выявление EGFR и/илиE/I-связующие имеют EGFR-связывающий домен и отличный от него IGFIR связывающий домен. Характерные связывающие домены включают антитела; следовательно, биспецифичные антитела могут быть получены для функционирования в качестве E/I-связующих. Биспецифичные антитела, содержащие комплементарные пары VH и VL областей, известны в уровне техники. Эти биспецифичные антитела содержат две пары VH и VL, каждая VH/L пара, связывающая один антиген. (См., например, Huet al., Cancer Res. 1996, 56:3055-306; Neri et al., J. Mol. Biol. 1995, 246:367-373; Atwell et al., Mol. Immunol. 1996, 33:1301-1312 и Carter et al., Protein Sci. 1997, 6:781-788). Приводимым в качестве примера биспецифичным антителом является диатело, т.е. небольшой фрагмент антитела с двумя антигенсвязывающими сайтами, эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, соединенный с вариабельным доменом легкой цепи в той же полипептидной цепи (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.E/I-связующие также охватывают димеры лигандсвязывающих каркасных белков. Каркасные белки хорошо описаны в литературе и включают, например, тендамистат, аффитело, домен фибронектинаIII типа, антикалин, тетранектин и анкирин. Дополнительные каркасные белки, которые могут быть использованы для получения E/I-связующих, описаны в обзоре Binz et al., Nature Biotech., 23:1257-1268(2005). Каркасные белки основаны на ригидной ядерной структуре или "каркасе", который является важным для определения и стабилизации трехмерной структуры. Между фиксированными или консервативными остатками каркаса лежат вариабельные области, такие как петли, поверхности или полости,которые могут быть рандомизированы для изменения лигандного связывания. Огромное расхождение аминокислот представлено в вариабельных областях между фиксированными остатками каркаса для обеспечения специфичного связывания с молекулой-мишенью. Приводимый в качестве примера лигандсвязывающий каркасный белок основан на домене фибронектина III типа (Fn3). Фибронектин представляет собой крупный белок, который играет самые глав-7 022415 ные роли в формировании внеклеточного матрикса и межклеточных взаимодействий; он состоит из многих повторов трех типов (типы I, II и III) небольших доменов.Fn3 является небольшим, мономерным, растворимым и стабильным. Он лишен дисульфидных связей и, следовательно, является стабильным в редуцирующих условиях. Общая структура 10Fn3 напоминает складчатость иммуноглобулина. 10Fn3 домены содержат в порядке от N-конца к С-концу бета или бета-подобную цепь, А; петлю, АВ; бета или бета-подобную цепь, В; петлю, ВС; бета или бетаподобную цепь, С; петлю, CD; бета или бета-подобную цепь, D; петлю, DE; бета или бета-подобную цепь, Е; петлю, EF; бета или бета-подобную цепь, F; петлю, FG и бета или бета-подобную цепь, G. Семь антипараллельных -цепей организованы в виде двух бета слоев, которые формируют стабильное ядро, образуя две "поверхности" состоящие из петель, которые соединяют бета или бета-подобные цепи. Петли АВ, CD и EF расположены на одной поверхности и петли ВС, DE и FG расположены на противоположной поверхности. Любая или все петли АВ, ВС, CD, DE, EF и FG могут принимать участие в связывании лиганда. Существует по меньшей мере 15 различных модулей 10Fn3, и, хотя гомология последовательностей между молекулами является низкой, они все имеют высокое сходство в третичной структуре. Аднектины (Adnexus, a Bristol-Myers Squibb RD Company) представляют собой лигандсвязывающие каркасные белки на основе десятого домена фибронектина III типа, т.е. десятого модуля 10Fn3(10Fn3). Аминокислотная последовательность природного 10Fn3 человека представлена в последовательности SEQ ID NO: 1. В последовательности SEQ ID NO:1 петля АВ соответствует остаткам 15-16, петля ВС соответствует остаткам 21-30, петля CD соответствует остаткам 39-45, петля DE соответствует остаткам 51-56,петля EF соответствует остаткам 60-66 и петля FG соответствует остаткам 76-87 (Xu et al., ChemistryBiology, 2002, 9:933-942). Петли ВС, DE и FG упорядочены вдоль одной стороны молекулы, а петли АВ, CD и EF упорядочены вдоль противоположной стороны молекулы. В последовательностиSEQ ID NO: 1 -цепь А соответствует остаткам 9-14, -цепь В соответствует остаткам 17-20, -цепь С соответствует остаткам 31-38, -цепь D соответствует остаткам 46-50, -цепь Е соответствует остаткам 57-59, -цепь F соответствует остаткам 67-75 и -цепь G соответствует остаткам 88-94. Цепи соединены друг с другом посредством соответствующей петли, например цепи А и В соединены через петлю АВ при образовании петли А, петли АВ, петли В и т.д. Остатки, вовлеченные в образование гидрофобного ядра ("аминокислотные остатки ядра"), включают аминокислоты, соответствующие следующим аминокислотами последовательности SEQ ID NO: 1: L8, V10, А 13, L18, 120, W22, Y32, 134, Y36, F48,V50, А 57, 159, L62, Y68, 170, V72, А 74, 188, 190 и Y92, где аминокислотные остатки ядра представлены однобуквенным кодом аминокислот, за которым следует положение, в котором они распложены в пределах последовательности SEQ ID NO: 1. См., например, Dickinson et al., J. Mol. Biol. 236:1079-1092(1994). Как описано выше, аминокислотные остатки, соответствующие остаткам 21-30, 51-56 и 76-87 последовательности SEQ ID NO: 1, описывают петли ВС, DE и FG соответственно. Однако должно быть понятно, что не каждый остаток в пределах области петли нуждается в модификации для достижения 10Fn3 связующим высокой аффинности в отношении желаемой мишени, такой как IGFIR или EGFR. Например, во многих примерах, описанных в настоящем документе, только остатки, соответствующие аминокислотам 23-30, 52-55 и 77-86 последовательности SEQ ID NO: 1, были модифицированы для получения высокой аффинности 10Fn3 связующих (см. фиг. 46). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления петля ВС может быть определена аминокислотами, соответствующими остаткам 2330 последовательности SEQ ID NO: 1, петля DE может быть определена аминокислотами, соответствующими остаткам 52-55 последовательности SEQ ID NO: 1, и петля FG может быть определена аминокислотами, соответствующими остаткам 77-86 последовательности SEQ ID NO: 1. 10Fn3 являются структурно и функционально аналогичными антителам, в особенности вариабельной области антитела. Хотя домены 10Fn3 могут быть описаны как "имитаторы антител" или "антителоподобные белки", они предлагают целый ряд преимуществ по сравнению с традиционными антителами. В частности, они проявляют лучшие свойства укладки и термостабильности по сравнению с антителами, и они лишены дисульфидных связей, которые, как известно, препятствуют должной укладке в определенных условиях. Приводимые в качестве примера E/I-связующие на основе 10Fn3, являются преимущественно мономерными с Тпл в среднем 50C. Петли ВС, DE и FG 10Fn3 являются аналогичными областям, определяющим комплементарность(CDR) из иммуноглобулинов. Изменение аминокислотной последовательности в этих петлевых областях меняет специфичность связывания 10Fn3. Белковые последовательности вне CDR-подобных петель являются аналогичными каркасным областям иммуноглобулинов и играют роль в структурной кон-8 022415 формации 10Fn3. Изменения в областях, подобных каркасным 10Fn3 являются позволительными до степени, в которой структурная конформация не изменяется так, чтобы нарушать связывание с лигандом. Способы для получения 10Fn3 лиганд специфичных связующих были описаны в публикациях РСТWO 00/034787, WO 01/64942, и WO 02/032925, описывающих TNF связующие высокой аффинности,публикации РСТ WO 2008/097497, описывающей VEGFR2 связующие с высокой аффинностью и публикации РСТ WO 2008/066752, описывающей IGFIR связующие высокой аффинности. Дополнительные ссылки, рассматривающие 10Fn3 связующие и способы отбора связующих, включают публикации РСТ WO 98/056915, WO 02/081497, WO 2008/031098 и публикацию США 2003186385. Антителоподобные белки на основе 10Fn3 каркаса могут быть определены в основном последовательностью: где n представляет собой целое число от 1 до 20, о представляет собой целое число от 1 до 20 и р представляет собой целое число от 1 до 40. Петли ВС, DE и FG представлены (Х)n, (Х)o и (Х)р соответственно. 10Fn3 в основном начинается аминокислотным остатком, соответствующим номеру 1 последовательности SEQ ID NO: 1. Однако домены с аминокислотными делециями также охватываются настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки, соответствующие первым восьми аминокислотам последовательности SEQ ID NO: 1, делетированы. Дополнительные последовательности также могут быть добавлены к N- или С-концу. Например, дополнительная последовательность MG может быть расположена на N-конце 10Fn3. М обычно будет отщепляться, оставляяG на N-конце. В некоторых вариантах осуществления последовательности могут быть расположены на С-конце домена 10Fn3, например EIDKPSQ (SEQ ID NO: 9), EIDKPCQ (SEQ ID NO: 10), EGSGS(SEQ ID NO: 96) или EGSGC (SEQ ID NO: 97). Последовательности 10Fn3, не связывающие лиганд, т.е. " 10Fn3 каркас", могут быть изменены при условии, что 10Fn3 сохраняет лигандсвязывающую функцию и/или структурную стабильность. В некоторых вариантах осуществления один или более из Asp 7, Glu 9 и Asp 23 замещены другой аминокислотой, как, например, остаток неотрицательно заряженной аминокислоты (например, Asn, Lys и т.д.). Сообщалось, что эти мутации обладают действием вызывать большую стабильность мутантного 10Fn3 при нейтральном рН по сравнению с формой дикого типа (см. публикацию РСТ WO 02/04523). Был описан целый ряд дополнительных изменений в 10Fn3 каркасе, которые являются либо благоприятными, либо нейтральными. См., например, Baton et al., Protein Eng. 2002, 15(12):1015-20; Koide et al., Biochemistry, 2001, 40(34): 10326-33.Fn3 каркас может быть модифицирован путем одной или более консервативных замен. Не менее 5, 10, 20 или даже 30 или более аминокислот в 10Fn3 каркасе может быть изменено посредством консервативнойз замены без существенного изменения аффинности 10Fn3 в отношении лиганда. Например,модификация каркаса предпочтительно снижает аффинность связывания 10Fn3 связующего в отношении лиганда менее чем в 100, 50, 25, 10, 5 или 2 раза. Может быть, что такие изменения будут менять иммуногенность 10Fn3 in vivo, где иммуногенность снижена, такие изменения могут быть желательны. Используемые в настоящем описании "консервативные замены" представляют собой остатки, которые физически или функционально сходны с соответствующими эталонными остатками. То есть, консервативная замена и ее эталонный остаток имеют сходный размер, форму, электрический заряд, химические свойства, в том числе способность образовывать ковалентные или водородные связи или подобное. Предпочтительными консервативными заменами являются те, которые удовлетворяют критериям, определенным для принятой точковой мутации у Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure,5:345-352 (1978Supp.). Примеры консервативных замен представляют собой замены в следующих группах: (а) валин, глицин; (b) глицин, аланин; (с) валин, изолейцин, лейцин; (d) аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; (е) аспарагин, глутамин; (f) серин, треонин; (g) лизин, аргинин, метионин и(h) фенилаланин, тирозин. Е Связующие. В одном аспекте настоящее описание относится к антителоподобным белкам, содержащим EGFRсвязывающий 10Fn3 домен. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 может быть представлен как часть слитого белка или мультимера. Например, EGFR-связывающий 10Fn3 может быть ковалентно или нековалентно связан по меньшей мере со вторым 10Fn3 связывающим доменом. Второй 10Fn3 связывающий домен может связываться с EGFR или с другой мишенью. В приводимом в качестве примера варианте осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 может быть ковалентно или нековалентно связан с IGF-IR связывающим 10Fn3. В приводимых в качестве примера вариантах осуществления EGFR связывающие 10Fn3 белки,описанные в настоящем документе, связываются с EGFR с KD менее 500, 100, 50, 10, 1 нМ, 500, 100,100, 50 или 10 пМ.-9 022415 В приводимых в качестве примера вариантах осуществления ВС петля EGFR-связывающих 10Fn3 белков соответствует аминокислотам 23-30 последовательности SEQ ID NO: 1, DE петляEGFR-связывающих 10Fn3 белков соответствует аминокислотам 52-55 последовательностиSEQ ID NO: 1 и FG петля EGFR-связывающих 10Fn3 белков соответствует аминокислотам 77-86 последовательности SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3,содержащему ВС петлю, имеющую YQ в положениях, соответствующих аминокислотам 29 и 30 последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10FG петлю, которая распространяется в длину на пять аминокислот вследствие вставки пяти аминокислот между остатками, соответствующими аминокислотам 77-86 последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю, имеющую YQ в положениях, соответствующих аминокислотам 29 и 30 последовательности SEQ ID NO: 1, и DE петлю, имеющую V, I, L, М или А остаток в положении, соответствующем аминокислоте 54 последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю, имеющую YQ в положениях, соответствующих аминокислотам 29 и 30 последовательности SEQ ID NO: 1, DE петлю, имеющую V, I, L, М или А остаток в положении, соответствующем аминокислоте 54 последовательности SEQ ID NO: 1, и FG петлю, которая составляет в длину 15 аминокислот, например FG петлю, которая распространяется в длину на пять аминокислот вследствие вставки пяти аминокислот между остатками, соответствующими аминокислотам 77-86 последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю, имеющую YQ в положениях, соответствующих аминокислотам 29 и 30 последовательности SEQ ID NO: 1 и FG петлю, содержащую D или N в положении, соответствующем аминокислоте 77 последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю, имеющую YQ в положениях, соответствующих аминокислотам 29 и 30 последовательности SEQ ID NO: 1, и FG петлю, которая (i) составляет в длину 15 аминокислот, например FG петлю, которая распространяется в длину на пять аминокислот вследствие вставки пяти аминокислот между остатками, соответствующим аминокислотам 77-86 последовательности SEQ ID NO: 1 иSEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему DE петлю, содержащую V, I, L, М или А остаток в положении, соответствующем аминокислоте 54 последовательности SEQ ID NO: 1 и FG петлю, содержащую D или N в положении,соответствующем аминокислоте 77 последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему DE петлю, содержащую V, I, L, М или А остаток в положении, соответствующем аминокислоте 54 последовательности SEQ ID NO: 1 и FG петлю, которая (i) составляет в длину 15 аминокислот, например FG петлю, которая распространяется в длину на пять аминокислот вследствие вставки пяти аминокислот между остатками, соответствующими аминокислотам 77-86 последовательности SEQ ID NO: 1; и (ii) содержит D или N в положении, соответствующем аминокислоте 77 последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю, имеющую YQ в положениях, соответствующих аминокислотам 29 и 30 последовательности SEQ ID NO: 1, DE петлю, содержащую V, I, L, М или А остаток в положении, соответствующем аминокислоте 54 последовательности SEQ ID NO: 1, и FG петлю, содержащую D или N в положении, соответствующем аминокислоте 77 последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю, имеющую YQ в положениях, соответствующих аминокислотам 29 и 30 последовательности SEQ ID NO: 1, DE петлю, содержащую V, I, L, М или А остаток в положении, соответствующем аминокислоте 54 последовательности SEQ ID NO: 1, и FG петлю, которая (i) составляет в длину 15 аминокислот, например FG петлю, которая распространяется в длину на пять аминокислот вследствие вставки пяти аминокислот между остатками, соответствующими аминокислотам 77-86 последовательности SEQ ID NO: 1; и (ii) содержит D или N в положении, соответствующем аминокислоте 77 последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю, содержащую аминокислотную последовательность XXXXXXYQ, DE петлю, содержащую аминокислотную последовательность XX(V/I/L/M/A)X, и FG петлю, содержащую аминокислотную последовательность (D/N)Xn, где X представляет собой любую аминокислоту и n составляет 9-14 аминокислот. В приводимом в качестве примера варианте осуществления n составляет 14 аминокислот. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10SEQ ID NO: 1, содержащей аминокислотную последовательность XXXXXXYQ, DE петлю, соответствующую аминокислотам 52-55 последовательности SEQ ID NO: 1, содержащей аминокислотную последовательность XX(V/I/L/M/A)X, и FG петлю, соответствующую аминокислотам 77-86 последовательности SEQ ID NO: 1, содержащей аминокислотную последовательность (D/N)Xn, где X представляет собой любую аминокислоту и n составляет 9-14 аминокислот. В приводимом в качестве примера варианте осуществления n составляет 14 аминокислот. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю, содержащую аминокислотную последовательность XXXXXXYQ,DE петлю, содержащую аминокислотную последовательность XX(V/I/L/M/A)X, и FG петлю, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из: где X представляет собой любую аминокислоту. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю, содержащую аминокислотную последовательность XXXXXXYQ,DE петлю, содержащую аминокислотную последовательность (G/Y/H)(D/M/G)(V/L/I)X, и FG петлю,содержащую аминокислотную последовательность где X представляет собой любую аминокислоту. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю, содержащую аминокислотную последовательность XXXXXXYQ, DE петлю, содержащую аминокислотную последовательность (G/Y/H)(D/M/G)(V/L/I)X, и FG петлю, содержащую аминокислотную последовательность где X представляет собой любую аминокислоту. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю, содержащую аминокислотную последовательность XXXXXXYQ, DE петлю, содержащую аминокислотную последовательность XX(V/I/L/M/A)X, и FG петлю, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из: где X представляет собой любую аминокислоту. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю, содержащую аминокислотную последовательность XXXXXXYQ, DE петлю, содержащую аминокислотную последовательность XX(V/I/L/M/A)X, и FG петлю, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из: где X представляет собой любую аминокислоту. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю, содержащую аминокислотную последовательность XXXXXXYQ,- 11022415DE петлю, содержащую аминокислотную последовательность XX(V/I/L/M/A)X, и FG петлю, содержащую аминокислотную последовательность где X представляет собой любую аминокислоту. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю, содержащую аминокислотную последовательность XXXXXXYQ,DE петлю, содержащую аминокислотную последовательность XX(V/I/L/M/A)X, и FG петлю, содержащую аминокислотную последовательность где X представляет собой любую аминокислоту. В различных вариантах осуществления DE петля EGFR связывающего 10Fn3 может содержать последовательность (G/Y/H)(D/M/G)(V/L/I)X. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10 где X представляет собой любую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит любую консенсусную последовательность, приведенную выше, при условии, что EGFR-связывающий 10Fn3 не содержит одну или несколько следующих последовательностей: В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3, содержащий одну из консенсусных последовательностей, приведенных выше, по меньшей мере на 40, 50, 60, 70, 75 или 80% идентичен SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления общая структура EGFR связывающего 10Fn3, содержащего одну из консенсусных последовательностей, приведенных выше, имеет сходство с характерной для иммуноглобулина укладкой цепи. В определенном варианте осуществления EGFRсвязывающий 10Fn3, содержащий одну из консенсусных последовательностей, приведенных выше, дополнительно содержит аминокислотные остатки ядра каркаса. В некоторых вариантах осуществленияEGFR-связывающий 10Fn3, содержащий одну из консенсусных последовательностей, приведенных выше, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичен любой последовательностиSEQ ID NO: 5-8, 52, 66-68, 106-108, 112-114, 140-142, 155-157, 170-172, 182, 185-187, 198-200 или 219327. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3, содержащий одну из консенсусных последовательностей, приведенных выше, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичен аминокислотной последовательности аминокислотных остатков, соответствующих от Е 9 последовательности SEQ ID NO: 1 до Т 94 последовательности SEQ ID NO: 1 любой из последовательностей SEQ ID NO: 5-8, 52, 66-68, 106-108, 112-114, 140-142, 155-157, 170-172, 182, 185-187, 198200 или 219-327. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3, содержащий одну из консенсусных последовательностей, приведенных выше, содержит 10Fn3 каркас, имеющий примерно от 0 до 20, от 0 до 15, от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2 или от 0 до 1 замен, консервативных замен, делеций или добавлений относительно аминокислотных остатков каркаса последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10 аминокислотах 77-86 любой из последовательностей SEQ ID NO: 219-327. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему ВС петлю,имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 21-30, DE петлю,имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56, и FG петлю,имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-87 любой из последовательностей SEQ ID NO: 219-327. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к EGFR связывающему 10Fn3, содержащему аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60, 75, 80, 85, 90, 95 или 98% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 219327. В одном варианте осуществления представлен антителоподобный белок, содержащий десятый домен фибронектина III типа (10Fn3), который связывается с EGFR с KD менее 500 нМ и содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 21-30 последовательности SEQ ID NO: 5, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 5, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-92 последовательностиSEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю,имеющую аминокислотную последовательность XgDSGRGSYQXh (SEQ ID NO: 40), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность XiGPVHXj (SEQ ID NO: 42), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XkDHKPHADGPHTYHEXl (SEQ ID NO: 44); где Х представляет собой любую аминокислоту и g, h, i, j, k и l являются целыми числами, выбранными от 0 до 5. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWDSGRGSYQ (SEQ ID NO: 39), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PGPVHT (SEQ ID NO: 41), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательностьEGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95 или 100% идентичную SEQ ID NO: 5 или 6. В одном варианте осуществления представлен антителоподобный белок, содержащий десятый домен фибронектина III типа (10Fn3), который связывается с EGFR с KD менее 500 нМ и содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 21-30 последовательности SEQ ID NO: 7, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 7, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-87 последовательностиSEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю,имеющую аминокислотную последовательность XmVAGAEDYQXn (SEQ ID NO: 34), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность XoHDLVXP (SEQ ID NO: 36), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XqDMMHVEYTEHXr (SEQ ID NO: 38); где Х представляет собой любую аминокислоту и m, n, о, р, q и r являются целыми числами, независимо выбранными от 0 до 5. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWVAGAEDYQ (SEQ ID NO: 33), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PHDLVT (SEQ ID NO: 35), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDMMHVEYTEHP (SEQ ID NO: 37). В некоторых вариантах осуществленияEGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 7 или 8. В одном варианте осуществления представлен антителоподобный белок, содержащий десятый домен фибронектина III типа (10Fn3), который связывается с EGFR с KD менее 500 нМ и содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 23-30 последовательности SEQ ID NO: 82, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-55 последовательности SEQ ID NO: 82, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-86 последовательностиSEQ ID NO: 82. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю,имеющую аминокислотную последовательность XsLPGKLRYQXt (SEQ ID NO: 60), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность XuHDLRXw (SEQ ID NO: 62), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XyNMMHVEYSEYXz (SEQ ID NO: 64); где Х представляет собой любую аминокислоту и s, t, u, w, у и z являются целыми числами независимо выбранными от 0 до 5. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность LPGKLRYQ (остатки 3-13 последовательности SEQ ID NO: 59), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PHDLR (остатки 1-5 последовательностиSEQ ID NO: 61), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TNMMHVEYSEY (остатки 1-11 последовательности SEQ ID NO: 63). В некоторых вариантах осуществленияEGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 52 или 82. В одном варианте осуществления представлен антителоподобный белок, содержащий десятый домен фибронектина III типа (10Fn3), который связывается с EGFR с KD менее 500 нМ и содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 23-30 последовательности SEQ ID NO: 106, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-55 последовательности SEQ ID NO: 106, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-86 последовательностиSEQ ID NO: 106. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XgHERDGSRQXh (SEQ ID NO: 134), DE петлю,имеющую аминокислотную последовательность XiGGVRXj (SEQ ID NO: 135), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XkDYFNPTTHEYIYQTTXl (SEQ ID NO: 136); где Х представляет собой любую аминокислоту и g, h, i, j, k и l являются целыми числами независимо выбранными от 0 до 5. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWHERDGSRQ (SEQ ID NO: 109), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PGGVRT (SEQ ID NO: 110), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDYFNPTTHEYIYQTTP (SEQ ID NO: 111). В некоторых вариантах осуществленияEGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95 или 100% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 106-108. В одном варианте осуществления представлен антителоподобный белок, содержащий десятый домен фибронектина III типа (10Fn3), который связывается с EGFR с KD менее 500 нМ и содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 23-30 последовательности SEQ ID NO: 112, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-55 последовательности SEQ ID NO: 112, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-86 последовательностиSEQ ID NO: 112. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XgWAPVDRYQXh (SEQ ID NO: 137), DE петлю,имеющую аминокислотную последовательность XiRDVYXj (SEQ ID NO: 138), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XkDYKPHADGPHTYHESXl (SEQ ID NO: 139); где Х представляет собой любую аминокислоту и g, h, i, j, k и l являются целыми числами независимо выбранными от 0 до 5. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWWAPVDRYQ (SEQ ID NO: 115), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PRDVYT (SEQ ID NO: 116), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDYKPHADGPHTYHESP (SEQ ID NO: 117). В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90,95 или 100% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 112-114. В одном варианте осуществления представлен антителоподобный белок, содержащий десятый домен фибронектина III типа (10Fn3), который связывается с EGFR с KD менее 500 нМ и содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 13-22 последовательности SEQ ID NO: 141, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 43-48 последовательности SEQ ID NO: 141, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 68-84 последовательностиSEQ ID NO: 141. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XgTQGSTHYQXh (SEQ ID NO: 146), DE петлю,имеющую аминокислотную последовательность XiGMVYXj (SEQ ID NO: 147), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XkDYFDRSTHEYKYRTTX1 (SEQ ID NO: 148); где Х представляет собой любую аминокислоту и g, h, i, j, k и l являются целыми числами независимо выбранными от 0 до 5. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWTQGSTHYQ (SEQ ID NO: 143), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PGMVYT (SEQ ID NO: 144), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDYFDRSTHEYKYRTTP (SEQ ID NO: 145). В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90,95 или 100% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 140-142. В одном варианте осуществления представлен антителоподобный белок, содержащий десятый домен фибронектина III типа (10Fn3), который связывается с EGFR с KD менее 500 нМ и содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 13-22 последовательности SEQ ID NO: 156, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 43-48 последовательности SEQ ID NO: 156, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 68-84 последовательностиSEQ ID NO: 156. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XgYWEGLPYQXh (SEQ ID NO: 161), DE петлю,имеющую аминокислотную последовательность XiRDVNXj (SEQ ID NO: 162), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XkDWYNPDTHEYIYHTIXl (SEQ ID NO: 163); где Х представляет собой любую аминокислоту и g, h, i, j, k и l являются целыми числами независимо выбранными от 0- 14022415 до 5. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWYWEGLPYQ (SEQ ID NO: 158), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PRDVNT (SEQ ID NO: 159), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDWYNPDTHEYIYHTIP (SEQ ID NO: 160). В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90,95 или 100% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 155-157. В одном варианте осуществления представлен антителоподобный белок, содержащий десятый домен фибронектина III типа (10Fn3), который связывается с EGFR с KD менее 500 нМ и содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 13-22 последовательности SEQ ID NO: 171, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 43-48 последовательности SEQ ID NO: 171, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 68-84 последовательностиSEQ ID NO: 171. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XgASNRGTYQXh (SEQ ID NO: 176), DE петлю,имеющую аминокислотную последовательность XiGGVSXj (SEQ ID NO: 177), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XkDAFNPTTHEYNYFTTX1 (SEQ ID NO: 178); где Х представляет собой любую аминокислоту и g, h, i, j, k и l являются целыми числами независимо выбранными от 0 до 5. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWASNRGTYQ (SEQ ID NO: 173), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PGGVST (SEQ ID NO: 174), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDAFNPTTHEYNYFTTP (SEQ ID NO: 175). В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90,95 или 100% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 170-172. В одном варианте осуществления представлен антителоподобный белок, содержащий десятый домен фибронектина III типа (10Fn3), который связывается с EGFR с KD менее 500 нМ и содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 13-22 последовательности SEQ ID NO: 186, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 43-48 последовательности SEQ ID NO: 186, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 68-84 последовательностиSEQ ID NO: 186. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XgDAPTSRYQXh (SEQ ID NO: 190), DE петлю,имеющую аминокислотную последовательность XiGGLSXj (SEQ ID NO: 191), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XkDYKPHADGPHTYHESX1 (SEQ ID NO: 139); где Х представляет собой любую аминокислоту и g, h, i, j, k и l являются целыми числами независимо выбранными от 0 до 5. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWDAPTSRYQ (SEQ ID NO: 188), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PGGLST (SEQ ID NO: 189), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDYKPHADGPHTYHESP (SEQ ID NO: 117). В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95 или 100% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 185-187. В одном варианте осуществления представлен антителоподобный белок, содержащий десятый домен фибронектина III типа (10Fn3), который связывается с EGFR с KD менее 500 нМ и содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 13-22 последовательности SEQ ID NO: 199, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 43-48 последовательности SEQ ID NO: 199, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 68-84 последовательностиSEQ ID NO: 199. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XgDAGAVTYQXh (SEQ ID NO: 203), DE петлю,имеющую аминокислотную последовательность XiGGVRXj (SEQ ID NO: 135), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XkDYKPHADGPHTYHEYX1 (SEQ ID NO: 204); где Х представляет собой любую аминокислоту и g, h, i, j, k и l являются целыми числами независимо выбранными от 0 до 5. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWDAGAVTYQ (SEQ ID NO: 201), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PGGVRT (SEQ ID NO: ПО), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDYKPHADGPHTYHEYP (SEQ ID NO: 202). В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95 или 100% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NOs: 198-200. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 домен ковалентно или нековалентно связан с EGF-IR связывающим 10Fn3 доменом. В приводимых в качестве примера вариантах осуществления IGF-IR связывающий 10Fn3 может содержать ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 21-30 последовательности SEQ ID NO: 3, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 по- 15022415 следовательности SEQ ID NO: 3, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-83 последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления IGF-IR связывающий 10Fn3 содержит ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательностьXcKNVYXd (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XeRFRDYQXf (SEQ ID NO: 50), где X представляет собой любую аминокислоту и а, b, с, d, e, f, g, h, i, j, k иl являются целыми числами независимо выбранными от 0 до 5 или где а равно 2 и b-f равны 1 или гдеa-f равны 0. В некоторых вариантах осуществления IGF-IR связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичную последовательностиSEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления IGF-IR связывающий 10Fn3 содержит 10Fn3 каркас, имеющий в любом месте от 0 до 20, от 0 до 15, от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2 или от 0 до 1 замен, консервативных замен, делеций или добавлений относительно каркасных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления IGF-IR связывающий 10Fn3 имеет в любом месте от 0 до 15, от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2 или от 0 до 1 замен, консервативных замен, делеций или добавлений относительно соответствующих петлевых последовтательностей SEQ ID NO: 3. 10Fn3 E/I-связующие. Один аспект настоящего описания относится к E/I-связующим, сконструированным из мультимеров антителоподобных белков. В некоторых вариантах осуществления мультимер антителоподобного белка содержит по меньшей мере один EGFR-связывающий 10Fn3, ковалентно или нековалентно связанный по меньшей мере с одним IGFIR-связывающим 10Fn3. В некоторых вариантах осуществленияE/I-связующие, описанные в настоящем документе, могут быть сконструированы в виде одной полипептидной цепи, где Е и I субъединицы могут быть в любой ориентации, например от N-конца к С-концу, в E-I ориентации или в I-Е ориентации. Настоящее описание относится, частично, к неожиданному открытию того, что многочисленные 10Fn3, соединенные через полипептидный линкер, правильно укладываются независимо друг от друга,сохраняют высокую аффинность связывания и что каждый из доменов сохраняет свои функциональные свойства (см., например, примеры 5-10). Дополнительно, эти E/I-связующие на основе 10Fn3 демонстрируют желаемые биофизические свойства, такие как низкая агрегация и высокая температура плавления (Тпл) (см., например, пример 4). Примеры характеризуют целый ряд E/I-связующих на основе 10Fn3. Приводимый в качестве примера IGFIR-связывающий 10Fn3 изложен в последовательностиSEQ ID NO: 4. приводимые в качестве примера EGFR-связывающие 10Fn3 изложены в последовательностях SEQ ID NO: 6, 8, 52, 107, 113, 140, 155, 170, 185 и 198. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее содержит EGFR-связывающий 10Fn3 иIGFIR связывающий 10Fn3, независимо имеющие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 40, 50, 60, 70 или 80% идентичную 10Fn3 домену человека, показанному в последовательностиSEQ ID NO: 1. Значительная часть вариабельности в основном будет встречаться в одной или более петлях. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее содержит EGFR-связывающий 10Fn3 иIGFIR-связывающий 10Fn3, независимо имеющие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 32, где n представляет собой целое число от 1-20, о представляет собой целое число от 1-20 и р представляет собой целое число от 1-40. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число от 8-12,о представляет собой целое число от 4-8 и р представляет собой целое число от 4-28. В некоторых вариантах осуществления n равно 10, о равно 6 и р равно 12. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании представлены мультимеры 10Fn3,имеющие по меньшей мере одну петлю, выбранную из петли ВС, DE, и FG с измененной аминокислотной последовательностью относительно последовательности соответствующей петли 10Fn3 человека. Под "измененной" подразумевается одно или более изменений аминокислотной последовательности относительно матричной последовательности (соответствующей домену фибронектина человека) и включает аминокислотные добавления, делеции и замены. Изменение аминокислотной последовательности может осуществляться посредством преднамеренного, слепого или спонтанного изменения последовательности, в основном кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты, и может происходить с помощью любой методики, например ПЦР, ПЦР пониженной точности или химического синтеза ДНК. В некоторых вариантах осуществления аминокислотную последовательность изменяют заменой или добавлением природных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления одна или более петель, выбранных из ВС, DE и FG, могут быть удлинены или укорочены по длине относительно соответствующей петли фибронектина человека. В частности, FG петля 10Fn3 человека составляет в длину 12 остатков, тогда как соответствующая петля в тяжелых цепях антитела находится в интервале от 4 до 28 остатков. Для оптимизации антигенного связывания, следовательно, FG петля 10Fn3 может быть изменена в длину, а также в последовательно- 16022415 сти для получения наиболее возможной гибкости и аффинности в связывании антигена. В некоторых вариантах получения молекул 10Fn3 измененная ВС петля имеет вплоть до 10 аминокислотных замен, вплоть до 9 аминокислотных делеций, вплоть до 10 аминокислотных вставок или комбинации замен и делеций или вставок. В некоторых вариантах осуществления измененная DE петля имеет вплоть до 6 аминокислотных замен, вплоть до 5 аминокислотных делеций, вплоть до 14 аминокислотных вставок или комбинацию замен и делеций или вставок. В некоторых вариантах осуществления FG петля имеет вплоть до 12 аминокислотных замен, вплоть до 11 аминокислотных делеций,вплоть до 28 аминокислотных вставок или комбинацию замен и делеций или вставок. Природный 10Fn3 содержит интегрин-связывающий мотив "аргинин-глицин-аспарагиновую кислоту" (RGD) в петле FG. Предпочтительные мультимеры 10Fn3 лишены RGD интегрин-связывающего мотива. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий а) EGFR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность,представленную в аминокислотах 21-30 последовательностиSEQ ID NO: 5, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 5, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-92 последовательности SEQ ID NO: 5; b)ковалентно или нековалентно связанный IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 21-30 последовательностиSEQ ID NO: 3, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 3, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-83 последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления IGFIR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность,по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичную последовательностям SEQ ID NO: 20, 21,23, 24, 90, 92, 101 или 103. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий а) EGFR-связывающий 10Fn3 содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность,представленную в аминокислотах 21-30 последовательностиSEQ ID NO: 7, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 7, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-87 последовательности SEQ ID NO: 7; ковалентно или нековалентно связанный с b) IGFIR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 21-30 последовательностиSEQ ID NO: 3, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 3, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-83 последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления IGFIR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100%) идентичную последовательностям SEQ ID NO: 26, 27, 29, 30, 89, 91,100 или 102. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий а) EGFR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность,представленную в аминокислотах 21-30 последовательностиSEQ ID NO: 82, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 82, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-87 последовательности SEQ ID NO: 82; ковалентно или нековалентно связанный с b) IGFIR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 21-30 последовательностиSEQ ID NO: 3, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 3, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-83 последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 82. В некоторых вариантах осуществления IGFIR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 53, 54, 87, 88, 98, 99,104 или 105. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий а) EGFR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность,представленную в аминокислотах 21-30 последовательностиSEQ ID NO: 106, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 106, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-92 последовательности SEQ ID NO: 106; ковалентно или нековалентно связанный с b) IGFIR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 21-30 последовательностиSEQ ID NO: 3, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 3, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-83 последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 106. В некоторых вариантах осуществления IGFIR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательностям SEQ ID NO: 118-125. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий а) EGFR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность,представленную в аминокислотах 21-30 последовательностиSEQ ID NO: 112, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 112, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-92 последовательности SEQ ID NO: 112; ковалентно или нековалентно связанный с b) IGFIR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 21-30 последовательностиSEQ ID NO: 3, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 3, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-83 последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 112. В некоторых вариантах осуществления IGFIR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность,по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательностям SEQ ID NO: 126-133. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий а) EGFR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 13-22 последовательности SEQ ID NO: 141,DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 43-48 последовательности SEQ ID NO: 141, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность,представленную в аминокислотах 68-84 последовательности SEQ ID NO: 141; ковалентно или нековалентно связанный с b) IGFIR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 21-30 последовательности SEQ ID NO: 3, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 3, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-83 последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 140, 141, 142 или 300. В некоторых вариантах осуществления IGFIR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность,по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательностям SEQ ID NO: 149-154. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий а) EGFR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 13-22 последовательности SEQ ID NO: 156,DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 43-48 последовательности SEQ ID NO: 156, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность,представленную в аминокислотах 68-84 последовательности SEQ ID NO: 156; ковалентно или нековалентно связанный с b) IGFIR-связывающим 10Fn3 содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 21-30 последовательности SEQ ID NO: 3, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 3, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-83 последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 155, 156, 157 или 305. В некоторых вариантах осуществления, IGFIR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность,по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательностям SEQ ID NO: 158-166. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий а) EGFR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность,представленную в аминокислотах 13-22 последовательностиSEQ ID NO: 171, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 43-48 последовательности SEQ ID NO: 171, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 68-84 последовательности SEQ ID NO: 171; ковалентно или нековалентно связанный с b) IGFIR-связывающим 10Fn3 содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 21-30 последовательностиSEQ ID NO: 3, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 3, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-83 последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 170, 171, 172 или 311. В некоторых вариантах осуществления IGFIR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ IDNO: 3. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательностям SEQ IDNO: 179-184. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий а) EGFR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность,представленную в аминокислотах 13-22 последовательностиSEQ ID NO: 186, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 43-48 последовательности SEQ ID NO: 186, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 68-84 последовательности SEQ ID NO: 186; ковалентно или нековалентно связанный с b) IGFIR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 21-30 последовательностиSEQ ID NO: 3, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 3, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-83 последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 185, 186, 187 или 320. В некоторых вариантах осуществления IGFIR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательностиSEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательностямSEQ ID NO: 192-197. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий а) EGFR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность,представленную в аминокислотах 13-22 последовательностиSEQ ID NO: 199, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 43-48 последовательности SEQ ID NO: 199, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 68-84 последовательности SEQ ID NO: 199; ковалентно или нековалентно связанный с b) IGFIR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 21-30 последовательностиSEQ ID NO: 3, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 51-56 последовательности SEQ ID NO: 3, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 76-83 последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 198, 199, 200 или 327. В некоторых вариантах осуществления IGFIR-связывающий 10Fn3 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательностиSEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 100% идентичную последовательностямSEQ ID NO: 205-210. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XaSARLKVAXb (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность XcKNVYXd (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XeRFRDYQXf (SEQ ID NO: 50); ковалентно или нековалентно связанный с EGFRсвязывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательностьXkDHKPHADGPHTYHEXl (SEQ ID NO: 44); где Х представляет собой любую аминокислоту и а, b, с, d,e, f, g, h, i, j, k и l являются целыми числами, независимо выбранными от 0 до 5. В некоторых вариантах осуществления a, g и l равны 2; b-f и i-k равны 1 и h равен 0. В некоторых вариантах осуществления а-l равны 0. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); ковалентно или нековалентно связанный EGFR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWDSGRGSYQ(SEQ ID NO: 39), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PGPVHT(SEQ ID NO: 41), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDHKPHADGPHTYHESP (SEQ ID NO: 43). В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XaSARLKVAXb (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность XcKNVYXd (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XeRFRDYQXf (SEQ ID NO: 50); ковалентно или нековалентно связанный сXqDMMHVEYTEHXr (SEQ ID NO: 38); где Х представляет собой любую аминокислоту и а, b, с, d, e, f,m, n, о, р, q и r являются целыми числами от 0 до 5, независимо. В некоторых вариантах осуществленияa и m равны 2; b-f и о-r равны 1 и n равно 0. В некоторых вариантах осуществления a-f и m-r равны 0. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); ковалентно или нековалентно связанный с EGFR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWVAGAEDYQ(SEQ ID NO: 33), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PHDLVT(SEQ ID NO: 35), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDMMHVEYTEHP(SEQ ID NO: 37). В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XaSARLKVAXb (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность XcKNVYXd (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XeRFRDYQXf (SEQ ID NO: 50); ковалентно или нековалентно связанный сXyNMMHVEYSEYXz (SEQ ID NO: 64); где X представляет собой любую аминокислоту и а, b, с, d, e, f,s, t, u, w, у и z являются целыми числами от 0 до 5, независимо. В некоторых вариантах осуществления а и s равны 2; b-f, u, w, у и z равны 1 и t равно 0. В некоторых вариантах осуществления a-f, s-u, w, у и z равны 0. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); ковалентно или нековалентно связанный с EGFR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWLPGKLRYQ(SEQ ID NO: 59), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PHDLRT(SEQ ID NO: 61), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TNMMHVEYSEYP(SEQ ID NO: 63). В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XaSARLKVAXb (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность XcKNVYXd (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XeRFRDYQXf (SEQ ID NO: 50); ковалентно или нековалентно связанный сXkDYFNPTTHEYIYQTTXi (SEQ ID NO: 136); где Х представляет собой любую аминокислоту и а-l являются целыми числами от 0 до 5, независимо. В некоторых вариантах осуществления а и g равны 2; bf и i-l равны 1 и h равен 0. В некоторых вариантах осуществления а-l равны 0. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); ковалентно или нековалентно связанный с EGFR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWHERDGSRQ(SEQ ID NO: 109), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PGGVRTTDYFNPTTHEYIYQTTP (SEQ ID NO: 111). В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XaSARLKVAXb (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность XcKNVYXd (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XeRFRDYQXf (SEQ ID NO: 50); ковалентно или нековалентно связанный сXiRDVYXj (SEQ ID NO: 138), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XkDYKPHADGPHTYHESX1 (SEQ ID NO: 139); где Х представляет собой любую аминокислоту и а-l являются целыми числами от 0 до 5, независимо. В некоторых вариантах осуществления а и g равны 2; b-f и i-l равны 1 и h равен 0. В некоторых вариантах осуществления а-l равны 0. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); ковалентно или нековалентно связанный с EGFR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWWAPVDRYQ(SEQ ID NO: 115), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PRDVYT(SEQ ID NO: 116), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDYKPHADGPHTYHESP (SEQ ID NO: 117). В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XaSARLKVAXb (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность XcKNVYXd (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XeRFRDYQXf (SEQ ID NO: 50); ковалентно или нековалентно связанный сXkDYFDRSTHEYKYRTTX1 (SEQ ID NO: 148); где Х представляет собой любую аминокислоту и а-l являются целыми числами от 0 до 5, независимо. В некоторых вариантах осуществления а и g равны 2;b-f и i-l равны 1 и h равен 0. В некоторых вариантах осуществления а-l равны 0. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); ковалентно или нековалентно связанный с EGFR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWTQGSTHYQ(SEQ ID NO: 143), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PGMVYT В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XaSARLKVAXb (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность XcKNVYXd (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XeRFRDYQXf (SEQ ID NO: 50); ковалентно или нековалентно связанный сXkDWYNPDTHEYIYHTIX1 (SEQ ID NO: 163); где Х представляет собой любую аминокислоту и а-l являются целыми числами от 0 до 5, независимо. В некоторых вариантах осуществления а и g равны 2;b-f и i-l равны 1 и h равен 0. В некоторых вариантах осуществления а-l равны 0. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); ковалентно или нековалентно связанный с EGFR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWYWEGLPYQ(SEQ ID NO: 158), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PRDVNTTDWYNPDTHEYIYHTIP (SEQ ID NO: 160). В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XaSARLKVAXb (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность XcKNVYXd (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XeRFRDYQXf (SEQ ID NO: 50); ковалентно или нековалентно связанный сXkDAFNPTTHEYNYFTTX1 (SEQ ID NO: 178); где Х представляет собой любую аминокислоту и а-l являются целыми числами от 0 до 5, независимо. В некоторых вариантах осуществления а и g равны 2;b-f и i-l равны 1 и h равен 0. В некоторых вариантах осуществления а-l равны 0. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); ковалентно или нековалентно связанный с EGFR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWASNRGTYQ(SEQ ID NO: 173), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PGGVSTTDAFNPTTHEYNYFTTP (SEQ ID NO: 175). В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность XaSARLKVAXb (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность XcKNVYXd (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XeRFRDYQXf (SEQ ID NO: 50); ковалентно или нековалентно связанный сXiGGLSXj (SEQ ID NO: 191), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XkDYKPHADGPHTYHESX1 (SEQ ID NO: 139); где Х представляет собой любую аминокислоту и а-l являются целыми числами от 0 до 5, независимо. В некоторых вариантах осуществления а и g равны 2; b-f и i-l равны 1 и h равен 0. В некоторых вариантах осуществления a-l равны 0. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); ковалентно или нековалентно связанный с EGFR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWDAPTSRYQ (SEQ ID NO: 188), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PGGLST (SEQ ID NO: 189), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDYKPHADGPHTYHESP (SEQ ID NO: 117). В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислот- 22022415 ную последовательность XaSARLKVAXb (SEQ ID NO: 46), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность XcKNVYXd (SEQ ID NO: 48), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XeRFRDYQXf (SEQ ID NO: 50); ковалентно или нековалентно связанный сXiGGVRXj (SEQ ID NO: 135), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность XkDYKPHADGPHTYHEYXl (SEQ ID NO: 204); где Х представляет собой любую аминокислоту и а-l являются целыми числами от 0 до 5, независимо. В некоторых вариантах осуществления а и g равны 2; b-f и i-l равны 1 и h равен 0. В некоторых вариантах осуществления а-l равны 0. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWSARLKVAR (SEQ ID NO: 45), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PKNVYT (SEQ ID NO: 47), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TRFRDYQP (SEQ ID NO: 49); ковалентно или нековалентно связанный с EGFR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность SWDAGAVTYQ(SEQ ID NO: 201), DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность PGGVRT(SEQ ID NO: 110), и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность TDYKPHADGPHTYHEYP (SEQ ID NO: 202). В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий а) IGFIR-связывающий 10Fn3, содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность,представленную в аминокислотах 23-29 последовательностиSEQ ID NO: 3, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 52-55 последовательности SEQ ID NO: 3, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 77-82 последовательности SEQ ID NO: 3; ковалентно или нековалентно связанный с b) EGFR-связывающим 10Fn3, содержащим ВС, DE и FG петлю, как изложено в любой из последовательностей SEQ ID NO: 219-327 (см., например, фиг. 45, на которой подчеркнуты последовательности петель ВС, DE и FG для каждого EGFR-связывающиего 10Fn3). В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее представляет собой димер антителоподобного белка, содержащий а) IGFIR-связывающий 10Fn3 содержащий ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность,представленную в аминокислотах 23-29 последовательности SEQ ID NO: 3, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 52-55 последовательностиSEQ ID NO: 3, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах 77-82 последовательности SEQ ID NO: 3; ковалентно или нековалентно связанный с b) EGFRсвязывающим 10Fn3, содержащим ВС петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах, соответствующих аминокислотным остаткам 23-30 последовательностиSEQ ID NO: 1 любой из последовательностей SEQ ID NO: 5-8, 52, 66-68, 106-108, 112-114, 140-142, 155157, 170-172, 182, 185-187, 198-200 или 219-327, DE петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах, соответствующих аминокислотным остаткам 52-55 последовательности SEQ ID NO: 1 любой из последовательностей SEQ ID NO: 5-8, 52, 66-68, 106-108, 112-114,140-142, 155-157, 170-172, 182, 185-187, 198-200 или 219-327, и FG петлю, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотах, соответствующих аминокислотным остаткам 77-86 последовательности SEQ ID NO: 15-8, 52, 66-68, 106-108, 112-114, 140-142, 155-157, 170-172, 182,185-187, 198-200 или 219-327. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 антителоподобного белкового димера содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 95 или 100% идентичную аминокислотной последовательности аминокислотных остатков, соответствующих от Е 9 последовательности SEQ ID NO: 1 до Т 94 последовательности SEQ ID NO: 1 любой из последовательностей SEQ ID NO: 5-8, 52, 66-68, 106-108, 112-114, 140-142, 155-157, 170-172, 182,185-187, 198-200 или 219-327. В некоторых вариантах осуществления IGFIR-связывающий 10Fn3 антителоподобного белкового димера имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80,90, 95, 98, 99 или 100% идентичную аминокислотной последовательности аминокислотных остатков,соответствующих с Е 9 последовательности SEQ ID NO: 1 по Т 94 последовательности SEQ ID NO: 1,последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления E/I-связующее содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 20-31, 53-58, 87-92, 98-105, 118-133, 149-154, 164-169, 179184, 192-197, 205-210 и 211-216. Предпочтительно X, как определено в настоящем описании, представляет собой природную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления E-связующие или Е и/или I мономеры E/I-связующих,описанных в настоящем документе, могут содержать аминокислотную замену Ser на Cys в положении,соответствующем серину 62 или серину 91 последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых аспектах в настоящем описании представлены короткие пептидные последовательности, которые опосредуют связывание EGFR. Примеры таких последовательностей включают аминокислотные остатки, которые соответствуют петлям ВС, DE и FG из последовательностей SEQ ID NO: 5,7, 82, 106, 112, 141, 156, 171, 186 и 199. Другие примеры таких последовательностей включают аминокислотные остатки, которые соответствуют петлям ВС, DE и FG из последовательностейSEQ ID NO: 219-327. В некоторых вариантах осуществления эти пептиды связываются с соответствующим им лигандом с константой диссоциации (KD) менее 500, 100, 50, 5 нМ или менее. Такие последовательности могут опосредовать лигандное связывание в изолированной форме или при включении в конкретную белковую структуру, такую как иммуноглобулин или иммуноглобулин-подобный домен. В одном варианте осуществления димер антителоподобного белка содержит полипептид, имеющий структуру А-В-С, где А представляет собой полипептид, по существу состоящий из или состоящий из 10Fn3 домена, который связывается с EGFR, В представляет собой полипептидный линкер и С представляет собой полипептид, по существу состоящий из или состоящий из 10Fn3 домена, который связывается с IGF-IR. В другом варианте осуществления димер антителоподобного белка содержит полипептид, имеющий структуру А-В-С, где А представляет собой полипептид, по существу состоящий из или состоящий из 10Fn3 домена, который связывается с IGF-IR, В представляет собой полипептидный линкер, и С представляет собой полипептид, по существу состоящий из или состоящий из 10Fn3 домена, который связывается с EGFR. Конкретными примерами димеров антителоподобного белка,имеющих структуру А-В-С, являются полипептиды, содержащие (i) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную в одной из последовательностей SEQ ID NO: 20-31, 53-58, 8792, 98-105, 118-133, 149-154, 164-169, 179-184, 192-197, 205-210 и 211-216; или (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную любой из аминокислотных последовательностей, изложенных в SEQ ID NO: 20-31, 53-58, 87-92,98-105, 118-133, 149-154, 164-169, 179-184, 192-197, 205-210 и 211-216. В некоторых вариантах осуществления А или С область представляет собой полипептид, содержащий 10Fn3 домен, который связывается с EGFR; где 10Fn3 домен имеет структуру от N-конца к Сконцу: -цепь А, петля АВ, -цепь В, петля ВС, -цепь С, петля CD, -цепь D, петля DE, -цепь Е, петля EF, -цепь F, петля FG, -цепь G; где (i) ВС петля имеет аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 33 или 34, DE петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или 36 иFG петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37 или 38; (ii) ВС петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39 или 40, DE петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41 или 42 и FG петля имеет аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 43 или 44; (iii) ВС петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59 или 60, DE петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61 или 62 и FG петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63 или 64; (iv) ВС петля имеет аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 109 или 134, DE петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110 или 135 и FG петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 111 или 136; (v) ВС петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115 или 137, DE петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116 или 138 и FG петля имеет аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 117 или 139; (vi) ВС петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143 или 146, DE петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144 или 147 и FG петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145 или 148; (vii) ВС петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 158 или 161, DE петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 159 или 162 и FG петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160 или 163; (viii) ВС петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173 или 176, DE петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174 или 177 и FG петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 175 или 178; (ix) ВС петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 188 или 190, DE петля имеет аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 189 или 191 и FG петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117 или 139; (х) ВС петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 201 или 203, DE петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110 или 135 и FG петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 202 или 204 или (xi) петли ВС, DE и FG имеют аминокислотные последовательности, как изложено в любой из последовательностей SEQ ID NO: 219-327 (см., например,фиг. 45, на которой подчеркнуты петли ВС, DE и FG для каждой последовательности SEQ ID NO: 219327); где 10Fn3 домен укладывается в структуру, подобную вариабельной области тяжелой цепи антитела; и где указанный полипептид связывается с EGFR с KD менее 100 нМ. Домен 10Fn3, который связывается с EGFR, предпочтительно укладывается в структуру, где 7 -цепей распределены между двумя -слоями, которые группируются между собой, образуя стабильное ядро, и где -цепи соединены шестью петлями, которые являются гидрофильными. В приводимых в качестве примера вариантах осуществления домен 10Fn3 в длину составляет от 80 до 150 аминокислот. В приводимых в качестве примера вариантах осуществления А или С область представляет собой домен 10Fn3, который связывается с EGFR с KD менее 100 нМ, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 83-85 и 466-472, как изложено ниже. В последовательностях SEQ ID NO: 83-85 и 466-472 петли ВС, DE и FG имеют фиксированную последовательность, как показано жирным шрифтом, или последовательность, по меньшей мере на 75,80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную последовательностям, показанным жирным шрифтом, АВ петля представлена Xn1, CD представлена Xn2 и EF петля представлена Xn3 и -цепи A-G подчеркнуты.X представляет любую аминокислоту и индекс после X представляет целое число количества аминокислот. В частности, n1 может находиться в любом месте от 1-15, 2-15, 1-10, 2-10, 1-8, 2-8, 1-5, 2-5, 1-4,2-4, 1-3, 2-3 или 1-2 аминокислот; n2 и n3 каждый независимо может находиться в любом месте от 2-20,2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7 или 6-7 аминокислот и a1-а 6 может каждый независимо содержать от 0-10, 0-5, 1-10, 1-5 или 2-5 аминокислот. В предпочтительных вариантах осуществления n1 составляет 2 аминокислоты, n2 составляет 7 аминокислот, n3 составляет 7 аминокислот и a1-а 6 составляет 0 аминокислот. Последовательности -цепей могут иметь где-то от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2 или от 0 до 1 замен, делеций или добавлений по всем 7 каркасным областям, относительно соответствующих аминокислот, показанных в последовательностиSEQ ID NO: 1. В приводимом в качестве примера варианте осуществления последовательности -цепей могут иметь от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2 или от 0 до 1 консервативных аминокислотных замен по всем 7 каркасным областям относительно соответствующих аминокислот, показанных в последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки ядра являются фиксированными и любые замены, консервативные замены,делеции или добавления встречаются в остатках, отличных от аминокислотных остатков ядра. В некоторых вариантах осуществления EGFR связующее представлено одной из следующих аминокислотных последовательностей: В SEQ ID NO: 66-68, 108, 114, 141, 156, 171, 186 и 199 последовательность петель ВС, DE и FG имеет фиксированную последовательность, как показано жирным шрифтом, или последовательность,по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную последовательностям, показанным жирным шрифтом, и оставшаяся последовательность, которая подчеркнута (например, последовательность 7 -цепей и петли АВ, CD и EF), имеет в любом месте от 0 до 20, от 0 до 15, от 0 до 10, от 0 до 8,от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2 или от 0 до 1 замен, консервативных замен, делеций или добавлений относительно соответствующих аминокислот, показанных в SEQ ID NO: 66-68, 108,114, 141, 156, 171, 186 и 199. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки ядра являются фиксированными и любые замены, консервативные замены, делеции или добавления встречаются в остатках, отличных от аминокислотных остатков ядра. Домен 10Fn3, который связывается сEGFR, может необязательно содержать N-концевое удлинение длиной от 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4,1-3, 1-2 или 1 аминокислоту. Приводимые в качестве примера N-концевые удлинения включают (представлено однобуквенным кодом аминокислот) М, MG, G, MGVSDVPRDL (SEQ ID NO: 69),GVSDVPRDL (SEQ ID NO: 70) и VSDVPRDL (SEQ ID NO: 71) или N-концевые усечения любой из последовательностей SEQ ID NO: 69, 70 или 71. Другие подходящие N-концевые удлинения включают,например, XnSDVPRDL (SEQ ID NO: 72), XnDVPRDL (SEQ ID NO: 73), XnVPRDL (SEQ ID NO: 74),XnPRDL (SEQ ID NO: 75), XnRDL (SEQ ID NO: 76), XnDL (SEQ ID NO: 77) или XnL, где n = 0, 1 или 2 аминокислоты, где в тех случаях, когда n=1, X представляет собой Met или Gly, и в тех случаях, когдаn=2, X представляет собой Met-Gly. 10Fn3 домен, который связывается с EGFR, необязательно может содержать С-концевой хвост. Приводимые в качестве примера С-концевые хвосты включают полипептиды, которые в длину составляют от 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 или 1 аминокислоту. Конкретные примеры С-концевых хвостов включают EIDKPSQ (SEQ ID NO: 9), EIDKPCQ (SEQ ID NO: 10) и EIDK (SEQ ID NO: 78). В других вариантах осуществления подходящие С-концевые хвосты могут представлять собой усеченный на С-конце фрагмент последовательностей SEQ ID NO: 9, 10 или 78, в том числе, например, одну из следующих аминокислотных последовательностей (представленных однобуквенным кодом аминокислот): Е, EI, EID, EIDKP (SEQ ID NO: 79), EIDKPS (SEQ ID NO: 80) илиEGC, EGSGS (SEQ ID NO: 96), EGSGC (SEQ ID NO: 97) или EIEK (SEQ ID NO: 217). В некоторых вариантах осуществления домен 10Fn3, который связывается с EGFR, содержит как N-концевое удлинение, так и С-концевой хвост. В приводимых в качестве примера вариантах осуществления область А содержит N-концевое удлинение, начиная с Gly или Met-Gly и С-концевое удлинение, которое не содержит остаток цистеина, и В область содержит п N-концевое удлинение, которое не начинается с Met,и С-концевое удлинение, которое содержит остаток цистеина. Конкретными примерами доменов 10Fn3,которые связываются с EGFR, являются полипептиды, содержащие (i) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 5-8, 52, 6668, 82-85, 106-108, 112-114, 140-142, 155-157, 170-172, 185-187, 198-200, и 219-327, или (ii) полипептид,содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85, 90, 95%о, 97, 98 или 99% идентичную аминокислотной последовательности, изложенной в любой из последовательностейSEQ ID NO: 5-8, 52, 66-68, 82-85, 106-108, 112-114, 140-142, 155-157, 170-172, 185-187, 198-200 и 219327. В некоторых вариантах осуществления область А или С представляет собой полипептид, содержащий домен 10Fn3, который связывается с IGF-IR, где домен 10Fn3 имеет структуру от N-конца к С-концу: -цепь А, петля АВ, -цепь В, петля ВС, -цепь С, петля CD, -цепь D, петля DE, -цепь Е,петля EF, -цепь F, петля FG, -цепь G, где ВС петля имеет аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 45 или 46, DE петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47 или 48 иFG петля имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 или 50, где 10Fn3 домен укладывается в структуру, подобную вариабельной области тяжелой цепи антитела, и где указанный полипептид связывается с IGF-IR с KD менее 100 нМ. Домен 10Fn3, который связывается с IGF-IR, предпочтительно укладывается в структуру, в которой 7 -цепей распределены между двумя бета слоями, которые группируются напротив друг друга, образуя стабильное ядро, и где -цепи соединены шестью петлями, которые являются гидрофильными. В приводимых в качестве примера вариантах осуществления,домен 10Fn3 составляет в длину от 80 до 150 аминокислот. В приводимых в качестве примера вариантах осуществления область А или С представляет собой 10 В последовательности SEQ ID NO: 86, петли ВС, DE и FG имеют фиксированную последовательность, как показано жирным шрифтом или последовательность, по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95,97, 98 или 99% идентичную последовательностям, показанным жирным шрифтом, АВ петля представлена Xn1, CD петля представлена Xn2, EF петля представлена Xn3 и -цепи A-G подчеркнуты. X представляет любую аминокислоту и индекс, следующий после X представляет целое число количества аминокислот. В частности, n1 может составлять от 1-15, 2-15, 1-10, 2-10, 1-8, 2-8, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1-3,2-3 или 1-2 аминокислот; n2 и n3, каждый независимо, могут составлять от 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 515, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7 или 6-7 аминокислот; a1-а 6, каждый независимо, могут содержать от 0-10, 0-5, 1-10, 1-5 или 2-5 аминокислот. В предпочтительных вариантах осуществления n1 составляет 2 аминокислоты, n2 составляет 7 аминокислот, n3 составляет 7 аминокислот и a1-а 6 составляет 0 аминокислот. Последовательности -цепей могут иметь, где угодно, от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2 или от 0 до 1 замен, делеций или добавлений по всем 7 каркасным областям, относительно соответствующих аминокислот, показанных в последовательностиSEQ ID NO: 1. В приводимом в качестве примера варианте осуществления последовательности -цепей могут иметь, где угодно, от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2 или от 0 до 1 консервативных замен по всем 7 каркасным областям относительно соответствующих аминокислот, показанных в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки ядра являются фиксированными и любые замены, консервативные замены, делеции или добавления встречаются в остатках, отличных от аминокислотных остатков ядра. В некоторых вариантах осуществленияIGF-IR связующее представлено следующей аминокислотной последовательностью: В последовательности SEQ ID NO: 65 последовательность петель ВС, DE и FG имеют фиксированную последовательность, как показано жирным шрифтом, или последовательность, по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичная последовательности, показанной жирным шрифтом,и оставшаяся последовательность, которая подчеркнута (например, последовательность 7 -цепей и петель АВ, CD и EF), имеет в любом месте от 0 до 20, от 0 до 15, от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2 или от 0 до 1 замен, консервативных замен, делеций или добавлений относительно соответствующих аминокислот, показанных в последовательности SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки ядра являются фиксированными, и могут происходить любые замены, консервативные замены, делеции или добавления Домен 10Fn3, который связывается с IGF-IR, необязательно может содержать N-концевое удлинение от 1-20, 1-15, 1-10, 1-8,1-5, 1-4, 1-3, 1-2 или 1 аминокислот в длину. Приводимые в качестве примера N-концевые удлинения включают (представлены однобуквенным кодом аминокислот) М, MG, G, MGVSDVPRDL(SEQ ID NO: 69), GVSDVPRDL (SEQ ID NO: 70) и VSDVPRDL (SEQ ID NO: 71) или N-концевые усечения любой из последовательностей SEQ ID NO: 69, 70 или 71. Другие подходящие N-концевые удлинения включают, например, XnSDVPRDL (SEQ ID NO: 72), XnDVPRDL (SEQ ID NO: 73), XnVPRDL(SEQ ID NO: 74), XnPRDL (SEQ ID NO: 75), XnRDL (SEQ ID NO: 76), XnDL (SEQ ID NO: 77) или XnL,где n = 0, 1 или 2 аминокислоты, где в тех случаях, когда n=1, X представляет собой Met или Gly, и в тех случаях, когда n=2, X представляет собой Met-Gly. 10Fn3 домен, который связывается с IGF-IR, необязательно может содержать С-концевой хвост. Приводимые в качестве примера С-концевые хвосты включают полипептиды, которые составляют от 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 или 1 аминокислот в длину. Конкретные примеры С-концевых хвостов включают EIDKPSQ (SEQ ID NO: 9), EIDKPCQ(SEQ ID NO: 10) и EIDK (SEQ ID NO: 78). В других вариантах осуществления подходящие С-концевые хвосты могут представлять собой усеченный с С-конца фрагмент последовательностей SEQ ID NO: 9,10 или 78, в том числе, например, одну из следующих аминокислотных последовательностей (представленных однобуквенным кодом аминокислот): Е, EI, EID, EIDKP (SEQ ID NO: 79), EIDKPS(SEQ ID NO: 217). В некоторых вариантах осуществления 10Fn3 домен, который связывается с IGF-IR,содержит как N-концевое удлинение, так и С-концевой хвост. В приводимых в качестве примера вариантах осуществления область А содержит N-концевое удлинение, начиная с Gly или Met-Gly и С-концевое удлинение, которое не содержит остаток цистеина и область В содержит N-концевое удлинение, которое не начинается с Met, и С-концевое удлинение, которое содержит остаток цистеина. Конкретными примерами 10Fn3 доменов, которые связываются с IGF-IR являются полипептиды, содержащие (i) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 3, 4, 65 или 86; или (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную аминокислотной последовательности, изложенной в любой из последовательностей SEQ ID NO: 3, 4, 65 или 86. Область В представляет собой линкер, как описано далее в настоящем документе. В приводимых в качестве примера вариантах осуществления область В представляет собой полипептидный линкер. Приводимые в качестве примера полипептидные линкеры включают полипептиды, имеющие от 1-20,1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3 или 1-2 аминокислот. Конкретные примеры подходящих полипептидных линкеров описаны далее в настоящем документе и включают, например, линкеры, имеющие последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 11-19, 51, 93-95 и 218. В некоторых вариантах осуществления линкер может представлять собой полипептид С-концевого хвоста, описанный в настоящем документе, полипептид N-концевого удлинения, описанный в настоящем документе, или их сочетание. В одном варианте осуществления димер антителоподобного белка содержит полипептид, имеющий структуру Х 1-А-Х 2-В-Х 3-С-Х 4, где X1 представляет собой необязательное N-концевое удлинение,А представляет собой 10Fn3 домен, который связывается с EGFR, Х 2 представляет собой необязательный С-концевой хвост, В представляет собой полипептидный линкер, Х 3 представляет собой необязательное N-концевое удлинение, С представляет собой 10Fn3 домен, который связывается с IGF-IR, и Х 4 представляет собой необязательный С-концевой хвост. В другом варианте осуществления димер антителоподобного белка содержит полипептид, имеющий структуру Х 1-А-Х 2-В-Х 3-С-Х 4, где X1 представляет собой необязательное N-концевое удлинение, А представляет собой 10Fn3 домен, который связывается с IGF-IR, Х 2 представляет собой необязательный С-концевой хвост, В представляет собой полипептидный линкер, Х 3 представляет собой необязательное N-концевое удлинение, С представляет собой 10Fn3 домен, который связывается с EGFR, и Х 4 представляет собой необязательный С-концевой хвост. Конкретные примеры подходящих N-концевых удлинений и С-конце описаны далее. В некоторых вариантах осуществления один или более из X1, X2, В, Х 3 или Х 4 может содержать аминокислотный остаток, подходящий для пэгилирования, например остаток цистеина или лизина. В приводимых в качестве примера вариантах осуществления Х 4 содержит по меньшей мере одну аминокислоту, подходящую для пэгилирования, например остаток цистеина или лизина. Конкретные примеры подходящих полипептидных линкеров дополнительно описаны ниже. Конкретные примеры димеров антителоподобного белка, имеющие структуру Х 1-А-Х 2-В-Х 3-С-Х 4 представляют собой полипептиды, содержащие(i) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 20-31, 53-58, 87-92, 98-105, 118-133, 149-154, 164-169, 179-184, 192-197, 205210 и 211-216; или (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную аминокислотной последовательности, изложенной в любой из последовательностей SEQ ID NO: 20-31, 53-58, 87-92, 98-105, 118-133, 149-154, 164-169, 179-184,192-197, 205-210 и 211-216. В некоторых вариантах осуществления может быть желательным настроить эффективность одного 10Fn3 связывающего домена относительно другого 10Fn3 связывающего домена в димерах антителоподобного белка, описанных в настоящем документе. Например, если аффинность связывания первогоFn3 домена значительно выше аффинности связывания второго 10Fn3 домена, биологическое действие первого 10Fn3 домена могло подавить действия второго Fn3 домена. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления может быть желательным для аффинностей связывания первого и второго доменов 10Fn3 димера антителоподобного белка их сходство друг с другом, например аффинности связывания в пределах 100, 30, 10, 3, 1, 0,3 или 0,1 раз или аффинности связывания в пределах от 0,1 до 10 раз,в пределах от 0,3 до 10 раз, в пределах от 0,1 до 3 раз, в пределах от 0,3 до 3 раз, в пределах от 0,1 до 1 раз, в пределах от 0,3 до 1 раз, в пределах от 1 до 10 раз, в пределах от 3 до 10 раз, в пределах от 3 до 30 раз или в пределах от 1 до 3 раз друг с другом. Конъюгирование. Мультимеры антителоподобных белков могут быть ковалентно или нековалентно связаны. В некоторых вариантах осуществления EGFR-связывающий 10Fn3 может быть напрямую или опосредовано связан с IGFIR-связывающим 10Fn3 через полипептидный линкер. Подходящими линкерами для соединения 10Fn3 являются те, которые позволяют отдельным доменам осуществлять укладку независимо друг от друга, образуя трехмерную структуру, которая дает возможность для высокоаффинного связывания с молекулой-мишенью. В настоящем описании представлен ряд подходящих линкеров, которые удовлетворяют этим требованиям, в том числе линкеры на основе глицина-серина, линкеры на основе глицина-пролина, а также линкер, имеющий аминокислотную последовательность PSTSTST (SEQ ID NO: 12). Примеры, описанные в настоящем изобретении, демонстрируют, что 10Fn3 домены, соединенные посредством полипептидных линкеров, сохраняют свою функцию связывания с мишенью. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой линкер на основе глицина-серина. Эти линкеры содержат остатки глицина и серина и могут составлять от 8 до 50, от 10 до 30 и от 10 до 20 аминокислот в длину. Примеры включают линкеры,имеющие аминокислотную последовательность(SEQ ID NO: 17). В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой линкер на основе глицина-пролина. Эти линкеры содержат остатки глицина и пролина и могут быть от 3 до 30, от 10 до 30, и от 3 до 20 аминокислот в длину. Примеры включают линкеры, имеющие аминокислотную последовательность GPGPGPG (SEQ ID NO: 18), GPGPGPGPGPG (SEQ ID NO: 19) и GPG (SEQ ID NO: 51). В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой линкер на основе пролина-аланина. Эти линкеры содержат остатки пролина и аланина и могут составлять от 3 до 30, от 10 до 30, от 3 до 20 и от 6 до 18 аминокислот в длину. Примеры таких линкеров включают последовательностиSEQ ID NO: 93, 94 и 95. Считается, что оптимальная длина линкера и аминокислотный состав могут быть определены рутинным экспериментированием способами, хорошо известными в данной области. В некоторых вариантах осуществления мультимеры антителоподобных белков соединены через полипептидный линкер, имеющий протеазный сайт, который расщепляется под действием протеазы в крови или ткани-мишени. Такие варианты осуществления могут быть использованы для высвобождения двух или более терапевтических белков для улучшенной доставки или терапевтических свойств или более эффективной продукции по сравнению с получением таких белков в отдельности. Дополнительные линкеры или спейсеры, например SEQ ID NO: 9 и 10, могут быть введены на С-конце домена 10Fn3 между доменом 10Fn3 и полипептидным линкером. Дополнительные линкеры или спейсеры могут быть введены на N-конце домена 10Fn3 между доменом 10Fn3 и полипептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления мультимеры антителоподобных белков могут быть напрямую или опосредовано связаны через полимерный линкер. Полимерные линкеры могут быть использованы для оптимального изменения расстояния между каждой частью белка для создания белка с одной или более из следующих характеристик: 1) уменьшенное или увеличенное стерическое несоответствие связывания одного или более белковых доменов при связывании с белком, представляющим интерес; 2) повышенная стабильность или растворимость белка; 3) сниженная агрегация белка и 4) увеличенная суммарная авидность или аффинность белка. В некоторых вариантах осуществления мультимеры антителоподобных белков соединены через биосовместимый полимер, например полимерный сахар. Полимерный сахар может включать сайт ферментативного расщепления, который расщепляется под действием фермента в крови или тканимишени. Такие варианты осуществления могут быть использованы для высвобождения двух или более терапевтических белков для улучшенной доставки или терапевтических свойств или более эффективной продукции по сравнению с получением этих белков в отдельности.

МПК / Метки

МПК: C07K 16/28, C07K 14/78

Метки: связывающие, биспецифичные, молекулы

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/30-22415-bispecifichnye-molekuly-svyazyvayushhie-egfr-igfir.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Биспецифичные молекулы, связывающие egfr/igfir</a>