Соединение, предназначенное для лечения дегенеративных и воспалительных состояний

СОЕДИНЕНИЕ, ПРЕДНАЗНАЧЕННОЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ И ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СОСТОЯНИЙ Раскрыто соединение пиразолопиридина в соответствии с формулой I, способное ингибироватьJAK, а также его фармацевтически приемлемые соли, сольват, сольваты фармацевтически приемлемых солей и его биологически активный метаболит. Соединение может быть получено в виде фармацевтической композиции и может применяться для лечения или профилактики разнообразных состояний у млекопитающих, включающих людей, и, конкретно,таких состояний, которые могут быть ассоциированы с аберрантной активностью JAK,включающих посредством приведения неограничивающего примера аллергию, воспалительные состояния, аутоиммунные заболевания, пролиферативные заболевания, отторжение трансплантата,заболевания, включающие нарушения обновления хряща, врожденные дефекты хряща и/или заболевания, ассоциированные с гиперсекрецией IL-6. Мене Кристель Жанн Мари (BE),Ходжес Аластэр Джеймс, Вайтер Хью Дэвид (GB) Медведев В.Н. (RU) Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к соединению, которое представляет собой ингибитор JAK(янус-киназ), семейства тирозинкиназ, которые участвуют в воспалительных состояниях, аутоиммунных заболеваниях, пролиферативных заболеваниях, аллергии, отторжении трансплантата, заболеваниях,включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектах хряща и/или заболеваниях, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов. В частности, соединение изобретения ингибируетJAK1 и/или JAK2. Настоящее изобретение также предоставляет способы получения соединения изобретения, фармацевтические композиции, содержащие соединение изобретения, способы профилактики указанных заболеваний и/или лечения заболеваний, включающих воспалительные состояния, аутоиммунные заболевания, пролиферативные заболевания, аллергию, отторжение трансплантата, заболеваний,включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща и/или заболеваний, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов посредством введения соединения изобретения. Янус-киназы (JAK) представляют собой цитоплазматические тирозинкиназы, которые передают цитокиновые сигналы от мембранных рецепторов к факторам STAT-транскрипции. Описаны четыре члена семейства JAK, JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2. В процессе связывания цитокина со своим рецептором члены семейства JAK ауто- и/или трансфосфорилируют друг друга с последующим фосфорилированиемSTAT, которые затем мигрируют к ядру для модуляции транскрипции. При внутриклеточной передаче сигналов JAK-STAT задействованы интерфероны, большинство интерлейкинов, а также разнообразные цитокины и эндокринные факторы, такие как ЕРО, ТРО, GH, OSM, LIF, CNTF, GM-CSF и PRL(Vainchenker W. et al. (2008. Комбинация генетических моделей и исследования низкомолекулярных ингибиторов JAK продемонстрировали терапевтический потенциал некоторых JAK. Генетическими исследованиями на мышах и людях подтверждена роль JAK3 как иммуносупрессорной мишени (O'Shea J. et al. (2004. ИнгибиторыJAK3 были успешно приняты для клинической разработки, первоначально для отторжения органного трансплантата, но позднее также для других иммуновоспалительных состояний, таких как ревматоидный артрит (РА), псориаз и болезнь Крона (http://clinicaltrials.gov/).TYK2 является потенциальной мишенью для иммуновоспалительных заболеваний, что подтверждается генетическими исследованиями на людях и исследованиями на мышах с выключенными генамиJAK2 гетеродимеризуются с другими JAK для передачи направляемых цитокинами провоспалительных сигналов. Следовательно, ингибирование JAK1 и/или JAK2 представляет интерес для иммуновоспалительных заболеваний с ассоциированными с патологией цитокинами, в которых используется сигнальный путь JAK1 и/или JAK2, такими как IL-6, IL-4, IL-5, IL-12, IL-13, IL-23 или IFN-гамма, а также для других заболеваний, направляемых JAK-опосредованной передачей сигналов. Предшествующий уровень техники изобретения Дегенерация хряща является клиническим признаком разнообразных заболеваний, среди которых ревматоидный артрит и остеоартрит являются наиболее выраженными. Ревматоидный артрит (РА) представляет собой хроническое дегенеративное заболевание суставов, характеризующееся воспалением и разрушением суставных структур. Когда заболевание протекает без вмешательства, оно приводит к значительной инвалидности и боли, вследствие потери функциональности суставов и даже к преждевременной смерти. Задача терапии РА, следовательно, состоит не только в замедлении развития заболевания, но и в достижении ремиссии, чтобы остановить разрушение суставов. Помимо тяжести исхода заболевания,высокая степень распространенности РА (0,8% поражения взрослых людей в мировом масштабе) означает высокую социально-экономическую значимость. (Для обзора по РА авторы ссылаются на SmolenJAK1 и JAK2 вовлечены во внутриклеточную передачу сигналов для многих цитокинов и гормонов. Протекание патологий, ассоциированных с любым из этих цитокинов и гормонов, может улучшаться посредством ингибиторов JAK1 и/или JAK2. Следовательно, мог бы иметься положительный клинический результат от лечения с помощью соединений, описанных в данном изобретении, при некоторых аллергиях, воспалительных и аутоиммунных расстройствах, включающих ревматоидный артрит, системную красную волчанку, ювенильный идиопатический артрит, остеоартрит, астму, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), фиброз тканей, эозинофильное воспаление, эзофагит, воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона, язвенный колит), реакцию "трансплантат против хозяина", псориаз, миозит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, ювенильный идиопатический артрит, рассеянный склероз (Kopf et al., 2010). Остеоартрит (также называемый ОА или артрит изнашивания) является наиболее распространенной формой артрита и характеризуется потерей суставного хряща, часто ассоциированной с гипертрофией костей и болью. Для обширного обзора по остеоартриту авторы ссылаются на Wieland et al. (2005). Остеоартрит трудно поддается лечению. В настоящее время недоступно никакое излечение, и лечение фокусируется на уменьшении боли и предотвращении пораженного сустава от деформации. Обычные способы лечения включают применение нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (NSAID). Несмотря на то что биологически активные пищевые добавки, такие как хондроитин и глюкозамина сульфат, были рекомендованы в качестве безопасных и эффективных вариантов для лечения остеоартрита, недавнее клиническое испытание показало, что оба вида лечения не снижали боль,ассоциированную с остеоартритом. (Clegg et al., 2006). Стимуляция анаболических процессов, блокирование катаболических процессов или комбинация этих двух подходов могут приводить в результате к стабилизации хряща и, возможно, даже к обращению протекания заболевания и, следовательно, предотвращению дальнейшего развития заболевания. Были разработаны терапевтические способы коррекции повреждений суставного хряща, которые проявляются во время остеоартритного заболевания, но к настоящему времени ни один из них не обеспечивает опосредование регенерации суставного хряща in situ и in vivo. С учетом всего вышесказанного никакие модифицирующие заболевание остеоартритные лекарственные средства не являются доступными.Vandeghinste et al. (WO 2005/124342) обнаружил, что JAK1 является мишенью, ингибирование которой может иметь терапевтическую значимость для некоторых заболеваний, включающих ОА. Выключение гена JAK1 у мышей продемонстрировало, что JAK1 играет существенные и не избыточные роли во время развития: JAK1-/- мыши умерли в течение 24 ч после рождения, и развитие лимфоцитов было серьезно нарушено. Кроме того, JAK1-/- клетки были нечувствительны или менее чувствительны к цитокинам, которые используют класс II цитокиновых рецепторов, цитокиновым рецепторам, которые используют гамма-с субъединицу для сигнального пути и семейству цитокиновых рецепторов, которые используют gp130 субъединицу для сигнального пути (Rodig et al., 1998). Разнообразные группы участвуют в сигнальном пути JAK-STAT в биологии хондроцитов. Li et al.(2001) показали, что Онкостатин М индуцирует генную экспрессию ММР и TIMP3 в первичных хондроцитах посредством активации сигнальных путей JAK/STAT и MAPK. Osaki et al. (2003) показали, что опосредованное интерфероном-гамма ингибирование коллагена II в хондроцитах включает сигнальную систему JAK-STAT. IL1-бета индуцирует катаболизм хряща посредством снижения экспрессии компонентов матрикса и посредством индуцирования экспрессии коллагеназ и индуцируемой синтазы оксида азота (NOS2), которая опосредует выработку оксида азота (NO). Otero et al., (2005) показали, что лептин иIL1-бета синергически индуцировали выработку NO или экспрессию мРНК NOS2 в хондроцитах, и то,что она блокировалась ингибитором JAK. Legendre et al. (2003) показали, что рецептор IL-6/IL-6 индуцировал понижающую регуляцию специфичных для хрящевой ткани генов матрикса коллагена II, сердцевины аггрекана и связующего белка в бычьих суставных хондроцитах, и то, что это было опосредовано сигнальной системой JAK/STAT. Следовательно, эти наблюдения предполагают участие JAK-киназной активности при гомеостазе хряща и терапевтические возможности для ингибиторов JAK-киназы. Члены семейства JAK вовлечены в дополнительные состояния, включающие миелопролиферативные расстройства (O'Sullivan et al., 2007, Mol. Immunol. 44(10): 2497-506), где были идентифицированы мутации в JAK2. Данный факт указывает на то, что ингибиторы JAK, в частности JAK2, могут также найти применение при лечении миелопролиферативных расстройств. Дополнительно, семейство JAK, в частности JAK1, JAK2 и JAK3, связаны с раковыми заболеваниями, в частности лейкемиями, например острой миелоидной лейкемией (O'Sullivan et al., 2007, Mol. Immunol. 44(10): 2497-506; Xiang et al., 2008,"Identification of somatic JAK1 mutations in patients with acute myeloid leukaemia". Blood First Edition Paper,prepublished online December 26, 2007; DOI: 10.1182/blood-2007-05-090308) и острой лимфобластной лейкемией (Mullighan et al., 2009), или солидными опухолями, например лейомиосаркомой матки(Constantinescu et al., 2007, Trends in Biochemical Sciences 33(3): 122-131), раком простаты (Tam et al.,2007, British Journal of Cancer, 97, 378-383). Эти результаты указывают на то, что ингибиторы JAK, в частности JAK1 и/или JAK2, могут также иметь применение при лечении типов рака (лейкемий и солидных опухолей, например, лейомиосаркомы матки, рака простаты). В дополнение, болезнь Кастлемана, множественная миелома, мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, псориаз и саркома Капоши, вероятно, обусловлены гиперсекрецией цитокина IL-6,чьи биологические эффекты являются опосредованными внутриклеточным сигнальным путемJAK-STAT (Tetsuji Naka, Norihiro Nishimoto and Tadamitsu Kishimoto, Arthritis Res 2002, 4 (suppl 3): S233S242). Этот результат показывает, что ингибиторы JAK могут также найти применение при лечении указанных заболеваний. Существующие в настоящее время терапии являются неудовлетворительными, и, следовательно,остается потребность в идентификации дополнительных соединений, которые могут иметь применение при лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний,аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща и/или заболеваний, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов,например, остеоартрита, и ревматоидного артрита, в частности ревматоидного артрита. Настоящее изобретение, следовательно, предоставляет соединение, способы его получения и фармацевтические композиции, содержащие соединение изобретения вместе с подходящим фармацевтическим носителем. Настоящее изобретение также предоставляет применение соединения изобретения при получении лекарственного средства для лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща, и/или заболеваний, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов, например, остеоартрита и ревматоидного артрита, в частности ревматоидного артрита. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение основано на открытии, что соединение изобретения способно действовать в качестве ингибитора JAK и что оно может быть использовано для лечения воспалительных состояний,аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща и/или заболеваний,ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов. Настоящее изобретение также предоставляет способы получения данного соединения, фармацевтические композиции, содержащие данное соединение, и способы лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих нарушения обновления хряща,врожденных дефектов хряща и/или заболеваний, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов, посредством введения соединения изобретения. Соответственно, в первом аспекте изобретения предоставлено соединение, соответствующее формуле I или его фармацевтически приемлемая соль или сольват или сольват фармацевтически приемлемой соли. В дополнительном аспекте изобретения предоставлена фармацевтическая композиция для лечения или профилактики аллергии, воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща и/или заболеваний, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически эффективное количество вышеуказанного соединения или его фармацевтически приемлемой соли. В предпочтительном варианте фармацевтическая композиция содержит дополнительное терапевтическое средство, которое представляет собой средство для лечения или профилактики аллергии, воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща и/или заболеваний, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов. В предпочтительном варианте аутоиммунное заболевание выбирают из хронической обструктивной болезни легких, астмы, системной красной волчанки, сахарного диабета 1-го типа, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, ювенильного идиопатического артрита и воспалительного заболевания кишечника. В предпочтительном варианте воспалительное состояние выбирают из ревматоидного артрита, остеоартрита, астмы и воспалительных заболеваний кишечника. В дополнительном аспекте изобретения предоставлено применение вышеуказанного соединения или его фармацевтически приемлемой соли для лечения или профилактики аллергии, воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща и/или заболеваний,ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов. В предпочтительном варианте аутоиммунное заболевание выбирают из хронической обструктивной болезни легких, астмы, системной красной волчанки, сахарного диабета 1-го типа, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, ювенильного идиопатического артрита и воспалительного заболевания кишечника. В предпочтительном варианте воспалительное состояние выбирают из ревматоидного артрита, остеоартрита, астмы и воспалительных заболеваний кишечника. В дополнительном аспекте изобретения предоставлено применение вышеуказанного соединения или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения или профилактики аллергии, воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща и/или заболеваний, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов. В предпочтительном варианте аутоиммунное заболевание выбирают из хронической обструктивной болезни легких, астмы, системной красной волчанки, сахарного диабета 1-го типа, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, ювенильного идиопатического артрита и воспалительного заболе-3 024743 вания кишечника. В предпочтительном варианте воспалительное состояние выбирают из ревматоидного артрита, остеоартрита, астмы и воспалительных заболеваний кишечника. В другом дополнительно аспекте предоставлено применение вышеуказанной фармацевтической композиции для получения лекарственного средства для лечения или профилактики аллергии, воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща и/или заболеваний, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов. В другом дополнительном аспекте предоставлен способ лечения или профилактики аллергии, воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща и/или заболеваний, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов, включающий введение вышеуказанного соединения или его фармацевтически приемлемой соли или вышеуказанной фармацевтической композиции в количестве, эффективном для лечения или профилактики указанных заболеваний. В предпочтительном аспекте указанное выше соединение или его фармацевтически приемлемую соль или указанную выше фармацевтическую композицию вводят в комбинации с дополнительным терапевтическим средством, где дополнительное терапевтическое средство представляет собой средство для лечения или профилактики аллергии, воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща и/или заболеваний, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов. В предпочтительном варианте аутоиммунное заболевание выбирают из хронической обструктивной болезни легких, астмы, системной красной волчанки, сахарного диабета 1-го типа, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, ювенильного идиопатического артрита и воспалительного заболевания кишечника. В предпочтительном варианте воспалительное состояние выбирают из ревматоидного артрита, остеоартрита, астмы и воспалительных заболеваний кишечника. Другие задачи и преимущества станут очевидными квалифицированным специалистам в данной области из рассмотрения следующего подробного описания. Подробное описание изобретения Определения. Подразумевают, что следующие термины имеют значения, представленные в настоящем описании ниже, и могут быть использованы для понимания описания намеченного объема притязаний настоящего изобретения. При описании изобретения, которое может включать соединения, фармацевтические композиции,содержащие такие соединения, и способы использования таких соединений и композиций, следующие термины, если они присутствуют, имеют следующие значения, если не указано иначе. Следует также понимать, что при описании в данном документе любые из фрагментов, определенных ниже, могут быть замещены разнообразными заместителями, и что соответствующие определения предназначены для включения таких замещенных фрагментов в пределах их объема, как представлено ниже. Если не установлено иначе, термин "замещенный" будет определяться, как изложено ниже. Следует дополнительно понимать, что термины "группы" и "радикалы" могу считаться взаимозаменяемыми при использовании в настоящем описании. Как используют в настоящем описании, термин "JAK" относится к семейству Янус-киназ (JAK), которые представляют собой цитоплазматические тирозинкиназы, которые передают сигналы в цитокиновой сигнальной системе от мембранных рецепторов к факторам транскрипции STAT. Описаны четыре члена семейства JAK, JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2, и термин JAK может относиться ко всем членам семейства JAK совместно или одному или нескольким из членов семейства JAK, как указывает контекст."Фармацевтически приемлемые" означает разрешенные или проходящие стадию разрешения от регулирующего органа Федерального или государственного правительства или соответствующего ведомства в странах, отличных от Соединенных Штатов, или те, что приведены в Фармакопее США или других общепризнанных фармакопеях для применения на животных, более конкретно на людях."Фармацевтически приемлемая соль" относится к соли соединения изобретения, которая является фармацевтически приемлемой и которая обладает желательной фармакологической активностью родительского соединения. В частности, такие соли являются нетоксичными и могут являться солями присоединения неорганической или органической кислоты и солями присоединения основания. Конкретно,такие соли включают: (1) соли присоединения кислоты, образованные с неорганическими кислотами,такими как хлористо-водородная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п.; или образованные с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, пропионовая кислота, гексановая кислота, циклопентанпропионовая кислота, гликолевая кислота,пировиноградная кислота, молочная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота,малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота,-4 024743 3-(4-гидроксибензоил)бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, 1,2-этан-дисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота,бензолсульфоновая кислота, 4-хлорбензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота,4-толуолсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота, 4-метилбицикло[2.2.2]-окт-2-ен-1 карбоновая кислота, глюкогептоновая кислота, 3-фенилпропионовая кислота, триметилуксусная кислота,трет-бутилуксусная кислота, лаурилсерная кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гидроксинафтоевая кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, муконовая кислота и т.п.; или (2) соли,образованные, когда кислотный протон, присутствующий в родительском соединении, либо замещен на ион металла, например, ион щелочного металла, ион щелочноземельного металла, или ион алюминия; или образует координационное соединение с органическим основанием, таким как этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, н-метилглюкамин и т.п. Соли дополнительно включают, посредством только примера, натрий, калий, кальций, магний, аммоний, тетраалкиламмоний и т.п.; и, когда соединение содержит основную функциональность, соли нетоксичной органической или неорганической кислоты, такие как гидрохлорид, гидробромид, тартрат, мезилат, ацетат, малеат, оксалат и т.п. Термин "фармацевтически приемлемый катион" относится к приемлемому катионному противоиону кислотной функциональной группы. Такие катионы представлены на примере катионов натрия, калия,кальция, магния, аммония, тетраалкиламмония и т.п."Фармацевтически приемлемая среда" относится к разбавителю, вспомогательному средству, эксципенту или носителю, вместе с которым вводят соединение изобретения."Сольват" относится к формам соединения, которые являются ассоциированными с растворителем,обычно посредством реакции сольволиза. Эта физическая ассоциация включает образование водородных связей. Общепринятые растворители включают воду, этанол, уксусную кислоту и т.п. Соединение изобретения может быть получено, например, в кристаллической форме и может быть сольватировано или гидратировано. Подходящие сольваты включают фармацевтически приемлемые сольваты, такие как гидраты, и дополнительно включают как стехиометрические сольваты, так и нестехиометрические сольваты. В некоторых случаях сольват будет обладать способностью к выделению, например, когда одна или несколько молекул растворителя включены в кристаллическую решетку кристаллического твердого вещества. "Сольват" охватывает как сольваты в фазе раствора, так и выделяемые сольваты. Представительные сольваты включают гидраты, этаноляты и метаноляты."Терапевтически эффективное количество" означает количество соединения, которое при введении субъекту для лечения заболевания является достаточным, чтобы производить такое лечение заболевания."Предупреждение" или "предотвращение" относится к снижению риска приобретения или развития заболевания или расстройства (т.е. приводит к тому, что по меньшей мере один из клинических симптомов заболевания не развивается у субъекта, который может быть подвергнут воздействию средства, вызывающего заболевание или предрасположен к заболеванию перед наступлением заболевания. Термин "профилактика" имеет отношение к "предотвращению", и относится к мере воздействия или методике, задачей которой является предотвратить, в большей степени, чем вылечить или излечить заболевание. Неограничивающие примеры профилактических мер могут включать введение вакцин; введение низкомолекулярного гепарина больничным пациентам, имеющим риск тромбоза вследствие, например, неподвижности; и введение антималярийного средства, такого как хлорохин, перед посещением географической области, где малярия является эндемичной или риск заражения малярией является высоким."Проведение лечения" или "лечение" любого заболевания или расстройства относится в одном варианте осуществления к облегчению протекания заболевания или расстройства (т.е. остановке заболевания или снижению проявлений, степени или тяжести по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В еще одном другом варианте осуществления "проведение лечения" или "лечение" относится к улучшению по меньшей мере одного физического параметра, который может не различаться субъектом. В еще одном другом варианте осуществления "проведение лечения" или "лечение" относится к модуляции заболевания или расстройства, либо физически, (например, посредством стабилизации видимого симптома), физиологически, (например, стабилизации физического параметра) или к обоим случаям. В дополнительном варианте осуществления "проведение лечения" или "лечение" относится к замедлению развития заболевания. Как используют в настоящем описании, термин "аллергия" относится к группе состояний, характеризуемых расстройством гиперчувствительности иммунной системы, включающей аллергическое заболевание дыхательных путей (например, астму, ринит), синусит, экзему и сыпь, а также пищевые аллергии или аллергии к яду насекомых. Как используют в настоящем описании, термин "воспалительное состояние(состояния)" относится к группе состояний, включающих ревматоидный артрит, остеоартрит, ювенильный идиопатический арт-5 024743 рит, псориаз, псориатический артрит, аллергическое заболевание дыхательных путей (например, астму,ринит), воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона, язвенный колит), эндотоксин-управляемые болезненные состояния (например, осложнения после шунтирования или хронические эндотоксиновые состояния, способствующие, например, хронической сердечной недостаточности) и родственные заболевания, включающие хрящи, такие как заболевания суставов. Конкретно, термин относится к ревматоидному артриту, остеоартриту, аллергическому заболеванию дыхательных путей (например, астме) и воспалительным заболеваниям кишечника. Как используют в настоящем описании, термин "аутоиммунные заболевания(заболевание)" относится к группе заболеваний, включающей обструктивное заболевание дыхательных путей, включая состояния, такие как ХОБЛ, астма (например, наследственная бронхиальная астма, приобретенная бронхиальная астма, пылевая астма, детская астма) конкретно, хроническая или застарелая астма (например поздняя астма и гипервосприимчивость дыхательных путей), бронхит, включающие бронхиальную астму, системную красную волчанку (SLE), кожную красную волчанку, волчаночный нефрит, дерматомиозит, синдром Шегрена, рассеянный склероз, псориаз, сухость глаз, сахарный диабет 1-го типа и осложнения, ассоциированные с ним, атопическую экзему (атопический дерматит), контактный дерматит и дополнительный экзематозный дерматит, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона и язвенный колит), псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, ювенильный идиопатический артрит, атеросклероз и амиотрофический боковой склероз. Конкретно, термин относится к ХОБЛ,астме, системной красной волчанке, сахарному диабету 1-го типа и воспалительному заболеванию кишечника. Как используют в настоящем описании, термин "пролиферативные заболевания(заболевание)" относится к состояниям, таким как рак (например, лейомиосаркома матки или рак простаты), миелопролиферативные расстройства (например, истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитемия и миелофиброз), лейкемия (например, острая миелоидная лейкемия, острая и хроническая лимфобластная лейкемия), множественная миелома, псориаз, рестеноз, склеродерма или фиброз. В частности, термин относится к раку, лейкемии, множественной миеломе и псориазу. Как используют в настоящем описании, термин "рак" относится к злокачественному или доброкачественному росту клеток в коже или в органах организма, например, но без ограничения, молочной железе, простате, легком, почке, поджелудочной железе, желудке или кишечнике. Рак имеет тенденцию инфильтроваться в прилегающую ткань и распространяться (метастазировать) в удаленные органы, например в кости, печень, легкие или мозг. Как используют в настоящем описании, термин "рак" включает как типы метастатических опухолевых клеток, такие как, но не ограниченные ими, меланома, лимфома,лейкемия, фибросаркома, рабдомиосаркома и мастоциотома и типы тканевой карциномы, такие как, но не ограниченные ими, колоректальный рак, рак простаты, мелкоклеточный рак легких и немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, рак почки, рак желудка, глиобластома, первичный рак печени, рак яичника, рак простаты и лейомиосаркома матки. Как используют в настоящем описании, термин "лейкемия" относится к неопластическим заболеваниям крови и кроветворных органов. Такие заболевания могут вызывать дисфункцию костного мозга и иммунной системы, что делает хозяина в высокой степени подверженным к инфекции и кровотечению. В частности, термин "лейкемия" относится к острой миелоидной лейкемии (AML) и острой лимфобластной лейкемии (ALL) и хронической лимфобластной лейкемии (CLL). Как используют в настоящем описании, термин "отторжение трансплантата" относится к острому или хроническому отторжению клеток, ткани или твердых алло- или ксенографтов, например островков Лангерганса, стволовых клеток, костного мозга, кожи, мышц, ткани роговицы, нейрональной ткани,сердца, легкого, комбинированного сердца-легкого, почки, печени, кишечника, поджелудочной железы,трахеи или пищевода или заболеваниям с реакцией трансплантат против хозяина. Как используют в настоящем описании, термин "заболевания, включающие нарушения обновления хряща" включает состояния, такие как остеоартрит, псориатический артрит, ювенильный ревматоидный артрит, подагрический артрит, септический или инфекционный артрит, реактивный артрит, рефлекторная симпатическая дистрофия, альгодистрофия, синдром Титце или реберный хондрит, фибромиалгия,остеохондрит, нейрогенный или нейропатический артрит, артропатия, эндемичные формы артрита, такие как эндемичный деформирующий остеоартрит, болезнь Мселени и болезнь Хандигоду; дегенерация, являющаяся результатом фибромиалгии, системная красная волчанка, склеродерма и анкилозирующий спондилит. Как используют в настоящем описании, термин "врожденные дефект (дефекты) хряща" включает состояния, такие как наследственный хондролиз, хондродисплазии и псевдохондродисплазии, в частности, но без ограничения, микротия, анотия, метафизарная хондродисплазия и родственные расстройства. Как используют в настоящем описании, термин "заболевание(заболевания)", ассоциированные с гиперсекрецией IL-6", включает состояния, такие как болезнь Кастлемана, множественная миелома, псориаз, саркома Капоши и/или мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит. Как используют в настоящем описании, термин "заболевание(заболевания)", ассоциированное с гиперсекрецией интерферонов, включает состояния, такие как системная и кожная красная волчанка, волчаночный нефрит, дерматомиозит, Синдром Шегрена, псориаз, ревматоидный артрит."Соединение изобретения" и эквивалентные выражения охватывают соединение формулы, как описано в настоящем изобретении, причем это выражение включает биологически активные метаболиты,фармацевтически приемлемые соли и сольваты, например, гидраты, и сольваты фармацевтически приемлемых солей, где это позволяет контекст. Аналогично, ссылка на промежуточные соединения, вне зависимости от того, заявлены они или нет, означает, что охвачены их соли и сольваты, где это позволяет контекст. Когда в данном документе приводится ссылка на интервалы, например, но без ограничения,C1-8 алкил, цитирование интервала должно рассматриваться как представление каждого элемента указанного интервала. Другие производные соединения данного изобретения имеют активность как в виде их кислотной,так и производной от кислоты форм, но форма, чувствительная к кислоте, часто предлагает преимущества по растворимости, тканевой совместимости или замедленного высвобождения в организме млекопитающих (см. Bundgard, H., Design of Prodrugs, p. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam, 1985). Пролекарства включают производные кислот, хорошо известные специалистам-практикам в данной области, такие как,например, сложные эфиры, полученные посредством реакции родительской кислоты с подходящим спиртом, или амиды, полученные посредством реакции родительского кислотного соединения с замещенным или незамещенным амином, или ангидриды кислот, или смешанные ангидриды. Простые алифатические или ароматические сложные эфиры, амиды и ангидриды, производные от кислотной группы,находящейся в боковой цепи соединений данного изобретения, представляют собой особенно применимые пролекарства. В некоторых случаях желательно получать пролекарства типа двойных сложных эфиров, такие как (ацилокси)алкил сложные эфиры или алкоксикарбонил)окси)алкилсложные эфиры. Конкретные такие пролекарства представляют собой C1-8 алкил-, С 2-8 алкенил-, арил-, C7-12 замещенный арил, и С 7-12 арилалкильные сложные эфиры соединения изобретения. Также следует понимать, что соединения, которые имеют одинаковую молекулярную формулу, но различаются по природе или последовательности связывания их атомов или по расположению их атомов в пространстве называют "изомерами". Изомеры, которые различаются по расположению их атомов в пространстве, называют "стереоизомеры". Стереоизомеры, которые не являются зеркальными отображениями друг друга, называют "диастереомерами", а стереоизомеры, которые являются не налагающимися зеркальными изображениями друг друга, называют "энантиомерами". Когда соединение имеет асимметрический центр, например, он связан с четырьмя различными группами, возможно существование пары энантиомеров. Энантиомер может характеризоваться абсолютной конфигурацией своего асимметрического центра и описывается правилами R- и S-последовательностей Кана и Прелога или в соответствии с направлением, в котором молекула вращает плоскость поляризованного света и обозначается как правовращающая или левовращающая (т.е. как (+) или (-)-изомеры, соответственно). Хиральное соединение может существовать в виде либо индивидуального энантиомера, либо в виде их смеси. Смесь, содержащую равные пропорции энантиомеров,называют "рацемической смесью"."Таутомеры" относятся к соединениям, которые представляют собой взаимозаменяемые формы структуры конкретного соединения и которые различаются по сдвигу атомов водорода и электронов. Таким образом, две структуры могут находиться в равновесии посредством движения -электронов и атома (обычно Н). Например, енолы и кетоны являются таутомерами, так как они быстро взаимопревращаются посредством обработки либо кислотой или основанием. Еще одним примером таутомеризма являются аци- и нитро- формы фенилнитрометана, которые аналогично образуются при обработке кислотой или основанием. Таутомерные формы могут иметь отношение к приобретению оптимальной химической реактивности и биологической активности соединения, представляющего интерес. Если не указано иным образом, подразумевают, что описание или наименование конкретного соединения в описании и формуле изобретения включает как индивидуальные энантиомеры, так и их смеси, рацемические или иные. Способы определения стереохимии и разделения стереоизомеров являются хорошо известными в области. Соединение Настоящее изобретение основано на установлении того факта, что соединение изобретения представляет собой ингибитор JAK и что оно может быть использовано для лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата,заболеваний, включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща, и/или заболеваний, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов. Настоящее изобретение также предоставляет способы получения соединения изобретения, фармацевтические композиции, содержащие соединение изобретения, и способы лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща и/или заболеваний, ассоциированных с гиперсекрециейIL-6 или интерферонов, посредством введения соединения изобретения. В конкретном варианте осуществления соединение изобретения представляет собой ингибитор JAK1 и/или JAK2. Соответственно, в первом аспекте изобретения предоставлено соединение изобретения в соответствии с формулой I или его фармацевтически приемлемая соль или сольват или сольват фармацевтически приемлемой соли. Другие производные соединения данного изобретения имеют активность как в формах кислоты, так и производного кислоты, но форма, чувствительная к кислоте, часто предлагает преимущества по растворимости, тканевой совместимости или замедленному высвобождению в организме млекопитающего(см., Bundgard, H., Design of Prodrugs, p. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam, 1985). Соединение изобретения является новым ингибитором JAK. В частности, соединение является сильнодействующим ингибиторомJAK1 и/или JAK2, однако оно может ингибировать TYK2 и JAK3 с более низкой активностью действия. Фармацевтические композиции При использовании в качестве фармацевтического средства соединение изобретения обычно вводят в форме фармацевтической композиции. Такие композиции могут быть получены способами, хорошо известными в области фармацевтики, и содержат по меньшей мере одно активное соединение. Как правило, соединение данного изобретения вводят в фармацевтически эффективном количестве. Количество соединения, действительно вводимое, будет обычно определяться терапевтом с учетом присущих обстоятельств, включающих состояние, подлежащее лечению, выбранный путь введения, вводимое действительное соединение, возраст, массу тела и ответную реакцию индивидуального пациента, тяжесть симптомов пациента и т.п. Фармацевтические композиции изобретения могут вводиться посредством разнообразных путей,включающих пероральный, ректальный, трансдермальный, подкожный, внутрисуставной, внутривенный,внутримышечный и интраназальный. В зависимости от предназначенного пути доставки соединение данного изобретения предпочтительно составляют в виде либо композиций для инъекций или пероральных композиций или в виде мазей, лосьонов или пластырей, всех для трансдермального введения. Композиции для перорального введения могут принимать форму нерасфасованных жидких растворов или суспензий или нерасфасованных порошков. Более часто, однако, композиции представлены в стандартных лекарственных формах, чтобы облегчить точное дозирование. Термин "стандартные лекарственные формы" относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных дозировок для человеческих субъектов и других млекопитающих, причем каждая единица содержит предварительно определенное количество активного вещества, рассчитанное для получения желательного терапевтического эффекта, в ассоциации с подходящими фармацевтическими эксципиентом, средой или носителем. Типовые стандартные лекарственные формы включают предварительно заполненные, отмеренные ампулы или шприцы жидких композиций или пилюли, таблетки, капсулы или т.п. в случае твердых композиций. В таких композициях соединение изобретения обычно является минорным компонентом (от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мас.% или предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 40 мас.%.), причем оставшаяся часть представляет собой разнообразные среды или носители и вспомогательные вещества, используемые в производственном процессе, способствующие образованию желательной дозированной формы. Жидкие формы, пригодные для перорального введения, могут включать подходящую водную или неводную среду с буферами, суспендирующими и распределяющими средствами, красителями, ароматизаторами и т.п. Твердые формы могут включать, например, любые из следующих ингредиентов или соединений аналогичной природы: связующее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовую камедь или желатин; эксципент, такой как крахмал или лактоза, разрыхлитель такой как альгиновая кислота, Примогель или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния; вещество, способствующее скольжению, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как мята перечная, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор. Инъекционные композиции обычно основаны на инъекционном стерильном физиологическом растворе или забуференном фосфатом физиологическом растворе или других инъекционных носителях, из-8 024743 вестных в данной области. Как и прежде, активное соединение в таких композициях обычно является минорным компонентом, часто составляя от приблизительно 0,05 до 10 мас.%, причем оставшаяся часть является инъекционным носителем и т.п. Трансдермальные композиции обычно составляют в виде мази или крема для местного применения,содержащих активные ингредиент(ингредиенты), обычно в количестве, находящемся в интервале от приблизительно 0,01 до приблизительно 20 мас.%, предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мас.%, предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мас.% и более предпочтительно от приблизительно 0,5 до приблизительно 15 мас.%. При составлении в виде мази активные ингредиенты будут обычно комбинироваться либо с парафиновой, либо смешиваемой с водой мазевой основой. Альтернативно, активные ингредиенты могут быть составлены в крем, например, с основой для крема типа масло-в-воде. Такие трансдермальные составы являются хорошо известными в области и обычно включают дополнительные ингредиенты для усиления проницаемости через кожу или стабильности активных ингредиентов или состава. Все такие известные трансдермальные составы и ингредиенты включены в пределы объема данного изобретения. Соединение изобретения может также вводиться посредством трансдермального устройства. Соответственно, трансдермальное введение может осуществляться с использованием пластыря либо резервуарного типа или типа пористой мембраны или разнообразных твердых матриц. Описанные выше компоненты для перорально вводимых, инъекционных или вводимых местно композиций являются просто представительными. Другие материалы, а также методы обработки и т.п. изложены в части 8 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, 1985, Mack Publishing Company,Easton, Pennsylvania, которая включена в данный документ посредством ссылки. Соединение изобретения может также вводиться в формах с замедленным высвобождением или из систем лекарственной доставки с замедленным высвобождением. Описание представительных материалов для замедленного высвобождения можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences. Следующие примеры составов иллюстрируют представительные фармацевтические композиции,которые могут быть получены в соответствии с данным изобретением. Настоящее изобретение, однако,не является ограниченным следующими фармацевтическими композициями. Состав 1. Таблетки. Соединение изобретения может быть смешано в виде сухого порошка с сухим желатиновым связующим приблизительном при массовом соотношении 1:2. Минорное количество стеарата магния может быть добавлено в качестве смазки. Смесь может быть сформована в таблетки по 240-270 мг (80-90 мг активного амидного соединения на таблетку) в таблеточном прессе. Состав 2. Капсулы. Соединение изобретения может быть смешано в виде сухого порошка с крахмальным разбавителем при приблизительном массовом соотношении 1:1. Смесью могут быть заполнены капсулы по 250 мг(125 мг активного амидного соединения на капсулу). Состав 3. Жидкость. Соединение изобретения (125 мг) может быть смешано с сахарозой (1,75 г) и ксантановой камедью(4 мг), полученная в результате смесь может быть замешана, пропущена через сито 10 меш США и затем смешана с предварительно приготовленным раствором микрокристаллической целлюлозы и карбоксиметилцеллюлозы натрия (11:89, 50 мг) в воде. Бензоат натрия (10 мг), ароматизатор и краситель могут быть разбавлены водой и добавлены при перемешивании. Достаточное количество воды может затем добавляться при перемешивании. Дополнительное достаточное количество воды может затем добавляться для получения общего объема, равного 5 мл. Состав 4. Таблетки. Соединение изобретения может быть смешано в виде сухого порошка с сухим желатиновым связующим при приблизительном массовом соотношении 1:2. Минорное количество стеарата магния может быть добавлено в качестве смазки. Смесь может быть сформована в таблетки по 450-900 мг (150-300 мг активного амидного соединения) в таблеточном прессе. Состав 5.Инъекция. Соединение изобретения может быть растворено или суспендировано в забуференной стерильной инъекционной водной среде физиологического раствора до концентрации, равной приблизительно 5 мг/мл. Состав 6. Местного действия. Стеариловый спирт (250 г) и белый вазелин (250 г) могут быть расплавлены приблизительно при 75C и затем может быть добавлена смесь соединения изобретения (50 г), метилпарабена (0,25 г), пропилпарабена (0,15 г), лаурилсульфата натрия (10 г) и пропиленгликоля (120 г), растворенная в воде (около 370 г), полученная в результате смесь может быть перемешана до застывания. Способы лечения Соединение изобретения может применяться в качестве терапевтического средства для лечения или профилактики состояний у млекопитающих, которые обычно относят или приписывают к аберрантной активности JAK. В частности, состояний, относящихся к аберрантной активности JAK1 и/или JAK2. Соответственно, соединения и фармацевтические композиции изобретения находят применения в качестве терапевтических средств для лечения или профилактики воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний,включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща, и заболеваний, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов, у млекопитающих, включая людей. В одном из аспектов настоящего изобретения предоставлен способ лечения или профилактики аллергии, воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща и/или заболеваний, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов, включающий введение вышеуказанного соединения или его фармацевтически приемлемой соли или вышеуказанной фармацевтической композиции в количестве, эффективном для лечения или профилактики указанных заболеваний. В предпочтительном аспекте указанное выше соединение или его фармацевтически приемлемую соль или указанную выше фармацевтическую композицию вводят в комбинации с дополнительным терапевтическим средством, где дополнительное терапевтическое средство представляет собой средство для лечения или профилактики аллергии, воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих нарушения обновления хряща, врожденных дефектов хряща и/или заболеваний, ассоциированных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов. В предпочтительном варианте аутоиммунное заболевание выбирают из хронической обструктивной болезни легких, астмы, системной красной волчанки, сахарного диабета 1-го типа, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, ювенильного идиопатического артрита и воспалительного заболевания кишечника. В предпочтительном варианте воспалительное состояние выбирают из ревматоидного артрита, остеоартрита, астмы и воспалительных заболеваний кишечника. Конкретный режим настоящего способа включает введение субъекту, страдающему от заболевания,включающего воспаление, в частности ревматоидного артрита, остеоартрита, аллергического заболевания дыхательных путей (например, астмы) и воспалительных заболеваний кишечника, эффективного количества соединения изобретения в течение периода времени, достаточного для снижения уровня воспаления у субъекта, и предпочтительно прекращения процессов, ответственных за указанное воспаление. Особенный вариант осуществления способа включает введение эффективного количества соединения изобретения субъектному пациенту, страдающему от или подверженного развитию ревматоидного артрита, в течение периода времени, достаточного для того, чтобы снизить или предотвратить, соответственно, воспаление в суставах указанного пациента и предпочтительно остановить протекание процессов,ответственных за указанное воспаление. Дополнительный конкретный режим настоящего способа включает введение субъекту, страдающему от болезненного состояния, характеризуемого деградацией хряща или сустава (например, ревматоидного артрита и/или остеоартрита), эффективного количества соединения изобретения в течение периода времени, достаточного, чтобы снизить и предпочтительно остановить нескончаемые процессы, ответственные за указанную деградацию. Конкретный вариант осуществления способа включает введение эффективного количества соединения изобретения субъектному пациенту, страдающему от или подверженного развитию остеоартрита, в течение периода времени достаточного, чтобы снизить или предотвратить, соответственно, деградацию хряща в суставах указанного пациента, и, предпочтительно, остановить нескончаемые процессы, ответственные за указанную деградацию. В конкретном варианте осуществления указанное соединение может проявлять анаболические и/или антикатаболические свойства по отношению к хрящевой ткани. Уровни инъекционной дозы находятся в интервале от приблизительно 0,1 до по меньшей мере 10 мг/кг/ч, все в течение от приблизительно 1 до приблизительно 120 ч и особенно от 24 до 96 ч. Предварительно нагружающий болюс, равный от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мг/кг или более,также может вводиться для достижения адекватных уровней устойчивого состояния. Ожидают, что максимальная суммарная доза не превышает приблизительно 2 г/день для человеческого пациента с массой от 40 до 80 кг. Для профилактики указанных заболеваний и/или лечения долговременных состояний, таких как дегенеративные состояния, режим лечения обычно продлевается в течение многих месяцев или лет, так что пероральное дозирование является предпочтительным для удобства и переносимости пациента. При пероральном дозировании, от одной до пяти и особенно от двух до пяти и обычно три пероральные дозы в день являются предпочтительными режимами. При использовании этих схем дозирования каждая доза предоставляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 20 мг/кг соединения изобретения, причем ка- 10024743 ждая конкретная доза предоставляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мг/кг и особенно от приблизительно 1 до приблизительно 5 мг/кг. Трансдермальные дозы обычно подбирают, чтобы предоставить аналогичные или более низкие уровни в крови, чем достигают при использовании инъекционных доз. При использовании для предотвращения наступления состояния соединение изобретения будет вводиться пациенту, имеющему риск развития состояния, обычно по рекомендации и под наблюдением лечащего врача при уровнях дозировки, описанных выше. Пациенты, имеющие риск развития конкретного состояния, обычно включают пациентов, которые имеют семейную историю болезни состояния,или пациентов, которые были идентифицированы посредством генетического тестирования или скрининга, как являющиеся особенно подверженными развитию состояния. Соединение изобретения может вводиться как единственное активное средство или оно может вводиться в комбинации с другими терапевтическими средствами, включающими другие соединения, которые демонстрируют такую же или аналогичную терапевтическую активность и которые определяются как безопасные и эффективные для такого комбинированного введения. В конкретном варианте осуществления совместное введение двух (или более) средств позволяет использовать значительно более низкие дозы каждого из них, посредством чего снижаются наблюдаемые побочные эффекты. В одном варианте осуществления соединение изобретения или фармацевтическую композицию, содержащую соединение изобретения, вводят в качестве лекарственного средства. В конкретном варианте осуществления указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит дополнительный активный ингредиент. В одном варианте осуществления соединение изобретения совместно вводят с еще одним терапевтическим средством для лечения и/или профилактики заболевания, включающего воспаление; конкретные средства включают, но не ограничены лишь ими, иммунорегуляторные средства, например азатиоприн, кортикостероиды (например, преднизолон или дексаметазон), циклофосфамид, циклоспорин А,такролимус, Микофенолят Мофетил, муромонаб-CD3 (OKT3, например Ортоколон), ATG, аспирин,ацетаминофен, ибупрофен, напроксен и пироксикам. В одном варианте осуществления соединение изобретения вводят совместно с еще одним другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики артрита (например, ревматоидного артрита); конкретные средства включают, но не ограничены лишь ими, анальгетики, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAIDS), стероиды, синтетические DMARDS (например, но без ограничения, метотрексат, лефлуномид, сульфасалазин, ауранофин, ауротиомалат натрия, пеницилламин, хлорохин, гидроксихлорохин, азатиоприн, Тофацитиниб, Фостматиниб и циклоспорин) и биологические DMARDS (например, но без ограничения Инфликсимаб, Этанерцепт, Адалимумаб, Ритуксимаб и Абатацепт). В одном варианте осуществления соединение изобретения вводят совместно с еще одним другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики пролиферативных расстройств; конкретные средства включают, но не ограничены лишь ими, метотрексат, лейковорин, адриамицин, пренизон, блеомицин, циклофосфамид, 5-фторурацил, паклитаксел, доцетаксел, винкристин, винбластин, винорелбин,доксорубицин, тамоксифен, торемифен, мегэстрола ацетат, анастрозол, гозерелин, моноклональные антитела против HER2 (например, Герцептин), капецитабин, ралоксифена гидрохлорид, ингибиторыEGFR (например, Iressa, Тарцева, Эрбитукс), ингибиторы VEGF (например, Авастин), ингибиторы протеосом (например, Велкейд), Гливек и ингибиторы hsp90 (например, 17-AAG). Дополнительно, соединение изобретения может вводиться в комбинации с другими терапиями, включающими, но не ограниченными ими, лучевую терапию или хирургическое вмешательство. В конкретном варианте осуществления пролиферативное расстройство выбирают из рака, миелопролиферативного заболевания или лейкемии. В одном варианте осуществления соединение изобретения вводят совместно с еще одним другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики аутоиммунных заболеваний, конкретные средства включают, но не ограничены лишь ими, глюкокортикоиды, цитостатические средства (например, пуриновые аналоги), алкилирующие средства, (например, мустаргены (циклофосфамид), нитрозомочевины, соединения платины и др.), антиметаболиты (например, метотрексат, азатиоприн и меркаптопурин), цитотоксические антибиотики (например, дактиномициновые антрациклины, митомицин С, блеомицин и митрамицин), антитела (моноклональные антитела, например, против CD20, против CD25 или против CD3 (OTK3), Атгам и Тимоглобулин), циклоспорин, такролимус, рапамицин (сиролимус),интерфероны (например, IFN-), белки, связывающие ТНФ (например, инфликсимаб (Ремикейд), этанерцепт (Энбрел), или адалимумаб (Хумира, микофенолят, финголимод и мириоцин. В одном варианте осуществления соединение изобретения вводят совместно с еще одним другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики отторжения трансплантата, конкретные средства включают, но не ограничены лишь ими, ингибиторы кальциневрина (например, циклоспорин или такролимус (FK506, ингибиторы mTOR (например, сиролимус, эверолимус), антипролиферативные средства (например, азатиоприн, микофеноловая кислота), кортикостероиды (например, преднизолон,- 11024743 гидрокортизон), Антитела (например, моноклональные антитела против рецептора IL-2Ra, базиликсимаб, даклизумаб), поликлональные антитела против ТРЕТ-клеток (например, антитимоцитарный глобулин (ATG), антилимфоцитарный глобулин (ALG. В одном варианте осуществления соединение изобретения вводят совместно с еще одним другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактика астмы и/или ринита и/или ХОБЛ, конкретные средства включают, но не ограничены лишь ими, агонисты бета 2-адренорецепторов (например, сальбутамол, левосальбутамол, тербуталин и битолтерол), эпинефрин (для ингаляций или таблетки), антихолинергические средства (например, ипратропия бромид), глюкокортикоиды (пероральные или ингалирумые), 2-агонисты продолжительного действия (например, салметерол, формотерол, бамбутерол, и пероральный албутерол с замедленным высвобождением), комбинации ингалируемых стероидов и бронхолитиков длительного действия (например, флутиказон/салметерол, будезонид/формотерол), антагонисты лейкотриенов и ингибиторы их синтеза (например, монтелукаст, зафирлукаст и зилейтон), ингибиторы высвобождения медиаторов (например, кромогликат и кетотифен), биологические регуляторы ответа IgE(например, омализумаб), антигистамины (например, цетеризин, циннаризин, фексофенадин) и вазоконстрикторы (например, оксиметазолин, ксилометазолин, нафазолин и трамазолин). Дополнительно, соединение изобретения может вводиться в комбинации с экстренными терапиями для астмы и/или ХОБЛ, такие терапии включают введение кислорода или гелиево-водородной смеси,распыленный аэрозоль сальбутамола или тербуталина (необязательно комбинированный с антихолинергическим средством (например, ипратропием), системные стероиды (перорально или внутривенно, например, преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазон или гидрокортизон), внутривенный сальбутамол, неспецифические бета-агонисты, инъекционные или ингалируемые (например, эпинефрин,изоэтарин, изопротеренол, метапротеренол), антихолинергические средства (ВВ или распыленные, например гликопирролат, атропин, ипратропий), метилксантины (теофиллин, аминофиллин, бамифиллин),ингаляционные анестетики, которые имеют бронхолитический эффект (например, изофлуран, галотан,энфлуран), кетамин и внутривенный сульфат магния. В одном варианте осуществления соединение изобретения вводят совместно с еще одним другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики воспалительного заболевания кишечника(IBD), конкретные средства включают, но не ограничены лишь ими, синтетические глюкокортикоиды(например, преднизон, будезонид), модифицирующие заболевание, иммуномодулирующие средства (например, метотрексат, лефлуномид, сульфасалазин, месалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурин и циклоспорин) и биологические модификаторы заболевания, иммуномодулирующие средства (инфликсимаб, адалимумаб, ритуксимаб и абатацепт). В одном варианте осуществления соединение изобретения вводят совместно с еще одним другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики SLE, конкретные средства включают, но не ограничены лишь ими, модифицирующие заболевание противоревматические средства (DMARD), такие как антималярийные средства (например, плаквенил, гидроксихлорохин), иммуносупрессоры (например,метотрексат и азатиоприн), циклофосфамид и микофеноловая кислота; иммуносупрессорные лекарственные средства и анальгетики, такие как нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, опиаты (например, декстропропоксифен и со-кодамол), опиоиды (например, гидрокодон, оксикодон,MS Контин или метадон) и трансдермальный пластырь с фентанильным дюрогезиком. В одном варианте осуществления соединение изобретения вводят совместно с еще одним другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики псориаза, конкретные средства включают,но не ограничены лишь ими, местные средства лечения, такие как ванночки с раствором, увлажнители,лечебно-оздоровительные кремы и мази, содержащие деготь, дитранол (антралин), кортикостероиды,подобные дезокиметазону (Топикорт), флукоцинонид, аналоги витамина D3 (например, кальципотриол), ретиноиды арганового масла (этретинат, ацитретин, тазаротен), системные средства лечения, такие как метотрексат, циклоспорин, ретиноиды, тиогуанин, гидроксимочевина, сульфасалазин, микофенолята Мофетил, азатиоприн, такролимус, сложные эфиры фумаровой кислоты или биологические средства,такие как Амевайв, Энбрел, Хумира, Ремикейд, Раптива и узтекинумаб (блокатор IL-12 иIL-23). Дополнительно, соединение изобретения может вводиться в комбинации с другими терапиями,включающими, но не ограниченными ими, фототерапию или фотохимиотерапию (например, псораленовую и ультрафиолетовую А фототерапию (PUVA. В одном варианте осуществления соединение изобретения вводят совместно с еще одним другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики аллергической реакции, конкретные средства включают, но не ограничены лишь ими, антигистамины (например, цетиризин, дифенгидрамин,фексофенадин, левоцетиризин), глюкокортикоиды (например, преднизон, бетаметазон, беклометазон,дексаметазон), эпинефрин, теофиллин или анти-лейкотриены (например, монтелукаст или зафирлукаст),антихолинергические средства и противоотечные средства. При совместном введении включено любое средство доставки двух или более терапевтических средств пациенту как часть такого же режима лечения, что будет очевидно для квалифицированного специалиста. В то время как два или более средств могут вводиться одновременно в одиночном составе, т.е. как одиночная фармацевтическая композиция, это не является существенным. Средства могут вводиться в различных составах и в различное время. Общие методики синтеза Общая часть. Соединение изобретения может быть получено из легкодоступных исходных веществ с использованием следующих общих способов и методик. Следует учитывать, что там, где приведены типовые или предпочтительные условия процесса (т.е. температуры реакций, значения времени, мольные отношения реагентов, растворители, давления и т.д.), другие условия процессов также могут использоваться, если не установлено иначе. Оптимальные условия реакций могут изменяться с конкретными применяемыми реагентами или растворителем, но такие условия могут быть определены квалифицированным специалистом посредством рутинных методик оптимизации. Дополнительно, как будет очевидно для квалифицированного специалиста в области, могут потребоваться общепринятые защитные группы для предотвращения некоторых функциональных групп от протекания нежелательных реакций. Выбор подходящей защитной группы для конкретной функциональной группы, а также подходящих условий для защиты и снятия защиты являются хорошо известными в области. Например, многочисленные защитные группы, и их введение и удаление описаны в Т.W. Greene и P.G.M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Wiley, New York, 1991,и ссылках, цитируемых в ней. Следующие способы представлены в подробностях, что касается получения соединения изобретения, как определено в настоящем описании выше, и в сравнительных примерах. Соединение изобретения может быть получено из известных или доступных для приобретения известных веществ и реагентов квалифицированным специалистом в области органического синтеза. Все реагенты имели промышленную категорию качества и использовались в том виде, как были получены, без дополнительной очистки, если не установлено иначе. Доступные для приобретения безводные растворители применяли для реакций, проводимых в инертной атмосфере. Растворители с реагентной категорией качества применяли во всех других случаях, если не установлено иначе. Колоночную хроматографию осуществляли на силикагеле 60 (35-70 мкм). Тонкослойную хроматографию проводили,применяя пластины, предварительно покрытые силикагелем F-254 (толщина слоя 0,25 мм). Спектры 1 Н ЯМР регистрировали на ЯМР-спектрометре Bruker DPX 400 (400 МГц). Химические сдвигидля спектров 1 Н ЯМР приведены в миллионных долях (м.д.) относительно тетраметилсилана ( 0,00) или соответствующего пика остаточного растворителя, т.е. CHCl3 ( 7,27) в качестве внутреннего стандарта. Мультиплетности приведены как синглет (с), дублет (д), триплет (т), квартет (кв), мультиплет (м) и широкий сигнал (шир). Константы спин-спинового взаимодействия (J) приведены в герцах. Спектры массспектрометрии с распылением получали на ЖХ/МС спектрометре с платформой Микромасс. Колонки,применяемые для анализа ЖХМС: Hichrom, Kromasil Eternity, 2,5 мкм С 18, 1504,6 мм, Waters Xbridge 5 мкм С 18 (2), 2504,6 мм (кат. 86003117), Waters Xterra MS 5 мкм С 18, 1004,6 мм (Плюс картридж предколонки) (кат. 186000486), Gemini-NX 3 мкм С 18 1003,0 мм (кат. 00D-4453-Y0), Phenomenex Luna 5 мкм С 18 (2), 1004,6 мм. (Плюс картридж предколонки) (кат. 00D-4252-E0), Kinetix с плавленной сердцевиной 2,7 мкм С 18 1004,6 мм (кат. 00D-4462-E0), Supelco, Ascentis Express C18 (кат. 53829-U), илиMicromass ZQ, соединенный с ВЭЖХ Waters 2795, оборудованный УФ-детектором Waters 2996. ЖХ также проводили на ВЭЖХ Agilent 1100, соединенном с УФ-детектором Agilent G1315A. Препаративная ВЭЖХ: Waters XBridge Prep C18 5 мкм ODB 19 мм ВД 100 мм Д (Часть 186002978). Во всех способах используют градиенты MeCN/H2O. H2O содержит либо 0,1% ТФУ или 0,1% NH3. Синтетическое получение соединения изобретения. Соединение изобретения может быть получено в соответствии со следующей схемой. Соединение 1. N-4-(3-Фтор-4-4-(метилсульфонил)пиперазин-1-ил)метил)фенил)пиразоло[1,5 а]пиридин-2-ил)ацетамид Стадия i). 3-Бром-2-цианометилпиридин (промежуточное соединение 1). Безводный ТГФ (100 мл) охлаждали до -78C и добавляли н-бутиллитий (2,5 М в гексанах; 23 мл,58 ммоль). Ацетонитрил (3,3 мл, 64 ммоль) добавляли по каплям, поддерживая температуру ниже -60C. Образовывался белый осадок и реакционную смесь перемешивали при -78C в течение 45 мин. Раствор 2,3-дибромпиридина (2,0 г, 8,4 ммоль) в безводном ТГФ (10 мл) добавляли по каплям и реакционную смесь перемешивали при -78C в течение 1,5 ч, затем давали нагреться до комнатной температуры. Реакцию гасили посредством добавления по каплям воды. Водный слой экстрагировали ДХМ (3) и объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором, сушили (MgSO4) и концентри- 15024743 ровали в вакууме. (3-Бромпиридин-2-ил)ацетонитрил (промежуточное соединение 1) очищали посредством флэш-колоночной хроматографии. Стадия ii) 2-(3-Бромпиридин-2-ил)-N-гидроксиацетамидин (промежуточное соединение 2). Интенсивно перемешиваемую смесь гидрохлорида гидроксиламина (924 мг, 13,3 ммоль), воды(1,31 г, 6,65 ммоль) и этанола (14 мл) нагревали при кипячении с обратным холодильником в течение 5 ч. Реакционной смеси давали охладиться до комнатной температуры, этанол удаляли в вакууме и твердое вещество белого цвета собирали посредством фильтрации, промывая водой (310 мл). Влажное твердое вещество сушили в вакууме при 40C в течение 1 ч с получением 2-(3-бромпиридин-2-ил)-Nгидроксиацетамидина в виде твердого вещества (промежуточное соединение 2). Стадия iii). 3-Бром-2-(5-метил[1,2,4]оксадиазол-3-илметил)пиридин (промежуточное соединение 3). Смесь 2-(3-бромпиридин-2-ил)-N-гидроксиацетамидина, полученного на стадии ii) (1,24 г,5,39 ммоль) и уксусный ангидрид (552 мг, 5,41 ммоль) перемешивали в безводном ТГФ (10 мл) при 20C в течение 1,5 ч. Реакционную смесь концентрировали под вакуумом, и остаток интенсивно перемешивали в двухфазной системе из 2 М Na2CO3 (10 мл) и ДХМ (10 мл) при 20C в течение 10 мин. Полученный белый осадок собирали посредством фильтрации, промывая водой (25 мл) и ДХМ (25 мл), затем сушили в вакууме при 40C в течение 1 ч с получением О-ацетиламидоксима в виде порошка. Полученный О-ацетиламидоксим (610 мг, 2,24 ммоль) и K2CO3 (1,56 г, 11,3 ммоль) интенсивно перемешивали в CHCl3 (6 мл) при 60C в течение 41 ч. Воду (5 мл) и дополнительный CHCl3 (5 мл) добавляли к смеси при интенсивном перемешивании. Слои разделяли, и органический экстракт концентрировали в вакууме. Неочищенный 3-бром-2-(5-метил[1,2,4]оксадиазол-3-илметил)пиридин получали в виде жидкости желтого цвета и использовали в последующих реакциях без дополнительной очистки (промежуточное соединение 3). Стадия iv). 3-(4-Бромпиразоло[1,5-а]пиридин-2-ил)ацетамид (промежуточное соединение 4). 3-Бром-2-(5-метил[1,2,4]оксадиазол-3-илметил)пиридин, полученный на стадии iii) (663 мг,2,61 ммоль), перемешивали при 150C в толуоле (5,2 мл) в герметично закрытой пробирке в течение 41 ч. Реакционной смеси давали охладиться до комнатной температуры, толуол удаляли в вакууме и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (градиент: 0-10% МеОН в ДХМ). Полученное твердое вещество растирали с диэтиловым эфиром с получением 3-(4-бромпиразоло[1,5-а]пиридин-2 ил)ацетамида (промежуточное соединение 4) в виде твердого вещества. Стадия v). 1-(4-Бром-2-фторбензил)-4-метансульфонилпиперазин (промежуточное соединение 5). Смесь 4-бром-2-фторбензилбромида (30,4 г, 114 ммоль, 1 экв.), 1-метилсульфонилпиперазина(20,0 г, 114 ммоль, 1 экв.) и K2CO3 (31,6 г, 228 ммоль, 2 экв.) в ацетонитриле (500 мл) перемешивали при 40C в течение 18 ч. Реакционной смеси давали охладиться до комнатной температуры, смесь фильтровали через целит, промывая EtOAc. Фильтрат концентрировали под вакуумом с получением целевого амина. Смесь 4-бром-2-фторбензилбромида (30,4 г, 114 ммоль, 1 экв.), 1-метилсульфонилпиперазина(20,0 г, 114 ммоль, 1 экв.) и K2CO3 (31,6 г, 228 ммоль, 2 экв.) в ацетонитриле (500 мл) перемешивали при 40C в течение 18 ч. Реакционной смеси давали охладиться до комнатной температуры, смесь фильтровали через целит и промывали EtOAc. Фильтрат концентрировали под вакуумом с получением 1-(4-бром-2-фтор-бензил)-4-метансульфонилпиперазина (промежуточное соединение 5). Стадияvi). 1-[2-Фтор-4-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)бензил]-4 метансульфонилпиперазин (промежуточное соединение 6). Смесь арилбромида (20,0 г, 57 ммоль, 1 экв.), бис-(пинаколато)диборона (16,0 г, 63 ммоль, 1,1 экв.),PdCl2(dppf) (2,3 г, 2,9 ммоль, 0,05 экв.) и ацетат калия (6,2 г, 63 ммоль, 1,1 экв.) в дегазированном диоксане (200 мл) перемешивали под азотом в герметично закрытой пробирке при 90C в течение 18 ч. Реакционной смеси давали охладиться до комнатной температуры, смесь фильтровали через слой оксида кремния и промывали ДХМ. Фильтрат концентрировали под вакуумом. Остаток смешивали с изогексаном и добавляли диэтиловый эфир до кристаллизации продукта. Продукт собирали посредством фильтрации в виде твердого вещества. Альтернативно, смесь арилбромида (309 г, 879,7 ммоль), бис-(пинаколато)диборона (245,7 г,967,7 ммоль), PdCl2(dppf) (35,9 г, 43,9 ммоль) и ацетата калия (94,9 г, 967,7 ммоль) в дегазированном диоксане (3 л) перемешивали под азотом при 100C в течение 6 ч. Реакционной смеси давали охладиться до комнатной температуры, смесь фильтровали через слой оксида кремния и промывали DCM. Фильтрат концентрировали под вакуумом. ДХМ и гексан (2 л) добавляли к вязкому остатку, в это время продукт осаждался. Суспензию фильтровали, получая желательное соединение. Стадия(26,4 г, 66 ммоль, 1,1 экв.) добавляли к раствору арилбромида (16,0 г, 63 ммоль, 1 экв.) в смеси 1,4-диоксан/вода (540 мл, 4:1; об./об.). Na2CO3 (13,4 г, 126 ммоль, 2,0 экв.) и Pd(dppf)Cl2 (2,6 г, 3 ммоль,0,05 экв.) (dppf=1,1'-бис-(дифенилфосфино)ферроцен) добавляли к дегазированному раствору. Полученную в результате смесь нагревали при 100C в течение 2 ч. Реакционную смесь экстрагировали EtOAc,сушили MgSO4 и концентрировали в вакууме. Очисткой посредством препаративной ВЭЖХ получали целевые соединения. Стадия vii). Второй способ. 1-[2-Фтор-4-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)бензил]-4-метансульфонилпиперазин,полученный на стадии (ii) выше (7,5 г, 18 ммоль, 1 экв.), добавляли к раствору арилбромида (4,5 г,18 ммоль, 1 экв.) в смеси 1,4-диоксан/вода (150 мл, 4:1; об./об.). Na2CO3 (3,8 г, 36 ммоль, 2,0 экв.) иPd(dppf)Cl2 (0,7 г, 0,9 ммоль, 5%) (dppf=1,1'-бис-(дифенилфосфино)ферроцен) добавляли к дегазированному раствору. Полученную в результате смесь нагревали при 100C в течение 2 ч. Две реакционные смеси объединяли и растворитель удаляли в вакууме. Остаток смешивали с ДХМ и водой и нерастворимое вещество удаляли посредством фильтрации. (Нерастворимое вещество сохраняли и позднее повторно объединяли с органическим остатком перед очисткой.) Водный слой отделяли и экстрагировали ДХМ(3). Объединенные органические слои сушили (MgSO4) и концентрировали в вакууме. Этот остаток объединяли с прежде собранным нерастворимым веществом и адсорбировали на оксиде кремния. Очисткой посредством колоночной хроматографии (градиент: 0-5% МеОН в EtOAc) или препаративной ВЭЖХ получали целевое соединение в виде коричневого твердого вещества. Коричневое твердое вещество смешивали с этанолом и суспензию нагревали при кипячении с обратным холодильником. Смеси давали охладиться до комнатной температуры и затем дополнительно охлаждали с помощью бани со льдом. Целевое вещество собирали посредством фильтрации и сушили в вакууме. Стадия vii). Третий способ. Смесь 1-N-(4-бром-пиразоло[1,5-а]пиридин-2-ил)ацетамида (149 г, 0,586 моль) и Na2CO3 (124 г,1,172 моль) в смеси растворителей из 1,4-диоксана (2 л)/воды (0,5 л) при комнатной температуре дегазировали с помощью N2. К этой смеси добавляли бороновый сложный эфир (270 г, 1,15 экв.) и PdCl2 (dppf)(24 г, 5 мол.%). Рубашку реактора нагревали до 100C, дегазирование с помощью N2 останавливали и смесь перемешивали при нагреве в течение 45 мин. ВЭЖХ показала полное потребление боронового эфира. Добавляли дополнительное количество боронового эфира (10 г, 0,05 экв.) и перемешивание продолжали при 100C в течение дополнительных 30 мин. ВЭЖХ показала полную конверсию и единичный пик ожидаемого продукта. Объем растворителя удаляли при пониженном давлении до 0,5 л и полученную в результате суспензию оставляли при 4C в течение ночи. Воду (0,5 л) добавляли к суспензии и перемешивали в течение 30 мин и отфильтровывали. Полученную в результате лепешку промывали водой (0,5 л) и сушили при вакуумном отсосе в течение 1 ч. Лепешку переносили в чашку Петри (425 г) и оставляли для высыхания на воздухе в течение ночи для получения неочищенного желательного соединения. Порошок помещали на слой силикагеля и промывали ДХМ/МеОН (смесь 9:1). Первую фракцию(2,5 л) концентрировали досуха, получая смолообразное твердое вещество, которое отбрасывали. Вторую фракцию (10 л ДХМ/МеОН смеси 9:1, 10 л смеси 5:1 и 3 л смеси 3:1) концентрировали досуха, получая желательный продукт. Твердое вещество суспендировали в EtOH (1,1 л), нагревали при кипячении с обратным холодильником, перемешивали в течение 30 мин, охлаждали до 5C, перемешивали в течение 30 мин и отфильтровывали. Лепешку промывали холодным EtOH (300 мл) и переносили в чашку Петри,получая ожидаемый продукт. Соединение изобретения, которое было получено в соответствии со способом синтеза, описанным в настоящем изобретении выше, представлено в табл. I, а спектральные данные ЯМР соединения изобретения приведены в табл. II. Таблица II Данные ЯМР типичного соединения изобретения Биологические примеры Пример 1. Аналитические тесты in-vitro. 1.1. Аналитический тест на ингибирование JAK1. 1.1.1. Аналитический тест на JAK1 с поли-GT субстратом. Каталитический домен рекомбинантного человеческого JAK1 (аминокислоты 866-1154; номер по каталогу PV4774) получали от Invitrogen. 25 нг JAK1 инкубировали с 6,25 мкг субстрата поли-GT (Sigma,номер по каталогу Р 0275) в буфере для киназной реакции (15 мМ Hepes pH 7,5, 0,01% Tween 20, 10 мМNEG602K001MC) конечные концентрации) с или без 5 мкл, содержащими тестируемое соединение или среду (ДМСО, 1% конечная концентрация), в общем объеме, равном 25 мкл, в полипропиленовом 96-луночном планшете (Greiner, V-образное дно). Через 75 мин при 30C реакции останавливали добавлением 25 мкл/лунку 150 мМ фосфорной кислоты. Все содержимое остановленной киназной реакции переносили в предварительно промытые (75 мМ фосфорная кислота) 96-луночные фильтровальные планшеты (Perkin Elmer, номер по каталогу 6005177) с использованием коллектора клеток (Perkin Elmer). Планшеты промывали 6 раз с 300 мкл/лунку 75 мМ раствором фосфорной кислоты и донную часть планшетов герметично закрывали. Добавляли 40 мкл/лунку Microscint-20, верхнюю часть планшетов герметично закрывали и осуществляли считывание с использованием Topcount (Perkin Elmer). Киназную активность вычисляли посредством вычитания числа импульсов в мин (чивм), полученного в присутствии ингибитора положительного контроля (10 мкМ стауроспорина) от чивм, полученного в присутствии среды. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность определяли как: Процент ингибирования = чивм, определенное для образца с присутствующим тестируемым соединением-чивм, определенное для образца с ингибитором положительного контроля), разделенное на(чивм, определенное в присутствии среды-чивм, определенное для образца с ингибитором положительного контроля 100. Для соединений получали ряд разведения доз, позволяющий тестировать эффекты доза-ответ в аналитическом тесте JAK1 и вычисление IC50 для соединения. Соединение тестировали при концентрации 20 мкМ с последующим 1/3 серийным разведением в 8 точках (20 мкМ-6,67 мкМ-2,22 мкМ-740 нМ-247 нМ-82 нМ-27 нМ-9 нМ) при конечной концентрации 1% ДМСО. Когда активность соединения увеличивалась, получали больше разведений и/или верхнюю концентрацию снижали (например, 5, 1 мкМ). 1.1.2. Аналитический тест JAK1 Ulight - JAK1 пептид. Рекомбинантная человеческая JAK1 (каталитический домен, аминокислоты 866-1154; номер по каталогу PV4774) была получена от Invitrogen. 1 нг JAK1 инкубировали с 20 нМ пептида Ulight-JAK1(tyr1023) (Perkin Elmer, номер по каталогу TRF0121) в киназном реакционном буфере (25 мМ MOPS pH 6,8, 0,01% Brij-35,5 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 7 мкМ АТФ) с или без 4 мкл, содержащими тестируемое соединение или среду (ДМСО, 1% конечная концентрация), в общем объеме, равном 20 мкл, в белом планшете 384 Opti (Perkin Elmer, номер по каталогу 6007290). Через 60 мин при комнатной температуре реакции останавливали посредством добавления 20 мкл/лунку смеси для обнаружения (1 буфер для обнаружения (Perkin Elmer, номер по каталогу CR97-100 С), 0,5 нМ европий-антифосфотирозина (РТ 66)(Perkin Elmer, номер по каталогу AD0068), 10 мМ EDTA). Считывание осуществляли с использованиемEnvision с возбуждением при 320 нМ и измерением эмиссии при 615 нМ (Perkin Elmer). Киназную активность вычисляли посредством вычитания числа относительных единиц флуоресценции (ОЕФ), полученных в присутствии ингибитора положительного контроля (10 мкМ стауроспорина) из числа ОЕФ, полученных в присутствии среды. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность определяли как: Процент ингибирования = ОЕФ, определенное для образца с присутствующим тестируемым соединением - ОЕФ, определенное для образца с ингибитором положительного контроля), разделенное на(ОЕФ, определенное в присутствии среды - ОЕФ, определенное для образца с ингибитором положительного контроля 100. Для соединения был получен ряд разведения доз, позволяющий проводить тестирование эффектов доза-ответ в аналитическом тесте JAK1 и вычисление IC50 для соединения. Соединение обычным образом тестировали при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разведением 1/5, при 10 точках для конечной концентрации 1% ДМСО. Когда активность соединения увеличивалась, получали больше разведений и/или снижали верхнюю концентрацию (например, 5, 1 мкМ). Данные выражали как среднееIC50 из тестовстандартная ошибка среднего. Активность соединения изобретения против JAK1 определяли в соответствии с аналитическим тестом, описанным выше, таким образом возвращая значения IC50, равные 8,18, 11,5, 7,71, 35,2 и 7,85 нМ. 1.2. Аналитический тест определения Ki JAK1. Для определения Ki различные количества соединения смешивали с ферментом, и ферментативная реакция протекала как функция концентрации АТФ. Ki определяли посредством построения графика двойной обратной зависимости Km от концентрации соединения (график Лайнвивера-Берка). 1 нг JAK1DTT, 5 мМ MgCl2 с изменяющимися концентрациями АТФ и соединения. Фосфорилированный субстрат измеряли, используя меченное Европием антитело против фосфотирозина РТ 66 (Perkin Elmer, AD0068),как описано в 1.1.2. Считывание осуществляли на Envision (Perkin Elmer) с возбуждением при 320 нМ и эмиссией, следуемой при 615 и 665 нМ. 1.3. Аналитический тест на ингибирование JAK2. 1.3.1. Аналитический тест на JAK2 с поли-GT субстратом. Каталитический домен рекомбинантной человеческой JAK2 (аминокислоты 808-1132; номер по каталогу PV4210) был получен от Invitrogen. 0,05 мЕ JAK2 инкубировали с 2,5 мкг поли-GT субстрата(Sigma номер по каталогу Р 0275) в киназном реакционном буфере (10 мМ MOPS pH 7,5, 0,5 мМ EDTA,0,01% Brij-35, 1 мМ DTT, 15 мМ MgAc, 1 мкМ нерадиоактивной АТФ, 0,25 мкКи 33 Р-гамма-АТФ (PerkinElmer, номер по каталогу NEG602K001MC) конечные концентрации) с или без 5 мкл, содержащими тестируемое соединение или среду (ДМСО, 1% конечная концентрация), в общем объеме, равном 25 мкл, в полипропиленовом 96-луночном планшете (Greiner, V-образное дно). Через 90 мин при 30C реакции останавливали посредством добавления 25 мкл/лунку 150 мМ фосфорной кислоты. Все содержимое остановленной киназной реакции переносили в предварительно промытые (75 мМ фосфорная кислота) 96 луночные фильтровальные планшеты (Perkin Elmer, номер по каталогу 6005177), используя коллектор клеток (Perkin Elmer). Планшеты промывали 6 раз 300 мкл/лунку 75 мМ раствором фосфорной кислоты и дно планшетов герметично закрывали. Добавляли 40 мкл/лунку Microscint-20, верхнюю часть планшетов герметично закрывали, и считывание осуществляли с использованием Topcount (Perkin Elmer). Киназную активность вычисляли посредством вычитания числа импульсов в минуту (чивм), полученного в присутствии ингибитора положительного контроля (10 мкМ стауроспорина) от чивм, полученного в присутствии среды. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность определяли как: Процент ингибирования = чивм, определенное для образца с присутствующим тестируемым соединением - чивм, определенное для образца с ингибитором положительного контроля), разделенное на(чивм, определенное в присутствии среды - чивм, определенное для образца с ингибитором положительного контроля 100. Для соединений получали ряд разведения доз, позволяющий проводить тестирование эффектов доза-ответ в аналитическом тесте для JAK2 и вычисление IC50 для каждого соединения. Соединение тести- 19024743 ровали при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разведением 1/3, при 8 точках(20 мкМ-6,67 мкМ-2,22 мкМ-740 нМ-247 нМ-82 нМ-27 нМ-9 нМ) при конечной концентрации, равной 1% ДМСО. Когда активность ряда соединения увеличивалась, получали больше разведений и/или снижали верхнюю концентрацию (например, 5, 1 мкМ). 1.3.2. Аналитический тест на JAK2 Ulight-JAK1 пептид. Рекомбинантная человеческая JAK2 (каталитический домен, аминокислоты 866-1154; номер по каталогу PV4210) была получена от Invitrogen. 0,0125 мЕ JAK2 инкубировали с 25 нМ пептида Ulight-JAK1(tyr1023) (Perkin Elmer, номер по каталогу TRF0121) в киназном реакционном буфере (25 мМ HEPES рН 7,0, 0,01% Triton Х-100, 7,5 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 7,5 мкМ АТФ) с или без 4 мкл, содержащими тестируемое соединение или среду (ДМСО, 1% конечная концентрация), в общем объеме, равном 20 мкл, в белом планшете 384 Opti (Perkin Elmer, номер по каталогу 6007290). Через 60 мин при комнатной температуре реакции останавливали посредством добавления 20 мкл/лунку смеси для обнаружения (1 буфер для обнаружения (Perkin Elmer, номер по каталогу CR97-100C), 0,5 нМ европий-антифосфотирозина(РТ 66) (Perkin Elmer, номер по каталогу AD0068), 10 мМ EDTA). Считывание осуществляли с использованием Envision с возбуждением при 320 нМ и измерением эмиссии при 615 нМ (Perkin Elmer). Киназную активность вычисляли посредством вычитания относительных единиц флуоресценции (ОЕФ), полученных в присутствии ингибитора положительного контроля (10 мкМ стауроспорина) из ОЕФ, полученных в присутствии среды. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность определяли как: Процент ингибирования = ОЕФ, определенное для образца с присутствующим тестируемым соединением - ОЕФ, определенное для образца с ингибитором положительного контроля), разделенное на(ОЕФ, определенное в присутствии среды - ОЕФ, определенное для образца с ингибитором положительного контроля 100. Для соединения был получен ряд разведения доз, позволяющий проводить тестирование эффектов доза-ответ в аналитическом тесте для JAK2 и вычисление IC50 для соединения. Соединение тестировали при концентрации, равной 20 мкМ, с последующим серийным разведением 1/5, в 10 точках при конечной концентрации 1% ДМСО. Когда активность соединения увеличивалась, получали больше разведений и/или снижали верхнюю концентрацию (например, 5, 1 мкМ). Данные выражали как среднее IC50 из анализовстандартная ошибка среднего. Активность соединения изобретения против JAK2 определяли в соответствии с аналитическим тестом, описанным выше, таким образом возвращая значения IC50, равные 17,3, 11,3, 9,57, 26 и 18,2 нМ. 1.4. Аналитический тест на определение Kd/Ki для JAK2. 1.4.1. Аналитический тест на определение Ki для JAK2. Для определения Ki различные количества соединения смешивали с ферментом и ферментативную реакцию осуществляли как функцию концентрации АТФ. Ki определяли посредством построения графика двойной обратной зависимости Km от концентрации соединения (график Лайнвивера-Берка). При анализе применяли 0,0125 мЕ JAK1 (Invitrogen, PV4210). Субстратом являлось 25 нМ пептидаTriton Х-100, 7,5 мМ MgCl2, 2 мМ DTT с изменяющимися концентрациями АТФ и соединения. Фосфорилированный субстрат измеряли, используя меченное европием антитело против фосфотирозина РТ 66(Perkin Elmer, AD0068), как описано в 1.3.2. Считывание осуществляли на Envision (Perkin Elmer) с возбуждением при 320 нМ и следующей эмиссией при 615 и 665 нМ. 1.4.2. Аналитический тест на определение Kd для JAK2.JAK2 (Invitrogen, PV4210) применяли при конечной концентрации 2,5 нМ. Эксперимент по связыванию осуществляли в 50 мМ Hepes pH 7,5, 0,01% Brij-35, 10 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA с использованием 25 нМ трэйсера киназы 236 (Invitrogen, PV5592) и 2 нМ европий-против-GST (Invitrogen, PV5594) с переменными концентрациями соединения. Обнаружение трэйсера осуществляли в соответствии с методикой производителя. 1.5. Аналитический тест на ингибирование JAK3. Каталитический домен рекомбинантной человеческой JAK3 (аминокислоты 795-1124; номер по каталогу 08-046) был получен от Carna Biosciences. 0,5 нг белка JAK3 инкубировали с 2,5 мкг субстрата поли-GT (Sigma, номер по каталогу Р 0275) в киназном реакционном буфере (25 мМ Tris pH 7,5, 0,5 мМEGTA, 10 мМ MgCl2, 2,5 мМ DTT, 0,5 мМ Na3VO4, 5 мМ b-глицеринфосфата, 0,01% Triton Х-100, 1 мкМ нерадиоактивной АТФ, 0,25 мКи 33 Р-гамма-АТФ (Perkin Elmer, номер по каталогу NEG602K001MC) конечные концентрации) с или без 5 мкл, содержащими тестируемое соединение, или среду (ДМСО, 1% конечная концентрация), в общем объеме, равном 25 мкл, в полипропиленовом 96-луночном планшете(Greiner, V-образное дно). Через 45 мин при 30C реакции останавливали посредством добавления 25 мкл/лунку 150 мМ фосфорной кислоты. Все содержимое остановленной киназной реакции переносили в предварительно промытые (75 мМ фосфорная кислота) 96-луночные фильтровальные планшеты(Perkin Elmer, номер по каталогу 6005177), используя коллектор клеток (Perkin Elmer). Планшеты промывали 6 раз с 300 мкл на лунку 75 мМ раствора фосфорной кислоты и дно планшетов герметично за- 20024743 крывали. Добавляли 40 мкл/лунку Microscint-20, верхнюю часть планшетов герметично закрывали, и считывание осуществляли, используя Topcount (Perkin Elmer). Киназную активность вычисляли посредством вычитания числа импульсов в минуту (чивм), полученного в присутствии ингибитора положительного контроля (10 мкМ стауроспорина) из чивм, полученного в присутствии среды. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность определяли как: Процент ингибирования = (чивм, определенное для образца с присутствующим тестируемым соединением - чивм, определенное для образца с ингибитором положительного контроля), разделенное на(чивм, определенное в присутствии среды - чивм, определенное для образца с ингибитором положительного контроля 100. Для соединений получали ряд разведения доз, позволяющий проводить тестирование эффектов доза-ответ в аналитическом тесте для JAK3 и вычисление IC50 для соединения. Соединение тестировали при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разведением 1/5, при 10 точках при конечной концентрации 1% ДМСО. Когда активность соединения увеличивалась, получали больше разведений и/или верхнюю концентрацию снижали (например, 5 мкМ, 1 мкМ). Активность соединения изобретения против JAK3 определяли в соответствии с аналитическим тестом, описанным выше, таким образом возвращая значения IC50, равные 271, 299, 213, и 428 нМ. 1.6. Аналитический тест на определение Ki для JRK3. Для определения Ki различные количества соединения смешивали с ферментом и ферментативную реакцию проводили как функцию концентрации АТФ. Ki определяли посредством построения графика двойной обратной зависимости Km от концентрации соединения (график Лайнвивера-Берка). JAK3(Carna Biosciences, 08-046) применяли при конечной концентрации, равной 20 нг/мл. Субстрат представлял собой натриевую соль поли(Glu, Tyr) (4:1), ММ 20000-50000 (Sigma, Р 0275). Реакцию осуществляли в 25 мМ Tris pH 7,5, 0,01% Triton Х-100, 0,5 мМ EGTA, 2,5 мМ DTT, 0,5 мМ Na3VO4, 5 мМb-глицеринфосфата, 10 мМ MgCl2 с изменяющимися концентрациями АТФ и соединения и останавливали посредством добавления 150 мМ фосфорной кислоты. Измерение введенного фосфата в субстратный поли-GT проводили загрузкой образцов на фильтровальный планшет (используя коллектор, Perkin Elmer) и последовательную промывку. Введенный 33 Р в поли-GT измеряют в сцинтилляционном счетчикеTopcount после добавления сцинтиллятора к фильтровальным планшетам (Perkin Elmer). Например, при тестировании в данном аналитическом тесте соединение изобретения возвращалось к Ki=227 нМ. 1.7. Аналитический тест на ингибирование TYK2. Каталитический домен рекомбинантной человеческой TYK2 (аминокислоты 871-1187; номер по каталогу 08-147) был получен от Carna Biosciences. 4 нг TYK2 инкубировали с 12,5 мкг поли-GT субстрата(Sigma, номер по каталогу Р 0275) в киназном реакционном буфере (25 мМ Hepes, pH 7,2, 50 мМ NaCl,0,5 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 5 мМ MgCl2, 10 мМ MgCl2, 0,1% Brij-35, 0,1 мкМ нерадиоактивной АТФ,0,125 мкКи 33 Р-гамма-АТФ (Perkin Elmer, номер по каталогу NEG602K001MC) конечные концентрации) с или без 5 мкл, содержащими тестируемое соединение или среду (ДМСО, 1% конечная концентрация), в общем объеме, равном 25 мкл, в полипропиленовом 96-луночном планшете (Greiner, V-образное дно). Через 90 мин при 30C реакции останавливали посредством добавления 25 мкл/лунку 150 мМ фосфорной кислоты. Все содержимое остановленной киназной реакции переносили в предварительно промытые(75 мМ фосфорная кислота) 96-луночные фильтровальные планшеты (Perkin Elmer, номер по каталогу 6005177), используя коллектор клеток (Perkin Elmer). Планшеты промывали 6 раз 300 мкл/лунку 75 мМ раствором фосфорной кислоты и дно планшетов герметично закрывали. Добавляли 40 мкл/лункуMicroscint-20, верхнюю часть планшетов герметично закрывали и считывание осуществляли, используяTopcount (Perkin Elmer). Киназную активность вычисляли посредством вычитания числа импульсов в минуту (чивм), полученного в присутствии ингибитора положительного контроля (10 мкМ стауроспорина) из чивм, полученного в присутствии среды. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность определяли как: Процент ингибирования = чивм, определенное для образца с присутствующим тестируемым соединением - чивм, определенное для образца с ингибитором положительного контроля), разделенное на(чивм, определенное в присутствии среды - чивм, определенное для образца с ингибитором положительного контроля)100. Для соединений получали ряд разведения доз, позволяющий проводить тестирование эффектов доза-ответ в аналитическом тесте для TYK2 и вычисление IC50 для каждого соединения. Каждое соединение рутинным образом тестировали при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разведением 1/3, в 8 точках (20 мкМ-6,67 мкМ-2,22 мкМ-740 нМ-247 нМ-82 нМ-27 нМ-9 нМ) при конечной концентрации 1% ДМСО. Когда активность ряда соединения увеличивалась, получали больше разведений и/или верхнюю концентрацию снижали (например, 5 мкМ, 1 мкМ). Активность соединения изобретения против TYK2 определяли в соответствии с аналитическим тестом, описанным выше, таким образом возвращая значения IC50, равные 167, 135, 119 и 157 нМ. 1.8. Аналитический тест на определение Kd/Ki для TYK2. 1.8.1. Аналитический тест на определение Ki для TYK2. Для определения Ki, различные количества соединения смешивали с ферментом и ферментативную реакцию проводили как функцию от концентрации АТФ. Ki определяли посредством построения графика двойной обратной зависимости Km от концентрации соединения (график Лайнвивера-Берка). TYK2(Carna Biosciences, 08-147) использовали при конечной концентрации, равной 160 нг/мл. Субстрат представлял собой натриевую соль поли(Glu, Tyr) (4:1), ММ 20000-50000 (Sigma, Р 0275). Реакцию осуществляли в 25 мМ Hepes pH 7,2, 50 мМ NaCl, 0,5 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 5 мМ MgCl2, 10 мМ MgCl2, 0,1%Brij-35 с изменяющимися концентрациями АТФ и соединения и останавливали посредством добавления 150 мМ фосфорной кислоты. Измерение введенного фосфата в субстратный поли-GT проводили посредством загрузки образцов на фильтровальный планшет (с использованием коллектора, Perkin Elmer) и последующей промывки. Введенный 33 Р в поли-GT измеряли в сцинтилляционном счетчике Topcount после добавления сцинтиллятора к фильтровальным планшетам (Perkin Elmer). Например, при тестировании в данном аналитическом тесте, соединение изобретения возвращалось к Ki=110 нМ. 1.8.2. Аналитический тест на определение Kd для TYK2.TYK2 (Carna Biosciences, 08-147) использовали при конечной концентрации, равной 50 нМ. Эксперимент по связыванию осуществляли в 50 мМ Hepes pH 7,5, 0,01% Brij-35, 10 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA,используя 15 нМ трэйсера киназы 236 (Invitrogen, PV5592) и 10 нМ европий-анти-GST (Invitrogen,PV5594) с переменными концентрациями соединения. Обнаружение трэйсера осуществляли в соответствии с методикой изготовителя. Пример 2. Аналитические тесты на клетках. 2.1. Аналитический тест на сигнальный путь JAK-STAT. Клетки HeLa поддерживали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% инактивированную нагревом эмбриональную телячью сыворотку, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки HeLa применяли при 70% слияния для трансфекции. 20000 клеток в 87 мкл клеточной культуральной среды преходящим образом трансфицировали 40 нг pSTAT 1(2)-люциферазного репортера (Panomics), 8 нг репортера LacZ в качестве внутреннего контрольного репортера и 52 нг pBSK,используя 0,32 мкл JeT-PEI (Polyplus) в качестве реагента для трансфекции на лунку в формате 96-луночного планшета. После инкубации в течение ночи при 37C 5% СО 2 среду для трансфекции удаляли. Добавляли 81 мкл DMEM+1,5% инактивированной нагревом эмбриональной телячьей сыворотки. 9 мкл соединения при 10 концентрации добавляли в течение 60 мин и затем 10 мкл человеческого OSM(Peprotech) при конечной концентрации 33 нг/мл. Соединение тестировали в двух параллельных опытах, начиная от 20 мкМ, с последующим серийным разведением 1/3, всего при 8 дозах (20 мкМ-6,6 мкМ-2,2 мкМ-740 нМ-250 нМ-82 нМ-27 нМ-9 нМ) при конечной концентрации, равной 0,2% ДМСО. После инкубации в течение ночи при 37C 5% СО 2 клетки лизировали посредством добавления 100 мкл буфера для лизиса/лунку (PBS, 0,9 мМ CaCl2, 0,5 мМ MgCl2, 10% трегалозы, 0,05% тергитолаNP9, 0,3% BSA). 40 мкл клеточного лизата применяли для считывания -галактозидазной активности посредством добавления 180 мкл раствора -Gal (30 мкл ONPG 4 мг/мл + 150 мкл -галактозидазного буфера (0,06 МNa2HPO4, 0,04 M NaH2PO4, 1 мМ MgCl2 в течение 20 мин. Реакцию останавливали посредством добавления 50 мкл Na2CO3, 1 M. Поглощение считывали при 405 нМ. Люциферазную активность измеряли, используя 40 мкл клеточного лизата плюс 40 мкл Steadylite,как описано производителем (Perkin Elmer), на Envision (Perkin Elmer). Пропуск OSM применяли в качестве положительного контроля (100%) ингибирования). В качестве отрицательного контроля применяли 0,5% ДМСО (0% ингибирования). Положительный и отрицательный контроли применяли для вычисления значений z' и "процента ингибирования" (PIN). Процент ингибирования = флуоресценция, определенная в присутствии среды - флуоресценция,определенная для образца с присутствующим тестируемым соединением), разделенная на (флуоресценция, определенная в присутствии среды - флуоресценция, определенная для образца без запуска 100. Значения PIN помещали на график доза-ответ для тестируемых соединений, значения ЕС 50 выводили из него. Активность соединения изобретения против JAK-STAT определяли в соответствии с аналитическим тестом, описанным выше, таким образом возвращая значение IC50, равное 970 нМ. 2.2. Аналитический тест на сигнальный путь OSM/IL-I. Показано, что OSM и IL-I синергически регулируют с повышением уровня ММР 13 в клеточной линии SW1353 хондросаркомы человека. Клетки высевали в 96-луночные планшеты при 15000 клеток/лунку в объеме, равном 120 мкл DMEM (Invitrogen), содержащем 10% (об./об.) FBS и 1% пенициллин/стрептомицин (InVitrogen), инкубированном при 37C, 5% СО 2. Клетки предварительно инкубировали с 15 мкл соединения в среде M199 с 2% ДМСО за 1 ч перед запуском с помощью 15 мкл OSM и IL-I для достижения 25 нг/мл OSM и 1 нг/мл IL-I и уровни ММР 13 измеряли в кондиционированной среде через 48 ч после запуска. Активность ММР 13 измеряли, используя аналитический тест на активность захвата антител. Для этой цели 384-луночные планшеты (NUNC, 460518, MaxiSorb черные) покрывали 35 мкл раствора 1,5 мкг/мл антител против человеческой ММР 13 (RD Systems, MAB511) в течение 24 ч при 4C. После промывки лунок 2 раза с помощью PBS + 0,05% Tween оставшиеся участки связывания блокировали 100 мкл 5% обезжиренного сухого молока (Santa Cruz, sc-2325, Blotto) в PBS в течение 24 ч при 4C. Далее, лунки промывали дважды PBS + 0,05% Tween и добавляли 35 мкл разведения 1/10 супернатанта культуры, содержащего ММР 13 в 100-кратно разведенном блокирующем буфере, и инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре. Далее, лунки промывали дважды PBS + 0,05% Tween с последующей активацией ММР 13 добавлением 35 мкл раствора 1,5 мМ ацетата 4-аминофенилртути(АРМА) (Sigma, A9563) и с инкубацией при 37C в течение 1 ч. Лунки промывали снова PBS + 0,05%Tween и добавляли 35 мкл субстрата ММР 13 (Biomol, Р-126, OmniMMP флуорогенный субстрат). После инкубации в течение 24 ч при 37C флуоресценцию превращенного субстрата измеряли в считывающем устройстве Perkin Elmer Wallac Envision 2102 Multilabel Reader (длина волны возбуждения: 320 нм, длина волны эмиссии: 405 нМ). Процент ингибирования = флуоресценция, определенная в присутствии среды - флуоресценция,определенная для образца с присутствующим тестируемым соединением), разделенная на (флуоресценция, определенная в присутствии среды - флуоресценция, определенная для образца без запуска 100. 2.3. Аналитический тест на пролиферацию PBL. Лимфоциты периферической крови человека (PBL) стимулировали с помощью IL-2 и пролиферацию измеряли, используя аналитический тест на введение BrdU. PBL первоначально стимулировали в течение 72 ч с РНА, чтобы индуцировать рецептор IL-2, затем их подвергали голоданию в течение 24 ч для остановки пролиферации клеток с последующей стимуляцией IL-2 в течение еще других 72 ч (включая 24-часовое мечение BrdU). Клетки предварительно инкубировали с тестируемыми соединениями за 1 ч перед добавлением IL-2. Клетки культивировали в RPMI 1640, содержащей 10% (об./об.) FBS. 2.4. Анализ цельной крови (WBA). 2.4.1. Протокол стимуляции IFN. Чтобы предсказать активность тестируемых соединений для ингибирования JAK1- или JAK2 зависимых сигнальных путей in vivo, была разработана физиологически уместная модель in vitro с использованием человеческой цельной крови. В аналитическом тесте WBA кровь, собранная от человеческих добровольцев, подписавших информированное согласие, обрабатывали ex vivo соединением (1 ч) и в последующем стимулировали либо в течение 30 мин интерфероном(IFN, JAK1-зависимый путь) или в течение 2 ч гранулоцитарным макрофаг-колониестимулирующим фактором (GM-CSF, JAK2 зависимый путь). 2.4.1.1. Аналитический тест фосфо-STAT1. Для симуляции IFN измеряли увеличение фосфорилирования переносчиков сигнала и активаторов транскрипции 1 (pSTAT1) посредством IFN в экстрактах белых кровяных клеток, используя анализpSTAT1 ELISA. Фосфорилирование переносчика сигнала и активатора транскрипции 1 (STAT1) после включения интерферона альфа (IFN) представляет собой JAK1-опосредованное событие. Анализ фосфо-STAT1,который используют для измерения уровней фосфо-STAT1 в клеточных экстрактах, был разработан для оценки способности соединения ингибировать JAK1-зависимые сигнальные пути. Цельную человеческую кровь, собранную от человеческих добровольцев, давших информированное согласие, обрабатывали ex vivo соединение (1 ч) и в последующем стимулировали в течение 30 мин с помощью IFN. Увеличение фосфорилирования STAT1 посредством IFN в экстрактах белых кровяных клеток измеряли, используя фосфо-STAT1 ELISA. Буфер для лизиса ACK состоял из 0,15 М NH4Cl, 10 мМ KHCO3, 0,1 мМ EDTA. рН буфера составлял 7,3. Концентрат 10 буфера для лизиса (часть набора PathScan фосфо-STAT1 (Tyr701) сэндвич-ELISA от Cell Signaling) разбавляли 10-кратно в H2O. Ингибиторы протеаз добавляли к буферу перед применением. 20 мкг IFN растворяли в 40 мкл Н 2 О для получения исходного раствора 500 мкг/мл. Исходный раствор хранили при -20C. Ряд 3-кратного разбавления соединения получали в ДМСО (наивысшая концентрация: 10 мМ). В последующем, соединение дополнительно разводили в среде (фактор разбавления зависел от желательной конечной концентрации соединения). 2.4.1.1.1. Инкубация крови с соединением и стимуляция с помощью IFN. Человеческую кровь собирали в гепаринизированные пробирки. Кровь разделяли на аликвоты по 392 мкл. Далее, 4 мкл разведения соединения добавляли к каждой аликвоте и образцы крови инкубировали в течение 1 ч при 37C. Исходный раствор IFN разбавляли 1000-кратно в среде RPMI для получения рабочего раствора с 500 нг/мл. 4 мкл рабочего раствора с 500 нг/мл добавляли к образцам крови (конечная концентрация IFN: 5 нг/мл). Образцы инкубировали при 37C в течение 30 мин. 2.4.1.1.2. Получение клеточных экстрактов. В конце периода стимуляции 7,6 мл буфера ACK добавляли к образцам крови для лизиса красных кровяных клеток. Образцы смешивали посредством переворачивания пробирок пять раз и реакционную смесь инкубировали на льду в течение 5 мин. Лизис RBC должен быть очевидным во время этой инкубации. Клетки собирали в сгустки посредством центрифугирования при 300g, 4C в течение 7 мин и супернатант удаляли. 10 мл 1 PBS добавляли к каждой пробирке и сгусток клеток ресуспендировали. Образцы снова центрифугировали в течение 7 мин при 300 г, 4C. Супернатант удаляли и сгусток ресуспендировали в 500 мкл 1 PBS. Затем, суспензию клеток переносили в чистую 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Клетки собирали в сгустки посредством центрифугирования при 700g в течение 5 мин при 4C. Супернатант удаляли, и сгусток растворяли в 150 мкл буфера для лизиса клеток. Образцы инкубировали на льду в течение 15 мин. После этой операции, образцы хранили при -80C до дальнейшей обработки. 2.4.1.1.3. Измерение фосфорилирования STAT1 посредством ELISA. Набор сэндвич-ELISA Pathscan фосфо-STAT1 (Tyr701) от Cell Signaling (Кат.7234) применяли для определения фосфо-STAT1 уровней. Клеточные экстракты оттаивали на льду. Пробирки центрифугировали в течение 5 мин при 16000g, 4C и собирали осветленные лизаты. В то же время, микролуночные стрипы из набора уравновешивали до комнатной температуры и промывочный буфер получали разбавлением 20 промывочный буфер в Н 2 О. Образцы разбавляли 2-кратно в разбавителе для образцов и 100 мкл добавляли к микролуночным стрипам. Стрипы инкубировали в течение ночи при 4C. На следующий день лунки промывали 3 раза промывочным буфером. 100 мкл идентифицирующих антител добавляли в лунки. Стрипы инкубировали при 37C в течение 1 ч. Затем лунки промывали 3 раза промывочным буфером повторно. 100 мкл HRP-связанных вторичных антител добавляли в каждую лунку, и образцы инкубировали при 37C. Через 30 мин лунки промывали 3 раза повторно и 100 мкл ТМВсубстрата добавляли во все лунки. Когда образцы приобретали синюю окраску, 100 мкл STOP-раствора добавляли для остановки реакции. Поглощение измеряли при 450 нМ. 2.4.1.2. Анализ данных. Ингибирование индукции фосфо-STAT 1 посредством IFN в клеточных экстрактах наносили на график зависимости от концентрации соединения и значения IC50 выводили, используя программное обеспечение Graphpad. Данные сохраняли, если R2 было больше чем 0,8 и угловой коэффициент был меньше чем 3. 2.4.1.3. ELISA IL-8. Для стимуляции GM-CSF увеличение уровней интерлейкина-8 (IL-8) в плазме измеряли, используя аналитический тест ELISA для IL-8. Экспрессия интерлейкина 8 (IL-8), индуцированная гранулоцитарным макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF), представляет собой JAK2 опосредованное событие. ELISA IL-8, который может применяться для измерения уровней IL-8 в образцах плазмы, был разработан для оценки способности соединения ингибировать JAK2-зависимые сигнальные пути. Цельную человеческую кровь, забранную от добровольцев, подписавших информированное согласие, обрабатывали ex vivo соединением (1 ч) и последовательно стимулировали в течение 2 ч с помощью GM-CSF. Увеличение уровней IL-8 в плазме измеряли, используя аналитический тест ELISA для IL-8. 10 мкг GM-CSF растворяли в 100 мкл H2O для получения исходного раствора 100 мкг/мл. Исходный раствор сохраняли при -20C. Ряд 3-кратного разбавления тестируемого соединения получали в ДМСО (наивысшая концентрация: 10 мМ). Последовательно соединение дополнительно разводили в среде (кратность разведения зависела от желательной конечной концентрации соединения). 2.4.1.3.1. Инкубация крови с соединением и стимуляция с помощью GM-CSF. Человеческую кровь собирали в гепаринизированные пробирки. Кровь разделяли на аликвоты по 245 мкл. После этого, 2,5 мкл разведения тестируемого соединения добавляли к каждой аликвоте, и образцы крови инкубировали в течение 1 ч при 37C. Исходный раствор GM-CSF разбавляли 100-кратно в среде RPMI с получением рабочего раствора с концентрацией 1 мкг/мл. 2,5 мкл рабочего раствора с концентрацией 1 мкг/мл добавляли к образцам крови (конечная концентрация GM-CSF: 10 нг/мл). Образцы инкубировали при 37C в течение 2 ч. 2.4.1.3.2. Получение образцов плазмы. Образцы центрифугировали в течение 15 мин при 1000g, 4C. 100 мкл плазмы собирали и хранили при -80C до дальнейшего использования. 2.4.1.3.3. Измерение уровней IL-8 посредством ELISA. Набор для хемилюминесцентного иммунологического анализа человеческого IL-8 от RD Systems(Кат.Q8000B) применяли для определения уровней IL-8. Промывочный буфер получали разбавлением 10 промывочного буфера в H2O. Рабочий люминесцентный реагент получали посредством добавления 1 части реагента 1 Glo к 2 частям реагента Glo В за 15 мин - 4 ч перед использованием. 100 мкл аналитического разбавителя RD1-86 добавляли в каждую лунку. После этого добавляли 50 мкл образца (плазма). Планшет для ELISA инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре, 500 об/мин. Все лунки промывали 4 раза промывочным буфером и 200 мкл конъюгата IL-8 добавляли в каждую лунку. После инкубации в течение 3 ч при комнатной температуре лунки промывали 4 раза промывочным буфером и 100 мкл рабочего люминесцентного реагента добавляли в каждую лунку. Планшет ELISA инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре (в защищенном от света месте). Люминесценцию измеряли (время считывания 0,5 с/лунку). 2.4.2. Протокол стимуляции IL-6. В дополнение осуществляли анализ методом проточной цитометрии для установления селективности соединения к JAK1 по сравнению с JAK2 ex vivo, используя цельную человеческую кровь. Следовательно, кровь брали от добровольцев, подписавших информированное согласие. Кровь затем уравновешивали в течение 30 мин при 37C при осторожном встряхивании, затем аликвотировали в пробирки Эппендорфа. Соединение добавляли при различных концентрациях и инкубировали при 37C в течение 30 мин при осторожном встряхивании и последовательно стимулировали в течение 20 мин при 37C при осторожном встряхивании с интерлейкином 6 (IL-6) для стимуляции JAK1-зависимого пути или GM-CSF для стимуляции JAK2-зависимого пути. Фосфо-STAT1 и фосфо-STAT5 затем оценивали, используя анализ FACS. 2.4.2.1. Аналитические тесты с фосфо-STAT1. Для IL-6-стимулированного увеличения фосфорилирования передатчиков сигналов и активаторов транскрипции 1 (pSTAT1) в белых кровяных клетках цельную человеческую кровь, взятую от добровольцев, подписавших информированное согласие, обрабатывали ex vivo соединением в течение 30 мин и последовательно стимулировали в течение 20 мин с помощью IL-6. Увеличение фосфорилированияSTAT1 посредством IL-6 в лимфоцитах измеряли, используя антитела против фосфо-STAT1 посредствомFACS. Буфер 5 Х Lyse/Fix (BD PhosFlow, Кат.558049) разбавляли 5-кратно дистиллированной водой и предварительно нагревали при 37C. Оставшийся разбавленный буфер Lyse/Fix удаляли в отходы. 10 мкг rhIL-6 (RD Systems, Кат.206-IL) растворяли в 1 мл PBS 0,1% BSA для получения исходного раствора с 10 мкг/мл. Исходный раствор аликвотировали и хранили при -80C. Ряд 3-кратного разбавления соединения получали в ДМСО (10 мМ исходного раствора). В обработанные контролем образцы добавляли ДМСО вместо соединения. Все образцы инкубировали при 1% конечной концентрации ДМСО. 2.4.2.1.1. Инкубация крови с соединением и стимуляция с IL-6. Человеческую кровь собирали в гепаринизированные пробирки. Кровь разделяли на аликвоты по 148,5 мкл. Затем 1,5 мкл разбавления тестируемого соединения добавляли к каждой аликвоте крови и образцы крови инкубировали в течение 30 мин при 37C при осторожном встряхивании. Исходный раствор IL-6 (1,5 мкл) добавляли к образцам крови (конечная концентрация 10 нг/мл) и образцы инкубировали при 37C в течение 20 мин при осторожном встряхивании. 2.4.2.1.2. Получение белых кровяных клеток и мечение CD4. В конце периода стимуляции, 3 мл 1X предварительно нагретого буфера Lyse/Fix немедленно добавляли к образцам крови, непродолжительно встряхивали и инкубировали в течение 15 мин при 37C на водяной бане, чтобы лизировать красные кровяные клетки и фиксировать лейкоциты, затем замораживали при -80C до дальнейшего использования. Для следующих стадий пробирки оттаивали при 37C в течение приблизительно 20 мин и центрифугировали в течение 5 мин при 400g при 4C. Сгусток клеток промывали 3 мл холодного 1X PBS и после центрифугирования сгусток клеток ресуспендировали в 100 мкл PBS, содержащего 3% BSA. Добавляли FITC-конъюгированные антитела против CD4 или контрольные FITC-конъюгированные изотипные антитела и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, в темноте. 2.4.2.1.3. Пермеабилизация клеток и мечение антителами против фосфо-STAT1. После промывки клеток 1X PBS, сгусток клеток ресуспендировали в 100 мкл ледяного 1X PBS и добавляли 900 мкл ледяного 100% метанола. Клетки затем инкубировали при 4C в течение 30 мин для пермеабилизации. Клетки с нарушенной проницаемостью мембраны затем промывали 1X PBS, содержащего 3% BSA и окончательно ресуспендировали в 80 мкл 1X РВХ, содержащего 3% BSA. Добавляли 20 мкл РЕ мышиных антител против-STAT1 (pY701) или РЕ мышиных IgG2aK изотипных контрольных антител (BD Biosciences, Кат.612564 и 559319 соответственно) и смешивали, затем инкубировали в течение 30 мин при 4C, в темноте. Клетки затем промывали однократно 1X PBS и анализировали на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences). 2.4.2.1.4. Анализ флуоресценции на FACSCanto II. Всего было подсчитано 50000 событий и фосфо-STAT1 положительные клетки измеряли после открытия мембранного канала на CD4+ клетках, в лимфоцитарном мембранном канале. Данные анализировали, используя программное обеспечение FACSDiva, и вычисляли процент ингибирования стимуляцииIL-6 по процентному содержанию положительных клеток для фосфо-STAT1 на CD4+ клетках. 2.4.2.2. Аналитический тест с фосфо-STAT5. Для GM-CSF-стимулированного увеличения фосфорилирования передатчиков сигналов и активаторов транскрипции 5 (pSTAT5) в белых кровяных клетках цельную человеческую кровь, взятую от добровольцев, подписавших информированное согласие, обрабатывали ex vivo соединением в течение 30 мин и последовательно стимулировали в течение 20 мин с GM-CSF. Увеличение фосфорилирования STAT5 посредством GM-CSF в моноцитах измеряли, используя антитело против фосфо-STAT5 посредствомFACS. Буфер 5 Х Lyse/Fix (BD PhosFlow, Кат.558049) разбавляли 5-кратно дистиллированной водой и предварительно нагревали при 37C. Оставшийся разбавленный буфер Lyse/Fix удаляли в отходы. 10 мкг rhGM-CSF (AbCys S.A., Кат.Р 300-03) растворяли в 100 мкл PBS 0,1% BSA для получения исходного раствора с 100 мкг/мл. Исходный раствор сохраняли аликвотированным при -80C. Ряд 3-кратного разведения соединения получали в ДМСО (10 мМ исходный раствор). В образцы с обработкой контролем добавляли ДМСО без тестируемого соединения. Все образцы инкубировали при 1% конечной концентрации ДМСО. 2.4.2.2.1. Инкубация крови с соединением и стимуляция с GM-CSF. Человеческую кровь собирали в гепаринизированные пробирки. Кровь разделяли на аликвоты по 148,5 мкл. Затем 1,5 мкл разведения соединения добавляли к каждой аликвоте и образцы крови инкубировали в течение 30 мин при 37C при осторожном встряхивании. Исходный раствор GM-CSF (1,5 мкл) добавляли к образцам крови (конечная концентрация 20 пг/мл) и образцы инкубировали при 37C в течение 20 мин при осторожном встряхивании. 2.4.2.2.2. Получение белых кровяных клеток и мечение CD14. В конце периода стимуляции 3 мл 1X предварительно нагретого буфера Lyse/Fix немедленно добавляли к образцам крови, непродолжительно встряхивали и инкубировали в течение 15 мин при 37C в водяной бане, чтобы лизировать красные кровяные клетки и фиксировать лейкоциты, затем замораживали при -80C до дальнейшего применения. Для дальнейших стадий пробирки оттаивали при 37C в течение приблизительно 20 мин и центрифугировали в течение 5 мин при 400g при 4C. Сгусток клеток промывали 3 мл холодного 1X PBS и после центрифугирования сгусток клеток ресуспендировали в 100 мкл PBS, содержащего 3% BSA. Добавляли FITC мышиные антитела против CD14 (BD Biosciences,Кат.345784) или контрольные FITC мышиные изотипные антитела IgG2bK (BD Biosciences, Кат.555057) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, в темноте. 2.4.2.2.3. Пермеабилизация клеток и мечение антителами против фосфо-STAT5. После промывки клеток 1X PBS сгусток клеток ресуспендировали в 100 мкл ледяного 1X PBS и добавляли 900 мкл ледяного 100% метанола. Клетки затем инкубировали при 4C в течение 30 мин для пермеабилизации. Клетки с нарушенной проницаемостью мембраны затем промывали 1X PBS, содержащего 3%. BSA и окончательно ресуспендировали в 80 мкл 1X РВХ, содержащего 3% BSA. Добавляли 20 мкл РЕ мышиных антител против-STAT5 (pY694) или РЕ мышиных изотипных контрольных антителIgGlK (BD Biosciences, Кат.612567 и 554680 соответственно), смешивали, затем инкубировали в течение 30 мин при 4C, в темноте. Клетки затем однократно промывали 1X PBS и анализировали на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences). 2.4.2.2.4. Анализ флуоресценции на FACSCanto II. Всего было подсчитано 50000 событий и фосфо-STAT5 положительные клетки измеряли после открытия мембранного канала на CD14+ клетках. Данные анализировали, используя программное обеспечение FACSDiva, и приводили в соответствие с процентом ингибирования стимуляции GM-CSF, вычисленного по процентному содержанию положительных клеток для фосфо-STAT5 на CD14+ клетках. Пример 3. Модели in vivo. 3.1. Модель CIA. 3.1.1 Материалы. Полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA) были приобретены отDifco. Бычий коллаген типа II (CII), липополисахарид (LPS) и Энбрел получали от Chondrex (Isle d'Abeau, France); Sigma (P4252, L'Isle d'Abeau, France), Whyett (25 мг инъекционный шприц, France) AcrosOrganics (Palo Alto, CA) соответственно. Все другие использованные реагенты имели реагентную степень чистоты, и все растворители имели аналитическую степень чистоты. 3.1.2. Животные. Темные крысы Агути (самцы, возраст 7-8 недель) получали от Harlan Laboratories (Maison-Alfort,France). Крыс содержали при 12-часовом цикле свет/темнота (0700-1900). Температуру поддерживали при 22C и пищу и воду обеспечивали ad libitum. 3.1.3. Индуцированный коллагеном артрит (CIA). За один день перед экспериментом раствор CII (2 мг/мл) готовили вместе 0,05 М уксусной кислотой и хранили при 4C. Непосредственно перед иммунизацией равные объемы адъюванта (IFA) и CII смешивали посредством гомогенизатора в предварительно охлажденной стеклянной бутыли в бане с ледяной водой. Дополнительный адъювант и пролонгированная гомогенизация могут потребоваться, если эмульсия не образовалась. 0,2 мл эмульсии вводили посредством внутрикожной инъекции у основания хвоста каждой крысе в день 1, вторую бустерную внутрикожную инъекцию (раствор CII при 2 мг/мл в CFA 0,1 мл физраствора) осуществляли на день 9. Этот метод иммунизации был модифицирован на основании опубликованных методов (Sims et al., 2004; Jou et al., 2005). 3.1.4. План исследования. Терапевтические эффекты соединений тестировали на крысиной модели CIA. Крыс статистически разделяли на равные группы, и каждая группа содержала 10 крыс. Всех крыс иммунизировали в день 1 и повторно иммунизировали в день 9. Терапевтическое дозирование длилось от дня 16 до дня 30. Группу отрицательного контроля обрабатывали средой (МС 0,5%), а группу положительного контроля Энбрел(10 мг/кг, 3 неделю, п.к.). Соединение, представляющее интерес обычно тестировали при 3 дозах, например 3, 10, 30 мг/кг, п.о. 3.1.5. Клиническая оценка артрита. Артрит оценивали по балльной системе в соответствии со способом Khachigian, 2006, Lin et. al. 2007 и Nishida et al. 2004). Опухание каждой из четырех лап ранжировали с использованием балльной оценки артрита следующим образом: 0 - отсутствие симптомов; 1 - мягкие, но с определенной краснотой и опухание одного типа сустава, такого как лодыжка или кисти, или явная краснота и опухание, ограниченное индивидуальными пальцами, независимо от числа пораженных пальцев; 2 - умеренная краснота и опухание двух или более типов суставов; 3-сильная краснота и опухание целой лапы, включая пальцы; 4 - максимально воспаленная конечность с вовлечением множества суставов (максимальная кумулятивная клиническая балльная оценка артрита 16 на животное) (Nishida et al., 2004). Для обеспечения возможности метаанализа множества исследований значения клинических балльных оценок нормализовали следующим образом.AUC клинической балльной оценки (балльная оценка AUC): площадь под кривой (AUC) от дня 1 до дня 14 рассчитывали для каждой индивидуальной крысы. AUC каждого животного делили на среднююAUC, полученную для среды в исследовании, из которого получали данные для этого животного, и умножали на 100 (т.е. AUC выражали в виде процентной доли AUC средней среды на исследование). Клиническая балльная оценка возрастала от дня 1 до дня 14 (балльная оценка окончания исследования): различие клинических балльных оценок для каждого животного делили на среднее различие клинических балльных оценок, полученное для среды в исследовании, из которого получали данные для этого животного и умножали на 100 (т.е. различие выражали как процентную долю среднего различия клинических балльных оценок для среды на исследование). 3.1.6. Изменение массы тела (%) после наступления артрита. Клинически, потерю массы тела ассоциируют с артритом (Shelton et al., 2005; Argiles et al., 1998;Rail, 2004; Walsmith et al., 2004). Следовательно, изменения массы тела после наступления артрита могут использоваться в качестве неспецифической конечной точки для оценки эффекта терапевтических средств на крысиной модели. Изменение массы тела (%) после наступления артрита рассчитывали следующим образом: Мыши: 3.1.7. Рентгенология. Получали рентгеновские снимки задних лап каждого индивидуального животного. Статистический слепой идентификационный номер присваивали каждому из снимков и тяжесть костной эрозии ранжировали посредством независимых балльных шкал с помощью рентгенологической балльной системы Ларсена следующим образом: 0 - нормальная с неизмененными костными контурами и нормальным суставным объемом; 1 - легкая аномалия с одной или двумя из наружных плюсневых костей, показывающих легкую костную эрозию; 2 - определенная ранняя аномалия с любой из 3-5 из наружных плюсневых костей, показывающей костную эрозию; 3 - средняя деструктивная аномалия со всеми наружными плюсневыми костями, а также любыми одой или двумя внутренними плюсневыми костями, показывающими определенные костные эрозии; 4 - тяжелая деструктивная аномалия со всеми плюсневыми костями, показывающая определенную костную эрозию и по меньшей мере одним из полностью эродировавших внутренних плюсневых суставов, причем контуры некоторых костных суставов частично сохраняются; 5 - калечащая аномалия без костных контуров. Данная система балльных оценок является модификацией системы Salvemini et al., 2001; Bush et al., 2002; Sims et al., 2004; Jou et al., 2005. 3.1.8. Гистология. После рентгенологического анализа задние лапы мышей фиксировали в 10% забуференном фосфатом формалине (рН 7,4), декальцифицировали с помощью быстрого костного декальцификатора для тщательной гистологии (Laboratories Eurobio) и погружали в парафин. Для обеспечения обширной оценки пораженных артритом суставов по меньшей мере четыре надреза в ряд (5 мкм толщиной) надрезали, и каждый ряд надрезов имел промежуток 100 мкм между ними. Надрезы окрашивали гематоксилином и эозином (НЕ). Гистологические исследования в случаях синовиального воспаления и повреждения костей хряща осуществляли, используя двойной слепой протокол. Для каждой лапы оценивали четыре параметра, используя четырехбалльную шкалу. Параметрами являлись клеточная инфильтрация, тяжесть паннуса, эрозия хряща и костная эрозия. Присвоение баллов осуществляли соответственно следующим образом: 1 - нормальная, 2 - мягкая, 3 - умеренная, 4 - выраженная. Четыре балльные оценки суммировали вместе и представляли в качестве дополнительной бальной оценки, а именно "полная балльная оценка РА". 3.1.9. Микрокомпьютерная томография (мКТ) кальканеуса (пяточной кости). Разрушение кости, наблюдаемое при РА, происходит в особенности по трубчатой кости и может быть продемонстрировано посредством мКТ-анализа (Sims NA et al., Arthtitis Rheum. 50 (2004), 23382346: Targeting osteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collagen-induced arthritis; Oste L.CIA model by micro-CT morphometry). После сканирования и 3D объемной реконструкции пяточной кости костное разрушение измеряли в виде ряда дискретных объектов, представленных на срезе, выделенном при компьютерном моделировании перпендикулярно продольной оси кости. Чем больше кости разрушается, тем больше дискретных объектов измеряли. Анализировали 1000 срезов, равномерно распределенных вдоль пяточной кости (разделенных промежутком около 10,8 мкМ). 3.1.10. ФК в устойчивом состоянии. На день 7 или 11 образцы крови собирали при ретро-орбитальном синусе с использованием гепарина лития в качестве антикоагулянта при следующих временных отметках: предварительная доза, 1, 3 и 6 ч. Образцы цельной крови центрифугировали и полученные в результате образцы плазмы хранили при-20C в ожидании анализа. Плазменные концентрации каждого тестируемого соединения определяли посредством метода ЖХ-МС/МС, при котором масс-спектрометр эксплуатируют в положительном электрораспылительном режиме. Фармакокинетические параметры рассчитывали, используя Winnonlin(Pharsight, United States), и предполагали, что такие преддозовые плазменные уровни равны плазменным уровням до 24 ч. 3.1.11. Результаты. Соединение изобретения проявляло статистически значимые улучшения по нормализованным значениям клинической балльной оценки (рассчитанной как AUC или как отличие от дня 1 до дня 14) при дозе, равной 0,1 мг/кг. Пример 3.2. Модель септического шока. Инъекция липополисахарида (ЛПС) индуцирует быстрое высвобождение растворимого фактора некроза опухоли (ФНО-альфа) в периферию. Данную модель применяли для анализа перспективных блокаторов высвобождения ФНО in vivo. Шесть мышиных самок линии BALB/cJ (20 г) на группу обрабатывали при назначенном дозировании однократно, п.о. (перорально). Через 30 мин ЛПС (15 мкг/кг; серотипа 0111:В 4 Е.Coli) инъецировали в.б. (внутрибрюшинно). Через 90 мин мышей безболезненно умерщвляли и собирали кровь. Уровни циркулирующего ФНО-альфа определяли, используя доступные для приобретения наборы ELISA. Дексаметазон (5 мкг/кг) применяли в качестве референтного противовоспалительного соединения. Пример 3.3. Модель mAb. Модель mAb позволяет проводить быструю оценку модуляции РА-подобного воспалительного ответа посредством терапевтических средств (Kachigian L.M. Nature Protocols (2006), 2512-2516: Collagenantibody-induced arthritis). Мышам линии DBA/J инъецировали в.в. (внутривенно) смесь mAb, направленную против коллагена II. Через один день инициировали обработку соединением (среда: 10% (об./об.)HPCD). Через три дня мыши получали в.б. инъекцию ЛПС (50 мкг/мышь), приводящую к быстрому наступлению воспаления. Обработку соединением продолжали вплоть до 10 дней после инъекции mAb. Воспаление считывали посредством измерения опухания лапы и регистрации клинической балльной оценки каждой лапы. Кумулятивную клиническую балльную оценку артрита четырех конечностей представляли, чтобы показать тяжесть воспаления. Балльную систему оценки применяли к каждой конечности, используя шкалу 0-4, причем оценка 4 являлась оценкой самого тяжелого воспаления, 0 - без симптомов; 1 - мягкие, но определенные краснота и опухание одного типа суставов, таких как лодыжка или кисть, или явные краснота и опухание, ограниченные индивидуальными пальцами, независимо от числа пораженных пальцев, 2 - умеренные краснота и опухание двух или более типов суставов, 3 - тяжелые краснота и опухание целой лапы, включая пальцы, 4 - максимально воспаленная конечность с вовлечением множества суставов. Пример 3.4. Онкологические модели. Модели in vivo для оценки эффективности действия малых молекул по отношению к JAK2 управляемым миелопролиферативным заболеваниям описаны Wernig et al. Cancer Cell, 13, 311, 2008 иGeron et al., Cancer Cell, 13, 321, 2008. Пример 3.5. Мышиная модель IBD. Модели in vitro и in vivo для оценки эффективности действия малых молекул по отношению к IBD описаны Wirtz et al., 2007. Пример 3.6. Модель мышиной астмы. Модели in vitro и in vivo для оценки эффективности действия малых молекул по отношению к астме описаны Nials et al., 2008; Ip et al., 2006; Pernis et al., 2002; Kudlacz et al., 2008. Пример 4. Фармакокинетические, DMPK и аналитические тесты на токсичность. Пример 4.1. Термодинамическая растворимость. Раствор 1 мг/мл тестируемого соединения получали в 0,2 М фосфатном буфере рН 7,4 или 0,1 М цитратном буфере рН 3,0 при комнатной температуре в стеклянном пузырьке. Образцы вращали на вращающем приводном устройстве STR 4 (Stuart Scientific, Bibby) при скорости 3,0 при комнатной температуре в течение 24 ч. Через 24 ч 800 мкл образца переносили в пробирку Эппендорфа и центрифугировали 5 мин при 14000 об/мин. 200 мкл супернатанта образца затем переносили в планшет для исследования растворимости MultiscreenR (Millipore, MSSLBPC50) и супернатант отфильтровывали (10-12" Hg) с помощью вакуумного коллектора в чистый полипропилен 96-луночный планшет Greiner с V-образным дном(Кат.651201). 5 мкл фильтрата разбавляли в 95 мкл (F20) такого же буфера, используемого для инкубации в планшете, содержащем концентрации для построения стандартной кривой (Greiner,Кат.651201). Стандартную кривую для соединения получали по свежеприготовленным разведениям в ДМСО,начиная от 10 мМ ДМСО, исходный раствор разводили в 2 раза в ДМСО (5000 мкМ) и затем дополнительно разводили ДМСО вплоть до 19,5 мкМ. 3 мкл ряда разведения из 5000 мкМ затем переносили в 97 мкл смеси ацетонитрил-буфер (50/50). Конечный концентрационный интервал составлял от 2,5 до 150 мкМ. Планшет герметично закрывали герметизирующими покрытиями (MA96RD-04S, Kinesis, Cambs,PE19 8YX, UK) и образцы измеряли при комнатной температуре на ЖХМС (ZQ 1525 от Waters) при оптимизированных условиях, используя Quanoptimize для определения соответствующей массы молекулы. Образцы анализировали на ЖХМС при скорости потока 1 мл/мин. Растворитель А представлял собой 15 мМ аммиак, и растворитель В представлял собой ацетонитрил. Образец проходил условия распыления положительных ионов на колонке XBridge C18 3,5 мкм (2,130 мм) от Waters. Градиент растворителя имел полное время прохождения, равное 2 мин, и составлял от 5 до 95% В. Площади под пиками анализировали с помощью пакета программного обеспечения Masslynx и площади под пиками для образцов наносили на график зависимости для стандартной кривой для получения растворимости соединения. Значения растворимости представляли в мкМ или мкг/мл. Пример 4.2. Водорастворимость. 4.2.1. Методика оценки водорастворимости с 2% ДМСО. Начиная с 10 мМ исходного раствора в ДМСО, серийные разведения соединения получали в ДМСО. Ряд разведений переносили в 96-луночный планшет NUNC Maxisorb с F-дном (Кат.442404) и добавляли 0,2 М фосфатный буфер рН 7,4 или 0,1 М цитратный буфер рН 3,0 при комнатной температуре. Конечная концентрация находилась в интервале от 200 до 2,5 мкМ на 5 эквивалентных стадиях разведения. Конечная концентрация ДМСО не превышала 2%. 200 мкМ пирена добавляли к угловым точкам каждого 96-луночного планшета, и это служило в качестве референтной точки для калибровки Z-оси на микроскопе. Аналитические планшеты герметически закрывали и инкубировали в течение 1 ч при 37C при встряхивании при 230 об/мин. Планшеты затем сканировали в условиях белого света микроскопа,получая на выходе индивидуальные картины осадка на концентрацию. Осадок анализировали и преобразовывали в число, которое наносили на график. Первая концентрация, при которой соединение кажется полностью растворенным, является концентрацией, которая представлена ниже, однако истинная концентрация будет находиться где-то между этой концентрацией и выше одной стадии разведения. Значения растворимости, измеренные в соответствии с этим протоколом, приведены в мкг/мл. 4.2.2. Методика оценки водорастворимости с 3% ДМСО. Начиная с 10 мМ исходного раствора в ДМСО, серийные разведения соединения получали в ДМСО. Ряд разведений переносили 96-луночный планшет NUNC Maxisorb F-bottom (Кат.442404) и добавляли 0,1 М фосфатный буфер рН 7,4 или 0,1 М цитратный буфер рН 3,0 при комнатной температуре. Конечная концентрация находилась в интервале от 300 до 18,75 мкМ на 5 эквивалентных стадиях разведения. Конечная концентрация ДМСО не превышала 3%. 200 мкМ пирена добавляли к угловым