Терапия неврологических заболеваний на основе баклофена и акампросата

ТЕРАПИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ОСНОВЕ БАКЛОФЕНА И АКАМПРОСАТА Настоящее изобретение касается комбинаций и способов лечения неврологических заболеваний,связанных с эксцитотоксичностью глутамата и токсичностью -амилоида. В частности,настоящее изобретение касается новой комбинированной терапии рассеянного склероза, болезни Альцгеймера и родственных ей заболеваний, бокового амиотрофического склероза, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, невропатических болей, алкогольной нейропатии, алкоголизма или синдрома отмены алкоголя либо травмы спинного мозга на основе комбинации баклофена и акампросата. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение имеет отношение к комбинациям и способам лечения неврологических заболеваний. В частности, настоящее изобретение имеет отношение к новой комбинированной терапии неврологических заболеваний на основе комбинации баклофена и акампросата. Уровень техники Болезнь Альцгеймера (AD) является типичной корковой деменцией, которая характеризуется дефицитом памяти вместе с дисфазией (расстройство речи, при котором отмечается нарушение речи и понимание речи), диспраксией (нарушение способности к координации и выполнению определенных целенаправленных движений и жестов при отсутствии моторных и сенсорных нарушений) и агнозией (нарушение способности к распознаванию предметов, лиц, звуков, образов или запахов), что объясняется вовлеченностью ассоциативных областей коры головного мозга. Также могут отмечаться и специальные симптомы, такие как спастический парапарез (слабость, поражающая нижние конечности) (1-4). Встречаемость болезни Альцгеймера сильно возрастает с возрастом. AD в настоящее время является наиболее частой причиной слабоумия. Клинически она характеризуется глобальным снижением когнитивной функции, которое медленно прогрессирует и оставляет пациентов на последней стадии прикованными к постели, с недержанием мочи и зависимыми от посторонней помощи. Смерть наступает в среднем через 9 лет после установления диагноза (5). Рост заболеваемости AD сильно возрастает с возрастом. По оценкам роста населения ООН, количество людей старше 80 лет приблизится к 370 млн к 2050 г. В настоящее время считается, что 50% людей старше 85 лет страдают AD. Таким образом, через 50 лет более 100 млн людей во всем мире будут страдать слабоумием. То, что огромное число людей будет нуждаться в постоянном уходе и других услугах,сильно скажется на медицинских, денежных и людских ресурсах (6). Нарушение памяти является ранним признаком заболевания и затрагивает эпизодическую память(память на текущие события). Семантическая память (память на вербальные и визуальные значения) вовлекается в заболевание позже. Напротив, рабочая память (кратковременная память, вовлекающая структуры и процессы, используемые для временного хранения и обработки информации) и процедурная память (бессознательная память, которая является долговременной памятью навыков и процедур) сохраняются вплоть до последней стадии. По мере прогрессирования заболевания появляются дополнительные признаки нарушения речи, дефекты визуального и пространственного восприятия, возникает агнозия и апраксия. Классическая картина болезни Альцгеймера достаточно характерна и позволяет идентифицировать е примерно в 80% случаев (7). Тем не менее, существует клиническая гетерогенность, которая важна не только для клинического лечения, но также требует определенного лекарственного лечения для функционально различных форм (8). Отличительной чертой патологии AD являются амилоидные бляшки, содержащие бета-амилоид (Абета), нейрофибриллярные клубки (NFT), содержащие Tau, а также дисфункция и потеря нейронов и синапсов (9-11). За последнее десятилетие были выдвинуты две основные гипотезы о причинах AD: "гипотеза амилоидного каскада", которая гласит, что нейродегенеративный процесс представляет собой ряд событий, запускаемых аномальным процессингом предшественника амилоидного белка (АРР) (12), и"гипотеза дегенерации цитоскелета нейронов" (13), в которой предполагается, что пусковым событием являются изменения цитоскелета. Наиболее общепринятой теорией, объясняющей течение AD, является гипотеза амилоидного каскада (14-16), причем исследователи AD в основном сосредоточились на определении механизмов, лежащих в основе токсичности, связанной с белками А-бета. В качестве ключевых событий, способствующих токсичности АРР в амилоидном каскаде (17), установлены проницаемость и реконструкция микрососудов, аберрантный ангиогенез и нарушение гематоэнцефалического барьера. Напротив, белок Tau получил гораздо меньше внимания со стороны фармацевтической промышленности, чем амилоид, как по фундаментальным, так и по практическим причинам. Кроме того, изменение плотности синапсов является тем патологическим повреждением, которое лучше всего коррелирует с когнитивными нарушениями по сравнению с двумя другими. Исследования показали, что амилоидная патология развивается специфичным к нейромедиаторам образом, причем холинергические окончания наиболее уязвимы, а затем следуют глутаматергические окончания и, наконец, ГАМКергические окончания (11). Наиболее распространенным возбуждающим нейромедиатором в нервной системе млекопитающих является глутамат. При патологических условиях его чрезмерное накопление в синаптической щели ведет к избыточной активации глутаматных рецепторов (18). Чрезмерное накопление глутамата в синаптической щели вызывает перевозбуждение глутаматных рецепторов, что приводит к патологическим процессам и, наконец, к гибели нервных клеток. Этот процесс, который называют эксцитотоксичностью, обычно наблюдается в нервных тканях при острых и хронических неврологических заболеваниях. Становится очевидным, что эксцитотоксичность участвует в патогенезе многих заболеваний различной этиологии, таких как травмы спинного мозга, инсульт, травматическое повреждение мозга, потеря слуха, алкоголизм и синдром отмены алкоголя, алкогольная невропатия, невропатические боли, а также такие нейродегенеративные заболевания, как рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона (19-21). Разработка эффективного лечения этих заболеваний остается главной проблемой здравоохранения из-за их частоты, а также отсутствия способов лечения. Для облегчения или замедления симптомов AD используются два типа лекарств, которые составляют некоторые модуляторы ацетилхолинэстеразы и блокаторы NMDA-глутаматных рецепторов (26-27). Антагонисты NMDAR, нацеленные на различные участки этого рецептора, были протестированы для противодействия эксцитотоксичности. Неконкурентные антагонисты NMDAR воздействуют на пору ионного канала, тем самым уменьшая вход кальция в постсинаптические нейроны. Некоторые из них уже одобрены для применения. Так, например, мемантин в настоящее время разрешен к применению при умеренной и тяжелой форме болезни Альцгеймера. Его испытывали клинически и для других показаний,включая компонент эксцитотоксичности, такой как алкогольная зависимость (фаза II), боковой амиотрофический склероз (фаза III), слабоумие в связи с болезнью Паркинсона (фаза II), эпилепсия, болезнь Хантингтона (фаза IV), рассеянный склероз (фаза IV), болезнь Паркинсона (фаза IV) и черепно-мозговая травма (фаза IV). Однако эта молекула приносит ограниченную пользу для большинства пациентов с болезнью Альцгеймера, поскольку она оказывает только незначительные симптоматические эффекты. Другой подход к ограничению эксцитотоксичности состоит в ингибировании пресинаптического высвобождения глутамата. Ритузол, который в настоящее время разрешен к применению при боковом амиотрофическом склерозе, показал обнадеживающие результаты на моделях ишемии и черепно-мозговой травмы (22-25). В настоящее время он проходит II фазу испытаний при ранней стадии рассеянного склероза, болезни Паркинсона (проявляет не лучшие результаты, чем плацебо), а также травмы спинного мозга. В 1995 г. препарат получил статус "препарата-сироты" для лечения бокового амиотрофического склероза, а в 1996 г. - для лечения болезни Хантингтона. Применение таких антагонистов NMDAрецептора, как мемантин, фелбамат, акампросат и MRZ 2/579 для лечения депрессии, также было предложено в US 2010076075. В WO 2009133128, WO 2009133141, WO 2009133142 и WO 2011054759 раскрыты комбинации препаратов для применения при лечении AD. Несмотря на активные исследования в этой области, по-прежнему существует потребность в альтернативных или улучшенных эффективных способах терапии для неврологических заболеваний, связанных с токсичностью глутамата и/или бета-амилоида. Настоящее изобретение обеспечивает новые способы лечения таких неврологических заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС). Сущность изобретения Целью настоящего изобретения является обеспечение новых терапевтических способов и композиций для лечения неврологических заболеваний. В частности, изобретение касается композиций и способов лечения неврологических заболеваний, связанных с токсичностью глутамата и/или -амилоида, на основе комбинации баклофена и акампросата. Изобретение исходит, среди прочего, из неожиданного открытия авторами изобретения того, что комбинация баклофена и акампросата приносит существенную и неожиданную пользу пациентам с болезнью Альцгеймера. Кроме того, авторы вне ожидания обнаружили, что эта комбинация обеспечивает существенную и неожиданную защиту нервных клеток от различных повреждений, встречающихся при неврологических заболеваниях, включая токсичность глутамата. Таким образом, эта комбинация баклофена и акампросата составляет эффективное лечение для пациентов, страдающих от, предрасположенных к или с подозрением на неврологические заболевания. Объектом настоящего изобретения, таким образом, являются композиции, содержащие комбинацию баклофена и акампросата для применения при лечении неврологических заболеваний, в частностиAD и родственных заболеваний, рассеянного склероза (MS), бокового амиотрофического склероза (ALS),болезни Паркинсона (PD), невропатий (к примеру, невропатической боли или алкогольной невропатии),алкоголизма или синдрома отмены, болезни Хантингтона (HD) и травмы спинного мозга. Композиция изобретения может содержать баклофен и акампросат в качестве единственных активных ингредиентов. С другой стороны, композиции могут содержать дополнительные активные ингредиенты. В связи с этим следующим предметом настоящего изобретения являются композиции, содержащие комбинацию баклофена, акампросата и по меньшей мере еще одного третьего соединения, выбранного из сульфисоксазола, метимазола, прилокаина, дифиллина, хинакрина, карбеноксолона, аминокапроновой кислоты, каберголина, диэтилкарбамазина, цинакальцета, циннаризина, эплеренона, фенолдопама, лефлуномида, левосимендана, сулодексида, тербинафина, зонисамида, этомидата, фенформина, триметазидина, мексилетина, ифенпродила, моксифлоксацина, бромокриптина и торасемида, для применения при лечении неврологических заболеваний у нуждающихся в этом субъектов. Как будет изложено далее в настоящей заявке, соединения при комбинированной терапии настоящего изобретения могут вводиться субъектам одновременно, раздельно, последовательно и/или неоднократно. Изобретение также имеет отношение к фармацевтическим композициям per se, содержащим комбинацию по меньшей мере из двух соединений, приведенных выше. Композиции изобретения, как правило, также содержат один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей или носителей. Кроме того, соединения при применении в настоящем изобретении могут находиться в виде соли, гидрата, сложного эфира, простого эфира, кислоты, амида, рацемата или изомера. Они также могут иметь вид препаратов с пролонгированным высвобождением. Также могут применяться пролекарственные формы или производные соединений. В предпочтительном воплощении соединения используются как есть или в виде соли, гидрата,сложного эфира, простого эфира или формы с пролонгированным высвобождением. Особенно предпочтительной солью для применения в настоящем изобретении является акампросат кальция. В другом предпочтительном воплощении используется пролекарственная форма или производное. Другим объектом настоящего изобретения является способ получения фармацевтической композиции, который включает смешивание баклофена и акампросата в фармацевтически приемлемом наполнителе или носителе. Следующим объектом настоящего изобретения является способ лечения неврологических заболеваний у нуждающихся в этом субъектов-млекопитающих, предпочтительно у нуждающихся в этом людей, который включает введение данному субъекту эффективного количества комбинации по изобретению. Следующим объектом настоящего изобретения является способ лечения болезни Альцгеймера или родственных заболеваний у нуждающихся в этом субъектов-млекопитающих, предпочтительно у нуждающихся в этом людей, который включает введение данному субъекту эффективного количества комбинации по изобретению. Предпочтительно объектом настоящего изобретения является способ лечения неврологических заболеваний у нуждающихся в этом субъектов-млекопитающих, предпочтительно у нуждающихся в этом людей, который включает одновременное, раздельное или последовательное введение данному субъекту эффективного количества баклофена и акампросата. Более предпочтительно объектом настоящего изобретения является способ лечения болезни Альцгеймера или родственных заболеваний у нуждающихся в этом субъектов-млекопитающих, предпочтительно у нуждающихся в этом людей, который включает одновременное, раздельное или последовательное введение данному субъекту эффективного количества баклофена и акампросата. Изобретение может применяться для лечения неврологических заболеваний у субъектовмлекопитающих, предпочтительно людей, на любой стадии заболевания. Как будет изложено в примерах, композиции по изобретению способны облегчить патологическое состояние у данных субъектов. Краткое описание фигур Фиг. 1. Проверка экспериментальной модели токсичности -амилоида человека на эндотелиальных клетках, используемых для скрининга лекарственных препаратов. Предварительная обработка при 10 нМVEGF в течение 1 ч существенно защищала капиллярную сеть от повреждения этим амилоидом (+70% капиллярной сети по сравнению с амилоидной интоксикацией). Фиг. 2. Влияние комбинированной терапии баклофеном (BCL) и акампросатом (АСР) на общую длину капиллярной сети в культурах НВМЕС при бета-амилоидной интоксикации. Амилоидный пептид человека (A1-42, 2,5 мкМ) вызывает значительную интоксикацию, больше чем на 40% по сравнению с обработанными носителем клетками. Эта интоксикация существенно предотвращается комбинацией акампросата и баклофена (А), тогда как при тех же концентрациях акампросат (В) и баклофен (С) сами по себе не оказывают существенного влияния на интоксикацию. р 0,05, значимое отличие от интоксикации A1-42;p0,05, значимое отличие от носителя; "ns" незначительное влияние (ANOVA + post-hoc критерий Dunnett). Фиг. 3. Влияние комбинированной терапии баклофеном (BCL) и тербинафином (TBN) на общую длину капиллярной сети в культурах НВМЕС с бета-амилоидной интоксикацией. Амилоидный пептид человека (А 1-42, 2,5 мкМ) вызывает значительную интоксикацию, больше чем на 40% по сравнению с обработанными носителем клетками. Эта интоксикация существенно предотвращается комбинацией тербинафина и баклофена.р 0,05, значимое отличие от контроля (нет интоксикации). Фиг. 4. Проверка экспериментальной модели токсичности -амилоида человека на нейрональных клетках, используемых для скрининга лекарственных препаратов. Предварительная обработка эстрадиолом (150 нМ) или BDNF (50 нг/мл) в течение 1 ч существенно защищает нейроны от повреждения этим амилоидом (-94%), что считается положительным контролем на нейропротекцию.р 0,05, значимое отличие от контроля (нет интоксикации); р 0,05, значимое отличие от интоксикации А 1-42. Фиг. 5. Влияние комбинированной терапии акампросатом (АСР) и баклофеном (BCL) на высвобождение LDH при токсичности А 1-42 на первичных корковых клетках крыс. Амилоидный пептид (А 1-42, 10 мкМ) человека вызывает значительную интоксикацию по сравнению с обработанными носителем нейронами. Эта интоксикация существенно предотвращается комбинацией акампросата и баклофена (А), тогда как при тех же концентрациях акампросат (В) и баклофен (С) сами по себе не оказывают значительного влияния на интоксикацию. : р 0,05, значимое отличие от интоксикации A1-42; : p0,05, значимое отличие от носителя; "ns" не оказывает существенного влияния. (ANOVA + post-hoc критерий Dunnett). Фиг. 6. Влияние комбинированной терапии цинакальцетом (CNC) и сульфисоксазолом (SFX) на высвобождение LDH при токсичности А 1-42 на первичных корковых клетках крыс. Амилоидный пептид(A1-42, 10 мкМ) человека вызывает значительную интоксикацию по сравнению с обработанными носителем нейронами. Эта интоксикация предотвращается комбинацией цинакальцета и сульфисоксазола. : р 0,05, значимое отличие от носителя. Фиг. 7. Влияние комбинированной терапии баклофеном (BCL) и акампросатом (АСР) на общую длину сети нейритов в корковых нейронах при бета-амилоидной интоксикации. Амилоидный пептид человека (A1-42 2,5 мкМ) вызывает значительную интоксикацию, больше чем на 15% по сравнению с обработанными носителем клетками. Эта интоксикация существенно предотвращается комбинацией акампросата и баклофена (А), тогда как при тех же концентрациях акампросат (В) и баклофен (С) сами по себе не оказывают существенного влияния на интоксикацию. : р 0,05, значимое отличие от интоксикации A1-42; : p0,05, значимое отличие от носителя (ANOVA + post-hoc критерий Dunnett). Фиг. 8. Влияние комбинированной терапии акампросатом и баклофеном на поведение при тестировании в Y-лабиринте. Амилоидный пептид вызывает значительное снижение когнитивной способности при измерении по степени чередования (53,8% против 73,5%). Этот вредный эффект существенно предотвращается (защита на 48,2%) комбинацией акампросата (0,2 мг/кг/день) и баклофена (3 мг/кг/день). : р 0,05, значимое отличие от интоксикации А 25-35; : р 0,05, значимое отличие от носителя (ANOVA +post-hoc критерий Dunnett). Фиг. 9. Влияние комбинированной терапии акампросатом и баклофеном на память при определении методом пассивного избегания (латентность спасения). Амилоидный пептид вызывает значительное ухудшение памяти при измерении по латентности спасения по сравнению с контролем. Этот вредный эффект существенно предотвращается (полная защита) комбинацией акампросата (0,2 мг/кг) и баклофена(3 мг/кг). : р 0,05, значимое отличие от интоксикации А 25-35; : р 0,05, значимое отличие от носителя(ANOVA + критерий Dunn). Фиг. 10. Влияние комбинированной терапии акампросатом и баклофеном на память при определении методом пассивного избегания (латентность пассивного избегания). Амилоидный пептид вызывает значительное ухудшение памяти при измерении по латентности пассивного избегания, больше чем на 44% по сравнению с контролем. Этот вредный эффект существенно предотвращается (защитный эффект на 78,8%) комбинацией акампросата (0,2 мкг/кг) и баклофена (3 мкг/кг), тогда как при тех же концентрациях акампросат и баклофен сами по себе оказывают меньшее влияние на интоксикацию. : р 0,05, значимое отличие от интоксикации А 25-35; : р 0,05, значимое отличие от носителя (ANOVA + критерийDunn). Фиг. 11. Влияние комбинированной терапии акампросатом и баклофеном на плотность нейронов в гиппокампе. Амилоидный пептид вызывает значительное снижение плотности нейронов, судя по числу нейронов на 1 миллиметр в гиппокампе, больше чем на 21% по сравнению с контролем. Эти повреждения нейронов существенно предотвращаются (защищены 63,2% поврежденных нейронов) комбинацией акампросата (0,2 мг/кг) и баклофена (3 мг/кг). : р 0,05, значимое отличие от интоксикации А 25-35; : р 0,05, значимое отличие от носителя (ANOVA + post-hoc критерий Dunnett). Фиг. 12. Влияние комбинированной терапии акампросатом и баклофеном на целостность гематоэнцефалического барьера. Амилоидный пептид затрагивает гематоэнцефалический барьер (ВВВ), вызывая значительное увеличение его проницаемости, больше чем на 51% по сравнению с контролем. Эти повреждения гематоэнцефалического барьера существенно предотвращаются (целостность восстанавливается на 66,6%) комбинацией акампросата (0,2 мг/кг) и баклофена (3 мг/кг). : р 0,05, значимое отличие от интоксикации А 25-35; : р 0,05, значимое отличие от носителя (ANOVA + post-hoc критерий Dunnett). Фиг. 13. Влияние комбинированной терапии акампросатом и баклофеном на плотность синапсов,судя по концентрации синаптофизина. Амилоидный пептид затрагивает функцию синапсов, вызывая значительное снижение концентрации синаптофизина в мозге, больше чем на 34% по сравнению с контролем. Эти нарушения плотности синапсов существенно предотвращаются (76%) комбинацией акампросата (0,2 мг/кг/день) и баклофена (3 мг/кг/день). : р 0,05, значимое отличие от интоксикации А 25-35;: р 0,05, значимое отличие от носителя (ANOVA + post-hoc критерий Dunnett). Фиг. 14. Защитное действие комбинированной терапии акампросатом и баклофеном на окислительный стресс в гиппокампе. Амилоидный пептид вызывает значительное усиление окислительного стресса в гиппокампе, судя по перекисному окислению липидов, больше чем на 59% по сравнению с контролем. Этот окислительный стресс существенно предотвращается (65,9%) комбинацией акампросата (0,2 мг/кг/день) и баклофена (3 мг/кг/день). : р 0,05, значимое отличие от интоксикации А 25-35; : р 0,05,значимое отличие от носителя (ANOVA + post-hoc критерий Dunnett). Фиг. 15. Действие комбинированной терапии баклофеном и акампросатом против глутаматной токсичности в корковых нервных клетках. Глутаматная интоксикация существенно предотвращается комбинацией баклофена (400 нМ) и акампросата (1,6 нМ), тогда как при тех же концентрациях баклофен и акампросат сами по себе не оказывают влияния на интоксикацию. : р 0,001, значимое отличие от глутаматной интоксикации (ANOVA + post-hoc критерий Dunnett). Фиг. 16. Влияние комбинированной терапии донепезилом, акампросатом и баклофеном на поведение и когнитивные способности при тестировании в Y-лабиринте. Амилоидный пептид вызывает значительное снижение когнитивной способности при измерении по степени чередования (51,5% против 71,8%). Этот вредный эффект существенно предотвращается (защита на 98%) комбинацией донепезила(0,25 мг/кг/день), акампросата (32 мкг/кг/день) и баклофена (480 мкг/кг/день), тогда как при тех же концентрациях эти препараты сами по себе не оказывают существенного влияния. : р 0,01, значимое отличие от интоксикации А 25-35; : р 0,01, значимое отличие от носителя (ANOVA + post-hoc критерий Dunnett). Фиг. 17. Сравнение защитного эффекта предварительной обработки акампросатом и его производным гомотаурином при анализе токсичности А 1-42 человека на первичных корковых нейронах крыс. А 1-42 вызывает значительную интоксикацию по сравнению с обработанными носителем нейронами. Интоксикация в равной степени предотвращается гомотаурином и акампросатом (99%, 8 нМ). : р 0,0001,значимое отличие от интоксикации A1-42. Фиг. 18. Влияние комбинированной терапии акампросатом и баклофеном на развитие хронического прогрессирующего экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) при определении по клиническим показателям. Иммунизация вызывает значительное снижение физических показателей при измерении по клиническим данным. Этот вредный эффект существенно предотвращается (р 0,01) комбинацией акампросата (2 мг/кг/день) и баклофена (30 мг/кг/день). Раскрытие сущности изобретения Настоящим изобретением предусмотрены новые способы и композиции для лечения неврологических заболеваний. В изобретении раскрыты новые комбинации лекарственных препаратов, которые позволяют эффективно лечить такие заболевания и могут применяться на любых млекопитающих. Изобретение подходит для лечения любых неврологических заболеваний, будь то центральных или периферических, особенно таких заболеваний, в которые вовлечены повреждения нервов или нейронов,-амилоид, нарушения ВВВ или глутаматная эксцитотоксичность. Конкретные примеры таких заболеваний включают нейродегенеративные заболевания, нейропатии, травмы спинного мозга и злоупотребление различными веществами типа алкоголизма. К нейродегенеративным заболеваниям относятся такие заболевания, как болезнь Альцгеймера и родственные заболевания, боковой амиотрофический склероз (ALS), рассеянный склероз (MS), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Хантингтона (HD), охватывающие прогрессирующую потерю функции и гибель нейронов. К нейропатиям относятся такие заболевания, при которых повреждаются нервы периферической нервной системы, что включает повреждения периферической нервной системы, вызванные генетическими факторами, воспалительными заболеваниями или химическими веществами, включая лекарственные препараты (винкристин, оксалиплатин, этиловый спирт). Лечение невропатий также включает и лечение невропатической боли. Изобретение особенно подходит для лечения AD и родственных заболеваний. В контексте настоящего изобретения термин "родственные заболевания" охватывает старческое слабоумие типа AD(SDAT), деменцию с тельцами Леви, сосудистую деменцию, умеренные когнитивные нарушения (MCI) и связанное с возрастом ухудшение памяти (AAMI). В настоящем изобретении термин "лечение" включает терапию, предупреждение, профилактику,замедление или уменьшение симптомов или причин вышеуказанных заболеваний. В частности, термин лечение включает контролирование течения заболевания и связанных с ним симптомов. Термин лечение в особенности включает защиту от токсичности, вызванной бета-амилоидом, либо уменьшение или замедление этой токсичности, и/или защиту от эксцитотоксичности глутамата либо уменьшение или замедление этой токсичности у субъектов, подвергающихся лечению. Термин лечение также обозначает улучшение когнитивных симптомов или защиту нервных клеток. В контексте настоящего изобретения указание определенного препарата или соединения подразумевает не только указание конкретно указанной молекулы, но также и любой фармацевтически приемлемой соли, гидрата, производного, изомера, рацемата, конъюгата, пролекарственной формы либо их производных любой химической чистоты. Термин "комбинация или комбинированное лечение/терапия" обозначает такое лечение, при котором, по меньшей мере, баклофен и акампросат вводятся совместно субъекту, чтобы вызвать биологический эффект. При комбинированной терапии по настоящему изобретению по меньшей мере два препарата могут вводиться совместно или раздельно, одновременно или последовательно. Кроме того, по меньшей мере, баклофен и акампросат можно вводить различными способами и по разным схемам. При этом,хотя они и составляются вместе, препараты из комбинации также могут быть составлены по отдельности. Термин "пролекарственная форма" или "пролекарство" в настоящем изобретении относится к лю-5 023277 бым функциональным производным (или предшественникам) соединений настоящего изобретения, которые при введении в биологическую систему образуют указанное соединение в результате, например, спонтанной химической реакции, катализируемой ферментом химической реакции и/или метаболической химической реакции. Пролекарства обычно являются неактивными или менее активными, чем образующийся препарат, и могут применяться, к примеру, для улучшения физико-химических свойств лекарственного препарата,направления препарата в определенную ткань, улучшения фармакокинетических и фармакодинамических свойств препарата и/или уменьшения нежелательных побочных эффектов. Некоторые из наиболее часто встречающихся функциональных групп, подходящих для разработки пролекарств, включают, без ограничения, карбоксильные, гидроксильные, амино, фосфатные/фосфонатные и карбонильные группы. Пролекарства,которые обычно получают при модификации этих групп, включают, без ограничения, эфиры, карбонаты, карбаматы, амиды и фосфаты. Конкретные технические руководства для выбора подходящих пролекарств общеизвестны (29-33). Кроме того, получение пролекарств может осуществляться стандартными методами, известными специалистам в данной области. Методы, которые можно использовать для синтеза других пролекарств, описаны в многочисленных обзорах по предмету (30; 34-40). Например, в базе данных ChemID plusAdvance (веб-сайт: chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/) приведен арбаклофен плакарбил, который является хорошо известной пролекарственной формой баклофена (41-42). Термин "производное" соединения охватывает любые молекулы, которые функционально и/или структурно родственны данному соединению, как то кислотные, амидные, сложноэфирные, эфирные,ацетилированные, гидроксилированные или алкилированные (С 1-С 6) варианты такого соединения. Термин "производное" также включает структурно родственные соединения, потерявшие один или несколько заместителей, перечисленных выше. Например, гомотаурин является дезацитилированным производным акампросата. Предпочтительными производными соединения являются молекулы, имеющие значительную степень сходства с данным соединением при определении известными методами. Сходственные соединения вместе с их индексом сходства с исходной молекулой приведены в различных базах данных,таких как PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/) или DrugBank (http://www.drugbank.ca/). В более предпочтительном воплощении производные должны иметь индекс сходства Танимото с исходным препаратом больше чем 0,4, предпочтительно больше чем 0,5, более предпочтительно больше чем 0,6, еще более предпочтительно больше чем 0,7. Индекс сходства Танимото широко применяется для измерения степени структурного сходства между двумя молекулами. Индекс сходства Танимото можно рассчитать с помощью такого программного обеспечения, как Small Molecule Subgraph Detector (43-44),доступного через интернет (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/SMSD/). Предпочтительные производные должны быть и структурно, и функционально родственны исходному соединению, т.е. они также должны сохранять по меньшей мере часть активности исходного препарата, более предпочтительно должны обладать защитным действием против токсичности А или глутамата. Термин "производные" также включает метаболиты препарата, например, молекулы, которые возникают при (биохимической) модификации или процессинге данного препарата после введения в организм, обычно через специализированные ферментные системы, и проявляют или сохраняют биологическую активность препарата. Метаболиты оказались ответственными за большую часть терапевтического действия исходного препарата. В определенном воплощении "метаболит" означает модифицированный или подвергшийся процессингу препарат, сохраняющий по меньшей мере часть активности исходного препарата, предпочтительно обладающий защитным действием против токсичности А или глутамата. Термин "соль" относится к фармацевтически приемлемым и относительно нетоксичным неорганическим или органическим солям присоединения кислот соединений настоящего изобретения. Образование фармацевтической соли состоит в образовании пары кислой, основной или цвиттерионной молекулы препарата с противоионом с образованием солевой разновидности препарата. При реакции нейтрализации может использоваться целый ряд химических соединений. Таким образом, фармацевтически приемлемые соли по изобретению включают соли, полученные при реакции основного соединения, функционирующего как основание, с неорганической или органической кислотой с образованием соли, к примеру, соли уксусной кислоты, азотной кислоты, винной кислоты, соляной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, метансульфоновой кислоты, камфоросульфоновой кислоты, щавелевой кислоты, малеиновой кислоты, янтарной кислоты или лимонной кислоты. Фармацевтически приемлемые соли по изобретению также включают соли, в которых основное соединение действует как кислота и реагирует с соответствующим основанием с образованием, например, соли натрия, калия, кальция, магния, аммония или холина. Хотя большинство солей данного активного начала биоэквивалентны, однако некоторые могут обладать, в частности, свойствами повышенной растворимости или биодоступности. Выбор соли теперь является обычной стандартной операцией в процессе разработки лекарственных средства (как излагают Н. Stahl and C.G Wermuth в своем руководстве (45. В предпочтительном воплощении указание соединения подразумевает указание самого соединения,а также любых его фармацевтически приемлемых солей, гидратов, изомеров, рацематов, сложных эфиров или простых эфиров. В более предпочтительном воплощении указание соединения подразумевает указание самого кон-6 023277 кретно указанного соединения, а также любых его фармацевтически приемлемых солей. В определенном воплощении применяются формы с пролонгированным высвобождением соединения. Как изложено выше, изобретение касается определенных комбинаций лекарственных препаратов,которые оказывают неожиданно сильное действие на несколько биологических процессов, связанных с неврологическими заболеваниями. Таким образом, эти комбинации препаратов представляют новые подходы к лечению неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и родственные заболевания, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, нейропатии (к примеру, невропатические боли или алкогольная нейропатия), алкоголизм или синдром отмены алкоголя и травмы спинного мозга. В частности, в настоящем изобретении раскрыты композиции, содержащие баклофен в комбинации с акампросатом, которые обеспечивают существенный эффект in vivo на неврологические заболевания. Так, изобретение показывает, в экспериментальной части, что комбинированная терапия, включающая баклофен и акампросат, может существенно улучшить состояние пациентов, страдающих неврологическими заболеваниями. В частности, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что комбинации баклофена и акампросата оказывают неожиданно сильный эффект на длину капилларной сети или на высвобождение LDH в интоксифицированных бета-амилоидом нервных клетках, и представляют новые подходы к лечению AD. Кроме того, примеры показывают, что при комбинированной терапии по изобретению баклофен может быть эффективен в дозе 80 нМ или меньше, а акампросат может быть эффективен в дозе 1 нМ или меньше. Эти результаты примечательны и особенно выгодны, поскольку при таких низких дозах устраняются возможные побочные эффекты. Более того, эти комбинации эффективно защищают нервные клетки от различных вредных воздействий, таких как глутаматная токсичность и окислительный стресс, и предотвращают проницаемость ВВВ или индуцированный апоптоз в нервных клетках, которые задействованы при некоторых неврологических заболеваниях. Таким образом, настоящим изобретением предлагается новый способ лечения неврологических заболеваний на основе композиций баклофена и акампросата. В частности, настоящим изобретением предлагается новый способ лечения болезни Альцгеймера и родственных расстройств, рассеянного склероза,бокового амиотрофического склероза, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, нейропатий (к примеру, невропатических болей или алкогольной нейропатий), алкоголизма или синдрома отмены алкоголя и травмы спинного мозга на основе комбинаций баклофена и акампросата. В связи с этим, в определенном воплощении, изобретение касается композиций, содержащих баклофен и акампросат. В другом воплощении изобретение касается композиций, содержащих баклофен и акампросат, для применения при лечении AD, родственных AD заболеваний, MS, PD, ALS, HD, нейропатий (к примеру,невропатических болей или алкогольной нейропатий), алкоголизма или синдрома отмены алкоголя и травмы спинного мозга. В следующем воплощении изобретение касается применения баклофена и акампросата для изготовления лекарства для лечения AD, родственных AD заболеваний, MS, PD, ALS, HD, нейропатий (к примеру, невропатических болей или алкогольной нейропатий), алкоголизма или синдрома отмены алкоголя и травмы спинного мозга. Ниже в табл. 1 приведены показательные номера CAS для баклофена и акампросата. В табл. 1 также приведены, неограничивающим образом, обычные соли, рацематы, пролекарства, метаболиты или производные этих соединений, используемые в композициях по изобретению. Таблица 1 Конкретные примеры пролекарственных форм баклофена приведены в Hanafi et al., 2011 (41), в частности сложных эфиров баклофена и карбаматов сложных эфиров баклофена, которые представляют особый интерес для воздействия на ЦНС. Поэтому такие пролекарственные формы особенно подходят для композиций настоящего изобретения. Баклофен плакарбил, как уже было сказано, также является известным пролекарством и может применяться вместо баклофена в композициях изобретения. Другие пролекарственные формы баклофена приведены в следующих патентных заявках: WO 2010102071, US 2009197958, WO 2009096985, WO 2009061934, WO 2008086492, US 2009216037, WO 2005066122, US 2011021571, WO 2003077902, WO 2010120370. Подходящие пролекарственные формы акампросата, как то сложные неопентилсульфониловые эфиры пантоевой кислоты, другие неопентилсульфониловые эфиры или блокированные неопентилсульфониловые эфиры карбоксилатов акампросата, приведены в WO 2009033069, WO 2009033061, WO 2009033054 WO 2009052191, WO 2009033079, US 2009/0099253, US 2009/0069419, US 2009/0082464, US 2009/0082440 и US 2009/0076147. Баклофен и акампросат могут применяться по отдельности или же могут еще комбинироваться с дополнительными соединениями. В связи с этим,в определенном воплощении, композиции по изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере еще одно соединение, выбранное из сульфисоксазола, метимазола, прилокаина, дифиллина, хинакрина, карбеноксолона, аминокапроновой кислоты, каберголина, диэтилкарбамазина, цинакальцета, циннаризина, эплеренона, фенолдопама, лефлуномида,левосимендана, сулодексида, тербинафина, зонисамида, этомидата, фенформина, триметазидина, мексилетина, ифенпродила, моксифлоксацина, бромокриптина или торасемида. Ниже в табл. 2 приведены показательные номера CAS для каждого из этих соединений. Таблица 2 В определенном воплощении изобретение касается применения этой комбинации для лечения AD или родственных заболеваний у нуждающихся в этом субъектов. В определенном воплощении изобретение касается применения этой комбинации для лечения MS,PD, ALS, HD, невропатий (к примеру, невропатических болей и алкогольной невропатии), алкоголизма или синдрома отмены алкоголя либо травмы спинного мозга у нуждающихся в этом субъектов. Как показано в примерах, комбинированная терапия с использованием по меньшей мере баклофена и акомпросата оказывает неожиданно сильное действие на биологические процессы, приводящие к повреждениям нейронов. Кроме того, эти комбинации также проявляли in vivo очень эффективную способность корректировать симптомы неврологических заболеваний. Таким образом, эти комбинации представляют новые подходы к лечению неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, невропатии (к примеру, невропатические боли или алкогольная невропатия), алкоголизм или синдром отмены алкоголя и травмы спинного мозга. Эти композиции эффективно предотвращают токсическое действие-амилоидного (А) пептида или глутаматную эксцитотоксичность на нервные клетки. Кроме того, эти комбинации in vivo приводят к улучшению некоторых когнитивных симптомов, а также к защите нервных клеток. Поэтому они представляют новые и мощные способы лечения таких заболеваний. Экспериментальный раздел дополнительно показывает, что вышеуказанные композиции также эффективно i) синергически защищают нервные клетки in vitro от эксцитотоксичности глутамата и ii) приносят клиническую пользу in vivo на моделях заболеваний, связанных с эксцитотоксичностью глутамата. Композиции по изобретению могут содержать 2, 3, 4 или 5 различных препаратов, более предпочтительно 2, 3 или 4 различных препарата для комбинированного лечения болезни Альцгеймера (AD),родственных AD заболеваний, MS, PD, ALS, HD, невропатий (к примеру, невропатических болей или алкогольной невропатии), алкоголизма или синдрома отмены алкоголя либо травмы спинного мозга у нуждающихся в этом субъектов. В предпочтительном воплощении препараты по изобретению применяются в комбинациях для комбинированного, раздельного или последовательного введения, чтобы обеспечить наиболее эффективное действие. Предпочтительные композиции по изобретению для применения при лечении неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (AD), родственные AD заболевания, MS, PD, ALS, HD, невропатий (к примеру, невропатические боли или алкогольная невропатия), алкоголизм или синдром отмены алкоголя либо травмы спинного мозга, содержат одну из следующих комбинаций препаратов для комбинированного, раздельного или последовательного введения: баклофен и акампросат,баклофен, акампросат и диэтилкарбамазин,баклофен, акампросат и цинакальцет,баклофен, акампросат и сульфисоксазол,баклофен, акампросат и торасемид,баклофен, акампросат и ифенпродил,баклофен, акампросат и мексилетин,баклофен, акампросат и эплеренон,баклофен, акампросат и левосимендан,баклофен, акампросат и терминафин, или баклофен, акампросат и лефлуномид. Как показано в экспериментальной части, комбинированная терапия по изобретению дает значительный терапевтический и биологический эффект на улучшение болезни Альцгеймера и родственных заболеваний у человека. Она вызывает сильный нейропротекторный эффект против токсичности А и дает положительные результаты в поведенческих тестах и при биохимических анализах in vivo. Результаты показывают, что композиции по изобретению i) эффективно корректируют молекулярные пути,которые запускаются in vivo агрегатами А, и ii) приводят к улучшению нейрофизиологических нарушений, наблюдающихся у больных животных, в виде выживаемости нейронов или целостности синапсов. Кроме того, представленные результаты также показывают, что вышеуказанная комбинированная терапия оказывает важное синергическое нейропротекторное действие против глутаматной эксцитотоксичности (фиг. 15), которая участвует в различных неврологических заболеваниях, таких как AD, MS,PD, ALS, HD, невропатии (к примеру, невропатические боли или алкогольная невропатия), алкоголизм или синдром отмены алкоголя либо травмы спинного мозга. Такая терапия дает положительные результаты на in vivo и in vitro моделях этих заболеваний. Кроме того, результаты in vivo показывают, что композиции по изобретению эффективно восстанавливают целостность гематоэнцефалического барьера и предотвращают, замедляют или уменьшают запуск апоптоза, который нарушается при ряде неврологических заболеваний. Более того, особенно сильное синергическое взаимодействие, наблюдавшееся для этих двух препаратов, позволяет использовать такие концентрации препаратов, которые не дают никакого эффекта при использовании их по отдельности. Кроме того, как показано в экспериментальной части, комбинация баклофена и акампросата приносит большую терапевтическую пользу при болезни Альцгеймера по сравнению с другими терапевтическими комбинациями. Эти композиции эффективно предотвращают токсические эффекты -амилоидного белка или пептида на клетки человека и на моделях in vivo и представляют новые и мощные способы лечения таких заболеваний. Итак, объектом настоящего изобретения также являются приведенные выше композиции для лечения таких неврологических заболеваний, как болезнь Альцгеймера (AD), родственные AD заболевания,MS, PD, ALS, HD, невропатии (к примеру, алкогольная невропатия или невропатические боли), алкоголизм или синдром отмены алкоголя либо травмы спинного мозга. Как указано ранее, при комбинированной терапии по настоящему изобретению соединения или препараты могут быть составлены вместе или по отдельности и вводиться вместе, раздельно или последовательно. Следующим объектом настоящего изобретения являются приведенные выше композиции для изготовления лекарства для лечения таких неврологических заболеваний, как болезнь Альцгеймера (AD),родственные AD заболевания, MS, PD, ALS, HD, невропатии (к примеру, невропатические боли или алкогольная невропатия), алкоголизм или синдром отмены алкоголя либо травмы спинного мозга. Изобретением также предусмотрен способ лечения неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (AD), родственные AD заболевания, MS, PD, ALS, HD, невропатии (к примеру, невропатические боли или алкогольная невропатия), алкоголизм или синдром отмены алкоголя либо травмы спинного мозга, который включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, как изложено выше. Следующим объектом изобретения является способ лечения неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (AD), родственные AD заболевания, MS, PD, ALS, HD, невропатии (к примеру,-9 023277 невропатические боли или алкогольная невропатия), алкоголизм или синдром отмены алкоголя либо травмы спинного мозга, который включает одновременное, раздельное или последовательное введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, как изложено выше. В предпочтительном воплощении изобретение касается способа лечения таких неврологических заболеваний, как болезнь Альцгеймера (AD), родственные AD заболевания, MS, PD, ALS, HD, невропатии(к примеру, невропатические боли или алкогольная невропатия), алкоголизм или синдром отмены алкоголя либо травмы спинного мозга у нуждающегося в этом субъекта, который включает одновременное,раздельное или последовательное введение субъекту эффективного количества баклофена и акампросата. Композиции по изобретению обычно содержат один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или наполнителей. Кроме того, для применения в настоящем изобретении препараты или соединения обычно смешивают с фармацевтически приемлемыми наполнителями или носителями. В связи с этим следующим объектом настоящего изобретения является способ приготовления фармацевтической композиции, который включает смешивание указанных выше соединений в соответствующем наполнителе или носителе. В определенном воплощении способ включает смешивание баклофена и акампросата в соответствующем наполнителе или носителе. В соответствии с предпочтительными воплощениями изобретения, как указано выше, соединения применяются как есть или в виде фармацевтически приемлемой соли, пролекарства, производного или формы с пролонгированным высвобождением. Несмотря на высокую эффективность in vitro и in vivo, в зависимости от субъекта или конкретных условий, комбинированная терапия по изобретению также может применяться в сочетании или вместе с дополнительными препаратами или способами лечения, приносящими пользу при подлежащих лечению неврологических заболеваниях у субъектов. Другие способы лечения, применяемые в сочетании с препаратами или комбинациями препаратов по настоящему изобретению, могут включать один или несколько препаратов, облегчающих симптомы болезни Альцгеймера (AD), родственных AD заболеваний, MS, PD, ALS, HD, невропатий (к примеру,невропатических болей или алкогольной невропатии), алкоголизма или синдрома отмены алкоголя либо травмы спинного мозга, или же препаратов, которые могут применяться для паллиативного лечения этих заболеваний. Например, результаты показывают также, что приведенные выше способы терапии оказывают существенное синергическое нейропротекторное действие в сочетании с донепезилом (фиг. 16). При этом показательные терапии, которые могут применяться вместе с комбинациями изобретения, являются донепезил (CAS: 120014-06-4), габапентин (CAS: 478296-72-9; 60142-96-3), ривастигмин (12344103-2) или мемантин (CAS: 19982-08-2). В связи с этим, в определенном воплощении, препараты или композиции по настоящему изобретению можно дополнительно комбинировать с экстрактами Ginkgo biloba. Подходящими экстрактами являются, без ограничения, экстракты Ginkgo biloba, улучшенные экстракты Ginkgo biloba (к примеру, обогащенные активными ингредиентами или с меньшим загрязнением) или любые препараты, содержащие экстракты Ginkgo biloba. Терапия по изобретению может осуществляться дома, в офисе врача, в клинике, амбулаторном отделении больницы или в больнице с тем, чтобы врач мог наблюдать эффекты терапии вплотную и вносить любые необходимые изменения. Продолжительность лечения зависит от стадии подлежащего лечению заболевания, возраста и состояния пациента и того, как пациент реагирует на лечение. Дозировка, частота и способ введения каждого компонента комбинации может контролироваться независимо. Например, один препарат можно вводить перорально, а второй - внутримышечно. Комбинированная терапия может проводиться с периодическими циклами, которые включают периоды отдыха с тем, чтобы организм пациента имел возможность оправиться от любых непредвиденных побочных эффектов. Препараты также могут быть составлены вместе так, что при одном введении вводятся все препараты. Введение каждого препарата из комбинации может осуществляться любым подходящим способом,дающим такую концентрацию препарата, которая в сочетании с другим компонентом способна облегчить состояние пациента или эффективно лечить заболевание. Хотя препараты из комбинации можно вводить в виде химически чистых веществ, но предпочтительно представить их в виде фармацевтической композиции, которую также называют лекарственной формой. Возможные композиции включают такие композиции, которые подходят для перорального, ректального, топического (в том числе трансдермального, буккального и подъязычного) или парентерального (в том числе подкожного, внутримышечного, внутривенного и внутрикожного) введения. Чаще всего эти лекарственные формы назначаются пациентам в "упаковках для пациента", содержащих ряд дозовых единиц или других средств для введения стандартных дозовых единиц для использования в отдельный период лечения в одной упаковке, обычно в блистерной упаковке. Упаковки для пациента обладают преимуществом перед традиционными рецептами, когда фармацевт выделяет пациенту порцию лекарственного препарата из общего запаса, в том, что пациент всегда имеет доступ к вкладышу,вложенному в упаковку, который обычно отсутствует при традиционных рецептах. Наличие вкладыша в упаковке, как оказалось, улучшает соблюдение пациентами инструкций врача. Так что изобретение также охватывает лекарственные формы, как описано здесь ранее, в комбинации с упаковочным материалом, подходящим для данных форм. При этом предназначение лекарственной формы при комбинированном лечении можно узнать из инструкций, приспособлений, указаний, адаптации и/или других средств, способствующих правильному применению лекарственной формы при лечении. Такие меры делают упаковки для пациента особенно подходящими и приспособленными для применения при лечении с помощью комбинаций настоящего изобретения. Препарат может содержаться, в любом подходящем количестве, в любом подходящем веществе носителя. Препарат может присутствовать в количестве вплоть до 99 мас.% от общей массы композиции. Композиции могут быть представлены в дозовой форме, подходящей для перорального, парентерального(например, внутривенного, внутримышечного), ректального, кожного, интраназального, вагинального,ингаляционного, кожного (пластырь) или глазного способа введения. Таким образом, композиции могут иметь вид, например, таблеток, капсул, пилюль, порошков, гранул, суспензий, эмульсий, растворов, гелей, в том числе гидрогелей, паст, мазей, кремов, пластырей, насадок, осмотических устройств для доставки, свечей, клизм, инъекций, имплантатов, спреев или аэрозолей. Фармацевтические композиции могут быть составлены в соответствии с обычной фармацевтической практикой (см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R. Gennaro, Lippincott, WilliamsWilkins, 2000; и Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrickand J.C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York). Фармацевтические композиции по изобретению могут быть составлены так, чтобы активный препарат высвобождался практически немедленно после введения или в любое заданное время или период времени после введения. Лекарственные формы с контролируемым высвобождением включают (i) формы, которые создают практически постоянную концентрацию препарата в организме в течение длительного периода времени;(ii) формы, которые по истечении заданного времени задержки создают практически постоянную концентрацию препарата в организме в течение длительного периода времени; (iii) формы, которые поддерживают действие препарата в течение заданного периода времени путем поддержания относительно постоянного эффективного уровня препарата в организме и тем самым сводят к минимуму нежелательные побочные эффекты, связанные с колебаниями уровня активного вещества препарата в плазме; (iv) формы, которые локализуют действие препарата, например, путем пространственного размещения композиции с контролируемым высвобождением возле или в больной ткани или органе; и (v) формы, которые направляют действие препарата при помощи носителей или химических производных так, чтобы препарат попадал в клетки мишени определенного типа. Введение препаратов в виде форм с контролируемым высвобождением особенно предпочтительно в тех случаях, когда препарат имеет (i) узкий терапевтический индекс (т.е. разность между концентрацией в плазме, вызывающей вредные побочные эффекты или токсические реакции, и концентрацией в плазме,дающей терапевтический эффект, является небольшой; в общем, терапевтический индекс, TI, определяется как отношение средней летальной дозы (LD50) к средней эффективной дозе (ED50; (ii) узкое окошко всасывания в желудочно-кишечном тракте; или (iii) очень короткий биологический период полураспада,так что требуется частое введение дозы в течение суток для того, чтобы поддерживать уровень в плазме на терапевтическом уровне. Для того чтобы получить контролируемое высвобождение, можно придерживаться различных стратегий, при которых скорость высвобождения превосходит скорость метаболизма данного препарата. Контролируемое высвобождение можно получить при соответствующем выборе различных параметров состава и ингредиентов, включая, например, различные типы композиций с контролируемым высвобождением и покрытий. При этом препарат заключается вместе с соответствующими наполнителями в фармацевтическую композицию, из которой, после введения, препарат высвобождается контролируемым образом (композиции в виде таблеток или капсул для одной или нескольких дозовых единиц, масляных растворов, суспензий, эмульсий, микрокапсул, микросфер, наночастиц, пластырей и липосом). Твердые дозовые формы для приема внутрь Лекарственные формы для приема внутрь включают таблетки, содержащие композицию по изобретению в смеси с нетоксическими фармацевтически приемлемыми наполнителями. Такими наполнителями могут быть, к примеру, инертные разбавители или заполнители (например, сахароза, микрокристаллическая целлюлоза, крахмал, включая картофельный крахмал, карбонат кальция, хлорид натрия, фосфат кальция, сульфат кальция или фосфат натрия); гранулирующие и дезинтегрирующие вещества (например, производные целлюлозы, включая микрокристаллическую целлюлозу, крахмал, включая картофельный крахмал, натриевая кроскармеллоза, альгинаты или альгиновая кислота); связывающие вещества (например, гуммиарабик, альгиновая кислота, альгинат натрия, желатин, крахмал, желатинизированный крахмал, микрокристаллическая целлюлоза, натриевая карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза,гидроксипропилметилцеллюлоза, этилцеллюлоза, поливинилпирролидон или полиэтиленгликоль); и смазывающие вещества, скользящие и антиадгезивные вещества (например, стеариновая кислота, диоксид кремния или тальк). Другие фармацевтически приемлемые наполнителя - красители, ароматизаторы,- 11023277 пластификаторы, увлажнители, буферные вещества и др. Таблетки могут быть непокрытыми или же они могут быть покрыты известными методами, необязательно чтобы задержать дезинтеграцию и всасывание в желудочно-кишечном тракте и тем самым обеспечить непрерывное действие в течение длительного времени. Покрытие может быть приспособлено для высвобождения активного вещества препарата в заданном режиме (например, для получения формы с контролируемым высвобождением) или же не высвобождать активное вещество до полного прохождения через желудок (энтеросолюбильная оболочка). Покрытие может представлять собой сахарное покрытие, пленочное покрытие (например, на основе гидроксипропилметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, метилгидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, сополимеров акрилата, полиэтиленгликолей и/или поливинилпирролидона) или энтеросолюбильное покрытие (например,на основе сополимера метакриловой кислоты, ацетат-фталата целлюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы, ацетатсукцината гидроксиметилцеллюлозы, поливинилацетат-фталата, шеллака и/или этилцеллюлозы). Можно использовать материал, вызывающий задержку по времени, такой, например,как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. Твердые композиции типа таблетки могут включать покрытие, приспособленное для защиты композиции от нежелательных химических изменений (например, химической деградации до высвобождения активного вещества препарата). Покрытие может быть нанесено на твердую дозовую форму таким же образом, как описано в Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. Препараты могут быть смешаны вместе в таблетке или могут быть разделены. Например, первый препарат содержится внутри таблетки, а второй препарат находится на внешней стороне, так что значительная часть второго препарата высвобождается до высвобождения первого препарата. Лекарственные формы для приема внутрь также могут быть представлены в виде жевательных таблеток или в виде твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем (например, картофельным крахмалом, микрокристаллической целлюлозой, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином), либо в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водой или масляной средой, к примеру, жидким парафином или оливковым маслом. Порошки и гранулы могут быть получены с использованием указанных выше ингредиентов под таблетки и капсулы стандартным способом. Композиции для приема внутрь с контролируемым высвобождением, например, могут быть составлены так, чтобы высвобождение активного препарата контролировалось растворением и/или диффузией активного вещества препарата. Контролируемое растворением или диффузией высвобождение может осуществляться путем соответствующего покрытия таблеток, капсул, шариков или гранул препарата либо путем заключения препарата в соответствующий матрикс. Покрытие для контролируемого высвобождения может включать одно или несколько из покрывающих веществ, указанных выше, и/или, например, шеллак, пчелиный воск,гликовоск, касторовый воск, карнаубский воск, стеариловый спирт, глицерилмоностеарат, глицерилдистеарат, пальмитостеарат глицерина, этилцеллюлозу, акриловые смолы, dl-полимолочную кислоту, ацетат-бутират целлюлозы, поливинилхлорид, поливинилацетат, винилпирролидон, полиэтилен, полиметакрилат, метилметакрилат, 2-гидроксиметакрилат, гидрогели метакрилата, 1,3-бутиленгликоль, этиленгликоль метакрилат и/или полиэтиленгликоли. В состав матрикса для контролируемого высвобождения также может входить, например, гидратированная метилцеллюлоза, карнаубский воск и стеариловый спирт, карбопол 934, силикон, глицерилтристеарат, метилакрилат-метилметакрилат, поливинилхлорид,полиэтилен и/или галогенированный фторуглерод. Композиции с контролируемым высвобождением, содержащие один или несколько препаратов из заявленных комбинаций, также могут иметь вид плавучих таблеток или капсул (т.е. таких таблеток или капсул, которые при приеме внутрь плавают на поверхности содержимого желудка в течение определенного времени). Лекарственная форма препаратов в виде плавучих таблеток может быть получена путем гранулирования смеси препаратов с наполнителями и 20-75 мас.%, таких гидроколлоидов, как гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза или гидроксипропилметилцеллюлоза. Затем полученные гранулы могут быть спрессованы в таблетки. При контакте с желудочным соком таблетка образует практически водонепроницаемый слой геля вокруг своей поверхности. Этот слой геля принимает участие в поддержании плотности меньше единицы, что позволяет таблетке оставаться на плаву в желудочном соке. Жидкости для приема внутрь Порошки, диспергируемые порошки или гранулы, подходящие для получения водной суспензии при добавлении воды, являются удобной дозовой формой для перорального введения. Формы в виде суспензии обеспечивают активный ингредиент в смеси с диспергирующим или смачивающим веществом, суспендирующим веществом и одним или несколькими консервантами. Подходящими суспендирующими веществами являются, к примеру, натриевая карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, альгинат натрия и др. Парентеральные композиции Фармацевтические композиции также могут вводиться парентерально посредством инъекции, ин- 12023277 фузии или имплантации (внутривенно, внутримышечно, подкожно и т.п.) в виде дозовых лекарственных форм или через соответствующие устройства для доставки, либо в виде имплантов, содержащих стандартные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества. Составы и получение таких композиций хорошо известны специалистам в области лекарственных форм. Композиции для парентерального применения могут быть представлены в виде стандартных дозовых форм (например, в ампулах с однократной дозой) или во флаконах, содержащих несколько доз, в которые может быть добавлен подходящий консервант (см. ниже). Композиция может быть в виде раствора, суспензии, эмульсии, инфузионного устройства или имплантационного устройства или же в виде сухого порошка для разведения водой или другим подходящим носителем перед употреблением. Помимо активных препаратов композиция может включать подходящие парентерально приемлемые носители и/или наполнители. Активные препараты могут быть заключены в микросферы, микрокапсулы, наночастицы, липосомы и т.п. для контролируемого высвобождения. Композиция может включать суспендирующие, солюбилизирующие, стабилизирующие, рН-регулирующие вещества и/или диспергирующие вещества. Фармацевтические композиции по изобретению могут иметь вид, подходящий для стерильных инъекций. Для получения таких композиций подходящие активные средства растворяют или суспендируют в парентерально приемлемом носителе. К приемлемым носителям и растворителям, которые можно использовать, относятся вода или вода, доведенная до нужного рН добавлением соответствующего количества соляной кислоты, гидроокиси натрия или подходящего буфера, 1,3-бутандиол, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Водные составы также могут содержать один или несколько консервантов (например, метил-, этил- или н-пропил-n-гидроксибензоат). В тех случаях, когда один из препаратов лишь умеренно или слабо растворим в воде, можно добавить усиливающее растворение или солюбилизирующее вещество, или же растворитель может включать 10-60 мас.% пропиленгликоля или др. Парентеральные композиции с контролируемым высвобождением могут иметь вид водных суспензий, микросфер, микрокапсул, магнитных микросфер, масляных растворов, масляных суспензий или эмульсий. С другой стороны, активные препараты могут быть заключены в биосовместимые носители,липосомы, наночастицы, имплантаты или инфузионные устройства. Материалы, используемые при получении микросфер и/или микрокапсул, представлены, например, биоразлагаемыми/биоразрушимыми полимерами, такими как полигалактин, поли(изобутилцианоакрилат), поли(2-гидроксиэтил-L-глутамин). Биосовместимые носители, которые можно использовать при составлении парентеральных форм с контролируемым высвобождением, представлены углеводами (например, декстраны), белками (например,альбумин), липопротеинами или антителами. Материалы, используемые в имплантатах, могут не быть биоразлагаемыми (например, полидиметилсилоксан) или же быть биоразрушимыми (например, поликапролактон, полигликолевая кислота или полиортоэфиры). Альтернативные способы введения Хотя это и менее предпочтительно и менее удобно, предусмотрены и другие способы введения и,таким образом, другие составы. При этом подходящие для ректального введения дозовые формы для композиций включают свечи (типа эмульсии или суспензии) и ректальные желатиновые капсулы (растворы или суспензии). В типичной рецептуре свечей активные препараты сочетаются с соответствующей фармацевтически приемлемой основой свечи, такой как масло какао, этерифицированные жирные кислоты, глицериновый желатин и различные водорастворимые или диспергируемые основы типа полиэтиленгликолей. Могут входить и различные добавки, усилители или поверхностно-активные вещества. Фармацевтические композиции также могут применяться топически на кожу для всасывания через кожу в виде дозовых лекарственных форм, содержащих стандартные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители и наполнители, в том числе микросферы и липосомы. Лекарственные формы включают кремы, мази, лосьоны, линименты, гели, гидрогели, растворы, суспензии, карандаши, спреи,пасты, пластыри и другие разновидности трансдермальных систем для доставки лекарств. Фармацевтически приемлемые носители или наполнители могут включать эмульгирующие вещества, антиоксиданты, буферные вещества, консерванты, увлажнители, усилители проникновения, хелаторы, гелеобразующие вещества, основы мазей, отдушки и защищающие кожу вещества. Консерванты, увлажнители, усилители проникновения могут быть представлены парабенами, такими как метил- или пропил-n-гидроксибензоат и бензалкония хлорид, глицерин, пропиленгликоль, мочевина и др. Фармацевтические композиции, описанные выше для топического нанесения на кожу, также могут применяться при топическом нанесении на или вблизи части тела, подлежащей лечению. Композиции могут быть приспособлены для непосредственного нанесения или для нанесения с помощью специальных устройств для доставки лекарств, таких как повязки или же пластыри, прокладки, губки, полоски или другие формы из подходящего гибкого материала. Дозировки и продолжительность лечения Следует иметь в виду, что препараты из комбинации могут вводиться либо одновременно в одной и той же или в разных лекарственных формах, либо последовательно. При последовательном введении промежуток при введении второго (или дополнительного) активного ингредиента должен быть таким,чтобы не исчезло преимущество эффективного действия комбинации активных ингредиентов. Минимальное требование к комбинации согласно этому описанию состоит в том, что комбинация предназначается для комбинированного применения с преимуществом эффективного действия комбинации активных ингредиентов. Предназначение комбинации можно узнать из приспособлений, указаний, адаптации и/или других средств, предназначенных помочь правильно применять комбинации по изобретению. Терапевтически эффективные количества препаратов в комбинации настоящего изобретения включают, например, такие количества, которые эффективно уменьшают симптомы болезни Альцгеймера,останавливают или замедляют течение болезни, как только она стала клинически проявляться, предотвращают или снижают риск возникновения болезни. Хотя активные препараты настоящего изобретения могут вводиться дробными дозами, например два или три раза в день, однако предпочтительным является введение каждого препарата из комбинации один раз в день, при этом наиболее предпочтительным является однократное введение суточной дозы всех препаратов в одной фармацевтической композиции (стандартной дозовой форме). Введение может проводиться от одного до нескольких раз в день на протяжении от нескольких дней до нескольких лет и даже в течение всей жизни пациента. Хроническое или по меньшей мере периодически повторяющееся продолжительное введение показано в большинстве случаев. Термин "стандартная дозовая форма" относится к физически дискретным единицам (таким как капсулы, таблетки или заряженные цилиндры шприца), пригодным в качестве единичных доз для человека,причем каждая единица содержит заранее определенное количество активного материала или материалов, рассчитанное на получение нужного терапевтического эффекта, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Количество каждого препарата в предпочтительной стандартной дозовой форме композиции зависит от нескольких факторов, включая способ введения, вес тела и возраст пациента, стадию заболевания,риск возможных побочных эффектов, с учетом общего состояния здоровья пациента, подлежащего лечению. Кроме того, на дозировку может повлиять фармакогеномная (влияние генотипа на фармакокинетику, фармакодинамику или профиль эффективности лекарственного средства) информация о конкретном пациенте. За исключением особо тяжелых случаев, когда могут потребоваться более высокие дозы, предпочтительная дозировка каждого препарата в комбинации, как правило, должна находиться в диапазоне доз,не превышающих дозировки, которые обычно назначают при долгосрочном поддерживающем лечении или которые оказались безопасными в фазе 3 клинических испытаний. Замечательным преимуществом изобретения является то, что каждое соединение может применяться в низких дозах при комбинированной терапии, при этом принося, в комбинации, существенную клиническую пользу пациентам. Комбинированная терапия может оказаться эффективной при таких дозах, в которых соединения по отдельности оказывают слабое или не оказывают действия. Таким образом, особенное преимущество изобретения заключается в возможности использовать субоптимальные дозы каждого соединения, т.е. меньшие дозы, чем те, которые обычно назначают, предпочтительно 1/2 от терапевтической дозы, более предпочтительно 1/3, 1/4, 1/5 или еще более предпочтительно 1/10 от терапевтической дозы. В определенных примерах применяются такие низкие дозы, как 1/20, 1/30, 1/50, 1/100 или еще меньше от терапевтической дозы. При таких субтерапевтических дозировках соединения не должны проявлять побочных эффектов, и в то же время комбинации по изобретению будут полностью эффективными при лечении болезни Альцгеймера. Предпочтительная дозировка составляет от 1 до 50% от тех, которые обычно назначают для долгосрочного поддерживающего лечения. Наиболее предпочтительная дозировка может составлять от 1 до 10% от тех, которые обычно назначают для долгосрочного поддерживающего лечения. Конкретные примеры дозировки препаратов для применения в изобретении представлены ниже: акампросат от 1 до 1000 мг/день, предпочтительно менее 400 мг в день, более предпочтительно менее 200 мг/день, еще более предпочтительно менее 50 мг/день, причем такие дозировки особенно подходят для перорального введения; баклофен от 0,01 до 150 мг в день, предпочтительно менее 100 мг в день, более предпочтительно менее 50 мг/день, еще более предпочтительно менее 25 мг/день, причем такие дозировки особенно подходят для перорального введения; аминокапроновая кислота перорально от 0,1 г до 2,4 г в день; бромокриптин перорально от 0,01 до 10 мг в день; диэтилкарбамазин перорально от 0,6 до 600 мг в день; каберголин перорально от 1 до 10 мкг в день; цинакальцет перорально от 0,3 до 36 мг в день; циннаризин перорально от 0,6 до 23 мг в день; дифиллин перорально от 9 до 320 мг в день; эплеренон перорально от 0,25 до 10 мг в день; ифенпродил перорально от 0,4 до 6 мг в день; лефлуномид перорально от 0,1 до 10 мг в день; левосимендан перорально от 0,04 до 0,8 мг в день; мексилетин перорально от 6 до 120 мг в день; моксифлоксацин перорально от 4 до 40 мг в день; фенформин перорально от 0,25 до 15 мг в день; хинакрин перорально от 1 до 30 мг в день; сульфисоксазол перорально от 20 до 800 мг в день; сулодексид перорально от 0,05 до 40 мг в день; тербинафин перорально от 2,5 до 25 мг в день; торасемид перорально от 0,05 до 4 мг в день; триметазидин перорально от 0,4 до 6 мг в день; зонисамид перорально от 0,5 до 50 мг в день. Если композиция в качестве активного ингредиента содержит только баклофен и акампросат, то эти два соединения можно использовать в различных пропорциях, например, при весовом соотношении акампросат/баклофен, составляющем от 0,05 до 1000 (в весовом соотношении), предпочтительно от 0,05 до 100 (в весовом соотношении), более предпочтительно от 0,05 до 50 (в весовом соотношении). Следует иметь в виду, что количество вводимого препарата должно определяться врачом в свете конкретных обстоятельств, в том числе заболевания или заболеваний, подлежащих лечению, конкретной вводимой композиции, возраста, веса и реакции индивидуального пациента, тяжести симптомов у пациента и выбранного способа введения. Таким образом, вышеприведенные диапазоны дозировки предназначаются для общего руководства и поддержки приведенных здесь положений, а не для ограничения объема изобретения. Следующие примеры приводятся для раскрытия изобретения, а не для его ограничения. Примеры Содержание и уход за животными, а также эксперименты проводились в соответствии с директивами Комитета по исследованиям и вопросам этики I.A.S.P. (1983). А. Лечение заболеваний, связанных с токсичностью А В этой серии экспериментов комбинации-кандидаты проверяли на их способность предотвращать или уменьшать токсические эффекты A1-42 человека. A1-42 является полноразмерным пептидом, из которого состоят агрегаты, обнаруженные в биопсиях больных людей, страдающих AD. Эффект определяли на различных типах клеток, чтобы подробно документировать активность комбинаций на моделях invitro, иллюстрирующих различные физиологические особенности AD. Также проводились исследованияin vivo на мышиной модели AD, чтобы проверить такой защитный эффект путем исследования эффекта комбинаций на i) когнитивную способность животных и ii) на молекулярные признаки AD (индуцирование апоптоза, появление окислительного стресса, появление воспаления).I. Комбинированная терапия баклофеном и акампросатом предотвращает токсичность A1-42 человека in vitroI.1. Действие на токсичность пептида А 1-42 человека на клетках НВМЕ человека Для исследования защитного действия соединений-кандидатов на токсичность A1-42 использовали культуры эндотелиальных клеток микрососудов мозга человека. Эндотелиальные клетки церебральных микрососудов мозга человека (НВМЕС, ScienCell, кат.1000, замороженные при 10 пересеве) быстро оттаивали на водяной бане при +37 С. Супернатант немедленно вносили в 9 мл модифицированной Дюльбекко среды Игла (DMEM; Pan Biotech, кат.Р 0403600), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS; GIBCO, кат.10270-106). Суспензию клеток центрифугировали при 180g в течение 10 мин при +4 С, а осадки суспендировали в бессывороточной среде CSC (CSC бессывороточная, Cell System, кат.SF-4Z0-500-R, серия 51407-4) с 1,6% бессывороточного RocketFuel (Cell System, кат.SF-4Z0-500-R, серия 54102), 2% пенициллина 10000 ед./мл и стрептомицина 10 мг/мл (PS; Pan Biotech, кат.Р 06-07100, серия 133080808) и высеивали при плотности 20000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты (Matrigel layer biocoat angiogenesis system,BD, кат.354150, серия А 8662) в конечном объеме 100 мкл. На подложке из матригеля эндотелиальные церебральные клетки спонтанно запускали процесс морфогенеза капиллярной сети (33). Ставили три отдельные культуры на исследование 1 условия, по 6 лунок на 1 условие. Тестируемые соединения и обработка амилоидом-1-42 человека Вкратце, пептид А 1-42 (Bachem, кат.Н 1368, серия 1010533) растворяли в культуральной среде определенного состава при 20 мкМ (маточный раствор) и медленно встряхивали при +37 С в течение 3 дней в темноте. Контрольную среду получали в тех же условиях. Через 3 дня амилоидный пептид человека использовали на клетках НВМЕС при 2,5 мкМ, разбавленный в контрольной среде (оптимальное время инкубации). Пептид A1-42 добавляли через 2 ч после посева НВМЕС на матригель для инкубации в течение 18 ч. Через 1 ч после посева НВМЕС на матригель тестируемые соединения и VEGF-165 растворяли в культуральной среде (+ 0,1% DMSO), а затем преинкубировали с НВМЕС в течение 1 ч перед внесениемA1-42 (в конечном объеме 100 мкл на лунку). Через 1 ч после инкубации тестируемых соединений илиVEGF (через 2 ч после посева клеток на матригель) добавляли 100 мкл петида A1-42 до конечной концентрации 2,5 мкМ, разбавленного в контрольной среде в присутствии тестируемых соединений илиVEGF (в общем объеме 200 мкл на лунку), чтобы избежать дальнейшего разбавления препарата. Формирование культур на чашках В качестве контрольного соединения для всех экспериментов в данном исследовании использовалиVEGF-165, который, как известно, является проангиогенной изоформой VEGF-A. VEGF-165 является одной из самых распространенных изоформ VEGF, участвующих в ангиогенезе. VEGF использовали в качестве эталонного тест-соединения при 10 нМ (фиг. 1). Оценивали следующие условия: отрицательный контроль: сама среда + 0,1% DMSO; интоксикация: амилоид-A1-42 (2,5 мкМ) в течение 18 ч; положительный контроль: VEGF-165 (10 нМ) (1 эталонное соединение на 1 культуру) за 1 ч перед добавлением A1-42 (2,5 мкМ) для инкубации в течение 18 ч; тестируемые соединения: тестируемое соединение за 1 ч перед добавлением A1-42 (2,5 мкМ) для инкубации в течение 18 ч. Количественная оценка капиллярной сети Делали по 2 снимка на лунку с увеличением 4 при помощи InCell Analyzer 1000 (GE Healthcare) в режиме светопропускания. Все снимки делали в одинаковых условиях. Анализ сетей ангиогенеза проводили с помощью программы Developer (GE Healthcare). Оценивали общую длину капиллярной сети. Обработка данных Данные выражали в процентах от контрольных условий (без интоксикации, без амилоида = 100%),чтобы отразить повреждения, вызванные амилоидом. Все значения выражали в виде среднего значенияSEM (стандартная ошибка среднего) из 3 культур (n = 6 лунок на условие). Проводили статистический анализ на различные условия (односторонний метод ANOVA с последующим тестом Dunnett, если он проходит, программа Statview версии 5.0). Результаты Комбинация баклофен-акампросат производит значительный защитный эффект против токсичности пептида А 1-42 человека на модели НВМЕС (наблюдается снижение повреждений пептидом A1-42 на 24%), как это видно из фиг. 2. Результаты четко показывают, что интоксикация амилоидным пептидом человека (A1-42, 2,5 мкМ) значительно предотвращается комбинацией лекарственных препаратов, тогда как при тех же концентрациях сами препараты не производят значительного эффекта на интоксикацию при описанных выше экспериментальных условиях. Напротив, комбинация баклофена и тербинафина (которая представлена здесь только для сравнения) дает более слабую защиту (наблюдается снижение повреждений пептидом A1-42 на 15%) от A1-42(фиг. 3). Таким образом, хотя обе эти комбинации обеспечивают защиту от A1-42, комбинация баклофенакампросат явно выделяется. Так, эти препараты при концентрациях, не дающих эффекта по отдельности, обеспечивают значительную защиту клеток НВМЕ человека от A1-42 при использовании в комбинации. Кроме того, комбинация баклофен-акампросат оказалась более эффективной, чем комбинация баклофен-тербинафин. Такое действие баклофена и акампросата представляет значительное улучшение на 60% по сравнению, например, с действием комбинации баклофен-тербинафин. Более того, в комбинации баклофен-акампросат использовалась гораздо меньшая концентрация баклофена, чем концентрация баклофена, использовавшаяся в комбинации баклофен-тербинафин (в 25 раз меньше).I.2. Действие на токсичность пептида A1-42 человека на клетках первичных корковых нейронов Культура первичных корковых нейронов Корковые нейроны крыс культивировали, как описано в Singer et al. (47). Вкратце, беременных самок крыс на 15-й день беременности забивали смещением шейных позвонков (крысы Вистар) и извлекали плоды из матки. Кору головного мозга извлекали и помещали в ледяную среду Leibovitz (L15), содержащую 2% пенициллина 10000 ед./мл и стрептомицина 10 мг/мл и 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Кору подвергали диссоциации трипсином в течение 20 мин при 37 С (0,05%). Реакцию останавливали добавлением модифицированной Дюльбекко среды Игла (DMEM), содержащей ДНКазу-1 класса II и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS). Затем клетки подвергали механической диссоциации, пропуская их по 3 раза через пипетку на 10 мл, и центрифугировали при 515g в течение 10 мин при +4 С. Супернатант отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в культуральной среде определенного состава, состоящей из Neurobasal с добавлением В 27 (2%), L-глутамина (0,2 мМ), 2% раствора PS и 10 нг/мл BDNF. Подсчитывали жизнеспособные клетки на цитометре Neubauer с помощью теста на исключение трипанового синего. Клетки высеивали при плотности 30000 клеток на лунку в 96- 16023277 луночные планшеты (лунки предварительно покрывали поли-L-лизином (10 мкг/мл и культивировали при +37 С в увлажненной атмосфере из воздуха (95%) и СО 2 (5%). Ставили три независимые культуры на исследование 1 условия, по 6 лунок на 1 условие. Тестируемые соединения и обработка амилоидом-1-42 человека Вкратце, пептид A1-42 растворяли в культуральной среде определенного состава при 40 мкМ (маточный раствор) и медленно встряхивали при +37 С в течение 3 дней в темноте. Контрольную среду получали в тех же условиях. Через 3 дня раствор использовали на первичных корковых нейронах следующим образом. После 10 дней культивирования нейронов тестируемые соединения растворяли в культуральной среде (+0,1% DMSO), а затем преинкубировали с нейронами в течение 1 ч перед внесением A1-42 (в конечном объеме 100 мкл на лунку). Через 1 ч после инкубации тестируемых соединений добавляли 100 мкл пептида A1-42 до конечной концентрации 10 мкМ, разбавленного в присутствии препаратов, чтобы избежать дальнейшего разбавления тестируемых соединений. Корковые нейроны подвергали интоксикации в течение 24 ч. Ставили три отдельные культуры на исследование 1 условия, по 6 лунок на 1 условие. В качестве положительного контроля и эталонного соединения использовали BDNF (50 нг/мл) и эстрадиол (150 нМ) соответственно. Ставили три отдельные культуры на исследование 1 условия, по 12 лунок на 1 условие. Формирование культур на чашках В качестве положительного контроля использовали -эстрадиол при 150 нМ (фиг. 4). -Эстрадиол растворяли в культуральной среде и преинкубировали в течение 1 ч перед внесением амилоида-A1-42. Оценивали следующие условия: контрольный планшет: по 12 лунок на 1 условие отрицательный контроль: сама среда + 0,1% DMSO; интоксикация: амилоид-1-42 (10 мкМ) в течение 24 ч; эталонное соединение: эстрадиол (150 нМ) в течение 1 ч; планшет с препаратами: по 6 лунок на 1 условие отрицательный контроль: сама среда + 0,1% DMSO; интоксикация: амилоид-1-42 (10 мкМ) в течение 24 ч; тестируемые соединения: тестируемое соединение за 1 ч перед добавлением амилоида-1-42 (10 мкМ) на 24 ч. Анализ активности лактатдегидрогеназы (LDH) После 24-часовой интоксикации отбирали супернатанты и анализировали с помощью набора Cytotoxicity Detection kit (LDH, Roche Applied Science, кат.11644793001, серия 11800300). Этот колориметрический метод количественной оценки клеточной токсичности основан на измерении активности лактатдегидрогеназы (LDH), выделяющейся из цитозоля погибающих клеток в супернатант. Обработка данных Данные выражали в процентах от контрольных условий (без интоксикации, без амилоида = 100%),чтобы отразить повреждения, вызванные амилоидом. Все значения выражали в виде среднего значенияSEM (стандартная ошибка среднего) из 3 культур (n = 6 лунок на 1 условие). Проводили статистический анализ на различные условия (односторонний метод ANOVA с последующим тестом Dunnett, если он проходит, программа Statview версии 5.0). Результаты Комбинация баклофена и акампросата производит значительный защитный эффект против токсичности пептида A1-42 человека (улучшение выживаемости клеток на 34%) на клетках первичных корковых нейронов, как это видно из фиг. 5. Результаты четко показывают, что интоксикация амилоидным пептидом человека (A1-42, 10 мкМ) значительно предотвращается комбинацией лекарственных препаратов, тогда как при тех же концентрациях сами препараты не производят значительного эффекта на интоксикацию при описанных выше экспериментальных условиях. Напротив, хотя она и активна на этой модели, комбинация сульфисоксазола и цинакальцета дает более слабую защиту от A1-42 (19%, фиг. 6). Таким образом, хотя обе эти комбинации обеспечивают защиту от A1-42, комбинация баклофенакампросат явно выделяется. Так, при концентрациях, не дающих эффекта по отдельности, эти препараты обеспечивают значительную защиту клеток первичных корковых нейронов от A1-42 при использовании в комбинации. Кроме того, комбинация баклофен-акампросат оказалась более эффективной, чем комбинация сульфисоксазол-цинакальцет. Такое действие баклофена и акампросата представляет значительное улучшение на 60% по сравнению, например, с действием комбинации сульфисоксазола и цинакальцета. В целом, эти результаты свидетельствуют о неожиданном и примечательном положительном эффекте комбинации баклофен-акампросат на нескольких моделях болезни Альцгеймера in vitro. Наблюдавшийся эффект значительно превосходит эффект, который вызывают другие комбинированные тера- 17023277 пии на основе баклофена (например, баклофен-тербинафин) или другие активные комбинированные терапии (сульфисоксазол-цинакальцет). Проводилось сравнение защитной активности акампросата и гомотаурина на корковые клетки (фиг. 17). Эти результаты показали, что производное акампросата, называемое гомотаурином, обеспечивает эффективную защиту против A1-42. Таким образом, в контексте настоящего изобретения баклофен или акампросат можно заменять на их производные, при условии, что эти производные окажутся эффективными при описанном здесь анализе.I.3. Защита от токсичности A1-42 на модели роста нейритов и функциональности синапсов Корковые нейроны крыс культивировали, как описано в Singer et al. (47). Вкратце, беременных самок крыс на 15-й день беременности забивали смещением шейных позвонков (крысы Вистар) и извлекали плоды из матки. Кору головного мозга извлекали и помещали в ледяную среду Leibovitz (L15), содержащую 2% пенициллина 10000 ед./мл и стрептомицина 10 мг/мл и 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Кору подвергали диссоциации трипсином в течение 20 мин при 37 С (0,05%). Реакцию останавливали добавлением модифицированной Дюльбекко среды Игла (DMEM), содержащей ДНКазу-1 класса II и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS). Затем клетки подвергали механической диссоциации, пропуская их по 3 раза через пипетку на 10 мл, и центрифугировали при 515g в течение 10 мин при +4 С. Супернатант отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в культуральной среде определенного состава, состоящей из Neurobasal с добавлением В 27 (2%), L-глутамина (0,2 мМ), 2% раствора PS и 10 нг/мл BDNF. Подсчитывали жизнеспособные клетки на цитометре Neubauer с помощью теста на исключение трипанового синего. Клетки высеивали при плотности 30000 клеток на лунку в 96 луночные планшеты (лунки предварительно покрывали поли-L-лизином (10 мкг/мл и культивировали при +37 С в увлажненной атмосфере из воздуха (95%) и СО 2 (5%). После 10 дней культивирования клетки инкубировали с препаратами. Через 1 ч клетки подвергали интоксикации 2,5 мкМ -амилоида (1-42; Bachem) в среде определенного состава без BDNF, но вместе с препаратами. Корковые нейроны подвергали интоксикации в течение 24 ч. В качестве положительного(нейропротекция) контроля использовали BDNF (10 нг/мл). Ставили три независимые культуры на исследование 1 условия, по 6 лунок на 1 условие. Измерение длины нейритов и количества синапсов После 24-часовой интоксикации отбирали супернатанты, а корковые нейроны фиксировали в холодном растворе этанола (95%) и уксусной кислоты (5%) в течение 5 мин. После пермеабилизации с помощью 0,1% сапонина клетки блокировали в течение 2 ч PBS, содержащим 1% эмбриональной телячьей сыворотки. Затем клетки инкубировали с моноклональным антителом против ассоциированного с микротрубочками белка 2 (МАР-2; Sigma) или с антителами против синаптофизина (SYN, S5798, Sigma) и против PSD95 (Р 246, Sigma) для подсчета синапсов. Эти антитела специфически окрашивают клеточные тела и нейриты у нейронов (МАР 2) либо пре- и постсинаптические элементы (SYN и PSD95 соответственно). Эти антитела проявляли с помощью козьего антитела против IgG мыши с Alexa Fluor 488 (MolecularProbe). Ядра нейронов метили флуоресцентным маркером (раствор Hoechst, Sigma). Делали по 10 снимков на лунку с увеличением 20 при помощи InCell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Все снимки делали в одинаковых условиях. Анализ сети нейритов проводили с помощью программы Developer (GE Healthcare) для оценки общей длины сети нейритов. Результаты Комбинация баклофена и акампросата производит значительный защитный эффект против токсичности пептида А 1-42 человека (улучшение сети нейритов на 80%) на клетках первичных корковых нейронов, как это видно из фиг. 7. Результаты четко показывают, что интоксикация амилоидным пептидом человека (A1-42, 2,5 мкМ) значительно предотвращается комбинацией, тогда как при тех же концентрациях сам баклофен или акампросат не производит значительного эффекта на интоксикацию. Кроме того, общая длина сети нейритов, обработанных этой комбинацией, незначительно отличалась от контрольных клеток. Таким образом, эта комбинация обеспечивает эффективную защиту клеток корковых нейронов от токсичности пептида A1-42 человека, а также рост нейритов, сравнимый с нормальными клетками корковых нейронов.II. Комбинированная терапия баклофеном и акампросатом предотвращает токсичность А 25-35 человека in vitro Животные На протяжении всего исследования использовали самцов мышей Swiss. Животных содержали в пластиковых клетках со свободным доступом к лабораторному корму и воде, за исключением поведенческих экспериментов, и держали в регулируемых условиях при 12-часовом цикле свет/темнота (свет включали в 8:00 утра). Эксперименты проводились в звуконепроницаемой экспериментальной комнате с регулируемой подачей воздуха, к которой мыши привыкали по меньшей мере за 30 мин перед каждым экспериментом. Комбинированное лечение Препараты вводили ежедневно гаважем (перорально). Пептид 25-35 и беспорядочный пептид 25-35(контроль) растворяли в стерильной бидистиллированной воде и хранили при -20 С до употребления. Затем -амилоидные пептиды вводили внутрь желудочков мозга (i.c.v.). Вкратце, каждую мышь слегка анестезировали эфиром и вставляли калиброванную иглу из нержавеющей стали унилатерально на 1 мм вправо от точки на срединной линии на равном расстоянии от каждого глаза, на равном расстоянии между глазами и ушами и перпендикулярно к плоскости черепа. Пептиды или носители вводили постепенно в течение примерно 3 с. Мыши проявляли нормальное поведение через 1 мин после инъекции. Точку введения проверяли путем введения черной туши в предварительных экспериментах. Ни введение иглы,ни введение носителя не оказывали значительного влияния на выживание, поведенческие реакции или когнитивные функции. Обработка препаратами В день -1, т.е. за 24 ч до введения пептида А 25-35, вводили комбинации препаратов или раствор носителя гаважем per os два раза в день (в 8:00 утра и в 6:00 вечера). В день 0 (в 10:00 утра) мышам вводили i.c.v. пептид А 25-35 или беспорядочный пептид А 25-35 (контроль) в конечном объеме 3 мкл (3 мМ). Между днем 0 и днем 7 вводили препараты, комбинации препаратов или раствор носителя гаважемper os один или два раза в день (в 8:00 утра и в 6:00 вечера). Одна группа животных получала донепезил(эталонное соединение - 1 мг/кг/день) гаважем per os за один раз (в 8:00 утра). Препараты растворяли в воде и готовили свежими прямо перед каждым введением гаважем. В день 7 всех животных тестировали на показатели спонтанного чередования в Y-образном лабиринте как показатели пространственной рабочей памяти. В день 7 и 8 оценивали контекстную долговременную память у животных по методике пассивного избегания типа соскока. В день 8 животных забивали. Мозги препарировали и хранили при -80 С для дальнейшего анализа. Комбинации усиливают поведенческие и когнитивные показатели у животных с интоксикацией Показатели спонтанного чередования при тестировании в Y-образном лабиринте В день 7 всех животных тестировали на показатели спонтанного чередования в Y-образном лабиринте как показатели пространственной рабочей памяти. Y-образный лабиринт сделан из серого поливинилхлорида. Каждый рукав длиной 40 см, высотой 13 см, шириной 3 см в нижней части и 10 см в верхней части, причем все они сходятся под равными углами. Каждую мышь ставят в конце одного рукава и дают свободно перемещаться по лабиринту на протяжении 8 мин. Визуально отмечают все заходы в рукава, в том числе возможные возвращения в один и тот же рукав. Чередование определяется как заходы во все три рукава поочередно. Следовательно, максимальное число чередований есть общее число заходов в рукава минус два, а степень чередования рассчитывается в процентах как (фактические чередования/максимальное число чередований)100. Параметры включают степень чередования (показатель памяти) и общее число заходов в рукава (показатель поиска). Животных, проявляющих экстремальное поведение (степень чередования 25% или 85% или число заходов в рукава 10), не учитывают. Обычно они составляют 0-5% животных. Этот тест, кстати, служит для анализа на поведенческом уровне воздействия и амнестического эффекта, вызванного у мышей инъекцией А 25-35. Тест на пассивное избегание Установка представляет собой ящик (152015 см высотой) из двух отсеков: один освещенный со стенками из белого поливинилхлорида, а другой затемненный со стенками из черного поливинилхлорида и с сетчатым полом. Каждый отсек отделяется дверью типа гильотины. Белый отсек во время эксперимента освещается лампой на 60 Вт, расположенной на 40 см над установкой. На сетку пола подаются беспорядочные разряды для лап (0,3 мА в течение 3 с) с помощью генератора-скремблера разрядов (Lafayette Instruments, Lafayette, USA). Дверь-гильотина изначально закрыта во время тренировочного сеанса. Каждая мышь помещается в белый отсек. Через 5 с дверца поднимается. Когда мышь заходит в темный отсек и становится всеми лапами на сетчатый пол, дверца закрывается и подается разряд на лапы в течение 3 с. Отмечается латентность до перехода, то есть латентный период до вхождения в темный отсек, и количество издаваемых звуков. Через 24 ч после тренировки проводится тест на запоминание. Каждая мышь опять помещается в белый отсек. Через 5 с дверцы поднимаются и отмечается латентность до перехода и латентность до ухода, т.е. время, затраченное на возвращение в белый отсек, вплоть до 300 с. Наблюдались положительные результаты по поведенческим показателям и биохимическим анализам, выполненным через 7 дней после инъекции i.c.v. пептида 25-35. Комбинация баклофена и акампросата оказывает значительное защитное действие на поведенческие и когнитивные показатели у животных, подвергшихся интоксикации, как это видно из фиг. 8, 9 и 10. На фиг. 8 у мышей с интоксикацией, показавших только 53,8% чередования, проявляется сильное нарушение пространственной рабочей памяти по сравнению с контролем. Это нарушение значительно предотвращалось у мышей, получавших баклофен и акампросат с улучшением больше чем на 48% от их степени чередования по сравнению с контролем. Аналогичным образом из фиг. 9 и 10 видно, что у животных с интоксикацией проявляется сильное нарушение поведенческих и когнитивных показателей, судя по латентности спасения и латентности избегания соответственно. В обоих тестах комбинация баклофена и акампросата обеспечивает значительную коррекцию нарушений. Латентность спасения у мышей, получавших эту комбинацию, незначительно отличается от контрольных мышей (фиг. 9), а латентность избегания (фиг. 10) значительно повышается под действием комбинации по изобретению при более сильном эффекте комбинации по сравнению с самими препаратами. Ухудшение памяти является ранним признаком болезни Альцгеймера, а эти результаты четко показывают, что токсический эффект амилоидного пептида на поведенческие и когнитивные показатели(включая память) значительно предотвращается комбинациями по изобретению. Кроме того, из фиг. 16 видно, что можно комбинировать чрезвычайно низкие дозы баклофена (480 мкг/кг/день), акампросата (32 мкг/кг/день) и донепезила (0,25 мг/кг/день), получая полную защиту поведенческих и когнитивных показателей у мышей по данным теста в Y-образном лабиринте. В то время как донепезил, при такой концентрации, не оказывает значительного эффекта (32% защиты) на пространственную рабочую память, его применение в сочетании с комбинацией баклофена и акампросата обеспечивает полную защиту (98%) когнитивных показателей у мышей с интоксикацией. Таким образом, комбинации по изобретению можно дополнительно комбинировать с другими терапиями, чтобы усилить их действие. Комбинации улучшают нейрофизиологический аспект неврологических заболеваний Комбинированные терапии тестировали на модели интоксикации А in vivo. Оценивали их эффекты на некоторые параметры, которые ухудшаются при неврологических заболеваниях уровень экспрессии каспаз 3 и 9, которые считаются показателями апоптоза; перекисное окисление липидов, которое считается показателем уровня окислительного стресса; уровень экспрессии GFAP, который считается показателем уровня воспаления в мозге; целостность гематоэнцефалического барьера; общая целостность синапсов (ELISA на синаптофизин); количество жизнеспособных нейронов в СА 1. Целостность гематоэнцефалического барьера Схема экспериментов по интоксикации животных А была такая же, как и в части III. Возможный защитный эффект комбинированной терапии на целостность гематоэнцефалического барьера (ВВВ) анализировали на мышах, которым в желудочки мозга (i.c.v.) вводили олигомерный амилоидный пептид 25-35 (А 25-35) или беспорядочный контрольный пептид А 25-35 (Sc.A), через 7 дней после инъекции. На 7-й день после инъекции А 25-35 животных тестировали для определения целостности ВВВ методом ЕВ (Evans Blue). Краситель ЕВ связывается с сывороточным альбумином после периферической инъекции и его использовали в качестве индикатора для сывороточного альбумина. Краситель ЕВ (2% в физрастворе, 4 мл/кг) вводили внутрибрюшинно (i.p.) за 3 ч до транскардиальной перфузии. Затем мышей анестезировали i.p. с помощью 200 мкл готовой смеси кетамина 80 мг/кг и ксилазина 10 мг/кг и вскрывали грудную клетку. Мышей перфузировали транскардиально 250 мл физраствора примерно 15 мин до тех пор, пока жидкость из правого предсердия не становилась бесцветной. После декапитации извлекали мозг и рассекали на три части: церебральная кора (левая + правая), гиппокамп (левый + правый), промежуточный мозг. Затем каждую часть мозга взвешивали для количественного измерения вышедшего из сосудов ЕВ-альбумина. Образцы гомогенизировали в физрастворе с фосфатным буфером и перемешивали на вибромешалке после добавления 60% трихлоруксусной кислоты для осаждения белка. Образцы охлаждали при 4 С, а затем центрифугировали 30 мин при 10000g, при 4 С. В супернатанте измеряли поглощение ЕВ при 610 нм на спектрофотометре. ЕВ определяли количественно в мкг/мг ткани мозга по стандартной кривой, полученной при известных концентрациях ЕВальбумина, и в мкг/мг белка. Общая целостность синапсов (ELISA на синаптофизин) В качестве маркера целостности синапсов был выбран синаптофизин, который определяли с помощью коммерческого набора для ELISA (USCN, кат.Е 90425 Ми). Готовили образцы из ткани гиппокампа и гомогенизировали в специальном буфере для экстракции, как описано производителем и в справочной литературе. Ткани тщательно промывали в ледяном PBS (0,02 моль/л, рН 7,0-7,2) для удаления лишней крови и взвешивали, а затем замораживали в жидком азоте и хранили при -80 С. Ткани нарезали на мелкие кусочки и гомогенизировали в 1 мл ледяного физраствора с фосфатным буфером (PBS) в стеклянном гомогенизаторе. Полученную суспензию обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового дезинтегратора или подвергали двум циклам замораживания-оттаивания для дальнейшего разрушения клеточ- 20023277 ных мембран. Затем гомогенаты центрифугировали 5 мин при 5000g и сразу же отбирали супернатант для анализа. Все образцы анализировали в трех повторах. Количественное определение белка проводили с помощью набора Pierce BCA для определения белка с бицинхониновой кислотой (Pierce, кат.23227), чтобы оценить эффективность экстракции, и для нормализации. Затем рассчитывали общую концентрацию белка по стандартной кривой из разведений, которая служила для нормализации результатов ELISA. Количественная оценка жизнеспособных нейронов в СА 1 На 8-й день мышей анестезировали i.p. с помощью 200 мкл готовой смеси кетамина 80 мг/кг и ксилазина 10 мг/кг и перфузировали транскардиально 100 мл физраствора, а затем 100 мл 4% параформальдегида. Извлекали мозги и держали 24 ч для постфиксации в 4% растворе параформальдегида при 4 С. После этого мозги промывали в физрастворе с фосфатным буфером (PBS), затем удаляли мозжечок,а передний мозг помещали на платформу вибратома (Leica VT100OS, Leica, Wetzlar, Германия) для приготовления срезов. Мозги нарезали на корональные срезы (толщиной 20 мкм) с помощью вибратома (Leica VT100OS,Leica, Wetzlar, Германия). Серийные срезы помещали в 24-луночный планшет с PBS. Затем отбирали срезы, содержащие гиппокамп, и 9 срезов помещали на покрытые желатином предметные стекла (один срез на 1 животное для крезилового фиолетового). Все срезы сушили при комнатной температуре в течение 48 ч, чтобы они не отклеивались. Срезы хранили при комнатной температуре до окрашивания крезиловым фиолетовым. Срезы окрашивали реагентом с 0,2% крезилового фиолетового (Sigma-Aldrich), затем обезвоживали проведением через этанол, обрабатывали толуолом и монтировали с помощью среды Mountex (BDH Laboratory Supplies, Poole, Dorset, UK). После монтажа срезы держали при комнатной температуре 24 ч для высушивания. Исследование области СА 1 проводили под световым микроскопом (Dialux 22, Leitz), при этом срезы оцифровывали через CCD-камеру (Sony XC-77CE, Sony, Paris, Франция) с помощью программы NIHImage vl.63 (NIH). Измерение СА 1 и подсчет пирамидальных клеток проводили с помощью ImageJ (NIH). Данные выражали в виде среднего значения из 9 срезов по пирамидальным клеткам в СА 1 на 1 миллиметр для каждой группы (подсчет по СА 1 левого и правого гиппокампа) (49). Анализ окислительного стресса Мышей забивали путем декапитации и быстро извлекали оба гиппокампа, взвешивали и хранили в жидком азоте до проведения анализа. После оттаивания гиппокамп гомогенизировали в холодном метаноле (1/10 веса на единицу объема), центрифугировали при l000g в течение 5 мин, а супернатант помещали в эппендорфовскую пробирку. Порцию каждого гомогената вносили в раствор 1 мМ FeSO4, 0,25 М H2SO4, 1 мМ ксиленолового оранжевого и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После измерения поглощения при 580 нм (A5801) в образец добавляли 10 мкл 1 мМ гидроперекиси кумена(СНР) и инкубировали 30 мин при комнатной температуре для определения максимального уровня окисления. Измеряли поглощение при 580 нм (А 5802). Уровень перекисного окисления липидов определяли по эквивалентам СНР (СНРЕ) в соответствии с: СНРЕ = (А 5801/А 5802)[СНР] и выражали в виде эквивалентов СНР на вес ткани и в процентах от контроля. Анализ индукции каспазного пути и анализ экспрессии GFAP Мышей забивали путем декапитации и быстро извлекали оба гиппокампа, тщательно промывали в ледяном PBS (0,02 моль/л, рН 7,0-7,2) для удаления лишней крови, взвешивали, хранили в жидком азоте до анализа. Ткани нарезали на мелкие кусочки и гомогенизировали в 1 мл ледяного PBS в стеклянном гомогенизаторе. Полученную суспензию обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового дезинтегратора или подвергали двум циклам замораживания-оттаивания для дальнейшего разрушения клеточных мембран. Затем гомогенаты центрифугировали 5 мин при 5000g и сразу же отбирали супернатант для анализа. Эксперименты проводили с помощью коммерческих наборов для определения каспазы-3 (USCN E90626Mu), каспазы-9 (USCN - E90627Mu), GFAP (USCN - Е 90068). Количественное определение белка проводили с помощью набора Pierce BCA для определения белка с бицинхониновой кислотой (Pierce, кат.23227), чтобы оценить эффективность экстракции, и для нормализации. Комбинация баклофена и акампросата индуцировала значительный защитный эффект на нейрофизиологические функции у животных с интоксикацией, как это видно из фиг. 11, 12, 13 и 14. При степени защиты более 60% по сравнению с необработанными животными с интоксикацией комбинация эффективно предохраняет нейроны (фиг. 11) и плотность синапсов (фиг. 13). Точно так же из фиг. 12 видно, что комбинация баклофена и акампросата предохраняет целостность ВВВ (76%) по сравнению с необработанными животными с интоксикацией. Наконец, эта комбинированная терапия, в целом, эффективно снижает вызванный А окислитель- 21023277 ный стресс в мозге обработанных животных по сравнению с необработанными животными с интоксикацией (фиг. 14). Как видно из примеров в части А, комбинация баклофен-акампросат предохраняет некоторые неврологические функции, которые нарушаются при различных неврологических заболеваниях, включая нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и родственные заболевания, и замедляет или ослабляет их симптомы. В. Предотвращение токсичности глутамата на нервных клетках В следующей серии соединения-кандидаты тестировали на их способность предотвращать или снижать токсические эффекты глутаматной токсичности на нервные клетки. Глутаматная токсичность участвует в патогенезе таких неврологических заболеваний, как рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, невропатии, алкоголизм или синдром отмены алкоголя либо травмы спинного мозга. Препараты сначала проверяли по отдельности, а затем анализировали их комбинированное действие. Методы Эффективность комбинаций препаратов по изобретению оценивали на клетках первичных корковых нейронов. Методики, которые использовались при этом, были такими же, как описано выше в разделе A.I.2. Оценка глутаматной токсичности Нейропротекторный эффект соединений оценивали путем количественной оценки сети нейритов(иммуноокрашивание нейрофиламентов (NF, которая специфически отражает глутаматергические нейроны. После 12 дней культивирования нейронов препараты из комбинаций-кандидатов растворяли в культуральной среде (+0,1% DMSO). Затем комбинации-кандидаты преинкубировали с нейронами в течение 1 ч перед глутаматным повреждением. Через 1 ч после инкубации добавляли глутамат на 20 мин до конечной концентрации 40 мкМ, в присутствии комбинаций-кандидатов, чтобы избежать дальнейшего разбавления препаратов. По окончании инкубации среду заменяли средой с комбинацией-кандидатом, но без глутамата. Через 24 ч после глутаматного повреждения культуру фиксировали. В качестве положительного контроля использовали MK801 (дизоцилпин гидрогенмалеат, 77086-22-7 - 20 мкМ). После пермеабилизации сапонином (Sigma) клетки блокировали в течение 2 ч с помощью PBS, содержащего 10% козьей сыворотки, а затем клетки инкубировали с мышиным первичным моноклональным антителом мыши против нейрофиламентов (NF, Sigma). Это антитело проявляли с помощью козьего антитела против IgG мыши с Alexa Fluor 488 (Molecular Probe). Ядра нейронов метили флуоресцентным маркером (раствор Hoechst, Sigma) и количественно оценивали сеть нейритов. Для оценки выживаемости нейронов в 3 различных культурах использовали по шесть лунок на исследование 1 условия. Результаты Комбинация баклофен-акампросат оказывает защитный эффект против токсичности глутамата для корковых нейронов. Как видно из фиг. 15, комбинации по изобретению сильно защищают нейроны от глутаматной токсичности при описанных выше экспериментальных условиях. Следует отметить, что эффективная защита наблюдалась при таких концентрациях, при которых сами препараты дают меньший эффект. Комбинация баклофена и акампросата вызывает улучшение больше чем на 200% по сравнению с одним акампросатом и больше чем на 47% по сравнению с одним баклофеном. С. Улучшение при других заболеваниях, связанных с эксцитотоксичностью глутамата, с помощью комбинаций по изобретению Вышеприведенный защитный эффект in vitro против глутаматной токсичности у препаратов или комбинаций препаратов по изобретению в сочетании с защитными эффектами, установленными на нескольких моделях AD, побудили авторов изобретения проверить эти препараты и комбинации на некоторых моделях других заболеваний, в патогенезе которых также участвует глутаматная токсичность, таких как MS, ALS и невропатические боли.I. Защитный эффект комбинаций на модели рассеянного склероза in vivo Для демонстрации положительного эффекта композиций по изобретению при лечении рассеянного склероза использовали модель, при которой у мышей, иммунизированных гликопротеином олигодендроцитов миелина (иммунизированных MOG), развивается хронический прогрессирующий ЕАЕ. Животные и химикаты Самок мышей C57L/6J (8-недельного возраста) приобретали у Janvier (Франция); после 2 недель привыкания у самок мышей (в возрасте 10 недель) развивался хронический паралич после иммунизации пептидом MOG (гликопротеин олигодендроцитов миелина). Экспериментальный энцефаломиелит индуцировали с помощью набора Hooke Kit MOG35-55/CFA Emulsion PTX (коклюшный токсин) для индуцирования ЕАЕ (EK-0110, EK-0115; Hooke Laboratories). Контрольным набором служил CK-0115 (Hooke Laboratories). Экспериментальная процедура Экспериментальный энцефаломиелит индуцировали по следующей методике. В день 0 делали две подкожные инъекции по 0,1 мл: одну в верхнюю часть спины мыши и одну в нижнюю часть спины. Каждая инъекция содержит 100 мкг пептида MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK), 200 мкг инактивированного H37Ra Mycobacterium tuberculosis и эмульгирована в полном адъюванте Фрейнда (CFA)(Hooke Laboratories). Эмульсия обеспечивает антиген, необходимый для экспансии и дифференцировкиMOG-специфических аутоиммунных Т-клеток. Через 2 ч (день 0) и 24 ч (день 1) после введения MOG делали две внутрибрюшинные инъекции по 500 нг коклюшного токсина в PBS (Hooke kit). Коклюшный токсин усиливает развитие ЕАЕ, обеспечивая дополнительный адъювант. Через 8 дней после иммунизации у мышей развивался ЕАЕ и они оставались хронически парализованными на всем протяжении эксперимента. После иммунизации мышей ежедневно обследовали на клинические симптомы по слепой методике. Животных содержали в стандартной свободной от патогенов среде и все эксперименты проводились и были одобрены в соответствии с директивами, предписанными постоянным местным комитетом по биоэтике. Экспериментальные группы и обработка препаратами Перед иммунизацией подбирали по весу группы самок мышей, как описано контрольная группа: инъекция носителя при тех же условиях, что у мышей с ЕАЕ (со дня -1 до дня 28, ежедневно вводится плацебо); группа ЕАЕ: инъекция MOG (день 0) + инъекции коклюшного токсина (день 0 и 1) со дня -1 до дня 28, ежедневно перорально вводится плацебо; ЕАЕ + положительный контроль: инъекция MOG (день 0) + инъекции коклюшного токсина (день 0 и 1) со дня -1 до дня 28, ежедневно перорально вводится дексаметазон; группа ЕАЕ + обработка: инъекция MOG (день 0) + инъекции коклюшного токсина (день 0 и 1). Обработка начинается за день перед иммунизацией и продолжается до дня 28. Измеряются клинические показатели в дни 0-5-8-9-12-14-16-19-21-23-26-28. Для статистического анализа повсюду применяется программа Statistica (Statsoft Inc.). Для анализа клинических показателей заболевания применяется метод ANOVA и t-критерий Стьюдента. Значимым считается p0,05. Сравнивали замедление возникновения заболевания, клинические показатели и замедление наступления смерти между каждой группой относительно контрольной группы "immu" по кривым Kaplan-Meier и на модели Сох (пакет R "выживаемость"). Полученные значения р являются односторонними и по ним проверяется гипотеза улучшения по сравнению с контрольной группой "immu". Общий клинический показатель состоит из показателя хвоста, показателя задних лап, показателя передних лап и показателя мочевого пузыря, как изложено ниже. Показатель хвоста Глобальный показатель для каждого животного определяется сложением всех вышеупомянутых категорий. Максимальный показатель для живых животных составляет 10 баллов. Результаты: комбинированная терапия эффективна на модели MS Наблюдалось значительное улучшение глобального клинического показателя в "группе ЕАЕ + обработка" у мышей при комбинации баклофена и акампросата. Комбинация баклофена (30 мг/кг/день) и акампросата (2 мг/кг/день) индуцирует значительный защитный эффект против развития хронического прогрессирующего ЕАЕ и тем самым подтверждает положительный эффект композиции при лечении рассеянного склероза (фиг. 18). При снижении симптомов больше чем на 30% эти результаты четко показывают, что комбинация вызывает значительное уменьшение развития заболевания с 13 дня. Этот результат подтверждает замечательный положительный эффект комбинации баклофен-акампросат на защиту нейронов, в том числе на демиелинизацию и е последствия. В целом, эти результаты показывают, что данная комбинация обеспечивает эффективную защиту нейронов от многих стрессов, участвующих в развитии неврологических заболеваний, таких как амилоид, нарушение ВВВ, эксцитотоксичность глутамата или демиелинизация.II. Защитный эффект комбинации на моделях ALS Эффект комбинированной терапии по настоящему изобретению на ALS был продемонстрирован invitro, на модели при совместном культивировании, и in vivo, на мышиной модели ALS. В этом разделе представлены методики и результаты.II.1 Защитный эффект против токсичности глутамата на первичных совместных культурах нервных и мышечных клеток Первичные совместные культуры нервных и мышечных клеток Мышечную ткань человека получали согласно ранее описанному методу из части биоптата от здорового пациента (48). Мышечные клетки получали из диссоциированных клеток (10000 клеток на лунку),посеянных на покрытый 0,1% желатином 48-луночный планшет, и культивировали в пролиферативной среде, состоящей из смеси среды MEM и среды M199. Сразу же после слияния спутниковых клеток целые поперечные срезы спинного мозга от 13 дневных эмбрионов крыс Вистар с прикрепленными ганглиями задних корешков (DRG) помещали на мышечный монослой по 1 эксплантату на лунку (в центральной части). DRG необходимы для получения хорошего соотношения иннервации. Иннервированные культуры поддерживали в смешанной среде. Обычно через 24 ч в смешанной культуре наблюдались нейриты, растущие из эксплантатов спинного мозга. Они производят контакты с мышечными трубочками и индуцируют первые сокращения через 8 дней. Вскоре после этого практически непрерывно сокращаются иннервированные мышечные волокна,расположенные возле эксплантатов спинного мозга. Иннервированные волокна морфологически и пространственно отличаются от неинервированных и их можно легко отличить от них. Ставили одну совместную культуру (6 лунок на 1 исследование условия). Повреждение глутаматом На 27-й день совместные культуры инкубируют с соединениями-кандидатами или рилузолом за 1 ч перед интоксикацией глутаматом (60 мкМ) в течение 20 мин. Затем культуры промывают и добавляют соединения-кандидаты или рилузол еще на 48 ч. По окончании инкубации нефиксированные культуры инкубируют с -бунгаротоксином, конъюгированным с Alexa 488, в концентрации 500 нмоль/л в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем культуры фиксируют с помощью PFA в течение 20 мин при комнатной температуре. После пермеабилизации 0,1% сапонином совместные культуры инкубируют с антителом против нейрофиламентов (NF). Эти антитела проявляли с помощью козьего антитела против IgG мыши с Alexa Fluor 568 (MolecularProbe). Ядра нейронов метили флуоресцентным маркером (раствор Hoechst). Конечные точки: (1) общая длина нейритов, (2) количество моторных единиц, (3) общая площадь моторных единиц, которая свидетельствует о выживаемости и функциональности двигательных нейронов. Для каждого условия делали по 210 снимков на лунку с увеличением 20 при помощи InCell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Все снимки делали в одинаковых условиях. Результаты Комбинация баклофена и акампросата эффективно защищает мотонейроны и моторные клетки на модели в совместной культуре.II.2. Комбинированная терапия эффективна на мышиной модели ALS Эксперименты проводили на самцах мышей. Самцы трансгенных мышей B6SJL-Tg(SOD1)2Gur/J и их контроли (соответственно SN2726 и SN2297 от Jackson Laboratories, Ben Harbor, USA, которые во Франции распространяются фирмой Charles River) были выбраны в этой серии экспериментов для воспроизведения ALS. Больные мыши экспрессируют трансген SOD1-G93A, составленный с мутантным SOD1 человека(замена одной аминокислоты из глицина на аланин по кодону 93) под управлением эндогенного промотора SOD1 человека. Контрольные мыши экспрессируют контрольный ген SOD1 человека. Рандомизация животных Распределение по группам и рандомизация животных проводилась на основе массы тела; для каждой группы рандомизация проводилась за 1 день до первой обработки. Введение препаратов Мышам вводили препараты-кандидаты, разведенные в носителе, начиная с 60-го дня после рождения до самой смерти. Разбавленные растворы препаратов готовили на воде при комнатной температуре непосредственно перед началом введения. В питьевой воде в питьевую воду добавляли рилузол до конечной концентрации 6 мг/мл (подбирали по средней массе тела в каждой группе) в 5% циклодекстрине. Поскольку мыши выпивают примерно 5 мл в день, то вводимая доза составляла 30 мг/кг/день, что представляет дозу, которая, как было показано, повышает выживаемость у мышей; в качестве носителя использовали циклодекстрин в конечной концентрации 5%, разведенный в воде при комнатной температуре из маточного раствора (20% циклодекстрина). Пероральное введение (per os): комбинации препаратов вводили per os, ежедневно; в качестве носителя использовали циклодекстрин в конечной концентрации 5%, разведенный в воде при комнатной температуре из маточного раствора (20% циклодекстрина). Клиническое наблюдение Клиническое наблюдение каждой мыши проводили ежедневно, с первого дня обработки (в возрасте 60 дней) до самой смерти (или забоя). Клиническое наблюдение состоит в проведении поведенческих тестов: возникновения паралича, на "обвисание", "потерю рефлекса выпрямления" и общего наблюдения за походкой: начало паралича: наблюдение состоит в наблюдении за параличом по каждой конечности. Начало паралича соответствует дню появления первых признаков паралича; тест на "обвисание" заключается в появлении тремора или дрожания и в положении задних лап(свисающих или торчащих в стороны) при подвешивании мыши за хвост; тест на потерю рефлекса выпрямления: оценивается способность мыши к выпрямлению в течение 30 с после переворачивания на любую сторону. Рефлекс считается утерянным, если мышь неспособна выпрямиться. Потеря рефлекса выпрямления означает конечную стадию заболевания: мышь, неспособную выпрямиться, подвергают эвтаназии. Результаты: комбинированная терапия эффективна на модели ALS in vivo У больных животных при обработке комбинацией баклофена и акампросата наблюдается улучшение.III. Защитный эффект комбинаций при индуцированной оксалиплатином невропатии в качестве модели невропатических болей in vivo Комбинированную терапию по настоящему изобретению тестировали in vivo, на подходящих моделях периферической невропатии, т.е. острой модели индуцированной оксалиплатином невропатии и хронической модели индуцированной оксалиплатином невропатии. В этом разделе представлены животные,методики и результаты. Содержание животных Использовали крыс Sprague-Dawley (CERJ, Франция) весом 150-175 г в начале экспериментов по обработке оксалиплатином (D0). Животных содержали в помещении с ограниченным доступом в комнате с контролируемой температурой (19,5-24,5 С) и относительной влажностью (45-65%) при 12-часовом цикле свет/темнота, со свободным доступом к стандартному гранулированному корму и воде в течение всего исследования. Животных содержали по 4 или 5 на клетку и соблюдали период акклиматизации в течение одной недели перед тестированием. Экспериментальный дизайн Использовали следующие 4 группы крыс во всех экспериментах. Контрольные группы Группа 1: носитель для оксалиплатина (дистиллированная вода), i.p./носитель для комбинацийкандидатов (дистиллированная вода), per os, ежедневно. Группа 2: оксалиплатин (дистиллированная вода), i.p./носитель для комбинаций-кандидатов (дистиллированная вода), per os, ежедневно. Группа 3: оксалиплатин 3 мг/кг i.p./один препарат в дистиллированной воде, per os, ежедневно 9. Группы по тестированию комбинаций Группа 4: оксалиплатин 3 мг/кг i.p./комбинация-кандидат в дистиллированной воде, per os, ежедневно 9. Группа 5: оксалиплатин 3 мг/кг i.p./габапентин (100 мг/кг) в дистиллированной воде, per os, в дни тестирования (т.е. D1 и D8). Носители и исследуемые вещества вводили ежедневно с D1 до D7 (за день перед последним днем тестирования), тогда как габапентин вводили в дни тестирования (за 120 мин перед тестированием). Все обработки проводились в закодированном виде и в случайном порядке, по возможности. Дозы выражали в пересчете на свободную активную субстанцию. Индуцирование невропатии Острую невропатию индуцировали однократным внутрибрюшинным введением оксалиплатина (3 мг/мг). Хроническую периферическую невропатию индуцировали многократным внутрибрюшинным введением оксалиплатина (3 мг/мг, i.p.) в дни 0, 2, 4 и 7 (CD =12 мг/кг, i.p.). Хроническая невропатия у людей к тому же является кумулятивной, поэтому наиболее часто она наблюдается у тех пациентов, которые получили общие дозы оксалиплатинаили = 540 мг/м 2, что соответствует 15 мг/кг в виде кумулятивной дозы у крыс (Cersosimo R.J., 2005). Вызванная оксалиплатином болевая невропатия у крыс воспроизводит болевые симптомы у пациентов, принимавших оксалиплатин самым ранним симптомом является тепловая гипералгезия. Она измеряется с помощью теста с ацетоном или теста с погружением хвоста; позже появляется механическая гипералгезия. Она измеряется с помощью теста Von Frey или теста с надавливанием на лапу. Дозировка и тестирование животных Все комбинации препаратов начинали вводить со дня первой внутрибрюшинной инъекции оксалиплатина 3 мг/кг (D-1) и продолжали каждый день перорально до D7. В дни тестирования (т.е. D1 и D7) комбинации препаратов вводили после тестирования. Животные из группы, получавшей контрольный препарат (габапентин), получали дозы только в дни тестирования. Тест с ацетоном Холодовую аллодинию оценивали с помощью теста с ацетоном путем измерения реакции на термальную неноцицептивную стимуляцию в дни D1, примерно через 24 ч после первой инъекции оксалиплатина 3 мг/кг (острый эффект оксалиплатина), и D8 (хронический эффект оксалиплатина). В тесте с ацетоном измеряется латентность (задержка) отдергивания задней лапы после нанесения капли ацетона на поверхность подошвы обеих задних лап и оценивается интенсивность реакции (холодовой показатель). Измеряется время реакции на охлаждающее действие ацетона в пределах 20 с (точка отсечения) после нанесения ацетона. Реакция на ацетон также оценивается по следующей 4-балльной шкале: 0 (никакой реакции); 1 (быстрое отдергивание, отряхивание лапы); 2 (продолжительное отдергивание или заметное отряхивание лапы); 3 (повторяющееся отряхивание лапы с облизыванием или покусыванием). Результаты для каждой экспериментальной группы выражали в виде времени реакции, которое определяется как время в с, необходимое для того, чтобы вызвать реакцию лапы (среднее из 6 измерений для каждой крысы в целомSEM); кумулятивного холодового показателя, который определяется как сумма из 6 показателей для каждой крысы в целомSEM. Минимальное значение равно 0 (никакой реакции при любом из 6 испытаний), а максимальное возможное значение равно 18 (многократное отряхивание и облизывание или покусывание лап при каждом из шести испытаний). Статистический анализ Проверка по критерию Стьюдента, одностороннему, 3 типа. Уровень значимости задавали на уровне p 0,05; все группы сравнивали с группой болезнь+носитель (группа, получавшая оксалиплатин). На фигурах приводятся средние значения и стандартные ошибки среднего значения. Результаты Оксалиплатин вызывал значительное уменьшение времени реакции отдергивания лапы после нанесения ацетона (группа болезнь+носитель) с течением времени. Это уменьшение прогрессировало и было значимым с 1-го дня (острая модель вызванной оксалиплатином невропатии) до 8-го дня (хроническая модель) по сравнению с группой носителя. Антиаллодинное действие на острой модели и хронической модели вызванной оксалиплатином невропатии Комбинация баклофена и акампросата испытывалась на обеих моделях вызванной оксалиплатином невропатии. Она вызывала значительное снижение кумулятивного холодового показателя и значительное увеличение времени реакции по сравнению с группой, получавшей оксалиплатин и носитель. Таким образом, данная комбинация препаратов защищает от хронической и острой невропатии. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение комбинации, содержащей баклофен и акампросат или их фармацевтически приемлемые соли, для изготовления медикамента для лечения неврологических заболеваний. 2. Применение по п.1, где указанная комбинация дополнительно содержит по меньшей мере еще одно соединение, выбранное из сульфисоксазола, прилокаина, карбеноксолона, аминокапроновой кислоты, диэтилкарбамазина, цинакальцета, циннаризина, эплеренона, фенолдопама, лефлуномида, левосимендана, сулодексида, тербинафина, зонисамида, этомидата, фенформина, триметазидина, мексилетина,ифенпродила, моксифлоксацина, бромокриптина и торасемида или их фармацевтически приемлемых солей. 3. Применение по п.1 или 2, при этом комбинация содержит по меньшей мере одну из следующих комбинаций соединений: баклофен и акампросат,баклофен, акампросат и диэтилкарбамазин,баклофен, акампросат и цинакальцет,баклофен, акампросат и сульфисоксазол,баклофен, акампросат и торасемид,баклофен, акампросат и ифенпродил,баклофен, акампросат и мексилетин,баклофен, акампросат и эплеренон,баклофен, акампросат и левосимендан,баклофен, акампросат и тербинафин,- 28023277 баклофен, акампросат и лефлуномид,баклофен, акампросат и донепезил,баклофен, акампросат и мемантин,баклофен, акампросат и ривастигмин или их фармацевтически приемлемые соли. 4. Применение по любому из предыдущих пунктов, где указанная комбинация дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. 5. Применение по любому из предыдущих пунктов, где неврологическое заболевание выбрано из нейродегенеративных заболеваний, нейропатий, злоупотребления различными веществами и травмы спинного мозга. 6. Применение по п.5, где нейродегенеративное заболевание выбрано из болезни Альцгеймера,старческого слабоумия типа AD, деменции с тельцами Леви, сосудистой деменции, умеренного когнитивного нарушения, связанного с возрастом ухудшения памяти, рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона. 7. Применение по любому из предыдущих пунктов, при этом соединения в данной комбинации вводятся вместе, раздельно или последовательно. 8. Применение по любому из пп.1-6, при этом соединения в данной комбинации составлены вместе. 9. Применение по любому из предыдущих пунктов, при этом данная комбинация вводится субъекту неоднократно. 10. Применение по любому из предыдущих пунктов, при этом соотношение акампросат/баклофен(мас./мас.) составляет от 0,05 до 1000. 11. Применение по любому из предыдущих пунктов, при этом доза баклофена составляет от 0,01 до 100 мг в день, предпочтительно от 0,01 до 50 мг в день. 12. Применение по п.11, при этом доза баклофена составляет от 0,01 до 25 мг в день. 13. Применение по любому из предыдущих пунктов, при этом доза акампросата составляет от 1 до 1000 мг в день, предпочтительно от 1 до 400 мг в день. 14. Применение по п.13, при этом доза акампросата составляет от 1 до 200 мг в день, предпочтительно от 1 до 50 мг в день. 15. Применение по любому из предыдущих пунктов, где используется кальциевая соль акампросата. 16. Применение композиции, содержащей баклофен и акампросат или их фармацевтически приемлемые соли, для изготовления медикамента. 17. Медикамент, содержащий баклофен и акампросат или их фармацевтически приемлемые соли. 18. Медикамент, содержащий баклофен, акампросат и по меньшей мере одно соединение, выбранное из донепезила, мемантина, габапентина, ривастигмина, или их фармацевтически приемлемые соли. 19. Медикамент по п.18, содержащий баклофен, акампросат и донепезил или их фармацевтически приемлемые соли. 20. Медикамент по п.18, содержащий баклофен, акампросат и мемантин или их фармацевтически приемлемые соли. 21. Медикамент по п.18, содержащий баклофен, акампросат и ривастигмин или их фармацевтически приемлемые соли.