Варианты глюкоамилазы

Настоящее изобретение относится к комбинаторным вариантам исходной глюкоамилазы, которые имеют измененные свойства, для уменьшения синтеза продуктов конденсации в процессе гидролиза крахмала. Таким образом, варианты исходной глюкоамилазы пригодны, например, для применения в пивоварении и изготовлении патоки. Также описаны конструкции ДНК, кодирующие варианты, и способы получения вариантов глюкоамилаз в клетках-хозяевах. Дегн Петер Эдвард (DK), Ботт Ричард (US), Врумен Каспер Виллем,Схефферс Мартейн Силван (NL), Эле Вольфганг (DE) Медведев В.Н. (RU) Список последовательностей Прилагается список последовательностей, включающий SEQ ID NO: 1-1099, который включен в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Область изобретения Описаны комбинаторные варианты исходной глюкоамилазы, которые имеют измененные свойства и пригодны, например, для применения в пивоварении и производстве патоки. Также описаны конструкции ДНК, кодирующие эти варианты, и способы получения вариантов глюкоамилазы в клетках-хозяевах. Уровень техники изобретения Ферменты глюкоамилазы (глюкан-1,4 глюкогидролазы, ЕС 3.2.1.3) представляют собой гидролизующие крахмал экзогенно действующие карбогидразы, которые катализируют удаление последовательно расположенных элементов глюкозы с невосстанавливающих концов крахмала или родственных олиго- и полисахаридных молекул. Глюкоамилазы могут гидролизовать как линейные, так и разветвленные глюкозидные связи крахмала (например, амилозы и амилопектина). Глюкоамилазы продуцируются многочисленными штаммами бактерий, грибов, дрожжей и растений. Особенно интересными и коммерчески важными глюкоамилазами являются ферменты грибов, которые продуцируются внеклеточно, например, из штаммов Многие из генов, которые кодируют эти ферменты, были клонированы и экспрессированы в клетках дрожжей, грибов и/или бактерий. С коммерческой точки зрения глюкоамилазы являются очень важными ферментами и их используют в широком спектре применений, которые требуют гидролиза крахмала (например, для получения глюкозы и других моносахаридов из крахмала). Глюкоамилазы применяют для получения подсластителей из кукурузы с высоким содержанием фруктозы, которые составляют свыше 50% рынка подсластителей в США. Как правило, глюкоамилазы могут быть использованы и обычно используются с -амилазами в процессах гидролиза крахмала для гидролиза крахмала до декстринов, а затем до глюкозы. Затем глюкозу можно превращать во фруктозу с помощью других ферментов (например, глюкозоизомераз); кристаллизовать или использовать в ферментациях для получения множества конечных продуктов (например,этанол, лимонная кислота, молочная кислота, сукцинат, промежуточные соединения аскорбиновой кислоты, глутаминовая кислота, глицерин и 1,3-пропандиол). Этанол, полученный с использованием глюкоамилаз при ферментации крахмала и/или содержащего целлюлозу материала, можно использовать в качестве источника топлива или в сфере потребления алкоголя. При высоких концентрациях твердых веществ, используемых для производства в промышленных масштабах кукурузного сиропа с высоким содержанием глюкозы (HGCS) и кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы (HFCS), глюкоамилаза синтезирует ди-, три- и тетрасахариды из глюкозы с помощью реакций конденсации. Это происходит вследствие медленного гидролиза -(1-6)-Dглюкозидных связей в крахмале и образования различных накапливающихся продуктов конденсации,главным образом, изомальтозы, из D-глюкозы. Таким образом, выход глюкозы во многих традиционных способах не превышает 95% от теоретического выхода. Количество сиропов, производимых по всему миру этим способом, очень велико, и даже очень небольшое увеличение выхода глюкозы на тонну крахмала является коммерчески важным. Глюкоамилазу используют при пивоварении, главным образом, для производства пива с низким содержанием углеводов. В комбинации с другими амилазами (такими как из солода) глюкоамилаза обеспечивает очень значительный гидролиз крахмала на всем протяжении до глюкозных элементов. Глюкоза легко конвертируется в спирт дрожжами, что дает пивоварням возможность получать очень высокий выход спирта при ферментации и в то же время получать пиво, которое содержит очень низкое количество остаточных углеводов. Фермент разбавляют водой для желаемого % алкоголя, и конечное пиво выпускают на рынок как пиво с "низким содержанием углеводов". Хотя глюкоамилазы успешно используют в промышленных применениях многие годы, все еще остается потребность в новых глюкоамилазах с измененными свойствами, такими как увеличенная удельная активность, сниженное образование продуктов конденсации, таких как изомальтоза, и увеличенная термостабильность. Сущность изобретения В настоящем документе представлено применение вариантов глюкоамилазы для уменьшения синтеза продуктов конденсации в ходе гидролиза крахмала. Эти варианты глюкоамилазы содержат аминокислотные замены в каталитических доменах и/или связывающем крахмал домене. Варианты проявляют измененные свойства, такие как измененная удельная активность, уменьшенное образование продуктов конденсации, таких как изомальтоза, и/или измененная термостабильность. В одном аспекте в настоящем документе описано применение варианта глюкоамилазы со связывающим крахмал доменом и каталитическим доменом, причем указанный вариант содержит две или более аминокислотных замен в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или эквивалентной исходной глюкоамилазе в соединяющей петле 2' и/или в петле 1, и/или в спирали 2, и/или в петле 11, и/или в спирали 12 для уменьшения синтеза продуктов конденсации в процессе гидролиза крахмала. В следующем аспекте описано применение варианта глюкоамилазы, содержащего две или более аминокислотных замен относительно соединяющей петли 2' с аминокислотной последовательностью от положения 518 до положения 543 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или петли 1 с аминокислотной последовательностью от положения 21 до положения 51 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе,и/или спирали 2 с аминокислотной последовательностью от положения 52 до положения 68 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или петли 11 с аминокислотной последовательностью от положения 396 до положения 420 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или спирали 12 с аминокислотной последовательностью от положения 421 до положения 434 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, для уменьшения синтеза продуктов конденсации в процессе гидролиза крахмала. В следующем аспекте описано применение варианта глюкоамилазы, содержащего две или более аминокислотных замен относительно аминокислотной последовательности от положения 518 до положения 543 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе,и/или аминокислотной последовательности от положения 21 до положения 51 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или аминокислотной последовательности от положения 52 до положения 68 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или аминокислотной последовательности от положения 396 до положения 420 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или аминокислотной последовательности от положения 421 до положения 434 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, для уменьшения синтеза продуктов конденсации в процессе гидролиза крахмала. В следующем аспекте описано применение варианта глюкоамилазы, где указанные две или более аминокислотных замен относятся к соединяющей петле 2' с аминокислотной последовательностью от положения 518 до положения 543 SEQ ID NO: 2, и/или петле 1 с аминокислотной последовательностью от положения 21 до положения 51 SEQ ID NO: 2, и/или спирали 2 с аминокислотной последовательностью от положения 52 до положения 68 SEQ ID NO: 2, и/или петле 11 с аминокислотной последовательностью от положения 396 до положения 420 SEQ ID NO: 2, и/или спирали 12 с аминокислотной последовательностью от положения 421 до положения 434 SEQ ID NO: 2. В следующем аспекте предусматривается применение варианта глюкоамилазы, который в кристаллической форме имеет кристаллическую структуру, для которой атомные координаты атомов главной цепи имеют среднеквадратическое отклонение от атомных координат эквивалентных атомов главной цепи TrGA (как определено в табл. 20 в WO 2009/067218) менее 0,13 нм после выравнивания эквивалентных атомов главной цепи, и который имеет линкерную область, связывающий крахмал домен и каталитический домен, причем указанный вариант содержит две или более аминокислотных замен относительно аминокислотной последовательности исходной глюкоамилазы в соединяющей петле 2' связывающего крахмал домена и/или в петле 1, и/или в спирали 2, и/или в петле 11, и/или в спирали 12 каталитического домена для уменьшения синтеза продуктов конденсации в процессе гидролиза крахмала. В одном аспекте вариант глюкоамилазы содержит две или более аминокислотных замен, где аминокислотная замена находится в положении 539 и аминокислотная замена находится в положении 44,причем положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе, и его последовательность обладает по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с исходной глюкоамилазой, и где замена аминокислоты в положении 44 не является 44 С. Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему вариант глюкоамилазы, как описано в настоящем документе. Один аспект представляет собой плазмиду, содержащую нуклеиновую кислоту. Другой аспект представляет собой вектор, содержащий полинуклеотид, как описано, или способный экспрессировать вариант глюкоамилазы, как описано. Другой аспект представляет собой клетку-хозяин, содержащую плазмиду или вектор, например, трансформированную ими. Другой аспект представляет собой клетку-хозяин, которая имеет стабильно встроенную в хромосому последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант глюкоамилазы. Другой аспект представляет собой клетку, способную экспрессировать вариант глюкоамилазы, как описано. Другой аспект представляет собой способ экспрессии варианта глюкоамилазы, включающий получение клетки-хозяина или клетки и экспрессии варианта глюкоамилазы из клетки или клетки-хозяина, и необязательно очистку варианта глюкоамилазы. Следующий аспект изобретения представляет собой ферментную композицию, содержащую по меньшей мере один вариант глюкоамилазы, как описано в настоящем документе, и ее применение. Следующий аспект изобретения представляет собой способ конверсии крахмала или частично гидролизованного крахмала в сироп, содержащий глюкозу, включающий осахаривание жидкого раствора крахмала в присутствии по меньшей мере одного варианта глюкоамилазы или ферментной композиции,как описано в настоящем документе. Следующий аспект изобретения представляет собой применение варианта глюкоамилазы, как описано в настоящем документе, в способе конверсии крахмала, таком как способ непрерывной конверсии крахмала, в способе получения олигосахаридов, мальтодекстринов или патоки и в способе получения кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы. В следующем аспекте предусмотрено применение варианта глюкоамилазы, как описано в настоящем документе, в способе спиртовой ферментации. Следующий аспект изобретения представляет собой способ получения сусла для пивоварения,включающий формирование затора из крупки, и контактирование затора с вариантом глюкоамилазы, как описано, или с ферментной композицией, как описано. Другой аспект изобретения представляет собой способ производства пива, который включает: а) приготовление затора, b) фильтрацию затора с получением сусла и ферментацию сусла с получением пива, где вариант глюкоамилазы, как описано, добавляют на стадии (а), и/или стадии (b), и/или стадии (с). Следующий аспект изобретения представляет собой применение варианта глюкоамилазы, как описано, для усиления продукции ферментируемых сахаров либо на стадии затирания солода, либо на стадии ферментации процесса пивоварения. Следующий аспект изобретения представляет собой пиво, где пиво продуцируют с помощью стадий: а) приготовления затора, b) фильтрации затора с получением сусла, с) ферментации сусла с получением пива и d) пастеризации пива, где вариант глюкоамилазы, как описано, добавляют на стадии (а),и/или стадии (b), и/или стадии (с). Описание чертежей Прилагаемые чертежи включены в это описание и составляют его часть, иллюстрируя варианты осуществления. На фиг. 1 А представлена глюкоамилаза Trichoderma reesei (TrGA), имеющая 632 аминокислоты(SEQ ID NO: 1). Сигнальный пептид подчеркнут, каталитическая область (SEQ ID NO: 3), начинающаяся с аминокислотных остатков SVDDFI (SEQ ID NO: 12) и имеющая 453 аминокислотных остатка, выделена полужирным шрифтом; линкерная область выделена курсивом и связывающий крахмал домен (SBD) выделен как курсивом, так и подчеркиванием. Зрелый белок TrGA (SEQ ID NO: 2) включает каталитический домен (SEQ ID NO: 3), линкерную область (SEQ ID NO: 10) и связывающий крахмал домен (SEQ IDNO: 11). Что касается нумерации SBD молекулы глюкоамилазы TrGA, для настоящего изобретения может быть осуществлена отсылка на или а) положения 491-599 в SEQ ID NO: 2 зрелого TrGA, и/или b) положения 1-109 в SEQ ID NO: 11, что соответствует выделенной последовательности SBD зрелогоTrGA. Что касается нумерации каталитического домена молекулы TrGA, может быть осуществлена отсылка на SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3. На фиг. 1B представлена кДНК (SEQ ID NO: 4), которая кодирует TrGA. На фиг. 1 С представлены домены белка-предшественника и зрелого белка TrGA. На фиг. 2 представлено назначение плазмиды pDONR-TrGA, которая включает кДНК (SEQ ID NO: 4) TrGA. На фиг. 3 представлена плазмида pTTT-Dest. На фиг. 4 представлен конечный экспрессирующий вектор рТТТ-TrGA. На фиг. 5 А и 5 В представлено сравнение путем выравнивания каталитических доменов исходных глюкоамилаз из Aspergillus awamori (AaGA) (SEQ ID NO: 5); Aspergillus niger (AnGA) (SEQ ID NO: 6);(HgGA) (SEQ ID NO: 8) и Hypocrea vinosa (HvGA) (SEQ ID NO: 9). Идентичные аминокислоты указаны звездочкой . На фиг. 5 С представлвена зрелая белковая последовательность глюкоамилазы Talaromyces (TeGA) (SEQ ID NO: 384). На фиг. 5D и 5 Е представлено выравнивание, сравнивающее связывающий крахмал домен (SBD) исходных глюкоамилаз из Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 11); Humicola griseaID NO: 389) и Thielavia terrestris (TtGA) (SEQ ID NO: 390). На фиг. 6 представлено сравнение трехмерной структуры глюкоамилазы Trichoderma reesei (черный) (SEQ ID NO: 2) и глюкоамилазы Aspergillus awamori (серый) (SEQ ID NO: 5) , вид сбоку. Боковая определяется относительно активного центра и вход в активный центр находится "сверху" молекулы. На фиг. 7 представлено сравнение трехмерных структур глюкоамилазы Trichoderma reesei (черный)(SEQ ID NO: 2) и глюкоамилазы Aspergillus awamori (серый) (SEQ ID NO: 5), вид сверху. На фиг. 8 представлено выравнивание трехмерных структур TrGA (SEQ ID NO: 2) и AnGA (SEQ IDNO: 6), вид сбоку, демонстрирующий участки связывания 1 и 2. На фиг. 9 представлена модель связывания акарбозы с кристаллической структурой TrGA. На фиг. 10 представлена пластина TLC со стандартами, содержащими различные концентрации глюкозы, мальтозы и изомальтозы, и образцами, содержащими продукты реакции из глюкозы, инкубированной с TrGA и AnGA. Подробное описание изобретения Глюкоамилазы являются коммерчески важными ферментами в широком множестве применений,которые требуют гидролиза крахмала. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что путем внесения определенных изменений в положения в конкретных областях аминокислотной последовательности исходной глюкоамилазы скорость образования -(1-6)-связей снижается и/или уменьшается образование продуктов конденсации, таких как изомальтоза. Снижение скорости, с которой глюкоамилаза образует-(1-6)-связи относительно скорости, с которой она расщепляет -(1-4)-связи, имеет практическое значение. Авторы настоящего изобретения предоставили ряд вариантов исходной глюкоамилазы, и эти варианты в некоторых вариантах осуществления демонстрируют сниженную конденсацию и/или сниженное соотношение между активностью синтеза изомальтозы и активностью гидролиза крахмала (соотношениеIS/SH) по сравнению с исходной глюкоамилазой. В некоторых вариантах осуществления использование варианта глюкоамилазы, как описано в настоящем документе, в процессе осахаривания приводит к получению сиропа с высоким процентным содержанием глюкозы. В некоторых вариантах осуществления использование варианта глюкоамилазы, как описано в настоящем документе, приводит к усиленной продукции ферментируемых сахаров на стадии затирания солода и/или ферментации процесса пивоварения. В некоторых вариантах осуществления использование варианта глюкоамилазы, как описано в настоящем документе, приводит к увеличению истинной степени ферментации. Эти измененные свойства обеспечивают путем мутации, например замены, выбранных положений в исходной глюкоамилазе. Более подробно это описано ниже. Таким образом, в следующем аспекте описано применение варианта глюкоамилазы, содержащего две или более аминокислотных замен относительно соединяющей петли 2' с аминокислотной последовательностью от положения 518 до положения 543 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или петли 1 с аминокислотной последовательностью от положения 21 до положения 51 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или спирали 2 с аминокислотной последовательностью от положения 52 до положения 68 SEQID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или петли 11 с аминокислотной последовательностью от положения 396 до положения 420 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или спирали 12 с аминокислотной последовательностью от положения 421 до положения 434 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе для уменьшения синтеза продуктов конденсации в процессе гидролиза крахмала. В следующем аспекте описано применение варианта глюкоамилазы, содержащего две или более аминокислотных замен относительно аминокислотной последовательности от положения 518 до положения 543 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе,и/или аминокислотной последовательности от положения 21 до положения 51 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или аминокислотной последовательности от положения 52 до положения 68 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или аминокислотной последовательности от положения 396 до положения 420 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или аминокислотной последовательности от положения 421 до положения 434 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе для уменьшения синтеза продуктов конденсации в процессе гидролиза крахмала. Таким образом, в следующем аспекте описано применение варианта глюкоамилазы, который в кристаллической форме имеет кристаллическую структуру, для которой атомные координаты атомов главной цепи имеют среднеквадратическое отклонение от атомных координат эквивалентной главной цепиTrGA (как определено в табл. 20 в WO 2009/067218) менее 0,13 нм после выравнивания эквивалентных атомов главной цепи, и который имеет линкерную область, связывающий крахмал домен и каталитический домен, причем указанный вариант содержит две или более аминокислотных замен относительно аминокислотной последовательности исходной глюкоамилазы в соединяющей петле 2' связывающего крахмал домена, и/или в петле 1, и/или в спирали 2, и/или в петле 11, и/или в спирали 12 каталитического домена для уменьшения синтеза продуктов конденсации в процессе гидролиза крахмала. В следующем аспекте среднеквадратическое отклонение от атомных координат эквивалентных атомов главной цепиTrGA (как определено в табл. 20 в WO 2009/067218) составляет менее 0,12 нм, например менее 0,11 или менее 0,10. В одном аспекте в настоящем документе описано применение варианта глюкоамилазы со связывающим крахмалом доменом и каталитическим доменом, причем указанный вариант содержит две или более аминокислотных замен относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или эквивалентной исходной глюкоамилазы в соединяющей петле 2', и/или в петле 1, и/или в спирали 2, и/или в петле 11, и/или в спирали 12 для уменьшения синтеза продуктов конденсации в процессе гидролиза крахмала. В следующем аспекте описано применение варианта глюкоамилазы, где указанные две или более аминокислотных замен представляют собой замены относительно соединяющей петли 2' с аминокислотной последовательностью от положения 518 до положения 543 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или петли 1 с аминокислотной последовательностью от положения 21 до положения 51 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или спирали 2 с аминокислотной последовательностью от положения 52 до положения 68 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе,и/или петли 11 с аминокислотной последовательностью от положения 396 до положения 420 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе и/или спирали 12 с аминокислотной последовательностью от положения 421 до положения 434 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте описано применение варианта глюкоамилазы, где указанные две или более аминокислотные замены представляют собой замены относительно соединяющей петли 2' с аминокислотной последовательностью от положения 518 до положения 543 SEQ ID NO: 2, и/или петли 1 с аминокислотной последовательностью от положения 21 до положения 51 SEQ ID NO: 2, и/или спирали 2 с аминокислотной последовательностью от положения 52 до положения 68 SEQ ID NO: 2, и/или петли 11 с аминокислотной последовательностью от положения 396 до положения 420 SEQ ID NO: 2, и/или спирали 12 с аминокислотной последовательностью от положения 421 до положения 434 SEQ ID NO: 2. В следующем аспекте две или более аминокислотные замены представляют собой по меньшей мере одну, например, одну, две или три аминокислотные замены в соединяющей петле 2' и по меньшей мере одну, например, одну, две, три, четыре, пять или шесть аминокислотных замен в петле 1 и/или спирали 2 и/или петле 11 и/или спирали 12. В следующем аспекте две или более аминокислотные замены представляют собой одну, две, три или четыре аминокислотные замены в соединяющей петле 2' и одну, две, три или четыре аминокислотные замены в петле 1 и/или спирали 2 и/или петле 11 и/или спирали 12. В следующем аспекте имеются одна, две, три или четыре аминокислотные замены в соединяющей петле 2'. В следующем аспекте имеются одна, две, три или четыре аминокислотные замены в петле 1. В следующем аспекте имеются одна,две, три или четыре аминокислотные замены в спирали 2. В следующем аспекте имеются одна, две, три или четыре аминокислотные замены в петле 11. В следующем аспекте имеются одна, две, три или четыре аминокислотные замены в спирали 12. В следующем аспекте две или более аминокислотные замены представляют собой по меньшей мере одну аминокислотную замену в соединяющей петле 2' и по меньшей мере одну аминокислотную замену в петле 1. В следующем аспекте две или более аминокислотные замены представляют собой по меньшей мере одну аминокислотную замену в соединяющей петле 2' и по меньшей мере одну аминокислотную замену в спирали 2. В следующем аспекте две или более аминокислотные замены представляют собой по меньшей мере одну аминокислотную замену в соединяющей петле 2' и по меньшей мере одну аминокислотную замену в петле 11. В следующем аспекте две или более аминокислотные замены представляют собой по меньшей мере одну аминокислотную замену в соединяющей петле 2' и по меньшей мере одну аминокислотную замену в спирали 12. В следующем аспекте две или более аминокислотные замены представляют собой по меньшей мере одну аминокислотную замену в соединяющей петле 2' и по меньшей мере одну аминокислотную замену в петле 1 и по меньшей мере одну аминокислотную замену в спирали 2. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену в положении 520-543, 530-543 или 534-543 соединяющей петли 2', где положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентным положениям в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену в аминокислотной последовательности в положении 30-50, 35-48 или 40-46 петли 1, где положения соот-5 023194 ветствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентным положениям в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену в аминокислотной последовательности в положении 50-66, 55-64 или 58-63 спирали 2, где положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентным положениям в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену в аминокислотной последовательности в положении 405-420, 410-420 или 415-420 петли 11, где положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентным положениям в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену в аминокислотной последовательности в положении 421-434, 425-434 или 428-434 спирали 12, где положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентным положениям в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы обладает по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 98 или 99,5% идентичностью последовательности с исходной глюкоамилазой, такой как по меньшей мере 80,85, 90, 95, 98 или 99,5% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 или 9. В одном аспекте вариант глюкоамилазы обладает по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 98 или 99,5% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2. В следующем аспекте исходная глюкоамилаза или вариант глюкоамилазы имеет связывающий крахмал домен, который обладает по меньшей мере 96, 97, 98, 99 или 99,5% идентичностью последовательности со связывающим крахмал доменом SEQ ID NO: 1, 2, 11, 385, 386, 387, 388, 389 или 390. В следующем аспекте исходная глюкоамилаза или вариант глюкоамилазы имеет каталитический домен, который обладает по меньшей мере 80, 85, 90, 95 или 99,5% идентичностью последовательности с каталитическим доменом SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 или 9. В одном аспекте вариант глюкоамилазы имеет аминокислотную замену в положении 539 и одну или несколько аминокислотных замен в положении, выбранном из положений 44, 61, 417 и 431, где положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте вариант глюкоамилазы имеет аминокислотную замену в положении 539 и а) аминокислотную замену в положении 44 и/или b) аминокислотные замены как в положении 417, так и в положении 431, где положения соответствуют соответствующему положению в SEQID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте вариант глюкоамилазы имеет аминокислотную замену в положении 539 и аминокислотную замену в положении 44, где положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте вариант глюкоамилазы имеет аминокислотную замену в положении 539 и аминокислотные замены в положениях 417 и 431, где положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте вариант глюкоамилазы имеет аминокислотную замену в положении 539 и аминокислотные замены в положениях 44 и 61, где положения соответствуют соответствующему положению в SEQID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте вариант глюкоамилазы имеет аминокислотную замену в положении 43, где положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте вариант глюкоамилазы имеет аминокислотную замену в положении 61, где положение соответствует соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте аминокислотная замена в положении 539 представляет собой 539R, где положение соответствует соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте аминокислотная замена в положении 44 представляет собой 44R, где положение соответствует соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте аминокислотная замена в положении 417 представляет собой 417R/V, где положение соответствует соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте аминокислотная замена в положении 417 представляет собой 417R, где положение соответствует соответствующему положению в SEQID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте аминокислотная замена в положении 417 представляет собой 417V, где положение соответствует соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте аминокислотная замена в положении 431 представляет собой 431L, где положение соответствует соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте аминокислотная замена в положении 43 представляет собой 43R, где положение соответствует соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте аминокислотная замена в положении 61 представляет собой 611, где положение соответствует соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте продуктом конденсации является изомальтоза. В одном аспекте гидролиз крахмала происходит в процессе пивоварения. Например, при пивоварении образование изомальтозы является нежелательным, поскольку она не может конвертироваться в спирт в процессе ферментации. Пиво традиционно называют алкогольным продуктом, полученным из солода, такого как солод, полученный из ячменя и необязательно добавок, таких как хлебные злаки, и имеющим приданный ему привкус хмеля. Пиво можно изготавливать из различных зерен по существу тем же способом. Все зерновые крахмалы представляют собой гомополимеры глюкозы, в которых остатки глюкозы связаны либо -1,4-, либо-1,6-связями, причем -1,4-связи являются преобладающими. Процесс получения напитков из ферментированного солода обычно называют пивоварением. Основным сырьем, используемым при изготовлении этих напитков, является вода, хмель и солод. Кроме того, в качестве источника крахмала можно использовать добавки, такие как обычная кукурузная крупа,рафинированная кукурузная крупа, пивные измельченные дрожжи, рис, сорго, рафинированный кукурузный крахмал, ячмень, ячменный крахмал, очищенный от шелухи ячмень, пшеничный крахмал, обжаренные злаки, зерновые хлопья, рис, рожь, картофель, тапиока, и сиропы, такие как кукурузный сироп,сироп сахарного тростника, сироп инвертного сахара, ячменные и/или пшеничные сиропы, и т.п. Крахмал в конечном итоге конвертируется в декстрины и ферментируемые сахара. По ряду причин полагают, что солод, который получают, главным образом, из определенных сортов ячменя, вносит наибольший вклад в основные свойства и качество пива. Во-первых, солод является основной вкусовой добавкой в пиве. Во-вторых, солод обеспечивает часть ферментируемых сахаров. Втретьих, солод обеспечивает белки, которые вносят вклад в консистенцию пива и характер его пены. Вчетвертых, солод обеспечивает необходимую ферментативную активность в процессе затирания солода. Хмель также вносит значительный вклад в качество пива, включая придание вкуса. В частности,хмель (или компоненты хмеля) добавляют пиву желаемые придающие горечь вещества. Кроме того,хмель действует в качестве осадителя белков, образует консервирующие вещества и способствует образованию и стабилизации пены. Способ производства пива хорошо известен в данной области, но, в немногих словах, он вовлекает пять стадий: (а) затирание солода и/или разваривание добавок, (b) отделение и экстракция сусла, (с) кипячение и охмеление сусла, (d) охлаждение, ферментация и хранение и (е) созревание, обработка и упаковывание. Как правило, на первой стадии измельченный или раздробленный солод смешивают с водой и выдерживают в течение периода времени при контролируемых температурах, чтобы позволить ферментам, присутствующим в солоде, конвертировать крахмал, присутствующий в солоде, в ферментируемые сахара. На второй стадии затор переносят в "фильтрационный чан" или фильтр для отделения затора, где жидкость отделяют от зернового осадка. Эта сладкая жидкость называется "суслом", а оставшийся зерновой осадок называют "отработанным зерном". Затор, как правило, подвергают экстракции, которая вовлекает добавление к затору воды для отделения остаточного растворимого экстракта от отработанного зерна. На третьей стадии сусло подвергают интенсивному кипячению. Это обеспечивает стерилизацию сусла и способствует формированию цвета, вкуса и аромата и инактивирует ферменты. В процессе кипячения в некоторый момент времени добавляют хмель. На четвертой стадии сусло охлаждают и переносят в ферментер, который либо содержит дрожжи,либо в который дрожжи добавляют. Дрожжи конвертируют сахара путем ферментации в спирт и газообразный диоксид углерода; в конце ферментации ферментер охлаждают или ферментер можно охлаждать для остановки ферментации. Дрожжи выпадают в виде хлопьев и их удаляют. На последней стадии пиво охлаждают и хранят в течение периода времени, в ходе которого пиво становится прозрачным и приобретает его вкус, и любой материал, который может ухудшить внешний вид, вкус или срок хранения пива, выпадает в осадок. Перед упаковыванием пиво газируют и, необязательно, фильтруют и пастеризуют. После ферментации получают напиток, который обычно содержит от приблизительно 2 до приблизительно 10 мас.% спирта. Неферментируемые углеводы не конвертируются в ходе ферментации и образуют большую часть растворенных твердых веществ в конечном пиве. Этот осадок остается вследствие неспособности амилаз солода гидролизовать -1,6-связи крахмала. Неферментируемые углеводы обеспечивают приблизительно 50 калорий на 12 унций (0,34 кг) пива. Дальнейшая информация по традиционным способам пивоварения, а также определения терминов,используемых в области технологии пивоварения, применяемых для настоящего изобретения, могут быть найдены в "Technology Brewing and Malting", Wolfgang Kunze, the Research and Teaching Institute ofBrewing, Berlin (VLB), 2 пересмотренное издание 1999 г., ISBN 3-921690-39-0 или 3 издание (2004): ISBN 3-921690-49-8. Недавно произошла широкая популяризация производимых ферментацией напитков, называемых"легким пивом", "пивом со сниженным содержанием калорий" или "низкокалорийным пивом", в частно-7 023194 сти, на рынке США. Как определяют в США, это пиво имеет приблизительно на 30% меньше калорий,чем "нормальное" пиво от производителей. В настоящем документе термин "легкое пиво", "пиво со сниженным содержанием калорий" или"низкокалорийное пиво" относится к недавней широкой популяризации производимых ферментацией напитков, в частности, на рынке США. Как определяют в США, это пиво имеет приблизительно на 30% меньше калорий, чем "нормальное" пиво от производителей. Дальнейшая информация по традиционным способам пивоварения может быть найдена в "Technology Brewing and Malting", Wolfgang Kunze, the Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 3 полностью обновленное издание, 2004, ISBN 3921690-49-8. В настоящем документе описано применение варианта глюкоамилазы, где продукция ферментируемого сахара(ов) увеличена по сравнению с исходной глюкоамилазой, такой как TrGA. Кроме того, в настоящем документе описано применение варианта глюкоамилазы, где продукция сахара увеличивается на стадии затирания солода процесса пивоварения по сравнению с исходной глюкоамилазой, такой какTrGA. В настоящем документе описано применение варианта глюкоамилазы, где продукция ферментируемых сахаров увеличена на стадии ферментации процесса пивоварения по сравнению с исходной глюкоамилазой, такой как TrGA. В настоящем документе описано применение варианта глюкоамилазы, где ферментируемым сахаром является глюкоза. Глюкоамилаза, которая может продуцировать глюкозу со значимо сниженным количеством побочных продуктов, может представлять значительный коммерческий интерес, например, при производстве патоки или при пивоварении. Кроме того, в настоящем документе описано применение варианта глюкоамилазы, как описано в настоящем документе, где гидролиз крахмала происходит в процессе получения патоки. В одном аспекте глюкоамилаза проявляет сниженное соотношение между активностью синтеза изомальтозы (IS) и активностью гидролиза крахмала (SH) по сравнению с исходной глюкоамилазой,такой как TrGA. В одном аспекте глюкоамилаза проявляет сниженную активность гидролиза, которая не более чем на 5, не более чем на 10 или не более чем на 15% снижена по сравнению с исходной глюкоамилазой, такой как TrGA. В одном аспекте глюкоамилаза проявляет увеличенную истинную степень ферментации по сравнению с исходной глюкоамилазой, такой как TrGA. В одном аспекте глюкоамилаза образует более низкое количество продуктов конденсации, чем количество продуктов конденсации, образуемое глюкоамилазой Aspergillus niger (AnGA) (SEQ ID NO: 6) в сравнимых условиях. В одном аспекте глюкоамилаза образует количество продуктов конденсации, которое, по существу, является таким же,не более чем на 5% превышающим, не более чем на 8% превышающим или не более чем на 10% превышающим количество продуктов конденсации, образуемых Aspergillus niger (AnGA) (SEQ ID NO: 6) в сравнимых условиях. В одном аспекте дозирование глюкоамилаз является одинаковым в расчете на концентрацию белка. В одном аспекте дозирование глюкоамилаз является одинаковым в расчете на показатель активности в анализах активности. Варианты глюкоамилазы, описанные в настоящем документе, содержат аминокислотные замены в каталитическом домене и/или связывающем крахмал домене. Варианты могут проявлять измененные свойства, такие как повышенная термостабильность, измененное образование продуктов конденсации,таких как изомальтоза, и/или увеличенная истинная степень ферментации и/или сниженное соотношение между активностью синтеза изомальтозы (IS) и активностью гидролиза крахмала (SH) и/или сниженная удельная активность. Варианты со сниженным образованием продуктов конденсации, таких как изомальтоза, могут существенно повысить возможность получать желаемые продукты, например, в пивоваренной промышленности. 1. Определения и сокращения 1.1. Определения Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, обладают тем же значением, которое обычно подразумевают специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. В Singleton et al., Dictionary Of Microbiology And Molecular Biology,2nd ed., John Wiley and Sons, New York (1994), и HaleMarkham, The Harper Collins Dictionary Of Biology, Harper Perennial, N.Y. (1991) предоставлены для специалиста в данной области общие значения многих из использованных в настоящем документе терминов. Термины определены ниже для ясности и простоты отсылки. В настоящем документе термин "глюкоамилаза (ЕС 3.2.1.3)" относится к ферменту, который катализирует высвобождение D-глюкозы с невосстанавливающих концов крахмала и родственных олиго- и полисахаридов. Термины "исходный" или "исходная последовательность" относятся к последовательности, которая является нативной или встречающейся в природе в клетке-хозяине. Исходные глюкоамилазы включают,но не ограничиваются ими, последовательности глюкоамилазы, указанные в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 и 9, и глюкоамилазы по меньшей мере с 80% идентичностью аминокислотной последовательности с SEQID NO: 2. В настоящем документе "эквивалентное положение" означает положение, которое является общим для двух исходных последовательностей, на основе выравнивания аминокислотной последовательности представляющей интерес исходной глюкоамилазы, а также выравнивания трехмерной структуры представляющей интерес исходной глюкоамилазы, с аминокислотной последовательностью и трехмерной структурой эталонной глюкоамилазы TrGA (SEQ ID NO: 2). Таким образом, для определения эквивалентности можно использовать либо выравнивание последовательностей, либо структурное выравнивание. Термин "TrGA" относится к последовательности исходной глюкоамилазы Trichoderma reesei, имеющей зрелую белковую последовательность, проиллюстрированную в SEQ ID NO: 2, которая включает каталитический домен, имеющий последовательность, проиллюстрированную в SEQ ID NO: 3. Выделение, клонирование и экспрессия TrGA описаны в WO 2006/060062 и патенте США 7413887, оба из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок. В некоторых вариантах осуществления исходная последовательность относится к последовательности глюкоамилазы, которая является начальной точкой для белковой инженерии. Нумерация аминокислот глюкоамилазы в настоящем документе основана на выравнивании последовательности глюкоамилазы с TrGA (SEQ ID NO: 2 и/или 3). Выражение "зрелая форма белка или полипептида" относится к конечной функциональной форме белка или полипептида. Зрелая форма глюкоамилазаы может быть лишена, например, сигнального пептида. Для иллюстрации, зрелая форма TrGA включает каталитический домен, линкерную область и связывающий крахмал домен, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В настоящем документе термины "вариант глюкоамилазы" и "вариант" используют применительно к глюкоамилазам, которые обладают некоторой степенью идентичности аминокислотной последовательности с последовательностью исходной глюкоамилазы. Варианты являются сходными с исходной последовательностью, но имеют по меньшей мере одну замену, делецию или вставку в их аминокислотной последовательности, которая делает их последовательность отличающейся от исходной глюкоамилазы. В некоторых случаях выполняют манипулирование и/или инженерию вариантов для включения по меньшей мере одной замены, делеции или вставки в их аминокислотную последовательность, которая делает их последовательность отличающейся от исходной. Кроме того, вариант глюкоамилазы может сохранять функциональные характеристики исходной глюкоамилазы, например, сохраняя активность глюкоамилазы, которая по меньшей мере приблизительно на 50, приблизительно на 60, приблизительно на 70, приблизительно на 80 или приблизительно на 90% соответствует активности исходной глюкоамилазы. Также он может иметь активность, превышающую 100%, если это выбирают."Варианты" могут обладать по меньшей мере приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 88, приблизительно 90, приблизительно 91, приблизительно 92, приблизительно 93, приблизительно 94, приблизительно 95, приблизительно 96, приблизительно 97, приблизительно 98, приблизительно 99 или приблизительно 99,5% идентичностью последовательности с последовательностью исходного полипептида при оптимальном выравнивании для сравнения. В некоторых вариантах осуществления вариант глюкоамилазы может обладать по меньшей мере приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65,приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 88,приблизительно 90, приблизительно 91, приблизительно 92, приблизительно 93, приблизительно 94,приблизительно 95, приблизительно 96, приблизительно 97, приблизительно 98, приблизительно 99 или приблизительно 99,5% идентичностью последовательности с каталитическим доменом исходной глюкоамилазы. В некоторых вариантах осуществления вариант глюкоамилазы может обладать по меньшей мере приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65,приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 88,приблизительно 90, приблизительно 91, приблизительно 92, приблизительно 93, приблизительно 94,приблизительно 95, приблизительно 96, приблизительно 97, приблизительно 98, приблизительно 99 или приблизительно 99,5% идентичностью последовательности со связывающим крахмал доменом исходной глюкоамилазы. Идентичность последовательности можно измерять на протяжении всей длины исходной последовательности или последовательности варианта. Идентичность последовательностей определяют с использованием стандартных способов, известных в данной области (см., например, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and"Процентную идентичность (%) нуклеиновых кислот" или "процентную идентичность (%) аминокислотных последовательностей" определяют как процент нуклеотидных остатков или аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны нуклеотидным остаткам или аминокислотным остаткам в исходной последовательности (например, SEQ ID NO: 2). Идентичность последовательности можно измерять на протяжении всей длины исходной последовательности. В настоящем документе "идентичность последовательностей" определяют способом выравнивания последовательностей. Для целей настоящего изобретения способ выравнивания представляет собойNatl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993. Особенно пригодной программой BLAST является программаWU-BLAST-2 (см. Altschul et al., Meth. Enzymol. 266: 460-480 (1996. В WU-BLAST-2 используется несколько параметров поиска, большинство из которых установлены как величины по умолчанию. Корректируемые параметры установлены на следующие значения: отрезок перекрывания = 1, доля перекрывания = 0,125, порог для слова (Т) = 11. Параметры HSP S и HSP S2 представляют собой динамические величины, и они устанавливаются самой программой в зависимости от состава конкретной последовательности и состава конкретный базы данных, против которой проводят поиск представляющей интерес последовательности. Однако величины можно корректировать для увеличения чувствительности. Величину% идентичности аминокислотных последовательностей определяют по количеству совпавших идентичных остатков, деленному на общее количество остатков в "более длинной" последовательности в выравниваемой области. "Более длинная" последовательность представляет собой последовательность, имеющую наибольшее количество истинных остатков в выравниваемой области (пропуски, вносимые WUBlast-2 для максимизации показателя выравнивания, игнорируются). Термин "оптимальное выравнивание" относится к выравниванию, дающему наибольший показатель процентной идентичности. В настоящем документе термин "каталитический домен" относится к структурной области полипептида, которая содержит активный центр для гидролиза субстрата. Термин "линкер" относится к короткой аминокислотной последовательности, как правило, имеющей от 3 до 40 аминокислотных остатков, которые ковалентно связывают аминокислотную последовательность, содержащую связывающий крахмал домен, с аминокислотной последовательностью, содержащей каталитический домен. Термин "связывающий крахмал домен" относится к аминокислотной последовательности, которая предпочтительно связывается с крахмальным субстратом. В настоящем документе термины "мутантная последовательность" и "мутантный ген" используют взаимозаменяемо, и они относятся к полинуклеотидной последовательности, которая имеет изменение по меньшей мере в одном кодоне, встречающемся в исходной последовательности в клетке-хозяине. Продукт экспрессии мутантной последовательности представляет собой вариантный белок с измененной аминокислотной последовательностью относительно исходной. Продукт экспрессии может иметь измененную функциональную способность (например, усиленную ферментативную активность). Термин "свойство" или его грамматические эквиваленты в контексте полипептида, как используют в настоящем документе, относится к любой характеристике или признаку полипептида, которые можно выбирать или подвергать детекции. Эти свойства включают, но не ограничиваются ими, окислительную стабильность, субстратную специфичность, каталитическую активность, термическую стабильность,профиль активности рН, устойчивость к протеолитической деградации, KM, KCAT, отношение KCAT/KM,сворачивание белка, способность связывать субстрат и способность к секреции. Термин "свойство" или его грамматические эквиваленты в контексте нуклеиновой кислоты, как используют в настоящем документе, относится к любой характеристике или признаку нуклеиновой кислоты, которые можно выбирать или подвергать детекции. Эти свойства включают, но не ограничиваются ими, свойство влияния на транскрипцию гена (например, сила промотора или распознавание промотора),свойство влияния на процессинг РНК (например, сплайсинг РНК и стабильность РНК), свойство влияния на трансляцию (например, регуляция связывания мРНК с рибосомными белками). Термины "термически стабильный" и "термостабильный" относятся к вариантам глюкоамилазы по настоящему изобретению, которые сохраняют определенный уровень ферментативной активности после воздействия температуры в течение данного периода времени в условиях, преобладающих в ходе гидролиза крахмальных субстратов, например, при воздействии измененных температур. Термин "повышенная стабильность" в контексте свойства, такого как термостабильность, относится к более высокой сохраненной активности гидролиза крахмала с течением времени по сравнению с другой эталонной (т.е. исходной) глюкоамилазой. Термин "сниженная стабильность" в контексте свойства, такого как термостабильность, относится к более низкой сохраненной активности гидролиза крахмала с течением времени по сравнению с другой эталонной глюкоамилазой. Термин "удельная активность" определяют как активность на 1 мг белка глюкоамилазы. В некоторых вариантах осуществления активность глюкоамилазы определяют в анализе этанола, описанном в настоящем документе, и выражают как количество глюкозы, которое продуцируется из крахмального субстрата. В некоторых вариантах осуществления концентрацию белка можно определять с использованием анализа Caliper, описанного в настоящем документе. Термины "активный" и "биологически активный" относятся к биологической активности, ассоциированной с конкретным белком. Отсюда следует, что биологическая активность данного белка относится к любой биологической активности, обычно приписываемой белку специалистами в данной области. Например, ферментативная активность, ассоциированная с глюкоамилазой, является гидролитической, и, таким образом, активная глюкоамилаза обладает гидролитической активностью. Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота", используемые в настоящем документе взаимо- 10023194 заменяемо, относятся к полимерной форме нуклеотидов как рибонуклеотидов, так и дезоксирибонуклеотидов любой длины. Эти термины включают, но не ограничиваются ими, одноцепочечную, двухцепочечную или трехцепоченую ДНК, геномную ДНК, кДНК, РНК, гибрид ДНК-РНК или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически модифицированные,биохимически модифицированные, неприродные или производные нуклеотидные основания. В настоящем документе термины "конструкция ДНК", "трансформация ДНК" и "экспрессирующий вектор" используют взаимозаменяемо для обозначения ДНК, используемой для введения последовательности в клетку-хозяин или организм. ДНК можно получить способом ПЦР in vitro или любым другим пригодным способом(ами), известным специалистам в данной области. Конструкцию ДНК, трансформирующую ДНК или рекомбинантную экспрессирующую кассету можно включать в плазмиду, хромосому,митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Как правило,часть рекомбинантной экспрессирующей кассеты в экспрессирующем векторе, конструкции ДНК или трансформирующей ДНК включает, среди других последовательностей, последовательность нуклеиновой кислоты, подлежащую транскрипции, и промотор. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующие векторы способны включать гетерологичные фрагменты ДНК и экспрессировать их в клеткехозяине. В настоящем документе термин "вектор" относится к полинуклеотидной конструкции, предназначенной для введения нуклеиновых кислот в один или несколько типов клеток. Векторы включают клонирующие векторы, экспрессирующие векторы, челночные векторы, плазмиды, кассеты и т.п. В настоящем документе в контексте внесения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку термин "введенный" относится к любому способу, пригодному для переноса последовательности нуклеиновой кислоты в клетку. Такие способы введения включают, но не ограничиваются ими, слияние протопластов, трансфекцию, трансформацию, конъюгацию и трансдукцию. В настоящем документе термины "трансформированный" и "стабильно трансформированный" относится к клетке, которая имеет ненативную (гетерологичную) полинуклеотидную последовательность,встроенную в ее геном или присутствующую в качестве эписомальной плазмиды, которая поддерживается в течение по меньшей мере двух поколений. В настоящем документе термины "селектируемый маркер" и "селективный маркер" относятся к нуклеиновой кислоте (например, гену), способной экспрессироваться в клетке-хозяине, которая обеспечивает простоту селекции хозяев, содержащих вектор. Как правило, селективные маркеры представляют собой гены, которые придают противомикробную устойчивость или метаболическое преимущество клетке-хозяину, позволяя отличить клетки, содержащие экзогенную ДНК, от клеток, в которые не была введена какая-либо экзогенная последовательность в процессе трансформации. В настоящем документе термин "промотор" относится к последовательности нуклеиновой кислоты,которая функционирует, направляя транскрипцию расположенного ниже гена. Промотор, вместе с другими транскрипционными и трансляционными регуляторными последовательностями нуклеиновых кислот (также называемыми "последовательностями контроля") необходим для экспрессии данного гена. Как правило, транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности включают, но не ограничиваются ими, промоторные последовательности, участки связывания рибосом, последовательности инициации и терминации транскрипции, последовательности инициации и терминации трансляции и последовательности энхансеров или активаторов. Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК, кодирующая секреторную лидерную последовательность (т.е. сигнальный пептид), функционально связана с ДНК полипептида,если она экспрессируется в качестве пребелка, который участвует в секреции полипептида. Как правило,"функционально связанный" означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными и в случае секреторной лидерной последовательности являются смежными и находятся в рамке считывания. В настоящем документе термин "ген" относится к полинуклеотиду (например, сегменту ДНК), который кодирует полипептид и включает участки, предшествующие кодирующим областям и следующие после них, а также к встроенным в них последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами). В настоящем документе термины "ортолог" и "ортологичные гены" относятся к генам в различных видах, которые эволюционировали из общего предкового гена (т.е. гомологичного гена) вследствие видообразования. Как правило, ортологи сохраняют ту же функцию в процессе эволюции. Идентификация ортолога применима для достоверного предсказания функции гена или вновь отсеквенированных геномов. В настоящем документе термины "паралог" и "паралогичные гены" относятся к генам, которые являются родственными вследствие дупликации в геноме. В то время как ортологи сохраняют ту же функцию в процессе эволюции, у паралогов развиваются новые функции, даже несмотря на то, что некоторые функции часто являются сходными с исходными функциями. Примеры паралогичных генов включают,но не ограничиваются ими, гены, кодирующие трипсин, химотрипсин, эластазу и тромбин, все представляют собой сериновые протеазы и встречаются в одних и тех же видах. В настоящем документе термин "гибридизация" относится к процессу, посредством которого цепь нуклеиновой кислоты связывается с комплементарной цепью путем спаривания оснований, как известно в данной области. Последовательность нуклеиновой кислоты считают "селективно гибридизующейся" с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты, если две последовательности специфично гибридизуются друг с другом в условиях гибридизации и промывания от умеренной до высокой жесткости. Условия гибридизации основаны на температуре отжига (Tm) связывающего нуклеиновую кислоту комплекса или зонда. Например, "максимальная жесткость", как правило, имеет место при приблизительно Tm-5 С (на 5 ниже Tm зонда); "высокая жесткость" при приблизительно 5-10 С ниже Tm; "промежуточная жесткость" при приблизительно 10-20 С ниже Tm зонда; и "низкая жесткость при приблизительно" 20-25 С ниже Tm. Функционально условия максимальной жесткости можно использовать для идентификации последовательностей, имеющих строгую идентичность или практически строгую идентичность с зондом для гибридизации; в то время как гибридизацию промежуточной или низкой жесткости можно использовать для идентификации или детекции гомологов полинуклеотидной последовательности. Условия гибридизации умеренной и высокой жесткости хорошо известны в данной области. Пример условий высокой жесткости включает гибридизацию при приблизительно 42 С в 50% формамиде, 5SSC, 5 растворе Денхардта, 0,5% SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК-носителя, с последующим промыванием два раза в 2 SSC и 0,5% SDS при комнатной температуре и два дополнительных раза в 0,1 SSC и 0,5% SDS при 42 С. Пример условий умеренной жесткости включает инкубацию в течение ночи при 37 С в растворе, содержащем 20% формамид, 5 SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ трицитрат натрия),50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5 раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мг/мл денатурированной расщепленной ДНК спермы лосося, с последующим промыванием фильтров в 1 SSC при приблизительно 37-50 С. Специалистам в данной области известно, как корректировать температуру, ионную силу и т.д., при необходимости, для учета таких факторов, как длина зонда и т.п. В настоящем документе "рекомбинантный" включает указание на клетку или вектор, которые были модифицированы путем введения гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, или на то,что клетка происходит из клетки, модифицированной таким образом. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не встречаются в идентичной форме в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, или экспрессируют нативные гены, которые в ином случае аномально экспрессируются, экспрессируются на сниженном уровне или вообще не экспрессируются в результате преднамеренного вмешательства человека. В одном варианте осуществления создают мутантные последовательности ДНК с помощью мутагенеза с насыщением участка по меньшей мере в одном кодоне. В другом варианте осуществления мутагенез с насыщением участка проводят для двух или более кодонов. В следующем варианте осуществления мутантные последовательности ДНК имеют более чем 50, более чем 55, более чем 60, более чем 65, более чем 70, более чем 75, более чем 80, более чем 85, более чем 90, более чем 95 или более чем 98% гомологию с исходной последовательностью. В альтернативных вариантах осуществления мутантную ДНК создают in vivo с использованием любого известного способа мутагенеза, например, такого как облучение, применение нитрозогуанидина и т.п. Затем требуемую последовательность ДНК выделяют и используют в способах, представленных в настоящем документе. В настоящем документе термин "гетерологичный белок" относится к белку или полипептиду, который не является встречающимся в природе в клетке-хозяине. Фермент "сверхэкспрессируется" в клетке-хозяине, если фермент экспрессируется в клетке на более высоком уровне, чем уровень, на котором он экспрессируется в соответствующей клетке дикого типа. Термины "белок" и "полипептид" используют в настоящем документе взаимозаменяемо. В настоящем описании и формуле изобретения используют традиционные однобуквенный и трехбуквенный коды для аминокислотных остатков. 3-Буквенный код для аминокислот определяют в соответствии с IUPAC-IUBJoint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). Также понятно, что полипептид может кодировать более чем одну нуклеотидную последовательность вследствие вырожденности генетического кода. Варианты осуществления изобретения описаны с помощью следующей номенклатуры: [исходный аминокислотный остаток/положение/замещающий аминокислотный остаток]. Например, замену лейцином аргинина в положении 76 представляют как R76L. Когда в данном положении более одной аминокислоты является замещающей, замену представляют как 1) Q172C, Q172D или Q172R; 2) Q172C, D илиR или 3) Q172C/D/R. Когда положение, подходящее для замены, идентифицировано в настоящем документе без конкретной предложенной аминокислоты, следует понимать, что любой аминокислотный остаток может заменять аминокислотный остаток, присутствующий в этом положении. Когда вариантная глюкоамилаза содержит делецию по сравнению с другими глюкоамилазами, делецию обозначают с помощью . Например, делецию в положении R76 обозначают как R76. Делецию двух или более последовательных аминокислот обозначают, например, как (76-78)."Пропоследовательность" представляет собой аминокислотную последовательность между сигнальной последовательностью и зрелым белком, которая необходима для секреции белка. Отщепление пропоследовательности приводит к зрелому активному белку. Термин "сигнальная последовательность" или "сигнальный пептид" относится к любой последовательности нуклеотидов и/или аминокислот, которая может участвовать в секреции зрелой формы или формы предшественника белка. Это определение сигнальной последовательности является функциональным, что означает, что она включает все аминокислотные последовательности, кодируемые Nконцевой частью гена белка, которые участвуют в осуществлении секреции белка. Они часто, но не всегда, связываются с N-концевой частью белка или с N-концевой частью предшественника белка. Сигнальная последовательность может быть эндогенной или экзогенной. Сигнальная последовательность может представлять собой последовательность, в норме ассоциированную с белком (например, глюкоамилазой), или она может быть из гена, кодирующего другой секретируемый белок. Термин форма "предшественника" белка или пептида относится к зрелой форме белка, имеющей пропоследовательность, функционально связанную с N- или С-концом белка. Предшественник также может иметь "сигнальную" последовательность, функционально связанную с N-концом пропоследовательности. Предшественник также может иметь дополнительные полинуклеотиды, которые вовлечены в посттрансляционную активность (например, полинуклеотиды, отщепляемые от него, чтобы осталась зрелая форма белка или пептида)."Штамм-хозяин" или "клетка-хозяин" относится к пригодному хозяину для экспрессирующего вектора, содержащего ДНК по настоящему изобретению. Термины "происходящий из" и "полученный из" относятся не только к глюкоамилазе, продуцированной или продуцируемой рассматриваемым штаммом организма, но также к глюкоамилазе, кодируемой последовательностью ДНК, выделенной из такого штамма и продуцированной в организме хозяина,содержащем такую последовательность ДНК. Кроме того, термин относится к глюкоамилазе, которая кодируется последовательностью ДНК синтетического происхождения и/или из кДНК и которая имеет отличительные признаки рассматриваемой глюкоамилазы."Производное" в объеме этого определения, как правило, сохраняет характерную протеолитическую активность, наблюдаемую в форме дикого типа, нативной или исходной форме, до той степени, что производное является пригодным для целей, сходных с формой дикого типа, нативной или исходной формой. Функциональные производные глюкоамилаз охватывают встречающиеся в природе, синтетически или рекомбинантно продуцируемые пептиды или пептидные фрагменты, которые обладают основными характеристиками глюкоамилаз по настоящему изобретению. Термин "выделенный" относится к материалу, который извлечен из его природного окружения, если он является встречающимся в природе. "Очищенный" белок относится к белку, который является, по меньшей мере частично, очищенным до однородности. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок является более чем приблизительно на 10% чистым, приблизительно на 20% чистым или приблизительно на 30% чистым при определении посредством SDS-PAGE. Дополнительные аспекты изобретения охватывают белок в высокоочищенной форме (т.е. более чем на приблизительно 40% чистый,приблизительно на 60% чистый, приблизительно на 80% чистый, приблизительно на 90% чистый, приблизительно на 95% чистый, приблизительно на 97% чистый или приблизительно на 99% чистый) при определении посредством SDS-PAGE. В настоящем документе термин "комбинаторный мутагенез" относится к способам, в которых создают библиотеки вариантов исходной последовательности. В этих библиотеках варианты содержат одну или несколько мутаций, выбранных из заданного набора мутаций. Кроме того, способы обеспечивают способы внесения случайных мутаций, которые не являются членами заданного набора мутаций. В некоторых вариантах осуществления способы включают способы, указанные в патенте США 6582914,включенном в настоящий документ в качестве ссылки. В альтернативных вариантах осуществления способы комбинаторного мутагенеза включают коммерчески доступные наборы (например, QuikChangeMultisite, Stratagene, San Diego, CA). В настоящем документе термин "библиотека мутантов" относится к популяции клеток, которые идентичны в большей части их генома, но включают различные гомологи одного или нескольких генов. Такие библиотеки можно использовать, например, для идентификации генов или оперонов с улучшенными свойствами. В настоящем документе термин "содержание твердых веществ (DS или ds)" относится к общему содержанию твердых веществ во взвеси в % в расчете на сухую массу. В настоящем документе термин "первоначальный положительный результат" относится к варианту,который идентифицирован скринингом комбинаторной библиотеки мутагенеза консенсусной последовательности. В некоторых вариантах осуществления первоначальные совпадения имеют улучшенные рабочие характеристики по сравнению с исходным геном. В настоящем документе термин "улучшенный положительный результат" относится к варианту, который идентифицирован скринингом усиленной комбинаторной библиотеки мутагенеза консенсусной последовательности. В настоящем документе термин "заданное свойство" относится к свойству исходного гена, подлежащему изменению. Не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо кон- 13023194 кретным заданным свойством. Однако в некоторых вариантах осуществления заданное свойство представляет собой стабильность продукта гена (например, устойчивость к денатурации, протеолизу или другим деградирующим факторам), в то время как в других вариантах осуществления изменяется уровень продукции в продуцирующем хозяине. Действительно, предусматривается, что любое свойство исходного гена будет применимо для настоящего изобретения. Другие определения терминов могут быть представлены на протяжении описания. В настоящем документе "процесс производства пива" может далее применяться для затирания солода любой крупы. В настоящем документе термин "крупа" относится к любому крахмалу и/или содержащему сахар растительному материалу, происходящему из любого растения или части растения, включая клубни (например, картофель), корни (например, корни маниоки [Manihot esculenta]), стебли, листья и семена. Крупа может содержать зерно, такое как зерно ячменя, пшеницы, ржи, овса, кукурузы/маиса, риса, проса,пшена и сорго, и, например, по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 25, или по меньшей мере 35, например по меньшей мере 50, по меньшей мере 75, по меньшей мере 90 или даже 100% (мас./мас.) крупы для сусла происходит из зерна. В некоторых вариантах осуществления крупа может содержать крахмал и/или содержащий сахар материал, происходящий из корней маниоки [Manihotesculenta]. Крупа может содержать осоложенное зерно, такое как ячменный солод. Часто по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 25, или по меньшей мере 35, как, например, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75, по меньшей мере 90 или даже 100% (мас./мас.) крупы для сусла происходит из осоложенного зерна. Крупа может содержать добавку, например, вплоть до 10%, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 25, или по меньшей мере 35, или по меньшей мере 50, по меньшей мере 75, по меньшей мере 90 или даже 100% (мас./мас.) крупы для сусла представляет собой добавку. Термин "добавка" понимают как часть крупы, которая не является ячменным солодом. Добавка может представлять собой любой богатый углеводами материал. Термин "добавка" включает крахмал и/или содержащий сахар растительный материал, как, например, определено выше для термина "крупа". Термин "ферментация" означает, в контексте пивоварения, превращение сахаров в сусле с помощью ферментов пивных дрожжей в этанол и диоксид углерода с образованием других побочных продуктов ферментации. В настоящем документе термин "солод" понимают как любое осоложенное продовольственное зерно, такое как ячмень. В настоящем документе термин "солодовый напиток" включает такие пенообразующие ферментированные солодовые напитки, как полностью осоложенное пиво, эль, сухое пиво, безалкогольное пиво,легкое пиво, пиво с низким содержанием алкоголя, низкокалорийное пиво, портер, темное пиво, крепкое пиво, черное пиво, безалкогольное черное пиво и т.п. Термин "солодовые напитки" также включает не пенообразующее пиво и альтернативные солодовые напитки, такие как солодовые напитки с фруктовым вкусом, например солодовые напитки с цитрусовым вкусом, такие как солодовые напитки со вкусом лимона, апельсина, лайма или ягод, солодовые напитки со вкусом спиртных напитков, например солодовые напитки со вкусом водки, рома или текилы, или солодовые напитки со вкусом кофе, такие как солодовый раствор со вкусом кофеина и т.п. Термин "затор" понимают как водную крахмальную взвесь, содержащую, например, измельченный ячменный солод, измельченный ячмень и/или другую добавку или их комбинации, смешанные с водой,чтобы позднее быть разделенными на сусло + отработанное зерно. В настоящем документе термин "сусло" относится к неферментированному жидкому продукту после экстракции крупы в процессе затирания солода. В настоящем документе термин "отработанное зерно" относится к осушенным твердым веществам,оставшимся после экстракции крупы и отделения сусла из затора. В термин "пиво" включается любое ферментированное сусло, получаемое путем варения и ферментации содержащего крахмал материала, главным образом, полученного из продовольственного зерна,такого как осоложенный ячмень. Также можно использовать пшеницу, маис и рис. В настоящем документе термин "выход экстракта" в сусле определяют как сумму растворимых веществ, экстрагированных из крупы (солод и добавки), выраженный в процентах от сухого вещества. В настоящем документе термин "пастеризация" означает уничтожение микроорганизмов в водном растворе путем нагревания. Включение пастеризации в процесс пивоварения обычно проводят с использованием пастеризатора в потоке или туннельного пастеризатора. В настоящем документе термин "единицы пастеризации" или PU" относится к количественной мере пастеризации. Одну единицу пастеризации (1 PU) для пива определяют как удержание тепла в течение 1 мин при 60 С. Ее вычисляют какPU=t1,393 (Т-60),где t - время в минутах при температуре пастеризации в пастеризаторе; Т - температура в градусах Цельсия в пастеризаторе;[ (Т-60) представляет собой показатель степени (Т-60)]. Можно использовать различные минимальные PU в зависимости от типа пива, сырья и микробной контаминации, пивовара и ощущаемого эффекта на вкус пива. Как правило, для пастеризации пива требуется 14-15 PU. В зависимости от оборудования для пастеризации температуры пастеризации, как правило, находятся в диапазоне 64-72 С при времени пастеризации, вычисленном соответствующим образом. Дальнейшая информация может быть найдена в "Technology Brewing and Malting", Wolfgang Kunzeof the Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 3 полностью обновленное издание, 2004,ISBN 3-921690-49-8. В настоящем документе термин "безалкогольное пиво" или "пиво с низким содержанием алкоголя" относится к пиву, содержащему максимум от 0,1 до 3,5% или от 0,1 до 2,5%, например от 0,1 до 0,5% алкоголя по объему. Безалкоголльное пиво варят традиционными способами, однако в ходе конечных стадий процесса пивоварения алкоголь удаляют вакуумным выпариванием, пользуясь различием температур кипения воды и спирта. В настоящем документе термин "низкокалорийное пиво" или "пиво с низким содержанием углеводов" определяют как пиво с содержанием углеводов 1,5 г/100 г или менее и с истинной степенью ферментации по меньшей мере 80%. Когда предоставлен диапазон величин, понятно, что также конкретно описана каждая величина внутри диапазона до одной десятой единицы нижнего предела, если контекст явно не указывает на иное,между верхним и нижним пределами этого диапазона. Каждый меньший диапазон между любой указанной величиной или входящей в указанный диапазон величиной и любой другой указанной или входящей в указанный в диапазон величиной охватывается изобретением. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены или исключены из диапазона, и каждый диапазон, где любой, ни один или оба из пределов включены в меньшие диапазоны, также охватывается изобретением,учитывая какой-либо конкретно исключенный предел в указанном диапазоне. Когда указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любой или оба из этих включенных пределов,также включены в настоящее изобретение. Перед более подробным описанием иллюстративных вариантов осуществления следует понимать,что это изобретение не ограничивается конкретными описанными вариантами осуществления, поскольку они, безусловно, могут варьировать. Хотя для осуществления на практике или тестирования настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем документе, иллюстративные способы и материалы описаны далее. В настоящем документе и в прилагаемой формуле изобретения форма единственного числа включает множественное число указываемых объектов, если контекст явно не указывает на иное. Таким образом, например, указание на "ген" включает множество таких агентов-кандидатов и указание на "клетку" включает указание на одну или несколько клеток и ее эквивалентов, известных специалистам в данной области, и т.д. Публикации, рассмотренные в настоящем документе, предоставлены только для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем документе не следует истолковывать как допущение того, что это изобретение дает право на противопоставление факта создания изобретения с более ранним приоритетом. 1.2. Сокращения Ед - единицы,В - вольты,ММ - молекулярная масса,MWCO - предел молекулярной массы,с - секунда/секунды,мин - минута/минуты,ч - час/часов,DO - растворенный кислород,ABS - поглощение,EtOH - этанол,PSS - физиологический солевой раствор,мас./об. - масса/объем,МТР - микропланшет для титрования,н. - нормальный,DP1 - моносахариды,DP2 - дисахариды,DP3 - олигосахариды, сахара, имеющие степень полимеризации более 3,м.д. - миллионные доли,SBD - связывающий крахмал домен,CD - каталитический домен,ПЦР - полимеразная цепная реакция,WT - дикий тип. 2. Исходные глюкоамилазы В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к варианту глюкоамилазы. Вариант глюкоамилазы представляет собой вариант исходной глюкоамилазы, который может содержать как каталитический домен, так и связывающий крахмал домен. В некоторых вариантах осуществления исходная глюкоамилаза содержит каталитический домен, имеющий аминокислотную последовательность, как проиллюстрировано в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 или 9, или имеющий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 97, приблизительно 99 или приблизительно 99,5% идентичностью последовательности с одной или несколькими аминокислотными последовательностями, проиллюстрированными в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 или 9. В других вариантах осуществления исходная глюкоамилаза содержит каталитический домен, кодируемый последовательностью ДНК, которая гибридизуется в условиях умеренной жесткости, высокой жесткости или в жетских условиях с ДНК, кодирующий каталитический домен глюкоамилазы, имеющей одну из аминокислотных последовательностейSEQ ID NO: 1, 2 или 3. В некоторых вариантах осуществления исходная глюкоамилаза содержит связывающий крахмал домен, имеющий аминокислотную последовательность, как проиллюстрировано в SEQ ID NO 1, 2, 11,385, 386, 387, 388, 389 или 390, или имеющий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 97, приблизительно 99 или приблизительно 99,5% идентичностью последовательности с одной или несколькими из аминокислотных последовательностей, проиллюстрированных в SEQ ID NO 1, 2, 11,385, 386, 387, 388, 389 или 390. В других вариантах осуществления исходная глюкоамилаза содержит связывающий крахмал домен, кодируемый последовательностью ДНК, которая гибридизуется в условиях средней жесткости, высокой жесткости или в жестких условиях с ДНК, кодирующей связывающий крахмал домен глюкоамилазы, имеющей одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 или 11. Предсказанная структура и известные последовательности глюкоамилаз являются консервативными среди видов грибов (Coutinho et al., 1994, Protein Eng., 7:393-400 и Coutinho et al., 1994, Protein Eng., 7: 749-760). В некоторых вариантах осуществления исходная глюкоамилаза представляет собой глюкоамилазу нитчатых грибов. В некоторых вариантах осуществления исходную глюкоамилазу получают из штамма Trichoderma (например, Т. reesei, T. longibrachiatum, Т. strictipilis, Т. asperellum, Т. konilangbra и Т. hazianum), штамма Aspergillus (например, A. niger, A. nidulans, A. kawachi, A. awamori и A. orzyae),штамма Talaromyces (например, Т. emersonii, Т. thermophilus и T. duponti), штамма Hypocrea (например,H. gelatinosa, H. orientalis, H. vinosa и H. citrina), штамма Fusarium (например, F. oxysporum, F. roseum и F.venenatum), штамма Neurospora (например, N. crassa) и штамма Humicola (например, H. grisea, H insolens и H. lanuginose), штамма Penicillium (например, P. notaturn или P. chrysogenum) или штамма Saccharomycopsis (например, S. fibuligera). В некоторых вариантах осуществления исходная глюкоамилаза может представлять собой бактериальную глюкоамилазу. Например, полипептид можно получать из штамма грамположительных бактерий, такого как штамм Bacillus (например, В. alkalophilus, В. amyloliquefaciens, В. lentus, В. licheniformis,В. stearothermophilus, В. subtilis и В. thuringiensis) или штамм Streptomyces (например, S. lividans). В некоторых вариантах осуществления исходная глюкоамилаза содержит каталитический домен,обладающий по меньшей мере приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 93, приблизительно 95, приблизительно 97, приблизительно 98 или приблизительно 99 идентичностью последовательности с каталитическим доменом аминокислотной последовательности TrGA сSEQ ID NO: 3. В других вариантах осуществления исходная глюкоамилаза содержит каталитический домен, обладающий по меньшей мере приблизительно 90, приблизительно 93, приблизительно 95, приблизительно 96, приблизительно 97, приблизительно 98 или приблизительно 99 идентичностью последовательности с каталитическим доменом исходной глюкоамилазы Aspergillus SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6. В других вариантах осуществления исходная глюкоамилаза содержит каталитический домен, обладающий по меньшей мере приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 97 или приблизительно 99% идентичностью последовательности с каталитическим доменом исходной глюкоамилазыHumicola grisea (HgGA) SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления исходная глюкоамилаза содержит связывающий крахмал домен, обладающий по меньшей мере приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 97 или приблизительно 98% идентичностью последовательности со связывающим крахмал доменом аминокислотной последовательности TrGA SEQ ID NO: 1, 2 или 11. В других вариантах осуществления исходная глюкоамилаза содержит связывающий крахмал домен,обладающий по меньшей мере приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 97 или приблизительно 99% идентичностью последовательности с каталитическим доменом глюкоамилазы Humicolagrisea (HgGA) SEQ ID NO: 385. В других вариантах осуществления исходная глюкоамилаза содержит связывающий крахмал домен,обладающий по меньшей мере приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 97 или приблизительно 99 идентичностью последовательности с каталитическим доменом глюкоамилазы Thielavia terrestris (TtGA) SEQ ID NO: 390. В других вариантах осуществления исходная глюкоамилаза содержит связывающий крахмал домен,обладающий по меньшей мере приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 97% или приблизительно 99% идентичностью последовательности с каталитическим доменом глюкоамилазыThermomyces lanuginosus (ThGA) SEQ ID NO: 386. В других вариантах осуществления исходная глюкоамилаза содержит связывающий крахмал домен,обладающий по меньшей мере приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 97% или приблизительно 99% идентичностью последовательности с каталитическим доменом глюкоамилазы Talaromyces emersoniit (TeGA) SEQ ID NO: 387. В других вариантах осуществления исходная глюкоамилаза содержит связывающий крахмал домен,обладающий по меньшей мере приблизительно 90%, приблизительно 93%, приблизительно 95%,приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98% или приблизительно 99% идентичностью последовательности со связывающим крахмал доменом исходной глюкоамилазы AspergillusSEQ ID NO: 388 или 389. В некоторых вариантах осуществления исходная глюкоамилаза обладает по меньшей мере приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 88, приблизительно 90, приблизительно 93, приблизительно 95, приблизительно 96, приблизительно 97, приблизительно 98 или приблизительно 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью TrGA SEQ ID NO: 1 или 2. В следующих вариантах осуществления гомолог глюкоамилазы Trichoderma получают из штаммаTrichoderma или Hypocrea. Некоторые типичные гомологи глюкоамилазы Trichoderma описаны в патенте США 7413887 с конкретной отсылкой на аминокислотные последовательности, указанные в SEQ IDNO: 17-22 и 43-47 этой ссылки. В некоторых вариантах осуществления исходная глюкоамилаза представляет собой TrGA, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или гомолог глюкоамилазы Trichoderma,обладающий по меньшей мере приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 88, приблизительно 90, приблизительно 93, приблизительно 95, приблизительно 96, приблизительно 97, приблизительно 98 или приблизительно 99% идентичностью последовательности с последовательностью TrGA(SEQ ID NO: 2). Исходную глюкоамилазу можно выделять и/или идентифицировать с использованием стандартных способов рекомбинантных ДНК. Можно использовать любые стандартные способы, известные специалисту в данной области. Например, для идентификации гомологов в клетках бактерий или грибов (каталитический домен, активный центр и т.д.) можно использовать зонды и/или праймеры, специфичные к консервативным областям глюкоамилазы. Альтернативно для идентификации гомологов в клетках бактерий или грибов можно использовать ПЦР с вырожденными праймерами. В некоторых случаях известные последовательности, такие как в базе данных, можно анализировать в отношении идентичности последовательности и/или структурной идентичности с одной из известных глюкоамилаз, включая SEQ IDNO: 2, или с известным связывающим крахмал доменам, включая SEQ ID NO: 11. Функциональные анализы также можно использовать для идентификации активности глюкоамилазы в клетках бактерий или грибов. Белки, обладающие активностью глюкоамилазы, можно выделять и подвергать обратному секвенированию для выделения соответствующей последовательности ДНК. Такие способы известны специалисту в данной области. 3. Структурная гомология глюкоамилаз Центральная догма молекулярной биологии состоит в том, что последовательность ДНК, кодирующая ген конкретного фермента, определяет аминокислотную последовательность белка, эта последовательность, в свою очередь, определяет трехмерную укладку фермента. Эта укладка сводит вместе различные остатки, которые формируют каталитический центр и поверхность связывания субстрата, и это приводит к высокой специфичности и активности рассматриваемых ферментов. Глюкоамилазы состоят из трех различных структурных доменов: каталитический домен приблизительно из 450 остатков, который является структурно консервативным во всех глюкоамилазах, за которым, как правило, следует линкерная область, состоящая из от 30 до 80 остатков, которые связаны со связывающим крахмал доменом приблизительно из 100 остатков. Структура глюкоамилазы Trichodermareesei со всеми тремя неизмененными областями определена в настоящем документе с разрешением 1,8(см. табл. 20 в WO 2009/067218 (Danisco US Inc., Genencor Division), стр. 94-216, включенной в настоящий документ в качестве ссылки, и пример 11 в WO 2009/067218 (Danisco US Inc., Genencor Division), стр. 89-93, включенной в настоящий документ в качестве ссылки). С использованием координат(см. табл. 20 в WO 2009/067218 (Danisco US Inc., Genencor Division), стр. 94-216, включенной в настоящий документ в качестве ссылки) провели выравнивание структуры с координатами каталитического домена глюкоамилазы из штамма Aspergillus awamori X100, которые были определены ранее (Aleshin,A.E., Hoffman, С., Firsov, L.M. и Honzatko, R.B. Refined crystal structures of glucoamylase from Aspergillusawamori var. X100. J. Mol. Biol. 238: 575-591 (1994. Кристаллическая структура Aspergillus awamori включала только каталитический домен. Как видно на фиг. 6-7, структуры каталитических доменов очень высоко перекрываются, и эквивалентные остатки можно идентифицировать на основе наложения структур. Полагают, что все глюкоамилазы обладают общей основной структурой, представленной на фиг. 6-7. Каталитический домен TrGA, таким образом, имеет приблизительно 450 остатков, таких как остатки 1-453 TrGA SEQ ID NO: 2, и он представляет собой домен в виде двойного бочонка с двенадцатью спиралями. Спирали и петли каталитического домена можно определить с помощью остатков TrGA сSEQ ID NO: 2, формирующих их спираль 1 остатки 2-20,петля 1 остатки 21-51,спираль 2 остатки 52-68,петля 2 остатки 69-71,спираль 3 остатки 72-90,петля 3 остатки 91-125,спираль 4 остатки 126-145,петля 4 остатки 146,спираль 5 остатки 147-169,спираль 6 остатки 186-206,петля 6 остатки 207-210,спираль 7 остатки 211-227,петля 7 остатки 211-227,спираль 8 остатки 250-275,петля 8 остатки 260-275,спираль 9 остатки 276-292,петля 9 остатки 293-321,спираль 10 остатки 322-342,петля 10 остатки 343-371,спираль 11 остатки 372-395,петля 11 остатки 396-420,спираль 12 остатки 421-434,петля 12 остатки 435-443,спираль 13 остатки 444-447,петля 13 остатки 448-453. Линкерный домен имеет от 30 до 80 остатков, таких как остатки 454-490 TrGA с SEQ ID NO: 2. Связывающий крахмал домен TrGA имеет приблизительно 100 остатков, таких как остатки 496-596TrGA с SEQ ID NO: 2, состоящих из -сэндвича, сформированного из двух скрученных трехцепочечных слоев. В слоях спирали и петли связывающего крахмал домена можно определить с помощью остатковTrGA с SEQ ID NO: 2, формирующих их слой 1' остатки 496-504,петля 1' остатки 505-511,- 18023194 слой 2' остатки 512-517,соединяющая петля 2' остатки 518-543,слой 3' остатки 544-552,петля 3' остатки 553,слой 4' остатки 554-565,петля 4' остатки 566-567,слой 5' остатки 568-572,сегмент между слоями остатки 573-577,слой 5 а' остатки 578-582,петля 5' остатки 583-589,слой 6' остатки 590-596. Можно идентифицировать эквивалентные остатки в других глюкоамилазах на основе наложения структур, как более подробно описано ниже. На фиг. 6 представлено сравнение трехмерных структур глюкоамилазы Trichoderma reesei (черный)SEQ ID NO: 2 и глюкоамилазы Aspergillus awamorii (серый), вид сбоку. В этом представлении можно видеть соотношение между каталитическим доменом и линкерной областью и связывающим крахмал доменом. На фиг. 7 представлено сравнение трехмерных структур глюкоамилазы Trichoderma reesei (черный)SEQ ID NO: 2 и глюкоамилазы Aspergillus awamorii (серый), вид сверху. Глюкоамилазы, представленные здесь, и, в действительности, все известные на сегодняшний день глюкоамилазы обладают этой структурной гомологией. Консервативность структуры коррелирует с консеравтивностью активности и консервативным механизмом действия всех глюкоамилаз. Учитывая эту высокую гомологию, варианты глюкоамилазы Trichoderma с сайт-специфическими изменениями, приводящими к измененной функции,также могут обладать сходной структурой и, таким образом, функциональными последствиями в других глюкоамилазах. Таким образом, идеи о том, какие варианты приводят к желаемой пользе, можно применять к другим глюкоамилазам. Дальнейшая кристаллическая структура была получена с использованием координат, представленных в табл. 20 WO 2009/067218 (Danisco US Inc., Genencor Division), стр. 94-216, включенной в настоящий документ в качестве ссылки, для связывающего крахмал домена (SBD). SBD TrGA выравнивали сSBD А. niger. Как представлено на фиг. 8, структуры SBD A. niger и TrGA очень тесно перекрываются. Полагают, что, хотя все связывающие крахмал домены обладают, по меньшей мере, некоторой основной структурой, приведенной на фиг. 8, некоторые SBD являются более структурно сходными, чем другие. Например, SBD TrGA можно классифицировать как принадлежащие семейству 20 связывающих углевод модулей в базе данных CAZY (cazy.org). В базе данных CAZY описаны семейства структурно родственных каталитических и связывающих углевод модулей (или функциональных доменов) ферментов, которые осуществляют деградацию, модифицируют или создают гликозидные связи. Учитывая высокую структурную гомологию, сайт-специфические варианты SBD TrGA, приводящие к измененной функции,также могут обладать сходными структурными и, таким образом, функциональными последствиями в других глюкоамилазах, имеющих SBD со структурой, сходной со структурой SBD TrGA, в частности со структурами, классифицированными как принадлежащие семейству 20 связывающих углевод модулей 20. Таким образом, идеи о том, какие варианты приводят к желаемой пользе, можно применять к другимSBD, обладающим структурным сходством. Таким образом, номера аминокислотных положений, рассмотренные в настоящем документе, относятся к номерам, присвоенным последовательности зрелой глюкоамилазы Trichoderma reesei, представленной на фиг. 1 (SEQ ID NO: 2). Однако настоящее изобретение не ограничивается вариантами глюкоамилазы Trichoderma, а распространяется на глюкоамилазы, содержащие аминокислотные остатки в положениях, которые "эквивалентны" конкретным идентифицированным остаткам в глюкоамилазе Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения исходная глюкоамилаза представляет собой GA Talaromyces и замены вносят в эквивалентные положения аминокислотных остатков в глюкоамилазе Talaromyces (см., например, SEQ ID NO: 12), таких как остатки,описанные в настоящем документе. В других вариантах осуществления исходная глюкоамилаза содержит SEQ ID NO: 5-9 (см. фиг. 5 А и 5 В). В следующих вариантах осуществления исходная глюкоамилаза представляет собой глюкоамилазу Penicillium, таких как Penicillium chrysogenum (см., например, SEQ ID"Структурная идентичность" определяет, являются ли аминокислотные остатки эквивалентными. Структурная идентичность представляет собой взаимооднозначный топологический эквивалент, когда выравнивают две структуры (трехмерные и аминокислотные структуры). Положение остатка (аминокислоты) в глюкоамилазе "эквивалентно" остатку глюкоамилазы Т. reesei, если он является либо гомологичным (т.е. соответствующим по положению либо в первично, либо в третичной структуре), либо аналогичным определенному остатку или части этого остатка в глюкоамилазе Т. reesei (обладающему той же или сходной функциональной способностью к объединению, реакции или химическому взаимодействию). Для установления идентичности по первичной стриктуре аминокислотную последовательность глюкоамилазы можно прямо сравнивать с первичной последовательностью глюкоамилазы Trichodermareesei и, в частности, с набором остатков, которые, как известно, являются инвариантными в глюкоамилазах, для которых последовательность известна. Например, на фиг. 5 А и 5 В в настоящем документе представлены консервативные остатки между глюкоамилазами. На фиг. 5D и 5 Е представлено выравнивание связывающих крахмал доменов из различных глюкоамилаз. После выравнивания консервативных остатков, позволяющего необходимые инсерции и делеции для поддержания выравнивания (т.е. избегания устранения консервативных остатков путем произвольной делеции или инсерции), определяют остатки, эквивалентные конкретным аминокислотам в первичной последовательности глюкоамилазыTrichoderma reesei. Выравнивание по консервативным остаткам, как правило, должно сохранять 100% таких остатков. Однако выравнивание более чем приблизительно 75% или только приблизительно 50% консервативных остатков также является достаточным для определения эквивалентных остатков. Кроме того, структурную идентичность можно использовать в комбинации с идентичностью последовательности для идентификации эквивалентных остатков. Например, на фиг. 5 А и 5 В выровнены каталитические домены глюкоамилаз из шести организмов для обеспечения максимальной величины гомологии между аминокислотными последовательностями. Сравнение этих последовательностей демонстрирует, что в каждой последовательности содержится ряд консервативных остатков, как обозначено звездочкой. Таким образом, эти консервативные остатки можно использовать для определения соответствующих эквивалентных аминокислотных остатков глюкоамилазы Trichoderma reesei в других глюкоамилазах, таких как глюкоамилаза из Aspergillus niger. Аналогично, на фиг. 5D и 5 Е показаны связывающие крахмал домены глюкоамилаз из семи организмов, выровненные для идентификации эквивалентных остатков. Структурная идентичность вовлекает идентификацию эквивалентных остатков между двумя структурами. "Эквивалентные остатки" можно определить путем определения гомологии на уровне третичной структуры (структурная идентичность) для фермента, третичная структура которого была определена рентгеновской кристаллографией. Эквивалентные остатки определяют как остатки, для которых атомные координаты двух или более атомов главной цепи конкретного аминокислотного остатка глюкоамилазыTrichoderma reesei (N на N, СА на СА, С на С и О на О) находятся в пределах 0,13 нм и необязательно 0,1 нм после выравнивания. В одном аспекте по меньшей мере 2 или 3 из четырех возможных атомов главной цепи находятся в пределах 0,1 нм после выравнивания. Выравнивания достигают после того, как наилучшую модель ориентируют и располагают для максимального перекрывания атомных координат неводородных атомов белка рассматриваемой глюкоамилазы с глюкоамилазой Trichoderma reesei. Наилучшей моделью является кристаллографическая модель, дающая наиболее низкий R-фактор для экспериментальных дифракционных данных при наиболее высоком доступном разрешении Эквивалентные остатки, которые являются функционально аналогичными конкретному остатку глюкоамилазы Trichoderma reesei, определяют как аминокислоты фермента, которые могут принимать конформацию, так что они могут изменять, модифицировать или вносить вклад в структуру белка, связывание субстрата или катализ так, как определено и приписано для конкретного остатка глюкоамилазыTrichoderma reesei. Кроме того, они представляют собой остатки фермента (для которого была получена третичная структура рентгеновской кристаллографией), которые занимают аналогичное положение до той степени, что, хотя атомы главной цепи данного остатка могут не удовлетворять критериям эквивалентности на основе занятия гомологичного положения, атомные координаты по меньшей мере двух атомов боковой цепи остатка находятся в пределах 0,13 нм от соответствующих атомов боковой цепи глюкоамилазы Trichoderma reesei. Координаты трехмерной структуры глюкоамилазы Trichoderma reesei представлены в табл. 20 в WO 2009/067218 (Danisco US Inc., Genencor Division), стр. 94-216, включенной в настоящий документ в качестве ссылки, и их можно использовать, как описано выше, для определения эквивалентных остатков на уровне третичной структуры. Некоторые из остатков, идентифицированные для замены, представляют собой консервативные остатки, в то время как другие не являются ими. В случае остатков, которые не являются консервативными,замена одной или нескольких аминокислот ограничена до замен, которые приводят к варианту, обладающему аминокислотной последовательностью, которая не соответствует аминокислотной последовательности, встречающейся в природе. В случае консервативных остатков, такие замены не должны приводить к встречающейся в природе последовательности. 4. Варианты глюкоамилазы Варианты по изобретению включают по меньшей мере одну замену, делецию или инсерцию в аминокислотной последовательности исходной глюкоамилазы, которые делают последовательность варианта отличающейся от последовательности исходной глюкоамилазы. В некоторых вариантах осуществления варианты по изобретению имеют по меньшей мере приблизительно 20, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизи- 20023194 тельно 90, приблизительно 95, приблизительно 97 или приблизительно 100% активности глюкоамилазы,такой как активность TrGA (SEQ ID NO: 2), или исходной глюкоамилазы, которая обладает по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с TrGA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления варианты по изобретению содержат замену, делецию или инсерцию по меньшей мере в одном положении аминокислоты исходной TrGA (SEQ ID NO: 2) или в эквивалентном положении последовательности другой исходной глюкоамилазы, имеющей по меньшей мере приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 97, приблизительно 98 или приблизительно 99% идентичность последовательности с последовательностью TrGA (SEQ ID NO: 2). В других вариантах осуществления вариант по изобретению содержит замену, делецию или инсерцию по меньшей мере в одном положении аминокислоты фрагмента исходной TrGA, где фрагмент содержит каталитический домен последовательности TrGA (SEQ ID NO: 3) или в эквивалентном положении фрагмента, содержащего каталитический домен исходной глюкоамилазы, обладающего по меньшей мере приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 97%, приблизительно 98% или приблизительно 99% идентичностью последовательности с содержащим каталитический домен фрагментом SEQ ID NO: 3, 5, 6, 7, 8 или 9. В некоторых вариантах осуществления фрагмент содержит по меньшей мере приблизительно 400, приблизительно 425, приблизительно 450, или приблизительно 500 аминокислотных остатков каталитического домена TrGA (SEQ ID NO: 3). В других вариантах осуществления вариант согласно изобретению содержит замену, делецию или инсерцию по меньшей мере в одном положении аминокислоты фрагмента исходной TrGA, где фрагмент содержит связывающий крахмал домен последовательности TrGA (SEQ ID NO: 11), или в эквивалентном положении фрагмента, содержащего связывающий крахмал домен исходной глюкоамилазы, обладающего по меньшей мере приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95,приблизительно 97, приблизительно 98 или приблизительно 99% идентичностью последовательности с фрагментом, содержащим связывающий крахмал домен SEQ ID NO: 11, 385, 386, 387, 388, 389 и 390. В некоторых вариантах осуществления фрагмент содержит по меньшей мере приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100 или приблизительно 109 аминокислотных остатков связывающего крахмал домена TrGA(SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах осуществления, когда исходная глюкоамилаза включает каталитический домен, линкерную область и связывающий крахмал домен, вариант содержит замену, делецию или инсерцию по меньшей мере в одном положении аминокислоты фрагмента, содержащего часть линкерной области. В некоторых вариантах осуществления вариант содержит замену, делецию или инсерцию в аминокислотной последовательности фрагмента последовательности TrGA (SEQ ID NO: 2). Структурная идентичность в отношении аминокислотной замены означает, что замена происходит в эквивалентном положении аминокислоты в гомологичной глюкоамилазе или в исходной глюкоамилазе. Термин "эквивалентное положение" означает положение, общее для двух исходных последовательностей, которое основано на выравнивании аминокислотной последовательности рассматриваемой исходной глюкоамилазы, а также на выравнивании трехмерной структуры рассматриваемой исходной глюкоамилазы, с аминокислотной последовательностью и трехмерной последовательностью эталонной глюкоамилазы TrGA. Например, на основании фиг. 5 А положение 24 в TrGA (SEQ ID NO: 2 или 3) представляет собой D24 и эквивалентное положение для Aspergillus niger (SEQ ID NO: 6) представляет собой положение D25, и эквивалентное положение для Aspergillus oryzea (SEQ ID NO: 7) представляет собой положение D26. См. фиг. 6 и 7 для иллюстративного выравнивания трехмерной последовательности. Таким образом, в одном аспекте описан вариант глюкоамилазы, и этот вариант глюкоамилазы, когда он находится в кристаллической форме, имеет кристаллическую структуру, для которой атомные координаты атомов главной цепи имеют среднеквадратическое отклонение от атомных координат эквивалентных атомов главной цепи TrGA (как определено в табл. 20 в WO 2009/067218) менее 0,13 нм после выравнивания эквивалентных атомов главной цепи, и который имеет линкерную область, связывающий крахмал домен и каталитический домен, причем указанный вариант содержит две или более аминокислотные замены относительно аминокислотной последовательности исходной глюкоамилазы в соединяющей петле 2' связывающего крахмал домена, и/или в петле 1, и/или в спирали 2, и/или в петле 11,и/или в спирали 12 каталитического домена. В следующем аспекте среднеквадратическое отклонение от атомных координат эквивалентных атомов главной цепи TrGA (как определено в табл. 20 в WO 2009/067218) составляет менее 0,12 нм, например менее 0,11 или, например, менее 0,10. В одном аспекте описан вариант глюкоамилазы, и этот вариант глюкоамилазы содержит связывающий крахмал домен и каталитический домен, причем указанный вариант содержит две или более аминокислотные замены относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или эквивалентной исходной глюкоамилазы в соединяющей петле 2', и/или в петле 1, и/или в спирали 2, и/или в петле 11, и/или в спирали 12 для уменьшения синтеза продуктов конденсации в процессе гидролиза крахмала. В следующем аспекте описан вариант глюкоамилазы, и этот вариант глюкоамилазы содержит две или более аминокислотные замены относительно соединяющей петли 2' с аминокислотной последовательностью от положения 518 до положения 543 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или петля 1 с аминокислотной последовательностью от положения 21 до положения 51 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или спираль 2 с аминокислотной последовательностью от положения 52 до положения 68 SEQID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или петля 11 с аминокислотной последовательностью от положения 396 до положения 420 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или спираль 12 с аминокислотной последовательностью от положения 421 до положения 434 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте описан вариант глюкоамилазы, и этот вариант глюкоамилазы содержит две или более аминокислотные замены относительно аминокислотной последовательности от положения 518 до положения 543 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или аминокислотной последовательности от положения 21 до положения 51 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или аминокислотной последовательности от положения 52 до положения 68 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе, и/или аминокислотной последовательности от положения 396 до положения 420 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе,и/или аминокислотной последовательности от положения 421 до положения 434 SEQ ID NO: 2 или эквивалентной последовательности остатков в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте две или более аминокислотные замены представляют собой замены относительно соединяющей петли 2' с аминокислотной последовательностью от положения 518 до положения 543, например, в одном или нескольких из положений 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529,530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542 и/или 543 SEQ ID NO: 2, и/или петли 1 с аминокислотной последовательностью от положения 21 до положения 51, например, в одном или нескольких из положений 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 и/или 51 SEQ ID NO: 2, и/или спирали 2 с аминокислотной последовательностью от положения 52 до положения 68, например, в одном или нескольких из положений 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 и/или 68 SEQ ID NO: 2, и/или петли 11 с аминокислотной последовательностью от положения 396 до положения 420, например, в одном или нескольких из положений 396,397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418,419 и/или 420 SEQ ID NO: 2, и/или спирали 12 с аминокислотной последовательностью от положения 421 до положения 434, например, в одном или нескольких из положений 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427,428, 429, 430, 431, 432, 433 и/или 534 SEQ ID NO: 2. В следующем аспекте две или более аминокислотных замены представляют собой по меньшей мере одну аминокислотную замену в соединяющей петле 2' и по меньшей мере одну аминокислотную замену в петле 1 и/или спирали 2 и/или петле 11 и/или спирали 12. В следующем аспекте две или более аминокислотные замены представляют собой 1, 2, 3 или 4 аминокислотных замены в соединяющей петле 2' и 1,2, 3 или 4 аминокислотные замены в петле 1 и/или спирали 2 и/или петле 11 и/или спирали 12. В следующем аспекте две или более аминокислотные замены представляют собой по меньшей мере одну аминокислотную замену в соединяющей петле 2' и по меньшей мере одну аминокислотную замену в петле 1. В следующем аспекте две или более аминокислотные замены представляют собой по меньшей мере одну аминокислотную замену в соединяющей петле 2' и по меньшей мере одну аминокислотную замену в спирали 2. В следующем аспекте две или более аминокислотные замены представляют собой по меньшей мере одну аминокислотную замену в соединяющей петле 2' и по меньшей мере одну аминокислотную замену в петле 11. В следующем аспекте две или более аминокислотные замены представляют собой по меньшей мере одну аминокислотную замену в соединяющей петле 2' и по меньшей мере одну аминокислотную замену в спирали 12. В следующем аспекте две или более аминокислотные замены представляют собой по меньшей мере одну аминокислотную замену в соединяющей петле 2' и по меньшей мере одну аминокислотную замену в петле 1 и по меньшей мере одну аминокислотную замену в спирали 2. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену в положении 520-543, 530-543 или 534-543 соединяющей петли 2', причем положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентным положениям в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену в аминокислотной последовательности в положении 30-50, 35-48 или 40-46 петли 1, причем положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентным положениям в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену в аминокислотной последовательности в положении 50-66, 55-64 или 58-63 спирали 2, причем положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентным положениям в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену в аминокислотной последовательности в положении 405420, 410-420 или 415-420 петли 11, причем положения соответствуют соответствующему положению вSEQ ID NO: 2 или эквивалентным положениям в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену в аминокислотной последовательности в положении 421-434, 425-434 или 428-434 спирали 12, причем положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентным положениям в исходной глюкоамилазе. В одном аспекте вариант глюкоамилазы содержит две или более аминокислотные замены, где аминокислотная замена находится в положении 539 и аминокислотная замена находится в положении 44,причем положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе, и эта последовательность обладает по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с исходной глюкоамилазой, и где аминокислотная замена в положении 44 не является 44 С. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы содержит две или более аминокислотные замены, где аминокислотная замена находится в положении 539 и аминокислотная замена представляет собой 44R,причем положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы содержит аминокислотную замену в положении 61, где положение соответствует соответствующему положению в SEQID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте аминокислотная замена в положении 539 представляет собой 539R, где положение соответствует соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте аминокислотная замена в положении 44 представляет собой 44R, где положение соответствует соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте аминокислотная замена в положении 61 представляет собой 611, где положение соответствует соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы содержит следующие аминокислотные замены:b) D44R, N611 и A539R,причем положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2 или эквивалентному положению в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы состоит из SEQ ID NO: 2 и имеет следующие аминокислотные замены:b) D44R, N611 и A539R,причем положения соответствуют соответствующему положению в SEQ ID NO: 2. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы имеет связывающий крахмал домен, который обладает по меньшей мере 96, 97, 98, 99 или 99,5% идентичностью последовательности со связывающим крахмал доменом SEQ ID NO: 1, 2, 11, 385, 386, 387, 388, 389 или 390. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы имеет каталитический домен, который обладает по меньшей мере 80, 85, 90, 95 или 99,5% идентичностью последовательности с каталитическим доменом SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 или 9. В следующем аспекте исходная глюкоамилаза представляет собой глюкоамилазу грибов. В следующем аспекте исходная глюкоамилаза выбрана из глюкоамилазы, полученной из Trichoderma spp., Aspergillus spp., Humicola spp., Penicillium spp., Talaromycese spp. или Schizosaccharmyces spp. В следующем аспекте исходную глюкоамилазу получают из Trichoderma spp. или Aspergillus spp. В следующем аспекте глюкоамилаза является очищенной. Глюкоамилазы по настоящему изобретению можно выделять или очищать из культуральной среды различными способами, известными в данной области, включая центрифугирование, фильтрацию, экстракцию, осаждение и т.п. В некоторых вариантах осуществления вариант глюкоамилазы включает по меньшей мере две замены в аминокислотной последовательности исходной глюкоамилазы. В следующих вариантах осуществления вариант может иметь более двух замен. Например, вариант может иметь 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15,20 или 25 аминокислотных замен, делеций или инсерций по сравнению с соответствующей исходной глюкоамилазой. В некоторых вариантах осуществления вариант глюкоамилазы содержит замену, делецию или инсерцию, и, как правило, замену по меньшей мере в одном положении аминокислоты, соответствующем областям неконсервативных аминокислот, как проиллюстрировано на фиг. 5 А, 5 В, 5D и 5 Е (например,аминокислотные положения, соответствующие положениям, которые не обозначенына фиг. 5 А, 5 В, 5D и 5 Е). Хотя варианты могут иметь замены в любом положении зрелой белковой последовательности (SEQID NO: 2), в некоторых вариантах осуществления вариант глюкоамилазы содержит две или более замен в следующих положениях в аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2: 23, 42, 43,44, 59, 60, 61, 65, 67, 68, 410, 417, 418, 430, 431, 433, 518, 519, 520, 527, 531, 535, 536, 537 или 539, или в эквивалентном положении в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы содержит одну или несколько дополнительных замен в следующих положениях в аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2: 10, 14, 15, 72, 73, 97, 98, 99, 102, 110, 113, 114, 133, 140, 144,- 23023194 145, 147, 152, 153, 164, 182, 204, 205, 214, 216, 219, 228, 229, 230, 231, 236, 239, 241, 242, 263, 264, 265,268, 269, 276, 284, 291, 294, 300, 301, 303, 311, 338, 342, 344, 346, 349, 359, 361, 364, 375, 379, 382, 390,391, 393, 394, 436, 442, 444, 448, 451, 493, 494, 495, 502, 503, 508, 511, 563 или 577, или в эквивалентном положении в исходной глюкоамилазе. В некоторых вариантах осуществления исходная глюкоамилаза обладает по меньшей мере приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 96, приблизительно 97, приблизительно 98 или приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления исходная глюкоамилаза представляет собой гомолог глюкоамилазы Trichoderma. В некоторых вариантах осуществления вариант имеет измененные свойства. В некоторых вариантах осуществления исходная глюкоамилаза обладает структурной идентичностью с глюкоамилазой SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления вариант глюкоамилазы содержит две или более замен в следующих положениях в аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2: Р 23, Т 42, I43,D44, Р 45, D46, F59, K60, N61, Т 67, Е 68, R408, S410, S415, L417, Н 418, Т 430, А 431, R433, N518, А 519,А 520, Т 527, V531, А 535, V536, N537 и А 539 или в эквивалентном положении в исходной глюкоамилазе(например, гомолог глюкоамилазы Trichoderma). В следующем аспекте вариант глюкоамилазы содержит одну или несколько замен в следующих положениях в аминокислотной последовательности, указанной вSEQ ID NO: 2: Т 10, L14, N15, А 72, G73, S97, L98, А 99, S102, K108, Е 110, L113, K114, R122, Q124, R125,1133, K140, N144, N145, Y147, S152, N153, N164, F175, N182, А 204, Т 205, S214, V216, Q219, W228,V229, S230, S231, D236, 1239, N240, Т 241, N242, G244, N263, L264, G265, А 268, G269, D276, V284, S291,G294, Р 300, А 301, А 303, Y310, А 311, D313, Y316, V338, Т 342, S344, Т 346, А 349, V359, G361, А 364,Т 375, N379, S382, S390, Е 391, А 393, K394, I436, А 442, N443, S444, Т 448, S451, Т 493, Р 494, Т 495, Н 502,Е 503, Q508, Q511, N563 и N577 или в эквивалентном положении в исходной глюкоамилазе. В некоторых вариантах осуществления вариант обладает измененными свойствами по сравнению с исходной глюкоамилазой. В некоторых вариантах осуществления вариант глюкоамилазы может отличаться от исходной глюкоамилазы только в определенных положениях. В следующих вариантах осуществления вариант исходной глюкоамилазы содержит по меньшей мере две из следующих замен в следующих положениях аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2: T42V, I43Q/R, D44R/C, N61I, Т 67 М, Е 68 С/М, L417K/R/V, T430A/K, A431I/L/Q,R433C/E/G/L/N/S/V/Y, A519I/K/R/Y, A520C/L/P, V531L, A535K/N/P/R, V536M или A539E/R/S, или замену в эквивалентном положении в исходной глюкоамилазе. В следующем аспекте вариант глюкоамилазы содержит одну или несколько замен в следующих положениях аминокислотной последовательности,указанной в SEQ ID NO: 2: T10S, A72Y, G73F/W, S97N, S102A/M/R, K114M/Q, I133T/V, N145I,N153A/D/E/M/S/V, T205Q, Q219S, W228A/F/H/M/V, V229I/L, S230C/F/G/L/N/Q/R, S231L/V, D236R,I239V/Y, N263P, L264D/K, A268C/D/G/K, S291A/F/H/M/T, g294c, A301P/R, V338I/N/Q, T342V,S344M/P/Q/R/V, G361D/E/F/I/L/M/P/S/W/Y, A364D/E/F/G/K/L/M/R/S/T/V/W, T375N, K394S, I436H,T451K, T495K/M/S, E503A/C/V, Q508R, Q511H, N563C/E/I/K/K/Q/T/V или N577K/P/R, или в эквивалентном положении в исходной глюкоамилазе. В следующих вариантах осуществления вариант глюкоамилазы содержит один из следующих наборов замен в соответствующих положениях SEQ ID NO: 2 или в эквивалентных положениях в исходной глюкоамилазе: В следующих вариантах осуществления вариант глюкоамилазы содержит один из следующих наборов замен в положениях SEQ ID NO: 2 или эквивалентных положениях в исходной глюкоамилазе: где вариант глюкоамилазы не обладает дополнительными заменами относительно исходной глюкоамилазы, и где исходная глюкоамилаза имеет каталитический домен, который обладает по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 или 9. Таким образом, исходная глюкоамилаза может представлять собой любую из глюкоамилаз, описанных где-либо еще. Исходная глюкоамилаза может содержать связывающий крахмал домен, который обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, 2, 11, 385, 386, 387, 388, 389 или 390. Исходная глюкоамилаза может обладать по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1 или 2; например, она может содержать SEQ ID NO: 1 или 2. Необязательно исходная глюкоамилаза может состоять из SEQ ID NO: 1 или 2. Варианты глюкоамилазы по изобретению могут включать химерные или гибридные глюкоамилазы,например, со связывающим крахмал доменом (SBD) из одной глюкоамилазы и каталитическим доменом и линкером из другой глюкоамилазы. Например, гибридная глюкоамилаза может быть получена заменойSBD из AnGA (SEQ ID NO: 6) на SBD из TrGA (SEQ ID NO: 2) с получением гибрида с SBD AnGA и каталитическим доменом и ликером TrGA. Альтернативно SBD и линкер из AnGA можно заменять на SBD и линкер из TrGA. В некоторых аспектах вариант глюкоамилазы проявляет измененную термостабильность по сравнению с исходной глюкоамилазой. В некоторых аспектах измененная термостабильность может представлять собой увеличенную термостабильность по сравнению с исходной глюкоамилазой. В некоторых вариантах осуществления измененное свойство представляет собой измененную удельную активность по сравнению с исходной глюкоамилазой. В некоторых вариантах осуществления измененная удельная активность может представлять собой увеличенную удельную активность по сравнению с исходной глюкоамилазой. В некоторых вариантах осуществления измененное свойство представляет собой увеличенную термостабильность при более низких температурах по сравнению с исходной глюкоамилазой. В некоторых вариантах осуществления измененное свойство представляет собой как увеличенную удельную активность, так и увеличенную термостабильность по сравнению с исходной глюкоамилазой. В одном варианте осуществления некоторые варианты могут включать замены в положенияхSEQ ID NO: 2 или в эквивалентных положениях в исходных глюкоамилазах и, в частности, гомологах глюкоамилазы Trichoderma. В следующем варианте осуществления некоторые варианты могут включать замены в положенияхSEQ ID NO: 2, или в эквивалентных положениях в исходных глюкоамилазах и, в частности, гомологах глюкоамилазы Trichoderma. В следующем варианте осуществления некоторые варианты могут включать замены в положенияхSEQ ID NO: 2, или в эквивалентных положениях в исходных глюкоамилазах и, в частности, в гомологах глюкоамилазы Trichoderma. В следующем варианте осуществления некоторые варианты могут включать замены в положениях