Новые варианты маннаназы

В данном изобретении предложены новые варианты маннаназы, которые имеют аминокислотные последовательности, отличающиеся от маннаназы родительского/дикого типа Trichoderma reesei и обладающие одним или более преимущественными свойствами, такими как улучшенные термостабильность, профиль температура/активность, профиль рН/активность, специфическая активность и рН/протеаза чувствительность. Новые варианты маннаназы полезны и используются в спиртовых ферментационных процессах и/или при производстве спирта, для экстракции кофе,для обработки кофейных отходов, в качестве добавок к пищевым продуктам и кормам, для отбеливания с помощью энзимов бумажной пульпы, в качестве отбеливающего и/или шлихтующего агента в текстильной промышленности, для стимулирования нефтяных и газовых скважин при гидравлическом фракционировании пласта, в качестве моющих средств, в качестве ингредиентов в пекарном деле, для удаления биопленок и в питательных системах, для переработки зерна или для переработки возобновляемых ресурсов, предназначенных для производства биологического горючего, а также в текстильной промышленности, при бурении нефтяных скважин, при чистке,стирке, производстве моющих средств и в промышленности по переработке целлюлозных волокон. Область изобретения Предложенная здесь технология относится к улучшенным вариантам микробных маннаназ, более специфично к микробным энзимам, повышающим активность маннаназы в качестве их главной энзиматической активности; к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих указанные маннаназы, векторам,клеткам хозяина, которые содержат нуклеиновые кислоты, и к способам получения маннаназ; к композициям, включающим указанные маннаназы; к способам препарирования и получения таких энзимов; и к способам использования таких энзимов для обработки продуктов питания и кормов, для экстракции кофе и обработки кофейных отходов, а также в качестве добавок к продуктам питания и кормам, для энзимов,способствующих отбеливанию бумажной пульпы, в качестве отбеливающего и/или шлихтующего агента в текстильной промышленности, для лучшего стимулирования нефти или газа при гидравлическом фракционировании пластов, в качестве детергента, в качестве ингредиента в пекарном деле, для удаления биопленок и в перерабатывающих системах, для переработки зерна или для переработки возобновляемых ресурсов, предназначенных для производства биологического горючего, а также в текстильной промышленности, при бурении нефтяных скважин, при чистке, стирке, при производстве моющих средств и в промышленности по переработке целлюлозных волокон. Обоснование Эндо 1,4-D-маннаназа (-маннаназа; ЕС 3.2.1.78) катализирует беспорядочный гидролиз манногликозидных связей в полисахаридах на основе маннана. Большинство -маннаназ вызывают распад олигосахаридов до DP4 (Biely и Tenkanen, (1998), статья "Энзимология распада полуцеллюлозы", pp. 25-47, в книге Harman и Kubiceck (ed) Trichoderma and Gliocladium, vol. 2, Taylor and Francis Ltd. London), однако,остаточная активность была продемонстрирована на маннотриозе, указывая на существование как минимум четырех мест у маннозы для связывания с белком. Главным конечным продуктом гидролиза часто является маннобиоза и маннотриоза, хотя производятся также значительные количества маннозы. Некоторые -маннаназы способны вызывать распад кристаллического маннана. Наряду с гидролизом, для некоторых -маннаназ, включая -маннаназы из Trichoderma reesei, было показано, что они образуют продукты трансгликозилирования или с маннозой или с маннобиозой в качестве акцептора гликозидной связи.-маннаназы были выделены из большого числа организмов, включая бактерии, грибы, растения и животных. Хотя в большинстве случаев внеклеточно, некоторые р-маннаназы оказываются ассоциированными с клетками. Их экспрессия часто индуцируется в результате роста маннана или галактоманнана,однако, р-маннаназа из Т. reesei может также индуцироваться целлюлозой, тогда как их экспрессия подавляется глюкозой и другими моносахаридами. Часто мультиплетные маннаназы с различными изоэлектрическими точками обнаруживают в одном и том же организме, представляя собой продукты из различных генов или различные продукты из одного и того же гена, соответственно. Как правило, -маннаназы имеют умеренный температурный оптимум между 40 и 70 С, за исключением некоторых -маннаназ из термофилов (Politz и др., (2000), статья "Высоко термостабильные эндо-1,4 маннаназы из морской бактерии Rhodothermusmarinus", в журнале Appl. Microbiol. Biotechnol. 53 : 715-721). Оптимум рН находится в нейтральной или кислой области, то есть рН 5,0 для -маннаназы из Т. reesei (Arisan-Atac и др., (1993), статья "Очистка и характеристики -маннаназы из Trichodermareesei C-30", в журнале Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 58-62). Молекулярные веса энзимов лежат в интервале между 30 и 80 кД. В WO 002008009673 открыты варианты маннаназы из Trichoderma reesei, улучшенные по термической стабильности и с низкой рН/пепсин устойчивостью для использования при гидролизе содержащего галактоманнан растительного материала, то есть для выжимок ядер пальмовых орехов (ВЯПО), и для использования в корме животных. Например, термостабильность необходима для кормовых добавок, которые включают в кормовые смеси перед процедурой таблетирования, происходящей при высоких температурах. Кроме того, маннаназы, применяемые в качестве кормовых добавок, должны иметь низкие рН-значения и быть стабильными к пепсину, а также должны быть активными при низких рН-значениях, для того чтобы эффективно работать в желудке животных с однокамерным желудком. Однако тенденции в пищевой промышленности состоят во все большем повышении температуры таблетирования. Современная стабильность энзимов при температурах таблетирования от 90 до 95 С не дает возможности для использования энзимов на всех заводах для промышленного производства кормов. В связи с этим доступность маннаназы с улучшенной термической стабильностью может создавать большие преимущества, так как это позволяет использовать энзимы также на заводах с высокой операционной температурой. Краткое описание изобретения Согласно одному варианту данного изобретения получают варианты маннаназы, имеющие последовательности аминокислот, которые варьируют маннаназу, полученную из родительского/дикого типаTrichoderma reesei (последовательность SEQ ID1) и которые имеют одно или более улучшенных свойств. Такие свойства могут включать, но не ограничиваться по благоприятности: термостабильность; профиль температура/активность; профиль рН/активность; удельную активность и рН/протеазачувствительность. Согласно другому варианту данного изобретения имеются в виду варианты маннаназы, включающие маннаназы, имеющие замещение в одном или нескольких положениях, выбираемых из группы, которая включает положения: 66, 215 или 259, причем каждое положение соответствует положению в последовательности аминокислот маннаназы из родительского/дикого типа Trichoderma reesei (последовательность SEQ ID1). Согласно еще одному варианту данного изобретения имеются в виду варианты маннаназы, которые имеют последовательности аминокислот, отличающиеся от таковой у маннаназы из родительского/дикого типа Trichoderma reesei (последовательность SEQ ID1), которые включают вариации 201S,207F и 274L, и, как минимум, вариацию в одном или нескольких положениях, соответствующих положению 66, 215 или 259 по сравнению с последовательностью аминокислот SEQ ID1. И согласно еще одному варианту данного изобретения предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты маннаназы, которые открыты здесь, а также векторы и клетки хозяина, включающие такие нуклеиновые кислоты. В других вариантах изобретения последовательности используют в процессах, в результате которых получают варианты маннаназы. Далее варианты данного изобретения относятся в общем случае к использованию вариантов маннаназы для переваривания галактоманнана, в частности для катализа беспорядочного гидролиза манногликозидных связей в маннансвязанных полисахаридах. С успехом варианты маннаназы согласно данному изобретению могут быть использованы при промышленных применениях, которые включают, например, способы ожижения крахмала и для усиления переваривания галактоманнана в продуктах питания и в кормах животных. Предпочтительно варианты маннаназы согласно данному изобретению оказываются полезными и используются в процессах спиртовой ферментации и/или получения спиртов, для экстракции кофе и обработки кофейных отходов, а также в качестве добавок к продуктам питания и кормам, для энзимов, способствующих отбеливанию бумажной пульпы, в качестве отбеливающего и/или шлихтующего агента в текстильной промышленности, для лучшего стимулирования нефти и газа при гидравлическом фракционировании пластов, в качестве детергента, в качестве ингредиентов в пекарном деле, для удаления биопленок и в передающих системах, для переработки зерна или для переработки возобновляемых ресурсов, предназначенных для производства биологического горючего, а также в текстильной промышленности, при бурении нефтяных скважин, при чистке, стирке, при получении детергентов и в промышленности по переработке целлюлозных волокон. Другие варианты данного изобретения относятся к композициям энзимов, включающим описанные здесь варианты маннаназы, при которых композиция энзима оказывается полезной или используется в коммерческих применениях. В одном варианте данного изобретения композиция энзима может быть композицией корма для животных. В другом варианте изобретения композиция энзима может быть использована в процессах гидролизе крахмала (то есть ожижениия) . В одном успешном варианте изобретения варианты и/или композиция энзима могут применяться в процессах спиртовой ферментации. В другом варианте изобретения композиция энзима, включающая маннаназы, охватываемые этим изобретением, включает дополнительные энзимы, такие как фитазы, глюкоамилазы, альфа-амилазы, протеазы,целлюлазы, полуцеллюлазы и их комбинации. Другой вариант данного изобретения относится к способу получения вариантов маннаназы в клетке хозяина путем трансформирования клетки хозяина с помощью ДНК конструкции, предпочтительно включая промотор, обладающий транскрипционной активностью в клетке хозяина, культивирование трансформированной клетки хозяина в походящей культурной среде для разрешения экспрессии указанной маннаназы и получения маннаназы. Способ также включает извлечение полученной маннаназы. В одном из вариантов изобретения клетка хозяина является грибом, подобным Trichoderma, таким как T.reesei, дрожжевой, бактериальной или растительной клеткой. В предпочтительном варианте данного изобретения вариант маннаназы соответствует последовательности SEQ ID4, SEQ ID6, SEQ ID7,SEQ ID8 или SEQ ID9 или вариантам, модифицированным формам, гомологам, слившимся белкам, функциональным эквивалентам или их фрагментам. Прежде чем описать изобретение в деталях, следует понять, что это изобретение не ограничивается отдельными частями компонентов описанного устройства или стадиями процесса описанных способов,поскольку устройства и способы могут варьироваться. Также следует иметь в виду, что использованная здесь терминология взята только для целей описания отдельных вариантов изобретения, и ни в коем случае не является ограничивающей. Следует заметить, что использованные в описании и в формуле изобретения формы единственного числа представляют собой ссылки на единственное число и/или на множественное число, несмотря на то, что контекст может указывать на другое. Кроме того, понятно, что в случае приведения интервалов параметров, которые ограничены цифровыми значениями, считается, что эти интервалы включают и эти ограничивающие значения. Для того чтобы обеспечить исчерпывающее представление изобретения без чрезмерного удлинения описания, заявитель включает в описание в виде ссылок все приведенные выше патенты и патентные заявки, в частности, изобретение WO 2008/009673. Краткое описание фигур На фиг. 1 показана последовательность аминокислот в маннаназе из родительского/дикого типаTrichoderma reesei (последовательность SEQ ID1). На фиг. 2 показана последовательность аминокислот в варианте V-31 маннаназы из Trichodermareesei, открытом в WO 2008/009673 (последовательность SEQ ID2). На фиг. 3 показана последовательность аминокислот в другом варианте V-31/S3R маннаназы изTrichoderma reesei, открытом в WO 2008/009673 (последовательность SEQ ID3). На фиг. 4 показана последовательность аминокислот в улучшенном варианте ТМ-1 маннаназы изTrichoderma reesei согласно данному изобретению (последовательность SEQ ID4). На фиг. 5 показана последовательность нуклеиновых кислот в варианте ТМ-1 маннаназы (последовательность SEQ ID4) согласно данному изобретению (последовательность SEQ ID5). На фиг. 6 показана последовательность аминокислот в другом улучшенном варианте ТМ-100 маннаназы из Trichoderma reesei согласно данному изобретению (последовательность SEQ ID6). На фиг. 7 показана последовательность аминокислот в другом улучшенном варианте ТМ-108 маннаназы из Trichoderma reesei согласно данному изобретению (последовательность SEQ ID7). На фиг. 8 показана последовательность аминокислот в другом улучшенном варианте TM-CBD-148 маннаназы из Trichoderma reesei согласно данному изобретению (последовательность SEQ ID8). На фиг. 9 показана последовательность аминокислот в другом улучшенном варианте ТМ-144 маннаназы из Trichoderma reesei согласно данному изобретению (последовательность SEQ ID9). На фиг. 10 приведено сравнение маннаназы из родительского/дикого типа Trichoderma reesei и S3Rварианта в отношении термической стабильности и активности. На фиг. 11 показана аминокислотная последовательность связывающего целлюлозу домена (СЦД). Детальное описание этого изобретения Открытия, сделанные здесь, представляют собой варианты маннаназы из Trichoderma reesei (EC 3.2.1.78) и нуклеиновой кислоты, кодирующей маннаназы, которые могут быть использованы при промышленных применениях, включая способы гидролиза белков, разложения биомассы и повышения степени переваривания галактоманнана, содержащегося в пищевых продуктах и/или кормах для животных. В частности, используют варианты маннаназы согласно данному изобретению, показывающие особенную улучшенную термическую стабильность, рН/пепсин стабильность и в то же время улучшенную или сохраненную специфическую активность по сравнению с родительским энзимом маннаназой. Эти характеристики делают их специфически полезными для промышленного применения в кормах для животных, в продуктах питания и вообще для разложения галактоманнана в растительном материале. В данном изобретении открыты энзимы с последовательностями аминокислот, которые получены из последовательности аминокислот, показанной в SEQ ID1 или ее вариантов, модифицированных форм, гомологов, слияний белков, функциональных эквивалентов и их фрагментов, или включающие одну или более вставок, стираний или мутаций или любую их комбинацию. Гомологические маннаназы согласно данному изобретению включают любой энзим с идентичностью последовательности, как минимум, 70% или предпочтительно как минимум 80, 85, 90, 95, 97 или 99, предпочтительно к последовательности SEQ ID1, более предпочтительно к последовательности SEQ ID4, SEQ ID6, SEQ ID7, SEQ ID8 или SEQ ID9. Варианты маннаназы данного изобретения имеют активность маннаназы и последовательность аминокислот, которые варьируются, исходя из последовательности аминокислот маннаназы родительского/дикого типа Trichoderma reesei (последовательность SEQ ID1) и включая одну или более вариаций (включая замещения, вставки и стирания). В предпочтительном варианте изобретения последовательность аминокислот вариантов маннаназы включает, как минимум, вариации 201S, 207F и 274L и как минимум одну или более вариаций в одном или более положений, соответствующих положениям 66, 215 и 259 по отношению к последовательности аминокислот SEQ ID1. Например, предпочтительные вариации в вариантах маннаназы можно выбрать из группы, включающей вариации: 66 Р, 215 Т и 259R. Один из предпочтительных вариантов изобретения представляет собой вариант маннаназы согласно последовательности SEQ ID4 или варианты, модифицированные формы, гомологи, слияния белков,функциональные эквиваленты или их фрагменты, или включающие одну или более вставок, стираний или мутаций или любую их комбинацию, а также маннаназы, которые имеют, по крайней мере, минимум процентов идентичности последовательности и/или процентов гомологии по отношению к последовательности маннаназы SEQ ID4, в которой минимальный процент идентичности и/или гомологии составляет как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 75%, как минимум 80%, как минимум 85%,как минимум 90%, как минимум 93%, как минимум 96%, как минимум 97%, как минимум 98% или как минимум 99%. В другом предпочтительном варианте изобретения варианты маннаназы согласно данному изобретению включают дополнительно к вариациям 201S, 207F и 274L и к вариациям в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 66, 215 или 259, а также вариацию в положении 3 и/или 181,соответствующую положению в последовательности аминокислот SEQ ID1. Например, вариация в(181/А/Н). В другом предпочтительном варианте изобретения варианты маннаназы согласно данному изобретению включают вариации 201S, 207F и 274L и, как минимум, вариации в положении 66, 215 и 259 по сравнению с последовательностью аминокислот SEQ. ID1. В предпочтительном примере вариации в положениях 66, 215 и 259, соответственно, представляют собой вариации 66 Р, 215 Т и 259R. В другом варианте изобретения варианты маннаназы включают дополнительно к вариациям 201S,207F и 274L и в положениях 66, 215 и 259 также вариацию в положении, предпочтительно 181 А/Н по сравнению с последовательностью аминокислот SEQ ID1. В предпочтительном варианте изобретения варианты маннаназы дополнительно включают вариации в положении 3, подобные 3R. В одном предпочтительном варианте изобретения последовательности аминокислот вариантов маннаназы согласно данному изобретению включают, как минимум, вариации 201S, 207F и 274L, и как минимум, вариацию в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 66, 215 или 25 9, и одну или более дополнительных вариаций, в которых положениями вариаций являются положения 31, 97, 113, 146, 149, 173, 181, 280, 282, 331 или 344 по сравнению с последовательностью аминокислотSEQ. ID1. Например, вариации представляют собой 31Y, 97R, 113Y, 146Q, 149 К, 173 Н/Т, 181 Н/А,280S/L/R, 282D, 331S или 344D. К предпочтительным вариантам изобретения относятся варианты маннаназы, которые имеют, по крайней мере, минимальный процент идентичности последовательности и/или процент гомологии по отношению к маннаназам согласно данному изобретению, причем, минимальный процент идентичности и/или гомологии составляет как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 75%, как минимум 80%,как минимум 85%, как минимум 90%, как минимум 93%, как минимум 96%, как минимум 97%, как минимум 98% и как минимум 99%. К предпочтительным вариантам изобретения относятся другие варианты маннаназы, которые имеют активность маннаназы и последовательность аминокислот, отличающиеся от последовательности аминокислот маннаназы из родительского/дикого типа Trichoderma reesei (последовательность SEQ ID1), в которых последовательность аминокислот варианта маннаназы включает вариации 201S, 207F и 274L, и вариации выбирают, по крайней мере, из групп, которые включают Вариант данного изобретения также включают варианты любых маннаназ, представленных последовательностями 1-63, которые обладают активностью маннаназы и последовательностью аминокислот,имеющей процент идентичности последовательности и/или процент гомологии как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 75%, как минимум 80%, как минимум 85%, как минимум 90%, как минимум 93%, как минимум 95%, как минимум 96%, как минимум 97%, как минимум 98% и как минимум 99% по сравнению с каждым вариантом маннаназы, представленным последовательностями 1-63. Другие варианты данного изобретения включают молекулы нуклеиновых кислот, выбираемых из группы, которая включает:a) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую варианты маннаназы согласно данному изобретению;b) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую производные вариантов маннаназы согласно данному изобретению, в которых предпочтительно производные одного или более аминокислотных остатков замещены консервативно;c) молекулу нуклеиновой кислоты, которая является фракцией, вариантом, гомологом, производной или фрагментом молекулы нуклеиновой кислоты, представленной последовательностью SEQ ID5;d) молекулу нуклеиновой кислоты, которая способна гибридизоваться с любой молекулой нуклеиновой кислоты а-с при строгих условиях;e) молекулу нуклеиновой кислоты, которая способна гибридизоваться с комплементарной любой из молекул нуклеиновой кислоты а-с при строгих условиях;f) молекулу нуклеиновой кислоты, которая имеет идентичность последовательности как минимум 95% по отношению к любой молекуле нуклеиновой кислоты а-е и кодирует маннаназу,g) молекулу нуклеиновой кислоты, которая имеет идентичность последовательности как минимум 70% по отношению к любой молекуле нуклеиновой кислоты а-е и кодирует маннаназу,h) или комплементарную любой молекуле нуклеиновой кислоты а-g. Другие варианты данного изобретения являются векторами и клетками хозяина, включающими молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют варианты маннаназы согласно данному изобретению. Далее вариантами данного изобретения являются способы приготовления вариантов маннаназы согласно данному изобретению, которые включают выращивание в культуре трансформированных клеток хозяина и выделение модифицированной маннаназы из культуры. Если особо не оговорено, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют то же самое значение, которое обычно понимается специалистами, имеющими отношение к изобретению. В общих словарях Singleton и др., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) предложены объяснения известных специалистам многих терминов, использованных в данном изобретении. Это изобретение не ограничивается примерами способов и материалов, изобретенных в нем, и любые способы и материалы похожие или эквивалентные таковым, которые описаны здесь, могут быть использованы на практике или при тестировании вариантов данного изобретения. Численные интервалы также включают числа, которые определяют интервал. Если особо не оговорено, то последовательности нуклеиновых кислот записываются слева направо в 5'- к 3'- ориентации; последовательности аминокислот записываются слева направо от амино- к карбокси-ориентации, соответственно. Направления, предложенные здесь, не являются ограничивающими для различных аспектов или вариантов данного изобретения, а относятся ко всему описанию в целом. Соответственно, термины, которым дано определение непосредственно ниже, более полно определяются ссылкой на описание в целом. В одном варианте данного изобретения энзимы маннаназы показывают особенно улучшенную термическую стабильность и в то же самое время улучшенную или сохраненную специфическую активность по сравнению с энзимами маннаназы, открытыми в WO 2008/009673. Эти характеристики делают их особенно полезными для промышленного применения, как правило, в кормах для животных, в продуктах питания и для разложения галактоманнана в растительном материале. В связи с этим данное изобретение также относится к способу производства маннаназ в Trichodermareesei, которые активны при низких рН значениях, существующих в желудке и верхней части кишечника животных, а также в зобу, желудке и верхней части кишечника домашней птицы. Другим объектом данного изобретения является получение маннаназы, которая может быть добавлена в корм животных перед гранулированием, для того чтобы создать возможность точной и воспроизводимой дозировки энзима и избежать дополнительной стадии добавления спрея в кормовой препарат. Термин "маннаназа" относится к любому энзиму, который способен гидролизовать полиозные цепи,которые составляют маннозные единицы (маннополимеры или полиманнозы). "Маннаназы" поэтому включает как эндоманнаназы, так и экзоманнаназы, которые расщепляют маннополимеры внутри или у терминальных концов полимера, соответственно. Термин "функциональный эквивалент маннаназы" или "функциональный эквивалент ее" означает,что энзим должен иметь примерно те же самые функциональные характеристики, что и маннаназа изTrichoderma reesei. Термин "модифицированная форма" или "вариант" означает, что энзим был модифицирован из его оригинальной формы (родительский/дикий тип, wt) , но сохраняет те же самые энзиматические функциональные характеристики, что и маннаназа из Trichoderma reesei. Термин "слившиеся белки" охватывает все белки, полученные из родительской маннаназы или любых ее вариантов при ковалентном связывании дополнительных последовательностей аминокислот у Си/или N-концов. Источник и композиция дополнительных последовательностей аминокислот или является естественным из любых живых организмов или вирусов, или является не естественным. Термин "функциональный фрагмент" или "эффективный фрагмент" означает фрагмент или долю маннаназы из Trichoderma reesei, или ее производную, которая сохраняет почти ту же самую энзиматическую функцию или эффект. Термин "гомологичная маннаназа" согласно данному изобретению охватывает любой энзим с идентичностью последовательности, как минимум, 70% или предпочтительно, как минимум, 80%, 85%, 90%,95%, 97% или 99% по отношению к родительской маннаназе. Термин "полинуклеотиды" относится к любому генетическому материалу любой длины и любой последовательности, который включает молекулы ДНК и РНК с единичной нитью и двойной нитью,включая регуляторные элементы, структурные гены, группы генов, плазмиды, целые геномы и их фрагменты. Термин "положение" в полинуклеотиде или полипептиде относится к специфическим единичным основаниям или аминокислотам в последовательности полинуклеотида или полипептида соответственно. Термин "полипептид" включает белки, такие как энзимы, антитела и тому подобные, средней длины полипептиды, такие как пептидные ингибибиторы, цитокины и тому подобные, а также короткие пептиды с длиной последовательности аминокислот меньше десяти, такие как лиганды пептидных рецепторов, пептидные гормоны и тому подобные. Термин "варианты маннаназы" означает любую молекулу маннаназы, полученную при направленном по месту или случайном мутагенезе, встраивании, стирании, рекомбинации и/или любыми другими методами белковой инженерии, которые приводят к маннаназам, отличающимся по их аминокислотным последовательностям от родительской маннаназы. Термин "дикий тип маннаназы", "дикий тип энзима" или "дикий тип" в соответствии с данным изобретением описывает энзим маннаназы с аминокислотной последовательностью, обнаруженной в природе, или ее фрагмент."Родительская маннаназа" может быть или выделенным диким типом маннаназы или ее фрагментом, или одним или более вариантом маннаназы, выбираемым из библиотеки маннаназ. Термин "библиотека маннаназ" описывает, как минимум, один вариант маннаназы или смесь маннаназ, в которой каждая единичная маннаназа, соответственно, каждый вариант маннаназы, закодирован различными полинуклеотидными последовательностями. Термин "генная библиотека" указывает на библиотеку полинуклеотидов, которая кодирует библиотеку маннаназ. Термин "изолированная" описывает любую молекулу, выделенную из ее естественного источника. Термин "мутация" относится к замещению или замене единичного или мультиплетного нуклеотидного триплета, встраиванию или стиранию одного или нескольких кодонов, гомологической или гетерологической рекомбинации между различными генами, слиянию дополнительных кодирующих последовательностей у любого конца кодирующей последовательности, или встраиванию дополнительных кодирующих последовательностей, или любой комбинации этих методов, которая приводит к последовательности полинуклеиновых кислот, кодирующих желательный белок. Термин "мутации" также относится ко всем изменениям в последовательности полипептидов, кодируемой последовательностью полинуклеиновых кислот, которая модифицирована путем одного или более описанных выше изменений. Сокращения названий аминокислотных остатков приведено в таблице 1 в виде однобуквенного или трехбуквенного кода. Термин "молекула нуклеиновой кислоты" или "нуклеиновая кислота" означает любую однонитевую или двухнитевую молекулу нуклеиновой кислоты, которая происходит из сДНК, геномной ДНК, синтетической ДНК или РНК, пептидных нуклеиновых кислот или замкнутых линейных аминокислот. Термин "строгие условия" относится к условиям, при которых проба будет гибридизоваться в ее мишенную последовательность, но ни в какую другую последовательность. Строгие условия зависят от последовательностей и будут различными при различных обстоятельствах. Более длинные последовательности гибридизуются специфически при более высоких температурах. Как правило, строгие условия выбирают такими, чтобы они были примерно на 5 С ниже термической точки плавления (Тпл) для специфической последовательности при заданных ионной силе и рН. Тпл представляет собой температуру(при заданных ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% пробы, комплементарной к мишенной последовательности гибридизуется в мишенную последовательность при равновесии. (Поскольку мишенная последовательность, как правило, присутствует в избытке, при Тпл 50% пробы заняты при равновесии). Типичными строгими условиями будут такие, при которых концентрация соли составляет менее чем около 1,0 M ионов Na, типично от около 0,01 до 1,0 M ионов Na (или других солей) при значениях рН от 7,0 до 8,3 и при температуре, которая как минимум около 30 С для коротких проб (то есть 10-50 нуклеотидов) и при температуре как минимум около 60 С для более длинных проб. Строгие условия могут быть также достигнуты путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид и тому подобные. Термин "фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты" подразумевает указание на нуклеиновую кислоту, которая включает подсистему молекулы нуклеиновой кислоты согласно одной из заявленных последовательностей. То же самое применимо к термину "доля молекулы нуклеиновой кислоты". Термин "вариант молекулы нуклеиновой кислоты" относится здесь к молекуле нуклеиновой кислоты, которая в существенной мере подобна по структуре и биологической активности молекуле нуклеиновой кислоты согласно одной из заявленных последовательностей. Термин "гомолог молекулы нуклеиновой кислоты" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, последовательность которой содержит один или более нуклеотидов добавленных, подвергнутых стиранию,замещению или другой химической модификации по сравнению с молекулой нуклеиновой кислоты согласно одной или более заявленных последовательностей, в каждом случае при условии, что гомологи сохраняют, по существу, те же самые связывающие свойства, что и последний. Термин "производная", используемый здесь, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая имеет похожие связывающие характеристики по отношению к мишенным последовательностям нуклеиновых кислот, таким как молекулы нуклеиновой кислоты согласно одной из заявленных последовательностей. Таблица 1. Сокращения названий аминокислот Мутации или вариации описаны с использованием следующей номенклатуры обозначений: положение; замещенный, замещающий аминокислотный остаток(и). Согласно этой номенклатуре замещение,например, аланинового остатка на глициновый остаток в положении 20 показано как 20G. В том случае,когда аминокислотный остаток в заданном положении замещен двумя или более альтернативными аминокислотными остатками, то эти остатки разделены запятой или косой вертикальной чертой. Например,замещение аланина в положении 20 или глицином, или глутаминовой кислотой указывается как 20G/E,или 20G, 20 Е. Кроме того, также используется следующая номенклатура обозначений: аминокислотный остаток в конструкции белка; положение; замещенный, замещающий аминокислотный остаток(и). Согласно этой номенклатуре замещение, например, аланинового остатка на глициновый остаток в положении 20 указывается как Ala20Gly или A20G, или 20G. Стирание аланина в том же положении указывается как А 1 а 20 или А 20. Встраивание дополнительного аминокислотного остатка (например, глицина) указывается какAla20AlaGly или A20AG. Стирание последовательного промежутка аминокислотных остатков (например, между аланином в положении 20 и глицином в положении 21) указывается как (Ala20-Gly21) или(A20-G21). В том случае, когда последовательность имеет стирание по сравнению с родительским бел-9 023087 ком, использованным для нумерации, встраивание в такое положение (например, аланина в стертое положение 20) указывается как 20 А 1 а или 20 А. Мультиплетные мутации разделяются знаком плюс или наклонной чертой. Например, две мутации в положениях 20 и 21 с замещением аланина и глутаминовой кислоты на глицин и серии, соответственно, указывается как A20G+E21S или A20G/E21S. В том случае,когда аминокислотный остаток в заданном положении замещен двумя или более альтернативными аминокислотными остатками, то эти остатки разделены запятой или наклонной чертой. Например, замещение аланина в положении 20 или глицином, или глутаминовой кислотой указывается как A20G,E илиA20G/E, или A20G, А 20 Е. В том случае, когда положение, подходящее для модификации, идентифицировано здесь без указания какой-либо специфической модификации, должно быть понятно, что аминокислотный остаток может быть замещен аминокислотным остатком, присутствующим в положении. Так,например, когда имеется в виду модификация аланина в положении 20, но она не специфицирована, то под этим следует понимать, что аланин может быть удален или замещен любым другим аминокислотным остатком (например, одним из R, N, D, С, Q, E, G, H, I, L, К, М, F, Р, S, Т, W, Y и V). Термин "консервативная мутация" или "консервативное замещение", соответственно, относится к мутации аминокислоты, которую специалисты рассматривают, как консервативную по отношению к первой мутации. "Консервативная" в этом контексте означает похожая аминокислота в терминах аминокислотных характеристик. Если, например, мутация приводит в специфическом положении к замещению не алифатического аминокислотного остатка (например, Ser) на алифатический аминокислотный остаток(например, Leu), то последующее замещение в том же самом положении различными алифатическими аминокислотными остатками (например, Ile или Val) относят к консервативным мутациям. Другие характеристики аминокислот включают размер остатка, гидрофобность, полярность, заряд, pK-значение, а также другие характеристики аминокислот, известные специалистам. Соответственно, консервативная мутация может включать замещения, такие как основные на основные, кислотные на кислотные, полярные на полярные и т.д. Желательно, чтобы группы аминокислот, полученные таким образом, были сохранены по структурным причинам. Эти группы могут быть описаны в виде диаграммы Венна (Venn)(смотри статью Livingstone CD. и Barton G.J., (1993), "Выверка белковых последовательностей: стратегия для иерархического анализа сохранения остатков" в журнале Comput. Appl Biosci. 9: 745-756; статьюTaylor W.R., (1986), "Классификация сохранения аминокислот" в журнале J. Theor. Biol. 119; 205-218). Консервативное замещение можно провести, например, согласно приведенной ниже таблице, которая описывает общепринятую диаграмму Венна по группировке аминокислот. Таблица 2. Диаграмма Венна разделения по группам аминокислот Термин "каталитическая активность" или "активность" количественно описывает конверсию заданного субстрата при определенных условиях реакции. Термин "остаточная активность" означает отношение каталитической активности энзима при отличной группе условий к каталитической активности энзима при определенной заданной группе условий. В связи с этим остаточная активность ai задается выражением ai = vi/v0, где v означает меру каталитической активности и ai100 означает относительную активность в процентах. Термин "удельная активность" описывает количественно каталитическую активность по отношению к количеству энзима при определенных условиях реакции. Термин "термостабильность", "температурная стабильность" или "термическая стабильность" описывает способность белка по выдерживанию ограниченной экспозиции при нагреве без потери его активности при более низких температурах, то есть при температуре, при которой может быть измерена его активность. Термин "рН-стабильность" описывает способность белка по выдерживанию ограниченной экспозиции при рН-значениях, которые значительно отклоняются от рН-значений, при которых его стабильность оптимальна, то есть более чем на одну рН-единицу выше или ниже оптимального рН-значения, без потери его активности при условиях, при которых может быть измерена его активность. Термин "протеолитическая стабильность" описывает способность белка по выдерживанию ограниченной экспозиции с протеазами при условиях, в которых протеазы являются активными, без потери активности при условиях, при которых может быть измерена его активность. Термин "плазмид", "векторная система" или "экспрессионный вектор" означает генную конструкцию, способную к эспрессии in vivo или in vitro. В контексте данного изобретения эти генные конструкции могут быть использованы для введения генов, кодирующих энзимы, в клетки хозяина. Термин "клетка хозяина" согласно данному изобретению включает любую клетку, которая содержит или молекулу нуклеиновой кислоты, или экспрессионный вектор, как описано выше, и которая используется при рекомбинантном получении энзима, имеющего специфические свойства, как описано здесь или в способах данного изобретения."Температура пассивности" определяется как температура, при которой остаточная активность энзима маннаназы после инкубирования с определенной продолжительностью и последующего охлаждения до комнатной температуры составляет 50% от остаточной активности того же энзима маннаназы,инкубированного с той же продолжительностью, при тех же условиях при комнатной температуре. Термин "возобновляемые ресурсы" относится к субстратам биомассы, которые выращивают с последующей уборкой урожая, таким как урожай на корню, солома, древесина и продукты переработки древесины. Термин "биологическое горючее" относится к твердому, жидкому или газообразному горючему, состоящему из биомассы или полученному из биомассы, такому как биодизель, биогаз, растительное масло, биоэтанол, биоводород, био-диметиловый эфир, биометанол, БВЖ ("биомасса в жидкость") топливо, ГВЖ ("газ в жидкость") - топливо и тому подобные. Термин "их функциональные эквиваленты" означает, что энзим обладает почти теми же самыми характеристиками, что и маннаназа из Trichoderma reesei. Термин "модифицированная форма" или "вариант" означает, что энзим был модифицирован из его оригинальной формы, но сохраняет те же самые энзиматические функциональные характеристики, что и маннаназа из Trichoderma reesei. В частности, термин "вариант" или "модифицированная форма" охватывает энзим маннаназу с аминокислотной последовательностью, полученной из аминокислотной последовательности родительского/дикого типа маннаназы, имеющей одно или более аминокислотных замещений, встраиваний, стираний или любой их комбинации, которые вместе относятся к мутациям."Слившиеся белки" охватывают все белки родительской маннаназы или любые их варианты, полученные путем ковалентного присоединения дополнительной аминокислотной последовательности к Си/или N-концу родительской маннаназы."Процент идентичности последовательности" по отношению к двум аминокислотным или полинуклеотидным последовательностям относится к количеству процентов аминокислотных остатков, которые идентичны в двух последовательностях в том случае, когда последовательности оптимально сходны. Так,80% идентичности аминокислотной последовательности означает, что идентичны 80% аминокислот в двух оптимально сходных полипептидных последовательностях. Процент идентичности можно определить, например, при прямом сравнении информации о последовательности по двум молекулам путем выравнивания последовательностей, подсчета точного числа совпадений между двумя выравниваемыми последовательностями, деления на длину более короткой последовательности и умножения результата на 100. Для помощи при анализе можно использовать легко доступные компьютерные программы, такие как ALIGN, Dayhoff, M.O. в "Atlas of Protein Sequence and Structure", M.O. Dayhoff и др., Suppl. 3:353-358,National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, которые адаптируют алгоритм локальной гомологии, предложенный в статье Smith и Waterman, (1981), Advances in Appl. Math. 2:482-489 для анализа пептидов. Программы для определения идентичности нуклеотидных последовательностей приведены вWisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 (можно приобрести у Genetics Computer Group, Madison,WI), например, программы BESTFIT, FASTA и GAP, которые также опираются на алгоритмы Смита(Smith) и Ватермана (Waterman). Эти программы просто применяются с параметрами отклонения 5, которые рекомендованы составителями программ и описаны в Wisconsin Sequence Analysis Package, на которую сделана ссылка выше. К примерам алгоритма, который пригоден для определения сходства последовательностей, относится алгоритм BLAST, который описан в статье Altschul и др., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Программное обеспечение для проведения BLAST анализа публично доступно и его можно получить из Национального Центра по Биотехнологической Информации (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Аналогично, компьютерные программы для определения процента гомологии, также легко доступны. Термины "корма" и "продукты питания", соответственно, означают любые природные или искусственные диеты, пищу и тому подобное или компоненты такой пищи, предназначенные или пригодные для поедания, принятые вовнутрь, переваренные животными или людьми соответственно."Пищевые или кормовые добавки" представляют собой соединение или многокомпонентную композицию, предназначенную или пригодную для добавления в пищевые продукт или корма. Они могут включать, но это не обязательно, одно или более соединений, таких как витамины, минералы или усиливающие пищу энзимы и подходящие носители и/или наполнители, и их обычно получают в виде, который подходит для добавления к кормам животных. Модифицированные формы или варианты могут проявлять измененные энзимные характеристики по сравнению с родительским энзимом. Предпочтительные, модифицированные формы или варианты имеют один или более следующих усиленных фенотипов: увеличенную термостабильность; и/или увеличенную протеолитическую стабильность (например, по отношению к пепсину); и/или увеличенную специфическую активность и/или улучшенную стабильность при низких значениях рН. Термин "функциональный" или "эффективный" фрагмент означает фрагмент или долю маннаназы из Trichodermareesei, который сохраняет примерно ту же самую энзиматическую функцию или эффект. Также понятно,что данное изобретение включает все молекулы, которые получены из родительской маннаназы, и все варианты ее, описанные в этом описании, которые получены путем посттрансляционного процессирования, сравнимого с генетическим кодированием аминокислотной последовательности. Эти посттрансляционные модификации включают, однако не ограничиваются ими, протеолитический разрыв Nконечных последовательностей, таких как ведущие и/или пропоследовательности, протеолитическое удаление расширений у С-конца, N- и/или О-гликозилирование, липидирование, ацилирование, деамидирование, образование пироглутамата, фосфорилирование и/или другое, или любую их комбинацию,как это происходит во время получения/экспрессии с помощью нативного хозяина или любого другого подходящего экспрессионного хозяина. Эти пост-трансляционные модификации могут оказывать или не оказывают влияние на физические или энзиматические свойства энзимов, которые применяют здесь. Предпочтительно указанные изменения ведут к улучшенным свойствам энзима, таким как: 1) более высокая термостабильность, и/или 2) более специфическая активность, и/или 3) улучшенная стабильность при низких значениях рН, и/или 4) более высокая устойчивость по отношению к протеолитическому разрыву под воздействием протеазы, такой как пепсин, и/или 5) высокая остаточная активность при низких значениях рН. В предпочтительном варианте данного изобретения модифицированная маннаназа имеет замещения в одном или более положений 201, 207, 274, 66, 215, 259, 31, 97, 113, 146, 149, 173, 181, 280, 282, 331 и 344 относительно нумерации в родительской/дикого типа маннаназе, приведенной в последовательности SEQ ID1. Эти положения характеризуются тем, что мутагенез энзима в этих положениях ведет к улучшению желательных характеристик энзима. Еще в основном несколько аминокислотных замещений по отношению к родительской/дикого типа маннаназе привели к улучшению в терминах термостабильности как самой по себе, так и/или в комбинации с другими. Эти замещения показаны в табл. 3. Кроме того, несколько аминокислотных замещений приводят, как выяснилось, к очень успешным изменениям рН стабильности, стабильности по отношению к протеазе (в особенности к пепсину) и/или специфической активности. Эти замещения показаны в табл. 4. Согласно другому аспекту изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты и к использованию молекулы нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, которая включает:(a) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированную маннаназу согласно приведенному выше описанию;(b) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую производную модифицированной маннаназы согласно приведенному выше описанию, в которой производные одного или более аминокислотных остатков консервативно замещены;(d) молекулу нуклеиновой кислоты, которая представляет собой вариант, гомолог, производную или фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты, представленный последовательностью SEQ ID5;(e) молекулу нуклеиновой кислоты, которая комплементарна молекуле нуклеиновой кислоты, представленной последовательностью SEQ ID5;(f) молекулу нуклеиновой кислоты, которая комплементарна варианту, гомологу, производному или фрагменту молекулы нуклеиновой кислоты, представленной последовательностью SEQ ID5;(g) молекулу нуклеиновой кислоты, которая способна гибридизоваться в молекулу нуклеиновой кислоты, представленную последовательностью SEQ ID5;(h) молекулу нуклеиновой кислоты, которая способна гибридизоваться в вариант, гомолог, производное или фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты, представленную последовательностью SEQ ID5;(i) молекулу нуклеиновой кислоты, которая комплементарна молекуле нуклеиновой кислоты и которая способна гибридизоваться в молекулу нуклеиновой кислоты, представленную последовательностью SEQ ID5;(j) молекулу нуклеиновой кислоты, которая комплементарна молекуле нуклеиновой кислоты и которая способна гибридизоваться в вариант, гомолог, производное или фрагмент молекулы нуклеиновой(k) молекулу нуклеиновой кислоты, которая способна к гибридизации в комплементарную молекулу нуклеиновой кислоты, представленную последовательностью SEQ ID5;(l) молекулу нуклеиновой кислоты, которая способна к гибридизации в комплемент варианта, гомолога, производной или фрагмента молекулы нуклеиновой кислоты, представленную последовательностью SEQ ID5;(m) молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую идентичность последовательности как минимум 95% с любой из молекул нуклеиновой кислоты а)-b) и кодирующую маннаназу;(n) молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую идентичность последовательности как минимум 70% с любой из молекул нуклеиновой кислоты а)-b) и кодирующую маннаназу; и/или(о) долю или комплемент любых молекул нуклеиновой кислоты а)-n). Считается, что нуклеотид или нуклеиновая кислота способны гибридизоваться в один из приведенных выше нуклеотидов, если они способны гибридизоваться в условиях строгости среды, более предпочтительно высокой строгости, еще более предпочтительно в условиях очень высокой строгости. Для приготовления гибридизационного блота могут быть использованы существующие в молекулярной биологии стандартные протоколы для блоттинга (например, Соузерн блоттинг для ДНК гибридизаций). Количество мишенных ДНК зависит от относительного изобилия мишенных последовательностей. В том случае, когда используют чистую мишенную последовательность, предпочтительно использование от 1 до 5 пикограмм (пг) ДНК на тысячу оснований полинуклеотидов. Типично предел детектирования составляет около 0,5 пг ДНК для радиоактивной пробы со специфической активностью 109 распадов в минуту/мг, что является эквивалентным единичной копии гена длиной 500 пар нуклеотидных оснований в 3,3 мг геномного ДНК комплексного генома (то есть человека). На практике обычно используют около 10 мг геномного ДНК - например, для того чтобы экранировать организмы, такие как микроорганизмы, которые содержат маннаназу, кодирующую полинуклеотид данного изобретения. Если мишенная ДНК является бактериальной или плазмидной, следует соответственно разбавить ДНК во избежание превышения экспозиции. Мишенная ДНК блоттируется, например, путем точечного блоттирования или путем блоттирования электрофорезным гелем. Предпочтительные условия описаны в 'MembraneTransfer and Detection Methods, Amersham International plc, UK.-PI/162/85/1) предпочтительно используется гибонд (Hybond) N+ положительно заряженная найлоновая мембрана (Amersham Life Science). Пробу предпочтительно приготавливают в соответствии с Pharmacia's 'Ready to Go DNA labeling kit' для приготовления пробы с более 1109 распадов в минуту/мкг. Пробу используют в гибридизационном буфере при концентрации 1106 распадов в минуту на миллилитр гибридизационного буфера. Блоты предпочтительно прегибридизуют в гибридизационном буфере (6SSC, 5 раствор Рейнгардта (Reinhardt), и 0,5%SDS, и денатурированной спермы лосося ДНК к 100 мг/мл буфера) в течение 1 ч при температуре 65 С,после которой следует гибридизация в гибридизационном буфере, содержащем денатурированную меченную пробу, при встряхивании в течение 12 ч при температуре 65 С. Блот(ы) затем промывают подходящим объемом буфера для промывки (типично 50 мл) в 2SSC, 0,1% SDS в течение 30 мин при температуре 65 С, затем следует второе промывание подходящим объемом буфера для промывки (типично 50 мл) или в том же самом буфере для промывки (2SSC, 0,1% SDS) для строгости среды промывания, или в 0,1%SSC, 0,1% SDS в течение 10 мин при температуре 65 С (высокая строгость), второе промывание можно повторить при температуре 70 С для очень высокой строгости промывания. Молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения может включать нуклеотидные последовательности, которые кодируют последовательность SEQ ID1 или ее эффективный фрагмент или вариант, модифицированную форму, гомолога или их производное. В частности, в изобретении предлагается плазмидная или векторная система, включающая нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую маннаназу, описанную здесь, или ее гомолога или производное. Предпочтительно плазмидная или векторная система включает нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID4 или последовательность, которая как минимум на 75% гомологична ей, или ее эффективный фрагмент, или любую производную последовательности SEQ ID1, описанную здесь. Подходящими плазмидными или векторными системами является экспрессионный вектор для экспрессии любого из энзимов, кодируемого нуклеиновокислотной последовательностью, такой как представленная любой последовательностью SEQ ID4 или последовательностью, которая как минимум на 75% гомологична (идентична) ей в микроорганизме. Подходящие экспрессионные векторы описаны здесь. Кроме того, в изобретении предлагается плазмидная или векторная система для экспрессии любого из модифицированных энзимов или вариантов,или функциональных фрагментов, описанных здесь. Подходящие экспрессионные векторы описаны здесь. Улучшения характеристик маннаназы согласно данному изобретению предназначены для использования в ряде технических процессов, таких как, но не ограничивая, использование в качестве добавок к продуктам питания и кормам, использование в процессе получения продуктов питания и кормов, при производстве пульпы и бумаги, а также для стимулирования нефтяных/газовых скважин при гидравличе- 13023087 ском фракционировании пластов, при создании медленно высвободающих препаратов лекарств или дезинфицирующих средств, в частности, при удалении бактериалной биопленки. В частности, улучшения направлены на улучшение стабильности энзима при условиях этих или других применений и/или для стабильности во время прохождения желудка в случае пищевых или кормовых добавок, и/или для активности или стабильности в желудке человека или животных и/или кишечном тракте при кислотных условиях верхнего желудочнокишечного тракта. Такие улучшения включают наряду с другими параметрами увеличение стабильности при повышенной температуре, предпочтительно при температуре выше 60 С и/или увеличение стабильности по отношению к протеолитическому перевариванию, предпочтительно против протеаз пищеварительного тракта и/или увеличение стабильности при низких значениях рН и/или активности при низких значениях рН и/или общей эффективности высвобождения маннозы и/или олигоманнозы из углеводов, содержащих большие полиманнозы. Увеличение стабильности при повышенной температуре количественно оценивается температурой пассивности энзима. Температура пассивности определяется как температура, при которой остаточная активность энзима маннаназы после инкубирования в течение определенного времени и последующего охлаждения до комнатной температуры составляет 50% от остаточной активности того же энзима маннаназы, инкубированного в течение того же промежутка времени и при тех же условиях при комнатной температуре. Различия термостабильности представляют собой разности в С температур пассивности двух энзимов. В предпочтительном варианте изобретения варианты маннаназы применяются в процессах при повышенных температурах, что делает вариант маннаназы с более высокой температурой пассивности более желательным. Если сравнить с диким типом маннаназы, то маннаназы изобретения характеризуются более высокой остаточной активностью после термического инкубирования при температурах более высоких, чем температура пассивности дикого типа маннаназы, обеспечивая более высокую стабильность процесса. Клонирование маннаназы из T. reesei: В дополнение к маннаназе из Trichoderma reesei, соответствующей последовательности SEQ ID1, была клонирована другая маннаназа из Trichoderma reesei, соответствующая последовательности SEQID1, с замещением серина на аргинин в положении 3 (мутация S3R). Этот вариант маннаназы сравнивали с маннаназой из Trichoderma reesei согласно последовательности SEQ ID1 на предмет их термической стабильности и каталитической активности при высвобождении маннозы из субстрата содержащего полиманнозу. Результаты, представленные на фиг. 10, показывают, что S3R замещение не оказывает влияния на свойства, связанные с изобретением, и поэтому является нейтральной мутацией (смотри также WO 2008/009673). В связи с этим в контексте данного изобретения термины "дт" или "дт маннаназа", "дикий тип маннаназы", или "маннаназа из Trichoderma reesei" следует понимать, как включающие маннаназы согласно последовательности SEQ ID1, а также маннаназы согласно последовательностиSEQ ID1, дополнительно имеющие нейтральную мутацию S3R. Термостабильность в буфере: В предпочтительном варианте изобретения вариант маннаназы имеет повышенную остаточную активность и/или температуру пассивности, когда инкубируют при температуре более 60 С в течение более 30 мин. В более предпочтительном варианте изобретения повышенную остаточную активность и/или температуру пассивности получают после инкубирования в ацетатном буфере в течение 45 мин. Предпочтительно, когда температура пассивности варианта маннаназы составляет более 68 С, более предпочтительно более 70 С или более 72 С, или более 74 С, или еще более предпочтительно составляет более 84 С. Специфические температуры пассивности приведены в табл. 3 в связи с их соответствующими мутациями. Слияние белков: Также понятно, что аминокислотная последовательность, обнаруженная в последовательности SEQID1 и ее производных, описанная здесь для использования согласно данному изобретению, может быть получена, как слияние белка у N-и/или С-конца, например, для содействия экстракции, детектированию, и/или очистке, и/или для добавления функциональных свойств молекуле маннаназы. Партнером для слияния белка может быть любой белок или полипептид, включающий любую полипептидную последовательность, полученную из нативного хозяина, любую другую встречающуюся в природе аминокислотную последовательность, а также синтетическую последовательность. К примерам белковых партнеров для слияния относятся, но ни в коем случае не ограничиваются ими, глутатион-S-трансфераза(GST), 6His, GAL4 (связывающие и/или активирующие транскрипцию домены ДНК), FLAG-, MYCметки или другие метки, хорошо известные специалистам. Может оказаться удобным введение места протеолитического разрыва между белковым партнером слияния и представляющей интерес белковой последовательностью, позволяющее удаление слившейся белковой последовательности. Предпочтительно, когда слившийся белок не мешает активности представляющей интерес белковой последовательности. В предпочтительном варианте изобретения варианты маннаназы сливаются с функциональными доменами, включая более тяжелые пептиды, пропептиды, связывающие домены или каталитические до- 14023087 мены. Связывающие домены могут включать, однако не ограничиваются ими, связывающие углеводы домены различной специфичности, придающие увеличенное сродство к углеводным компонентам, которое присутствует во время применения маннаназы. Также сделано предположение, что партнерский по слиянию домен может включать энзиматически активные домены, которые поддерживают активность действия маннаназы при получении желательного продукта, путем обеспечения активности одного или более компонентов субстрата и/или любого продукта каталитической реакции маннаназы. Не ограничивающие примеры каталитических доменов включают целлюлазы, полуцеллюлазы, такие как ксиланаза, экзоманнаназы, глюканазы, арабиназы, галактозидазы, пектиназы и/или другие активности, такие как протеазы, липазы, кислотные фосфатазы и/или другие функциональные фрагменты их. Линкеры: Слившиеся белки при необходимости могут быть связаны с маннаназой с помощью связывающей последовательности, включающей предпочтительно менее чем 100 аминокислот, более предпочтительно менее чем 50 аминокислот, менее чем 30 аминокислот или менее чем 20 аминокислот. Линкер может просто связать маннаназу и сливающийся домен, не оказывая значительного влияния на свойства любого компонента, или может при необходимости иметь функциональное значение для предусмотренного применения в связи с его аминокислотной композицией, структурой и/или посттрансляционной модификацией, появляющейся во время экспрессии в нативном хозяине или в любом подходящем гетерологическом хозяине. Источником линкерной последовательности может быть аминокислотная последовательность из любого организма или любой синтетической пептидной последовательности. Дополнитель ные белки: Описанные здесь маннаназы для использования согласно данному описанию могут быть использованы в соединении с одним или более дополнительных белков, представляющих интерес (БПИ), или нуклеотидных последовательностей, представляющих интерес (НППИ). Неограничивающие примеры БПИ включают фитазы, полуцеллюлазы, альфа-галактозидазы, бетагалактозидазы, лактазы, бета-глюканазы, эндо-бета-1,4-глюканазы, целлюлазы, ксилозидазы, ксиланазы,ксилоглюканазы, ксилан ацетил-эстеразы, галактаназы, экзо-маннаназы, пектиназы, пектинлиазы, пектинэстеразы, полигалактуроназы, арабиназы, рамногалактуроназы, лакказы, редуктазы, оксидазы, фенолоксидазы, лигниназы, протеазы, амилазы, фосфатазы, липолитические энзимы, кутиназы и/или другие. Они включают энзимы, которые, например, модулируют вязкость субстрата раствора/суспензии или увеличивают доступность и/или растворимость полиманнозного субстрата. НППИ может быть также антисенс последовательностью для любых таких последовательностей. Как описано выше, БПИ может также быть слившимся белком. БПИ может также слиться с секреционной последовательностью. В предпочтительном варианте изобретения вариант маннаназы согласно данному изобретению используется в соединении, как минимум, с фитазой. Другие последовательности могут также облегчать секрецию или увеличивать выход секретированного БПИ. Такие последовательности кодируют сопровождающие белки, такие как, например, продуктAspergillus niger сур В гена, описанный в английской патентной заявке UK 9821198.0. НППИ кодирование БПИ может быть организовано для того, чтобы изменить активность этого белка по ряду причин, включая, но не ограничивая, изменения, которые модифицируют обработку и/или экспрессию его экспрессионного продукта. В качестве другого примера, БПИ может быть также модифицирован для оптимизации экспрессии в определенной клетке хозяина. Другие изменения последовательности могут оказаться желательными для того, чтобы ввести опознавательные места ограничительного энзима. НППИ кодирование БПИ может включать в себя синтетические или модифицированные нуклеотиды - такие как метилфосфонатные и фосфоротиоатные основные цепи. НППИ кодирование БПИ может быть модифицировано для увеличения внутриклеточной стабильности и времени полураспада. Возможные модификации включают, но не ограничиваются ими, добавление боковых последовательностей у 5' и/или 3" концов молекулы или использование фосфоротиоатных или 2' О-метильных связей предпочтительнее чем сложных фосфордиэфирных связей внутри основной цепи молекулы. Экспрессия генов маннаназы: Для того чтобы получить энзим маннаназы, ДНК, кодирующую энзим, можно химически синтезировать из опубликованных последовательностей или получить напрямую из клеток хозяина, приютивших ген (например, путем отбора из библиотеки сДНК или PCR расширения). Ген маннаназы может быть включен в экспрессионную кассету и/или клонирован в подходящий экспрессионный вектор с помощью стандартной техники молекулярного клонирования. Такие экспрессионные кассеты или векторы часто содержат последовательности, которые поддерживают инициирование и окончание транскрипции(например, промоторы и завершатели) и могут содержать выбираемые маркеры. Кассеты также могут быть включены в плюс или минус нить mPHK, и их экспрессия может включать или не включать стадию расширения перед трансляцией mPHK. Подлежащий экспрессии ген маннаназы может содержать или не содержать определенные домены белка, такие как домены, связывающие полимеры (например, домены,связывающие углеводы) различных спецификаций. Экспрессионная кассета или вектор могут быть вве- 15023087 дены в подходящую экспрессионную клетку хозяина, которая затем будет вызывать экспрессию соответствующего гена маннаназы. Особенно подходящими экспрессионными хозяевами являются бактериальный экспрессионный хозяйский ген, включающий эшерихию (например, Escherichia coli), псевдомонасcarnosus), лактококкус (например, Lactococcus lactis), бактерию молочной кислоты или или бациллус(Bacillus (subtilis, megaterium, licheniformis, и т.д Также особенно подходят дрожжевые экспрессионные хозяева, такие как Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomycespombe, Yarrowialipolytica, Hansenula-polymorpha, Kluyveromyceslactis или Pichiapastoris. Особенно подходят грибные экспрессионные хозяева, такие как Aspergillusniger, Chrysosporiumlucknowense, Aspergillus (например, A. oryzae, A. niger,A. Nidulans и т.д.) или Trichoderma reesei. Также подходят млекопитающие экспрессионные хозяева, такие как клеточные линии мышей (например, NS0), яичника китайского хомяка (СНО) или почек детеныша хомяка (ВНК), трансгенные системы млекопитающих, таких как кролики, козы или крупный рогатый скот, другие эукариотические хозяева, такие как клетки насекомых или вирусные экспрессионные системы, например, такие как бактериофаги подобные М 13, Т 7 фаг или ламбда, или вирусы, такие как бакуловирусная (Baculovirus) экспрессионная система или растения. Гены маннаназы, введенные в экспрессионные клетки хозяина путем ряда методов трансформации,включая, но не ограничиваясь ими, электропорацию, поддержанную липидами трансформацию или трансфекцию ("липофекцию"), химически опосредованную трансфекцию (например, CaCl и/или СаР),опосредованную ацетатом лития трансформацию (например, протопластов клетки хозяина), биобаллистическую трансформацию с использованием "генной пушки", ПЭГ(полиэтиленгликоль)опосредованную трансформацию (например, протопластов клетки хозяина), слияния протопласта (например, используя бактериальные или эукариотические протопласты), липозомой опосредованную трансформацию, Agrobacterium tumefaciens, аденовирусную или другую вирусную или фаговую трансформацию или трансдукцию. Альтернативно варианты энзимов подвергаются экспрессии внутриклеточно. При необходимости после внутриклеточной экспрессии вариантов энзимов или секреции в периплазменное пространство с использованием сигнальных последовательностей, которые упомянуты выше, может быть использована стадия просачивания или разрушения для секреции энзима маннаназы в надосадочную жидкость. На разрыв мембранного барьера можно воздействовать, используя механические воздействия, такие как ультразвуковые волны, обработку давлением (французский пресс), кавитацию или используя энзимы, способствующие перевариванию мембраны, такие как лизозимы или смеси энзимов. В качестве другой альтернативы гены, кодирующие энзим маннаназы, подвергают экспрессии в отсутствии клеток с использованием подходящей свободной от клеток экспрессионной системы. Например, используют для этих целей линию S30, экстрагированную из клеток Escherichia coli, или имеющуюся в продаже систему (например, CECF технологию фирмы Roche Applied Science, Inc.). В свободных от клеток системах представляющий интерес ген типично транскрибируют с помощью промотора, однако связывание для образования циркулярного экспрессионного вектора делается при необходимости. РНК можно таким образом быть экзогенно добавлена или генерирована без транскрипции и трансляции в свободной от клеток системе. Конфигурации экспрессионных конструкций для in vitro экспрессии и оформления всех приведенных выше экспрессионных систем находится в пределах компетенции специалистов. Приведенные выше способы клонирования генов маннаназы из Trichoderma reesei пригодны как для экспрессии в промышленных масштабах, так и для использования в высокой степени проведенных отборах для определения мутированных вариантов. Очистка: Как описано выше, белки маннаназы могут быть экспрессированы в различных экспрессионных системах и могут быть отобраны согласно подходящим процедурам обработки вниз по потоку и очистки. Представляющий интерес белок может быть подвергнут секреции во внеклеточном или периплазмическом пространстве или экспрессирован внутриклеточно. В одном из предпочтительных вариантов изобретения вариант маннаназы экспрессирован в микробном хозяине и белок подвергается секреции в периплазмическом или внеклеточном пространстве. Клетки, которые экспрессируют варианты маннаназы,сохраняют методами, хорошо известными специалистам, такими как, но не ограничивая, замораживание. Культуры экспрессионного организма приготавливают в подходящем объеме с помощью стандартных способов ферментации. В предпочтительном варианте изобретения культуры для экспрессии белка инокулируют из замороженного состояния и объем культуры увеличивают последовательно в подходящих контейнерах. В предпочтительном варианте клетки выращивают при ферментативных и при необходимости ростовых условиях, таких как рН, температура, снабжение кислородом и/или питательными веществами, которые контролируются. Первая стадия очистки включает отделение клеток от надстоящей жидкости с использованием одной или нескольких различных технологий, таких как осаждение, микрофильтрование, центрифугирование, хлопьеобразование или другие. В предпочтительном варианте изобретения применяется способ микрофильтрования. В случае внутриклеточной экспрессии клетки, подлежат обработке, которая приводит к освобождению белка из внутриклеточного пространства. Такие обработки могут включать, например, давление, энзиматическую обработку, осмотический шок,- 16023087 ботки могут включать, например, давление, энзиматическую обработку, осмотический шок, замораживание, ультразвуковую или другую обработку для получения клеточного экстракта, который может быть или не может быть предметом дальнейшей очистки. В предпочтительном варианте изобретения белок секретируют в надстоящую жидкость и не обязательная стадия очистки включает концентрирование надстоящей жидкости путем ультрафильтрования. Дальнейшая очистка белка из надстоящей жидкости или концентрированной надстоящей жидкости может быть проведена одним или несколькими различными способами, включающими экстракционные способы или способы фракционирования, такие как осаждение с помощью сульфата аммония или этанола, или кислоты, или хроматографические способы, включая, но не ограничиваясь ими, ионный обмен,гидрофобное взаимодействие, гидроксилапатит, фракционирование по размерам путем гельфильтрования, фосфоцеллюлозная или лектиновая хроматография и хроматография по химическому сродству или любая их комбинация. В более предпочтительном способе родственно меченый белок чистят с помощью хроматографии металл-хелатного сродства для получения высокочистого белка. Предпочтительный способ очистки приводит к чистоте белка более 30%, более предпочтительный способ очистки приводит к чистоте белка более 50%, более 60%, более 70% или 80%. В еще более предпочтительном способе достигается чистота белка более 90%, а в еще одном предпочтительном способе достигается чистота белка более 95% и в наиболее предпочтительном способе достигается чистота белка более 98%. В другом предпочтительном варианте изобретения надстоящая жидкость или частично очищенная путем ультрафильтрования надстоящая жидкость, или концентрированная и/или диафильтрованная надстоящая жидкость высушивается одним или несколькими техническими способами, такими как, но не ограничиваясь ими, сушка при разбрызгивании, лиофилизация, выпаривание при движении от центра к периферии, тонкослойное выпаривание, выпаривание центрифугированием, сушка на транспортере или любая их комбинация. В другом предпочтительном варианте изобретения ферментированную суспензию клеток, включающую экспрессированный вариант маннаназы, сушат как целое, используя такие процессы как, но не ограничиваясь ими, сушка в флюидизованном ложе, сушка на транспортере, сушка при разбрызгивании или барабанная сушка, или любую их комбинацию. Виды препаратов: Как правило, композиции маннаназы или любых ее производных, описанных здесь, могут быть или жидкими, или сухими. Жидкие композиции могут включать одну только маннаназу или в комбинации с другими белками или энзимами и могут содержать добавки, которые поддерживают стабильность и/или активность маннаназы или других белков или энзимов в композиции. Они включают, но не ограниваются ими, глицерин, сорбитол, пропилен-гликоль, соли, сахара, консервирующие средства, рН-буферы и углеводы. Типично, когда жидкая композиция является кашицей на водной или масляной основе, суспензией или раствором. Сухие композиции могут быть получены из любых жидких композиций, включая ферментационную надстоящую жидкость или суспензию клеток, или экстракцию клеток, путем сушки при разбрызгивании, лиофилизации, выпаривания при движении от центра к периферии, тонкослойного выпаривания,выпаривания центрифугированием, сушки на транспортере или любых их комбинаций. Сухие комбинации могут представлять собой грануляты подходящих размеров, для того чтобы быть подходящими для других последующих применений, таких как переработка пищевых продуктов и кормов, или для квалифицирования в качестве компонентов пищевых продуктов и кормов для животных. Перед сушкой к жидкой композиции может быть добавлен агент, увеличивающий объем, который после сушки эффективно усиливает свойства сухой композиции, такие как придание более высокой термической стабильности для защиты энзима от окружающих факторов с помощью увеличивающего объем реагента, лучшие технические свойства при обращении с композицией и другие. После того как получен сухой препарат, могут быть приготовлены агломерационные гранулы с использованием агломерационной техники, например, в смесителе со срезающими усилиями, во время которого материал наполнителя и энзим совместно агломеризуются с формированием гранул. Абсорбционные грануляты получают, используя в качестве сердцевины материал-носитель, на котором абсорбируется или который покрывается энзимом. К типичным материалам-наполнителям относятся динатрийсульфат, каолин, тальк, силикат магния-алюминия и целлюлозные волокна. При необходимости агломерационные грануляты могут также включать связующие, такие как декстрин. Типичные материалыносители включают крахмал, например, таких видов как маниоковый, кукурузный, картофельный, рисовый или пшеничный, а также могут быть использованы соли. При необходимости грануляты покрывают покровной смесью. Такие смеси включают покровные агенты, предпочтительно гидрофобные покровные агенты, такие как гидрированное пальмовое масло и говяжий жир, а также при желании другие добавки, такие как карбонат кальция и каолин. В более предпочтительном варианте изобретения композиции, включающие маннаназы данного изобретения, предназначены для переработки продуктов питания и кормов и для добавок к продуктам питания и кормам. В этом случае маннаназные композиции могут дополнительно содержать другие ком- 17023087 поненты, такие как красящие агенты, придающие аромат соединению, стабилизаторы, витамины, минералы, другие энзимы, улучшающие продукты питания и корма, и тому подобные. Это применяется, в частности, в так называемых предварительных смесях. Пищевые добавки согласно данному изобретению можно комбинировать с другими пищевыми компонентами для получения обработанных продуктов питания. Такие другие компоненты продуктов включают один или более других, предпочтительно термостабильных, энзимных добавок, витаминных добавок к пище и минеральных добавок к пище. Полученные в результате комбинированные пищевые добавки, включающие возможно несколько различных типов соединений, можно затем смешать в подходящем количестве с другими компонентами продуктов питания, такими как злаковые или растительные белки с получением обработанного пищевого продукта. Переработку этих компонентов в пищевой продукт можно проводить, используя любой современный доступный способ. В предпочтительном варианте изобретения композиция маннаназы дополнительно включает эффективное количество одного или более энзимов, улучшающих корма и продукты питания, в частности,выбираемых из группы, которая включает, но не ограничивается ими, фитазы, полуцеллюлозы, альфагалактозидазы, бета-галактозидазы, лактазы, бета-глюконазы, эндо-бета-1,4-глюканазы, целлюлазы, ксилозидазы, ксиланазы, ксилоглюканазы, ксиланацетил-эстеразы, галактаназы, экзо-маннаназы, пектиназы,пектинлиазы, пектинэстеразы, полигалактуроназы, арабиназы, рамно-галактуроназы, лакказы, редуктазы,оксидазы, фенолоксидазы, лигниназы, протеазы, амилазы, фосфатазы, липолитические энзимы, кутиназы и/или другие. Препараты маннаназы данного изобретения используют для обработки и/или производства продуктов питания и кормов для животных. Технические применения Очевидно использование производных маннаназы в качестве пищевых добавок или в качестве вспомогательных средств для переваривания, которые способствуют деградации пищевого материала,содержащего олигоманнозу, таким образом высвобождая потенциально полезную олигоманнозу или ее производные. Другое применение в области переработки пищевых продуктов и кормов состоит в производстве манно-олигосахаридов, в качестве важных пребиотиков из ВЯПО (выжимки ядер пальмовых орехов) для кормов и продуктов питания. При обработке ВЯПО или других галактоманнанов, содержащих компоненты с маннаназой, получают манно-олигосахариды и D-маннозу. Манно-олигосахариды используют в качестве пребиотических компонентов для кормов и продуктов питания: манно-олигосахариды способствуют росту пробиотиков (например, Bifidobacteria и Lactobacillus sp.), ингибируют рост энтеробактерии Salmonella, нейтрализуют противопитательные свойства лектинов и находят применение в фармацевтической промышленности. Кроме того, предполагается, что манно-олигосахариды и особенно манноза являются иммунно стимулирующими компонентами в кормовом материале. Еще одно другое применение в области переработки продуктов питания и кормов состоит в расщеплении содержащих маннан компонентов в стенке клеток фруктов для улучшения получения соков, например, путем добавления этих энзимов к ананасам, лимонам, апельсинам, к разновидностям лимонов,грейпфрутам перед процессом раздавливания. Успешным применением является использование варианта маннаназы согласно данному изобретению в процессах выпечки, например при выпечке печенья, хлеба и т.д. Другое применение в области переработки продуктов питания и кормов состоит в использовании маннаназы согласно данному изобретению для достижения улучшения экстракции масла из ядер пальмовых орехов. Остаточное содержание масла в выжимках ядер пальмовых орехов составляет 5-12% после прессования. Этот остаток можно далее понизить путем химической экстракции до около 3%. При применении маннаназы согласно данному изобретению высвобождение жира может быть быстро увеличено, таким образом обеспечивая улучшенный процесс. Кроме того, получающиеся выжимки ядер пальмовых орехов будут обладать более высоким качеством, так как уменьшено содержание галактоманнановых волокон, о которых известно, что они являются антипитательными компонентами в корме. Еще одно другое применение в области переработки продуктов питания и кормов состоит в получении D-маннозы из ВЯПО или других компонентов, содержащих галактоманнану. Мука из ядер пальмовых орехов содержит около 20% маннозы, связанной в виде галактоманнановых волокон. Обработка ВЯПО, сушенного ядра кокосовых орехов или других содержащих галактоманнану сырых веществ с маннаназами вызывает высвобождение D-маннозы. Манноза и ее производные являются ингредиентами,используемыми в продуктах питания (например, низкокалорийные продукты питания), в лекарственных средствах (манноза лечит более чем 90% всех инфекций мочевого тракта), в косметике, в текстиле и при производстве полимеров. В связи с ограниченными запасами манноза является очень дорогостоящей в настоящее время по сравнению с другими более обычными гексозными сахарами и ее запасы скудны. Dманноза может быть также использована в качестве сырья для получения маннитола. Сам маннитол получают из маннозы путем восстановления со значительно более высоким выходом и с меньшим количеством побочных продуктов, чем при конверсии фруктозы. Маннитол является полиолом, широко используемым в пищевой и фармацевтической промышленности в связи с его уникальными функциональными свойствами: манитол используют в качестве подсластителя в фармацевтических препаратах (жевательных таблеток и гранулированных порошков), при производстве жевательной резины, в качестве скрепляющего, текстурирующего и препятствующего спеканию агента для продуктов питания, в качестве осмотически активного фармацевтического и диабетического пищевого компонента. Кроме того, в контексте вышесказанного о переработке продуктов питания и кормов предложено использование маннаназы согласно данному изобретению для частичного гидролиза галактоманнаны при инкубации гуаровой солы или смолы плодов рожкового дерева. Полученные гидролизаты используют в пищевой и пивоваренной промышленности в качестве текстурирующего компонента и для фармацевтических применений. Получение сахаров Описанные энзимы маннаназы данного изобретения в особенности полезны при получении сахаров или олигосахаридов из полиманнозы, содержащейся в растительном материале, таком как ядра пальмовых орехов, кокосовые орехи, аморфофаллус коньяк, смола плодов рожкового дерева, гуаровая смола и соя-бобы. Предпочтителен такой растительный материала, как мука ядер пальмовых орехов, выжимки ядер пальмовых орехов (ВЯПО), мука сушенных ядер кокосовых орехов, выжимки сушенных ядер кокосовых орехов и скорлупа соя-бобов. В более предпочтительном варианте изобретения энзимы маннаназы согласно данному изобретению используют для производства маннозы и маннополимеров, таких как маннобиоза, маннотриоза,маннотетраоза, маннопентаоза, манногексаоза, манногептаоза, маннооктаоза, маннононаоза и более высокие полимеры маннозы и/или ее производных. Также предпочтительны их галактозилманноолигосахариды с различным соотношением между галактозой и маннозой, находящемся в интервале от 1 до 0,05. В другом более предпочтительном варианте данного изобретения сахара состоят из маннозы и глюкозы и относятся к глюкоманнанам. Эти полиолы могут состоять из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более мономеров маннозы и/или глюкозы с содержанием маннозы, составляющим 1/15, 1/14, 1/13, 1/12, 1/11, 1/10, 1/9,1/8, 1/7, 1/6, 1/5, 1/4, 1/3, 1/2, 1, 2/3, 3/4, 3/5, 4/5, 5/6, 2/7, 3/7, 4/7, 5/7, 6/7, 3/8, 5/8, 7/8, 2/9, 4/9, 3/10, 2/11,4/11, 3/12, 2/13 или 1/14. Также более предпочтительными являются их галактозилглюкоманноолигосахариды с различным соотношением между галактозой и маннозой, находящемся в интервале от 1 до 0,05. В другом более предпочтительном варианте данного изобретения маннаназу используют в комбинации с другими карбогидразами, подобными глюканазе, и/или ксиланазе, и/или альфа-галактозидазе,и/или целлюлазе для гидролиза растительного материала с целью создания сахаров. В более предпочтительном варианте данного изобретения гидролиз растительного материала, содержащего полиманнозу, приводит к сахарам проявляющим пребиотическую функциональность. Эти сахара создаются для содействия росту пробиотиков, бактерий, о которых известно, что они поддерживают здоровую иммунную систему. К примерам таких бактерий относятся бифидобактерии. К известным бифидобактериям относятся Bifidoabteria adolescensis, В. angulation, В. animalis, В. astrodes, В. bifidum,В. bifidum, В. boum, В. breve, В. catenulatum, В. choerinum, В. coryneforme, В. cuniculi, В. dentium, В. gallicum, В. gallinarum, В. indicum, В. infantis, В. longum, В. magnum, В. merycicum, В. minimum, В. pseudocatenulatum, В. pseudolongum, В. pullorum, В. ruminantium, В. saeculare, В. scardovii, В. subtile, В. thermacidophilum и Bifidoabteria thermophilum. Экстракция кофе: Описанные энзимы маннаназы согласно данному изобретению оказались полезными для гидролиза галактоманнана, который присутствует в жидких экстрактах кофе. В предпочтительном варианте изобретения маннаназу используют для ингибирования образования гелей, которые образуются во время сушки замораживанием жидких экстрактов кофе. Уменьшенная вязкость экстракта понижает потребность в энергии во время сушки. В еще более предпочтительном варианте данного изобретения энзим маннаназы используют в иммобилизованной форме, что уменьшает потребность в энзиме и препятствует загрязнению экстракта кофе. В этом контексте другое интересное применение состоит в использовании энзима маннаназы согласно данному изобретению для производства маннозы или манно-олигосахаридов из выжимок кофе, с целью получения более ценных продуктов. Как описано выше маннаназа высвобождает маннозу или олигосахариды из выжимок кофе, которые являются высокоценными функциональными компонентами кормов и продуктов питания. В промышленности кофейных напитков использованный кофейный осадок,как правило, применяют в качестве топлива или обрабатывают в качестве промышленных отходов). Поджаренное кофе содержит 1,8-4,4% маннана. В связи с этим использованные кофейные осадки содержат большое количество -маннана, который может быть превращен в манноолигосахариды путем энзиматического гидролиза. Манноолигосахариды, полученные из кофейного маннана, пригодны для уменьшения уровней липидов в сыворотке человека (Jpn. J. food eng., 6 (2005). Корма для животных: Несколько антипитательных факторов ограничивают использование специфического растительного материала при приготовлении кормов для животных и продуктов питания для людей. Описано, что растительный материал, содержащий олигоманнаны, такие как маннан, галактоманнан, глюкоманнан и галактоглюкоманнан, уменьшает удобоваримость и поглощение животными питательных соединений, таких как минералы, витамины, сахара и жиры. Отрицательные эффекты, в частности, связаны с высокой вязкостью маннополимеров и со способность маннополимеров адсорбировать питательные соединения. Эти эффекты могут быть устранены/уменьшены путем использования энзимов, вызывающих деградацию маннополимеров, в частности, энзимы маннаназы, что тем самым позволяет значительно большую пропорцию содержания маннополимера в дешевом растительном материале в кормах и в связи с этим снижение расходов. Кроме того, в результате активности энзима маннаназы маннополимеры разрушаются до моносахаридов, которые легко могут быть ассимилированы и давать дополнительную энергию. Для того чтобы использовать энзим в качестве эффективной кормовой добавки к кормам, например,животных с однокамерным желудком, таких как домашняя птица или свиньи, он должен быть стабильным в желудке. Это означает, что он должен быть стабильным при низких значениях рН (приблизительно рН 2-3) и дополнительно он должен быть стабилен по отношению к пепсину при этих низких значениях рН. Далее такой энзим должен быть активным при низких значениях рН (приблизительно рН 3,0),для того чтобы быть эффективными в желудке. Энзимы маннаназы, предлагаемые в этом изобретении,выполняют все эти критерии в отличие от других энзимов маннаназы, таких как, например, маннаназы из дикого типа Trichoderma reesei, который не стабилен при низких значениях рН, в частности не стабилен по отношению к пепсину при низких значениях рН. В связи с этим энзимы маннаназы, предлагаемые в данном изобретении, особенно хорошо подходят для применения в кормах, в которых энзимы должны быть активными в животном. Энзимы маннаназы согласно данному изобретению полезны в качестве добавок к кормам животных с однокамерным желудком, таких как домашняя птица и свиньи, а также для добавок в продукты питания человека. Эти корма могут быть предназначены для уток, гусей, а также для крупного рогатого скота, собак, коз, лошадей, кошек, и, кроме того, для ракообразных и рыб. Энзимы маннаназы можно также использовать для предварительной обработки кормов, вместо того чтобы добавлять их в корма. В предпочтительном варианте данного изобретения энзимы маннаназы добавляют к кормам молочных поросят, поросят, подсвинков, откармливаемых свиней, подрастающих свиней, выращенных свиней,кур-несушек, бройлерных цыплят, индеек. В другом предпочтительном варианте данного изобретения энзимы маннаназы являются добавками к кормам, которые составлены из растительного материала, такого как ядра пальмовых орехов, кокосовые орехи, аморфофаллус коньяк, смола плодов рожкового дерева, гуаровая смола, соя-бобы, ячмень,овес, лен, пшеница, кукуруза, семена льна, цитрусовая пульпа, семена хлопчатника, арахис, семена рапса, подсолнечник, горох, лупины и витамины, а также минералы. В еще более предпочтительном варианте данного изобретения энзимы маннаназы добавляют к кормам, частично состоящим из муки ядер пальмовых орехов, выжимок ядер пальмовых орехов, муки сушенных ядер кокосовых орехов, дробинок сушенных ядер кокосовых орехов и скорлупы соя-бобов. В другом предпочтительном варианте данного изобретения энзимы маннаназы используют в комбинации с другими энзимами, выбираемыми из группы, которая включает, но не ограничивается ими,фитазы, альфа-галактозидазы, бета-галактозидазы, пектиназы, ксиланазы, арабиноксиланазы, протеазы,бета-глюканазы, целлюлазы, галактаназы, эндоглюканазы, ксилозидазы, кутиназы, липазы и/или фосфолипазы, для приготовления кормов. Энзимы маннаназы вместе с дополнительными энзимами или без них можно также использовать в комбинации с минералами, витаминами и другими типичными добавками к кормам. В связи с тем, что энзимы маннаназы согласно данному изобретению являются термостабильными энзимами, их можно подвергнуть нагреванию без потери важной активности. Поэтому энзимы маннаназы можно использовать в процессах получения гранулированных кормов, при которых тепловая обработка применяется к кормовой смеси перед стадией гранулирования, как это имеет место в большинстве коммерческих грануляционных мельниц. Энзимы маннаназы могут быть добавлены к другим кормовым компонентам перед стадией гранулирования или добавлены после стадии гранулирования к уже сформированным кормовым гранулам. В другом предпочтительном варианте данного изобретения энзимы маннаназы используют в кормах животных, которые специально скармливают животным при условиях, когда не желательны никакие антибиотики. В более предпочтительном варианте данного изобретения энзимы маннаназы используют в кормах животных, частично состоящих из муки ядер пальмовых орехов, выжимок ядер пальмовых орехов, муки сушенных ядер кокосовых орехов, дробинок сушенных ядер кокосовых орехов и/или скорлупы соябобов. В еще более предпочтительном варианте данного изобретения энзимы маннаназы используют в кормах для бройлерных цыплят, которые частично состоят из муки ядер пальмовых орехов, выжимок ядер пальмовых орехов, муки сушенных ядер кокосовых орехов, дробинок сушенных ядер кокосовых орехов и/или скорлупы соя-бобов. Производство бумажной пульпы Энзимы маннаназы согласно данному изобретению используются в поддерживаемом энзимами отбеливании бумажной пульпы, такой как химическая пульпа, полухимическая пульпа, крафт-пульпа, механическая пульпа или пульпа, приготовленная сульфитным способом. Пульпа может быть также полностью свободной от хлора пульпой, отбеливаемой кислородом, озоном, пероксидом или перекисными кислотами. В более предпочтительном варианте данного изобретения энзимы маннаназы, используемые для поддерживаемого энзимом отбеливания пульпы, получают модифицированным или непрерывным способом образования пульпы, который приводит к низким содержаниям лигнина. В другом более предпочтительном варианте данного изобретения энзимы маннаназы при таких применениях могут применяться только сами по себе или предпочтительно в комбинации с такими энзимами, как ксиланаза и/или эндо-глюканаза, и/или альфа-галактозидаза, и/или целлобиогидролаза. Отбеливающий и/или шлихтующий агент в тексильной промышленности Энзимы маннаназы согласно данному изобретению также могут использоваться для отбеливания не хлопковых целлюлозных волокон, пряжи или фабрикатов, включающих лен, джут, волокно из китайской крапивы или полотно, путем инкубирования волокна, пряжи или фабрикатов с маннаназой согласно данному изобретению в течение заданного времени и при условиях подходящих, для достижения отбеливания волокна, пряжи или фабрикатов. Деградация полуцеллюлозы улучшает процесс отбеливания фабриката. При печатании на текстиле используется паста для печатания, содержащая краситель и биологический полимер (например, гуаровая смола) в качестве загустителя, удаление этого загустителя и избытка красителя более предпочтительно осуществляют путем стирки печатного текстиля в присутствие маннаназы. Энзиматическое разрушение загустителя уменьшает время процесса, а также количество энергии и воды, необходимые для достижения удовлетворительного качества текстиля. Энзимы маннаназы согласно данному изобретению оказываются полезными при шлихтовании фабрикатов, сделанных, например, из синтетических волокон, в которых часто используют галактоманнаны,подобные гуаровой смоле или смоле плодов рожкового дерева, в качестве шлихтующих агентов. Стимулирование нефтяных и газовых скважин при гидравлическом фракционировании пласта Энзимы маннаназы согласно данному изобретению оказываются полезными в способе гидравлического фракционирования пласта, которые используют для стимулирования нефтяных и газовых скважин. Здесь энзимы маннаназы действуют в качестве разжижающих агентов в гидравлических флюидах, которые базируются на маннополимере или состоят из него и обычно содержат песок. Поскольку энзимы маннаназы согласно данному изобретению являются термостабильными энзимами, их предпочтительно применяют при гидравлическом фракционировании пласта, которое осуществляется при высоких температурах. В другом предпочтительном варианте данного изобретения активность энзимов маннаназы по разжижению при применениях для гидравлического фракционирования пласта контролируется (ингибируется или ускоряется) условиями окружающей среды, такими как значение рН и температура. Моющие средства Энзимы маннаназы согласно данному изобретению могут использоваться в композициях моющих средств для того, чтобы облегчить удаление маннополимера, содержащего красящие вещества/грязь. В предпочтительном варианте данного изобретения энзимы маннаназы используют в композициях моющих средств в комбинации с другими энзимами из группы амилаз, целлюлаз, липаз, пектиназ и эндоглюканаз. Удаление биопленок Энзимы маннаназы, описанные в данном изобретении, могут использоваться для удаления биопленок, содержащих маннополимер. Предпочтительно для такого рода применений энзимы маннаназы используются в комбинации с моющими средствами и/или другими энзимами из группы, включающей альфа-галактозидазы, пектиназы, ксиланазы, арабиноксиланазы, протеазы, бета-глюканазы, целлюлазы,галактаназы, эндоглюканазы, ксилозидазы, кутиназы и липазы. Системы доставки Энзимы маннаназы согласно данному изобретению могут быть использованы для создания меток и/или для зависящей от времени доставки вещества. Это достигается в результате использования систем,которые базируются на гелях маннополимеров, которые содержат и транспортируют вещество. Функция энзима маннаназы в такой системе состоит в контролируемом освобождении вещества при частичном или полном распаде геля, связанном со специфическим изменением окружающей среды геля, например значения рН и/или температуры, которое активирует энзимы маннаназы. В предпочтительном варианте данного изобретения энзимы маннаназы используют для меченной доставки лекарства при фармацевтическом применении. Возобновляемые ресурсы, например субстраты биомассы, которые выращены и урожай которых снят, такие как урожай зерна, соломы, древесины и древесных продуктов, привлекают все большее внимание, поскольку они являются подходящими субстратами для производства биологического горючего,например, твердого, жидкого или газообразного, такого как биодизель, биогаз, растительное масло, биоэтанол, биобутанол, биоводород, простой био-диметиловый эфир, биометанол, BTL ("из биомассы жидкое")-горючее, GTL ("из газа жидкое")-горючее и тому подобные. В 1-ом поколении биологического горючего, указанные растения были превращены, используя установившиеся способы из пищевой промышленности, например, их подвергают сжатию, для того чтобы получить растительное масло, или крупу, содержащую крахмал, превращают в сахар и затем ферментизируют дрожжами, для того чтобы получить биоэтанол. Это означает, что утилизуются исключительно запасы энергии (например, жир и/или крахмал) указанных растений. Это приводит к бедным выходам энергии, или к производству небольшого количества биогорючего на 1 акр. Во 2-ом поколении биологического горючего используются не только энергетические запасы указанных растений, но и осуществляется тенденция по утилизации всей биомассы растения. В этом контексте маннаназа согласно данному изобретению может быть использована для превращения биомассы растения, содержащей полуцеллюлозу, в сахара, которые можно подвергнуть метаболизму с помощью специфических дрожжей (например, Saccharomyces sp. ) или с помощью бактериальных линий и других микроорганизмов, для того чтобы получить ферментационные продукты. Эти ферментационные продукты могут быть горючим, таким как биоэтанол, биобутанол, однако может образоваться блок молекул, таких как 3-гидроксипропионовая кислота, аспарагиновая кислота, ксилитол и глюконовая кислота. Более подробно об образующих блок молекулах, которые могут быть получены из Сахаров смотри (Werpy и Petersen (2004), Top Value Added Chemicals from Biomass: Volume 1-Results ofScreening for Potential Candidates from Sugars and Synthesis Gas. National Renewable Energy Laboratory Report NREL/TP-510-35523, фиг. 3 и табл. 8). Другие потенциальные применения включают каталитическую обработку продуктов, которые были получены из возобновляемых источников, с помощью маннаназ согласно данному изобретению. Они включают переработку глюкозы и/или фруктозы, которые получены с помощью маннаназы согласно данному изобретению, в 2,5-диметилфуран, представляющий собой гетероциклическое соединение, для которого предполагается, что он обладает значительно лучшими горючими свойствами по сравнению с биоэтанолом и обладает на 40% более высокой энергетической плотностью, химически стабилен и не растворим в воде. Указанные подходы приводят к большим преимуществам, связанным с улучшенными свойствами маннаназ согласно данному изобретению, в частности к повышенной термической стабильности. Это означает, что превращение соответствующей биомассы в сахар может происходить при более высоких температурных условиях, а это ускоряет соответствующие процессы и таким образом приводит к большей экономической эффективности. В последних экспериментах изобретателей субстраты выжимок ядер пальмовых орехов (ВЯПО) были использованы для питания дрожжей (Saccharomyces cerevisiae). Указанные субстраты содержат около 37% галактоманнана. С другой стороны, ВЯПО, обработанные двумя манноназами согласно данному изобретению (например, вариантом В, вариантом С и/или вариантом 31) приводят к высвобождению большого количества сахаров, и тем самым приводят к улучшенному росту дрожжей по сравнению с необработанными ВЯПО. Это является ясным указанием на высказанный выше постулат о том, что маннаназы согласно данному изобретению могут быть использованы в качестве полезного инструмента для увеличения выхода, например, биоэтанольной продукции из возобновляемых ресурсов (см. пример 19 в WO 2008/009673). Общим для всех указанных применений маннаназы согласно данному изобретению является то, что эти подходы приводят к существенным преимуществам, связанным с улучшенными свойствами маннаназ согласно данному изобретению, в частности к повышенной термической стабильности и к повышенной устойчивости к низким значениям рН и к энзимам протеазы. Это связано главным образом с тем фактом, что большинство указанных применений имеет место в окружении с неблагоприятными условиями, такими, которые существуют в пищеварительных трактах млекопитающих животных, где преобладают низкие значения рН, или при повышенных температурах,которые используют для увеличения скорости, облегчения и экономической оптимизации процесса гидролиза, такого как превращение возобновляемых ресурсов в сахара, как описано выше. Следующие способы и примеры предлагаются только в иллюстративных целях и ни в коем случае не предназначены для ограничения охвата данного изобретения. Способы и примеры Следующие примеры, материалы и способы данного изобретения предназначены для определения каталитических свойств энзимов, полученных данным способом. Понятно, что эти примеры приведены только в иллюстративных целях, но ни в коем случае не являются ограничивающими для данного изобретения. Все цитированные здесь публикации, патенты и заявки на патент поэтому включены в качестве ссылок для всех целей в описание. Пример 1. Очистка энзимов маннаназы с помощью HisTag Очистку энзимов маннаназы, не содержащих связывающего углеводы домена (СУВД), проводят,используя 6HisTag, который слился с С-концом с энзимами маннаназы (HisTag представляет собой товарный знак метода с применением гистидина, разработанного фирмой EMD Biosciences, tag = маркировка).S. saccharomyces, трансформированную плазмидом, кодирующим 6His-меченной маннаназы, культивируют во встряхиваемых колбах при температуре 30 С в течение 72 ч в культурной среде SCгалактозы. Центрифугированием удаляют клетки из 2 л культурной среды и надстоящую жидкость доводят до 40-кратной концентрации путем ультрафильтрования с использованием 5 кДа отсекающей мембраны. Концентрат после этого диафильтруют той же самой отсекающей мембраной для буферного обмена (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, pH 5,0) и концентрируют до конечного объема, равного 1/40 от объема культуры. Концентрат фильтруют через 0,45 мкм фильтр и значение рН подгоняют до 8,0 непосредственно перед загрузкой в металлическую колонку сродства с металлом (BD-талон, фирмы BDBioscience). Колонку промывают несколькими слоевыми объемами диафильтрационного буфера с рН 8,0. Маннаназу элюируют с градиентом от 0 до 100% буфера В, где буфер В содержал 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl и 250 мМ имидазола со значением рН 6,0. Элюированные образцы белка анализируют с помощью гель-электрофореза с применением додецилсульфата натрия. Фракции, содержащие маннаназу,объединяют и подвергают диализу по отношению к буферу, содержащему 50 мМ NaOAc, рН 5,0. Чистоту образцов маннаназы контролируют с помощью хроматографии с обратимой фазой, используя для детектирования белка поглощение при длине волны 280 нм. Пример 2. Очистка энзимов маннаназы с помощью С-конечного СУВД Очистку энзимов маннаназы с помощью С-конечного СУВД проводят, используя анионный обмен и хроматографию с гидрофобным взаимодействием. В деталях, S. saccharomyces, трансформированные плазмидом, который кодирует соответствующие энзимы маннаназы, культивируют во встряхиваемых колбах при температуре 30 С в течение 72 ч в культурной среде SC-галактозы. Центрифугированием удаляют клетки из 5 л культурной среды и надстоящую жидкость подвергают концентрированию и обмену с буфером (буфер А: 20 мМ трис(гидроксиметил)аминометан, рН 8,6) путем ультрафильтрования, используя 10 кДа отсекающей мембраны. В заключение получают 200 мл концентрата маннаназы в буфере А. Раствор подают в 6,3 мл колонку TSK гель супер-Q-5PW(30) (фирмы TosohBioscience) в равновесии с буфером А. Колонку промывают несколькими объемами, равными объему колонки, буфера А. Затем энзимы маннаназы элюируют с линейным градиентом от 0 до 100% буфера В(20 мМ трис (гидроксиметил) аминометана, рН 8,6, 1 М NaCl) свыше 120 мл. Элюированные образцы белка анализируют с помощью гель-электрофореза с применением додецилсульфата натрия. Фракции,содержащие маннаназу, объединяют, разбавляют 1:1 с помощью 3 М раствора сульфата аммония и помещают в уравновешенную (буфер С: 50 мМ NaOAc, рН 5,0, 1,5 M сульфат аммония) 8,8 мл TSK гель фенил-5PW (20) колонку (фирмы Tosoh Bioscience) . Колонку промывают буфером С. Элюирование маннаназы проводят с линейным градиентом от 0 до 100% буфера D (50 мМ NaOAc, pH 5.0) свыше 100 мл. Элюированные образцы белка анализируют с помощью гель-электрофореза с применением додецилсульфата натрия. Фракции, содержащие маннаназу, объединяют и подвергают диализу по отношению к буферу D. Чистоту образцов маннаназы контролируют с помощью хроматографии с обратимой фазой,используя для детектирования белка поглощение при длине волны 280 нм. Пример 3. Генерирование и характеристика вариантов маннаназ Варианты маннаназ генерируют, используя различные способы мутагенеза ДНК, кодирующих белки маннаназы, такие как кассетный или мутагенез в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР) или другие способы мутагенеза, хорошо известные специалистам. Эти способы включают такие способы,которые открыты в статье Morinaga и др., Biotechnology, 2:646-649 (1984) и в статье Nelson и Long, Analytical Biochemistry, 180:147-151 (1989); или в протоколе Error Threshold Mutagenesis, описанном в WO 92/18645. Другой подходящий способ для мутагенной ПЦР открыт Cadwell и Joyce, PCR Methods Appl.,3:136-140 (1994). Варианты маннаназы подвергают гетерологической экспрессии в одном или более следующих экспрессионных хозяев: Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis и Escherichia coll. Пример 4. Определение температурной стабильности Температурная стабильность вариантов маннаназы определяется температурой их инактивации. Инактивационную температуру определяют путем измерения остаточной активности энзимов маннаназы после инкубирования при различных температурах. Остаточную активность определяют путем измерения активности вариантов маннаназы, не подвергнутых и подвергнутых температурной обработке. Более детально, образцы маннаназы подвергают инкубированию в 50 мМ NaOAc буфере, рН 5,0 и 0,025% тритон-Х-100 в течение 45 мин при различных температурах. После этого определяют активность маннаназы, используя AZCL-галактоманнан (камедь плодов рожкового дерева фирмы Megazyme) в качестве субстрата. Для этих образцов маннаназы и энзима маннаназы калибровочные серии (очищенная маннаназа согласно последовательности Seq. ID3 с С- 23023087 концом 6His-MeTKa) были инкубированы с 1 мг/мл AZCL-галактоманнаном, 50 мМ NaOAc, pH 5,0 и 0,1% тритон-Х-100 в течение 60 мин при температуре 37 С. Надстоящую жидкость из опытов с AZCLгалактоманнаном затем переносят на микротитровальную пластинку с 96-углублениями и измеряют поглощение при длине волны 590 нм на стандартном считывающем устройстве для пластинок. Данные по поглощению для калибровочной серии, полученные для энзима маннаназы, наносят по отношению к концентрациям энзима. Активности других образцов маннаназы рассчитывают, используя уравнения,которые были созданы путем соответствующего совпадения кривой с данными для стандартной серии энзима маннаназы. Для этого активности образцов маннаназы подвергают экспрессии в качестве эквивалентов активности энзима маннаназы калибровочной серии. Температуру инактивации энзима маннаназы определяют как температуру, при которой остаточная активность маннаназы составляет 50% по сравнению с остаточной активностью той же самой маннаназы после инкубирования при тех же самых условиях, но только при комнатной температуре. При необходимости делаются экстраполяции и интерполяции данных по активности, для того чтобы определить температуру, соответствующую 50% остаточной активности. Разность температур стабильности (РТС) в [С] для двух энзимов рассчитывают вычитанием их температур инактивации. Таблица 3. Разность температур стабильности (РТС) в [С] для вариантов маннаназы. Представленные варианты базируются на последовательности Seq. ID3 и содержат в качестве С-концов или 6Hisметку, или связывающий углевод домен ( СУВД , последовательность Seq. ID10, фиг. 11). Приведенные замещения введены в последовательность Seq. ID3. Разность температур стабильности (РТС) определяется как (температура инактивации варианта) минус (температура инактивации энзима с последовательностью Seq. ID3), причем как вариант, так и энзим с последовательностью Seq. ID3 имеют идентичную С-конечную метку. Энзим с последовательностью Seq. ID3, содержащий С-конечный СУВД, проявляет инактивационную температуру при 74,6 С. Энзим с последовательностью Seq. ID3,содержащий С-конечную 6His-метку, проявляет инактивационную температуру при 75,7 С. Пример 5. Специфическая активность Специфическую активность энзимов маннаназы определяют, используя очищенные энзимы согласно примерам 1 и 2. Активность маннаназы определяют по выделению восстановленных сахаров из галактоманнана. Белок маннаназы определяют измерением оптической плотности (ОП) при длине волны 280 нм. Более детально, очищенные образцы маннаназы растворяют в 50 мМ NaOAc, pH 5,0. Добавляют раствор галоктоманнана камеди плодов рожкового дерева (низкой вязкости, фирмы Megazyme) для получения конечной концентрации 0,7% (вес/объем) галактоманнана, 50 мМ NaOAc, pH 5,0 и около 10 мкг/мл белка маннаназы. Раствор инкубируют в течение 16 ч при температуре 37 С. Затем следующим образом определяют количество восстановленного сахара. Одну часть раствора опыта с галактоманнаном или раствора с определенным количеством маннозы смешивают с одной частью раствора, содержащего 1% (в/о) динитросалициловой кислоты (ДИСК), 30% (в/о) тартрата калия натрия и 0,4 M NaOH. Смесь инкубируют в течение 10 мин при температуре 99 С и в течение 5 мин при температуре 4 С. Затем измеряют поглощение при длине волны 540 нм. Восстановленные эквиваленты сахара (такие как эквиваленты маннозы) были рассчитаны путем нанесения на график данных по поглощению стандартных образцов маннозы по отношению к концентрации маннозы. Количество восстановленных эквивалентов сахара для образцов рассчитывают, используя уравнения, которые были выведены из соответствующей кривой, полученной при введении данных для стандартных образцов маннозы. Концентрации маннаназы рассчитывают из оптической плотности препаратов при длине волны 280 нм и из соответствующего коэффициента поглощения для каждого варианта маннаназы. Коэффициенты поглощения рассчитывают, опираясь на композиции аминокислот белков, согласно способу, предложенному в статье Gill и von Hippel, Analytical Biochemistry, 182:319-326 (1989). Специфическая активность энзимов маннаназы согласно данному изобретению выражается в нкат на мг белка маннаназы в субстрате галоктоманнана камеди плодов рожкового дерева, как описано выше. Активность в один нкат определяется как выделение одного наномоля восстановленных Сахаров в секунду.Tаблица 4. Специфическая активность вариантов маннаназы Представленные варианты базируются на последовательности Seq. ID3 и содержат в качестве Сконечных заместителей или 6His-метку или связывающий углеводы домен (СУВД, последовательностьSeq. ID10). Приведенные заместители были введены в последовательность Seq. ID3. Значения специфической активности определены как отношение (специфическая активность варианта)/(специфическая активность, от которой проводится отсчет). В данном случае отсчет проводится по отношению к маннаназе с последовательностью Seq. ID3 с той же самой С-конечной меткой, которая представлена в соответствующем варианте. Отсчетная с С-конечной 6His-меткой специфическая активность составляет 1228 нкат/мг и отсчетная с С-конечным СУВД специфическая активность составляет 535 нкат/мг. Пример 6. Стабильность при низком рН/пепсине Для того чтобы определить стабильность при низком рН/пепсине энзимов маннаназы, S.Saccharomyces, трансформированные с помощью кодирования плазмидов соответствующих энзимов маннаназы, культивируют во встряхиваемой колбе при температуре 30 С в течение 72 ч в среде культуры SC-галактозы. Клетки удаляют центрифугированием и надстоящую жидкость отделяют и концентрируют, например, 10-кратно путем ультрафильтрования с 10 кДа отсекающими мембранами. Концентрированную надстоящую жидкость разбавляют, например, 10-кратно в автоклавном растворе, содержащем 30 г/л картофельного сока, 30 г/л жидкости из вымоченной кукурузы, 5 г/л сульфата аммония, 15 г/лKH2PO4, 10 г/л смолы плодов рожкового дерева и 20 г/л целлюлозы (фирмы Avicell). Разбавленные образцы маннаназы смешивают 1:1 с пепсиновой пробой (200 мМ глицин-HCl, рН 1,5, 5 мг/мл пепсин предварительно выпаренный BSA (альбумин бычьей сыворотки), 2 мМ CaCl2 и 0,5 мг/мл пепсин) и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37 С. Значение рН смеси составляло рН 2,45. Дополнительно был создан контрольный образец. Для этого те же самые разбавленные образцы маннаназы смешивают 1:1 с контрольной пробой (100 мМ NaOAc, рН 5,2, 5 мг/мл пепсин-предварительно выпаренный BSA и 2 мМ CaCl2) и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37 С. Значение рН смеси составляло рН 5,2. Для того чтобы определить активность маннаназы, смешивают 1 часть приведенных выше смесей или энзимов маннаназы из калибровочной серии (очищенная маннаназа согласно последовательностиSeq. ID3 с С-концевой 6His-меткой) с 14 частями AZCL-галактоманнановой пробы (200 мМ NaOAc,рН 5,0, 0,1% тритон-Х-100, 1% AZCL-галактоманнана камеди плодов рожкового дерева (фирмыMegazyme и инкубируют в течение 60 минт при температуре 37 С. Образцы центрифугируют и надстоящие жидкости анализируют по поглощению при длине волны 590 нм. Данные по поглощению калибровочной серии энзима маннаназы наносят на график по отношению к концентрациям. Активности других образцов маннаназы рассчитывают, используя уравнения, которые были выведены из соответствующей кривой, полученной при введении данных для калибровочных серий энзима маннаназы. В связи с этим активности образцов маннаназы представляют в виде эквивалентов активности калибровочной кривой энзима маннаназы. Остаточную активность энзимов маннаназы рассчитывают согласно приведенному ниже отношению:(активность маннаназы после инкубирования в опыте с пепсином)//(активность маннаназы после инкубирования в контрольном опыте. Таблица 5. Низкий рН/пепсин стабильность вариантов маннаназы Представленные варианты базируются на последовательности Seq. ID3 и содержат С-конечный связывающий углеводный домен (СУВД, последовательность Seq. ID10). Представленные замещения введены в последовательность Seq. ID3. По отношению к маннаназе согласно последовательностиSeq. ID1 вариант с С-конечным СУВД повышает остаточную активность на 39%. Пример 7. Сравнение маннаназы из Trlchoderma reesei и варианта S3R Температурная стабильность и получение маннозы с помощью Trlchoderma reesei маннаназы с последовательностью SEQ ID1 было сравнено с действием варианта маннаназы, полученным из последовательности SEQ ID1 путем введения замещения S3R (замещение серина на аргенин в положении 3). Эксперимент и результаты детально описаны в W0 2008/009673 (пример 8, р. 100-101; фиг. 1 В) и на фиг. 10. Список последовательностей, свободный текст Последовательность SEQ ID1: фрагмент дикого типа Trichoderma reesei маннаназы/аминокислота. Последовательность SEQ ID2: вариант маннаназы V-31 опубликована в WO 2008/009673/аминокислота. Последовательность SEQ ID3: вариант маннаназы V-31/S3R опубликована в WO 2008/009673/аминокислота. Последовательность SEQ ID4: вариант маннаназы ТМ-1/аминокислота. Последовательность SEQ ID5: вариант маннаназы ТМ-1/ДНК. Последовательность SEQ ID6: маннаназа ТМ-100/аминокислота. Последовательность SEQ ID7: вариант маннаназы ТМ-108/аминокислота. Последовательность SEQ ID8: вариант маннаназы TM-CBD-148/аминокислота. Последовательность SEQ ID9: вариант маннаназы ТМ-144/аминокислота. Последовательность SEQ ID9: СУВД / аминокислота. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Вариант маннаназы, имеющий маннаназную активность и аминокислотную последовательность,отличающуюся от аминокислотной последовательности маннаназы из родительского/дикого типаTrichoderma reesei (последовательность SEQ ID1), в которой аминокислотная последовательность варианта маннаназы включают замены 201S, 207F и 274L, а также замены 66 Р, 215 Т и 259R, а также идентичность последовательности как минимум 90% к SEQ ID1. 2. Вариант маннаназы по п.1, в котором вариант маннаназы далее включает вариацию 3R. 3. Вариант маннаназы по п.2 или 3, в котором вариант маннаназы далее включает вариацию 181 А/Н. 4. Вариант маннаназы по любому из пп.1-3, в котором вариант маннаназы далее включает одну или более дополнительных вариаций, в котором вариационными положениями являются 31, 97, 113, 146, 149,173, 181, 280, 282, 331 или 344. 5. Вариант маннаназы по п.4, в котором вариациями являются 31Y, 97R, 113Y, 146Q, 149K, 173 Н/T 181 Н/А, 280S/L/R, 282D, 331S или 344D. 6. Вариант маннаназы, имеющий маннаназную активность и аминокислотную последовательность,которая отличается от аминокислотной последовательности маннаназы дикого типа Trichoderma reesei(последовательность SEQ ID1), в которой аминокислотная последовательность варианта маннаназы включает замены 201S, 207F и 274L, и, как минимум, замены , выбираемые из группы, включающей: