Антитело к склеростину и его применение

Настоящее изобретение относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с эпитопом полипептида склеростина и являются способными к увеличению плотности кости или содержанию минеральных веществ в кости млекопитающего. Увеличение минеральной плотности кости имеет применение при заболеваниях и состояниях,в которых низкая минеральная плотность кости характеризуется для такого состояния, как остеопения, остеопороз, переломы кости. Данное изобретение относится, в общем, к фармацевтическим продуктам и способам и, более конкретно, к способам и композициям, пригодным для увеличения минерального содержания кости. Такие композиции и способы могут быть использованы для лечения большого разнообразия состояний, в том числе, например, остеопении, остеопороза, переломов и других нарушений, в которых отличительным признаком заболевания является низкая минеральная плотность кости. Уровень техники Две или три отличающиеся фазы изменений костной массы встречаются на протяжении жизни индивидуума (см. Riggs, West J. Med. 154:63-77, 1991). Первая фаза имеет место как у мужчин, так и у женщин и протекает для приобретения максимальной костной массы. Эта первая фаза достигается посредством линейного роста хрящевых пластинок роста и радиального роста вследствие скорости периостеального присоединения новых слоев (утолщения надкостницы). Вторая фаза начинается в возрасте около 30 лет для губчатой кости (плоских костей, таких как позвонки и таз) и в возрасте около 40 лет для кортикального слоя кости (например, длинных костей, находящихся в конечностях) и продолжается до старости. Эта фаза характеризуется медленным разрежением кости и встречается как у мужчин, так и у женщин. У женщин встречается также третья фаза разрежения кости, наиболее вероятно, обусловленная постклимактерической недостаточностью эстрогена. Во время только этой фазы женщины могут терять дополнительные 10% костной массы из кортикального слоя кости и 25% из губчатого компартмента (см.Riggs, supra). Потеря минерального содержания кости может быть обусловлена большим разнообразием состояний и может быть результатом существенных медицинских проблем. Например, остеопороз является истощающим заболеванием у людей, характеризующимся заметными уменьшениями скелетной костной массы и минеральной плотности, структурным разрушением кости, включающим деградацию микроархитектуры кости и соответствующие увеличения хрупкости кости и подверженности к перелому у пораженных индивидуумов. Остеопорозу у людей предшествует клиническая остеопения (минеральная плотность костей, которая более, чем на одно стандартное отклонение, но менее, чем на 2,5 стандартных отклонений, ниже средней величины для кости молодого взрослого человека), состояние,обнаруживаемое у приблизительно 25 млн лоюдей в Соединенных Штатах. Другие 7-8 млн пациентов в Соединенных Штатах диагностированы как имеющие клинический остеопороз (определяемый как минеральное содержание кости, которое более, чем на 2,5 стандартных отклонений, ниже минерального содержания кости зрелой кости молодого взрослого человека). Остеопороз является одним из требующих наибольших расходов заболеваний для системы здравоохранения, стоящим десятков миллиардов долларов ежегодно в Соединенных Штатах. Кроме связанных с медико-санитарной помощью расходов долгосрочное врачебное обслуживание и потерянные рабочие дни увеличивают финансовую и социальную стоимость этого заболевания. Во всем мире приблизительно 75 млн людей находятся при риске остеопороза. Частота встречаемости остеопороза у населения увеличивается с возрастом и среди членов ИндоЕвропейской группы населения остеопороз является преобладающим у женщин (которые составляют 80% пула пациентов с остеопорозом в Соединенных Штатах). Увеличенная хрупкость и подверженность к перелому скелетных костей у пожилых людей усугубляется увеличением риска случайных падений в этой популяции. Более 1,5 млн связанных с остеопорозом переломов костей сообщаются каждый год в Соединенных Штатах. Переломы тазобедренных суставов, кистей и позвонков находятся среди наиболее частых повреждений, связанных с остеопорозом. Переломы тазобедренных суставов, в частности, являются крайне неудобными и дорогими для пациента, а для женщин коррелируют с высокими коэффициентами смертности и болезненности. Хотя остеопороз определяется как увеличение риска перелома вследствие уменьшения костной массы, ни одно из доступных в настоящее время лечений для скелетных нарушений, по существу, не может увеличивать плотность кости у взрослых. Все врачи хорошо понимают, что необходимы лекарственные средства, которые могли бы увеличивать плотность костей у взрослых, в частности, костей кисти,позвоночника и тазобедренного сустава, которые находятся при риске в случае остеопении и остеопороза. Существующие стратегии для предупреждения остеопороза могут предоставить некоторую пользу для индивидуумов, но не могут гарантировать освобождение от этого заболевания. Эти стратегии включают снижение физической активности (в частности, активностей, приводящих к увеличению массы) с достижением старости, включение достаточного количества кальция в пищевой рацион и избегание потребления продуктов, содержащих алкоголь или табак. Для пациентов, обнаруживающих клиническую остеопению или остеопороз, все существующие терапевтическиие лекарственные средства и стратегии направлены на уменьшение дополнительной потери костной массы ингибированием процесса резорбции костей, природного компонента процесса ремоделирования, который встречается конститутивно. Например, в настоящее время для замедления потери костной массы прописывают эстроген. Однако, имеется некоторая полемика относительно того, имеется ли долгосрочная польза для пациентов и имеется ли какой-то эффект вообще в случае пациентов в возрасте более 75 лет. Кроме того, считается,что применение эстрогена увеличивает риск рака молочной железы и эндометрия. Высокие дозы пищевого кальция, с витамином или без витамина D, также предлагаются для по-1 022991 стклимактерических женщин. Однако высокие дозы кальция могут часто иметь неприятные побочные желудочно-кишечные эффекты, и постоянно должен проводиться мониторинг уровней кальция в сыворотке и моче (см. Khosla and Rigss, Mayo Clin. Proc. 70:978-982, 1995). Другие терапевтические вещества, которые были предложены, включают кальцитонин, бисфосфонаты, анаболические стероиды и фторид натрия. Однако такие терапевтическиие вещества имеют нежелательные побочные действия (например, кальцитонин и стероиды могут вызывать тошноту и провоцировать иммунную реакцию, бисфосфонаты и фторид натрия могут ингибировать репарацию переломов,даже при умеренном увеличении плотности костей), которые могут предотвращать их применение (см.Khosla and Rigss, supra). Ни одна практикуемая в настоящее время терапевтическая стратегия не включает лекарственное средство, которое стимулирует или усиливает рост новой костной массы. Данное изобретение обеспечивает композиции и способы, которые могут быть использованы для увеличения минерализации кости и,следовательно, могут быть использованы для лечения широкого разнообразия состояний, в которых желательным является увеличение костной массы. Кроме того, данное изобретение обеспечивает другие,связанные с этим преимущества. Сущность изобретения Изобретение относится к антителу или его антиген-связывающему фрагменту, которые специфично связываются с полипептидом склеростина, содержащим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, где указанные антитело или фрагмент связываются с последовательностью аминокислот в пределах аминокислот 57-146 SEQ ID NO:46. Изобретение дополнительно включает клеткухозяина, которая способна продуцировать или экспрессировать указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, и полинуклеотид, кодирующий указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела. Краткое описание графического материала Фиг. 1 является схематической иллюстрацией, сравнивающей аминокислотную последовательностьHuman Dan; Human Gremlin; Human Cerberus и Human Beer. Стрелки указывают цистеиновый скелет. Фиг. 2 суммирует результаты, полученные из обследования различных тканей человека на экспрессию гена TGF-бета-связывающего белка, конкретно, гена Human Beer. Полуколичественную процедуру полимеразной цепной реакции с обращенно-фазовой транскрипцией (ОТ-ПЦР) использовали для амплификации части этого гена из кДНК первой цепи, синтезированной из тотальной РНК (описано более подробно в примере 2 А). Фиг. 3A-3D суммируют результаты, полученные из гибридизации РНК in situ срезов эмбриона мыши с использованием кРНК-зонда, который комплементарен мышиному транскрипту Beer (описано более подробно в примере 2 В). Панель 3 А является поперечным срезом эмбриона 10,5 dpc. Панель 3 В является сагиттальным срезом эмбриона 12,5 dpc, и панели 3 С и 3D являются сагиттальными срезами эмбрионов 15,5 dpc. Фиг. 4 А-4 С иллюстрируют, посредством Вестерн-блот-анализа, специфичность трех различных поликлональных антител в отношении их соответствующих антигенов (описано более подробно в примере 4). Фиг. 4 А показывает специфическую реактивность анти-Н. Beer-антитела в отношении антигена Н.Beer, но не в отношении Н. Dan или Н. Gremlin. Фиг. 4 В показывает реактивность анти-Н. Gremlinантитела в отношении антигена Н. Gremlin, но не Н. Beer или Н. Dan. Фиг. 4 С показывает реактивность анти-Н. Dan-антитела в отношении Н. Dan, но не Н. Beer или Н. Gremlin. Фиг. 5 иллюстрирует, посредством Вестерн-блот-анализа, селективность TGF-бета-связывающего белка, Beer, в отношении ВМР-5 и ВМР-6, но не ВМР-4 (описано более подробно в примере 5). Фиг. 6 демонстрирует, что ионное взаимодействие между TGF-бета-связывающим белком, Beer, и ВМР-5 имеет константу диссоциации в диапазоне 15-30 нМ. Фиг. 7 представляет выравнивание района, содержащего характерный цистиновый узел полипептида SOST (склеростина) и его ближайших гомологов. Три дисульфидные связи, которые образуют цистиновый узел, проиллюстрированы жирными линиями. Дополнительная дисульфидная связь, показанная пунктирной линией, является уникальной для этого семейства, и она соединяет концы двух -шпилек в 3D-структуре. Изображенные полипептиды являются SOST: склеростин (SEQ ID NO:126); CGHB: Хорионический Гонадотропин (3 человека (SEQ ID NO:127); FSHB: бета-субъединица фолликулостимулирующего гормона (SEQ ID NO: 128); TSHB: предшественник бета-цепи тиротропина (SEQ ID NO: 129);VWF: фактор фон Виллебранда (SEQ ID NO:130); MUC2: предшественник муцина 2 человека (SEQ ID(SEQ ID NO:134); CTGF: предшественник фактора роста соединительной ткани (SEQ ID NO:135); NOV:NovH (гомолог белка сверхэкспрессируемого гена нефробластомы) (SEQ ID NO:136); CYR6: (SEQ IDNO:137). Фиг. 8 иллюстрирует 3D-модель внутреннего района (кора) SOST (SOSTCore). Фиг. 9 представляет 30-модель внутреннего района (кора) гомодимера SOST. Фиг. 10 А и 10 В представляют выравнивание аминокислотных последовательностей Noggin из пяти различных животных: человека (NOGGJHUMAN (SEQ ID NO:138); курицы (NOGGCHICK, SEQ IDNO:139); Африканской шпорцевой лягушки (NOGGXENLA, SEQ ID NO:140); NOGGFUGRU, SEQ IDNO:141); и полосатой перцины (NOGGZEBRA, SEQ ID NO:142); и SOST из человека (SOSTHUMAN,SEQ ID NO:46), крысы (SOSTRAT, SEQ ID NO:65) и мыши (SOSTMouse, SEQ ID NO:143). Фиг. 11 иллюстрирует структуру комплекса Noggin/BMP-7. Гомодимер BMP показан на нижней части этой фигуры поверхностным способом. Гомодимер Noggin показан на верхней части димера BMP в в виде "огрубленного" изображения. Круги очерчивают N-концевой связывающий район, внутренний (коровый) район и линкер между N-концевым и коровым районами. Фиг. 12 иллюстрирует 30-модель потенциального ВМР-связывающего фрагмента, локализованного в N-концевом районе SOST. Димер BMP показан поверхностным способом, а потенциальный BMPсвязывающий фрагмент показан способом "послеизображения". Отмечен остаток фенилаланина, соответствующий гидрофобному карману на поверхности BMP. Подробное описание изобретения Как отмечалось выше, данное изобретение обеспечивает новый класс или семейство TGF-бетасвязывающих белков, а также анализы для отбора соединений, которые увеличивают минеральное содержание кости и минеральную плотность кости, соединения, которые увеличивают минеральное содержание кости и минеральную плотность кости, и способы использования таких соединений для лечения или предупреждения широкого разнообразия состояний. В одном аспекте данного изобретения обеспечены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, которые выбирают из группы, состоящей из: (а) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей последовательность SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13 или 15, или ее комплементарной последовательности; (b) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты (а) при жестких условиях; и (с) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует TGF-бета-связывающий белок по (а) или (b). В родственных аспектах данного изобретения выделенные молекулы нуклеиновых кислот обеспечивают на основе гибридизации только с частью одной из вышеописанных последовательностей (например, для (а) гибридизация может быть с зондом из по меньшей мере 20, 25, 50 или 100 нуклеотидов, выбранных из нуклеотидов 156-539 или 555-687 SEQ IDNO:1). Как должно быть вполне очевидным, необходимая жесткость, используемая для гибридизации,может варьироваться на основании размера зонда. Например, для 25-мерного зонда жесткие условия могут включать следующее: 60 мМ Трис рН 8,0, 2 мМ ЭДТА, 5 среду Денхардта, 6 SSC, 0,1% (мас./об.)N-лаурилсаркозин, 0,5% (мас./об.) NP-40 (нонидет Р-40) в течение ночи при 45 С с последующими двумя промывками 0,2 SSC/0,1% ДСН при 45-50 С. Для 100-мерного зонда при условиях низкой жесткости подходящие условия могут включать следующее: 5 SSPE, 5 среду Денхардта и 0,5% ДСН в течение ночи при 42-50 С с последующими двумя промывками 2 SSPE (или 2 SSC)/0,1% ДСН при 42-50 С. В родственных аспектах данного изобретения обеспечены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, которые имеют гомологию с последовательностями SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13 или 15 при уровне гомологии 50, 60, 75, 80, 90, 95 или 98% с использованием алгоритма Wilbur-Lipman. Репрезентативные примеры таких выделенных молекул включают, например, молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белок, включающий последовательности SEQ ID NO:2, 6, 10, 12, 14 или 16, или имеют гомологию с этими последовательностями при уровне 50, 60, 75, 80, 90, 95 или 98% гомологии с использованием алгоритма Lipman-Pearson. Выделенные молекулы нуклеиновых кислот обычно имеют размер менее, чем 100 т.п.н. и в некоторых вариантах осуществления размер менее чем 50 т.п.н., 25 т.п.н., 10 т.п.н. или даже 5 т.п.н. Далее выделенные молекулы нуклеиновых кислот в других вариантах осуществления не существуют в "библиотеке" других неродственных молекул нуклеиновых кислот (например, субклоне ВАС, таком как описанный в GenBank Accession No. AC003098 и EMB No. AQ171546). Однако выделенные молекулы нуклеиновых кислот могут быть найдены в библиотеках родственных молекул (например, для перетасовки, такой как описанная в патентах США с номерами 5837458; 5830721 и 5811238). Наконец, выделенные молекулы нуклеиновых кислот, описанные здесь, не включают молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют Dan, Cerberus, Gremlin или SCGF (Патент США 5780263). Данное изобретение обеспечивает также клонирующие векторы, которые содержат вышеупомянутые молекулы нуклеиновых кислот, и экспрессирующие векторы, которые содержат промотор (например, регуляторную последовательность), функционально связанный с одной из вышеупомянутых молекул нуклеиновых кислот. Репрезентативные примеры подходящих промоторов включают тканеспецифические промоторы и промоторы на основе вирусов (например, промоторы на основе CMV, такие какCMV I-Е, ранний промотор SV40 и MuLV LTR). Экспрессирующие векторы могут быть также основаны на вирусах или произведены из вирусов (например, "вирусный вектор"). Репрезентативные примеры вирусных векторов включают вирусные векторы на основе вируса простого герпеса, аденовирусные векторы, аденовирус-ассоциированные векторы и ретровирусные векторы. Обеспечены также клетки-хозяева,содержащие или включающие любой из вышеупомянутых векторов (в том числе, например, клеткихозяева, полученные из человека, обезьяны, собаки, крысы или мыши). В других аспектах данного изобретения обеспечены способы получения TGF-бета-связывающих белков, предусматривающие стадию культивирования вышеупомянутой клетки-хозяина, содержащей вектор, при условиях и времени, достаточных для продуцирования этого TGF-бета-связывающего белка. В других вариантах осуществления белок, продуцируемый этим способом, может быть дополнительно очищен (например, колоночной хроматографией, аффинной очисткой и т.п.). Таким образом, выделенные белки, которые кодируются вышеупомянутыми молекулами нуклеиновых кислот (например, SEQ IDNO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16), могут быть легко получены в соответствии с описанием данной заявки. Следует также отметить, что вышеупомянутые белки или их фрагменты могут быть получены в виде слитых белков. Например, в одном аспекте обеспечены слитые белки, содержащие первый полипептидный сегмент, содержащий TGF-бета-связывающий белок, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, описанной выше, или его часть длиной по меньшей мере 10, 20, 30, 50 или 100 аминокислот, и второй полипептидный сегмент, содержащий не связывающий TGF-бета белок. В некоторых вариантах осуществления вторым полипептидом может быть метка (тэг), подходящая для очистки или узнавания(например, полипептид, содержащий множественные анионные аминокислотные остатки - см. Патент США 4851341), маркер (например, зеленый флуоресцентный белок или щелочная фосфатаза) или токсичная молекула (например, рицин). В другом аспекте данного изобретения обеспечены антитела, которые способны специфически связывать вышеописанный класс TGF-бета-связывающих белков (например, BEER человека). В различных вариантах осуществления это антитело может быть поликлональным антителом или моноклональным антителом (например, полученным из человека или мыши). В других вариантах осуществления это антитело является фрагментом антитела, который сохраняет связывающие характеристики целого антитела(например, F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab или Fv-фрагментом или даже CDR). Обеспечены также гибридомы и другие клетки, которые способны продуцировать или экспрессировать вышеупомянутые антитела. В родственных аспектах данного изобретения обеспечены способы детектирования TGF-бетасвязывающего белка, предусматривающие стадии инкубирования антитела, описанного выше, при условиях и в течение времени, достаточных для обеспечения возможности для указанного антитела связыватьTGF-бета-связывающий белок, и детектирования этого связывания. В различных вариантах осуществления это антитело может быть связано с твердым носителем для облегчения промывки или разделения и/или помечено (например, маркером, выбранным из группы, состоящей из ферментов, флуоресцентных белков и радиоизотопов). В других аспектах данного изобретения обеспечены выделенные олигонуклеотиды, которые гибридизуются с молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 или 18 или ее комплементом при жестких условиях. В следующих вариантах осуществления этот олигонуклеотид может быть обнаружен в последовательности, которая кодирует SEQ ID NO.2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16. В некоторых вариантах осуществления этот олигонуклеотид имеет длину по меньшей мере 15,20, 30, 50 или 100 нуклеотидов. В следующих вариантах осуществления этот олигонуклеотид является меченым другой молекулой (например, ферментом, флуоресцентной молекулой или радиоизотопом). Обеспечены также праймеры, которые способны специфически амплифицировать все или часть вышеуказанных молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют TGF-бета-связывающие белки. В данном контексте термин "специфически амплифицировать" должен пониматься как относящийся к праймерам,которые амплифицируют вышеупомянутые TGF-бета-связывающие белки, а не другие TGF-бетасвязывающие белки, такие как Dan, Cerberus, Gremlin или SCGF (патент США 5780263). В родственных аспектах данного изобретения обеспечены способы обнаружения молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует TGF-бета-связывающий белок, предусматривающие стадии инкубирования олигонуклеотида, описанного выше, при жестких условиях и детектирования гибридизации указанного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления этот олигонуклеотид может быть меченым и/или связанным с твердым носителем. В других аспектах данного изобретения обеспечены рибозимы, которые способны расщеплять РНК,которая кодирует один из вышеупомянутых TGF-бета-связывающих белков (например, SEQ ID NO: 2, 6,8, 10, 12, 14 или 16). Такие рибозимы могут состоять из ДНК, РНК (в том числе 2'-Oметилрибонуклеиновых кислот), аналогов нуклеиновых кислот (например, нуклеиновых кислот, имеющих фосфоротиоатные связи) или их смесей. Обеспечены также молекулы нуклеиновых кислот (например, ДНК или кДНК), которые кодируют эти рибозимы, и векторы, которые способны экспрессировать или продуцировать рибозимы. Репрезентативные примеры векторов включают плазмиды, ретротранспозоны, космиды и векторы на основе вирусов (например, вирусные векторы, генерируемые по меньшей мере отчасти, из ретровируса, аденовируса или аденоассоциированного вируса). Обеспечены также клетки-хозяева (например, клетки человека, собаки, крысы или мыши), которые содержат эти векторы. В некоторых вариантах осуществления, эти клетки-хозяева могут быть стабильно трансформированы вектором. В следующих аспектах данного изобретения обеспечены способы получения рибозимов или синтетически, или транскрипцией in vitro или in vivo. В других вариантах осуществления полученные таким образом рибозимы могут быть дополнительно очищены и/или приготовлены в виде фармацевтических композиций (например, рибозим или молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая этот рибозим, вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем). Подобным образом, антисмысловые олигонуклеотиды и антитела или другие выбранные молекулы, описанные здесь, могут быть приготовлены в фармацевтических композициях. В других аспектах данного изобретения обеспечены антисмысловые олигонуклеотиды, включающие молекулу нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 или 15, или с ее комплементом, причем указанный олигонуклеотид ингибирует экспрессию TGF-бета-связывающего белка, описанного здесь (например, BEER человека). В различных вариантах осуществления олигонуклеотид имеет длину 15, 20, 25, 30, 35, 40 или 50 нуклеотидов. Предпочтительно этот олигонуклеотид имеет длину менее, чем 100, 75 или 60 нуклеотидов. Как должно быть вполне очевидно, этот олигонуклеотид может состоять из одного или нескольких аналогов нуклеиновых кислот, рибонуклеиновых кислот или дезоксирибонуклеиновых кислот. Далее, этот олигонуклеотид может быть модифицирован одной или несколькими связями, в том числе, например,ковалентной связью, такой как фосфоротиоатная связь, фосфотриэфирная связь, метилфосфонатная связь, метилен(метилимино)-связь, морфолино-связь, амидная связь, полиамидная связь, межсахарная алкильная связь с короткой цепью, циклоалкильная межсахарная связь, гетероатомная межсахарная связь с короткой цепью и гетероциклическая межсахарная связь. Один реперезентативный пример химерного олигонуклеотида описан в патенте США 5989912. Еще в одном аспекте данного изобретения обеспечены способы увеличения минерализации кости,предусматривающие введение в теплокровное животное эффективного количества описанного здесь рибозима. В родственных аспектах такие способы предусматривают стадию введения пациенту эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, описанных здесь, которые способны продуцировать желаемый рибозим при условиях, способствующих транскрипции этой молекулы нуклеиновой кислоты для получения рибозима. В других аспектах данного изобретения обеспечены трансгенные животные, не являющиеся человеком. В одном варианте осуществления обеспечено трансгенное животное, зародышевые клетки и соматические клетки которого содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую TGF-бетасвязывающий белок, описанный выше, который функционально связан с промотором, эффективным для экспрессии гена, который введен в это животное или предка этого животного на эмбриональной стадии,при условии, что указанное животное не является человеком. В других вариантах осуществления, обеспечены трансгенные животные с нокаутом гена, включающие животное, зародышевые клетки и соматические клетки которого содержат нарушение по меньшей мере одного аллеля эндогенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует TGFбета-связывающий белок, описанный здесь, где это нарушение предотвращает транскрипцию информационной РНК из указанного аллеля по сравнению с животным без этого разрушения, при условии, что это животное не является человеком. В различных вариантах осуществления этим нарушением является делеция, замена или инсерция нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления этим трансгенным животным является мышь, крыса, овца, свинья или собака. В следующих аспектах данного изобретения обеспечены наборы для детектирования экспрессииTGF-бета-связывающего белка, содержащие контейнер, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из (а) молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 или 101; (b) молекулы нуклеиновой кислоты, включающей комплемент нуклеотидной последовательности (а); (с) молекулы нуклеиновой кислоты, которая является фрагментом (а) или (b) с длиной по меньшей мере 15, 20, 30, 50, 75 или 100 нуклеотидов. Обеспечены также наборы для детектирования TGF-бета-связывающего белка, которые содержат контейнер, содержащий одно из описанных здесь антител против TGF-бета-связывающего белка. Например, в одном аспекте данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) смешивания одного или нескольких кандидатных молекул с TGF-бета-связывающим белком, кодируемым молекулой нуклеиновой кислоты по п.1, и выбранного члена TGF-бета-семейства белков (например,BMP 5 или 6), (b) определения, изменяет ли кандидатная молекула передачу сигнала члена TGF-бетасемейства или изменяет ли связывание TGF-бета-связывающего белка с членом TGF-бета-семейства. В некоторых вариантах осуществления эта молекула изменяет способность TGF-бета функционировать в качестве положительного регулятора дифференцировки мезенхимальных клеток. В этом аспекте данного изобретения кандидатная молекула (кандидатные молекулы) могут изменять передачу сигнала или связывание, например, или уменьшением (например, ингибированием), или увеличением (например, усилением) передачи сигнала или связывания. Еще в одном аспекте обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадию определения, ингибирует ли выбранная молекула связывание TGF-бета-связывающего белка с костью, или ее аналогом. Репрезентативные примеры кости или ее аналогов включают гидроксиапатит и пробы первичной кости человека, полученные посредством биопсии. В некоторых вариантах осуществления описанных выше способов выбранная молекула содержится в смеси молекул, и эти способы могут дополнительно предусматривать стадию выделения одной или нескольких молекул, которые являются функциональными в этом анализе. В других вариантах осуществления TGF-бета-семейство белков связывают с твердым носителем и измеряют связывание TGF-бетасвязывающего белка, или TGF-бета-связывающий белок связывают с твердым носителем и измеряют связывание TGF-бета-белков. С использованием таких способов, как описанные выше, большое разнообразие молекул может быть проанализировано на их способность увеличивать минеральное содержание кости ингибированием связывания TGF-бета-связывающего белка с TGF-бета-семейством белков. Репрезентативные примеры таких молекул включают белки или пептиды, органические молекулы и молекулы нуклеиновых кислот. В других родственных аспектах данного изобретения обеспечены способы увеличения минерального содержания кости у теплокровного животного, предусматривающие стадию введения теплокровному животному терапевтически эффективного количества молекулы, идентифицированной из описанных здесь анализов. В другом аспекте обеспечены способы увеличения минерального содержания кости у теплокровного животного, предусматривающие стадию введения теплокровному животному терапевтически эффективного количества молекулы, которая ингибирует связывание TGF-бета-связывающего белка с TGF-бета-суперсемейством белкоа, в том числе костных морфогенетических белков (BMP). Репрезентативные примеры подходящих молекул включают антисмысловые молекулы, рибозимы, гены рибозимов и антитела (например, гуманизированное антитело), которые специфически узнают и изменяют активность TGF-бета-связывающего белка. В другом аспекте данного изобретения обеспечены способы увеличения минерального содержания кости у теплокровного животного, предусматривающие стадии: (а) введения в клетки, которые направляются домой - в кость, вектора, который управляет экспрессией молекулы, ингибирующей связывание(BMP), и (b) введение содержащих вектор клеток в теплокровное животное. Должно быть понятно, в данном контексте, что клетки направляются домой - в кость, если они локализованы в костном матриксе после периферического введения. В одном варианте осуществления такие способы дополнительно включают, перед стадией введения, выделение клеток из костного мозга, которые направляются домой в кость. В следующем варианте осуществления клетки, которые направляются домой - в кость, выбирают из группы, состоящей из CD34+ клеток и остеобластов. В других аспектах данного изобретения обеспечены (предпочтительно выделены) молекулы, которые ингибируют связывание TGF-бета-связывающего белка с TGF-бета-суперсемейством белков. В следующих вариантах осуществления эти молекулы могут быть обеспечены в виде композиции и могут дополнительно содержать ингибитор резорбции кости. Репрезентвтивные примеры таких ингибиторов включают кальцитонин, эстроген, бифосфонат, фактор роста, имеющий антирезорбирующую активность и тамоксифен. Репрезентативные примеры молекул, которые могут быть использованы в вышеупомянутых контекстах, включают, например, рибозимы, гены рибозимов, антисмысловые молекулы и/или антитела (например, гуманизированные антитела). Такие молекулы могут в зависимости от их выбора использоваться для изменения, антагонистического или агонистического действия на передачу сигнала или связывание члена семейства TGF-бета-связывающих белков, описанных здесь. В различных вариантах осуществления данного изобретения вышеописанные молекулы и способы лечения или предупреждения могут быть использованы в случае таких состояний, как остеопороз, остеомаляция, периодонтальное заболевание, цинга, болезнь Кушинга, перелом кости, и состояний, обусловленных иммобилизацией конечности и применением стероидов. Данное изобретение обеспечивает также антитела, которые специфически связываются с TGF-бетасвязывающим белком, склеростином (SOST), и обеспечивает иммуногены, содержащие пептиды склеростина, произведенные из районов склеростина, которые взаимодействуют с членом TGF-бетасуперсемейства, таким как костный морфогенетический белок. В одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются специфически с полипептидом склеростина, включающим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, 6, 8, 14, 46 или 65, где это антитело конкурентно ингибирует связывание полипептида SOST по меньшей мере с одним из сайтов: (i) сайтом связывания рецептора Типа I костного морфогенетического белка (BMP) и (ii) сайтом связывания рецептора Типа II BMP, где сайт связывания рецептора Типа I BMP способен связываться с полипептидом рецептора типа I BMP, включающим аминокислотную последовательность, представленную в GenBank Acc.NM004329 (SEQ ID NO:102);NO:106); D38082 (SEQ ID NO:107); NP001194 (SEQ ID NO:108); BAA19765 (SEQ ID NO:109) или ААВ 33865 (SEQ ID NO:110), и где сайт связывания рецептора Типа II BMP способен связываться с полипептидом рецептора Типа II BMP, включающим аминокислотную последовательность, представленную в GenBank Acc.U25110 (SEQ ID NO:111); NM033346 (SEQ ID NO:112); Z48923 (SEQ ID ния данное изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются специфически с полипептидом склеростина и которые нарушают образование гомодимера склеростина, где этот полипептид склеростина включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, 6, 8, 14, 46 или 65. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения это антитело является поликлональным антителом. В других вариантах осуществления это антитело является моноклональным антителом,которое является моноклональным антителом мыши, человека, крысы или хомячка. Данное изобретение обеспечивает также гибридомную клетку или клетку-хозяина, которая способна продуцировать это моноклональное антитело. В других вариантах осуществления данного изобретения это антитело является гуманизированным антителом или химерным антителом. Данное изобретение обеспечивает дополнительно клетку-хозяина, которая продуцирует гуманизированное или химерное антитело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела является фрагментом F(ab')2, Fab',Fab, Fd или Fv. Данное изобретение обеспечивает также антитело, которое является одноцепочечным антителом, и обеспечивает клетку-хозяина, которая способна экспрессировать это одноцепочечное антитело. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую такие антитела и физиологически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает иммуноген, содержащий пептид, содержащий по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более, чем 50 последовательных аминокислот полипептида SOST, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, 6, 8, 14, 46 или 65, где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом SOST и которое конкурентно ингибирует связывание полипептида SOST по меньшей мере с одним из сайтов: (i) сайтом связывания рецептора Типа I костного морфогенетического белка (BMP) и (ii) сайтом связывания рецептора Типа II BMP, где сайт связывания рецептора Типа I BMP способен связываться с полипептидом рецептора типа I BMP, включающим аминокислотную последовательность,представленную в GenBank Acc.NM004329 (SEQ ID NO:102); D89675 (SEQ ID NO:103);NO:107); NP001194 (SEQ ID NO:108); BAA19765 (SEQ ID NO:109) или ААВ 33865 (SEQ ID NO:110), и где сайт связывания рецептора Типа II BMP способен связываться с полипептидом рецептора Типа II(SEQ ID NO:111); NM033346 (SEQ ID NO:112); Z48923 (SEQ ID NO:114); CAA88759 (SEQ ID NO:115) или NM001204 (SEQ ID NO:113). Данное изобретение обеспечивает также иммуноген, содержащий пептид, который содержит по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более, чем 50 последовательных аминокислот полипептида SOST, включающего аминокислотную последовательность,представленную в SEQ ID NO:2, 6, 8, 14, 46 или 65, где этот пептид способен индуцировать в животном,не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом SOST и которое нарушает образование гомодимера SOST. В некоторых конкретных вариантах осуществления иммуногены рассматриваемого изобретения связаны с молекулой-носителем. В некоторых вариантах осуществления молекула-носитель является полипептидом-носителем и в конкретных вариантах осуществления этот полипептид-носитель является гемоцианином фиссуреллы. Данное изобретение обеспечивает также способ получения антитела, которое специфически связывается с полипептидом SOST, предусматривающий иммунизацию животного, не являющегося человеком, иммуноегном, содержащим по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более, чем 50 последовательных аминокислот полипептида SOST, где (а) указанный полипептид SOST включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, 6, 8, 14, 46 или 65, (b) это антитело конкурентно ингибирует связывание полипептида SOST по меньшей мере с одним из сайтов: (i) сайтом связывания рецептора Типа I костного морфогенетического белка (BMP) и (ii) сайтом связывания рецептора Типа II BMP, (с) сайт связывания рецептора Типа I BMP способен связываться с полипептидом рецептора типа I BMP, включающим аминокислотную последовательность, представленную в GenBankBAA19765 (SEQ ID NO:109) или ААВ 33865 (SEQ ID NO:110), и (d) сайт связывания рецептора Типа IIBMP способен связываться с полипептидом рецептора Типа II BMP, включающим аминокислотную последовательность, представленную в GenBank Acc.U25110 (SEQ ID NO:111); NM033346 (SEQ IDNO:112); Z48923 (SEQ ID NO:114); CAA88759 (SEQ ID NO:115) или NM001204 (SEQ ID NO:113). В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ получения антитела,которое специфически связывается с полипептидом SOST, включающим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 или 65, предусматривающий иммунизацию животного, не являющимся человеком, иммуногеном, содержащим по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более, чем 50 последовательных аминокислот полипептида SOST, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:2, 6, 8, 14, 46 или 65, где это антитело нарушает образование гомодимера SOST. Эти и другие аспекты данного изобретения будут очевидными после ссылки на следующее подробное описание и сопутствующие фигуры. Кроме того, документы, включающие различные приведенные здесь ссылки, которые описывают более подробно некоторые процедуры или композиции (например,плазмиды и т.д.), полностью включены в качестве ссылок. Определения Перед подробным изложением данного изобретения может быть полезным для его понимания приведение определений некоторых терминов и перечисление и определение аббревиатур, которые будут использованы далее."Молекула" включает белки или пептиды (например, антитела, рекомбинантные партнеры по связыванию, пептиды с желаемой аффинностью связывания), нуклеиновые кислоты (например, ДНК, РНК,химерные молекулы нуклеиновых кислот и аналоги нуклеиновых кислот, такие как ПНК) и органические или неорганические соединения."TGF-бета" включает любой известный или новый член TGF-бета-суперсемейства, который включает также костные морфогенетические белки (BMP).TGF-бета-суперсемейства (в том числе костных морфогенетических белков (BMP."TGF-бета-связывающий белок" обозначает белок со специфической аффинностью связывания в отношении конкретного члена или субпопуляции членов TGF-бета-суперсемейства (в том числе костных морфогенетических белков (BMP. Конкретные примеры TGF-бета-связывающих белков включают белки, кодируемые последовательностями SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 и 101. Ингибирование "связывания TGF-бета-связывающего белка с TGF-бета-семейством белков и костными морфогенетическими белками (BMP)" относится к молекулам, которые делают возможной активацию TGF-бета- или костных морфогентических белков (BMP) или делают возможным связывание членовTGF-бета-семейства, в том числе костных морфогенетических белков (BMP), с их соответствующими рецепторами, посредством удаления или предотвращения TGF-бета от связывания с TGF-бетасвязывающим белком. Такое ингибирование может выполняться, например, молекулами, которые ингибируют связывание TGF-бета-связывающего белка со специфическими членами TGF-бетасуперсемейства."Вектор" обозначает ансамбль, который способен управлять экспрессией желаемого белка. Вектор должен включать промоторные элементы транскрипции, которые функционально связаны с представляющим интерес геном (представляюими интерес генами). Вектор может состоять из ДНК, РНК или комбинации этих двух компонентов (ДНК-РНК-химерный вектор). Необязательно, вектор може включать последовательность полиаденилирования, один или несколько сайтов рестрикции, а также один или несколько селектируемых маркеров, таких как неомицинфосфотрансфераза или гигромицинфосфотрансфераза. Дополнительно, в зависимости от выбранной клетки-хозяина и используемого вектора, в описанные здесь векторы могут быть также включены другие генетические элементы, такие как сайт инициации репликации, дополнительные сайты рестрикции нуклеиновых кислот, энхансеры, последовательности,придающие индуцибельность транскрипции, и селектируемые маркеры."Выделенная молекула нуклеиновой кислоты" обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геномную ДНК организма. Например, ДНК-молекула, которая кодирует TGF-бетасвязывающий белок, которая была выделена из геномной ДНК эукариотической клетки, является выделенной молекулой ДНК. Другим примером выделенной молекулы нуклеиновой кислоты является химически синтезированная молекула нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геном организма. Выделенной молекулой нуклеиновой кислоты может быть геномная ДНК, кДНК, РНК или молекула,составленная по меньшей мере частично из аналогов нуклеиновых кислот."Выделенный полипептид" является полипептидом, который, по существу, свободен от загрязняющих клеточных компонентов, таких как углеводы, липиды или другие небелковые примеси, ассоциированные с этим полипептидом в природе. Предпочтительно такие выделенные полипептиды являются по меньшей мере на приблизительно 90% чистыми, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95% чистыми и наиболее предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 99% чистыми. В некоторых вариантах осуществления конкретный препарат белка содержит выделенный полипептид,если он появляется номинально в виде единственной полосы при электрофорезе в ДСН-ПААГ с окрашиванием Кумасси. Термин "выделенный", при применении к органическим молекулам (например, небольшим органическим молекулам) означает, что эти соединения являются более чем на 90%, чистыми согласно способам, хорошо известным в данной области (например, ЯМР, точка кипения)."Склеростеоз" является термином, который использовался Hansen (1967) (Hansen, H.G.,Sklerosteose, in: Opitz, H.; Schmidt, F, Handbuch der Kinderheilkunde. Berlin: Springer (pub.) 6 1967. Pp. 351355) в отношении нарушения, сходного с синдромом ван Бухема генерализованного кортикального гиперостоза, но, возможно, отличающегося радиологическим изображением изменений костей и присутствием асиммметричной кожной синдактилии указательного и среднего пальцев во многих случаях. Подбородок имеет обычно квадратный вид в этом состоянии."Гуманизированные антитела" являются рекомбинантными белками, в которых определяющие комплементарность районы моноклональных антител мыши или другого животного, не являющегося человеком, были перенесены из вариабельных районов тяжелых и легких цепей из иммуноглобулина мыши или другого животного, не являющегося человеком, в вариабельный домен человека. В данном контексте "фрагмент антитела" является частью антитела, такой как F(ab')2, F(ab)2, Fab',Fab и т.п. Независимо от структуры, фрагмент антитела связывается с тем же самым антигеном, который узнается интактным антителом. Например, фрагмент моноклонального антитела против TGF-бетасвязывающего белка связывается с эпитопом TGF-бета-связывающего белка. Термин фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент включает также любой синтетический или генетически сконструированный белок, который действует подобно антителу посредством связывания специфического антигена с образованием комплекса. Например, фрагменты антител включают выделенные фрагменты, состоящие из вариабельного района легкой цепи, "Fv"-фрагменты, состоящие из вариабельных районов тяжелой и легкой цепей, рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, в которых вариабельные районы легкой и тяжелой цепей соединены пептидным линкером ("sFvбелки"), и минимальные единицы узнавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельный район."Детектируемая метка" является молекулой или атомом, которые могут быть конъюгированы с полипептидной частью, такой как часть антитела или часть нуклеиновой кислоты, для получения молекулы, полезной для диагностики. Примеры детектируемых меток включают хелаторы, фотоактивные агенты, радиоизотопы, флуоресцентные агенты, парамагнитные ионы, ферменты и другие маркерные молекулы. В данном контексте, "иммуноконъюгат" является молекулой, содержащей антитело против TGFбета-связывающего белка, или фрагмент антитела, и детектируемую метку или эффекторную молекулу. Предпочтительно, иммуноконъюгат имеет в грубом приближении такую же, или только слегка уменьшенную, способность связывать TGF-бета-связывающий белок после конъюгации, что и до конъюгации. Аббревиатуры: TGF-бета - "трансформирующий фактор роста бета"; TGF-bBP - "трансформирующий фактор роста бета-связывающий белок" (один репрезентативный TGF-bBP обзначается как "Н,BEER"); BMP - "костный морфогенетический белок"; ПЦР - "полимеразная цепная реакция"; ОТ-ПЦР ПЦР-процесс, в котором РНК сначала транскрибируют в ДНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ); "ДНК - любая ДНК, полученная копированием РНК-последовательности в ДНК-форму. Как отмечалось выше, данное изобретение обеспечивает новый класс TGF-бета-связывающих белков, а также способы и композиции для увеличения минерального содержания кости у теплокровных животных. Вкратце, данное изобретение основывается на неожиданном открытии, что мутация в гене,который кодирует новый член семейства TGF-бета-связывающих белков, приводит к редкому состоянию(склеростеозу), характеризующемуся минеральными содержаниями кости, которые являются в один раз четыре раза более высокими, чем у нормальных индивидуумов. Таким образом, как обсуждается более подробно ниже, это открытие привело к развитию анализов, которые могут быть использованы для отбора молекул, которые ингибируют связывание TGF-бета-связывающего белка с семейством белков TGFбета и костными морфогенетическими белками (BMP), и способов использования таких молекул для увеличения минерального содержания кости теплокровных животных (в том числе, например, людей). Обсуждение заболевания, известного как склеростеоз Склеростеоз является заболеванием, родственным атипичной минеральной плотности кости у людей. Склеростеоз является термином, который применялся Hansen (1967 (Hansen H.G., Sklerosteose, in:Opitz H.; Schmidt R, Handbuch der Kinderheilkunde. Berlin: Springer (pub.) 6 1967. Pp. 351-355) в отношении нарушения, сходного с синдромом ван Бухема генерализованного кортикального гиперостоза, но,возможно, отличающегося радиологическим изображением изменений костей и присутствием асиммметричной кожной синдактилии указательного и среднего пальцев во многих случаях. В настоящее время известно, что склеростеоз является аутосомным полудоминантным нарушением,которое характеризуется широко диссеминированными склеротическими повреждениями кости у взрослого человека. Это состояние является прогрессирующим. Склеростеоз имеет также связанный с развитием аспект, который связан с синдактилией (два или более пальцев слиты вместе). Синдром склеростеоза ассоциирован с высоким ростом, и многие пораженные индивидуумы достигают высоты шесть или более футов. Минеральное содержание кости гомозигот может быть в 1-6 раз большим, чем наблюдаемое у нормальных индивидуумов, и минеральная плотность кости может быть в 1-4 раза выше нормальных величин (например, из непораженных сибсов). Синдром склеростеоза встречается прежде всего у африканцев нидерланского происхождения в Южной Африке. Приблизительно 1/140 индивидуумов в населении Африки являются носителями этого мутированного гена (гетерозиготами). Эта мутация обнаруживает 100% пенетрантность. Имеются невероятные сообщения об увеличенной минеральной плотности кости в гетерозиготах без ассоциированных патологий (синдактилии или разрастания черепа). Отсутствие аномалии системы гипофиз-гипоталамус наблюдали у пациентов со склеростеозом. В частности, по-видимому, нет сверхпродуцирования гормона роста и кортизона. Кроме того, уровни по-9 022991 ловых гормонов являются нормальными у пораженных индивидуумов. Однако маркеры обновления кости (остеобласт-специфическая щелочная фосфатаза, остеокальцин, пропептид проколлагена С типа 1(PICP) и общая щелочная фосфатаза; (см. Cornier С., Curr. Opin. in Rheu. 7:243, 1995) показывают, что имеется гиперостеобластическая активность, ассоциированная с этим заболеванием, но имеется нормальная - слегка уменьшенная активность остеокластов, как измерено с использованием маркеров резорбции кости (пиридинолина, дезоксипиридинолина, N-телопептида, гидроксипролина мочи, тартратустойчивых кислых фосфатаз плазмы и галактолилгидроксилизина (см. Cornier, supra. Склеростеоз характеризуется непрерывным депонированием минералов кости по всему скелету во время времени жизни пораженных индивидуумов. В гомозиготах непрерывное депонирование минералов кости приводит к разрастанию кости в зонах скелета, в которых отсутствуют механорецепторы (череп, подбородок, мозговой череп). В гомозиготах со склеростеозом разрастание костей черепа приводит к сдавливанию черепа и со временем к смерти вследствие избыточного гидростатического давления на ствол мозга. Во всех других частях скелета имеется генерализованный или диффузный склероз. Кортикальные зоны длинных (трубчатых) костей сильно утолщаются, приводя к существенному увеличению прочности кости. Губчатые соединения увеличиваются по толщине, что, в свою очередь, увеличивает прочность губчатой кости. Склеротические кости, по-видимому, являются непрозрачными для рентгеновских лучей. Как описано более подробно в примере 1, редкая генетическая мутация, которая является ответственной за синдром склеростеоза, была обнаружена в хромосоме 17 человека, которая кодирует новый член смейства TGF-бета-связывающих белков (один репрезентативный пример назван "Н. Beer"). Как описано более подробно ниже, на основании этого открытия механизм минерализации кости стал более полно понимаемым, что позволяет разработку анализов на молекулы, которые увеличивают минерализацию кости, и использование таких молекул для увеличения минерального содержания кости и для лечения или предупреждения большого числа заболеваний.TGF-бета-суперсемейство Суперсемейство трасформирующих факторов роста бета (TGF-бета) содержит различные факторы роста, которые имеют общие элементы и структурные мотивы последовательности (как на вторичном,так и на третичном уровне). Известно, что это семейство белков проявляет широкий спектр биологических реакций, которые влияют на большое разнообразие типов клеток. Многие из членов семейства TGFбета имеют важные функции во время эмбрионального развития в процессе приобретения упорядоченного распределения типов клеток и активностей и спецификации ткани; у взрослых члены этого семейства участвуют, например, в заживлении ран, репарации и ремоделировании кости и в модуляции иммунной системы. Кроме TGF-бета это суперсемейство включает костные морфогенетические белки (BMP), активины, ингибины, факторы роста и дифференцировки (GDF) и нейротрофические факторы глиального происхождения (GDNF). Первичная классификация установлена посредством общих признаков последовательности, которые относят конкретный белок к общему подсемейству. Дополнительное расслоение в этом подсемействе является возможным вследствие более строгой консервации последовательности между членами меньших групп. В некоторых случаях, таких как ВМР-5, ВМР-6 и ВМР-7, идентичность аминокислот может быть такой высокой, как 75%, среди членов этой меньшей группы. Этот уровень идентичности позволяет единственной реперезентативной последовательности иллюстрировать ключевые биохимические элементы данной подгруппы, которые выделяют ее из других членов большего семейства. Кристаллическая структура TGF-бета 2 была определена. Общая укладка TGF-бета 2-мономера содержит стабильную, компактную цистеиновую, подобную узлу структуру, образованную тремя дисульфидными мостиками. Димеризация, стабилизированная одним дисульфидным мостиком, является антипараллельной.TGF-бета передает сигналы посредством индукции образования гетероолигомерных комплексов рецепторов типа I и типа II. Трансдукция сигналов TGF-бета включает эти два отличающиеся подсемейства типа I и типа II трансмембранных серин/треонинкиназных рецепторов. Были идентифицированы по меньшей мере семь рецепторов типа I и пять рецепторов типа II (см. Kawabata et al., Cytokine Growth Factor Rev. 9:49-61 (1998); Miyazono et al., Adv. Immunol. 75:115-57 (2000). Члены семейства TGF-бета инициируют свое клеточное действие посредством связывания с рецепторами с присущей им серин/треонинкиназной активностью. Каждый член TGF-бета-семейства связывается с характерной комбинацией рецепторов типа I и типа II, оба из которых являются необходимыми для передачи сигнала. В существующей модели активации рецептора TGF-бета TGF-бета-лиганд сначала связывается с рецептором типа II (TbR-II), который встречается в клеточной мембране в олигомерной форме с активированной киназой. После этого рецептор типа I (TbR-I), который не может связывать лиганд в отсутствие TbRII,рекрутируется в этот комплекс для образования тройного комплекса лиганд/тип II/тип I. Затем TbR-II фосфорилирует TbR-I преимущественно в домене, богатом остатками глицина и серина (GS-домене), в расположенном рядом с мембраной районе и тем самым активирует TbR-I. Затем эта активированная киназа рецептора типа I фосфорилирует конкретные члены Smad-семейства белков, которые перемещаются в ядро, где они модулируют транскрипцию специфических генов. Костные морфогенетические белки (BMP) являются ключевыми регуляторными белками в определении минеральной плотности кости у людей Главным успехом в понимании остеогенеза была идентификация костных морфогенетических белков (BMP), также известных как остеогенные белки (ОР), которые регулируют дифференцировку хряща и кости in vivo. BMP/OP индуцируют дифференцировку кости через каскад событий, которые включают образование хряща, гипертрофию и кальцификацию хряща, васкулярную инвазию, дифференцировку остеобластов и образование кости. Как описано выше, ВМР/ОР (BMP 2-14 и остеогенные белки 1 и 2(BMP9); GenBank 095393 (BMP10); GenBank 095390 (BMP11, предшественник фактора 11 роста/дифференцировки (GDF-11; GenBank 095972 (BMP15 являются членами суперсемейства TGF-бета. Поразительное эволюционное сохранение между членами подсемейства ВМР/ОР предполагает, что они являются решающими в нормальном развитии и функционировании животных. Кроме того, присутствие множественных форм ВМР/ОР вызывает важный вопрос о биологическом значении этой видимой избыточности. Кроме постфетального хондрогенеза и остеогенеза ВМР/ОР играют множественные роли в скелетогенезе (в том числе, в развитии черепно-лицевых и зубных тканей) и в эмбриональном развитии и органогенезе паренхиматозных органов, в том числе, почек. В настоящее время понятно, что природа основывается на общих (и находящихся в небольшом количестве) молекулярных механизмах, созданных для обеспечения появления специализированных тканей и органов. Суперсемейство ВМР/ОР является изящным примером бережливости природы в программировании множественных специализированных функций, использующих молекулярные изоформы с минорными вариациями в аминокислотных мотивах в высоко консервативных карбоксиконцевых районах.BMP синтезируются в виде больших белков-предшественников. После димеризации BMP протеолитически расщепляются в клетке с образованием карбоксиконцевых зрелых белков, которые затем секретируются из клетки. BMP, подобно другим членам семейства TGF-бета, инициируют трансдукцию сигнала связыванием кооперативно с серин/треонинкиназными рецепторами как типа I, так и типа II. Рецепторы типа I, в отношении которых BMP могут действовать в качестве лигандов, включают BMPRIA (также известный как ALK-3), BMPR-IB (также известный как ALK-6), ALK-1 и ALK-2 (также известный как ActR-I). Из рецепторов типа II, BMP связывается с рецептором BMP типа II (BMPR-II), активином типа II (ActR-II) и активином типа IIB (ActR-IIB). (См. Balemans et al., supra и ссылки в этой работе). Полинуклеотидные последовательности и кодируемая аминокислотная последовательность полипептидов рецептора типа I BMP обеспечены в базе данных GenBank, например, NM004329 (SEQ IDNO:119); NM030849 (SEQ ID NO:106, кодируемая SEQ ID NO:120) и D38082 (SEQ ID NO:107, кодируемая SEQ ID NO:121). Другие полипептидные последовательности рецепторов типа I обеспечены в базе данных GenBank, например, NP001194 (SEQ ID NO:108); ВАА 19765 (SEQ ID NO:109) и ААВ 33865(SEQ ID NO:110). Полинуклеотидные последовательности и кодируемая аминокислотная последовательность полипептидов рецептора типа II BMP обеспечены в базе данных GenBank, например, U25110 (SEQID NO:125). Дополнительные полипептидные последовательности рецепторов типа II также обеспечены в базе данных GenBank, например, САА 88759 (SEQ ID NO:115).BMP, сходные с другими имеющими цистиновый узел белками, образуют гомодимерную структуру(Scheufler et al., J. Mol. Biol. 287:103-15 (1999. В соответствии с анализом эволюционного прослеживания, выполненного на семействе BMP/TGF-, сайт связывания рецептора типа I BMP и сайт связывания рецептора типа II BMP были картированы на поверхности структуры BMP (Innis et al., Protein Eng. 13:839-47 (2000. Местоположение сайта связывания рецептора типа I на BMP было позднее подтверждено рентгеновской структурой комплекса ВМР-2/рецептор IA BMP (Nickel et al., J. Joint Surg. Am. 83A(Suppl 1(Pt1:S7-S14 (2001. Предсказанный сайт связывания рецептора типа II хорошо согласуется с рентгеновской структурой комплекса TGF-3/рецептор типа II TGF- (Hart et al., Nat. Struct. Biol. 9:203208 (2002, который имеет большое сходство с системой BMP/рецептор IIA BMP. Антагонизм в отношении BMP Подсемейства BMP и активина подвергаются значительной посттрансляционной регуляции, например, TGF-бета-связывающими белками. Существует сложная система внеклеточной регуляции, посредством которой синтезируется и экспортируется высокоаффинный антагонист, и затем он образует комплексы селективно с BMP или активинами для разрушения их биологической активности (W.C.Smith(1999) TIG 15(1) 3-6). Ряд этих природных антагонистов были идентифицированы и, на основе дивергенции последовательности, эти антагонисты, по-видимому, эволюционировали независимо вследствие отсутствия сохранения первичной последовательности. Более ранние исследования этих антагонистов ярко выявили отличающуюся предпочтительность в отношении взаимодействия и нейтрализации ВМР-2 и ВМР-4. У позвоночных антагонисты включают ноггин, хордин, хордин-подобный, фоллистатин, FSPR,семейство белков DAN/Cerberus и склеростин (SOST) (см. Balemans et al., supra и ссылки в этой работе). Механизм антагонизма или ингибирования, по-видимому, отличается для различных антагонистов(lemura et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 9337-9342). Сайты связывания рецепторов типа I и типа II на антагонисте BMP ноогине были также картированы. Ноггин связывается с BMP с высокой аффинностью (Zimmerman et al., 1996). Исследование структуры комплекса ноггин/ВМР-7 выявило связывающие взаимодействия между этими двумя белками(Groppe et al., Nature 420:636-42 (2000. Наложение структуры ноггин-ВМР-7 на модель комплекса передачи сигнала BMP показало, что связывание ноггина эффективно маскирует обе пары связывающих эпитопов (т.е. сайтов связывания рецепторов типа I и типа II BMP) на ВМР-7. Последовательности богатого цистеином каркаса ноггина предшествует N-концевой сегмент из приблизительно 20 аминокислотных остатков, который называют "зажимом" ("клипом") (остатки 28-48). Сайт связывания рецептора типа I закрыт N-концевой частью домена-зажима ноггина, а сайт связывания рецептора типа II закрыт карбоксиконцевой частью этого домена-зажима. Две -цепи во внутреннем (коровом) районе вблизи С-конца ноггина также контактируют с ВМР-7 при сайте связывания рецептора типа II. Этот способ связывания позволяет димеру ноггина эффективно блокировать все сайты связывания рецепторов (два сайта связывания рецептора типа I и два сайта связывания рецептора типа II) на димере BMP. Новые TGF-бета-связывающие белки Как отмечалось выше, данное изобретение обеспечивает новый класс TGF-бета-связывающих белков, которые имеют почти идентичный цистеиновый (дисульфидный) каркас при сравнении с белкамиHuman DAN, Human Gremlin и Human Cerberus и SCGF (Патент США 5780263), но почти не имеют гомологии на уровне нуклеотидов (в отношении предшествующей информации см. в основном Hsu D.R.,Economides A.N., Wang X., Eimon P.M., Harland R.M., "The Xenopus Dorsalizing Factor Gremlin Identifies aNovel Family of Secreted Proteins that Antagonize BMP Activities," Molecular Cell 1:673-683, 1998). Репрезентативные примеры нового класса молекул нуклеиновых кислот, кодирующих TGF-бетасвязывающие белки, описаны в последовательностях SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 и 101. Полинуклеотиды, описанные здесь, кодируют полипептид, названный Beer, который называют здесь также склеростин или SOST. Следует также понимать, что репрезентативные члены этого класса связывающих белков включают варианты TGF-бета-связывающего белка (например, SEQ ID NO:5 и 7). В данном контексте "вариантный ген TGF-бета-связывающего белка" (например, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариант TGF-бета-связывающего белка) обозначает молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является модификацией SEQ ID NO:2, 10, 12, 14, 16, 46 или 65. Такие варианты включают природно встречающиеся полиморфизмы или аллельные варианты генов TGF-бета-связывающих белков, а также синтетические гены, которые содержат консервативные аминокислотные замены этих последовательностей аминокислот. Различные критерии, известные специалистам с квалификацией в данной области, показывают, являются ли аминокислоты в конкретном положении в пептиде или полипептиде подобными. Например, сходной аминокислотой или консервативной аминокислотной заменой является замена, в которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь,причем сходные аминокислоты включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин); кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота); незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии,треонин, тирозин, цистеин, гистидин); неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан); бета-разветвленными боковыми цепями(например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан). Пролин, который, как считается, более трудно классифицировать, имеет общие свойства с аминокислотами, которые имеют алифатические боковые цепи (например, Leu, Val, Ile и Ala). В некоторых обстоятельствах замена глутамином глутаминой кислоты или аспарагином аспарагиновой кислоты может рассматриваться как сходная замена вследствие того, что глутамин и аспарагин являются амидными производными глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, соответственно. Дополнительными вариантными формами гена TGF-бета-связывающего белка являются молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат инсерции или делеции описанных здесь нуклеотидных последовательностей. Вариантные гены TGF-бета-связывающих белков могут быть идентифицированы определением, гибридизуются ли эти гены с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 и 101 в жестких условиях. Кроме того, вариантные гены TGF-бета-связывающих белков должны кодировать белок, имеющий цистеиновый скелет основной цепи. В качестве альтернативы, вариантные гены TGF-бета-связывающих белков могут быть идентифицированы сравнением последовательностей. В данном контексте, две аминокислотные последовательности имеют "100% идентичность аминокислотной последовательности", если аминокислотные остатки этих двух аминокислотных последовательностей являются одинаковыми при выравнивании для макси- 12022991 мального соответствия. Подобным образом, две нуклеотидные последовательности имеют "100% идентичность нуклеотидной последовательности", если нуклеотидные остатки этих двух нуклеотидных последовательностей являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия. Сравнения последовательностей могут выполняться с использованием стандартных программ программного обеспечения, таких как программы, включенные в компьютерный комплект биоинформатики LASERGENE, который производится DNASTAR (Madison, Wisconsin). Другие способы сравнения двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей определением оптимального выравнивания хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области (см., например, Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al., (eds.),"Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997) и Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2ndEdition (Academic Press, Inc. 1998). Вариантные TGF-бета-связывающие белки должны иметь по меньшей мере 50% идентичность аминокислотной последовательности относительно SEQ ID NO:2, 6, 10, 12, 14, 16, 46 или 65 и предпочтительно идентичность, большую чем 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95%. Альтернативно, варианты TGFбета-связывающих белков могут быть идентифицированы по наличию по меньшей мере 70% идентичности нуклеотидной последовательности относительно SEQ ID NO:1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 и 101. Кроме того,данное изобретение рассматривает варианты генов TGF-бета-связывающих белков, имеющие 75, 80, 85,90 или 95% идентичность относительно SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:100. Независимо от конкретного способа, используемого для идентификации вариантного гена TGF-бета-связывающего белка или варианта TGF-бета-связывающего белка, вариантный TGF-бета-связывающий белок или полипептид, кодируемый вариантным геном TGF-бета-связывающего белка, может быть функционально охарактеризован,например, его способностью связываться с выбранным членом TGF-бета-семейства белков и/или ингибировать передачу сигнала выбранного члена TGF-бета-семейства белков или его способностью связываться специфически с антителом против TGF-бета-связывающего белка. Данное изобретение включает функциональные фрагменты генов TGF-бета-связывающих белков. В контексте данного изобретения "функциональный фрагмент" гена TGF-бета-связывающего белка обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует часть полипептида TGF-бета-связывающего белка, которая или (1) обладает вышеупомянутой функциональной активностью, или (2) специфически связывается с антителом против TGF-бета-связывающего белка. Например, функциональный фрагмент гена TGF-бета-связывающего белка, описанный здесь, содержит часть нуклеотидной последовательностиSEQ ID NO:1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 или 101. Выделение гена TGF-бета-связывающего белка Молекулы ДНК, кодирующие TGF-бета-связывающий белок, могут быть получены скринингом библиотеки кДНК или геномной библиотеки человека с использованием полинуклеотидных зондов на основе, например, SEQ ID NO:1. Например, первой стадией в получении кДНК-библиотеки является выделение РНК с использованием способов, хорошо известных специалистам с квалификацией в данной области. Обычно способы выделения РНК обеспечивают способ разрушения клеток, средство ингибирования РНКазной деградации РНК и способ отделения РНК от ДНК-, белковых и полисахаридных загрязнителей. Например, тотальная РНК может быть выделена замораживанием ткани в жидком азоте, растиранием замороженной ткани пестиком в ступке для лизиса клеток, экстракцией измельченной ткани раствором фенол/хлорорм для удаления белков и отделением РНК от оставшихся примесей селективным осаждением хлоридом лития (см., например, Ausubel et al., (eds.), Short Protocols in Molecular biology, 3rdEdition, pages 4-1 - 4-6 (John Wiley amd Sons 1995) ["Ausubel (1995)"]; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, pages 33-41 (CRC Press, Inc. 1997) ["Wu (1997)"]). Альтернативно, тотальная РНК может быть выделена экстракцией измельченной ткани изотиоцианатом гуанидиния, экстракцией органическими растворителями и отделением РНК от загрязнителей с использованием дифференциального центрифугирования (см., например, Ausubel (1995), pages 4-1 -4-6; Wu (1997), pages 33-41). Для конструирования кДНК-библиотеки из препарата тотальной РНК предпочтительно выделяют поли(А+) РНК. Поли(А+) РНК может быть выделена из тотальной РНК с использованием стандартного способа олиго(dT)-целлюлозной хроматографии (см., например, Ausubel (1995), pages 4-11 - 4-12). Двухцепочечные молекулы кДНК могут быть синтезированы из поли(А+) РНК с использованием способов,хорошо известных специалистам с квалификацией в данной области (см., например, Wu (1997), pages 4146). Кроме того, для синтеза двухцепочечных молекул кДНК могут быть использованы коммерчески доступные наборы (например, Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, Maryland); CLONTECH Laboratories, Inc.(Palo Alto, California); Promega Corporation (Madison, Wisconsin); и Stratagene Cloning Systems (La Jolla,California. Основной подход для получения кДНК-клонов TGF-бета-связывающих белков может быть модифицирован конструированием "произведенной путем вычитания" кДНК-библиотеки, которая обогащена специфическими в отношении TGF-бета-связывающих белков кДНК-молекулами. Способы конструирования произведенных путем вычитания библиотек хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области (см., например, Sargent, "Isolation of Differentially Expressed Genes," in Meth. Enzymol.Libraries," in Methods in Gene Biotechnology, pages 29-65 (CRC Press, Inc. 1997. Различные клонирующие векторы являются подходящими для конструирования кДНК-библиотеки. Например, кДНК-библиотека может получена в векторе, полученном из бактериофага, таком как векторgt10 (см., например, Huynh et al., "Constructing and Screening cDNA Libraries ingt10 and gt11," inDNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glover (ed.), page 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997), pages 47-52). Альтернативно, двухцепочечные молекулы кДНК могут быть встроены в плазмидный вектор, такой как вектор pBluescript (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, California), LambdaGEM-4 (Promega Corp.; Madison, Wisconsin) или другие коммерчески доступные векторы. Подходящие клонирующие векторы могут быть также получены из Американской Коллекции Типовых Культур (Rockville, Maryland). Для амплификации клонированных молекул кДНК кДНК-библиотеку встраивают в прокариотического хозяина с использованием стандартных способов. Например, кДНК-библиотека может быть введена в компетентные клетки Е. coli DH5, которые могут быть получены из Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, Maryland). Библиотека геномной ДНК человека может быть получена способами, хорошо известными в данной области (см., например, Ausubel (1995), pages 5-1 - 5-6; Wu (1997), pages 307-327). Геномная ДНК может быть выделена лизисом ткани детергентом Саркозилом, расщеплением этого лизата протеиназой К, осветлением посредством удаления нерастворимых остатоков (дебриса) из лизата центрифугированием, осаждением нуклеиновой кислоты из лизата с использованием изопропанола и очисткой ресуспендированной ДНК в градиенте плотности хлорида цезия. ДНК-фрагменты, которые являются подходящими для получения геномной библиотеки, могут быть получены случайным разрезанием геномной ДНК или частичным расщеплением геномной ДНК рестрикционными эндонуклеазами. Фрагменты геномной ДНК могут быть встроены в вектор, такой как бактериофаг или космидный вектор, в соответствии с общепринятыми способами, такими как использование расщепления рестриктазами для получения подходящих концов, использование обработки щелочной фосфатазой во избежание нежелательного соединения молекул ДНК и лигирование с использованием подходящих лигаз. Способы такой манипуляции являются хорошо известными в данной области (см.,например, Ausubel (1995), pages 5-1 - 5-6; Wu (1997), pages 307-327. Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют TGF-бета-связывающий белок, могут быть также получены с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидными праймерами, имеющими нуклеотидные последовательности, которые основаны на нуклеотидных последовательностях гена TGF-бета-связывающего белка человека, описанного здесь. Общие способы для скрининга библиотек с использованием ПЦР описаны, например, Yu et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction toScreen Phage Libraries," in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 211-215 (Humana Press, Inc. 1993). Кроме того, способы использования ПЦР для выделения родственных генов описаны, например, Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primersand the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members," in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 317-337 (Humana Press, Inc. 1993). Альтернативно, геномные библиотеки человека могут быть получены из коммерческих источников,таких как Research Genetics (Huntsville, AL) и Американская Коллекция Типовых Культур (Rockville,Maryland). Библиотека, содержащая кДНК- или геномные клоны, может быть подвергнута скринингу с использованием одного или нескольких полинуклеотидных зондов на основе SEQ ID NO:1, с использованием стандартных способов, описанных здесь и известных в данной области (см., например, Ausubel(1995), pages 6-1 - 6-11). Антитела против TGF-бета-связывающих белков, полученные как описано здесь, могут быть также использованы для выделения последовательностей ДНК, которые кодируют TGF-бета-связывающий белок, из кДНК-библиотек. Например, эти антитела могут быть использованы для скрининга библиотек экспрессии gt11, или эти антитела могут быть использованы для иммуноскрининга после отбора и трансляции гибридов (см., например, Ausubel (1995), pages 6-12 - 6-16; Margolis et al., "Screeningexpression libraries with antibody and protein probes," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition,Glover et al. (eds.), pages 1-14 (Oxford University Press 1995. Последовательность кДНК TGF-бета-связывающего белка или геномного фрагмента TGF-бетасвязывающего белка может быть определена с использованием стандартных способов. Кроме того, идентификация геномных фрагментов, содержащих промотор или регуляторный элемент TGF-бетасвязывающего белка, может быть достигнута с использованием хорошо установленных способов, таких как делеционный анализ (см. в общем Ausubel (1995), supra). В качестве альтернативы, ген TGF-бета-связывающего белка может быть получен синтезом молекул ДНК с использованием взаимнопраймирующих длинных олигонуклеотидов и нуклеотидных последовательностей, описанных здесь (см., например, Ausubel (1995), pages 8-8 - 8-9). Установленные способы с использованием полимеразной цепной реакции обеспечивают возможность синтеза молекул ДНК с длиной по меньшей мере две т.п.н. (Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131, 1993; Bambot et al., PCRApplications, White (ed.), pages 263-268, (Humana Press, Inc. 1993); Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299, 1995). Получение генов TGF-бета-связывающих белков Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие вариантные гены TGF-бета-связывающих белков, могут быть получены скринингом различных кДНК-библиотек или геномных библиотек полинуклеотидными зондами, имеющими нуклеотидные последовательности на основе SEQ ID NO:1, 5, 9, 11, 13, 15,100 и 101, с использованием процедур, описанных здесь. Варианты генов TGF-бета-связывающих белков могут быть также сконструированы синтетически. Например, может быть изобретена молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, имеющий консервативную аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 или 65. То есть,могут быть получены варианты, которые содержат одну или несколько аминокислотных замен SEQ IDNO: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 или 65, в которых алкиламинокислотой заменяют алкиламинокислоту в аминокислотной последовательности TGF-бета-связывающего белка, ароматической аминокислотой заменяют ароматическую аминокислоту в аминокислотной последовательности TGF-бета-связывающего белка, серусодержащей аминокислотой заменяют серусодержащую аминокислоту в аминокислотной последовательности TGF-бета-связывающего белка, гидроксисодержащей аминокислотой заменяют гидроксиаминокислоту в аминокислотной последовательности TGF-бета-связывающего белка, кислотной аминокислотой заменяют кислотную аминокислоту в аминокислотной последовательности TGF-бетасвязывающего белка, основной аминокислотой заменяют основную аминокислоту в аминокислотной последовательности TGF-бета-связывающего белка или двухосновной монокарбоновой аминокислотой заменяют двухосновную монокарбоновую аминокислоту в аминокислотной последовательности TGFбета-связывающего белка. Среди обычных аминокислот, например, "консервативная аминокислотная замена" иллюстрируется заменой среди аминокислот в каждой из следующих групп: (1) глицин, аланин,валин, лейцин и изолейцин, (2) фенилаланин, тирозин и триптофан, (3) серии и треонин, (4) аспартат и глутамат, (5) глутамин и аспарагин и (6) лизин, аргинин и гистидин. В выполнении таких замен важно,когда это возможно, сохранять цистеиновый скелет, показанный на фиг. 1. Консервативные аминокислотные изменения в гене TGF-бета-связывающего белка могут быть введены заменой другими нуклеотидами нуклеотидов, указанных в SEQ ID NO:1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 и 101. Такие варианты "консервативных аминокислот" могут быть получены, например, олигонуклеотиднаправленным мутагенезом, линкер-сканирующим мутагенезом, мутагенезом с использованием полимеразной цепной реакции и т.п. (см. Ausubel (1995), pages 8-10 - 8-22; McPherson (ed.), Directed Mutagenes:A Practical Approach (IRL Press 1991. Функциональная способность таких вариантов может быть определена с использованием стандартного способа, такого как описанный здесь анализ. Альтернативно, вариантный полипептид TGF-бета-связывающего белка может быть идентифицирован по способности специфически связывать антитела против TGF-бета-связывающего белка. Рутинные делеционные анализы молекул нуклеиновых кислот могут выполняться для получения"функциональных фрагментов" молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид TGFбета-связывающего белка. В качестве иллюстрации молекулы ДНК, имеющие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, могут быть расщеплены нуклеазой Bal31 с получением ряда вмонтированных делеций. Затем эти фрагменты встраивают в экспрессирующие векторы в правильной рамке считывания и экспрессируемые полипептиды выделяют и испытывают на активность или на способность связывать антитела против TGF-бета-связывающего белка. Одной альтернативой экзонуклеазному расщеплению является использование олигонуклеотид-направленного мутагенеза для введения делеций или стопкодонов для спецификации получения желаемого фрагмента. Альтернативно, конкретные фрагменты гена TGF-бета-связывающего белка могут быть синтезированы с использованием полимеразной цепной реакции. Стандартные способы функционального анализа белков описаны, например, Treuter et al., Molec.al., J. Biol. Chem. 270:29270, 1995; Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270: 25291, 1995; Yamaguchi et al.,Biochem. Pharmacol. 50: 1295, 1995; Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1, 1996. Данное изобретение рассматривает также функциональные фрагменты гена TGF-бетасвязывающего белка, которые имеют консервативные замены аминокислот. Вариантный ген TGF-бета-связывающего белка может быть идентифицирован на основе структуры определением уровня идентичности с нуклеотидными и аминокислотными последовательностями SEQID NO: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 и 101 и 2, 6, 10, 12, 14, 16, 46 или 65, как обсуждалось выше. Альтернативный подход для идентификации вариантного гена на основе структуры заключается в определении, может ли молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая потенциальный вариантный ген TGF-бета- 15022991 связывающего белка, гибридизоваться в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 и 101 или ее частью с длиной по меньшей мере 15 или 20 нуклеотидов. В качестве иллюстрации жестких условий гибридизации молекула нуклеиновой кислоты, имеющая вариантную последовательность гена TGF-бета-связывающего белка,может связываться с фрагментом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность из SEQID NO:1, в буфере, содержащем, например, 5SSPE (ISSPE = 180 мМ хлорид натрия, 10 мМ фосфат натрия, 1 мМ ЭДТА (рН 7,7), 5 раствор Денхардта (100 раствор Денхардта = 2% (мас./об) бычий сывороточный альбумин, 2% (мас./об) Фиколл, 2% (мас./об.) поливинилпирролидон) и 0,5% ДМН, при инкубировании в течение ночи при 55-60 С. Постгибридизационные промывки при высокой жесткости обычно выполняют в 0,5SSC (1SSC = 150 мМ хлорид натрия, 15 мМ тринатрийцитрат) или в 0,5SSPE при 55-60 С. Независимо от конкретной нуклеотидной последовательности вариантного гена TGF-бетасвязывающего белка этот ген кодирует полипептид, который может быть охарактеризован его функциональной активностью или его способностью связываться специфически с антителом против TGF-бетасвязывающего белка. Более конкретно, вариантные гены TGF-бета-связывающих белков кодируют полипептиды, которые проявляют по меньшей мере 50% и предпочтительно большую, чем 60, 70, 80 или 90% активность полипептидов, кодируемых геном TGF-бета-связывающего белка человека, описанным здесь. Получение TGF-бета-связывающего белка в культивируемых клетках Для экспрессии гена TGF-бета-связывающего белка молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая этот полипептид, должна быть функционально связана с регуляторными последовательностями, которые регулируют транскрипционную экспрессию, в экспрессирующем векторе и затем введена в клеткухозяина. Кроме регуляторных последовательностей транскрипции, таких как промоторы и энхансеры,экспрессирующие векторы могут включать регуляторные последовательности трансляции и маркерный ген, который пригоден для отбора клеток, которые несут этот экспрессирующий вектор. Экспрессирующие векторы, которые пригодны для получения чужеродного белка в эукариотических клетках, обычно содержат (1) элементы прокариотической ДНК, кодирующие бактериальный сайт инициации репликации и маркер устойчивости к антибиотику для обеспечения роста и отбора этого экспрессирующего вектора в бактериальном хозяине; (2) элементы эукариотической ДНК, которые регулируют инициацию транскрипции, такие как промотор; и (3) элементы ДНК, которые регулируют процессинг транскриптов, такие как последовательность терминации транскрипции/полиаденилирования.TGF-бета-связывающие белки данного изобретения предпочтительно экспрессируются в клетках млекопитающих. Примеры клеток-хозяев млекопитающих включают клетки почки Африканской зеленой мартышки (Vero; ATCC CRL 1587), клетки эмбриональной почки человека (293-НЕК; ATCC CRL 1573),клетки почки хомячка (baby hamster) (BHK-21; ATCC CRL8544), клетки почки собачьих (MDCK; ATCCCCL 34), клетки яичника Китайского хомячка (СНО-К 1; ATCC CCL61), клетки гипофиза крысы (GH1;ATCC CCL82), клетки HeLa S3 (ATCC CCL2.2), клетки гепатомы крысы (H-4-II-E; ATCC CRL 1548),SV40-трансформированные клетки почки обезьяны (COS-1; ATCC CRL 1650) и мышиные эмбриональные клетки (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). Для хозяина-млекопитающего регуляторные сигналы транскрипции и трансляции могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирус, бычий папилломавирус, вирус обезьян или т.п., в которых регуляторные сигналы ассоциированы с конкретным геном, который имеет высокий уровень экспрессии. Подходящие регуляторные последовательности транскрипции и трансляции могут быть также получены из генов млекопитающих, таких как гены актина, коллагена, миозина и металлотионеина. Транскрипционные регуляторные последовательности включают промоторный район, достаточный для управления инициацией синтеза РНК. Подходящие эукариотические промоторы включают промотор мышиного гена металлотионеина I [Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:273, 1982], промотор ТК вируса герпеса [McKnight, Cell 31:355, 1982], ранний промотор SV40 [Benoist et al., Nature 290:304, 1981], промотор вируса саркомы Рауса [Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777, 1982], промотор цитомегаловируса [Foecking et al., Gene 45:101, 1980] и промотор вируса опухоли молочной железы мыши (см.,в общем, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," in Protein Engineering:Principles and Pravtice, Cleland et al., (eds.), pages 163-181 (John Wiley and Sons, Inc. 1996. Альтернативно, прокариотический промотор, такой как промотор РНК-полимеразы бактериофага Т 3, может быть использован для регуляции экспрессии гена TGF-бета-связывающего белка в клетках млекопитающих, если этот прокариотический промотор регулируется эукариотическим промотором(Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529, 1990; Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19:4485, 1991). Гены TGF-бета-связывающего белка могут быть также экспрессированы в бактериальных, дрожжевых клетках, клетках насекомых или клетках растений. Подходящие промоторы, которые могут быть использованы для экспрессии полипептидов TGF-бета-связывающих белков в прокариотическом хозяине, хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области и включают промоторы, способ- 16022991 ные узнавать полимеразы Т 4, Т 3, Sp6 и Т 7, промоторы PR и PL бактериофага лямбда, промоторы trp,recA, белков теплового шока, LacUV5, tac, Ipp-lacSpr, phoA и промоторы lacZ E. coli, промоторы Bacillussubtilis, промоторы бактериофагов Bacillus, промоторы Streptomyces, промотор int бактериофага лямбда,промотор Ыа pBR322 и промотор CAT гена хлорамфениколацетилтрансферазы. Прокариотические промоторы обсуждались в обзоре Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277, 1987, Watson et al., Molecular Biology of theGene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987) и Ausubel (1995). Предпочтительные прокариотические хозяева включают Е. coli и Bacillus subtilis. Подходящие штаммы E. coli включают BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I,DH5IP, DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1,Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 и ER1647 (см., например, Brown (Ed.), Molecular Biology Labfax (AcademicPress 1991. Подходящие штаммы Bacillus subtilis включают BR151, YB886, Ml 119, MI120 и В 170 (см.,например, Hardy, "Bacillus Cloning Methods," in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985). Способы экспрессии белков в прокариотических хозяевах хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области (см., например, Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli usinget al., (eds.), page 101 (John Wiley and Sons, Inc, 1996. Бакуловирусная система обеспечивает эффективное средство введения клонированных генов TGFбета-связывающих белков в клетки насекомых. Подходящие экспрессирующие векторы основаны на вирусе множественного ядерного полиэдроза Autographe californica (AcMNPV) и содержат хорошо известные промоторы, такие как промотор белка 70 теплового шока (hsp) Drosophila, промотор немедленно раннего гена вируса множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (ie-1) и задержанный ранний промотор 39 К, промотор бакуловируса рЮ и промотор металлотионеина Drosophila. Подходящие клетки-хозяева насекомых включают клеточные линии, полученные из IPLB-Sf-21, клеточную линию пупального яичника Spodoptera frugiperda, такую как Sf9 (АТСС CRL 1711), Sf21AE и Sf21 (InvitrogenCorporation; San Diego, CA), a также клетки Drosophila Schneider-2. Установленные способы для получения рекомбинантных белков в бакуловирусных системах обеспечены Bailey et al., "Manipulation of Baculovirus Vectors," in Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, MurrayCloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al., (eds.), pages 205-244 (Oxford University Press 1995),Ausubel (1995), pages 16-37 - 16-57, Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press,Inc. 1995), и Lucknow, ("Insect Cell Expression Technology," in Protein Engineering: Principles and Practice,Cleland et al., (eds.), pages 183-218 (John Wiley and Sons, Inc. 1996). Промоторы для экспрессии в дрожжах включают промоторы из GAL1 (галактозы), PGK (фосфоглицераткиназы), ADH (алкогольдегидрогеназы), АОХ 1 (алкогольоксидазы), HIS4 (гистидинолдегидрогеназы) и т.п. Многие клонирующие векторы дрожжей были сконструированы и являются легко доступными. Эти векторы включают векторы на основе Ylp, такие как Ylp5, векторы YRp, такие как векторыYRp17, векторы YEp, такие как YEp13, и векторы YCp, такие как YCp19. Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что имеется большое разнообразие подходящих векторов для экспрессии в клетках дрожжей. Экспрессирующие векторы могут также вводиться в протопласты растений, ткани интактных растений или в выделенные клетки растений. Общие способы культивирования тканей растений обеспечены, например, Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants," in Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), pages 67-88 (CRC Press, 1993). Экспрессирующий вектор может быть введен в клетки-хозяева стандартными способами, в том числе, кальций-фосфатной трансфекцией, опосредованной липосомами трансфекцией, опосредованной микроснарядами доставкой, электропорацией и т.п. Предпочтительно трансфицированные клетки отбирают и размножают для обеспечения рекомбинантных клеток-хозяев, которые содержат этот экспрессирующий вектор, стабильно интегрированный в геном клетки-хозяина. Способы введения векторов в эукариотические клетки и способы отбора таких стабильных трансформантов с использованием доминантного селектируемого маркера описаны, например, Ausubel (1995) и Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991). Способы введения экспрессирующих векторов в бактериальные,дрожжевые клетки, клетки насекомых и клетки растений обеспечены также Ausubel (1995). Общие способы экспрессии и извлечения чужеродного белка, продуцируемого системой клеток млекопитающего, обеспечены, например, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian CellCulture," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al., (eds.), pages 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Стандартные способы извлечения белка, продуцируемого бактериальной системой, обеспечены,например, Grisshammer et al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells," in DNA Cloning 2: ленные способы выделения рекомбинантных белков из бакуловирусной системы описаны Richardson(ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995). Более часто TGF-бета-связывающий белок может быть выделен стандартными способами, такими как аффинная хроматография, гель-фильтрационная хроматография, ионообменная хроматография, ВЖХ и т.п. Дополнительные вариации в выделении и очистке TGF-бета-связывающего белка могут быть придуманы специалистами с квалификацией в данной области. Например, антитела против TGF-бетасвязывающего белка, полученные как описано ниже, могут быть использованы для выделения больших количеств белка иммуноаффинной очисткой. Получение антител к TGF-бета-связывающим белкам Данное изобретение обеспечивает антитела, которые специфически связываются со склеростином,как описано здесь подробно. Антитела к TGF-бета-связывающему белку могут быть получены, например, с использованием продукта экспрессирующего вектора в качестве антигена. Антитела, которые специфически связываются со склеростином, могут быть также получены с использованием пептидов, полученных из любой из полипептидных последовательностей склеростина, обеспеченных здесь (SEQ IDNO:2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 и 65). Особенно предпочтительные антитела против TGF-бета-связывающего белка "связываются специфически" с TGF-бета-связывающим белком SEQ ID NO: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16,46 и 65, но не с другими TGF-бета-связывающими белками, такими как Dan, Cerberus, SCGF или Gremlin. Антитело данного изобретения (в том числе его фрагменты и производные) может быть поликлональным или, в частности, моноклональным антителом. Это антитело может принадлежать к любому классу иммуноглобулинов и может быть, например, IgG (в том числе изотипами lgG, которые для антител человека известны в данной области как lgG1, lgG2, lgG3, lgG4); антитело IgE; IgM или IgA. Антитело может быть получено из птицы или млекопитающих, предпочтительно, например, из мышиных, крысы, человека или другого примата. Когда это желательно, это антитело может быть интернализующим антителом. Поликлональные антитела к рекомбинантному TGF-бета-связывающему белку могут быть получены с использованием способов, хорошо известных специалистам с квалификацией в данной области (см.,например, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press, 1992); Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectorset al., (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995). Хотя поликлональные антитела обычно индуцируются у животных, таких как крысы, мыши, кролики, козы или овцы, антитело против TGF-бета-связывающего белка данного изобретения может быть также получено из антитела примата (не человека). Общие способы индукции диагностически и терапевтически применимых антител у павианов может быть найдены,например, в Goldenberg et al., International patent publication No. WO 91/11465 (1991) и в Losman et al., Int.J. Cancer 46:310, 1990. Это антитело должно содержать по меньшей мере домен вариабельной области. Этот домен вариабельной области может быть любого размера или любого аминокислотного состава и будет обычно содержать по меньшей мере одну гипервариабельную аминокислотную последовательность, ответственную за связывание антигена, заключенную в каркасную последовательность. В общих чертах, этот домен вариабельной области (V) может быть любым подходящим расположением вариабельных доменов тяжелой (VH) и/или легкой (VL) цепи. Так, например, домен V-области может быть мономерным и быть VH- иVL-доменом, где они способны независимо связывать антиген с приемлемой аффинностью. Альтернативно, домен V-области может быть димерным и содержать VH-VH, VH-VL или VL-VL-димеры, в которыхVH- и VL-цепи нековалентно связаны (сокращенно называется далее Fv). Однако, если желательно, эти цепи могут быть ковалентно связаны или непосредственно, например, через дисульфидную связь между двумя вариабельными доменами, или через линкер, например, пептидный линкер, с образованием одноцепочечного домена (сокращенно называемого здесь scFv). Домен вариабельной области может быть любым природно встречающимся вариабельным доменом или его сконструированной версией. Под сконструированной версией имеют в виду домен вариабельной области, который был создан с использованием способов конструирования рекомбинантных ДНК. Такие сконструированные версии включают версии, созданные, например, из вариабельных областей природного антитела посредством инсерций, делеций или замен в отношении аминокислотных последовательностей природных антител. Конкретные примеры этого типа включают сконструированные домены вариабельной области, содержащие по меньшей мере один CDR и необязательно одну или несколько аминокислот каркасной области из одного антитела и остальную часть домена вариабельной области из второго антитела. Этот домен вариабельной области может быть ковалентно связан при С-концевой аминокилоте с по меньшей мере одним другим доменом антитела или его фрагментом. Так, например, если присутствуетVн-домен в домене вариабельной области, он может быть связан с доменом иммуноглобулина CH1 или его фрагментом. Подобным образом, VL-домен может быть связан с Ск-доменом или его фрагментом. Таким путем, например, это антитело может быть Fab-фрагментом, где антигенсвязывающий домен содержит ассоциированные VH- и VL-домены, ковалентно связанные на их С-концах с Сн 1 и CK-доменом,соответственно. CH1-домен может быть удлинен дополнительными аминокислотами, например, для обеспечения домена шарнирной области, как обнаруживается в Fab'-фрагменте, или для обеспечения дополнительных доменов, таких как домены CH2 и CH3. Другой формой фрагмента антитела является пептид, включающий единственный определяющий комплементарность район (CDR). CDR-пептиды ("минимальные единицы узнавания") могут быть получены конструированием генов, кодирующих CDR представляющего интерес антитела. Такие гены получают, например, с использованием полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельной области из РНК продуцирующих антитело клеток (см., например, Larrick et al., Methods: A Comparison to Methods inPrinciples and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995. Антитела для применения в данном изобретении могут быть в общем моноклональными (полученными общепринятыми процедурами иммунизацией и слияния клеток) или, в случае фрагментов, полученными из них с использованием любого стандартного химического способа, такого как восстановление или ферментативное расщепление, и/или способов расщепления, например, обработкой пепсином. Более конкретно, моноклональные антитела против TGF-бета-связывающего белка могут быть генерированы с использованием различных способов. Моноклональные антитела грызунов к специфическим антигенам могут быть получены способами, известными специалистам с квалификацией в данной областиagainst proteins expressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al., (eds.),page 93 (Oxford University Press 1995. Вкратце, моноклональные антитела могут быть получены инъекцией мышей композицией, содержащей продукт гена TGF-бета-связывающего белка, подтверждением присутствия продуцирования антитела взятием пробы сыворотки, удалением селезенки для получения В-лимфоцитов, слиянием этих Влимфоцитов с миеломными клетками для получения гибридом, клонированием этих гибридом, отбором положительных клонов, которые продуцируют антитела к данному антигену, культивированием клонов,которые продуцируют антитела к данному антигену и выделением этих антител из гибридомных культур. Кроме того, антитело против TGF-бета-связывающего белка данного изобретения может быть получено из моноклонального антитела человека. Моноклональные антитела человека получают из трансгенных мышей, которые были получены генной инженерией для получения специфических антител человека в ответ на введение антигена. В этом способе элементы локуса тяжелой и легкой цепи человека вводят в линии мышей, полученных из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат нацеленные разрушения эндогенных локусов тяжелой цепи и легкой цепи. Трансгенные мыши могут синтезировать антитела человека, специфические в отношении антигенов человека, и эти мыши могут быть использованы для получения гибридом, секретирующих антитела человека. Способы получения антитела человека из трансгенных мышей описаны, например, Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg etal., Nature 368:856, 1994 и Taylor et al., Int. Immun. 6:579, 1994. Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены из гибридомных культур различными хорошо установленными способами. Такие способы выделения включают аффинную хроматографию с использованием Белок-А-сефарозы, гель-фильтрационную хроматографию и ионообменную хроматографию (см., например, Coligan, pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purifications of Immunoglobin G (IgG)", in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992. Для конкретных применений может быть желательным получение фрагментов антитела противTGF-бета-связывающих белков. Такие фрагменты антител могут быть получены, например, протеолитическим гидролизом антитела. Фрагменты антител могут быть получены расщеплением пепсином или папаином целых антител общепринятыми способами. В качестве иллюстрации фрагменты антител могут быть получены ферментативным расщеплением антител пепсином для обеспечения фрагмента 5S, названного F(ab')2. Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с использованием восстанавливающего тиол агента с получением моновалентных Fab'-фрагментов 3,5S. Необязательно, реакцию расщепления можно выполнять с использованием блокирующей группы для сульфгидрильных групп, которые возникают из расщепления дисульфидных связей. В качестве альтернативы, ферментативное расщепление с использованием пепсина производит два моновалентных Fab-фрагмента и Fc-фрагмент непосредственно. Эти способы описаны, например, Goldenberg, Патент США 4331647, Nisonoff et al., Arch.Biochem. Biophys. 89:230, 1960, Porter, Biocem. J. 73:119, 1959, Edelman et al., in Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967) и Coligan, pages 2.8.1-2.8.10 и 2.10-2.10.4. Другие способы расщепления антител, такие как отделение тяжелых цепей для образования моновалентных фрагментов легких-тяжелых цепей, дополнительное расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические способы, могут быть использованы, пока эти фрагменты связываются с антигеном, который узнается интактным антителом. Альтернативно, это антитело может быть рекомбинантным или полученным генной инженерией антителом, полученным с использованием способов рекомбинантных ДНК, включающих манипулирование и повторную экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и/или константные области антитела. Такая ДНК известна и/или является легко доступной из библиотек ДНК, в том числе, например, фаговых библиотек антител (см. Chiswell, D.J. and McCafferty, J. Tibtech. 10 80-84 (1992, или, если желательно,может быть синтезирована. Стандартные процедуры молекулярной биологии и/или химии могут быть использованы для секвенирования ДНК и манипуляции с ДНК, например, для введения кодонов для создания остатков цистеина, для модификации, добавления или делеции других аминокислот или доменов,если это желательно. Один или несколько реплицируемых экспрессирующих векторов, содержащих ДНК, кодирующую вариабельную и/или константную область, могут быть получены и использованы для трансформации подходящей клеточной линии, например, непродуцирующей линии клеток миеломы, такой как мышиная линия NSO, или бактериальной линии, такой как Е. coli, в которых будет происходить продуцирование этого антитела. Для получения эффективной транскрипции и трансляции ДНК-последовательность в каждом векторе должна включать подходящие регуляторные последовательности, в частности, промоторную и лидерную последовательность, функционально связанные с последовательностью вариабельного домена. Конкретные способы получения антител таким путем обычно хорошо известны и рутинно используются. Например, основные процедуры молекулярной биологии описаны Maniatis et al., (MolecularCloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989); секвенирование ДНК может выполняться, как описано Sanger et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463, (1977 и Amersham International plc sequencinghandbook; сайт-направленный мутагенез может проводиться в соответствии со способом Kramer et al.USA 82:488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987). Дополнительно, многочисленные публикации подробно описывают способы, подходящие для получения антител манипуляцией ДНК, создание экспрессирующих векторов и трансформацию подходящих клеток, например, как описано в обзоре Mountain A and Adair, J R in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P,10, Chapter 1, 1992, Intercept, Andover, UK) и в International Patent Specification NO. WO 91/09967. В некоторых вариантах осуществления антитело в соответствии с данным изобретением может иметь одну или несколько эффекторных или репортерных молекул, присоединенных к нему, и данное изобретение включает в себя такие модифицированные белки. Репортерной молекулой может быть детектируемая часть или метка, такая как фермент, цитотоксичный агент или другая репортерная молекула,в том числе, краситель, радионуклид, люминесцентная группа, флуоресцентная группа или биотин или т.п. Специфические в отношении TGF-бета-связывающего белка иммуноглобулин или его фрагмент могут быть радиоактивно помечены для диагностических или терапевтических применений. Способы радиоактивного мечения антител известны в данной области. См., например, Adams 1998 In Vivo 12:11-21;Hiltunen 1993 Acta Oncol. 32:831-9. Терапевтические применения описаны более подробно ниже и могут включать использование специфического в отношении TGF-бета-связывающего белка антитела (или его фрагмента) вместе с другими терапевтическими агентами. Эффекторная или репортерная молекулы могут быть присоединены к этому антителу через любую доступную боковую цепь аминокислоты, концевую аминокислоту или, через углеводную функциональную группу, расположенную в этом антителе,когда она присутствует, при условии, что это присоединение или процесс присоединения не оказывает неблагоприятного влияния на связывающие свойства и применимость этой молекулы. Конкретные функциональные группы включают, например, любую свободную амино-, имино-, тиол-, гидрокси-, карбоксильную или альдегидную группу. Соединение антитела и эффекторной и/или репортерной молекулы(молекул) может быть достигнуто через такие группы и подходящую функциональную группу в этих эффекторных или репортерных молекулах. Эта связь может быть прямой или непрямой через спейсерные или мостиковые группы. Эффекторные молекулы включают, например, противоопухолевые агенты, токсины (такие как ферментативно активные токсины бактериального (например, экзотоксин А Р. aeruginosa) или растительного происхождения и их фрагменты (например, рицин и его фрагменты; гелонин растений, бриодин из(например, полисахариды и полиалкиленовые полимеры, такие как поли(этиленгликоль), и их производные); радионуклиды, в частности радиоиодид; и хелатированные металлы. Подходящие репортерные группы включают хелатированные металлы, флуоресцентные соединения или соединения, которые могут быть детектированы с помощью ЯМР и ЭПР (электорнный парамагнитный резонанс) спектроскопии. Подходящими применимыми эффекторными группами являются калихаемицин и его производные (см.,например, South African Patent Specifications Nos. 85/8794, 88/8127 and 90/2839). Многочисленные другие токсины, в том числе, химиотерапевтические агенты, антимитотические агенты, антибиотики, индукторы апоптоза (или "апоптогены", см., например, Green and Reed, 1998, Science 281:1309-1312) или т.п. известны лицам, знакомым с данной областью, и примеры, обеспеченные здесь, предназначены для иллюстрации без ограничения объема и идеи данного изобретения. Конкрет- 20022991 ные противоопухолевые агенты включают цитотоксические и цитостатические агенты, например, алкилирующие агенты, такие как азотные аналоги горчичного газа (например, хлорамбуцил, мелфалан, мехлорэтамин, циклофосфамид или урацилиприт) и их производные, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, бусульфан или цисплатин; антиметаболиты, такие как метотрексат, фторурацил, флоксуридин, цитарабин, меркаптопурин, тиогуанин, фторуксусная кислота или фторлимонная кислота, антибиотики, такие как блеомицины (например, блеомицина сульфат), доксорубицин, даунорубицин, митомицины (например, митомицин С), актиномицины (например, дактиномицин), пликамицин, калихаемицин и его производные, или эсперамицин и его производные; митотические ингибиторы, такие как этопозид, винкристин или винбластин и их производные; алкалоиды, такие как эллиптицин; полиолы,такие как таксицин-I или таксицин-II; гормоны, такие как андрогены (например, дромостанолон или тестолактон), прогестины (например, мегестрола ацетат или медроксипрогестерона ацетат), эстрогены (например, диметилстилбестрола дифосфат, полиэстрадиола фосфат или эстрамустина фосфат) или антиэстрогены (например, тамоксифен); антрахиноны, такие как митоксантрон, мочевины, такие как гидроксимочевина; гидразины, такие как прокарбазин; или имидазолы, такие как дакарбазин. Хелатированные металлы включают хелаты ди- или триположительных металлов, имеющих координационное число от 2 до 8, включительно. Конкретные примеры таких металлов включают технеций(Тс), рений (Re), кобальт (Со), медь (Си), золото (Au), серебро (Ад), свинец (РЬ), висмут (Bi), индий (In),галлий (Ga), иттрий (Y), тербий (Tb) гадолиний (Gd) и скандий (Se). Обычно этот металл предпочтительно является радионуклидом. Конкретные радионуклиды включают 99mTc, 186Re, 188Re, 58Co, 60Co, 67Cu,195Au, 199Au, 110Ag, 203Pb, 206Bi, 207Bi, 111ln, 67Ga, 68Ga, 88Y, 90Y, 160Tb, 153Gd и 47Sc Хелатированным металлом может быть, например, один из вышеуказанных типов металла, хелатированных любым подходящим полидентатным хелатообразующим агентом, например, ациклическими или циклическими полиаминами, простыми полиэфирами (например, кроун-эфирами и их производными); полиамидами; порфиринами и карбоциклическими производными. Обычно, тип хелатообразующего агента будет зависеть от используемого металла. Однако одной особенно применимой группой хелатообразующих агентов в конъюгатах по данному изобретению являются ациклические и циклические полиамины, особенно полиаминокарбоновые кислоты, например, диэтилентриаминпентауксусная кислота и ее производные, и макроциклические амины, такие как циклические триазапроизводные и тетразапроизводные (например, описанные в Международной заявке на патент WO 92/22583) и полиамиды, в частности дезферриоксамин и его производные. При использовании тиоловой группы в антителе в качестве точки присоединения это может быть достигнуто посредством реакции с тиоловой реактивной группой, присутствующей в эффекторной или репортерной молекуле. Примеры таких групп включают а-галогенкарбоновую кислоту или эфир, такой как иодацетамид, имид, такой как малеимид, винилсульфон или дисульфид. Эти и другие подходящие процедуры связывания описаны в общем виде и более конкретно в Международных заявках на патентWO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/091195 and WO 89/01476. Анализы для отбора молекул, которые увеличивают плотность кости Как описано выше, данное изобретение обеспечивает способы отбора и/или выделения соединений,которые способны увеличивать плотность кости. Например, в одном аспекте данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула (например, кандидатный агент) увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) смешивания (или контактирования) выбранной молекулы с TGF-бета-связывающим белком и выбранным членом белков TGF-бетасемейства, (b) определения, стимулирует ли выбранная молекула передачу сигнала TGF-бета-семейством белков или ингибирует связывание TGF-бета-связывающего белка по меньшей мере с одним членомTGF-бета-семейства белков. В некоторых вариантах осуществления эта молекула усиливает способностьTGF-бета функционировать в качестве положительного регулятора дифференцировки мезенхимальных клеток. В других аспектах данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула (кандидатный агент) увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии(а) экспонирования (контактирования, смешивания, объединения) выбранной молекулы клеткам, которые экспрессируют TGF-бета-связывающий белок, и (b) определения, уменьшается ли экспрессия (или активность) TGF-бета-связывающего белка в экспонированных клетках, или уменьшается ли активностьTGF-бета-связывающего белка, и определения из этих данных, способно ли это соединение увеличивать минеральное содержание кости. В одном варианте осуществления эти клетки выбраны из группы, состоящей из самопроизвольно перерожденной или неперерожденной кости нормального человека из костных биопсий и остеобластов теменной кости крысы. Способы детектирования уровня экспрессии TGFбета-связывающего белка могут выполняться в большом разнообразии форматов, известных в данной области и описанных здесь. Для детектирования и количественного определения экспрессии TGF-бетасвязывающего белка могут быть использованы иммуноанализы, например противоточный иммуноэлектрофорез (CIEP), радиоиммуноанализы, радиоиммунопреципитации, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), иммуноблот-анализы, такие как дот-блот-анализы и Вестерн-блоты, анализы ингибирования или конкурентные анализы и сэндвич-анализы (см. патенты США с номерами 4376110 и 4486530; см также Antibodies: A Laboratory Manual, supra). Такие иммуноанализы могут использовать антитело, которое является специфическим в отношении TGF-бета-связывающего белка, такое как описанные здесь антитела против склеростина, или могут использовать антитело, которое является специфическим в отношении репортерной молекулы, которая присоединена к TGF-бета-связывающему белку. Уровень экспрессии полипептида может быть также определен определением количества TGF-бетасвязывающего белка, которое связывается с лигандом TGF-бета-связывающего белка. Например, связывание склеростина в пробе с BMP может быть детектировано с использованием резонанса поверхностных плазмонов (SPR). Альтернативно, может быть количественно определен уровень экспрессии мРНК,кодирующей специфический TGF-бета-связывающий белок. Репрезентативные варианты таких анализов обеспечены ниже в примерах 5 и 6. Вкратце, член TGFбета-суперсемейства или TGF-бета-связывающий белок сначала связывают с твердой фазой с последующим добавлением кандидатной молекулы. Затем в этот анализ добавляют меченый член TGF-бетасуперсемейства или TGF-бета-связывающий белок (т.е. меченым полипептидом является лиганд для полипептида, связанного с твердой фазой), твердую фазу промывают и количество связанного или меченого члена TGF-бета-суперсемейства или TGF-бета-связывающего белка определяют на твердом носителе. Молекулы, которые пригодны для применения в увеличении минерального содержания кости, как описано здесь, являются молекулами, которые уменьшают связывание TGF-бета-связывающего белка с членом или членами TGF-бета-суперсемейства статистически значимым образом. Очевидно, что анализы,подходящие для использования в данном изобретении, не должны ограничиваться вариантами, описанными в примерах 2 и 3. В частности, многочисленные параметры могут быть изменены, например, связыванием TGF-бета с твердой фазой или элиминацией полностью твердой фазы. В других аспектах данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) экспонирования(контактирования, смешивания, комбинирования) выбранной молекулы (кандидатного агента) клеткам,которые экспрессируют TGF-бета, и (b) определения, изменяется ли активность TGF-бета из указанных экспонированных клеток, и определения из этих данных, способно ли это соединение увеличивать минеральное содержание кости. Подобно описанным здесь способам, большое разнообразие способов может быть использовано для оценки изменений экспрессии TGF-бета-связывающего белка, обусловленных выбранным тест-соединением. В одном варианте осуществления данного изобретения кандидатным агентом является антитело, которое связывается с описанным здесь TGF-бета-связывающим белком склеростином. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, обеспечен способ идентификации антитела, которое модулирует путь передачи сигнала TGF-бета, предусматривающий контактирование антитела, которое специфически связывается с полипептидом SOST, с пептидом SOST, в том числе,но не только, с описанными здесь пептидами, при условиях и в течение времени, достаточных для создания возможности образования комплекса антитело плюс (+) SOST (антитело/SOST), и затем детектирования уровня (например, определения количества) комплекса SOST/антитело для определения присутствия антитела, которое модулирует путь передачи сигнала TGF-бета. Этот способ может выполняться с использованием SPR или любого числа других иммуноанализов, известных в данной области и описанных здесь, в том числе, ELISA, иммуноблоттинга или т.п. Путь передачи сигнала TGF-бета включает путь передачи сигнала, при помощи которого BMP связывается с рецептором типа I и рецептором типа II на клетке для стимуляции или индукции пути, который модулирует минеральное содержание кости. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается сSOST, стимулирует или усиливает путь для увеличения минерального содержания кости. Такое антитело может быть идентифицировано с использованием описанных здесь способов для детектирования связывания антитела с SOST-специфическими пептидами. Способы данного изобретения могут быть также использованы для идентификации антител, которые нарушают, ингибируют (в том числе конкурентно ингибируют) или предотвращают связываниеBMP с полипептидом SOST, детектированием, связывается ли антитело с пептидами SOST, которые находятся в районах или частях районов на SOST, с которыми связывается BMP, таких как пептиды на амино-концевой стороне SOST, и пептиды, которые включают амино-концевые аминокислотные остатки и часть внутреннего района (docking core) SOST (например, SEQ ID NO:47-64, 66-73 и 92-95). Способы данного изобретения могут быть также использованы для идентификации антитела, которое нарушает,предотвращает или ингибирует образование гомодимеров SOST Такое антитело, которое связывается специфически с SOST, может быть идентифицировано детектированием связывания этого антитела с пептидами, которые произведены из внутренней части или карбокси-концевого района SOST (например,SEQ ID NO:74-91 и 96-99). В другом варианте осуществления данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) смешивания или контактирования выбранной молекулы (кандидатного агента) с TGF-бета-связывающим белком и выбранным членом белков TGF-бета-семейства, (b) определения, увеличивает ли выбранная молекула передачу сигнала белков TGF-бета-семейства, или ингибирует связывание TGF-бетасвязывающего белка с белками TGF-бета-семейства. В некоторых вариантах осуществления эта молекула усиливает способность TGF-бета функционировать в качестве положительного регулятора дифференцировки мезенхимальных клеток. Подобно вышеописанным способам, большое разнообразие способов может быть использовано для оценки стимуляции TGF-бета, обусловленной выбранным тест-соединением. Один такой репрезентативный способ обеспечен ниже в примере 6 (см. также Durham et al., Endo. 136:1374-1380). В других аспектах данного изобретения обеспечены способы определения, способна ли выбранная молекула (кандидатный агент) увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадию определения, ингибирует ли выбранная молекула связывание TGF-бета-связывающего белка с костью или ее аналогом. В данном контексте, должно быть понятно, что выражение "кость или ее аналог" относится к гидроксиапатиту или поверхности, состоящей из порошкообразной формы кости, измельченной кости или интактной кости. Подобно вышеописанным способам, большое разнообразие способов может быть использовано для оценки ингибирования локализации TGF-бета-связывающего белка в костном матриксе. Один такой репрезентативный способ обеспечен ниже в примере 7 (см., также Nicolas et al.,Calcif. Tissue Int. 47:206-12 (1995. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом склеростина, способны конкурентно ингибировать связывание члена TGF-бета-семейства с полипептидом склеростина. Способность антитела или фрагмента антитела разрушать или блокировать связывание члена TGF-бета-семейства, такого какBMP, со склеростином, может быть определена в соответствии с любым из описанных здесь способов. Антитело или его фрагмент, которые специфически связываются со склеростином, могут нарушать, блокировать или предотвращать связывание члена TGF-бета-семейства со склеростином нарушением образования гомодимеров склеростина. Антитело, которое специфически связывается со склеростином, может быть также использовано для идентификации активности склеростина по ингибированию или нарушению связывания склеростина с BMP Альтернативно, это антитело или его фрагмент могут быть включены в анализ на основе клеток или в модели животного, в которых склеростин имеет определенную активность, для определения, изменяет ли антитело (увеличивает или уменьшает статистически значимым образом) эту активность. Антитело или его фрагмент, которые специфически связываются со склеростином, могут быть использованы для испытания действия такого антитела в пути передачи сигнала и посредством этого модуляции (стимуляции или ингибирования) этого пути передачи сигнала. Предпочтительно, связывание антитела с SOST приводит к стимуляции или индукции пути передачи сигнала. Хотя описанные здесь способы могут относиться к анализу индивидуальной тест-молекулы, данное изобретение не должно ограничиваться таким образом. В частности, выбранная молекула может содержаться в смеси соединений. Таким образом, описанные способы могут дополнительно включать стадию выделения молекулы, которая ингибирует связывание TGF-бета-связывающего белка с членом TGFбета-семейства. Кандидатные молекулы Большое разнообразие молекул может быть проанализировано на их способность ингибировать связывание TGF-бета-связывающего белка с членом TGF-бета-семейства. Репрезентативные примеры,обсуждаемые более подробно ниже, включают органические молекулы (например, органические небольшие молекулы), белки или пептиды и молекулы нуклеиновых кислот. Хотя из приведенного ниже обсуждения должно быть очевидно, что описанные здесь кандидатные молекулы могут быть использованы в описанных здесь способах, должно быть также вполне очевидно, что такие молекулы могут быть также использованы в различных диагностических и терапевтических ситуациях. 1. Органические молекулы Многочисленные органические небольшие молекулы могут быть проанализированы на их способность ингибировать связывание TGF-бета-связывающего белка с членом TGF-бета-семейства. Например,в одном варианте осуществления данного изобретения подходящие органические молекулы могут быть выбраны или из химической библиотеки, где химикалии анализируют индивидуально, или из комбинаторных химических библиотек, где множественные соединения анализируют сразу, затем подвергают деконволюции для определения и выделения наиболее активных соединений. Репрезентативные примеры таких комбинаторных химических библиотек включают библиотеки,описанные Agrafiotis et al., "System and method of automatically generating chemical compounds with desiredInhibitors from 4-Thiazolidinone Combinatorial Libraries," Bioorg. and Med. Chem. Letters 6:707-12, 1996. 2. Белки и пептиды Большой диапазон белков и пептидов могут быть подобным образом использованы в качестве кандидатных молекул для ингибиторов связывания TGF-бета-связывающего белка с членом TGF-бетасемейства.a) Комбинаторные библиотеки пептидов Молекулы пептидов, которые являются предположительными ингибиторами связывания TGF-бетасвязывающего белка с членом TGF-бета-семейства, могут быть получены посредством скрининга комбинаторных библиотек пептидов. Такие библиотеки могут быть либо получены специалистом с квалификацией в данной области (см., например, Патенты США с номерами 4528266 и 4359535 и Публикации Договора о патентной кооперации с номерами WO 92/15679, WO 92/15677, WO 90/07862, WO 90/02809),либо куплены из коммерчески доступных источников (например, New England Biolabs Ph.D. Phageb) Антитела Данное изобретение обеспечивает антитела, которые специфически связываются с полипептидами склеростина, и способы применения таких антител. Данное изобретение обеспечивает также полипептидные иммуногены склеростина, которые могут быть использованы для получения и анализа этих антител. Эти антитела могут быть применимы для блокирования или нарушения связывания полипептида склеростина, который является TGF-бета-связывающим белком, с лигандом, в частности, костным морфогенетическим белком, и могут также блокировать или нарушать связывание полипептида склеростина с одним или несколькими другими лигандами. Молекула, такая как антитело, которое ингибирует связывание TGF-бета-связывающего белка с одним или несколькими членами TGF-бета-семейства белков, в том числе одним или несколькими костными морфогенетическими белками (BMP), является, как должно быть понятно, например, молекулой, которая делает возможной активацию члена TGF-бета-семейства или BMP или делает возможным связывание членов TGF-бета-семейства, в том числе одного или нескольких BMP, с их соответствующими рецепторами посредством удаления или предотвращения связывания члена TGF-бета-семейства с TGFбета-связывающим белком. Данное изобретение обеспечивает также пептидные и полипептидные иммуногены, которые могут быть использованы для генерирования и/или идентификации антител или их фрагментов, которые способны ингибировать, предотвращать или нарушать связывание TGF-бета-связывающего белка склеростина с одним или несколькими BMP. Данное изобретение обеспечивает также пептидные и полипептидные иммуногены, которые могут быть использованы для генерирования и/или идентификации антител или их фрагментов, которые способны ингибировать, предотвращать или нарушать (например,уменьшать статистически значимым образом) образование гомодимеров склеростина. Антитела данного изобретения могут быть применимы для увеличения минерального содержания и минеральной плотности кости, с ослаблением посредством этого многочисленных состояний, которые приводят к потере минерального содержания кости, в том числе, например, заболевания, генетической предрасположенности,несчастных случаев, которые приводят к дефекту кости (например, вследствие перелома), терапевтических веществ, которые влияют на резорбцию кости или которые убивают образующие кость клетки, и обычного старения. Полипептиды или пептиды, применимые для иммунизации и/или анализа склеростинспецифических антител, могут быть также выбраны посредством анализа первичной, вторичной и третичной структуры TGF-бета-связывающего белка в соответствии со способами, известными специалистам с квалификацией в данной области и описанными здесь, для определения аминокислотных последовательностей, которые с большей вероятностью будут генерировать антигенный ответ в животномхозяине. См., например, Novotny, Mol. Immunol. 28:201-207 (1991); Berzofsky, Science 229:923-40 (1985. Моделирование и результаты рентгеновской кристаллографии могут быть также использованы для предсказания и/или идентификации, какие части или районы TGF-бета-связывающего белка взаимодействуют с какими частями лиганда TGF-бета-связывающего белка, такого как BMP. Могут быть сконструированы и получены пептидные иммуногены TGF-бета-связывающего белка, которые включают аминокислотные последовательности в частях или районах взаимодействия или окружают части или районы взаимодействия. Эти антитела могут быть использованы для блокирования или нарушения связывания TGFбета-связывающего белка с тем же самым лигандом и могут также блокировать или нарушать связывание TGF-бета-связывающего белка с одним или несколькими другими лигандами. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, рассматриваемые данным изобретением, вклю- 24022991 чают антитела, которые способны специфически связываться со склеростином и конкурентно ингибировать связывание TGF-бета-полипептида, такого как BMP, со склеростином. Например, антитела, рассматриваемые данным изобретением, конкурентно ингибируют связывание полипептида склеростина с сайтом связывания рецептора типа I BMP на BMP или с сайтом связывания рецептора типа II BMP наBMP или могут конкурентно ингибировать связывание склеростина с сайтами связывания как рецептора типа I, так и рецептора типа II на BMP. He желая связывать себя теорией, авторы изобретения считают,что, когда антитело против склеростина конкурентно ингибирует связывание сайтов связывания типа I и/или типа II полипептида BMP со склеростином, блокируя таким образом антагонистическую активность склеростина, сайты связывания рецептора на BMP являются доступными для связывания рецепторов типа I и типа II, с увеличением посредством этого минерализации кости. Связывающее взаимодействие TGF-бета-связывающего белка, такого как склеростин и TGF-бета-полипептид, такой как BMP,обычно имеет место, когда эта пара лигандов образует гомодимер. Таким образом, вместо или в дополнение к использованию антитела, специфического для склеростина, для блокирования, нарушения или предотвращения связывания склеростина с BMP посредством конкурентного ингибирования связывания склеростина с BMP, склеростин-специфическое антитело может быть использовано для блокирования или нарушения образования гомодимера склеростина. В качестве примера, один димер Noggin человека, который является антагонистом BMP, который способен связываться с BMP с высокой аффинностью (Zimmerman et al., supra), выделяли в комплексе с одним димером.ВМР-7 человека и анализировали мультивалентной аномальной дифракцией (MAD)Noggin может эффективно блокировать все сайты связывания рецепторов (сайты связывания рецепторов типа I и типа II) на димере BMP. Определение местоположения аминокислот Noggin, которые контактируют с ВМР-7, может быть использовано в моделировании взаимодействия между другими TGF-бетасвязывающими белками, такими как склеростин (SOST) и BMP, и, следовательно, это будет способствовать конструированию пептидов, которые могут быть использованы в качестве иммуногенов для генерирования антител, которые блокируют или нарушают такое взаимодействие. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом SOST, конкурентно ингибируют связывание полипептида SOST по меньшей мере с одним или обоими из сайтов: сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (BMP) и сайтом связывания рецептора типа II BMP, которые расположены на BMP. Эпитопы на SOST, с которыми связываются эти антитела, могут включать или быть включены в смежные аминокислотные последовательности, которые расположены в N-конце полипептида SOST (аминокислоты в положениях приблизительно 1-56 SEQ ID NO.46). Эти полипептиды могут также включать последовательность короткого линкерного пептида, который соединяет этот Nконцевой район с внутренним районом, например, полипептиды, представленные в SEQ ID NO:92 (человека) и SEQ ID NO:93 (крысы). Более короткие репрезентативные N-концевые пептидные последовательности SOST человека (например, SEQ ID NO:46) включают SEQ ID NO:47-51, а репрезентативные пептидные последовательности SOST крысы (например, SEQ ID NO:65) включают SEQ ID NO:57-60. Антитела, которые специфически связываются с полипептидом SOST и блокируют или конкурентно ингибируют связывание полипептида SOST с BMP, например, блокированием или ингибированием связывания аминокислот BMP, соответствующих одному или нескольким из сайтов связывания рецепторов типа I и типа II, могут также специфически связываться с пептидами, которые включают аминокислотную последовательность, соответствующую внутреннему (коровому) району SOST (аминокислоты в положениях приблизительно 57-146 SEQ ID NO:46). Полипептиды, которые включают этот внутренний район, могут также включать дополнительные аминокислоты, простирающиеся на любом или на обоихN-конце и С-конце, например, для включения остатков цистеина, которые могут быть полезными для конъюгирования этого полипептида с молекулой-носителем. Репрезентативные внутренние полипептидыSEQ ID NO:94 и SEQ ID NO:95 соответственно. Такие антитела могут также связывать более короткие полипептидные последовательности. Репрезентативные внутренние пептидные последовательностиSOST крысы представлены в SEQ ID NO:70-73. В другом варианте осуществления антитела, которые специфически связываются с полипептидомSOST, нарушают (ингибируют, предотвращают или блокируют, например, уменьшают статистически значимым образом) образование гомодимера SOST. Поскольку взаимодействие между SOST и BMP может включать гомодимер SOST и гомодимер BMP, антитело, которое предотвращает или нарушает образование гомодимера SOST, может посредством этого изменять минеральную плотность кости, предпочтительно увеличивать минеральную плотность кости. В одном варианте осуществления антитела, которые связываются с внутренним районом SOST, предотвращают образование гомодимера. Такие антитела могут также связываться с пептидами, которые включают последовательности смежных аминокислот,соответствующие внутреннему району, например, SEQ ID NO:74, 75 и 98 (SOST человека) и SEQ ID районе полипептида SOST (приблизительно в положениях аминокислот 147-190 SEQ ID NO:46 или 65),могут также нарушать образование гомодимера. Репрезентативные С-концевые полипептиды SOST человека и крысы, например, включают аминокислотные последовательности, представленные в SEQ IDNO:96 и SEQ ID NO:97 соответственно. Такие антитела могут также связывать более короткие полипептидные последовательности. Репрезентативные С-концевые пептидные последовательности SOST человека представлены в SEQ ID NO: 78-81, а репрезентативные С-концевые пептидные последовательностиSOST крысы представлены в SEQ ID NO: 86-88. Описанные здесь полипептиды и пептиды SOST, с которыми антитела могут специфически связываться, применимы в качестве иммуногенов. Эти иммуногены данного изобретения могут быть использованы для иммунизации животного для генерирования гуморального иммунного ответа, который приводит к продуцированию антител, которые специфически связываются с сайтом связывания рецептора типа I или типа II или с обоими, расположенными на BMP, и включают пептиды, произведенные из Nконцевого района SOST, или которые могут предотвращать образование гомодимера SOST. Такие полипептиды и пептиды SOST, которые применимы в качестве иммуногенов, могут быть также использованы в способах скрининга проб, содержащих антитела, например, проб очищенных антител, антисывороток или супернатантов клеточных культур или любой другой биологической пробы,которая может содержать одно или несколько антител, специфических в отношении SOST. Эти пептиды могут быть также использованы в способах идентификации и отбора из биологической пробы одной или нескольких В-клеток, которые продуцируют антитело, которое специфически связывается с SOST (например, анализы образования бляшек и т.п.). Затем эти В-клетки используют в качестве источника, кодирующего SOST-специфическое антитело полинуклеотида, который может быть клонирован и/или модифицирован рекомбинантными способами молекулярной биологии, известными в данной области и описанными здесь."Биологическая проба" обозначает в некоторых вариантах осуществления пробу, содержащую по меньшей мере одно антитело, специфическое в отношении полипептида SOST, и биологическая проба может быть обеспечена получением пробы крови, образца биопсии, эксплантата ткани, культуры органа или любой другой ткани или препарата клеток из субъекта или биологического источника. Пробой может дополнительно называться препарат ткани или клеток, в котором морфологическая целостность или физическое состояние было разрушено, например, иссечением, диссоциацией, солюбилизацией, фракционированием, гомогенизацией, биохимической или химической экстракцией, измельчением в порошок, лиофилизацией, обработкой ультразвуком или любым другим способом для обработки пробы, полученной из субъекта или биологического источника. Субъектом или биологическим источником может быть человек или животное, не являющееся человеком, первичная культура клеток (например, В-клеток,иммунизированных in vitro) или адаптированная к культуре клеточная линия, в том числе, но не только,генетически сконструированные клеточные линии, которые могут содержать интегрированные в хромосомы или эписомные рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот, иммортализованные или иммортализируемые клеточные линии, гибридные клеточные линии соматических клеток, дифференцированные или дифферецируемые клеточные линии, трансформированные клеточные линии и т.п. Пептидные иммуногены SOST могут быть также получены синтезом серии пептидов, которые, в целом, представляют полную полипептидную последовательность полипептида SOST и каждый из которых имеет часть аминокислотной последовательности SOST, общую с другим пептидом в этой серии. Эта перекрывающаяся часть может состоять предпочтительно по меньшей мере из четырех аминокислот и более предпочтительно из 5, 6, 7, 8, 9, или 10 аминокислот. Каждый пептид может быть использован для иммунизации животного, сыворотки собирают из этого животного и испытывают в анализе для идентификации, какое животное продуцирует антитела, которые нарушают или блокируют связываниеSOST с TGF-бета-белком. Затем получают антитела из таких идентифицированных иммунизированных животных в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь. Антитела, которые ингибируют связывание TGF-бета-связывающего белка с членом TGF-бетасемейства, могут быть легко получены с использованием обеспеченного здесь описания. Особенно полезными являются антитела против TGF-бета-связывающего белка, которые "специфически связывают"TGF-бета-связывающий белок SEQ ID NO: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 или 65, но не другие TGF-бетасвязывающие белки, такие как Dan, Cerberus, SCGF или Gremlin. В контексте данного изобретения, антитела включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, одноцепочечные, химерные, иммуноглобулины с пересаженными CDR, антиидиотипические антитела и фрагменты этих антител (например, вариабельные области Fab, Fd, Fab' и F(ab')2 или определяющие комплементарность районы). Как описано выше, предполагается, что антитела являются специфическими против TGF-бета-связывающего белка или против конкретного члена TGF-бета-семейства, если они связываются с Ка, равной или большей, чем 107 М-1, предпочтительно равной или большей, чем 108 М-1, и не связываются с другими TGFбета-связывающими белками, или связываются c Ka, равной или меньшей, чем 106 М-1. Аффинность антитела в отношении его родственного антигена выражают обычно в виде константы диссоциации KD, и анти-SOST-антитело специфически связывается с членом TGF-бета-семейства, если оно связывается сKD, равной или меньшей, чем 10-5 М, более предпочтительно равной или меньшей, чем 10-6 M и еще бо- 26022991 лее предпочтительно равной или меньшей, чем 10-7 М, и даже еще более предпочтительно равной или меньшей, чем 10-8 М. Кроме того, антитела данного изобретения предпочтительно блокируют, нарушают или ингибируют (например, уменьшают со статистической значимостью) связывание TGF-бетасвязывающего белка с членом TGF-бета-семейства. Аффинность моноклонального антитела или партнера связывания, а также ингибирование связывания могут быть легко определены специалистом с обычной квалификацией в данной области (см. Scatchard, Ann. N.Y.Acad. Sci. 51:660-672, 1949). Аффинность может быть также легко определена с использованием резонанса поверхностных плазмонов (SPR;BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Для резонанса поверхностных плазмонов молекулы-мишени иммобилизуют на твердой фазе и подвергают действию лигандов в подвижной фазе, идущей вместе с потоком клеток. Если связывание лиганда с иммобилизованной мишенью имеет место, локальный показатель преломления изменяется, приводя к изменению угла SPR, которое может быть подвергнуто мониторингу в реальном времени детектированием изменений в интенсивности отраженного света. Скорости изменения сигнала SPR могут анализироваться для получения видимых констант скорости для фаз ассоциации и диссоциации реакции связывания. Отношение этих величин дает видимую константу равновесия (аффинность) (см., например, Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-65 (1993. Антитело в соответствии с данным изобретением может принадлежать к любому классу иммуноглобулинов, например, IgG, IgE, IgM, IgD или IgA, и может быть любым из различных изотипов, которые могут составлять класс (таким как lgG1, lgG2, lgG3 и lgG4 класса IgG человека). Оно может быть получено или произведено из животного, например, домашней птицы (например, курицы) и млекопитающих,которые включают, но не ограничиваются ими, мышь, крысу, хомячка, кролика или другого грызуна,корову, лошадь, овцу, козу, верблюда, человека или другого примата. Это антитело может быть интернализующимся антителом. Хорошо известные в данной области способы могут быть использованы для генерирования антител,поликлональных антител или моноклональных антител, которые являются специфическими в отношенииTGF-бета-связывающего белка, такого как SOST. Антитела могут быть также получены в виде генетически сконструированных иммуноглобулинов (lg) или lg-фрагментов, сконструированных таким образом,что они имеют желаемые свойства. Например, в качестве иллюстрации, а не для ограничения, антитела могут включать рекомбинантный IgG, который является химерным слитым белком, имеющим по меньшей мере один домен вариабельной области (V) из первого вида млекопитающего и по меньшей мере один домен константной области из второго, отличающегося вида млекопитающего. Наиболее часто,химерное антитело имеет последовательности вариабельной области мыши и последовательности константной области человека. Такой мышь/человек-химерный иммуноглобулин может быть гуманизирован пересадкой определяющих комплементарность районов (CDR), происходящих из мышиного антитела, которые придают специфичность связывания в отношении антигена, в районы каркасной области(V) человека и происходящие из человека константные области. Фрагменты этих молекул могут быть генерированы протеолитическим расщеплением или, необязательно, протеолитическим расщеплением с последующим мягким восстановлением дисульфидных связей и алкилированием. Альтернативно, такие фрагменты могут быть также генерированы рекомбинантными способами генной инженерии. Некоторые предпочтительные антитела являются антителами, которые ингибируют или блокируют активность TGF-бета-связывающего белка в анализе in vitro, как описано здесь. Связывающие свойства антитела в отношении TGF-бета-связывающего белка могут быть, как правило, оценены с использованием способов иммунодетектирования, включающих, например, иммуноферментный твердофазный анализ(ELISA), иммунопреципитацию, иммуноблоттинг, противоточный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализы, дот-блот-анализы, анализы ингибирования или конкуренции и т.п., которые могут легко выполняться специалистами с обычной квалификацией в данной области (см., например, Патенты США с номерами 4376110 и 4486530; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,1988. Иммуноген может состоять из клеток, экспрессирующих TGF-бета-связывающий белок, очищенных или частично очищенных TGF-бета-связывающих полипептидов или их вариантов или фрагментов(т.е. пептидов) или пептидов, полученных из TGF-бета-связывающего белка. Такие пептиды могут быть получены протеолитическим расщеплением большего полипептида, рекомбинантными молекулярными методологиями или могут быть синтезированы химически. Например, здесь обеспечены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие TGF-бета-связывающие белки, так что лица с квалификацией в данной области могут рутинным образом получить TGF-бета-связывающие белки для использования в качестве иммуногенов. Пептиды могут быть химически синтезированы способами, описанными здесь и известными в данной области. Альтернативно, пептиды могут быть получены протеолитическим расщеплением TGF-бета-связывающего белка, и индивидуальные пептиды могут быть выделены способами,известными в данной области, такими как электрофорез в полиакриламидном геле, или любым количеством из способов жидкостной хроматографии или других способов разделенияя. Пептиды, применимые в качестве иммногенов, обычно могут иметь аминокислотные последовательности по меньшей мере из 4 или 5 последовательных аминокислот из аминокислотной последовательности TGF-бета-связывающего белка, такой как описанные здесь, и предпочтительно имеют по меньшей мере 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15,- 27022991 16, 18, 19 или 20 последовательных аминокислот TGF-бета-связывающего белка. Некоторые другие предпочтительные пептидные иммуногены содержат по меньшей мере 6, но не более, чем 12, последовательных аминокислот последовательности TGF-бета-связывающего белка, а другие предпочтительные пептидные иммуногены содержат по меньшей мере 21, но не более, чем 50, последовательных аминокислот полипептида SOST Другие предпочтительные пептидные иммуногены содержат 21-25, 26-30, 3135, 36-40, 41-50 или любое целое число аминокислот между 21 и 100, включительно, последовательных аминокислот и между 100 и 190 последовательных аминокислот последовательности TGF-бетасвязывающего белка. Как описано здесь, поликлональные антитела могут быть легко получены специалистом с обычной квалификацией в данной области из различных теплокровных животных, таких как лошади, коровы, различная домашняя птица, кролики, мыши, овцы, козы, павианы или крысы. Обычно, TGF-бетасвязывающий белок или его уникальный пептид из 13-20 аминокислот или описанный здесь (предпочтительно конъюгированный с гемоцианином фиссуреллы сшиванием с глутаровым альдегидом), используют для иммунизации животного с использованием внутрибрюшинной, внутримышечной, интраокулярной, интрадермальной или подкожной инъекций, вместе с адъювантом, таким как полный или неполный адъювант Фрейнда, или системой адъювантов Ribi (Corixa Corporation, Seattle, WA). См. также, например, Harlow et al., supra. Обычно после первой инъекции животные получают одну или несколько бустер-иммунизаций в соответствии с предпочтительной схемой, которая может варьироваться в соответствии, inter alia, с антигеном, адъювантом (если его вводят) и/или конкретным видом животного. Иммунный ответ может быть подвергнут мониторингу периодическим взятием крови животного и получением и анализом сывороток в иммуноанализе, таком как ELISA или диффузионный анализ Оухтерлони или т.п., для определения титра специфических антител. Особенно предпочтительные поликлональные антитела будут давать детектируемый сигнал в одном из этих анализов, таком как ELISA, который предпочтительно является по меньшей мере в три раза большим, чем фон. После того как титр животного достиг плато в отношении его реактивности с белком, могут быть получены большие количества антисывороток либо еженедельными взятиями крови, либо обескровливанием животного. Поликлональные антитела, которые связываются специфически с TGF-бета-связывающим белком или пептидом, могут быть затем очищены из таких антисывороток, например, аффинной хроматографией с использованием белка А. Альтернативно, может выполняться аффинная хроматография, где TGFбета-связывающий белок или пептид или антитело, специфическое в отношении константной области lg конкретного иммунизированного вида животного иммубилизовано на подходящем твердом носителе. Антитела для применения в данном изобретении включают моноклональные антитела, которые получают общепринятыми процедурами иммунизации и слияния клеток, описанными здесь и известными в данной области. Моноклональные антитела могут быть легко получены с использованием общепринятых способов (см., например, Kohler et al., Nature 256:495, 1975; Coligan et al., (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley and Sons 1991) ["Coligan"]; Патенты США с номерами RE32011,4902614, 4543439 и 4411993, которые включены здесь в качестве ссылки; см. также Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennet, McKearn and Bechtol (eds.),1980 и Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, которые включены здесь в качестве ссылок; Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteinsUniversity Press 1995. Фрагменты антител могут быть получены из антител с использованием любого подходящего стандартного способа, такого как протеолитическое расщепление, или, необязательно, протеолитическим расщеплением (например, при помощи папаина или пепсина) с последующим мягким восстановлением дисульфидных связей и алкилированием. Альтернативно, такие фрагменты могут быть также созданы рекомбинантными способами генной инженерии. Вкратце, в одном варианте осуществления животное, такое как крыса, мышь или хомячок, иммунизируют TGF-бета-связывающим белком или частью района его последовательности, в том числе пептидами в районе, описанном здесь. Этот белок может быть смешан с адъювантом, таким как полный или неполный адъювант Фрейнда или адъювант Ribi, для увеличения полученного иммунного ответа. Спустя одну-три недели после начальной иммунизации животное повторно иммунизируют другой бустериммунизацией и испытывают на реактивность в отношении белка с использованием описанных здесь анализов. После того как животное достигает плато в его реактивности в отношении инъецированного белка, его умещвляют и собирают органы, которые содержат большие количества В-клеток, такие как селезенка и лимфатические узлы. Суспензии клеток собранных селезенок и/или лимфатических узлов сливают с подходящими клетками миеломы, которые сенсибилизированы лекарственным средством, для создания "гибридомы", которая секретирует моноклональное антитело. Подходящие гибридомные линии включают, например, NS-0, SP20, NS-1 (АТСС No. TIB 18) и Р 3 Х 63 - Ag 8.653 (АТСС No. CRL 1580). Лимфоидные клетки (например, селезенки) и миеломные клетки могут быть объединены на несколько минут с агентом, усиливающим слияние мембран, таким как полиэтиленгликоль или неионогенный детергент, и затем посеяны при низкой плотности на селективной среде, которая поддерживает рост гибридомных клеток, но не неслитых миеломных клеток. После слияния эти клетки могут быть помеще- 28022991 ны в культуральные чашки, содержащие подходящую среду, такую как RPMI 1640 или DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла) (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), а также дополнительные ингредиенты, такие как фетальная телячья сыворотка (ФТС, т.е. из Hyclone, Logan, Utah или JRH Biosciences). Дополнительно, эта среда должна содержать реагент, который избирательно позволяет расти слитым клеткам селезенки и миеломы, такой как HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин) (Sigma ChemicalCo., St. Louis, Missouri). Спустя приблизительно семь дней полученные слитые клетки или гибридомы могут быть подвергнуты скринингу для определения присутствия антител, которые являются реактивными с TGF-бета-связывающим белком (в зависимости от используемого антигена) и которые блокируют, нарушают или ингибируют связывание TGF-бета-связывающего белка с членом TGF-бета-семейства. Гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела, которые специфически связываются со склеростином или его вариантом, являются предпочтительными. Большое разнообразие анализов может быть использовано для определения присутствия антител,которые являются реактивными в отношении белков данного изобретения, включающих, например, противоточный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализы, радиоиммунопреципитации, иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA), дот-блот-анализы, вестерн-блоты, иммунопреципитацию, анализы ингибирования или конкуренции и сэндвич-анализы (см., например, Патенты США с номерами 4376110 и 4486530; см. также Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Эти гибридомы клонируют, например, клонированием с использованием лимитирующих разведений или выделением бляшек с использованием мягкого агара и повторно анализируют. Таким образом может быть выделена гибридома, продуцирующая антитела, реактивные в отношении желаемого белка. Моноклональные антитела из гибридомных культур могут быть выделены из супернатантов гибридомных культур. Альтернативным способом получения мышиного моноклонального антитела является инъецирование этих гибридомных клеток в брюшную полость сингенной мыши, например, мыши, которая была обработана (например, праймирована пристаном) для усиления образования асцитной жидкости, содержащей моноклональное антитело. Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены различными хорошо установленными способами. Такие способы выделения включают аффинную хроматографию с использованием Белок А-Сефарозы, гель-фильтрационную хроматографию и ионообменную хроматографию (см., например, Coligan на страницах 2.7.1-2.7.12 и на стр. 2.9.1-2.9.3; Baines et al.,"Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992. Моноклональные антитела могут быть очищены аффинной хроматографией с использованием подходящего лиганда, выбранного на основе конкретных свойств антитела (например,изотипа тяжелой или легкой цепи, специфичности связывания и т.д.). Примеры подходящего лиганда,иммобилизованного на твердом носителе, включают белок А, белок G, антитело против константной области (легкой цепи или тяжелой цепи), антиидиотипическое антитело и TGF-бета-связывающий белок или его фрагмент или вариант. Кроме того, антитело против TGF-бета-связывающего белка данного изобретения может быть моноклональным антителом человека. Моноклональные антитела человека могут быть генерированы любым числом способов, с которыми знакомы специалисты с обычной квалификацией в данной области. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, трансформацию периферических клеток крови(например, содержащих В-лимфоциты) человека вирусом Эпстейна-Барра (EBV), in vitro иммунизацию В-клеток человека, слияние клеток селезенки из иммунизированных трансгенных мышей, несущих инсертированные гены иммуноглобулина человека, выделение из фаговых библиотек V-области иммуноглобулина человека или другие процедуры, известные в данной области и основанные на раскрытии данной заявки. Например, моноклональные антитела человека могут быть получены из трансгенных мышей,которые были получены с использованием генной инженерии для продуцирования специфических антител человека в ответ на введение антигена. Способы получения антител человека из трансгенных мышей описаны, например, Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; Taylor et al.,Int. Immun. 6:579, 1994; S. Patent No. 5,877,397; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58;Jakobovits et al., 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:525-35. В этом способе элементы локуса тяжелой и легкой цепей человека вводят в линии мышей, полученных из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат нацеленные разрывы эндогенных локусов тяжелой и легкой цепей. (См. также Bruggemann etal., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997. Например, трансгены иммуноглобулина человека могут быть минигенными конструкциями или транслокусами на искусственных хромосомах дрожжей, которые подвергаются специфической в отношении В-клеток реаранжировке ДНК и гипермутации в лимфоидной ткани мыши. Моноклональные антитела человека могут быть получены иммунизацией трансгенных мышей, которые затем могут продуцировать антитела человека, специфические в отношении этого антигена. Лимфоидные клетки иммунизированных трансгенных мышей могут быть использованы для получения гибридом, секретирующих антитело человека, в соответствии с описанными здесь способами. Поликлональные сыворотки, содержащие антитела человека, могут быть также получены из крови этих иммунизированных животных. Другой способ получения моноклональных антител, специфических в отношении TGF-бета- 29