Способ лечения злокачественной опухоли с использованием анти-erbb3 антитела

СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИErbB3 АНТИТЕЛА Данное изобретение касается способов лечения пациента, имеющего злокачественную опухоль, включающий введение анти-ErbB3 антитела пациенту, при условии, что уровень фосфорилированного ErbB3 (pErbB3) в образце опухоли, полученном от пациента, составляет не ниже, чем 0,064 пг/мкг общего белка. Уровень техники Достигнуты значительные успехи в разработке таргетной терапии для лечения рака и других заболеваний. Таргетная терапия включает моноклональные антитела, которые связываются с антигенами,специфично или преимущественно экспрессируемыми на опухолевых клетках, и низкомолекулярные вещества, которые специфически препятствуют дискретным компонентам сигнальных путей, активным в опухолевых клетках. Например, цетуксимаб (Эрбитукс) представляет собой моноклональное антитело,которое нацелено на рецептор эпидермального фактора роста (EGFR, также известный как ErbB1 илиHER1), что показано, по крайней мере, при раке толстой кишки и раке головы и шеи. Кроме того, например, иматиниб (Гливек) является низкомолекулярным соединением, нацеленным на тирозинкиназуBCR-Ab1, которая экспрессируется и выступает в качестве онкогенного фактора, при некоторых видах хронического миелоидного лейкоза и является аномальным вариантом доброкачественного клеточного белка Хотя было показано, что такая таргетная терапия эффективна у некоторых пациентов, ее эффективность никогда не достигает 100%. Например, средний показатель эффективности для монотерапии цетуксимабом составляет всего около 15-20% пациентов, даже при наличии опухоли с известной экспрессией ErbB1 (EGFR). Таким образом, явная экспрессия ErbB1 (антиген-мишень антитела цетуксимаб) в опухоли не гарантирует восприимчивости к цетуксимабу. Таким образом, хотя таргетная терапия является весьма перспективной, варьирующая эффективность такой терапии у пациентов в сочетании с побочными эффектами, связанными с такой терапией и,как правило, высокой стоимостью такого лечения, показывает, что способы лечения пациентов, которые включают прогнозирование возможной реакции пациентов на терапевтическое лечение и лечение только пациентов со спрогнозированой реакцией, весьма желательны. Один из подходов был предпринят для того, чтобы попытаться выявить генетические маркеры (например, мутации или аллели), которые коррелируют с восприимчивостью к терапии. При таком способе выборку пациентов генотипировали до начала лечения, чтобы определить, является ли пациент носителем генетического маркера(ов), свидетельствующего о восприимчивости к терапии. Другой подход был предпринят, чтобы попытаться идентифицировать белковые биомаркеры, которые коррелируют с восприимчивостью к терапии. При таком подходе,экспрессия белка определяется в полученных от пациентов образцах до начала лечения, чтобы определить, экспрессируются ли в организме пациента один или несколько белковых биомаркеров, которые указывают на чувствительность к терапии. Оба вышеупомянутых способа могут считаться подходами "прямых" маркеров, в которых наличие(или отсутствие, или уровень экспрессии) маркера(ов) (например, BCR-Ab1 или ErbB1) измеряется непосредственно, и продемонстрирована корреляция чувствительности или нечувствительности к терапии. Кроме того, оба этих способа базируются на использовании маркеров, которые являются достаточно стабильными в клетках, и могут быть достоверно определены количественно в образце, выделенном из организма пациента. Учитывая, что может пройти значительный период времени между моментом, когда образец выделен из организма пациента и, когда содержание маркера(ов) измеряется в образцах, такие подходы "прямых" маркеров, описанные выше, как правило, требуют использования генетических или белковых маркеров, которые не подвержены разложению или изменению с течением времени, когда образцы подвергаются стандартной обработке и переработке. Хотя такие стабильные, "прямые" маркеры,которые являются индикаторами реакции на определенные терапевтические средства, были идентифицированы, неясно, могут ли быть идентифицированы такие маркеры для всех терапевтических средств. Считается, что рост опухоли регулируется набором активируемых лигандами сигнальных путей,которые обычно активируются связыванием лиганда с его родственными рецепторами, вызывая фосфорилирование самого рецептора, а также последующее фосфорилирование киназ, что ведет к дальнейшему фосфорилированию следующих компонентов пути. Эти киназы запускают механизмы выживания и пролиферации клеток. Таким образом, активация сигнального пути приводит к изменению внутриклеточных компонентов, в частности, к фосфорилированию белка. Признак фосфорилирования определенных рецепторов, экспрессирующихся на опухолевой ткани, может помочь идентифицировать основные пути, которые ведут к прогрессированию определенной опухоли. Однако фосфопротеины могут быть очень нестабильны, и фосфорилирование может быстро угасать после хирургического вмешательства,если образец ткани не был сразу и быстро заморожен (или, в некоторых случаях, зафиксирован в формалине). Более того, даже если возможно надежно измерить уровень одного или нескольких фосфопротеинов в образце определенной опухоли, прогностическое значение наличия или отсутствия того или иного фосфопротеина в отношении эффективности лечения таких опухолей каким-либо терапевтическим средством, как правило, неизвестно. Таким образом, в то время как фосфопротеиновые профили содержат важную информацию о путях стимуляции прогрессирования опухолей, такие фосфопротеиновые профили в настоящее время не распространены широко в качестве биомаркеров для прогнозирования реакции на терапевтическое лечение. Соответственно, новые способы определения уровня различных фосфопротеинов и использования таких уровней и других характеристик опухолевых клеток для прогнозирования реакции отдельных опухолей на определенные терапевтические средства необходимы для улучшения терапевтической и эконо-1 022884 мической эффективности лечения рака Сущность изобретения В этом разделе представлены способы лечения больных от злокачественных новообразований противоопухолевым терапевтическим средством путем получения образца злокачественных клеток от пациента, определения известных биохимических характеристик клеток в образце, а затем введение, по крайней мере, одного противоопухолевого терапевтического средства пациенту. Заявленный способ лечения пациента, имеющего злокачественную опухоль, включает введение анти-ЕrbВ 3 антитела пациенту, при условии что уровень фосфорилированного ErbB3 (pErbB3) в образце опухоли, полученном от пациента, составляет не ниже, чем 0,064 пг/мкг общего белка. В некоторых вариантах предложены способы лечения больного с опухолевым новообразованием противоопухолевыми терапевтическими средствами, которые включают получение образца опухоли (например, биоптат или полученный в результате резекции образец), содержащего клетки опухоли, определение уровня фосфорилированных ErbB3 (фосфо-ErbB3, pErbB3) в образце, а затем введение по крайней мере одного антинеопластического терапевтического средства больному. Анти-ErbB3 антитело вводят,если в клетках образца обнаружен, по крайней мере, минимальный уровень pErbВ 3; анти-ErbB3 терапевтическое средство не применяется у больных, если обнаружено, что клетки образца не содержат, по крайней мере, минимального уровня pErbB3, и тогда вводят антинеопластическое терапевтическое средство, которое не является анти-ErbB3 терапевтическим средством. Обычно отдают предпочтение антиErbB3 фармацевтическимсредствам, содержащим антитела против ErbB3. Также в данном изобретении предлагаются способы лечения, при этом уровень pErbB3 в образце определяют путем косвенного измерения, которое включает измерение общего белка в образце и измерение в клетках образца уровней (I) херегулина (HRG) или и бета-целлюлина и (II), по крайней мере, одного из выбранных рецепторовErbB1, ErbB2 и ErbB3. Повышенный уровень HRG и, по крайней мере, одного рецептора, по сравнению с контролем, прогнозирует реакцию на лечение терапевтическим средством. В некоторых вариантах такой способ может дополнительно включать лечение клеток, или пациента, от которого получены клетки, терапевтическим средством, на основании спрогнозированной реакции клеток на терапевтическое средство. Краткое описание фигур Фиг. 1A-1D представляют собой графики, показывающие ингибирование роста ксенотрансплантата опухоли, обработанного антителом Ab 6. Фиг. 1 А показывает результаты для модели ксенотрансплантата опухоли MALME3M. Фиг. 1 В - результаты для модели ксенотрансплантата опухоли DU145. Фиг. 1 С результаты для модели ксенотрансплантата опухоли ADRr. Фиг. 1D - результаты для модели ксенотрансплантата опухоли ACHN. Фиг. 2 представляет собой график концентрации фосфорилированных ErbB3 (pErbB3) в ксенотрансплантате опухоли (в пг/мкг общего белка) против замедления темпов роста (%), наблюдаемого при лечении ксенотрансплантата Ab6. Фиг. 3 А-3 Е - это гистограммы, показывающие уровень pErbB3 (фиг. 3 А) и фосфорилированных протеинкиназ (pAKT) (фиг. 3 В) в образцах ксенотрансплантата опухоли ACHN, замороженных через 0,10, 30 или 60 мин после препарирования ксенотрансплантата, и уровни ErbB1 (фиг. 3 С), ErbB2 (фиг. 3D) и ErbB3 (фиг. 3 Е) в образцах ксенотрансплантата EKVX опухоли, замороженных через 0, 10, 30 или 60 мин после препарирования ксенотрансплантата. На фиг. 4A-4D показана схематическая диаграмма преобразования динамического изображения сигнального пути в вычислительную модель, фиг. 4 А показывает динамическое изображение сигнального пути ErbB, содержащего различные лиганды и рецепторы ErbB. Фиг. 4 В показывает множество биохимических реакций, описывающих белковые взаимодействия в виде динамического изображения. Фиг. 4 С показывает множество изменений, полученных из множества биохимических реакций. Фиг. 4D показывает множество нелинейных обыкновенных дифференциальных уравнений (ОДУ) с учетом кинетики,характеризирующей сети трансдукции сигнала. Фиг. 5 А-5 В - это графики, показывающие уровни фосфо-ErbB3, фосфо-ErbB2, фосфо-ErbB1 и фосфо-АКТ во времени в клетках, стимулированных девятью различными концентрациями херегулина(HRG) (фиг. 5 А) или бета-целлюлина (фиг. 5 В) в клетках рака яичников ADRr. Параметры вычислительной модели были откалиброваны для результатов моделирования (сплошные линии) с целью описания экспериментальных данных (точки). Фиг. 6 - это гистограмма, показывающая результаты анализа локальной чувствительности для определения ключевых маркеров активации ErbB3. Фиг. 7 представляет собой график вычисления уровней pErbB3 в линиях клеток MALME3M,DU145, ADRr и ACHN. Фиг. 8 А-8 В - это графики, показывающие применение значения состояния активации сети (САС) для прогнозирования реакции 15 клеточных линий на лечение Ab6, на основе порога значений САС,установленное на 4 изучаемых клеточных линиях (MALME3M, DU145, ADRr и ACHN). На фиг. 8 А представлена гистограмма, моделирующая уровни pErbB3 для 19 клеточных линий, от самого высокого до самого низкого уровня pErbB3. Фиг. 8 В - это линейный график значений 19 клеточных линий от само-2 022884 го высокого до самого низкого значения САС, где клеточные линии со значением САС ниже значенийMALME3M обозначены как резистентные (NR), а клеточные линии со значением САС выше значенийADRr обозначены как реагирующие на лечение, и клеточные линии со значением САС между значениями MALME3M и ADRr обозначены как неопределенные. Фиг. 9 А-9 С - это графики, показывающие ингибирование роста ксенотрансплантата опухоли, обработанного антителом Ab6. Фиг. 9 А показывает результаты для модели ксенотрансплантата опухолиIGROV1. Фиг. 9 В показывает результаты для модели ксенотрансплантата опухоли OVCAR8. Фиг. 9 С показывает результаты для модели ксенотрансплантата опухоли SKOV3. Фиг. 10A-10D - это графики, на которых логарифм концентрации одного рецептора ErbB нанесен против логарифма концентрации одного или нескольких других рецепторов ErbB. Значения рецепторов для приведенных клеточных линий классифицируются как реагирующие или не реагирующие на Ab6. Фиг. 10 А - это график сравнения ErbB2 и ErbB1. Фиг. 10 В - это график сравнения ErbB3 и ErbB1. Фиг. 10 С - это график сравнения ErbB2 и ErbB3. Фиг. 10D - это график сравнения ErbB1 с ErbB2 и ErbB3. На фиг. 11 показан график, на котором логарифм концентрации HRG нанесен против логарифма концентрации ErbB1. На графике выделены реагирующие по сравнению с не реагирующими клеточными линиями в исследованиях ксенотрансплантата. Фиг. 12 А-12 С - это графики, на которых нанесен логарифм упорядоченного уровня экспрессии (в пг/мкг, определенный по методу ELISA) различных компонентов ErbB сигнального пути ксенотрансплантата клеточных линий и образцов опухоли человека. Фиг. 12 А - это график ErbB2 по сравнению сErbB1. Фиг. 12 В - это график ERBB4 по сравнению с ErbB3. Фиг. 12 С - это график HRG-131 по сравнению с ВТС. Фиг. 13A-13D - это графики, показывающие количественные иммуногистохимические (qIHC) результаты для ксенотрансплантатов клеточных линий и образцов опухоли человека. На фиг. 13 А показана стандартная кривая клеточной линии для ErbB1. Фиг. 13 В, 13 С и 13D - это гистограммы оценки qIHC для ErbB1, ErbB2 и ErbB3, соответственно, в ксенотрансплантатах клеточных линий (красные столбики) и образцах опухоли человека (синие линии). Фиг. 14 является гистограммой, показывающей суммарное содержание фосфорилированногоErbB1: 3 уровня гетеродимера (количество интегрированного во времени гетеродимера на клетку), рассчитанные для 8 клеточных линий, которые разделены на не реагирующие (MALME3M, ВТ 474, IGROV1 и ADRr) и реагирующие (OVCAR8, SKOV3, DU145 и ACHN) на Ab6. Фиг. 15A и 15 В являются блок-схемами, включающими различные функциональные шаги и действия, которые могут быть выполнены в ходе реализации некоторых вариантов изобретения. Фиг. 16 является одним из вариантов вычислительной схемы, которая может быть использована для реализации некоторых аспектов изобретения. Фиг. 17A-D - это графики кривых ингибирования для клеток, обработанных биспецифическими антителами Н 3 В 1D2. Фиг. 17 А и 17 В показывают кривые ингибирования для уровней pErbВ 3 и уровнейpAKT, соответственно, в клетках OVCAR8. Фиг. 17 С и 17D показывают кривые ингибирования для уровней pErbB3 и уровней рАКТ, соответственно, в клетках OVCAR8 трансфицированных HER2/ErbB2(клетки OVCAR8-HER2). Сплошная линия модельных данных получена из расчетной модели, в то время,как круги представляют данные, полученные экспериментальным путем. Смоделированные значенияIC50 (DR50sim) и экспериментальные значения IC50 (DR50data) также показаны. Фиг. 18A-D - это графики кривых ингибирования для клеток, обработанных биспецифическими антителами Н 3 В 1D2. Фиг. 18 А и 18 В показывают кривые ингибирования для уровней pErbB3 и уровней рАКТ, соответственно, в клетках ADrR. Сплошная линия модельных данных получена из расчетной модели, в то время, как круги представляют данные, полученные экспериментальным путем. Смоделированные значения IC50 (DR50sim) и экспериментальные значения IC50 (DR50data) также показаны. Фиг. 18 С и 18D показывают смоделированные кривые ингибирования для уровней pErbB3 и уровней рАКТ, соответственно, в клетках ADrR с имитацией лечения иРНК ErbB1. Фиг. 19 А-С - это графики определенной in vivo относительной скорости роста (RGR) для группы опухолевых клеток модели ксенотрансплантата, обработанного Н 3 В 1D2, в зависимости от расчетных уровней мономеров ErbB2 (фиг. 19 А), гомодимеров ErbB2:ErbB2 (фиг. 19 В) и гетеродимеровErbB2.ErbB3 (фиг. 19 С) в группе опухолевых клеток без Н 3B1D2 Фиг. 20 А-В - это графики определенной in vivo относительной скорости роста (RGR), для группы опухолевых клеток модели ксенотрансплантата, обработанного Н 3B1D2, в зависимости от расчетных относительных уровней гетеродимеров ErbB2 ErbB3 (фиг. 20 А) и гетеродимеров ErbB1ErbB3 (фиг. 20 В) в группе опухолевых клеток в модели в отсутствие и в присутствии Н 3B1D2 Фиг. 21 представляет собой графическое изображение прогнозируемых (линия, построенная по точкам) и фактических (точки) данных индуцированного HRG проведения сигнала pErbB3 и pAKT в чрезмерно экспрессирующей ErbB2 клеточной линии ВТ 474-М 3 при дозах HRG, как указано и как описано в примере 11. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение в целом предлагает способы лечения пациента, имеющего злокачественную опухоль, включающие введение анти-ErbB3 антитела пациенту, при условии что уровень фосфорилированного ErbB3 (pErbB3) в образце опухоли, полученном от пациента, составляет не ниже, чем 0,064 пг/мкг общего белка. Определение состояния активации одного или нескольких элементов (например, ErbB3) одного или нескольких клеточных сигнальных путей определяется путем использования косвенных маркеров, а не путем прямого измерения уровня одного или нескольких элементов. Такие косвенные измерения могут быть использованы для определения состояния активации элементов сигнального пути путем компьютерного моделирования, с помощью модели сигнального пути. Фосфорилированные клеточные белки могут быть использованы в качестве биомаркеров для определения реакции на терапевтические средства без необходимости непосредственного измерения уровня таких фосфопротеинов в клинических образцах, что позволяет избежать потенциальных проблем, связанных с измерением фосфопротеинов (например, нестабильности, ненадежности). Такое моделирование типичных свойств фосфорилирования может быть использовано для точного прогнозирования реакции клеток на противоопухолевые терапевтические средства, и, следовательно, может быть использовано,чтобы избежать введения пациентам тех противораковых препаратов, которые будут неэффективны для лечения рака у данного пациента. В некоторых способах уровень одного или нескольких стабильных клеточных компонентов (таких как рецепторы клеточной поверхности, лиганды и т. п.) внутриклеточной сети измеряется в клетках образца (например, биоптате или полученном в результате резекции образце). Показано использование "косвенных" маркеров чувствительности клеток к лечению, при котором уровень "косвенных" маркеров (например, фосфорилированных белков или димеров активированных сигнальных путей) не измеряется непосредственно, а вычисляется или моделируется на основе уровней других клеточных компонентов, которые измеряются непосредственно. Для упрощения понимания изобретения ниже определены некоторые термины. В данном описании термин "терапевтическое средство" включает все без исключения соединения,которые способны снижать или уменьшать тяжесть симптомов заболеваний или нарушений, или увеличивать частоту и/или длительность периодов ремиссии в ходе заболевания или расстройства, или тормозить или предотвращать ухудшение или потерю трудоспособности, в связи с заболеванием или расстройством, или препятствовать или тормозить прогрессирование заболевания или расстройства, или препятствовать или задерживать начало развития заболевания или расстройства, или подавлять или предотвращать инфекцию или инфекционное заболевание или расстройство. Неограничивающими примерами терапевтических средств являются низкомолекулярные органические соединения, моноклональные антитела, биспецифические антитела, рекомбинантные биопрепараты, иРНК соединения и т.п. Используемый в данном описании термин "биомаркер" относится к веществам (например, белкам,мРНК, аллелям), находящимся или экспрессированным в клетках, в которых биомаркеры коррелируют с восприимчивостью заболевания к назначенному лечению. В данном описании термин "прямые биомаркеры" относится к веществам (например, белкам,мРНК, аллелям), находящимся или экспрессированным в клетках, в которых прямые биомаркеры коррелируют с восприимчивостью заболевания к назначенному лечению, и где наличие или уровень этого вещества измеряется непосредственно в клетках, чтобы таким образом спрогнозировать реакцию заболевания на назначенное лечение. В данном описании термин "косвенные биомаркеры" относится к веществам (например, белкам,мРНК, аллелям), находящимся или экспрессированным в клетках, в которых прямые биомаркеры коррелируют с восприимчивостью заболевания к назначенному лечению, и где наличие или уровень этого вещества не измеряется непосредственно в клетках, но определяется косвенным путем, например, путем моделирования с использованием расчетной модели, тем самым прогнозируя реакцию заболевания на назначенное лечение."Антитела" в данном описании представляют собой белки, состоящие из одного или нескольких полипептидов, содержащих домены связывания, кодируемые генами иммуноглобулинов или фрагментами генов иммуноглобулинов, с помощью которых иммуноспецифический белок связывается с антигеном. Распознаваемые гены иммуноглобулинов включают гены константного участка каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, ипсилон и мю, а также множество генов вариабельного участка иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируются как каппа или лямбда. Тяжелые цепи классифицируются как гамма, мю,альфа, дельта или ипсилон, что, в свою очередь, определяет иммуноглобулины классов IgG, IgM, IgA,IgD и IgE, соответственно. Типичная структурная единица иммуноглобулина является тетрамером, состоящим из двух идентичных пар полипептидных цепей, одна пара "легких" цепей (около 25 кДа) и одна"тяжелых" цепей (около 50-70 кДа). "VL" и "VH" - это легкие и тяжелые цепи, соответственно. Антитела включают интактные иммуноглобулины, а также антигенсвязывающие их фрагменты, которые могут быть получены при обработке различными пептидазами, или синтезированы химически denovo, с использованием метода рекомбинантной ДНК. К таким фрагментам относятся, например, F(ab)2 димер и Fab мономер Представленные антитела являются одноцепочечными антителами (антитела, ко-4 022884 торые существуют в виде одной полипептидной цепи), как правило, одноцепочечными антителами Fv(scFv), в которых цепи VH и VL соединены вместе (непосредственно или через пептидный линкер) в форме стабильного полипептида 5132405, и 4956778)."Иммуноспесифичные" или "иммуноспецифично" относится к антителам, которые связываются с помощью доменов, в основном кодируемых генами иммуноглобулинов или фрагментами генов иммуноглобулинов, с одним или несколькими эпитопами целевого белка, но которые в незначительной мере распознают и связываются с другими молекулами в образце, содержащем смешанную популяцию антигенных молекул. Как правило, антитела связываются с распознаваемым антигеном с константой диссоциации Kd не менее 50 нМ, что измеряется методом резонанса поверхностного плазмона или методом связывания с клетками. Применение таких методов хорошо известно в этой области, и подтверждено в примере 13 настоящего описания."Анти-ErbB3 антитело" - это выделенное антитело, которое связывается иммуноспецифично с эктодоменом ErbB3. Такое связывание с ErbB3 дает Kd не менее 50 нМ, при измерении методом резонанса поверхностного плазмона или методом связывания с клетками. Обычно рассматриваются анти-ErbB3 антитела, которые ингибируют опосредованное EGF-подобным лигандом фосфорилирование ErbB3.EGF-подобные лиганды включают EGF, TGF, бета-целлюлин, связывающийся с гепарином эпидермальный фактор роста, бирегулин, эпиген, эпирегулин и амфирегулин, которые обычно связываются сErbB1 и индуцируют гетеродимеризацию ErbB1 с ErbВ 3. Термин "биспецифические" в данном описании относится к белкам, включающим два антигенсвязывающих сайта, где первый сайт связывания обладает сродством к первому антигену или эпитопу и второй сайт связывания обладает сродством ко второму антигену или эпитопу, отличающемуся от первого. В данном описании термин "субъект" или "пациент (больной)" подразумевает любого человека или животное, не относящееся к Homo sapiens, с заболеваниями или расстройствами, при которых реакция на лечение терапевтическим средством может быть спрогнозирована указанными способами по изобретению, например, субъект или пациент с опухолью. Термин "животное, не относящееся к Homo sapiens",включает всех позвоночных, например млекопитающих и не млекопитающих, таких как приматы, овцы,собаки, кошки, лошади, коровы, куры и т. п. Дополнительные аспекты, касающиеся вышеизложенного, и различные дополнительные аспекты данного изобретения описаны более подробно в следующих подразделах, которые не считаются исчерпывающими.I. Измерение уровня клеточных компонентов в клетках образца. В способах, предложенных в данном описании, для лечения пациентов со злокачественными опухолям, одна из процедур обычно включает измерение в клетках образца уровня фосфорилированногоErbB3 (pErbB3). Например, образец опухоли может быть получен стандартными способами от пациента с опухолью, и уровни одного или нескольких компонентов клеточной сети можно измерить в образце опухоли. В данном описании термин "уровень" компонента относится к количеству или концентрации компонента, присутствующего в образце. Уровень компонента может быть измерен с помощью любого из множества известных способов. Уровень обычно определяется путем измерения уровня белка, и альтернативно, в некоторых случаях, уровень может быть определен путем измерения уровней мРНК, которые могут быть использованы путем перевода данных относительно мРНК, чтобы предсказать уровни белка. Уровни белков (например, мономеров, гомодимеров, или гетеродимеров) могут быть измерены с помощью одного или нескольких способов, хорошо известных в данной области, с неограничивающими примерами, которые включают количественную флуоресцентную сортировку клеток (qFACS), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA, Luminex), иммуногистохимию (IHC), количественную иммуногистохимию (qIHC), способы, основанные на сближении (например, метод Форстера, основанный на резонансном переносе энергии, флуоресценция биомолекулярной комплементации (BiFC), методы VeraTag или ДНК-запрограммированная химия (DPC, масс-спектрометрию, Вестерн-анализ (иммуноблоттинг) и коиммунопреципитацию. Уровень белка может быть представлен как пг определенного белка на мкг общего белка. Белки или мРНК могут быть определены в клеточном лизате. Клеточный лизат может быть получен, например, как подробно описано в примере 2. Кроме того, представленные примеры использования методов ELISA для определения уровней белка подробно описаны в примерах 2 и 4, типичный пример использования qFACS для определения уровня белка подробно описан в примере 4, и типичный пример измерения содержания мРНК и преобразования его в уровень белка подробно описан в примере 4 (дляHRG-1). Образцом опухоли может быть, например, свежий образец клеток, свежезамороженный образец или зафиксированный образец ткани. Для пациентов образцы тканей, архивные блоки ткани могут быть более доступны, чем свежезамороженные образцы. Таким образом, предпочтителен вариант, когда используется фиксированный в формалине и залитый парафином (FFPE) образец ткани, и уровень компонентов(например, лигандов, рецепторов) может быть определен методом полуколичественной иммуногистохимии (ИГС, IHС) (описан в примере 9 ниже). Чтобы преобразовать информацию, полученную методом полуколичественной ИГС, в концентрацию, пригодную для ввода в вычислительную модель, контрольный слайд, содержащий клеточные пробки или ксенотрансплантаты с известными уровнями экспрессии рецепторов и/или лигандов, сравнивают с образцом пациента. Кроме того, могут быть определены коэффициенты перевода для преобразования уровня экспрессии, полученного в безразмерных единицах (например, количество белка или РНК), в уровень концентрации, который может быть введен в расчетную модель, как описано более подробно в примере 4 для уровня экспрессии ВТС и HRG. Уровни мРНК лиганда и белка лиганда в целом достаточно хорошо коррелируют. Поэтому может быть использована qRT-ПЦР для определения уровня экспрессии мРНК в клеточных лизатах линий опухолевых клеток и ксенотрансплантата, а также фиксированных в формалине и залитых парафином образцов.II. Прогнозирование реакции на терапевтические средства. Описанные способы лечения основаны на спрогнозированной реакции клеток на терапевтическое средство. В различных аспектах обнаруженные уровни компонента(ов) служат признаком эффективности прогнозирования для одного или нескольких конкретных терапевтических средств. Нередко это означает, что, если измеренные уровни компонента(ов) (или определенный коэффициент концентрации по сравнению с другими указанными компонентами) соответственно вышеприведенному критерию (или, в некоторых случаях, ниже) заранее определенного порога отсечки или коэффициента, то данное терапевтическое средство по прогнозам будет эффективным и вводится пациенту, а если измеренные уровни компонента(ов) или коэффициент концентрации не соответствуют критерию определенного порога отсечки или коэффициенту, то терапевтическое средство не вводят пациенту. Для способов, предложенных в данном описании, используют клеточную сеть сигнального путиErbB, в частности один или несколько лигандов, участвующих в сигнальном пути ErbB. Неограничивающие примеры таких лигандов включают HRG (в том числе, HRG-1, HRG-2, HRG-, HRG-3 и HRG4), EGF, HB-EGF, TGF, AR, EPG и EPR. Дополнительно или альтернативно один или несколько компонентов, уровни которых измеряют в способе, могут включать один или несколько рецепторов, участвующих в сигнальном пути ErbB. Неограничивающие примеры таких рецепторов включают ErbB1,ErbB2, ErbB3 и ERbB4 (также известные в данной области как HER1, HER2, HER3 и HER4, соответственно). Такие рецепторы могут быть проанализированы как отдельный объект (любой из встречающихся мономеров, гомодимеров или гетеродимеров), а в некоторых вариантах каждый гомодимер и гетеродимер также может быть измерен в качестве отдельного компонента и введен в вычислительную систему. Например, компоненты измерения могут включать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или больше рецепторов, лигандов,или обоих, выбранных из ErbB1, ErbB2, ErbB3, ERbB4, HRG, и ВТС (например, ErbB1 и HRG, илиErbB1, ErbB2 и ErbB3). В другом варианте терапевтические средства включают анти-ErbB3 антитела. Предпочтительно анти-ErbB3 антитела включают ММ-121, которые в настоящее время проходят этап клинических испытаний. Предпочтительно анти-ErbB3 антитела включают Ab6, описанные более подробно в WO 2008/100624 и VH и VL последовательности SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно. В другом варианте антиЕrbВ 3 антитела являются антителами, включающими Ab6 последовательности CDR VH и VL, показанные в SEQ ID NO: 7-9 (VH CDR1, 2, 3) и 10-12 (VL CDR1, 2, 3), соответственно. Другие примеры антиErbB3 антител включают Ab3, Ab14, Ab17 и Ab19, также описанные дополнительно в WO 2008/100624, и последовательности VH и VL, показанные в SEQ ID NO: 3 и 4, 5 и 6, 25 и 26, и 33 и 34, соответственно. В другом варианте анти-ErbB3 антитела - это антитела, включающие последовательностиCDR VH и VL Ab3 (SEQ ID NO: 13-15 и 16-18, соответственно), или антитела, включающие последовательности CDR VH и VL Ab14 (SEQ ID NO: 19-21 и 22-24, соответственно), или антитела, включающие последовательности CDR VH и VL Ab17 (SEQ ID NO: 27-29 и 30-32, соответственно), или антитела,включающие последовательности CDR VH и VL Ab19 (SEQ ID NO: 35-37 и 38-40, соответственно). Другие примеры анти-ErbB3 антител включают антитела 1 В 4 С 3 и 2D1D12 (U3 Pharma AG), описанные в Публикации США 2004/0197332, и моноклональные антитела (в том числе, гуманизированную версию), такие как 8 В 8, описанные в патенте США 5968511. В другом варианте анти-ErbB3 антитела - это биспецифические антитела (например, рекомбинантный белок), включающие анти-ErbB3 антитела, связанные с другими антителами (например, анти-ErbB2 антителами). Предпочтительным примером такого биспецифического антитела является H3B1D2, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 41. В этом биспецифическом антителе одноцепочечное антитело, которое связывается с ErbB3, названное Н 3 (с последовательностями CDR VH И VL, показанными в SEQ ID NO: 42-44 и 45-47, соответственно), связано с одноцепочечным антителом,которое связывается с ErbB2, названное B1D2 (с последовательностями CDR VH и VL, показанными в(опубликована как WO 2007/084181) и заявке PCT/US 2007/024287 (опубликована как WO 2008/140493). В еще одном варианте терапевтическое средство состоит из двух или более анти-ErbB3 антител,каждое из которых связывается с различными эпитопами на ErbB3. Предпочтительно терапевтическое средство состоит из трех анти-ErbB3 антител, каждое из которых связывается с различными эпитопами на ErbB3.III. Биомаркеры и способы прогнозирования реакции на ингибирование пути ErbB. В другом аспекте изобретения предлагаются прямые биомаркеры, которые предсказывают реакцию клеток (например, опухолевых клеток) на лечение терапевтическими средствами, нацеленными на компоненты внутриклеточной сети (например, сигнального пути ErbB). Такие биомаркеры могут быть определены с использованием предусмотренных расчетных моделей. Способы идентификации таких биомаркеров, как правило, включают: (а) измерение в клетках образца уровней одного или нескольких компонентов клеточной сети; и (б) применение компьютерной реализации способа, включающей: (I) вычисление уровня одного или нескольких дополнительных компонентов клеточной сети с помощью расчетной модели внутриклеточной сети; и (II) определение компонентов клеточной сети, вычисленный уровень которых прогнозирует реакцию клеток на лечение терапевтическим средством, чтобы, таким образом,идентифицировать такие компоненты, как биомаркеры для прогнозирования реакции клеток на лечение терапевтическим средством. Некоторые методы определения биомаркеров для прогнозирования реакции клеток на лечение терапевтическим средством, нацеленным на компоненты клеточной сети, включают: а) введение в вычислительную систему через устройство ввода входных данных, которые идентифицируют измеренные уровни одного или нескольких компонентов клеточной сети в клетках образца; б) вычисление с помощью вычислительной системы уровней одного или нескольких дополнительных компонентов клеточной сети с помощью расчетной модели клеточной сети, а также с) идентификацию с помощью вычислительной системы компонента клеточной сети, вычисленный уровень которого прогнозирует реакцию клеток на лечение терапевтическим средством, и тем самым идентифицируют компонент, как биомаркер для прогнозирования реакции клеток на лечение терапевтическим средством. Например, как показано в примере 10, расчетная модель может быть применена для вычисления уровней одного или нескольких компонентов внутриклеточной сети (например, сигнального пути ErbB),чтобы получить одно или несколько значений САС (как меру активации клеточной сети) и определить корреляцию САС с реакцией клеток на лечение терапевтическим средством. Эти компоненты клеточной сети, для которых вычислены уровни отдельно чувствительных и нечувствительных образцов, могут также быть использованы в качестве прямых биомаркеров для прогнозирования реакции на лечение, в особенности, когда уровни этих компонентов легко измеряются прямым путем. То есть, подход расчетной модели/САС, описанный здесь, может быть применен для идентификации (компьютерной) компонентов(а), которые прогнозируют реакцию клеток на лечение терапевтическими средствами, и, кроме того, могут быть непосредственно измерены уровни идентифицированных компонентов, как прямых биомаркеров для прогнозирования реакции. Например, расчетная модель, описанная в данном документе, была применена для вычисления уровней гомо- и гетеродимеров сигнального пути ErbB, а затем уровни димеров, разделенных на чувствительные и нечувствительные образцы, могут быть непосредственно измерены как прямые биомаркеры для прогнозирования реакции на лечение опухолей. Далее, как описано в примере 8, в настоящее время показано, что комбинированные измерения уровней (I) HRG и (II) по крайней мере одного рецептора семейства ErbB (например, ErbB1, ErbB2 иErbB3) в образце опухоли позволяют эффективно распределить опухоли на чувствительные и нечувствительные с точки зрения реакции на лечение терапевтическими средствами, нацеленными на компоненты сигнального пути ErbB, такими как анти-ErbB3 антитела (например, Ab6). Кроме того, как описано далее в примере 10, уровни гетеродимеров ErbB1/ErbB3 или уровни фосфорилированных гетеродимеровErbB1/ErB3 могут служить прямыми маркерами для реакции на лечение терапевтическими средствами,нацеленными на компоненты ErbB сигнального пути, такими как анти-ErbB3 антитела (например, Ab 6). Кроме того, как описано далее в примере 12, уровни мономеров ErbB2, гомодимеров ErbB2/ErbB2 и гетеродимеров ErbB2/ErbB3 позволяют эффективно распределить опухоли на чувствительные и нечувствительные с точки зрения реакции на лечение терапевтическими средствами, нацеленными на компоненты сигнального пути ErbB, такими как анти-ErbB3 анти-ErbB2 биспецифические антитела (например,Н 3 В 1D2). Популярные терапевтические средства, для которых прогнозируется чувствительность, включают анти-ErbB3 антитела, более предпочтительно Ab6 (последовательности VH И VL показаны в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно) или анти-ErbB3 антитела, содержащие последовательности CDR VH и VL Ab6,показанные в SEQ ID NO: 7-9 (CDR1 VH, 2, 3) и 10-12 (CDR1 VL, 2, 3), соответственно. Другие способы прогнозирования реакции клеток на лечение терапевтическим средством, нацеленным на компоненты сигнального пути ErbB, включают:(а) измерение в клетках образца уровней одного или нескольких гетеродимеров ErbB1/ErbB3, мо-7 022884 номеров ErbB2, гомодимеров ErbB2, гетеродимеров ErbB2/ErbB3, фосфорилированных гетеродимеров(б) прогнозирование с помощью вычислительной системы реакции клеток на лечение терапевтическим средством в зависимости от измеренного уровня в (а), при этом разница в уровне гетеродимеровErbB1/ErbB3, мономеров ErbB2, гомодимеров ErbB2/ErbB2, гетеродимеров ErbB2/ErbB3, фосфорилированных гетеродимеров ErbB1/ErbB3 или фосфорилированных гетеродимеров ErbB2/ErbB3, по сравнению с контролем прогнозирует реакцию на лечение терапевтическим средством. Прогнозирование может быть выполнено путем вычисления с применением способов, которые включают.(I) введение в вычислительную систему через устройство ввода входных данных, которые идентифицируют измеренные уровни одного или нескольких гетеродимеров ErbB1/ErbB3, мономеров ErbB2,гомодимеров ErbB2/ErbB2, гетеродимеров ErbB2/ErbB3, фосфорилированных гетеродимеров ErbB1/ErbB3 и фосфорилированных гетеродимеров ErbB2/ErbB3, где уровни измерены в клетках образца; и(II) генерация в вычислительной системе, а затем выведение на устройство вывода спрогнозированной реакции клеток на лечение терапевтическим средством на основе измеренных уровней, в которых разница в уровне гетеродимеров ErbBl/ErbB3, мономеров ErbB2, гомодимеров ErbB2/ErbB2, гетеродимеров ErbB2/ErbB3, фосфорилированных гетеродимеров ErbB1/ErbB3 или фосфорилированных гетеродимеров ErbB2/ErbB3, по сравнению с контролем, прогнозирует реакцию на лечение терапевтическим средством. В некоторых вариантах способов, описанных выше, измеренные уровни вводятся в статистический алгоритм классификации, и реакция клеток на лечение прогнозируется на основе выходных данных алгоритма. Дополнительно в таких способах состояние активации сети (САС) или состояние ингибирования сети (СИС) вычисляется на основе измеренных уровней с использованием расчетной модели клеточной сети ErbB; предпочтительно, реакция клеток на лечение терапевтическим средством прогнозируется на основе вычислений значений САС или СИС. В некоторых вариантах измеренные уровни - это уровни мономеров ErbB2, гомодимеровErbB2:ErbB2 и/или гетеродимеров ErbB2ErbB3, и терапевтическое средство представляет собой биспецифическое антитело, включающее анти-ErbB3 антитело, связанное с анти-ErbB2 антителом, как описано выше. Предпочтительно клетки для использования в способах, описанных выше, это опухолевые клетки,включая перечисленные выше. Образцы включают опухолевую ткань, тонкоигольный пунктат, сосковый пунктат, цельную кровь, сыворотку, плазму, лимфу, слюну и мочу или выделения из зева или из циркулирующих опухолевых клеток. Как отмечалось выше, очевидно, что измеренные уровни являются уровнями белков (например,мономеров, гомодимеров или гетеродимеров) или мРНК, и в целом могут быть определены, как описано выше. Любой из данных способов необязательно может дополнительно включать выбор схемы лечения(например, для терапевтического средства) на основе спрогнозированной реакции клеток на лечение и/или может дополнительно включать приготовление терапевтического средства для применения на основе спрогнозированной реакции. В предпочтительном варианте разницей уровня по сравнению с контролем является повышенный уровень. Вышеуказанные способы необязательно могут дополнительно включать лечение клеток или субъекта (пациента), от которого клетки получены, терапевтическим средством, на основе спрогнозированной реакции клеток на терапевтическое средство. Для вариантов, в которых измеряются уровни гетеродимеров ErbB1/ErbB3 и/или фосфорилированных гетеродимеров ErbB1/ErbB3 предпочтительно терапевтическое средство, для которого прогнозируется чувствительность, является анти-ErbB3 антителом, более предпочтительно Ab6 (последовательности VH и VL показаны в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно) или анти-ErbB3 антителом, содержащим последовательности CDR VH и VL Ab6, показанные в SEQ ID NO: 7-9 (CDR1 VH, 2, 3) и 10-12 (CDR1 VL, 2,3), соответственно для вариантов, в которых измеряются уровни мономеров ErbB2, гомодимеровErbB2/ErbB2 и/или гетеродимеров ErbB2/ErbB3, предпочтительным терапевтическим средством, для которого прогнозируется чувствительность, является анти-ErbB3 анти-ErbB2 биспецифическое антитело,более предпочтительно, биспецифическое антитело H3B1D2 (последовательность аминокислот показана в SEQ ID NO: 41), или биспецифическое антитело, включающее анти-ErbB3 антитело, содержащее(SEQ ID NO: 48-50 и 1-53). Уровни гомо- или гетеродимеров рецепторов или гомо- или гетеродимеров фосфорилированных рецепторов могут быть измерены в клетках образца с применением способов, известных в данной области. Например, уровни таких гомо- или гетеродимеров могут быть измерены с помощью способа обнаружения димеризации, как описано в патенте США 7105308, патенте США 7255999, публикации США 20040229380 и публикации США 20080187948. В таких способах используют пару зондов(например, антител), один меченый зонд и один расщепленный зонд, при этом каждый зонд специфически связывается с одним из компонентов димера. Связывание двух зондов с димером приводит к расщеплению и выходу молекулярной метки из димерного комплекса, что обеспечивает измерение структуры димерного комплекса. Такие методы также упоминаются здесь как способы, основанные на сближении,примерами которых, присутствующими на рынке, является система VeraTag (Monogram Biosciences). Кроме того, другие способы, известные в данной области для количественного определения уровня димеров, могут применяться, в том числе, не ограничиваясь ими, коиммунопреципитация компонентов димера и применение других способов, основанных на сближении, таких как основанный на резонансном переносе энергии метод Форстера и биомолекулярная флуоресцентная комплементация (BiFC) (подробнее описано, например, в Tao, R.H. and Maruyama, I.N. (2008) J. Cell Sci. 121:3207-3217). В одном из вариантов вышеуказанных способов уровни прямых биомаркеров, измеренные в а),вводятся в статистический алгоритм классификации, сохраненный в вычислительной системе, и реакция клеток на лечение прогнозируется на основе результатов алгоритма, на базе расчетов и преобразований данных в вычислительной системе с использованием алгоритма и измеренных уровней. В другом варианте состояние активации сети (САС) или состояние ингибирования сети (СИС) вычисляется в зависимости от уровня, измеренного в б), с использованием расчетной модели клеточной сети ErbB Можно спрогнозировать реакцию клеток на лечение терапевтическим средством, на основе, по крайней мере частично, вычислений значений САС или СИС. В различных вариантах терапевтическое средство включает любое сочетание одного или нескольких анти-ErbB3 антител, анти-ErbB1 антител, анти-ErbB2 антител, анти-ERBB4 антител, ингибитора panErbB, ингибитора димеризации HER и низкомолекулярного ингибитора из сигнального пути ErbB, каждый из которых описан и приведен выше.IV. Применение способов в лечении. Способы прогнозирования лечения можно применять для любой опухоли, зависящей от сигнального пути, который моделируется в способе. Например, в одном из вариантов способа опухоли зависят от сигнального пути ErbB (например, сигнальный путь ErbB3). В предпочтительном варианте опухоль - это опухоль толстой кишки. В другом предпочтительном варианте опухоли - это немелкоклеточный рак легкого (NSCLC). В ином варианте опухоль является солидной опухолью. В другом варианте опухоль - это несолидная опухоль, такая как светлоклеточная саркома. В различных других вариантах опухоль может быть, например, опухолью органа, выбранного из легкого, толстой кишки, прямой кишки, желчного пузыря, головного мозга, спинного мозга, молочной железы, почек, поджелудочной железы, желудка, печени, костей, кожи, селезенки, яичника, яичка, предстательной железы, головы и шеи, щитовидной железы и мышц. В других вариантах опухоль это опухоль желудка или опухоль рта/глотки. Для осуществления способа прогнозирования клетки образца, например, клетки опухоли, получают от пациента. Например, образец опухоли - это предпочтительно образец опухолевой ткани. Образец ткани опухоли может быть получен с помощью стандартных способов, таких как биопсия опухоли или хирургическая резекция опухоли. Свежезамороженные образцы опухолевой ткани могут быть использованы или, наоборот, зафиксированы в формалине, залитый парафином (FFPE) образец ткани тоже пригоден для использования. Другие типы образцов опухоли также могут быть доступны для использования в способах, в которых образец содержит клетки опухоли и/или клеточные компоненты, выделенных из опухоли. Неограничивающие примеры других типов образцов опухоли включают тонкоигольную аспирацию,сосковую аспирацию, цельную кровь, сыворотку, плазму, лимфу, слюну и мочу или слущивающиеся или циркулирующие опухолевые клетки. В предпочтительном варианте изобретение предусматривает способ, в котором прогнозирование реакции больного раком на лечение терапевтическим средством может быть легко и быстро осуществляться диагностической лабораторией, чтобы предоставить оперативную информацию о том, с какой вероятностью пациент с опухолью будет реагировать на конкретное терапевтическое лечение. В таком способе образцы опухоли, такие как свежезамороженные образцы или фиксированные в формалине, залитые парафином образцы ткани получают от пациента и уровни рецепторов/лигандов опухоли измеряют с помощью полуколичественной иммуногистохимии (IHC). Выбор рецептора(ов) и лиганда(ов) для измерений основан на том, на какую клеточную сеть терапевтическое средство нацелено (например, для пути ErbB уровни следующих лигандов/рецепторов могут быть измерены HRG, BTC, ErbB1, ErbB2 и ЕrbВ 3). Затем результаты измерений методом полуколичественной IHC преобразуются в концентрацию с помощью контроля, который содержит клеточные пробки или ксенотрансплантаты с известными уровнями экспрессии рецепторов и лигандов по сравнению с образцом пациента. В определенных ситуациях,статус мутации одного или нескольких целевых генов (например, PI3K, PTEN) может быть определен в образце с использованием стандартных способов генотипирования. Далее набор данных (концентрации лиганда и рецептора, статус генной мутации, если он установлен) вводится в расчетную модель целевой клеточной сети и вычисляется состояние активации сети (САС). Прогнозирование реакции на терапевтическое средство может быть осуществлено на основе сравнения рассчитанного значения САС с пороговым значением САС для чувствительности и нечувствительности. Использование веб-приложений для ввода концентрации белка и данных относительно мутации в расчетную модель с последующим вычис-9 022884 лением САС и прогнозированием реакции, позволяет диагностической лаборатории получить почти мгновенно сведения о вероятности восприимчивости к лечению опухоли терапевтическим средством. В одном из вариантов для определения уровней одного или нескольких компонентов клеточной сети вводили один или нескольких реагентов, позволяющих определять уровни белковых компонентов,таких как один или несколько реагентов в форме антител. В другом варианте вводили для определения уровней одного или нескольких компонентов клеточной сети один или несколько реагентов, позволяющих определять уровни мРНК компонентов, например один или несколько реагентов в форме нуклеиновых кислот (например, зонды нуклеиновых кислот, праймеры для ПЦР и тому подобное). Такие реагенты для обнаружения белковых или мРНК клеточных компонентов обычно хорошо известны специалистам. Такие средства для определения уровней могут также включать вычислительное устройство, настроенное на измерение уровня белка. К способам, пригодным для определения уровня белка в клеточных компонентах, относятся описанные в данном описании такие способы, как количественная флуоресцентная сортировка клеток(qFACS), твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА, Люминекс), иммуногистохимия (IHС), количественная иммуногистохимия (qIHC), масс-спектрометрия и Вестерн-анализ (иммуноблоттинг). К способам, подходящим для обнаружения уровней мРНК в клеточных компонентах относятся, например,количественная полимеразная цепная реакция (qPCR) и Нозерн-блоттинг. Средства для обнаружения уровня одного или нескольких компонентов клеточной сети могут также включать, например, буферы или другие реагенты для использования в способах оценки уровня компонента(ов). Набор может включать в себя инструкции (например, печатные инструкции, такие как этикетки или листки-вкладыши) для проведения эксперимента(ов) по определению уровня одного или нескольких компонентов клеточной системы. Предпочтительно, клеточная сеть - это сигнальный путь ErbB, используют средство для определения уровня одного или нескольких компонентов (например, одного или несколько рецепторов, гомодимеров рецепторов, гетеродимеров рецепторов и лигандов рецепторов) сигнального пути ErbB, выбранных из ErbB1, ErbB2, ErbB3, ERbB4, HRG (в том числе HRG-1), BTC, EGF, HB-EGF, TGF, AR, EPG иEPR. Предпочтительно средство для обнаружения уровня по крайней мере одного рецептора сигнального пути ErbB (например, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ERbB4) и по крайней мере одного лиганда сигнального путиErbB (например, HRG, BTC, EGF, HB-EGF, TGF, AR, EPG и EPR). Например, в одном из вариантов используют средство для определения уровня ErbB1, ErbB2, ErbB3, HRG и BTC. В другом варианте используют средство для определения уровня ErbB1 и HRG. В еще одном варианте используют средство для обнаружения ErbB1, ErbB2 и ЕгЬВЗ. В других вариантах используют средство для обнаружения мономеров ErbB2, гомодимеров ErbB2, гетеродимеров ErbB2/ErbB3 или гетеродимеров ErbB1/ErbB3. Предпочтительно наборы по изобретению предназначены для применения у субъекта-человека, например, пациента-человека с опухолью. В таких случаях клетки, как правило, это клетки, полученные от пациентов путем биопсии или резекции опухоли.V. Терапевтические способы. Предлагаются способы лечения пациентов со злокачественными опухолями. В общем такие способы включают в себя: получение образца (например, образец биопсии или резекции) опухоли от пациента,определение уровня одного или нескольких биомаркеров в образце и введение терапевтического средства пациенту, если уровни биомаркера(ов) в образце соответствуют заданному профилю, например уровень биомаркеров больше минимального уровня. Такие способы применяются к любой солидной опухоли. Пригодные образцы опухоли в общих чертах описаны выше. В некоторых вариантах биомаркеры являются рецепторными белками ErbB. Некоторые варианты таких способов включают получение образцов опухоли, оценку уровня рЕrbВ 3 в образце, а затем введение по крайней мере одного противоопухолевого терапевтического средства пациенту, при этом, если уровень pErbB3, определенный в образце, не ниже минимального уровня,составляющего 25, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% (желательно 50%) от уровня pErbB3, измеренного в культуре клеток ACHN (клетки рака почек, номер доступа АТСС CRL-1611), культивированной около 20-24 часов в среде без сыворотки, то пациенту далее вводят по крайней мере одно противоопухолевое терапевтическое средство, содержащее анти-ErbB3 антитела, и если уровень pErbB3, измеренный в образце,ниже минимального уровня, то пациенту далее вводят по крайней мере одно противоопухолевое терапевтическое средство, не содержащее анти-ErbB3 антитела Предпочтительными культурами клетокACHN являются клетки, которые перевивали не более 9 раз, например, перевитые 8 раз клетки ACHN В дальнейших аспектах таких вариантов биомаркер представляет собой pErbB3, терапевтическое средство- это анти-ErbB3 антитело, и минимальный уровень составляет 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% от уровня,наблюдаемого в опухолевых клетках модели ксенотрансплантата опухоли ACHN В дополнительных аспектах минимальный уровень равен 0,064 пг/мкг общего белка, 0,08 пг/мкг общего белка, 0,096 пг/мкг общего белка, 0,122 пг/мкг общего белка, 0,128 пг/мкг общего белка, 0,144 пг/мкг общего белка или 0,16 пг/мкг общего белка. В предыдущих вариантах уровень pErbB3 в образце может, в определенных случаях, быть опреде- 10022884 лен а) измерением уровня по крайней мере двух компонентов сигнального пути ErbB3 в образце, б) вычислением состояния активации сети (САС), которое имитирует уровень pErbB3 в образце с помощью уровня(ей), измеренного в (а), введенного в вычислительную модель сигнального пути ErbB3, и (с) определением на них основе уровня pErbB3 в образце. В некоторых вариантах уровни по крайней мере трех,четырех, пяти или шести компонентов сигнального пути ErbB3 определяют в (а). Соответствующие компоненты сигнального пути ErbB3 включают, например, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ERBB4 (и гомо- и гетеродимеры белков ErbB), HRG (например, HRG-1), ВТС, EGF, HB-EGF, TGF, AR, EPG и EPR Эти компоненты могут быть проанализированы как белки (например, мономеры, гомодимеры или гетеродимеры) или, если это возможно (например, если общий уровень белка измеряется независимо от статуса фосфорилирования, а не там, где измеряется уровень фосфопротеина, например, для мономеров, гомодимеров или гетеродимеров), как уровень мРНК, которая кодирует белок. Соответствующие способы хорошо известны в этой области и включают описанные в данном описании. В дополнительных аспектах способы определения уровня pErbB3 дополнительно включают применение статистического алгоритма классификации для создания расчетной модели сигнального путиErbB3, использующегося при расчете CAC. В других вариантах вычисленное САС имитирует уровни фосфорилированных гетеродимеров ErbB1/ErbB3 и/или фосфорилированных гетеродимеров ErbB2/ErbB3 в образце. Анти-ErbB3 антитела для применения в рамках настоящего изобретения включают, не ограничиваясь ими, анти-ErbB3 антитела, раскрытые в международной патентной заявке PCT/US 2008/002119,опубликованной как международная заявка WO 2008/100624, которая включена в данное описание путем ссылки. Особенно предпочтительные для данного изобретения антитела, раскрытые в данном описании, известны как ММ-121, которые в настоящее время проходят этап клинических испытаний. Представленные анти-ErbB3 антитела также включают анти-ErbB3 антитела, описанные выше. Другими антиErbB3 антителами, которые могут быть использованы в способах, описанных здесь, являются U3-1287(AMG888) (U3Pharma AG и Amgen), которые в настоящее время проходят этап клинических испытаний. Опухоли, поддающиеся лечению, как указано в данном описании, в целом описаны выше. Образцы опухолей органов выбраны из опухолей толстой кишки, легкого, прямой кишки, желчного пузыря, головного мозга, спинного мозга, молочной железы, почек, поджелудочной железы, желудка, печени, кости, кожи, селезенки, яичников, яичек, предстательной железы и мышц. В некоторых аспектах ErbB3 положительные опухоли или ErbB2- и ErbB3-положительные опухоли (например, опухоли молочной железы и немелкоклеточный рак легкого) являются предпочтительными. Противоопухолевые терапевтические средства можно вводить пациенту в любой приемлемой форме. Как правило, терапевтическое средство поставляется в виде фармацевтической композиции, которая содержит терапевтические средства в сочетании с физиологически приемлемыми носителями. При желании другие активные или неактивные ингредиенты могут быть также включены в фармацевтическую композицию. Фармацевтические композиции, которые могут использоваться в способе лечения, могут быть созданы для любого соответствующего способа введения, в том числе, например, парентерального, интраназального, перорального, или местного применения, например, с помощью трансдермальных средств для профилактики и/или терапевтического лечения. Примеры подходящих фармацевтических способов введения и носителей описаны в "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," A.R. Gennaro, ed. Lippincott WilliamsWilkins, Philadelphia, PA (21st ed., 2005). Как правило, фармацевтические композиции, применяемые в способах, предусмотренных в данном описании, вводятся парентерально (например, внутривенно, внутримышечно или подкожно). Для парентерального введения противоопухолевое терапевтическое средство может быть в виде суспензии или раствора в носителе. Стерильные водные носители, как правило, предпочтительны, такие как вода, буфер, физиологический раствор или фосфатный буферный раствор. Кроме того, стерильные жирные масла могут быть использованы в качестве растворителя или среды для суспендирования. Для этого любое нелетучее жирное масло может быть использовано, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, нашли применение в приготовлении композиций для инъекций. Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества также могут включать в приближенных к физиологическим условиях рН регуляторы и буферные средства, регулирующие тоничность, диспергирующие средства, суспендирующие средства, увлажняющие средства, детергенты, консерванты, местные анестетики и буферные вещества. Фармацевтическая композиция может быть создана для внутривенного введения пациенту (например, человеку). Как правило, композиции для внутривенного введения являются растворами в стерильном изотоническом водном буферном растворе. В случае необходимости, композиция может также включать солюбилизирующие агенты. Компоненты могут поставляться отдельно или смешиваться в единую лекарственную форму, например, сухой лиофилизированный порошок или безводный концентрат в герметичном контейнере, таком как ампулы. Если композиция подлежит введению посредством инфузии, она может поставляться с емкостью для инфузий, содержащей стерильную воду фармацевтического качества или физиологический раствор. Если композицию вводят путем инъекции, ампула со сте- 11022884 рильной водой для инъекций или физиологическим раствором должна поставляться таким образом, чтобы ингредиенты могли быть смешаны перед введением. Фармацевтические композиции могут быть стерилизованы обычными способами стерилизации или стерилизующей фильтрацинй. Стерильные водные растворы могут быть упакованы для использования или лиофилизированы, лиофилизированный препарат поставляют со стерильным водным носителем для введения рН водной фармацевтической композиции обычно будет находиться между 3 и 11, более предпочтительно от 5 до 9 или между 6 и 8 и наиболее предпочтительно между 7 и 8, например от 7 до 7,5. Терапевтическое средство, как правило, присутствует в фармацевтической композиции в концентрации, при которой введение разовой дозы пациенту обеспечивает терапевтически эффективное количество. Терапевтически эффективное количество- это количество, которое приводит к заметному эффекту у пациента, например замедлению или прекращению роста опухоли или предпочтительно уменьшению размеров опухоли. Терапевтически эффективное количество зависит от целого ряда факторов, в том числе активности применяемого противоопухолевого терапевтического средства; возраста, массы тела,общего состояния здоровья, пола и рациона пациента, времени и способа введения, скорости экскреции; любого сопутствующего лечения, такого как комбинация лекарственных средств, и вида и тяжести повреждения тканей у больного, проходящего лечение. Оптимальные дозы могут быть определены с помощью обычных испытаний и процедур, которые хорошо известны в данной области. В целом предпочтительны композиции, которые обеспечивают уровень дозы от 1 мг до 100 мг на кг массы тела в сутки, в неделю или 1 раз в 2 недели. Неограничивающие примеры соответствующего диапазона доз и схемы приема включают 2-50 мг/кг (массы тела субъекта), введение 1 раз в неделю или 2 раза в неделю или 1 раз в 3 дня, 1 раз в 2 недели или 1 раз в 3 недели, и 1-100 мг/кг 1 раз в неделю, или 2 раза в неделю или 1 раз в 3 дня, или 1 раз в 2 недели. В различных вариантах терапевтическое средство вводят в дозе 3,2 мг/кг, 6 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 35 мг/кг или 40 мг/кг с периодичностью 1 раз в неделю или 2 раза в неделю или 1 раз в 3 дня, 1 раз в 2 недели или 1 раз в 3 недели. Дополнительно диапазон доз включает 1-1000 мг/кг, 1-500 мг/кг, 1-400 мг/кг, 1-300 мг/кг и 1-200 мг/кг. Соответственно,схемы применения включают 1 раз в 3 дня, 1 раз в 5 дней, 1 раз в 7 дней (т. е, 1 раз в неделю), 1 раз в 10 дней, 1 раз каждые 14 дней (т е., 1 раз в 2 недели), 1 раз каждый 21 день (т е., 1 раз в 3 недели), 1 раз каждые 28 дней (т е., 1 раз в 4 недели) и 1 раз в месяц. Предпочтительно терапевтическое средство (например, анти-ErbB3 антитела) вводят пациенту в соответствии с указаниями инструкций по медицинскому применению препарата, предоставленных фирмой-производителем или дистрибьютором терапевтического средства.VI. Примеры. Следующие неограничивающие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение. Описание изобретения к каждому патенту США, международным или другим патентам или патентным заявкам или публикациям, на которые ссылаются в данном описании, включено в данное описание путем ссылки в полном объеме. Пример 1. Исследования эффективности Ab6 с использованием ксенотрансплантата: учебный набор данных. В данном примере использовали четыре модели ксенотрансплантата опухоли с целью идентификации линий опухолевых клеток, которые отвечают на лечение анти-ErbB3 антителом Ab6. Изучаемые четыре модели ксенотрансплантата опухоли представляют различные показания: MALME3M (линия рака меланомы; АТСС, Нет. НТВ-64), ADRr (линия клеток рака яичников; NCI-60, образец COSMIC ID905987), ACHN (линия клеток рака почки; АТСС,CRL-1611) и DU145 (линия клеток рака предстательной железы; АТСС,НТВ-81). Как подробно описано ниже, ксенотрансплантаты MALME3M иADRr не продемонстрировали реакции на лечение Ab6, тогда как ксенотрансплантаты ACHN и DU145 продемонстрировали реакцию на лечение Ab6. В моделях ксенотрансплантата опухоли мышам (мыши nu/nu: самки в возрасте 3-4 недель, с дефицитом Т-клеток; аутбредная популяция; происхождения Albino; из лаборатории Charles River Labs, Wilmington, MA) вводили путем подкожной инъекции в правый бок 200 мкл 3,5106-3108 клеток/мышь (в зависимости от линии клеток). Состояние мышей контролировали с целью наблюдения за начальным ростом опухоли. Опухолевые клетки выращивали в течение нескольких дней, пока объем опухоли не достигал приблизительно 200 мм 3. Объем опухоли вычисляют какV = (/6 (LW2). Мышам вводили антитело Ab6 в дозе 600 мкг/инъекцию каждые 3 дня (qd3). Мышам контрольной группы вводили фосфатный буферный солевой раствор (ФБР). Объем опухоли измеряют в течение 60-80 дней. Результаты (полученные с использованием способов, описанных выше или их незначительных вариаций), выраженные как влияние лечения антителом на рост опухоли, приведены на графиках, показанных на фиг. 1A-1D, которые демонстрируют, что лечение Аb 6 замедляло рост опухоли на моделях ксенотрансплантата DU145 и ACHN, тогда как лечение Ab 6 не замедляло роста (по сравнению с контрольным фосфатным буферным раствором) опухоли на моделях ксенотрансплантата ADRr и MALME3M.- 12022884 Как показатель восприимчивости опухоли к Ab6 определяют экспоненциальный темп роста, который наилучшим образом описывает экспериментальные данные. Для описания экспоненциального роста используют следующую формулу: где V - объем опухоли в мм 3;Vo - объем опухоли на нулевом отрезке времени;t - время в днях. Для сравнения замедления роста в различных исследованиях ксенотрансплантатов для каждой исследуемой линии клеток вычисляют показатель замедления темпов роста (ЗТР, GRR), связывающий наблюдаемый темп роста в присутствии Ab6 с темпом роста, наблюдаемым в контрольной группе, получающей фосфатный буферный раствор; данный показатель вычисляют по следующей формуле: Замедление темпа роста=1-(темп роста в группе Ab6kAb 6)/(темп роста в группе фосфатного буферного раствора kPBS). Показатели ЗТР для четырех исследуемых линий клеток (полученные с использованием способов,описанных выше или их незначительных модификаций) приведены в табл. 1 ниже. В случае негативного замедления темпа роста показатель ЗТР принимают за нуль. Таблица 1. Обобщнные результаты по показателям замедления темпа роста (ПЗТР) опухоли для исследования учебного набора ксенотрансплантатов Результаты демонстрируют, что четыре ксенотрансплантата показывают интервал восприимчивости клеток к лечению Ab6, причем клетки ADRr и MALME3M не демонстрируют реакции на лечениеAb 6, ACHN проявляет умеренную восприимчивость, а клетки DU145 демонстрируют самую высокую восприимчивость к лечению Ab 6. Пример 2. Уровни pErbB3 в лизатах линий опухолевых клеток коррелируют с восприимчивостью кAb6 в ксенотрансплантатах. В данном примере концентрацию фосфорилированного ErbB3 (pErbB3) измеряли in vivo в каждой из четырех линий опухолевых клеток, изученных в примере 1, MALME3M, ADRr, DU145 и ACHN, в краткосрочном исследовании фармакодинамики (ФД). Ксенотрансплантат OvCAR8 также включили в данный эксперимент (в примере 5, описанном ниже, показано, что данный ксенотрансплантат реагирует на лечение Ab6). Клетки MALME3M, ADRr, DU145, OvCAR 8 и ACHN выращивают в культуре и собирают после культивирования для имплантации (пластинки 1515 см, 80% заселнности, общее количество клеток = 2-4108) и помещают на лед до имплантации. Клетки (приблизительно 2107 клеток/мышь) имплантируют 20 мышам (путем подкожной инъекции, 200 мкл клеток/инъекцию/мышь) в правый бок, а затем наблюдают за мышами до их выздоровления, контролируя начальный рост опухоли. Опухоли измеряют(ДШ) цифровым толщиномером. Как только у мышей опухоль достигает объема более 100 мм 3, животных подвергают эвтаназии с использованием СО 2, а опухоли от каждой мыши вырезают и мгновенно замораживают в жидком азоте. Замороженные образцы опухолевой ткани хранят при температуре -80 С для биохимического анализа. Количество фосфорилированного ErbB3 (pErbB3) в опухолевых лизатах определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием набораRD Systems Human pErbB3 ELISA (кат.DYC1769). Приготовление образца и протоколы ELISA подробно описаны ниже. Для приготовления образца и экстракции белка, сначала замороженные опухоли измельчают и переносят в предварительно взвешенные криопробирки VWR объемом 2 мл (VWR International). Измельченные образцы взвешивают, их массу регистрируют. После вычисления массы образца в каждую пробирку добавляют подходящее количество ледяного лизирующего буфера и доводят до конечной концентрации 62 мг/мл. Образцы некоторое время перемешивают на вихревой мешалке при низкой скорости и,вращая, инкубируют при температуре 4 С. Далее необработанный опухолевый лизат переносят в Qiagen Qiashredder и центрифугируют при 12000 об/мин в течение 8 мин для дальнейшей гомогенизации образцов. После переноса очищенных лизатов в чистую пробирку отбирают небольшое количество каждого лизата для количественного анализа содержания белка. Остальную часть лизата разделяют на аликвоты и хранят при температуре -80 С для дальнейшего анализа методом ELISA. Для количественного определения общего содержания белка с использованием набора для количественного анализа содержания белка (ВСА) (Pierce, кат.23225) сначала строят стандартную кривую- 13022884 содержания бычьего сывороточного альбумина (БСА), состоящую из 8 точек, используя стандартный раствор 2 мг/мл из набора ВСА, начиная с исходной концентрации 2 мг/мл. После смешивания реактивов А и Б из данного набора (50:1) и приготовления 3-кратного и 5-кратного разведений исходного опухолевого лизата с помощью фосфатного буферного раствора в каждую ячейку 96-луночного планшета помещают 20 мкл стандартного раствора бычьего сывороточного альбумина или разбавленного образца опухолевого лизата и 160 мкл рабочего реактива. Планшет инкубируют при температуре 37 С в течение 20 мин. Считывают OD562 и определяют общее содержание белков в опухолевых лизатах с помощью стандартной кривой БСА. Для проведения твердофазного иммуноферментного анализа pErbB3 различные иммобилизованные антитела разбавляют фосфатным буферным раствором до рабочей концентрации, рекомендуемой производителем набора (RD Systems DYC1769). После покрытия черных 96-луночных планшетов (NuncMaxisorb) разведенными иммобилизованными антителами, все планшеты инкубируют при комнатной температуре (КТ) на протяжении ночи. Планшеты промывают 3 раза контрольным фосфатным буферным раствором (фосфатный буферный раствор + 0,05% Твина-20) на промывочном аппарате для пластин Теk Bio и блокируют в течение 2 ч при комнатной температуре 200 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина в контрольном фосфатном буферном растворе. Растворы рекомбинантных белков для стандартных кривых готовят с самой высокой концентрацией, рекомендуемой производителем набора, с 2-кратным разведениями для 11 точек. Планшеты промывают 3 раза фосфатным буферным раствором и добавляют 100 мкл опухолевых лизатов, после чего инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты промывают 3 раза контрольным фосфатным буферным раствором и добавляют 100 мкл антитела для первичного обнаружения, разбавленного до рабочей концентрации с помощью 0,1% фосфатного буферного раствора, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% Твина-20. Далее планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. В конце перед считыванием планшетов в каждую ячейку добавляют 100 мкл смешанного хемилюминесцентного субстрата SuperSignal ELISA Pico (Pierce, кат.37069). Фиг. 2 представляет собой график, изображающий концентрацию pErbB3 в ксенотрансплантатах опухолей в отсутствии лечения (в пг/мг опухолевого лизата) против уменьшения темпа роста опухоли(значение в %, полученное при помощи способов, описанных выше или их незначительных модификаций), наблюдаемого для ксенотрансплантатов при лечении Ab6. Фиг. 2 демонстрирует, что наблюдается выраженная корреляция между уменьшением темпа роста опухоли и основными уровнями pErbB3, измеренными в краткосрочных исследованиях фармакодинамики. Ксенотрансплантаты MALME3M и ADRr,которые не отвечали на лечение Ab6, показали самые низкие уровни pErbB3, тогда как ксенотрансплантаты ACHN, OvCAR8 и DU145, которые отвечали на лечение Ab6, продемонстрировали существенно более высокие уровни pErbB3. Результаты демонстрируют, что уровни pErbB3 в опухолевых клетках в высокой степени коррелируют с восприимчивостью опухолевых клеток к лечению анти-ErbB3 антителом. Пример 3. Снижение уровней pErbB3 и pAKT как функция времени замерзания. В данном примере оценивают стабильность pErbB3 и рАКТ и уровни экспрессии ErbB1, ErbB2 иErbB3 в опухолевых лизатах как функцию времени после размораживания опухоли. Не получавших лечения мышей с ксенотрансплантатом ACHN и EKVX подвергают эвтаназии с использованием СО 2, опухоли вырезают и разрезают на 4 части, помещают в жидкий азот через различные временные отрезки: 0, 10, 30 и 60 мин. Затем после размораживания измеряют уровни pErbB3 и pAKT, а также уровни ErbB1-3 в каждом из образцов. Результаты, полученные с использованием способов, описанных выше или их незначительных вариаций, приведены на гистограммах, показанных на фиг. 3 А-3 Е,где фиг. 3 А и 3 В показывают уровни pErbB3 и pAKT, соответственно, в лизатах ACHN, а фиг. 3 С, 3D и 3 Е демонстрируют уровни ErbB1, ErbB2 и ErbB3, соответственно, в лизатах EKVX. Как показано на фиг. 3 А и 3 В, в образцах, замороженных через 10 мин, уже наблюдается измеримое уменьшение уровней pErbB3 и pAKT по сравнению с образцами 0-й мин. В образцах, замороженных через 30 мин, наблюдается уменьшение концентрации pErbB3 на 40% по сравнению с контролем (мгновенное замораживание опухоли, образец 0-й минуты), а для рАКТ уменьшение концентрации составляло 20% по сравнению с контролем. В отличие от них, в лизатах опухолевых клеток EKVX и ACHN общие уровни ErbB1-3 остались неизменными и не зависели от момента их замораживания (см. фиг. 3 С-3 Е). Таким образом, наблюдаемая нестабильность фосфопротеинов в данных образцах опухоли и стабильность общего белка демонстрируют преимущество скорее вычисления уровня фосфорилирования ErbB3,а не непосредственного измерения уровней в лизате опухолевой клетки. Данный вычисленный уровеньpErbB3 относится к состоянию активации сети (САС, Network Activation State) в следующих примерах,где использовали механистическую вычислительную модель, построенную, как описано ниже в примере 4 Пример 4. Построение и обучение механистической вычислительной модели сигнального путиErbB. В следующем примере описано построение механистических вычислительных биохимических моделей сигнальных путей трансдукции. Базируясь на знании литературы о сигнальном пути ErbB, была- 14022884 разработана механистическая вычислительная модель, содержащая все взаимодействия "белок-белок",описывающие присоединение лиганда к рецептору, димеризацию, интернализацию рецептора и деградацию, а также связывание с адаптерной молекулой Gabl, приводящее к активации каскада PI3K. На фиг. 4 А изображена сигнальная сеть ErbB в виде графика. Вычислительная модель представляет собой набор нелинейных обыкновенных дифференциальных уравнений (ОДУ) с использованием кинетики действия масс. На фиг. 4 В изображен набор биохимических реакций сигнального пути, а на фиг. 4 С показан набор переносов. Биохимические реакции и переносы преобразованы в набор нелинейных ОДУ, показанных на фиг. 4D. В целом, состояние изменения концентрации белка ci равно скорости продуцирования белкаV продуцирования минус скорость поглощения V поглощения белка, как показано в уравнении 1: Вычислительная модель, используемая для прогнозирования реакций на Ab6 в следующих примерах, состоит из сети ErbB млекопитающих, которая включает все четыре рецептора (ErbB 1-4) и сигнальный каскад трансдукции Akt. Рецепторы ErbB представляют собой однопроходные трансмембранные рецепторы типа I с внеклеточными доменами связывания с лигандом, внутриклеточным доменом тирозинкиназы и цитоплазматическим концевым сегментом, который действует как сигнальный каркас. ErbB1 и ErbB4 полностью функциональны с точки зрения связывания с лигандом и активности тирозинкиназы, но ErbB2 не связывается с известными на данный момент лигандами, функционируя вместо этого как готовый к димеризации усилитель сигнала (Klapper, L.N. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4995-5000). ErbB3 содержит поврежднный домен киназы (Guy, P.M. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8132-8136), и, следовательно, испытывает недостаток каталитической активности, вместо того, чтобы преобразовывать сигналы при фосфорилировании другими рецепторами ErbB. Из 13 известных лигандов ErbB, BTC иHRG задействованы как лиганды, которые индуцируют самые высокие уровни фосфорилирования ЕrbВ 3. Тринадцать известных лигандов ErbB можно разделить на три группы: (i) лиганды, которые специфично связываются с ErbB1, например EGF, преобразовывая трансформирующий фактор роста альфа(TGF) и амфирегулин (АР), (ii) лиганды, которые проявляют двойную специфичность, связываясь как сErbBl, так и ЕrbВ 4, в том числе с BTC, HB-EGF, EPG и EPR, и (iii) нейрегулины (НРГ - NRG), которые делятся на две подгруппы: NRG1 (также известные как GGF2, SMDF или HRG), связывающиеся сErbB3/ErbB4, данное свойство также присуще NRG2, и NRG3/NRG4, связывающиеся только с ErbB4. После связывания с лигандами рецепторы димеризуются и подвергаются трансфосфорилированию на остатках цитоплазматических концевых сегментов, таким образом создавая стыковочные сайты для SH2 содержащих адаптерных молекул, например, She, Grb2, GAP, Sos и PI3K. ErbB1 содержит как минимум 20 сайтов фосфорилирования тирозина в цитоплазматическом концевом сегменте, 12 из которых предложены партнеру с SH2-содержащими адаптерными белками и ферментами (Schulze, W.X. et al. (2005)Mol. Syst. Biol. 1:2005-2008). Другие рецепторы ErbB подвергаются такой же сложной посттрансляционной модификации. Сопряженные с рецептором адаптеры, например Grb2 и PI3K, активируют белок RAS,и в конечном счете включают ERK и АКТ. АКТ может также быть активирован в RAS-независимой форме через прямое связывание PI3K-р 85 с множественными сайтами на ErbB3. Хотя опубликован целый ряд вычислительных моделей, например, Kholodenko, B.N. et al. (1999) J.Nat. Cell. Biol. 7:365-373; Birtwistle, M.R. et al. (2007) Molecular Systems Biology 3:144), вычислительная модель, используемая в данном описании, обширнее и включает все четыре рецептора ErbB и два четких класса лигандов (HRG и ВТС), при этом сохраняя устойчивость состава действия масс, основанного на элементарных реакциях. Семь гетеро- и гомодимеров ErbB, которые описаны в литературе, были задействованы в модели:ErbB1/1, ErbB1/2, ErbB1/3, ErbB1/4, ErbB2/2, ErbB2/3 и ErbB2/4. Большинство этих димеров активируются путем связывания с лигандом, но несколько из них появляются в процессе "латеральной передачи сигнала" (или вторичной димеризации), в котором димеры, фосфорилированные зависимым от лиганда образом, диссоциируют на мономеры, а затем гомо- или гетеродимеры олигомеризируются с активированными или неактивированными мономерами для образования активных димеров. Вычислительную модель обучали на основании набора экспериментальных данных, позволяющих идентификацию димеров, образующихся в присутствии HRG или ВТС с использованием линии клеток ADRr. Вычислительная модель основана на обычных нелинейных дифференциальных уравнениях, для которых необходимы два вида параметров, которые должны быть измерены или определены: начальное количество молекул и константы скорости. До калибровки модели уточняют значения как можно большего количества параметров на основании информации из литературных источников, например, констант связывания лигандов с их сопряжнными рецепторами. С помощью количественного анализа методом флуоресцентной сортировки клеток (qFACS) определяли уровни экспрессии рецепторов ErbB во всех линиях клеток, используемых в данном изобретении. Более того, применяли твердофазный имму- 15022884 ноферментный анализ (ELISA) для количественного определения уровней ВТС и pErbB3. Кроме того,определяли уровни мPHK в HRG-1 в сравнении с уровнями мPHK в линии клеток ZR-75 (АТСС,CRL-1500). Уровни экспрессии рецептора и лиганда, информацию о которых используют в вычислительной модели, приведены в табл. 2 ниже. Методология получения данных уровней экспрессии подробно описана ниже. Линии опухолевых клеток получают из Национального института рака. Все линии клеток выращивают как однослойные культуры в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО 2 и 95% воздуха, при температуре 37 С в полноценных средах: среды RPMI-1640 (Gibco) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ФТС-FCS) (Hyclone), 2 мМ L-глутамина (Gibco) и Ед/мл Pen-strep (Gibco). Уровни экспрессии рецептора определяют количественно при помощи набора Quantum Simply Cellular Kit 816A (Bangs Laboratories), позволяющего проводить количественное определение уровней экспрессии рецептора qFACS. Указанный набор содержит ряд из 4-х популяций микросфер, меченных варьирующими количествами козьего анти-человеческого IgG плюс контрольная популяция. IgG, специфичный по отношению к участку Fc антител IgG, конъюгированный с поверхностью сфер. Сферы окрашивают точно так же, как и образцы клеток, с тем же антителом. Каждая из различных популяций микросфер связывает известное количество меченного моноклонального антитела. Путем нанесения на график интенсивности флуоресценции каждой популяции против показателя заданной антителосвязывающей способности (АСС), строится стандартная кривая АСС, с помощью которой легко определяют АСС в образцах окрашенных клеток, при помощи программного обеспечения, предложенного Bangs Laboratories (QuickCal v 2.3). Данная программа учитывает режим работы используемого прибора, напряжение для данного образца и применяемый флуорохром. Уровни экспрессии ВТС измеряют с помощью метода ELISA с использованием набора человеческого бета-целлюлина RD Systems Dy261 DuoSet-IC. 384-луночный планшет покрывают 4 мкг/мл иммобилизированного антитела. 384-Луночный планшет блокируют путем добавления 50 мкл 2% бычьего сывороточного альбумина/1 ФБР (без Твина-20) в течение 1 ч, и строят рекомбинантную стандартную кривую. После промывания планшетов добавляют 16 мкл клеточных лизатов, а также идентифицирующее анти-фосфотирозин-пероксидаза хрена антитело, с последующей инкубацией в течение 2 ч. В конце добавляют 20 мкл люминесцентного субстрата Pico и планшеты считывают с помощью спектрофотометра. Поскольку коммерчески доступные анализы для измерения уровней экспрессии белка HRG-61 не были достаточно чувствительными для получения надежных данных для исследуемых линий клеток,уровни мРНК HRG-1 для целевых линий клеток вычисляли количественно. РНК выделяют из клеточных лизатов в соответствии с протоколом RNeasy Mini (74104 RNEASY KIT от QUIAGEN). После преобразования изолированной РНК в кДНК и приготовления мастер-смеси для количественной ПЦР(КПЦР) с использованием мастер-смеси Applied Biosystems 430443 7 Tagman, КПЦР запускает и позволяет количественно определить экспрессию мРНК HRG-1 относительно уровней мРНК в клетках ZR751. Праймеры для КПЦР приобретены у Applied Biosystems. Уровни фосфорилирования ErbB3 для различных линий клеток, показанных в табл. 2, определяют при помощи набора ELISA pErbB3 от RD (Dyc1769-2 DuoSet-IC человеческий фосфо-ErbB3) с использованием способов, описанных выше в Примере 2 или их незначительных модификаций. Табл. 2, приведенная ниже, обобщает информацию, касающуюся уровней экспрессии рецептора и лиганда, полученную для различных линий клеток с помощью способов, описанных выше, или их незначительных вариаций; данную информацию использовали при построении модели вычислений сигнального пути ErbB. В первой колонке приведено название линии клеток; во второй показан вид опухоли; в колонках 3-5 показано количество рецепторов на клетку для ErbB1, ErbB2 и ErbB3, соответственно; колонка 6 демонстрирует уровни мРНК HRG-B1, выраженные как изгиб по сравнению с уровнями мРНК в клетках ZR-75; а в колонках 7 и 8 приведено количество ВТС и pErbB3 в клетках, выраженное как пг/клетку.- 16022884 Таблица 2. Обобщнные результаты уровней экспрессии рецептора и лиганда для линий клеток, используемых в экспериментах с ксенотрансплантом Для обучения вычислительной модели использовали набор данных, который включает дозовременные матрицы, где измеряют методом ELISA фосфорилирование ErbB1, ErbB2, ЕrbВ 3 и АКТ на различных отрезках времени и в девяти различных концентрациях стимуляции ВТС или HRG в клетках ADRr. Для стимуляции клеток производят посев клеток в 100 мкл полной среды в количестве 35000 клеток на лунку на 96-луночных планшетах для культуры ткани и инкубируют на протяжении ночи в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО 2 и 95% воздуха, при температуре 37 С. Далее клетки переносят в свободные от сыворотки среды: среды RPMI-1640 (Gibco) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Gibco) и Ед/млPen-strep (Gibco). Истощнные клетки инкубируют в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО 2 и 95% воздуха, при температуре 37 С в течение 20-24 ч перед стимуляцией. Для исследований дозовременной матрицы клетки стимулируют лигандом (ВТС или HRG) через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 20, 30, 60 и 120 мин. После стимуляции 9 различными концентрациями HRG (0,038-250 нМ) и ВТС (0-700 нМ) для каждого временного отрезка клетки размещают на льду, промывают холодным ФБР, а затем лизируют в 30 мкл холодного буфера для экстракции белков млекопитающих M-PER (Thermo Scientific, кат.78501) с добавлением смеси ингибиторов протеаз (Sigma-Aldrich, P2714), 1 мМ натрия ортованадата(Sigma-Aldrich, S6508), 5 мМ натрия пирофосфата (Sigma-Aldrich, 221368), 50 мкМ оксофениларсина(EMD Biosciences, 521000) и 10 мМ bpV(phen) (EMD Biosciences, 203695). Уровни фосфорилирования белка в стимулированных клетках измеряют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Иммобилизированные антитела против ErbB1 (RD Systems,AF231), ErbB2 (RD Systems, MAB1129), ErbB3 (RD Systems, MAB3481) и АКТ (Upstate, 05-591MG) инкубируют в 384-луночных черных плоскодонных планшетах из полистирола с высокой способностью к связыванию (Corning, кат.3708) при комнатной температуре на протяжении ночи. Планшеты для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) блокируют 2% бычьим сывороточным альбумином(БСА) и фосфатным буферным раствором (ФБР) в течение 1 ч, затем инкубируют с лизатами, разбавленными 2% БСА, 0,1% Твина-20 и ФБР в течение 2 ч при комнатной температуре. Между каждой инкубацией планшеты промывают 3 раза 0,05% Твина-20 в ФБР. Образцы для проведения метода ELISA с целью измерения фосфо-ErbB1, -ErbB2 и -ErbB3 инкубируют со связанным моноклональным антифосфотирозин-пероксидаза хрена (ПОХ - HRP) антителом (RD Systems, HAM1676) в течение 2 ч. Образцы для проведения ELISA с целью измерения фосфо-AKT инкубируют со специфичным по отношению к первичному серину 473 моноклональным мышиным анти-фосфо AKT антителом (Cell SignalingTechnologies, кат.5102) в течение 2 ч, а затем инкубируют со стрептавидином-ПОХ (RD Systems,кат.DY998,) в течение 30 мин. Образцы, проверенные методом ELISA, визуализируют с помощью хемилюминесцентного субстрата SuperSignal ELISA Pico (Pierce, кат.37069), а люминесцентный сигнал измеряют с помощью люменометра. Результаты (полученные с применением способов, описанных выше или их незначительных модификаций) для набора данных фосфорилирования белка в различных отрезках времени при девяти различных концентрациях ВТС или HRG приведены на фиг. 5 А-5 В, где фиг. 5 А показывает уровни фосфо- 17022884ErbB3, фосфо-ErbB2, фосфо-ErbB3 и фосфо-АКТ для HRG-стимулированных клеток, а фиг. 5 В демонстрирует уровни фосфо-ErbB3, фосфо-ErbB2, фосфо-ErbB3 и фосфо-AKT для ВТС-стимулированных клеток. Указанный набор данных применяли для калибровки вычислительной модели сигнального путиErbB, таким образом, результаты (линии) имитации описывают экспериментальные данные (точки), показанные на фиг. 5 А-5 В. Дальнейшая информация относительно развития вычислительной модели рецептора сигнального пути ErbB предоставлена ниже. Структура образца Модель сигнальной сети рецептора ErbB состоит из трех рецепторов (ErbB1, ErbB2, ErbB3), рецепторной фосфатазы, фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K, связывающейся с рецепторами) и компонентовPI3K-AKT каскада (фосфатидилинозитола бисфосфата, PIP2, фосфатидилинозитолзависимой протеинкиназы, PDK1, PTEN, удаленного из хромосомы 10, PTEN, серин, треонинпротеинкиназы, также известной как протеинкиназа В, АКТ, протеинфосфатазы 2 А, РР 2 А) (см. табл. 8 ниже). Были включены два лиганда рецептора ErbB: херегулин (HRG1-), связывающийся с ErbB3 и ErbB4 (не включен в данную модель изза значительных трудностей в экспериментальном обнаружении уровней экспрессии ErbB4 в линиях клеток (см. табл. 3 ниже), и бета-целлюлин (ВТС), связывающийся прежде всего с ErbB1 (Beerli, R.R. andHynes, N.E. (1996) J. Biol. Chem. 271:6071-6076; Jones, J.T. et al. (1999) FEBS Lett. 447:227-231). Кинетические реакции действия масс, полностью перечисленные в табл. 11 ниже, преобразовали в обыкновенные дифференциальные уравнения с использованием Matlab Simbiology 2.3 (Mathworks, MA). В модель включили индуцированную лигандом димеризацию, интернализацию, рециклизацию и деградацию, как описано в литературе для всех гомо- и гетеродимеров (Hendriks, B.S. et al. (2003) J. Biol.Chem. 228:23343-23351; Wang, Z. et al. (1999) Mol. Biol. Cell 10:1621-1636). Применяли значения стабильности димеров рецепторов с использованием относительной шкалы, опубликованной в Shankaran, H.et al. (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun. 371:220-224, где сопутствующая экспрессия ErbB1 с ErbB2 или ErbB3 оказывает влияние на проведение сигнала к поверхности клетки и регуляцию вниз под действием сигнала и где одновременная сопутствующая экспрессия ErbB1-3 приводит к избытку гетеродимеров ErbB2-ErbB3. Таким образом, ErbB3-содержащие димеры интернализируются и деградируют медленнее, чем гомодимеры ErbBl или гетеродимеры ErbB1-ErbB2. Также включена конститутивная димеризация, хотя существует предположение, что свободные от лигандов димеры не вызывают передачу сигнала по ходу транскрипции (Yu, X. et al. (2002) Mol. Biol. Cell 11:2547-2557) и остаются на поверхности клеток. Лиганды ErbB связываются различными сродством с гомо- и гетеродимерами ErbB(Teramura, Y. et al. (2006) EMBO J. 25:4215-4222), но для сокращения числа кинетических параметров,которые необходимо оценить, и для описания экспериментальных данных с самой простой возможной моделью, мы ограничились одинаковым сродством связывания лигандов с гомо- и гетеродимерами ErbB. Димеризованные рецепторы подвергаются быстрому фосфорилированию и активизируют сигнальные пути по ходу транскрипции через связывание сигнальных адаптеров с сайтами фосфотирозина на цитоплазматическом концевом сегменте рецептора (Yarden Y. and Sliwkowski, M.X. (2001) Nat. Rev. Mol.Cell. Biol. 2:127-137). Здесь внедряли упрощенный каскад PI3K-AKT, где PI3K прямо связывается со связанными с лигандом гетеродимерами, активирует PIP2, образующий комплекс с PDK1 и AKT, что приводит к двухступенчатому двойному фосфорилированию AKT. ErbB3 содержит шесть сайтов для связывания с PI3K, тогда как другие рецепторы ErbB содержат только один (Wallasch, С. et al. (1995) EMBO J. 14:4267-4275; Soltoff, S.P. et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:3550-3558). Хотя в настоящий момент неизвестно, могут ли шесть молекул PI3K связываться одновременно с ErbB3, PI3K активируется в 10-20 раз сильнее при помощи ErbB3 (Fedi, P. et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:492-500), чем другими рецепторами. Существуют также данные о том, что PI3K связывается с ErbB с большим сродством, чем с другими рецепторами ErbB (Jones, R.B. et al. (2006) Nature 439'168-174) Мы объединили эти явления в модель и избежали комбинаторной сложности включения шести сайтов связывания, задавая следующие условия дляErbB3-содержащих димеров, а именно: увеличенную скорость связывания с PI3K; увеличенную скорость связывания PIP2 с PI3K и увеличенную скорость активации PIP3. PIP2 отсутствует в эндосомах (Haugh,J.M. (2002) Mol. Interv. 2:292-307), следовательно, только димеры мембраносвязанного рецептора в плазме способны к активации PIP2 в данной модели. Начальные имитации слишком медленно ускоряли активацию AKT, что вынуждало практически полностью дезактивировать фосфатазу AKT перед имитацией и вводить негативный контур обратной связи посредством чего AKT активирует собственную фосфатазу, данное явление описано в другом источнике (Camps, M. et al. (1998) Science 280.1262-1265). Каскадом MAPK пренебрегли как из-за его простоты, так и из-за недавно полученных нами данных, что передача сигнала АКТ относительно нечувствительна к молекулам и параметрам в каскаде MAPK (Chen,W.W. et al. (2009) Mol Syst. Biol 5 239); таким образом, для описания динамики передача сигнала AKT не требуется перекрстное действие MAPK-PI3K. Показатели начальных молекул измеряли непосредственно (рецепторы ErbB, PDK1, AKT), сделав вывод по литературным источникам (Birtwistle, M.R. et al.(2007) Mol. Syst. Biol. 3:144; Hatakeyama, M. et al. (2003) Biochem. J. 373:451-453) или устанавливали по не ограничивающим скорость значениям. Калибровка образцов Многие из параметров скорости реакции в клеточной системе, которую мы исследовали, неизвестны и, таким образом, их следует изучить и оценить (см. табл. 10 ниже). Чтобы избежать отклонения от исходной точки, все параметры привели к стандартным значениям (Aldridge, B.B. et al. (2006) Nat. Cell.Biol. 8:1195-1203). Количество оцененных параметров было ограничено, поскольку оценку проводили в две стадии: сначала откалибровали модель по отношению к экспериментально наблюдаемым данным фосфорилирования рецептора ErbB; во-вторых, параметры, чувствительные к фосфорилированию АKТ,оптимизировали по отношению к экспериментальным данным. Оцененные значения принимали только,если параметры ограничивали в сериях множественных опытов, используя генетический алгоритм на популяции размером 50 и 25 поколений (Mathworks, MA). Константы скорости связывания с лигандомHRG1-6 и ВТС оценивали отдельно с использованием известных констант диссоциации (Kd) (Tzahar, E.et al. (1999) FEBS Lett. 447:227-231) и начальных кривых "доза-реакция" с целью соответствия скорости связывания по ходу транскрипции 1105 М-1 с-1 для обоих лигандов. Анализы чувствительности (Mathworks, MA) выполняли с целью идентификации параметров, которые сильно повлияли на активностьErbB1, ErbB2, ErbB3 и фосфорилирование AKT со стимуляцией HRG1-В или ВТС (см. табл. 11 ниже). Каждый параметр мог изменяться по отдельности, когда систему стимулировали 1 нМ HRG1-B или ВТС. Приведенную к стандартным значениям чувствительность каждой молекулы интегрировали за период стимуляции в течение 2 ч, параметры со стандартной, интегрированной чувствительностью выше произвольного порога 1000 перечислены в табл. 11 ниже. Как упомянуто выше, фосфорилирование ErbB4 не включали в оценку параметров, поскольку исследуемая линия клеток содержала едва обнаружимые количества ErbB4 (см табл. 3 ниже). Реакции ErbB4 параметризованы согласно реакциям ErbB3. Профили фосфорилирования рецептора ErbB были чувствительны к параметрам димеризации, интернализации, рециклизации и деградации (ферментные реакции, диссоциация димеров и константы скорости фосфатазы не проявляли чувствительности). Данные параметры были пригодны при использовании массива данных высокой плотности. Каждую выборку информации упорядочивали до максимально достигнутой активации любым лигандом, при этом сохраняя относительную эффективность каждого лиганда. Скорости димеризации рецептора ErbB сильно ограничивали, а взаимосвязи параметров наблюдали параллельно данным, описанным в литературе: ErbB2 является предпочтительным партнером димеризации для связанного с лигандом ErbB1 или ErbB3 (более заметно при стимуляции херегулином). На основе доступных данных невозможно было ограничить как скорости рециклизации, так и скорости интернализации; таким образом, скорости рециклизации устанавливали на уровне 0,005 с-1, аппроксимировали только скорости интернализации. Полученные результаты наблюдения, таким образом, применяют в одинаковой мере и к скоростям рециклизации (в обратном порядке). Скорости интернализации варьировали в зависимости от лиганда-раздражителя: HRG1 связанные димеры демонстрировали гораздо более медленную интернализацию по сравнению с ВТС-связанными гомо- и гетеродимерами; данная гипотеза поддерживается повсеместно (Sorkin, A. and Goh, L.K. (2008) Exp. Cell Res. 314:3093-3106). Скорости деградации также сильно ограничивали, но они были подобны скоростям всех димеров, свидетельствуя о том, что нет необходимости объяснять наблюдаемые данные с помощью скоростей деградации отдельных димеров. Фосфорилированный АКТ чувствителен ко многим параметрам в пределах каскада PI3K и на уровне рецептора (см. табл. 11 ниже). Таким образом, мы ограничили калибровку параметрами модели, которые находились в каскаде PI3K-AKT и обучали модель по отношению к отрезкам времени фосфорилирования AKT, в то время как мы блокировали значения параметров, уже рассмотренных в профилях рецептора ErbB. После обучения модели выполняют вручную локальную коррекцию параметров с целью расшифровки эффекта каждого параметра, определения их возможного дальнейшего совершенствования, а также ограничения параметров до биологически достоверных значений. Для стандартизации параметры округляли и приводили к подобным значениям при сохранении типа параметра (как объяснено для скоростей деградации). Внедрение ингибитора Ингибиторы сети ErbB включили в модель, используя самую простую интерпретацию известных механизмов действия (см. табл 12 ниже): анти-ErbB3 моноклональное антитело Ab6 изолирует ErbB3 путем связывания с лигандом и вызывает интернализацию и деградацию; цетуксимаб изолирует ErbB1 и препятствует связыванию с лигандом; лапатиниб препятствует активации рецепторов ErbB, но не димеризации или связыванию с лигандом; а пертузумаб блокирует димеризацию ErbB2. Для Ab6 использовались константы скорости, измеренные Kinexa, а для других ингибиторов использовались константы скорости, приведенные в литературе (Wood, E.R. et al. (2004) Cancer Res. 64:6652-6659; Patel, D. et al.(2007) Anticancer Res. 27:3355-3366; Adams, C.W. et al. (2006) Cancer Immunol. Immunothex. 55:717-727) и перечисленные в табл. 13 ниже; параметры цетуксимаба были экспериментально подтверждены Kinexa. Различная дополнительная информация, используемая при разработке вычислительной модели сигнального пути ErbB, рассматривается в табл. 3-13 ниже.- 19022884 Таблица 3. Измеренная экспрессия рецептора ErbB и статус мутации для исследуемых линий клеток НО - не обнаруживаемый;- измерено с помощью qFACS; Веб-сайт, используемый для определения статуса мутации исследуемых линий клеток:http://www.sanger.ac.uk/perl/genetics/CGP/corelinevieweraction=nci60list. Таблица 4. Характеристика кривых "доза-реакция" фосфорилирования ErbB1 для лигандов связывания ErbB1 и HRG1 Таблица 5. Характеристика кривых "доза-реакция" фосфорилирования ErbB2 для лигандов,связывающихся с ErbB1 и HRG1- 21022884 Таблица 8. Начальные количества ненулевых видов в модели вычислений Таблица 9. Обобщнные результаты биохимических реакций, воспроизведенных в вычислительной модели с использованием кинетики действия масс с соответствующими параметрами Определение используемых сокращений:: обозначает комплекс белка, например, лиганд, связанный с рецептором; р обозначает, что белок является фосфорилированным;- 28022884 Таблица 10. Описание параметров со значениями. Номер параметра соответствует первой реакции, в которой появляется данный параметр