Длинные растворимые полипептиды рн20 и их использование

ДЛИННЫЕ РАСТВОРИМЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ РН 20 И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ Изобретение включает растворимые полипептиды РН 20, в том числе расширенные (длинные) растворимые полипептиды РН 20, и их применение. Также предусмотрены укороченные с С-конца полипептиды РН 20 и частично дегликозилированные полипептиды РН 20, а также их использование. Родственные заявки Приоритет по заявке на данное изобретение принадлежит предварительной заявке США 61/281240, авторами которой являются Ge Wei, Krishnasamy Panneerselvam, Louis Bookbinder и(Длинные растворимые полипептиды PH20 и их использование), поданной 13 ноября 2009 г., и предварительной заявке США 61/201384, Ge Wei, Krishnasamy Panneerselvam, Louis Bookbinder и Gregory I.Frost, озаглавленной "EXTENDED SOLUBLE PH20 POLYPEPTIDES AND USES THEREOF" (Длинные растворимые полипептиды PH20 и их использование), поданной 9 декабря 2008 г. Содержание вышеупомянутых родственных заявок в полном объеме включено в настоящее описание в виде ссылок. Заявка на данное изобретение родственна заявке США 12/653245, поданной одновременно с настоящей заявкой, озаглавленной "EXTENDED SOLUBLE PH20 POLYPEPTIDES AND USESTHEREOF" (Длинные растворимые полипептиды PH20 и их применение), которая претендует на приоритет предварительных заявок США 61/281240 и 61/201384. Область техники Изобретение относится к растворимым полипептидам PH20, в том числе к длинным растворимым полипептидам PH20, и их применению. Изобретение также включает и другие укороченные с С-конца полипептиды PH20 и частично дегликозилированные полипептиды PH20 и их применение. Уровень техники Гиалуронан (гиалуроновая кислота, ГК) представляет собой полипептид, распространенный во внеклеточном матриксе множества тканей, особенно в мягкой соединительной ткани. В организме млекопитающих ГК также преимущественно встречается в коже, хрящах и в синовиальной жидкости. Гиалуроновая кислота также является основным компонентом стекловидного тела глаза. ГК играет важную роль в различных физиологических процессах, таких как водный гомеостаз и гомеостаз белков плазмы(Laurent Т.С. et al. (1992), FASEB J. 6: 2397-2404). Некоторые заболевания связаны с экспрессией и/или продукцией гиалуроновой кислоты. Гиалуронидазы представляют собой ферменты, которые разрушают гиалуронан. Выступая в роли катализаторов гидролиза ГК, гиалуронидазы могут быть использованы для лечения заболеваний или расстройств, связанных с накоплением ГК или других гликозаминогликанов. Кроме того, поскольку ГК является основным компонентом интерстициального барьера, гиалуронидазы способны увеличивать проницаемость тканей и, следовательно, могут быть использованы для усиления распространения и ускорения доставки терапевтических агентов. В терапевтических целях в комбинации с другими терапевтическими агентами,как правило, в качестве диспергирующих агентов и агентов, усиливающих распространение, были использованы различные гиалуронидазы (например Hydase, Vitrase и Wydase). Многие из указанных ферментов являются бычьими или овечьими белками, которые могут быть иммуногенными для человека. Таким образом, существует потребность в улучшенных композициях гиалуронидаз, которые могут быть использованы для лечения. Краткое описание изобретения Изобретение включает растворимые полипептиды PH20, в том числе длинные растворимые полипептиды PH20 (esPH20), и их композиции. Предусмотренные в настоящем изобретении полипептидыPH20 представляют собой укороченные с С-конца растворимые белки, включая белки, в которых отсутствует сигнальная последовательность присоединения GPI-якоря (например, белки, в которых отсутствуют аминокислоты с 450 до 490). К растворимым полипептидам PH20 также относятся длинные растворимые полипептиды PH20, которые включают один или несколько аминокислотных остатков из сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря соответствующего полноразмерного полипептида PH20 дикого типа. Также в данном изобретении предусмотрены другие модифицированные укороченные с С-конца полипептиды PH20. Также предусмотрены частично дегликозилированные формы всех описанных полипептидов. Кроме того, предусмотрены способы лечения с использованием предусмотренных полипептидов PH20. Изобретение включает выделенные и существенно очищенные длинные растворимые гиалуронидазы PH20 (esPH20), которые могут быть N-гликозилированы или частично N-гликозилированы. В некоторых примерах частично N-гликозилированный полипептид esPH20 содержит, по меньшей мере, остатокN-ацетилглюкозамина, связанный по меньшей мере с каждым из двух N-замещенных остатков, таких как, например, аминокислотные остатки 368 и 393 из SEQ ID NO: 107, или соответствующие аминокислотным остаткам 368 и 393 из SEQ ID NO: 107 остатки. В некоторых аспектах частичноN-гликозилированный полипептид esPH20 содержит не менее двух остатков N-ацетилглюкозамина, связанных по меньшей мере с каждым из двух N-замещенных остатков. Частично N-гликозилированный полипептид esPH20 по настоящему изобретению также может содержать разветвленные сахара. Изобретение включает полипептиды esPH20 с последовательностями аминокислот, приведенными в любой из SEQ ID NO: 60-63 и 102-104, а также их аллельные или видовые варианты. Кроме того, предусмотрены варианты полипептидов esPH20, не менее чем на 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92,93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные любой из последовательностей SEQ ID NO: 60-63 и 102-104 и сохраняющие не менее 30% гиалуронидазной активности соответствующей немодифицированной фор-1 022752 мы или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид из аминокислот 36-482 SEQ ID NO: 107. Такие полипептиды esPH20 остаются растворимыми и активными. В одном из примеров esPH20 представляет собой человеческую esPH20, например, с последовательностью аминокислот, приведенной в любой из SEQ ID NO: 60-63 и 102-104, или esPH20 шимпанзе, например, с последовательностью аминокислот, соответствующей аминокислотам 36-491, 36-492, 36-493, 36-494,36-495, 36-496, 36-497 или 36-498 из SEQ ID NO: 197. Также в данном изобретении предусмотрены в значительной степени очищенные полипептидыPH20. Указанные полипептиды PH20 могут иметь последовательности аминокислот, приведенные в любой из SEQ ID NO: 55-63 и 64-95, или их аллельные или видовые варианты. В другом примере полипептиды PH20 представляют собой варианты, не менее чем на 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93,94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные любой из последовательностей SEQ ID NO: 55-63 и 64-95 и сохраняющие не менее 30% гиалуронидазной активности соответствующей немодифицированной формы или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид из аминокислот 36-482 из SEQ ID NO: 107. Такие полипептиды PH20 обладают промежуточной активностью. Предусмотренные в данном изобретении полипептиды PH20 могут быть N-гликозилированы или частично N-гликозилированы. В некоторых примерах частично N-гликозилированные полипептидыesPH20 содержат по меньшей мере один остаток N-ацетилглюкозамина, связанный по меньшей мере с каждым из двух N-замещенных остатков, таких как, например, аминокислотные остатки 368 и 393 изSEQ ID NO: 107, или соответствующие аминокислотным остаткам 368 и 393 из SEQ ID NO: 107 остатки. В некоторых аспектах частично N-гликозилированный полипептид esPH20 содержит не менее двух остатков N-ацетилглюкозамина, связанных по меньшей мере с каждым из двух N-замещенных остатков. Частично N-гликозилированные полипептиды PH20 по настоящему документу также могут содержать разветвленные сахара. В некоторых аспектах полипептиды PH20 по настоящему документу являются растворимыми и могут представлять собой полипептиды PH20 человека, шимпанзе, макаки, обезьяны циномолгус, мыши, кролика, морской свинки, коровы или овцы. Полипептиды esPH20 и PH20 по настоящему изобретению могут быть модифицированы, например,путем сиалирования, альбуминирования, фарнезилирования, карбоксилирования, гидроксилирования или фосфорилирования. В некоторых аспектах полипептиды esPH20 и PH20 модифицированы присоединением полимеров, таких как декстран или ПЭГ. В настоящем документе также предусмотрены конъюгаты, содержащие полипептиды esPH20 или PH20. Примеры конъюгатов включают молекулы, в которыхesPH20 или PH20 конъюгированы с доменом для мультимеризации (например, доменом Fc), токсином,меткой для обнаружения или лекарством. Также данное изобретение включает нуклеиновые кислоты, кодирующие описанные выше и предусмотренные в данном изобретении полипептиды esPH20 и PH20. Указанные нуклеиновые кислоты включают нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептиды esPH20 или PH20 с последовательностями, соответствующими аминокислотам 36-450, 36-451, 36-452, 36-453, 36-454, 36-455, 36-456, 36-457,36-458, 36-459, 36-460, 36-461, 36-462, 36-463, 36-464, 36-465, 36-484, 36-485, 36-486, 36-487, 36-489,36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496 или 36-497 из SEQ ID NO: 107, и нуклеиновые кислоты,которые кодируют esPH20 с последовательностями, соответствующими аминокислотам 36-491, 36-492,36-493, 36-494, 36-495, 36-496, 36-497 или 36-498 из SEQ ID NO: 197. Также в данном изобретении предусмотрены векторы, которые содержат эти нуклеиновые кислоты, и клетки, которые содержат указанные векторы, такие как клетки CHO. Изобретение включает композиции, содержащие один или несколько описанных здесь полипептидов esPH20 или PH20. В некоторых примерах композиции содержат несколько полипептидов esPH20 илиPH20. Например, композиции могут содержать несколько полипептидов esPH20, которые кодируются молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими последовательности, соответствующие аминокислотам 36-450, 36-451, 36-452, 36-453, 36-454, 36-455, 36-456, 36-457, 36-458, 36-459, 36-460, 36-461, 36-462,36-463, 36-464, 36-465, 36-484, 36-485, 36-486, 36-487, 36-489, 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495,36-496 или 36-497 из SEQ ID NO: 107, и которые кодируются молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими esPH20 с последовательностью, соответствующей аминокислотам 36-491, 36-492, 36-493,36-494, 36-495, 36-496, 36-497 или 36-498 из SEQ ID NO: 197. В некоторых примерах композиции содержат полипептиды esPH20 или PH20, которые выделяют из клеток CHO. Предусмотренные в данном изобретении композиции могут представлять собой фармацевтические композиции. В некоторых примерах композиции содержат дополнительный терапевтический агент, который может быть включен в ту же композицию либо может быть включен в отдельную композицию. Примеры терапевтических агентов, которые могут быть включены в предусмотренные здесь композиции, включают химиотерапевтические агенты, анальгетики, противовоспалительные средства, противомикробные агенты, противоамебные агенты, противотрихомонадные агенты, агенты для лечения болезни Паркинсона, противомалярийные агенты, противосудорожные агенты, антидепрессанты, противоартритные агенты, противогрибковые агенты, антигипертензивные агенты, жаропонижающие агенты, противопаразитные агенты, антигистаминные агенты, агонисты альфа-адренорецепторов, альфа-блокаторы, анестетики, расширяющие бронхи агенты, биоцидные агенты, бактерицидные агенты, бактериостатические-2 022752 агенты, бета-адренергические блокаторы, блокаторы кальциевых каналов, сердечно-сосудистые агенты,противозачаточные агенты, противоотечные агенты, мочегонные агенты, депрессанты, диагностические агенты, электролиты, снотворные агенты, гормоны, средства против гипергликемии, миорелаксанты,агенты, вызывающие сокращение мышц, офтальмологические агенты, парасимпатомиметические агенты,антидепрессанты, седативные средства, симпатомиметики, транквилизаторы, агенты для лечения заболеваний, связанных с мочевой системой, агенты для лечения вагинальных заболеваний, противовирусные препараты, витамины, нестероидные противовоспалительные средства, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, полипептиды, белки, нуклеиновые кислоты, лекарства, органические молекулы и индукторы сна. В конкретном примере терапевтический агент представляет собой антитело, иммуноглобулин, бисфосфонат (такой как золентроновая кислота), цитокин, химиотерапевтическое средство или инсулин (например, быстродействующий инсулин). Другие терапевтические агенты, которые могут быть включены в предусмотренные в данном изобретении композиции, включают, но не ограничиваются, ацивицин; акларубицин; акодазол; акронин; адозелезин; алдеслейкин; алемтузумаб; алитретиноин (9-цис-ретиноевая кислота); аллопуринол; алтретамин; алвоцидиб; амбазон; амбомицин; аметантрон; амифостин; аминоглутетимид; амсакрин; анастрозол; анаксирон; анситабин; антрамицин; апазиквон; аргимесна; триоксид мышьяка; аспарагиназу; асперлин; атримустин; азацитидин; азетепа; азотомицин; баноксантрон; батабулин; батимастат; вакцину БЦЖ; бенаксибин; бендамустин; бензодепа; бексаротен; бевацизумаб; бикалутамид; биетасерпин; бирикодар; бизантрен; димезилат биснафид; бизелезин; блеомицин; бортезомиб; бреквинар; бропиримин; будотитан; бусульфан; кактиномицин; калустерон; канертиниб; капецитабин; карацемид; карбетимер; карбоплатин; карбоквон; кармофур; кармустин с полифепрозаном; кармустин; карубицин; карзелезин; седефингол; селекоксиб; семадотин; хлорамбуцил; циотеронел; циролемицин; цисплатин; кладрибин; кланфенур; клофарабин; криснатол; циклофосфамид; липосомальный цитарабин; цитарабин; дакарбазин; дактиномицин; дарбепоэтин альфа; липосомальный даунорубицин; даунорубицин/дауномицин; даунорубицин; децитабин; денилейкин дифтитокс; декснигулдипин; дексоннаплатин; дексразоксан; дезагуанин; диазиквон; диброспидиум; диеногест; диналин; дизермолид; доцетаксел; дофеквидар; доксифлуридин; липосомальный доксорубицин; доксорубицин-HCl; липосомальный докорубицин-HCl для инъекций; доксорубицинаы; дролоксифен; пропионат дромостанолона; дуазомицин; экомустин; эдатрексат; эдотекарин; эфлорнитин; элакридар; элинафид; раствор Эллиотта В; элсамитрусин; эмитефур; энлоплатин; энпромат; энзастаурин; эпипропидин; эпирубицин; эпоэтин альфа; эпталопрост; эрбулозол; эзорубицин; эстрамустин; этанидазол; этоглуцид; этопозид фосфат; этопозид VP-16; этопозиды; этоприн; эксеместан; эксизулинд; фадрозол; фазарабин; фенретинид; филграстим; флоксуридин; флударабин; фторурацил; 5-фторурацил; флуоксиместерон; флуроцитабин; фосхидон; фостриецин; фотретамин; фулвестрант; галарубицин; галоцитабин; гемцитабин; гемтузумаб/озогамицин; герохинол; гиматекан; гимерацил; глоксазон; глуфосфамид; гозерелин ацетат; гидроксимочевинуй; ибритумомаб/тиукситан; идарубицин; ифосфамид; илмофозин; иломастат; иматиниб мезилат; имексон; импросульфан; индизулам; инпроквон; интерферон альфа-2 а; интерферон альфа-2b; интерферон альфа, интерферон бета, интерферон гамма, интерферонами, интерлейкин-2 и другие интерлейкины (в том числе рекомбинантные интерлейкины); интоплицин; иобенгуан [131-1]; ипроплатин; иринотекан; ирсогладин; иксабепилон; кетотрексат;[2-Н]; зиностатин; золедронат; зорубицин и зосухидар. В настоящем документе предусмотрен способ лечения заболеваний, связанных с гиалуроновой кислотой, или состояний, при которых субъекту вводят предусмотренные и описанные здесь esPH20 илиPH20 или предусмотренные и описанные здесь композиции, содержащие esPH20 или PH20. Также предусмотрен способ лечения превышенного уровня гликозаминогликанов, способ лечения опухолей, лечения накопления гликозаминогликанов в головном мозге, лечения сердечно-сосудистых расстройств, лечения офтальмологических расстройств, лечения легочных заболеваний, способ усиления проницаемости плотных опухолей для химиотерапевтических агентов; способ лечения целлюлита или способ увеличения биодоступности лекарственных препаратов и других терапевтических средств. Описанные способы включают введение субъекту любых описанных здесь полипептидов esPH20 или PH20 или композиций. Предусмотренные в данном изобретении полипептиды esPH20 и PH20 могут быть использованы вместо гиалуронидазы PH20, отдельно или в комбинации, в любых методах лечения или в комбинированной терапии, для которых гиалуронидазу PH20 используют в опубликованных заявках СШАUS20040268425, US20050260186 и US20060104968 и заявках США 12/381844, 12/386249, 12/387225 и 12/386222. Краткое описание фигур На фиг. 1 представлены выровненные аминокислотные последовательности полипептидов PH20 человека (SEQ ID NO: 107) и шимпанзе (SEQ ID NO: 197) (выровнены с помощью программы выравнивания ClustalW2). Аминокислотные остатки сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря человеческого PH20, а также соответствующие аминокислоты в последовательности PH20 шимпанзе выделены жирным шрифтом и подчеркиванием. Символ указывает, что расположенные выше остатки одинаковы для обеих выровненных последовательностей. Символ ":" указывает консервативные замены и символ . указывает полуконсервативные замены. На фиг. 2 приведены основные типы N-гликанов у позвоночных, в том числе богатые маннозой гликаны, гибридные гликаные и сложные гликаны. На фиг. 3 показаны сайты расщепления эндогликозидазой. На фиг. 3 А показаны сайты расщепления для эндогликозидазы F1 и пептид N-гликозидазы F(ПНГазы F). На фиг. 3 В приведены сайты расщепления для эндогликозидазы F2 и ПНГазы F. На фиг. 3 С приведены сайты расщепления для эндогликозидазы F3 и ПНГазы F. На фиг. 3D приведены сайты расщепления для эндогликозидазы F4 и ПНГазы F. Подробное раскрытие изобретения Обзор.C. Длинные растворимые полипептиды PH20. 1. Человеческие полипептиды esPH20. 2. Полипептиды esPH20 других видов.D. Частично гликозилированные полипептиды PH20. 1. Полипептиды PH20. 2. Укороченные с С-конца полипептиды PH20. 3. Дополнительные модификации.E. Методы получения нуклеиновых кислот, кодирующих длинные растворимые гиалуронидазыF. Подготовка, получение композиций и введение длинных растворимых полипептидов PH20 и других растворимых полипептидов PH20 1. Растворы и эмульсии для инъекций. Лиофилизированные порошки. 2. Местное введение. 3. Композиции для других способов введения. 4. Способы введения и дозы. 5. Упаковка, изделия и наборы.H. Способы лечения и применения длинных растворимых PH20 и других растворимых PH20 и комбинированная терапия. 1. Применение в качестве агента для распространения и для комбинированной терапии. 2. Применение для удаления избытка гликозаминогликанов. а) Применение в лечении рака.b) Применение в лечении накопления гликозаминогликанов в мозге.c) Применение в лечении накопления гликозаминогликанов при сердечно-сосудистых заболеваниях.d) Применение в витрэктомии и при офтальмологических нарушениях и состояниях.h) Применение при трансплантации органов.i) Применение при заболеваниях легких. 3. Другие области применения.I. Примеры. А. Определения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, как это обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится изобретение. Все патенты, патентные заявки, опубликованные заявки и публикации, последовательности Genbank,базы данных, веб-сайты и другие печатные материалы, упомянутые на протяжении всего приведенного здесь раскрытия, если не указано иное, включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. В случае если существует множество определений упомянутого в данном изобретении термина,преимущественную силу имеет определение, приведенное в этом разделе. Если в данном изобретении приведена ссылка на URL или другой такой идентификатор или адрес, то подразумевается, что такой идентификатор может измениться и конкретная информация в сети Интернет может появиться и исчезнуть, однако эквивалентную информацию можно найти с помощью функции поиска в Интернете. Такая ссылка свидетельствует о наличии и публичном распространении такой информации. В настоящем документе гиалуронидазы относятся к классу ферментов, которые разрушают гиалуроновую кислоту. Гиалуронидазы включают, но не ограничиваются, бактериальные гиалуронидазы(ЕС 4.2.2.1 или ЕС 4.2.99.1), гиалуронидазы пиявок, других паразитов и ракообразных (ЕС 3.2.1.36) и гиалуронидазы млекопитающих (ЕС 3.2.1.35). Гиалуронидазы включают любые гиалуронидазы не человеческого происхождения, включая, но не ограничиваясь, мышиные, собачьи, кошачьи, заячьи, птичьи,бычьи, овечьи, свиные, лошадиные, рыбьи, лягушачьи, бактериальные гиалуронидазы и гиалуронидазы пиявок, других паразитов и ракообразных. Примеры человеческих гиалуронидаз включают HYAL1,HYAL2, HYAL3, HYAL4 и PH20 (SEQ ID NO: 107). Также гиалуронидазы включают растворимые гиалуронидазы, включая баранью и бычью PH20, растворимую человеческую PH20 и rHuPH20. Примеры коммерчески доступных бычьих или овечьих растворимых гиалуронидаз включают гиалуронидазу-5 022752 В настоящем документе PH20 относится к типу гиалуронидазы, который встречается в сперме и активен в нейтральной среде. PH20 локализована на поверхности сперматозоидов, в акросоме лизосомного происхождения, где она связана с внутренней акросомной мембраной. PH20 включают гиалуронидазы любого происхождения, включая, но не ограничиваясь, человеческую гиалуронидазу, гиалуронидазу шимпанзе, обезьяны циномолгус, обезьяны резус, мышиную, бычью, баранью гиалуронидазу, гиалуронидазу морской свинки, кроличью и крысиную гиалуронидазу. Примеры полипептидов PH20 включают гиалуронидазы человека (SEQ ID NO: 107), шимпанзе (SEQ ID NO: 197), обезьяны резусPH20 и зрелые полипептиды PH20 (например, полипептиды, в которых удалена сигнальная последовательность), их усеченные формы, обладающие активностью, включает аллельные варианты и видовые варианты, варианты сплайсинга и другие варианты, включая полипептиды с 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80,85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с полипептидомпредшественником, приведенным в SEQ ID NO: 107 и 109, или их зрелые формы. PH20 также включают полипептиды, содержащие химические или посттрансляционные модификации, а также полипептиды без химических или посттрансляционных модификаций. Такие модификации включают, но не ограничиваются, пегилирование, альбуминирование, гликозилирование, фарнезилирование, карбоксилирование,гидроксилирование, фосфорилирование, а также другие модификации полипептидов, известные в уровне техники. Усеченные гиалуронидазы PH20 относятся к любой усеченной с С-конца форме гиалуронидазы,в частности к усеченной и активной в нейтральной среде при наличии N-гликозилирования гиалуронидазе. В настоящем документе растворимая PH20 относится к любой форме PH20, которая является растворимой в физиологических условиях. Растворимая PH20 может быть идентифицирована, например, по распределению в водную фазу раствора Тритон Х-114 при температуре 37 С (Bordier et al. (1981), J.Biol. Chem., 256:1604-7). Заякоренная в мембране PH20, такая как заякоренная липидом PH20, включаяGPI-заякоренную PH20, переходит в обогащенную детергентом фазу, но переходит в обедненную детергентом или водную фазу после обработки фосфолипазой-С. Растворимые PH20 включают заякоренные в мембране PH20, в которых один или несколько районов, связанных с заякореванием PH20 в мембране,удален или изменен, где растворимая форма сохраняет гиалуронидазную активность. Растворимые PH20 также включают рекомбинантные растворимые PH20 и полипептиды, содержащиеся в природных источниках или очищенные из природных источников, таких как, например, экстракт из овечьих или коровьих яичек. Примером таких растворимых PH20 является растворимая человеческая PH20. В настоящем документе растворимая человеческая PH20 или sHuPH20 включает полипептидыPH20, в которых отсутствует вся сигнальная последовательность присоединения гликозилфосфатидилинозитольного (GPI) якоря на С-конце или ее часть, так что после экспрессии полипептиды являются растворимыми в физиологических условиях. Растворимость можно оценить с помощью любого подходящего метода, который демонстрирует растворимость в физиологических условиях. Примером такого метода является описанный выше и в примерах анализ с Тритон Х-114, при котором оценивают распределение полипептида между водной и неполярной фазами. Кроме того, растворимый человеческий полипептидPH20 при получении в клетках CHO, например клетках CHO-S, экспрессируется и секретируется в культуральную среду. Растворимые человеческие полипептиды PH20, однако, не ограничиваются получаемым в клетках CHO полипептидом, полипептид может быть получен в любом типе клеток или любым другим способом, включая рекомбинантную экспрессию и синтез полипептида. Указание на секрецию в клетках CHO является дефинициональным. То есть, если полипептид может быть экспрессирован и секретирован в клетках CHO и является растворимым, т.е. полипептид переходит в водную фазу при экстракции Тритоном Х-114, он представляет собой растворимый полипептид PH20 в не зависимости о того, как он получен. Полипептиды-предшественники полипептидов sHuPH20 могут включать сигнальную последовательность, такую как гетерологичную или не гетерологичную (т.е. нативную) сигнальную последовательность. Примерами предшественников являются полипептиды, которые включают сигнальную последовательность, такую как нативную сигнальную последовательность из 35 аминокислот, соответствующую положениям 1-35 (см., например, аминокислоты 1-35 из SEQ ID NO: 107). В настоящем документе "длинная растворимая PH20" или "esPH20" включает растворимый полипептид PH20, который включает остатки до сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря и один или несколько последовательно расположенных остатков из сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря, если при этом esPH20 является растворимым при физиологических условиях. Растворимость в физиологических условиях может быть определена любым способом, известным специалистам в данной области. Например, она может быть оценена с помощью анализа с Тритоном Х 114, описанного выше и в примерах. Кроме того, как уже говорилось выше, растворимая PH20 при получении в клетках CHO, например клетках CHO-S, представляет собой полипептид, который экспрессируется и секретируется в культуральную среду. Растворимые человеческие полипептиды PH20, однако, не-6 022752 ограничиваются получаемыми в клетках CHO полипептидами, но могут быть получены в любом типе клеток или любым способом, в том числе рекомбинантной экспрессией и полипептидным синтезом. Указание на секрецию в клетках CHO является дефинициональным. То есть, если полипептид может быть экспрессирован и секретирован в клетках CHO и является растворимым, т.е. полипептид переходит в водную фазу при экстракции Тритоном Х-114, он представляет собой растворимый полипептид PH20 вне зависимости от того, как он получен. Растворимые человеческие полипептиды esPH20 включают,помимо остатков 36-490, одну или несколько последовательно расположенных аминокислот, начиная с позиции 491 из SEQ ID NO: 107, при условии, что полипептид является растворимым. Примеры человеческих растворимых полипептидов esPH20 включают полипептиды с аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотам 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496 и 36-497 изSEQ ID NO: 107. Примеры также включают полипептиды с аминокислотной последовательностью, приведенной в любой из SEQ ID NO: 60-63 и 102-104. Кроме того, примеры включают аллельные варианты и другие варианты с 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% и большей идентичностью последовательности с соответствующими полипептидами из SEQ ID NO: 60-63 и 102-104 при условии сохранения ими активности в нейтральной среде и растворимости. Указание идентичности последовательности относится к вариантам с аминокислотными заменами. В настоящем документе esPH20 включает предшественников полипептидов esPH20 и зрелые полипептиды esPH20 (в которых удалена сигнальная последовательность), их усеченные формы, которые сохраняют ферментативную активность (сохраняют по меньшей мере 1, 10, 20, 30, 40, 50% или более от активности полноразмерной формы) и которые являются растворимыми, и включает аллельные и видовые варианты, варианты сплайсинга и другие варианты, в том числе полипептиды по меньшей мере с 40,45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности по сравнению с полипептидом-предшественником, приведенным в SEQ ID NO: 107 и 109, или его зрелой формой. В настоящем документе esPH20 также относится к полипептидам с химическими или посттрансляционными модификациями и полипептидам без химических или посттрансляционных модификаций. Такие модификации включают, но не ограничиваются, пегилирование, альбуминирование, гликозилирование, фарнезилирование, карбоксилирование, гидроксилирование, фосфорилирование, а также другие модификации полипептидов, известные в уровне техники. В настоящем документе растворимая рекомбинантная человеческая PH20 (rHuPH20) относится к растворимой форме человеческой PH20, экспрессированной рекомбинантно и секретированной в клетках яичников китайского хомячка (CHO). Растворимая rHuPH20 кодируется включающей сигнальную последовательность нуклеиновой кислотой, которая приведена в SEQ ID NO: 109. Также предусмотрены молекулы ДНК, представляющие собой ее аллельные варианты, и другие растворимые варианты. Кодирующие растворимую rHuPH20 нуклеиновые кислоты экспрессируют в клетках CHO, которые секретируют зрелый полипептид. При получении в культуре наблюдается гетерогенность белка на С-конце, так что продукт представляет собой смесь полипептидов, включающих один или более из полипептидовSEQ ID NO: 122 - SEQ ID NO: 127 в различном количественном соотношении. Аналогично, для других форм PH20, таких как esPH20, рекомбинантно экспрессированные полипептиды и композиции могут включать множество видов полипептидов с гетерогенностью на С-конце. Например, композиции с рекомбинантно экспрессированной esPH20, полученной экспрессией полипептида SEQ ID NO: 8, который кодирует esPH20, включающей аминокислоты 36-497, могут включать формы с меньшим количеством аминокислот, например 36-496, 36-495. В настоящем документе N-замещенный остаток относится к аминокислотному остатку аспарагина(N) в полипептиде, который может быть посттрансляционно модифицирован гликозилированием. Примеры N-замещенных остатков в PH20 человека включают аминокислоты N82, N166, N235, N254, N368 иN393 человеческого полипептида PH20, приведенного в SEQ ID NO: 107. В настоящем документе N-гликозилированный полипептид относится к полипептиду PH20 или его усеченной форме, содержащим по меньшей мере три олигосахарида, присоединенных к N-замещенным остаткам аминокислот, например N-замещенным остаткам, соответствующим остаткам N235, N368 иN393 из последовательности SEQ ID NO: 107. N-гликозилированный полипептид включает полипептид,в котором к трем, четырем, пяти или всем N-замещенным остаткам присоединены олигосахариды.N-связанные олигосахариды могут включать олигоманнозы, сложные, гибридные или сульфатированные олигосахариды или другие олигосахариды и моносахариды. В настоящем документе N-гликозилированный полипептид относится к полипептиду, который содержит, по меньшей мере, N-ацетилглюкозаминовый гликан, присоединенный по меньшей мере к тремN-замещеннымм остаткам. Частично гликозилированный полипептид может включать различные формы гликанов, в том числе моносахариды, олигосахариды и разветвленные сахара, в том числе образовавшиеся при обработке полипептида EndoH, EndoF1, EndoF2 и/или EndoF3. Расщепление гликанов указанными ферментами представлено, например, на фиг. 2. В настоящем документе дегликозилированный полипептид PH20 относится к предусмотренному в данном изобретении полипептиду PH20, в котором гликозилированы не все возможные сайты гликози-7 022752 лирования. Дегликозилирование может быть осуществлено, например, удалением сахаров, путем предупреждения гликозилирования или изменением полипептидной цепи для устранения сайтов гликозилирования. Как описано в данном изобретении, некоторые сайты N-гликозилирования не нужны для проявления активности, в то время как другие необходимы. В настоящем документе связанные с гиалуроновой кислотой заболевания, расстройства или состояния относятся к любому заболеванию или состоянию, при котором в качестве причины, последствия или иного фактора наблюдается повышение уровня гиалуроновой кислоты. Связанные с гиалуроновой кислотой заболевания и состояния сопровождаются повышенной экспрессией гиалуроновой кислоты в тканях или клетках, увеличением давления интерстициальной жидкости, снижением сосудистого объема и/или повышением содержания воды в тканях. Связанные с гиалуроновой кислотой заболевания, нарушения или состояния можно лечить введением композиции, содержащей расщепляющий гиалуронан фермент, такой как гиалуронидазу, например растворимую гиалуронидазу, причем лечение можно проводить указанной композицией отдельно либо в сочетании или в дополнение к другому виду лечения и/или агенту. Примеры заболеваний и состояний включают, но не ограничиваются, богатые гиалуронаном раки, например опухоли, в том числе плотные опухоли, такие как опухоли на поздней стадии рака,метастатические раки, недифференцированные раки, рак яичников, рак in situ (ISC), плоскоклеточный рак (SCC), рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак толстой кишки и другие виды рака. Также примерами связанных с гиалуроновой кислотой заболеваний или состояний являются заболевания, связанные с повышенным давлением интерстициальной жидкости, такие как связанные с внутридисковым давлением заболевания, и отеки, например отек при пересадке органов, инсульте, травме мозга или другой травме. Примеры связанных с гиалуроновой кислотой заболеваний или состояний включают заболевания и состояния, связанные с повышением давления интерстициальной жидкости, снижением сосудистого объема и/или повышением содержания воды в тканях, включая рак, повышенное внутридисковое давление и отеки. В одном из примеров лечение связанного с гиалуроновой кислотой заболевания, состояния или нарушения приводит к улучшению, уменьшению или другому полезному эффекту по отношению к повышенному давлению интерстициальной жидкости (IFP), сниженному сосудистому объему и повышенному содержанию воды в тканях. В настоящем документе конъюгат относится к растворимым полипептидам PH20, связанным напрямую или не напрямую с одним или несколькими другими полипептидами или химическими фрагментами. Такие конъюгаты включают слитые белки, полученные химическим конъюгированием или с применением любого другого метода, где по меньшей мере один растворимый полипептид PH20 связан напрямую или не напрямую с другим полипептидом или химическим фрагментом, при этом конъюгат сохраняет гиалуронидазную активность. Примеры конъюгатов по настоящему изобретению включают полипептиды PH20, связанные напрямую или не напрямую с доменом мультимеризации, таким какFc-фрагмент, токсином, меткой или лекарством. В настоящем документе белок слияния относится к полипептиду, кодируемому нуклеиновой кислотой, содержащей кодирующую последовательность из одной молекулы нуклеиновой кислоты и кодирующую последовательность из другой молекулы нуклеиновой кислоты, в которой кодирующие последовательности находятся в одной рамке считывания, так что транскрипция и трансляция гибридной конструкции в клетке-хозяине приводят к белку, включающему два белка. Две молекулы могут непосредственно соседствовать в конструкции или могут быть разделены линкерным полипептидом, который содержит 1, 2, 3 или более аминокислот, но обычно менее чем 10, 9, 8, 7 или 6 аминокислот. Белковый продукт, кодируемый гибридной конструкцией, называют белком слияния. Примеры белков слияния включают слитые с Fc белки. В настоящем документе полимер, конъюгированный с разрушающим гиалуроновую кислоту ферментом, таким как гиалуронидаза, относится к любому полимеру, который ковалентно или иным образом стабильно связан, напрямую или через линкер, с разрушающим гиалуроновую кислоту ферментом. Такие полимеры, как правило, увеличивают период полураспада белка в сыворотке, и включают, но не ограничиваются полимерами из остатков сиаловой кислоты, фрагментами полиэтиленгликоля, декстраном, сахарами и другими фрагментами, например, присоединяемыми при гликозилировании. В настоящем документе активность относится к функциональной активности или активностям полипептида или его части, связанным с активностью полноразмерного (целого) белка. Функциональная активность включает, но не ограничивается, биологическую активность, каталитическую и ферментативную активность, антигенность (способность связывать или конкурировать с полипептидом за связывание с антителами против полипептида), иммуногенность, способность образовывать мультимеры и способность специфически связывать рецепторы или лиганды полипептида. В настоящем документе гиалуронидазная активность относится к способности ферментативно катализировать расщепление гиалуроновой кислоты. В тесте фармакопеи США (USP) XXII издания на гиалуронидазу гиалуронидазную активность определяют косвенно, измеряя оставшееся количество высокомолекулярной гиалуроновой кислоты или гиалуронана в качестве субстрата после проведения ферментативной реакции с ГК в течение 30 мин при 37 С (USP-NF XXII XVII (1990) 644-645, Конвенция о Фарма-8 022752 копее США, Роквилл, штат Мэриленд). Для определения относительной активности любой гиалуронидазы в единицах активности в анализе может быть использован стандартный раствор сравнения. Для определения гиалуронидазной активности гиалуронидаз, например PH20, в том числе растворимой PH20 иesPH20, известны в уровне техники и описаны здесь in vitro анализы. Примеры анализов включают анализ микромутности, описанный ниже (см., например, пример 12), при котором расщепление гиалуроновой кислоты гиалуронидазой измеряют косвенно по нерастворимому осадку, образующемуся при связывании нерасщепленной гиалуроновой кислоты с сывороточным альбумином. Для построения стандартной кривой для определения активности исследуемой гиалуронидазы в единицах активности могут быть использованы стандартные образцы. В настоящем документе активность в нейтральной среде относится к способности полипептидаPH20 ферментативно катализировать расщепление гиалуроновой кислоты при нейтральном рН. Активная в нейтральной среде укороченная с С-конца или частично N-гликозилированная PH20 по настоящему документу обладает приблизительно 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110,120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500, 1000% активности или большей активностью по сравнению с гиалуронидазной активностью соответствующей активной в нейтральной среде не укороченной с С-конца или не частично N-гликозилированной PH20. В настоящем документе сигнальная последовательность присоединения GPI-якоря является С-концевой аминокислотной последовательностью, которая направляет присоединение предварительно синтезированного GPI-якоря к полипептиду в просвете ЭР. Сигнальная последовательность присоединения GPI-якоря присутствует в предшественниках полипептидов с GPI-якорем, таких как полипептидыPH20 с GPI-якорем. С-концевая сигнальная последовательность присоединения GPI-якоря, как правило,содержит преимущественно гидрофобную область из 8-20 аминокислот, которой предшествует гидрофильный спейсер из 8-12 аминокислот, расположенный непосредственно после -сайта или сайта присоединения GPI-якоря. Сигнальная последовательность присоединения GPI-якоря может быть легко идентифицирована с помощью хорошо известных в уровне техники методов. Они включают, но не ограничиваются, in silico методы и алгоритмы (см., например Udenfriend et al. (1995), Methods Enzymol. 250:571-582, Eisenhaber et al. (1999), J. Biol. Chem. 292:741-758, Kronegg и Buloz, (1999), "Detection/prediction of GPI cleavage site (GPI-anchor) in a protein (DGPI)", например, веб-сайт 129.194.185.165/dgpi/, Fankhauser et al. (2005), Bioinformatics, 21:1846-1852, Omaetxebarria et al. (2007),Proteomics 7:1951-1960, Pierleoni et al. (2008), ВМС Bioinformatics, 9:392), а также протоколы, легко доступные на биоинформатических веб-сайтах, таких как веб-сайт ExPASy Proteomics tools (веб-сайт expasy.ch/tools/). В настоящем документе бифукозилированный полипептид относится к полипептиду, который включает два остатка фукозы, присоединенных к N-ацетилглюкозаминовому ядру, где один остаток присоединен -1,3-связью, а другой остаток присоединен -1,6-связью, a N-ацетилглюкозаминовый фрагмент связан с остатком аспарагина в полипептидной цепи. Бифукозилированные полипептиды обычно производятся в клетках насекомых. В настоящем документе нуклеиновые кислоты включают ДНК, РНК и их аналоги, в том числе пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК), и их смеси. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. При упоминании зондов или праймеров, необязательно меченных, например, обнаруживаемой меткой, например люминесцентной или радиоактивной меткой, предусмотрены одноцепочечные молекулы. Длина таких молекул, как правило, достаточна для того, чтобы их мишень при гибридизации или праймировании библиотеки была статистически уникальна или была представлена низким числом копий (обычно менее 5, как правило, менее 3). Обычно зонд или праймер содержит последовательность по меньшей мере из 14, 16 или 30 расположенных подряд нуклеотидов, комплементарную или идентичную последовательности представляющего интерес гена. Зонды и праймеры могут включать 10, 20, 30, 50,100 или более нуклеотидов в длину. В настоящем документе пептид относится к полипептиду, длина которого больше или равна 2 аминокислотам и меньше или равна 40 аминокислотам. В настоящем документе аминокислоты, встречающиеся в различных приведенных в данном изобретении последовательностях аминокислот, определяются в соответствии с их известными, трехбуквенными или однобуквенными обозначениями (табл. 1). Нуклеотиды, встречающиеся в различных фрагментах нуклеиновых кислот, обозначены стандартными однобуквенными обозначениями, рутинно употребляемыми в уровне техники. В настоящем документе термин "аминокислота" относится к органическому соединению, содержащему аминогруппу и карбоксильную группу. Полипептид содержит две или более аминокислоты. В настоящем изобретении аминокислоты включают 20 природных аминокислот, неприродные аминокислоты и аналоги аминокислот (например, аминокислоты с боковой цепью у -атома углерода). В настоящем документе термин "аминокислотный остаток" относится к аминокислоте, образующейся при химическом расщеплении (гидролизе) полипептида по пептидным связям. Аминокислотные остатки по настоящему документу находятся в "L" изомерной форме. Остатки в "D" изомерной форме,-9 022752 обозначенные таким образом, могут быть заменены на любой остаток L-аминокислоты, если при этом полипептид сохраняет желаемое свойство. NH2 относится к свободной аминогруппе, присутствующей на аминоконце полипептида. COOH относится к свободной карбоксильной группе, присутствующей на карбоксильном конце полипептида. Аббревиатуры для обозначения аминокислотных остатков, соответствующие стандартной полипептидной номенклатуре, описанной в J. Biol. Chem, 243. 3557-3559 (1968) и принятой 37 C.F.R.1.821-1.822, приведены в табл. 1. Таблица 1 Таблица соответствия Все последовательности аминокислотных остатков представлены в данном изобретении в виде формул при ориентации слева направо в обычном направлении от аминоконца к карбоксильному концу. Термин "аминокислотный остаток" включает аминокислоты, перечисленные в табл. 1, и модифицированные и необычные аминокислоты, такие как указанные в приведенных здесь в качестве ссылки 1.8211.822 37 C.F.R. аминокислоты. Кроме того, следует отметить, что тире в начале или в конце последовательности аминокислотных остатков обозначает пептидную связь с последовательностью из одного или более аминокислотных остатков, связь с аминоконцевой группой, такой как NH2, или карбоксильной концевой группой, такой как COOH. В настоящем документе термин "природные -аминокислоты" относится к остаткам 20-аминокислот, встречающихся в природе, которые включаются в белок посредством специфического распознавания кодона мРНК молекулой тРНК, несущей остаток аминокислоты. Не встречающиеся в природе аминокислоты включают, например, аминокислоты или аналоги аминокислот, отличающиеся от 20 природных аминокислот и включающие, но не ограничивающиеся, D-изостереомеры аминокислот. Примеры неприродных аминокислот описаны в данном изобретении и известны специалистам в данной области. В настоящем документе ДНК-конструкция представляет собой одноцепочечную или двухцепочечную, линейную или кольцевую молекулу ДНК, которая содержит фрагменты ДНК, комбинированные и соединенные в неприродном порядке. ДНК-конструкции существуют как результат человеческой манипуляции и включают клоны и другие копии искусственных молекул. В настоящем документе фрагмент ДНК представляет собой часть более крупной молекулы ДНК с определенными атрибутами. Например, фрагмент ДНК, кодирующий указанный полипептид, представляет собой часть большей молекулы ДНК, такой как плазмида или фрагмент плазмиды, который при чтении от 5' к 3' кодирует последо- 10022752 вательность аминокислот указанного полипептида. В настоящем документе термин "полинуклеотид" означает одноцепочечный или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидных оснований, читаемый от 5'- к 3'-концу. Полинуклеотиды включают РНК и ДНК и могут быть выделены из природных источников, синтезированы invitro или получены комбинацией натуральных и синтетических молекул. Длину полинуклеотидных молекул в данном изобретении приводят в нуклеотидах (сокращенно "нт") или парах оснований (сокращенно "по"). Определение длины в нуклеотидах применяют для одноцепочечных и двухцепочечных молекул, где позволяет контекст. Когда термин применяют к двухцепочечной молекуле, он употребляется для обозначения общей длины и эквивалентен термину пара оснований. Специалисту в данной области техники очевидно, что две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут незначительно отличаться по длине и что концы их могут быть расположены уступом, поэтому не все нуклеотиды в двухцепочечной молекуле полинуклеотида могут образовывать пары. Такие непарные концы, как правило, не превышают в длину 20 нуклеотидов. В настоящем документе "сходство" между двумя белками или нуклеиновыми кислотами относится к подобию аминокислотных последовательностей белков или нуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот. Сходство может быть определено по степени идентичности и/или гомологии последовательностей остатков и самих содержащихся в них остатков. Методы оценки степени сходства белков или нуклеиновых кислот хорошо известны специалистам в данной области. Например, в одном методе оценки сходства последовательностей две аминокислотные или нуклеотидные последовательности выравнивают таким образом, чтобы достичь максимального уровня идентичности между последовательностями. "Идентичность" относится к степени, в которой аминокислотные или нуклеотидные последовательности инвариантны. При выравнивании аминокислотных последовательностей, и в некоторой степени нуклеотидных последовательностей, также возможно учитывать консервативные различия и/или частые замены аминокислот (или нуклеотидов). Различия являются консервативными при сохранении физико-химических свойств участвующих остатков. Выравнивание может быть глобальным (выравнивание сравниваемых последовательностей по всей длине последовательностей, включая все остатки) или локальным (выравнивание частей последовательностей, которые включают только наиболее близкие район или районы)."Идентичность" имеет признанное в данной области значение и может быть рассчитана с применением опубликованных методов (см., например, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., OxfordSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., М Stockton Press, New York, 1991). Хотя существует множество методов определения идентичности между двумя полинуклеотидами или полипептидами, термин "идентичность" хорошо известен квалифицированному специалисту (Carillo, H., Lipton, D.,SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988. В настоящем документе термин гомологичный (по отношению к последовательностям нуклеиновых кислот и/или аминокислот) означает большую или равную приблизительно 25% гомологию последовательностей, как правило, большую или равную 25, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90 или 95% гомологию последовательностей; точный процент может быть указан, если это необходимо. В настоящем документе термины "гомология" и "идентичность" часто являются взаимозаменяемыми, если отдельно не указано иное. Как правило, для определения процента гомологии или идентичности последовательности выравнивают для достижения наибольшего совпадения остатков (см., например, Computational MolecularPress, New York, 1991; Carillo et al. (1988), SIAM J. Applied Math, 48:1073). Для определения гомологии последовательностей количество консервативных аминокислот определяют с помощью стандартных алгоритмов программ выравнивания, при этом могут быть использованы установленные по умолчанию штрафы за разрыв, предусмотренные поставщиком программного обеспечения. Существенно гомологичные молекулы нуклеиновых кислот гибридизуются, как правило, при умеренно жестких условиях или при высоко жестких условиях по всей длине интересующих нуклеиновых кислот. Также предусмотрены молекулы нуклеиновых кислот, которые включают вырожденные кодоны вместо кодонов в гибридизующихся молекулах нуклеиновых кислот."Идентичность" или "гомология" нуклеотидных последовательностей или аминокислотных последовательностей любых двух молекул по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% может быть определена с помощью известных компьютерных алгоритмов, таких как программа "FASTA", с использованием, например, параметров по умолчанию, как указано Pearson et al. (1988), Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85:2444 (другие программы включают пакет программ GCG (Devereux, J. et al., Nucleic Acids(1988), SIAM J. Applied Math, 48:1073). Например, для определения идентичности может быть использована функция BLAST базы данных Национального центра биотехнологической информации. Другие коммерчески или публично доступные программы включают программу "MegAlign" от DNAStar (Мэдисон, Висконсин) и программу "Gap", разработанную компьютерной группой генетики Университета Висконсин (UWG) (Мэдисон, Висконсин). Процент гомологии или идентичности белков и/или молекул нуклеиновых кислот можно определить, например, путем сравнения их последовательностей с применением компьютерной программы GAP (см., например, Needleman et al. (1970), J. Mol. Biol. 48:443, с изменениями от Smith и Waterman 1981), Adv. Appl. Math. 2:482). Программа GAP определяет сходство как отношение количества выровненных символов (например, нуклеотидов или аминокислот), которые являются идентичными, к общему числу символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать (1) унарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичных символов и 0 для не идентичных) и взвешенную матрицу сравнения Gribskovet al. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745, как описано Schwartz и Dayhoff в атласе белковых последовательностей и структур Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation,p. 353-358 (1979); (2) штраф в размере 3,0 для каждого разрыва и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом разрыве и (3) штраф не применяют для разрывов на концах. Таким образом, в данном изобретении термины "идентичность" или "гомология" относятся к сравнению исходного и исследуемого полипептида или полинуклеотида. В настоящем документе термин "по меньшей мере на 90% идентичны" относится к проценту идентичности от 90 до 99,99% по отношению к исходной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности полипептида. Принимая для иллюстративных целей длину сравниваемого и исходного полипептидов в 100 аминокислот идентичность на уровне 90% и более свидетельствует о том, что не более 10% аминокислот(т.е. 10 из 100 аминокислот) в исследуемом полипептиде отличается от исходного полипептида. Подобное сравнение можно провести между исследуемым и исходным полинуклеотидами. Такие различия могут быть представлены в виде точечных мутаций, случайным образом распределенных по всей длине полипептидной цепи, или они могут быть сосредоточены в одном или нескольких районах цепи различной длины вплоть до максимально допустимой, например 10/100 отличающихся аминокислот (приблизительно 90% идентичности). Отличия определяются как замены, вставки или делеции нуклеотидов или аминокислот. При уровне гомологии или идентичности выше приблизительно 85-90% результат не должен зависеть от выбранной программы и параметров штрафов за разрыв; такие высокие уровни идентичности могут быть легко оценены, часто с помощью ручного выравнивания без помощи программного обеспечения. В настоящем документе выравнивание последовательностей относится к использованию гомологии(сходства и/или идентичности) для выравнивания соответствующих позиций в нуклеотидной или аминокислотной последовательности. Как правило, две или более последовательности, которые связаны 50% и большей идентичностью, выравниваются. Набор выровненных последовательностей относится к 2 или большему количеству последовательностей, которые выровнены в соответствующих позициях, и может включать последовательности, полученные на основе РНК, такие как EST и другие кДНК, выровненные с последовательностью геномной ДНК. В настоящем документе "праймер" относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые в соответствующих условиях (например, в присутствии четырех различных нуклеозидтрифосфатов и полимеризующего агента, такого как ДНК-полимераза, РНК-полимераза или обратная транскриптаза) в соответствующем буфере и при подходящей температуре могут выступать в качестве точки начала направляемого матрицей синтеза ДНК. Следует иметь в виду, что определенные молекулы нуклеиновых кислот могут служить в качестве "зонда" и в качестве "праймера". Праймеры, однако, имеют на конце 3' гидроксильную группу для удлинения. Праймеры могут быть использованы для осуществления разнообразных методов, включая, например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), ПЦР с обратной транскрипцией(RT)-ПЦР, ПЦР на РНК, ЛЦР, мультиплексную ПЦР, супрессионную ПЦР, ПЦР с захватом, ПЦР с экспрессией, 3' и 5' RACE (быстрая амплификация концов кДНК), in situ ПЦР, ПЦР с лигированием и другие протоколы амплификации. Используемый в данном изобретении термин "пары праймеров" относится к набору праймеров, который включает 5'-праймер (вышерасположенный), который гибридизуется с 5'-концом амплифицируемой (например, методом ПЦР) последовательности, и 3' праймер (нижерасположенный), который гибридизуется с 3'-концом амплифицируемой последовательности. В настоящем документе термин "специфически гибридизуется" относится к отжигу оснований молекулы нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотида) с целевой молекулой нуклеиновой кислоты через комплементарное спаривание. Специалистам в данной области известны in vitro и in vivo параметры, которые влияют на специфическую гибридизацию, такие как длина и состав конкретной молекулы. Особенно важные для in vitro гибридизации параметры дополнительно включают температуру отжига и отмывания, состав буфера и концентрацию соли. Примеры условий отмывания для удаления неспецифически связанных молекул нуклеиновых кислот включают 0,1 SSPE, 0,1% SDS и 65 С при высокой же- 12022752 сткости и 0,2 SSPE, 0,1% SDS и 50 С при умеренной жесткости. Эквивалентные условия известны в уровне техники. Специалист в данной области для достижения специфической гибридизации молекул нуклеиновой кислоты с целевыми молекулами нуклеиновой кислоты может легко изменить условия для конкретной задачи. При упоминании двух молекул нуклеиновых кислот комплементарность означает,что две нуклеотидные последовательности способны гибридизоваться, как правило, при наличии 25, 15 или 5% не совпадающих нуклеотидов. При необходимости может быть точно указан процент комплементарности. Как правило, две молекулы выбирают таким образом, что они гибридизуются при жестких условиях. В настоящем документе термин "в значительной степени идентичный" по отношению к продукту означает достаточно близкий продукт, в котором интересующее свойство является в значительной степени неизменным, поэтому в значительной степени идентичный продукт может быть использован вместо исходного продукта. В настоящем документе термины "в значительной степени идентичные" или "сходные" варьируются в зависимости от контекста, как это понимает специалист в данной области техники. В настоящем документе "аллельный вариант" или "аллельные различия" относятся к любой из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один хромосомный локус. Аллельные различия естественно возникают в результате мутаций и могут привести к фенотипическому полиморфизму в популяциях. Генные мутации могут быть молчащими (без изменений в закодированном полипептиде) или могут приводить к полипептидам с измененной аминокислотной последовательностью. Термин "аллельный вариант" также используется здесь для обозначения белка, кодируемого аллельными вариантами гена. Обычно образцовая форма гена кодирует полипептид дикого типа и/или преобладающую форму полипептида в популяции или у одного представителя вида. Как правило, аллельные варианты, которые включают варианты между видами и внутри видов, обладают по меньшей мере 80, 90% или большей идентичностью аминокислотной последовательности с формой дикого типа и/или преобладающей формой у того же вида, причем степень идентичности зависит от гена и от того, является сравнение межвидовым или внутривидовым. Как правило, внутривидовые аллельные варианты обладают по меньшей мере приблизительно 80, 85, 90, 95% или большей идентичностью с формой дикого типа и/или преобладающей формой, в том числе 96, 97, 98%, 99% или большей идентичностью с формой дикого типа и/или преобладающей формой полипептида. Упоминание аллельного варианта в данном изобретении обычно относится к различиям в белках между представителями одного и того же вида. Используемый здесь термин "аллель" является взаимозаменяемым с термином "аллельный вариант" и относится к альтернативным формам генов или их частей. Аллели занимают одинаковый локус или позицию в гомологичных хромосомах. Когда субъект имеет два одинаковых аллеля гена, субъект называется гомозиготным субъектом по этому гену или аллелю. Когда субъект имеет два различных аллеля гена, субъект называется гетерозиготным по гену. Аллели конкретного гена могут отличаться друг от друга одним нуклеотидом или несколькими нуклеотидами и могут включать изменения, такие как замены, делеции и вставки нуклеотидов. Аллель гена также может быть одной изформ гена, содержащего мутацию. В настоящем документе "видовой вариант" относятся к вариантам полипептида среди различных видов, включая различные виды млекопитающих, такие как мышь и человек. Примеры видовых вариантов, предусмотренных в данном изобретении, включают PH20 приматов, включая, но не ограничиваясь,человека, шимпанзе, макак и обезьян циномолгус. Как правило, видовые варианты обладают 70, 75, 80,85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98% идентичностью последовательности. Соответствующие остатки у межвидовых вариантов и среди видовых вариантов могут быть определены путем сравнения и выравнивания последовательностей для достижения максимального числа соответствующих нуклеотидов или остатков, например, при идентичности между последовательностями 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более или 99% или более. Интересующему положению затем присваивают номер по сравниваемой молекуле нуклеиновой кислоты. Выравнивание может осуществляться вручную, особенно при уровне идентичности последовательностей, превышающем 80%. Например, представленное на фиг. 1 выравнивание показывает, что аминокислотный остаток 491 человеческой PH20 соответствует аминокислотному остатку 491 PH20 шимпанзе и аминокислотный остаток 497 человеческой PH20 соответствует аминокислотному остатку 498 PH20 шимпанзе. В настоящем документе "вариант сплайсинга" относится к варианту, образованному в результате различного процессинга первичного транскрипта геномной ДНК, что приводит более чем к одному типу мРНК. Используемый здесь термин "промотор" означает часть гена, содержащую последовательность ДНК, которая обеспечивает связывание РНК-полимеразы и инициацию транскрипции. Промоторная последовательность обычно, но не всегда, находится в 5'-некодирующей области гена. В настоящем документе "выделенный" или "очищенный" полипептид или белок или его биологически активная часть практически не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков из клеток или тканей, из которых происходит белок, или является в значительной степени свободным от химических веществ-предшественников и других химических веществ при его химическом синтезе.- 13022752 Препараты могут быть определены как существенно чистые, если они являются свободными от легко обнаруживаемых примесей, определяемых с помощью стандартных способов анализа, таких как тонкослойная хроматография (ТСХ), гель-электрофорез и высокоэффективная жидкостная хроматография(ВЭЖХ), используемых специалистами в области техники для оценки чистоты, или препараты могут быть определены как достаточно чистые, если дальнейшая очистка не изменяет физические и химические свойства вещества, такие как энзиматическая и биологическая активность. Способы очистки соединений для получения существенно химически чистых соединений известны специалистам в данной области. Существенно химически чистые соединения, однако, могут представлять собой смесь стереоизомеров. В таких случаях дополнительная очистка может увеличить удельную активность соединения. Таким образом, упоминание существенно очищенного полипептида, например существенно очищенного длинного растворимого PH20, относится к препаратам белка PH20, которые практически не содержат клеточного материала и включают препараты белков, в которых белок отделен от компонентов клеток, из которых был выделен, или в которых получен рекомбинантно. В одном варианте термин"практически не содержащий клеточного материала" относится к препаратам белков-ферментов, содержащим менее чем приблизительно 30% (по сухому весу) белков неферментов (также называемых в данном изобретении загрязняющими белками), как правило, содержащим менее 20% белков неферментов,10% белков неферментов или менее чем приблизительно 5% белков неферментов. Если белок-фермент получен рекомбинантно, препарат должен практически не содержать культуральной среды, т.е. содержание культуральной среды составляет менее приблизительно 20, 10 или 5% от объема препарата белкафермента. Используемый здесь термин "практически не содержит химических веществ-предшественников и других химических веществ" относится к препарату фермента, в котором белок отделен от химических веществ-предшественников и других химических веществ, которые использовали в синтезе белка. Этот термин включает препараты фермента, содержащие менее 30% (на сухой вес), 20, 10, 5% или менее химических веществ-предшественников или химических веществ и компонентов, не являющихся ферментом. В настоящем документе термин "синтетический", употребляемый, например, по отношению к синтетическим молекулам нуклеиновой кислоты, синтетическим генам или синтетическим пептидам относится к молекуле нуклеиновой кислоты или полипептиду, которые получают с помощью рекомбинантных методов и/или методов химического синтеза. В настоящем документе "получение рекомбинантными методами или с помощью методов рекомбинантной ДНК" означает использование известных методов молекулярной биологии для экспрессии белков, кодируемых клонированной ДНК. В настоящем документе "вектор" (или плазмида) относится к дискретному элементу, который используется для введения гетерологичных нуклеиновых кислот в клетки для их экспрессии или репликации. Векторы обычно остаются в эписомном состоянии, но могут быть разработаны векторы для интеграции гена или его части в хромосому генома. Также предусмотрены векторы, которые представляют собой искусственные хромосомы, такие как бактериальные искусственные хромосомы, искусственные хромосомы дрожжей и искусственные хромосомы млекопитающих. Процедуры выбора и использования таких векторов хорошо известны специалистам в данной области. В настоящем документе "вектор экспрессии" включает векторы, способные экспрессировать ДНК,функционально связанную с регуляторными последовательностями, такими как промоторные районы,которые способны вызывать экспрессию таких фрагментов ДНК. Дополнительные последовательности могут включать промоторные и терминаторные последовательности и, при необходимости, могут включать одну или несколько точек начала репликации, один или более маркеров для отбора, энхансер, сигнал полиаденилирования и т.п. Векторы экспрессии обычно получают из плазмидной или вирусной ДНК или вектор может содержать элементы того и другого. Таким образом, вектор экспрессии относится к рекомбинантным ДНК или РНК конструкциям, например плазмидам, бактериофагам, рекомбинантным вирусам или другим векторам, которые после введения в соответствующую клетку-хозяина приводят к экспрессии клонированной ДНК. Соответствующие векторы экспрессии хорошо известны специалистам в данной области и включают векторы, которые реплицируются в эукариотических клетках и/или прокариотических клетках, векторы, которые остаются в эписомном состоянии, или векторы, которые интегрируются в геном клетки-хозяина. В настоящем документе вектор также включает "вирусный вектор" или "вирусные векторы". Вирусные векторы представляют собой сконструированные вирусы, функционально связанные с экзогенным геном для передачи (как носитель или челнок) экзогенного гена в клетки. В настоящем документе термины "функционально" или "функционально связанный" по отношению к сегментам ДНК означают, что сегменты расположены так, что они функционируют в соответствии с их назначением, например, транскрипция инициируется после промотора и до начала любой транскрибируемой последовательности. Промотор, как правило, представляет собой домен, с которым, начиная транскрипцию, связывается транскрипционный комплекс, который затем проходит через кодирующий сегмент до терминатора.- 14022752 В настоящем документе термин "оценка" относится к качественному и количественному определению абсолютного значения активности белка или его домена, присутствующих в образце, а также к получению индекса, коэффициента, процента, визуального показателя или другого показателя уровня активности. Оценка может быть прямой или косвенной, и химические вещества, определяемые в процессе исследования, необязательно должны представлять собой непосредственно продукт реакции, но могут представлять собой, например, производные или некоторые дополнительные вещества. Например, обнаружение продукта расщепления белка комплемента можно проводить, например, с помощью SDS-PAGE и окрашивания белка кумасси синим. Используемый здесь термин "биологическая активность" относится к активности соединения invivo или к физиологической реакции, которая проявляется при in vivo введении соединения, композиции или другой смеси. Биологическая активность, таким образом, охватывает терапевтический эффект и фармацевтическую активность таких соединений, композиций и смесей. Биологическую активность можно наблюдать в in vitro системах, предназначенных для исследования или использования такой активности. Таким образом, например, биологическая активность протеазы представляет собой ее каталитическую активность, при которой происходит гидролиз полипептида. Используемый в данном изобретении термин "эквивалент" в отношении двух последовательностей нуклеиновых кислот означает, что две интересующие последовательности кодируют одну последовательность аминокислот или эквивалентные белки. Термин "эквивалент" в отношении двух белков или пептидов означает, что два белка или пептида обладают в значительной степени одинаковой аминокислотной последовательностью и включают только такие аминокислотные замены, которые существенно не изменяют активности или функции белка или пептида. Термин "эквивалент" в отношении свойства не обязательно означает, что свойство присутствует в той же степени (например, два пептида могут проявлять одну ферментативную активность при разной скорости катализа), но при этом активность, как правило, остается в значительной мере одинаковой. В настоящем документе термины "модулирует" и "модуляция" или "изменяет" относятся к изменению активности молекулы, такой как белок. Примеры активности включают, но не ограничиваются, биологическую активность, такую как передача сигнала. Модуляция может включать повышение активности(т.е. усиление активности или агонистическую активность), снижение активности (т.е. ослабление активности или ингибирование) или любые другие изменения активности (такие как изменения периодичности, частоты, длительности, кинетики или другого параметра). Термин "модуляция" зависит от контекста, как правило, модуляция относится к изменению параметра одного объекта по сравнению с другим указанным объектом, например белком дикого типа, белком в основном состоянии или белком, экспрессируемым в указанном типе клеток или при определенном состоянии. В настоящем документе "композиция" относится к любой смеси. Композиция может представлять собой раствор, суспензию, жидкость, порошок, пасту, может быть водной или неводной или представлять собой комбинацию указанных типов. В настоящем документе "комбинация" относится к любому соединению двух или более элементов. Комбинация может представлять собой два или более отдельных элемента, таких как две композиции или две совокупности, может представлять собой их смесь, например смесь двух или более элементов,или любые их вариации. Элементы комбинации, как правило, функционально связаны или сходны. Используемый здесь термин "заболевание или нарушение" относится к патологическим состояниям организма, которые возникли в результате факторов или состояний, включающих, но не ограничивающихся, инфекцию, приобретенные состояния, генетические состояния, и характеризуются идентифицируемыми симптомами. Заболевания и нарушения в данном изобретении включают заболевания и нарушения, связанные с компонентами ЕСМ (внеклеточного матрикса). В настоящем документе "лечение" субъекта с заболеванием или состоянием означает, что симптомы субъекта частично или полностью облегчаются или остаются неизменными после лечения. Поэтому лечение включает профилактику, процесс лечения и/или излечение. Профилактика относится к предотвращению возможного заболеваний и/или предотвращению ухудшения симптомов или прогрессирования заболевания. Лечение также включает любое фармацевтическое применение предусмотренных здесь композиций. В настоящем документе "фармацевтически эффективный агент" включает любое терапевтическое средство или биологически активное вещество, включая, но не ограничиваясь, например, анестетики,вазоконстрикторы, диспергирующие агенты, обычные терапевтические препараты, включая низкомолекулярные препараты, например бисфофонаты, и терапевтические белки, например инсулин, молекулыIgG и другие антитела. В настоящем документе "лечение" представляет собой любой способ уменьшения или иного благотворного изменения симптомов состояния, расстройства или заболевания. В настоящем документе "терапевтический эффект" представляет собой эффект лечения субъекта,который заключается в изменении, как правило, улучшении или смягчении симптомов заболевания или состояния, или заключается в излечении заболевания или состояния. Терапевтически эффективное количество относится к количеству композиции, молекулы или соединения, которое приводит к терапевтиче- 15022752 скому эффекту после введения субъекту. Используемый здесь термин "субъект" относится к животному, в том числе млекопитающему, такому как человек. В настоящем документе термин "пациент" относится к человеческому субъекту, проявляющему симптомы заболевания или расстройства. В настоящем документе "улучшение симптомов заболевания или расстройства" посредством лечения, например, фармацевтической композицией или лекарственным средством относится к любому уменьшению симптомов, постоянному или временному, устойчивому или кратковременному, связанному с введением или приписываемому введению композиции или лекарственного средства. В настоящем документе "профилактика" или "предотвращение" относится к способам уменьшения риска развития заболевания или состояния. В настоящем документе "терапевтически эффективное количество соединения или композиции" представляет собой количество, которое является достаточным для проявления терапевтического эффекта. Указанное количество необходимо для предотвращения, лечения, смягчения, устранения или частичного устранения симптомов заболевания или нарушения. В настоящем документе "единичная дозированная форма" относится к физически дискретным единицам, пригодным для человека и животных, содержащимся в индивидуальной упаковке, как известно в уровне техники. В настоящем документе "единичная дозированная композиция" относится к композиции для непосредственного введения. В настоящем документе "изделие" представляет собой продукт, который изготавливается и продается. В настоящем документе термин охватывает терапевтический агент, используемый совместно сPH20, таким как esPH20 или esPH20, отдельно, содержащиеся в одной или отдельных упаковках. В настоящем документе "жидкая композиция" относится к любой композиции, которая может течь. Таким образом, жидкие композиции включают композиции в полутвердой форме, пасты, растворы, водные смеси, гели, лосьоны, кремы и другие подобные композиции. В настоящем документе "набор" относится к комбинации предусмотренных в данном изобретении композиций и другого объекта, предназначенного, например, для восстановления и активации, относится к комбинации предусмотренных в данном изобретении композиций и приборов/устройств для доставки,введения, диагностики и оценки биологической активности или свойства. Наборы необязательно включают инструкции по использованию. В настоящем документе "клеточный экстракт" или "лизат" относится к смеси или фракции, которая состоит из лизированных или разрушенных клеток. В настоящем документе "животное" включает любое животное, включая, но не ограничиваясь,приматов, например человека, горилл и низших приматов, грызунов, таких как мыши и крысы, птиц, таких как куры, жвачных животных, например козы, коровы, олени, овцы, свиньи, и других животных. Термин "животные, не представляющие собой человека" исключает человека из круга предусмотренных животных. Ферменты, предусмотренные здесь, представляют собой ферменты из любого источника,включая животных, растения, прокариоты и грибы. Большая часть ферментов представляют собой ферменты животного происхождения, в том числе ферменты млекопитающих. В настоящем документе "контроль" относится к образцу, который в значительной мере идентичен исследуемому образцу, за исключением того, что он не обладает в какой-то мере исследуемым параметром, или, если речь идет об образце плазмы, контроль может быть взят у нормального добровольца, не затронутого интересующим состоянием. Контроль также может представлять собой внутренний контроль. В настоящем документе упоминание понятий в единственном числе также включает множественное число, если контекст с очевидностью не указывает на иное. Таким образом, например, упоминание молекулы, включающей "внеклеточный домен" относится к молекулам с одним или несколькими внеклеточными доменами. В настоящем документе диапазоны и количества могут быть обозначены как конкретные значения с добавлением термина "приблизительно". Термин приблизительно также включает в себя точное значение. Следовательно, "приблизительно 5 оснований" означает "приблизительно 5 оснований", а также "5 оснований". В настоящем документе термины "по желанию" или "необязательно" означают, что описанные явления или обстоятельства могут иметь место или могут не иметь места и что описание включает случаи,когда указанное явление или обстоятельство происходит, и случаи, когда это не так. Например, необязательно замещенная группа означает, что группа не является замещенной или является замещенной. В настоящем документе аббревиатуры для любых защитных групп, аминокислот и других соединений, если не указано иное, употребляются в соответствии с их обычным использованием и являются признанными аббревиатурами или употребляются в соответствии с Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB (см. Biochem. (1972), 11:1726).- 16022752 В. Обзор. Гиалуронидазы представляют собой ферменты, которые катализируют гидролиз гиалуроновой кислоты, тем самым снижая вязкость гиалуроновой кислоты и увеличивая проницаемость тканей. PH20 является активной в нейтральной среде и активной в кислой среде гиалуронидазой, демонстрирующей оптимальную активность при гликозилировании. Человеческая PH20 является белком с GPI-якорем, который присоединяется к внеклеточной поверхности плазматической мембраны через гликозилфосфатидилинозитольный (GPI) якорь на С-конце белка. Присоединение GPI-якоря ко всем белкам с GPI-якорем происходит после расщепления полипептидной цепи по определенной аминокислотной позиции, называемой -сайтом (как правило, сайт расположен приблизительно в 20-30 аминокислотах от С-конца) и удаления С-концевой части белка в ЭР. Указанная удаляемая С-концевая часть представляет собой сигнальную последовательность присоединения GPI-якоря. Сигнальная последовательность присоединенияGPI-якоря человеческого PH20 соответствует положениям 491-509 аминокислотной последовательности полипептида-предшественника, приведенного в SEQ ID NO: 107, -сайт находится в положении 490. Полипептиды PH20 с GPI-якорем, такие как человеческая PH20, являются связанными с мембраной белками и, следовательно, не являются растворимыми. Нерастворимые формы PH20, как правило, не подходят для применения в терапевтических целях. Полипептиды PH20 без GPI-якоря обычно секретируются клетками при экспрессии, поскольку они не содержат сигнальной последовательность присоединения GPI-якоря, которая закрепляет полипептид на мембране. Авторы изобретения обнаружили, что растворимые формы PH20 также включают белки,которые содержат аминокислотные остатки из сигнальной последовательности присоединения GPIякоря. Длинные растворимые полипептиды PH20 (esPH20) представляют собой растворимые белкиPH20, укороченные с С-конца, но сохраняющие один или более аминокислотных остатков, расположенных в сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря соответствующего полипептида PH20 дикого типа. Такие полипептиды esPH20 растворимы и могут быть использованы в качестве терапевтических полипептидов, например, для лечения связанных с гиалуроновой кислотой заболеваний или состояний, и/или могут быть использованы в качестве диспергирующего агента или агента для распространения с целью усиления, улучшения или увеличения распространения и доставки других агентов, лекарств и белков, улучшая, таким образом, фармакокинетический и фармакодинамический профиль совместно вводимого агента, лекарственного средства или белка. 1. PH20.PH20, также известный как поверхностный белок сперматозоидов, молекула адгезии сперматозоидов 1, SPAM1 или HYAL3, представляет собой гиалуронидазу. Гиалуронидаза представляет собой семейство ферментов, которые разрушают гиалуроновую кислоту (также известную как гиалуронан, гиалуронат или ГК), являющуюся одним из важнейших компонентов внеклеточного матрикса и основным составляющим интерстициального барьера. Катализируя гидролиз гиалуроновой кислоты, гиалуронидазы снижают вязкость гиалуроновой кислоты, тем самым повышая проницаемость тканей. Вследствие этого гиалуронидазы применяли, например, в качестве агентов для распространения или диспергирующих агентов в сочетании с другими агентами, лекарствами и белками для усиления их распространения и доставки, а также для улучшения фармакокинетического и фармакодинамического профиля совместно вводимого агента, лекарства или белка.PH20,как и другие гиалуронидазы млекопитающих,представляет собой эндо- -N-ацетилгексозаминидазу, которая гидролизует 14 гликозидные связи гиалуроновой кислоты в олигосахаридах различной длины, таких как тетрасахариды и гексасахариды. PH20 обладает гидролилитической и трансгликозидазной активностями и может разрушать гиалуроновую кислоту и хондроитин сульфаты, такие как C4-S и C6-S. В организме PH20 участвует в адгезии сперматозоида к яйцеклетке и посредством расщепления гиалуроновой кислоты способствует проникновению сперматозоидов сквозь слой кумулюсных клеток. PH20 находится на поверхности сперматозоидов и в акросоме лизосомального происхождения, где белок присоединен к внутренней акросомной мембране. PH20 плазматической мембраны проявляет гиалуронидазную активность только при нейтральном рН, в то время как PH20 внутренней акросомной мембраны проявляет активность при нейтральном и кислом рН. В дополнение к тому, что PH20 является гиалуронидазой, белок также представляет собой рецептор для ГК-индуцированной клеточной сигнализации, а также рецептор для зоны pellucida, окружающей ооцит. Примеры PH20 белков включают, но не ограничиваются, PH20 человека (полипептидпредшественник приведен в SEQ ID NO: 107, зрелый полипептид приведен в SEQ ID NO: 108), бычий(SEQ ID NO: 198). мРНК транскрипт PH20 человека, как правило, транслируется с образованием белкапредшественника из 509 аминокислот (SEQ ID NO: 107), содержащим сигнальную последовательность из 35 аминокислот на N-конце (аминокислотные остатки 1-35 из SEQ ID NO: 107). Таким образом, после транспорта в ЭР и удаления сигнального пептида образуется зрелый полипептид из 474 аминокислот с- 17022752 аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 108. Затем, как описано ниже, в ЭР отщепляется С-концевой пептид, что облегчает ковалентное присоединение GPI-якоря к новообразованной С-концевой аминокислоте в положении, соответствующем позиции 490 аминокислотной последовательности полипептида-предшественника, приведенного в SEQ ID NO: 107.PH20 человека является прототипом активной в нейтральной среде гиалуронидазы, которая, как правило, связана с мембраной через гликозилфосфатидилинозитольный (GPI) якорь. Как отмечалось выше, PH20 также экспрессируется на внутренней поверхности акросомной мембраны, где она проявляет гиалуронидазную активность при нейтральном и кислом рН. Опыт показывает, что район 1 пептидаPH20, который соответствует аминокислотам 142-172 последовательности полипептидапредшественника, приведенного в SEQ ID NO: 107, требуется для активности фермента при нейтральном рН. Район 3 пептида, который соответствует аминокислотам 277-297 последовательности полипептидапредшественника, приведенного в SEQ ID NO: 107, как представляется, важен для активности фермента при кислом рН (Cherr et al. (2001), Matrix Biology, 20:515-525). Таким образом, создается впечатление,что PH20 содержит два каталитических центра. В дополнение к каталитическим центрам PH20 также содержит гиалуронан-связывающий участок. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что этот участок находится в районе 2 пептида, который соответствует аминокислотным позициям 205-235 аминокислотной последовательности полипептида-предшественника, приведенного в SEQ ID NO: 107. Указанный район является высококонсервативным среди гиалуронидаз и похожим на связывающий гепарин мотив.a) Гликозилирование. Гликозилирование, в том числе N- и О-гликозилирование некоторых деградирующих гиалуронан ферментов, в том числе гиалуронидаз, может иметь большое значение для их каталитической активности и стабильности. N-связанные олигосахариды делятся на несколько основных типов (олигоманнозы,сложные и гибридные), все указанные типы включают (Man)3-GlcNAc-GlcNAc-ядро, связанное через амидный азот остатка Asn, который входит в последовательность -Asn-Xaa-Thr/Ser (где Хаа не являетсяPro). Для белка коагуляции С сообщалось о наличии дополнительного сайта гликозилирования-Asn-Xaa-Cys-. В некоторых случаях деградирующий гиалуронан фермент, такой как гиалуронидаза, может быть N- и О-гликозилирован. Например, PH20 имеет один О-связанный олигосахарид в положении Т 475 и шесть N-связанных олигосахаридов в положениях N82, N166, N235, N254, N368, N393 последовательности человеческой PH20, приведенной в SEQ ID NO: 107. Аминокислотные остатки N82, N166 иN254 заняты гликанами сложного типа, в то время как аминокислотные остатки N368 и N393 заняты богатыми маннозой гликанами (см. пример 6 ниже). Аминокислотный остаток N235 приблизительно в 80% случаев занят богатыми маннозой гликанами, а в 20% случаев - сложными гликанами. Хотя изменение типа гликана при модифицировании гликопротеина может драматически повлиять на антигенность белка, его структурный фолдинг, растворимость и стабильность, считается, что большинство ферментов не требуют гликозилирования для оптимальной ферментативной активности. Для некоторых гиалуронидаз удаление N-гликозилирования может привести к практически полной инактивации. Таким образом, для таких гиалуронидаз наличие N-гликанов необходимо для получения активного фермента. Наличие N-гликанов в полипептиде PH20 необходимо для получения активного фермента. Например, авторами изобретения установлено, что полное дегликозилирование человеческого PH20 путем обработки эндогликозидазой ПНГазой F или ингибитором GlcNAc-фосфотрансферазы (GPT) туникамицином приводит к полной потере гиалуронидазной активности (см. примеры 7, 8 ниже). В отличие от этого, частичное дегликозилирование человеческой PH20 обработкой эндогликозидазой EndoF1,EndoF2, EndoF3 или EndoH не влияет на активность человеческой гиалуронидазы PH20 (см. пример 7 ниже).b) GPI-якорь. Человеческий PH20 представляет собой белок с GPI-якорем. Таким образом, полипептид PH20 крепится к внеклеточной поверхности плазматической мембраны через гликозилфосфатидилинозитольный(GPI) якорь, прикрепленный к С-концу белка. Белки с GPI-якорем, такие как человеческий PH20, транслируются с отщепляемым N-концевым сигнальным пептидом, который направляет белок в эндоплазматический ретикулум (ЭР). На С-конце указанных белков присутствует другая сигнальная последовательность, которая направляет присоединение к полипептиду предварительно образованного GPI-якоря в просвете ЭР. Присоединение GPI-якоря происходит после расщепления С-концевой части полипептидной цепи по определенной аминокислотной позиции, называемой -сайтом (как правило, сайт расположен приблизительно в 20-30 аминокислотах от С-конца). Несмотря на то что, как представляется, не существует консенсусной последовательности для идентификации расположения -сайта, белки с GPIякорем содержат С-концевую сигнальную последовательность или домен присоединения GPI-якоря, который, как правило, содержит преимущественно гидрофобную область из 8-20 аминокислот, которой предшествует гидрофильный спейсерный район из 8-12 аминокислот, расположенный непосредственно после -сайта. Указанный гидрофильный спейсерный район часто богат заряженными аминокислотами и пролином (White et al. (2000), J. Cell Sci. 113 (часть 4):721-727). Более детальный анализ показывает,- 18022752 что существует область приблизительно из 11 аминокислот, предшествующая -1 позиции, которая характеризуется низким уровнем предсказанной вторичной структуры, область вокруг сайта расщепления(-сайт) от -1 до +2, которая характеризуется наличием остатков с небольшими боковыми цепями,спейсерная область между позициями+3 и со+9 и гидрофобный хвост от +10 до С-конца (Pierleoni etal. (2008), ВМС Bioinformatics, 9:392). Хотя не существует консенсусной сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря, было разработано множество различных in silico методов и алгоритмов, которые могут быть использованы для определения таких последовательностей в полипептидах (см., например, Udenfriend et al. (1995), MethodsPierleoni et al. (2008), BMC Bioinformatics, 9:392), включая методы, доступные на биоинформатических веб-сайтах, таких как веб-сайт ExPASy Proteomics tools (веб-сайт expasy.ch/tools/). Таким образом, специалист в данной области может определить, содержит ли полипептид PH20 сигнальную последовательность присоединения GPI-якоря и, следовательно, является ли полипептид PH20 белком с GPI-якорем. Сигнальная последовательность присоединения GPI-якоря человеческого PH20 занимает позиции 491-509 в аминокислотной последовательности полипептида-предшественника, приведенного вSEQ ID NO: 107, -сайт находится в положении 490. Таким образом, у человеческой PH20 после переноса в ЭР отщепляются аминокислоты 491-509, и GPI-якорь ковалентно присоединяется к остатку серина в положении 490. Ковалентное присоединение GPI-якоря к С-концу PH20 человека и, следовательно, мембраносвязанный характер PH20, были подтверждены с помощью исследований с фосфатидилинозитолспецифическим гидролизом фосфолипазой С (PI-PLC) (см., например, Lin et al. (1994), J. Biol. Chem. 125:1157-1163 и пример 3 ниже). Специфичные к фосфатидилинозитолу фосфолипазы С (PI-PLC) и D(PI-PLD) гидролизуют GPI-якорь, освобождая полипептид PH20 от клеточной мембраны. Следовательно,полученный освобожденный полипептид PH20 является растворимым. Растворимый PH20 может быть обнаружен и отделен от нерастворимого, мембраносвязанного PH20 хорошо известными в данной области методами, включая, но не ограничиваясь, тест с Тритон Х-114, как описано ниже и в примере 4. В указанном анализе растворимая гиалуронидаза PH20 переходит в водную фазу нагретого до 37 С раствора Тритон Х-114 (Bordier et al. (1981), J. Biol. Chem., 256:1604-7), тогда как заякоренная в мембране гиалуронидаза PH20 переходит в богатую детергентом фазу. Таким образом, для определения, является ли полипептид PH20 in vivo GPI-заякоренным, в дополнение к использованию алгоритмов также могут быть выполнены тесты на растворимость.c) Длинные растворимые полипептиды PH20. Изобретение включает длинные растворимые полипептиды PH20 (esPH20) и их композиции. Примерами предусмотренных в данном изобретении полипептидов esPH20 являются полипептиды esPH20 приматов, включая, но не ограничиваясь, полипептиды esPH20 человека и шимпанзе. Предусмотренные в данном изобретении полипептиды esPH20 являются растворимыми, т.е. секретируемыми, белкамиPH20, укороченными на С-конце, но сохраняющими по меньшей мере один или более аминокислотных остатков из сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря соответствующего полипептидаPH20 дикого типа (например, укороченными по положениям аминокислотной последовательности 491500). Полипептиды esPH20 могут быть получены из любого GPI-заякоренного полипептида PH20 модификацией GPI-заякоренного полипептида PH20, т.е. удалением части сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря, при условии, что полученный полипептид esPH20 растворим. Растворимость или секрецию в культуральную среду можно определить с помощью SDS-PAGE и анализа методом Вестерн-блоттинг после экспрессии или, альтернативно, с помощью теста с Тритон Х-114, как описано ниже и в примере 4, при этом полипептид PH20 получают любым способом, известным специалисту в данной области, в том числе рекомбинантной экспрессией и синтетически. Предусмотренные в данном изобретении полипептиды esPH20 могут быть использованы, например, в качестве терапевтических полипептидов, в качестве агентов для распространения или диспергирующих агентов в сочетании с другими препаратами, лекарствами и белками для улучшения их диспергирования и доставки, а также для улучшения фармакокинетического и фармакодинамического профиля совместно вводимых агентов, лекарственных средств или белков. Предусмотренные в данном изобретении полипептиды esPH20 содержат 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 или более аминокислотных остатков из сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря, что обеспечивает растворимость полипептида esPH20, т.е. полипептид переходит в водную фазу раствора Тритон Х-114, как описано ниже. Длинные растворимые полипептиды PH20 по настоящему документу могут быть получены укорочением С-конца любого природного GPI-заякоренного полипептида PH20, где полученный полипептид esPH20 является растворимым и содержит 1 или более аминокислотных остатков из сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря. Специалист в данной области с применением хорошо известных в уровне техники методов легко может определить, является ли полипептидPH20 GPI-заякоренным. Такие методы включают, но не ограничиваются использованием известных ал- 19022752 горитмов для предсказания наличия и расположения сигнальной последовательности присоединенияGPI-якоря и -сайта, а также тестом на растворимость до и после фосфатидилинозитол-специфического расщепления фосфолипазой С (PI-PLC) или D (PI-PLD). Примеры полипептидов esPH20 включают, но не ограничиваются, полипептиды esPH20 приматов,такие как, например, полипептиды esPH20 человека и шимпанзе. Например, предусмотренные в данном изобретении полипептиды esPH20 могут быть получены усечением С-конца любого зрелого полипептида или полипептида-предшественника, приведенного в SEQ ID NO: 107, 108 или 197, а также усечением их аллельных или других вариантов, в том числе их активных фрагментов, при условии, что полученный полипептид растворим и сохраняет один или более аминокислотных остатков из сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря. Аллельные варианты и другие варианты известны специалистам в данной области и включают полипептиды с 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95% или большей идентичностью последовательности с любой из последовательностей SEQ ID NO: 107, 108 и 197. ПолипептидыesPH20 по настоящему документу могут быть укорочены с С-конца на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот по сравнению с полипептидом дикого типа, таким как полипептид с последовательностьюSEQ ID NO: 107, 108 и 197, при условии, что полученный полипептид esPH20 растворим и сохраняет один или более аминокислотных остатков из сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря. Длинные растворимые полипептиды PH20 по настоящему документу сохраняют гиалуронидазную активность. Кроме того, полипептиды esPH20 являются активными в нейтральной среде, т.е. они сохраняют гиалуронидазную активность при нейтральном рН. Гиалуронидазная активность может быть увеличена или уменьшена по сравнению с GPI-заякоренной формой PH20 дикого типа. Например, предусмотренные в данном изобретении полипептиды esPH20 могут проявлять гиалуронидазную активность,которая составляет 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500,1000% и более от гиалуронидазной активности, проявляемой GPI-заякоренной формой PH20 дикого типа. 1. Полипептиды esPH20 человека. Примерами предусмотренных в данном изобретении полипептидов esPH20 являются человеческие полипептиды esPH20. Человеческие полипептиды esPH20 по настоящему документу растворимы и содержат 1 или более аминокислотных остатков из сигнальной последовательности присоединенияGPI-якоря. Таким образом, в данном изобретении предусмотрены растворимые формы человеческойPH20, в которых не полностью отсутствует сигнальная последовательность присоединения GPI-якоря. Полипептиды-предшественники esPH20 человека по настоящему документу включают, но не ограничиваются полипептидами с укороченным С-концом с последовательностью, соответствующей последовательности от 1 до 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 аминокислоты из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 107. При экспрессии в клетках млекопитающих во время процессинга у белка отщепляется N-концевая сигнальная последовательность из 35 аминокислот, и секретируется зрелая форма белка. Таким образом, зрелые человеческие полипептиды esPH20 содержат аминокислоты от 36 до 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 из SEQ ID NO: 107. Таким образом, зрелые человеческие полипептиды esPH20 по настоящему документу включают полипептиды, приведенные вSEQ ID NO: 59-63 и 100-104, или их аллельные или другие варианты. Предусмотренные в данном изобретении человеческие полипептиды esPH20 могут быть экспрессированы в клетках CHO или, альтернативно, могут быть получены в любых клетках или каким-либо способом, известным специалисту в данной области, при условии, что полипептиды растворимы и содержат по меньшей мере одну аминокислоту из сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря. Получаемые в клетках CHO растворимые человеческие полипептиды esPH20 представляют собой полипептиды, секретируемые в культуральную среду. Специалисту в данной области очевидно, что если секретируемый esPH20 растворим, т.е. переходит в водную фазу раствора Тритон Х-114, как описано ниже,то человеческий esPH20 может частично секретироваться, т.е. экспрессированный полипептид может секретироваться в культуральную среду на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,99% или более. Человеческие полипептиды esPH20 по настоящему документу, содержащие аминокислоты 1-500 или 36-500, частично секретируются. Кроме того, при экспрессии в клетках CHO полипептидыпредшественники человеческого esPH20, содержащие аминокислоты с 1 по 498, 499 или 500, или зрелые человеческие полипептиды esPH20, содержащие аминокислоты с 36 до 498, 499 или 500, экспрессируются слабо (см. пример 3 ниже). Таким образом, примеры полипептидов-предшественников человеческой esPH20 включают, но не ограничиваются любыми укороченными с С-конца полипептидами с последовательностью от 1 до 491,492, 493, 494, 495, 496 или 497 аминокислоты из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 107. При экспрессии в клетках млекопитающих после отщепления у белка во время процессинга N-концевой сигнальной последовательности, зрелые человеческие полипептиды esPH20 содержат аминокислотные последовательности, соответствующие аминокислотам от 36 до 491, 492, 493, 494, 495, 496 или 497 изSEQ ID NO: 107. Таким образом, примеры зрелых человеческих полипептидов esPH20 по настоящему документу включают полипептиды, содержащие 456, 457, 458, 459, 460, 461 или 462 аминокислот в дли- 20022752 ну, такие как полипептиды в любой из SEQ ID NO: 60-63 и 102-104, или их аллельные или иные варианты. Аллельные варианты и другие варианты, как известно специалистам в данной области, включают полипептиды с 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95% или большей идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 107 или 108. Также в данном изобретении предусмотрены человеческие полипептиды esPH20 с аминокислотными заменами. Полипептиды esPH20 с аминокислотными заменами представляют собой человеческие полипептиды esPH20, модифицированные аминокислотными заменами по сравнению с человеческими полипептидами esPH20, предусмотренными в данном изобретении и приведенными, например, вSEQ ID NO: 60-63 и 102-104. Таким образом, человеческие полипептиды esPH20 с аминокислотными заменами представляют собой укороченные с С-конца полипептиды. В некоторых примерах последовательности человеческих полипептидов esPH20 с аминокислотными заменами по настоящему документу по меньшей мере на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичны аминокислотным последовательностям с 1 до 491, 492, 493, 494, 495, 496 или 497 аминокислоты или последовательностям с 36 до 491, 492, 493, 494, 495, 496 или 497 аминокислоты из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 107. В других примерах последовательности человеческих полипептидов esPH20 с аминокислотными заменами на 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичны последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 60-63 и 102-104. Предусмотренные в данном изобретении человеческие полипептиды esPH20 могут проявлять увеличенную или уменьшенную по сравнению с PH20 с GPI-якорем дикого типа гиалуронидазную активность. Например, предусмотренные в данном изобретении человеческие полипептиды esPH20 могут проявлять гиалуронидазную активность, которая составляет 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110,120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500, 1000% и более от гиалуронидазной активности формы дикого типа с GPI-якорем. В некоторых примерах человеческие полипептиды esPH20 обладают повышенной гиалуронидазной активностью по сравнению с формой дикого типа с GPI-якорем. Гиалуронидазная активность человеческих полипептидов esPH20 может быть увеличена на 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500, 1000% и более по сравнению с гиалуронидазной активностью формы дикого типа с GPI-якорем. Предусмотренные в данном изобретении человеческие полипептиды esPH20 проявляют гиалуронидазную активность в нейтральной среде или гиалуронидазную активность, измеряемую при нейтральном рН, увеличенную или уменьшенную по сравнению с PH20 с GPI-якорем дикого типа. Например, предусмотренные в данном изобретении человеческие полипептиды esPH20 могут проявлять гиалуронидазную активность, которая составляет 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300,400, 500, 1000% и более от гиалуронидазной активности формы дикого типа с GPI-якорем. В некоторых примерах человеческие полипептиды esPH20 обладают пониженной гиалуронидазной активностью в нейтральной среде по сравнению с формой дикого типа с GPI-якорем. Гиалуронидазная активность в нейтральной среде может быть снижена на 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% и более по сравнению с гиалуронидазной активностью формы дикого типа с GPI-якорем в нейтральной среде. В других примерах человеческие полипептиды esPH20 обладают повышенной гиалуронидазной активностью в нейтральной среде по сравнению с формой дикого типа с GPI-якорем. Гиалуронидазная активность в нейтральной среде может быть увеличена на 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110,120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500, 1000% и более по сравнению с гиалуронидазной активностью формы дикого типа с GPI-якорем в нейтральной среде. Как правило, для сохранения активности полипептида человеческие полипептиды esPH20 получают с помощью систем экспрессии белков, которые обеспечивают правильное N-гликозилирование, так как гликозилирование является важным для каталитической активности и стабильности этих полипептидов. Примеры полезных для рекомбинантной экспрессии полипептидов esPH20 клеток включают, например,клетки яичников китайского хомячка (CHO) (например, клетки DG44 CHO или клетки CHO-S). 2. Полипептиды esPH20 других видов. Изобретение включает длинные растворимые полипептиды PH20 не человеческого происхождения. Для определения позиций, соответствующих позициям 491-500 человеческого полипептида PH20, приведенного в SEQ ID NO: 107, специалист в данной области техники может произвести выравнивание аминокислотной последовательности человеческого PH20 с последовательностью любого полипептидаPH20 не человеческого происхождения, у которого для получения длинного растворимого полипептидаPH20 может быть укорочен С-конец. Кроме того, для прогнозирования расположения в полипептиде сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря могут быть использованы, например, описанные в данном изобретении алгоритмы. Чтобы определить, являются ли полученные укороченные с С-конца полипептиды растворимыми и, следовательно, представляют ли собой полипептиды esPH20, с помощью хорошо известных в уровне техники методов, включая анализы с Тритон Х-114, описанные ниже и в примере 4, можно оценить растворимость укороченных с С-конца полипептидов. Изобретение включает длинные растворимые полипептиды PH20 приматов, где приматы не включают человека. Примеры полипептидов PH20 с GPI-якорем приматов включают, но не ограничиваются,PH20 шимпанзе (SEQ ID NO: 197). Таким образом, в данном изобретении предусмотрены полипептидыesPH20 шимпанзе. Предусмотренные в данном изобретении полипептиды esPH20 шимпанзе укорочены с С-конца, как описано выше для укороченных с С-конца человеческих полипептидов esPH20. Таким образом, аминокислотные последовательности предусмотренных в данном изобретении полипептидовesPH20 шимпанзе соответствуют аминокислотным остаткам с 1 до 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498,499, 500 или 501 последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 107. Полипептиды PH20 шимпанзе могут быть выровнены с человеческими полипептидами PH20 любым способом, известным специалисту в данной области. При выравнивании обычно достигается максимальное число совпадений, и способы выравнивания включают ручное выравнивание, выравнивание с помощью многочисленных доступных программ (например, BLASTP) и другие известные специалистам в данной области способы. На фиг. 1 представлен результат выравнивания полипептидовпредшественников PH20 человека и шимпанзе. Аминокислотные остатки с 491 до 500 человеческойPH20 (где человеческие полипептиды esPH20 по настоящему документу укорочены по сравнению с человеческим полипептидом PH20 дикого типа) соответствуют аминокислотным остаткам с 491 до 501PH20 шимпанзе. Таким образом, в данном изобретении предусмотрены полипептиды esPH20 шимпанзе,содержащие аминокислотные остатки с 1 до 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 или 501 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 197. При экспрессии в системах экспрессии млекопитающих во время процессинга отщепляется сигнальный пептид из 35 аминокислот, и секретируется зрелая форма белка. Таким образом, зрелые полипептиды esPH20 шимпанзе содержат аминокислоты с 36 до 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 или 501 из SEQ ID NO: 197. Примеры полипептидов esPH20 шимпанзе включают полипептиды, которые содержат аминокислотные остатки с 1 до 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497 или 498 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 197. При экспрессии в системах экспрессии млекопитающих во время процессинга отщепляется сигнальный пептид из 35 аминокислот и секретируется зрелая форма белка. Таким образом, зрелые полипептиды esPH20 шимпанзе содержат аминокислоты с 36 до 491, 492, 493, 494, 495,496, 497 или 498 из SEQ ID NO: 197.D. Частично N-гликозилированные полипептиды PH20. Изобретение включает частично N-гликозилированные гиалуронидазы, в том числе частично дегликозилированные полипептиды PH20, которые полностью или частично сохраняют гиалуронидазную активность N-гликозилированной гиалуронидазы. Примеры частично дегликозилированных гиалуронидаз включают частично дегликозилированные полипептиды PH20 любых видов, например полипептиды,приведенные в любой из SEQ ID NO: 107-109, 111-120, 197 и 198, или их аллельные или другие варианты. Аллельные и другие варианты, как известно специалистам в данной области техники, включают полипептиды, обладающие 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95% или большей идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 107-109, 111-120, 197 и 198 или их усеченными формами. Частично дегликозилированные гиалуронидазы по настоящему документу также включают гибридные, слитые и химерные частично дегликозилированные гиалуронидазы и конъюгаты частично дегликозилированных гиалуронидаз. Предусмотренные в данном изобретении частично N-гликозилированные гиалуронидазы могут быть получены с помощью расщепления одной или несколькими гликозидазами. Таким образом, хотя все сайты N-гликозилирования (например, сайты в аминокислотных позициях N82, N166, N235, N254,N368 и N393 PH20 человека, приведенной, например, в SEQ ID NO: 107) могут быть гликозилированы,степень гликозилирования белка будет уменьшена по сравнению с гиалуронидазой, не расщепленной одной или несколькими гликозидазами. Частично дегликозилированные гиалуронидазы по настоящему документу, в том числе частично дегликозилированные растворимые полипептиды PH20, могут обладать 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% гликозилирования полностью гликозилированной гиалуронидазы. В одном из примеров 1, 2, 3, 4, 5 или 6 сайтов N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82,N166, N235, N254, N368 и N393 из SEQ ID NO: 107, частично дегликозилированы, так что они больше не содержат богатых маннозой или сложных гликанов, а содержат, по меньшей мере,N-ацетилглюкозаминовые фрагменты. В некоторых примерах 1, 2 или 3 сайта N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166 и N254 из SEQ ID NO: 107, дегликозилированы, т.е. не содержат полисахаридного фрагмента. В других примерах 3, 4, 5 или 6 сайтов N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166, N235, N254, N368 и N393 из SEQ ID NO: 107, гликозилированы. Гликозилированные аминокислотные остатки содержат, по меньшей мере, N-ацетилглюкозаминовый фрагмент. Также в данном изобретении предусмотрены частично N-гликозилированные укороченные с С-конца полипептиды PH20. У частично дегликозилированных укороченных с С-конца полипептидовPH20 по настоящему документу отсутствуют одна или несколько аминокислот из С-конца полноразмерного полипептида PH20, такого как любой из полипептидов, приведенных в SEQ ID NO: 107-109, 111120, 197 и 198. Таким образом, частично N-гликозилированные укороченные с С-конца полипептидыPH20 по настоящему документу могут быть укорочены с С-конца на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 или более аминокислот по сравнению с полноразмерным полипептидом дикого типа, например полноразмерным полипептидом дикого типа с последова- 22022752 тельностью, приведенной в SEQ ID NO: 107-109, 111-120, 197 и 198. В некоторых примерах в белке гликозилированы 3, 4, 5 или 6 сайтов N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166,N235, N254, N368 и N393 из SEQ ID NO: 107. Гликозилированные аминокислотные остатки содержат, по меньшей мере, N-ацетилглюкозаминовый фрагмент. В других примерах 1, 2 или 3 сайтаSEQ ID NO: 107, не гликозилированы. В других примерах может быть уменьшена степень гликозилирования, так что частично гликозилированные укороченные с С-конца полипептиды PH20 не содержат богатых маннозой и сложных гликанов, но содержат, по меньшей мере, N-ацетилглюкозаминовый фрагмент, сохраняя при этом гиалуронидазную активность. Таким образом, частично дегликозилированные укороченные с С-конца полипептиды PH20 по настоящему документу могут быть гликозилированы на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% от уровня гликозилирования полностью гликозилированного укороченного с С-конца полипептида PH20. Частично дегликозилированные полипептиды PH20 и укороченные с С-конца полипептиды PH20 по настоящему документу сохраняют гиалуронидазную активность. Кроме того, частично дегликозилированные полипептиды PH20 и укороченные с С-конца полипептиды PH20 активны в нейтральной среде,т.е. они сохраняют гиалуронидазную активность при нейтральном рН. Гиалуронидазная активность может быть увеличена или уменьшена по сравнению с гликозилированными полноразмерными или укороченными с С-конца полипептидами PH20. Например, частично дегликозилированные полипептиды PH20 и укороченные с С-конца полипептиды PH20 по настоящему документу могут проявлять гиалуронидазную активность, которая составляет 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200,300, 400, 500, 1000% и более от гиалуронидазной активности гликозилированных полноразмерных и укороченных с С-конца полипептидов PH20. Таким образом, предусмотренные в данном изобретении полипептиды PH20 могут быть использованы в качестве терапевтических полипептидов, например, для лечения связанных с гиалуроновой кислотой заболеваний или состояний. Частично дегликозилированные полипептиды PH20 и укороченные с С-конца полипептиды PH20 также могут быть использованы, например, для комбинированной терапии. 1. Полипептиды PH20. Примеры частично N-гликозилированных гиалуронидаз по настоящему документу включают частично дегликозилированные полипептиды PH20 любых видов, например частично дегликозилированные полипептиды, приведенные в любой из SEQ ID NO: 107-109, 111-120, 197 и 198, или их аллельные или другие варианты. Аллельные и другие варианты, как известно специалистам в данной области техники,включают полипептиды, обладающие 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95% или большей идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 107-109, 111-120, 197 и 198 или их усеченными формами. В некоторых примерах в полипептидах гликозилированы 3, 4, 5 или 6 сайтов N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166, N235, N254, N368 и N393 из SEQ ID NO: 107. В других примерах 1, 2 или 3 сайта N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166 и N254 из SEQ IDSEQ ID NO: 107, содержат, по меньшей мере, N-ацетилглюкозаминовый фрагмент. Частично дегликозилированные гиалуронидазы по настоящему документу могут быть получены расщеплением одной или несколькими гликозидазами. Таким образом, хотя все сайтыN-гликозилирования (например, сайты гликозилирования, соответствующие аминокислотам N82, N166,N235, N254, N368 и N393 человеческой PH20, приведенной в SEQ ID NO: 107) могут быть гликозилированы, степень их гликозилирования уменьшается по сравнению с не расщепленной одной или несколькими гликозидазами гиалуронидазой. В частности, частично гликозилированные гиалуронидазы сохраняют в каждом сайте N-гликозилирования, по меньшей мере, N-ацетилглюкозаминовый фрагмент. Частично гликозилированные гиалуронидазы могут быть гликозилированы по 3, 4, 5 или 6 сайтамSEQ ID NO: 107. В некоторых примерах гиалуронидазы дегликозилированы по 1, 2 или 3 сайтамN-гликозилирования, соответствующим аминокислотным остаткам N82, N166, N235, N254, N368 и N393 из SEQ ID NO: 107. Частично дегликозилированные полипептиды PH20 по настоящему документу могут быть гликозилированы на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% от уровня гликозилирования полностью гликозилированной гиалуронидазы. Гликозидазы или гликозидгидролазы представляют собой ферменты, которые катализируют гидролиз гликозидной связи с образованием двух меньших молекул углеводов. Как показано на фиг. 2, к основным видам N-гликанов у позвоночных животных можно отнести богатые маннозой гликаны, гибридные гликаны и сложные гликаны. Существует несколько гликозидаз, которые дегликозилируют белки только частично, например EndoF1, которая расщепляет богатые маннозой и гибридные гликаны;EndoF2, которая расщепляет биантенные сложные гликаны; EndoF3, которая расщепляет биантенные и более разветвленные сложные гликаны, и EndoH, которая расщепляет богатые маннозой и гибридные гликаны (фиг. 3). Обработка гиалуронидазы, такой как растворимая гиалуронидаза, такая как растворимая PH20, одной или всеми указанными гликозидазами может привести лишь к частичному дегликози- 23022752 лированию и, следовательно, сохранению гиалуронидазной активности. Например, обработка rHuPH20 одной или всеми описанными выше гликозидазами приводит к частичному дегликозилированию. Частично дегликозилированные полипептиды rHuPH20 могут проявлять гиалуронидазную активность, которая сопоставима с активностью полностью гликозилированного полипептида (см. пример 7). Напротив, обработка rHuPH20 (SEQ ID NO: 122) ПНГазой F, гликозидазой, которая расщепляет все N-гликаны (см. фиг. 3), или обработка ингибитором GlcNAc-фосфотрансферазы(GPT) туникамицином приводит к полному удалению всех N-гликанов и, тем самым, делает PH20 энзиматически неактивной (см. примеры 7, 8). Частично дегликозилированная гиалуронидаза по настоящему документу, в том числе частично дегликозилированный растворимый полипептид PH20, может сохранить 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% от уровня гликозилирования полностью гликозилированного полипептида. Как правило, частично дегликозилированная гиалуронидаза, в том числе частично дегликозилированный растворимый полипептидPH20, проявляет гиалуронидазную активность, которая составляет 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500, 1000% и более от гиалуронидазной активности полностью гликозилированного полипептида. Частично дегликозилированные гиалуронидазы по настоящему документу также включают гибридные, слитые и химерные частично дегликозилированные гиалуронидазы и конъюгаты частично дегликозилированных гиалуронидаз. 2. Укороченные с С-конца полипептиды PH20. Примеры частично N-гликозилированных или частично дегликозилированных полипептидов PH20 по настоящему документу включают укороченные с С-конца полипептиды PH20. В последовательности частично гликозилированных укороченных с С-конца полипептидов PH20 по настоящему документу отсутствуют один или несколько аминокислотных остатков из С-конца полноразмерного полипептидаPH20, приведенного в SEQ ID NO: 107-109, 111-120, 197 и 198. Таким образом, частично гликозилированные укороченные с С-конца полипептиды PH20 по настоящему документу могут быть укорочены с С-конца на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 или более аминокислот по сравнению с полноразмерным полипептидом дикого типа, например полноразмерным полипептидом дикого типа с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 107-109, 111-120,197 и 198. В некоторых примерах в полипептиде гликозилированы 3, 4, 5 или 6 сайтовSEQ ID NO: 107. В других примерах 1, 2 или 3 сайта N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166 и N254 из SEQ ID NO: 107, не гликозилированы. Частично дегликозилированные укороченные с С-конца полипептиды PH20 по настоящему документу могут быть получены расщеплением одной или несколькими гликозидазами. Хотя все сайтыN-гликозилирования (например, сайты гликозилирования, соответствующие аминокислотам N82, N166,N235, N254, N368 и N393 человеческой PH20, приведенной в SEQ ID NO: 107) могут быть гликозилированы, степень их гликозилирования уменьшается по сравнению с не расщепленной одной или несколькими гликозидазами гиалуронидазой. Таким образом, частично дегликозилированные полипептидыPH20 по настоящему документу могут быть гликозилированы на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% от уровня гликозилирования полностью гликозилированной гиалуронидазы. В частности, частичноN-гликозилирования соответствует полностью гликозилированной гиалуронидазе. В дополнительных примерах 1, 2 или 3 сайта N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166, N235,N254, N368 и N393 из SEQ ID NO: 107, полностью дегликозилированы. В этих примерах, как правило,полностью дегликозилированы аминокислоты N82, N166 и N254. Примеры частично N-гликозилированных укороченных с С-конца полипептидов PH20 включают полипептиды любого видового происхождения, например любые полипептиды, приведенные вSEQ ID NO: 107-109, 111-120, 197 и 198, или их аллельные и другие варианты. Аллельные и другие варианты, как известно специалистам в данной области техники, включают полипептиды, обладающие 60, 70,80, 90, 91, 92, 93, 94, 95% или большей идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 107109, 111-120, 197 и 198 или их усеченными формами. Частично N-гликозилированные укороченные с С-конца полипептиды PH20 по настоящему документу также включают гибридные, слитые и химерные полипептиды PH20 и конъюгаты PH20. Например, частично дегликозилированный укороченный с С-конца полипептид PH20 по настоящему документу может быть конъюгирован с полимером, таким как декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) (т.е. пегилирован), фрагмент полимера сиаловой кислоты или другие подобные полимеры, например природные полимеры и полисахариды. В других примерах частичноN-гликозилированный укороченный с С-конца полипептид PH20 связан или слит с белковым доменом,- 24022752 таких как домен Fc иммуноглобулина IgG. Гликозилированные или частично гликозилированные укороченные с С-конца полипептиды по настоящему документу включают полипептиды, укороченные с С-конца на 2-44 аминокислоты по сравнению с PH20 дикого типа, приведенным в SEQ ID NO: 107 (полипептид-предшественник) или 108 (зрелый полипептид), а также их аллельные или видовые варианты. Таким образом, укороченные с С-конца полипептиды PH20 включают любые полипептиды с усеченным С-концом, последовательности которых соответствуют последовательности с 1 аминокислоты до 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459,460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481,482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503,504, 505, 506 или 507 аминокислоты из SEQ ID NO: 107, или соответствующим позициям в ее аллельных или видовых вариантах, причем в указанных полипептидах 2, 3, 4, 5 или 6 сайтов N-гликозилирования,соответствующих аминокислотам N82, N166, N235, N254, N368 и N393 из SEQ ID NO: 107, должны быть гликозилированы. При экспрессии в клетках млекопитающих во время процессинга у белка отщепляетсяN-концевая сигнальная последовательность из 35 аминокислот, и секретируется зрелая форма белка. Таким образом, в данном изобретении предусмотрены зрелые человеческие укороченные с С-конца полипептиды PH20, последовательности которых соответствуют аминокислотам с 36 до 450, 451, 452, 453,454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475,476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497,498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506 или 507 из последовательности аминокислот, приведенной вSEQ ID NO: 107, или соответствующим аминокислотам в ее аллельных или видовых вариантах, причем в указанных полипептидах 3, 4, 5 или 6 сайтов N-гликозилирования, соответствующих аминокислотамN82, N166, N235, N254, N368 и N393 из SEQ ID NO: 107, должны быть гликозилированы. В табл. 2 приведены не ограничивающие примеры укороченных с С-конца полипептидов PH20, которые могут быть гликозилированы или частично дегликозилированы. В табл. 2 ниже приведена длина (в аминокислотах) полипептидов-предшественников и зрелых полипептидов, а также идентификаторы последовательностей (SEQ ID NO), под которыми приведены примеры аминокислотных последовательностей укороченных с С-конца полипептидов-предшественников и зрелых полипептидов PH20. Полипептид PH20 дикого типа также включен в табл. 2 для сравнения.N-гликозилированные и частично дегликозилированные усеченные с С-конца полипептиды PH20 по настоящему документу включают растворимые полипептиды, т.е. полипептиды, которые переходят в водную фазу раствора Тритон Х-114, и нерастворимые полипептиды, т.е. полипептиды, которые переходят в богатую детергентом фазу раствора Тритон Х-114. Частично дегликозилированные укороченные с С-конца полипептиды PH20 по настоящему документу могут быть гликозилированы на 10, 20, 30,40, 50, 60, 70 или 80% от уровня гликозилирования полностью гликозилированной гиалуронидазы. Кроме того, частично дегликозилированные укороченные с С-конца полипептиды PH20 могут иметь 1, 2 или 3 сайта N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166 и N254 из SEQ ID NO: 107,которые не гликозилированы. Сайт N-гликозилирования, содержащий, по меньшей мере,N-ацетилглюкозаминовый фрагмент, считается гликозилированным. В некоторых примерах частично N-гликозилированные укороченные с С-конца полипептиды по настоящему изобретению являются растворимыми, т.е. не содержат GPI-якорь. Наличие GPI-якоря можно установить, например, с помощью анализа с Тритон Х-114 после инкубации с PI-PLC или PI-PLD, как описано ниже и в примере 4. Например, полипептиды PH20, укороченные с С-конца к 5'-концу от аминокислоты, соответствующей аминокислотной позиции 490 полипептида PH20, приведенного вSEQ ID NO: 107, при получении в системе экспрессии млекопитающих обычно растворимы (см. пример 3). Эти полипептиды растворимы в силу того, что они полностью лишены сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря. В других примерах частично гликозилированные укороченные с С-конца полипептиды по настоящему изобретению при получении в системе экспрессии млекопитающих являются нерастворимыми и связанными с мембраной. Например, полипептиды PH20, укороченные с С-конца к 3'-концу от аминокислоты, соответствующей аминокислотной позиции 500 полипептидаPH20, приведенного в SEQ ID NO: 107, при получении в системе экспрессии млекопитающих обычно нерастворимы (см. пример 3). Укороченные с С-конца полипептиды по настоящему документу могут быть частично гликозилированы, т.е. в полипептидах 3, 4, 5 или 6 сайтов N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166, N235, N254, N368 и N393 из SEQ ID NO: 107, являются гликозилированными. Растворимые частично гликозилированные усеченные с С-конца полипептиды PH20 по настоящему документу включают полипептиды, которые являются укороченными, но сохраняют по меньшей мере один или более аминокислотных остатков, расположенных в сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря, и полипептиды, в которых полностью отсутствует сигнальная последовательность присоединения GPI-якоря и -сайт. Таким образом, указанные полипептиды лишены ковалентно присоединяемого в ЭР к С-концу белка GPI-якоря, не связаны с внеклеточной поверхностью плазматической мембраны и являются секретируемыми. Указанные усеченные с С-конца полипептиды PH20 могут быть частично гликозилированы, например могут быть гликозилированы 3, 4, 5 или 6 сайтовN-гликозилирования. Примеры растворимых укороченных с С-конца полипептидов PH20 без сигнальной- 27022752 последовательности присоединения GPI-якоря включают полипептиды любых видов, например, приведенные в любой из SEQ ID NO: 107-109, 111-120, 197 и 198, и полипептиды или их аллельные или другие варианты. Последовательности указанных растворимых частично гликозилированных усеченных с С-конца полипептидов PH20 соответствуют аминокислотам с 1 до 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457,458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479,480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 107. После отщепления N-концевой сигнальной последовательности при экспрессии в клетках млекопитающих последовательности зрелых растворимых частично гликозилированных усеченных с С-конца полипептидов PH20 соответствуют аминокислотам с 36 до 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468,469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490,491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 из последовательности аминокислот, приведенной вSEQ ID NO: 107. В некоторых примерах растворимые полипептиды PH20 с усеченной с С-конца сигнальной последовательностью присоединения GPI-якоря частично гликозилированы и содержат, например, по меньшей мере, остаток N-ацетилглюкозамина в 3, 4, 5 или 6 сайтах N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166, N235, N254, N368 и N393 из SEQ ID NO: 107. В других примерах растворимые полипептиды PH20 с усеченной с С-конца сигнальной последовательностью присоединения GPI-якоря гликозилированы на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% от уровня гликозилирования полностью гликозилированной гиалуронидазы. Частично дегликозилированные усеченные с С-конца полипептиды PH20 по настоящему документу, которые сохраняют по меньшей мере одну аминокислоту из сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря, представляют собой частично дегликозилированные длинные растворимые поли пептиды PH20. В некоторых примерах частично дегликозилированные усеченные с С-конца полипептиды PH20 не гликозилированы по 1, 2 или 3 сайтам N-гликозилирования, соответствующим аминокислотам N82, N166 и N254 из SEQ ID NO: 107. Указанные частично дегликозилированные длинные растворимые полипептиды PH20 включают аминокислоты с 1 до 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 107. При экспрессии в клетках млекопитающих во время процессинга отщепляется N-концевая сигнальная последовательность из 35 аминокислот, и секретируется зрелая форма белка. Таким образом, зрелая форма частично дегликозилированного полипептида esPH20 включает аминокислоты с 36 до 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 107. Зрелые человеческие частично гликозилированные полипептиды esPH20 по настоящему документу включают приведенные вN-ацетилглюкозамина в 3, 4, 5 или 6 сайтах N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82,N166, N235, N254, N368 и N393 из SEQ ID NO: 107. В некоторых примерах степень гликозилирования уменьшают обработкой эндогликозидазой. Таким образом, частично дегликозилированные укороченные с С-конца полипептиды PH20 по настоящему документу, содержащие по меньшей мере одну аминокислоту из сигнальной последовательности присоединения GPI-якоря, могут быть гликозированы на 10, 20,30, 40, 50, 60, 70 или 80% от уровня гликозилирования полностью гликозилированной гиалуронидазы. Также в данном изобретении предусмотрены частично дегликозилированные укороченные с С-конца полипептиды PH20, которые не растворимы, т.е. прикреплены к клеточной мембране и поэтому не секретируется в культуральную среду при экспрессии. Не растворимые усеченные с С-конца полипептиды PH20 могут быть частично дегликозилированы при условии, что они сохраняют гиалуронидазную активность. Примеры частично гликозилированных зрелых укороченных с С-конца полипептидов PH20,которые не являются растворимыми, включают полипептиды с последовательностями, соответствующими аминокислотам с 36 до 501, 502, 503, 504, 505, 506 или 507 из SEQ ID NO: 107. Таким образом, частично гликозилированные укороченные с С-конца нерастворимые полипептиды PH20 по настоящему документу включают полипептиды длиной 466, 467, 468, 469, 470, 471 или 472 аминокислот, например,приведенные в SEQ ID NO: 55-58 и 97-99, которые сохраняют по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% от уровня гликозилирования полностью гликозилированной гиалуронидазы. В некоторых примерах в полипептидах гликозилированы 3, 4, 5 или 6 сайтов N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166, N235, N254, N368 и N393 из SEQ ID NO: 107. В других примерах 1, 2, 3, 4, 5 или 6 сайтов N-гликозилирования, соответствующих аминокислотам N82, N166, N235, N254, N368 иN393 из SEQ ID NO: 107, содержат, по меньшей мере, N-ацетилглюкозаминовый фрагмент. Частично гликозилированные укороченные с С-конца полипептиды по настоящему документу могут проявлять увеличенную или уменьшенную по сравнению с формой PH20 с GPI-якорем дикого типа гиалуронидазную активность. Кроме того, частично дегликозилированные укороченные с С-конца полипептиды PH20 активны в нейтральной среде, т.е. они сохраняют гиалуронидазную активность при нейтральном рН. Например,усеченные с С-конца полипептиды PH20 по настоящему документу могут проявлять гиалуронидазную активность, которая составляет 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300,400, 500, 1000% и более от гиалуронидазной активности, проявляемой формой дикого типа с GPI-якорем.- 28022752 В некоторых примерах частично гликозилированные усеченные с С-конца полипептиды PH20 обладают повышенной гиалуронидазной активностью по сравнению с формой дикого типа с GPI-якорем. Усеченные с С-конца полипептиды PH20 по настоящему документу могут быть такжеN-гликозилированы. N-гликозилированные и частично N-гликозилированные гиалуронидазы по настоящему документу также включают гибридные, слитые и химерные N-гликозилированные и частично дегликозилированные гиалуронидазы, а также конъюгаты N-гликозилированных и частично дегликозилированных гиалуронидаз. 3. Дополнительные модификации. Предусмотренные в данном изобретении полипептиды PH20, в том числе человеческие полипептиды esPH20, N-гликозилированные и частично N-гликозилированные укороченные с С-конца полипептиды PH20, а также частично гликозилированные полипептиды PH20, включают также полипептиды, которые содержат химические или посттрансляционные модификации, и полипептиды, которые не содержат химических или посттрансляционных модификаций. Такие модификации включают, но не ограничиваются, пегилирование, сиалирование, альбуминирование, гликозилирование, фарнезилирование, карбоксилирование, гидроксилирование, фосфорилирование, а также другие известные в уровне техники модификации полипептидов. Таким образом, предусмотренные в данном изобретении укороченные с С-конца полипептиды PH20, в том числе полипептиды esPH20, могут содержать и другие модификации,затрагивающие или не затрагивающие первичную последовательность полипептида, включая, но не ограничиваясь, присоединение углеводного фрагмента, фрагмента полиэтиленгликоля (ПЭГ), сиалильного фрагмента, Fc домена иммуноглобулина G или любого другого домена или фрагмента. Например, такие дополнительные модификации могут быть введены для повышения стабильности или времени полураспада белка в сыворотке. Укороченные с С-конца полипептиды PH20, в том числе полипептиды esPH20 по настоящему документу, могут быть конъюгированы или слиты с любым фрагментом с использованием любых методов, известных в уровне техники, в том числе химических и рекомбинантных методов. Снижение иммуногенности. У полипептидов PH20 по настоящему документу, включая человеческие полипептиды esPH20, может быть уменьшена иммуногенность. Снижение иммуногенности может быть достигнуто за счет внесения изменений в последовательность, которые устраняют антигенные эпитопы полипептида, или с помощью посттрансляционных модификаций. Например, предусмотрено изменение гликозилирования пептида, при условии, что полипептид должен содержать, по меньшей мере, остаткиN-ацетилглюкозамина в аминокислотных позициях N235, N368 и N393 из SEQ ID NO: 107. Например, полипептиды PH20 могут быть модифицированы таким образом, чтобы не содержать фукозу, особенно избежать бифукозилирования. В частности, предусмотренные в данном изобретении полипептиды PH20 не бифукозилированы. Это может быть достигнуто путем экспрессии и получения полипептидов PH20 в клетках-хозяевах, как правило, клетках насекомых, в которых не происходит бифукозилирование. Фукоза представляет собой дезоксигексозу, которая присутствует в самых разнообразных организмах, включая млекопитающих, насекомых и растения. Фукозилированные гликаны синтезируются фукозилтрансферазами. См., например, Ма et al., Glycobiology, 15(2):158R-184R, (2006);Nakayama et al., J. Biol. Chem., 276:16100-16106 (2001) и Sturla et al., Gfycobiology, 15(10):924-935 (2005). У человека фукоза часто присутствует на концах модифицированных гликанов, было показано, что наличие связанной 1,6-гликозидной связью с N-ацетилглюкозамином фукозы важно для процессинга и распознавания гликопротеинов. У насекомых в ядре структур N-гликанов встречается бифукозилирование с -1,6- и -1,3-связями. Фукозилирование ядра гликанов в клетках насекомых с -1,3-связями порождает углеводные эпитопы, иммуногенные для человека (см., например, заявка США 20070067855). Например, полипептиды PH20 по настоящему документу, в том числе полипептиды esPH20, могут быть получены в клетках-хозяевах, которые не способны к бифукозилированию полипептида. Таким образом,хотя для экспрессии полипептидов могут быть использованы способные к бифукозилированию клетки насекомых или другие клетки, как правило, для получения полипептидов используют клетки млекопитающих, такие как клетки CHO. В некоторых примерах в клетках насекомых с измененными путями гликозилирования могут быть получены дефукозилированные или фукоза-дефицитные полипептиды PH20, "маммалинизированные" клеточные системы экспрессии насекомых могут быть получены за счет применения бакуловирусных векторов экспрессии, содержащих гены процессинга олигосахаридов эукариот (см., например, патент США 6461863). Кроме того, антигенность может быть устранена при экспрессии полипептидов PH20 в клетках насекомых без -1,3-фукозилтрансферазы (FT3) (см., например, заявку США 20070067855). В других примерах дефукозилированные или фукоза-дефицитные полипептиды PH20 могут быть получены, например, в клеточных линиях, которые производят дефукозилированные белки, в том числе в дефицитных по фукозилированию белков Lec13 CHO клетках (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); заявка США 2003/0157108, а также WO 2004/056312), и нокаутных клеточных линиях, таких как клетки CHO с нокаутом гена -1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (Yamane-Ohnuki et al.,Biotech. Bioeng. 87:614 (2004.