Антагонисты толл-подобного рецептора 3

Область изобретения Настоящее изобретение относится к антителам, являющимся антителами-антагонистами толлподобного рецептора 3 (TLR3), полинуклеотидам, кодирующим антитела-антагонисты TLR3 или их фрагменты, а также к способам получения и использования названных продуктов. Предпосылки создания изобретения Толл-подобный рецептор (TLR) регулирует активацию врожденного иммунного ответа, а также развитие адаптивного (специфического) иммунитета, активируя каскады внутриклеточной передачи сигнала в ответ на связывание бактериальных, вирусных, паразитических, а в некоторых случаях и эндогенных лигандов (Lancaster et al., J. Physiol. 563:945-955, 2005). Расположенные на плазматической мембране TLR, TLR1, TLR2, TLR4 и LR6 распознают лиганды, включая белковые или липидные компоненты бактерий и грибков. Толл-подобные рецепторы, TLR3, TLR7 и TLR9, преимущественно внутриклеточные, активируются двухцепочечными РНК, одноцепочечными РНК и неметилированными CpG ДНК соответственно. Считается, что дисрегуляция сигнального пути TLR является причиной множества проблем, и терапевтические стратегии развиваются в этом направлении (Hoffman et al., Nat. Rev. DrugDiscov. 4:879-880, 2005; Rezaei, Int. Immunopharmacol. 6:863-869, 2006; Wickelgren, Science 312:184-187,2006). Например, антагонисты TLR4, а также TLR7 и TLR9, проходят клинические испытания воможности их применения для лечения тяжелого сепсиса и системной красной волчанки соответственно (Kanzleret al., Nat. Med. 13:552-559, 2007). Сигнальный путь TLR3 активируется двухцепочечной РНК, матричной РНК или РНК, высвобождаемой некротическими клетками при воспалении или вирусной инфекции. Активация TLR3 индуцирует секрецию интерферонов и провоспалительных цитокинов, а также приводит к активации и увеличению числа иммунных клеток, защищая таким образом от некоторых микробных инфекций. Например, обнаружена связь доминантно-негативного аллеля TLR3 с повышенной восприимчивостью к энцефалиту,вызванному вирусом простого герпеса, после первичного инфицирования вирусом HSV-1 в детском возрасте (Zheng et al., Science 317:1522-1527, 2007). У мышей недостаток TLR3 связан с пониженной выживаемостью при экспериментальном заражении вирусом Коксаки (Richer et al., PLoS One 4:e4127, 2009). Тем не менее, показано, что нарушенная регуляция сигнального пути TLR3 имеет отношение к заболеваемости и смертности при определенных вирусных инфекциях, в том числе вызванных вирусом западнонильской лихорадки, флебовирусом, вирусом коровьей оспы и вирусом гриппа типа A (Wang et al.,Nat. Med. 10:1366-1373, 2004; Gowen et al., J. Immunol. 177:6301-6307, 2006; Hutchens et al., J. Immunol. 180:483-491, 2008; Le Goffic et al., PloS Pathog. 2:E53, 2006). Кристаллическая структура внеклеточных доменов человеческого и мышиного TLR3 известна (Bellet al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 102:10976-80, 2005; Choe et al., Science 309:581-585, 2005; Liu et al.,Science, 320:379-381, 2008). TLR3 имеет подковообразную форму соленоида, несет на своей поверхности гликаны и включает 23 домена, состоящих из лейцитовых повторов (LRR). Были картированы участки связывания двухцепочечной РНК в двух разных областях (Liu et al., Science, 320:379-81, 2008). Предполагается, что сигнальная единица состоит из одной двухцепочечной РНК и двух внеклеточных доменовTLR3 (Leonard et al., Proc. Natl. Acad. Natl. Acad. Sci. (USA) 105:258-263, 2008). Показано, что TLR3 запускает патогенные механизмы при целом ряде воспалительных, иммуноопосредованных и аутоиммунных заболеваний, включающих, например, септический шок (Cavassani etal., J. Exp. Med. 205:2609-2621, 2008), острое поражение легких (Murray et al., Am. J. Respir. Crit. CareMed. 178:1227-1237, 2008), ревматоидный артрит (Kim et al., Immunol. Lett. 124:9-17, 2009; Brentano et al.,Arth. Rheum. 52:2656-2665, 2005), астму (Sugiura et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 40:654-662, 2009; Morishima et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 145:163-174, 2008; Stowell et al., Respir. Res. 10:43, 2009), воспалительные заболевания ЖКТ, например, болезнь Крона и язвенный колит (Zhou et al., J. Immunol. 178:4548-4556, 2007; Zhou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 104:7512-7515, 2007), аутоиммунные заболевания печени (Lang et al., J. Clin. Invest. 116:2456-2463, 2006) и сахарный диабет I типа (Dogusan et al.Diabetes 57:1236-1245, 2008; Lien and Zipris, Curr. Mol. Med. 9:52-68, 2009). Кроме того, показано, что органоспецифическая экспрессия TLR3 коррелирует с рядом патологических состояний, вызываемых нарушением регуляции местных воспалительных реакций, например, в тканях печени при первичном биллиарном циррозе (Takii et al., Lab Invest. 85:908-920, 2005), в суставах при ревматоидном артрите (Ospelt et al., Arthritis Rheum. 58:3684-3692, 2008) и слизистой оболочке носа при аллергическом рините(Fransson et al., Respir. Res. 6:100, 2005). При некрозе высвобождение клеточного содержимого, в том числе эндогенных матричных РНК,индуцирует секрецию цитокинов, хемокинов и других факторов, которые инициируют процесс местного воспаления, облегчают уничтожение клеточных остатков и восстановительный процесс. Некроз часто приводит к непрекращающемуся воспалительному процессу, способствуя его переходу в хроническую форму или усилению (Bergsbaken et al., Nature Reviews 7:99-109, 2009). Активация TLR3 в месте некроза может способствовать развитию ненормального воспалительного процесса и привести к возникновению провоспалительной положительной обратной связи за счет высвобождения лигандов TLR3. Таким образом, антагонисты TLR3 могут играть положительную роль при многих заболеваниях, сопровождающихся хроническим или острым воспалением и/или некрозом.-1 021512 Снижение активации TLR3 может рассматриваться как новая стратегия в лечении онкологических заболеваний, таких как почечноклеточный рак и плоскоклеточный (эпидермальный) рак области головы и шеи (Morikawa et al., Clin. Cancer Res. 13:5703-5709, 2007; Pries et al., Int. J. Mol. Med. 21:209-215, 2008). Кроме того, аллель TLR3L423F, кодирующий белок с меньшей активностью, связан с функцией защиты против продвинутой "сухой" макулярной дегенерации вследствие возрастных изменений (Yang et al., N.Engl. J. Med. 359:1456-1463, 2008), что указывает на возможную положительную роль антагонистовTLR3 при этом заболевании. Заболевания, связанные с воспалением, также как и заболевания, вызываемые инфекциями, имеют значительное влияние на здоровье и, следовательно, большое экономическое значение. Тем не менее,несмотря на прогресс во многих областях медицины, существует относительно мало возможностей для лечения большинства названных заболеваний. Таким образом, существует необходимость в подавлении активности TLR3 для лечения связанных с функцией этого рецептора заболеваний. Краткое описание фигур На фиг. 1 показан эффект моноклональных антител (mAb) против человеческого TLR3 (huTLR3) в эксперименте с использованием гена-репортера NF-kB. На фиг. 2 А и 2 В показан эффект (% ингибирования) или эффект моноклональных антител против человеческого TLR3 в эксперименте с использованием гена BEAS-2B. На фиг. 3 А и 3 В показан эффект моноклональных антител против человеческого TLR3 в эксперименте с использованием гена NHBE. На фиг. 4 показан эффект моноклональных антител против человеческого TLR3 в эксперименте с использованием гена РВМС. На фиг. 5 А и 5 В показан эффект моноклонального антитела против человеческого TLR3 в эксперименте с использованием гена HASM. На фиг. 6 А, 6 В и 6 С показано связывание моноклонального антитела против человеческого TLR3 с мутантами TLR3. На фиг. 7 А показаны эпитопы, распознаваемые mAb 15EVQ (черным цветом) и С 1068 (серым цветом) (верхняя часть фигуры), и эпитопы, распознаваемые mAb 12QVQ/QSV (черным цветом, нижняя часть фигуры), наложенные на изображение структуры внеклеточного домена человеческого TLR3. На фиг. 7 В показана карта возмущений при избирательном замещении водорода дейтерием в случае, когда внеклеточный домен TLR3 образует комплекс с mAb 15EVQ. На фиг. 8 А и 8 В показан эффект суррогатных крысиных/мышиных mAb (mAb против мышиногоTLR3, mAb 5429) в экспериментах с использованием А) гена-репортера NF-kB и В) гена-репортера ISRE. На фиг. 9 показан эффект суррогатных mAb (mAb 5429, mAb с 1811) в эксперименте с MEFCXCL10/IP-10. На фиг. 10 показана специфичность связывания суррогатных mAb с TLR3. Верхняя панель: контроль изотипа; нижняя панель: mAb с 1811. На фиг. 11 показано влияние суррогатных mAb на уровень penH в при экспериментально индуцированной гиперчувствительности дыхательных путей (ГДП). На фиг. 12 показан эффект суррогатных mAb на общее число нейтрофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) при гиперчувствительности дыхательных путей (ГДП). На фиг. 13 показан эффект влияния суррогатных mAb на уровень продукции CXCL10/IP-10 в жидкости после лаважа при ГДП. На фиг. 14 показан эффект суррогатных mAb на гистопатологические показатели при использовании декстран сульфата натрия (ДСН). На фиг. 15 показан эффект суррогатных mAb на А) гистопатологические показатели и В) приток нейтрофилов при переносе Т-клеток. На фиг. 16 показано влияние суррогатных mAb на клинические показатели при коллагениндуцированном артрите (КИА). На фиг. 17 показан эффект суррогатных mAb на площадь под кривой, описывающей динамику клинических показателей, при КИА. На фиг. 18 показано влияние суррогатных mAb на выживаемость мышей C57BL/6 после интраназального введения вируса гриппа A/PR/8/34. Введение mAb началось в день -1. На фиг. 19 показано влияние суррогатных mAb на клинические показатели после заражения вирусом гриппа типа A/PR/8/34. Введение mAb началось в день -1. На фиг. 20 показано влияние суррогатных mAb на массу тела в течение 14 дней после введения вируса гриппа A/PR/8/34. Введение mAb началось в день -1. На фиг. 21 показано влияние суррогатных mAb на концентрацию глюкозы в крови у животных (A)WT DIO и (В) TLR3KO DIO после пробного введения глюкозы. На фиг. 22 показано влияние суррогатных mAb на концентрацию инсулина у животных WT DIO. На фиг. 23 показано влияние mAb 15EVQ на (A) NTHi и (В) продукцию CXCL10/IP-10 и-2 021512 На фиг. 24 показано влияние mAb 15EVQ на (А) содержание sICAM-1 и (В) жизнеспособность клеток HUVEC. На фиг. 25 показана выживаемость животных после введения суррогатных mAb через 3 дня после инфекции вирусом гриппа А. На фиг. 26 показаны оценки клинического состояния после введения суррогатных mAb через 3 дня после заражения вирусом гриппа А. На фиг. 27 показано изменение массы тела животных после введения суррогатных mAb через 3 дня после инфекции вирусом гриппа А. На фиг. 28 показана молекулярная структура четвертичного комплекса внеклеточного домена TLR3 с Fab 12QVQ/QSV, Fab 15EVQ и Fab c1068 в А с представлением цепей в форме лент и общей структурой поверхности. Внеклеточный домен TLR3 показан светло-серым цветом, N-конец отмечен буквой N; все Fab-фрагменты на схеме расположения цепей показаны темно-серым цветом. В. Эпитопы показаны светло-серым цветом и помечены на схеме внеклеточного домена TLR3 так же, как Fab в А. На фиг. 28,29 и 30 Fab 12QVQ/QSV, Fab c1068 и Fab 15EVQ сокращенно указаны как Fab12, Fab1068 и Fab15, соответственно, для ясности. Фиг. 29 показывает механизм нейтрализации Fab 15EVQ. А. Сигнальная единица (СЕ) двухцепочечная PHK:TLR3 с эпитопом Fab 15EVQ, отмеченным светло-серым цветом, в одном из двух внеклеточных доменов TLR3 (светло- и темно-серый цвет, и помечен TLR3). Лиганд двухцепочечной РНК показан в виде двойной спирали серого цвета. В. Иллюстрация связывания Fab 15EVQ, создающего стерические препятствия для связывания с двухцепочечной РНК и, таким образом, образования СЕ. Связывание Fab 15EVQc высоким сродством будет препятствовать формированию СЕ или вызовет распад уже образовавшейся СЕ. На фиг. 30 показан механизм Fab 12QVQ/QSV и Fab c1068 и соединения единиц в сигнальную единицу (СЕ) TLR3. A. Fab 12QVQ/QSV и Fab c1068 могут связываться (в том числе совместно) с одной СЕ. В. Модель тесного объединения двух СЕ на двухцепочечной РНК длиной примерно 76 пар оснований. Для наглядности три эпитопа выделены цветом. С. Связывание Fab 12QVQ/QSV и Fab c1068 препятствует объединению СЕ из-за стерических столкновений между антителами и соседними СЕ. Две стрелки,направленные влево, обозначают разные количественные степени разделения СЕ под влиянием антител(нижняя стрелка относится к Fab 12QVQ/QSV, а верхняя - к Fab c1068). На фиг. 31 показано соответствие между последовательной нумерацией и системой нумерации Кабата и Чотиа на примерах антител. Области, определяющие комплементарность, и гипервариабельные участки показаны серым цветом. На фиг. 32 показано совмещение региона VL mAb 15EVQ с каркасным сегментом человеческого антитела Vk1. Гипервариабельные петли Чотиа подчеркнуты, паратопы подчеркнуты двойной чертой, а различия каркасного сегмента показаны серым цветом. Гены V1 представляют собой аллели 01, если не указано иное. Нумерация остатков последовательная. На фиг. 33 показано совмещение региона VH mAb 15EVQ с каркасным сегментом человеческого антитела Vh5. Особенности последовательности показаны, как на фиг. 32. На фиг. 34 показано совмещение региона VL mAb 12QVQ/QSV с каркасным сегментом человеческого антитела Vk3. Особенности последовательности показаны, как на фиг. 32. На фиг. 35 показано совмещение областей VL и VH mAb 15EVQ или mAb 12QVQ/QSV с каркасными сегментами человеческого антитела J, J или Jh. Особенности последовательности показаны, как на фиг. 32. Изложение сущности изобретения Один из аспектов изобретения относится к изолированному антителу или его фрагменту, при этом антитело связывается с аминокислотными остатками K416, K418, L440, N441, Е 442, Y465, N466, K467,Y468, R488, R489, А 491, K493, N515, N516, N517, Н 539, N541, S571, L595 и K619 SEQ ID NO: 2 толлподобного рецептора 3 (TLR3). Другой аспект настоящего изобретения относится к изолированному антителу или его фрагменту,при этом антитело связывается с аминокислотными остатками S115, D116, K117, A120, K139, N140,N141, V144, K145, Т 166, Q167, V168, S188, Е 189, D192, А 195 и А 219, SEQ ID NO: 2 толл-подобного рецептора 3 (TLR3). Другой аспект настоящего изобретения относится к изолированному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, или его фрагменту, при этом антитело связывается с TLR3, имеющим аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2,через вариабельную область тяжелой цепи с остатками Чотиа W33, F50, D52, D54, Y56, N58, Р 61, Е 95,Y97, Y100 и D100b и вариабельную область легкой цепи с остатками Чотиа Q27, Y32, N92, Т 93, L94 иS95. Другой аспект настоящего изобретения относится к изолированному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, или его фрагменту, при этом антитело связывается с TLR3, имеющим аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2-3 021512 через вариабельную область тяжелой цепи с остатками Чотиа N31a, Q52, R52b, S53, K54, Y56, Y97, Р 98,F99 и Y100, и вариабельную область легкой цепи с остатками Чотиа G29, S30, Y31, Y32, Е 50, D51, Y91,D92 и D93. Следующий аспект настоящего изобретения заключается в изолированных антителах, способных реагировать с TLR3, причем антитела имеют по меньшей мере одно из следующих свойств: а) связываются с человеческим TLR3 с Kd10 нМ;b) уменьшают биологическую активность TLR3 в анализе in vitro с использованием гена-репортераh) ингибируют биологическую активность TLR3 яванского макака в анализе in vitro с использованием гена-репортера NF-kB при IC50 10 мкг/мл; илиi) ингибируют биологическую активность TLR3 яванского макака в анализе in vitro с использованием гена-репортера ISRE при IC50 5 мкг/мл. Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированных антителах, способных взаимодействовать с TLR3, конкурирующих за связывание TLR3 с моноклональными антителами, причем эти моноклональные антитела состоят из аминокислотных последовательностей участков 1, 2 и 3, определяющих комплементарность (complementarity determining regions - CDR) определенных тяжелых цепей,аминокислотных последовательностей CDR 1, 2 и 3 определенных легких цепей, а также из аминокислотных последовательностей вариабельных участков определенных тяжелых цепей (VH) или аминокислотных последовательностей вариабельных участков определенных легких цепей (VL). Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированных антителах, способных реагировать с TLR3, содержащих как вариабельный участок тяжелой, так и вариабельный участок легкой цепи, причем эти антитела также содержат определяющие комплементарность участки 1, 2 и 3 (CDR) определенных тяжелых цепей и аминокислотные последовательности 1, 2 и 3 участков CDR определенных легких цепей. Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированных антителах, способных реагировать с TLR3, содержащих вариабельные участки как тяжелой, так и легкой цепи, причем эти антитела также содержат аминокислотные последовательности вариабельных участков определенных тяжелых цепей (VH) и аминокислотные последовательности вариабельных участков определенных легких цепей(VL). Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированных антителах, способных реагировать с TLR3, содержащих вариабельные участки как тяжелой, так и легкой цепей, причем эти антитела также содержат аминокислотные последовательности определенных тяжелых цепей и аминокислотные последовательности определенных легких цепей. Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированной тяжелой цепи антитела, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213,214, 215 или 216. Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированной тяжелой цепи антитела, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210, 211 или 225. Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированной тяжелой цепи антитела, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 102, 130, 131, 132, 133,134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 или 168. Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированной легкой цепи антитела, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 203,205, 207, 165, 167 или 227. Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированном полинуклеотиде, кодирующем тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159,198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 или 216. Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированном полинуклеотиде, кодирую-4 021512 щем легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209,210, 211 или 225. Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированном полинуклеотиде, кодирующем тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQID NO: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 или 168. Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированном полинуклеотиде, кодирующем легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQID NO: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165, 167 или 227. Следующий аспект данного изобретения заключается в фармацевтической композиции, состоящей из изолированных антител настоящего изобретения и фармацевтически приемлемых носителей. Следующий аспект данного изобретения заключается в векторе, включающем по меньшей мере один полинуклеотид, представленный в данном изобретении. Следующий аспект данного изобретения заключается в клетках-хозяевах, содержащих вектор,представленный в данном изобретении. Следующий аспект данного изобретения заключается в способе получения антител, способных реагировать с TLR3, заключающемся в культивировании клеток-хозяев, представленных в данном изобретении, и отборе антител, производимых клетками-хозяевами. Следующий аспект данного изобретения заключается в способе лечения или профилактики воспалительных заболеваний, который включает введение терапевтически эффективных доз изолированных антител, представленных в данном изобретении, нуждающимся в лечении пациентам в течение периода,достаточного для лечения или предупреждения воспалительного заболевания. Следующий аспект данного изобретения заключается в способе лечения или профилактики системных воспалительных заболеваний, который включает введение терапевтически эффективных доз изолированных антител, представленных в данном изобретении, нуждающимся в лечении пациентам в течение периода, достаточного для лечения или предупреждения системного воспалительного заболевания. Следующий аспект данного изобретения заключается в способе лечения диабета 2 типа, который включает введение терапевтически эффективных доз изолированных антител, представленных в данном изобретении, нуждающимся в лечении пациентам в течение периода, достаточного для лечения диабета 2 типа. Следующий аспект данного изобретения заключается в способе лечения гипергликемии, который включает введение терапевтически эффективных доз изолированных антител, представленных в данном изобретении, нуждающимся в лечении пациентам в течение периода, достаточного для лечения гипергликемии. Следующий аспект данного изобретения заключается в способе лечения гиперинсулинемии, который включает введение терапевтически эффективных доз изолированных антител, представленных в данном изобретении, нуждающимся в лечении пациентам в течение периода, достаточного для лечения резистентности к инсулину. Следующий аспект данного изобретения заключается в способе лечения или профилактики вирусных инфекций, который включает введение терапевтически эффективных доз изолированных антител,представленных в данном изобретении, нуждающимся в лечении пациентам в течение периода, достаточного для лечения или профилактики вирусных инфекций. Подробное описание изобретения Все публикации, упоминаемые в данном описании, в том числе, помимо прочего, патенты и патентные заявки, включенные в настоящее описание путем ссылки, являются частью настоящего документа, как если бы они были изложены непосредственно в настоящем документе. Используемый в данном изобретении термин "антагонист" означает молекулу, которая любым способом, частично или полностью, ингибирует эффект другой молекулы, такой как рецептор или внутриклеточный медиатор. Используемый в данном изобретении термин "антитела-антагонисты TRL3" или антитела, "способные реагировать с TLR3", относится к антителам, способным прямо или косвенно физически взаимодействовать, уменьшать или ингибировать биологическую активность TLR3 или активацию рецептораTLR3. Например, антитело, способное реагировать с TLR3, может связываться непосредственно с TLR3 и нейтрализовать активность TLR3, т.е. блокировать сигнальный путь TLR3, приводя к уменьшению продукции цитокинов и хемокинов, либо к активации NF-B. Используемый в данном изобретении термин "антитела" имеет широкое значение и относится к иммуноглобулинам или молекулам антител, включая поликлональные антитела, моноклональные антитела, включая мышиные/крысиные, человеческие, адаптированные к человеку, гуманизированные и химерные моноклональные антитела и фрагменты антител. В общем смысле антитела являются белками или пептидными цепочками, которые специфически связываются со специфическим антигеном. Интактные антитела являются гетеротетрамерными гликопротеинами, состоящими из двух одинаковых легких цепей и двух одинаковых тяжелых цепей. Обычно,-5 021512 каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью посредством одного ковалентного дисульфидного мостика,тогда как число дисульфидных связей между тяжелыми цепями различных иммуноглобулиновых изотипов может варьироваться. Каждая тяжелая и каждая легкая цепь также обладает регулярно расположенными внутренними дисульфидными мостиками. На одном конце каждой тяжелой цепи расположен вариабельный домен (вариабельная область, VH), за которой следует ряд постоянных доменов (постоянные области). Каждая легкая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VL), а на другом конце постоянный домен. Постоянный домен легкой цепи находится напротив первого постоянного домена тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи находится напротив вариабельного домена тяжелой цепи. Исходя из аминокислотной последовательности постоянных доменов легкая цепь антитела любого вида позвоночных может быть отнесена к одному из двух четко различающихся типов, а именно каппаи лямбда . Иммуноглобулины делятся на пять больших классов, а именно IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, в зависимости от аминокислотного состава постоянного домена тяжелой цепи. IgA и IgG, в свою очередь, подразделяются на изотипы IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Термин "фрагмент антитела" относится к части интактного антитела, обычно это антигенсвязывающий или вариабельный участок интактного антитела. Например, к фрагментам антитела относятся фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, диатела, одноцепочечные фрагменты антитела и мультиспецифичные антитела, сформированные из по меньшей мере двух интактных антител. Вариабельные участки легкой или тяжелой цепи состоят из "каркасного" участка, прерванного тремя "антигенсвязывающими участками". Антигенсвязывающие участки могут называться по-разному,например, (i) термин "определяющие комплементарность участки" (CDR) отражает вариабельность последовательности (Wu and Rabat, J. Exp. Med. 132:211-250, 1970). Как правило, антигенсвязывающий участок имеет шесть CDR; три из которых расположены на VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3), а другие три на VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) (Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) Согласно определению Чотии и Леска термин "гипервариабельный участок", "HVR", или "HV" относится к вариабельному домену антитела,который имеет гипервариабельную структуру (Chothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-917, 1987). Как правило, антигенсвязывающий участок содержит шесть гипервариабельных областей, три из которых находятся в VH (H1, Н 2, Н 3) и три - в VL (L1, L2, L3). Чотиа и Леск называют структурно консервативныеImmunol. 27:55-77, 2003), термин "IMGT-CDR" основывается на сравнении пяти доменов иммуноглобулинов и рецепторов Т-клеток. В международной базе данных ImMunoGeneTics (IMGT;http://wwwimgtorg) приводится стандартизованное обозначение и определение этих участков. Соответствие между CDR, HV и IMGT подробно описано у Lefranc et al. (Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77,2003). (iv) Антигенсвязывающий участок также может быть определен на основании использования остатков, определяющих специфичность (SDRU) (Almagro, Mol. Recognit. 17:132-143, 2004), где термин"определяющие специфичность аминокислотные остатки" (specificity determining residues, SDR) используется для обозначения аминокислотных остатков иммуноглобулинов, непосредственно вовлеченных в контакт с антигеном. SDRU - точная мера количества и распределения SDR для разных типов антигенов,согласно результатам анализа кристаллической структуры комплексов антиген-антитело. (v) Антигенсвязывающий участок также можно определить как остатки паратопа антитела, определенные в кристаллической структуре комплекса антиген-антитело. Используемый в данном изобретении термин "композитные последовательности" означает антигенсвязывающий участок, включающий все аминокислотные остатки, индивидуально упомянутые у Кабата,Чотии или в IMGT, или любые другие участки, определенные как антигенсвязывающие."Остатки Чотиа" в настоящем документе относятся к VL и VH областям антитела и нумеруются согласно Al-Lazikani (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-48, 1997). Соответствие между двумя самыми употребительными системами нумерации, Кабата (Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, NIH, Bethesda, MD, 1991) и Чотиа (Chothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-17, 1987) по отношению к последовательной нумерации полипептидов показано на фиг. 31 на примере антител, относящихся к настоящему изобретению. Название "каркасный участок" или "каркасные последовательности" относится к последовательностям вариабельных участков, которые не были определены как антигенсвязывающие. Каркасный участок обычно разделяют на четыре области, FR1, FR2, FR3 и FR3, образующие каркасную структуру для трех антигенсвязывающих участков в каждой вариабельной области. Поскольку для определения антигенсвязывающего участка могут использоваться разные термины, как указано выше, определение точной последовательности аминокислот каркасного участка зависит от определения антигенсвязывающего участка."Каркасный участок вариабельной области легкой цепи каппа 1 (V1)" или "V1" в настоящем документе означает каркасный участок с аминокислотной последовательностью, кодируемой любым из человеческих функциональных генов V1 или их аллелей. Например, это следующие функциональные-6 021512 человеческие гены V1: IGKV1-501, IGKV1-601, IGKV1-801, IGKV1-901, IGKV1-1201, IGKV11302, IGKV1-1601, IGKV1-1701, IGKV1-2701, IGKV1-3301, IGKV1-3701, IGKV1-3901, IGKV1D801, IGKV1D-1201, IGKV1D-1301, IGKV1D-1601, IGKV1D-1701, IGKV1D-3301, IGKV1D-3701,IGKV1D-3901, IGKV1D-4201 или IGKV1D-4301. Номенклатура генов иммуноглобулина хорошо известна."Каркасный участок вариабельной области легкой цепи лямбда 3 (V3)" или "v3" в настоящем документе означает каркасный участок с аминокислотной последовательностью, кодируемой любым из человеческих функциональных генов V3 или их аллелей. Например, это следующие функциональные человеческие гены V3: IGLV3-101, IGLV3-901, IGLV3-1001, IGLV3-1201, IGLV3-1601, IGLV31901, IGLV3-2101, IGLV3-2201, IGLV3-2501, IGLV3-2701 и IGLV3-3201."Каркасный участок вариабельной области легкой цепи Vh5 или "Vh5" в настоящем документе означает каркасный участок с аминокислотной последовательностью, кодируемой любым из человеческих функциональных генов Vh5" или их аллелей. Например, это следующие функциональные гены Vh5:"Каркасный участок вариабельной области легкой цепи Vh6 или "Vh6" в настоящем документе означает каркасный участок с аминокислотной последовательностью, кодируемой любым из человеческих функциональных генов Vh6 или их аллелей. Например, это функциональный ген Vh6 IGHV6-101."Каркасный участок легкой цепи J-каппа (или J) в настоящем документе означает каркасный участок с аминокислотной последовательностью, кодируемой любым из человеческих функциональных генов J или их аллелей. Например, это функциональные человеческие гены V IGKJ1, IGKJ2, IGKJ3,IGKJ4 и IGKJ5."Каркасный участок J-лямбда легкой цепи (или J) в настоящем документе означает каркасный участок с аминокислотной последовательностью, кодируемой любым из человеческих функциональных генов J или их аллелей. Например, это функциональные человеческие гены J IGLJ1, IGLJ2, IGLJ3,IGLJ4, IGLJ5, IGLJ6 и IGLJ7."Каркасный участок J-области тяжелой цепи или "Jh" в настоящем документе означает каркасный участок с аминокислотной последовательностью, кодируемой любым из человеческих функциональных генов Jh или их аллелей. Например, это функциональные гены Jh IGHJ1, IGHJ2, IGHJ3, IGHJ4, IGHJ5 иIGHJ6. Термин "гены зародышевой линии" или "гены зародышевой линии антитела" в настоящем документе означает последовательности иммуноглобулина, кодируемые нелимфоидными клетками, не претерпевшими процесс созревания, ведущий к генетической перестройке и мутации для экспрессии конкретного иммуноглобулина. Термин "каркасный белок" в настоящем документе означает аминокислотные последовательности вариабельной области легкой или тяжелой цепей, кодируемые человеческими зародышевыми генами. Таким образом, этот термин охватывает и каркасную область, и антигенсвязывающий участок. Используемый в данном изобретении термин "антиген" означает любую молекулу, которая прямо или косвенно может приводить к выработке антител. Понятие "антиген" также включает кодирующую белок нуклеиновую кислоту. Термин "гомолог" означает белковые последовательности, имеющие от 40 до 100% сходства по отношению к рассматриваемой последовательности. Гомологами человеческого TLR3 являются полипептиды других видов, имеющие от 40 до 100% сходства по отношению к уже известной последовательности человеческого TLR3. Идентичность между двумя пептидными цепочками, определенная в процентном соотношении, может быть вычислена путем попарного совмещения с помощью настройки по умолчанию в модуле AlignX программного обеспечения Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen, CA). Термин "TLR3" обозначает человеческий TLR3 (huTLR3) и его гомологи. Полная нуклеотидная и аминокислотная последовательности человеческого TLR3 показаны в SEQ ID NO: 1 и 2 соответственно. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности внеклеточного домена (ECD) человеческого TLR3 представлены в SEQID NO: 3 и 4 соответственно. Используемый в данном изобретении термин "по существу, идентичный" означает, что аминокислотные последовательности двух антител или фрагментов антител при сравнении являются идентичными или имеют "незначительные отличия". Незначительными отличиями являются замещения 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислот в аминокислотной последовательности антитела или фрагмента антитела. Аминокислотные последовательности, по существу, идентичные последовательностям, представленным в данном изобретении, также рассматриваются как часть данного изобретения. В некоторых случаях идентичность последовательностей может достигать 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более. Идентичность в процентном соотношении может быть вычислена, как описано выше. Для сравнения пептидных цепочек наилучшим образом подходят вариабельные участки тяжелой или легкой цепи. Используемый в данном изобретении термин "в сочетании с" означает, что описанные активные вещества могут использоваться совместно, образуя смесь, по отдельности или последовательно в любом порядке.-7 021512 Используемый в данном изобретении термин "воспалительное заболевание" означает местную (локальную) реакцию на клеточное повреждение, частично опосредованную активностью цитокинов, хемокинов или воспалительных клеток (например, нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов, макрофагов), которое в большинстве случаев сопровождается болью, покраснением, припухлостью и утратой тканью своей нормальной функции. Используемый в данном изобретении термин "воспаление легких" означает воспалительное заболевание, поражающее легкие или связанное с ними. Используемый в данном изобретении термин "моноклональное антитело" (mAb) означает антитело(или фрагмент антитела), полученное из популяции, по существу, гомогенных антител. Моноклональные антитела высокоспецифичны и, как правило, направлены против единственной антигенной детерминанты. Определение "моноклональные" означает, по существу, гомогенный характер антител и не требует использования какого-либо определенного способа производства антител. Например, мышиные mAbs можно получить гибридомным методом согласно Kohler et al. (Nature 256:495-497, 1975). ХимерныеmAbs, содержащие вариабельную область легкой и тяжелой цепи, полученные из донорного антитела(обычно мышиного) и постоянные области легкой и тяжелой цепей, полученные из акцепторного антитела (обычно другого вида млекопитающих, например, человека), можно получить по методу, описанному в патенте 4816567. Гуманизированные mAb, имеющие CDR из донорного не человеческого иммуноглобулина (обычно мышиного) и оставшиеся части молекулы, взятые из одного или нескольких человеческих иммуноглобулинов, можно получить с помощью методик, известных специалистам, например,как описано в патенте 5225539. Человеческие каркасные последовательности, использующиеся получения гуманизированных антител, могут выбираться специалистами в этой области из соответствующих баз данных. В случае необходимости, для сохранения аффинности связывания гуманизированные mAb могут быть дополнительно модифицированы включением измененных оснований каркасного участка с помощью способов, предложенных Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:10029-10032, 1989 иHodgson et al., Bio/Technology, 9:421, 1991). Полностью человеческие mAb, не содержащие ни одной экзогенной последовательности, могут быть получены от мышей, имеющих человеческий трансген, с помощью существующих методов (см.,например, Lonberg Nature 368:856-859, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-851, 1996; иMendez et al., Nature Genetics 15:146-156, 1997). Человеческие mAb могут быть получены и оптимизированы с помощью комбинаторных фаговых библиотек, а также с помощью других доступных способов(см., например, Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000; и Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254:67-84 2001). Фрагменты антител, например Fab, F(ab')2, Fd и dAb, могут быть получены путем расщепления антител или методами рекомбинантной технологии. Например, фрагменты Fab и F(ab')2 могут быть получены путем обработки антител ферментом, например пепсином. Используемый в данном изобретении термин "эпитоп" означает часть антигена, с которой специфически связываются антитела. Эпитопы обычно состоят из химически активных (неполярных, полярных или гидрофобных), поверхностно расположенных функциональных групп, таких как боковые группы аминокислот или полисахаридов, и могут иметь специфическую трехмерную структуру, а также специфический заряд. Строение эпитопа может быть линейным или прерывистым, например конформационный эпитоп, который формируется в результате пространственного взаимодействия аминокислот, не находящихся в непрерывной аминокислотной последовательности антигена, в отличие от взаимодействия линейно связанных аминокислот. Конформационный эпитоп включает эпитопы, возникающие в результате пространственного свертывания белков антигенов, при котором аминокислоты из различных участков линейной последовательности антигена оказываются в тесной близости в трехмерном пространстве. Используемый в данном изобретении термин "паратоп" означает часть антитела, с которой специфически связывается антиген. Паратоп может быть линейным или дискретным, образованным за счет пространственных взаимоотношений между аминокислотами, не находящимися в непрерывной последовательности, в отличие от взаимодействия линейно связанных аминокислот. Термины "паратоп легкой цепи" и "паратоп тяжелой цепи" или "аминокислотные остатки паратопа легкой цепи" и "аминокислотные остатки паратопа тяжелой цепи" означает аминокислотные остатки легкой и тяжелой цепей, контактирующие с антигеном. Используемый в данном изобретении термин "специфическое связывание" относится к антителам,проявляющим большую аффинность при связывании с определенными антигенами, по сравнению с другими антигенами или белками. Как правило, связывание антитела характеризуется константой диссоциации (KD) 10-7 М или менее. Связывание с предопределенным антигеном происходит при KD, в два раза меньшей, чем KD связывания со неспецифичным антигеном (например, BSA, казеин или любой другой полипептид), отличным от предопределенного антигена. Фразы "антитело, распознающее антиген" и"антитело, специфичное к антигену" используются как взаимозаменяемые вместе с выражениями "антитело, которое специфически связывается с антигеном" или "специфичное к антигену антитело", например, антитело, специфичное к TLR3. Константа диссоциации может быть измерена с помощью стандартных способов, описанных далее. Использующийся в настоящем изобретении термин "биологическая активность TLR3" или "активация TLR3" относится к любой активности, являющейся результатом связывания лиганда с TLR3. Лиган-8 021512 ды TLR3 включают двухцепочечную РНК, поли(I:С) и эндогенную мРНК, например, мРНК, высвобожденную из некротических клеток. В отдельных случаях, активация TLR3 приводит к активации NF-B в ответ на связывание лиганда TLR3. Экспериментальная оценка активации NF-B может быть осуществлена с использованием генарепортера после индукции рецептора лигандом поли(I:С) (Alexopoulou et al., Nature 413:732-738, 2001;Hacker et al., EMBO J. 18:6973-6982, 1999). В других случаях активация TLR3 приводит к активации факторов (IRF-3, IRF-7), участвующих в интерфероновом ответе, в ответ на лиганд TLR3. Экспериментальная оценка опосредованной рецептором TLR3 активации IRF может быть сделана с помощью генарепортера, контролируемого интерферон-стимулированными элементами (interferon-stimulated responseelement - ISRE). В отдельных случаях активация TLR3 приводит к секреции провоспалительных цитокинов и хемокинов, например, TNF-, IL-6, IL-8, IL-12, CXCL5/IP-10 и RANTES. Высвобождение цитокинов и хемокинов из клеток, тканей или в циркуляционных потоках может быть измерено с помощью хорошо известных иммунологических тест-систем, таких как ИФА. В данном изобретении использованы общепринятые одно- и трехбуквенные коды обозначения аминокислот Композиции данного изобретения Настоящее изобретение относится к антителам-антагонистам, способным ингибировать биологическую активность TLR3, и к использованию этих антител. Антагонисты TLR3 могут связываться с TLR3 и ингибировать активацию TLR3. Примеры механизмов, по которым указанные антитела могут ингибировать активацию TLR3, включают ингибирование in vitro, in vivo или in situ путем связывания лигандов сTLR3, ингибирования димеризации рецептора, ингибирования TLR3 в эндосоме, ингибирования киназной активности дальнейшего сигнального пути или ингибирования транскрипции матричных РНК TLR3. Другие антитела-антагонисты, способные ингибировать активацию TLR3 за счет других механизмов,также являются частью настоящего изобретения. Данные антагонисты находят применение в качестве исследовательских и диагностических реагентов, а также терапевтических агентов. В природе разнообразие антител создается благодаря множеству генов зародышевой линии, кодирующих вариабельные области, и множеству соматических событий. Соматические события включают рекомбинацию переменного генного сегмента, сегмента разнообразия (D) и сегмента присоединения (J),а при образовании участка VL - рекомбинацию V и J сегментов. Сам процесс рекомбинации может быть неточным, приводя к уменьшению или увеличению числа аминокислот в месте соединения V(D)J. Эти механизмы разнообразия действуют в развивающихся В-клетках до антигенной стимуляции. После антигенной стимуляции экспрессирующиеся гены антител в В-клетках претерпевают соматическую мутацию. На основании оценки числа сегментов генов зародышевой линии произвольная рекомбинация этих сегментов и произвольное спаривание VH-VL может дать начало до 1,6107 разных антител (FundamentalImmunology, 3rd ed. (1993), ed. Paul, Raven Press, New York, N.Y.). Если учитывать другие процессы, спо-9 021512 собствующие разнообразию антител (например, соматические мутации), полагают, что возможна генерация до 1010 разных антител (Immunoglobulin Genes, 2nd ed. (1995), eds. Jonio et al., Academic Press, SanDiego, Calif.). Поскольку в обеспечении разнообразия антител участвует много процессов, очень маловероятно, что полученные независимо моноклональные антитела с такой же антигенной специфичностью будет иметь идентичные аминокислотные последовательности. Изобретение представляет новые участки связывания антигенов и цепи иммуноглобулина, полученные с использованием библиотек человеческих генов иммуноглобулинов. Структура, несущая антигенсвязывающий участок, обычно является тяжелой или легкой цепью антитела, или частью указанных структур, где антигенсвязывающий участок располагается на своем естественном месте, согласно приведенному выше описанию. В настоящем изобретении предлагаются изолированные антитела или их фрагменты, способные реагировать с TLR3, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, в том числе антитела,содержащие аминокислотные последовательности 1, 2 и 3 (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) определяющего комплементарность участка тяжелой цепи (CDR) и аминокислотные последовательности 1, 2 и 3(LCDR1, LCDR2 и LCDR3) определяющего комплементарность участка тяжелой цепи (CDR), показанные в табл. 1 а. Таблица 1 а 15 CDR по базе IMGT 15 CDR как общий типичный элемент В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или их фрагменты, способные реагировать с TLR3, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, включая антитела, содержащие аминокислотную последовательность HCDR2, представленную в SEQ ID NO: 192, где HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 192 HCDR2 определяется формулой (I) В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или их фрагменты, способные реагировать с TLR3, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, включая антитела, содержащие аминокислотную последовательность HCDR2, показанную в SEQ В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или их фрагменты, способные реагировать с TLR3, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, включая антитела, содержащие аминокислотную последовательность HCDR2, показанную в SEQ В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или их фрагменты, способные реагировать с TLR3, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, включая антитела, содержащие аминокислотную последовательность LCDR3, показанную в SEQ В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или их фрагменты, способные реагировать с TLR3, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, включая антитела, содержащие аминокислотную последовательность LCDR3, показанную в SEQ В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или их фрагменты, способные реагировать с TLR3, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, включая антитела, содержащие аминокислотную последовательность LCDR3, показанную в SEQ В настоящем изобретении также предлагаются изолированные антитела и их фрагменты, способные реагировать с TLR3, содержащие аминокислотные последовательности 1, 2 и 3 (HCDR1, HCDR2 иHCDR3) определяющего комплементарность участка тяжелой цепи (CDR) и аминокислотные последова- 11021512 тельности 1, 2 и 3 (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) определяющего комплементарность участка легкой цепи(CDR), показанные в табл. 1 а. Антитела, чьи аминокислотные последовательности антигенсвязывающих участков не отличаются существенным образом от последовательностей, представленных в табл. 1a (SEQ ID NO: 49-121 или 191196), рассматриваются как часть настоящего изобретения. Как правило, это относится к замене аминокислот на другие аминокислоты, имеющие сходный заряд, гидрофобные или стереохимические характеристики. Также возможны дополнительные замены в каркасных участках, в отличие от антигенсвязывающих участков, в случае, если они не изменяют свойств антитела. Возможны замещения, улучшающие свойства антитела, такие как стабильность или аффинность. Одно, два, три, четыре, пять или шесть замещений могут быть сделаны в антигенсвязывающем участке. Возможно замещение 1%, 2%, 3%, 4%,5%, 10%, 15%, 20%, 25% или 30% аминокислотных остатков каркасного фрагмента при условии сохранения желаемых свойств антитела. Консервативные модификации приведут к созданию молекул, имеющих функциональные и химические характеристики, близкие к исходной молекуле. Существенные модификации функциональных и/или химических характеристик молекул могут быть достигнуты путем тех замещений в аминокислотной последовательности, которые приводят к изменениям (1) в структуре каркаса молекулы в районе замещения, например, к плоской или спиральной конформации, (2) в заряде или гидрофобности молекулы в районе замещения или (3) в размере молекулы. Например, "консервативные аминокислотные замещения" могут означать замещения природных аминокислотных остатков на неприродные, которые не сопровождаются изменением полярности или с незначительными изменениями полярности в районе замещения. Более того, любой природный аминокислотный остаток в полипептиде может быть замещен аланином согласно способу, описанному как аланин-сканирующий мутагенез (MacLennan et al., ActaPhysiol. Scand. Suppl. 643:55-67, 1998; Sasaki et al., Adv. Biophys. 35:1-24, 1998). Любое желательное аминокислотное замещение (консервативное или нет) может быть запланировано специалистом в случае необходимости. Например, аминокислотное замещение может быть использовано для того, чтобы идентифицировать важные аминокислотные остатки в последовательности или с целью увеличения/уменьшения аффинности молекул, предложенных в настоящем изобретении. Некоторые аминокислотные замещения показаны в табл. 1b. В некоторых вариантах осуществления консервативные аминокислотные замещения могут быть осуществлены путем введения в молекулу неприродных аминокислотных остатков, которое обычно происходит при химическом синтезе белков. Аминокислотные замещения могут быть осуществлены, например, с помощью ПЦР мутагенеза (патент США 4683195). Могут быть созданы библиотеки новых вариантов с помощью хорошо известных способов, например применения случайных (NNK) или неслучайных кодонов, таких как кодоны DVK, кодирующие 11 аминокислот (ACDEGKNRSYW), а также поиска вариантов с необходимыми свойствами в уже существующих библиотеках, как показано в примере 1. В табл. 1 с показаны замещения, сделанные с целью улучшения характеристик антител в трех родственных антителах-антагонистах TLR3 в пределах участков LCDR3 и HCDR2. В зависимости от определения антигенсвязывающих участков аминокислотные остатки антигенсвязывающих участков антител, предложенных в настоящем изобретении, и, следовательно, аминокислотные остатки каркасных участков могут слегка отличаться для каждой тяжелой и легкой цепи. Таблица 1b- 12021512 В табл. 2 а и 2b показаны остатки антигенсвязывающих участков некоторых антител, предложенных в настоящем изобретении, согласно Кабату, Чотии и IMGT, а также их композитные последовательности. В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или фрагменты антител, способные взаимодействовать с TLR3, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, где антитела содержат аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей, а также предлагаются вариабельные участки для каждой отдельной тяжелой и легкой цепи, как показано в табл. 3 а. F17, F18 и F19 относятся к вариантам антител, содержащих аминокислотную последовательность-консенсус для семейств 17, 18 и 19 соответственно (см. пример 1). Таблица 1c Хотя варианты осуществления, проиллюстрированные в примерах, содержат вариабельные участки,один для тяжелой и один для легкой цепи, специалисты поймут, что альтернативные варианты осуществления могут содержать различные вариабельные участки тяжелой или легкой цепи. Одиночный вариабельный участок может использоваться для поиска второго вариабельного участка, способного к формированию двухдоменного специфического антиген-связывающего фрагмента, способного, например, связываться с TLR3. Такой поиск может осуществляться с помощью методов фагового отображения, например, с использованием иерархического двойного комбинаторного подхода, описанного в публикации РСТ No. WO 92/01047. Согласно указанному методу индивидуальная колония, содержащая клон Н или L цепей, используется для инфицирования всей библиотеки клонов, кодирующих другую цепь (L или Н), а появляющийся в результате двухцепочечный специфический антигенсвязывающий домен селективно отбирается в соответствии с методами фагового отображения. В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или фрагменты антител, способные взаимодействовать с TLR3, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, имеющие по меньшей мере 95%-ное сходство с аминокислотной последовательностью определенного вариабельного участка, как показано в табл. 3 а. Следующий аспект настоящего изобретения заключается в изолированных антителах, имеющих определенную аминокислотную последовательность тяжелой и легкой цепей, как показано в табл. 3b. Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированных полинуклеотидах, кодирующих любое из антител, представленных в настоящем изобретении и его дополнениях. Некоторые полинуклеотиды описываются в настоящем изобретении, однако, другие полинуклеотиды, которые, принимая во внимание вырожденность генетического кода или предпочтительность использования кодонов в данной экспрессионной системе, кодируют предложенные в настоящем изобретении антитела-антагонисты, также рассматрива- 15021512 ются как часть настоящего изобретения. Таблица 2b Некоторыми антителами-антагонистами могут быть антитела изотипов IgG, IgD, IgG, IgA или IgM. Кроме того, эти антитела-антагонисты могут модифицироваться на постранскрипционном уровне за счет таких процессов, как гликозилирование, изомеризация, дегликозилирование или ненатуральная ковалентная модификация, такая как добавление активной группы полиэтиленгликоля (PEG) или липидизация. Такие модификации могут происходить in vivo или in vitro. Например, предлагаемые в настоящем изобретении антитела могут быть конъюгированы с полиэтиленгликолем с целью усовершенствования их фармакокинетических характеристик. Конъюгация может быть выполнена с помощью известных специалистам способов. Показано, что конъюгация терапевтических антител с ПЭГ усиливает фармакодинамику, не влияя на функцию (Deckert et al., Int. J. Cancer 87:382-390, 2000; Knight et al., Platelets 15:409418, 2004; Leong et al., Cytokine 16:106-119, 2001; Yang et al., Protein Eng. 16:761-770, 2003). Таблица 3b Фармакокинетические свойства антител, описанных в настоящем изобретении, также могут быть усилены за счет модификаций Fc с применением способов, хорошо известных специалистам. Например,тяжелая цепь иммуноглобулина изотипа IgG4 в шарнирном участке содержит мотив Cys-Pro-Ser-Cys(CPSC), способный формировать дисульфидные мостики между тяжелыми цепями или внутри тяжелой цепи, например, два Cys-остатка в мотиве CPSC могут образовывать дисульфидный мостик с двумя дру- 17021512 гими остатками в другой тяжелой цепи (между), или два остатка Cys внутри данного CPSC мотива могут образовывать дисульфидный мостик друг с другом (внутри). Считается, что in vivo ферменты, осуществляющие изомеризацию, способны конвертировать дисульфидные мостики между тяжелыми цепями во внутрицепочечные мостики и vice versa (Aalberse and Schuurman, Immunology 105:9-19, 2002). Соответственно, поскольку пара тяжелая:легкая цепи (H:L) в молекулах иммуноглобулина IgG4 с внутрицепочечными мостиками в шарнирном участке тяжелой цепи не связаны друг с другом ковалентной связью, она может диссоциировать на H:L мономеры, а вслед за этим реассоциировать, формируя биспецифичную,гетеродимерную молекулу иммуноглобулина IgG4. В биспецифичном антителе IgG два фрагмента Fab молекулы различаются по эпитопам, с которыми они связываются. Замещение аминокислотного остаткаSer в мотиве CPSC шарнирного участка IgG4 на остаток Pro приводит к "IgG1-подобному поведению",например, молекулы формируют стабильные дисульфидные мостики между тяжелыми цепями и, следовательно, не могут участвовать в обмене H:L с другой молекулой иммуноглобулина IgG4. В одном из вариантов осуществления описанные в данном изобретении антитела составляют Fc домен иммуноглобулина IgG4 с мутацией S в Р в мотиве CPSC. Мотив CPSC, как правило, расположен у остатка 228 зрелой тяжелой цепи, но расположение этого мотива может изменяться в зависимости от длины CDR. Кроме того, в антителах, описанных в настоящем изобретении, участки, влияющие на связывание с рецепторами Fc, отличными от рецептора FcRn, могут быть удалены. Например, в антителах, описанных в настоящем изобретении, участки, связывающие рецептор Fc, вовлеченный в активность ADCC, могут быть удалены. Например, мутация Leu234/Leu235 в шарнирном участке IgG1 в L234A/L235A или мутация Phe235/Leu236 в шарнирном участке IgG4 в P235A/L236A минимизирует связывание FcR и уменьшает способность иммуноглобулина опосредовать комплементарно зависимую цитотоксичность иADCC. В одном варианте осуществления настоящего изобретения описанные антитела содержат Fc домен иммуноглобулина IgG4 с мутацией P235A/L236A. Расположение этих аминокислотных остатков в зрелых тяжелых цепях указано выше, но может изменяться в зависимости от длины CDR. Некоторые антитела с мутациями P235A/L236A являются антителами, чьи тяжелые цепи кодируются последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 218, 219 или 220. Полностью человеческие, адаптированные к человеку, гуманизированные и аффинно-зрелые молекулы антител или фрагменты антител являются частью настоящего изобретения, также как гибридные и химерные белки. Аффинность антитела к антигену может быть улучшена с помощью продуманной конструкции или случайного созревания аффинности с использованием хорошо известных способов случайного или направленного мутагенеза или комбинаторных фаговых библиотек. Например, возможно замещение остатков зоны верньера, располагающихся преимущественно в каркасной области, или "остатков,определяющих аффинность", ADR, для регуляции аффинности антитела (патент 6639055; публикации РСТ No. WO 10/045340). Частью настоящего изобретения являются полностью человеческие, адаптированные к человеку,гуманизированные, аффинно-зрелые молекулы антител или фрагментов антител, модифицированные с целью улучшения стабильности, селективности, перекрестной реактивности, аффинности, иммуногенности или достижения других желательных биологических характеристик. Стабильность антитела определяется целым рядом факторов, включая (1) пространственную укладку индивидуальных доменов, влияющую на естественную стабильность, (2) поверхностное взаимодействие белков, определяющее спаривание НС и LC, (3) глубину расположения полярных и заряженных аминокислотных остатков, (4) сеть водородных мостиков между полярными и заряженными аминокислотными остатками; а также (5) поверхностный заряд и распределение полярных аминокислотных остатков наряду с другими внутри- и межмолекулярными взаимодействиями (Worn et al., J. Mol. Biol., 305:989-1010, 2001). Аминокислотные остатки, способные дестабилизировать структуру, могут быть идентифицированы на основании кристаллической структуры антитела или путем молекулярного моделирования, а эффект определенных аминокислотных остатков на стабильность антитела может быть проверен путем создания мутаций и оценки их влияния. Один из способов увеличить стабильность антитела заключается в увеличении срединной точки термоперехода (Tm), измеряемой путем дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Как правило, Tm белка имеет положительную корреляцию с его стабильностью и отрицательную корреляцию с подверженностью нарушениям третичной структуры и денатурации в растворах, а также деградации,которая также зависит от склонности белка к нарушению третичной структуры (Remmele et al.,Biopharm., 13:36-46, 2000). Ряд исследований свидетельствует о корреляции между степенью физической стабильности, измеренной как термостабильность путем ДКС, и измерениями, проведенными с помощью других способов (Gupta et al., AAPS Pharm. Sci. 5E8, 2003; Zhang et al., J Pharm. Sci. 93:3076-3089,2004; Maa et al., Int. J. Pharm., 140:155-168, 1996; Bedu-Addo et al., Pharm. Res., 21:1353-1361, 2004; Remmele et al., Pharm. Res., 15:200-208, 1997). Результаты исследований состава позволяют предположить,что Tm Fab-фрагмента влияет на долговременную физическую стабильность соответствующего mAb. Различие аминокислот каркасного фрагмента или антигенсвязывающих участков может значительно влиять на термическую стабильность домена Fab (Yasui et al., FEBS Lett. 353:143-146, 1994). Предложенные в настоящем изобретении антитела-антагонисты могут связывать TLR3 с Kd, меньшей либо равной 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 или 10-12 М. Аффинность данной молекулы к TLR3, например,- 18021512 такой как антитело, может быть определена экспериментально с помощью любого подходящего способа. Такие способы могут включать использование аппаратуры Biacore или KinExA, набора реагентов для ИФА или способов конкурентно-связывающего анализа, хорошо известных специалистам. Антитела-антагонисты, с необходимой аффинностью связывающиеся с данным гомологом TLR3,могут быть выбраны в библиотеках вариантов или фрагментов с помощью способов, основанных на созревании аффинности антитела. Антитела-антагонисты могут быть идентифицированы с помощью соответствующих способов на основе их способности ингибировать биологическую активность TLR3. Такие способы могут включать тестовую систему с геном-репортером или измерение с помощью уже известных способов производства цитокинов. Другой вариант осуществления настоящего изобретения заключается в векторе, содержащем по меньшей мере один предложенный в данном изобретении полинуклеотид. Такие векторы могут быть плазмидными, вирусными, бакуловирусными экспрессионными векторами, векторами на основе транспозонов или любыми другими векторами, пригодными для интродукции предложенных в настоящем изобретении полинуклеотидов в данный организм или в данное генетическое окружение. Другой вариант осуществления настоящего изобретения заключается в клетках-хозяевах, имеющих любой из предложенных в настоящем изобретении полинуклеотидов, кодирующих полипептид, включающий в свой состав вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38,40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 или 216, или вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209,210, 211 или 225. Другой вариант осуществления настоящего изобретения заключается в клетках-хозяевах, имеющих любой из предложенных в настоящем изобретении полинуклеотидов, кодирующих полипептид, включающий в свой состав тяжелую цепь иммуноглобулина с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 или 168, или легкую цепь иммуноглобулина с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 155,156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 167 или 227. Такими клетками-хозяевами могут быть эукариотические,бактериальные, растительные клетки или клетки архей. Как правило, используются эукариотические клетки млекопитающих, насекомых, птиц или другие клетки животного происхождения. Эукариотические клетки млекопитающих включают бессмертные клеточные линии, такие как гибридомы или клеточные линии миеломы, например, SP2/0 (Американская коллекция типовых культур (АТСС), Манассас,VA, CRL-1581), NS0 (Европейская коллекция клеточных культур (ЕСАСС), Солсбери, Уилтшир, Великобритания, ЕСАСС 85110503), FO (АТСС CRL-1646) и Ag653 (АТСС CRL-1580) - мышиные клеточные линии. Обычно используется линия клеток миеломы человека U266 (АТТС CRL-TIB-196). Другие полезные клеточные линии включают линии, полученные из яичников китайского хомячка (СНО), например, линии CHO-K1SV (Lonza Biologies, Walkersville, MD), CHO-K1 (АТСС CRL-61) или DG44. Другой вариант осуществления настоящего изобретения заключается в способе получения антител,способных реагировать с TLR3, включающем культивирование предложенных в настоящем изобретении клеток-хозяев, и отборе антител, производимых клетками-хозяевами. Способы создания и очистки антител хорошо известны специалистам в данной области. Другой вариант осуществления настоящего изобретения заключается в клеточной линии гибридомы, производящей предложенные в настоящем изобретении антитела. Еще один вариант осуществления изобретения относится к изолированному антителу или его фрагменту, при этом антитело связывается с аминокислотными остатками K416, K418, L440, N441, Е 442,Y465, N466, K467, Y468, R488, R489, А 491, K493, N515, N516, N517, Н 539, N541, S571, L595 и K619,идент.последовательности: 2 с, толл-подобного рецептора 3 (TLR3). Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к изолированному антителу или его фрагменту, при этом антитело связывается с аминокислотными остатками S115, D116, K117, А 120,K139, N140, N141, V144, K145, Т 166, Q167, V168, S188, Е 189, D192, А 195 и А 219, SEQ ID NO: 2, толлподобного рецептора 3 (TLR3). Несколько хорошо известных способов могут быть использованы для определения эпитопа антител,предложенных в настоящем изобретении. Например, в случае, когда известна структура каждого из компонентов, может быть использован анализ in silico белок-белковой стыковки с целью идентификации способных к взаимодействию участков. Может быть проведено избирательное замещение водорода дейтерием в антигене и антителе с целью определения участков антигена, способных связываться с антителом. Сегментный и точечный мутагенез, модифицирующие антиген, могут быть использованы для определения местоположения необходимых для связывания антитела аминокислот. Для таких больших белков, как TLR3, картирование путем точечного мутагенеза может быть облегчено предварительным определением участка связывания с помощью компьютерного анализа соединения белков, сегментного мутагенеза или избирательного замещения водорода дейтерием. В случае, когда известна структура каждого из компонентов, может быть использован анализ белок-белковой стыковки in silico с целью идентифика- 19021512 ции способных к взаимодействию участков. Со-кристаллическая структура комплекса антиген-антитело может использоваться для идентификации остатков, участвующих в образовании эпитопа и паратопа. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к изолированному антителу,имеющему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, или его фрагменту, при этом антитело связывается с TLR3, имеющим аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, через вариабельную область тяжелой цепи с остатками Чотиа W33, F50, D52, D54, Y56,N58, Р 61, Е 95, Y97, Y100 и D100b и вариабельную область легкой цепи с остатками Чотиа Q27, Y32,N92, Т 93, L94 и S95. Остатки Чотиа паратопа тяжелой цепи и паратопа легкой цепи соответствуют остаткам тяжелой цепи W33, F50, D52, D55, Y57, N59, Р 62, Е 99, Y101, Y104 и D106 SEQ ID NO: 216 и остаткам легкой цепи Q27, Y32, N92, Т 93, L94 и S95 SEQ ID NO: 41. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к изолированному антителу,имеющему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельнуюобласть легкой цепи, или его фрагменту, при этом антитело связывается с TLR3, имеющим аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, через вариабельную область тяжелой цепи с остатками Чотиа N31a, Q52, R52b, S53,K54, Y56, Y97, Р 98, F99 и Y100 и вариабельную область легкой цепи с остатками Чотиа G29, S30, Y31,Y32, Е 50, D51, Y91, D92 и D93. Остатки Чотиа паратопа тяжелой и легкой цепей соответствуют остаткам тяжелой цепи N32, Q54, R56, S57, K58, Y60, Y104, Р 105, F106 и Y107 SEQ ID NO: 214 и остаткам легкой цепи G28, S29, Y30, Y31, Е 49, D50, Y90, D91 и D92, SEQ ID NO: 211. Изолированные антитела, имеющие определенные остатки паратопа, связывающие TLR3, могут быть получены, например, встраиванием остатков паратопа в подходящий каркасный белок, сборкой искусственных каркасных белков в цельные антитела, экспрессией полученных антител и исследованием антител на способность к связыванию TLR3 или влияние на биологическую активность TLR3. В качестве примера каркасных белков можно привести аминокислотные последовательности вариабельных областей человеческих антител, кодируемые человеческими генами зародышевой линии. Выбор каркасного белка может основываться, например, на общей гомологии последовательности, % идентичности между остатками паратопа или идентичности канонической структуры каркасного белка и примерного антитела, например, mAb 15EVQ или mAb 12QVQ/QSV. Человеческие гены зародышевой линии описаны (см.,например, работу Tomlinson et al., J. Mol. Biol 227:776-798, и в международных базах данных ImMunoGeneTics (IMGT) (http://wwwimgtorg. Также можно использовать консенсунсные последовательности человеческих каркасных областей, как описано в патенте 6300064. Выбор подходящего каркасного белка может производиться, например, в соответствии с методами, описанными в публикации РСТ No.WO 10/045340. Примерами человеческих генов зародышевой линии, которые можно использовать для получения каркасных белков, в которые встраиваются остатки паратопа, являются гены, кодируемые V1, V3,Vh5, Vh6, J, J и Jh. J-области зародышевой линии используются полностью или частично для выбора последовательностей FR4. Например, остатки паратопа легкой цепи mAb 15EVQ могут быть встроены в каркасный участок V1, кодируемый IGKV1-3901, непосредственно соединенный с J-областью, кодируемой IGKJ1. Также могут использоваться последовательности, кодируемые другими генами V1, и последовательности FR4 других генов J могут замещать IGKJ1. Остатки паратопа тяжелой цепи mAb 15EVQ могут встраиваться в каркасный участок Vh5, кодируемый IGHV5-5101, и за ними может следовать приблизительно 11-13 остатков, например 12 остатков, составляющих HCDR3, и последовательность FR4, кодируемая IGHJ1. 11-13 Остатков могут располагаться между FR3-областью ("CAR") и началом FR4 области (WGQ в большинстве JH-областей) и включать 4 определенных остатка паратопа изmAb 15EVQ Vh. Также могут использоваться последовательности, кодируемые другими генами Vh5, и последовательности других генов Jh могут замещать IGJH1. В другом примере остатки паратопа легкой цепи mAb 12QVQ/QSV могут быть встроены в каркасный участок V3, кодируемый IGLV3-101, непосредственно соединенный с J-областью, кодируемой IGJL2. Также можно использовать последовательности, кодируемые иными генами v3 и J. Длина LCDR3 поддерживается на уровне приблизительно 911 остатков, например 10 остатков. Эти приблизительно 9-11 остатков располагаются между концом области FR3 ("YYC" в большинстве V лямбда каркасных белков) и началом области FR4 ("FGG" в большинстве областей JL) и включают 3 определенных остатка паратопа из mAb 12QVQ/QSV. Остатки паратопа тяжелой цепи mAb 12QVQ/QSV могут встраиваться в каркасный участок Vh6, кодируемый IGHV6101, и за ними может следовать приблизительно 9-11 остатков, например 10 остатков, составляющихHCDR3, и последовательность FR4, кодируемая IGJH1. Приблизительно 9-11 остатков могут располагаться между FR3-областью ("CAR") и началом FR4 области (WGQ в большинстве JH-областей) и включать 4 определенных остатка паратопа из mAb 12QVQ/QSV Vh. Последовательности FR4 других генов Jh могут замещать IGHJ1. Связывание с TLR3 и биологическую активность полученного антитела можно оценить стандартными методами. Ориентация вариабельных областей легких и тяжелых цепей mAb 15EVQ и mAb 12QVQ/QSV с генами V1, Vh5, V3, Vh6, J, J или Jh показана на фиг. 32-35. Искусственные антитела с встроенным паратопом могут быть далее модифицированы путем замены остатков зоны верньера или остатков, определяющих аффинность, для улучшения свойств антитела, например,- 20021512 аффинности, как описано выше. До тех пор пока антитело с встроенным паратопом сохраняет способность к связыванию TLR3, аминокислотная последовательность каркасного участка антитела с встроенным паратопом может быть на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательностям каркасной области mAb 15EVQ или 12QVQ/QSV. Последовательности антиген-связывающих участков могут встраиваться в дополнение к остаткам паратопов с использованием стандартных методов. Например, возможна встройка полной последовательности HCDR3 или LCDR3. Другой аспект настоящего изобретения относится к изолированным антителам или их фрагментам,способным реагировать с TLR3, которые конкурируют за связывание с TLR3 с моноклональными антителами, причем эти моноклональные антитела состоят из аминокислотных последовательностей участков 1, 2 и 3, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDR) определенных тяжелых цепей, аминокислотных последовательностей CDR 1, 2 и 3 определенных легких цепей, а также из аминокислотных последовательностей вариабельных участков определенных тяжелых цепей (VH) или аминокислотных последовательностей вариабельных участков определенных легких цепей (VL) Как правило, моноклональные антитела, представленные в настоящем изобретении, являются изолированными антителами, содержащими вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 216, и аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 41, а также антитела, содержащие аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 214,и аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи, представленную в SEQ IDNO: 211. Анализ конкуренции за связывание с TLR3 может быть проведен in vitro с помощью уже известных способов. Например, оценка связывания MSD Sulfo-Tag NHS-эфир-меченого антитела с TLR3 в присутствии немеченого антитела может быть проведена с помощью ИФА. Как правило, в настоящем изобретении используются антитела mAb 12, mAb 15 и mAb с 1811 (см. табл. 3 а). Ранее известные антитела с 1068 против TLR3 и их производные (описанные в публикации РСТ No. WO 06/060513A2), TLR3.7(eBiosciences, кат.14-9039) и Imgenex IMG-315A (Imgenex IMG-315 А; против аминокислотной последовательности 55-70, VLNLTHNQLRRLPAAN, человеческого TLR3) не конкурируют за связывание сTLR3 с mAb 12, 15 или с mAb с 1811, как показано в примере 5. Следующий аспект настоящего изобретения заключается в изолированном антителе, способном реагировать с TLR3, которое обладает по меньшей мере одним из следующих свойств:b) уменьшает биологическую активность TLR3 в анализе in vitro с использованием гена-репортераg) на 20% ингибирует поли(I:С)-индуцированную продукцию IFN-, IL-6 или IL-12 в клетках РВМС при концентрации 1 мкг/мл;h) ингибирует биологическую активность TLR3 яванского макака в анализе in vitro, с использованием гена-репортера NF-B при IC50 10 мкг/мл; илиi) ингибирует биологическую активность TLR3 яванского макака в экспериментальной системе invitro, с использованием гена-репортера ISRE при IC50 5 мкг/мл. Способы лечения Предложенные в настоящем изобретении антагонисты TLR3, например антитела-антагонистыTLR3, могут использоваться для воздействия на иммунную систему. Опуская теоретическое обоснование, авторы утверждают, что предложенные в настоящем изобретении антагонисты могут модулировать иммунную систему, предотвращая или уменьшая связывание лиганда с TLR3, димеризацию TLR3, интернационализацию TLR3 или перенос TLR3. Предложенные в настоящем изобретении способы могут быть использованы для лечения любого животного. Например, это могут быть млекопитающие, в том числе человек, грызуны, собаки, кошки и сельскохозяйственные животные. Например, представленные в настоящем изобретении антитела могут найти применение в качестве антагонистов активности TLR3 при лечении воспаления, воспалительных заболеваний и метаболических расстройств, а также в изготовлении медикаментозных препаратов для лечения указанных заболеваний, причем настоящее изобретение также предлагает предназначенную для введения дозу. Вообще, воспалительные, инфекционные или иммуноопосредованные воспалительные состояния,- 21021512 которые могут быть предотвращены или вылечены введением предложенных в настоящем изобретении антител-антагонистов TLR3, включают заболевания, опосредованные действием цитокинов или хемокинов, а также заболевания, которые целиком или частично возникают в результате активации TLR3 или сигнального пути TLR3. Примерами таких воспалительных состояний являются связанные с сепсисом состояния, воспалительные заболевания пищеварительного тракта, аутоиммунные, воспалительные и инфекционные заболевания. Также считается, что рак, сердечно-сосудистые заболевания, нарушения метаболизма, невралгические и фиброзные заболевания могут быть предотвращены или вылечены введением предложенных в настоящем изобретении антител-антагонистов TLR3. Воспаление может затрагивать одну ткань или быть системным. Как правило, поражаются ткани дыхательных путей, легкие, желудочно-кишечный тракт, тонкий и толстый кишечник, толстая кишка, прямая кишка, сердечнососудистая система, ткань сердца, кровеносные сосуды, суставы, мозг, синовиальные ткани, хрящевая ткань, эпителий, эндотелий, печень и жировая ткань. Типичными системными воспалительными состояниями являются "цитокиновый шторм" или гиперцитокинемия, синдром системной воспалительной реакции (SIRS), реакция "трансплантат против хозяина" (GVHD), острый респираторный дистресс-синдром(ARDS), тяжелый острый респираторный дистресс-синдром (SARS), тяжелые вирусные инфекции,грипп, пневмония, шок или сепсис. Воспаление является защитной реакцией организма на атаку проникающего агента. Воспаление состоит из последовательности событий, в которой участвуют многие клеточные или гуморальные медиаторы. С другой стороны, подавление воспалительных реакций может приводить к ослаблению иммунитета; тем не менее, при отсутствии контроля, воспаление может приводить к серьезным осложнениям,таким как хронические воспалительные заболевания (например, астма, псориаз, артрит, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, воспалительное заболевание пищеварительного тракта и тому подобные),септическому шоку и полиорганной недостаточности. Важно, что все эти заболевания имеют общие воспалительные медиаторы, такие как цитокины, хемокины, воспалительные клетки и другие медиаторы,секретируемые этими клетками. Активация TLR3 лигандами поли(I:С), двухцепочечной РНК или эндогенными матричными РНК ведет к активации сигнального пути, приводящего к синтезу и секреции провоспалительных цитокинов,активации и рекрутингу участвующих в воспалительной реакции клеток, таких как макрофаги, гранулоциты, нейтрофилы и эозинофилы, а также к клеточной смерти и разрушению ткани. TLR3 индуцирует секрецию IL-6, IL-8, IL-12, TNF-, MIP-1, CXCL5/IP-10 и RANTES, а также провоспалительных цитокинов и хемокинов, участвующих в привлечении и активации иммунокомпетентных клеток, приводя к разрушению ткани в случае аутоиммунных и других воспалительных заболеваний. Эндогенные матричные РНК, являющиеся лигандами TLR3, высвобождаются из некротических клеток в процессе воспаления и могут приводить к возникновению замкнутой положительной обратной связи, которая активирует TLR3,приводя к продолжению воспалительного процесса и дальнейшему разрушению ткани. АнтагонистыTLR3, такие как антитела-антагонисты TLR3, могут участвовать в нормализации секреции цитокинов,уменьшать привлечение участвующих в воспалительном процессе клеток, а также уменьшать повреждение ткани и клеточную смерть. Следовательно, антагонисты TLR3 имеют терапевтический потенциал в лечении воспаления и целого спектра воспалительных заболеваний. В качестве примера воспалительного состояния, связанного с сепсисом, можно привести синдром системной воспалительной реакции (ССВР), септический шок или синдром полиорганной недостаточности. Двухцепочечная РНК, высвобождающаяся при вирусной, бактериальной, грибковой инфекции или паразитарной инвазии, а также некротическими клетками, может способствовать развитию сепсиса. Опуская теоретическое обоснование, утверждается, что лечение антагонистами TLR3 может дать положительный терапевтический эффект, увеличив время жизни пациентов, страдающих от связанных с сепсисом воспалительных заболеваний, или предотвратив распространение местного воспалительного процесса (например, в легких) и переход воспаления в системное за счет естественной антимикробной активности, а также за счет взаимодействия с антимикробными агентами, минимизируя локальное воспаление, участвующее в развитии патологии, или за счет любой комбинации указанных эффектов. Такое вмешательство может быть достаточным для проведения необходимого для выживания пациента дополнительного лечения (например, лечения основной инфекции или уменьшения уровня цитокинов). Сепсис может исследоваться на животных моделях, например, у мышей, путем введения D-галактозамина и поли(I:С). В таких моделях D-галактозамин и гепатотоксин действуют как сенсибилизаторы при сепсисе, а поли(I:С) индуцирует сепсис, имитируя эффект двухцепочечной ДНК, и активирует TLR3. Лечение антагонистом TLR3 способно повысить выживаемость животных в экспериментах с сепсисом на мышах, следовательно, антагонисты TLR3 могут использоваться для лечения сепсиса. Воспаление желудочно-кишечного тракта является воспалением слизистой оболочки и включает острое и хроническое состояние. Острое воспаление обычно характеризуется коротким начальным периодом и инфильтрацией или притоком нейтрофилов. Хроническое воспаление обычно характеризуется относительно более длительным начальным периодом и инфильтрацией или притоком мононуклеарных клеток. Слизистая оболочка может быть слизистой оболочкой пищеварительного тракта (включая тонкий и толстый кишечник), прямой кишки, выстилающего слоя желудка или ротовой полости. Примеры хро- 22021512 нических воспалительных заболеваний включают воспалительное заболевание пищеварительного тракта,индуцированные внешними воздействиями колиты (например, воспаление ЖКТ, (например, колиты),вызванное или сопутствующее (например, в качестве побочного эффекта) терапевтическим режимам,таким как химиотерапия, радиотерапия и тому подобные), инфекционный колит, ишемический, коллагеновый или лимфоцитный колит, некротический энтероколит, колиты, вызванные другими заболеваниями, такими как хроническая грануломатозная болезнь или целиакия, пищевые аллергии, гастриты, инфекционные гастриты или энтероколиты (например, хронический гастрит, вызванный инфекцией Helicobacter pylori), а также другие формы желудочно-кишечного воспаления, вызванные инфекционным агентом. Воспалительные заболевания пищеварительного тракта включают группу хронических воспалительных заболеваний обычно неизвестной этиологии, например, язвенный колит и болезнь Крона. Клинические и экспериментальные наблюдения позволяют предположить, что патогенез воспалительных заболеваний ЖКТ основан на многих факторах, включающих генетическую предрасположенность и влияние окружающей среды. При воспалении пищеварительного тракта повреждение ткани является результатом неправильного или чрезмерного иммунного ответа на антиген или микрофлору кишечника. Существует несколько животных моделей воспалительных заболеваний пищеварительного тракта. Наиболее распространена модель колита, индуцированного введением 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты/этанола (TNBS), и модель с использованием оксазалона, который индуцирует хроническое воспаление и изъязвление прямой кишки (Neurath et al., Intern. Rev. Immunol 19:51-62, 2000). В другой модели используется декстрансульфат натрия (ДСН), который индуцирует острый колит, сопровождающийся такими симптомами, как кровавая диарея, потеря веса, сокращение прямой кишки и вызываемое инфильтрацией нейтрофилов изъязвление слизистой оболочки. ДСН-индуцированные колиты гистологически характеризуются инфильтрацией участвующих в воспалении клеток в собственную пластинку слизистой оболочки, лимфоидной гиперплазией, поражением центральной крипты и изъязвлением эпителия(Hendrickson et al., Clinical Microbiology Reviews 15:79-94, 2002). Другая модель основана на адоптивном переносе наивных CD45RB CD4 Т-клеток мышам линий RAG или SCID. В данной модели наивные Тклетки донора атакуют кишечник реципиента, вызывая хроническое воспаление пищеварительного тракта и симптомы, сходные с воспалительным заболеванием пищеварительного тракта человека (Read andPowrie, Curr. Protoc. Immunol. Chapter 15 unit 15.13, 2001). Введение предложенных в настоящем изобретении антагонистов в любую из названных моделей может быть использовано для оценки потенциальной эффективности указанных антагонистов в облегчении симптомов и изменении течения болезней, связанных с воспалительным процессом в пищеварительном тракте, например, воспалительного заболевания пищеварительного тракта. Существуют несколько возможностей лечения воспалительных заболеваний ЖКТ, например, антитела против TNF- уже в течение десятилетия используются для лечения болезни Крона (Van Assche et al., Eur. J. Pharmacol. Epub Oct 2009). Тем не менее, значительная часть пациентов невосприимчива к используемым в настоящее время способам лечения (Hanauer et al., Lancet 359:15411549, 2002; Hanauer et al., Gastroenterology 130:323-333, 2006) и, следовательно, необходима разработка новых подходов к лечению указанных пациентов. Другим примером воспалительного состояния является воспалительный процесс в легких. Типично,воспаление легких включает вызванные инфекцией заболевания легких, в том числе связанные с вирусными, бактериальными, грибковыми, паразитарными и прионовыми инфекциями; индуцированные аллергеном заболевания легких; индуцированные загрязнением окружающей среды заболевания легких,такие как асбестоз, силикоз и бериллиоз; вызванные аспирацией желудочного содержимого, а также вызванные иммунной дисрегуляцией заболевания, воспалительные заболевания, зависящие от генетической предрасположенности, такие как муковисцидоз, заболевания, индуцированные физической травмой легких, например травма при искусственной вентиляции. Указанные воспалительные заболевания также включают астму, эмфизему, бронхиты, хронические обструктивные заболевания легких (ХОЗЛ), саркоидозы, гистиоцистозы, лимфоангиоматозы, острое повреждение легких, синдром острого нарушения дыхания, хроническое заболевание легких, бронхопульмональную дисплазию, внебольничную пневмонию,госпитальную пневмонию, вызванную искусственной вентиляцией легких пневмонию, сепсис, вирусную пневмонию, инфекции вирусом гриппа, парагриппозные инфекции, инфекции ротавирусом, инфекции человеческим метапневмовирусом, респираторно-синциальные инфекции, легочный аспергиллез и другие грибковые инфекции. Как правило, связанные с инфекцией воспалительные заболевания могут включать вирусную или бактериальную пневмонию, в том числе тяжелую пневмонию, муковисцидоз,бронхит, обострения заболеваний дыхательных путей и синдром острого нарушения дыхания (СОНД). Такие связанные с инфекцией заболевания могут вовлекать множественные инфекции, такие как первичную вирусную и вторичную бактериальную инфекции. Астма является воспалительным заболеванием легких, которое характеризуется гиперчувствительностью дыхательных путей (ГДП), бронхостенозом, хрипами в легких, эозинофильным или нейтрофильным воспалением, гиперсекрецией слизи, субэпителиальным фиброзом и увеличением уровня иммуноглобулина IgE. Больные астмой испытывают "приступы", ухудшение симптомов, чаще всего вследствие инфекций респираторного тракта (например, риновирус, грипп, гемофильная палочка Haemophilus influ- 23021512enza и пр.). Астматические приступы могут провоцироваться факторами окружающей среды (например,аскариды, насекомые, животные (например, кошки, собаки, кролики, мыши, крысы, хомячки, морские свинки и птицы), грибки, загрязнение воздуха (например, табачный дым), раздражающие газы, запахи,испарения, аэрозоли, химикаты, пыльца, физические упражнения или холодный воздух). Кроме астмы некоторые хронические, поражающие легкие воспалительные заболевания характеризуются нейтрофильной инфильтрацией дыхательных путей, например хроническое обструктивное заболевание легкихet al. , Clin. Immunol. 115:268-276, 2005), а такие заболевания, как ХОЗЛ, аллергические риниты и муковисцидоз, характеризуются гиперчувствительностью дыхательных путей (Fahy and O'Byrne, Am. J.Respir. Crit. Care Med. 163:822-823, 2001). В качестве животных моделей для изучения астмы и воспаления дыхательных путей обычно используют провокацию овальбумином, а также модели, в которых сенсибилизация животного достигается введением метахолина (Hessel et al., Eur. J. Pharmacol. 293:401-412,1995). Ингибирование продукции цитокинов и хемокинов в культурах человеческих эпителиальных бронхиальных клеток, бронхиальных фибробластов или клеток гладкой мускулатуры дыхательных путей может быть использовано в качестве экспериментальных моделей in vitro. Введение предложенных в настоящем изобретении антагонистов в любую из указанных моделей может быть использовано для оценки эффективности данных антагонистов в облегчении симптомов и изменении течения астмы, воспалений дыхательных путей, ХОЗЛ и других подобных заболеваний. Другие воспалительные заболевания и нейропатии, которые могут быть предупреждены или вылечены представленными в настоящем изобретении способами, являются болезнями, вызванными аутоиммунными процессами. Эти заболевания и нейропатии включают рассеянный склероз, системную красную волчанку и нейродегенеративные заболевания и расстройства центральной нервной системы (ЦНС),например болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, биполярное аффективное расстройство и амиотрофический боковой склероз, болезни печени, например, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, неалкогольная жировая инфильтрация (жировой метаморфоз) печени/стеатогепатит, фиброз, гепатит С (HCV) и гепатит В (HBV), диабет и резистентность к инсулину, сердечно-сосудистые расстройства, например атеросклероз, церебральные кровотечения, инсульт и инфаркт миокарда, артрит, ревматоидный артрит, псориатический артрит и ювенильный ревматоидный артрит, остеопороз, остеоартрит, панкреатит, фиброз, энцефалит, псориаз, гигантоклеточный артериит, анкилозный спондилит, аутоиммунный гепатит, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), воспалительные заболевания кожи, трансплантаты, рак, аллергии, эндокринные заболевания, заживление ран, другие аутоиммунные заболевания, гиперчувствительность дыхательных путей, а также клеточные,вирусные или опосредованные прионами инфекции и заболевания. Артриты, включая остеоартрит, ревматоидный артрит, артрит, развившийся в результате повреждения суставов, и другие подобные заболевания, являются обычными воспалительными заболеваниями,лечение которых может быть улучшено за счет терапевтического использования противовоспалительных белков, таких как представленные в настоящем изобретении антагонисты. Например, ревматоидный артрит (РА) является системным заболеванием, поражающим все тело, и одной из самых часто встречающихся форм артрита. Поскольку ревматоидный артрит приводит к поражению тканей, лиганды TLR3,скорее всего, присутствуют в месте воспаления. Активация сигнального пути TLR3 может приводить к непрекращающемуся воспалению и повреждению других тканей в воспаленном суставе. Существуют животные модели для изучения ревматоидного артрита. Например, при моделировании коллагениндуцированного артрита (КИА) у мыши развивается хронический воспалительный артрит, который сильно напоминает человеческий ревматоидный артрит. Введение представленных в настоящем изобретении антагонистов TLR3 экспериментальным мышам с КИА может быть использовано для оценки применения указанных антагонистов для облегчения симптомов и изменения течения болезни. Сахарный диабет (лат. Diabetes mellitus) является многофакторным заболеванием и характеризуется гипергликемией (LeRoith et al., (eds.), Diabetes Mellitus, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa.U.S.A. 1996, а также все упомянутые в работе ссылки). Неконтролируемая гипергликемия может приводить к увеличению преждевременной смертности вследствие повышения риска микро- и макроангиопатий, включая нефропатии, нейропатии, ретинопатии, гипертензии, цереброваскулярные заболевания и ишемическую болезнь сердца. Следовательно, контроль гомеостаза глюкозы является критически важным в лечении диабета. Диабеты могут быть разделены на две большие группы, основываясь на вызывающих заболевание дефектах: диабет типа 1 (инсулинозависимый сахарный диабет, IDDM), возникающий при отсутствии в поджелудочной железе пациента производящих инсулин бета-клеток, и диабет типа 2 (инсулиннезависимый сахарный диабет, NIDDM), возникающий у пациентов с нарушением секреции инсулина бетаклетками и/или резистентностью к действию инсулина. Диабет типа 2 характеризуется устойчивостью к инсулину, сопровождаемой относительной, но не абсолютной, инсулиновой недостаточностью. У инсулин-резистентных индивидуумов секретируется аномально высокое количество инсулина, что имеет компенсаторный эффект. При недостаточном количестве инсулина для компенсации резистентности к инсулину и контроля концентрации глюкозы разви- 24021512 вается состояние нарушения толерантности к глюкозе. У значительного числа индивидуумов во время болезни секреция инсулина уменьшается и концентрация глюкозы в плазме возрастает, приводя к клиническому диабету. Связанные с жировой тканью воспаления в значительной степени связаны с развитием резистентности к инсулину, диабетом типа 2, дислипидемией и сердечно-сосудистыми заболеваниями. У страдающих ожирением пациентов макрофаги перемещаются в жировую ткань и накапливаются там,приводя к выработке провоспалительных цитокинов, таких как TNF- и IL-6, свободных жирных кислот и адипокинов, способных влиять на инсулиновый сигнальный путь и индуцировать развитие резистентности к инсулину. Активация рецепторов TLR3 на макрофагах может приводить к состоянию, способствующему воспалению в жировой ткани. Существует несколько моделей для изучения резистентности к инсулину. Например, у экспериментальных животных с алиментарным ожирением развивается гипергликемия и резистентность к инсулину, сопровождающиеся набором веса. Введение представленных в настоящем изобретении антагонистов TLR3 экспериментальным животным с алиментарным ожирением может быть использовано для оценки эффективности антагонистов для облегчения осложнений, связанных с диабетом типа 2, и изменения течения болезни. К раковым заболеваниям относятся злокачественные изменения в клетке, ткани, органе, организме,будь то животное или человек, включая, помимо прочего, такие заболевания, как лейкоз, острый лейкоз,острый лимфобластный лейкоз (лимфолейкоз) (ОЛЛ), В-лимфобластный, либо Т-лимфобластный ОЛЛ,острый мелиелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический мелиелоидный лейкоз (ХМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), волосатоклеточный лейкоз, миелодиспластический синдром (МДС), лимфома,болезнь Ходжкина (лимфогранулематоз), злокачественная лимфома, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта, множественная миелома, саркома Капоши, колоректальная карцинома, карцинома поджелудочной железы, рак почки, рак молочной железы, назофарингеальная карцинома, злокачественный гистиоцитоз, паранеопластический синдром/гиперкальциемия, связанная со злокачественным ростом, твердые (локализованные) опухоли, аденокарциномы, плоскоклеточные карциномы, саркомы, злокачественная меланома, в особенности метастатическая меланома, гемангиома, метастазирующая опухоль, связанная с раком резорбция костной ткани и связанная с раком боль. Типично, сердечно-сосудистые заболевания включают сердечно-сосудистые нарушения в клетках,ткани, органе, организме, будь то животное или человек, включая, помимо прочего, такие заболевания,как синдром внезапной смерти, инфаркт миокарда, застойная сердечная недостаточность, инсульт, ишемический инсульт, кровотечение, артериосклероз, атеросклероз, рестеноз, атеросклероз на фоне сахарного диабета, гипертензия, артериальная гипертензия, вазоренальная гипертензия, обморок, шок, сифилис сердечно-сосудистой системы, остановка сердца, легочное сердце (лат. cor pulmonale), первичная легочная гипертензия, сердечные аритмии, суправентрикулярная эктопическая систола, трепетание предсердий, мерцание предсердий (хроническое или приступообразное/пароксизмальное), реперфузионный синдром, воспалительный ответ на искусственное кровообращение, хаотическая или политопная предсердная тахикардия, тахикардия с узкими комплексами QRS, специфические аритмии, фибрилляция желудочков, аритмии, связанные с нарушением функции пучка Гиса, атриовентрикулярный блок, атриовентрикулярная блокада, ишемии миокарда, заболевания коронарной артерии, стенокардия (лат. angina pectoris), инфаркт миокарда, кардиомиопатия, дилатационная (застойная) кардиомиопатия, рестриктивная кардиомиопатия, порок сердца, эндокардит, перикардит, опухоли сердца, аневризм аорты и периферическая аневризма, расслаивающая аневризма аорты, воспаление аорты, окклюзия абдоминальной аорты и ее ответвлений, заболевания периферических кровеносных сосудов, окклюзии артериальных сосудов,атеросклероз периферических артерий, тромбоангиит (лат. thromboangiitis obliterans), функциональные расстройства периферических артерий, феномен Рейно и виброболезнь, акроцианоз, эритромелалгия,венозные заболевания, тромбоз вен, варикозное расширение вен, артериовенозная фистула, лимфедема,липедема, нестабильная стенокардия, реперфузионное повреждение, постперфузионный синдром и ишемически-реперфузионное повреждение. Типично, неврологические заболевания включают неврологические нарушения в клетках, ткани,органе, организме, будь то животное или человек, включая, помимо прочего, такие заболевания, как нейродегенеративные болезни, рассеянный склероз, мигрень, СПИД-деменция, демиелинизирующие заболевания, такие как рассеянный склероз и острый поперечный миелит; экстрапирамидный синдром и церебеллярные расстройства, такие как поражения кортико-спинальной системы; заболевания, поражающие базальные ганглии, или церебеллярные расстройства; гиперкинетические синдромы, такие как хорея Гентингтона и сенильная хорея; медикаментозные нарушения движения, такие как нарушения, вызываемые блокировкой допаминовых рецепторов; гипокинетические нарушения движения, такие как болезнь Паркинсона; прогрессирующий супрануклеарный паралич; структурные нарушения мозжечка; спиноцеребеллярные дегенерации, такие как спинальная атаксия, атаксия Фридрейха, мозжечковые кортикальные дегенерации, мультисистемные дегенерации (Менцеля, Дежерина-Тома, Ши-Драгера и МачадоДжозефа); системные расстройства (болезнь Рефсума, абеталипопротеинемия, атаксия, телеангиэктазия и митохондриальные мультисистемные расстройства); демиелинизирующие заболевания, такие как рассеянный склероз, острый поперечный миелит; и расстройства моторной функции, такие как нейрогенные мышечные атрофии (дегенерация моторных нейронов, например амиотрофический боковой склероз, дет- 25021512 ская и юношеская спинальные мышечные атрофии); болезнь Альцгеймера; синдром Дауна в зрелом возрасте; деменция с тельцами Леви; сенильная деменция с тельцами Леви; синдром Вернике-Корсакова; хронический алкоголизм; болезнь Крейтцфельда-Якоба; подострый склерозирующий лейкоэнцефалит,болезнь Галлервордена-Шпатца и деменция боксеров. Типичные фиброзные заболевания включают фиброз печени (включая, помимо прочего, такие заболевания, как вызванный алкоголем цирроз, цирроз, индуцированный вирусной инфекцией, аутоиммунный гепатит); фиброз легких (включая, помимо прочего, такие заболевания, как склеродермия, идиопатический фиброз легких); фиброз почек (включая, помимо прочего, такие заболевания, как склеродермия, вызванный диабетом нефрит, гломерулонефрит, вызванный системной красной волчанкой нефрит); фиброзы кожи (включая, помимо прочего, такие заболевания, как склеродермия, гипертрофические и келлоидные рубцы); миелофиброз; нейрофиброматоз; фиброму; фиброзные изменения кишечника и фиброзные спайки, возникающие в результате хирургического вмешательства. В этих способах фиброз может быть органоспецифическим или системным. Органоспецифический фиброз может быть связан по меньшей мере с одним из следующих заболеваний: фиброз легких, фиброз печени, фиброз почек, фиброз сердца, фиброз сосудов, фиброз кожи, фиброз глаза, фиброз костного мозга и пр. Фиброз легких может быть связан по меньшей мере с одним из следующих заболеваний: идиопатический легочный фиброз,медикаментозный легочный фиброз, астма, саркоидоз или хроническая обструктивная болезнь легких. Фиброз печени может быть связан по меньшей мере с одним из следующих заболеваний: цирроз, шистосомоз или холангит. Цирроз может быть либо алкогольным, либо возникшим после гепатита С или первичным билиарным циррозом. Холангит является склерозирующим холангитом. Фиброз почек может быть связан с диабетической нефропатией или с вызванным системной красной волчанкой гломерулосклерозом. Фиброз сердца может быть связан с инфарктом миокарда. Фиброз сосудов может быть связан с повторным сужением артерий после ангиопластии или атеросклерозом. Фиброз кожи может быть связан с возникшими в результате ожога рубцами, гипертрофическими рубцами, келлоидными рубцами или нефрогенной фиброзирующей дермопатией. Фиброз глаза может быть связан с ретро-орбитальным фиброзом, с хирургическим вмешательством при лечении катаракты или пролиферативной витреоретинопатией. Фиброз костного мозга может быть связан с идиопатическим миелофиброзом или медикаментозным миелофиброзом. Другие фиброзы могут быть выбраны из таких заболеваний, как болезнь Пейрони,контрактура Дюпюитрена (синдром) или дерматомиозит. Системные фиброзы могут быть системными склерозами или реакцией "трансплантат против хозяина". Введение/составление фармацевтических композиций"Терапевтически эффективное количество" агента, эффективного в лечении или профилактике заболевания, при котором желательна активность TLR3, может быть определено путем стандартных исследовательских способов. Например, доза агента, эффективная в лечении или профилактике воспалительных заболеваний, таких как астма, болезнь Крона, язвенных колит иди ревматоидный артрит, может быть определена введением агента в соответствующую модель, такую как представленные здесь модели. Кроме того, в случае необходимости, для оптимизации дозы могут быть использованы тестсистемы in vitro. Точное определение эффективной дозы (например, с помощью клинических испытаний) может быть осуществлено специалистами на основании нескольких факторов. Такими факторами являются подлежащее лечению или профилактике заболевание, симптомы заболевания, масса тела пациента,иммунологический статус пациента и другие известные специалистам факторы. Точная доза, предназначенная для применения в формуле композиции, зависит от способа введения препарата, а также от тяжести болезни и должна определяться на основании врачебного решения и состояния каждого пациента. Эффективная доза может быть экстраполирована исходя из кривой динамики доза-ответ, полученной в экспериментах на животных или in vitro. В представленных в настоящем изобретении способах антагонисты TLR3 могут вводиться по одному или в сочетании по меньшей мере с одной дополнительной молекулой. В качестве дополнительных молекул могут выступать другие молекулы-антагонисты TLR3 или молекулы, имеющие терапевтическое значение, не опосредованное сигнальным путем рецептора TLR3. Уменьшающие производство или активность цитокинов компаунды, состоящие из антибиотиков, противовирусных, паллиативных или прочих веществ, являются примерами таких дополнительных молекул. Для введения предназначенного для терапевтического использования агента может быть использован любой приемлемый путь введения, который обеспечивает попадание агента к пациенту. Фармацевтические композиции данных агентов являются особенно полезными при парэнтеральном введении, например, внутрикожном, внутримышечном, внутрибрюшном, внутривенном, подкожном или интраназальном. Предложенный в данном изобретении агент может быть изготовлен в виде фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество агента в качестве активного компонента вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Термин "носитель" относится к растворителям, адъювантам, связывающим веществам или среде, вместе с которыми активное соединение будет вводиться. Фармацевтическая среда может быть жидкой, как, например, вода или масла, включая масла, получаемые из нефти,масла растительного, животного или синтетического происхождения, например арахисовое, соевое, ми- 26021512 неральное, кунжутное и другие подобные масла. Например, могут быть использованы 0,4% раствор поваренной соли и 0,3% раствор глицина. Указанные растворы стерильны и обычно не содержат твердых примесей. Стерилизация проводится с использованием общепринятых, хорошо известных способов стерилизации (например, фильтрации). Композиции могут содержать принятые в фармацевтике вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, например, вещества,необходимые для контроля и изменения рН, стабилизаторы, увеличивающие плотность, увлажняющие и придающие окраску агенты и т.д. Концентрация предложенного в данном изобретении агента в таких фармацевтических формулировках может значительно варьировать, т.е. от менее чем 0,5% (обычно не менее 1%) до 15-20% от веса и определяется, в первую очередь, на основании необходимой дозы, объема, вязкости и т.д., в соответствии с выбранным способом введения. Таким образом, предложенные в настоящем изобретении фармацевтические композиции, предназначенные для внутримышечного введения, могут содержать 1 мл стерильного буферного раствора, а также приблизительно от 1 нг до 100 мг, например приблизительно от 50 нг до 30 мг, или предпочтительнее приблизительно от 5 до 25 мг предложенного в настоящем изобретении антитела-антагонистаTLR3. Сходным образом, предложенная в настоящем изобретении фармацевтическая композиция для внутривенного введения может содержать приблизительно 250 мл стерильного раствора Рингера и приблизительно от 1 до 30 мг, или предпочтительнее приблизительно от 5 до 25 мг предложенного в настоящем изобретении антагониста. Способы изготовления парэнтерально вводимых композиций хорошо известны и их детальное описание может быть найдено (см., например, в "Remington's PharmaceuticalScience", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA). Предложенные в настоящем изобретении антитела-антагонисты могут быть лиофилизированы для хранения и впоследствии перед использованием восстановлены (растворены) в подходящем носителе. Было показано, что этот способ эффективен для обычно используемых иммуноглобулинов и белковых препаратов, при этом могут быть использованы известные специалистам способы лиофилизации и восстановления. Настоящее изобретение сейчас будет охарактеризовано с помощью нижеприведенных примеров,описывающих настоящее изобретение, но не ограничивающих его. Пример 1 Идентификация и получение антагонистов mAb против huTLR3 Комбинаторная библиотека человеческих антител MorphoSys (HuCAL) Gold phage display library(Morphosys AG, Мартинсрид, Германия) использовалась в качестве источника фрагментов человеческих антител и планировалась для получения антител против очищенного антигена TLR3, полученного путем экспрессии аминокислот 1-703 человеческого TLR3 (huTLR3) (SEQ ID NO: 4) с полигистидиновым хвостом на С-конце и очистки методом аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов. Аминокислоты 1-703 соответствуют предсказанному внеклеточному домену (ECD) huTLR3.Fab-фрагменты, специфически связывающиеся с внеклеточным доменом huTRL3, выбирали путем представления белка TLR3 различными способами, чтобы идентифицировать разнородный набор фрагментов антител, секвенировали и подтверждали его уникальность. Используя различные стратегии, было отобрано 62 белка-кандидата (с различными последовательностями V-сегмента), способных связываться исключительно с внеклеточным доменом huTLR3. Эти 62 белка, идентифицированные как способные связываться исключительно с внеклеточным доменом huTLR3, были проверены на способность нейтрализовать его активность с помощью целого ряда работающих на клеточном уровне тест-систем, пригодных для анализа противовоспалительной активности. Используя предварительные показатели активности (см. далее пример 2), из 62 были отобраны четыре кандидата (Fab 16-19), определяющие семейства 16-19, в качестве исходного материала для созревания тяжелой цепи CDR2 (HCDR2) и легкой цепи CDR3 (LCDR3). Один из исходных кандидатов(кандидат 19) имел N-связанный гликозилированный участок в HCDR2; с целью избавиться от гликозилированного участка в гене, кодирующем названный белок-кандидат, была индуцирована мутация, заменяющая Ser на Ala (S на А). После созревания CDR четырех исходных кандидатов было выбрано 15 дочерних кандидатов (кандидаты 1-15) для дальнейшей характеризации, согласно описанию, приведенному ниже в примере 2. Вариабельные участки легкой и тяжелой цепей каждого из 19 кандидатов перечислены в табл. 3. Указанные кандидаты будут далее называться mAb 1-19 или Fab 1-19, в зависимости от того, являются ли они Fab-фрагментами антител или представляют собой полную клонированную последовательность антитела (пример 3). Вследствие особенности дизайна экспрессионного вектора крайними сегментами вариабельных участков зрелых антител у всех кандидатов являются QVE для тяжелой цепи иDI для легкой цепи. Предпочтительными последовательностями для указанных сегментов являются последовательности генов клеток зародышевой линии, имеющие высокую степень сходства с последовательностью кандидата. Для семейств 17 и 18 последовательность генов клеток зародышевой линии былаVH и DI для VL. Последовательность SY является уникальной для лямбда подгруппы 3, и существуют свидетельства гетерогенности S или Y в отношении конечного остатка. Таким образом, консенсунсный конец QSV из выдающейся подгруппы лямбда 1 был сочтен более подходящей заменой DIE для VL се- 27021512 мейств 17 и 18. Эти изменения были внесены в кандидаты 9, 10 и 12 из семейства 18 и кандидаты 14 и 15 из семейства 19. В этом процессе были оптимизированы кодоны областей VH и VL этих антител. Варианты N-конца аминокислотных последовательностей вариабельного участка легкой цепи, полученные из клеток зародышевой линии, которые являются вариантами кандидатов 9, 10 и 11, показаны в SEQ ID NO: 209-211, а варианты N-конца аминокислотных последовательностей вариабельного участка тяжелой цепи, полученные из клеток зародышевой линии, которые являются вариантами кандидатов 9, 10, 12, 14 и 15, показаны в SEQ ID NO: 212-216 соответственно. Варианты N-конца данных кандидатов называются в настоящем изобретении кандидат/mAb/Fab 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ или 15EVQ. Варианты N-конца, полученные из клеток зародышевой линии, экспрессированные как mAb, не оказывают влияния на связывание TLR3 или на способность антител ингибировать биологическую активностьTLR3 по сравнению с исходными белками (данные не показаны). Пример 2 Определение активности антагониста TLR3 in vitro 15 Охарактеризованных выше кандидатов с созревшим CDR были отобраны как потенциально пригодные для лечения человека, была определена эффективность связывания и способность оказывать нейтрализующий эффект на активность рецептора. Результаты исследования активности и результаты для четырех исходных Fab, Fab 16-19 и фрагментов Fab 15, содержащих созревшие CDR, Fab 1-15, либо ихV-участки, не заимствованные из клеток зародышевой линии, приводятся далее. Ингибирование сигнального каскада kNF-B и ISRE Клетки 293 Т культивировали в средах DMEM и GlutaMax (Invitrogen, Carlsbad, CA), содержащих инактивированный с помощью термического воздействия FBS, затем клетки были трансфецированы введением 30 нг pNF-B или плазмиды-репортера ISRE, содержащей ген люциферазы светлячка, 13,5 нг вектора плазмидной ДНК 3,1, 5 нг вектора phRL-TK и 1,5 нг вектора плазмидной КДНК, кодирующегоFL TLR3 (SEQ ID NO: 2). Плазмида phRL-TK содержит ген люциферазы Renilla (люцифераза коралла,Renilla reniformis), регулируемый HSV-1 промотором тимидинкиназы (Promega, Madion, WI). АнтителаTLR3 инкубировались в течение 30-60 мин перед добавлением поли(I:С) (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Планшеты инкубировались в течение 6 или 24 ч при 37 С перед добавлением люциферазного реагентаDual-Glo; последующий анализ планшет проводился с помощью прибора FLUOstar. Нормализацию значений (относительная интенсивность сигнала) получили делением RLU (интенсивность сигнала, измеренная в относительных единицах люминесценции - relative luminescence units, RLU) люциферазы светлячка на RLU коралловой люциферазы (Renilla). Путем стимуляции агентом поли(I:С), являющимся агонистом TLR3 (1 мкг/мл), добивались специфического ингибирования каскада передачи сигнала с участием NF-kB или ISRE, стимулирующего производство люциферазы светлячка, что достигалось за счет инкубации клеток с антителами против TLR3 (0,4, 2,0 и 10 мкг/мл). Результаты анализа NF-kB показаны на фиг. 1 как выраженное в процентах относительное ингибирование люцифераз Firefly/Renilla с 5465 в качестве положительного контроля (нейтрализация mAb против человеческого TLR3) и mAb против человеческого тканевого фактора (859) в качестве контроля для человеческого изотипа IgG4. 50% Ингибирование было достигнуто при концентрации mAb 0,4-10 мкг/мл. с 1068 и TLR3.7 ингибируют около 38 и 8% биологической активности TLR3 при концентрации 10 мкг/мл. Сходные результаты были получены при использовании гена-репортера ISRE (данные не показаны). Производство цитокинов клетками BEAS-2B Клетки BEAS-2B (SV-40 трансформированные нормальные человеческие клетки бронхиального эпителия) высевались на чашки, покрытые коллагеном типа 1, и, перед добавлением поли(I:С), инкубировались с антителами против человеческого TLR3 или без них. Через 24 ч после обработки собирали надосадочную жидкость и определяли содержание цитокинов и хемокинов с помощью сделанной по заказу тест-системы, основанной на гибридизации на поверхности шариков, для определения IL-6, IL-8,CCL-2/MCP-1, CCL5/RANTES и CXCL10/IP-10. Результаты показаны на фиг. 2 как % ингибирования отдельных цитокинов/хемокинов после обработки mAB, при концентрации 0,4, 2,0 и 10 мкг/мл. 5465 положительный контроль; 859 - контроль изотипа. Производство цитокинов клетками NHBE Производство цитокинов может быть также изучено в нормальных клетках человеческого эпителия(NHBE) (Lonza, Walkersville, MD). Клетки NHBE были размножены, а затем перенесены на покрытые коллагеном чашки для инкубации в течение 48 ч; после этого использованную среду удалили и добавили 0,2 мл свежей среды. Клетки инкубировались с mAb против человеческого TLR3 или без них в течение 60 мин перед добавлением поли(I:С). Спустя 24 ч надосадочную жидкость собирали и хранили при-20 С, либо анализировали на содержание IL-6. Результаты представлены графически на фиг. 3 как выраженное в процентах ингибирование секреции IL-6 в результате обработки mAb в дозах от 0,001 до 50 мкг/мл. 5465 - положительный контроль; 859 - контроль изотипа. Большинство mAb вызывали по меньшей мере 50% ингибирование выработки IL-6 при концентрации 1 мкг/мл и ингибирование до 75% при концентрации 5 мкг/мл.- 28021512 Производство цитокинов клетками РВМС Производство цитокинов также было изучено в мононулеарных клетках периферической крови человека (РВМС). Кровь, полученная от доноров, собиралась в содержащие гепарин пробирки, к которым осторожно, в качестве нижнего слоя, добавляли раствор Фиколл Пак Плюс (Ficoll-Paque Plus). Пробирки центрифугировались и клетки РВМС, формирующие белый слой непосредственно над слоем Ficoll, были собраны и высеяны на планшеты. После этого клетки РВМС культивировали с mAb против человеческого TLR3 или без них перед добавлением 25 мкг/мл поли(I:С). Через 24 ч отбирали надосадочную жидкость и определяли концентрацию цитокинов с помощью технологии Luminex. Результаты представлены на графике на фиг. 4, где показано выраженное процентное суммарное ингибирование IFN-, IL-12 и IL-6 при использовании единичной дозы mAb (0,4 мкг/мл) с 5465 в качестве положительного контроля;huIgG4 использован в качестве контроля изотипа. Производство цитокинов клетками HASM Вкратце, клетки гладкой мускулатуры дыхательных путей человека (HASM) инкубировались с mAb против человеческого TLR3 или без них, после чего к клеткам была добавлена комбинация 500 нг/мл поли(I:С) и 10 нг/мл TNF-. Спустя 24 ч супернатанты собрали и определили уровень цитокинов с помощью технологии Luminex. Результаты показаны графически на фиг. 5 в виде концентраций хемокинаCCL5/RANTES при трех дозах mAb (0,4, 2 и мкг/мл). 5465 - положительный контроль; hIgG4 - контроль изотипа. Результаты исследования клеток человека in vitro подтверждают способность предложенных в настоящем изобретении антител уменьшать производство цитокинов и хемокинов в результате связывания с huTLR3. Пример 3 Конструкции антител в полную длину Четыре исходных фрагмента Fab (кандидаты 16-19) и 15 дочерних Fab (кандидаты 1-15) тяжелых цепей были клонированы в клетках, содержащих мутацию в гене иммуноглобулина IgG4 (мутацияS229P Fc). Кандидаты 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ или 15EVQ были клонированы в клетках, содержащих мутации в гене иммуноглобулина IgG4, мутации F235A/L236A и S229P Fc. Зрелые, имеющие полную длину аминокислотные последовательности тяжелых цепей показаны в Для экспрессии эти последовательности тяжелых цепей могут включать N-концевую лидерную последовательность, например, MAWVWTLLFLMAAAQSIQA (SEQ ID NO: 103). Нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую цепь кандидатов 14EVQ и 15EVQ с лидерной последовательностью,а также зрелую форму (без лидерной последовательности), показаны в SEQ ID NO: 104 и 105 соответственно. Подобным образом, для экспрессии последовательности легкой цепи антител настоящего изобретения могут включатьN-концевую лидерную последовательность,например,MGVPTQVLGLLLLWLTDARC (SEQ ID NO: 106). Нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую цепь кандидата 15 после оптимизации кодонов с лидерной последовательностью, а также зрелую форму (без лидерной последовательности), показаны в SEQ ID NO: 107 и 108 соответственно. Пример 4 Характеристика связывания mAb против TLR3 Значения ЭК 50 при связывании mAb с внеклеточным доменом (ECD) человеческого TLR3 определяли методом ИФА. Белок ECD человеческого TLR3 разводили до 2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере