Способ индукции иммунного ответа, вакцинная композиция, ее применение и набор

СПОСОБ ИНДУКЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА, ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ И НАБОР Настоящее изобретение относится, среди прочего, к способу индукции иммунного ответа против патогена, включающему введение (1) одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида, происходящего из указанного патогена; (2) одного или более чем одного аденовирусного вектора, содержащего один или более чем один гетерологичный полинуклеотид,кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъюванта; где один или более чем один первый иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант вводят совместно. Данное изобретение также относится к вакцинам, фармацевтическим композициям, наборам и применениям с использованием указанных полипептидов, аденовирусных векторов и адъювантов. Фосс Геральд Герман (BE) Поликарпов А.В., Борисова Е.Н. (RU) Область изобретения Данное изобретение относится к новым композициям вакцин и к их применению при стимуляции иммунных ответов у млекопитающих, особенно у людей, и, конкретно, для предупреждения и лечения инфекции патогенами. Конкретно оно относится к композициям, способным индуцировать ответы Тклеток CD4+ и CD8+, а также гуморальные ответы у субъектов без обращения к сложным схемам с первичной-повторной иммунизацией. Предшествующий уровень техники Инактивированные целые организмы используют в успешной вакцинации с конца девятнадцатого столетия. Позднее использовали вакцины, включающие введение экстрактов, субъединиц, анатоксинов и капсульных полисахаридов. С момента, когда стали доступными методики генной инженерии, применение рекомбинантных белков стало предпочтительной стратегией, устраняющей многие риски, связанные с применением очищенных белков из природных источников. Ранние подходы с использованием вакцин были основаны на введении белков, которые стимулировали некоторый аспект иммунного ответа in vivo. Затем стало понятно, что иммунные ответы также могут быть индуцированы введением ДНК, которая может быть транскрибирована и транслирована хозяином в иммуногенный белок. Иммунный ответ млекопитающих имеет два ключевых компонента: гуморальный ответ и клеточноопосредованный ответ. Гуморальный ответ включает генерацию циркулирующих в крови антител, которые будут связываться с антигеном, к которому они являются специфичными, посредством этого нейтрализуя данный антиген и способствуя его последующему устранению при помощи процесса, включающего другие клетки, которые являются либо цитотоксическими, либо фагоцитарными. В-клетки ответственны за генерацию антител (плазматические В-клетки), а также за сохранение иммунологической гуморальной памяти (В-клетки памяти), т.е. способности распознавать антиген через несколько лет после его первого воздействия, например, посредством вакцинации. Клеточно-опосредованный ответ включает взаимодействие многих разных типов клеток, среди которых находятся Т-клетки. Т-клетки делят на целый ряд разных подклассов, главным образом, на Т-клетки CD4+ и CD8+. Антигенпрезентирующие клетки (АРС), такие как макрофаги и дендритные клетки, действуют как стражи иммунной системы, осуществляя скрининг организма на чужеродные антигены. Когда экстраклеточные чужеродные антигены определяются АРС, эти антигены фагоцитируются (поглощаются) внутрь АРС, где они будут переработаны в меньшие пептиды. Эти пептиды затем презентируются на молекулах главного комплекса гистосовместимости класса II (МНС II) на поверхности АРС, где они могут распознаваться антигенспецифичными Т-лимфоцитами, экспрессирующими поверхностные молекулы CD4 (Тклетки CD4+). Когда Т-клетки CD4+ распознают антиген, к которому они являются специфичными, на молекулах МНС II в присутствии дополнительных адекватных костимулирующих сигналов, они становятся активированными и секретируют ряд цитокинов, которые затем активируют другие ветви иммунной системы. В общем, Т-клетки CD4+ классифицируют на субпопуляции Т-хелперов 1 (Th1) или Тхелперов 2 (Th2), в зависимости от типа ответа, который они генерируют после распознавания антигена. При распознавании комплекса пептид-МНС II, Т-клетки CD4+ Th1 секретируют интерлейкины и цитокины, такие как интерферон-гамма, активируя, посредством этого, макрофаги к высвобождению токсичных химических веществ, таких как оксид азота и активные формы кислорода/азота. IL-2 (интерлейкин 2) и TNF-альфа (фактор некроза опухолей-альфа) также обычно классифицируются как Th1-цитокины. В отличие от этого, Т-клетки CD4+ Th2 обычно секретируют такие интерлейкины, как IL-4, IL-5 или IL-13. Другие функции Т-хелперных Т-клеток CD4+ включают обеспечение помощи при активации Вклеток для продукции и высвобождения антител. Они также могут участвовать в активации антигенспецифичных Т-клеток CD8+, другой главной субпопуляции Т-клеток, помимо Т-клеток CD4+. Т-клетки CD8+ распознают пептид, к которому они являются специфичными, когда он презентируется на поверхности клетки-хозяина молекулами главного комплекса гистосовместимости класса I (МНСI) в присутствии подходящих костимулирующих сигналов. Для того чтобы быть представленным на молекулах МНС I, чужеродный антиген должен непосредственно поступить внутрь клетки (в цитоплазму или в ядро) так, как происходит, когда вирус или внутриклеточные бактерии непосредственно проникают в клетку-хозяина, или после ДНК-вакцинации. Внутри клетки данный антиген перерабатывается на маленькие пептиды, которые будут загружаться на молекулы МНС I, которые перенаправляются на поверхность клетки. При активации Т-клетки CD8+ секретируют ряд цитокинов, таких как интерферонгамма, которые активируют макрофаги и другие клетки. Конкретно, субпопуляция этих Т-клеток CD8+ секретирует при активации литические и цитотоксические молекулы (например, гранзим, перфорин). Такие Т-клетки CD8+ называются цитотоксические Т-клетки. Совсем недавно был описан альтернативный путь презентации антигена, включающий загрузку экстраклеточных антигенов или их фрагментов на комплексы МНС I и названный "перекрестной презентацией" (cross-presentation). На природу ответа Т-клеток также влияет композиция адъюванта, использованного в вакцине. Например, было показано, что адъюванты, содержащие MPL и QS21, активируют Т-клетки CD4+ Th1 секретировать IFN-гамма (Stewart et al. Vaccine. 2006, 24 (42-43):6483-92). В то время как хорошо известно, что адъюванты имеют ценность при усилении иммунных ответов на белковые антигены, их обычно не используют в сочетании с ДНК-вакцинацией или вакцинацией на основе ДНК-векторов. Есть несколько гипотез относительно того, почему адъюванты не используют в сочетании с вакцинами на основе ДНК-векторов. В действительности интерференции между адъювантом и вектором могут иметь влияние на их стабильность. Кроме того, можно ожидать, что добавление адъюванта к ослабленному вектору могло бы повышать реактогенность, индуцированную таким продуктом. Наконец, увеличение иммуногенности вакцины на основе ДНК-вектора может приводить к усиленному нейтрализующему иммунному ответу против самого вектора, предотвращая, посредством этого, любой ревакцинаторный эффект последующих инъекций той же самой вакцины на основе вектора. На самом деле, в протоколе вакцинации, направленной на защиту против инфекции P. falciparum, Jones et al. (2001,J. Infect Diseases 183, 303-312), сообщали о вредных последствиях после объединения ДНК, рекомбинантного белка и адъюванта в виде ревакцинаторной композиции после первичной иммунизации ДНК. В самом деле, уровни паразитемии были значительно ниже в группе, в которой ревакцинаторная композиция содержала только белок и адъювант. Заключили, что применение комбинации ДНК, рекомбинантного белка и адъюванта в этом протоколе вредно влияло на результат по паразитемии, а также на гуморальные ответы. С другой стороны, сообщалось об увеличении эффективности адъювантной вакцины на основе ДНК-вектора (Ganne et al. Vaccine (1994), 12(13) 1190-1196). В частности, повышенная эффективность вакцины на основе дефектного по репликации аденовирусного вектора посредством добавления масляных адъювантов коррелировала с более высокими уровнями антител, но о влиянии на ответы Т-клетокCD4 и CD8 не сообщали. Применение непатогенного вируса в качестве адъюванта было раскрыто в WO 2007/016715. Не было упомянуто, что указанный вирус может содержать какой-либо гетерологичный полинуклеотид. Обычно считается, что для оптимального защитного иммунитета нужна стимуляция как клетокCD4+, так и CD8+, особенно при определенных заболеваниях, таких как ВИЧ инфекция/СПИД. Для того чтобы индуцировать оптимальный иммунный ответ либо профилактически, либо терапевтически, желательной является стимуляция и CD4+, и CD8+ клеток. Это является одной из главных целей стратегий вакцинации с первичной-повторной иммунизацией, при которых поочередное введение вакцин на основе белка (индуцирующих главным образом Т-клетки CD4+) с вакцинами на основе ДНК-векторов, т.е. с обнаженной ДНК, с вирусными векторами или с векторами на основе внутриклеточных бактерий, таких как листерия (индуцирующих главным образом Т-клетки CD8+) или, наоборот, вероятнее всего активирует как ответы Т-клеток CD4+, так и CD8+. Однако, несмотря на то что стратегии вакцинации с первичной-повторной иммунизацией обычно могут приводить к большему или к более сбалансированному ответу, требование вакцинировать более чем один раз и, определенно, более чем два раза может быть обременительным или даже нежизнеспособным, особенно в программах массовой иммунизации для развивающихся стран. Кроме того, как уже упоминалось выше, часто невозможно осуществлять ревакцинацию компонентом вирусного вектора из-за иммунитета, который был индуцирован против самого вектора. Таким образом, цели данного изобретения включают одно или более чем одно из следующего: (а) предоставление полного протокола вакцинации и вакцинной композиции, которая стимулирует продукцию CD4+ и/или CD8+ клеток, и/или антител, и, конкретно, которая устраняет или уменьшает необходимость повторных иммунизаций; (б) предоставление протокола вакцинации и вакцинной композиции,которая лучше стимулирует продукцию CD4+ клеток и/или CD8+ клеток, и/или антител по отношению к композициям вакцин, содержащим один иммуногенный полипептид, или один полинуклеотид, или по отношению к традиционному протоколу с первичной-повторной иммунизацией, включающему раздельное введение иммуногенного полипептида и полинуклеотида; (в) предоставление вакцинной композиции, которая стимулирует или лучше стимулирует Th1-ответы; (г) предоставление вакцинной композиции и протокола вакцинации, в которых требующиеся дозы компонентов, особенно вирусных векторов,минимизированы; и (д) в общем, предоставление полезной вакцинной композиции и протокола вакцинации для лечения или предупреждения заболеваний, вызванных патогенами. Под фразой "лучше стимулирует" подразумевается, что интенсивность и/или стойкость ответа увеличивается. Краткое изложение сущности изобретения Таким образом, согласно данному изобретению предложен способ индукции иммунного ответа против патогена, включающий введение (1) одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида, происходящего из указанного патогена; (2) одного или более чем одного аденовирусного вектора, содержащего один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъювант; где один или более чем один первый иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант вводят совместно. Согласно конкретному аспекту данного изобретения предложена вакцинная композиция, содержащая (1) один или более чем один первый иммуногенный полипептид, происходящий из патогена; (2) один или более чем один аденовирусный вектор, содержащий один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъювант. Также предложена иммуногенная композиция, содержащая (1) один или более чем один первый иммуногенный полипептид, происходящий из патогена; (2) один или более чем один аденовирусный вектор, содержащий один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъювант. Указанные вакцины и иммуногенные композиции соответственно стимулируют продукцию патогенспецифичных Т-клеток CD4+, и/или Т-клеток CD8+, и/или антител. Под "патогенспецифичными Т-клетками CD4+, и/или Т-клетками CD8+, и/или антителами" подразумеваются Т-клетки CD4+, и/или Т-клетки CD8+, и/или антитела, которые специфично распознают целый патоген или его часть (например, иммуногенную субъединицу). Под фразой "специфично распознают" подразумевается, что Т-клетки CD4+, и/или Т-клетки CD8+, и/или антитела распознают указанный патоген (или его часть) иммуноспецифичным, а не неспецифичным способом. Также предложен способ стимуляции иммунного ответа у млекопитающего, который включает введение субъекту иммунологически эффективного количества такой композиции. Также предложено применение такой композиции в изготовлении лекарственного средства для стимуляции иммунного ответа у млекопитающего. Также предложена такая композиция для применения при стимуляции иммунного ответа у млекопитающего. Также предложен способ стимуляции продукции патогенспецифичных Т-клеток CD4+, и/или Тклеток CD8+, и/или антител у млекопитающих, включающий введение указанному млекопитающему (1) одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида, происходящего из патогена; (2) одного или более чем одного аденовирусного вектора, содержащего один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъюванта; где один или более чем один первый иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант вводят совместно, например, путем введения иммунологически эффективного количества вышеуказанной композиции. Также предложено применение вышеуказанных композиций в изготовлении лекарственного средства для стимуляции продукции патогенспецифичных CD4+ и/или CD8+ клеток и/или антител у млекопитающих. Например, стимулируется продукция Т-клеток CD4+, или Т-клеток CD8+, или антител. Соответственно, стимулируется продукция 2 и особенно 3 из Т-клеток CD4+, и/или Т-клеток CD8+,и/или антител. Соответственно, стимулируется продукция Т-клеток CD8+. Соответственно, стимулируется продукция Т-клеток CD4+ и CD8+. Соответственно, стимулируется продукция Т-клеток CD4+ и CD8+ и антител. В качестве альтернативы, соответственно, стимулируется продукция Т-клеток CD4+. Соответственно, стимулируется продукция CD4+ и антител. В качестве альтернативы, соответственно, стимулируется продукция антител. Способы по данному изобретению, соответственно, предназначены для обеспечения адекватных стадий для полного способа индукции иммунного ответа (хотя при необходимости данный способ можно повторить). Следовательно, данные способы, соответственно, не включают применение примирующей дозы любого иммуногенного полипептида или полинуклеотида (например, в форме вектора, такого как аденовирусный вектор), кодирующего любой иммуногенный полипептид. Например, предложен способ индукции иммунного ответа против патогена, который состоит из стадий: (а) введения (1) одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида, происходящего из указанного патогена; (2) одного или более чем одного аденовирусного вектора, содержащего один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъюванта; где один или более чем один иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант вводят совместно; и (б) возможно повторения стадий (а). Стадии данного способа можно повторять (например, повторять один раз), если повтор дает улучшенный иммунный ответ. Адекватный ответ, по меньшей мере, насколько это касается ответа Т-клеток,может быть получен без какой-либо необходимости повторения. Также предложен способ индукции иммунного ответа против патогена, включающий (а) введение(1) одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида, происходящего из указанного патогена; (2) одного или более чем одного аденовирусного вектора, содержащего один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъюванта; где один или более чем один первый иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант вводят совместно; и где данный способ не включает введения какой-либо примирующей дозы иммуногенного полипеп-3 021391 тида или полинуклеотида, кодирующего иммуногенный полипептид. Также предложен набор, включающий (1) один или более чем один первый иммуногенный полипептид, происходящий из патогена; (2) один или более чем один аденовирусный вектор, содержащий один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъювант; и, конкретно, включающий (1) один или более чем один первый иммуногенный полипептид, происходящий из патогена, и адъювант; и 2) один или более чем один второй аденовирусный вектор, содержащий один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; для применения в способе согласно данному изобретению. Композиции и способы по изобретению могут быть полезными для предупреждения инфекции патогенами у субъектов, не подвергавшихся воздействию, или для предупреждения повторной инфекции у субъектов, которые ранее были инфицированы патогеном, или для лечения субъектов, которые были инфицированы патогеном. Краткое описание фигур На фиг. 1 показано графическое изображение конструкции плазмиды p73i-Tgrn; на фиг. 2-8 показаны результаты экспериментов, обсуждаемых в примере 1, в частности: на фиг. 2 а, 2 б, 3 а, 3 б - ответы Т-клеток CD4+ и CD8+ в ответ на повторную стимуляцию пулами пептидов, происходящих из р 24, RT, Nef и р 17, после разных протоколов иммунизации и в разные моменты времени; на фиг. 4 - гуморальные ответы против F4; на фиг. 5-8 - гуморальные ответы против F4 компонентов р 24, RT, р 17 и Nef соответственно; на фиг. 9 показаны результаты экспериментов, обсуждаемых в примере 2, в частности ответы Тклеток CD4+ в ответ на повторную стимуляцию пулами пептидов, происходящих из р 24 и RT, после разных протоколов иммунизации; на фиг. 10-12 показаны результаты экспериментов, обсуждаемых в примере 3, в частности на фиг. 10 показан лимфопролиферативный ответ РВМС (мононуклеары периферической крови) против пептидных пулов, охватывающих последовательность F4; на фиг. 11 показана динамика гуморальных ответов против F4; на фиг. 12 а и 12 б показаны гуморальные ответы (в сутки 77) против F4 компонентов р 24 и RT соответственно; на фиг. 13 показана количественная оценка ВИЧ-1-специфичных Т-клеток CD4; на фиг. 14 показано распределение частоты F4-специфичных Т-клеток CD4 через 7 суток после двух иммунизаций; на фиг. 15 показана продукция цитокинов F4-специфичными Т-клетками CD4 через 7 суток после двух иммунизаций; на фиг. 16 показана количественная оценка ВИЧ-1-специфичных Т-клеток CD8; на фиг. 17 показана продукция цитокинов F4-специфичными Т-клетками CD8 через 7 суток после двух иммунизаций; на фиг. 18 показана количественная оценка CSP-специфичных Т-клеток CD4; на фиг. 19 показана количественная оценка CSP-специфичных Т-клеток CD8; на фиг. 20 показана количественная оценка CSP(N-конец)-специфичных Т-клеток CD4; на фиг. 21 показана количественная оценка CSP(С-конец)-специфичных Т-клеток CD4; на фиг. 22 показана количественная оценка CSP(N-конец)-специфичных Т-клеток CD8; на фиг. 23 показана количественная оценка CSP(С-конец)-специфичных Т-клеток CD8; на фиг. 24 показана количественная оценка титров CSP-специфичных антител. Перечисленные выше последовательности можно использовать в виде полипептидов или полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, полезных в показательных аспектах данного изобретения. Указанные полипептиды могут состоять из или включать вышеупомянутые последовательности. Исходные остатки Met являются возможными. N-концевые His остатки (включая His остатки, следующие сразу за исходным Met, как в SEQ ID NO: 9) являются возможными, или можно использовать N-концевую His метку разной длины (например, для облегчения выделения белка обычно можно использовать вплоть до 6 His остатков). Можно использовать белки-аналоги, которые имеют значительную идентичность последовательностей, например большую чем 80%, например большую чем 90%, например большую чем 95%,например большую чем 99% идентичности последовательности по всей длине эталонной последовательности, особенно когда белок-аналог имеет сходную функцию, и, конкретно, когда белок-аналог является аналогично иммуногенным. Например, может быть приемлемым вплоть до 20, например вплоть до 10,например 1-5 замен (например, консервативных замен). Можно использовать нуклеиновые кислоты, которые отличаются от нуклеиновых кислот, перечисленных выше, которые кодируют те же самые белки или вышеупомянутые белки-аналоги. Идентичность последовательности можно определять традиционными способами, например, с использованием BLAST. В одном конкретном варианте SEQ ID NO: 16,который можно упомянуть, остаток 398 представляет собой Ser, а не Cys. Подробное описание изобретения При использовании здесь термин "совместно" означает, когда один или более чем один иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант вводят в пределах периода не более чем 12 ч, например в пределах периода не более чем 1 ч, типично за один раз, например, во время одного визита к медицинскому работнику, например, один или более чем один иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант вводят последовательно или одновременно. Термин "эпитоп" при использовании здесь относится к иммуногенной аминокислотной последовательности. Эпитоп может относиться к минимальной аминокислотной последовательности типично из 68 аминокислот, причем минимальная последовательность является иммуногенной при удалении из ее природного контекста, например, при трансплантации в гетерологичный полипептид. Эпитоп также может относиться к той части белка, которая является иммуногенной, где полипептид, содержащий эпитоп,именуется антигеном (или иногда "полипептидным антигеном"). Полипептид или антиген могут содержать один или более чем один (например, 2, или 3, или более) отличный эпитоп. Термин "эпитоп" охватывает В-клеточные и Т-клеточные эпитопы. Термин "Т-клеточный эпитоп" охватывает Т-клеточные эпитопы CD4+ и Т-клеточные эпитопы CD8+ (иногда также именуемые эпитопы CTL). Термин "иммуногенный полипептид" относится к полипептиду, который является иммуногенным,-5 021391 т.е. он способен вызывать иммунный ответ у млекопитающего и, следовательно, содержит один или более чем один эпитоп (например, Т-клеточные и/или В-клеточные эпитопы). Иммуногенные полипептиды могут содержать один или более чем один полипептидный антиген, например, в неестественном расположении как, например, в слитом белке. Иммуногенные полипептиды типично будут рекомбинантными белками, продуцируемыми, например, экспрессией в гетерологичном хозяине, таком как бактериальный хозяин, в дрожжах или в культивируемых клетках млекопитающих. Термин "полипептид, происходящий из патогена" означает полипептид, который частично или полностью содержит последовательности (т.е. антигены), которые встречаются в природе у патогенов или несут высокую степень идентичности последовательностей с ними (например, более чем 95%-ная идентичность на отрезке из по меньшей мере 10, например из по меньшей мере 20 аминокислот). Иммуногенные полипептиды могут содержать один или более чем один (например, 1, 2, 3 или 4) полипептидных антигена. Если не определено иначе, "иммунный ответ" может быть клеточным и/или гуморальным ответом. В одном воплощении данного изобретения один или более чем один из указанного одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида является, по существу, тем же самым, что и один или более чем один из указанного одного или более чем одного второго иммуногенного полипептида. Например, один из по меньшей мере одного первого иммуногенного полипептида и один из по меньшей мере одного второго иммуногенного полипептида может иметь общую идентичность последовательности 90% или более, например 95% или более, например 98% или 99% или более по длине одного или другого иммуногенного полипептида. В другом воплощении данного изобретения один или более чем один из указанного одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида содержит по меньшей мере один антиген, который,по существу, является тем же самым, что и антиген, содержащийся в одном или более чем одном из указанного одного или более чем одного второго иммуногенного полипептида. Например, один из по меньшей мере одного первого иммуногенного полипептида и один из по меньшей мере одного второго иммуногенного полипептида может иметь общую идентичность последовательности 90% или более, например 95% или более, например 98 или 99% или более по длине отрезка из 20 аминокислот или более, например из 40 аминокислот или более, например из 60 аминокислот или более. Соответственно, один или более чем один первый иммуногенный полипептид содержит по меньшей мере один Т-клеточный эпитоп. Соответственно, один или более чем один второй иммуногенный полипептид содержит по меньшей мере один Т-клеточный эпитоп. Соответственно, один или более чем один первый иммуногенный полипептид содержит по меньшей мере один В-клеточный эпитоп. Соответственно, один или более чем один второй иммуногенный полипептид содержит по меньшей мере один В-клеточный эпитоп. В другом воплощении данного изобретения один или более чем один из указанного одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида и один или более чем один из указанного одного или более чем одного второго иммуногенного полипептида имеют один или более чем один идентичный В-клеточный и/или Т-клеточный эпитоп. Соответственно, они имеют одну или более чем одну идентичную аминокислотную последовательность длиной 10 аминокислот или более, например 15 аминокислот или более, например 25 аминокислот или более. В другом воплощении данного изобретения ни один из одного или более чем одного из указанного одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида не является, по существу, тем же самым или не содержит какой-либо общий антиген с одним или более чем одним из указанного одного или более чем одного второго иммуногенного полипептида, например, они могут иметь общую идентичность последовательности менее чем 90% на отрезке из 20 аминокислот или более, например из 40 аминокислот или более, например из 60 аминокислот или более. Таким образом, они могут не иметь каких-либо общих В-клеточных или Т-клеточных эпитопов. Например, они могут не иметь каких-либо общих идентичных аминокислотных последовательностей длиной 10 аминокислот или более, например 15 аминокислот или более, например 25 аминокислот или более. В одном конкретном воплощении данного изобретения первый иммуногенный полипептид и второй иммуногенный полипептид содержат те же самые антигены в том же самом расположении или в другом расположении (например, в другом расположении). Под "другим расположением" подразумевается, что они могут располагаться в другом порядке и/или то, что они могут быть разделены. В другом конкретном воплощении данного изобретения первый иммуногенный полипептид и второй иммуногенный полипептид являются одинаковыми. Композиция согласно данному изобретению может содержать один первый иммуногенный полипептид в качестве единственного иммуногенного полипептида в композиции. В качестве альтернативы,композиция согласно данному изобретению может содержать более чем один первый иммуногенный полипептид, например 2, или 3, или 4, или более иммуногенных полипептидов. Композиция согласно данному изобретению может содержать один аденовирусный вектор. В качестве альтернативы, она может содержать более чем один аденовирусный вектор, например 2 аденовирусных вектора. В композициях согласно данному изобретению аденовирусный вектор может содержать гетерологичный полинуклеотид, который кодирует один второй иммуногенный полипептид, или он может содержать более чем один гетерологичный полинуклеотид, которые вместе кодируют более чем один второй иммуногенный полипептид под контролем более чем одного промотора. Так же как и для профилактической вакцинации, композиции по данному изобретению также можно использовать у индивидуумов, которые уже инфицированы патогеном, и они будут приводить к улучшенному иммунологическому контролю установившейся инфекции. Это особенно интересно, когда патогеном является ВИЧ (вирус иммунодефицита человека). В случае ВИЧ считается, что этот контроль достигается CD8-позитивными Т-клетками, которые специфически распознают ВИЧ-инфицированные клетки. Такой ответ CD8-позитивных Т-клеток поддерживается присутствием ВИЧ-специфичных CD4 позитивных клеток Т-хелперов. Следовательно, индукция обоих типов иммунного ответа является особенно полезной и может достигаться путем объединения разных композиций вакцины. Комбинация адъювантного белка и рекомбинантного аденовируса является особенно интересной. ВИЧ-инфицированные пациенты, которые будут получать пользу от вышеописанной вакцинации, находятся во время вакцинации или в состоянии первичной инфекции, в латентной, или конечной фазе ВИЧ-инфекции. Во время вакцинации данные пациенты могут подвергаться или могут не подвергаться другим вмешательствам терапевтического лечения против патогена (в случае ВИЧ - например, высокоактивной антиретровирусной терапии). Антигены. Полезные антигены согласно данному изобретению происходят из патогенов. Патогены включают вирусы, бактерии, простейшие и другие паразитические организмы, вредные для млекопитающих, включая человека. Подходящие полипептидные антигены, подлежащие введению в виде полипептида или полинуклеотида, кодирующего полипептид согласно данному изобретению, включают антигены, происходящие из ВИЧ (например, HIV-1), вирусов герпеса человека (такие как gH, gL, gM, gB, gC, gK, gE или gD, или их производные, или предранний белок, такой как ICP27, ICP47, ICP4, ICP36 из HSV1 или HSV2), цитомегаловируса, особенно человеческого (такой как gB или их производные), вируса Эпштейна-Барр (такой как gp350 или его производные), вируса ветряной оспы (такой как gpI, II, III и IE63) или из вируса гепатита, такого как вирус гепатита В (например, антиген поверхности гепатита В, PreS1, PreS2 и поверхностные белки оболочки, коровый антиген гепатита В или pol), вирус гепатита С (например, кор, Е 1,Е 2, Р 7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и В) и антиген вируса гепатита Е, или из других вирусных патогенов, таких как парамиксовирусы: респираторно-синцитиальный вирус (такие как белки F и G и их производные), или антигены из вируса парагриппа, вируса кори, вируса свинки, вирусов человеческой папилломы (например, HPV6, 11, 16, 18, например L1, L2, Е 1, Е 2, Е 3, Е 4, Е 5, Е 6, Е 7), флавивирусов (например,вирус желтой лихорадки, вирус денге, вирус клещевого энцефалита, вирус японского энцефалита) или вируса гриппа (такой как гемагглютинин, нуклеопротеин, белки NA или М, или их комбинации), или антигены, происходящие из бактериальных патогенов, таких как виды рода Neisseria, включая N. gonorrhea и N. meningitidis, например трансферринсвязывающие белки, лактоферринсвязывающие белки, PilC,адгезины); S. pyogenes (например, М белки или их фрагменты, протеиназа С 5 А), S. agalactiae, S. mutans;H. ducreyi; виды рода Moraxella, включая М. catarrhalis, также известная как Branhamella catarrhalis (например, адгезины и инвазины с высокой и низкой молекулярной массой); виды рода Bordetella, включая В. pertussis (например, пертактин, коклюшный токсин или его производные, нитчатый гемагглютинин,аденилатциклаза, фимбрии), В. parapertussis и В. bronchiseptica; виды рода Mycobacterium, включая М.tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; виды рода Legionella, включая L. pneumophila; виды рода Escherichia, включая энтеротоксическую Е.coli (например, факторы колонизации, термолабильный токсин или его производные, термостабильный токсин или его производные),энтерогеморрагическую Е.coli, энтеропатогенную Е.coli (например, шигаподобный токсин или его производные); виды рода Vibrio, включая V. cholera (например, холерный токсин или его производные); виды рода Shigella, включая S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; виды рода Yersinia, включая Y. enterocolitica (например, белок Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; виды рода Campylobacter, включая С. jejuniaeruginosa; виды рода Staphylococcus, включая S. aureus, S. epidermidis; виды рода Enterococcus, включая Е. faecalis, E. faecium; виды рода Clostridium, включая С. tetani (например, столбнячный токсин и его производное), С. botulinum (например, ботулотоксин и его производное), С. difficile (например, токсины А или В клостридий или их производные); виды рода Bacillus, включая В. anthracis (например, ботулотоксин и его производные); виды рода Corynebacterium, включая С. diphtheriae (например, дифтерийный токсин и его производные); виды рода Borrelia, включая В. burgdorferi (например, OspA, OspC, DbpA,DbpB), В. garinii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB),B. andersonii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; виды рода Ehrlichia, включая Е. equi и агент человеческого гранулоцитарного эрлихиоза; виды рода Rickettsia, включая R. rickettsii; виды родаChlamydia, включая С. trachomatis, С. pneumoniae, С. psittaci; виды рода Leptospira, включая L. interrogans; виды рода Treponema, включая Т. pallidum (например, редкие белки наружной мембраны), Т. denticola, Т. hyodysenteriae; или происходящие из паразитов, таких как виды рода Plasmoium, включая P. falciparum и P. vivax; виды рода Toxoplasma, включая T. gondii (например, SAG2, SAG3, Tg34); виды родаPneumocystis, включая P. carinii; виды рода Trichomonas, включая Т. vaginalis; виды рода Schisostoma,включая S. mansoni, или происходящие из дрожжей, таких как виды рода Candida, включая С. albicans; виды рода Cryptococcus, включая С. neoformans. Дополнительные бактериальные антигены включают антигены, происходящие из видов рода Streptococcus, включая S. pneumoniae (PsaA, PspA, стрептолизин, холинсвязывающие белки) и белковый антиген пневмолизин (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342) и его мутантные детоксифицированные производные (WO 90/06951; WO 99/03884). Другие бактериальные антигены включают антигены, происходящие из видов рода Haemophilus, включая Н. influenzae типа В (например, PRP и его конъюгаты), нетипируемый Н. influenzae, например, ОМР 26, высокомолекулярные адгезины, Р 5, Р 6, белок D и липопротеин D, фимбрин и пептиды, происходящие из фимбрина (US 5843464), или их варианты с множественными копиями или слитые белки. Конкретно способы или композиции по настоящему изобретению можно использовать для защиты против или для лечения вирусных расстройств, таких как расстройства, вызванные вирусом гепатита В,вирусом гепатита С, вирусом папилломы человека, вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), или вирусом герпеса; бактериальных заболеваний, таких как заболевания, вызванные Mycobacterium tuberculosis(ТВ) или видами рода Chlamydia; и протозойных инфекций, таких как малярия. Следует понимать, что на эти конкретные болезненные состояния, патогены и антигены ссылались только в качестве примера, и они не предназначены для того, чтобы ограничивать объем настоящего изобретения. Антигены ТВ (туберкулез). Патогеном может быть, например, Mycobacterium tuberculosis. Типичными антигенами, происходящими из М. tuberculosis, являются, например, альфа-кристаллин(HspX), HBHA, Rv1753, Rv2386, Rv2707, Rv2557, Rv2558, RPF: Rv0837c, Rv1884c, Rv2389c, Rv2450,Rv1009, aceA (Rv0467), ESAT6, Tb38-1, Ag85A, -В или -С, MPT 44, MPT59, MPT45, HSP10, HSP65,HSP70, HSP75, HSP90, PPD 19 кДа [Rv3763], PPD, 38 кДа [Rv0934], PstS1, (Rv0932), SodA (Rv3846),Rv2031c, 16 кДа, Ra12, TbH9, Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, DPPD, mTCC1, mTCC2, hTCC1 (WO 99/51748) и hTCC2 и особенно Mtb32a, Ra35, Ra12, DPV, MSL, MTI, Tb38-1, mTCC1, TbH9 (Mtb39a),hTCC1, mTCC2 и DPPD. Антигены, происходящие из М. tuberculosis, также включают слитые белки и их варианты, где по меньшей мере два или, например, три полипептида М. tuberculosis слиты в больший белок. Такие слияния могут содержать или состоять из Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTIMSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI(WO 99/51748), Ra12-Tbh9-Ra35-Ag85B и Ra12-Tbh9-Ra35-mTCC2. Конкретно последовательность Ra12Tbh9-Ra35, которую можно упомянуть, определена SEQ ID NO: 6 WO 2006/117240, вместе с вариантами,в которых Ser 704 этой последовательности мутирован до другой аминокислоты, чем серин, например, доAla, и их производными, включающими N-концевую His метку подходящей длины (например, SEQ IDNO: 2 или 4 WO 2006/117240). См. также SEQ ID NO: 10, которая представляет собой последовательность, содержащую возможный исходный М и возможную N-концевую His-His метку (положения 2 и 3),и в которой в положении 706 находится мутированный Ala по сравнению с Ser дикого типа. Антигены Chlamydia. Патогеном могут быть, например, виды рода Chlamydia, например С. trachomatis. Типичные антигены, происходящие из видов рода Chlamydia, например из С. trachomatis, выбраны из СТ 858, СТ 089, СТ 875, МОМР, СТ 622, PmpD, PmpG и их фрагментов, SWIB и иммуногенных фрагментов любого из них (таких как PmdDpd и PmdGpd) и из их комбинаций. Предпочтительные комбинации антигенов включают СТ 858, СТ 089 и СТ 875. Конкретные последовательности и комбинации, которые можно использовать, описаны в WO 2006/104890. Антигены Plasmodium. Патогеном может быть, например, паразит, который вызывает малярию, такой как Plasmodium sp,например P. falciparum или P. vivax. Например, антигены, происходящие из P. falciparum, включают белок циркумспорозоита (белокCS), PfEMP-1, антиген Pfs 16, MSP-1, MSP-3, LSA-1, LSA-3, АМА-1 и TRAP. Конкретным гибридным антигеном, который можно упомянуть, является RTS. RTS представляет собой гибридный белок, содержащий, по существу, всю С-концевую часть белка циркумспорозоита (CS) P. falciparum, связанную через четыре аминокислоты части preS2 антигена поверхности (вируса) гепатита В с антигеном поверхности(S) вируса гепатита В. При экспрессии в дрожжах RTS продуцируется в виде частицы липопротеина, и,когда он коэкспрессируется с антигеном S HBV (вирус гепатита В), он продуцирует смешанную частицу,известную как RTS,S. Структура RTS и RTS,S раскрыта в WO 93/10152. Антигены TRAP описаны в WO 90/01496. Другие антигены Plasmodium включают ЕВА, GLURP, RAP1, RAP2, секвестрин, Pf332,STARP, SALSA, PfEXPI, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230 P. falciparum и их аналоги в других видах рода Plasmodium. Одним воплощением настоящего изобретения является композиция, содержащаяRTS,S или белок CS, или его фрагмент, такой как CS часть RTS,S в комбинации с одним или более чем одним другим малярийным антигеном, который может быть выбран, например, из группы, состоящей изMSP-1, MSP-3, АМА-1, Pfs 16, LSA-1 или LSA-3. Возможные антигены из P. vivax включают белок циркумспорозоита (белок CS) и белок, связывающий антиген Даффи (Duffy), и их иммуногенные фрагменты, такие как PvRII (см., например, WO 02/12292). Таким образом, в одном подходящем воплощении данного изобретения первый и второй иммуногенные полипептиды выбраны из антигенов, происходящих из Plasmodium falciparum и/или из Plasmodium vivax. Например, первый и/или второй иммуногенные полипептиды, выбранные из антигенов, происходящих из Plasmodium falciparum и/или Plasmodium vivax, выбраны из RTS (например, в виде RTS,S), белка циркумспорозоита (CS), MSP-1, MSP-3, АМА-1, LSA-1, LSA-3 и из их иммуногенных производных или их иммуногенных фрагментов. Одним конкретным производным, которое можно упомянуть, является гибридный белок, известный как RTS, особенно когда он представлен в форме смешанной частицы, известной как RTS,S. Типичная последовательность RTS показана в SEQ ID NO: 14. Типичный антиген, происходящий из белка CS P. falciparum, показан в SEQ ID NO: 12. Эта конкретная последовательность соответствует последовательности CSP P. falciparum (штамм 3D7), которая также содержит вставку из 19 аминокислот, происходящую из штамма 7G8 (81-100). В одном конкретном воплощении данного изобретения первый иммуногенный полипептид представляет собой RTS,S, и второй иммуногенный полипептид представляет собой белок CS из Plasmodiumfalciparum или его иммуногенный фрагмент. Антигены HPV (вирус папилломы человека). Патогеном может быть, например, вирус папилломы человека. Таким образом, антигены, полезные в настоящем изобретении, например, могут происходить из вируса папилломы человека (HPV), который, как считается, отвечает за остроконечные бородавки (HPV 6 или HPV 11 и другие), и/или из вирусов HPV, ответственных за рак шейки матки (HPV16, HPV18,HPV33, HPV51, HPV56, HPV31, HPV45, HPV58, HPV52 и другие). В одном воплощении формы профилактических или терапевтических композиций против остроконечных бородавок содержат частицы L1 или капсомеры и слитые белки, содержащие один или более чем один антиген, выбранные из белковHPV Е 1, Е 2, Е 5, Е 6, Е 7, L1 и L2. В одном воплощении формами слитого белка являются: L2E7, как раскрыто в WO 96/26277, и белок D (1/3)-Е 7, раскрытый в РСТ/ЕР 98/05285. Предпочтительные профилактические или терапевтические композиции против инфекции или рака шейки матки, вызванных HPV, могут содержать антигены HPV 16 или 18. Например, мономеры антигенов L1 или L2, или антигены L1 или L2, присутствующие вместе в виде вирусоподобной частицы (VLP),или один белок L1, присутствующий один в VLP, или в структуре капсомера. Такие антигены, вирусоподобные частицы и капсомер известны как таковые. См., например, WO 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 и WO 93/02184. Могут быть включены дополнительные ранние белки, одни или в виде слитых белков, такие как, например, Е 7, Е 2 или предпочтительно Е 5; особенно предпочтительное воплощение этого включает VLP, содержащую слитые белки L1E7 (WO 96/11272). В одном воплощении антигеныHPV 16 содержат ранние белки Е 6 или Е 7 в слиянии с белком-носителем D с образованием белок D-E6 или -Е 7 слияний из HPV 16 или их комбинации; или комбинации Е 6 или Е 7 с L2 (WO 96/26277). В качестве альтернативы ранние белки Е 6 или Е 7 HPV 16 или 18 могут быть представлены в одной молекуле,предпочтительно в слиянии белок D-E6/E7. Такая композиция возможно может давать один из или оба белка Е 6 и Е 7 из HPV 18, предпочтительно в форме слитого белка белок D-E6 или белок D-E7 или слитого белка белок D E6/E7. Дополнительно можно использовать антигены из других штаммов HPV, предпочтительно из штаммов HPV 31 или 33. Антигены ВИЧ. Патогеном может быть, например, ВИЧ, например ВИЧ-1. Таким образом, антигены могут быть выбраны из антигенов, происходящих из ВИЧ, конкретно из антигенов, происходящих из ВИЧ-1. Белки Tat и Nef ВИЧ представляют собой ранние белки, т.е. они экспрессируются рано при инфекции и в отсутствие структурных белков. Ген Nef кодирует ранний вспомогательный белок ВИЧ, который, как было показано, обладает несколькими активностями. Например, известно, что белок Nef вызывает удаление CD4, рецептора ВИЧ, с поверхности клетки, хотя биологическая значимость этой функции обсуждается. Дополнительно Nef взаимодействует с сигнальным путем Т-клеток и индуцирует активное состояние, которое, в свою очередь, может стимулировать более эффективную экспрессию генов. Некоторые изоляты ВИЧ имеют мутации или делеции в этой области, которые являются причиной того, что эти изоляты не кодируют функциональный белок и имеют серьезные нарушения в своей репликации и патогенезе in vivo. Ген Gag транслируется в полноразмерную РНК с образованием полибелка-предшественника, который затем расщепляется на 3-5 капсидных белков; белок матрикса р 17, капсидный белок р 24 и белок,связывающий нуклеиновые кислоты (Fundamental Virology, Fields B.N., Knipe D.M. and Howley M. 1996,2. Fields Virology, vol. 2, 1996). Ген Gag приводит к образованию белка-предшественника Gag в 55 килодальтон (кДа), также именуемого р 55, который экспрессируется на вирусной мРНК, не подвергавшейся сплайсингу. Во время трансляции N-конец р 55 миристоилируется, запуская его ассоциацию с цитоплазматической стороной клеточных мембран. Ассоциированный с мембраной полибелок Gag рекрутирует две копии вирусной геномной РНК, наряду с другими вирусными и клеточными белками, которые запускают отпочковывание вирусной частицы от поверхности инфицированной клетки. После отпочковывания, на протяжении процесса созревания вируса, р 55 расщепляется протеиназой, кодируемой вирусом (продукт гена Pol), на четыре меньших белка, обозначенных МА (матриксный [р 17]), СА (капсидный [р 24]), NC (нуклеокапсидный [р 9]) и р 6.(4). Помимо 3 главных Gag белков (р 17, р 24 и р 9) все предшественники Gag содержат несколько других областей, которые вырезаются и сохраняются в вирионе в виде пептидов разных размеров. Эти белки имеют разные назначения, например, белок р 2 имеет предполагаемую роль в регуляции активности протеиназы и способствует правильному временному паттерну протеолитического процессинга. Полипептид МА происходит из N-концевого миристоилированного конца р 55. Большинство молекул МА остаются прикрепленными к внутренней поверхности липидного бислоя вириона, стабилизируя частицу. Подгруппа МА рекрутируется внутрь более глубоких слоев вириона, где она становится частью комплекса, который экскортирует вирусную ДНК в ядро. Эти молекулы МА облегчают ядерный транспорт вирусного генома, так как кариофильный сигнал МА распознается клеточным механизмом ядерного импорта. Этот феномен позволяет ВИЧ инфицировать неделящиеся клетки, что является необычным свойством для ретровируса. Белок р 24 (СА) образует конический кор вирусных частиц. Было продемонстрировано, что циклофилин А взаимодействует с областью р 24 р 55, приводя к его включению в частицы ВИЧ. Взаимодействие между Gag и циклофилином А является существенным, так как нарушение этого взаимодействия циклоспорином ингибирует репликацию вируса. Область NC Gag отвечает за специфическое распознавание так называемого упаковочного сигнала ВИЧ. Данный упаковочный сигнал состоит из четырех структур типа "стебель-петля", расположенных около 5'-конца вирусной РНК, и является достаточным для опосредования включения гетерологичной РНК в вирионы ВИЧ-1. NC связывается с упаковочным сигналом посредством взаимодействий, опосредованных двумя мотивами цинковых пальцев. NC также облегчает обратную транскрипцию. Полипептидная область р 6 опосредует взаимодействия между р 55 Gag и вспомогательным белкомVpr, приводя к включению Vpr в собирающиеся вирионы. Область р 6 также содержит так называемый поздний домен, который требуется для эффективного высвобождения отпочковывающихся вирионов из инфицированной клетки. Ген Pol кодирует три белка, имеющих активности, нужные вирусу при ранней инфекции, обратную транскриптазу RT, протеиназу и интегразный белок, необходимый для интеграции вирусной ДНК в клеточную ДНК. Первичный продукт Pol отщепляется протеиназой вириона с образованием аминоконцевого пептида RT, который содержит активности, необходимые для синтеза ДНК (РНК- и ДНКнаправленная ДНК-полимераза, рибонуклеаза Н), и карбоксиконцевого интегразного белка. RT ВИЧ представляет собой гетеродимер полноразмерной RT (р 66) и продукта расщепления (р 51), не имеющего карбоксиконцевого домена РНКазы Н.RT является одним из наиболее высококонсервативных белков, кодируемых ретровирусным геномом. Двумя главными активностями RT являются (активности) ДНК Pol и рибонуклеазы Н. Активность ДНК Pol RT взаимозаменяемо использует РНК и ДНК в качестве матриц и, подобно всем известным ДНК-полимеразам, не способна инициировать синтез ДНК de novo, но требует того, чтобы заранее существующая молекула служила в качестве праймера (РНК). Активность РНКазы Н, присущая всем белкам RT, играет существенную роль в ранний момент времени при репликации, удаляя РНК геном по мере продолжения синтеза ДНК. Она селективно деградирует РНК из всех гибридных молекул РНК-ДНК. Структурно полимераза и рибо Н занимают раздельные, неперекрывающиеся домены в Pol, охватывающие две трети аминоконца Pol. Каталитическая субъединица р 66 складывается в 5 различных субдоменов. Их 23 аминоконцевые(аминокислоты) имеют часть с активностью RT. Ближе к карбоксиконцу по отношению к ним находится домен РНКазы Н. После инфекции клетки-хозяина ретровирусная геномная РНК копируется в линейную двухцепочечную ДНК обратной транскриптазой, которая присутствует в инфекционной частице. Интеграза (рас- 10021391 смотренная в Skalka AM '99 Adv in Virus Res 52, 271-273) распознает концы вирусной ДНК, подрезает их и сопровождает вирусную ДНК к сайту на хромосоме хозяина для того, чтобы катализировать интеграцию. Многие сайты в ДНК хозяина могут быть мишенями для интеграции. Несмотря на то что интеграза достаточна для катализа интеграции in vitro, она является не единственным белком, связанным с вирусной ДНК in vivo - большой комплекс белок-вирусная ДНК, выделенный из инфицированных клеток, был обозначен как прединтеграционный комплекс. Он облегчает захват генов клетки-хозяина потомством вирусных геномов. Интеграза составлена из 3 отличных доменов, N-концевого домена, каталитического кора и Сконцевого домена. Каталитический коровый домен содержит все требующееся для химии полинуклеотидильного переноса. Антигены, происходящие из ВИЧ-1, для применения в данном изобретении, таким образом, могут,например, быть выбраны из Gag (например, полноразмерного Gag), p17 (части Gag), p24 (другой частиGag), р 41, р 40, Pol (например, полноразмерная Pol), RT (часть Pol), p51 (часть Pol), интегразы (часть Pol),протеиназы (часть Pol), Env, gp120, gp140 или gp160, gp41, Nef, Vif, Vpr, Vpu, Rev, Tat и их иммуногенных производных и их иммуногенных фрагментов, конкретно Env, Gag, Nef и Pol и их иммуногенный производных и их иммуногенных фрагментов, включая р 17, р 24, RT и интегразу. Вакцины против ВИЧ могут содержать полипептиды и/или полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, соответствующие многим разным антигенам ВИЧ, например 2, или 3, или 4, или более антигенам ВИЧ, которые можно выбрать из списка, приведенного выше. Несколько разных антигенов, например, могут содержаться в одном слитом белке. Можно использовать более чем один первый иммуногенный полипептид и/или более чем один второй иммуногенный полипептид, каждый из которых представляет собой антиген ВИЧ или слияние более чем одного антигена. Например, антиген может содержать Gag или его иммуногенное производное, или иммуногенный фрагмент, слитый с RT, или его иммуногенное производное, или иммуногенный фрагмент, слитый с Nef,или его иммуногенное производное, или иммуногенный фрагмент, где Gag часть слитого белка присутствует на 5'-конце полипептида. Последовательность Gag, полезная согласно данному изобретению, может исключать последовательность, кодирующую полипептид р 6 Gag. Конкретный пример последовательности Gag для применения в данном изобретении содержит последовательности, кодирующие р 17 и/или р 24. Последовательность RT может содержать мутацию для того, чтобы, по существу, инактивировать любую активность обратной транскриптазы (см. WO 03/025003). Ген RT является компонентом большего гена pol в геноме ВИЧ. Будет понятно, что последовательность RT, используемая согласно данному изобретению, может присутствовать в контексте Pol или фрагмента Pol, соответствующего, по меньшей мере, RT. Такие фрагменты Pol сохраняют главные эпитопы Pol для CTL (цитолитические Т-лимфоциты). В одном конкретном примере RT включен в виде только р 51 или только р 66 фрагментов RT. Компонент RT слитого белка или композиции согласно данному изобретению возможно содержит мутацию для удаления сайта, который служит в качестве внутреннего сайта инициации в прокариотических системах экспрессии. Возможно последовательность Nef для применения в данном изобретении является усеченной для удаления последовательности, кодирующей N-концевую область, т.е. для удаления от 30 до 85 аминокислот, например от 60 до 85 аминокислот, конкретно 65 N-концевых аминокислот (последнее усечение именуется здесь trNef). Альтернативно или дополнительно Nef может быть модифицирован для удаления сайта миристилирования. Например, сайт миристилирования Gly 2 может быть удален делецией или заменой. Альтернативно или дополнительно Nef может быть модифицирован для изменения дилейцинового мотива Leu 174 и Leu 175 путем делеции или замены одного или обоих лейцинов. Важность дилейцинового мотива при понижающей регуляции CD4 описана, например, в Bresnahan P.A. et al. (1998), CurrentBiology, 8(22): 1235-8. Антиген Env может присутствовать полноразмерным, как gp160, или усеченным, как gp140, или более коротким (возможно с подходящей мутацией для разрушения мотива сайта расщепления междуgp120 и gp41). Антиген Env также может присутствовать в его встречающейся в природе подвергнувшейся процессингу форме в виде gp120 и gp41. Эти два производных gp160 можно использовать индивидуально или совместно в виде комбинации. Вышеупомянутые антигены Env могут дополнительно демонстрировать делеции (конкретно вариабельные петли) и усечения. Также можно использовать фрагменты Env. Типичная последовательность gp120 показана в SEQ ID NO: 8. Типичная последовательность gp140 показана в SEQ ID NO: 6. Иммуногенные полипептиды согласно данному изобретению могут содержать Gag, Pol, Env и Nef,где присутствуют по меньшей мере 75%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, например, 96% эпитопов CTL этих нативных антигенов. В иммуногенных полипептидах согласно данному изобретению, которые содержат р 17/р 24 Gag, р 66RT и усеченный Nef, как определено выше, соответственно присутствуют 96% эпитопов CTL нативных антигенов Gag, Pol и Nef. Согласно одному воплощению данного изобретения предложен иммуногенный полипептид, содержащий р 17, р 24 Gag, р 66 RT, усеченный Nef (лишенный нуклеотидов, кодирующих терминальные аминокислоты 1-85 -"trNef") в порядке Gag, RT, Nef. В полинуклеотидах, кодирующих иммуногенные полипептиды по изобретению, соответственно, Р 24 Gag и Р 66 RT являются оптимизированными по кодонам. Конкретные полинуклеотидные конструкции и соответствующие полипептидные антигены согласно данному изобретению включают: 1. р 17, р 24 (с оптимизированными кодонами) Gag - р 66 RT (с оптимизированными кодонами) - усеченный Nef; 2. усеченный Nef - р 66 RT (с оптимизированными кодонами) - р 17, р 24 (с оптимизированными кодонами) Gag; 3. усеченный Nef - р 17, р 24 (с оптимизированными кодонами) Gag - р 66 RT (с оптимизированными кодонами); 4. р 66 RT (с оптимизированными кодонами) - р 17, р 24 (с оптимизированными кодонами) Gag - усеченный Nef; 5. р 66 RT (с оптимизированными кодонами) - усеченный Nef - p17, р 24 (с оптимизированными кодонами) Gag; 6. р 17, р 24 (с оптимизированными кодонами) Gag - усеченный Nef - р 66 RT (с оптимизированными кодонами). Типичным слиянием является слияние Gag, RT и Nef, конкретно, в порядке Gag-RT-Nef (см., например, SEQ ID NO: 2). Другим типичным слиянием является слияние р 17, р 24, RT и Nef, конкретно, в порядке p24-RT-Nef-p17 (см., например, SEQ ID NO: 16, везде здесь именуемую "F4"). В другом воплощении иммуногенные полипептиды содержат Gag, RT, интегразу и Nef, особенно в порядке Gag-RT-интеграза-Nef (смотри, например, SEQ ID NO: 4). В других воплощениях антиген ВИЧ может представлять собой слитый полипептид, который содержит Nef или его иммуногенное производное, или его иммуногенный фрагмент и р 17 Gag и/или р 24Gag или их иммуногенные производные, или их иммуногенные фрагменты, где при присутствии обоих р 17 и р 24 Gag, между ними присутствует по меньшей мере один антиген ВИЧ или иммуногенный фрагмент. Например, Nef соответственно представляет собой полноразмерный Nef. Например, р 17 Gag и р 24 Gag соответственно представляют собой полноразмерные р 17 и р 24 соответственно. В одном воплощении иммуногенный полипептид содержит и р 17, и р 24 Gag, или их иммуногенные фрагменты. В таких конструкциях компонент р 24 Gag и компонент р 17 Gag разделены по меньшей мере одним другим антигеном ВИЧ или иммуногенным фрагментом, таким как Nef и/или RT или их иммуногенные производные, или их иммуногенные фрагменты. См. WO 2006/013106 для дополнительных подробностей. В слитых белках, которые содержат р 24 и RT, может быть предпочтительным, чтобы р 24 предшествовал RT в конструкции, так как, при экспрессии данных антигенов в Е.coli по одному, наблюдается лучшая экспрессия р 24, чем RT. Некоторые конструкции согласно данному изобретению включают следующие: представляет собой мутацию метионина 592 RT на лизин. В другом аспекте настоящего изобретения предложен слитый белок из антигенов ВИЧ, содержащий по меньшей мере четыре антигена ВИЧ или их иммуногенных фрагмента, где четыре антигена или фрагмента представляют собой или происходят из Nef, Pol и Gag. Предпочтительно Gag присутствует в виде двух отдельных компонентов, которые разделены в слиянии по меньшей мере одним другим антигеном. Предпочтительно Nef представляет собой полноразмерный Nef. Предпочтительно Pol представляет собой р 66 или p51RT. Предпочтительно Gag представляет собой р 17 и р 24 Gag. Другие предпочтительные характеристики и свойства антигенных компонентов слияния в этом аспекте изобретения являются та- 12021391 кими, как здесь описано. Предпочтительными воплощениями этого аспекта данного изобретения являются четырехкомпонентные слияния, уже перечисленные выше: Иммуногенные полипептиды по настоящему изобретению могут иметь линкерные последовательности, присутствующие между последовательностями, соответствующими конкретным антигенам, таким как Gag, RT и Nef. Такие линкерные последовательности могут иметь длину, например, вплоть до 20 аминокислот. В конкретном примере они могут быть из 1-10 аминокислот или из 1-6 аминокислот, например из 4-6 аминокислот. Дополнительное описание таких подходящих антигенов ВИЧ можно найти в WO 03/025003. Антигены ВИЧ по настоящему изобретению могут происходить из любого клада ВИЧ, например,клада А, клада В или клада С. Например, антигены ВИЧ могут происходить из клада А или В, особенно из В. В одном конкретном воплощении данного изобретения первый иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, содержащий Gag, и/или Pol, и/или Nef, или фрагмент, или производное любого из них (например, p24-RT-Nef-p17). В одном конкретном воплощении данного изобретения второй иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, содержащий Gag, и/или Pol, и/или Nef, или фрагмент, или производное любого из них (например, Gag-RT-Nef или Gag-RT-интеграза-Nef). Таким образом, в одном конкретном воплощении полипептид, содержащий Gag, и/или Pol, и/илиNef, или фрагмент, или производное любого из них (например, p24-RT-Nef-p17), представляет собой первый иммуногенный полипептид, и полипептид, содержащий Gag, и/или Pol, и/или Nef, или фрагмент,или производное любого из них (например, Gag-RT-Nef или Gag-RT-интеграза-Nef), представляет собой второй иммуногенный полипептид. В другом конкретном воплощении данного изобретения первый иммуногенный полипептид представляет собой Env или его фрагмент, или производное, например, gp120, gp140 или gp160 (особенноgp120). В одном конкретном воплощении данного изобретения второй иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, содержащий Gag, и/или Pol, и/или Nef, или фрагмент, или производное любого из них (например, p24-RT-Nef-p17). Таким образом, в одном конкретном воплощении Env или его фрагмент, или производное, например, gp120, gp140 или gp160 (особенно gp120) представляет собой первый иммуногенный полипептид, и полипептид, содержащий Gag, и/или Pol, и/или Nef, или фрагмент, или производное любого из них (например, p24-RT-Nef-p17), представляет собой второй иммуногенный полипептид. В другом конкретном воплощении данного изобретения первый иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, содержащий Gag, и/или Pol, и/или Nef, или фрагмент, или производное любого из них (например, p24-RT-Nef-p17). В одном конкретном воплощении данного изобретения второй иммуногенный полипептид представляет собой Env или его фрагмент, или производное, например,gp120, gp140 или gp160 (особенно gp120). Таким образом, в одном конкретном воплощении полипептид, содержащий Gag, и/или Pol, и/илиNef, или фрагмент, или производное любого из них (например, p24-RT-Nef-p17), представляет собой первый иммуногенный полипептид, и Env или его фрагмент, или производное, например gp120, gp140 или gp160 (особенно gp120), представляет собой второй иммуногенный полипептид. Иммуногенные производные и иммуногенные фрагменты антигенов. Вышеупомянутые антигены можно применять в виде их иммуногенных производных или иммуногенных фрагментов, а не в виде целого антигена. При использовании здесь, термин "иммуногенное производное" по отношению к антигену нативного происхождения относится к антигену, который был модифицирован ограниченным способом по отношению к его природным эквивалентам. Например, он может включать точечную мутацию, которая может изменять свойства белка, например, путем улучшения экспрессии в прокариотических системах или путем устранения нежелательной активности, например, ферментативной активности. Иммуногенные производные, однако, будут достаточно сходными с нативными антигенами так, что они сохраняют их антигенные свойства и остаются способными к индукции иммунного ответа против нативного антигена. Индуцирует или нет данное производное, такой иммунный ответ можно измерить подходящим иммунологическим анализом, таким как ELISA (для гуморальных ответов) или проточная цитометрия с использованием подходящего окрашивания для клеточных маркеров (для клеточных ответов). Иммуногенные фрагменты представляют собой фрагменты, которые кодируют по меньшей мере один эпитоп, например эпитоп CTL, типично пептид из по меньшей мере 8 аминокислот. Фрагменты из по меньшей мере 8, например из 8-10 аминокислот или из вплоть до 20, 50, 60, 70, 100, 150 или 200 аминокислот в длину рассматриваются как попадающие в объем данного изобретения, при условии, что дан- 13021391 ный полипептид демонстрирует антигенность, т.е. главные эпитопы (например, эпитопы CTL) сохраняются в полипептиде. Аденовирус. Аденовирусные векторы по настоящему изобретению содержат один или более чем один гетерологичный полинуклеотид (ДНК), который кодирует один или более чем один иммуногенный полипептид. Аденовирусные векторы, полезные в настоящем изобретении, могут происходить из целого ряда хозяев-млекопитающих. Аденовирусы (здесь именуемые "Ad" или "Adv") имеют характерную морфологию с икосаэдрическим капсидом, состоящим из трех главных белков, гексона (II), пентонового основания (III) и шишковатой нити (IV), наряду с целым рядом других минорных белков VI, VIII, IX, IIIa и IVa2 (Russel W.C. 2000,Gen Virol, 81:2573-2604). Вирусный геном представляет собой линейную двухцепочечную ДНК с терминальным белком, ковалентно присоединенным к 5'-концам, которые имеют инвертированные концевые повторы (ITR). Вирусная ДНК тесно ассоциирована с сильно основным белком VII и с маленьким пептидом, именуемым mu. Другой белок, V, упакован с комплексом ДНК-белок и обеспечивает структурную связь с капсидом через белок VI. Данный вирус также содержит протеиназу, кодируемую вирусом, которая необходима для процессинга некоторых структурных белков для продукции зрелого инфекционного вируса. Было выделено свыше 100 отличных серотипов аденовируса, которые инфицируют разные виды млекопитающих, 51 из которых имеют человеческое происхождение. Таким образом, один или более чем один из аденовирусных векторов может происходить из человеческого аденовируса. Примерами таких происходящих от человека аденовирусов являются Ad1, Ad2, Ad4, Ad5, Ad6, Ad11, Ad24, Ad34, Ad35,конкретно Ad5, Ad11 и Ad35. Человеческие серотипы были классифицированы на шесть подродов (A-F),на основе целого ряда биологических, химических, иммунологических и структурных критериев. Несмотря на то что векторы на основе Ad5 широко используются в целом ряде генотерапевтических испытаний, могут существовать ограничения по использованию Ad5 и других аденовирусных векторов группы С из-за уже существующего иммунитета у всех слоев населения благодаря природной инфекции. Ad5 и другие члены группы С имеют тенденцию находиться среди наиболее серопревалирующих серотипов. Иммунитет на существующие векторы может развиваться в результате воздействия вектора во время лечения. Эти типы уже существующего или развившегося иммунитета на серопревалирующие векторы могут ограничивать эффективность генотерапии или усилий по вакцинации. Альтернативные аденовирусные серотипы, таким образом, представляют собой очень важные мишени в поисках систем доставки генов, способных ускользать от иммунного ответа хозяина. Одной такой областью альтернативных серотипов являются серотипы, происходящие от приматов,не являющихся человеком, особенно от аденовирусов шимпанзе. См. патент США 6083716, который описывает геном двух аденовирусов шимпанзе. Было показано, что аденовирусные векторы шимпанзе ("Pan" или "С") индуцируют сильный иммунный ответ на трансгенные продукты также эффективно, как человеческие аденовирусные векторы(Fitzgerald et al. J. Immunol. 170:1416). Аденовирусы приматов, не являющихся человеком, можно выделить из брыжеечных лимфатических узлов шимпанзе. Аденовирусы шимпанзе являются достаточно сходными с подтипом С человеческого аденовируса для обеспечения репликации делетированного вируса Е 1 в клетках HEK 293 (клетки почки эмбриона человека). Тем не менее, аденовирусы шимпанзе филогенетически отличаются от более обычных человеческих серотипов (Ad2 и Ad5). Pan6 является менее близкородственным и серологически отличным от Pan5, 7 и 9. Таким образом, один или более чем один аденовирусный вектор может происходить из аденовируса приматов, не являющихся человеком, например из аденовируса шимпанзе, такого как вирус, выбранный из серотипов Pan5, Pan6, Pan7 и Pan9. Аденовирусные векторы также могут происходить из более чем одного аденовирусного серотипа, и каждый серотип может быть из того же самого или из другого источника. Например, они могут происходить из более чем одного человеческого серотипа и/или из более чем одного серотипа приматов, не являющихся человеком. Способы для конструирования химерных аденовирусных векторов раскрыты в WO 2005/001103. Существуют определенные ограничения по размеру, связанные с вставкой гетерологичной ДНК в аденовирусы. Человеческие аденовирусы имеют способность к упаковке вплоть до 105% длины генома дикого типа (Bett et al. 1993, J. Virol 67 (10), 5911-21). Для человеческих аденовирусов был показан меньший упаковочный предел, составляющий 75% длины генома дикого типа (Parks et al. 1995, J. Virol 71(4), 3293-8). Одним примером аденовирусов, полезных в настоящем изобретении, являются аденовирусы, которые отличаются от превалирующих встречающихся в природе серотипов в человеческой популяции, таких как Ad2 и Ad5. Это предупреждает индукцию мощного иммунного ответа против вектора, который ограничивает эффективность последующих введений того же самого серотипа блокировкой поглощения вектора посредством нейтрализующего антитела и влияния на токсичность. Таким образом, аденовирусом может быть аденовирус, который не является превалирующим встречающимся в природе серотипом человеческого вируса. Аденовирусы, выделенные из животных, имеют иммунологически отличные капсидный, гексоновый, пентоновый и нитчатый компоненты, но филогенетически являются близкородственными. Конкретно, данный вирус может представлять собой аденовирус, отличный от человеческого, например аденовирус обезьяны и, конкретно, аденовирус шимпанзе,такой как Pan5, 6, 7 или 9. Примеры таких штаммов описаны в WO 03/000283 и доступны из Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, и из других источников. Желательными штаммами аденовирусов шимпанзе являются Pan5 [АТСС VR-591], Pan6[АТСС VR-592] и Pan7 [АТСС VR-593]. Считается, что применение аденовирусов шимпанзе является преимущественным по сравнению с применением человеческих серотипов аденовирусов из-за отсутствия уже существующего иммунитета,конкретно из-за отсутствия перекрестно нейтрализующих антител на аденовирусы у целевого населения. Перекрестная реактивность аденовирусов шимпанзе с ответами уже существующих нейтрализующих антител присутствует только у 2% целевого населения по сравнению с 35% в случае определенных человеческих аденовирусных векторов-кандидатов. Аденовирусы шимпанзе отличаются от более обычных человеческих подтипов Ad2 и Ad5, но являются более близкородственными человеческому Ad4 из подгруппы Е, который не является превалирующим подтипом. Pan6 является менее близкородственнымPan5, 7 и 9. Аденовирус по изобретению может быть дефектным по репликации. Это означает, что он имеет пониженную способность реплицироваться в некомплементирующих клетках по сравнению с вирусом дикого типа. Это можно осуществлять путем мутирования вируса, например, путем удаления гена, участвующего в репликации, например, удаления гена Е 1a, E1b, E3 или Е 4. Аденовирусные векторы согласно настоящему изобретению могут происходить из аденовируса,дефектного по репликации, содержащего функциональную делецию Е 1. Таким образом, аденовирусные векторы согласно данному изобретению могут быть дефектными по репликации из-за отсутствия способности экспрессировать аденовирусные Е 1 а и Е 1b, т.е. являются функционально делегированными по Е 1 а и Е 1b. Рекомбинантные аденовирусы также могут нести функциональные делеции в других генах[см. WO 03/000283], например, делеции в генах Е 3 или Е 4. Задержанный ранний ген аденовируса Е 3 может быть устранен из последовательности аденовируса, что образует часть рекомбинантного вируса. Функция Е 3 не является необходимой для продукции рекомбинантной аденовирусной частицы. Таким образом, нет необходимости замещать функцию этого генного продукта для того, чтобы упаковать рекомбинантный аденовирус, полезный в данном изобретении. В одном конкретном воплощении рекомбинантные аденовирусы имеют функционально делетированные гены Е 1 и Е 3. Конструкция таких векторов описана в Roy et al., Human Gene Therapy 15:519-530, 2004. Также могут быть сконструированы рекомбинантные аденовирусы, имеющие функциональную делецию гена Е 4, хотя может быть желательным сохранение функции ORF6 Е 4. Аденовирусные векторы согласно данному изобретению также могут содержать делецию в задержанном раннем гене Е 2 а. Также можно сделать делеции в любом из поздних генов L1-L5 аденовирусного генома. Аналогично могут быть полезными делеции в промежуточных генах IX и IVa. Другие делеции могут быть сделаны в других структурных или в неструктурных аденовирусных генах. Приведенные выше делеции можно использовать индивидуально, т.е. последовательность аденовируса для применения в настоящем изобретении может содержать делеции только Е 1. В качестве альтернативы, можно использовать делеции целых генов или их частей в любой комбинации для эффективного нарушения их биологической активности. Например, в одном типичном векторе последовательности аденовируса могут иметь делеции генов Е 1 и гена Е 4, или генов Е 1, Е 2 а и Е 3, или генов Е 1 и Е 3 (такие как функциональные делеции в Е 1a и Е 1b и делеция по меньшей мере части Е 3), или генов Е 1, Е 2 а и Е 4 с или без делеции Е 3 и т.д. Такие делеции могут быть частичными или полными делециями этих генов и могут использоваться в комбинации с другими мутациями, такими как температурочувствительные мутации, для достижениия желательного результата. Аденовирусные векторы можно продуцировать на любой подходящей клеточной линии, в которой вирус способен к репликации. Конкретно, можно использовать комплементирующие клеточные линии,которые дают факторы, отсутствующие в вирусном векторе, что приводит к ухудшенным характеристикам его репликации (такие как Е 1 и/или Е 4). Без ограничений такая клеточная линия может представлять собой клетки HeLa [ доступа АТСС (Американская коллекция типовых культур) CCL 2], А 549 [ доступа АТСС CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [например Detroit 510, CCL 72] и WI-38 [CCL 75],среди прочих. Все эти линии клеток доступны в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209. Из других источников можно получить другие подходящие родительские линии клеток, такие как клетки PER.C6, представленные клетками, заложенными под ЕСАСС 96022940 в Европейскую коллекцию культур животных клеток (ЕСАСС) в Центре прикладной микробиологии и исследований (CAMR, UK), или клетки Her 96 (Crucell). Полинуклеотидные последовательности, которые кодируют иммуногенные полипептиды, могут быть оптимизированными по кодонам для клеток млекопитающих. Такая оптимизация по кодонам под- 15021391 робно описана в WO 05/025614. Оптимизация по кодонам для определенных последовательностей ВИЧ дополнительно описана в WO 03/025003. В одном воплощении настоящего изобретения полинуклеотидные конструкции содержат Nконцевую лидерную последовательность. Сигнальная последовательность, трансмембранный домен и цитоплазматический домен каждый индивидуально возможно присутствуют или удалены. В одном воплощении настоящего изобретения все эти области присутствуют, но модифицированы. Промотором для применения в аденовирусном векторе согласно данному изобретению может быть промотор из гена IE HCMV, например, где 5'-нетранслируемая область гена IE HCMV, содержащая экзон 1, включена, и интрон А полностью или частично исключен, как описано в WO 02/36792. Когда несколько антигенов подвергнуты слиянию в слитый белок, такой белок будет кодироваться полинуклеотидом под контролем одного промотора. В альтернативном воплощении данного изобретения несколько антигенов могут экспрессироваться раздельно посредством индивидуальных промоторов, причем каждый их указанных промоторов может быть одинаковым или разным. В еще одном другом воплощении данного изобретения некоторые антигены могут образовать слияние, связанное с первым промотором, и другой антиген(ы) может быть связан со вторым промотором, который может быть таким же или другим, чем первый промотор. Таким образом, аденовирусный вектор может содержать одну или более чем одну кассету экспрессии, каждая из которых кодирует один антиген под контролем одного промотора. Альтернативно или дополнительно он может содержать одну или более чем одну кассету экспрессии, каждая из которых кодирует более чем один антиген под контролем одного промотора, причем данные антигены, посредством этого, экспрессируются в виде слияния. Каждая кассета экспрессии может присутствовать в аденовирусном векторе в более чем одном локусе. Полинуклеотид или полинуклеотиды, кодирующие иммуногенные полипептиды, подлежащие экспрессии, могут быть вставлены в любую из делегированных областей аденовируса, например в делегированную область Е 1. Несмотря на то что два или более полинуклеотида, кодирующих иммуногенные полипептиды, могут быть связаны в виде слияния, образующийся белок может экспрессироваться в виде слитого белка,или он может экспрессироваться в виде отдельных белковых продуктов, или он может экспрессироваться в виде слитого белка и затем позднее распадаться на меньшие субъединицы. Адъювант. Адъюванты в общем описаны в Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach, например Powelland Newman, Plenum Press, New York, 1995. Подходящие адъюванты включают соль алюминия, такую как гидроксид алюминия или фосфат алюминия, но также могут представлять собой соль кальция, железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированных сахаров, катионные или анионные производные сахаров, или полифосфазены. В препарате по данному изобретению предпочтительно, что адъювантная композиция предпочтительно индуцирует Th1-ответ. Однако будет понятно, что не исключаются другие ответы, включая другие гуморальные ответы. Хорошо известно, что определенные адъюванты вакцин особенно подходят для стимуляции цитокиновых ответов либо Th1-, либо Th2-типа. Традиционно лучшие индикаторы баланса Th1:Th2 иммунного ответа после вакцинации или инфекции включают прямое измерение продукции Th1- или Th2 цитокинов Т-лимфоцитами in vitro после повторной стимуляции антигеном и/или измерение отношенияIgG1:IgG2a антигенспецифичных антительных ответов. Таким образом, адъювантом Th1-типа является адъювант, который стимулирует продукцию выделенными популяциями Т-клеток высоких уровней цитокинов Th1-типа in vivo (при измерении в сыворотке) или ex vivo (цитокины, которые измеряют, когда клетки повторно стимулируют антигеном invitro), и индуцирует антигенспецифичные ответы иммуноглобулинов, связанные с изотипом Th1-типа. Предпочтительные иммуностимуляторы Th1-типа, которые можно готовить в виде препаратов для продукции адъювантов, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают и не ограничиваются следующими. Лиганды Toll-подобного рецептора (TLR) 4, особенно агонист, такой как производное липида А,конкретно монофосфориллипид А и более конкретно 3-деацилированный монофосфориллипид А (3 DMPL). 3 D-MPL продается GlaxoSmithKline под торговой маркой MPL и главным образом стимулирует ответы Т-клеток CD4+, характеризуемые продукцией IFN-g (Th1-клетками, т.е. клетками Т-хелперамиCD4 с фенотипом типа-1). Его можно получить согласно способам, раскрытым в GB 2220211 А. Химически он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительно в композициях по настоящему изобретению используется 3 D-MPL в виде маленьких частиц. 3 D-MPL в виде маленьких частиц имеет такой размер частиц, что его можно подвергнуть стерилизующей фильтрации через 0,22-мкм фильтр. Такие препараты описаны в международной патентной заявкеWO 94/21292. Известны синтетические производные липида А, считающиеся(AGP), такие как AGP, раскрытые в WO 9850399 или US 6303347 (способы получения AGP также раскрыты), или фармацевтически приемлемые соли AGP, как раскрыто в US 6764840. Некоторые AGP являются агонистами TLR4, и некоторые являются антагонистами TLR4. Считается, что и те, и другие являются полезными в качестве адъювантов. Согласно данному изобретению сапонины также являются предпочтительными Th1 иммуностимуляторами. Сапонины являются хорошо известными адъювантами, и о них сообщается в:Phytomedicine, vol. 2, p. 363-386). Например, Quil А (происходящий из коры южноамериканского дереваQuillaja Saponaria Molina) и его фракции описаны в US5057540 и в "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil,С.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; и в ЕР 0362279 B1. Гемолитические сапониныQS21 и QS17 (очищенные ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) фракции Quil А) были описаны как мощные системные адъюванты, и способ их получения раскрыт в патентах США 5057540 и в ЕР 0362279 В 1. В этих ссылках также раскрыто применение QS7 (негемолитическая фракция Quil-A), который действует как мощный адъювант для системных вакцин. Применение QS21 дополнительно раскрыто в Kensil et al. (1991, J. Immunology, vol. 146, 431-437). Также известны комбинации QS21 и полисорбата или циклодекстрина (WO 99/10008). Адъювантные системы в виде частиц,содержащие фракции QuilA, такие как QS21 и QS7, описаны в WO 96/33739 и WO 96/11711. Одна такая система известна как Iscom и может содержать один или более чем один сапонин. Адъювант по настоящему изобретению конкретно может содержать лиганд Toll-подобного рецептора (TLR) 4, особенно 3D-MPL, в комбинации с сапонином. Другие подходящие адъюванты включают лиганды TLR9 (агонисты). Таким образом, другим предпочтительным иммуностимулятором является иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий неметилированные динуклеотиды CpG ("CpG"). CpG является сокращением цитозин-гуанозиновых динуклеотидных мотивов, присутствующих в ДНК. CpG известен в данной области как адъювант при введении как системным путем, так и через слизистую (WO 96/02555, ЕР 468520, Davis et al., J. Immunol,1998, 160(2):870-876; McCluskie and Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6). Исторически наблюдали, что фракция ДНК BCG может оказывать противоопухолевый эффект. В других исследованиях было показано, что синтетические олигонуклеотиды, происходящие из генных последовательностей BCG, способны индуцировать иммуностимулирующие эффекты (как in vitro, так и in vivo). Авторы этих исследований заключили, что определенные палиндромные последовательности, включающие центральный мотив CG,несли эту активность. Центральная роль мотива CG при иммуностимуляции была позднее прояснена в публикации Krieg, Nature 374, р 546 1995. Подробный анализ показал, что мотив CG должен находиться в контексте определенной последовательности, и что такие последовательности являются обычными в бактериальной ДНК, но редкими в ДНК позвоночных. Иммуностимулирующая последовательность часто представляет собой: пурин, пурин, С, G, пиримидин, пиримидин; где мотив CG является неметилированным, но известно, что другие неметилированные последовательности CpG яляются иммуностимулирующими и могут быть использованы в настоящем изобретении. В определенных комбинациях из шести нуклеотидов присутствует палиндромная последовательность. Несколько этих мотивов, либо в виде повторов одного мотива, либо комбинации разных мотивов,могут присутствовать в том же самом олигонуклеотиде. Присутствие одной или более чем одной из этих иммуностимулирующих последовательностей, содержащих олигонуклеотиды, может активировать разные иммунные субпопуляции, включая естественные клетки-киллеры (которые продуцируют интерферони имеют цитолитическую активность) и макрофаги (Wooldrige et al. Vol 89 (no. 8), 1977). Теперь также было показано, что другие неметилированные последовательности, содержащие CpG, не имеющие этой консенсусной последовательности, являются иммуномодулирующими.CpG, приготовленный в виде препаратов вакцин, обычно вводится в свободном растворе вместе со свободным антигеном (WO 96/02555; McCluskie and Davis, ранее) или ковалентно конъюгированным с антигеном (WO 98/16247), или приготовленным в виде препарата с носителем, таким как гидроксид алюминия (поверхностный антиген вируса гепатита) Davis et al., ранее; Brazolot-Millan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1998, 95(26), 15553-8). Другие агонисты TLR9, представляющие потенциальный интерес, включают олигонуклеотиды, содержащие иммуностимулирующий мотив CpR, и олигонуклеотиды, содержащие мотив YpG (Idera). Такие иммуностимуляторы, в том виде, как они описаны выше, можно приготовить в виде препарата совместно с носителями, такими как, например, липосомы, эмульсии типа "масло-в-воде" и/или соли металлов, включающие соли алюминия (такие как гидроксид алюминия). Например, 3D-MPL можно приготовить в виде препарата с гидроксидом алюминия (ЕР 0689454) или с эмульсиями типа "масло-вводе" (WO 95/17210); QS21 предпочтительно можно готовить в виде препаратов с липосомами, содержащими холестерин (WO 96/33739), эмульсиями типа "масло-в-воде" (WO 95/17210) или с алюминиевыми квасцами (WO 98/15287); CgG можно приготовить в виде препарата с алюминиевыми квасцами (Davis et al., ранее; Brazolot-Millan ранее) или с другими катионными носителями. Комбинации иммуностимуляторов также являются предпочтительными, конкретно комбинация монофосфориллипида А и производного сапонина (WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241), более конкретно, комбинация QS21 и 3D-MPL, как раскрыто вWO 94/00153. В качестве альтернативы, комбинация CpG плюс сапонин, такой как QS21, также образует мощный адъювант для применения в настоящем изобретении. В качестве альтернативы, сапонин может быть приготовлен в виде препарата в липосоме или в Iscorn и объединен с иммуностимулирующим олигонуклеотидом. Таким образом, подходящие адъювантные системы включают, например, комбинацию монофосфориллипида А, предпочтительно 3D-MPL, вместе с солью алюминия (например, как описано в WO 00/23105). Улучшенная система включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина,конкретно комбинацию QS21 и 3D-MPL, как раскрыто в WO 94/00153, или менее реактогенную композицию, где QS21 погашен в липосомах, содержащих холестерин (DQ), как раскрыто в WO 96/33739. Эта комбинация может дополнительно содержать иммуностимулирующий олигонуклеотид. Таким образом, пример адъюванта содержит QS21, и/или MPL, и/или CpG. Особенно мощный адъювантный препарат, включающий QS21, 3D-MPL и токоферол в эмульсии типа "масло-в-воде", описан в WO 95/17210 и представляет собой другой предпочтительный препарат для применения в данном изобретении. Другой предпочтительный препарат содержит олигонуклеотид CpG, один или вместе с солью алюминия. В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ изготовления препарата вакцины, как здесь описано, где данный способ включает смешивание одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида согласно изобретению с подходящим адъювантом. Особенно предпочтительными адъювантами для применения в препаратах согласно данному изобретению являются следующие: 1) 3D-MPL + QS21 в липосоме (см., например, адъювант Б, описанный ниже),2) Квасцы + 3D-MPL,3) Квасцы + QS21 в липосоме + 3D-MPL,4) Квасцы + CpG,5) 3D-MPL + QS21 + эмульсия типа "масло-в-воде",6) CpG,7) 3D-MPL + QS21 (например, в липосоме) + CpG,8) QS21 + CpG. Предпочтительно адъювант представлен в форме липосомы, ISCOM или эмульсии типа "масло-вводе". В одном типичном воплощении данного изобретения адъювант включает эмульсию типа "масло-вводе". В другом типичном воплощении данного изобретения адъювант содержит липосомы. Соответственно, адъювантный компонент не собержит какого-либо вируса. Таким образом, соответственно, композиции для применения согласно данному изобретению не содержат какого-либо вируса, отличного от одного или более чем одного аденовирусного вектора, содержащего один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из патогена. Композиции, дозировка и введение. В способах по изобретению иммуногенный полипептид(ы), аденовирусный вектор(ы) и адъювант вводят совместно. Типично адъювант будет приготовлен в виде комбинированного препарата с иммуногенным полипептидом. Соответственно, адъювант также будет приготовлен в виде комбинированного препарата с любым другим иммуногенным полипептидом, подлежащим введению. Таким образом, в одном воплощении данного изобретения предложен способ индукции иммунного ответа, который включает введение: (1) одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида, приготовленного в виде препарата вместе с адъювантом; и (2) одного или более чем одного аденовирусного вектора, содержащего один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид; где один или более чем один первый иммуногенный полипептид и адъювант и один или более чем один аденовирусный вектор вводят совместно. Под фразой "приготовленный в виде препарата вместе с" подразумевается, что первый иммуноген- 18021391 ный полипептид и адъювант содержатся в одной и той же композиции, например в фармацевтической композиции. Типично в композиции, например в фармацевтической композиции, содержится аденовирусный вектор. В качестве альтернативы, один или более чем один первый иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант готовят вместе в виде препарата. Таким образом, предложены композиции согласно изобретению, которые содержат один или более чем один иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант. Композиции и способы согласно данному изобретению могут включать применение более чем одного иммуногенного полипептида и/или более чем одного аденовирусного вектора. Применение множественых антигенов является особенно полезным при индукции защитных иммунных ответов на определенные патогены, такие как ВИЧ, М. tuberculosis и Plasmodium sp. Композиции согласно данному изобретению могут содержать более чем один адъювант. Композиции и способы, применяемые согласно данному изобретению, типично могут содержать носитель, например, в виде водного забуференного носителя. Могут быть включены защитные компоненты, такие как сахара. Композиции должны вводиться в достаточных количествах для трансдукции клеток-мишеней, для обеспечения достаточных уровней переноса и экспрессии генов и для обеспечения развития патогенспецифичных иммунных ответов с тем, чтобы обеспечить профилактическую или терапевтическую пользу без нежелательных вредных физиологических эффектов или с физиологическими эффектами, приемлемыми с медицинской точки зрения, которые могут определить специалисты в области медицины. Традиционные и фармацевтически приемлемые пути введения включают, но не ограничиваются, прямую доставку в сетчатку и другие внутриглазные способы доставки, прямую доставку в печень, ингаляцию, интраназальный, внутривенный, внутримышечный внутритрахеальный, подкожный, внутрикожный, эпидермальный, ректальный, пероральный и другие парентеральные пути введения. Пути введения можно комбинировать, если это желательно, или адаптировать в зависимости от генного продукта или состояния. Путь введения прежде всего будет зависеть от природы состояния, которое лечат. Самым подходящим путем является внутримышечный, внутрикожный или эпидермальный. Предпочтительными тканями, служащими мишенями, являются мышцы, кожа и слизистые оболочки. Кожа и слизистые оболочки являются физиологическими сайтами, где обычно встречается большинство инфекционных антигенов. Когда первый иммуногенный полипептид, адъювант и аденовирусный вектор не приготовлены вместе в виде препарата, разные препараты (например, препараты полипептида/адъюванта и аденовирусного вектора) можно вводить тем же самым путем введения или разными путями введения. Дозировки композиций в данных способах будут прежде всего зависеть от таких факторов, как состояние, которое лечат, возраст, масса и здоровье субъекта, и, таким образом, могут варьировать у субъектов. Например, терапевтически эффективная взрослая человеческая или ветеринарная дозировка обычно находится в интервале от примерно 100 мкл до примерно 100 мл носителя, содержащего концентрации от примерно 1106 до примерно 11015 частиц, примерно 11011-11013 частиц или примерно 110911012 частиц вируса вместе с приблизительно 1-1000 мкг, или примерно 2-100 мкг, например, приблизительно 4-40 мкг иммуногенного полипептида. Дозировки будут варьировать в зависимости от размера животного и от пути введения. Например, подходящая человеческая или ветеринарная дозировка (для животного массой приблизительно 80 кг) для внутримышечной инъекции находится в интервале от примерно 1109 до примерно 51012 вирусных частиц и 4-40 мкг белка на 1 мл для одного сайта. Специалист в данной области может адаптировать эти дозы, в зависимости от пути введения и терапевтического или вакцинационного применения, для которого используется данная композиция. Количество адъюванта будет зависеть от природы адъюванта и иммуногенного полипептида, состояния, которое лечат, возраста, массы и состояния здоровья субъекта. Типично для введения человеку может быть подходящим количество адъюванта 1-100 мкг, например 10-50 мкг, на дозу. Соответственно, адекватного иммунного ответа добиваются одиночным совместным введением композиции или композиций по изобретению в способах по изобретению. Однако, если иммунный ответ дополнительно усиливается введением дополнительной дозы первого иммуногенного полипептида, адъюванта и аденовирусного вектора при втором или последующем случаях (например, через месяц или два месяца), тогда такой протокол охвачен данным изобретением. Авторы данного изобретения обнаружили, что хорошие патогенспецифичные ответы Т-клетокCD4+ и/или CD8+ обычно могут быть индуцированы после одиночного совместного введения композиции или композиций по изобретению в способах по изобретению. Однако авторы данного изобретения обнаружили, что для хороших патогенспецифичных гуморальных ответов может потребоваться второе или дальнейшее совместное введение композиции или композиций по изобретению. Компоненты данного изобретения можно комбинировать или готовить в виде препаратов с любым фармацевтически приемлемым эксципиентом, таким как вода, буферы и т.п. Примеры Адъювантные препараты. 1) Получение эмульсии типа "масло-в-воде", следуя протоколу, изложенному в WO 95/17210. Данная эмульсия содержит: 42,72 мг/мл сквалена, 47,44 мг/мл токоферола, 19,4 мг/мл Tween 80. Образующиеся капельки масла имеют размер приблизительно 180 нм.Tween 80 растворяли в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) с получением 2%ного раствора в PBS. Для получения 100 мл двухкратного концентрата, эмульсию 5 г DL-альфатокоферола и 5 мл сквалена встряхивали до тщательного перемешивания. Добавляли 90 мл раствораPBS/Tween и тщательно перемешивали. Образующуюся эмульсию затем пропускали через шприц и, наконец, подвергали псевдоожижению с использованием установки для микропсевдоожижения M110S. Образующиеся капельки масла имеют размер приблизительно 180 нм. 2) Получение эмульсии типа "масло в воде" с QS21 и MPL. Стерильный основной объем эмульсии добавляли к PBS для достижения конечной концентрации 500 мкл эмульсии на 1 мл (об./об.). Затем добавляли 3D-MPL. Затем добавляли QS21. Между каждым добавлением компонента промежуточный продукт перемешивали в течение 5 мин. Через 15 мин рН проверяли и подводили, если это необходимо, до 6,8 +/- 0,1 NaOH или HCI. Конечная концентрация 3D-MPL и QS21 составляла 100 мкг на 1 мл для каждого. 3) Получение липосомного MPL. Смесь липида (такого как фосфатидилхолин, либо из яичного желтка, либо синтетического), холестерина и 3D-MPL в органическом растворителе сушили под вакуумом (или, в качестве альтернативы,под струей инертного газа). Затем добавляли водный раствор (такой как забуференный фосфатом физиологический раствор), и сосуд встряхивали, пока весь липид не оказывался в суспензии. Эту суспензию затем подвергали микропсевдоожижению, пока размер липосом не снижался до примерно 100 нм, и затем подвергали стерилизующей фильтрации через 0,2-мкм фильтр. Эту стадию могли заменить экструзия или обработка ультразвуком. Типично соотношение холестерин:фосфатидилхолин составляло 1:4 (мас./мас.), и добавляли водный раствор с получением конечной концентрации холестерина 10 мг/мл. Конечная концентрация MPL составляет 2 мг/мл. Липосомы имеют размер приблизительно 100 нм и называются SUV (маленькие однослойные везикулы). Данные липосомы сами по себе стабильны с течением времени и не имеют способности к слиянию. 4) Получение адъюванта В ("adj В"). Стерильный основной объем SUV добавляли к PBS. Состав PBS был следующим: Na2HPO4: 9 мМ;KH2PO4: 48 мМ; NaCl: 100 мМ, рН 6,1. QS21 в водном растворе добавляли к SUV. Конечная концентрация 3D-MPL и QS21 составляла 100 мкг для каждого. Эта смесь называется Адъювант В. Между каждым добавлением компонента промежуточный продукт перемешивали в течение 5 мин. рН проверяли и подводили, если это необходимо, до 6,1 +/-0,1NaOH или HCl. Получение белка p24-RT-Nef-P17 ("F4").F4 получали, как описано в WO 2006/013106, пример 1, способ с оптимизированными кодонами. Получение аденовируса шимпанзе Pan7, содержащего трансген Gag-RT-Nef ("Pan7GRN"). Конструкция плазмиды Gag, RT, Nef. Плазмида p73i-Tgrn. Полная последовательность вставки в плазмиду Tgrn приведена в SEQ ID NO: 1, и конструкция данной плазмиды показана графически на фиг. 1. Она содержит р 17 р 24 (с оптимизированными кодонами) Gag, р 66 RT (с оптимизированными кодонами и инактивированный) и усеченный Nef. Плазмиду P73i-Tgrn получали, как описано в WO 03/025003, примеры 1-13. Конструкция аденовируса Pan7 с делециями Е 1/Е 3. Аденовирус Pan7 с делециями Е 1/Е 3 получали, как описано в WO 2006/120034, пример 1. Другие серотипы векторов можно сконструировать аналогичным способом. Полное описание конструкции делеций Е 1, Е 3 и Е 4 в этом и в других серотипах аденовируса Pan приведено в WO 03/0046124. Дополнительная информация также доступна в Human Gene Therapy 15:519-530. Вставка последовательности Gag, RT, Nef в аденовирус. С использованием плазмиды P73i-Tgrn в аденовирус Pan7 с делециями Е 1/Е 3 вставили кассету экспрессии GRN с получением C7-GRNC, как описано в WO 2006/120034, пример 3. C7-GRNC представляет собой компонент аденовируса Pan7GRN, использованный в изложенных здесь примерах. Пример 1. Исследование иммуногенности у мышей, иммунизированных аденовирусным компонентом(Pan7GRN) и белковым компонентом (F4/адъювант В) раздельно, или вместе как аденовирусным, так и белковым компонентом, приготовленными вместе в виде препарата. Использовали штамм мышей CB6F1, и 3 мышей использовали в каждый момент времени. Для иммунизации F4/адъювант В (Р) инъецировали 1/10 человеческой дозы, т.е. 9 мкг белка F4 в 50 мкл адъюванта В. Для иммунизации Pan7GRN (А) использовали 10108 вирусных частиц в 50 мкл физиологиче- 20021391 ского раствора (0,9%-ный раствор NaCl в воде для инъекции). Аденовирус шимпанзе Pan7GRN несет гены, кодирующие Gag (G), RT (R) и Nef (N). Схема вакцинации была следующей.(РР) или аденовируса (АА) соответственно. Мыши из групп 3 и 4 получали традиционную схему с первичной-повторной иммунизацией: белок, затем аденовирус (РРАА), или наоборот (ААРР), тогда как в группах 5 и 6 мыши получали одну или две инъекции комбинации (combo) белка и аденовируса совместно согласно изобретению. Мыши из группы 7 получали только адъювантный контроль, тогда как мыши из группы 6 были наивными. Получали следующие показатели: гуморальные ответы (ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) проводили на сыворотке из каждого отдельного животного из каждой группы): гуморальный ответ против F4 (фиг. 4),гуморальный ответ против компонентов F4: р 24, RT, Nef и р 17 (фиг. 5-8). Клеточные ответы (фиг. 2-3): измеренные проточной цитометрией, отслеживающей поверхностное и внутриклеточное окрашивание на цитокины, после повторной стимуляции клеток селезенки пулами пептидов р 24, RT, Nef или р 17 в течение ночи. Для анализа объединяли клетки селезенки из 3 мышей на момент времени и на группу. Для групп 1 и 2 пробы отбирали для измерения через 21 сутки после соответствующей конечной иммунизации. Для остальных групп измерения проводили через 21 сутки, 56 суток и 112 суток после соответствующей конечной иммунизации. Результаты. Результаты показаны на фиг. 2-8. Метки оси X соответствуют следующему: РР - группа 1 животных после второй иммунизации,АА - группа 2 животных после второй иммунизации,РРАА - группа 3 животных после четвертой иммунизации,ААРР - группа 4 животных после четвертой иммунизации,Combo - группа 5 животных после иммунизации,Combo х 2 - группа 6 животных после второй иммунизации. Моменты времени измерения (21, 56 или 112 суток после последней иммунизации) показаны в скобках. Клеточные ответы (фиг. 2, 3). В проанализированные моменты времени данные показывают, что ответы Т-клеток CD4+ наблюдали главным образом против р 24, RT и Nef. Как показано на фиг. 2 а и 2 б (левые панели), через 21 сутки после последней иммунизации самые сильные ответы Т-клеток CD4+ наблюдали с двумя иммунизациями аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком/адъювантом (животные группы 4). Одна инъекция комбинации аденовирус/белок/адъювант индуцирует более высокие уровни Т-клеток CD4+, чем две инъекции белка/адъюванта после повторной стимуляции пептидами р 24, RT или Nef. Что касается повторной стимуляции RT и Nef, две иммунизации комбинацией аденовирус/белок/адъювант индуцируют ответ Т-клетокCD4+, немного более сильный, чем одна иммунизация комбинацией, тогда как для р 24 ответы с одной или с двумя иммунизациями были идентичными. В проанализированные моменты времени ответы Т-клеток CD8+ главным образом наблюдали против пептидов р 24 и RT, и не определяли значительного числа Т-клеток CD8+, специфичных для Nef или р 17. Как показано на фиг. 2 а и 2 б (правые панели), через 21 сутки после последней иммунизации ответы Т-клеток CD8+ были идентичными после одной или двух иммунизаций комбинацией аденовирус/белок/адъювант. Ответ CD8 против р 24, наблюдавшийся в группах, иммунизированных либо (1) дважды аденовирусом, либо (2) дважды аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком,либо (3) один или два раза комбинацией аденовирус/белок/адъювант, были сравнимыми друг с другом и немного слабее, чем ответ в группе, дважды иммунизированной белком с последующими двумя иммунизациями аденовирусом. Ответ CD8 против RT, наблюдавшийся в группах, иммунизированных один или два раза комбинацией аденовирус/белок/адъювант, был сравнимым и слегка слабее ответа в группах,иммунизированных либо (1) дважды аденовирусом, либо (2) дважды аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком, либо (3) дважды белком с последующими двумя иммунизациями аденовирусом. Ответы Т-клеток CD4 и CD8 также анализировали в более поздние моменты времени (56 и 112 суток после последней иммунизации), когда можно определить стойкость ответов (фиг. 3 а и 3 б). ОтветыCD4 (фиг. 3 а и 3 б, левые панели) главным образом наблюдаются против р 24, RT и Nef. В эти моменты времени самые сильные ответы CD4 наблюдаются у животных, иммунизированных два раза аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком. Ответы CD4 у мышей, иммунизированных один или два раза комбинацией аденовирус/белок/адъювант, были сравнимыми друг с другом и обычно более сильными, чем ответ, наблюдавшийся в группах, дважды иммунизированных белком с последующими двумя иммунизациями аденовирусом. В более поздние моменты времени ответ CD8 против р 24 является самым сильным в группе, иммунизированной один раз комбинацией аденовирус/белок/адъювант (фиг. 3 б, правая панель). Он является сравнимым с ответом у животных, дважды иммунизированных белком с последующими двумя иммунизациями аденовирусом, и немного более сильным, чем ответ у животных, иммунизированных либо (1) дважды комбинацией аденовирус/белок/адъювант, либо (2) дважды аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком. Последние два являются сравнимыми друг с другом. Ответ CD8 против RT является самым сильным и аналогичным в группах, иммунизированных (1) дважды комбинацией аденовирус/белок/адъювант или (2) дважды аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком. Ответы CD8 против RT в группах, иммунизированных (1) дважды комбинацией аденовирус/белок/адъювант или (2) дважды белком с последующими двумя иммунизациями аденовирусом были немного слабее, но сравнимыми друг с другом (фиг. 3). Как показано на фиг. 3 а (правая панель), не было обнаружено значимого числа Т-клеток CD8+, специфичных к Nef или р 17. Гуморальные ответы. Как показано на фиг. 4-8, обнаруженные гуморальные ответы направлены главным образом против р 24 (фиг. 5), RT (фиг. 6) и Nef (фиг. 8). Ответ против F4 (фиг. 4) обычно имитирует ответ, наблюдавшийся против каждого из компонентов - р 24, RT или Nef, и может быть охарактеризован следующим образом: гуморальный ответ от слабого до отсутствующего определен в группах, иммунизированных (1) дважды аденовирусом или (2) один раз комбинацией аденовирус/белок/адъювант; самые сильные гуморальные ответы обычно определяются в группе, дважды иммунизированной белком, в сутки 21 после иммунизации. Однако именно в этой группе также наблюдается наивысшая вариабельность между индивидуумами. Кроме того, что касается анти-Nef серологии, группа, дважды иммунизированная аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком, по-видимому, демонстрирует самый сильный ответ при сравнении с другими группами; ответы, наблюдавшиеся в группах, иммунизированных (1) дважды комбинацией аденовирус/белок/адъювант или (2) дважды белком с последующими двумя иммунизациями аденовирусом, или(3) дважды аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком, являются сравнимыми, достигают пика в сутки 21 после последней иммунизации и затем слегка ослабевают со временем. Гуморальные ответы против р 17 (фиг. 7) были во всех группах от очень слабых до неопределимых. Заключение. В целом, самый сильный антигенспецифичный клеточно-опосредованный иммунный ответ наблюдается в группе обработки ААРР после 4 иммунизаций. Однако, при сравнении групп после 2 иммунизаций (т.е. группы АА, РР и 2xcombo), индукция антигенспецифичных ответов и Т-клеток CD4, и CD8 наблюдается только в группе, дважды иммунизированной комбинацией белок/аденовирус/адъювант. Кроме того, аналогичные уровни ответов Т-клеток CD4 и CD8 могут достигаться после одной инъекции комбинации белок/аденовирус/адъювант. Кроме того, в показателях стойкости, антигенспецифичные ответы Тклеток, наблюдавшиеся через 112 суток после 2-й иммунизации комбинацией белок/аденовирус/адъювант, являются сравнимыми с ответами, наблюдавшимися через 112 суток после 4-й иммунизации в группе обработки ААРР. Наконец, по-видимому, требуются 2 иммунизации комбинацией белок/аденовирус/адъювант для получения гуморального ответа, сравнимого с ответом, полученным в группе, дважды иммунизированной адъювантным белком, в группе, которая в общем давала самые сильные гуморальные ответы. Пример 2. Исследование иммуногенности у мышей, иммунизированных аденовирусом Pan7GRN и белкомF4/адъювантом В, приготовленных в виде комбинированного препарата. Использовали штамм мышей CB6F1, с 9 мышами на группу. Мышей иммунизировали один раз комбинированным препаратом белка F4 (инъецировали 1/10 человеческой дозы, т.е. 9 мкг) вместе с 10106 вирусных частиц Pan7GRN в 50 мкл адъюванта В или с разведениями последнего (1/2, 1/4 или 1/10). Клеточные ответы CD4 и CD8 против пула каждого из пептидов Nef, p17, р 24 или RT определяли через 21 сутки после иммунизации (3 пула из 3 селезенок для каждой группы). Получили следующие показатели. Клеточные ответы (фиг. 9): измеренные проточной цитометрией после окрашивания на поверхностные и внутриклеточные цитокины после повторной стимуляции клеток селезенки пулами пептидов р 24, RT, Nef или р 17 в течение ночи. Клетки селезенки объединяли (3 пула из 3 селезенок на группу) для анализа. Результаты. Результаты, показанные на фиг. 9, представляют собой клеточные ответы, наблюдавшиеся после повторной стимуляции пулом пептидов р 24 или RT. Метки оси X соответствуют следующему:Adj В - Мыши, иммунизированные 9 мкг F4/108 вирусных частиц Pan7GRN/неразведенным адъювантом В 1/2 Adj В - Мыши, иммунизированные 9 мкг F4/108 вирусных частиц Pan7GRN/адъювантом В, разведенным 1/2 1/4 Adj В - Мыши, иммунизированные 9 мкг F4/108 вирусных частиц Pan7GRN/адъювантом В, разведенным 1/4 1/10 Adj В - Мыши, иммунизированные 9 мкг F4/108 вирусных частиц Pan7GRN/адъювантом В,разведенным 1/10 Наивные - Наивные мыши (нет иммунизации). Результаты показывают, что ответы CD4 (фиг. 9, левая панель) и CD8 (фиг. 9, правая панель) главным образом наблюдаются против р 24 и RT, причем ответ Т-клеток CD8, специфичный к RT, слабее, чем ответ, специфичный к р 24. Кроме того, данные результаты показывают, что ответы CD4 против р 24 и RT в сутки 21 после иммунизации в группах, иммунизированных неразведенным адъювантом В или его разведением 1/2, являются аналогичными. Эти ответы CD4 имеют тенденцию к снижению, когда адъювант разведен 1/4. Когда адъювант В разведен 1/10, наблюдавшиеся ответы CD4 являются аналогичными ответам в группах, иммунизированных разведением 1/4 адъюванта В. Анти-CD8 ответы против р 24 являются сравнимыми независимо от того, разведен ли адъювант 1/2 или нет. Однако ответ снижается, когда адъювант В разведен 1/4, и даже более, если он разведен 1/10. Напротив, такие тенденции не наблюдаются для анти-RT ответов CD8, где отсутствует реальный эффект интервала дозы использованного адъюванта. Заключение. Клетки CD4+ и клетки CD8+ против компонентов F4 были индуцированы одним введением композиции, содержащей иммуногенный полипептид, аденовирусный вектор, содержащий гетерологичный полинуклеотид, кодирующий иммуногенный полипептид, и адъювант, даже когда последний был разведен. Влияние разведения адъюванта различалось, в зависимости от интересующих антигенспецифичных ответов CD4 или CD8. Конкретно, самыми сильными наблюдавшимися ответами были ответы против р 24, и ответы анти-р 24 Т-клеток CD4 и CD8 показывают эффект интервала дозы, коррелирующий с дозой адъюванта, использованного в комбинированной вакцине. В то время как тот же самый эффект можно наблюдать для ответа анти-RT Т-клеток CD4, эффект интервала доз дозы адъюванта, использованной в combo, менее ясен для ответа анти-RT Т-клеток CD8. Наконец, при рассмотрении общих антигенспецифичных ответов Т-клеток CD4 или CD8 и суммы ответов против 4 антигенов, можно наблюдать (эффект) интервала доз. Пример 3. Исследование иммуногенности у новозеландских белых кроликов, иммунизированных Pan7GRN или F4/адъювант В последовательно или обеими аденовирусным и белковым компонентами, приготовленными вместе в виде комбинированного препарата. Для иммунизации F4/адъювантом В инъецировали человеческую дозу, т.е. 90 мкг белка F4 в 500 мкл адъюванта В. Для иммунизации Pan7GRN использовали 101010 или 101012 вирусных частиц в 500 мкл физиологического раствора. Для иммунизации как аденовирусным, так и и белковым компонентами,приготовленными вместе в виде вместе препарата, использовали 90 мкг белка F4, 101011 вирусных частиц Pan7GRN в 500 мкл адъюванта В. Схема вакцинации была следующей: Было 3 кролика на группу, за исключением группы 1, которая включала только 2 кроликов. Получили следующие показатели: гуморальные ответы (ELISA проводили на сыворотке из каждого отдельного животного из каждой группы): гуморальный ответ против F4,гуморальный ответ против компонентов F4 - р 24, RT, Nef и р 17. Лимфопролиферативные ответы: лимфопролиферацию определяли по поглощению тритированного тимидина одноядерными клетками периферической крови (выделенные из цельной крови после градиента плотности), повторно стимулированными in vitro пулами пептидов Nef, p17, р 24 и/или RT в течение 88 ч в присутствии тритированного тимидина в течение последних 16 ч инкубации. Результаты. Лимфопролиферативный ответ. Как показано на фиг. 10, самые сильные лимфопролиферативные ответы наблюдаются в группе,дважды иммунизированной белком. Лимфопролиферативный ответ у животных, дважды иммунизированных комбинацией аденовирус/белок/адъювант, наблюдали у всех кроликов из данной группы. Он на самом деле достигал пика после одной инъекции и мог быть дополнительно возвращен (до аналогичных уровней, что и после 1-й инъекции) после третьей инъекции комбинации аденовирус/белок/адъювант,свидетельствуя о том, что первые две инъекции не индуцируют нейтрализующий ответ, который ингибировал бы любой ответ на дополнительную аналогичную инъекцию. Пролиферативный ответ, наблюдавшийся у кроликов, иммунизированных комбинацией аденовирус/белок/адъювант, был сравнимым по его интенсивности с ответом, наблюдавшимся у животных, иммунизированных один или два раза 1012 вирусных частиц аденовируса, и оказывался более сильным, чем ответ у животных, иммунизированных один или два раза 1010 вирусных частиц аденовируса. В целом, это свидетельствует о том, что использование комбинации аденовирус/белок/адъювант могло снизить дозу аденовируса, подлежащую применению. Наконец, после третьей инъекции комбинации аденовирус/белок/адъювант ответ, наблюдавшийся в группе 4, был аналогичным ответу у животных, иммунизированных белком 3 раза (группа 1). Серология. Как показано на фиг. 11, кинетика гуморального ответа против F4, наблюдавшаяся у животных,дважды иммунизированных комбинацией аденовирус/белок/адъювант, является аналогичной кинетике у животных, дважды иммунизированных белком: он уже определялся в сутки 7 после 2-й инъекции и затем уменьшался со временем. Однако, в показателях интенсивности, анти-F4 ответ животных, дважды иммунизированных комбинацией аденовирус/белок/адъювант, остается более сильным в более поздние моменты времени (21 и 63 суток после 2-й иммунизации) по сравнению с анти-F4 ответом у животных,дважды иммунизированных белком. У кроликов, иммунизированных один раз 1010 вирусных частиц аденовируса, не наблюдается гуморальный ответ против F4. У кроликов, иммунизированных один раз 1012 вирусных частиц аденовируса, ответ против F4 определяется только в сутки 21 и 63 после иммунизации. В этой группе высокая вариабельность ответа, наблюдавшаяся в момент времени 63 суток после иммунизации (d77), происходит из-за одного животного (из 3), демонстрирующего более высокие титры против разных компонентов F4, особенно против р 24 и RT, как показано на фиг. 12 а и 12 б соответственно. Гуморальный ответ против F4 главным образом состоит из антител, имеющих в качестве мишени р 24 иRT, и в значительно меньшей степени - Nef и р 17. Заключение. Лимфопролиферативные и гуморальные ответы у кроликов могли быть индуцированы после двух инъекций композиции, содержащей иммуногенный полипептид, аденовирусный вектор, содержащий гетерологичный полинуклеотид, кодирующий иммуногенный полипептид, и адъювант. Кроме того, авторы данного изобретения имеют доказательство того, что лимфопролиферативный ответ может быть вызван повторно после третьей инъекции такой композиции. Наконец, наилучший гуморальный ответ(по интенсивности и стойкости) наблюдается с комбинацией аденовирус/белок/адъювант. Пример 4. Иммуногенность F4 (с оптимизированными кодонами)/адъювант В и C7-GRN при введении в виде комбинации мышам CB6F1. Схема эксперимента. Мышей CB6F1 дважды иммунизировали (сутки 0 и 21) разными комбинациями, перечисленными ниже. F4co (F4 с оптимизированными кодонами)/адъювант В использовали в дозе 9 мкг F4 со/животное в 50 мкл адъюванта В (1/10 человеческой дозы) и вирус C7-GRN - в дозе 108 вирусных частиц/животное. С 7 пустой С 7 пустой/адъювант В С 7 пустой/F4 со С 7 пустой/F4 со/адъювант В Схема иммунизации и анализ иммунного ответа. Иммунизации проводили в сутки 0 и в сутки 21. Окрашивание на внутриклеточные цитокины (ICS) проводили в сутки 21, сутки 28 (7 суток после иммунизации 2), сутки 42 (21 сутки после иммунизации 2) и в сутки 77 (56 суток после иммунизации 2). Результаты. ВИЧ-специфичные ответы Т-клеток CD4. Результаты показаны на следующих фигурах. Фиг. 13. Количественная оценка ВИЧ-1-специфичных Т-клеток CD4.% Т-клеток CD3 CD4, секретирующих IFN- и/или IL-2, представлен для каждого протокола иммунизации в четыре момента времени. Лимфоциты периферической крови (PBL) стимулировали ex vivo (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих последовательность F4, и продукцию цитокинов измеряли ICS. Каждое значение представляет собой среднее геометрическое значение 5 пулов из 3 мышей. Фиг. 14. Распределение частот F4-специфичных Т-клеток CD4 через 7 суток после двух иммунизаций. Частота F4-специфичных циркулирующих Т-клеток CD4 через 7 суток после двух иммунизаций представлена для каждого протокола. Каждая точка представляет собой значение, полученное для одного пула из 3 мышей. Фиг. 15. Продукция цитокинов F4-специфичными Т-клетками CD4 через 7 суток после двух иммунизаций.% F4-специфичных Т-клеток CD4, секретирующих IL-2 и/или IFN-, представлен для 5 пулов из 3 мышей. Представлены результаты для иммунизации F4 со/адъювант В (A), F4co/адъювант В/С 7 пустой(Б) и F4co/адъювант В/C7-GRN (В). Частота F4-специфичных циркулирующих Т-клеток CD4 достигает 2,82% через 21 сутки после двух иммунизаций комбинацией F4co/адъювант В и снижается до 0,91% через 56 суток после иммунизации(фиг. 13). Две дозы одного вируса C7-GRN приводят к 0,52% F4-специфичных циркулирующих Т-клетокCD4 через 21 сутки после последней иммунизации, и присутствие адъюванта Б не изменяет этот ответ. Присутствие пустого вектора С 7 или рекомбинантного вируса C7-GRN помимо смесиF4 со/адъювант В не увеличивает и не влияет на частоту ответа F4-специфичных Т-клеток CD4 (3,58% и 2,82% соответственно через 21 сутки после последней иммунизации). Даже если бы не проводился статистический анализ, распределение популяции свидетельствует о том, что интенсивность ответов F4 специфичных Т-клеток CD4 не различается между тремя протоколами - F4co/адъювант В, F4co/адъювант В/С 7 пустой и F4co/адъювант В/C7-GRN (фиг. 14). Как ожидалось, введение F4co без адъюванта В не индуцирует значительно F4-специфичные Т-клетки CD4. Профиль продукции цитокинов показывает, что после иммунизации F4co/адъювант В, F4 специфичные Т-клетки CD4 секретируют как IFN-, так и IL-2. Добавление пустого С 7 или C7-GRN в данный протокол иммунизации не изменяет этот профиль. В результате, эти данные говорят о том, что наибольший ответ F4-специфичных Т-клеток CD4 получают после иммунизации комбинацией F4co/адъювант В, и что присутствие вируса C7-GRN не улучшает и не изменяет этот ответ. Ответы антигенспецифичных Т-клеток CD8. Результаты показаны на следующих фигурах. Фиг. 16. Количественная оценка ВИЧ-1-специфичных Т-клеток CD8.% Т-клеток CD3 CD8, секретирующих IFN- и/или IL-2, представлен для каждого протокола иммунизации в четыре момента времени. Лимфоциты периферической крови (PBL) стимулировали ex vivo (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих F4, и продукцию цитокинов измеряли ICS. Каждое значение представляет собой среднее геометрическое значение 5 пулов из 3 мышей. Фиг. 17. Продукция цитокинов F4-специфичными Т-клетками CD8 через 7 суток после двух иммунизаций.% F4-специфичных Т-клеток CD8, секретирующих IL-2 и/или IFN-, представлен для 5 пулов из 3 мышей. Представлены результаты для иммунизации C7-GRN (A), C7-GRN/адъювант В (Б) и C7GRN+F4co/адъювант В (В). После одной инъекции рекомбинантный вектор C7-GRN индуцирует высокую частоту F4 специфичных циркулирующих Т-клеток CD8 (всего 9,70% Т-клеток CD8, 21 сутки после иммунизации)(фиг. 4). Вторая инъекция не индуцирует ответ F4-специфичных Т-клеток CD8. КомбинацияF4co/адъювант В индуцирует от слабого до неопределимого (ответа) F4-специфичных Т-клеток CD8, и добавление этой комбинации к C7-GRN не улучшает или не ухудшает ответ F4-специфичных Т-клетокCD8. Ответ F4-специфичных Т-клеток CD8 задерживается, когда адъювант В добавляют к C7-GRN, но достигает того же самого уровня, что и с одним С 7-GRN или с комбинацией C7-GRN/F4co/адъювант В через 21 сутки после второй иммунизации.F4-специфичные Т-клетки CD8 главным образом секретируют IFN- независимо от того, инъецируется ли вектор C7-GRN один или в комбинации с F4co/адъювант В (фиг. 17). Интересно, что ответ F4-специфичных Т-клеток CD8 сохраняется вплоть до 56 суток после последней иммунизации без снижения, свидетельствуя о том, что вектор С 7 вызывает сильный и стойкий (ответ) Т-клеток CD8. Заключения. Вакцина F4 со/адъювант В индуцирует высокую частоту полифункциональных ВИЧ-специфичных Т-клеток CD4, но не ВИЧ-специфичных Т-клеток CD8 у мышей CB6F1. В той же самой животной модели рекомбинантный аденовирус С 7, экспрессирующий Gag, RT и Nef (Ad C7-GRN), индуцирует сильный антигенспецифичный ответ Т-клеток CD8 и от слабого до неопределимого антигенспецифичного ответа Т-клеток CD4. Комбинация F4/адъювант В и Ad C7-GRN вызывает (ответы) как антигенспецифичных Тклеток CD4, так и CD8, в то же самое время. Комбинация трех компонентов - F4co, адъювант В и C7GRN вызывает самые высокие уровни как антигенспецифичных Т-клеток CD4, так и CD8, в то же самое время. Комбинирование F4/адъюванта В и Ad C7-GRN имеет аддитивный эффект относительно интенсивности обеих ветвей клеточного иммунного ответа. В этой модели остается определить эффект ответа антигенспецифичных Т-клеток CD4 на функциональность ответа антигенспецифичных Т-клеток CD8. Пример 5. Иммуногенность аденовируса шимпанзе С 7, экспрессирующего конструкцию CS2 белка CSP изPlasmodium falciparum (C7-CS2), когда он вводится один. Схема эксперимента. Мышей CB6F1 один раз внутримышечно иммунизировали в интервале доз (1010, 109 и 108 вирусных частиц) аденовируса шимпанзе С 7, экспрессирующего антиген малярии CSP, и определяли CSPспецифичные (к С-концу и N-концу) ответы Т-клеток CD4 и CD8 через 21, 28 и 35 суток после инъекции посредством ICS (окрашивание на внутриклеточные цитокины).CSP-специфичные ответы Т-клеток CD4. Результаты показаны на следующих фигурах. Фиг. 18. Количественная оценка CSP-специфичных Т-клеток CD4.% Т-клеток CD4, секретирующих IFN- и/или IL-2, представлен для каждого протокола иммунизации в три момента времени. Лимфоциты периферической крови (PBL) стимулировали ex vivo (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих последовательностиN-конца CSP или С-конца CSP, и продукцию цитокинов измеряли посредством ICS. Ответы на Сконцевые и N-концевые пептидные пулы складывали, и каждое значение представляет собой среднее 5 пулов из 4 мышей. Фиг. 19. Количественная оценка CSP-спеиифичных Т-клеток CD8.% Т-клеток CD8, секретирующих IFN- и/или IL-2, представлен для каждого протокола иммунизации в три момента времени. Лимфоциты периферической крови (PBL) стимулировали ex vivo (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих последовательностиN-конца CSP или С-конца CSP, и продукцию цитокинов измеряли посредством ICS. Ответы на Сконцевые и N-концевые пептидные пулы складывали, и каждое значение представляет собой среднее 5 пулов из 4 мышей. Эти результаты показывают, что обе дозы C7-CS2, 1010 и 109, вызывают аналогичные уровни CSPспецифичных ответов Т-клеток CD4 (пик 0,5%) и аналогичные уровни CSP-специфичных ответов Тклеток CD8 (пик 8%). Доза C7-CS2 1010 была выбрана в последующих экспериментах, где тестировали иммуногенность C7-CS2 в комбинации с RTS,S (см. ниже). Пример 6. Иммуногенность C7-CS2 и RTS,S при введении в виде комбинации у мышей CB6F1. Схема эксперимента. Мышей CB6F1 три раза внутримышечно иммунизировали (сутки 0, 14 и 28) либо комбинацией вакцины-кандидата против малярии RTS,S (5 мкг) в 50 мкл адъюванта В (на фигурах, приведенных ниже,называется Р-Р-Р), либо комбинацией RTS,S (5 мкг) и C7-CS2 (1010 вирусных частиц) в 50 мкл адъюванта В (на фигурах, приведенных ниже, называется С-С-С). CSP-специфичные (к С-концу и N-концу) ответы Т-клеток CD4 и CD8 определяли в следующие моменты времени: 7 суток после 2 иммунизации 7, 21, 35 и 49 суток после 3 иммунизацииCSP-специфичные гуморальные ответы в сыворотке от иммунизированных животных также определяли ELISA в сутки 14 и 42 после 3-й иммунизации.CSP-специфичные ответы Т-клеток CD4. Результаты показаны на следующих фигурах. Фиг. 20. Количественная оценка CSP(N-конец)-специфичных Т-клеток CD4.% Т-клеток CD4, секретирующих IFN- и/или IL-2, представлен для каждого протокола иммунизации в пять моментов времени. Лимфоциты периферической крови (PBL) стимулировали ex vivo (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих последовательность Nконца CSP, и продукцию цитокинов (IFN- и/или IL-2) измеряли посредством ICS. Каждое значение представляет собой среднее 4 пулов из 7 мышей. Фиг. 21. Количественная оценка CSP(С-конец)-специфичных Т-клеток CD4.% Т-клеток CD4, секретирующих IFN- и/или IL-2, представлен для каждого протокола иммунизации в пять моментов времени. Лимфоциты периферической крови (PBL) стимулировали ex vivo (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих последовательность Сконца CSP, и продукцию цитокинов (IFN- и/или IL-2) измеряли посредством ICS. Каждое значение представляет собой среднее 4 пулов из 7 мышей. Эти результаты показывают, что мыши, иммунизированные 3 инъекциями комбинации [RTS.S +C7-CS2 1010 + адъювант В] демонстрируют более сильные антигенспецифичные ответы Т-клеток CD4CSP-специфичные ответы Т-клеток CD8. Результаты показаны на следующих фигурах. Фиг. 22. Количественная оценка CSP(N-конец)-специфичных Т-клеток CD8.% Т-клеток CD8, секретирующих IFN- и/или IL-2, представлен для каждого протокола иммунизации в пять моментов времени. Лимфоциты периферической крови (PBL) стимулировали ex vivo (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих последовательность Nконца CSP, и продукцию цитокинов (IFN- и/или IL-2) измеряли посредством ICS. Каждое значение представляет собой среднее 4 пулов из 7 мышей. Фиг. 23. Количественная оценка CSP(С-конец)-специфичных Т-клеток CD8.% Т-клеток CD8, секретирующих IFN- и/или IL-2, представлен для каждого протокола иммунизации в пять моментов времени. Лимфоциты периферической крови (PBL) стимулировали ex vivo (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих последовательность Сконца CSP, и продукцию цитокинов (IFN- и/или IL-2) измеряли посредством ICS. Каждое значение представляет собой среднее 4 пулов из 7 мышей. Эти результаты показывают, что мыши, иммунизированные 3 инъекциями комбинации [RTS,S +C7-CS2 1010 + адъювант В], демонстрируют более сильные антигенспецифичные ответы Т-клеток CD8CSP-специфичные гуморальные ответы. Результаты показаны на следующей фигуре. Фиг. 24. Количественная оценка CSP-специфичных титров антител. Сыворотку у мышей брали в сутки 14 и 42 после 3-й иммунизации. Титры антител против CSP измеряли в каждой из этих индивидуальных сывороток посредством ELISA. Показанные данные представляют собой среднее геометрическое титров антител 95%-ный доверительный интервал. Эти результаты показывают, что мыши, иммунизированные 3 инъекциями комбинации [RTS,S +C7-CS2 1010 + адъювант В], демонстрируют аналогичные титры CSP-специфичных антител, что и мыши,иммунизированные 3 инъекциями RTS,S + адъювант В. Заключения. Вакцина RTS,S/адъювант В индуцирует высокую частоту Т-клеток CD4, специфичных к С-концуCSP, но не Т-клеток CD4, специфичных к N-концу CSP. Кроме того, вакцина RTS,S/адъювант В индуцирует от низких до непределимых (уровней) Т-клеток CD8, специфичных к С- и N-концу CSP. В той же самой животной модели рекомбинантный аденовирус С 7, экспрессирующий CSP, индуцирует сильные ответы CSP(С-конец и N-конец)-специфичных Т-клеток CD8 и слабые ответы CSP(С-конец и N-конец)специфичных Т-клеток CD4. Комбинация RTS,S/адъювант В и Ad C7-CS2 вызывает высокие уровни какCSP(С-конец и N-конец)-специфичных Т-клеток CD4, так и CD8, в то же самое время. КомбинацияRTS,S/адъювант В и Ad C7-CS2 имеет аддитивный эффект относительно интенсивности обоих ветвей ответа Т-клеток. Наконец, комбинация RTS,S/адъювант В и Ad C7-CS2 вызывает высокие уровни CSPспецифичных антительных ответов, которые являются сравнимыми с ответами, индуцированными