Химерный аденовирусный вектор, иммуногенная композиция на его основе, способ индукции иммуного ответа с его помощью и выделенная нуклеиновая кислота

ХИМЕРНЫЙ АДЕНОВИРУСНЫЙ ВЕКТОР, ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ, СПОСОБ ИНДУКЦИИ ИММУНОГО ОТВЕТА С ЕГО ПОМОЩЬЮ И ВЫДЕЛЕННАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА Изобретение относится к химерным аденовирусным векторам и использованию этих векторов для создания иммунного ответа на интересующий антиген. 014757 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к химерным аденовирусным векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, которые кодируют гетерологичный полипептид, а также к способам индукции иммунного ответа против гетерологичного полипептида. Сведения о предшествующем уровне техники Вакцины являются важным средством профилактики и/или лечения различных заболеваний и расстройств (например, вирусных инфекций, бактериальных инфекций и рака). Вакцины, основанные на нуклеиновых кислотах, характеризуются несколькими преимуществами, по сравнению с белковыми или ослабленными живыми вакцинами. Введение нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует антиген, в клетку-мишень позволяет быстро разработать вакцину, генерирующую иммунный ответ против интересующего антигена. В случае белковых вакцин каждый раз, когда требуется создать вакцину, необходимо также разработать эффективный и целесообразный способ очистки белка. В случае живых вакцин необходимо найти способ их ослабления, который не полностью останавливал бы рост патогена, но делал бы его безопасным для людей. На разработку методов очистки белков и методик ослабления уходит чрезвычайно много времени. Напротив, большую часть вакцин, основанных на нуклеиновых кислотах, можно изготовить очень быстро, используя каждый раз одни и те же технологии только с незначительными модификациями нуклеиновых кислот, кодирующих интересующий антиген. Одной из систем вакцин, основанных на нуклеиновых кислотах, является некомпетентный по репликации аденовирус, ее высокий титр удается получить быстро, предсказуемо и недорого. [Polo, J. M. and Dubensky, Т. W., Jr., Drug Discov Today, 7(13), 719-727 (2002)]. Однако эффективность антиген-специфического ответа после введения аденовирусных векторов невелика. Таким образом, в уровне техники существует ярко выраженная потребность в новых аденовирусных векторах, которые можно было бы использовать для эффективной индукции иммунного ответа против интересующего антигена. Настоящее изобретение призвано удовлетворить эти и другие потребности. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к химерным аденовирусным векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, которые кодируют гетерологичный полипептид, а также способам индукции иммунного ответа против гетерологичного полипептида. Один аспект изобретения относится к химерным аденовирусным векторам экспрессии, содержащим кассету расширения, которая содержит: (а) первый промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей агонист Toll-подобного рецептора (Toll-like receptor (TLR)-3); и (b) второй промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей гетерологичный полипептид. В соответствии с некоторыми аспектами агонист TLR-3 представляет собой дцРНК (двухцепочечная РНК илиdsRNA). В соответствии с некоторыми аспектами кодирующая TLR-3 агонист нуклеиновая кислота содержит последовательность, выбранную из следующих: SEQ ID NOS: 3, 7, 8, 9, 10, 11 и 12. В соответствии с некоторыми аспектами гетерологичный полипептид выбран из числа оболочечных полипептидов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (например, gp41, gp120 или gp160) и полипептида гриппа НА. В соответствии с некоторыми аспектами первый промотор совпадает со вторым. В соответствии с некоторыми аспектами первый промотор и второй промотор разные. В соответствии с некоторыми аспектами промоторы выбраны из числа бета-актинового промотора и промотора цитомегаловируса (CMV, или ЦМВ). Изобретение относится также к иммуногенным композициям, содержащим вектор экспрессии. Еще один аспект изобретения относится к способам индукции иммунного ответа против гетерологичного полипептида, предусматривающий введение иммунологически эффективного количества композиций млекопитающему (например, грызуну, такому как мышь, крыса или морская свинка, или примату,такому как шимпанзе, макака-резус или человек). В соответствии с некоторыми аспектами вектор вводится по непарентеральному маршруту (например, орально, интраназально или мукозально). В соответствии с некоторыми аспектами гетерологичный полипептид экспрессируется в клетках, выбранных из числа дендритных клеток, складчатых клеток и клеток эпителия кишечника. Еще один аспект изобретения относится к иммуногенным композициям, содержащим: (а) химерные аденовирусные векторы экспрессии, содержащие промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей гетерологичный полипептид; и (b) агонист TLR-3 (например, дцРНК). В соответствии с некоторыми аспектами, агонист TLR-3 кодируется нуклеиновой кислотой. Изобретение относится также к способам индукции иммунного ответа, заключающимся во введении композиций млекопитающему(например, грызуну, такому как мышь, крыса или морская свинка, или примату, такому как шимпанзе,макака-резус или человек) по любому непарентеральному маршруту (например, орально, интраназально или мукозально). Еще один аспект изобретения относится к выделенным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, описанную в SEQ ID NOS: 1, 2, 6, 7, 13, 14, 15, 16 или 17. Перечень фигур, чертежей и иных материалов Перечень фигур На фиг. 1-2 представлены данные, демонстрирующие, что химерный аденовирусный вектор изобретения (например, DS1) совместно с агонистом TLR-3 более эффективен в индукции антиген-1 014757 специфического иммунного ответа после орального введения, чем стандартный аденовирусный вектор(например, rAd5). На фиг. 1 представлены данные, отражающие титр антител к оболочечному белку ВИЧ (то есть,gpl20) через три недели после орального введения аденовирусных векторов. На фиг. 2 представлены данные, отражающие титр антител к оболочечному белку ВИЧ (то есть,gpl20) через шесть недель после орального введения аденовирусных векторов. На фиг. 3-5 представлены данные, демонстрирующие, что химерный аденовирусный вектор изобретения (то есть, DS1b или DS1c) совместно с агонистом TLR-3 более эффективен в индукции антигенспецифического иммунного ответа, чем стандартный аденовирусный вектор (например, rAd5). На фиг. 3 представлены данные, отражающие титр anti-GFP IgG через три недели после орального введения векторов. На фиг. 4 представлены данные, отражающие ответ Т-клеток СВ 8+ на GFP через 10 недель после введения вектора в 0, 4 и 8 недели. На фиг. 5 представлены данные, отражающие титр антител anti-HA через три недели после орального введения векторов. На фиг. 6-7 представлены данные, демонстрирующие, что химерные аденовирусные векторы изобретения вызывают иммунный ответ более эффективно, если введены непарентерально. На фиг. 6 показаны данные, отражающие титр anti-gpl20 антител через три недели после внутримышечного введения DS1. На фиг. 7 показаны данные, отражающие титр anti-HA через три недели после интраназального введения DS1c. На фиг. 8-9 представлены данные, демонстрирующие, что экспрессируемые агонисты TLR-3 могут индуцировать активацию антиген-представляющих клеток. На фиг. 8 представлены данные, отражающие активацию дендритных клеток экспрессируемым дцРНК TLR-3 агонистом Iuc1. На фиг. 9 представлены данные, отражающие активацию дендритных клеток экспрессируемыми дцРНК TLR-3 агонистами luc1 и m1. Фиг. 10 представляет собой графическую иллюстрацию химерных аденовирусных векторов изобретения, то есть, химерных аденовирусных векторов, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие экспрессируемые дцРНК TLR-3 агонисты. На фиг. 11 представлены данные, демонстрирующие, что химерные аденовирусные векторы изобретения эффективно индуцируют антиген-специфический иммунный ответ после введения орально. Данные этой фигуры отражают титр anti-gp120 антител через три недели после орального введения химерного аденовируса, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует дцРНК TLR-3 агонист Iucl1. На фиг. 12 представлены данные, демонстрирующие, что агонисты TLR-7/8 малоэффективны в индукции антиген-специфического иммунного ответа. На фиг. 13-15 представлены данные, демонстрирующие, что химерные аденовирусные векторы изобретения эффективно индуцируют антиген-специфический иммунный ответ после орального введения. Данные фиг. 13 демонстрируют титр anti-HA антител четыре недели спустя орального введения химерной аденовирусной композиции, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует дцРНК TLR-3 агонист luc 1. Данные фиг. 14 демонстрируют титр anti-HA антител через четыре или семь недель после введения химерной аденовирусной композиции, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует дцРНК TLR-3 агонист luc1. На фиг. 15 представлены данные, показывающие титр anti-HA антител через три недели после орального или интраназального введения химерной аденовирусной композиции, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирующую дцРНК TLR-3 агонист Iuc1. Перечень последовательностейSEQ ID NO: 1 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектораSEQ ID NO: 2 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектораSEQ ID NO: 6 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектора,содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую НА гриппа, и нуклеиновую кислоту, кодирующуюTLR-3 агонист (luc), где НА гриппа и TLR-3 агонист находятся в одной и той же ориентации.SEQ ID NO: 7 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектора,содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую НА гриппа, и нуклеиновую кислоту, кодирующуюTLR-3 агонист (luc), где НА гриппа и TLR-3 агонист находятся в противоположной ориентации.SEQ ID NO: 8 описывает нуклеотидную последовательность, кодирующую короткую шпильку РНКTLR-3 агониста. Комплементарные фрагменты последовательности обозначены заглавными буквами, а последовательности линкера - маленькими буквами.SEQ ID NO: 9 описывает нуклеотидную последовательность, кодирующую короткую шпильку РНКTLR-3 агониста (gl). Комплементарные фрагменты последовательности обозначены заглавными буквами,а последовательности линкера - маленькими буквами.PHK TLR-3 агониста (luc). Комплементарные фрагменты последовательности обозначены заглавными буквами, а последовательности линкера - маленькими буквами.PHK TLR-3 агониста (ml). Комплементарные фрагменты последовательности обозначены заглавными буквами, а последовательности линкера - маленькими буквами.SEQ ID NO: 12 описывает нуклеотидную последовательность, кодирующую короткую шпильку РНК TLR-3 агониста. Комплементарные фрагменты последовательности обозначены заглавными буквами, а последовательности линкера - маленькими буквами.SEQ ID NO: 13 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектораSEQ ID NO: 14 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектораDS2beta-luc. Вектор содержит последовательность, кодирующую TLR-3 агонист luc под контролем промотора бета-актина. Вектор содержит также открытые сайты клонирования для включения нуклеотидной последовательности (последовательностей), кодирующих интересующий антиген.SEQ ID NO: 15 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектораDS2C-luc. Вектор содержит последовательность, кодирующую TLR-3 агонист luc под контролем промотора ЦМВ. Вектор содержит также открытые сайты клонирования для включения нуклеотидной последовательности (последовательностей), кодирующих интересующий антиген.SEQ ID NO: 16 описывает нуклеотидную последовательность челночного вектора pShuttle, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую TLR-3 агонист luc под контролем промотора ЦМВ и нуклеотидную последовательность, кодирующую НА (птичий грипп) под контролем другого промотора ЦМВ.SEQ ID NO: 17 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектораND 1.1 214. Нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичный антиген, выделена полужирным шрифтом и ограничена по краям сайтом распознавания Cla I по 5' концу и сайтом распознавания Not 1 по 3' концу. Нуклеотидная последовательность, кодирующая TLR-3 агонисты, выделена курсивом, а последовательность линкера полужирным шрифтом. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенияI. Введение. Настоящее изобретение относится к новым химерным аденовирусным векторам, которые можно вводить непарентерально с целью вызвать иммунный ответ против интересующего антигена. Химерные аденовирусные векторы изобретения включают нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичный полипептид, и нуклеиновую кислоту, кодирующую TLR-3 агонист. Химерные аденовирусные векторы индуцируют сильный и эффективный иммунный ответ, специфичный для гетерологичного полипептида,особенно, если вводятся по непарентеральному маршруту (например, орально, интраназально или мукозально). Изобретение основано на неожиданном открытии, что введение дцРНК TLR-3 агонистов является эффективным вспомогательным средством, если осуществляется совместно с вирусными векторами. Фактически, применение дцРНК в качестве адьюванта для вирусных векторов невозможно предположить на основании простой интуиции, особенно если учесть, что основное предполагаемое применение дцРНКмиметических поли I:С является использование их в качестве противовирусного средства [Nemes,et al, Proc Soc Exp Biol Med. (1969) 132:776; Schafer, et al, Nature. (1970) 226:449; Fenje, et al, Nature (1970) 226:171].II. Определения. Термин "химерный" или "рекомбинантный" со ссылкой, например, на нуклеиновую кислоту, белок или вектор означает здесь, что нуклеиновая кислота, белок или вектор были модифицированы путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка, либо путем изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка. Так, например, химерные или рекомбинантные векторы включают нуклеотидные последовательности, не содержащиеся в нативных (нехимерных или нерекомбинантных) формах вектора. Химерные аденовирусные векторы экспрессии означают аденовирусные векторы экспрессии, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный полипептид. "Вектор экспрессии" представляет собой нуклеотидный конструкт, сгенерированный рекомбинантно или синтетически,совместно с последовательностью указанных нуклеотидных остатков, который позволяет осуществить транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в клетке хозяина. Вектор экспрессии может входить в-3 014757 состав плазмиды, вируса или нуклеотидного фрагмента. Как правило, вектор экспрессии включает транскрибируемую нуклеиновую кислоту, оперативно связанную с промотором. Термины "промотор" и "последовательность, контролирующая экспрессию", здесь означает массив нуклеотидных контролирующих последовательностей, которые направляют транскрипцию нуклеиновых кислот. Промотор здесь включает необходимую нуклеотидную последовательность, расположенную около стартового сайта транскрипции, такого как, в случае промотора полимеразы II типа, элемент ТАТА. Промотор также может включать дистальные энхансеры или репрессоры, расположенные даже на расстоянии несколько тысяч пар оснований от стартового сайта транскрипции. Промоторы включают конститутивные и индуцибельные промоторы. "Конститутивным" является промотор, сохраняющий активность при большинстве обстоятельств окружающей среды или развития. Активность индуцибельного промотора контролируется эволюционными условиями или условиями окружающей среды. Термин"оперативно (операбельно) связанный" означает функциональную связь между контролирующей экспрессию нуклеотидной последовательностью (такой как промотор или массив сайтов связывания факторов транскрипции) и другой нуклеотидной последовательностью, где контролирующая экспрессию последовательность направляет транскрипцию нуклеиновой кислоты второй последовательности. Термин "TLR агонист" или "агонист Toll-подобного рецептора" (Toll-like receptor) означает здесь соединение, которое связывается с Toll-подобным рецептором и стимулирует его. Например, это могут быть агонисты рецепторов TLR-2, TLR-3, TLR-6, TLR-7 или TLR-8. TLR агонисты описаны в работахMacKichan, IA VI Report. 9:1-5 (2005) и Abreu et al, J Immunol, 174(8), 4453-4460 (2005). Агонисты индуцируют трансдукцию сигнала после связывания со своим рецептором. Термины "TLR-3 агонист" или "агонист Toll-подобного рецептора третьего типа" означает здесь соединение, которое связывается с TLR-3 и стимулирует его. TLR-3 агонисты, включают двухцепочечные РНК, вирусные дцРНК, некоторые химически синтезированные аналоги двухцепочечной РНК, включая полиинозин-полицитидиловую кислоту (поли I:C), полиадениловую-полиуридиловую кислоту (полиBiol Chem 18:38133-45 (2005)]. Агонисты TLR-3 включают также экспрессированнуюдцРНК (например,дцРНК, кодируемую нуклеиновой кислотой, последовательность которой описана в SEQ ID NOS: 3, 7, 8,9, 10, 11 или 12). Термины "TLR-7/8 агонист" или "агонист Toll-подобного рецептора типа 7/8" означает здесь соединение, которое связывается с рецепторами TLR-3 или TLR-8 и стимулирует их; некоторые лиганды распознаются теми и другими рецепторами. Было обнаружено несколько агонистов TLR-7/8, такие как вирусные одноцепочечные РНК, имихимод, локсорибин, полиуридиловая кислота или резихимод. Термин "гетерологичный" здесь с указанием на участок нуклеиновой кислоты означает, что нуклеиновая кислота содержит две или больше последовательности, не находящихся в таком же отношении друг к другу в природе. Например, это может быть нуклеиновая кислота, полученная, как правило, рекомбинантно, содержащая две или более последовательности неродственных генов, связанных так, чтобы образовать новую функциональную нуклеиновую кислоту, например, промотор из одного источника и кодирующий участок из другого источника. Аналогично вышесказанному, термин "гетерологичный белок" означает, что белок содержит две или более последовательности, не находящиеся в таком же отношении друг к другу в природе (например, химерный белок). Термины "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" здесь используются в одном смысле и означают дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды и полимеры из них в одно- либо двухцепочечной форме. Термин включает нуклеиновые кислоты, содержащие известные нуклеотидные аналоги, а также модифицированные остатки каркаса или связи, которые могут быть синтетическими, а также встречающимися и не встречающимися в природе, которые характеризуются одинаковыми свойствами связывания с нуклеиновой кислотой сравнения и которые метаболизируются так же, как и нуклеотиды сравнения. Примеры таких аналогов включают, но не ограничиваются, фосфортиоаты, фосфорамидаты, метил фосфонаты, хиральные метил фосфонаты, 2-О-метил рибонуклеотиды, комплексы пептидов и нуклеиновых кислот (PNAs - от англ. peptide-nucleic acids). Если не указано по-другому, к числу особых нуклеотидных последовательностей относятся также их консервативно модифицированные варианты (например, заместители дегенерированных кодонов) и комплементарные последовательности, а также явным образом указанные последовательности. Конкретно, замену дегенерированных кодонов можно осуществить, сгенерировав последовательности, в которых третье положение одного или более выбранных (или всех) кодонов замещено остатками различных оснований и/или деоксиинозиновыми остатками (Batzer et ai, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et ah, J.Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994. Термин "нуклеиновая кислота" используется взаимозаменяемо с терминами "ген", кДНК, мРНК, олигонуклеотид и полинуклеотид. Термин "антиген" означает белок или часть полипептидной цепочки, которая может быть распознана Т-клеточными рецепторами и/или антителами. Как правило, антигены выделяют из белков бактерий,вирусов или грибков.-4 014757 Термин "иммуногенно эффективная доза или количество" композиций настоящего изобретения означает количество, которое индуцирует или модулирует иммуногенный ответ, специфичный для гетерологичного полипептида. Иммунные ответы включают гуморальные иммунные ответы и опосредованные клетками иммунные ответы. Иммуногенная композиция может применяться терапевтически или профилактически для лечения или профилактики заболевания на любой стадии."Гуморальные иммунные ответы" опосредуются бесклеточными компонентами крови, то есть,плазмой или сывороткой; перенос сыворотки или плазмы от одного индивидуума другому переносит и его иммунитет."Опосредуемые клетками иммунные ответы" опосредуются антиген-специфичными лимфоцитами; перенос антиген-специфичных лимфоцитов от одного индивидуума другому переносит и его иммунитет."Терапевтическая доза", "терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" химерного аденовирусного вектора или композиции, содержащей химерный аденовирусный вектор,представляет собой количество вектора или содержащей вектор композиции, которое предотвращает,ослабляет, уменьшает или снижает интенсивность симптомов заболевания или расстройства, связанного с источником гетерологичного полипептида (например, вирусом, бактерией, паразитом или раком). Антитело означает полипептид, закодированный геном иммуноглобулина или его фрагментом, который специфически связывается с антигеном и распознает его. Известные гены иммуноглобулина включают гены каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю константных регионов, а также гены вариабельных регионов иммуноглобулина. Легкие цепи бывают либо каппа, либо лямда. Тяжелые цепи могут быть гамма, мю, дельта, альфа или эпсилон, они, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулина IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Т-клетки означают конкретный класс лимфоцитов, которые экспрессируют конкретный рецептор(рецептор Т-клеток), закодированный семейством генов. Известные гены рецепторов Т-клеток включают альфа, бета, дельта и гамма локусы, и, как правило (но не всегда), рецепторы Т -клеток узнают комбинацию МНС и короткого пептида. Термин "адаптивный иммунный ответ" означает распознавание антигена Т-клетками и/или антителами. Термин "антиген-представляющие клетки" (АРС - от англ. antigen presenting cells) здесь означает клетки, способные представлять иммуногенные пептиды или их фрагменты Т-клеткам, активируя или усиливая иммунный ответ. АРС включают дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, моноциты и другие клетки, которые можно сделать эффективными АРС. Такие клетки можно генетически модифицировать(но необходимости в этом нет), чтобы повысить их способность представлять антиген, чтобы улучшить активацию и/или обслуживание ответа Т-клеток, чтобы обеспечить противоопухолевые эффекты и/или чтобы сделать их иммунологически совместимыми с приемником (то есть, чтобы у них был подходящий гаплотип HLA). APC можно выделить из большого количества биологических жидкостей и органов,включая костный мозг, периферическую кровь, опухолевые и периопухолевые ткани, они могут быть автологичными, аллогеничными, сингеничными или ксеногеничными. Как правило, для представления Т клеткам коротких полипептидов в АРС используются локусы рецепторы главного комплекса гистосовместимости (МНС). Адьювант представляет собой неспецифический усилитель иммунного ответа. Подходящие адьюванты включают, например, токсин холеры, монофосфорил липид A (monophosphoryl lipid A (MPL,полный адьювант Фрейнда, неполный адьювант Фрейнда, Quil А и Al(ОН)3. Адьюванты могут также вызывать активацию АРС и улучшенную презентацию Т-клеткам посредством вторичных сигнальных молекул, таких как Toll-подобные рецепторы. Примеры Toll-подобных рецепторов включают рецепторы,распознающие двухцепочечные РНК, жгутики бактерий, LPS, CpG ДНК и бактериальные липопептиды(недавно описаны в работе Abreu et al, J Immunol, 174(8), 4453-4460 (2005. Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются здесь для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины применимы к аминокислотным полимерам, один или более остатков в которых представляют собой искусственные химические миметики соответствующих природных аминокислот, а также полимеры из природных аминокислот и неприродных аминокислот. Термин "аминокислота" означает природные и синтетические аминокислоты, а также аналоги и миметики аминокислот, функционирующие наподобие природных аминокислот. Природные аминокислоты кодируются генетическим кодом, некоторые аминокислоты затем подвергаются модификации, например, гидроксипролин, -карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аналоги аминокислот означают соединения с такой же базовой химической структурой, как и природные аминокислоты, то есть, у которых углерод связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например, гомосерин,норлейцин, метионина сульфоксид, метионина метил сульфоний. Такие аналоги содержат модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные каркасы, но сохраняют такую же базовую химическую структуру, что и природная аминокислота. Миметики аминокислот означают химические соединения, структура которых отличается от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют наподобие природных аминокислот. Аминокислоты здесь могут обо-5 014757 значаться либо их распространенным трехбуквенным обозначением, либо однобуквенным символом,рекомендованным комиссией по номенклатуре IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Аналогично этому, нуклеотиды могут обозначаться их повсеместно принятыми однобуквенными кодами. Термин "консервативно модифицированные варианты" применим как к аминокислотным, так и к нуклеотидным последовательностям. По отношению к нуклеотидным последовательностям термин обозначает нуклеиновые кислоты, кодирующие идентичные или в существенной степени идентичные аминокислотные последовательности, или, если нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, то существенно идентичные последовательности. Из-за вырожденности генетического кода любой данный белок может кодироваться большим количеством функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом,везде, где аланин обозначен кодоном, этот кодон можно заменить на любой из соответствующих указанных кодонов, не меняя закодированный им полипептид. Такие вариации нуклеиновых кислот называются "молчащими вариациями", они представляют собой разновидность консервативно модифицированных вариаций. Каждая нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, соответствует также всем возможным молчащим вариациям нуклеиновой кислоты. Специалист понимает, что каждый кодон нуклеиновой кислоты (кроме кодона AUG, который, обычно, является единственным кодоном, кодирующим метионин, и TGG, который, обычно, является единственным кодоном, кодирующим триптофан) можно модифицировать, получив функционально идентичную молекулу. Соответственно, каждая описанная последовательность неявным образом предполагает все молчащие вариации нуклеиновой кислоты, кодирующие данный полипептид. Что касается аминокислотных последовательностей, специалист понимает, что индивидуальные замены, делеции или вставки в нуклеиновую кислоту, пептид, полипептид или белковую последовательность, которые изменяют, добавляют или удаляют отдельные аминокислотные остатки или небольшое количество аминокислотных остатков в кодируемой последовательности, представляют собой консервативно модифицированные варианты, если аминокислота замещается на химически подобную аминокислоту. Таблицы консервативных замен, приводящих к получению функционально похожих аминокислот,хорошо известны в уровне техники. Такие консервативно модифицированные варианты представляют собой, помимо прочего, полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели изобретения. Следующие далее восемь групп содержат аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга: 1) Аналин (А), Глицин (G); 2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (Е); 3) Аспарагин (N), Глутамин (Q); 4) Аргинин I, Лизин (K); 5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (М), Валин (V); 6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W); 7) Серии (S), Треонин (Т); и 8) Цистеин (С), Метионин (М) (см., например, Creighton, Proteins (1984. Фраза "селективно (или специфически) гибридизуется с" означает связывание, образование дуплексов или гибридизация молекулы только с конкретной нуклеотидной последовательностью в жестких условиях гибридизации, если последовательность представлена в сложной смеси (например, общая ДНК или РНК клетки или библиотеки). Фраза "жесткие условия гибридизации" означает условия, в которых зонд будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью, как правило, в комплексной смеси нуклеиновых кислот, но не с другими последовательностями. Жесткие условия зависят от последовательности и будут различными в различных обстоятельствах. Более длинные последовательности специфически гибридизуются при более высоких температурах. Обширное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот содержится в работе Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). В общем случае, жесткие условия подбирают так, чтобы температура была, приблизительно, на 5-10 С меньше термальной точки плавления I для конкретной последовательности при определенной ионной силе Ph. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе, Ph и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зонда, комплементарного мишени, гибридизуется с целевой последовательностью в состоянии равновесия (так как целевая последовательность представлена в избытке, при температуре Tm в состоянии равновесия связано 50% зонда). При жестких условиях концентрация соли бывает меньше, чем, приблизительно, 1,0 М ионов натрия, как правило, приблизительно, от 0,01 до 1,0 М ионов натрия (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, и при температуре не меньше, чем приблизительно, 30 С для коротких зондов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и не меньше 60 С для длинных зондов (например, более 50 нуклеотидов). Жесткие условия можно создать также введением дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации положительный сигнал должен хотя бы в два раза превышать фоновую гибридизацию, а возможно, в 10 раз. Примеры жестких условий гибридизации могут быть следующие: 50% формамида, 5 SSC и 1% SDS, инкубация при 42 С, или 5 SSC, 1%SDS, инкубация при 65% с промывкой в 0,2 SSC и 0,1% SDS при 65 С. Нуклеиновые условия, которые не гибридизуются друг с другом при жестких условиях, все-таки,являются идентичными, если полипептиды, которые они кодируют, в существенной степени идентичны. Это бывает, например, если копию нуклеиновой кислоты создают с максимальным вырождением кодона,допустимым генетическим кодом. В таких случаях нуклеиновая кислота, как правило, гибридизуется при умеренно жестких условиях гибридизации. Примеры "умеренно жестких условий гибридизации" включают гибридизацию в буфере из 40% формамида, 1 М NaCl, 1% SDS при 37 С и промывку в 1 Х SSC при 45 С. Положительная гибридизация хотя бы в два раза превышает фон. Специалисты понимают, что для создания условий одной жесткости можно применять различные условия гибридизации и промывки."Антитело" означает полипептид, содержащий каркасный регион гена иммуноглобулина или его фрагментов, который специфически связывается с антигеном и распознает его. Известные гены иммуноглобулина включают константные регионы генов каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю константных регионов, а также гены переменных регионов иммуноглобулина. Легкие цепи бывают либо каппа, либо лямда. Тяжелые цепи могут быть гамма, мю, дельта, альфа или эпсилон, они, в свою очередь,определяют классы иммуноглобулина IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Пример структурной единицы иммуноглобулина (антитела) содержит тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара содержит одну "легкую"(около 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (около 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет переменный регион, состоящий, приблизительно, из 100, 110 или больше аминокислотных остатков, в основном, отвечающих за распознавание антигена. Термины "вариабельная легкая цепь" (VL) и "вариабельная тяжелая цепь" (VH) означают эти легкую и тяжелую цепи, соответственно. Фраза "специфически (или селективно) связывается с" антителом или "специфически (или селективно) иммунореактивен с" в отношении белка или пептида означает реакцию связывания, зависящую от присутствия белка в гетерогенной популяции белков и других биологических веществ. Так, в спроектированных условиях иммуноанализа специфические антитела связываются с конкретным белком, по меньшей мере, в два раза сильнее фона, и, фактически, не связываются в значительных количествах с другими белками образца. Для специфического связывания с антителом в таких условиях может потребоваться наличие антитела, специфически выбранного для конкретного белка. Например, работая с поликлональными антителами, образующимися по отношению к химерному белку, можно выделить только такие поликлональные антитела, которые специфически иммунореактивны с химерным белком, но не с индивидуальными компонентами этих белков. Этого можно добиться, вычитая антитела, перекрестно реагирующие с индивидуальными антигенами. Для выбора антител, специфически реагирующих с конкретным белком, подходят различные способы иммуноанализа. Например, твердофазный иммунохимический анализ (ELISA) рутинно используется для выбора антител, специфически иммунореактивных с белком (см., например, HarlowLane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), в этой работе содержится описание форматов иммунохимического анализа и условий, позволяющих определить специфическую иммунореактивность). Как правило, для специфической или селективной реакции отношение сигнала к шуму будет по меньшей мере два, а более типично, если это отношение составляет от 10 до 100. Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (то есть, эндогенную последовательность, кодирующую индивидуальный полипептид, дцРНК или его фрагмент), а могут содержать вариант такой последовательности. Полинуклеотидные варианты могут содержать одну или более замен,инсерций, делеций и/или вставок, так чтобы биологическая активность кодируемого полипептида не снижалась, по сравнению с полипептидом, содержащим нативные антигены. Полинуклеотидные варианты могут содержать одну или более замен, инсерций, делеций и/или вставок, так чтобы активность TLR3 агониста закодированной дцРНК не снижалась относительно дцРНК, не содержащего замен, добавлений, делеций и/или вставок. Варианты предпочтительно содержат по меньшей мере приблизительно 50,55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% от полинуклеотидной последовательности,кодирующей нативный полипептид или его фрагмент, или полинуклеотидной последовательности, кодирующей дцРНК с активностью TLR-3 агониста. Термины "идентичный" или процент "идентичности" в контексте двух или более нуклеотидных(например, дцРНК, являющейся агонистом TLR-3) или полипептидных последовательностей означает две или более последовательности или субпоследовательности, одинаковых или содержащих указанное количество общих аминокислотных остатков или нуклеотидов (то есть, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90,91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или еще большая идентичность в указанной области) при сравнении и выравнивании для достижения максимального соответствия в окне сравнения или указанном регионе,причем сравнение осуществляется по одному из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или вручную с визуальным изучением. Такие последовательности затем называют "в значительной степени идентичными". Определение относится также к комплементу тестируемой последовательности. Возможно, что идентичность наблюдается в регионе, содержащем по меньшей мере приблизительно от 10 до 100, от 20 до 75, от 30 до 50 аминокислотных остатков или нуклеотидов. При сравнении последовательностей, как правило, одна последовательность является последовательностью сравнения, и с ней сравнивают тестируемые последовательности. Если используется алго-7 014757 ритм сравнения последовательностей, тестируемую последовательность и последовательность сравнения вводят в компьютер, задают координаты последовательности, если необходимо, и параметры алгоритма сравнения. Затем алгоритм рассчитывает процент идентичности последовательностей по отношению к последовательности сравнения, используя при этом параметры программы."Окно сравнения" здесь означает сегмент из любого количества расположенных подряд нуклеотидов (аминокислот), приблизительно, от 10 до 500, от 25 до 200, от 50 до 150, последовательность которого можно сравнивать с таким же количеством расположенных подряд нуклеотидов последовательности сравнения после их оптимального выравнивания. Методы выравнивания последовательностей (sequencealignment) для их сравнения хорошо известны в уровне техники. Оптимальное выравнивание последовательностей можно провести, например, по алгоритму локальной гомологии (SmithWaterman, Adv.Appl. Math. 2:482 (1981, по алгоритму гомологичного выравнивания (NeedlemanWunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970, по методу поиска сходства (PearsonLipman, Proc. Nat 'I. Acad. Sd. USA 85:2444 (1988,с помощью компьютерной реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA из пакета программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), a также можно выровнять последовательности вручную с последующим визуальным исследованием (см.,например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement. Одним примером полезного алгоритма является PILEUP. Он выравнивает несколько последовательностей в группе родственных последовательностей с использованием прогрессивного, попарного выравнивания, позволяющего показать отношения между последовательностями и процент идентичности. Алгоритм позволяет также построить дерево или дендрограмму с иллюстрацией отношений кластеризации, на основании которых создается выравнивание. В PILEUP используется упрощенный вариант метода прогрессивного выравнивания Фенга и Дулиттла (FengDoolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360(1987. Реализованный метод аналогичен описанному в работе HigginsSharp, CABIOS 5:151 -153(1989). Программа может выровнять до 300 последовательностей, максимальная длина каждой 5000 нуклеотидов или аминокислот. Процедура множественного выравнивания начинается с попарного выравнивания двух наиболее похожих последовательностей с получением кластера из двух выровненных последовательностей. Этот кластер затем выравнивается к следующей наиболее похожей последовательности или кластеру выровненных последовательностей. При выравнивании двух кластеров последовательностей используется простое расширение метода попарного выравнивания двух индивидуальных последовательностей. Общее выравнивание достигается в результате серии прогрессивных попарных выравниваний. При запуске программы задают конкретную последовательность, а также координаты аминокислотного остатка или нуклеотида ее участка сравнения и параметры программы. С помощью PILEUP последовательность сравнения сравнивают с другими тестовыми последовательностями и определяют отношение идентичности последовательностей в процентах. Параметры задаются следующие: весовой зазор по умолчанию (3.00), весовой зазор длины по умолчанию (0.10), а также взвешенные зазоры концевых участков. PILEUP входит в состав программного пакета анализа последовательностей GCG, например, версии 7.0 (Devereaux et ah, Nuc. Acids Res. 12:387395 (1984). Другим примером алгоритма, подходящего для определения процентной идентичности и сходства последовательностей являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, описанные в работах Altschul et al., Nuc.Acids Res. 25:3389-3402 (1977) и Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), соответственно. Программное обеспечение для проведения анализа BLAST доступно публично в Национальном центре биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/. Прежде всего, он связан с идентификацией так называемых пар последовательностей высокого счета (high scoring sequence pairs (HSP), для чего сначала находятся короткие слова длины W в последовательности запроса, которые при выравнивании со словом такой же длины из последовательности базы данных либо соответствуют этому слову, либо удовлетворяют некоторому положительному пороговому значению Т. Параметр Т называют пороговым счетом слова соседства (neighborhood wordscore threshold (Altschul et al, там же). Исходное слово соседства представляет собой семя для инициации поиска содержащих его более длинных HSP. Затем это слово удлиняется в обоих направлениях последовательности до тех пор, пока возрастает общий счет выравнивания. Для определения общего счета в случае нуклеотидных последовательностей используют параметры М ("награда" для пары соответствующих остатков всегда больше 0) и N ("наказание" для пары несоответствующих остатков всегда меньше 0). В случае аминокислотных последовательностей кумулятивный счет подсчитывают с помощью матрицы счета. Удлинение слова в каждом направлении останавливается, если: кумулятивный счет выравнивания падает ниже величины X; он падает до 0 или ниже, из-за появления одного или больше выравниваний остатков с отрицательным счетом, а также при достижении конца последовательности. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN(для последовательностей нуклеотидов) используются по умолчанию следующие значения параметров: длина слова W = 11, ожидание Е = 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. В случае аминокислотных последовательностей используются по умолчанию следующие значения параметров: длина слова 3, ожидание (Е) 10 и матрица счета BLOSUM62 (см. HenikoffHenikoff, Proc. Natl. Acad. ScL USA 89:10915(1989 выравниваний (В) 50, ожидание (Е) 10, M=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Алгоритм BLAST выполняет также статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, KarlinAltschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993. Одной предоставляемой алгоритмом характеристикой сходства является вероятность минимальной суммы (P(N, указывающая вероятность того, что соответствие между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями осуществится случайно. Например, нуклеиновая кислота считается такой же, что и последовательность сравнения, если вероятность минимальной суммы при сравнении между ними менее чем приблизительно 0,2, более предпочтительно, если менее 0,01, и наиболее предпочтительно, если менее 0,001.III. Композиции настоящего изобретения. Изобретение относится к композициям, содержащим химерные аденовирусные векторы. В соответствии с некоторыми аспектами химерные аденовирусные векторы изобретения содержат первый промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, которая кодирует гетерологичный полипептид, и второй промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, которая кодирует TLR3 агонист. Первый и второй промоторы могут быть одинаковыми или различными. В соответствии с некоторыми аспектами первый и второй промоторы независимо выбраны из числа промотора бета-актина и промотора ЦМВ. В соответствии с некоторыми аспектами химерные аденовирусные векторы содержат аденовирусный геном (без генов Е 1 и Е 3) и нуклеиновую кислоту, кодирующую ген, который активирует IRF-3 и другие сигнальные молекулы ниже TLR-3. Химерный вектор можно вводить в клетку, которая экспрессирует ген Ad E1, так что клетка будет продуцировать рекомбинантный аденовирус (rAd). Этот rAd можно выделить, после чего он будет способен осуществить один раунд инфекции, которая введет трансгенную композицию в другую клетку млекопитающего, чтобы индуцировать иммунный ответ на гетерологичный полипептид. А. Подходящие аденовирусные векторы. В соответствии с некоторыми аспектами аденовирусный вектор представляет собой аденовирус 5,включая, например, Ad5 с делецией участков Е 1/Е 3 и Ad5 с делецией участка Е 4. Другие подходящие аденовирусные векторы включают штаммы 2, орально протестированные штаммы 4 и 7, энтерические аденовирусы 40 и 41 и другие штаммы (например, Ad34), которых достаточно для введения антигена и индукции адаптивного иммунного ответа на трансгенный антиген [Lubeck et al, Proc Natl Acad Sci USA,86(17), 6763-6767 (1989); Shen et al, J Virol, 75(9), 4297-4307 (2001); Bailey et al, Virology, 202(2), 695-706(1994)]. В соответствии с некоторыми аспектами аденовирусный вектор представляет собой живой, некомпетентный по репликации аденовирусный вектор (такой как rAd5 с делецией по Е 1 и Е 3), живой и ослабленный аденовирусный вектор (такой как вирусы с делецией Е 1B55K) или живой аденовирусный вектор с репликацией дикого типа. Транскрипционная и трансляционная управляющие последовательности векторов экспрессии, используемые для трансформации клеток позвоночных животных in vivo, можно получить из вирусных источников. Например, обычно используемые промоторы и усилители получают, например, из бетаактина, аденовируса, обезьяньего вируса (SV40), а также цитомегаловируса человека (ЦМВ). Например,подходят векторы, делающие возможной экспрессию белков под управлением ЦМВ промотора, раннего промотора SV40, позднего промотора SV40, металлотионеинового промотора, промотора мышиного вируса опухолей, промотора вируса саркомы Роуса, промотор трансдукции или других промоторов, эффективных для экспрессии в клетках млекопитающих. Можно использовать и другие вирусные генетические промоторы, управляющие и/или сигнальные последовательности, если только такие сигнальные последовательности совместимы с клеткой-хозяином. В. Гетерологичные полипептиды. Нуклеиновые кислоты, кодирующие подходящие гетерологичные полипептиды, можно выделить из антигенов, таких как, например, вирусные антигены, бактериальные антигены, раковые антигены, грибковые антигены или антигены паразитов. Вирусные антигены можно получить, например, из следующих источников: вирус иммунодефицита человека, например, gag (р 55 и p160), pol, env (gp120 и gp41), как описано в работе Shiver et al. Nature 415(6869):331 (2002); последовательности генома ВИЧ доступны из Genbank с номерами доступа EF363127, EF363126,EF363125, EF363124, EF363123, EF363122, EF192592 и EF192591; ВИЧ gag последовательности имеют номера доступа EF396891, EF396890, EF396889, EF396888,EF396887, EF396886, EF396885, EF396884, EF396883, EF396882, EF396881, EF396880, EF396879,EF396878, EF396877, EF396876, EF39687, EF396874, EF396873 и EF396872; ВИЧ pol последовательности имеют номера доступа Genbank EF396810, EF396809, EF396808,EF396807, EF396806, EF396805, EF396804, EF396803, EF396802, EF396801, EF396800, EF396799,EF396798, EF396797, EF396796, EF396795, EF396794, EF396793, EF396792 и EF396791; ВИЧ env последовательности имеют номера доступа Genbank EF367234, EF367233, EF367232,EF367231, EF367230, EF367229, EF367228, EF367227, EF367226, EF367225, EF367224 и EF367223;-9 014757 вирус папилломы человека (например, белка капсида L1, описанного, например, в работе Donnellyet al. J Infect Dis. 173:314 (1996) и последовательностей с номерами доступа Genbank EF362755,EF362754, NC001694, NC001693, NC001691, NC001690, NC005134, NC001458, NC001457,NC001354, NC001352, NC001526 и Х 94164); вирус Эпштейна Бара, простой вирус герпеса, вирус герпеса человека, риновирус, коксакивирус,энтеровирус, гепатиты А, В, С и Е (например, поверхностный антиген вируса гепатита В, описанный,например, в работе Lubeck et al., PNAS USA 86:6763 (1989) и последовательностей с номерами доступаVariella-zoster virus. Антигены гриппа включают, например, гемагглютинин (НА), матриксный белок 1 (М 1) и нуклеопротеин (NP) (см., например, Donnelly, et al, Vaccine 15:865 (1997) и последовательности НА гриппа с номерами доступа Genbank АВ 294219, АВ 294217, АВ 294215, АВ 294213, EF102944, EF102943, EF102942,EF102941, EF102940, EF102939, EF102938, EF102937, EF102936, EF102935, EF102934, EF102933,DQ643982, DQ464354, CY019432, CY019424, CY019416, CY019408, CY019400, CY019392, CY019384,CY019376, CY019368, CY019360, CY019352, EF124794, EF110519, EF110518, EF165066, EF165065,EF165064 и EF165063; последовательности гриппа М 1 с номерами доступа Genbank AB292791, CY019980, CY019972,CY019964, CY019956, CY019948, CY019940, CY019628, CY019652, CY019644, CY019932, CY019924,CY019916, CY019908, CY019900, CY019892, CY019884, CY019876, CY019868, CY019860 и последовательности гриппа NP с номерами доступа Genbank AB292790, CY019461, CY019974,CY019966, CY019958, CY019950, CY019942, CY019630,CY019654, CY019646, CY019934, CY019926, CY019918 CY019910, CY019902, CY019894,CY019886, CY019878, CY019870 и CY019862. Подходящие вирусные антигены включают, например, вирусные неструктурные белки. Термин"вирусный неструктурный белок" здесь означает белки, кодируемые вирусной нуклеиновой кислотой,которая не кодирует структурные полипептиды, такие как компоненты капсида или окружающие вирус. Неструктурные белки включают белки, инициирующие репликацию вирусной нуклеиновой кислоты и экспрессию генов вируса, таких как, например, неструктурные белки 1, 2, 3 и 4 (NS1, NS2, NS3 и NS4,соответственно) Венесуэльского конского энцефалита (VEE), ЕЕЕ или вируса леса Семлики [Dubensky etal, J Virol, 70(1), 508-519 (1996); Petrakova et al J Virol 2005 79(12): 7597-608; патент США 5185440,5739026, 6566093 и 5814482]. Несколько репрезентативных примеров подходящих альфавирусов включают Aura (ATCC VR-368), вирус Bebaru (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), Cabassou (Genbank номера доступа AF398387, ATCC VR-922), вирус чикугуньи (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), вирус восточного конского энцефаломиелита (Genbank номера доступа AY705241, AY705240, ATCC VR-65, ATCC VR1242), Форт Морган (ATCC VR-924), вирус Гетах (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Кизилагах (ATCCVR-1245), вирус Росс Ривер (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), лес Семлики (Genbank номера доступаAJ251359, ATCC VR-67, ATCC VR-1247), вирус Синдбиса (Genbank номера доступа J02363, ATCC VR68, ATCC VR-1248), Тонат (АТСС VR-925), Тринити (ATCC VR-469), Уна (АТСС VR-374), Венесуэльский конский энцефаломиелит (АТСС VR-69), вирус Венесуэльского конского энцефаломиелита (Genbank номера доступа AY986475, AY973944, NC 001449, АТСС VR-923, АТСС VR-1250 АТСС VR-1249,АТСС VR-532), Западный конский энцефаломиелит (АТСС VR-70, АТСС VR-1251, АТСС VR-622,АТСС VR-1252), Вхатароа (АТСС VR-926) и Y-62-33 (АТСС VR-375). Бактериальные антигены можно выделить, например, из Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Helicobacter pylori, Streptococcus bovis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Listeriatrachomatis и Shigella dysenteriae, Vibrio cholera (например, субъединица В токсина холеры с номерами доступа Genbank U25679, А 09803, EF158842, Х 76391, AF390572, сорегулируемые с токсином холеры пили (TCP), описанные в работе Wu et al, Infection and Immunity Vol. 69(12):7695 (2001) и в Genbank номера доступа NC002505 и АЕ 004169), Helicobacter pylorii (VacA, в соответствии с Genbank номера доступа AY848858, AF042737, AF042736, AF042735, AF042734 и NC000921; CagA с номерами доступаAF227080, AF227079, AF227078, AF227077, AF227076, AF227075 и AF227074; Hsp или каталаза в соответствии с Genbank номера доступа NC000921; уреаза в соответствии с Genbank номера доступа АМ 417610, АМ 417609, АМ 417608, АМ 417607, АМ 417606, АМ 417605, АМ 417604, АМ 417603,АМ 417602, АМ 417601 и АМ 417600; антигены Е. coli в соответствии с Genbank номера доступаNC000913, U00096, NC002655, BA000007, АЕ 014075, включая фимбриальные антигены Е. coli, имеющие номера доступа в Genbank AB214865, АВ 214864, АВ 214863, АВ 214862; термолабильный энтеротоксин Е. coli с номерами доступа Genbank Х 83966, V00275, Х 83966, JOI 646, V00275, М 35581, М 17873,М 17874, K01995, М 61015, М 17894, М 17101 и К 00433. Антигены паразитов можно получить, например, из Giardia lamhlia, Leishmania sp., Trypanosoma sp.,Trichomonas sp., Plasmodium sp. (например, антигены белков поверхности P.faciparum, такие как последовательности pfs25, описанные в Genbank номера доступа ХМ 001347551, X07802, AF193769,AF179423, AFI 54117 и AF030628, последовательности pfs28, имеющие номера доступа в GenbankL25843, последовательности pfs45, описанные в Genbank с номерами доступа EF158081, EF158079,EF158078, EF158076, EF158075 и EF158085, последовательности pfs84, pfs 48/45, описанные в Genbank с номерами доступа AF356146, AF356145, AF356144, AF356143, AF356142, AF356141, AF356140,AF356139, AF356138, AF356137, AF356136, AF356135, AF356134, AF356133, AF356132, AF356131,AF35613O, AF356129, AF356128, AF356127, последовательности pfs 230, описанные в Genbank с номерами доступа NC000910, XM001349564, АЕ 001393, L22219, L08135 и AF269242, антигены P. vivax,такие как последовательности Pvs25, описанные в Genbank с номерами доступа DQ641509, DQ641508,DQ641507, AY639972, AY639971, AY639970, AY639969, AY639968, AY639967, AY639966 и AY639965,и последовательности Pvs28, описанные в Genbank с номерами доступа АВ 033364, АВ 033363, АВ 033362,АВ 033361, АВ 033360, АВ 033359, АВ 033358, АВ 033357, АВ 033356, В 033355, АВ 033354, АВ 033353,АВ 033352, АВ 033351, АВ 033350, АВ 033349, АВ 033348, АВ 033347, АВ 033346 и АВ 033345), Schistosomasp., Mycobacterium tuberculosis (например, последовательности Ag85, описанные в Genbank с номерами доступа АХ 253506, АХ 253504, АХ 253502 и АХ 211309, последовательности МРТ 64, ESAT-6, CFP10,R8307, МТВ-32 МТВ-39, CSP, LSA-I, LSA-3, EXPI, SSP-2, SALSA, STARP, GLURP, MSP-I, MSP-2,MSP-3, MSP-4, MSP-5, MSP-8, MSP-9, интегрального мембранного белка АМА-15 Тип 1, RESA, ЕВА 175 и DBA, описанные в Genbank с номерами доступа ВХ 842572, ВХ 842573, ВХ 842574, ВХ 842575,ВХ 842576, ВХ 842577, ВХ 842578, ВХ 842579, ВХ 842580, ВХ 842581, ВХ 842582,ВХ 842583, ВХ 842584 иNC000962, последовательности HSP65, описанные в Genbank с номерами доступа AY299175,AY299174, AY299144, AF547886 и AF547885). Раковые антигены включают, например, антигены, экспрессируемые при раке толстой кишки, раке желудка, поджелудочной железы, легкого, яичников, простаты, молочной железы, кожи (например, меланома), при лейкемии, лимфоме или миеломе, примеры раковых антигенов включают, например, HPVL1, HPV L2, HPV E1, HPV E2, плацентарную щелочную фосфатазу, AFP, BRCA1, Her2/neu, СА 15-3, СА 19-9, СА-125, СЕА, Hcg, активатор плазминогена урокиназного типа (Upa), ингибитор активатора плазминогена. Антигены грибков можно получить, например, из Tinea pedis, Tinea corporus, Tinea cruris, Tinea unguium, Cladosporium carionii, Coccidioides immitis, Candida sp., Aspergillus fumigatus и Pneumocystiscarinii. Нуклеиновые кислоты, кодирующие иммуногенные полипептиды, как правило, получают методами рекомбинированияДНК(см., например, Ausubel, et al. ed. (2001) Current Protocols in Molecular Biology). Например, последовательности ДНК, кодирующие иммуногенные полипептиды, можно собрать из фрагментов кДНК и коротких полипептидных линкеров, или из серии нуклеотидов, или амплифицировать из кДНК с использованием соответствующих праймеров с получением синтетического гена, который может быть включен в рекомбинантный вектор экспрессии (то есть, в плазмидный или вирусный вектор) и экспрессирован в рекомбинантную единицу транскрипции. После получения нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуногенный полипептид, ее можно включить в рекомбинантный вектор экспрессии, подходящий для экспрессии in vivo или ex vivo. Рекомбинантные векторы экспрессии содержат последовательность ДНК, кодирующую иммуногенный полипептид и оперативно связанную с подходящими транскрипционными или трансляционными регуляторными элементами, выделенными из генов млекопитающих или вирусов. Такие регулирующие элементы включают промотор транскрипции, дополнительную операторную последовательность для контроля транскрипции (необязательно), последовательность, кодирующую подходящие рибосомальные сайты связывания мРНК, а также последовательность, контролирующую остановку транскрипции и трансляции. Можно также включить источник репликации и выбираемый маркер для облегчения распознавания трансформантов. Гены, используемые в рекомбинантных векторах экспрессии, можно разделить между несколькими вирусами, так что образующиеся гены будут кодироваться двумя различными векторами, и эти векторы совместно будут получать генные продукты в трансформантах. Причины разделения генов включают ограничения на вставки по размерам и токсичность комбинированных генетических продуктов для образующихся с помощью вирусов клеточных линий. С. TLR агонисты. В соответствии со способами изобретения TLR применяются для усиления иммунного ответа на ге- 11014757 терологичный полипептид. В соответствии с некоторыми аспектами используются TLR-3 агонисты. В соответствии с другими аспектами, используются TLR 7/8 агонисты. Описанные здесь TLR агонисты можно вводить совместно с вектором экспрессии, кодирующим интересующий антиген, а также отдельно (то есть, пространственно или временно) от этого вектора. Например, вектор экспрессии можно вводить по непарентеральному маршруту (например, орально, интраназально или мукозально), а TLRагонист будет вводится по парентеральному маршруту (например, внутримышечно, внутрибрюшинно или подкожно). 1. TLR-3 агонисты. В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения TLR-3 агонист используется для стимулирования иммунного распознавания интересующего антигена. TLR-3 агонисты включают,например, короткие шпильки РНК, вирусную РНК, короткие сегменты РНК, которые могут формировать двухцепочечные РНК или короткие шпильки РНК, а также короткую интерферирующую РНК (siRNA). В соответствии с одним аспектом изобретения, TLR-3 агонист представляет собой вирусную дцРНК, такую, как, например, дцРНК из вируса Синдбис (Sindbis) или вирусные интермедиаты дцРНК [Alexopoulou et al, Nature 413:732-8 (2001)]. В соответствии с некоторыми аспектами TLR-3 агонисты представляют собой короткие РНК шпильки. Такие последовательности, как правило, содержат две комплементарные последовательности, объединенные линкерной последовательностью. Конкретная линкерная последовательность не является критическим аспектом изобретения. Может использоваться любая подходящая линкерная последовательность, если только она не мешает связыванию двух линкерных последовательностей с образованием дцРНК. В соответствии с некоторыми аспектами короткие шпильки РНК содержат последовательность,описанную в SEQ ID NOS: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 или 12, последовательность, в значительной степени идентичную последовательности из SEQ ID NOS: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 или 12, или вариант последовательности с SEQ ID NOS: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 или 12. В соответствии с некоторыми аспектами дцРНК, представляющая собой TLR-3 агонист, не кодирует конкретный полипептид, но продуцирует провоспалительный цитокин (например, IL-6, IL-8, TNF-альфа, IFN-альфа, IFN-бета) при взаимодействии с респондерной клеткой (например, дендритной клеткой, моноядерной клеткой периферической крови или макрофагом)in vitro или in-vivo. Иногда кодирующая TLR-3 агонист нуклеиновая кислота (например, экспрессированная дцРНК) и химерный аденовирусный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует гетерологичный антиген, вводятся в одном составе. В других случаях кодирующая TLR-3 агонист нуклеиновая кислота и химерный аденовирусный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует гетерологичный антиген, вводятся по отдельности. Если кодирующая TLR-3 агонист нуклеиновая кислота и химерный аденовирусный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует гетерологичный антиген, вводятся по отдельности, то это введение может быть одновременным или последовательным. Например, сначала можно ввести кодирующую TLR-3 агонист нуклеиновую кислоту, а затем химерный аденовирусный вектор (например, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 или 24 ч, а также 2, 4, 6, 8 или 10 дней спустя). В соответствии с некоторыми аспектами, кодирующая TLR-3 агонист нуклеиновая кислота и нуклеиновая кислота, которая кодирует гетерологичный антиген, находятся под контролем одного и того же промотора. В соответствии с другим и аспектами, кодирующая TLR-3 агонист нуклеиновая кислота и нуклеиновая кислота, которая кодирует гетерологичный антиген, находятся под контролем различных промоторов. Коммерчески доступно несколько химически синтезированных аналогов двухцепочечной РНК. Эти аналоги включают полиинозин-полицитидиловую кислоту (поли I:C), полиаденилполиуридиловую кислоту (поли A:U), а также поли I:поли С. Антитела (или перекрестно сшитые антитела) к TLR-3 могут также вести к продукции IFN-бета или провоспалительных цитокинов [Matsumoto etal, Biochem. Biophys. Res. Commun. 24:1364 (2002), de Bouteiller et al, J Biol. Chem. 18:38133-45 (2005)]. Коммерчески доступные сегменты siRNA любой последовательности могут также быть получены, в частности, от Invitrogen. 2. TLR7/8 агонисты. В соответствии с некоторыми аспектами TLR агонисты представляют собой TLR7/8 агонисты. Как правило, TLR7/8 лиганды - это одноцепочечные РНК вирусной природы. Поскольку рецепторы экспрессируются во внутриклеточных компартментах, таких как эндосомы, то не все короткие сегменты РНКзапускают сигнальный каскад TLR7/8; это связано с тем, что им надо достичь корректного компартмента. Примерами лигандов, которые, как показано, запускают этот процесс при добавлении экзогенно, являются полиуридиловая кислота, резихимод и имихимод [Westwood, et al, Vaccine 24:1736-1745(2006)].IV. Фармацевтические композиции. Фармацевтические композиции, содержащие описанные здесь векторы, могут также содержать другие компоненты, которые могут быть биологически активны или неактивны. Полипептиды могут быть (а могут и не быть) конъюгированы с другими описанными макромолекулами, например, в патентах США 4372945 и 4474757. Фармацевтические композиции могут, в целом, быть использованы для профилактических и терапевтических целей. Фармацевтические композиции могут составляться способами,защищающими от разложения в желудке, так что введенные химерные аденовирусные векторы могли бы достичь требуемых мест в организме. Для орального введения доступно несколько таких композиций,- 12014757 включая системы высвобождения Eudragit и TimeClock, а также другие способы, специально разработанные для аденовирусов [Lubeck et ah, Proc Natl Acad Sd USA, 86(17), 6763-6767 (1989); Chourasia and Jain,J Pharm Pharm Sci, 6(1), 33-66 (2003)]. Описано также еще несколько методов для микроинкапсулирования ДНК и лекарств, предназначенных для введения орально (см., например, заявку на патент США 2004/043952). В соответствии с некоторыми аспектами, система Eudragit может использоваться для доставки химерных аденовирусных векторов в нижнюю часть тонкого кишечника. Однако лекарства могут доставляться также и в другие участки тонкого кишечника. Как уже упоминалось, химерные аденовирусные векторы изобретения можно вводить с использованием любой системы доставки, известной специалистам в соответствующей области. Известно много технологий введения генов, некоторые из них описаны в работе Rolland (1998) Crit. Rev. Therap. DrugCarrier Systems 15:143-198 и процитированных там ссылках. Очевидно, что иммуногенные композиции могут содержать фармацевтически приемлемые соли полинуклеотидов, кодирующих гетерологичные полипептиды (например, иммуногенные полипептиды). Такие соли можно получить из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований, включая органические основания (например, соли первичных, вторичных и третичных аминов и основных аминокислот) и неорганические основания (например, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция и магния). Конкретные примеры солей включают забуференный фосфатом физиологический раствор и физиологический раствор для инъекций. В составе фармацевтических композиций изобретения может использоваться любой подходящий носитель, известный специалистам. Подходящие носители включают, например, воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск, буфер, твердый носитель, такой как маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния,сахаринат натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния, или биодеградируемые микросферы (например, полилактата полигликолят). Подходящие биодеградируемые микросферы описаны,например, в патентах США 4897268, 5075109, 5928647, 5811128 и 5820883. Иммуногенный полипептид и/или вирус-носитель можно инкапсулировать в биодеградируемую микросферу или связать с ее поверхностью. Такие композиции могут также содержать буферы (например, нейтральный забуференный физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор), углеводы (например, глюкозу, маннозу, сахарозу или декстраны), маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин, антиоксиданты, бактериостатики, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА или глутатион, адьюванты (например, гидроксид алюминия), растворы, делающие состав изотоническим, гипотоническим или слегка гипертоническим по отношению к крови реципиента, суспендирующие агенты, уплотняющие агенты и/или консерванты. Альтернативно, композиции настоящего изобретения можно получить в виде лиофилизатов. Соединения можно также инкапсулировать в липосомы, используя хорошо известные методы. В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения, композиции также содержат адьювант. Подходящие адьюванты включают, например, липиды и не-липидные соединения, токсин холеры (СТ), субъединицу В СТ, производное СТ под названием СТК 63, лабильные энтеротоксин Е. coli(1978), а также Crowle и May, Infect. Immun. 38(3):932-7(1982. Подходящие полиионные органические кислоты включают, например, 6,6'-[3,3'-диметил[1,1'-бифенил]-4,4'-диил]бис(азо)бис[4-амино-5-гидрокси-1,3-нафталит-дисульфоновая кислота] (Evans Blue) and 3,3'-[1,1'-бифенил]-4,4'-диилбис(азо)бис[4 амино-1-нафталинсульфоновая кислота] (Congo Red). Специалист понимает, что полиионные органические кислоты могут использоваться в любом методе генетической вакцинации совместно с любым типом введения. Другие подходящие адьюванты включают местные иммуномодуляторы, такие как члены семейства имидазохинолинов, например, имихимод и резихимод (см., например, Hengge et al, Lancet Infect. Dis. l(3): 189-98 (2001). В настоящем изобретении могут также использоваться экспрессированные TLR-3 агонисты (например, дцРНК) и TLR-7 агонисты (например, ssRNA). Другие коммерчески доступные подходящие адьюванты включают, например, дополнительные адьюванты из алюмокалиевых квасцов (например, Альгидрогель, Регидрогель, фосфат алюминия, Альгаммулин); адьванты на масле (полный и неполный адьюванты Фрейнда (Difco Laboratories, Detroit, Mich.), Спекол, RIBI, TiterMax, Монтанид MONTANIDE ISA50 или Seppic MONTANIDE ISA 720); неионные блок-сополимерные адьюванты; цитокины(например, GM-CSF или Flat3-лиганд); Адьювант Мерка Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc.,Rahway, N. J.); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.); соли кальция, железа или цинка; нерастворимую суспензию ацилированного тирозина; ацилированные сахара; катионно или анионно дериватизированные полисахариды; полифосфазены; биодеградируемые микросферы; монофосфорил липид А и цитокины Quil A. Цитокины, такие как GM-CSF или интерлейкин-2, -7 или -12, также представляют собой подходящие адьюванты. В изобретении могут также использоваться гемоцианины (например, гемоцианин мор- 13014757 ского моллюска фиссуреллии) и гемоэритрины. В качестве адьювантов подходят также полисахаридные адьюванты, такие как, например, хитин, хитозан и деацетилированный хитин. Другие подходящие адьюванты включают мурамил дипептид (MDP, N ацетилмурамил L аланил D изоглутамин), бактериальные пептидоглюканы и их производные (например, треонил-MDP и МТРРЕ). Может использоваться также скелетон клеточной стенки BCG и BCG (CWS) совместно или без димиколята трегалозы. Последний может использоваться и сам по себе (см., например, патентСША 4579945). В качестве адьювантов полезны также детоксифицированные эндотоксины, самостоятельно или совместно с другими адьювантами(см., например, патенты США 4866034, 4435386, 4505899, 4436727, 4436728, 4505900 и 4520019). Могут использоваться также сапонины QS21, QS17, QS7 (см., например, патент США 5057540, ЕР 0362279, WO 96/33739 и WO 96/11711). Другие подходящие адьюванты включают Монтанид MontanideISA 720 (Seppic, France), SAF (Chiron, Calif., United States), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), серию адьювантов SBAS (например, SBAS-2, SBAS-4 или SBAS-6 или их варианты, доступные в компании SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium), Детокс Detox (Corixa, Hamilton, Mont.), а также RC-529 (Corixa, Hamilton, Mont). В качестве адьюванта в настоящем изобретении могут использоваться также суперантигены. Суперантигены включают экзопротеины Staphylococcus, такие как иэнтеротоксины из S. aureus и S.epidermidis, а также , ,иэкзотоксины Е. coli. Обычные энтеротоксины Staphylococcus называются стафилококкальным энтеротоксином A (SEA) и стафилококкальным энтеротоксином В (SEB), но описаны энтеротоксины вплоть до Е (SEE) (Rott et al., 1992). Используются также такие суперантигены, какStreptococcus пиоген В (SEB), энтеротоксин Clostridium perfringens (Bowness et al., 1992), цитоплазмический связанный с мембраной белок (CAP) из S. pyogenes (Sato et al, 1994) и токсин 1 синдрома токсического шока (toxic shock syndrome toxin 1 (TSST 1 из S. aureus (Schwab et al., 1993). В состав описанных здесь фармацевтических композиций можно включать специальные адьювантные композиции для того, чтобы индуцировать, например, иммунный ответ, в основном, типа Th1 илиTh2. Высокое содержание цитокинов Th1 (например, IFN-гамма, TNF-альфа, IL-2 и IL-12) благоприятствует индукции опосредованного клетками иммунного ответа на введенный антиген. Напротив, высокое содержание цитокинов Th2 (например, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10) благоприятствует индукции гуморальных иммунных ответов. После орального введения содержащей иммуногенный полипептид композиции,описанной здесь, как правило, развивается иммунный ответ, включающий ответы типов Th1 и Th2. Описанные здесь композиции можно вводить в составе задержанного высвобождения (то есть, таком составе, как капсула или пилюля, которая приводит к медленному выделению соединения после введения). Такие составы могут, в целом, быть приготовлены по хорошо известным технологиям (см., например, Coombes et al. (1996) Vaccine 14:1429-1438). Составы задержанного высвобождения могут содержать полипептид, полинуклеотид или антитело, диспергированное в матрице-носителе и/или содержащееся в резервуаре, окруженном мембраной, которая контролирует скорость высвобождения. Используемые в таких составах носители должны быть биосовместимы и могут также быть биодеградируемыми; предпочтительно, чтобы состав обеспечивал относительно постоянную скорость высвобождения активного компонента. Такие носители включают микрочастицы поли(лактид-ко-гликолида), а также полиакрилат, латекс, крахмал, целлюлозу и декстран. Другие носители замедленного высвобождения включают супрамолекулярные био-векторы, которые содержат нежидкое гидрофильное ядро (например, перекрестно сшитый полисахарид или олигосахарид) и, возможно, внешний слой, состоящий из амфифильного соединения (см., например, WO 94/20078, WO 94/23701 и WO 96/06638). Количество активного соединения, содержащегося в составе задержанного высвобождения, зависит от места введения,скорости и ожидаемой продолжительности высвобождения, а также от природы состояния, которое требуется вылечить или предотвратить. Фармацевтические композиции могут быть представлены в виде контейнеров для одной или нескольких доз, такие как закупоренные ампулы или сосуды. Подобные контейнеры предпочтительно герметически закупоривают, чтобы сохранить стерильность препарата до его использования. В целом составы можно хранить в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях. Альтернативно фармацевтическую композицию можно хранить в лиофилизированном состоянии, когда непосредственно перед использованием к ней требуется добавить стерильный водный носитель.V. Терапевтическое применение изобретения. Один аспект настоящего изобретения предполагает использование описанных здесь иммуногенных композиций для индукции антиген-специфического иммунного ответа у субъекта или пациента с таким заболеванием, как, например, вирусная инфекция, бактериальная инфекция, паразитарная инфекция,грибковая инфекция или рак. Здесь термин "субъект" или "пациент" означает любое теплокровное животное, такое как, например, грызун, кошка, собака, примат, предпочтительно, человек. Иммуногенные композиции могут использоваться для лечения на любой стадии заболевания, то есть, на предраковой стадии, во время рака, на этапе метастаз или для предотвращения болезни. Например, описанные здесь композиции могут использоваться для лечения вирусного заболевания, такого как ВИЧ или гепатит, а также для профилактики или лечения рака. В рамках указанных методов фармацевтическую компози- 14014757 цию, как правило, вводят пациенту. У пациента может быть, а может и не быть заболевание или расстройство (например, вирусная инфекция, бактериальная инфекция или рак). Соответственно, упомянутые выше фармацевтические композиции могут использоваться для профилактики развития заболевания или расстройства (например, вирусной инфекции, бактериальной инфекции или рака) или для лечения пациентов, страдающих от заболевания или расстройства (например, вирусной инфекции, бактериальной инфекции или рака). Заболевание или расстройство может быть диагностировано на основании критериев, общепринятых в уровне техники. Например, вирусную инфекцию можно диагностировать, измеряя титр вирусов в образце, взятом у пациента, бактериальную инфекцию можно диагностировать, обнаружив бактерии в образце, взятом у пациента, а рак можно диагностировать, обнаружив злокачественную опухоль. Фармацевтические композиции можно вводить до или после хирургического удаления первичных опухолей и/или лечения, такого как радиотерапия или назначение традиционных химиотерапевтических лекарств. Как правило, иммунотерапия является активной иммунотерапией, когда лечение основано на in vivo стимуляции эндогенной иммунной системы хозяина, чтобы заставить ее реагировать против, например,опухолей либо клеток, инфицированных вирусами, либо против бактерий. Эта стимуляция осуществляется путем введения агентов, модифицирующих иммунный ответ (композиций, содержащих нуклеиновые кислоты, которые кодируют иммуногенные полипептиды описанным здесь способом). Частота введения и дозировка описанных здесь профилактических или терапевтических композиций зависят от индивидуума и могут быть легко установлены стандартными методами. Часто в течение 52-недельного периода вводят от одной до десяти доз. Часто вводят три дозы препарата с интервалом в один месяц, более типично, если каждые 2-3 месяца вводят 2-3 дозы. Для некоторых видов лечения интервалы могут приближаться к году. Периодически после этого могут делать ускоренную (booster) вакцинацию. Для отдельных пациентов и конкретных заболеваний и расстройств могут быть разработаны альтернативные протоколы лечения. Подходящая доза представляет собой такое количество соединения,которое при введении описанным выше способом может стимулировать, например, противоопухолевый,противовирусный или антибактериальный иммунный ответ, который по меньшей мере на 10-50% выше базового (то есть, в отсутствие лечения) уровня. Такой ответ можно отслеживать, измеряя противоопухолевые антитела у пациента или определяя вакцинозависимую генерацию цитолитических Т-клеток,способных убивать, например, опухолевые клетки пациента, клетки пациента, инфицированные вирусами или бактериями in vitro. Такие вакцины должны быть способны также вызывать иммунный ответ,ведущий к улучшению клинического результата (например, более частым ремиссиям, полному, частичному или более длительному периоду жизни без заболевания) у вакцинированных пациентов, по сравнению с невакцинированными пациентами. Как правило, вирусные титры составляют от 1,0104 вирусных частиц в единице объема/животное до 1,01015 вирусных частиц в единице объема/животное. Подходящая доза зависит от размера пациента, но, как правило, колеблется приблизительно от 0,01 мл до 10 мл,более типично приблизительно от 0,025 до 7,5 мл, более типично приблизительно от 0,05 до 5 мл. Специалисты понимают, что размер дозы можно определить для конкретного пациента и конкретного заболевания или расстройства, которое предстоит лечить. При оральном введении химерные аденовирусные векторы часто можно сформулировать в виде пилюли. В целом, соответствующая дозировка и режим лечения позволяют ввести активное соединение (соединения) в количестве, достаточном для достижения терапевтических и/или профилактических целей. Такой ответ можно обнаружить, зарегистрировав улучшение клинических показателей (например, более частые ремиссии, полные или частичные, а также более длительное время жизни без приступов болезни) у принимавших лечение пациентов, по сравнению с нелеченными. Такие иммунные ответы оценивают с помощью стандартных описанных выше анализов пролиферации, цитотоксичности или цитокинов, которые можно провести по отношению к образцам, взятым у пациента до и после лечения. Например, для отслеживания эффективности терапии можно использовать метод детекции иммунокомплексов, образующихся между иммуногенными полипептидами и антителами жидкостей организма,специфичными для иммуногенных полипептидов. Этот анализ связан с поиском конкретных иммуногенных полипептидов, специфичных для заболевания или расстройства. Образцы жидкостей тела, взятые у индивидуума до и после начала терапии, можно проанализировать на наличие иммунокомплексов описанными выше методами. В целом, при этом необходимо сравнить количество иммунокомплексов в обоих образцах. Существенное изменение числа иммунокомлексов во втором образце (после начала терапии) по сравнению с первым (до ее начала) показывает эффективность лечения.A. Введение композиций настоящего изобретения В соответствии со способами настоящего изобретения содержащую химерный аденовирусный вектор композицию вводят любым непарентеральным маршрутом (например, орально, интраназально или мукозально, например, через влагалище, легкие, слюнные железы, носовые полости, тонкий кишечник,толстый кишечник, прямую кишку, миндалевидные железы или пейеровы бляшки). Композиции можно вводить самостоятельно или совместно с адьювантом, как описано выше. В соответствии с некоторыми- 15014757 аспектами, адьюванты кодируются нуклеотидными последовательностями (например, последовательностями, кодирующими IL-2, GM-CSF, IL-12 или белок бактериального жгутика). В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения адьювант вводят в то же время, что и композицию. В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения адьювант вводят после композиции, например,спустя 6, 12, 18, 24, 36, 48, 60 или 72 после ее введения.B. Детекция иммунного ответа на интересующие антигены. Иммунный ответ на гетерологичный полипептид можно зарегистрировать любыми известными способами, включая, например, детекцию специфической активации CD4+ или СР 8+Т-клеток или антител, специфически связывающихся с полипептидом. Специфическая активация CD4+ или CD8+ Т-клеток, ассоциированная с мукозальным, гуморальным или клеточным иммунным ответом, может быть обнаружена большим количеством способов. Методы детекции специфической активации Т-клеток включают, но не ограничиваются, регистрацию пролиферации Т-клеток, продукции цитокинов (например, лимфокинов) или генерации цитолитической активности (то есть, генерации цитотоксических Т-клеток, специфических для иммуногенного полипептида). В случае CD4+ Т-клеток предпочтительным методом детекции специфической активации Т-клеток является регистрация пролиферации Т-клеток. В случае CD8+ Т-клеток предпочтительным методом детекции специфической активации Т-клеток является регистрация цитолитической активности методом высвобождения меченого 51Cr (см., например, Brossart and Bevan, Blood 90(4): 1594-1599 (1997) and Lenzet al, J. Exp. Med. 192(8):1135-1142 (2000. Пролиферацию Т-клеток можно осуществить множеством известных методов. Например, этого можно добиться, измеряя скорость синтеза ДНК. Стимулированные пролиферирующие Т-клетки демонстрируют повышенную скорость синтеза ДНК. Распространенным способом измерения скорости синтеза ДНК является, например, импульсное мечение культур Т-клеток тритированным тимидином, предшественником нуклеотидов, встраивающимся в синтезируемую ДНК. Количество включенного тритированного тимидина можно определить с помощью спектрофотометра с жидкостной сцинцилляцией. Другие способы детекции пролиферации Т-клеток включают измерение скорости усиления продукции интерлейкина-2(IL-2), потока Са 2+ или захвата красителя, такого как 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5 дифенилтетразолин. Альтернативно, можно измерить синтез лимфокинов (например, интерферонагамма) или относительное количество Т-клеток, реагирующих на иммуногенный полипептид. Иммунный ответ антител (он же гуморальный иммунный ответ или ответ В-клеток), включая мукозальный иммунный ответ антител, можно определить методами иммунохимического анализа, известными в уровне техники [Tucker et al., Mol Therapy, 8, 392-399 (2003); Tucker et al., Vaccine, 22, 2500-2504(2004)]. Подходящие методы включают иммуноферментный сэндвич-анализ с двумя моноклональными антителами, разработанный David et al. (патент США 4376110); иммуноферментный сэндвич-анализ с моноклональными и поликлональными антителами (Wide et al., in Kirkham and Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh (1970; метод "вестерн блоттинга" Gordon et al. (патент США 4452901); иммунопреципитация меченого лиганда (Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:49804983); твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), описанный, например, в работе Raines et al.(1982) J. Biol. Chem. 257:5154-5160; иммуноцитохимические методы, включая применение флуорохромов (Brooks et al. (1980) Clin. Exp. Immunol. 39:477); а также нейтрализация активности (Bowen-Роре et al.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2396-2400). В дополнение к описанным выше методам, в настоящее время доступно множество других технологий иммуноферментного анализа, включая описанные в патентах США 3817827, 3850752, 3901654, 3935074, 3984533, 3996345, 4034074 и 4098876. Примеры Следующие далее примеры предназначены для иллюстрации, но не ограничивают область настоящего изобретения. Пример 1. Конструирование химерного аденовирусного вектора (DS1). Чтобы продемонстрировать, что TLR-3 агонисты способны улучшать адаптивные иммунные ответы на интересующие экспрессируемые антигены, было сконструировано несколько различных химерных аденовирусных векторов, содержащих нуклеотидные последовательности, которые кодируют различные антигены. В данном примере нуклеиновую кислоту, кодирующую gp120 (NIH AIDS Reagent and Reference Reagent Program) расположили под контролем ЦМВ промотора с небольшим интроном сразу за стартовым кодоном челночного вектора (pShuttle, Qbiogene). Номера доступа ниже нуклеиновой кислоты, кодирующей gp120, поместили poly-A хвост из bGH. Последовательность вектора описана вSEQ ID NO: 1. Чтобы сгенерировать вектор, способный продуцировать рекомбинантный Ad (с делецией Е 1/Е 3), содержащий кодирующую gp120 нуклеиновую кислоту, выполнили гомологичную рекомбинацию с вектором pAd (Qbiogene). DS1 сгенерировали, трансфицировав новый pAd-CM-gp120 конструкт экспрессии в 293 клетки. Титры измеряют стандартными методами. Пример 2. DS1 (вектор плюс TLR-3 агонист) превосходит стандартный rAd5 по способности индуцировать антиген-специфический иммунный ответ. Чтобы определить, может ли введение TLR-3 агониста улучшить адаптивный иммунный ответ, животным ввели 1,0107 PFU либо rAd-CMV-gp120 плюс 5 мкг/мл поли I:C (DS1), либо одного только rAd- 16014757CMV-gp120 (rAd5). Введение осуществляли через желудочный зонд в недели 0 и 3 эксперимента. Оба вектора экспрессируют ВИЧ gp120 под контролем ЦМВ промотора и используют рекомбинантный аденовирус типа 5 с делецией Е 1/ЕЗ. Титр антител к gp120 измеряли в плазме через 3 и 6 недель после первоначального введения методом anti-gp120 IgG ELISA, как описано в работе Tucker, et al., Mol Ther 8:392(2004. Как показано на фиг. 1-2, DS1 функционировал значительно эффективнее, чем rAd5, лучше индуцируя ответ антител на белок gp120 как на третью, так и на шестую недели после первоначального орального введения. В частности, на шестой неделе средний титр антител к gp120 был для группы DS1 в 100 раз выше, чем для rAd5. Кроме того, представляется, что повторное введение на неделе 4 значительно усилило ответ, так как средний титр между третьей и шестой неделями возрос более чем в 20 раз, в то время как группа rAd5 продемонстрировала только незначительное увеличение. Результаты показывают,что введение TLR-3 агониста может значительно улучшить опосредованный Ad5 ответ антител на интересующие антигены после орального введения химерного аденовирусного вектора, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую интересующий антиген. В качестве положительного контроля в этом анализе использовали сыворотку животных, которым подкожно вводили gp120 совместно с полным адьювантом Фрейнда, ее также анализировали на anti-gp120 методом ELISA на неделе 3. Нелеченые животные и животные, которым вводили только один аналог дцРНК(дцРНК), использовались в ELISA в качестве отрицательного контроля и контроля фона, соответственно. Каждая группа содержала по 6 животных. Пример 3. Конструирование второго химерного аденовирусного вектора (DS1b) и третьего химерного аденовирусного вектора (DS1c). Нуклеиновую кислоту, кодирующую зеленый флуоресцирующий белок (GFP) включили в pShuttleCMV стандартными рестриктазами. Плазмиду pShuttleCMV-GFP получили гомологичной рекомбинацией с вектором pAd (Qbiogene), как описано выше, с целью создания вектора, способного продуцировать рекомбинантный Ad (с делецией Е 1/Е 3), который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую GFP. Клонировали нуклеиновую кислоту, кодирующую гемагглютинин из вируса гриппаA/PR/8/34 и поместили ее в вектор pShuttle-CMV (Qbiogene) (SEQ ID NO: 13). Плазмиду pShuttleCMVHA (PR/8) получили гомологичной рекомбинацией с вектором pAd (Qbiogene), как описано выше, с целью создания вектора, способного продуцировать рекомбинантный Ad (с делецией Е 1/Е 3), который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую НА. Рекомбинантный Ad генерировали, трансфицировав новые конструкты экспрессии pAd-CMV-GFP и pAd-CMV-HA в 293 клетки. Титры измеряли стандартными методами. Пример 4. DS1b (Ad-CMV-GFP плюс TLR-3 агонист) и DS1c (Ad-CMV-HA плюс TLR-3 агонист) превосходят стандартный rAd5 по способности индуцировать антиген-специфический иммунный ответ 1,0107 PFU либо Ad-CMV-GFP плюс 5 мкг/мл поли I:C (DS1), либо Ad-CMV-GFP (rAd5) ввели животным через желудочный зонд в неделю 0. Оба вируса экспрессируют CFP под контролем ЦМВ промотора и используют рекомбинантный аденовирус типа 5 с делецией Е 1/Е 3. Титр антител к GFP измеряли в плазме через 3 недели после первоначального введения вируса методом anti-GFP IgG ELISA. Как показано на фиг. 3-4, группа DS1b значительно более эффективно, чем rAd5, индуцировала ответ антител на белок GFP через три недели после первоначального орального введения. Ответ CD8+ Т-клеток на GFP измеряли методом тетрамерного окрашивания спленоцитов. Животных вакцинировали в недели 0, 4 и 8,и в неделю 10 извлекали у них селезенку. Спленоциты окрашивали CD8-FITC и добавляли тетрамер,распознающий иммунодоминантный эпитоп к GFP y мышей Balb/c. Результаты показывают, что векторDS1b статистически лучше, по сравнению с одним rAd, индуцировал тетрамер-положительные CD8 клетки (фиг. 4). 1,0107 PFU либо Ad-CMV-HA плюс 5 мкг/мл поли I:C (DS1), либо Ad-CMV-HA (rAd5) ввели животным через желудочный зонд в неделю 0. Оба вируса экспрессируют НА под контролем ЦМВ промотора и используют рекомбинантный аденовирус типа 5 с делецией Е 1/Е 3. Титры антител к НА измеряли в плазме через 3 недели после первоначального введения вируса методом anti-PR8/34 IgG ELISA. Процедура определения ответа антител похожа на описанную ранее, за исключением того, что в планшеты ELISA было добавлено 5 мкг/мл цельного лизата A/PR8/34 (Advanced Biotechnology Incorporated,Gaithersburg, MD). Как показано на фиг. 5, группа DS1c значительно более эффективно, чем rAd5, индуцировала ответ антител на белок гриппа через три недели после первоначального орального введения(приблизительно, в 100 раз эффективнее). Результаты этих экспериментов демонстрируют также, чтоTLR-3 агонист совместно с химерным рекомбинантным аденовирусным вектором можно широко применять к множеству различных гетерологичных антигенов, при этом титр антител улучшается в 100 раз. Пример 5. Непарентеральные маршруты введения лучше парентеральных маршрутов. Внутримышечное введение препаратов тестировали, выполняя непосредственные инъекции 1,0107PFU pAd-CMV-gp120 (DS10 +/- поли I:C в концентрации 5 мкг/мл группам животных в четырехглавую мышцу (квадрицепс). Титры IgG к GFP в сыворотке крови измерялись, как описано выше. Каждая группа содержала шесть животных. Как показано на фиг. 6, значительные титры антител к gp120 наблюдались через три недели после введения TLR-3 агониста (то есть, rAd+PI). (фиг. 6). Интраназальное введение проверяли, вводя 20 мкл 1,1 106 PFU DS1c+/-5 мкг/мл поли I:C в назаль- 17014757 ную полость мышам. Мышей слегка анестезировали изофлураном, после чего вводили вирус, сформулированный в стерильном физиологическом растворе. Результаты показывают, что rAd-CMV-HA плюс поли I:C (DS1c) демонстрирует слегка более высокие титры антител, по сравнению с животными, которым давали стандартный rAd-CMV-HA. Результаты для индивидуальных животных были нанесены на графики для групп DS1c (N=6) и rAd (N=5). В качестве отрицательного контроля использовали нелеченых животных (N=4). Пример 6. Конструирование экспрессируемого TLR3 агониста. Короткий сегмент из 45 пар оснований синтезировали, исходя из олигонуклеотидов и ДНК, которые при совместном отжиге формировали 45 bp сегмент, способный создать "шпильку" двухцепочечной РНК(GCGATATGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTTC) (SEQ ID NO:10). Этот короткий сегмент (с названием Iuc1) клонировали в плазмиду pSK, содержащую человеческий бета-актиновый промотор и хвост BGH poly А. Такая плазмида называется pSk-luc1. Пример 7. pSK-luc 1 функционирует в дендритных клеточных культурах наподобие поли I:C, эффекты поли I:C и rAd аддитивны. Чтобы определить, может ли экспрессированный TLR-3 агонист из примера 6 функционировать как индуктор развития про-воспалительных цитокинов и дендритных клеток, наподобие лиганда TLR-3 полиI:C, экспрессированный дцРНК TLR-3 агонист протестировали на культуре дендритных клеток. Костный мозг из бедер мышей Balb/c выращивали совместно с лигандом flt-3 (200 нг/мл) и 5% сыворотки в средеDMEM, получив первичные культуры дендритных клеток. Пять дней спустя 293 клетки из первичных культур костного мозга трансфицировали либо pSk-luc1, pSK-beta2 (длинный сегмент бета галактозидазы, формирующий шпильку из 200 пар оснований), либо pcDNA3 (пустой вектор экспрессии). На шестой день трансфицированные клетки обработали ультрафиолетом (20 с при 40 кДж/см 2), чтобы вызвать их апоптоз, после чего добавили к дендритным клеткам. К культуре дендритных клеток добавляли либо поли I:С (1 мкг/мл), rAd (1 PFU/клетку), rAd + поли I:C, pSK-luc 1 трансфицированные клетки, и pSKbeta2 трансфицированные клетки, либо pcDNA3 трансфицированные клетки, после чего систему культивировали одну ночь. Как показано на фиг. 8, pSK-luc 1 трансфицированные клетки могут значительно усиливать активацию дендритных клеток, что измеряли методом IL-6 ELISA. Результаты этого эксперимента показывают также, что сочетание rAd плюс TLR3 лиганд (поли I:C) сильно повышает активность дендритных клеток. Протестировали также и другие лиганды. TLR-3 агонист из SEQ ID NO: 11 (мл) также формирует шпильку дцРНК, приблизительно, такого же размера, что и Iuc1. Ее приготовили, смешивая олигонуклеотиды и совместно отжигая их с последующим клонированием в вектор pSK под контролем человеческого промотора бета-актина. Векторы трансфицировали в 293 клетки и добавили к первичным дендритным клеткам, как описано выше. Как показано на фиг. 9, эти дополнительные лиганды могут активировать дендритные клетки, наподобие лиганда Iuc1 (фиг. 9). Пример 8. Конструирование четвертого химерного аденовирусного вектора (DS2) и быстрое клонирование векторов (DS2beta-luc и DS2C-luc). Нуклеиновую кислоту, кодирующую gp120 (NIH AIDS Reagent and Reference Reagent Program) расположили под контролем ЦМВ промотора с небольшим интроном сразу выше стартового кодона челночного вектора (pShuttle, Qbiogene). Ниже нуклеиновой кислоты, кодирующей gp120, поместили poly-A хвост из bGH. Последовательность вектора описана в SEQ ID NO: 1. дцРНК TLR-3 агонист Iuc1 под контролем промотора из бета-актина человека и poly А (описанный в примере 5 выше) включили в челночный вектор gp120 pShuttle, так чтобы нуклеиновая кислота, кодирующая gp120, и нуклеиновая кислота,кодирующая TLR-3 агонист, содержались в одном векторе под контролем двух различных промоторов. Направление экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей интересующий антиген, и экспрессии TLR3 агониста показаны на фиг. 10. Были также сконструированы два общих челночных вектора DS2beta-luc (SEQ ID NO: 14) и DS2Cluc (SEQ ID NO: 15). Это сделано так, чтобы в них можно было включить нуклеиновую кислоту, кодирующую любой интересующий антиген, под контролем промотора ЦМВ. Для управления экспрессией дцРНК TLR-3 агониста могут использоваться либо промотор бета-актина человека, либо промотор ЦМВ. В частности, вектор DS2C-luc содержит уникальный сайт Kpn 1, в который с легкостью может быть клонирована нуклеиновая кислота, кодирующая интересующий антиген. Целью разработки этих векторов является значительное облегчение последующего конструирования векторов, поскольку кодирующую любой интересующий антиген нуклеиновую кислоту можно просто включить в сайт клонирования, чтобы быстро изготовить вектор, способный индуцировать ответ антител и Т-клеток на интересующий антиген. Гомологичную репликацию DS2 с вектором pAd (Qbiogene) выполнили, как описано выше, с целью получения вектора, который способен продуцировать рекомбинантный Ad (с делецией по Е 1/Е 3),содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую GFP, и нуклеиновую кислоту, кодирующую дцРНКTLR-3 агонист luc1. Рекомбинантный Ad сгенерировали, трансфицировав новый конструкт экспрессии pAd-бетаактинluc1-CMV-gp120 в 293 клетки. Титры измеряли стандартными методами. Пример 9. Индукция антиген-специфического иммунного ответа после орального введения DS2.- 18014757 1,0107 PFU либо pAd-CMV-gp120 плюс TLR-3 агонист luc1 (DS2), либо pAd-CMV-gp120 (rAd5) ввели животным через желудочный зонд. Оба вируса экспрессируют gp120 под контролем ЦМВпромотора и используют рекомбинантный аденовирус типа 5 с делецией Е 1/Е 3. Титр антител к gp120 измеряли в плазме через три недели после введения вируса методом anti-gp120 IgG ELISA. ПротоколELISA был описан ранее (Tucker, et al, Mol Therapy 8:392 (2004. Результаты демонстрируют, что DS2 способен индуцировать увеличение титра антител к gp120 (используемому в этом изобретении гетерологичному антигену), приблизительно, на две логарифмические единицы. Вектор DS2 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую экспрессируемый gp120, и нуклеотидную последовательность, кодирующую дцРНК TLR-3 агонист. В качестве положительного контроля в анализе использовали сыворотку из двух животных, которым подкожно ввели 10 микрограмм белка gp120 плюс Полный адьювант Фрейнда, анализ также проводился методом anti-gp120 ELISA. Отрицательным контролем дляELISA служили нелеченые животные. Каждая группа содержала по 6 животных. Результаты представлены на фиг. 11. Пример 10. Индукция антиген-специфического иммунного ответа после орального введения DS3. 1,0107 PFU либо Ad-CMV-HA гриппа (из A/PR/8/34) плюс TLR7/8 лиганд полиуридиловая кислота(DS3), либо Ad-CMV-HA (rAd5) ввели животным через желудочный зонд в неделю 0. Оба вируса экспрессируют НА под контролем ЦМВ промотора и используют рекомбинантный аденовирус типа 5 с делецией Е 1/Е 3. Титр антител к НА измеряли в плазме через 3 недели после введения вируса методом antiHA гриппа IgG ELISA. Каждая группа содержала по 6 животных. Результаты показаны на фиг. 12. Пример 11. Конструирование пятого, шестого и седьмого химерного аденовирусного вектора(DS2b, DS2b-for и ND1.1 214). Ген НА гриппа (A/lndo/5/2005) был синтезирован компанией CelTek (Nashville, TN) и помещен в вектор pShuttleCMV (Qbiogene), содержащий ЦМВ промотор с небольшим интроном сразу выше стартового кодона челночного вектора. Ниже антигена в векторе расположили Iuc1 DNA с промотором человеческого бета-актина и poly А (как описано в примере 5), ориентация для DS2b показана на фиг. 10. Последовательность Iuc1 следующая: GCGATATGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTIuc1 с промотором в челночном векторе описана в SEQ ID NO:7 и названа DS2b-for. Сконструировали также еще один челночный вектор (под названием DS2bC-HA) (SEQ ID NO: 16), содержащий два различных ЦМВ промотора, которые управляют экспрессией TLR-3 агониста Iuc1 и НА гриппа, описанных выше. Гомологичную рекомбинацию с вектором pAd (Qbiogene) выполняли, как описано выше, с целью генерировать векторы, способные продуцировать рекомбинантный Ad (с делецией по Е 1/Е 3), который содержал бы нуклеиновые кислоты, кодирующие НА и TLR-3 агонист Iuc1 под контролем различных промоторов. Рекомбинантный Ad генерировали, трансфицировав новые pAd-конструкты в 293 клетки. Титры измеряли стандартными методами. Готовый вектор pAd, содержащий DS2C-luc, назвали ND 1.1 214 и опубликовали в патентном депозитарии АТСС 22 февраля 2007 года (Manassus, VA). Нуклеотидная последовательность этого химерного аденовирусного вектора описана в SEQ ID NO: 17. Кодирующая гетерологичный антиген нуклеиновая кислота выделена полужирным шрифтом и окружена сайтом распознавания Cla I по 5' концу и сайтом распознавания Not1 по 3' концу. Кодирующая TLR-3 агонисты нуклеотидная последовательность выделена курсивом, а линкерная последовательность полужирным шрифтом. В химерный аденовирусный вектор можно включить нуклеотидную последовательность, кодирующую любой интересующий антиген, и последовательность, кодирующую любой подходящий экспрессируемый TLR-3 агонист. Пример 12. Индукция антиген-специфического иммунного ответа после орального введения DS2b. 1,0107 PFU либо pAd-CMV-HA плюс TLR-3 агониста Iuc1 в обратной (DS2b) или прямой (DS2bfor) ориентации, либо pAd-CMV-HA (rAd5) ввели животным через желудочный зонд в неделю 0. Эти вирусы экспрессируют антиген НА гриппа под контролем ЦМВ-промотора и используют рекомбинантный аденовирус типа 5 с делецией Е 1/Е 3. Титр антител к НА измерили в плазме через три недели после введения вируса методом anti-HA IgG ELISA. Результаты демонстрируют, что вектор DS2b индуцирует ответ антител к белку НА в большей степени, чем стандартный вектор rAd (rAd5). Вектор DS2b содержит rAd5, экспрессирующий НА, он также экспрессирует агонист Toll-подобного рецептора (TLR3),шпильку двухцепочечной РНК и демонстрирует тем самым, что использование закодированного дцРНКлиганда может улучшить адаптивный иммунный ответ на интересующие антигены. Как показано на фиг. 11 и 13, экспрессированная дцРНК улучшает адаптивный иммунный ответ к различным гетерологичным антигенам. Отрицательным контролем для ELISA служили нелеченые животные. Каждая группа содержала по 6 животных. Векторы в противоположной ориентации (DS2for) исследовали на ответ антител после либо орального, либо внутримышечного введения 1,0107 PFU вируса на животное в недели 0 и 5. Ответ антител на НА измеряли на четвертую и седьмую недели после первоначального введения. Как показано на фиг. 14,векторы в противоположной ориентации также могут индуцировать существенный ответ антител на гетерологичные антигены. Векторы DS1b and DS1 bfor индуцировали одинаковые ответы на НА на четвер- 19014757 той неделе. Важно, что для DS1bfor был продемонстрирован эффект резкого усиления иммунного ответа,показавший, что в целях усиления иммунного ответа на гетерологичный антиген можно использовать многократные введения. Был продемонстрирован также и еще один пример возможностей подхода с использованием химерных аденовирусных векторов. Вектор ND1.1 214 вводили животным орально (1,0107 PFU) или интраназально (3106 PFU), а ответы антител на гетерологичный антиген измеряли в неделю 3. Как показано на фиг. 15, после орального введения был получен значимый ответ антител на НА, далеко превосходящий типичные значения, наблюдаемые после однократного орального введения вектора rAd. Все публикации,патентные публикации, патенты и номера доступа Genbank, процитированные в настоящей спецификации, включены в нее по ссылке во всей своей полноте для всех целей, как если бы для каждой отдельной публикации, патентной публикации или патента было бы отдельно и конкретно указано, что они включены по ссылке. НЕФОРМАЛЬНЫЙ ЛИСТИНГ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ