Непрерывные генетически стабильные птичьи клеточные линии, полученные из эмбрионов, способ их получения и их применение для производства вирусных вакцин, рекомбинантных белков и пептидов

НЕПРЕРЫВНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ СТАБИЛЬНЫЕ ПТИЧЬИ КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ,ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ ЭМБРИОНОВ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВИРУСНЫХ ВАКЦИН, РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ Данное изобретение относится к разработке и производству вирусных вакцин. В частности,изобретение относится к области промышленного производства вирусных векторов и вакцин,более конкретно к использованию птичьих эмбриональных стволовых клеток, предпочтительно клеточной линии ЕВх, полученной из утиных эмбриональных стволовых клеток, для производства вирусных векторов и вирусов. Изобретение, в частности, можно использовать для промышленного производства вирусных вакцин для предотвращения вирусных инфекций человека и животных. 021064 Данное изобретение относится к разработке и изготовлению вирусных вакцин. В частности изобретение относится к области промышленного производства вирусных векторов и вакцин, более конкретно к использованию клеточных линий, полученных из эмбриональных стволовых клеток утки, которые не содержат птичьих эндогенных ретровирусов, для производства вирусных векторов и вирусов. Изобретение, в частности, может быть применено в промышленном производстве вирусных вакцин для профилактики вирусных инфекций человека и животных. Предшествующий уровень техники Вакцины эффективно уменьшают и предотвращают смерть и заболеваемость многими вирусными инфекциями, такими как, например, грипп, корь, эпидемический паротит, оспа, желтая лихорадка. Много вирусных вакцин в настоящее время производится в оплодотворенных куриных яйцах или в первичных фибробластах куриных эмбрионов, выделенных из куриных эмбрионов. Тем не менее, производство вакцин иногда осложняется случайным загрязнением случайными агентами, которые могут возникнуть из птичьих клеточных субстратов, использованных для размножения вакцинных штаммов. В самом деле, обратнотранскриптазная (RT) активность, указывающая на наличие ретровирусов, была обнаружена в полученных с помощью куриных клеток живых ослабленных вакцинах против желтой лихорадки, кори и эпидемического паротита, в том числе европейского и американского производства (Hussain et al., 2003, J. Virol 77:1105-1111; Johnson et Heneine, 2001, J. Virol., 75:3605-3612). Исследования происхождения RT-активности в этих вакцинах доказали наличие частиц, содержащих РНК от эндогенного вируса птичьего лейкоза (ALV-E) и эндогенного птичьего ретровируса (EAV) (Johnson et Heneine,2001, J. Virol 75:3605-3612; Tsang et al., 1999, J. Virol 73:5843-5851; Weissmahr et al., 1997, J. Virol 71:3005-3012).ALV-E и EAV являются членами семейств эндогенных ретровирусов, имеющихся в куриной зародышевой линии. ALV-E экспрессируется в ev-локусах, которые являются наследуемыми провирусными элементами. На основании их конвертированных последовательностей, ALV-E были дифференцированы на подгруппы ALV-E от А до D и J, которые являются экзогенными приобретенными инфекциями. Хотя экзогенные ALV являются у зараженных кур причиной ряда опухолевых заболеваний, таких как миокардит и остеопетроз, о патогенности ALV-Е для кур ничего не известно. Отсутствие онкогенного потенциала у ALV-E -инфекций может быть связано с отсутствием как вирусных онкогенов, так и энхансерной активности в эндогенных длинных концевых повторах (LTR). Более 20 различных ev-локусов было выявлено у белых кур Ливорно (с ev-1 по ev-22). Ev-локусные обозначения давались в порядке обнаружения и были фенотипически отнесены к категориям в связи с генными продуктами, которые они экспрессировали, и их способностью генерировать инфекционные частицы. В ALV-Е фенотипах, присвоенныхev-локусам в диапазоне от структурно и ферментативно полных инфекционных частиц до структурно или ферментативно (RT-) дефектных, не было обнаружено вирусной экспрессии белка. Большинство evлокусов являются структурно неполными и, следовательно, не кодируют все последовательности, необходимые для продукции инфекционных вирусных частиц. Путем размножения были получены куриные породы, устойчивые к ALV-E и названные ev-0. У кур линии 0 отсутствовали ev-локусы (т.е. ev-0), но в геноме кур линии 0 были представлены EAV-провирусные последовательности (Dunwiddie and Faras,1985, Proc Natl. Acad. Sci USA, 82: 5097-5101). Немногое известно о семействе EAV, которое отличается от семейства ALV, но связано с ним.EAV-элементы присутствуют в количестве по меньшей мере 50 копий на один куриный геном. Тем не менее, ни одна из известных последовательностей EAV не отображает интактный ретровирусный геном полной длины, и ни один из инфекционных EAV-изолятов еще не был идентифицирован. Однако было показано, что EAV высоко экспрессируется в эмбриональных клетках, полученных из птиц рода Gallus.Weissmahr и др. (1997, J. Virol 71:3005-3012) показали, что частицы из семейства эндогенных ретровирусов EAV чаще всего отвечают за большую часть RT-активности, связанной с частицами, наблюдаемой в супернатантах культивируемых фибробластов куриного эмбриона. Риск случайной передачи особенно велик для живых ослабленных вирусных вакцин, поскольку они не могут быть подвергнуты процедуре инактивации, и большинство из них вводят человеку инъекционно, то есть минуя неспецифические иммунные защитные механизмы. Таким образом, чтобы обеспечить безопасность вакцин для применения у животных и человека, клеточные субстраты для производства вакцины в настоящее время должны быть проверены на наличие способных к репликации ретровирусов,которые могут быть переданы хозяевам в виде животного или человека в ходе иммунизации (серия технических докладов ВОЗ, 1994). С другой стороны, системы производства оплодотворенных куриных яиц и первичных фибробластов куриного эмбриона связаны с рядом серьезных ограничений, включая: длительный, громоздкий и ресурсно-затратный способ изготовления, который требует приобретения и контроля качества большого количества яиц или CEF для каждой отдельной производимой партии; в ряде случаев необходимость использования дорогостоящих свободных от специфического патогена (SPF) куриных эмбрионов; риск недостаточной поставки яиц в случае эпидемии инфекций в стае куриных доноров; инфляция издержек, связанная с использованием бычьих сывороток, полученных из стран, свобод-1 021064 ных от BSE (бычьей губчатой энцефалопатии); невозможность использования яиц для размножения вирусов, которые высоко вируленты и смертельны для кур. Поэтому существует срочная необходимость улучшения имеющихся вирусных технологий производства вакцин на основе яиц или фибробластов куриных эмбрионов. Развитие клеточно-культуральных платформ в качестве альтернативы производственным системам с яйцами и CEF для производства вирусных вакцин, вероятно, является самым быстрым и перспективным решением для преодоления узких мест нынешнего производства вакцин и нехватки времени. Кроме того, использование для производства вирусных вакцин клеточных линий, а не яиц или CEF-платформ, будет иметь следующие дополнительные преимущества в связи с безопасностью вакцины: отсутствие добавок антибиотиков в вакцинном составе; отсутствие необходимости в токсичных консервантах (например тиомерсале); снижение уровней эндотоксина, отсутствие вопроса аллергии на яйца; отсутствие риска попадания случайного агента/BSE из клеточной культуры в безбелковые и бессывороточные среды; более высокая чистота приготовления вирусной вакцины. Примерами клеточных линий для продукции вирусных вакцин являются MDCK (клетки, полученные из почки собаки Мадин-Дарби), PerC6 (клетки, полученные из человеческих эмбриональных клеток сетчатки, генетически модифицированных путем вставления генов Е 1 от аденовируса человека 5 типа,разработанные CRUCELL (Нидерланды, VERO (клетки, полученные из эпителиальных клеток почек африканской зеленой мартышки (Cercopithecus aethiops), выделенные в Университете Чиба, Япония),ВНК 21 (клетки, полученные иммортализацией клеток почек детенышей хомяков). Ни одна из доступных клеточных линий не удовлетворяет всем медицинским, нормативным и промышленным требованиям. Например, большинство этих клеточных линий являются онкогенными, и существует значительная нормативная обеспокоенность по поводу использования онкогенных клеток в продукции человеческих вакцин; поэтому сегодня регулирующие органы неохотно утверждают онкогенные клеточные субстраты для массового производства вакцин. Кроме того, некоторые из этих клеточных линий являются субстратзависимыми, что является серьезным препятствием для промышленного линейного увеличения производства вакцины. Таким образом, существует необходимость в разработке субстрат-независимых клеточных линий без способных к репликации ретровирусов, которые являются неонкогенными, промышленно совместимыми и восприимчивыми к инфицированию широким спектром вирусов. Это является целью данного изобретения. Таким образом, изобретатель воспользовался своим опытом в области птичьей биологии и птичьих эмбриональных стволовых (ES, embryonic stem) клеток для разработки новых стабильных клеточных линий утки, которые делают возможной эффективную репликацию большой группы человеческих и ветеринарных вакцин и кандидатов в вакцины. Путем адаптации своих собственных способов (см. WO 03/076601 и WO 05/007840) изобретателю удалось создать серии хорошоохарактеризованных и документированных клеточных линий утки (т.е. клеток dEBx), которые получены из утиных клеток ES без каких-либо этапов генетической, химической или вирусной иммортализации и которые не продуцируют в культуре способных к репликации ретровирусов. Описание Данное изобретение предлагает способ получения непрерывных диплоидных птичьих клеточных линий, названных ЕВх, полученных из птичьих эмбриональных стволовых клеток (ES), которые не продуцируют эндогенных ретровирусных частиц, способных к репликации. Клеточные линии изобретения являются "непрерывными", поскольку они обладают характеристиками, необходимыми для культивирования in vitro в течение продолжительного периода времени. Преимущественно клетки изобретения способны к пролиферации в течение по меньшей мере 50 поколений,по меньшей мере 75 поколений, по меньшей мере 100 поколений, по меньшей мере 125 поколений, по меньшей мере 150 поколений, по меньшей мере 175 поколений, по меньшей мере 200 поколений, по меньшей мере 250 поколений. 250 поколений не составляют временное ограничение, поскольку полученные клетки до сих пор живы и их все еще можно пассировать в дополнительных пассажах. Без связи с теорией допускается, что клетки изобретения можно культивировать "постоянно" до тех пор, пока клетка экспрессирует теломеразу. Действительно, предполагается, что высокий уровень экспрессии теломеразы в птичьих клетках изобретения отвечает за генетическую стабильность (т. е. птичьи клетки изобретения являются диплоидными) и непрерывный клеточный рост. Под "пассажем" понимают перенос трансплантата клеток, с или без разбавления, из одного культурального сосуда в другой. Следует понимать, что пока клетки переносят из одного сосуда в другой, определенная часть клеток может быть потеряна и, следовательно, может возникнуть разбавление клеток,преднамеренное или нет. Этот термин является синонимом термина "субкультура". Количество пассажей представляет собой количество раз, которое клетки в культуре, растущие в суспензии или на подложке,были субкультивированы или перенесены в новый сосуд. Этот термин не является синонимом удвоения популяции или поколения, которое представляет собой время, необходимое для однократного воспроизведения клеточной популяции; то есть, грубо говоря, время, необходимое для воспроизведения каждой-2 021064 клетки популяции. Например, время удвоения популяции (PDT, population doubling time) для птичьих ESклеток на этапе а) изобретения составляет около 40 ч. Птичьи ЕВх-клетки изобретения имеют PDT около 30 ч; обычно для клеток ЕВх делают один пассаж каждые три поколения. Под "диплоидным" подразумевается, что клетки изобретения имеют две копии (2n) каждой хромосомы, как правило, по одной от матери и от отца. Тот факт, что птичьи клеточные линии ЕВх изобретения являются непрерывными и диплоидными(т.е. генетически стабильными), представляет собой замечательную и уникальную особенность, так как эти условия обычно антагонистичны. Таким образом, раковые клетки и/или иммортализованные клетки,полученные химической, физической (УФ-облучение, рентгеновские лучи или гамма-излучение и т.д.) или генетической модификации (вирусная трансформация, сверхэкспрессия онкогенов и т.д.), являются непрерывными клетками, так как они способны к бесконечному воспроизведению в культуре, но они не являются генетически стабильными, потому что демонстрируют полиплоидные кариотипы. С другой стороны, первичные клетки, например фибробласты куриных эмбрионов,MRC5, WI38, которые являются нетрансформированными клетками, не являются непрерывными,поскольку они имеют конечную продолжительность жизни после нескольких поколений, но они являются генетически стабильными (т.е. диплоидными) клетками. В данном изобретении термины "клеточная линия" и "клетки" будут использоваться неконкретно. Подразумевается, что термины "птичий", "птица", "aves" или "ava", используемые в данном документе, имеют одно и то же значение и будут использоваться неконкретно. Термин "птицы" относится к организму любого вида, подвида или рода таксономического класса "ava". В предпочтительном воплощении термин "птицы" относится к любому животному таксономического отряда:"Anseriformes" (т.е. утки, гуси, лебеди и родственные им). Отряд Гусеобразные содержит около 150 видов птиц из трех семейств: Anhimidae (шпоровые гуси, крикуны), Anseranatidae (полулапчатый гусь) иAnatidae, которое включает более 140 видов водоплавающих птиц, среди них утки, гуси и лебеди. Все виды в отряде высоко адаптированы к существованию на водной поверхности. Все являются лапчатыми для эффективного плавания (хотя некоторые из них впоследствии стали главным образом наземными)."Galliformes" (то есть куры, перепелы, индейки, фазаны и родственные им). Курообразные представляют собой отряд птиц, включающий кур, индеек, перепелок и фазанов. Около 256 видов встречается во всем мире."Columbiformes" (т.е. голуби и родственные им). Отряд птиц Columbiformes включает в себя очень широкий спектр голубей. В данном изобретении под термином "эндогенная ретровиральная частица" или "эндогенная ретровирусная частица" понимается ретровирусная частица или ретровирус, закодированный и/или экспрессированный ALV-E или EAV провирусными последовательностями в геномах некоторых птичьих клеток. У птиц ALV-E-провирусные последовательности, как известно, присутствуют в геноме домашних кур (за исключением кур линии 0), красной джунглевой курицы и кольцо-шейного фазана. Как известно, EAVпровирусные последовательности присутствуют у всех птиц рода gallus, который включает домашнюю курицу, курицу линии 0, красную джунглевую курицу, зеленую джунглевую курицу, серую джунглевую курицу, цейлонскую джунглевую курицу и их родственников (см. Resnick et al., 1990, J. Virol., 64:46404653). В соответствии с предпочтительным воплощением птицу изобретения выбирают среди птиц безALV-E- и EAV-провирусных последовательностей в геноме. Специалист в данной области способен определить, присутствуют ли ALV-Е- и EAV-последовательности в геноме птицы (Johnson and Heneine,2001; Weissmahr et al., 1996). Предпочтительно птицу выбирают из группы, состоящей из Anseriformes(например утки, гуси, лебеди), индеек, перепелов, японского перепела, цесарки, павлина. Таким образом,клетки, полученные от таких птиц, не продуцируют способных к репликации эндогенных ALV-E- и/илиEAV-частиц. В предпочтительном воплощении птицу данного изобретения выбирают из группы, включающей уток, гусей, лебедей, индеек, перепелов и японских перепелов, цесарок и павлинов. В соответствии с наиболее предпочтительным воплощением птица является уткой, более предпочтительно пекинской или мускусной уткой. В соответствии с более предпочтительным воплощением птица является пекинской уткой. Таким образом, изобретение предлагает способ получения непрерывных диплоидных утиных клеточных линий, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ES), которые не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц. В соответствии со вторым предпочтительным воплощением птицу изобретения выбирают среди птиц, которые не имеют полные ALV-E-провирусные последовательности в геноме, но имеют в конечном итоге EAV-провирусные последовательности. Специалист в данной области способен определить,частичные или полные ALV-E- и EAV-последовательности присутствуют в геноме птицы (Johnson andHeneine, 2001). Несколько куриных пород было выбрано путем разведения тех особей, которые не содержат полных ALV-E-провирусных последовательностей (т.е. штамм ev-0) и поэтому не продуцируют инфекционные ALV-E-ретровирусные частицы, например: домашняя курица линии 0 с фермы домашней птицы East Lansing USDA (порода ELL-0). Куры ли-3 021064 нии 0 East Lansing не содержат никаких эндогенных вирусных (ev) локусов, связанных с ALV (Dunwiddieand Faras, 1985); линии DE и РЕ 11 из Institut National de la Recherche Agronomique (Domaine de Magneraud, Сюржер,Франция). Таким образом клетки, полученные от ev-0 птиц, не продуцируют способных к репликации эндогенных ALV-E частиц. В соответствии с предпочтительным воплощением птица представляет собой домашнюю курицу ev-0 (Gallus Gallus подвид domesticus), предпочтительно выбранную среди ELL-0, DE и РЕ 11. Как правило, курицы ev-0 по-прежнему содержат EAV-провирусную последовательность, но до сих пор не были выявлены никакие инфекционные EAV-изоляты. Таким образом, данное изобретение предлагает способ получения непрерывных диплоидных куриных клеточных линий, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ES) куриных пород ev-0, где указанные куриные клеточные линии ev-0 не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц. В соответствии с третьим воплощением птицу изобретения выбирают среди птиц, которые содержат в своем геноме полные и/или неполные ALV-E- и EAV-провирусные последовательности, но которые не могут продуцировать способных к репликации ALV-E- и EAV-ретровирусных частиц. Специалист в данной области способен определить, продуцируют ли указанные птичьи клетки инфекционные и/или неинфекционные ретровирусные частицы ALV-E и/или EAV (Johnson and Heneine, 2001; Weissmahr et al., 1996). Предпочтительно птицу выбирают из группы, состоящей из кур, свободных от специфического патогена (SPF), предпочтительно из кур породы Valo (Lohman) или линии 22 (SPAFAS). Термин "способный к репликации" означает, что эндогенные ретровирусные частицы являются инфекционными, т.е. можно сказать, что такие ретровирусные частицы способны инфицировать птичьи клетки изобретения и реплицироваться в них. Способ создания непрерывных диплоидных птичьих клеточных линий изобретения, названных ЕВх, состоит из двух этапов:a) выделение, культивирование и размножение эмбриональных стволовых клеток птиц, которые не содержат полные эндогенные провирусные последовательности или их фрагменты, допускающие продукцию способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц, более конкретно EAV- и/или ALVE-провирусных последовательностей или их фрагментов, в полной культуральной среде, содержащей все факторы для их роста, в присутствии фидерного (питательного) слоя и с добавлением животной сыворотки; возможно указанная полная культуральная среда может содержать добавки, такие как дополнительные аминокислоты (т.е. глутамин, заменимые аминокислоты и т.д.), пируват натрия, бетамеркаптоэтанол, витамины, белковый гидролизат неживотного происхождения (т.е. дрожжевого, растительного (соя, пшеница и т.д.;b) пассаж путем модификации культуральной среды, чтобы получить полное выведение указанных факторов, указанного фидерного слоя и указанной сыворотки и возможно указанных добавок, и дальнейшее получение прикрепленных или суспендированных птичьих клеточных линий, названных ЕВх,которые не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц, способны к пролиферации в течение длительного периода времени в основной среде в отсутствие экзогенных факторов роста, фидерного слоя и животной сыворотки. Модификация культуральной среды этапа b) способа создания клеточных линий ЕВх таким образом, чтобы получить постепенное или полное выведение факторов роста, сыворотки и фидерного слоя,может быть сделана одномоментно, последовательно или по частям. Последовательность истощения культуральной среды может быть выбрана среди следующих: фидерный слой/сыворотка/факторы роста; фидерный слой/факторы роста/сыворотка; сыворотка/факторы роста/фидерный слой; сыворотка/фидерный слой/факторы роста; факторы роста/сыворотка/фидерный слой; факторы роста/фидерный слой/сыворотка. В предпочтительном воплощении последовательность выведения представляет собой последовательность факторы роста/фидерный слой/сыворотка. В предпочтительном воплощении выведение добавок, таких как пируват натрия, заменимые аминокислоты (NNEA), витамины, дрожжевой гидролизат,производится после выведения фидерного слоя и до выведения сыворотки. Предпочтительно выведение дрожжевого гидролизата производится после выведения пирувата натрия, NNEA и витаминов. В соответствии с предпочтительным воплощением птичьи эмбриональные стволовые клетки в соответствии с этапом а) изобретения забирают из птичьих эмбрионов при откладке яиц, то есть когда яйца отложены. В соответствии с Sellier et al. (2006, J. Appl. Poult. Res. 15:219-228) яйцекладка соответствует следующим этапам развития в соответствии с классификацией Эяль-Гилади (классификация Eyal-Giladi:-4 021064 49:321-337): мускусная утка (также называемая утка Barbari): этап VII цесарка: этап VII - VIII индейка: этап VII-VIII пекинская утка: этап VIII курица: этап X японский перепел: этап XI гусь: этап XI. Предпочтительно утиные эмбриональные стволовые клетки (ES) этапа а) получают путем диссоциации эмбриона(ов) пекинской утки в районе этапа VIII (яйцекладки) по классификации Эяль-Гилади. Если отложенное яйцо, собранное при яйцекладке, не достаточно развито для забора эмбриональных стволовых клеток, то отложенное яйцо можно дальше инкубировать в течение периода от нескольких часов (в течение ночи) до одного или двух дней до созревания эмбриона. В соответствии со вторым воплощением утиные эмбриональные стволовые клетки (ES) этапа а) получены от мускусной утки. При яйцекладке эмбрион мускусной утки не достаточно зрелый, поскольку яйцекладка проходит примерно на этапе VII, поэтому яйцо инкубируют в течение ночи для созревания яйца до этапа VIII-Х по классификации Эяль-Гилади. Предпочтительно куриные эмбриональные стволовые клетки (ES) этапа а), предпочтительно от куриной породы ev-0, получают путем диссоциации эмбриона(ов) в районе этапа X (яйцекладки) по классификации Эяль-Гилади. С другой стороны, птичьи эмбриональные стволовые клетки в соответствии с этапом а) изобретения забирают из эмбрионов до откладки яиц. Основные ограничения забора до откладки яиц заключаются в том, что яйцо должно быть получено от курицы хирургическим путем, и в том, что количество ESклеток в эмбрионе значительно меньше. Кроме того, на очень ранних стадиях развития птичьего эмбриона ES-клетки не так детально охарактеризованы, что делает трудным культивирование клеток ES in vitro. Специалист в данной области может определить срок до откладки яиц, что позволяет забирать птичьиES-клетки. С другой стороны, птичьи эмбриональные стволовые клетки в соответствии с этапом а) изобретения могут быть получены из птичьего эмбриона после откладки яиц до вылупления. Однако птичьи эмбриональные стволовые клетки будут постепенно вступать в дифференцировку для создания дифференцированных тканей; поэтому предпочительно забирать птичьи ES в течение недолгого периода после откладки. Специалист в данной области может определить срок после откладки яиц, что позволяет забирать птичьи эмбриональные стволовые клетки. В соответствии с другим воплощением клетки этапа а) являются популяцией эмбриональных стволовых клеток, обогащенной первичными (примордиальными) зародышевыми клетками (PGC, primordialgerm cell). Более предпочтительно птичьи ES-клетки этапа а) являются очищенными PGC. У птиц различных видов первичные зародышевые клетки развиваются из центральной области бластодермы (Ginsburg and Eyal-Giladi, 1987 Development 101(2):209-19; Karagenc et al, 1996 Dev Genet 19(4):290-301; Petitteet al, 1997 Poultry Sci. 76(8): 1084-92). Затем они перемещаются в переднюю, внеэмбриональную, часть зародышевого полумесяца до тех пор, пока не собираются сосудами между 2,5 и 5 днями эмбрионального для связи с зародышевым хребтом. Они колонизируют зародышевый хребет, где в конечном итоге дифференцируются в ооциты или сперматоциты (Nieuwkoop and Sutasurya, 1979. The Migration of theprimordial germ cells. In: Primordial germ cell in Chordates. London: Cambridge University Press p113-127). Способы выделения PGC из донорных птичьих эмбрионов были представлены в литературе и могут быть легко выполнены специалистом в данной области (см., например, JP924997, опубликованный 7 сентября 1993, публикация 05-227947; Chang et al. 1992. Cell Biol. Int. 19(2): 143-149; Naito et al. 1994 Mol. Reprod. Dev. 39: 153-161; Yasuda et al. 1992. J. Reprod. Fert. 96: 521-528; Chang et al. 1992 Cell Biol. Int. Reporter 16(9): 853-857). В соответствии с воплощением PGC забирают из эмбриональной крови, забранной из спинной аорты куриного эмбриона на стадии 12-14 по классификации Гамбургера и Гамильтона(HamburgerHamilton 1951 A series of normal stages in the development of chick embryo. J. Morphol. 88: 49-92). В другом предпочтительном воплощении PGC забирали из зародышевого полумесяца путем механического вскрытия куриного эмбриона или из половых желез. Однако, как говорилось выше, известны и другие способы выделения PGC, которые могут быть использованы в качестве альтернативы. Эти птичьи эмбриональные стволовые клетки характеризуются долгим временем удвоения, которое составляет от 48 до 72 ч в культуре при 39 С. Без связи с теорией определенные условия культивирования птичьих клеток ES после постепенного выведения факторов роста, фидерного слоя, добавок и сыворотки, позволяют адаптировать и отбирать клетки, которые сохраняют большинство желательных свойств ES-клеток (стабильность кариотипа, неограниченная пролиферация, экспрессия ES-маркеров), а кроме того демонстрируют удобные для производства характеристики, такие как рост в суспензии до высокой плотности клеток в бессывороточной среде. Теломераза является одним из наиболее важных ES-маркеров. Из-за непрерывной и сохраняющей-5 021064 ся экспрессии теломеразы в течение клеточных пассажей клетки ЕВх являются непрерывными (т.е. бессмертными), а также являются генетически стабильными (т.е. диплоидными). Более конкретно данное изобретение предлагает способ получения непрерывных диплоидных птичьих клеточных линий, полученных из ES-клеток, где указанные птичьи клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц, причем указанный способ состоит из следующих этапов:a) выделение птичьего эмбриона(ов), предпочтительно от утки или курицы ev-0, на стадии развития в период примерно от стадии VI по классификации Эяль-Гилади (классификация EYAL-GILADI's:table and a new look at the first stages of the development in the chick". "General Morphology" Dev. Biol.,49:321-337) и до вылупления, предпочтительно в районе откладки яиц, где геном указанной птицы не содержит эндогенные провирусные последовательности, допускающие продукцию способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;b) суспендирование птичьих эмбриональных стволовых клеток (ES), полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной: инсулиновым фактором роста 1 (IGF-1) и цилиарным нейротрофическим фактором (CNTF); животной сывороткой; и возможно факторами роста, выбранными из группы, включающей интерлейкин-6 (IL-6), рецептор интерлейкина-6 (IL-6R), фактор стволовых клеток (SCF) и фактор роста фибробластов (FGF);c) посев суспензии ES-клеток, полученной на этапе b), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование ES-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;d) дополнительно выведение всех факторов роста, выбранных из группы, включающей IL-6, IL-6R,SCF, FGF, из культуральной среды в течение нескольких пассажей в диапазоне от 1 до примерно 15 пассажей, предпочтительно от 3 до примерно 15 пассажей, и дальнейшее культивирование птичьих ESклеток в течение по меньшей мере одного пассажа. Предпочтительно выведение из культуральной среды всех факторов роста, выбранных из группы, включающей IL-6, IL-6R, SCF, FGF, осуществляется одновременно в течение одного пассажа. Как правило, выведение IL-6, IL-6R, SCF, FGF производят в районе 10-15 пассажа;e) выведение IGF-1 и CNTF из культуральной среды и дальнейшее культивирование птичьих ESклеток в течение по меньшей мере одного пассажа. Предпочтительно выведение из культуральной среды факторов роста, выбранных из группы, включающей IGF-1 и CNTF, проводится одновременно в течение одного пассажа. Как правило, выведение IGF-1 и CNTF производят в течение пассажей с 15 по 25. Альтернативно выведение IGF-1 и CNTF осуществляют путем постепенного снижения в течение нескольких пассажей (по меньшей мере 2 пассажей и примерно до 15 пассажей);f) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;g) возможно постепенное уменьшение концентрации добавок в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение добавок через по меньшей мере один пассаж; иh) возможно постепенное уменьшение концентрации животной сыворотки в культуральной среде, с тем чтобы получить полное выведение животной сыворотки после нескольких пассажей; иi) получение прикрепленных птичьих клеточных линий, названных ЕВх, полученных из ESклеток, способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя, возможно без животной сыворотки и добавок, где указанные непрерывные диплоидные птичьи клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;j) возможно дальнейшая адаптация указанных прикрепленных птичьих клеточных линий ЕВх к условиям суспензионного культивирования. Этап адаптации клеточной культуры к суспензии может происходить в течение всего способа создания клеток ЕВх. Например утиные клетки ЕВх, полученные из эмбриональных стволовых клеток мускусной утки, были адаптированы к росту в суспензии перед выведением фидерного слоя. Утиные клетки ЕВх (ЕВ 24, ЕВ 26, ЕВ 66), полученные от пекинской утки,были адаптированы к росту в суспензии перед выведением животной сыворотки;k) возможно дальнейшее субклонирование указанных птичьих клеток ЕВх, например путем ограниченного разбавления. В предпочтительном воплощении данное изобретение связано с способом получения непрерывных диплоидных птичьих клеточных линий, названных ЕВх, полученных из птичьих эмбриональных стволовых клеток (ES), где указанные птичьи клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц, а указанный способ включает следующие этапы:a) выделение птичьего эмбриона(ов) на стадии развития примерно в период откладки яиц, где геном указанной птицы не содержит эндогенные провирусные последовательности, допускающие продукцию способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;b) суспендирование птичьих эмбриональных стволовых клеток (ES), полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной, по меньшей мере:-6 021064 инсулиновым фактором роста 1 (IGF-1) и цилиарным нейротрофическим фактором (CNTF); и сывороткой млекопитающего, например фетальной бычьей сывороткой;c) посев суспензии ES-клеток, полученной на этапе b), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование ES-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;e) выведение IGF-1 и CNTF из культуральной среды и дальнейшее культивирование клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;f) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;g) постепенное уменьшение концентрации указанной сыворотки млекопитающего в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение сыворотки млекопитающего после нескольких пассажей; иh) получение прикрепленных птичьих клеточных линий ЕВх, полученных из ES-клеток, способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя и сыворотки млекопитающего, и где указанные непрерывные диплоидные птичьи клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;i) возможно дальнейшая адаптация указанных прикрепленных птичьих клеточных линий ЕВх к условиям суспензионного культивирования, предпочтительно путем поддерживания роста в виде суспензии, более предпочтительно путем переноса прикрепленной птичьей клеточной линии ЕВх, полученной в этапе h), на другую подложку с менее выраженными прикрепляющими свойствами по сравнению с первоначальной подложкой (например, такую как подложка для прикрепления Ultra Low). Этап j) адаптации прикрепленных птичьих клеточных линий ЕВх к условиям суспензионного культивирования при его осуществлении может быть произведен в другом предпочтительном воплощениии перед этапом g) постепенного уменьшения концентрации сыворотки млекопитающего в культуральной среде. В другом предпочтительном воплощении основная культуральная среда в этапе b) способа получения непрерывных диплоидных птичьих клеточных линий в соответствии с данным изобретением также дополняют фактором роста, выбранным из группы, включающей интерлейкин-6 (IL-6), рецептор интерлейкина-6 (IL-6R), фактор стволовых клеток (SCF) и фактор роста фибробластов (FGF), и указанный способ дополнительно содержит этап d):d) возможно выведение из культуральной среды всех факторов роста, выбранных из группы, включающей IL-6, IL-6R, SCF, FGF, и дальнейшее культивирование ES-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа. В более предпочтительном воплощении, когда осуществляется этап d), этап е) выведения IGF-1 иCNTF из культуральной среды осуществляется после этапа d) выведения из культуральной среды всех факторов роста, выбранных из группы, включающей IL-6, IL-6R, SCF, FGF. В соответствии с изобретением "основная культуральная среда" обозначает культуральную среду с классическим составом среды, которая сама по себе обеспечивает по меньшей мере выживание клеток, а еще лучше рост клеток. Примерами основных сред являются ВМЕ (основная среда Игла), MEM (минимальная среда Игла), среда 199, DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко), GMEM (среда Игла в модификации Глазго), DMEM-HamF12, Ham-F12 и Ham-F10, среда Дульбекко в модификации Искова,среда Маккоя 5 А, об/мин 1640, GTM3. Основная среда содержит неорганические соли (например: CaCl2,KCl, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4, MgSO4 и т.д.), аминокислоты, витамины (тиамин, рибофлавин, фолиевая кислота, D-Ca пантотенат и т.д.) и другие компоненты, такие как глюкоза, бета-меркаптоэтанол, пируват натрия. Предпочтительно основная среда является синтетической. В табл. 1 приведен состав DMEM/ Кроме того, основная среда изобретения может быть дополнена добавками, выбранными из следующей группы: 0,1-5 мМ L-глутамин, предпочтительно 2-3 мМ L-глутамин; 0,05-2 мМ пируват натрия, предпочтительно 0,1-1 мМ пируват натрия; 0,1-2,5% заменимые аминокислоты, предпочтительно примерно 1%, заменимые аминокислоты; 0,1-2,5% витамины, предпочтительно примерно 1% витамины; 0,05-5 мМ бета-меркаптоэтанол, предпочтительно примерно 0,16 мМ бета-меркаптоэтанол; белковый гидролизат неживотного происхождения. Для создания утиных клеток ЕВх изобретения основную среду предпочтительно дополняют белковым гидролизатом неживотного происхождения. Белковые гидролизаты неживотного происхождения выбирают из группы, включающей бакто-триптон, дрожжевой триптон, растительные гидролизаты, такие как соевые гидролизаты или их смеси. В предпочтительном воплощении белковые гидролизаты неживотного происхождения представляют собой гидролизаты дрожжей. Термин "гидролизат" включает ферментативное расщепление соевого пептона или дрожжевого экстракта. Гидролизат может быть получен из множества препаратов соевого пептона или дрожжевого экстракта соответственно, которые затем могут быть ферментативно расщеплены (например папаином), и/или образован путем аутолиза, термолиза и/или плазмолиза. Гидролизаты, такие как Yeastolate, Hy-Soy, Ну-Yeast 412 и Hi-Yeast 444, также можно получить коммерческим путем, из таких источников как SAFC BioSciences (бывший JRH) (Ленекса, Канзас), Quest International (Норвич, Нью-Йорк), OrganoTechnie S.A. (Франция) или Deutsche Hefewerke GmbH (Германия). Источники дрожжевых экстрактов также раскрыты в WO 98/15614. Источники дрожжевых экстрактов и соевых гидролизатов также раскрыты в WO00/03000. Гидролизаты, используемые в средах изобретения, предпочтительно очищены от нерасщепленной фракции, поскольку примеси,которые могут помешать эффективному культивированию, предпочтительно удаляются в ходе этой очистки, тем самым улучшая консистенцию гидролизата. Очистку можно проводить путем ультрафильтрации или хроматографии на сефадексе (например на Сефадексе G25 или Сефадексе G10 или эквивалентных материалах), ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, эксклюзионной хроматографии или "обратнофазовой" хроматографии. Предпочтительно очистку выполняют путем ультрафильтрации с использованием фильтра для удаления частиц более 10 кДа. Эти способы являются известными в данной области. Используя эти способы, можно выбрать фракции, содержащие соевый или дрожжевой гидролизат определенного молекулярного веса. Предпочтительно средний молекулярный вес соевых и дрожжевых гидролизатов находится между примерно 220 и 375 Да. Предпочтительно в клеточной культуральной среде присутствует дрожжевой гидролизат. Дрожжевой гидролизат 50 Х (около 200 г/л), полученный, например, из SAFC-BIOSCIENCES (см. 58902 С), присутствует в клеточной культу-9 021064 ральной среде в конечной концентрации от примерно 0,1 Х до 2 Х, предпочтительно от примерно 0,5 Х до примерно 1 Х. Также в клеточную культуральную среду может быть добавлен соевый гидролизат. 50 Х соевый гидролизат, полученный, например, из SAFC-BIOSCIENCES (см. 58903 С), добавляют в культуральную среду до конечной концентрации от примерно 0,1 Х до 2 Х, предпочтительно примерно 1 Х. В качестве альтернативы в клеточную культуральную среду можно добавить смесь соевого и дрожжевого гидролизатов, как описано в US2004/0077086. В соответствии с предпочтительным воплощением основная среда изобретения представляет собойDMEM-HamF12, которая дополнена 2 мМ L-глутамином, 1 мМ пируватом натрия, 1% заменимыми аминокислотами, 1% витаминами, 0,16 мМ бета-меркаптоэтанолом и возможно 1 Х дрожжевым гидролизатом. Под "полной культуральной средой" понимают основную культуральной среду, дополненную или не дополненную, предпочтительно основную синтетическую среду, дополненную по меньшей мере одним фактором роста и животной сывороткой. Пример полной культуральной среды описан в WO 03/076601, WO 05/007840, ЕР 787180, US 6114168, US 5340740, US 6656479, US 5830510 и в Pain et al.(1996, Development 122:2339-2348). Альтернативно полная культурная среда может быть кондиционной средой, предпочтительно кондиционной средой BRL (buffalo rat liver, клетки печени крыл линии Буффало). Например, кондиционные среды BRL готовят в соответствии с признанными в данной области техниками, например описанными в Smith and Hooper (1987, Dev. Biol. 121:1-9). BRL-клетки можно получить из АТСС под регистрационным номером CRL-1442. Кондиционная среда может быть дополнена экзогенными факторами роста и животной сывороткой, как описано ниже. Используемый в данном документе термин "факторы роста" означает факторы роста, необходимые для выживания и роста недифференцированных птичьих ES-клеток в культуре в основной культуральной среде. Можно схематически охарактеризовать два семейства факторов роста: цитокины и трофические факторы. Цитокины являются главным образом такими цитокинами, которые действуют через рецептор, связанный с белком gp130. Таким образом, ингибирующий фактор лейкемии (LIF), интерлейкин 11, интерлейкин-6, рецептор интерлейкина-6, цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), онкостатин и кардиотропин имеют аналогичный механизм действия с увеличением уровня рецепторов к специфической цепи и их комбинации с белком gp130 в мономерной, а иногда и гетеродимерной форме. Трофические факторы представляют собой главным образом фактор стволовых клеток (SCF), инсулиновый фактор роста 1 (IGF-1) и фактор роста фибробластов (FGF), предпочтительно основной FGF (bFGF) или человеческий FGF (hFGF). Полная культуральная среда в соответствии с изобретением включает основную культуральную среду, предпочтительно основную синтетическую среду, и по меньшей мере один цитокин, который действует через рецептор, связанный с белком gp130, и/или по меньшей мере один трофический фактор. Предпочтительно полная культурная среда в соответствии с изобретением включает основную среду и по меньшей мере один фактор роста, выбранный из группы, включающей ингибирующий фактор лейкемии (LIF), онкостатин, кардиотропин, инсулиновый фактор роста 1 (IGF-1), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), интерлейкин 6 (IL-6), рецептор интерлейкина-6 (IL-6R), фактор стволовых клеток(SCF), фактор роста фибробластов (FGF), интерлейкин-11 (IL-11). В соответствии с первым предпочтительным воплощением полная культуральная среда является основной средой, дополненной животной сывороткой и по меньшей мере IGF-1 и CNTF. В соответствии со вторым предпочтительным воплощением полная культуральная среда является основной средой, дополненной животной сывороткой и по меньшей мере IGF-1, CNTF, IL-6 и IL-6R. В соответствии с третьим предпочтительным воплощением полная культуральная среда является основной средой, дополненной животной сывороткой и по меньшей мере IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF. В соответствии с другим воплощением полная культуральная среда является кондиционной культуральной средой, содержащей факторы роста (например экспрессируемые клетками BRL и STO) и возможно дополненной по меньшей мере одним экзогенным фактором роста, выбранным из группы, включающей: LIF, IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF, IL-11. Концентрация факторов роста IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF, IL-11 в основной среде или в кондиционной культуральной среде составляет примерно от 0,01 до 10 нг/мл, предпочтительно от 0,1 до 5 нг/мл, а более предпочтительно около 1 нг/мл. Культуральная среда изобретения может также содержать дополнительные антибиотики, такие как,например, гентамицин, пенициллин и стрептомицин, чтобы предотвратить бактериальную контаминацию. Антибиотики можно добавить в культуральную среду на ранних пассажах культуры ES-клеток. Например, в культуральную среду можно добавить гентамицин до конечной концентрации 10 нг/мл, пенициллин до конечной концентрации 100 U/мл и стрептомицин до конечной концентрации 100 мкг/мл. В предпочтительном воплощении на поздних этапах способа создания непрерывных диплоидных птичьих клеточных линий изобретения антибиотики в культуральную среду не добавляют. В способе создания птичьих эмбриональных стволовых клеток изобретения клетки культивировали на слое фидерных клеток. Более предпочтительно фидерные клетки являются животными клетками или клеточными линиями, культивированными для получения культуры птичьих ES-клеток. Альтернативно фидерные клетки могут быть заменены внеклеточным матриксом со связанными факторами роста. Фи- 10021064 дерный матрикс будет соответственно относиться либо к фидерным клеткам, либо к внеклеточному матриксу. Фидерный матрикс, используемый здесь, создавали в соответствии с процедурами, известными в данной области. Как отмечалось выше, предпочтительно фидерный матрикс является предварительно обработанным. Под термином "предварительно обработанный" подразумевается, что фидерный матрикс культивируют в присутствии сред в течение периода времени до момента сохранения клеток, полученных из бластодермального диска оплодотворенных птичьих яиц в контакте с фидерным матриксом, например в течение времени, достаточного для того, чтобы начать и наладить продукцию фидерным матриксом, например, факторов роста или иных факторов; обычно фидерный матрикс предварительно обрабатывали путем культивирования его самого по себе в течение от одного до двух дней до момента сохранения клеток, полученных из бластодермального диска оплодотворенных птичьих яиц в контакте с фидерным матриксом. Фидерные клетки предпочтительно включают мышиные фибробласты. Предпочтительными являются STO-фибробласты, но первичные фибробласты тоже подходят. Кроме того, в то время как данное изобретение было описано в связи с использованием мышиных клеточных фидерных матриц, предполагается, что также могут быть использованы фидерные матриксы, содержащие клетки от других мышиных видов (например, крысы); других видов млекопитающих (например, видов копытных,крупного рогатого скота, свиней) или видов птиц (например Gallinacea, курицы, индейки, утки, гуси, перепела, фазана). В другом воплощении фидерные клетки изобретения могут быть трансфицированы вектором(ами) экспрессии, позволяющим(и), например, постоянно экспрессировать в STO-клетках факторы роста, такие как птичий SCF. Таким образом, этот "фидер" производит фактор в такой форме, которая является растворимой и/или прикрепленной к плазматической мембране клеток. Таким образом, способ культивирования данного изобретения возможно может включать создание монослоя фидерных клеток. Фидерные клетки митотически инактивируют с помощью стандартных методик. Например, фидерные клетки можно подвергнуть рентгеновскому или гамма-излучению (например гамма-излучению в 4000 рад), либо можно обработать митомицином С (например 10 мкг/мл в течение 2-3 ч). Процедуры митотического инактивования клеток также детально описаныв информации, обычно посылаемой вместе с клетками из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, ATCC), 10801University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 (например STO-фидерные клетки находятся в ATCC под регистрационным номером 1503). Монослои возможно могут быть культивированы до конфлюентности примерно 80%, предпочтительно до конфлюентности примерно 90%, а более предпочтительно до конфлюентности примерно 100%. Хотя конфигурация фидерных клеток в виде монослоя является предпочтительной конфигурацией для культуры, в рамках данного изобретения предусматривается любая подходящая конфигурация. Так, например, предполагается, что слои, монослои, кластеры, агрегаты или другие ассоциации или объединения фидерных клеток попадают в рамки данного изобретения и в частности под значение термина "матрикс". Культуральную среду изобретения дополняют животной сывороткой. Животной сывороткой предпочтительно является фетальная животная сыворотка. Предпочтительной является фетальная бычья сыворотка. Кроме того, хотя данное изобретение было описано с использованием фетальной бычьей сыворотки, предполагается, что также может быть использована животная сыворотка от других видов животных (например, курицы, лошади, свиньи, копытных и т.д.). Конечная концентрация животной сыворотки в культуральной среде составляла примерно от 1 до 25%, предпочтительно от 5 до 20%, более предпочтительно от 8 до 12%. В предпочтительном воплощении конечная концентрация животной сыворотки в культуральной среде составляла примерно 10%. В соответствии с предпочтительным воплощением культуральная среда содержала примерно 10% фетальной бычьей сыворотки. В первом предпочтительном воплощении птица данного изобретения выбрана из отряда Anseriformes и предпочтительно является уткой, более предпочтительно пекинской уткой, и более предпочтительно пекинской уткой породы М 14 или GL30. В соответствии со вторым предпочтительным воплощением птица данного изобретения представляет собой мускусную утку. Таким образом данное изобретение предлагает первый способ получения непрерывных диплоидных утиных клеточных линий, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ES), где указанные утиные клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц и где указанный способ включает следующие стадии:a) выделение утиного эмбриона(ов) на стадии яйцекладки (т.е. откладки яиц) или незадолго до или после яйцекладки. Возможно яйца могут быть инкубированы, обычно в течение ночи, до созревания (например у мускусной утки).b) суспендирование утиных эмбриональных стволовых клеток (ES), полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной инсулиновым фактором роста 1 (IGF-1), цилиарным нейротрофическим фактором (CNTF), интерлейкином-6 (IL-6), рецептором интерлейкина-6 (IL-6R), фактором стволовых клеток (SCF), фактором роста фибробластов (FGF) и животной сывороткой;c) посев суспензии ES-клеток, полученной на этапе b), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование утиных ES-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;d) выведение всех факторов роста, выбранных из группы, включающей IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R,- 11021064SCF, FGF, из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование утиных ES-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;f) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде, от пассажа к пассажу с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, предпочтительно от 5 до примерно 25 пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;g) возможно постепенное уменьшение концентрации животной сыворотки в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение животной сыворотки через несколько пассажей; иh) получение прикрепленных утиных клеточных линий, полученных из ES-клеток и названных утиными ЕВх, способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя и возможно без животной сыворотки, и где указанные непрерывные диплоидные утиные клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;i) возможно дальнейшая адаптация прикрепленных утиных клеточных линий к условиям суспензионного культивирования. Добавки к основной среде выводятся в ходе способа и предпочтительно между этапами f) и g) или между этапами g) и h). Концентрация животной сыворотки на этапе b) предпочтительно составляет от 5 до 10%. Концентрация инсулинового фактора роста 1 (IGF-1), цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), интерлейкина-6 (IL-6), рецептора интерлейкина-6 (IL-6R), фактора стволовых клеток (SCF) и фактора роста фибробластов (FGF) предпочтительно составляет около 1 нг/мл. Данное изобретение также предлагает второй способ получения непрерывных диплоидных утиных клеточных линий, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ES), где указанные утиные клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц и где указанный способ включает следующие этапы:a) выделение утиного эмбриона(ов) на стадии яйцекладки (т.е. откладки яиц) или незадолго до или после яйцекладки. Возможно яйца могут быть инкубированы обычно в течение ночи, до созревания (например у мускусной утки).b) суспендирование утиных эмбриональных стволовых клеток (ES), полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R,SCF, FGF и животной сывороткой;c) посев суспензии ES-клеток, полученной на этапе b), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование утиных ES-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;d) выведение всех факторов роста, выбранных из группы, включающей IL-6, IL-6R, SCF, FGF, из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;e) выведение факторов роста IGF-1 и CNTF из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;f) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, предпочтительно после примерно 5-15 пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;g) возможно постепенное уменьшение концентрации животной сыворотки в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение животной сыворотки через несколько пассажей; иh) получение прикрепленных утиных клеточных линий, полученных из ES-клеток и названных утиными ЕВх, способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя и возможно без животной сыворотки, и где указанные непрерывные диплоидные утиные клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;i) возможно дальнейшая адаптация прикрепленных утиных клеточных линий к условиям суспензионного культивирования. Добавки к основной среде выводятся в ходе способа и предпочтительно между этапами f) и g) или между этапами g) и h). Концентрация животной сыворотки на этапе b) предпочтительно составляет от 5 до 10%. Концентрация IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF и FGF предпочтительно составляет около 1 нг/мл. Данное изобретение также предлагает третий способ получения непрерывных диплоидных утиных клеточных линий, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ES), где указанные утиные клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц и где указанный способ включает следующие этапы:a) выделение утиного эмбриона(ов) на стадии яйцекладки (т.е. откладки яиц) или незадолго до или после яйцекладки. Возможно яйца могут быть инкубированы обычно в течение ночи до созревания (например у мускусной утки).b) суспендирование утиных эмбриональных стволовых клеток (ES), полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной инсулиновым фактором роста 1 (IGF-1), цилиарным нейротрофическим фактором (CNTF) и животной сывороткой;c) посев суспензии ES-клеток, полученной на этапе b), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование утиных ES-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;d) выведение факторов роста IGF-1 и CNTF из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование утиных ES-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;f) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, предпочтительно в течение от примерно 5 до примерно 25 пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;g) возможно постепенное уменьшение концентрации животной сыворотки в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение животной сыворотки через несколько пассажей; иh) получение прикрепленных утиных клеточных линий, полученных из ES-клеток и названных утиными ЕВх, способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя и возможно без животной сыворотки, и где указанные непрерывные диплоидные утиные клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;i) возможно дальнейшая адаптация прикрепленных утиных клеточных линий ЕВх к условиям суспензионного культивирования. Добавки к основной среде выводятся в ходе способа и предпочтительно между этапами f) и g) или между этапами g) и h). При получении прикрепленных или суспендированных утиных клеточных линий способ изобретения может также включать дополнительный этап адаптации утиных клеток ЕВх к росту в культуральной клеточной среде без белкового гидролизата неживотного происхождения, такого как дрожжевой гидролизат. Предпочтительно утиные клеточные линии ЕВх изобретения не отображают обратнотранскриптазную активность при анализе Q-PERT. Кроме того, способные к репликации эндогенные ретровирусные частицы не продуцируются утиными клетками ЕВх, как об этом свидетельствуют эксперименты совместного культивирования утиных клеток ЕВх изобретения с клетками, способными к репликацииALV, такими как перепелиные QT6-клетки или куриные DF1-клетки. Кроме того, анализ путем трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) также свидетельствует об отсутствии способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц в утиных клетках ЕВх. Предпочтительно утиные клеточные линии ЕВх изобретения выбирают среди утиной ЕВ 24, утиной ЕВ 26 и утиной ЕВ 66, как описано далее. В другом предпочтительном воплощении птица данного изобретения выбрана из отряда Galliformes и более предпочтительной является курица, предпочтительно домашняя курица ev-0 (Gallus Gallus подвид domesticus). Таким образом, данное изобретение предлагает способ получения непрерывных диплоидных клеточных линий домашней курицы ev-0, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ES),где указанные клеточные линии домашней курицы ev-0 не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц ALV-E и где указанный способ включает следующие этапы:a) выделение эмбриона(ов) домашней курицы ev-0 на стадии яйцекладки (т.е. откладки яиц) или незадолго до или после яйцекладки;b) суспендирование эмбриональных стволовых клеток (ES) домашней курицы ev-0, полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной IGF-1, CNTF,IL-6, IL-6R, SCF, FGF и животной сывороткой;c) посев суспензии ES-клеток, полученной на этапе b), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование ES-клеток домашней курицы ev-0 в течение по меньшей мере одного пассажа;d) выведение всех факторов роста, выбранных из группы, включающей IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R,SCF, FGF, из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование куриных ES-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;f) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, предпочтительно в течение от 5 до примерно 25 пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;g) возможно постепенное уменьшение концентрации животной сыворотки в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение животной сыворотки через несколько пассажей; иh) получение прикрепленных клеточных линий домашней курицы ev-0, полученных из ES-клеток и названных ЕВх ev-0, способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя и возможно без животной сыворотки, и где указанные непрерывные диплоидные птичьи клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц ALV-E;i) возможно дальнейшая адаптация прикрепленных птичьих клеточных линий ЕВх ev-0 к условиям суспензионного культивирования.- 13021064 Добавки к основной среде выводятся в ходе способа и предпочтительно между этапами f) и g) или между этапами g) и h). Концентрация животной сыворотки на этапе b) предпочтительно составляет от 5 до 10%. Концентрация IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF и FGF предпочтительно составляет около 1 нг/мл. Данное изобретение также предлагает второй способ получения непрерывных диплоидных клеточных линий домашней курицы ev-0, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ES), где указанные клеточные линии домашней курицы ev-0 не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц ALV-E и где указанный способ включает следующие этапы:a) выделение эмбриона(ов) домашней курицы ev-0 на стадии яйцекладки (т.е. откладки яиц) или незадолго до или после яйцекладки;b) суспендирование эмбриональных стволовых клеток (ES) домашней курицы ev-0, полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной IGF-1, CNTF,IL-6, IL-6R, SCF, FGF и животной сывороткой;c) посев суспензии ES-клеток, полученной на этапе b), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование ES-клеток домашней курицы ev-0 в течение по меньшей мере одного пассажа;d) выведение всех факторов роста, выбранных из группы, включающей IL-6, IL-6R, SCF, FGF, из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование куриных ES-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;e) выведение факторов роста IGF-1 и CNTF из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование ES-клеток домашней курицы ev-0 в течение по меньшей мере одного пассажа;f) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, предпочтительно в течение от примерно 5 до примерно 45 пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;g) возможно постепенное уменьшение концентрации животной сыворотки в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение животной сыворотки через несколько пассажей; иh) получение прикрепленных клеточных линий домашней курицы ev-0, полученных из ES-клеток,способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя и возможно без животной сыворотки, где указанные непрерывные диплоидные клеточные линии домашней курицы ev-0, названные куриными ЕВх, не продуцируют способных к репликации эндогенных ALV-E ретровирусных частиц;i) возможно дальнейшая адаптация прикрепленных клеточных линий домашней курицы ev-0 к условиям суспензионного культивирования. Добавки к основной среде выводятся в ходе способа и предпочтительно между этапами f) и g) или между этапами g) и h). Концентрация животной сыворотки на этапе b) предпочтительно составляет от 5 до 10%. Концентрация IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF и FGF предпочтительно составляет около 1 нг/мл. Данное изобретение также предлагает третий способ получения непрерывных диплоидных клеточных линий домашней курицы ev-0, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ES), где указанные клеточные линии домашней курицы ev-0 не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц ALV-E и где указанный способ включает следующие этапы: а) выделение эмбриона(ов) домашней курицы ev-0 на стадии яйцекладки (т.е. откладки яиц) или незадолго до или после яйцекладки;b) суспендирование эмбриональных стволовых клеток (ES) домашней курицы ev-0, полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной IGF-1, CNTF и животной сывороткой;c) посев суспензии ES-клеток, полученной на этапе b), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование ES-клеток домашней курицы ev-0 в течение по меньшей мере одного пассажа;d) выведение факторов роста IGF-1 и CNTF из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование ES-клеток домашней курицы ev-0 в течение по меньшей мере одного пассажа;f) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, предпочтительно в течение от примерно 5 до примерно 45 пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;g) возможно постепенное уменьшение концентрации животной сыворотки в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение животной сыворотки через несколько пассажей; иh) получение прикрепленных клеточных линий домашней курицы ev-0, полученных из ES-клеток и названных куриными ЕВх ev-0, способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя и возможно без животной сыворотки, и где указанные непрерывные диплоидные куриные клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;i) возможно дальнейшая адаптация прикрепленных клеточных линий домашней курицы ev-0 к условиям суспензионного культивирования. Добавки к основной среде выводятся в ходе способа и предпочтительно между этапами f) и g) или между этапами g) и h). Концентрация животной сыворотки на этапе b) предпочтительно составляет от 5 до 10%. Концентрация IGF-1 и CNTF предпочтительно составляет около 1 нг/мл. В другом предпочтительном воплощении птицей данного изобретения является домашняя курица(Gallus Gallus подвид domesticus), полученная из стаи птиц, свободных от специфического патогена(SPF). Более предпочтительной куриной породой является порода белых кур Ливорно (White-Leghorn). Куриные яйца SPF были проверены на отсутствие известных куриных бактериальных патогенов и вирусов, включая вирус ретикулоэндотелиоза (REV) и экзогенные вирусы птичьего лейкоза (ALV-A, ALV-B,ALV-C, ALV-D, ALV-J). Яйца SPF изобретения могут быть яйцами VALO от LOHMANN (Куксхафен,Германия) или яйцами L22 от CHARLES RIVER (Spafas). Таким образом, данное изобретение также предлагает способы получения непрерывных диплоидных куриных клеточных линий, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ES) из куриных яиц SPF, как описано для куриных яиц ev-0. Предпочтительно куриная клеточная линия ЕВх, полученная из яиц SPF, представляет собой EBv13. Куриные клеточные линии ЕВх изобретения могут отображать обратнотранскриптазную активность при анализе Q-PER, но без продукции способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц. Отсутствие способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц может быть продемонстрировано в экспериментах совместного культивирования куриных клеток ЕВх ev-0 изобретения с клетками,способными к репликации ALV, такими как перепелиные QT6-клетки или куриные DF1-клетки. Кроме того, анализ путем трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) также свидетельствует об отсутствии способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц в куриных клетках ЕВх ev-0. Температура тела птиц обычно составляет около 39C. Таким образом, способы изобретения могут также включать дополнительный этап понижения температуры клеточных культур до 37 С в целях адаптации птичьих клеточных линий изобретения к росту при 37C. Предпочтительно температурная адаптация производится после удаления фидера и до удаления сыворотки. Альтернативно температурная адаптация производится после этапа удаления сыворотки или после этапа адаптации клеточных линий к суспензионному культивированию. Установленные линии ЕВх изобретения имеют характерный рост либо в виде прикрепленных клеток, либо в виде суспензии клеток в культуральной среде без экзогенных факторов роста и животной сыворотки и без фидерных клеток. Для адаптации клеток к суспензионному культивированию могут быть использованы отдельно или в комбинации различные методики, среди которых прикрепленные клетки сеяли с высокой плотностью, немного поышенной конфлюентностью клеток для усиления перехода клеток в суспензию; прикрепленные клетки сеяли в клеточной культуральной среде с низкой концентрацией животной сыворотки; прикрепленные клетки сеяли в клеточные культуральные сосуды из пластика, на котором невозможна адгезия клеток или слабая адгезия клеток, например бактериальные чашки и платы, платы с ультранизкой прикрепляющей способностью, разработанные такими компаниями как Corning (чашки и платы для тканевых культур, см. 3262, 3473, 3471, 3474; колбы см. 3814 и т.д.) или Sarstedt (сосуды см. 831810502 и т.д.); прикрепленные клетки сеяли в сосуд и культивировали в условиях перемешивания (прибл. 50 об/мин). Клетки ЕВх, предпочтительно утиные ЕВх и куриные ЕВх ev-0, могут быть культивированыin vitro в течение значительного периода времени. Преимущественно прикрепленные или субстратнезависимые (т.е. "суспендированные") клетки ЕВх, полученные в способе изобретения, способны к пролиферации в течение по меньшей мере 50 поколений, по меньшей мере 75 поколений, по меньшей мере 100 поколений, по меньшей мере 125 поколений, по меньшей мере 150 поколений, по меньшей мере 175 поколений, по меньшей мере 200 поколений, по меньшей мере 250 поколений. Под выражением "линия" понимается любая популяция клеток, способных бесконечно пролиферировать в культуре in vitro,сохраняя в большей или меньшей степени те же морфологические и фенотипические характеристики. Клоны могут быть получены, например путем ограниченного разведения, из клеток ЕВх изобретения. Эти клоны представляют собой клетки, которые являются генетически идентичными клетке, из которой они образовались путем деления. Данное изобретение также относится к непрерывным диплоидным птичьим клеточным линиям, названным ЕВх, полученным в способе изобретения; указанные ЕВх являются небольшими, круглыми(т.е. диаметром около 10 мкм), одтельными клетками с временем удвоения около 30 ч или менее при 37 или 39C. Птичьи клетки ЕВх, предпочтительно утиные ЕВх или куриные ЕВх ev-0, демонстрируют фенотип эмбриональной стволовой клетки со следующими характеристиками: высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение;- 15021064 эндогенная теломеразная активность; возможно они могут экспрессировать один или более дополнительный ES-маркер, например щелочную фосфатазу, маркеры SSEA-1, ЕМА-1, ENS1; время удвоения короче времени удвоения птичьих ES-клеток этапа а) способа изобретения (от 48 до 72 ч при 39 С), около 30 ч или менее (предпочтительно 24 ч при 37C. Указанные клетки не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц. Птичьи ЕВх клеточные линии изобретения способны к бесконечной пролиферации в основной среде, в частности в такой среде как SAFC Excell, DMEM, GMEM, DMEM-HamF12 или Маккоя, без экзогенных факторов роста, сыворотки и/или инактивированного фидерного слоя, возможно дополненной различными добавками, обычно используемыми специалистами в данной области. Примерами добавок являются заменимые аминокислоты, витамины, пируват натрия и антибиотики. Утиные клетки ЕВх изобретения имеют замечательное свойство расти в основной культурной среде, не дополненной глутамином. Данное изобретение также относится к клеточной культуральной среде для поддержания плюриили мультипотентных птичьих эмбриональных стволовых клеток, предпочтительно плюри- или мультипотентных утиных эмбриональных стволовых клеток (ES) в культуре в недифференцированном состоянии. В соответствии с предпочтительным воплощением данное изобретение относится к клеточной культуральной среде для утиных эмбриональных стволовых клеток, содержащей основную культуральную среду, дополненную животной сывороткой и по меньшей мере IGF-1 и CNTF. В соответствии со вторым предпочтительным воплощением данное изобретение относится к клеточной культуральной среде для утиных эмбриональных стволовых клеток, содержащей основную культуральную среду, дополненную животной сывороткой и по меньшей мере IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R. В соответствии с третьим предпочтительным воплощением данное изобретение относится к клеточной культуральной среде для утиных эмбриональных стволовых клеток, содержащей основную культуральную среду, дополненную животной сывороткой и по меньшей мере IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF и FGF. Указанные среды являются достаточными для поддержания указанных утиных ES-клеток в культуре в течение по меньшей мере 7 дней,предпочтительно по меньшей мере 20 дней, предпочтительно по меньшей мере 100 дней в недифференцированном состоянии. Указанные культуральные среды изобретения возможно могут также содержать по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, включающей интерлейкин-11, кардиотропин,онкостатин и ингибирующий фактор лейкемии (LIF). Предпочтительно указанные культуральные среды также содержат белковый гидролизат неживотного происхождения, как описано выше; более предпочтительно это дрожжевые гидролизаты в концентрации 1 Х. Культуральная среда птичьих (предпочтительно утиных) ES-клеток изобретения может также содержать слой фидерных клеток. Данное изобретение также предлагает непрерывную утиную культуру ES-клеток, состоящую в основном из недифференцированных утиных ES-клеток, демонстрирующих фенотип стволовой клетки со следующими характеристиками: высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение; эндогенная теломеразная активность; возможно утиные ES-клетки могут экспрессировать один или более дополнительный ES-маркер,например щелочную фосфатазу, маркеры SSEA-1, ЕМА-1, ENS1; время удвоения около 40 ч при 37 или 39 С. Указанные недифференцированные утиные клетки в соответствии с изобретением способны поддерживать указанный фенотип стволовых клеток при выращивании на фидерных клетках в клеточной культуральной среде для утиных эмбриональных стволовых клеток, как описано выше. Указанные недифференцированные утиные клетки используются для продукции химерных или трансгенных уток. Таким образом, данное изобретение также относится к способу получения химерной утки, который включает следующие стадии:a) введение непрерывной утиной ES-культуры клеток, описанной выше, в подзародышевую полость реципиентного утиного эмбриона; иb) инкубация эмбриона, полученного на этапе а), для выведения утенка;c) выбор указанного химерного утенка, содержащего гетерологичные клетки, которые в нем колонизировались. Данное изобретение также относится к способу получения генетически модифицированной химерной утки, который включает следующие этапы:a) введение генетически модифицированных утиных ES-клеток, описанных выше, в подзародышевую полость реципиентного утиного эмбриона иb) инкубация эмбриона, полученного на этапе а), для выведения утенка;c) выбор указанного химерного утенка, содержащего генетически модифицированные гетерологичные клетки, которые в нем колонизировались. Данное изобретение также относится к способу получения потомства указанного химерного утенка,который включает следующие этапы:a) ожидание созревания выбранного химерного утенка, полученного на этапе с), во взрослую птицу;b) разведение указанной взрослой птицы, имеющей гетерологичные клетки данного изобретения, и производство таким образом потомства птицы;c) выбор в потомстве целевых птиц. Изобретение может включать дополнительный этап экспрессии гетерологичного полипептида, закодированного вектором экспрессии, содержащимся в указанных генетически модифицированных утиных ES-клетках. Предпочтительно гетерологичный полипептид вводят в биологические жидкости утки,такие как кровь, сперму, мочу или белок развивающегося птичьего яйца, производимого женской особью генетически модифицированной утки. Клетки ЕВх изобретения имеют все вышеупомянутые характеристики и могут использоваться для производства биопрепаратов, таких как вирусные вакцины и рекомбинантные пептиды и белки. Данное изобретение также предлагает способ репликации вируса в непрерывных диплоидных птичьих клеточных линиях ЕВх изобретения. Более предпочтительно изобретение предлагает способ репликации вируса в непрерывных диплоидных птичьих клеточных линиях ЕВх изобретения, предпочтительно утиных или куриных клеточных линиях ЕВх, который включает следующие этапы: инфицирование птичьей культуры клеток ЕВх целевым вирусом; указанные птичьи клетки ЕВх предпочтительно культивировали в среде без животной сыворотки; культивирование инфицированных птичьих клеток ЕВх с целью репликации указанного вируса; сбор вируса в клеточном культуральном супернатанте и/или внутри указанных клеток. В соответствии с предпочтительным воплощением указанный способ включает следующие этапы: а) пролиферация указанных птичьих ЕВх в культивационном сосуде в суспензии в бессывороточной среде 1;b) инфицирование указанных клеток выбранным вирусом, когда клеточная плотность достигает не менее 1,5 млн клеток/мл; с) непосредственно перед инфицированием, одновременно с инфицированием или вскоре после инфицирования возможно добавление к клеточной культуре бессывороточной среды 2 иd) дальнейшее культивирование указанных инфицированных клеток с целью репликации вируса и е) возможно сбор указанного вируса. Указанный способ изобретения может включать дополнительный этап добавления протеолитического фермента в культуральную среду в условиях, которые позволят вирусу размножаться. Протеолитический фермент выбирают из группы, включающей трипсин, химотрипсин, термолизин, пепсин, панкреатин, папаин, проназу, субтилизин А, эластазу, фурин и карбоксипептидазу. В соответствии с предпочтительным воплощением фермент является трипсином. Предпочтительно протеолитический фермент является рекомбинантным белком, произведенным в прокариотическом хозяине или на растениях (например trypzean). Протеолитический фермент можно добавить до, во время и/или после инфицирования вирусом. Предпочтительно добавление протеолитического фермента производится после инфицирования вирусом. Добавление протеолитического фермента в культуральную среду можно выполнять один раз в сутки, более одного раза в сутки или менее одного раза в сутки до того, как вирус не будет забран. Используемый в данном документе термин "вирус" включает в себя не только природные вирусы,но также ослабленные вирусы, химерные вирусы, вакцинные штаммы, а также рекомбинантные вирусы и вирусные векторы, полученные от них. Вирус изобретения предпочтительно выбирают из группы,включающей поксвирусы, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, вирусы герпеса, вирусы гепатита, аденовирусы, парвовирусы, реовирусы, цирковирусы, коронавирусы, флавивирусы, тогавирусы, бирнавирусы и ретровирусы. В предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вирусные, вакцины принадлежат к семейству Poxviridae и более предпочтительно к Chordopoxviridae. В одном воплощении вирус или связанные с ним вирусные векторы, вирусные частицы и вирусные вакцины представляют собой Poxvirus, предпочтительно Avipoxvirus, выбранный среди вируса оспы птиц (т.е.TROVAC), вируса оспы канареек (т.е. ALVAC), вируса оспы юнко, вируса оспы майны, вируса оспы голубя, вируса оспы попугаев, вируса оспы перепела, вируса оспы скворца, вирус оспы индейки. В соответствии с другим предпочтительным воплощением вирус представляет собой вирус осповакцины, выбранный среди штамма Lister-Elstree вируса осповакцины, модифицированного вируса осповакцины,такого как модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара (MVA), который может быть получен из АТСС (номер АТСС VR-1508), NYVAC (Tartaglia et al., 1992, Virology, 188:217-232), LC16m8 (Sugimoto et Yamanouchi, 1994, Vaccine, 12:675-681), CVI78 (Kempe et al., 1968, Pediatrics 42:980-985), и других рекомбинантных или нерекомбинантных вирусов осповакцины. В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Orthomyxoviridae, в частности к вирусу гриппа. Вирус гриппа выбирают из группы, включающей вирус человеческого гриппа, вирус птичьего гриппа, вирус лошадиного гриппа, вирус свиного гриппа, вирус кошачего гриппа. Вирус гриппа предпочтительно выбирают- 17021064 среди штаммов А, В и С. Среди штаммов А можно перечислить вирусы с различными подтипами гемагглютинина и нейраминидазы, такими как H1N1, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H5N2, H7N7 и H9N2,но не ограничиваясь ими. Среди штаммов H1N1 можно перечислить А/Пуэрто-Рико/8/34, А/Новая Каледония/20/99, А/Пекин/262/95, А/Йоханнесбург/282/96, А/Техас/36/91, А/Сингапур, А/Соломоновы острова/03/2006. Среди штаммов H3N2 можно перечислить А/Панама/2007/99, А/Москва/10/99, А/ Йоханнесбург/33/94, А/Висконсин/10/04. Среди штаммов В можно перечислить В/Пуэрто-Рико/8/34,В/Йоханнесбург/5/99, В/Вена/1/99, В/Энн-Арбор/1/86, В/Мемфис/1/93, В/Харбин/7/94, N/Шандонг/7/97,В/Конг Конг/330/01, В/Яманаси/166/98, В/Жиангсу/10/03, В/Малайзия, но не ограничиваясь ими. Вирус гриппа изобретения выбирают среди вируса дикого типа, первичного вирусного изолята, полученного от инфицированного индивидуума, рекомбинантного вируса, ослабленного вируса, термочувствительного вируса, адаптированного к низкой температуре вируса, химерного вируса, вируса, спроектированного путем обратной генетики. Когда вирус изобретения является вирусом гриппа, способ изобретения включает дополнительный этап добавления протеолитического фермента в культуральную среду в условиях,которые позволят вирусу размножаться. В соответствии с предпочтительным воплощением фермент является трипсином. Конечная концентрация трипсина в клеточной культуральной среде составляет от примерно 0,01 до 10 мкг/мл. Более предпочтительно конечная концентрация трипсина в клеточной культуральной среде находится в пределах от 0,01 до 10 usp/мл (usp: фармакологическая единица США),предпочтительно в диапазоне от 0,05 до 2 usp/мл, более предпочтительно в диапазоне от 0,3 до 1 usp/мл и более предпочтительно около 0,75 usp/мл. В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Paramyxoviridae. Предпочтительно вирус является природным парамиксовирусом или рекомбинантным парамиксовирусом, выбранным из группы, включающей вирус кори, вирус эпидемического паротита, вирус краснухи, вирус Сендай, респираторносинцитиальный вирус (RSV, Respiratory Syncythial virus), вирус человеческого парагриппа типов I и III,вирус чумы крупного рогатого скота, вирус собачьей чумки, вирус болезни Ньюкасла, вируса утиного парагриппа. В соответствии с предпочтительным воплощением вирус представляет собой вирус кори или рекомбинантный вирус кори. В соответствии с другим предпочтительным воплощением вирус представляет собой вирус болезни Ньюкасла (NDV, Newcastle Disease virus) или рекомбинантный NDV. Примером штамма NDV является штамм LaSota. Когда вирусом изобретения является NDV, способ изобретения предпочтительно содержит дополнительный этап добавления протеолитического фермента в культуральную среду в условиях, которые позволят вирусу размножаться. В соответствии с предпочтительным воплощением фермент является трипсином. Конечная концентрация трипсина в клеточной культуральной среде составляет от примерно 0,01 мкг/мл до 10 мкг/мл. Более предпочтительно конечная концентрация трипсина в клеточной культуральной среде находится в пределах от 0,01 до 10 usp/мл (usp: фармакологическая единица США), предпочтительно в диапазоне от 0,3 до 1 usp/мл, более предпочтительно в диапазоне от 0,4 до 0,75 usp/мл. Интересно, что клеточные линии ЕВх изобретения, которые могут расти в прикрепленном состоянии, могут использоваться для выполнения титрования вируса и предпочтительно для титрования NDV при анализе бляшкообразования. Действительно, в отличие от CEF и куриных DF1 фибробластов, у которых невозможно наблюдать никакие цитопатологические эффекты, вирусный рост в клетках ЕВх приводит к формированию характерных гигантских клеток. Кроме того,вирусные частицы NDV можно выявлять с помощью анализа гемагглютинации. Таким образом, изобретение также имеет отношение к применению клеток ЕВх изобретения для титрования вирусов, таких как вирус NDV. В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Togaviridae. Предпочтительно вирус является природным альфавирусом или рекомбинантным альфавирусом, выбранным из группы, включающей вирус Синдбис,вирус леса семлики, вирус лихорадки О'Ньонг-Ньонг, вирус чикунгуньи, вирус Майяро, вирус реки Росс,вирус восточного лошадиного энцефалита, вирус западного лошадиного энцефалита, вирус венесуэльского лошадиного энцефалита. В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Herpesviridae. Предпочтительно вирус являетсяприродным вирусом болезни Марека или рекомбинантным вирусом болезни Марека. Вирус болезни Марека (MDV,Marek Disease virus) предпочтительно выбирают среди лицензированных вакцинных штаммов MDV, таких как: FC126 (HTV), SB-1, 301 В/1, CVI988 клон С, CV1988/C/R6, CVI988/Rispens, R2/23 (Md11/75). В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Hepadnaviridae. Предпочтительно вирус является природным вирусом гепатита или рекомбинантным вирусом гепатита, предпочтительно выбранным среди вирусов птичьего и человеческого гепатита. Вирус птичьего гепатита предпочтительно выбирают из группы,включающей вирус утиного гепатита В (DHBV), вирус гепатита В цапли (HHBV) и вирус гепатита В белого гуся (SGHBV). В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные ча- 18021064 стицы и вакцины принадлежат к семейству Birnaviridae, в частности вирус инфекционного бурсита. В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Flaviviridae, в частности вирус лихорадки денге, вирус японского энцефалита и вирус Западного Нила. В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Coronaviridae, в частности вирус инфекционного бронхита. В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Circoviridae, в частности вирус куриной анемии. В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Retroviridae. Предпочтительно вирус является природным ретровирусом, выбранным среди вируса ретикулоэндотелиоза, вируса инфекционной анемии уток, вируса некроза селезенки уток, или его рекомбинантным ретровирусом. В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Parvoviridae. Предпочтительно вирус является природным парвовирусом, таким как утиный парвовирус или его рекомбинантный парвовирус. В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Adenoviridae. Предпочтительно вирус является природным аденовирусом, предпочтительно выбранным среди аденовируса птиц, аденовируса гусей, аденовируса уток и аденовируса голубей, или его рекомбинантным аденовирусом. Примерами аденовируса птиц являются аденовирус птиц 1 (CELO), аденовирус птиц 5 (340), аденовирус птиц 4 (KR95), аденовирус птиц 10 (CFA20), аденовирус птиц 2 (П 7-А), аденовирус птиц 3 (75), аденовирус птиц 9 (А 2-А), аденовирус птиц 11 (380), аденовирус птиц 6 (CR119), аденовирус птиц 7 (YR36), аденовирус птиц 8 а (TR59), аденовирус птиц 8b (764) и вирус синдрома снижения яйценоскости. Примерами аденовируса гусей являются аденовирус гусей 1, аденовирус гусей 2, аденовирус гусей 3. Примером аденовируса уток является аденовирус уток 2. Примером аденовируса голубей является аденовирус голубей 1. Рекомбинантные вирусы включают вирусные векторы, содержащие гетерологичный ген, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях вспомогательную функцию (или функции) для репликации вирусов обеспечивает принимающая клета (клетка-хозяин) ЕВх, вирус-помощник (или хелперный вирус) или плазмида-помощник (или хелперная плазмида). Представленные векторы включают такие векторы, которые инфицируют клетки птиц или млекопитающих, но не ограничиваются ими. Данное изобретение также относится к применению клеток ЕВх изобретения для репликации внутриклеточных бактерий, таких как хламидии, риккетсии или коксиеллы. Клетки ЕВх изобретения могут также быть использованы для получения рекомбинантных белков и пептидов. Изобретение также относится к способу производства рекомбинантных белков и пептидов,который включает следующие этапы: (i) генетическая модификация клеток ЕВх изобретения путем временной или стабильной трансфекции вектора экспрессии; (ii) возможно выбор клеток ЕВх, экспрессирующих указанные рекомбинантные белки или пептиды; и (iii) очистка указанных пептидов и белков. Пептиды и белки, продуцируемые клетками ЕВх, также включены в данное изобретение. Культивационный сосуд изобретения более предпочтительно выбирают среди резервуаров биореактора с непрерывным встряхиванием, биореактора Wave, биореактора Bello, вращающихся колб и"клеточных фабрик" (cell factory). Как правило, клетки из главного или рабочего клеточного банка постепенно проводят через Т-колбы (колбы для тканевых культур) различных размеров, вращающиеся колбы или биореактор Wave и предпочтительно заканчивают биореактором. Полученную клеточную суспензию затем обычно подают в биореактор для выращивания посевного материла (продукционный биореактор) (обычно объемом 20-30 л) для дальнейшего культивирования, а в некоторых воплощениях в больший по размеру продукционный биореактор (обычно объемом 150-180 л и больше). Отношение объема второго (большего) биореактора к продукционному биореактору зависит от степени, в которой клеточная линия размножается в первом биореакторе, но обычно составляет от 3:1 до 10:1, например в диапазоне (6-8): 1. В соответствии с предпочтительным воплощением культивационный сосуд является резервуаром биореактора с непрерывным встряхиванием, что позволяет контролировать температуру,аэрацию, рН и другие контролируемые условия, и которая оснащена соответствующим входным отверстием для введения клеток, стерильного кислорода, различных сред для культивирования и выходным отверстием для удаления клеток, сред и средства для перемешивания культуральной среды в биореакторе. В соответствии с данным изобретением термин "бессывороточная среда" (SFM, serum-free medium) обозначает клеточную культуральную среду, готовую к использованию, т.е. она не требует добавления животной сыворотки и позволяет клеткам выживать и расти. Эта среда не имеет строгого химического состава и может содержать гидролизаты различного происхождения, например растительные или дрожжевые. Предпочтительно указанная SFM определена как имеющая "неживотное происхождение", т.е. она не содержит компонентов животного или человеческого происхождения (статус МСХ: "без компонентов животного происхождения"). В SFM нативные сывороточные белки заменяют рекомбинантными белка- 19021064 ми. Альтернативно SFM-среда в соответствии с изобретением не содержит белок (PF-среда: "безбелковая среда", "protein free medium") и/или является химически определенной (CDM-среда: "химически определенная среда", "chemically defined medium"). SFM-среды демонстрируют ряд преимуществ: (i) в первую очередь эти среды удовлетворяют нормативным требованиям (в самом деле, нет опасности контаминации случайными агентами, такими как BSE, вирусы); (ii) оптимизация способа очистки; (iii) лучшая воспроизводимость способа из-за более определенного состава среды. Примерами коммерчески доступныхProd (См. М 3678), среда Gene Therapy 3 (без компонентов животного происхождения) (SIGMA-Aldrich,см. G-9916 или Excell GTM-3) (в дальнейшем называемая средой G9916), HYQ CDM4 НЕК-293 (Hyclone,см. SH30859), HYQ SFM4 НЕК-293 (HYCLONE, см. SH30521), AEM (InVitrogen). В соответствии с первым предпочтительным воплощением бессывороточная среда 1 и бессывороточная среда 2 являются одной и той же средой. В соответствии со вторым предпочтительным воплощением бессывороточная среда 1 и бессывороточная среда 2 имеют различный состав. Способ изобретения включает удаление всей или части бессывороточной среды 1 с последующей ее заменой бессывороточной средой 2. Однако более удобно удалять большую долю (например примерно 50%) бессывороточной среды 1, а затем восполнять ее бессывороточной средой 2 в то время, пока среда 1 еще удаляется, например через спинфильтр (центрифужный фильтр). В соответствии с предпочтительным воплощением бессывороточную среду 2 непосредственно добавляют в бессывороточную среду 1 без удаления части бессывороточной среды 1. К 1 объему бессывороточной среды 1 добавляют от 0,25 до 10 объемов бессывороточной среды 2. В предпочтительном воплощении к 1 объему бессывороточной среды 1 добавляют от 0,5 до 8 объемов бессывороточной среды 2. В более предпочтительном воплощении к 1 объему бессывороточной среды 1 добавляют от 3 до 6 объемов бессывороточной среды 2. Бессывороточная среда 1 и/или бессывороточная среда 2 может быть дополнена по меньшей мере одним компонентом, выбранным из группы, включающей аминокислоты, липиды, жирные кислоты, холестерин, витамины, углеводы, белковые гидролизаты неживотного происхождения, а также их смеси. Альтернативно способ репликации вируса изобретения является полунепрерывным способом с подпиткой, который включает дополнительный этап подпитки клеток по меньшей мере одним компонентом, выбранным из группы, включающей аминокислоты, липиды, витамины, углеводы, белковые гидролизаты неживотного происхождения, поверхностно-активные вещества и их смесь. В соответствии с первым предпочтительным воплощением подпитку проводят в ходе этапов от а) до d) способа изобретения репликации вируса, альтернативно только в ходе этапов от b) до d), или альтернативно в ходе этапаd). Питание может происходить либо на ежедневной основе, либо на постоянной основе. При прерывистом питании оно может происходить один раз в сутки, более одного раза в сутки или менее одного раза в сутки.SFM-среды изобретения содержат ряд компонентов, включая аминокислоты, витамины, органические и неорганические соли, источники углеводов, каждый ингредиент присутствует в количестве, которое поддерживает культивирование клеток in vitro. Тем не менее, для улучшения роста клеток или производительности вируса в SFM-среды добавляют дополнительные ингредиенты. Выбор аминокислот(ы) для добавления к клеточной культуре может быть проведен путем анализа потребления аминокислот клетками в культуре; такое потребление варьирует в зависимости от вида клеток. В соответствии с предпочтительным воплощением аминокислоты, добавленные в среду, могут быть выбраны из группы, включающей аспарагин и глутамин, или их смеси. В более предпочтительном воплощении глутамин добавляют к культуре куриных клеток ЕВх и питание глутамином производится в ходе этапов от а) до d) для сохранения концентрации глутамина в среде между примерно 0,5 мМ и примерно 5 мМ, предпочтительно между примерно 1 мМ и примерно 3 мМ, и наиболее предпочтительно примерно 2 мМ. В предпочтительном воплощении питание глутамином производят на постоянной основе. Интересно, что утиные клетки ЕВх не потребляют много глутамина, потому что утиные клетки способны синтезировать глутамин. Таким образом, глутамин может быть добавлен или не добавлен в культуру утиных клеток ЕВх. В соответствии с предпочтительным воплощением углеводы, добавляемые в среду, выбирают из группы, включающей D-глюкозу, D-сахарозу и D-галактозу или их смеси. В соответствии с более предпочтительным воплощением добавленным углеводом является D-глюкоза. Подпитка D-глюкозой произ- 20021064 водится в ходе этапов от а) до d), более предпочтительно в ходе этапов от b) до d) для сохранения концентрации D-глюкозы в среде между примерно 0,5 и 25 г/л D-глюкозы, предпочтительно между примерно 1 и 10 г/л D-глюкозы, предпочтительно примерно от 2 до 3 г/л D-глюкозы. В предпочтительном воплощении подпитку глюкозой производят на постоянной основе. В соответствии с предпочтительным воплощением липиды выбирают из группы, включающей холестерин, стероиды и жирные кислоты, такие как пальмитиновую кислоту, пальмитолеиновую кислоту,стеариновую кислоту, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоты и их производные,или их смесей. Более предпочтительно жирные кислоты получают из SIGMA-ALDRICH (см. F7050) и добавляют в культуральную среду примерно 0,35 мкл/мл раствора жирных кислот. Среда может содержать вспомогательные вещества, такие как буферные вещества, например бикарбонат натрия, стабилизаторы окисления, стабилизаторы для противодействия механическим нагрузкам или ингибиторы протеаз. При необходимости к среде в качестве антипенного агента может быть добавлено неионогенное поверхностно-активное вещество, такое как полипропиленгликоль (PLURONIC F61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 или PLURONIC F-108). Эти агенты, как правило, используются для защиты клеток от негативного воздействия аэрации, поскольку без добавления поверхностно-активного вещества поднимающиеся и разрывающиеся пузырьки воздуха могут привести к повреждению тех клеток, которые находятся на поверхности этих пузырьков воздуха ("барботирование"). Количество неионогенного поверхностно-активного вещества предпочтительно составляет от примерно 0,05 до примерно 10 г/л, как правило от 0,1 до 5 г/л. В соответствии с другим воплощением изобретения концентрация поверхностно-активного вещества в клеточной культуральной среде может быть изменена для адаптации (т.е. увеличения или уменьшения) размера клеточных сгустков. В соответствии с воплощением способа репликации вируса изобретения добавление бессывороточной среды 2 в клеточную культуру осуществляют после этапа инфицирования b), предпочтительно примерно через 0,5-4 ч после этапа b) и более предпочтительно примерно через 1 ч после этапа b). В соответствии с другим воплощением изобретения добавление бессывороточной среды 2 в клеточную культуру осуществляют перед этапом инфицирования b), предпочтительно примерно через 0,5-4 ч после этапа b), и более предпочтительно примерно за 1 ч до этапа b). В соответствии с другим воплощением изобретения добавление бессывороточной среды 2 в клеточную культуру осуществляют одновременно с этапом инфицирования b. Вирусное инфицирование этапа b) осуществляют при m.o.i. (multiplicity ofinfection, множественности заражения) примерно от 10 до 10-8, предпочтительно примерно от 10-1 до 10-6,более предпочтительно примерно от 10-2 до 10-5 и более предпочтительно примерно 10-4. Специалист в данной области сможет определить оптимальное значение m.o.i. в зависимости от типа вируса. На этапе с) инфицированные клетки предпочтительно культивируют в течение по меньшей мере 24 ч, по меньшей мере 48 ч, по меньшей мере 72 ч, по меньшей мере 96 ч, по меньшей мере 120 ч, по меньшей мере 144 ч. Когда вирус представляет собой поксвирус, инфицированные клетки культивируют по меньшей мере 144 ч. В способе изобретения культивирование клеток этапа а) осуществляют путем полунепрерывного культивирования, полунепрерывного культивирования в отливно-приливом режиме, полунепрерывного культивирования с подпиткой или перфузионного культивирования. Более предпочтительно культивирование клеток на этапе а) осуществляют путем полунепрерывного культивирования. Инфицирование в этапе b) выполняют, когда плотность клеток становится по меньшей мере примерно 4 млн, предпочтительно 6 млн клеток/мл, более предпочтительно 8 млн клеток/мл при полунепрерывном культивировании или полунепрерывном культивировании с подпиткой. При использовании перфузионного способа инфицирование на этапе b) выполняют, когда плотность клеток становится по меньшей мере примерно 8 млн,предпочтительно примерно от 9 до 10 млн клеток/мл или даже выше. рН бессывороточной культуральной среды на этапах а), b), с) и d) предпочтительно контролируется биореактором. рН должен находиться в диапазоне от 6,5 до 7,8, предпочтительно примерно от 6,8 до 7,5 и более предпочтительно примерно 7,2. В способе изобретения этап d) длится от 1 до 10 дней до момента сбора. В соответствии с предпочтительным воплощением этап d) длится от 2 до 5 дней до момента сбора. Время сбора (этап е) определяют по плотности клеток в культивационном сосуде. Изобретателем установлено, что оптимальное время для сбора вирусов наступает через два дня после того, как плотность жизнеспособных клеток достигла своего оптимального уровня и начала снижаться из-за вирусной инфекции. Культивирование клеток выполняют при температуре между 32 и 39 С в зависимости от типа вируса. Для продукции вируса гриппа и поксвируса инфицирование клеточной культуры выполняют предпочтительно при 33C. Клетки ЕВх способны расти в суспензионной культуре с клетками, слипшимися в рыхлые агрегаты из нескольких клеток вплоть до нескольких сотен клеток. Без привязки к какой-либо теории размер сгустка может варьировать в зависимости от состава клеточной культуральной среды. Например на размер сгустка может влиять присутствие поверхностно-активного вещества, такого как полипропиленгликоль (PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 или PLURONIC F-108),встряхивание, концентрация двухвалентных ионов, таких как Mg2+ и Ca2+. Изобретателем было установ- 21021064 лено, что выход вируса можно увеличить, позволяя клеткам ЕВх изобретения агрегировать друг с другом до формирования сгустков в ходе по меньшей мере этапа а) способа. Во время перехода из сосудов с главным и рабочим банком клеток через Т-колбы различного размера или вращающиеся колбы в биореакторы суспендированные клетки, как правило, переводят в больший сосуд либо путем разведения в свежей среде, либо путем центрифугирования, после которого клеточный осадок ресуспендируют в свежей среде. Изобретателем было обнаружено, что во время клеточных пассажей лучше оставлять большие сгустки клеток в культуре. Чтобы это сделать, лучше не разрушать клеточные сгуски в целях улучшения репликации вируса в клетках ЕВх. Например, на начальных этапах культивирования этапа а) в Тколбах или вращающихся колбах рекомендуется разводить клеточную культуру для переноса клеток в больший сосуд(ы), и не рекомендуется ни центрифугировать ее, ни разрушать клеточные сгустки пипетированием или встряхиванием. Однако слишком большие сгустки могут быть субоптимальными для высокой вирусной продукции. Следовательно, специалист в данной области сможет определить, может ли частичное разрушение сгустков при пипетировании или встряхивании во время начальных пассажей клеток этапа а) улучшить вирусный выход. В соответствии с предпочтительным воплощением поксвирусы и предпочтительно вирусы MVA, ALVAC и Fowlpox получают в способе изобретения, включающем этап а) пролиферации сгустков ЕВх в рыхлых агрегатах, содержащих от нескольких клеток до более чем по меньшей мере 100 клеток, по меньшей мере 200 клеток, по меньшей мере 500 клеток, по меньшей мере 1000 клеток. Изобретателямибыло обнаружено, что размер сгустков клеток ЕВх, предпочтительно сгустков утиных клеток ЕВх, могут зависеть от концентрации ионов Mg2+ и/или Ca2+ в субстрат-независимой клеточной культуральной среде. Поскольку слишком большие сгустки могут быть субоптимальными для высокой вирусной продукции, то размер сгустков можно контролировать путем коррекции концентрацииMg2+ и Ca2+ в клеточной культуральной среде. Для утиных клеток ЕВх клеточная культуральная среда предпочтительно содержит Mg2+ в концентрации от 0,5 мМ до 2,5 мМ, предпочтительно около 1,6 мМ, и Са 2+ в концентрации от 0,01 мМ до 0,5 мМ, предпочтительно около 0,1 мМ. Изобретение также относится к вирусу, полученному в способе изобретения. Данное изобретение также относится к вакцине, содержащей вирус изобретения. Способ изготовления вирусной вакцины включает способ репликации вируса в соответствии с изобретением, где этап е) сбора вируса включает по меньшей мере один этап, выбранный среди фильтрации, концентрирования, замораживания и стабилизации путем добавления стабилизирующих агентов. Сбор вируса осуществляется в соответствии с технологиями, хорошо известными специалисту в данной области. В соответствии с предпочтительным воплощением этап сбора указанного вируса включает сбор клеточного культурального супернатанта,полученного при центрифугировании клеточной культуры, затем фильтрацию, концентрирование, замораживание и стабилизацию путем добавления стабилизирующих агентов. Например, для вируса гриппа см. Furminger, In Nicholson, Webster and Hay (Eds) Textbook of influenza, глава 24, стр. 324-332. Способ производства вирусной вакцины в соответствии с изобретением может также включать дополнительный этап инактивации собранного вируса. Инактивацию предпочтительно выполняют путем обработки формальдегидом, бета-пропиолактоном, эфиром, эфиром и поверхностно-активным веществом (например таким как Твин-80), цетилтриметил-бромидом аммония (СТАВ) и Тритоном 102,дезоксихолатом натрия и три(N-бутил)фосфатом. В соответствии с другим воплощением изобретение также относится к способу изготовления вирусных антигенных белков из вируса, полученных в способе изобретения, который включает дополнительные этапы:a) возможно инкубации клеточного культурального супернатанта, содержащего целый вирус с ферментами рестрикции дезоксирибонуклеиновой кислоты, предпочтительно ДНКазами (см. классификацию ЕС 3.1.21 и ЕС 3.1.22) и нуклеазами (см. классификацию ЕС 3.1.30 и ЕС 3.1.31). Предпочтительно ферментом, расщепляющим ДНК, является бензоназа (бензоновая нуклеаза) или ДНКаза I;b) добавления катионного поверхностно-активного вещества. Примеры катионного поверхностноактивного вещества включают цетилтриметиловую соль аммония, например СТАВ, миристилтриметиловую соль аммония, липофектин, DOTMA и Твин, но не ограничиваются ими;c) выделения антигенных белков. Этот последний этап можно осуществить путем центрифугирования или ультрафильтрации. Вирус в вакцине может находиться либо в виде интактных вирусных частиц, либо в виде дезинтегрированных вирусных частиц. В соответствии с воплощением вакцина является убитой или инактивированной вакциной. В соответствии с другим воплощением вакцина является живой ослабленной вакциной, которая главным образом состоит из супернатанта клеточной культуры ЕВх, полученного в способе изобретения, предпочтительно без сыворотки, возможно фильтрованной и/или концентрированной и содержащей указанный вирус. В соответствии с третьим воплощением вакцина содержит вирусные антигенные белки, полученные от вируса, изготовленного в соответствии с способом изобретения. Изобретение также относится к получению вакцины, содержащей инфицированную клеточную линию ЕВх, предпочтительно утиную или куриную ev-0 ЕВх, полученную в способе изобретения, где- 22021064 инфицированная клеточную линию ЕВх, предпочтительно утиную или куриную ev-0 EBx, собирают на этапе d). Вакцина изобретения может содержать вирус изобретения в сочетании с фармацевтически приемлемыми веществами, которые усиливают иммунный ответ. Неограничивющими примерами веществ,которые повышают иммунный ответ, являются неполный адъювант Фрейнда, сапонин, кристаллогидраты алюминия, лизолецитин, полиолы плутония, полианионы, пептиды, бациллы Кальметта-Герена(БЦЖ) и Corynebacterium parvum. Примером синтетического адъюванта является QS-21. Кроме того, для повышения иммунного ответа на вакцину можно использовать иммуно-стимулирующие белки (интерлейкины IL1, IL2, IL3, IL4, IL12, IL13, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и т.д.). Вакцина изобретения является предпочтительно жидким составом, замороженным препаратом, дегидрированным и замороженным препаратом, возможно адаптированным к интраназальному способу введения. Вакцина изобретения применяется в профилактике и/или терапевтическом лечении человека или животного, инфицированного вирусом из перечисленных выше. Предпочтительно вирусная вакцина изобретения применяется для профилактики и/или терапевтического лечения человека, инфицированного вирусом, выбранным среди вирусов оспы, гриппа, кори, эпидемического паротита, краснухи, RSV. Альтернативно вакцину изобретения предпочтительно используют для профилактики и/или терапевтического лечения животного, инфицированного вирусом, выбранным среди вируса гриппа, вируса болезни Ньюкасла, вируса синдрома снижения яйценоскости, вируса инфекционного бурсита, вируса инфекционного бронхита, вируса собачьей чумки, вируса куриной анемии. Рекомбинантная вирусная вакцина изобретения может также использоваться для профилактики и/или терапевтического лечения хронических заболеваний, таких как рак, и инфекционных заболеваний, таких как СПИД. Клеточные линии ЕВх изобретения используют для создания и производства химерного вируса("re-assorted virus"). Вирус с сегментированным геномом, например вирус гриппа, может быть изменен. При одновременном инфицировании клеток ЕВх изобретения по меньшей мере двумя различными штаммами вируса гриппа, смесь сегментированного генома из двух разных штаммов находится в одной принимающей клетке (клетке-хозяине). В ходе вирусной сборки теоретически могут быть получены все комбинации геномных сегментов. Таким образом конкретные химерные вирусы можно выделить путем отбора или элиминирования вируса с желаемыми признаками, например с помощью антител. Клеточные линии ЕВх. изобретения также используют для создания и производства вируса гриппа с помощью обратной генетики (см. Enami, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3802-3805 (1990); Enami et Palese, J. Virol. 65:2511-2513 (1991); Luytjes, Cell 59:1107-1113 (1989. Данное изобретение также относится к применению клеточных линий ЕВх изобретения в качестве клеточного субстрата для выполнения титрования вируса. Клетки ЕВх будут эффективны в замене существующей клеточной системы, такой как оплодотворенное яйцо, CEF, клетки DF1 и т.д., используемой для определения титра вирусного раствора. Предпочтительно титрование вируса осуществляется способом TCID50 (Reed L, Muench H, 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J.Hyg. 27, 493-97). Данное изобретение относится также к применению клеточных линий ЕВх изобретения в качестве клеточного субстрата для выполнения санитарного тестирования. Изобретение также относится к диагностическому составу, содержащему вирусы изобретения или его составные части. Приведенные ниже примеры объясняют изобретение более подробно. Следующие препараты и примеры даны специалистам в данной области для более четкого понимания и практического применения данного изобретения. Данное изобретение, однако, не ограничено рамками приведенных в пример воплощений, которые предназначены для иллюстрирования только отдельных аспектов изобретения, и способы, которые являются функционально эквивалентными, входят в рамки изобретения. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые описаны в данном документе,будут очевидны специалистам в данной области, исходя из вышеизложенного описания и сопутствующих иллюстраций. Предполагается, что такие модификации подпадают под сферу действия приложенной формулы изобретения. В оставшейся части описания будут даны ссылки на легенды к иллюстрациям ниже. Графические материалы Фиг. 1: Субстрат-независимые куриные ЕВх-клетки Фиг. 1 А: Субстрат-независимые куриные клетки Valo EBv13 в бессывороточной среде. КлеткиEBv13 инкубировали при 37 С в суспензионной бессывороточной среде Excell 65319 (SAFC). КлеткиEBv13 имели однородные размеры и росли в рыхлых сгустках в культуре. Время удвоения популяции составляло около 16-18 ч, а плотность клеток, достигаемая в перемешиваемых сосудах, составляла около 4-5 млн клеток/мл. Фиг. 1 В: Субстрат-независимые куриные клетки ЕВ линии 0 в бессывороточной среде. Клетки ЕВ- 23021064 линии 0 инкубировали при 39 С в суспензионной бессывороточной среде Excell 66444 (SAFC). Клетки ЕВ линии 0 имели однородные размеры и росли в рыхлых сгустках. Фиг. 2: Куриные клетки Valo EBv13 экспрессируют высокий уровень теломеразы Клетки EBv13 при пассаже р 193 экспрессировали высокий уровень теломеразы того же порядка значений, что и куриные клетки ЕВ 14-О 74 (см. WO03/076601) при пассаже р 164 (главный банк клеток: МСВ) или при пассаже р 184 (рабочий банк клеток: WCB). Мышиные эмбриональные стволовые клеткиEBv13 (пассаж 188) сеяли с плотностью 0,4106 клеток/мл в колбы F175 объемом 100 мл или в 40 мл среды SFM Excell Medium 65319, или в G9916 SFM Medium (SAFC), дополненную 4 мМ глутамином. Клеточный рост и инфицирование MVA-GFP (MOI 10-2 TCID50/клетка) проводили при 37 С. Через час после инфицирования добавляли 60 мл свежей среды. Фиг. 3 А: кинетика клеточной плотности в среде SFM Excell Medium 65319 или G9916 SFM Medium(SAFC). Фиг. 3 В: MVA-производительность, выраженная в TCID50/мл, в среде SFM Excell Medium 65319 или G9916 SFM Medium (SAFC). Фиг. 4: Анализ трансмиссионной электронной микроскопии утиных ЕВх-клеток Анализ трансмиссионной электронной микроскопии dEBx-клеток был проведен доктором A Rivoire(Лион, Франция). Утиные ЕВх-клетки имели типичную морфологию эмбриональных стволовых клеток(т.е. высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение), которые схожи с фенотипом мышиных эмбриональных стволовых клеток и клеток VIVALIS EB14, описанных в WO 2006/108846. Утиные ЕВх-клетки представляют собой небольшие круглые клетки с большим ядром и ядрышком, с короткими псевдоподиями, вытягивающимися из плазматической мембраны. Они обладают высокой метаболической активностью и цитоплазмой, богатой рибосомами и митохондриями. Фиг. 5 а и 5b: Экспрессия теломеразы в утиных клеточных линиях ЕВх Экспрессию теломеразы на различных этапах создания утиных клеток ЕВх исследовали с помощью набора для обнаружения теломеразы от Roche (Telomerase OCR ELISA). Фиг. 5 А: Теломераза высоко экспрессирована в различных прикрепленных линиях утиных ЕВхклеточных линиях, как в куриных клетках EBv13. Утиные эпителиальные клетки, используемые в качестве отрицательного контроля, не экспрессируют теломеразу. Фиг. 5 В: В способе создания суспендированных утиных ЕВх-клеток сохраняется высокий уровень экспрессии теломеразы. Высокий уровень теломеразы исследовали в утиных ЕВх-клетках в способе удаления фидера (с фидерными клетками или без них), в способе адаптации утиных клеток ЕВ 26 к суспензии и после удаления сыворотки из dEB24 и dEB26. Утиные ЕВх-клетки, такие как ЕВ 24 и ЕВ 26, экспрессируют высокий уровень теломеразы, как куриные клетки ЕВ 14. Утиные клетки ЕВ 66 также экспрессируют высокий уровень теломеразы (данные не представлены). Фиг. 6 А и 6 В: Утиные клетки ЕВх не проявляют эндогенной обратнотранскриптазной активности Фиг. 6 А: Экспрессию эндогенной обратной транскриптазы исследовали путем прямого F-PERT анализа (Lovatt et al., 1999, J. Virol. Methods, 82:185-200) в Clean Cells (Франция). Утиные клеточные линии ЕВх, ЕВ 26 и ЕВ 5-1 не проявляли эндогенной обратнотранскриптазной (RT) активности. Высокий уровень активности RT-активности был выявлен в куриных клеточных культурах ЕВ 14 и EBv13 (в различных пассажах), а также, в меньшей степени, в куриных эмбриональных фибробластах (CEF), полученных от породы кур, свободных от специфического патогена (SPF). СЕМ-клетки, которые являютсяRTaзa-негативными, использовали в качестве отрицательного контроля для определения предела обнаружения анализа. Фиг. 6 В: Наличие эндогенных ретровирусных частиц, репликативных (т.е. способных к репликации) или не репликативных, в клеточном культуральном супернатанте утиных и куриных ЕВх-клеток исследовали с помощью анализа ИФА, выявляющего основной капсидный антиген Р 27 вируса птичьего лейкоза. Утиные клеточные линии ЕВх, ЕВ 26 и ЕВ 5-1, а также куриные EBv13 не секретируют антигенALV P27. Напротив, куриные клетки ЕВ 14 экспрессируют антиген ALV P27. Фиг. 7 А и 7 В: Утиные ЕВх-клетки не секретируют репликативный вирус птичьего лейкоза (ALV) Анализ совместного культивирования утиных ЕВх-клеток с перепелиной клеточной линией QT6,которая, как известно, чувствительна к эндогенным и экзогенным ALV, выполняли в Bioreliance (Великобритания) для выявления присутствия эндогенных репликативных утиных вирусов. Фиг. 7 А: описывает принцип совместного культивирования QT6. Фиг. 7 В: Наличие репликативного вируса выявляют с помощью анализа ИФА, обнаруживающего основной капсидный антиген Р 27 вируса птичьего лейкоза. Анализ показывает, что никакие из тестируемых утиных клеток ЕВх (dEB26 и dEB51) не серетируют репликативный ALV. В качестве положительного контроля использовали вирус RAV-1, который,- 24021064 как известно, реплицируется в QT6. Фиг 8. Экспрессия рецепторов клеточной поверхности SA2-3 и SA2-6 утиными ЕВх и куриными ЕВ 14 клеточными линиями. Клетки инкубировали с лектином, меченым дигоксигенином: лектин Sambuca nigra agglutinin специфически связывается с Sia2-6Gal, в то время как лектин Maackia amurensis agglutinin специфически связывается с Sia2-3Gal. Лектины, которые прикрепляются к клеткам, выявляют с помощью антител против дигоксигенина, меченных FITC в соответствии с метидиками, хорошо известными специалисту в данной области. FITC-меченые клетки считают способом FACS (флуоресцентной сортировки клеток,fluorescent cell sorter). Молекулы SA2-3 и SA2-6 были описаны как рецепторы для вирусов птичьего и человеческого гриппа, соответственно. Почти все утиные ЕВх-клетки высоко экспрессировали рецепторы клеточной поверхности SA2-3 и SA2-6. Фиг. 9 А и 9 В: Размножение вируса MVA-GFP в инфицированных утиных ЕВх-клетках Фиг. 9 А: Утиным ЕВх давали формировать небольшие сгустки во встряхиваемых колбах Т 175 во время клеточной пролиферации в клеточной ростовой среде SFM. Затем сгустки инфицировали вирусомMVA-GFP в дозе 10-2 TCID50/клетка и смесь разбавляли средами для продукции SFM. В течение 6 дней периода вирусного размножения при 37 С инфицированные клетки ежедневно фотографировали в УФсвете. Пик MVA-инфекции был достигнут на 4-й день после инфицирования (pi, post-infection). На 6 деньpi инфицированные клетки начинали умирать. Фиг. 9 В: Титрование вируса MVA-GFP, размножившегося в утиных клетках ЕВх в 3-л биореакторе для полунепрерывного способа (слева). Полученной из ЕВх биомассе давали накопиться во время фазы пролиферации клеток в ростовой среде Excell (SAFC). На 4 день плотность клеток достигала 4 млн клеток/мл. Затем клетки инфицировали вирусом MVA-GFP в дозе 10-1 TCID50/клетка и смесь разводили в 1,5 л среды Excell. В течение 6 дней периода вирусного размножения при 37 С ежедневно брали пробы на день и в конце проводили титрование TCID50 (справа). На 4 день p.i. был достигнут выход 8,5 logTCID50/мл, соответствующий выходу 205 TCID50/клетка. Фиг. 10: Влияние концентрации кальция и магния в среде SFM на размер сгустков клеток ЕВх Фиг. 10 А: Куриные клетки EBv13 вначале культивировали в среде SFM от SAFC Biosciences, которая содержит высокие концентрации ионов кальция (Са 2+) (примерно 0,79 мМ) и магния (Mg2+); в этой среде клетки образовывали крупные агрегаты в культуре. Через три дня после того, как клеточную культуральную среду заменяли на такую же SFM-среду,которая содержала более низкую концентрацию ионов Са 2+ (конечная 0,03 мМ) и Mg2+ (конечная 1,6 мМ), клетки начинали формировать меньшие агрегаты. Фиг. 10 В: Утиные клетки ЕВ 24, ЕВ 26 и ЕВ 66 вначале культивировали в среде SFM от SAFC Biosciences, которая содержит высокие концентрации ионов кальция (Са 2+) (примерно 0,79 мМ) и магния(Mg2+); и в этой среде клетки образовывали крупные агрегаты в культуре. Через три дня после того, как клеточную культуральную среду заменяли на такую же SFM-среду,которая содержала более низкую концентрацию ионов Са 2+ (конечная 0,03 мМ) и Mg2+ (конечная 1,6 мМ), клетки начинали формировать меньшие агрегаты. Фиг. 11 А и 11 В: Производство штаммов вируса гриппа А в утиных клетках ЕВх в 3-л биореакторах Биомассе утиных ЕВх давали накопиться при 37 С на этапе клеточной пролиферации в клеточной ростовой среде. Затем клетки инфицировали вирусом гриппа А/Н 1N1/Пекин/262/95 или А/Н 3N2/НьюЙорк/55/2004 в дозе 10-4 TCID50/клетка, смесь разводили в 1,5 л среды для продукции Excell, дополненной 0,75 USP/мл трипсина, и уменьшали температуру до 33C. В течение 14 дней периода размножения вируса ежедневно брали образцы и сохраняли их при температуре -80C. Фиг. 11 А: Кинетика роста утиных ЕВх-клеток, инфицированных штаммом вируса гриппаA/H1N1/Пекин/262/95 Слева: Клеточная плотность (ромб, 106 клеток/мл) и вирусный титр в logTCID50/мл. Справа: Общее количество клеток (квадрат), жизнеспособность (черные круги, %) и концентрация гемагглютинина в мкг/мл (красные круги, %). Вирусный выход составил 20 мкг гемагглютинина на 1 мл культурального супернатанта. Фиг. 11 В: Кинетика роста утиных ЕВх-клеток, инфицированных штаммом вируса гриппа А/Н 3N2/Нью-Йорк/55/2004 Слева: Клеточная плотность (ромб, 106 клеток/мл) Справа: Общее количество клеток (квадрат), жизнеспособность (черные круги, %) и концентрация гемагглютинина в мкг/мл (красные круги, %). Вирусный выход составил 30 мкг гемагглютинина на 1 мл культурального супернатанта. Фиг. 12: Производство вируса гриппа штамма В в утиных клетках ЕВх Биомассе утиных ЕВх дали накопиться при 37 С на этапе клеточной пролиферации в клеточной ростовой среде. Затем клетки инфицировали вирусом гриппа В/Жиангсу/10/2003 в дозе 10-3TCID50/клетка, смесь разводили в 1,5 л среды для продукции Excell, дополненной 0,75 USP/мл трипсина,и уменьшали температуру до 33C. В течение 14 дней периода размножения вируса ежедневно брали- 25021064 образцы и сохраняли их при температуре -80 С. Слева: Клеточная плотность (ромб, 106 клеток/мл) Справа: Общее количество клеток (квадрат), жизнеспособность (черные круги, %) и концентрация гемагглютинина в мкг/мл (красные круги, %). Вирусный выход составил 25 мкг гемагглютинина на 1 мл культурального супернатанта. Фиг. 13: Анализ производительности NDV и экспрессии вирусного белка в суспензии утиных клеток ЕВ 66 (MOI 10-3, 0,75 USP/мл трипсина) Утиные и куриные клетки ЕВх чувствительны к штамму NDV LaSota и реплицируют его. Титры (вTCID50/мл) NDV, продуцированного утиными клетками ЕВ 66, увеличивались с 0 до 2 дня pi до достижения в среднем 106,83TCID50/мл (фиг. 13, слева). Анализ вестерн-блоттинг (фиг. 13, справа) показал экспрессию вирусных белков NDV (HN, Fo/F,NP и М). Состав вирусных белков вируса NDV, производимого утиными клетками ЕВ 66, аналогичен составу, полученному из вируса NDV, производимого в куриных клетках ЕВ 14. Кроме того, кинетика высвобождения вирусов, производимых в куриных и утиных ЕВх-клеткиах, схожа. Фиг. 14: Анализ репликации рекомбинантного вируса кори в суспензии утиных клеток ЕВ 66 (MOI 10-1 или 10-2) в колбах для тканевых культур в бессывороточной среде Утиные клетки ЕВ 66 по меньшей мере столь же чувствительны к инфицированию вирусом кори,как и VERO-клетки. Титры (в TCID50/мл) рекомбинантного вируса кори, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP), производимый утиными клетками ЕВ 66, достигали 107 TCID50/мл на 6 день после инфицирования. Фиг. 15 А и 15 В: Экспрессия SSEA-1, ЕМА-1 и теломеразы в утиных клетках ЕВ 66 Экспрессию теломеразы в различных пассажах утиных ЕВ 66, культивированных во вращающихся колбах, исследовали с помощью набора для набора для обнаружения теломеразы от Roche (TelomeraseOCR ELISA). SSEA-1 и ЕМА-1 в различных пассажах утиных ЕВ 66, культивированных во вращающихся колбах, исследовали путем анализа FACS. Фиг. 15A: Было обнаружено, что теломераза высоко экспрессируется в суспензионной утиной клеточной линии ЕВ 66 в различных пассажах (138, 144, 147, 150, 154). Фиг. 15 В: Было обнаружено, что маркеры клеточной поверхности SSEA-1 и ЕМА-1 высоко экспрессируются в суспензионной утиной клеточной линии ЕВ 66 в различных пассажах (138, 144, 147, 150,154). Фиг. 16: Анализ кариотипа утиных клеток ЕВ 66 Кариотип утиных клеток ЕВ 66 проводил Pr. Franck, ENVL, Лион. ЕВ 66 клетки являются диплоидными клетками. Примеры Пример 1: куриная клеточная линия EBv13 от куриц SPF породы Valo 1.1 - Сырье Яйца Свободная от специфического патогена (SPF, Specific Pathogene Free) порода, называемая Valo. Порода Valo является породой белых кур Ливорно, производимой и поставляемой Lohman из Германии. Такие SPF-куриные яйца, снабженные сертификатом анализа, проверяли на: CAV, птичьи аденовирусы(группа 1, серотипы 1-12 и группа 3), EDS, вирус птичьего энцефаломиелита, вирусы птичьего лейкоза/RSV (в том числе серотип ALV-J), вирус птичьего нефрита, птичьи реовирусы, вирус куриной оспы, вирус инфекционного бронхита, вирус инфекционного бурсита (IBDV), вирус инфекционного ларинготрахеита, вирус гриппа типа А, вирус болезни Марека, микоплазмоз (Mg + Ms), Mycobacterium avium, вирус болезни Ньюкасла, вирус ретикулоэндотелиоза, Salmonella pullorum, другие сальмонеллезные инфекции, вирус птичьего ринотрахеита (ART), Hemophilus paragallinarum. Куриные яйца Valo подвергали только дезинфекции с деконтаминацией, чтобы избежать любого риска контаминации в связи с обращением с яйцами во время транспортировки. Фидерные клетки На первом этапе способа создания EBv13, клетки мышиного происхождения (STO-клетки) использовали в качестве фидерного слоя для поддержания плюрипотентности куриных стволовых клеток. Эти фидерные клетки митотически инактивировали путем гамма-облучения (от 45 до 55 Грей) перед посевом на пластик. Эта доза облучения является сублетальной дозой, вызывающей окончательное прекращение клеточного цикла, но все же позволяющей продуцировать факторы роста и внеклеточный матрикс, необходимые для ускорения клеточного роста недифференцированных клеток. Клеточная линия STO была получена A. Bernstein, Институт рака в Онтарио, Торонто, Канада из непрерывной линии мышиных эмбриональных фибробластов SIM (нелинейных мышей Sandos) и доставлена из Американской коллекции типовых культур (АТСС) (номер STO: CRL-1503, номер партии 1198713). Свежие фидерные слои готовили два раза в неделю, обычно в понедельник и четверг. Экспоненциально клетки делили на две части и подсчитывали. Часть клеток сеяли для сохранения жизнеспособных культур, а другую часть облучали. Для облучения мы готовили клеточную суспензию с 10106- 26021064 клеток/мл в пробирках. Клетки подвергали облучению от 45 до 55 Грей и сеяли на пластик. После посева чашки и платы, покрытые инактивированными фидерными клетками, использовали в течение максимум 5 дней. СредыDMEM- HamF12 (Cambrex, каталоговый номер ВЕ 04-687) Среда Optipro (Invitrogen, каталоговый номер 12309)EX-CELL 65195, 60947 и 65319 (SAFC, заказная среда) Добавки Глутамин (Cambrex, каталоговый номер ВЕ 17-605 Е) Пенициллин/стрептомицин (Cambrex, каталоговый номер ВЕ 17-602 Е Заменимые аминокислоты (Cambrex, каталоговый номер ВЕ 13-114 Е) Пируват натрия (Cambrex, каталоговый номерВЕ 13-115) Витамины (Cambrex, каталоговый номер 13-607 С) Бета-меркаптоэтанол (Sigma, каталоговый номер М 7522) Буферы и фиксаторыKCl 5,6% (Sigma, каталоговый номер Р 9333) Метанол/уксусная кислота (3/1): Метанол (Merck, каталоговый номер K34497209 Уксусная кислота (Sigma каталоговый номерА 6283) Колцемид, Karyomax (Gibco, каталоговый номер 15212-046) Криопротективный агент Диметилсульфоксид (DMSO) (Sigma, каталоговый номер D2650) Факторы Было использовано два различных рекомбинантных фактора: рекомбинантный человеческий нейротрофический фактор (CNTF) (Peprotech Inc, каталоговый номер 450-13) рекомбинантный человеческий инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) (Peprotech Inc, каталоговый номер 100-11) Эти два фактора были произведены в бактериях Е. Coli. Фетальная бычья сыворотка Необлученная фетальная бычья сыворотка (FBS) (JRH, каталоговый номер 12103) Необлученную сыворотку, используемую в программе, собирали и производили в США. В МСХ животных, используемых для сбора, проверяли и подтверждали их приемлемость для убоя. Сыворотку добавляли в среду в ходе культивирования птичьих стволовых клеток. Эту партию не подвергали облучению, чтобы избежать разрушения необходимых белков или компонентов, определенных как необходимые, для поддержания стволовых клеток в культуре. Облученная сыворотка (JRH, каталоговый номер 12107) Облученную партию, используемую в этой программе, также собирали в США. Эту облученную партию вносили в качестве добавки в средуDMEM, используемую для культивирования клеток STO или FED (фидерных клеток). Эти клетки как стволовые не требуют специфического качества сыворотки для роста и поддержания в культуре. Чтобы свести к минимуму высокую концентрацию сыворотки в среде, мы адаптировали STO-клетки для роста в присутствии только 4% FBS. Диссоциирующие агенты: Проназа (Roche, каталоговый номер 165921) Проназа является рекомбинантной протеазой фирмы Roche Diagnostics, Германия, использующейся для диссоциации прикрепленных птичьих стволовых клеток. Трипсин-ЭДТА (Cambrex, каталоговый номер ВЕ 17-161 Е) Трипсин используется для диссоциации клеток STO или FED и в последних пассажах для диссоциации птичьих клеток, адаптированных к бессывороточной среде. Этот фермент свиного происхождения производят асептично в соответствии с рекомендованными условиями cGMF ("соответствующей практики производства лекарств") с помощью утвержденного способа стерильной фильтрации и тестируют в соответствии с текущим Е.Р. Сырьевой материал, облученный до сборки состава, тестируют на свином парвовирусе в строгом соответствии с 9/CFR 113.53. Раствор для неферментной клеточной диссоциации (Sigma, каталоговый номер С 5914) Этот агент диссоциации представляет собой готовый к использованию состав для осторожного отделения клеток от поверхности роста культурального сосуда. Формула не содержит белков и позволяет удалять клетки без применения ферментов. Клеточные белки сохраняются, делая возможными иммунохимические исследования, которые зависят от распознавания белков клеточной поверхности. Этот фермент используется для отсоединения клетки перед FACS-анализом биологических маркеров, таких как ЕМА-1 (эпителиальный мембранный антиген 1) и SSEA1 (стадиеспецифичный эмбриональный антиген 1).- 27021064 1.2 - Способ создания клеточной линии EBv13 Яйца вскрывали, желток отделяли от белка при вскрытии. Эмбрионы извлекали из желтка либо непосредственно, либо с помощью пипетки Пастера, либо с помощью небольшой абсорбирующей фильтровальной бумаги (бумага Ватман 3 М), предварительно вырезанной в форме перфорированного кольца с помощью перфоратора. Диаметр перфорации составлял около 5 мм. Эти небольшие кольца стерилизовали сухим теплом в течение примерно 30 мин в термошкафу. Такое небольшое бумажное кольцо располагали на поверхности желтка и центрировали над эмбрионом, который, таким образом, был окружен бумажным кольцом. Эбрион затем вырезали с помощью маленьких ножниц и, целиком удаленный, помещали в чашку Петри, наполненную PBS или с физиологическим раствором. Эмбрион, извлеченный таким образом с помощью кольца и очищенный от избыточного желтка в среде и эмбрионального диска,таким образом свободный от избыточного вителлина, собирали пипеткой Пастера. Куриные эмбрионы Valo помещали в пробирку, содержащую физиологическую среду (1 Х PBS,Трис, глюкоза, среда и т.д.). Затем эмбрионы Valo механически диссоциировали и инокулировали в фидерный слой STO-клеток в полной культуральной среде при 39 С. Фидерные клетки сеяли в сосуде с плотностью примерно 2,7104 клеток/см 2. Полная культурная среда состоит из основной коммерческой среды DMEM-Ham F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки с IGF1 и CNTF в конечной концентрации 1 нг/мл, с 1% заменимых аминокислот, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, пируватом натрия в конечной концентрации 1 мМ, бета-меркаптоэтанолом в конечной концентрации 0,2 мМ, глутамином в конечной концентрации 2,9 мМ, с исходной смесью антибиотиков, содержащей пенициллин в конечной концентрации 100 U/мл и стрептомицин в конечной концентрации 100 мкг/мл. Вскоре после первого пассажа клеток смесь антибиотиков уже не добавляли к среде. Выражение"вскоре" обычно подразумевает через первые 3-5 пассажей. Когда птичьи клетки ES из куриных эмбрионов Valo переносили из одной культуральной чашки в другую, посев культуры в чашку проводили с плотностью примерно от 7104/см 2 до 8104/см 2 птичьихES-клеток в полной культуральной среде. Предпочтительно посев производили с плотностью примерно 7,3104/см 2 (4106 клеток/55 см 2 или 4106 мм клеток/100 мм чашка). Птичьи клетки, предпочтительно птичьи эмбриональные клетки этапа а), культивировали в течение нескольких пассажей в полной среде. При пассаже 15 из полной среды удаляли факторы роста IGF1 и CNTF. Удаление производили непосредственно в течение одного этапа при переходе от одного пассажа к другому. Эмбриональные стволовые клетки, предпочтительно птичьи эмбриональные клетки, культивировали в течение нескольких пассажей в полной среде без факторов роста IGF1 и CNTF. Затем после удаления факторов роста IGF1 и CNTF, удаляли фидерные клетки путем постепенного уменьшения концентрации фидерных клеток в течение нескольких пассажей. Практически одинаковую концентрацию фидерных клеток использовали в пассажах с 2 по 4, затем снижали концентрацию фидерных клеток в течение дополнительных 2-4 пассажей, и так далее. Сосуды первоначально засеивали с плотностью около 2,7104 фидерных клеток/см 2, затем около 2,2104 фидерных клеток/см 2, затем около 1,8104 фидерных клеток/см 2, затем около 1,4104 фидерных клеток/см 2, затем около 1,1104 фидерных клеток/см 2, затем около 0,9104 фидерных клеток/см 2, затем около 0,5104 фидерных клеток/см 2. Затем засеивали сосуды с плотностью от 6,5104 птичьих клеток/см 2 до 7,5104 птичьих клеток/см 2 и без фидерных клеток. Удаление фидерных клеток начинали в районе 21 пассажа и заканчивали в районе 65 пассажа. В ходе удаления фидерных клеток куриные Valo ES-клетки сеяли в культивационный сосуд в более низкой концентрации, чем в этапе а), примерно от 4104 клеток/см 2 до 5104 клеток/см 2. Предположив, что Valo ES-клетки не были в хорошей форме после снижения концентрации фидерных клеток в сосуде, птичьи клетки культивировали в течение дополнительных пассажей с такой же концентрацией фидерных клеток, прежде чем продолжать удаление фидерных клеток. Удаление сыворотки проводили после удаления факторов роста и фидерных клеток. В начале удаления сыворотки культуральная среда содержала основную коммерческую среду DMEM HamF12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% заменимых аминокислот, 1% смеси витаминов из коммерческого источника, натрия пируват в конечной концентрации 1 мМ, бета-меркаптоэтанола в конечной концентрации 0,2 мМ, глутамина в конечной концентрации 2,9 мМ. Куриные клетки Valo адаптировали к росту в бессывороточной среде в два этапа: сначала куриные клетки Valo быстро адаптировали к культуральной среде, состоящей из коммерческой бессывороточной среды (SFM), предпочтительноExcell 60947 (SAFC Biosciences) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% заменимых аминокислот, 1% смеси витаминов из коммерческого источника, пирувата натрия в конечной концентрации 1 мМ, бета-меркаптоэтанола в конечной концентрации 0,2 мМ, глутамина в конечной концентрации 2,9 мМ. Когда была проведена эта быстрая адаптация к новой среде (от DMEM-HamF12 к Excell 60947), был начат второй этап, состоящий из медленной адаптации к уменьшению концентрации животной сыворотки в среде SFM. Удаление сыворотки выполняли путем постепенного уменьшения, начиная с 10% сыворотки, затем 7,5%, затем 5%, затем 2,5%, затем 1,25%, затем 0,75% от концентрации сыворотки в культуральной клеточной среде SFM, до достижения в конце концов 0% сыворотки в культуральной клеточной среде SFM. Удаление сыворотки начинали в пассаже 103 и заканчивали в пассаже 135.- 28021064 В конце способа удаления сыворотки, когда оставшаяся концентрация сыворотки в среде SFM составляла 0,75 или 0%, начинали адаптацию субстрат-зависимых EBv13-клеток к суспензионному культивированию. Среди нескольких осуществленных попыток изолировать субстрат-независимые EBv13 изоляты, 62,5% попыток были успешными и позволили получить различные изоляты суспендированных клеток EBv13. Один изолят клеток EBv13 был выбран в соответствии со временем удвоения популяции(около 18 ч), оптимальной концентрацией клеток в культуральном сосуде (около 4 млн клеток/мл), жизнеспособностью клеток, однородностью клеточной культуры (наличием и размером клеточных сгустков) и легкостью манипулирования клетками (фиг. 1). В конце удаления сыворотки субстрат-зависимые куриные клетки Valo, названные EBv13, были способны расти в отсутствие факторов роста, в отсутствие фидерных клеток, в бессывороточной среде.EBv13-клетки затем адаптировали к росту при 37 С путем постепенного снижения температуры культивирования клеток на 0,5 С в день. Пример 2. Куриная клеточная линия ЕВ линии 0 от SPF-куриной породы ELL-0 2.1 - Сырье Яйца Свободная от специфического патогена (SPF) куриная порода, называемая ELL-0 (East Lansing Line 0), была предоставлена Лабораторией птичьих заболеваний и онкологии (USDA-ARS-MWA, США). ЭтиSPF-куриные яйца были получены от стаи, тщательно проверенной на различные патогены птиц. Протестированные заболевания включали Salmonella pullorum, Salmonella gallinarum, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, вирус птичьего лейкоза A-D и J, вирус болезни Марека, вирус ретикулоэндотелиоза, птичий аденовирус, вирус инфекционного бронхита, вирус инфекционного бурсита, вирус птичьего гриппа, вирус болезни Ньюкасла, вирус птичьего энцефаломиелита и птичий реовирус. Куриные яйца линии 0 подвергли только дезинфекции с деконтаминацией, чтобы избежать любого риска контаминации в связи с обращением с яйцами во время транспортировки. Фидерные клетки На первом этапе способа создания ЕВ линии 0 клетки мышиного происхождения (STO-клетки) использовали в качестве фидерного слоя для поддержания плюрипотентности куриных стволовых клеток. Эти фидерные клетки митотически инактивировали путем гамма-облучения (от 45 до 55 Грей) перед посевом на пластик. Эта доза облучения является сублетальной дозой, вызывающей окончательное прекращение клеточного цикла, но все же позволяющей продуцировать факторы роста и внеклеточный матрикс, необходимые для ускорения клеточного роста недифференцированных клеток. Клеточная линия STO была получена A. Bernstein, Институт рака в Онтарио, Торонто, Канада из мышиных эмбриональных фибробластов непрерывной линии SIM (нелинейных мышей Sandos) и доставлена из Американской коллекции типовых культур (АТСС) (номер STO: CRL-1503, номер партии 1198713). Свежие фидерные слои готовили два раза в неделю, обычно в понедельник и четверг. Экспоненциально клетки делили на две части и подсчитывали. Часть клеток сеяли для сохранения жизнеспособных культур, а другую часть облучали. Для облучения мы готовили клеточную суспензию с 10106 клеток/мл в пробирках. Клетки подвергали облучению от 45 до 55 грей и сеяли на пластик. После посева чашки и платы, покрытые инактивированными фидерными клетками, использовали в течение максимум 5 дней. СредыDMEM- HamF12 (Cambrex, каталоговый номер ВЕ 04-687) Среда GTM-3 (Sigma, каталоговый номер G9916) Среда EX-CELL 66522, 65788 и 66444 (SAFC, заказная среда) Добавки Глутамин (Cambrex, каталоговый номер ВЕ 17-605 Е) Пенициллин/стрептомицин (Cambrex, каталоговый номер ВЕ 17-602 Е Заменимые аминокислоты (Cambrex, каталоговый номер ВЕ 13-114 Е) Пируват натрия (Cambrex, каталоговый номер ВЕ 13-115) Витамины (Cambrex, каталоговый номер 13-607 С) Бета-меркаптоэтанол (Sigma, каталоговый номер М 7522) Дрожжевой гидролизат (SAFC, каталоговый номер 58902 С) Буферы и фиксаторыPBS 1X (Cambrex, каталоговый номер BE17-516F) Криопротективный агент Диметилсульфоксид (DMSO) (Sigma, каталоговый номер D2650) Факторы Было использовано шесть различных рекомбинантных факторов: рекомбинантный человеческий цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) (Peprotech Inc, каталоговый номер 450-13),рекомбинантный человеческий инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) (Peprotech Inc, каталого- 29