Гидролазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения
Номер патента: 20145
Опубликовано: 30.09.2014
Авторы: Клайн Кэти А., Миллер Марк Л., Буэно Аналиа, Хитчмэн Тим, Куэнка Джослин, Дейтон Кристофер Л.Г., Лайон Джонатан, Уолл Марк А., Бартон Нельсон Р.
Формула / Реферат
1. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, включающая:
(а) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид, где нуклеиновая кислота включает последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности с нуклеиновой кислотой SEQ ID NO:1,
имеющая по меньшей мере одну замену нуклеотида (или эквивалент), кодирующую аминокислотную замену V163R (или ее эквивалент),
где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, или кодирует полипептид или пептид, способные генерировать образование антитела, специфичного к гидролазе (полипептид или пептид, которые действуют в качестве эпитопа или иммуногена);
(b) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (а), где идентичности последовательностей определены (А) путем анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуального обследования или (В) на протяжении области по меньшей мере из приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 или более остатков или полной длины кДНК, транскрипта (мРНК) или гена;
(c) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (а) или (b), где алгоритмом сравнения последовательностей является алгоритм BLAST версии 2.2.2, где фильтрация устанавливается как blastall -p blastp -d "nr pataa" -FF и все другие опции устанавливаются по умолчанию;
(d) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид или пептид, обладающие гидролазной активностью, где нуклеиновая кислота включает последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементом нуклеиновой кислоты из (а), (b) или (с), где жесткие условия включают стадию промывки, включающую промывку в 0,2Х SSC при температуре приблизительно 65°С в течение приблизительно 15 мин;
(e) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной, активностью, где полипептид включает последовательность SEQ ID NO:2 или ее ферментативно активные фрагменты, имеющие, по меньшей мере, аминокислотную замену V163R (или ее эквивалент);
(f) (А) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из (а)-(е), кодирующую полипептид, содержащий по меньшей мере одну консервативную замену аминокислоты и сохраняющий свою гидролазную активность, или (В) нуклеиновую кислоту по (f) (А), где по меньшей мере одна консервативная замена аминокислоты включает замену аминокислоты другой аминокислотой со сходными характеристиками или консервативная замена включает замену алифатической аминокислоты другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином и наоборот; замену кислого остатка другим кислым остатком; замену остатка, несущего амидную группу, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка другим основным остатком или замену ароматического остатка другим ароматическим остатком;
(g) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из (a)-(f), кодирующую полипептид, обладающий гидролазной активностью, но не имеющий сигнальной последовательности;
(h) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из (a)-(g), кодирующую полипептид, обладающий гидролазной активностью, дополнительно включающий гетерологичную последовательность;
(i) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (h), где гетерологичная последовательность включает последовательность, кодирующую (А) гетерологичную сигнальную последовательность, (В) последовательность по (А), где гетерологичная сигнальная последовательность происходит от гетерологичного фермента, или (С) метку, эпитоп, направляющий пептид, расщепляемую последовательность, определяемую часть или фермент, или состоит из нее; или
(j) последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида), полностью (целиком) комплементарную последовательности по любому из (a)-(j).
2. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, где гидролазная активность включает липазную активность, сатуразную, стеаратазную или пальмитазную активность,
где, необязательно, сатуразная активность включает избирательный гидролиз по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% сложных эфиров насыщенных жирных кислот, где, необязательно, гидролизуемые сложные эфиры могут представлять собой сложные эфиры насыщенных жирных кислот и глицерина, умбеллиферола или других спиртов,
где, необязательно, пальмитазная активность включает избирательный гидролиз жирных кислот, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой пальмитиновую кислоту, или
где, необязательно, стеаратазная активность включает избирательный гидролиз жирных кислот, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой стеариновую кислоту.
3. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, где гидролазная активность включает:
(a) гидролиз триацилглицерина до диацилглицерина и свободной жирной кислоты, или гидролиз триацилглицерина до моноацилглицерина и свободных жирных кислот, или гидролиз диацилглицерина до моноацилглицерина и свободных жирных кислот, или гидролиз моноацилглицерина до свободной жирной кислоты и глицерина, или гидролиз триацилглицерина (TAG), диацилглицерина (DAG) или моноацилглицерина (MAG);
(b) синтез триацилглицерина из диацилглицерина или моноацилглицерина и свободных жирных кислот;
(c) синтез 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерина (POP), 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерина (SOS), 1-пальмитоил-2-олеоил-3-стеароилглицерина (POS) или 1-олеоил-2,3-димиристоилглицерина (ОММ), длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот, арахидоновой кислоты, докозагексаеновой кислоты (DHA) или эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА);
(d) гидролазную активность, которая специфична в отношении положения триацилглицерина (TAG), диацилглицерина (DAG) или моноацилглицерина (MAG), где, необязательно, гидролазная активность является Sn2-специфичной, Sn1- или Sn3-специфичной;
(e) гидролазную активность, которая специфична в отношении жирной кислоты, где, необязательно, жирная кислота представляет собой пальмитиновую, стеариновую или другую насыщенную жирную кислоту;
(f) модификацию масел путем гидролиза, алкоголиза, этерификации, трансэтерификации или переэтерификации;
(g) гидролазную активность, которая является региоспецифичной или химиоселективной, где, необязательно, гидролазная активность включает синтез энантиомерно чистых хиральных продуктов; или
(h) синтез умбеллифериловых сложных эфиров жирных кислот (ЖК).
4. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, где гидролазная активность является термостабильной, где, необязательно, полипептид сохраняет липазную активность в условиях, включающих диапазон температуры от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно
-80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более.
5. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, где гидролазная активность является термоустойчивой, где, необязательно, полипептид сохраняет гидролазную активность после экспозиции при температуре в диапазоне от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более.
6. Экспрессионная кассета, вектор или носитель для клонирования, включающие нуклеиновую кислоту, включающую последовательность по п.1, где, необязательно, носитель для клонирования включает вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагмиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому, где, необязательно, вирусный вектор включает аденовирусный вектор, ретровирусный вектор или ассоциированный с аденовирусом вирусный вектор, и, необязательно, носитель для клонирования включает бактериальную искусственную хромосому (ВАС), плазмиду, вектор, происходящий из бактериофага Р1 (РАС), искусственную хромосому дрожжей (YAC) или искусственную хромосому млекопитающих (MAC).
7. Трансформированная клетка, включающая нуклеиновую кислоту, включающую последовательность по п.1, или экспрессионная кассета, вектор или носитель для клонирования по п.6, где, необязательно, клетка представляет собой бактериальную клетку, клетку млекопитающего, клетку гриба, клетку дрожжей, клетку насекомого или клетку растения.
8. Трансгенное животное, отличное от человека, включающее последовательность по п.1, где, необязательно, животное представляет собой мышь.
9. Трансгенное растение, включающее последовательность по п.1, где, необязательно, растение представляет собой растение кукурузы, растение сорго, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, растение масличной культуры, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя, траву или растение табака.
10. Трансгенное семя, включающее последовательность по п.1, где, необязательно, семя представляет собой рис, семя кукурузы, зерно пшеницы, семя масличной культуры, семя рапса, семя сои, зерно пальмы, семя подсолнечника, семя кунжута, рис, ячмень, арахис или семя растения табака.
11. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид, включающий:
(а) последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% (полной) идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 или ее ферментативно активными фрагментами и содержащую, по меньшей мере, аминокислотную замену V163R (или ее эквивалент), или где полипептид или пептид обладают гидролазной активностью или полипептид или пептид способны генерировать образование антитела, специфичного в отношении гидролазы (полипептид или пептид, которые действуют в качестве эпитопа или иммуногена);
(b) последовательность полипептида или пептида по (а), где идентичности последовательностей определены (А) путем анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуального обследования или (В) на протяжении области по меньшей мере из приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 или более аминокислотных остатков либо на протяжении полной длины полипептида или пептида либо фермента и/или их ферментативно активных подпоследовательностей (фрагментов);
(c) последовательность полипептида или пептида по (b), где алгоритмом сравнения последовательностей является алгоритм BLAST версии 2.2.2, где фильтрация устанавливается как blastall -p blastp -d "nr pataa" -FF и все другие опции устанавливаются по умолчанию;
(d) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид обладает (i) гидролазной активностью или (ii) иммуногенной активностью в том плане, что он способен генерировать образование антитела, которое специфически связывается с полипептидом, обладающим последовательностью по (а) и/или его ферментативно активными подпоследовательностями (фрагментами);
(e) аминокислотную последовательность по любому из (a)-(d), включающую по меньшей мере одну консервативную замену аминокислотного остатка и где полипептид или пептид сохраняют гидролазную активность;
(f) аминокислотную последовательность по (е), где консервативная замена включает замену алифатической аминокислоты другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином и наоборот; замену кислого остатка другим кислым остатком; замену остатка, несущего амидную группу, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка другим основным остатком или замену ароматического остатка другим ароматическим остатком или их сочетание;
(g) аминокислотную последовательность по (f), где алифатический остаток включает аланин, валин, лейцин, изолейцин или их синтетический эквивалент; кислый остаток включает аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или их синтетический эквивалент; остаток, включающий амидную группу, включает аспарагин, глутамин или их синтетический эквивалент; основной остаток включает лизин, аргинин, гистидин или их синтетический эквивалент или ароматический остаток включает фенилаланин, тирозин, триптофан или их синтетический эквивалент;
(h) последовательность полипептида по любому из (a)-(f), обладающего гидролазной активностью, но лишенного сигнальной последовательности;
(i) последовательность полипептида по любому из (a)-(h), обладающего гидролазной активностью и дополнительно включающего гетерологичную последовательность;
(j) последовательность полипептида по (i), где гетерологичная последовательность включает (А) гетерологичную сигнальную последовательность, (В) последовательность по (А), где гетерологичная сигнальная последовательность происходит от гетерологичного фермента, и/или (С) метку, эпитоп, направляющий пептид, расщепляемую последовательность, обнаруживаемую часть или фермент, или состоит из нее; или
(m) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1.
12. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность включает липазную активность, сатуразную, стеаратазную или пальмитазную активность, где, необязательно, сатуразная активность включает избирательный гидролиз по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% сложных эфиров насыщенных жирных кислот, где, необязательно, гидролизуемые сложные эфиры могут представлять собой сложные эфиры насыщенных жирных кислот и глицерина, умбеллиферола или других спиртов, где, необязательно, пальмитазная активность включает избирательный гидролиз жирных кислот, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой пальмитиновую кислоту, или где, необязательно, стеаратазная активность включает избирательный гидролиз жирных кислот, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой стеариновую кислоту.
13. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность включает:
(a) гидролиз триацилглицерина до диацилглицерина и свободной жирной кислоты, или гидролиз триацилглицерина до моноацилглицерина и свободных жирных кислот, или гидролиз диацилглицерина до моноацилглицерина и свободных жирных кислот, или гидролиз моноацилглицерина до свободной жирной кислоты и глицерина, или гидролиз триацилглицерина (TAG), диацилглицерина (DAG) или моноацилглицерина (MAG);
(b) синтез триацилглицерина из диацилглицерина или моноацилглицерина и свободных жирных кислот;
(c) синтез 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерина (POP), 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерина (SOS),
1-пальмитоил-2-олеоил-3-стеароилглицерина (POS) или 1-олеоил-2,3-димиристоилглицерина (ОММ), длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот, арахидоновой кислоты, докозагексаеновой кислоты (DHA) или эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА);
(d) гидролазную активность, которая специфична для положений триацилглицерина (TAG), диацилглицерина (DAG) или моноацилглицерина (MAG), где, необязательно, гидролазная активность является Sn-специфичной, Sn1- или Sn3-специфичной;
(e) гидролазную активность, которая специфична для жирных кислот, где, необязательно, жирная кислота представляет собой пальмитиновую, стеариновую или другую насыщенную жирную кислоту;
(f) модификацию масел путем гидролиза, алкоголиза, этерификации, трансэтерификации или переэтерификации;
(g) гидролазную активность, которая является региоспецифичной или химиоселективной, где, необязательно, гидролазная активность включает синтез энантиомерно чистых хиральных продуктов; или
(h) синтез умбеллифериловых сложных эфиров жирных кислот (ЖК).
14. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность является термостабильной, где, необязательно, полипептид сохраняет гидролазную активность в условиях, включающих диапазон температуры от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно
-80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более.
15. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность является термоустойчивой, где, необязательно, полипептид сохраняет гидролазную активность после экспозиции при температуре в диапазоне от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более.
16. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность включает специфичную активность приблизительно при 37°С в диапазоне от приблизительно 100 до приблизительно 1000 ед/1 мг белка, от приблизительно 500 до приблизительно 750 ед/1 мг белка, от приблизительно 500 до приблизительно 1200 ед/1 мг белка или от приблизительно 750 до приблизительно 1000 ед/1 мг белка.
17. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где полипептид включает по меньшей мере один сайт гликозилирования, где, необязательно, гликозилирование может представлять собой N-связанное гликозилирование, и, необязательно, полипептид гликозилирован после экспрессии в
P. pastoris или S. pombe.
18. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где полипептид сохраняет гидролазную активность в условиях, включающих рН 3,0, приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или выше.
19. Препарат белка, включающий полипептид по п.11, где препарат белка включает жидкость, твердое вещество или гель.
20. Гетеродимер, включающий полипептид по п.11, и второй домен, где, необязательно, второй домен представляет собой полипептид и гетеродимер представляет собой слитый белок или второй домен представляет собой эпитоп или метку.
21. Гомодимер, включающий полипептид по п.11.
22. Иммобилизованный полипептид, где полипептид включает последовательность по п.11 или ее подпоследовательность, где, необязательно, полипептид иммобилизован на клетке, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитовой частице, шарике, геле, планшете, матрице или капиллярной трубке.
23. Матрица, включающая (i) иммобилизованный полипептид по п.11.
24. Выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело, которое специфически связывается с полипептидом по п.11, где, необязательно, антитело представляет собой моноклональное или поликлональное антитело.
25. Гибридома, включающая антитело, которое специфически связывается с полипептидом по п.11.
26. Пищевой продукт, корм, пищевая добавка, кормовая добавка, диетическая добавка или диетическая композиция, включающие полипептид по п.11 или его подпоследовательность, где, необязательно, полипептид гликозилирован.
27. Матрица для доставки пригодного в пищу фермента, включающая полипептид по п.11, где, необязательно, матрица для доставки включает гранулу и, необязательно, полипептид гликозилирован или полипептид обладает термоустойчивой или термостабильной гидролазной активностью.
28. Способ получения рекомбинантного полипептида, включающий стадии (а) обеспечения нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, где нуклеиновая кислота включает последовательность по п.1; и (b) экспрессии нуклеиновой кислоты со стадии (а) в условиях, которые обеспечивают экспрессию полипептида, с получением тем самым рекомбинантного полипептида, где, необязательно, способ дополнительно включает трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой со стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты со стадии (а), с получением тем самым рекомбинантного полипептида в трансформированной клетке.
29. Способ идентификации полипептида, обладающего гидролазной активностью, включающий следующие стадии:
(a) обеспечение полипептида по п.11,
(b) обеспечение субстрата гидролазы,
(c) приведение полипептида в контакт с субстратом со стадии (b) и определение снижения количества субстрата или роста количества продукта реакции, где снижение количества субстрата или рост количества продукта реакции указывает на полипептид, обладающий гидролазной активностью, где, необязательно, субстрат представляет собой жирную кислоту, триацилглицерин (TAG), диацилглицерин (DAG) или моноацилглицерин (MAG).
30. Способ повышения термоустойчивости или термостабильности гидролазного полипептида, причем способ включает гликозилирование гидролазного полипептида, где полипептид включает по меньшей мере тридцать последовательных аминокислот полипептида по п.11, чем повышается термоустойчивость или термостабильность гидролазного полипептида, где, необязательно, специфическая гидролазная активность является термостабильной или термоустойчивой при температуре в диапазоне выше чем от приблизительно -100 до приблизительно 115°С.
31. Композиция детергента, включающая полипептид по п.11, где полипептид включает гидролазную активность, где, необязательно, гидролаза представляет собой не поверхностно-активную гидролазу или поверхностно-активную гидролазу или, необязательно, гидролазу составляют в виде неводной жидкой композиции, литой твердой формы, гранулированной формы, в форме частиц, в форме прессованной таблетки, в форме геля, порошка, геля, гидрогеля, липосомы, аэрозоля, пасты или в форме суспензии.
32. Способ мытья объекта, включающий следующие стадии:
(a) обеспечение композиции, включающей полипептид, обладающий гидролазной активностью, где полипептид включает полипептид по п.11;
(b) обеспечение объекта;
(с) приведение полипептида со стадии (а) и объекта со стадии (b) в контакт в условиях, при которых композиция может мыть объект.
33. Способ стереоселективного гидролиза рацемических смесей сложных эфиров 2-замещенных кислот, включающий следующие стадии:
(a) обеспечение гидролазы по п.11, где гидролаза является стереоселективной;
(b) обеспечение композиции, включающей рацемическую смесь сложных эфиров 2-замещенных кислот; и
(c) приведение полипептида со стадии (а) в контакт с композицией со стадии (b) в условиях, при которых полипептид со стадии (b) может селективно гидролизовать сложные эфиры, где, необязательно, гидролаза иммобилизована и, необязательно, 2-замещенная кислота включает 2-арилоксизамещенную кислоту, R-2-(4-гидроксифенокси)пропионовую кислоту или 2-арилпропионовую кислоту, где, необязательно, 2-замещенная кислота включает кетопрофен.
34. Композиция, включающая гидролазу по п.11, вариант гидролазы по п.35 или фермент, полученный способом по п.37, где, необязательно, композиция представляет собой пищевой продукт, корм, пищевую добавку, кормовую добавку, диетическую добавку или диетическую композицию и где, необязательно, пищевой продукт, корм, пищевая добавка, кормовая добавка, диетическая добавка или диетическая композиция дополнительно включают питательную основу, включающую жир или жир и немного гидролазы или ее отсутствие, или, необязательно, гидролаза активируется солью желчной кислоты, или, необязательно, пищевой продукт, корм, пищевая добавка, кормовая добавка, диетическая добавка или диетическая композиция дополнительно включают состав для детей на основе коровьего молока, или, необязательно, гидролаза может гидролизовать длинноцепочечные жирные кислоты.
35. Способ получения варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с гидролазной активностью, включающий стадии:
(a) обеспечения матричной нуклеиновой кислоты по п.1 и
(b) модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов или их сочетания в матричную последовательность для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты,
где, необязательно, способ дополнительно включает экспрессию варианта нуклеиновой кислоты для получения варианта гидролазного полипептида,
и, необязательно, модификации, добавки или делеции вводятся с помощью метода, включающего подверженную ошибкам ПЦР, перетасовку, олигонуклеотид-специфический мутагенез, сборочную ПЦР, мутагенез со скрещиванием ПЦР, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, мутагенез с рекурсивной сборкой, мутагенез с экспоненциальной сборкой, сайт-специфический мутагенез, Gene Site Saturation MutagenesisSM (GSSMSM), повторную сборку с синтетическим лигированием (SLR или GeneReassembly) и их сочетание, или модификации, добавки или делеции вводятся с помощью метода, включающего рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, мутагенез модифицированной фосфотиоатом ДНК, мутагенез содержащей урацил матрицы, мутагенез дуплекса с пропуском, мутагенез с репарацией точечного несоответствия, мутагенез штамма хозяина с недостаточностью репарации, химический мутагенез, радиогенетический мутагенез, делеционный мутагенез, мутагенез с ограничением-селекцией, мутагенез с ограничением-очисткой, синтез искусственного гена, мутагенез со сборкой, создание мультимера гибридной нуклеиновой кислоты и их сочетание.
36. Способ по п.35, где способ итеративно повторяется до тех пор:
(a) (i) пока не получают гидролазу, обладающую измененной или отличной активностью или измененной или отличной стабильностью, отличных от полипептида, кодируемого матричной нуклеиновой кислотой, где, необязательно, вариант гидролазного полипептида является термоустойчивым и сохраняет некоторую активность после экспозиции при повышенной температуре, или, необязательно, вариант гидролазного полипептида обладает повышенным гликозилированием по сравнению с гидролазой, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой, или, необязательно, вариант гидролазного полипептида обладает гидролазной активностью при высокой температуре, где гидролаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, не активна при высокой температуре;
(ii) пока не получают кодирующую последовательность гидролазы, характеризуемую использованием кодона, измененного по сравнению с матричной нуклеиновой кислотой, где, необязательно, способ итеративно повторяется до тех пор, пока не получают ген гидролазы, имеющий более высокий или более низкий уровень экспрессии или стабильности мРНК по сравнению с матричной нуклеиновой кислотой; или
(iii) пока не получают гидролазу, обладающую измененной субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, где, необязательно, субстратная специфичность или субстратная предпочтительность варианта гидролазы включает предпочтительный или усиленный гидролиз пальмитиновой кислоты из масла, или субстратная специфичность или субстратная предпочтительность варианта гидролазы включает предпочтительный или усиленный гидролиз стеариновой кислоты из масла, или субстратная специфичность или субстратная предпочтительность варианта гидролазы включает предпочтительный или усиленный гидролиз пальмитиновой и стеариновой кислоты из масла; или
(b) пока не получают гидролазу по (а), где вариант имеет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или более либо все замены аминокислотных остатков (или их эквивалентов), как представлено в табл. 3 или 4.
37. Способ получения фермента, обладающего измененными субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающий:
(a) обеспечение родительской гидролазы по п.11 и
(b) получение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 или более модификаций аминокислотных остатков фермента родительской гидролазы, где, необязательно, модификации аминокислотных остатков соответствуют мутациям аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, как представлено в табл. 3 или 4 (или их эквивалентам), с получением тем самым фермента, обладающего измененными субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью,
где, необязательно, измененные субстратная специфичность или субстратная предпочтительность включают предпочтительный или усиленный гидролиз пальмитиновой кислоты,
где, необязательно, измененные субстратная специфичность или субстратная предпочтительность включают предпочтительный или усиленный гидролиз стеариновой кислоты,
где, необязательно, измененные субстратная специфичность или субстратная предпочтительность включают предпочтительный гидролиз конкретной жирной кислоты, где, необязательно, жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту, где, необязательно, жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту.
38. Липаза, включающая аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2, но также включающая:
(a) по меньшей мере, модификацию аминокислотного остатка А48С; D49R; D61A; D61E; R72E; R72K; V83M; R85Y; Е95K; Е116А E116I; E116L; E116N; E116Q; E116R; Е116Т; E116V; S133A; A144I; Е149Н; A150I; I151G; I151A; P162G; Р162K; V163R; D164R; R172H R172L; A225S или его эквивалента либо их сочетания;
(b) по меньшей мере, модификацию одного кодона (GCG)35(GCT); (GGC)45(GGA); (GCG)92(GCT); (GTG)102(GTT); (AGC)108(AGT); (CTG)117(CTT); (CTG)124(TTG); (CGG)126(AGG); (GTC)128(GTG); (AGT)133(TCT); (TTC)135(TTT); (GTG)183(GTT); (ACC)188(ACG) или его эквивалента либо их сочетания или
(с) липазу по (а), дополнительно включающую, по меньшей мере, модификацию одного кодона (GCG)35(GCT); (GGC)45(GGA); (GCG)92(GCT); (GTG)102(GTT); (AGC)108(AGT); (CTG)117(CTT); (CTG)124(TTG); (CGG)126(AGG); (GTC)128(GTG); (AGT)133(TCT); (TTC)135(TTT); (GTG)183(GTT); (ACC)188(ACG) или его эквивалента либо их сочетания.
39. Липаза, включающая аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2, но также включающая, по меньшей мере, модификацию одного аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; Е116Т; E116G; Н140K; K146S; I167S; L180E; Е194М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А218Н; A218S; V223A; А225М; A225Q или его эквивалента либо их сочетания.
40. Липаза по п.38 или 39, где субстратная специфичность или субстратная предпочтительность новой липазы включают предпочтительный или усиленный гидролиз жирной кислоты по сравнению с "родительской" SEQ ID NO:2, где, необязательно, жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту.
41. Косметическое средство или крем, включающие липазу по п.38 или 39 либо полипептид по п.11.
42. Фармацевтический агент, липосома, таблетка, капсула, состав или агент для доставки лекарства, включающие липазу по п.38 или 39 либо фермент по п.11.
Текст
ИСПРАВЛЕННОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ 2009.08.28 ГИДРОЛАЗЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИХ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ В изобретении предлагаются гидролазы, включающие липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы и кодирующие их полинуклеотиды, а также способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. Дополнительно предлагаются полипептиды, например ферменты, обладающие гидролазной активностью, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, и способы получения масел низкой насыщенности или имеющих низкое содержание жирных транс-кислот, таких как животные или растительные масла низкой насыщенности, или имеющие низкое содержание жирных транс-кислот, например масло сои или канолы. Примечание: библиография отражает состояние при переиздании(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL) Ссылка на перечень последовательностей, посланный через EFS-WEB Полное содержание последующего перечня последовательностей, посланного в электронном виде через сервер USPTO EFS-WEB, как санкционировано и изложено в МРЕР 1730 II.В.2(a) (С), включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей. Перечень последовательностей идентифицирован в файле электронного текста следующим образом: Область техники, к которой относится изобретение В настоящем документе предлагаются полипептиды, обладающие гидролазной активностью, включая липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность, кодирующие их полинуклеотиды и способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В настоящем описании предлагаются также пептиды и полипептиды, например ферменты, обладающие гидролазной активностью, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, и способы обработки жиров и масел такими пептидами и полипептидами для получения продуктов гидролизованных масел, таких как животные или низконасыщенные растительные масла, например масла сои или канолы, продуктов масел, обработанных таким образом, и продуктов, включающих такие обработанные масла. Известный уровень техники Основные виды промышленного применения гидролаз, например липаз, сатураз, пальмитаз и/или стеаратаз, включают пищевую промышленность и производство напитков, применение в качестве агентов против черствости хлебобулочных изделий и для получения маргарина и других бутербродных паст с отдушками природных масел; применение в системах отходов и в фармацевтической промышленности,где они используются в качестве средств, способствующих усваиванию. Бакалейные масла и жиры являются главным компонентом пищевых продуктов, пищевых добавок и средств приготовления пищи, а также представляют собой важное возобновляемое сырье для химической промышленности. Они доступны в больших количествах в результате обработки семян масличных культур таких растений, как рис, отруби, кукуруза, рапс, канола, подсолнечник, олива или соя. Другие источники ценных масел и жиров включают рыбу, ресторанные отходы и животные топленые жиры. Эти жиры и масла представляют собой смесь триацилглицеридов или липидов, т.е. жирных кислот (ЖК), этерифицированных на каркасе глицерина. Каждое масло или жир содержит большое разнообразие различных липидных структур, определяемых по содержанию ЖК и по их региональному химическому распределению на остове глицерина. Эти свойства индивидуальных липидов определяют физические свойства чистого триацилглицерида. Следовательно, содержание триацилглицеридов в жире или масле в высокой степени определяет физические, химические и биологические свойства масла. Ценность липидов существенно возрастает в зависимости от их чистоты. Высокая чистота может быть достигнута с помощью фракционной хроматографии или перегонки, отделения желаемого триацилглицерида из смешанного окружения источника жира или масла. Однако это дорого, и выход часто ограничивается низкими уровнями, в которых триацилглицерид находится в природе. Кроме того, легкость очистки продукта часто осложняется присутствием многих структурно и физически или химически сходных триацилглицеридов в масле. Альтернативой очистке триацилглицеридов или других липидов из природного источника является синтез липидов. Продукты таких способов называют структурными липидами, потому что они содержат определенный набор жирных кислот, распределенных определенным образом на остове глицерина. Ценность липидов также существенно возрастает при контролировании содержания и распределения жирных кислот в липиде. Удаление из триглицеридов, жиров или масел нежелательных ЖК или замена ЖК с нежелательными свойствами на жирные кислоты с лучшими или более желательными химическими,физическими или биологическими свойствами повышает ценность липидов. В частности, существует потребность в липазах, которые могут гидролизовать, например избирательно гидролизовать, насыщенную жирную кислоту ("сатураза"), или в тех, которые, в частности, могут гидролизовать, например избирательно гидролизовать, пальмитиновую кислоту ("пальмитаза") или стеариновую кислоту ("стеаратаза") на остове глицерина. Липазы, такие как сатуразы, например пальмитазы и/или стеаратазы, могут быть использованы для осуществления такого контроля, когда ЖК, предназначенные для удаления, добавления или замены, представляют собой насыщенные жирные кислоты, например пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту. Краткое изложение сущности изобретения В настоящем изобретении предлагаются полипептиды, обладающие гидролазной активностью,включая липазную активность. В одном аспекте в настоящем изобретении предлагаются новые классы липаз, обозначаемые как "сатуразы", "пальмитазы" и "стеаратазы". Предлагаются также полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, обладающие сатуразной, например пальмитазной и/или стеаратазной активностью, и способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В одном аспекте в настоящем изобретении предлагаются полипептиды, например ферменты, обладающие гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью,-1 020145 обладающие термостабильной и/или термоустойчивой ферментативной (каталитической) активностью. Типы ферментативной активности полипептидов и пептидов, предлагаемых в настоящем документе,включают (включают или состоят из) сатуразную активность или липазную активность, включая гидролиз липидов, реакции кислотного гидролиза (например, замены этерифицированной жирной кислоты свободной жирной кислотой), реакции трансэтерификации (например, обмена жирными кислотами между триацилглицеридами), синтез сложных эфиров, реакции взаимопревращений сложных эфиров и активность ацилгидролазы липидов (LAH). В другом аспекте предлагаемые в настоящем изобретении полипептиды используются для синтеза энантиомерно чистых хиральных продуктов. Предлагаемые в настоящем изобретении полипептиды могут быть использованы в разнообразных фармацевтических, сельскохозяйственных и промышленных целях, включая производство косметики и пищевых продуктов. Кроме того, предлагаемые в настоящем изобретении полипептиды могут быть использованы в приготовлении пищи, пивоварении, в качестве добавок в ванну, в получении спирта, пептидном синтезе, энантиоселективности, получении шкур в кожевенной промышленности, в управлении отходами и разрушении животных отходов, в регенерации серебра в фотографической промышленности,медицинском лечении, отварке шелка, деградации биологических пленок, превращении биомассы в этанол, биологической защите, противомикробных агентах и дезинфицирующих средствах, в индивидуальном уходе и косметике, биотехнологических реагентах, для повышения выхода крахмала из кукурузы мокрого помола и в качестве фармацевтических агентов, таких как средства, способствующие усваиванию, и противовоспалительные (антивоспалительные) агенты. В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагаются композиции(например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) и способы получения низконасыщенных масел, например масел с содержанием жирных кислот более низкой насыщенности, включая масла с низким содержанием производных жирных кислот, пальмитата, стеарата, миристата, лаурата или бутирата и/или каприловой кислоты (октановой кислоты). Любое растительное масло, например масло канолы,масло сои или животное масло или жир, например сало, может быть обработано с помощью предлагаемых в настоящем описании композиции или способа. Любые пищевые продукты, съедобные изделия или продукты хлебопечения, обжаривания или кулинарии (например, соусы, маринады, приправы, распыляемые масла, маргарины, масла для выпечки, майонез, кулинарные масла, салатные масла, густые или жидкие подливы и тому подобное, и продукты, приготовленные с ними) могут включать растительное масло или животный жир, которые обработаны с помощью предлагаемых в настоящем описании композиции или способа. Растительные масла, модифицированные для получения масел с более низкой насыщенностью, могут быть использованы в любых пищевых продуктах, съедобных изделиях или продуктах хлебопечения или кулинарии, например соусах, маринадах, приправах, распыляемых маслах, маргаринах, маслах для выпечки, майонезе, кулинарных маслах, салатных маслах, густых или жидких подливах и тому подобном. В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предлагаются масла, такие как растительные масла, например масло канолы или масло сои, и пищевые продукты или продукты хлебопечения или кулинарии, включая соусы, маринады, приправы, распыляемые масла, маргарины, майонез, масла для выпечки, кулинарные масла, масла для жарения, салатные масла, густые или жидкие подливы и тому подобное, где масло или пищевой продукт либо продукт хлебопечения или кулинарии модифицирован с использованием предлагаемого в настоящем изобретении фермента. В одном аспекте эти растительные масла, например масло канолы, касторовое масло, кокосовое масло, масло кориандра, кукурузное масло, хлопковое масло, масло фундука, конопляное масло, льняное масло, масло пенника лугового, оливковое масло, пальмовое масло, косточковое пальмовое масло, арахисовое масло, масло семян рапса, масло отрубей риса, сафлоровое масло, масло горной камелии, соевое масло, масло семян подсолнечника, tall масло, tsubaki масло, разнообразные "природные" масла, обладающие измененными составами жирных кислот из-за генетически модифицированных организмов (ГМО) или традиционные "сорта", такие как с высоким содержанием олеиновой кислоты, низким содержанием линоленовой кислоты,или низконасыщенные масла (масло канолы с высоким содержанием олеиновой кислоты, соевое масло с низким содержанием линоленовой кислоты или масла подсолнечника с высоким содержанием стеариновой кислоты), животные жиры (сало, шпик, полутвердый жир и жир цыплят), масла рыб (масло талеихтиса, рыбий жир, масло хоплостета, масло сардин, масло сельди и масло американской сельди) или смеси любых из указанных выше, и пищевые продукты или продукты хлебопечения, жарения или кулинарии включают масла с более низким содержанием насыщенных жирных кислот, включая масла с низким содержанием пальмитиновой кислоты, миристиновой кислоты, лауриновой кислоты, стеариновой кислоты,каприловой кислоты (октановой кислоты) и т.п., обработанные с использованием композиции или способа, предлагаемых в настоящем изобретении. В одном аспекте в настоящем изобретении предлагаются полипептиды, например ферменты и каталитические антитела, обладающие гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, включая термостабильную и термоустойчивую ферментативную активность, и специфическую для жирных кислот или избирательную для жирных кислот активность, и устойчивые к низкому или высокому рН ферментативные активности, и полинуклеотиды, кодирующие эти полипептиды, включая векторы, клетки-хозяева, трансгенные растения и животные, не являющиеся человеком, и способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В другом аспекте в настоящем изобретении предлагаются выделенные синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, включающие:(а) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид, где нуклеиновая кислота включает последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 50,51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или полной (100%) идентичностью последовательности:(ii) с нуклеиновой кислотой SEQ ID NO:1, имеющей одну или более замен нуклеотидов (или их эквивалентов), кодирующих одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать,двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одну, двадцать две, двадцать три, двадцать четыре или более или все аминокислотные замены (или их эквиваленты), как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23,где нуклеиновая кислота по (i) или (ii) кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, или кодирует полипептид или пептид, способный индуцировать образование антитела, специфичного для гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) (полипептид или пептид, который действует в качестве эпитопа или иммуногена);(b) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (а), где идентичности последовательностей определены (А) путем анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуального обследования или (В) на протяжении области по меньшей мере из приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50,55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900,950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 или более остатков или полной длины кДНК, транскрипта (мРНК) или гена;(c) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (а) или (b), где алгоритмом сравнения последовательностей является алгоритм BLAST версии 2.2.2, где установка фильтрации берется как blastall -p blastp -d"nr pataa" -F F и все другие опции устанавливаются по умолчанию;(d) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид или пептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, где нуклеиновая кислота включает последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементарной нуклеиновой кислотой по (а), (b) или (с), где жесткие условия включают стадию промывки, включающую промывку в 0,2 Х SSC при температуре приблизительно 65 С в течение приблизительно 15 мин;(e) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, где полипептид включает последовательность SEQ ID NO:2 или ее ферментативно активный фрагмент, имеющие по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одну, двадцать две, двадцать три, двадцать четыре или более или все аминокислотные замены (или их эквиваленты), как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23;(f) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, где полипептид включает последовательность SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 или SEQ IDNO:20 или их ферментативно активные фрагменты;(g) (А) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из от (а) по (f) и кодирующую полипептид, обладающий по меньшей мере одной консервативной заменой аминокислот и сохраняющий свою гидролазную активность, например липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность, или (В) нуклеиновую кислоту по (g) (А), где по меньшей мере одна консервативная замена аминокислоты включает замену аминокислоты другой аминокислотой со сходными характеристиками; или консервативная замена включает замену алифатической аминокислоты другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином и наоборот; замену кислого остатка другим кислым остатком; замену остатка, несущего амидную группу, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка другим основным остатком; или замену ароматического остатка другим ароматическим остатком;(h) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из (а)-(g), кодирующую полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, но не имеющий сигнальной последовательности;(i) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из (а)-(h), кодирующую полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, дополнительно включающий гетерологичную последовательность;(j) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (i), где гетерологичная последовательность включает или состоит из последовательности, кодирующей (А) гетерологичную сигнальную последовательность,(В) последовательность по (А), где гетерологичная сигнальная последовательность происходит от гетерологичного фермента, или (С) метку, эпитоп, направляющий пептид, расщепляемую последовательность, определяемую часть или фермент; или(k) последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида), полностью (целиком) комплементарную последовательности по любому из (a)-(j). В одном аспекте выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид или пептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, который является термостабильным. Полипептиды и пептиды,кодируемые предлагаемыми в настоящем описании нуклеиновыми кислотами, или любой полипептид или пептид, предлагаемый в настоящем документе, могут сохранять ферментативную или связывающую способность (например, связывание субстрата) в условиях, включающих диапазон температур от приблизительно -100 до приблизительно -80 С, от приблизительно -80 до приблизительно -40 С, от приблизительно -40 до приблизительно -20 С, от приблизительно -20 до приблизительно 0 С, от приблизительно 0 до приблизительно 5 С, от приблизительно 5 до приблизительно 15 С, от приблизительно 15 до приблизительно 25 С, от приблизительно 25 до приблизительно 37 С, от приблизительно 37 до приблизительно 45 С, от приблизительно 45 до приблизительно 55 С, от приблизительно 55 до приблизительно 70 С, от приблизительно 70 до приблизительно 75 С, от приблизительно 75 до приблизительно 85 С, от приблизительно 85 до приблизительно 90 С, от приблизительно 90 до приблизительно 95 С, от приблизительно 95 до приблизительно 100 С, от приблизительно 100 до приблизительно 105 С, от приблизительно 105 до приблизительно 110 С, от приблизительно 110 до приблизительно 120 С или 95, 96, 97, 98,99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 С или более. В настоящем описании предлагаются термостабильные полипептиды, которые сохраняют гидролазную активность,например липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность, при температуре в описанных выше диапазонах при приблизительно рН 3,0, приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0,приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или более. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании полипептиды могут быть термоустойчивыми и могут сохранять гидролазную активность, например липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность, после экспозиции с температурой в диапазоне от приблизительно -100 до приблизительно -80 С, от приблизительно -80 до приблизительно -40 С, от приблизительно -40 до приблизительно -20 С, от приблизительно -20 до приблизительно 0 С, от приблизительно 0 до приблизительно 5 С, от приблизительно 5 до приблизительно 15 С, от приблизительно 15 до приблизительно 25 С, от приблизительно 25 до приблизительно 37 С, от приблизительно 37 до приблизительно 45 С, от приблизительно 45 до приблизительно 55 С, от приблизительно 55 до приблизительно 70 С, от приблизительно 70 до приблизительно 75 С, от приблизительно 75 до приблизительно 85 С, от приблизительно 85 до приблизительно 90 С, от приблизительно 90 до приблизительно 95 С, от приблизительно 95 до приблизительно 100 С, от приблизительно 100 до приблизительно 105 С, от приблизительно 105 до приблизительно 110 С, от приблизительно 110 до приблизительно 120 С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103,104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 С или более. В некоторых вариантах осуществления термостабильные полипептиды сохраняют гидролазную активность, например липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность, после экспозиции с температурой в описанных выше диапазонах при приблизительно рН 3,0, приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5,приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или более. В одном варианте осуществления выделенные синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты включают последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с предлагаемой в настоящем описании нуклеиновой кислотой, например с предлагаемой в настоящем описании иллюстративной нуклеиновой кислотой, включающей последовательность, как показано в SEQ ID NO:1, SEQ IDSEQ ID NO:1, имеющей 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более или все замены остатков (модифицированные последовательности SEQ ID NO:1), как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, или их фрагментами или подпоследовательностями, и последовательностями, (полностью) комплементарными им. В одном аспекте нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий гидролазной активностью,например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью. Нуклеиновая кислота может иметь по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125,150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 или более остатков в длину или полную длину гена или быть транскриптом, включающим SEQ ID NO:1, и обладать последовательностью, представленной SEQ ID NO:1, имеющей 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более или все замены остатков(модифицированные аминокислотные последовательности) в SEQ ID NO:1, как представлено в табл. 3, 4,9, 10, 11, 16 или 23; и последовательностями, (полностью) комплементарными им. В одном аспекте жесткие условия включают стадию промывки, включающую промывку в 0,2 Х SSC при температуре приблизительно 65 С в течение приблизительно 15 мин. В одном осуществлении зонд нуклеиновой кислоты, например зонд для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, включает зонд, включающий или состоящий по меньшей мере из приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100,150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более последовательных оснований предлагаемой в настоящем описании последовательности или ее фрагментов или подпоследовательностей, где зонд идентифицирует нуклеиновую кислоту с помощью связывания или гибридизации. Зонд может включать олигонуклеотид, включающий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80 или приблизительно от 60 до 100 последовательных оснований последовательности, включающей последовательность, предлагаемую в настоящем описании, или ее фрагменты или подпоследовательности. Зонд может включать олигонуклеотид, включающий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80 или приблизительно от 60 до 100 последовательных оснований предлагаемой в настоящем описании последовательности нуклеиновой кислоты или ее подпоследовательности. В одном варианте осуществления последовательности пары амплификационных праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий гидролазной активностью,например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, включает пару праймеров, включающих или состоящих из пары праймеров, способных амплифицировать нуклеиновую кислоту, включающую последовательность, предлагаемую в настоящем описании, или ее фрагменты или подпоследовательности. Один или каждый член последовательности пары праймеров для амплификации может включать олигонуклеотид, включающий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 оснований последовательности. В одном варианте осуществления методы амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, включают амплификацию матрицы нуклеиновой кислоты с помощью последовательностей пары амплификационных праймеров, способных амплифицировать последовательность нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, или ее фрагменты либо подпоследовательности. В одном варианте осуществления экспрессионные кассеты включают нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем описании, или ее подпоследовательность. В одном аспекте экспрессионная кассета может включать нуклеиновую кислоту, которая функционально связана с промотором. Промотор может быть вирусным, бактериальным промотором, промотором млекопитающих или растительным промотором. В одном аспекте растительный промотор может представлять собой промотор картофеля, риса,кукурузы, пшеницы, табака или ячменя. Промотор может представлять собой конституционный промотор. Конституционный промотор может включать CaMV35S. В другом аспекте промотор может представлять собой индуцируемый промотор. В одном аспекте промотор может являться тканеспецифическим промотором или промотором, регулируемым факторами внешней среды или регулируемым факторами развития. Таким образом, промотор может являться, например, промотором, специфическим для семян, специфическим для корней, специфическим для ствола или индуцируемым опадением листьев. В одном аспекте экспрессионная кассета может дополнительно включать растительный экспрессионный вектор или экспрессионный вектор вирусов растений. В одном варианте осуществления носители для клонирования включают экспрессионную кассету(например, вектор), предлагаемую в настоящем описании, или предлагаемую в настоящем описании нуклеиновую кислоту. Носитель для клонирования может представлять собой вирусный вектор, плазмиду,фаг, фагемиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому. Вирусный вектор может включать аденовирусный вектор, ретровирусный вектор или ассоциированный с аденовирусом вирусный вектор. Носитель для клонирования может включать бактериальную искусственную хромосому (ВАС),плазмиду, вектор, происходящий из бактериофага Р 1 (РАС), искусственную хромосому дрожжей (YAC) или искусственную хромосому млекопитающих (MAC). В одном варианте осуществления трансформированные клетки включают нуклеиновую кислоту,предлагаемую в настоящем описании, или экспрессионную кассету (например, вектор), предлагаемые в настоящем описании, или носитель для клонирования, предлагаемый в настоящем описании. В одном аспекте трансформированная клетка может представлять собой бактериальную клетку, клетку млекопи-5 020145 тающих, клетку грибов, клетку дрожжей, клетку насекомых или клетку растений. В одном аспекте клетка растений может представлять собой клетку картофеля, пшеницы, риса, кукурузы, табака или ячменя. Трансформированная клетка может быть любой из клеток-хозяев, известных специалистам в данной области техники, включая клетки прокариот, клетки эукариот, такие как бактериальные клетки, клетки грибов, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Примеры бактериальных клеток включают любые штаммы в пределах родов Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Salmonella, Pseudomonas и Staphylococcus, включая, например, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillussubtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens. Примеры клеток грибов включают любые виды Aspergillus. Примеры клеток дрожжей включают любые виды Pichia, Saccharomyces,Schizosaccharomyces или Schwanniomyces, включая Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae или Schizosaccharomyces pombe. Примеры клеток насекомых включают любые виды Spodoptera или Drosophila,включая Drosophila S2 и Spodoptera Sf9. Примеры клеток животных включают линии СНО, COS или меланому Bowes либо любые клеточные линии мыши или человека. В одном варианте осуществления трансгенные растения включают нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем описании, или экспрессионную кассету (например, вектор), предлагаемую в настоящем описании. Трансгенное растение может представлять собой растение кукурузы, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, растение масличной культуры, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя или растение табака. В одном варианте осуществления трансгенные семена включают нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем описании, или экспрессионную кассету (например, вектор), предлагаемую в настоящем описании. Трансгенные семена могут представлять собой рис, семена кукурузы, зерно пшеницы, семена масличной культуры, семена рапса, семена сои, зерно пальмы, семена подсолнечника, семена кунжута,арахис или семена растения табака. В одном варианте осуществления выделенные синтетические или рекомбинантные полипептиды обладают гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, или полипептиды способны вызывать иммунный ответ, специфичный для гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы (например, как эпитоп); и в альтернативных аспектах пептиды и полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, включают последовательность:(а) обладающую по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63,64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93,94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо 100% (полной) идентичностью последовательности:(i) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 или ее ферментативно активными фрагментами и имеющей по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24 или более или все аминокислотные замены (или их эквиваленты), как представлено в табл. 3, 4, 9,10, 11, 16 или 23, илиNO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:20,где полипептид или пептид по (i) или (ii) обладает гидролазной активностью, например липазной,сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, или полипептид или пептид способен индуцировать образование антитела, специфичного для гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) (полипептид или пептид, который действует в качестве эпитопа или иммуногена);(b) полипептида или пептида по (а), где идентичности последовательностей определены (А) путем анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуального обследования или (В) на протяжении области по меньшей мере из приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150,200, 250, 300 или более аминокислотных остатков либо на протяжении полной длины полипептида или пептида либо фермента и/или их ферментативно активных подпоследовательностей (фрагментов);(c) полипептида или пептида по (b), где алгоритмом сравнения последовательностей является алгоритм BLAST версии 2.2.2, где установка фильтрации берется как blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, и все другие опции устанавливаются по умолчанию;(d) аминокислотную последовательность, кодируемую предлагаемой в настоящем описании нуклеиновой кислотой, где полипептид обладает (i) гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, или (ii) обладает иммуногенной активностью, в том плане, что он способен индуцировать выработку антитела, которое специфически связывается с полипептидом, обладающим последовательностью по (а) и/или их ферментативно активными подпоследовательностями (фрагментами);(e) аминокислотную последовательность по любому из (а)-(d), включающую по меньшей мере одну консервативную замену аминокислотного остатка, и полипептид или пептид сохраняет гидролазную активность, например липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность;(f) аминокислотную последовательность по (е), где консервативная замена включает замену алифатической аминокислоты другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином и наоборот; замену кислого остатка другим кислым остатком; замену остатка, несущего амидную группу, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка другим основным остатком; или замену ароматического остатка другим ароматическим остатком либо их сочетание;(g) аминокислотную последовательность по (f), где алифатический остаток включает аланин, валин,лейцин, изолейцин или их синтетический эквивалент; кислый остаток включает аспарагиновую кислоту,глутаминовую кислоту или их синтетический эквивалент; остаток, включающий амидную группу, включает аспарагин, глутамин или их синтетический эквивалент; основной остаток включает лизин, аргинин,гистидин или их синтетический эквивалент или ароматический остаток включает фенилаланин, тирозин,триптофан или их синтетический эквивалент;(h) полипептида по любому из (a)-(f), обладающего гидролазной активностью, например липазной,сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, но лишенного сигнальной последовательности;(i) полипептида по любому из (a)-(h), обладающего гидролазной активностью, например липазной,сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, дополнительно включающего гетерологичную последовательность;(j) полипептида по (i), где гетерологичная последовательность включает или состоит из (А) гетерологичной сигнальной последовательности, (В) последовательности по (А), где гетерологичная сигнальная последовательность происходит от гетерологичного фермента, и/или (С) метки, эпитопа, направляющего пептида, расщепляемой последовательности, определяемой части или фермента; или(m) включающую аминокислотную последовательность, кодируемую любой последовательностью нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании. Иллюстративные последовательности полипептидов и пептидов, предлагаемых в настоящем описании, включают SEQ ID NO:2, ее подпоследовательности и ее варианты, например по меньшей мере приблизительно из 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 или более остатков в длину или на протяжении полной длины фермента, все обладающие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12 или более либо всеми заменами аминокислотных остатков (модифицированные аминокислотные последовательности SEQ ID NO:2), как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23. Иллюстративные последовательности полипептидов и пептидов, предлагаемых в настоящем описании, включают последовательность, кодируемую предлагаемой в настоящем описании нуклеиновой кислотой. Иллюстративные последовательности полипептидов и пептидов, предлагаемых в настоящем описании, включают полипептиды или пептиды, специфически связывающиеся с антителом, предлагаемым в настоящем описании. В одном аспекте полипептид, предлагаемый в настоящем описании, обладает по меньшей мере одной гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью. В одном аспекте активность представляет собой региоселективную и/или химиоселективную активность. В одном аспекте выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид может включать полипептид, предлагаемый в настоящем описании, лишенный сигнальной (пептидной) последовательности,например, лишенный его гомологичной сигнальной последовательности, и в одном аспекте он включает гетерологичную сигнальную (пептидную) последовательность. В одном аспекте выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид может включать полипептид, предлагаемый в настоящем описании, включающий гетерологичную сигнальную последовательность, такую как гетерологичная сигнальная последовательность гидролазы или не гидролазы (например, не липазы, не сатуразы или не пальмитазы). В одном аспекте слитые белки включают первый домен, включающий сигнальную последовательность, предлагаемую в настоящем описании, и, по меньшей мере, второй домен. Белок может представлять собой слитый белок. Второй домен может включать фермент. Фермент может представлять собой гидролазу (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), предлагаемую в настоящем описании, или другую гидролазу. В одном аспекте гидролазная (например, липазная, сатуразная, пальмитазная и/или стеаратазная) активность включает специфичную активность при приблизительно 37 С в диапазоне от приблизительно 100 до приблизительно 1000 ед/1 мг белка. В другом аспекте гидролазная (например, липазная, сатуразная, пальмитазная и/или стеаратазная) активность включает специфичную активность от приблизительно 500 до приблизительно 750 ед/1 мг белка. Альтернативно, гидролазная активность включает специфичную активность при 37 С в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 1200 ед/1 мг белка. В одном аспекте гидролазная активность включает специфичную активность при 37 С в диапазоне от приблизительно 750 до приблизительно 1000 ед/1 мг белка. В другом аспекте термоустойчивость включает сохранение, по меньшей мере, половины специфической активности гидролазы при 37 С после нагревания при повышенной температуре. Альтернативно, термоустойчивость может включать сохранение специфической активности при 37 С в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 1200 ед/1 мг белка после нагревания при повышенной температуре. В одном варианте осуществления выделенные синтетические или рекомбинантные полипептиды,предлагаемые в настоящем описании, включают по меньшей мере один сайт гликозилирования. В одном аспекте гликозилирование может представлять собой N-связанное гликозилирование. В одном аспекте полипептид может быть гликозилирован после экспрессии в P. pastoris или S. pombe или в растениях,таких как растения, продуцирующие масла, например соя, канола, рис, подсолнечник или генетически модифицированные (ГМО) варианты этих растений. В одном аспекте полипептид может сохранять гидролазную (например, липазную, сатуразную,пальмитазную и/или стеаратазную) активность в условиях, включающих приблизительно рН 6,5, 6, 5,5,5, 4,5 или 4,0 или ниже. В другом аспекте полипептид может сохранять гидролазную (например, липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную) активность в условиях, включающих приблизительно рН 7, 7,5, 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12,0 или выше. В одном варианте осуществления препараты белка включают предлагаемый в настоящем описании полипептид, где препарат белка включает жидкость, твердое вещество или гель. В одном аспекте гетеродимеры, предлагаемые в настоящем описании, включают полипептид и второй домен. В одном аспекте второй домен может представлять собой полипептид и гетеродимер может представлять собой слитый белок. В одном аспекте второй домен может представлять собой эпитоп или метку. В одном аспекте гомодимеры, предлагаемые в настоящем описании, включают предлагаемый в настоящем описании полипептид. В одном варианте осуществления иммобилизованные полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, обладают гидролазной (например, липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной) активностью, где полипептид включает предлагаемый в настоящем описании полипептид, полипептид,кодируемый нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании, или полипептид, включающий предлагаемый в настоящем описании полипептид и второй домен. В одном аспекте полипептид, предлагаемый в настоящем описании, может быть иммобилизован на клетке, пузырьке, липосоме, пленке, мембране, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитовой частице, шарике, геле,планшете, кристалле, таблетке, пилюле, капсуле, порошке, агломерате, поверхности, пористой структуре,матрице или капиллярной трубке или таких материалах, как зерна, шелуха, кора, кожа, волос, кость, оболочка, и происходящих от них материалах. Полинуклеотиды, полипептиды и ферменты, предлагаемые в настоящем описании, могут быть составлены в виде твердой формы, такой как порошок, лиофилизованный препарат, гранулы, таблетка, брусок, кристалл, капсула, пилюля, шарик, или в виде жидкой формы,такой как водный раствор, аэрозоль, гель, паста, суспензия, эмульсия воды в масле, крем, капсула или везикулярная либо мицеллярная суспензия. В одном варианте осуществления пищевые добавки для животного включают полипептид, предлагаемый в настоящем описании, например полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании. В одном аспекте полипептид в пищевой добавке может быть гликозилирован. В одном варианте осуществления матрицы для доставки пригодного в пищу фермента включают полипептид, предлагаемый в настоящем описании, например полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой,предлагаемой в настоящем описании. В одном аспекте матрица для доставки включает гранулу. В одном аспекте полипептид может быть гликозилирован. В одном аспекте гидролазная активность является термоустойчивой. В другом аспекте гидролазная активность является термостабильной. В одном варианте осуществления методы выделения или идентификации полипептида, обладающего гидролазной (например, липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной) активностью, включают следующие стадии: (а) обеспечение антитела, предлагаемого в настоящем описании; (b) обеспечение образца, включающего полипептиды; и (с) контактирование образца со стадии (b) с антителом со стадии (а) в условиях, когда антитело может специфически связываться с полипептидом, тем самым достигая выделения или идентификации полипептида, обладающего гидролазной (например, липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной) активностью. В одном варианте осуществления методы получения антитела против гидролазы включают введение животному, не являющемуся человеком, нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, или полипептида, предлагаемого в настоящем описании, или их подпоследовательностей в количестве, достаточном для индукции гуморального иммунного ответа, тем самым создавая выработку антитела против гидролазы. В настоящем описании предлагаются методы получения антитела против гидролазы, включающие введение животному, не являющемуся человеком, нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, или полипептида, предлагаемого в настоящем описании, или их подпоследовательностей в количестве, достаточном для индукции иммунного ответа. В одном варианте осуществления методы получения рекомбинантного полипептида включают следующие стадии: (а) обеспечение нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, функционально связанной с промотором, и (b) экспрессия нуклеиновой кислоты со стадии (а) в условиях, которые позволяют экспрессировать полипептид, тем самым получая рекомбинантный полипептид. В одном аспекте метод может дополнительно включать трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой со стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты со стадии (а), тем самым получая рекомбинантный полипептид в трансформированной клетке. В одном варианте осуществления методы идентификации полипептида, обладающего гидролазной(с) контактирование полипептида или его фрагмента либо варианта со стадии (а) с субстратом со стадии(b) и определение снижения количества субстрата или роста количества продукта реакции, где снижение количества субстрата или рост количества продукта реакции указывает на полипептид, обладающий гидролазной (например, липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной) активностью. В одном варианте осуществления методы идентификации субстрата гидролазы включают следующие стадии: (а) обеспечение полипептида, предлагаемого в настоящем описании; или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании; (b) обеспечение субстрата гидролазы; (с) контактирование полипептида со стадии (а) с тестируемым субстратом со стадии (b) и определение снижения количества субстрата или роста количества продукта реакции, где снижение количества субстрата или рост количества продукта реакции идентифицирует тестируемый субстрат как субстрат гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы). В одном варианте осуществления методы определения, будет ли тестируемое соединение специфически связываться с полипептидом, включают следующие стадии: (а) экспрессия нуклеиновой кислоты или вектора, включающего нуклеиновую кислоту, в условиях, пермиссивных для трансляции нуклеиновой кислоты в полипептид, где нуклеиновая кислота включает нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем описании, или нуклеиновую кислоту, обеспечивающую предлагаемым в настоящем описании полипептидом; (b) обеспечение тестируемого соединения; (c) контактирование полипептида с тестируемым соединением и (d) определение, будет ли тестируемое соединение со стадии (b) специфически связываться с полипептидом. В одном варианте осуществления методы идентификации модулятора гидролазной (например, липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной) активности включают следующие стадии: (а) обеспечение полипептида, предлагаемого в настоящем описании, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании; (b) обеспечение тестируемого соединения; (с) контактирование полипептида со стадии (а) с тестируемым соединением со стадии (b) и измерение активности гидролазы, где изменение активности гидролазы, измеренное в присутствии тестируемого соединения, по сравнению с активностью в отсутствие тестируемого соединения, указывает на то, что тестируемое соединение модулирует активность гидролазы. В одном аспекте гидролазная (например, липазная, сатуразная, пальмитазная и/или стеаратазная) активность может быть измерена с помощью предоставления субстрата гидролазы и определения снижения количества субстрата, или роста количества продукта реакции, или повышения количества субстрата, или снижения количества продукта реакции. Снижение количества субстрата или рост количества продукта реакции под действием тестируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без тестируемого соединения идентифицирует тестируемое соединение как активатор гидролазной активности. Повышение количества субстрата или снижение количества продукта реакции под действием тестируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без тестируемого соединения идентифицирует тестируемое соединение как ингибитор гидролазной активности. В одном варианте осуществления компьютерные системы включают процессор и устройство накопления данных, где в устройстве накопления данных сохраняются предлагаемые в настоящем описании полипептидная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты (например, полипептид, кодируемый предлагаемой в настоящем описании нуклеиновой кислотой). В одном аспекте компьютерная система может дополнительно включать алгоритм сравнения последовательностей и устройство накопления данных, имеющее по меньшей мере одну сохраняемую на нем реперную последовательность. В другом аспекте алгоритм сравнения последовательностей включает компьютерную программу,которая указывает на полиморфизмы. В одном аспекте компьютерная система может дополнительно включать идентификатор, который идентифицирует одну или более характеристик в указанной последовательности. В одном варианте осуществления полипептидная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты, предлагаемые в настоящем описании, сохраняются на носителях программ компьютера. В одном варианте осуществления методы идентификации характеристики последовательности включают стадии (а) считывания последовательности с использованием компьютерной программы, которая идентифицирует одну или более характеристик последовательности, где последовательность включает полипептидную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты, предлагаемые в настоящем описании; и (b) идентификации одной или более характеристик последовательности с помощью компьютерной программы. В другом варианте осуществления в настоящем описании предлагаются методы сравнения первой последовательности со второй последовательностью, включающие стадии (а) считывания первой последовательности и второй последовательности с помощью использования компьютерной программы, которая сравнивает последовательности, где первая последовательность включает полипептидную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты, предлагаемые в настоящем описании; и (b) определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью с помощью компьютерной программы. Стадия определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью может дополнительно включать стадию идентификации полиморфизмов. В одном аспекте метод может дополнительно включать идентификатор, который идентифицирует одну или более характеристик последовательности. В другом аспекте метод может включать считывание первой после-9 020145 довательности с использованием компьютерной программы и идентификацию одной или более характеристик последовательности. В одном варианте осуществления методы выделения или получения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий гидролазной (например, липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной) активностью из образца, включают стадии (а) обеспечения последовательностей пары амплификационных праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий гидролазной активностью, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, включающую последовательность, предлагаемую в настоящем описании; (b) выделения нуклеиновой кислоты из образца или обработки образца таким образом, что нуклеиновая кислота в образце становится доступной для гибридизации с парой амплификационных праймеров; и (с) объединения нуклеиновой кислоты со стадии (b) с парой амплификационных праймеров со стадии (а) и амплификации нуклеиновой кислоты из образца, тем самым выделяя или получая нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид,обладающий гидролазной активностью из образца. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец из окружающей среды, например образец воды, образец жидкости, образец почвы,образец воздуха или биологический образец, например бактериальную клетку, клетку простейших, клетку насекомых, клетку дрожжей, клетку растений, клетку грибов или клетку млекопитающих. Один или каждый член пары последовательностей праймеров для амплификации может включать олигонуклеотид,включающий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 или более последовательных оснований последовательности, предлагаемой в настоящем описании. В одном варианте осуществления методы повышения термоустойчивости или термостабильности гидролазного полипептида включают гликозилирование гидролазного полипептида, где полипептид включает по меньшей мере тридцать последовательных аминокислот полипептида, предлагаемого в настоящем описании; или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, тем самым повышая термоустойчивость или термостабильность гидролазного полипептида. В одном аспекте специфическая гидролазная активность может быть термостабильной или термоустойчивой при температуре в диапазоне выше чем от приблизительно 37 до приблизительно 95 С. В одном варианте осуществления методы гиперэкспрессии рекомбинантного гидролазного полипептида (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) в клетке включают экспрессию вектора, включающего нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем описании, или последовательность нуклеиновой кислоты, предлагаемую в настоящем описании, где идентичности последовательностей определяют путем анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуального обследования, где гиперэкспрессия достигается использованием высокоактивного промотора, двухцистронного вектора или генной амплификации вектора. В одном варианте осуществления композиции детергентов, включающие полипептид, предлагаемый в настоящем описании, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании, включают гидролазную активность, например липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность. В одном аспекте гидролаза может представлять собой не поверхностноактивную гидролазу. В другом аспекте гидролаза может представлять собой поверхностно-активную гидролазу. В одном варианте осуществления методы мытья объекта включают следующие стадии: (а) обеспечение композиции, включающей полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, где полипептид включает полипептид,предлагаемый в настоящем описании, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании; (b) обеспечение объекта; (с) контактирование полипептида со стадии (а) и объекта со стадии (b) в условиях, когда композиция может мыть объект. В одном варианте осуществления методы получения трансгенного растения включают следующие стадии: (а) введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку растения, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, предлагаемую в настоящем описании, тем самым получая трансформированную клетку растения; и (b) получение трансгенного растения из трансформированной клетки. В одном аспекте стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты с помощью электропорации протопластов клеток растения или микроинъекции в них. В другом аспекте стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты прямо в ткань растения с помощью бомбардировки частичками ДНК. Альтернативно, стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в ДНК растительной клетки с использованием хозяина Agrobacterium tumefaciens. В одном аспекте растительная клетка может представлять собой клетку картофеля, кукурузы, риса, пшеницы, табака или ячменя. В одном варианте осуществления методы экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в растительной клетке включают следующие стадии: (а) трансформация растительной клетки гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промо- 10020145 тором, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты включает нуклеиновую кислоту,предлагаемую в настоящем описании; (b) выращивание растения в условиях, когда гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется в растительной клетке. В одном варианте осуществления первый метод биокаталитического синтеза структурного липида включает следующие стадии: (а) обеспечение полипептида (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемого в настоящем описании; (b) обеспечение композиции, включающей триацилглицерид (TAG); (с) контактирование полипептида со стадии (а) с композицией со стадии (b) в условиях, когда полипептид гидролизует ацильный остаток в положении Sn2 триацилглицерида (TAG),тем самым продуцируя 1,3-диацилглицерид (DAG); (d) обеспечение сложного эфира R1; (е) обеспечениеR1-специфичной гидролазы и (f) контактирование 1,3-DAG со стадии (с) со сложным эфиром R1 со стадии (d) и R1-специфичной гидролазой со стадии (е) в условиях, когда R1-специфичная гидролаза катализирует этерификацию положения Sn2, тем самым продуцируя структурный липид. Гидролаза, предлагаемая в настоящем описании, может представлять собой Sn2-специфичную гидролазу. Структурный липид может включать альтернативу масла какао (СВА), синтетическое масло какао, природное масло какао, 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерин (POP), 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерин (SOS), 1 пальмитоил-2-олеоил-3-стеароилглицерин (POS) или 1-олеоил-2,3-димиристоилглицерин (ОММ). В одном варианте осуществления второй метод биокаталитического синтеза структурного липида включает следующие стадии: (а) обеспечение гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемой в настоящем описании; (b) обеспечение композиции, включающей триацилглицерид (TAG); (с) контактирование полипептида со стадии (а) с композицией со стадии (b) в условиях,когда полипептид гидролизует ацильный остаток в положении Sn1 или Sn3 триацилглицерида (TAG),тем самым продуцируя 1,2-DAG или 2,3-DAG; и (d) стимуляция миграции ацила в 1,2-DAG или 1,3-DAG со стадии (с) в кинетически контролируемых условиях, тем самым получая композицию, включающую 1,3-DAG. Этот второй метод может дополнительно включать обеспечение сложного эфира R1 и R1 специфичной липазы и контактирование 1,3-DAG со стадии (d) со сложным эфиром R1 и R1 специфичной липазой в условиях, когда R1-специфичная гидролаза катализирует этерификацию положения Sn2, тем самым продуцируя структурный липид. Гидролаза, например липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза, предлагаемая в настоящем описании, может представлять собой Sn1- или Sn3 специфичный фермент. Структурный липид может включать любое растительное масло, например масло сои, масло канолы, альтернативу маслу какао (СВА), синтетическое масло какао, природное масло какао,1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерин (POP), 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерин (SOS), 1-пальмитоил-2 олеоил-3-стеароилглицерин (POS) или 1-олеоил-2,3-димиристоилглицерин (ОММ). Сложный эфир R1 может включать часть с более низким насыщением, чем гидролизованный ацильный остаток, в этом случае структурный липид, полученный таким образом, является жиром или маслом с более низкой насыщенностью, чем исходный TAG. Сложный эфир R1 может включать одну или более омега-3-жирных кислот, омега-6-жирных кислот, мононенасыщенных жирных кислот, полиненасыщенных жирных кислот, фосфогруппу, фитостероловый сложный эфир и оризанол. Более конкретно, сложный эфир R1 может включать часть, выбранную из группы, состоящей из альфалиноленовой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты, докозагексаеновой кислоты, гамма-линоленовой кислоты, дигомо-гамма-линоленовой кислоты, арахидоновой кислоты, олеиновой кислоты, пальмолеиновой кислоты, холина, серина, бета-ситостерола, кумэстрола, диэтилстильбэстрола и оризанола. В одном аспекте этого второго метода стадия (d) дополнительно включает использование ионообменных смол. Кинетически контролируемые условия могут включать неравновесные условия, приводящие к продукции конечного продукта, обладающего отношением 1,3-DAG к 2,3-DAG более чем 2:1. Композиция на стадии (b) может включать флуорогенную жирную кислоту (ЖК). Композиция на стадии(b) может включать умбеллифериловый сложный эфир ЖК. Конечный продукт может быть энантиомерно чистым. В одном варианте осуществления метод получения жира или масла с более низкой насыщенностью включает следующие стадии: (а) обеспечение полипептида (гидролазы, например липазы, сатуразы,пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемого в настоящем описании; (b) обеспечение масла или жира;(с) контактирование полипептида со стадии (а) с маслом или жиром со стадии (b) в условиях, когда гидролаза может модифицировать масло или жир, например удалить по меньшей мере одну насыщенную жирную кислоту, например пальмитиновую, стеариновую, лауриновую, каприловую кислоту (октановую кислоту) и тому подобное. Модификация может включать катализируемый гидролазой гидролиз жира или масла. Гидролиз может быть полным или частичным гидролизом жира или масла. Гидролизованное масло может включать сложный эфир глицерина и полиненасыщенной жирной кислоты, который может заменять удаленную насыщенную жирную кислоту, или масло рыб, животных или растительное масло. Растительное масло может включать оливковое масло, масло канолы, подсолнечное, пальмовое, соевое или лауриновое масло либо масло отрубей риса или их сочетание. В одном варианте осуществления метод получения жира или масла более низкой насыщенности,которые могут включать незаменимые жирные кислоты, включает следующие стадии: (а) обеспечение полипептида (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемого в настоящем описании; (b) обеспечение композиции, включающей триацилглицерид (TAG); (с) контактирование полипептида со стадии (а) с композицией со стадии (b) в условиях, когда полипептид гидролизует ацильный остаток в положении Sn1 или Sn3 триацилглицерида (TAG), тем самым продуцируя 1,2-DAG или 2,3-DAG; и (d) стимуляция миграции ацила в 1,2-DAG или 1,3-DAG со стадии (с) в кинетически контролируемых условиях, тем самым получая 1,3-DAG. Метод может дополнительно включать обеспечение сложного эфира R1 и R1-специфичной липазы и контактирование 1,3-DAG со стадии (d) со сложным эфиром R1 и R1-специфичной липазой в условиях,когда R1-специфичная липаза катализирует этерификацию положения Sn2, тем самым продуцируя структурный липид. Сложный эфир R1 может включать часть более низкой насыщенности, чем гидролизованный ацильный остаток, в этом случае структурный липид, полученный таким образом, является жиром или маслом с более низкой насыщенностью, чем исходный TAG. Сложный эфир R1 может включать омега-3-жирную кислоту (альфа-линоленовую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА), докозагексаеновую кислоту (DHA), омега-6-жирную кислоту (гамма-линоленовую, дигомо-гамма-линоленовую кислоту (DGLA) или арахидоновую), мононенасыщенную жирную кислоту (олеиновую, пальмолеиновую и тому подобное), фосфогруппы (холин и серин), фитостероловые сложные эфиры (бета-ситостерол,кумэстрол и диэтилстильбэстрол) и оризанол. Гидролаза, например липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза, предлагаемая в настоящем описании, может представлять собой Sn1- или Sn3-специфичный фермент. Жир или масло более низкой насыщенности могут быть получены с помощью описанного выше гидролиза любого масла водорослей, растительного масла или животного жира либо масла, например масла Neochloris oleoabundans, масла Scenedesmus dimorphus, масла Euglena gracilis, масла PhaeodactylumDunaliella tertiolecta, масла Nannochloris species, масла Spirulina species, масла Chlorophy cease (зеленой водоросли) и масла Bacilliarophy, масла канолы, касторового масла, кокосового масла, масла кориандра,кукурузного масла, хлопкового масла, масла лещины рогатой, льняного масла, масла пенника лугового,оливкового масла, пальмового масла, масла пальмовых зерен, арахисового масла, масла семян рапса,масла отрубей риса, масла сафлора красильного, масла горной камелии, соевого масла, масла семян подсолнечника, таллового масла, масла tsubaki, разнообразных "природных" масел, обладающих измененными составами жирных кислот из-за генетически модифицированных организмов (ГМО) или традиционных "сортов", таких как с высоким содержанием олеиновой кислоты, низким содержанием линоленовой кислоты, или низконасыщенных масел (масла канолы с высоким содержанием олеиновой кислоты,соевого масла с низким содержанием линоленовой кислоты или масел подсолнечника с высоким содержанием стеариновой кислоты); животных жиров (сала, шпика, полутвердого жира и жира цыплят), масел рыб (масла талеихтиса, рыбьего жира, масла хоплостета, масла сардин, масла сельди и масла американской сельди) или смесей любых из указанных выше. Жир или масло с более низкой насыщенностью, полученные таким образом, могут быть использованы в пищевых продуктах или в продуктах хлебопечения, жарения или кулинарии, включающих масла или жиры с более низким содержанием жирных кислот, включая масла с низким содержанием пальмитиновой кислоты, олеиновой кислоты, лауриновой кислоты, стеариновой кислоты, каприловой кислоты (октановой кислоты) и т.д., обработанные с использованием композиции или способа, предлагаемых в настоящем изобретении. В одном варианте осуществления метод очистки смазочного агента включает следующие стадии:(а) обеспечение композиции, включающей гидролазу, (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), предлагаемой в настоящем описании; (b) обеспечение смазочного агента; (с) обработка смазочного агента гидролазой в условиях, когда гидролаза, (например, липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза), предлагаемая в настоящем описании, может избирательно гидролизовать масла в смазочном агенте, тем самым очищая его. Смазочный агент может представлять собой смазочное масло для гидравлических систем. В одном варианте осуществления метод обработки ткани включает следующие стадии: (а) обеспечение композиции, включающей гидролазу (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу),предлагаемой в настоящем описании, где гидролаза может избирательно гидролизовать сложные эфиры карбоновой кислоты; (b) обеспечение ткани; (с) обработка ткани гидролазой в условиях, когда гидролаза может избирательно гидролизовать сложные эфиры карбоновой кислоты, тем самым осуществляя обработку ткани. Обработка ткани может включать улучшение ткани на ощупь и исправление складок конечной ткани, окраску, получение огнезащитного состава, получение гидрофобности, получение оптической яркости или получение прорезиненной обработки. Ткань может включать хлопок, вискозу, искусственный шелк, лиоцелл, льняное полотно, льняную ткань, волокно рами, все их сочетания или их сочетания с полиэфирами, шерстью, полиамидными акриловыми волокнами или полиакриловыми волокнами. В одном варианте осуществления гидролаза, предлагаемая в настоящем описании, включаемая в ткань, пряжу или волокно, может быть адсорбирована, абсорбирована или иммобилизована на поверхности ткани,пряжи или волокна. В одном варианте осуществления метод удаления или снижения количества пищевых или масляных пятен включает контактирование гидролазы, (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемой в настоящем описании, с пищевыми или масляными пятнами в условиях, когда гидролаза может гидролизовать масло или жир в пятне. Гидролаза (например, липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза), предлагаемая в настоящем описании, может иметь повышенную стабильность в отношении денатурации под действием поверхностно-активных веществ и тепловой инактивации. Гидролаза(например, липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза), предлагаемая в настоящем описании, может содержаться в детергенте или растворе для стирки. В одном варианте осуществления диетическая композиция включает гидролазу (например, липазу,сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), предлагаемую в настоящем описании. Диетическая композиция может дополнительно включать питательную основу, включающую жир. Гидролаза может быть активирована с помощью соли желчной кислоты. Диетическая композиция может дополнительно включать состав для детей на основе коровьего молока. Гидролаза может гидролизовать длинноцепочечные жирные кислоты. В одном варианте осуществления метод снижения содержания жира в молоке или диетических композициях на основе растений включает следующие стадии: (а) обеспечение композиции, включающей гидролазу (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), предлагаемый в настоящем описании; (b) обеспечение композиции, включающей молоко или растительное масло; (с) обработка композиции со стадии (b) гидролазой в условиях, когда гидролаза может гидролизовать масло или жир в композиции. В одном варианте осуществления диетическая композиция для человека и нежвачных животных включает питательную основу, где основа включает жир и немного гидролазы или ее отсутствие,и эффективное количество гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемой в настоящем описании, для увеличения всасывания жира и роста человека или нежвачного животного. В одном варианте осуществления метод катализа реакции переэтерификации для получения новых триглицеридов включает следующие стадии: (а) обеспечение композиции, включающей полипептид (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), предлагаемый в настоящем описании, где полипептид может катализировать реакцию переэтерификации; (b) обеспечение смеси триацилглицеридов и свободных жирных кислот; (с) обработка смеси со стадии (b) полипептидом в условиях, когда полипептид может катализировать обмен свободных жирных кислот с ацильными группами триацилглицеридов,тем самым продуцируя новые триацилглицериды, обогащенные добавленными жирными кислотами. Полипептид может представлять собой Sn1,3-специфичную липазу. В одном варианте осуществления метод переэтерификации для получения масла, имеющего низкое содержание транс-кислот и низкое содержание жирных кислот с промежуточными цепями, включает следующие стадии: (а) обеспечение смеси для реакции переэтерификации, включающей материал источника стеариновой кислоты, выбранный из группы, состоящей из стеариновой кислоты, моноэфиров стеариновой кислоты с одноатомными спиртами низкой молекулярной массы и их смесями; (b) обеспечение жидкого растительного масла; (с) обеспечение полипептида (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемого в настоящем описании, где полипептид включает 1,3-специфичную липазную активность; (d) переэтерификация материала источника стеариновой кислоты и триацилглицерида растительного масла; (е) отделение компонентов переэтерифицированных свободных жирных кислот от компонентов триглицеридов смеси для переэтерификации с получением переэтерифицированного продукта маргаринового масла и смеси жирных кислот, включающей жирные кислоты, моноэфиры жирных кислот или их смеси, выделенной из растительного масла; (f) гидрогенизация смеси жирных кислот. В одном варианте осуществления метода переэтерификации реакция переэтерификации продолжается до тех пор, пока существует достаточное равновесие эфирных групп в 1-, 3-положениях глицеридного компонента с неглицеридными компонентами жирных кислот реакционной смеси. В одном варианте осуществления метод получения композиции, включающей 1-пальмитоил-3 стеароил-2-моноолеин (POSt) и 1,3-дистеароил-2-моноолеин (StOSt), включает обеспечение полипептида(например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемого в настоящем описании, где полипептид как 1,3-специфичная липаза способен катализировать переэтерификацию 1,3-дипальмитоил 2-моноолеина (POP) со стеариновой кислотой или тристеарином, и контактирование указанного полипептида с композицией, включающей указанный POP, в присутствии источника стеарина, такого как стеариновая кислота или тристеарин, с получением продукта, обогащенного 1-пальмитоил-3-стеароил-2 моноолеином (POSt) или 1,3-дистеароил-2-моноолеином (StOSt). В одном варианте осуществления метод ослабления или предотвращения токсичности, опосредованной липополисахаридом (LPS), включает введение больному фармацевтической композиции, включающей гидролазу (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), предлагаемую в настоящем описании. В одном варианте осуществления метод детоксикации эндотоксина включает контактирование эндотоксина с гидролазой (например, липазой, сатуразой, пальмитазой и/или стеаратазой), предлагаемой в настоящем описании. В одном варианте осуществления метод дезацетилирования 2'- или 3'цепи жирной кислоты в липиде А включает контактирование липида А с полипептидом, предлагаемым в настоящем описании. В одном варианте осуществления методы изменения субстратной специфичности или субстратной предпочтительности фермента родительской липазы (гидролазы жирных кислот), обладающей аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2,включают стадию создания (вставки) по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более мутаций аминокислотных остатков в SEQ ID NO:2, как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23,создавая тем самым новый гидролазный фермент, обладающий модифицированной аминокислотной последовательностью и измененной субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью по сравнению с родительской липазой (гидролазой жирных кислот), ферментом с SEQ ID NO:2. В одном аспекте субстратная специфичность или предпочтение субстратов нового фермента липазы (гидролазы жирных кислот) включает предпочтительный или повышенный гидролиз пальмитиновой кислоты из масла или субстратная специфичность или предпочтение субстратов нового фермента липазы (гидролазы жирных кислот) включает предпочтительный или повышенный гидролиз стеариновой кислоты из масла. В одном аспекте модифицированная аминокислотная последовательность (по сравнению с "родительской" SEQ ID NO:2) включает модификацию по меньшей мере одной аминокислоты А 48 С; D49R;A225S либо их эквивалентов или их сочетаний и/или модификацию по меньшей мере одного кодона(ACC)188(ACG) или их эквивалентов либо их сочетаний, и субстратная специфичность или предпочтение субстратов нового фермента липазы (гидролазы жирных кислот) включает предпочтительный или повышенный гидролиз пальмитиновой кислоты из масла. В одном аспекте модифицированная аминокислотная последовательность (по сравнению с "родительской" SEQ ID NO:2) включает I20L; V62S;G215V; G215W; А 218 Н; A218S; V223A; А 225 М; A225Q или их сочетание, и субстратная специфичность или предпочтение субстратов нового фермента липазы (гидролазы жирных кислот) включает предпочтительный или повышенный гидролиз стеариновой кислоты из масла. В одном варианте осуществления методы получения фермента, обладающего субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный или повышенный гидролиз пальмитиновой кислоты из масла, включают стадии (а) обеспечения фермента родительской гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), обладающей субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный гидролиз пальмитиновой кислоты из масла, где фермент родительская гидролаза (например, липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза) обладает последовательностью, предлагаемой в настоящем описании; и (b) создания по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более модификаций аминокислотных остатков фермента родительской гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), где модификации аминокислотных остатков соответствуют мутациям аминокислотной последовательностиSEQ ID NO:2, как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, создавая тем самым фермент, обладающий субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный или повышенный гидролиз пальмитиновой кислоты из масла. В одном варианте осуществления методы получения фермента, обладающего субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный или повышенный гидролиз стеариновой кислоты из масла, включают стадии (а) обеспечения фермента родительской гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), обладающей субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный гидролиз стеариновой кислоты из масла, где фермент родительская гидролаза (например, липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза) обладает последовательностью, предлагаемой в настоящем описании; и (b) создания по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более модификаций аминокислотных остатков фермента родительской гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), где модификации аминокислотных остатков соответствуют мутациям аминокислотной последовательностиSEQ ID NO:2, как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, создавая тем самым фермент, обладающий субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный или повышенный гидролиз стеариновой кислоты из масла. В одном варианте осуществления методы получения фермента гидролазы жирных кислот (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), обладающей субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный гидролиз конкретной жирной кислоты, включают стадии (а) обеспечения последовательности фермента гидролазы жирных кислот (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемой в настоящем описании; (b) создания (вставки) по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более мутаций остатков оснований в нуклеиновой кислоте, где мутации соответствуют тем изменениям последовательностей, которые представлены в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23; и (с) тестирования активности вновь полученного фермента на субстратную специфичность или субстратную предпочтительность, включающие предпоч- 14020145 тительный гидролиз конкретной жирной кислоты, тем самым получая новый фермент гидролазу жирных кислот (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), обладающий субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный гидролиз конкретной жирной кислоты. В одном аспекте фермент гидролаза жирных кислот (например, липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза) включает последовательность, как представлено в SEQ ID NO:2. В одном аспекте жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту,пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту. В одном варианте осуществления методы получения фермента гидролазы жирных кислот (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), обладающей субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный гидролиз конкретной жирной кислоты, включают стадии (а) обеспечения кодирующей фермент последовательности нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании; (b) создания (вставки) по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11 или 12 либо более мутаций остатков оснований в нуклеиновой кислоте, где мутации соответствуют тем изменениям последовательностей, которые представлены в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23; и (с) экспрессии полученной нуклеиновой кислоты для получения нового фермента гидролазы жирных кислот(например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), тем самым получая фермент гидролазу жирных кислот (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), обладающий субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный гидролиз конкретной жирной кислоты. В одном аспекте последовательность, кодирующая фермент гидролазу жирных кислот (например,липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), включает последовательность, представленную в SEQ IDNO:1. В одном аспекте жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, линолевую кислоту,олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту. В одном аспекте специфическим субстратом или предпочтительным субстратом нового фермента гидролазы жирных кислот (например,липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) является пальмитиновая кислота по сравнению с субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью в отношении стеариновой кислоты у родительского фермента гидролазы жирных кислот (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) или специфическим субстратом или предпочтительным субстратом нового фермента гидролазы жирных кислот (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) является стеариновая кислота по сравнению с субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью в отношении пальмитиновой кислоты у родительского фермента гидролазы жирных кислот (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы). В одном варианте осуществления липазы включают аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, но включают также модификацию, по меньшей мере, аминокислотного остатка А 48 С; D49R; D61A; D61E; R72E; R72K; V83M; R85Y; Е 95K; Е 116 А; E116I; E116L; E116N; E116Q;R172H; R172L или A225S либо его эквивалента или их сочетаний и/или модификацию по меньшей мере одного кодона (GCG)35(GCT); (GGC)45(GGA); (GCG)92(GCT), (GTG)102(GTT); (AGC)108(AGT);(GTG)183(GTT); (АСС)188(ACG) или его эквивалента либо их сочетания. В одном варианте осуществления липазы включают аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, но включают также модификацию, по меньшей мере, аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H;Y113G; Е 116 Т; E116G; Н 140K; K146S; I167S; L180E; Е 194 М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А 218 Н; A218S; V223A; А 225 М; A225Q или их сочетания. В одном аспекте субстратная специфичность или субстратная предпочтительность новой липазы включает предпочтительный или усиленный гидролиз жирной кислоты из масла по сравнению с "родительской" SEQ ID NO:2. В одном аспекте жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту. Подробности предлагаемых в настоящем описании одного или более вариантов осуществления представлены на сопровождающих чертежах и описании ниже. Другие предлагаемые в настоящем описании черты, цели и преимущества должны быть ясны из описания и чертежей, а также из формулы изобретения. Все публикации, патенты, патентные заявки, последовательности GenBank и депозиты АТСС, цитируемые в настоящем описании, включены, таким образом, определенно в качестве ссылки для всех целей. Описание чертежей Следующие чертежи представляют собой иллюстрацию вариантов осуществления, предлагаемых в настоящем описании, и не предназначены для ограничения объема или формулы изобретения. Файл патента или заявки содержит по меньшей мере одну фигуру, выполненную в цвете. Копии этого патента или публикации патентной заявки с цветной(ми) фигурой(ами) будут предоставлены учреждением по запросу и при оплате необходимого денежного сбора. На фиг. 1 представлена блок-схема компьютерной системы. На фиг. 2 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один аспект процесса сравнения новой нуклеотидной или белковой последовательности с базой данных последовательностей, для определения уровней гомологии между новой последовательностью и последовательностями в базе данных. На фиг. 3 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один аспект процесса сравнения в компьютере, для определения, являются ли две последовательности гомологичными. На фиг. 4 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один аспект процесса идентификации 300, для определения присутствия особенности в последовательности. На фиг. 5 представлен иллюстративный метод, предлагаемый в настоящем описании, включающий использование липаз, предлагаемых в настоящем описании, для обработки липида, например липида из соевого масла, для избирательного гидролиза пальмитиновой кислоты с получением "соевого масла со сниженным содержанием пальмитиновой кислоты". На фиг. 6 а проиллюстрировано влияние иллюстративных мутаций GSSMSM пальмитазы на гидролиз пальмитата и стеарата относительно родительской SEQ ID NO:2, как подробно обсуждается в примере 4 ниже. На фиг. 6b проиллюстрировано влияние иллюстративных мутаций GSSMSM стеаратазы на гидролиз пальмитата и стеарата относительно родительской SEQ ID NO:2, как подробно обсуждается в примере 4 ниже. На фиг. 7 представлена SEQ ID NO:2 с конкретными положениями мутаций пальмитата и стеарата,представленными жирным шрифтом заглавных букв. Подчеркнутые мутации (например, 61 А, Е) представляют собой альтернативные положения аминокислотных остатков (альтернативные последовательности для альтернативных вариантов осуществления) для улучшенного гидролиза пальмитата. Мутации,выделенные курсивом (например, 20L), представляют собой альтернативные положения аминокислотных остатков (альтернативные последовательности для альтернативных вариантов осуществления) для улучшенного гидролиза стеарата. Положение 116 представляет собой альтернативное положение мутированного аминокислотного остатка (альтернативная последовательность для альтернативного варианта осуществления) для улучшенного гидролиза как пальмитата, так и стеарата. На фиг. 8 представлены данные подтверждающего анализа соевого масла для отобранных клонов из пальмитазной библиотеки. Сходные опорные символы на различных чертежах указывают на сходные элементы. Подробное описание Альтернативные варианты осуществления включают полипептиды, включающие липазы, сатуразы,пальмитазы и/или стеаратазы, кодирующие их полинуклеотиды и способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. Альтернативные варианты осуществления включают полипептиды,например ферменты, обладающие гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, включая термостабильную и термоустойчивую гидролазную активность, и кодирующие эти ферменты полинуклеотиды, а также получение и применение этих полинуклеотидов и полипептидов. Гидролазная активность полипептидов и пептидов, предлагаемых в настоящем описании, включает липазную активность (гидролиз липидов), реакции переэтерификации, синтез сложных эфиров, реакции взаимопревращений сложных эфиров, активность ацилгидролазы липидов(LAH) и сходную ферментативную активность. Для целей этой патентной заявки реакции переэтерификации могут включать реакции кислотного гидролиза (включающие реакцию жирной кислоты и триацилглицерида), гидролиза спиртов (включающие реакцию спирта и триацилглицерида), гидролиза глицерина (включающие реакцию глицерина и триацилглицерида) и реакции трансэтерификации (включающие реакцию сложного эфира и триацилглицерида). Полипептиды и пептиды, предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы в разнообразных вариантах фармацевтической, сельскохозяйственной промышленности и промышленном производстве, включая производство косметики и нутрицевтиков. В другом аспекте полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, используются для синтеза энантиомерно чистых хиральных продуктов. В определенных вариантах осуществления ферменты, предлагаемые в настоящем описании, могут быть высокоселективными катализаторами. Они могут обладать способностью катализировать реакции со стерео-, регио- и химиоселективностью, что невозможно в традиционной синтетической химии. В одном варианте осуществления ферменты, предлагаемые в настоящем описании, могут быть многофункциональными. В различных аспектах они могут функционировать в органических растворителях, действовать при экстремальных величинах рН (например, высоких рН и низких рН), экстремальных температурах (например, высоких температурах и низких температурах), экстремальных уровнях солености (например, высокой солености и низкой солености) и катализировать реакции с соединениями, которые структурно не родственны их природным, физиологическим субстратам. В одном аспекте полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, включают гидролазы, обладающие липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, и могут быть использованы, например, в биокаталитическом синтезе структурных липидов (липидов, которые содержат определенный набор жирных кислот, распределенных определенным образом на остове глицерина), включая любое растительное масло, например масло канолы, соевое масло, альтернативы соевому маслу, альтер- 16020145 нативы маслу какао (СВА), 1,3-диацилглицериды (DAG), 2-моноацилглицериды (MAG) и триацилглицериды (TAG), такие как 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерин (POP), 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерин(ОММ), полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты, такие как арахидоновая кислота, докозагексаеновая кислота (DHA) и эйкозапентаеновая кислота (ЕРА). В определенном варианте осуществления предлагаемые в настоящем описании ферменты и методы могут быть использованы для удаления, добавления или обмена любой жирной кислоты в композиции,например получения масла с более низким содержанием насыщенных жирных кислот (например, масла"низкой насыщенности") или с содержанием отличных жирных кислот (например, превращая масло,включающее "насыщенные" жирные кислоты, в масло, включающее альтернативные "ненасыщенные" жирные кислоты). Примеры насыщенных жирных кислот, которые могут быть удалены, добавлены или "реорганизованы" в липиде, например масле, с использованием фермента или с помощью применения методов,предлагаемых в настоящем описании, включают уксусную: СН 3 СООН,масляную: CH3(CH2)2COOH,капроновую: СН 3(СН 2)4 СООН,каприловую: СН 3(СН 2)6 СООН,каприновую: СН 3(СН 2)8 СООН,ундекановую: СН 3 (СН 2)9 СООН,лауриновую (додекановую кислоту): СН 3(СН 2)10 СООН,миристиновую (тетрадекановую кислоту): СН 3(СН 2)12COOH,пентадекановую: СН 3(СН 2)13COOH,пальмитиновую (гексадекановую кислоту): СН 3(СН 2)14 СООН,маргариновую: СН 3(СН 2)15 СООН,стеариновую (октадекановую) : СН 3(СН 2)16 СООН,арахиновую (эйкозановую кислоту): СН 3(СН 2)18COOH,бегеновую: СН 3(СН 2)20 СООН. Примеры омега-3-ненасыщенных жирных кислот, которые могут быть удалены, добавлены или"реорганизованы" в липиде, например масле, с использованием фермента или с помощью применения методов, предлагаемых в настоящем описании, включают-линоленовую (ALA): СН 3 СН 2 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СН(СН 2)7 СООН,стеараиадоновую (октадекатетраеновую): СН 3 СН 2 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СН(СН 2)4 СООН,эйкозапентаеновую (ЕРА): СН 3 СН 2 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СН (СН 2)3 СООН,докозагексаеновую (DHA): СН 3 СН 2 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СН(СН 2)2 СООН. Примеры омега-6-ненасьщенных жирных кислот, которые могут быть удалены, добавлены или "реорганизованы" в липиде, например масле, с использованием фермента или с помощью применения методов, предлагаемых в настоящем описании, включают линолевую (9,12-октадекадиеновую кислоту): СН 3(СН 2) 4 СН=СНСН 2 СН=СН(СН 2)7 СООН,гамма-линолевую (6,9,12-октадекатриеновую кислоту): СН 3(СН 2)4 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СН(СН 2)4 СООН,эйкозадиеновую (11,14-эйкозадиеновую кислоту): СН 3 (СН 2) 4 СН=СНСН 2 СН=СН (СН 2)9 СООН,дигомо-гамма-линоленовую (8,11,14-эйкозатриеновую кислоту): СН 3(СН 2)4 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СН(СН 2)6 СООН,арахидоновую (5,8,11,14-эйкозатетраеновую кислоту): СН 3(СН 2)4 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СН(СН 2)3 СООН,докозадиеновую (13,16-докозадиеновую кислоту): СН 3(СН 2)4 СН=СНСН 2 СН=СН(СН 2)11 СООН,адреналовую (7,10,13,16-докозатетраеновую кислоту): СН 3(СН 2)4 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СН(СН 2)5 СООН,докозапентаеновую (4,7,10,13,16-докозапентаеновую кислоту): СН 3(СН 2)4 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СН(СН 2)2 СООН. Примеры омега-9-жирных кислот, которые могут быть удалены, добавлены или "реорганизованы" в липиде, например в масле, с использованием фермента или с помощью применения методов, предлагаемых в настоящем описании, включают олеиновую (9-октадеценовую кислоту): СН 3(СН 2)7 СН=СН(СН 2)7 СООН,эйкозеновую (11-эйкозеновую кислоту): СН 3(СН 2)7 СН=СН(СН 2)9 СООН,медовую (5,8,11-эйкозатриеновую кислоту): СН 3(СН 2)7 СН=СНСН 2 СН=СНСН 2 СН=СН(СН 2)3 СООН,эуриновую (13-докозеновую кислоту): СН 3(СН 2)7 СН=СН(СН 2)11 СООН,ацетэруковую (15-тетракозеновую кислоту): СН 3(СН 2)7 СН=СН(СН 2)13 СООН,пальмитолеиновую: СН 3(СН 2)7 СН=СН(СН 2)5 СООН. В одном аспекте в настоящем описании предлагаются новые классы липаз, обозначаемых "сатуразами", например "пальмитазами" и "стеаратазами". Термин "стеаратаза", как ранее использовалось в литературе, описывает фермент, который осуществляет насыщение конкретных связей в метаболическом пути, например гидрирование двойной связи (Moise, et. al., J. Biol. Chem., 2005, 280 (30):27815-27825). Однако в настоящем описании предлагаются новые, не описанные ранее "сатуразы", где сатуразы, описанные в настоящем описании, гидролизуют сложные эфиры насыщенных жирных кислот, где гидролизуемые сложные эфиры могут представлять собой сложные эфиры насыщенных жирных кислот и глицерина, умбеллиферола или других спиртов. В настоящем описании предлагаются также не описанные ранее "пальмитазы" и "стеаратазы", где пальмитазы и стеаратазы гидролизуют пальмитиновую кислоту и стеариновую кислоту соответственно,например, из каркаса глицерина. Описанные в настоящем документе "сатуразы" могут также обозначаться как "гидролазы насыщенных жирных кислот". Сходно, "пальмитазы", описанные в настоящем документе, могут также обозначаться как "гидролазы пальмитата", и "стеаратазы", описанные в настоящем документе, могут также обозначаться как "гидролазы стеарата". В другом аспекте сатуразы, описанные в настоящем документе, избирательно гидролизуют по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% насыщенных жирных кислот. В другом аспекте пальмитазы, описанные в настоящем документе, избирательно гидролизуют жирные кислоты, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой пальмитиновую кислоту. В другом аспекте стеаратазы, описанные в настоящем документе,избирательно гидролизуют жирные кислоты, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой стеариновую кислоту. В одном аспекте, как проиллюстрировано на фиг. 5, с помощью методов использования фермента,предлагаемого в настоящем описании, можно обрабатывать липид, например липид из соевого или другого растительного масла, для избирательного гидролиза насыщенной жирной кислоты, например пальмитиновой или стеариновой кислоты (например, из масла, содержащего эти насыщенные жирные кислоты), с получением "низко (или более низко) насыщенного масла", например "восстановленного пальмитинового масла", такого как "восстановленное пальмитиновое растительное масло", например "восстановленное пальмитиновое соевое масло". Предлагаемые в настоящем описании ферменты могут быть также использованы для избирательного гидролиза любой жирной кислоты, особенно насыщенных жирных кислот из каркаса глицерина с получением "низко (или более низко) насыщенного масла", включая избирательный гидролиз насыщенной жирной кислоты, например пальмитиновой кислоты или стеариновой кислоты, в положениях Sn1 или Sn2 каркаса глицерина в дополнение к гидролизу в положении Sn3(например, гидролиз пальмитиновой кислоты в положении Sn3 проиллюстрирован на фиг. 5). В одном аспекте предлагаются примеры синтеза триглицеридов, масел или жиров низкой насыщенности. В этом примере синтеза могут использоваться либо свободные жирные кислоты, либо сложные эфиры жирных кислот в зависимости от используемого фермента. В одном аспекте гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, предлагаемые в настоящем описании, используются для удаления или гидролиза насыщенных жирных кислот, таких как уксусная кислота, масляная кислота,капроновая кислота, каприловая кислота, каприновая кислота, ундекановая кислота, лауриновая кислота,миристиновая кислота, пентадекановая кислота, пальмитиновая кислота, маргариновая кислота, стеариновая кислота, арахиновая кислота или бегеновая кислота, из триглицерида, масла или жира. В одном аспекте удаленные или гидролизованные жирные кислоты заменяют жирными кислотами с улучшенными преимуществами для здоровья (такими как пониженная корреляция с сердечно-сосудистым заболеванием) или с улучшенными химическими свойствами (такими как стабильность к окислению или реакци- 18020145 онная способность) либо с улучшенными физическими свойствами (такими как точка плавления или вкусовое ощущение). В одном аспекте добавляемыми жирными кислотами являются омега-3 ненасыщенные жирные кислоты, такие как -линоленовая кислота, стеаридоновая кислота, эйкозапентаеновая кислота (ЕРА) или докозагексаеновая кислота (DHA), или ПНЖК, или жирные кислоты масел рыб. В одном аспекте добавляемыми жирными кислотами являются омега-6-ненасыщенные жирные кислоты, такие как линолевая кислота, гамма-линолевая кислота, эйкозадиеновая кислота, дигомо-гаммалиноленовая кислота, арахидоновая кислота, докозадиеновая кислота, адреналовая кислота или докозапентаеновая кислота. В одном аспекте добавляемыми жирными кислотами являются омега-9 ненасыщенные жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, эйкозеновая кислота, медовая кислота,эуриновая кислота, ацетэруковая кислота, пальмитолеиновая кислота. В одном аспекте добавляемые жирные кислоты (например, омега-3, омега-6 или омега-9) добавляют путем взаимодействия жирных кислот с триглицеридами, маслом или жиром после удаления или гидролиза насыщенных жирных кислот с помощью гидролаз, например липаз, сатураз, пальмитаз и/или стеаратаз, предлагаемых в настоящем описании. В одном аспекте добавляемые жирные кислоты (например, омега-3, омега-6 или омега-9) добавляют в результате взаимодействия сложных эфиров жирных кислот или этиловых или метиловых эфиров с триглицеридами, маслом или жиром после удаления или гидролиза насыщенных жирных кислот с помощью гидролаз, например липаз, сатураз, пальмитаз и/или стеаратаз, предлагаемых в настоящем описании. В одном аспекте взаимодействие с добавляемыми жирными кислотами (например, омега 3, омега-6 или омега-9) катализируется с помощью гидролазы или липазы, таких как неспецифичная липаза (включая нерегиоспецифичную и не специфичную для жирных кислот), или Sn1,3-специфичная липаза, или Sn1-специфичная липаза, или Sn3-специфичная липаза, или Sn2-специфичная липаза, или липаза, специфичная для жирных кислот. Способы и композиции (гидролаз, например липаз, сатураз, пальмитаз и/или стеаратаз), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для получения нутрицевтиков (например, полиненасыщенных жирных кислот и масел), различных пищевых продуктов и пищевых добавок (например,эмульгаторов, заменителей жира, маргаринов и бутербродных паст), косметики (например, эмульгаторов,кремов), фармацевтических агентов и агентов для доставки лекарств (например, липосом, таблеток, составов) и добавок в корма для животных (например, полиненасыщенных жирных кислот, таких как линоленовые кислоты). В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании липазы могут действовать на сложные эфиры флуорогенных жирных кислот (ЖК), например умбеллифериловые сложные эфиры ЖК. В одном аспекте профили специфичности в отношении ЖК липаз, полученных или модифицированных с помощью методов, предлагаемых в настоящем описании, могут быть получены путем измерения их относительных активностей на серии умбеллифериловых сложных эфиров ЖК, таких как пальмитат, стеарат, олеат, лаурат, ПНЖК или бутират. В одном аспекте полипептид (например, антитело или фермент, например липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза), предлагаемый в настоящем описании для этих реакций, иммобилизован, например, как описано ниже. В альтернативных аспектах предлагаемые в настоящем описании методы не требуют органического растворителя, могут протекать с относительно высокими скоростями реакций; см.,например, патенты США 5552317; 5834259. В определенных вариантах осуществления методы и композиции (липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для гидролиза (включая избирательный гидролиз) масел, таких как масло рыб, животные и растительные масла, и липидов,таких как полиненасыщенные жирные кислоты. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании полипептиды используются для получения масел низкой насыщенности, например, с помощью удаления(гидролиза) по меньшей мере одной жирной кислоты из масла; и гидролиз может представлять собой избирательный гидролиз, например удаление только конкретной жирной кислоты, такой как пальмитиновая, стеариновая или другая насыщенная жирная кислота, или удаление жирной кислоты именно из одного положения, например Sn1, Sn2 или Sn3. В одном аспекте полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, используются для обработки жирных кислот (таких как полиненасыщенные жирные кислоты), например жирные кислоты масла рыб, например, для применения в пищевых продуктах или пищевых добавках или в виде них, или для кулинарии, жарения, хлебопечения, или в виде пищевого масла. В другом варианте осуществления методы и композиции (липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для избирательного гидролиза насыщенных сложных эфиров по сравнению с ненасыщенными сложными эфирами в кислотах или спиртах. В другом варианте осуществления методы и композиции (липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для обработки латексов для различных целей, например для обработки латексов, используемых в композициях для фиксации волос для удаления неприятных запахов. В другом варианте осуществления методы и композиции (липазы,сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для лечения дефицита липазы у животного, например млекопитающего, такого как человек. В другом варианте осуществления методы и композиции (липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для получения смазочных агентов, таких как смазочные масла для гидравлических систем. В другом варианте осуществления методы и композиции(липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для получения и использования детергентов. В другом варианте осуществления методы и композиции (липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы в процессах химической обработки тканей, волокон или пряжи. В одном аспекте методы и композиции (липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для получения огнезащитного состава, используемого в ткани, например галогензамещенной карбоновой кислоты или ее сложного эфира, т.е. фторированной, хлорированной или бромированной карбоновой кислоты или ее сложного эфира. В одном аспекте предлагаются методы создания липаз из библиотек окружающей среды. В одном варианте осуществления "гидролазы", предлагаемые в настоящем описании, охватывают полипептиды (например, антитела, ферменты) и пептиды (например, "активные сайты"), обладающие какой-либо гидролазной активностью, т.е. полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, могут иметь любую гидролазную активность, включая, например, липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность. В другом варианте осуществления "гидролазы", предлагаемые в настоящем описании, включают все полипептиды, обладающие какой-либо липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, включая активность синтеза липидов или гидролиза липидов, т.е. полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, могут иметь любую липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность. В другом варианте осуществления липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, предлагаемые в настоящем описании, включают ферменты, активные в отношении биопревращения липидов путем реакций каталитического гидролиза, гидролиза спиртов, кислотного гидролиза, этерификации и аминолиза. В одном аспекте гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут гидролизовать эмульсии липидов. В одном аспекте ферменты, предлагаемые в настоящем описании, могут действовать предпочтительно на связи Sn1, Sn2 и/или Sn3 триацилглицеридов с высвобождением одной или более жирных кислот из каркаса глицерина. Например, гидролазная, липазная, сатуразная, пальмитазная и/или стеаратазная активность полипептидов, предлагаемых в настоящем описании, включает синтез масла какао, полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), 1,3-диацилглицеридов (DAG), 2-моноацилглицеридов (MAG) и триацилглицеридов (TAG). В другом варианте осуществления липазная, сатуразная, пальмитазная и/или стеаратазная активность полипептидов, предлагаемых в настоящем описании, также включает продукцию масел низкой насыщенности, например масла сои или канолы, путем удаления жирной кислоты, например пальмитиновой, олеиновой, лауриновой или стеариновой кислоты. В альтернативных аспектах предлагаемые в настоящем описании ферменты могут также гидролизовать и/или изомеризовать связи при высоких температурах, низких температурах, щелочных рН и кислых рН. В одном аспекте гидролаза,например липаза, предлагаемая в настоящем описании, представляет собой сатуразу, которая катализирует реакции гидролиза, гидролиза спиртов, кислотного гидролиза, этерификации и аминолиза, где карбоновая или жирная кислота в образованной или прореагировавшей молекуле представляет собой насыщенную жирную кислоту, такую как уксусная кислота, масляная кислота, лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота или арахиновая кислота. В одном аспекте гидролаза, например липаза или сатураза, предлагаемая в настоящем описании, представляет собой пальмитазу, которая катализирует реакции гидролиза, гидролиза спиртов, кислотного гидролиза, этерификации и аминолиза, где карбоновая или жирная кислота в образованной или прореагировавшей молекуле представляет собой пальмитиновую кислоту. В одном аспекте гидролаза, например липаза или сатураза, предлагаемая в настоящем описании, представляет собой стеаратазу, которая катализирует реакции гидролиза, гидролиза спиртов, кислотного гидролиза, этерификации и аминолиза, где карбоновая или жирная кислота в образованной или прореагировавшей молекуле представляет собой стеариновую кислоту. В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются ферменты, включающие варианты ферментов гидролаз (например, "вариант липазы", "вариант сатуразы", "вариант пальмитазы" или "вариант стеаратазы"), предлагаемые в настоящем описании; эти ферменты могут иметь аминокислотную последовательность, которая происходит от аминокислотной последовательности"предшественника". Предшественник может включать природную гидролазу и/или рекомбинантную гидролазу. Аминокислотная последовательность варианта гидролазы "происходит" от аминокислотной последовательности предшественника гидролазы в результате замены, делеции или вставки одной или более аминокислот в аминокислотную последовательность предшественника. Такая модификация осуществляется в "последовательности ДНК предшественника", которая кодирует аминокислотную последовательность предшественника липазы, а не за счет манипуляции с самим предшественником фермента гидролазы. Подходящие методы для такой модификации последовательности ДНК предшественника включают методы, раскрытые в настоящем описании, а также методы, известные специалистам в данной области техники. Получение нуклеиновых кислот и манипуляции с ними. В одном аспекте в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, включая экспрессион- 20020145 ные кассеты, такие как экспрессионные векторы, кодирующие полипептиды (например, гидролазы, такие как липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы). В другом аспекте в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, обладающие последовательностью, представленной SEQ ID NO:1, и имеющие по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более или все замены остатков оснований,как описано в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23 (или их эквиваленты). В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, обладающие последовательностью, представленной SEQ ID NO:2, и имеющие по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11 или 12 либо более или все замены аминокислотных остатков, как описано в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23 (или их эквиваленты). В настоящем описании предлагаются методы раскрытия новых последовательностей гидролаз с использованием нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем описании. Предлагаются также методы модификации нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем описании, с помощью, например, методов GSSMSM и GeneReassemblySM. Нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, могут быть получены, выделены и/или с ними могут проводиться манипуляции с помощью, например, клонирования и экспрессии библиотек кДНК, амплификации матрицы или геномной ДНК путем ПЦР и тому подобного. Исходными источниками отобранных иллюстративных полипептидов и нуклеиновых кислот являются При применении предлагаемых в настоящем описании методов гомологичные гены могут быть модифицированы с помощью манипуляций с матричной нуклеиновой кислотой, как описано в настоящем документе. Заявленный предмет изобретения может быть осуществлен на практике в сочетании с любым методом или протоколом, или устройством, известным в данной области техники, которые хорошо описаны в научной и патентной литературе. Общие методы. В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, включающие РНК, РНК-i (например, si-РНК, mi-РНК), антисмысловую нуклеиновую кислоту,кДНК, геномную ДНК, векторы, вирусы или их гибриды, нуклеиновые кислоты, выделенные из различных источников, созданные с помощью генной инженерии, амплифицированные и/или экспрессированные/созданные с помощью рекомбинации. Рекомбинантные полипептиды, полученные из этих нуклеиновых кислот, могут быть индивидуально выделены или клонированы и протестированы на желаемую активность (например, гидролазную, такую как, например, липазная, сатуразная, пальмитазная и/или стеаратазная активность). Может быть использована любая рекомбинантная экспрессионная система, включая бактериальную систему, систему млекопитающих, дрожжей, грибов, насекомых или экспрессионные системы растительных клеток. Альтернативно, эти нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы in vitro с помощью хорошо известных методов химического синтеза, как описано, например, в Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth.Enzymol. 68: 109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; патенте США 4458066. Способы проведения манипуляций с нуклеиновыми кислотами, такие как, например, субклонирование, мечение зондов (например, мечение случайных праймеров с использованием полимеразы Кленова, ник-трансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и тому подобное, хорошо описаны в научной и патентной литературе, см., например, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS INPROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993). Другими полезными способами получения и манипуляций с нуклеиновыми кислотами, используемыми для осуществления методов, предлагаемых в настоящем описании, является клонирование из геномных образцов, и, если это желательно, скрининг и повторное клонирование вставок, выделенных или амплифицированных, например, из геномных клонов или клонов кДНК. Источники нуклеиновой кислоты, используемой в методах, предлагаемых в настоящем описании, включают библиотеки геномной или кДНК, содержащиеся, например, в искусственных хромосомах млекопитающих (MAC), см., например,патенты США 5721118; 6025155; искусственные хромосомы человека, см., например, Rosenfeld(1997) Nat. Genet. 15:333-335; искусственные хромосомы дрожжей (YAC); искусственные хромосомы бактерий (ВАС); искусственные хромосомы Р 1, см., например, Woon (1998) Genomics 50:306-316; происходящие от Р 1 векторы, (РАС), см., например, Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; космиды, рекомбинантные вирусы, фаги или плазмиды. Выражения "нуклеиновая кислота" или "последовательность нуклеиновой кислоты" могут включать олигонуклеотид, нуклеотид, полинуклеотид или фрагмент любого из перечисленного, ДНК или РНК(например, мРНК, рРНК, тРНК, РНК-i) геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут представлять собой смысловую или антисмысловую цепь, нуклеиновую кислоту пептида (PNA) или любое ДНК-подобное или РНК-подобное вещество,природного или синтетического происхождения, например РНК-i (двухцепочечную "интерферирующую" РНК), рибонуклеопротеиды (например, iRNP). Термин охватывает нуклеиновые кислоты, т.е. олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. Термин также охватывает структуры,подобные нуклеиновым кислотам, с синтетическими каркасами, см., например, Mata (1997) Toxicol. Appl.Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156. Применяемый в настоящем описании термин "промотор" включает все последовательности, способные управлять транскрипцией кодирующей последовательности в клетке, например в растительной клетке. Таким образом, промоторы, используемые в конструктах, предлагаемых в настоящем описании,включают цис-действующие элементы, контролирующие транскрипцию, и регуляторные последовательности, которые вовлечены в регуляцию или модуляцию синхронизации и/или скорости транскрипции гена. Например, промотор может представлять собой цис-действующий элемент, контролирующий транскрипцию, включающий энхансер, промотор, терминатор транскрипции, ориджин репликации, последовательность хромосомной интеграции, 5'- и 3'-нетранслируемые области или последовательность интронов, которые вовлечены в регуляцию транскрипции. Эти цис-действующие последовательности обычно взаимодействуют с белками или другими биологическими молекулами для осуществления (включения/выключения, регуляции, модуляции и т.д.) транскрипции. "Конститутивные" промоторы представляют собой промоторы, которые управляют экспрессией постоянно при большинстве условий окружающей среды и стадий развития или клеточной дифференцировки. "Индуцибельные" или "регулируемые" промоторы управляют экспрессией нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, под влиянием условий окружающей среды или условий развития. Примеры условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию под действием индуцибельных промоторов, включают анаэробные условия, повышенную температуру, засушливость или присутствие света."Тканеспецифические" промоторы представляют собой элементы, контролирующие транскрипцию,которые активны только в определенных клетках или тканях либо органах, например, у растений или животных. Тканеспецифическая регуляция может быть достигнута с помощью определенных внутренних факторов, которые гарантируют экспрессию генов, кодирующих белки, специфичные для данной ткани. Такие факторы, как известно, существуют у млекопитающих и растений, что позволяет развиваться специфическим тканям. Термин "растение" включает целые растения, части растений (например, листья, стебли, цветы,корни и т.д.), растительные протопласты, семена и растительные клетки и их потомство. Класс растений,который может быть использован в методе, предлагаемом в настоящем описании, обычно широк настолько, что включает класс высших растений, поддающийся методам трансформации, включая покрытосеменные (однодольные и двудольные растения), а также голосеменные. Он включает растения различных уровней плоидности, включая полиплоидные, диплоидные, гаплоидные и гемизиготные состояния. Применяемый в настоящем описании термин "трансгенное растение" включает растения или растительные клетки, в которые вставлена последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты, например нуклеиновых кислот и различных рекомбинантных конструктов (например, экспрессионных кассет),предлагаемых в настоящем описании. В одном аспекте нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, предлагаемый в настоящем описании, соединена в подходящей фазе с лидирующей последовательностью, способной управлять секрецией транслированного полипептида или его фрагмента. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются слитые белки и кодирующие их нуклеиновые кислоты. Полипептид, предлагаемый в настоящем описании, может быть соединен с гетерологичным пептидом или полипептидом, таким как N-концевые идентифицирующие пептиды, которые придают желаемые характеристики, такие как повышенная стабильность или упрощенная очистка. Пептиды и полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, могут быть также синтезированы и экспрессированы в виде слитых белков с одним или более соединенными с ними дополнительными доменами, например, для продукции более иммуногенного пептида, для более легкого выделения пептида, синтезированного рекомбинантным способом, для идентификации и выделения антител и экспрессирующих антител В-клеток и тому подобное. Облегчающие определение и очистку домены включают, например,пептиды, хелатирующие металлы, такие как полигистидиновые тракты и гистидин-триптофановые модули, которые дают возможность проводить очистку на иммобилизованных металлах, домены протеина А,которые дают возможность проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, использующий систему расширения FLAGS/аффинную очистку (Immunex Corp, Seattle WA). Включение последовательности расщепляющего линкера, такого как фактор Ха, или последовательностей расщепления энтерокиназой (Invitrogen, San Diego CA) между доменом очистки и включающим мотив пептидом или полипептидом может облегчить очистку. Например, экспрессионный вектор может включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей эпитоп, связанную с шестью гистидиновыми остатками с последующим тиоредоксином и сайтом расщепления энтерокиназой (см., например, Williams (1995)Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414). Гистидиновые остатки облегчают определение и очистку, тогда как сайт расщепления энтерокиназой обеспечивает способ очистки эпитопа из оставшегося слитого белка. Способ, применяемый к векторам, кодирующим слитые белки, и применение слитых белков хорошо описаны в научной и патентной литературе, см., например, Kroll(1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53. Последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию. В другом варианте осуществления в настоящем описании предлагаются последовательности нуклеиновых кислот (например, ДНК, i-РНК), функционально связанные с последовательностью(тями), контролирующей(ими) экспрессию, например, промоторами или энхансерами, для управления или модуляции синтеза/экспрессии РНК. Последовательность, контролирующая экспрессию, может находиться в экспрессионном векторе. Примеры бактериальных промоторов включают lacI, lacZ, Т 3, Т 7, gpt, лямбдаPR, PL и trp. Примеры эукариотных промоторов включают немедленно-ранний CMV, тимидинкиназуHSV, ранний и поздний SV40, LTR из ретровируса и металлотионеин мыши. Промоторы, подходящие для экспрессии полипептида в бактериях, включают промоторы lac или trpE. coli, промотор lacI, промотор lacZ, промотор Т 3, промотор Т 7, промотор gpt, промотор лямбда PR,промотор лямбда PL, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3 фосфоглицераткиназа (PGK), и промотор кислой фосфатазы. Эукариотные промоторы включают немедленно-ранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промотор SV40, LTR из ретровирусов и промотор металлотионеина-I мыши. Могут быть также использованы другие промоторы,известные как контролирующие экспрессию генов в прокариотных или эукариотных клетках или соответствующих вирусах. Тканеспецифические промоторы растений. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются экспрессионные кассеты,которые могут экспрессироваться тканеспецифически, например которые могут экспрессировать гидро- 26020145 лазу, предлагаемую в настоящем описании, тканеспецифически. В другом варианте осуществления в настоящем описании предлагаются растения или семена, которые экспрессируют гидролазу, предлагаемую в настоящем описании, тканеспецифически. Тканеспецифичность может представлять собой специфичность для семян, специфичность для стебля, специфичность для листьев, специфичность для корней,специфичность для плодов и тому подобное. В одном аспекте конститутивный промотор, такой как CaMV 35S, может быть использован для экспрессии в конкретных частях растения или семян либо во всем растении. Например, для гиперэкспрессии гидролазы, предлагаемой в настоящем описании, может применяться фрагмент растительного промотора, который будет управлять экспрессией нуклеиновой кислоты в некоторых или во всех тканях растения, например регенерированного растения. Такие "конститутивные" промоторы активны при большинстве условий окружающей среды и стадий развития или клеточной дифференцировки. Примеры конститутивных промоторов включают область инициации транскрипции вируса мозаики цветной капусты(CaMV) 35S, 1'- или 2'-промотор, происходящий от Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens, и другие области инициации транскрипции из различных растительных генов, известные специалистам в данной области техники. Такие гены включают, например, АСТ 11 из Arabidopsis (Huang (1996) Plant Mol Biol. 33:125139); Cat3 из Arabidopsis (GenBank No. U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251:196-203); ген, кодирующий стеароил-ацил-переносящий белок десатуразу из Brassica napus (Genbank No. X74782, Solocombe (1994) Plant Physiol. 104: 1167-1176); GPc1 из маиса (GenBank No. X15596; Martinez (1989) J. Mol.Biol 208:551-565); Gpc2 из маиса (GenBank No. U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33:97-112); растительные промоторы, описанные в патентах США 4962028; 5633440. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются тканеспецифические или конститутивные промоторы, происходящие от вирусов, которые могут включать, например, субгеномный промотор тобамовируса (Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1679-1683); палочковидный тунгро-вирус риса (RTBV), который реплицируется только в клетках флоэмы у инфицированных растений риса, с его промотором, который управляет усиленной специфичной для флоэмы экспрессией репортерного гена; промотор вируса мозаики жилок маниоки (CVMV) с наибольшей активностью в элементах сосудов, в мезофильных клетках листьев и в верхушках корня (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31: 11291139). Альтернативно, растительный промотор может управлять экспрессией нуклеиновой кислоты, экспрессирующей гидролазу, в конкретной ткани, органе или типе клеток (т.е. тканеспецифические промоторы) или может находиться другим образом под более точным контролем окружающей среды или стадий развития либо под контролем индуцибельного промотора. Примеры условий окружающей среды,которые могут влиять на транскрипцию, включают анаэробные условия, повышенную температуру, присутствие света или опыление химикатами/гормонами. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются индуцируемые засухой промоторы маиса (Busk (1997) выше); индуцируемый холодом, засухой и высокой концентрацией соли промотор из картофеля (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33:8 97 909). Тканеспецифические промоторы могут стимулировать транскрипцию только в пределах определенной временной рамки или стадии развития в этой ткани; см., например, Blazquez (1998) Plant Cell 10:791-800, охарактеризовавшего промотор гена LEAFY Arabidopsis; см. также Cardon (1997) Plant J 12:367-77, описавшего транскрипционный фактор SPL3, который узнает консервативный мотив последовательности в области промотора гена API идентичности меристемы цветка A. Thaliana; и Mandel (1995)Plant Molecular Biology, Vol. 29, p. 995-1004, описавшего промотор eIF4 меристемы. Могут быть использованы тканеспецифические промоторы, которые активны в течение жизненного цикла конкретной ткани. В одном аспекте нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, функционально связаны с промотором, активным главным образом только в клетках волокон хлопка. В одном аспекте нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, функционально связаны с промотором, активным главным образом в течение стадий удлинения клеток волокон хлопка, например, как описаноRinehart (1996) выше. Нуклеиновые кислоты могут быть функционально связаны с промотором генаFbl2A для предпочтительной экспрессии в клетках волокон хлопка (там же); см. также John (1997) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89:5769-5773; John, et al., патенты США 5608148 и 5602321, описывающих промоторы, специфические для волокон хлопка, и методы создания трансгенных растений хлопка. Для экспрессии нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем описании, могут также использоваться промоторы, специфические для корней. Примеры промоторов, специфические для корней, включают промотор гена алкогольдегидрогеназы (DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123:39-60). Другие промоторы, которые могут быть использованы для экспрессии нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем описании,включают, например, специфические для семяпочки, эмбриоспецифические, специфические для эндосперма, специфические для покрова семяпочки, специфические для семенной оболочки или некоторые их сочетания; специфический для листьев промотор (см., например, Busk (1997) Plant J. 11:1285 1295, описывающего специфический для листьев промотор маиса; промотор ORF13 из Agrobacterium rhizogenes(который проявляет высокую активность в корнях, см., например, Hansen (1997) выше); специфический промотор пыльцы маиса (см., например, Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224:161 168); может быть ис- 27020145 пользован промотор томата, активный в течение созревания плодов, старения и опадания листьев и в меньшей степени цветов (см., например, Blume (1997) Plant J. 12:731 746); специфический для пестика промотор гена SK2 картофеля (см., например, Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35:425 431); ген Blec4 из гороха, который активен в эпидермальной ткани точек роста вегетативных и цветочных побегов трансгенной люцерны, делая ее удобным инструментом для направленной экспрессии чужеродных генов в эпидермальном слое активно растущих побегов или волокон; специфический для семяпочки ген BEL1 (см.,например, Reiser (1995) Cell 83:735-742, GenBank No. U39944) и/или промотор в патенте США 5589583 от Klee, описывающем область растительного промотора, способную придавать высокие уровни транскрипции в ткани меристемы и/или быстро делящихся клетках. Альтернативно, для экспрессии нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем описании, используются растительные промоторы, которые индуцируются при экспозиции с гормонами растений, такими как ауксины. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются промоторы, включающие ауксинчувствительные элементы Е 1 фрагмента промотора (AuxRE) в сое (Glycine max L.) (Liu(1997) Plant Physiol. 115:397-407); ауксинчувствительный промотор GST6 Arabidopsis (отвечающий также на салициловую кислоту и перекись водорода) (Chen (1996) Plant J. 10: 955-966); индуцируемый ауксином промотор parC из табака (Sakai (1996) 37:906-913); растительный биотинчувствительный элемент(Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937) и промотор, отвечающий на гормон стресса абсцизовую кислоту (Sheen (1996) Science 274:1900-1902). Нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, могут быть также функционально связаны с растительными промоторами, которые индуцируются при экспозиции с химическими реагентами, которые могут быть применимы для растения, такими как гербициды или антибиотики. Например,может быть использован промотор In2-2 маиса, активируемый бензолсульфонамидными гербицидными антидотами (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577); применение различных гербицидных антидотов индуцирует отчетливую экспрессию паттернов генов, включая экспрессию в корне, гидатодах и апикальной меристеме побегов. Кодирующие последовательности могут находиться под контролем, например, промотора, индуцируемого тетрациклином, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы Avena sativa L. (овса) (Masgrau (1997) Plant J. 11:465473); или чувствительного к салициловой кислоте элемента (Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324). При использовании промоторов, индуцируемых химически (например, гормоном или пестицидом), т.е. промоторов, чувствительных к химическим агентам, которые могут быть применены к трансгенным растениям в полевых условиях, экспрессия полипептида, предлагаемого в настоящем описании, может быть индуцирована на конкретной стадии развития растения. В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются трансгенные растения, содержащие индуцибельный ген, кодирующий полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, диапазон хозяев которого ограничивается такими видами растений-мишеней, как кукуруза, рис, ячмень, пшеница, картофель или другие сельскохозяйственные культуры, который индуцируется на любой стадии развития сельскохозяйственной культуры. Тканеспецифические растительные промоторы могут управлять экспрессией функционально связанных последовательностей в тканях, отличных от ткани-мишени. Таким образом, тканеспецифический промотор представляет собой промотор, который управляет экспрессией преимущественно в тканимишени или клеточном типе, но может также вести к некоторой экспрессии в других тканях. Нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, могут быть также функционально связаны с растительными промоторами, которые индуцируются при экспозиции с химическими реагентами. Эти реагенты включают, например, гербициды, синтетические ауксины или антибиотики, которые могут быть применены, например, при распылении на трансгенные растения. Индуцибельная экспрессия предлагаемых в настоящем описании нуклеиновых кислот, продуцирующих гидролазу, должна позволять садоводу отбирать растения с оптимальным соотношением крахмал:сахар. Таким образом, может контролироваться развитие частей растения. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются средства для облегчения сбора растений и частей растений. Например, в различных вариантах осуществления используется промотор In2-2 маиса, активируемый бензолсульфонамидными гербицидными антидотами (De Veylder(1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577); применение различных гербицидных антидотов индуцирует отчетливую экспрессию паттернов генов, включая экспрессию в корне, гидатодах и апикальной меристеме побегов. Кодирующие последовательности, предлагаемые в настоящем описании, также находятся под контролем промотора, индуцируемого тетрациклином, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы Avena sativa L. (овса) (Masgrau (1997) Plant J. 11:465473); или чувствительного к салициловой кислоте элемента (Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324). Если желательна подходящая экспрессия полипептида, должна быть включена область полиаденилирования на 3'-конце кодирующей области. Область полиаденилирования может происходить от природного гена, от различных других растительных генов или от генов агробактериальной Т-ДНК. Экспрессионные векторы и носители для клонирования. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются экспрессионные векторы,экспрессионные кассеты и носители для клонирования, включающие нуклеиновые кислоты, например последовательности, кодирующие гидролазы и антитела. Экспрессионные векторы и носители для клонирования, предлагаемые в настоящем описании, могут включать вирусные частицы, бакуловирус, фаг,плазмиды, фагемиды, космиды, фосмиды, искусственные хромосомы бактерий, ДНК вирусов (например,вируса коровьей оспы, аденовируса, поксвируса птиц, вируса ложного бешенства и производные SV40),искусственные хромосомы на основе Р 1, дрожжевые плазмиды, искусственные хромосомы дрожжей и любые другие векторы, специфические для конкретных интересующих хозяев (таких как бацилла, Aspergillus и дрожжи). Предлагаемые в настоящем описании векторы могут включать последовательности хромосомной, нехромосомной и синтетической ДНК. Большое количество подходящих векторов известно специалистам в данной области техники, и они имеются в продаже. Примеры векторов включают векторы pQE (Qiagen), плазмиды pBLUESCRIPT, векторы pNH, (векторы лямбда-ZAP (Stratagene); ptrc99a,pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eukaryotic: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG,pSVLSV40 (Pharmacia). Однако могут быть использованы какая-либо другая плазмида или другой вектор до тех пор, пока они способны к репликации и выживанию в хозяине. Могут применяться векторы с низким количеством копий или с высоким количеством копий. В одном варианте осуществления "экспрессионная кассета", предлагаемая в настоящем описании,включает нуклеотидную последовательность, которая способна влиять на экспрессию структурного гена(т.е. кодирующую белок последовательность, такую как гидролаза, предлагаемая в настоящем описании) в хозяине, совместимом с такими последовательностями. Экспрессионные кассеты включают, по меньшей мере, промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей полипептид; и, необязательно, с другими последовательностями, например сигналами терминации транскрипции. Могут также использоваться дополнительные факторы,необходимые или полезные для влияния на экспрессию, например энхансеры. Применяемый в настоящем описании термин "функционально связанный" относится к связи промотора выше от последовательности ДНК, так что промотор опосредует транскрипцию последовательности ДНК. Таким образом,экспрессионные кассеты включают также плазмиды, экспрессионные векторы, рекомбинантные вирусы,любую форму вектора рекомбинантной "голой" ДНК и тому подобное. "Вектор" включает нуклеиновую кислоту, которая может инфицировать, трансфецировать, временно или постоянно трансдуцировать клетку. Должно быть ясно, что вектор может представлять собой голую нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в комплексе с белком или липидом. Вектор, необязательно, включает вирусную или бактериальную нуклеиновые кислоты и/или белки, и/или мембраны (например, клеточную мембрану,вирусную липидную оболочку и т.д.). Векторы включают, но не ограничиваются этим, репликоны (например, репликоны РНК, бактериофаги), к которым могут присоединяться фрагменты ДНК с появлением возможности реплицироваться. Векторы, таким образом, включают, но не ограничиваются этим, РНК,автономную самореплицирующуюся кольцевую или линейную ДНК или РНК (например, плазмиды, вирусы и тому подобное, см., например, патент США 5217879) и включают как экспрессионные, так и неэкспрессионные плазмиды. Когда рекомбинантный микроорганизм или клеточная культура описывается как "экспрессионный вектор" хозяина, это включает как внехромосомную кольцевую или линейную ДНК, так и ДНК, которая включена в хромосому(ы) хозяина. Когда вектор поддерживается клеткойхозяином, вектор может либо стабильно реплицироваться клетками в процессе митоза как автономная структура, либо включаться в геном хозяина. Экспрессионный вектор может включать промотор, сайт связывания рибосом для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор может также включать подходящие последовательности для амплификации экспрессии. Экспрессионные векторы млекопитающих могут включать ориджин репликации, любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, сайты доноров и акцепторов сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-примыкающие нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах для обеспечения требуемыми нетранскрибируемыми генетическими элементами могут быть использованы последовательности ДНК, происходящие из сайтов сплайсинга и полиаденилирования SV40. В одном аспекте экспрессионные векторы содержат один или более генов маркеров селекции для возможности отбора клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие маркеры секции включают гены, кодирующие дигидрофолатредуктазу, или гены, придающие устойчивость к неомицину, для культур эукариотных клеток, гены, придающие устойчивость к тетрациклину или ампициллину, для Е. coli, и ген TRP1S. cerevisiae. Области промотора могут быть отобраны от любого желаемого гена с использованием векторов хлорамфениколтрансферазы (CAT) или других векторов с маркерами селекции. Векторы для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотных клетках могут также содержать энхансеры для повышения уровней экспрессии. Энхансеры представляют собой цисдействующие элементы ДНК, обычно от приблизительно 10 до приблизительно 300 п.о. в длину, которые влияют на промотор, увеличивая его транскрипционную активность. Примеры включают энхансерSV40 в поздней области ориджина репликации от 100 до 270 п.о., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы в поздней области ориджина репликации и энхансеры аденовируса. Последовательность ДНК может быть вставлена в вектор с помощью разнообразных способов. В целом последовательность ДНК лигируют с желаемым положением в векторе с последующим гидроли- 29
МПК / Метки
МПК: C07H 21/00, C12N 15/00
Метки: гидролазы, кодирующие, способы, получения, применения, кислоты, нуклеиновые
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-20145-gidrolazy-kodiruyushhie-ih-nukleinovye-kisloty-i-sposoby-ih-polucheniya-i-primeneniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Гидролазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения</a>
Альдолазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения
Номер патента: 19971
Опубликовано: 30.07.2014
Авторы: Лугинбул Питер, Хикс Паула М., Ричардсон Тоби, Берк Эллен, Уэйнер Дэвид П., Чжао Лишань
МПК: A23K 1/00, C07K 16/00, A23L 1/00...
Метки: применения, нуклеиновые, способы, альдолазы, кислоты, кодирующие, получения
Формула / Реферат:
1. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая:(a) нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности SEQ ID NO:275 на протяжении участка, состоящего по меньшей мере приблизительно из 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 или более нуклеотидов, которая кодирует полипептид полной длины...
Фосфолипазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения
Номер патента: 15591
Опубликовано: 31.10.2011
Авторы: Бартон Нельсон Р., О’донохью Эйлин
МПК: C12N 15/00, C12N 1/20, C07H 21/04...
Метки: получения, кодирующие, нуклеиновые, способы, кислоты, применения, фосфолипазы
Формула / Реферат:
1. Изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты:(a) кодирующую полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, и (i) имеющую по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 177, и имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W,...
Фосфолипазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения
Номер патента: 10903
Опубликовано: 30.12.2008
Авторы: Лэм Дэвид, Бартон Нельсон, Граматикова Светлана, Хэйзлвуд Джеофф
МПК: A61K 38/46, C07H 21/04, C12N 15/00...
Метки: способы, фосфолипазы, применения, кодирующие, кислоты, нуклеиновые, получения, их
Формула / Реферат:
1. Выделенная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая: (a) последовательность нуклеиновой кислоты, приведенную в последовательности SEQ ID NO:1, или ее фрагмент, кодирующий ферментативно активный полипептид, обладающий фосфолипазной активностью; (b) последовательность нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичность с последовательностью SEQ...
Целлюлазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения
Номер патента: 13540
Опубликовано: 30.06.2010
Авторы: Блум Дэвид, Дикайко Марк, Гемсч Джослин
МПК: C12N 15/00, A62D 3/00, C12N 1/20...
Метки: кислоты, применения, нуклеиновые, их, способы, кодирующие, получения, целлюлазы
Формула / Реферат:
1. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая:(а) последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая:(i) по меньшей мере 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную идентичность последовательности сили ее ферментативно активный фрагмент,(ii) по меньшей мере 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93,...
Целлюлазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения
Номер патента: 18577
Опубликовано: 30.09.2013
Авторы: Блум Дэвид, Гемсч Джослин, Дикайко Марк
МПК: A23K 1/00, A23L 2/00, A23L 1/00...
Метки: их, применения, получения, целлюлазы, кислоты, способы, нуклеиновые, кодирующие
Формула / Реферат:
1. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая:(a) последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полную идентичность последовательности с SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:71, SEQ...
Предыдущий патент: Конденсированные производные пиридина и их применение
Следующий патент: Устройство для пиролиза углеродсодержащих материалов и способ пиролиза углеродсодержащих материалов
Случайный патент: Способ финишной обработки деталей