Альдолазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения

АЛЬДОЛАЗЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИХ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Изобретение относится к полипептидам, обладающим активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазыHMG и/или KHG, к полинуклеотидам, кодирующим эти полипептиды, и к способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептидам, обладающим активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы HMG и/ или KHG, включая термостабильную или термоустойчивую активность, к полинуклеотидам,кодирующим эти ферменты, и к получению и применению этих полинуклеотидов и полипептидов. Полипептиды по изобретению можно применять во множестве фармацевтических,сельскохозяйственных и промышленных направлений. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептидам и к биосинтетическим каскадам, которые пригодны для получения R-2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (R-MP) и определенных стереоизомеров монатина, таких как R,R- и S,R-монатин, и их солей, а также определенных стереоизомеров производных монатина, таких как R,R- и S,R-конфигурации, и их солей. Область изобретения Это изобретение относится к молекулярной и клеточной биологии и биохимии. Более конкретно,это изобретение относится к полипептидам, обладающим активностью альдолазы, полинуклеотидам,кодирующим эти полипептиды, и способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. Предпосылки изобретения Монатин представляет собой сильный подсластитель, имеющий химическую формулу: Монатин включает два хиральных центра, приводящих к четырем возможным стереоизомерным конфигурациям: конфигурация R,R ("R,R-стереоизомер" или "R,R-монатин"); конфигурация S,S ("S,Sстереоизомер" или "S,S-монатин"); конфигурация R,S ("R,S-стереоизомер" или "R,S-монатин") и конфигурация S,R ("S,R-стереоизомер" или "S,R-монатин"). Как используют в настоящем документе, если нет иных указаний, термин "монатин" применяют для обозначения композиций, включающих все четыре стереоизомера монатина, композиций, включающих любое сочетание стереоизомеров монатина (таких как композиция, включающая только R,R- и S,S-стереоизомеры монатина), а также единичной изомерной формы. Для целей этого описания углеродный остов монатина будет пронумерован, как проиллюстрировано выше, при этом атом углерода, прямо ковалентно связанный с группой спирта, обозначен как атом углерода во 2-м положении, и атом углерода, прямо ковалентно связанный с аминогруппой, обозначен как атом углерода в 4-м положении. Таким образом, указание в настоящем документе на R,R-монатин,S,S-монатин, R,S-монатин и S,R-монатин означает: 2R,4R-монатин, 2S,4S-монатин, 2R,4S-монатин и 2S,4R-монатин, соответственно, если нет иных указаний. Следует отметить, что в литературе углеродный остов монатина также нумеруют с использованием альтернативного способа, при этом атом углерода, присоединенный к группе спирта, представляет собой атом углерода в 4-м положении, и атом углерода, присоединенный к аминогруппе, представляет собой атом углерода во 2-м положении. Таким образом, например, указание на 2S,4R-монатин в этом описании может означать то же, что указание на 2R,4S-монатин в литературе с использованием альтернативного способа нумерации. Более того, вследствие различных способов номенклатуры, монатин известен под рядом альтернативных химических названий, включая 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-аминоглутаровая кислота; 4 амино-2-гидрокси-2-(1 Н-индол-3-илметил)пентандиовая кислота; 4-гидрокси-4-(3-индолилметил)глутаминовая кислота и 3-(1-амино-1,3-дикарбокси-3-гидрокси-бут-4-ил)индол. Некоторые изомерные формы монатина могут быть найдены в коре корней растения Schlerochitonilicifolius, встречающегося в области Трансвааля Южной Африки. В патентных заявках США 10/422366 ("заявка '366") и 10/979821 ("заявка '821"), которые включены в настоящий документ в качестве ссылок, описаны, помимо прочего, полипептиды, каскады и микроорганизмы для получения монатинаin vitro и in vivo. Сущность изобретения Это изобретение относится к полипептидам, обладающим активностью альдолазы (в дальнейшем в настоящем документе "альдолазы"), включая активность пируватальдолазы, такую как, но не ограничиваясь ими, активность альдолазы HMG и/или KHG, к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, и к способам получения и применения полипептидов и полинуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления это изобретение также относится к композициям (таким как фармацевтические композиции, композиции топлива и добавки к топливу, продукты питания и добавки к продуктам питания, напитки и добавки к напиткам, корма и добавки к кормам, лекарственные средства и добавки к лекарственным средствам, диетические добавки), содержащим полипептиды или полинуклеотиды по этому изобретению. Эти композиции можно изготавливать в различных формах, таких как таблетки, гели, пилюли, имплантаты, жидкости, аэрозоли, пленки, мицеллы, порошки, продукты питания, кормовые гранулы, или в виде инкапсулированной формы любого типа. В некоторых вариантах осуществления альдолазы и/или их композиции могут быть пригодны в фармацевтической, промышленной и/или сельскохозяйственной обстановке. В некоторых вариантах осуществления альдолазы и/или их композиции могут быть пригодны для образования или расщепления углерод-углеродных связей. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены альдолазы, которые катализируют реакции образования углерод-углеродной связи между акцептором в виде альфа-кетокислоты и донором в виде пирувата или производного пирувата (см. схему реакции, ниже). В некоторых вариантах осуществления акцептор также может представлять собой кетон или альдегид. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены альдолазы, которые обладают активностью 4-гидрокси-2-оксоглутаратальдолазы (такой как 2-кето-4-гидроксиглутаратальдолаза, 2-оксо-4-гидроксиглутаратальдолаза, альдолаза KHG, ЕС 4.1.3.16) и катализируют следующую реакцию: 4-гидрокси-2-оксоглутарат = пируват + глиоксилат. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены альдолазы, которые обладают активностью альдолазы HMG (такой как 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутаратальдолаза, пируватальдолаза, гамма-метилгамма-гидрокси-альфа-кетоглутаровая альдолаза, 4-гидрокси-4-метил-2-кетоглутаратальдолаза, ЕС 4.1.3.17) и катализируют следующую реакцию: 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат = 2 пируват. Альдолаза HMG также действует на 4-гидрокси-4-метил-2-оксоадипат и 4-карбокси-4-гидрокси-2 оксогексадиоат.R3 = Н, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, бензил, замещенный бензил, карбоновая кислота. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены альдолазы, такие как пируватальдолаза, такая как, но не ограничиваясь этим, альдолаза HMG и/или KHG, которые облегчают продукцию 3,4 замещенного 2-кетоглутарата. В одном варианте осуществления это изобретение относится к способу получения 3,4-замещенного 2-кетоглутарата, включающему: (а) предоставление полипептида, обладающего активностью альдолазы, такой как активность пируватальдолазы, такая как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы HMG и/или альдолазы KMG; (b) предоставление донорного и акцепторного соединения; и (с) контактирование полипептида стадии (а) с соединениями стадии (b) в условиях, при которых альдолаза катализирует синтез 3,4-замещенного 2-кетоглутарата, где необязательно донор и акцептор представляют собой пируват или донор пирувата и акцептор -кетокислоты, кетон и/или альдегид. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены альдолазы, которые облегчают продукциюR-2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (R-MP), предшественника монатина. В некоторых вариантах осуществления альдолазу пирувата, такую как альдолаза HMG и/или KHG, можно использовать совместно с D-аминотрансферазой для получения 4-замещенной D-глутаминовой кислоты или ее производного. 4-замещенную D-глутаминовую кислоту и/или ее производное можно применять в качестве антибиотиков, поскольку было выявлено, что эти соединения ингибируют бактериальную глутаматрацемазу (WO 0214261A3). В одном варианте осуществления это изобретение относится к способу получения 4-замещенной D-глутаминовой кислоты, включающему: (а) предоставление полипептида,обладающего активностью альдолазы, такой как активность пируватальдолазы, такая как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы HMG и/или альдолазы KMG; (b) предоставление акцептора кетокислоты и пирувата или донора пирувата; и (с) контактирование полипептида стадии (а) с соединениями стадии (b) в условиях, при которых альдолаза катализирует синтез 4-замещенной D-глутаминовой кислоты, где необязательно полипептид обладает активностью пируватальдолазы, альдолазы HMG и/или альдолазы KHG, и где необязательно способ дополнительно включает применение D-аминотрансферазы. Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной(100%) идентичностью последовательности с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, включаяNO:335, SEQ ID NO:336, SEQ ID NO:337 и SEQ ID NO:338 на протяжении участка по меньшей мере из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800,850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700,1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 остатков или более. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько нуклеиновых кислот кодируют по меньшей мере один полипептид, обладающий активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы HMG и/или KHG. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием. В альтернативных вариантах осуществления одна или несколько нуклеиновых кислот кодируют по меньшей мере один полипептид, способный образовывать антитело, которое может специфично связываться с полипептидом по этому изобретению, или эти нуклеиновые кислоты можно использовать в качестве зондов для идентификации или выделения кодирующих альдолазу нуклеиновых кислот, или для ингибирования экспрессии экспрессирующих альдолазу нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты по этому изобретению также включают выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты по этому изобретению, такие как ферменты, включающие один или несколько полипептидов, имеющих последовательность, как указано в SEQID NO:326, SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:330, SEQ ID NO:332 и SEQ ID NO:334, ее подпоследовательности, их варианты и их ферментативно активные фрагменты. В некоторых вариантах осуществления полипептид обладает активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы HMG и/или KHG. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к кодирующим альдолазу нук-3 019971 леиновым кислотам, таким как нуклеиновые кислоты, кодирующие пируватальдолазу, такую как альдолаза HMG и/или KHG, предпочтительно полученным из смешанных культур. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к образованию углерод-углеродной связи или расщеплению кодирующих фермент нуклеиновых кислот, выделенных из смешанных культур, содержащих полинуклеотиды по этому изобретению, такие как последовательность, обладающая по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной (100%) идентичностью последовательностей с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, такой как SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ IDNO:331, SEQ ID NO:333, SEQ ID NO:335, SEQ ID NO:336, SEQ ID NO:337 и SEQ ID NO:338 на протяжении участка по меньшей мере приблизительно из 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550,600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 или более. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим фермент альдолазу, такой как фермент пируватальдолаза, фермент HMG и/или KHG, включая полинуклеотидные последовательности по этому изобретению и к кодируемым ими полипептидам, включая ферменты по этому изобретению,такие как полипептиды по этому изобретению, такие как SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQID NO:332 или SEQ ID NO:334, и их ферментативно активные фрагменты, предпочтительно полученные из общего источника, такого как окружающая среда. В некоторых вариантах осуществления это изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим фермент альдолазу, такой как фермент пируватальдолаза, фермент HMG и/или KHG, предпочтительно полученным из естественных источников, таких как смешанные естественные источники. В некоторых вариантах осуществления алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм BLAST, например, алгоритм BLAST версии 2.2.2, где установлены параметры фильтров:blastall-p blastp-d "nr pataa"-FF, a все другие параметры установлены по умолчанию. Другие варианты осуществления этого изобретения представляют собой выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, включающие по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40,45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050,1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950,2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более последовательно расположенных оснований последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению, по существу, идентичных ей последовательностей, и комплеметарных им последовательностей. В некоторых вариантах осуществления выделенные синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты по этому изобретению кодируют полипептид, обладающий активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы HMG и/или KHG, который является термостабильным. Термостабильный полипептид по этому изобретению может сохранять активность альдолазы, такую как активность альдолазы пирувата, такую как активность альдолазы HMG и/или KHG, в условиях, включающих диапазон температур от приблизительно -100 С до приблизительно -80 С, от приблизительно -80 С до приблизительно -40 С, от приблизительно -40 С до приблизительно -20 С, от приблизительно -20 С до приблизительно 0 С, от приблизительно 0 С до приблизительно 37 С, от приблизительно 0 С до приблизительно 5 С, от приблизительно 5 С до приблизительно 15 С, от приблизительно 15 С до приблизительно 25 С, от приблизительно 25 С до приблизительно 37 С, от приблизительно 37 С до приблизительно 45 С, от приблизительно 45 С до приблизительно 55 С, от приблизительно 55 С до приблизительно 70 С, от приблизительно 70 С до приблизительно 75 С, от приблизительно 75 С до приблизительно 85 С, от приблизительно 85 С до приблизительно 90 С, от приблизительно 90 С до приблизительно 95 С, от приблизительно 95 С до приблизительно 100 С, от приблизительно 100 С до приблизительно 105 С, от приблизительно 105 С до приблизительно 110 С, от приблизительно 110 С до приблизительно 120 С или 95 С, 96 С, 97 С, 98 С, 99 С,100 С, 101 С, 102 С, 103 С, 104 С, 105 С, 106 С, 107 С, 108 С, 109 С, 110 С, 111 С, 112 С, 113 С,114 С, 115 С или более. Термостабильные полипептиды по этому изобретению могут сохранять активность альдолазы, такую как активность пируватальдолазы, такую как активность альдолазы HMG и/илиKHG, при температурах в диапазоне от приблизительно -100 С до приблизительно -80 С, от приблизительно -80 С до приблизительно -40 С, от приблизительно -40 С до приблизительно -20 С, от приблизительно -20 С до приблизительно 0 С, от приблизительно 0 С до приблизительно 5 С, от приблизительно 5 С до приблизительно 15 С, от приблизительно 15 С до приблизительно 25 С, от приблизительно 25 С до приблизительно 37 С, от приблизительно 37 С до приблизительно 45 С, от приблизительно 45 С до приблизительно 55 С, от приблизительно 55 С до приблизительно 70 С, от приблизительно 70 С до приблизительно 75 С, от приблизительно 75 С до приблизительно 85 С, от приблизительно 85 С до приблизительно 90 С, от приблизительно 90 С до приблизительно 95 С, от приблизительно 95 С до приблизительно 100 С, от приблизительно 100 С до приблизительно 105 С, от приблизительно 105 С до приблизительно 110 С, от приблизительно 110 С до приблизительно 120 С или 95 С, 96 С, 97 С, 98 С,99 С, 100 С, 101 С, 102 С, 103 С, 104 С, 105 С, 106 С, 107 С, 108 С, 109 С, 110 С, 111 С, 112 С, 113 С,114 С, 115 С или более. В некоторых вариантах осуществления термостабильные полипептиды по этому изобретению сохраняют активность альдолазы при температуре в диапазонах, описанных выше, при приблизительно рН 3,0, приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0,приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или более. В других вариантах осуществления выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты кодируют полипептид, обладающий активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы HMG и/или KHG, который является термоустойчивым. Термоустойчивые полипептиды по этому изобретению могут сохранять активность альдолазы, такую как активность пируватальдолазы, такую как активность альдолазы HMG и/или KHG,после воздействия условий, включающих температуру в диапазоне от приблизительно -100 С до приблизительно -80 С, от приблизительно -80 С до приблизительно -40 С, от приблизительно -40 С до приблизительно -20 С, от приблизительно -20 С до приблизительно 0 С, от приблизительно 0 С до приблизительно 5 С, от приблизительно 5 С до приблизительно 15 С, от приблизительно 15 С до приблизительно 25 С, от приблизительно 25 С до приблизительно 37 С, от приблизительно 37 С до приблизительно 45 С, от приблизительно 45 С до приблизительно 55 С, от приблизительно 55 С до приблизительно 70 С, от приблизительно 70 С до приблизительно 75 С, от приблизительно 75 С до приблизительно 8 5 С, от приблизительно 85 С до приблизительно 90 С, от приблизительно 90 С до приблизительно 95 С,от приблизительно 95 С до приблизительно 100 С, от приблизительно 100 С до приблизительно 105 С,от приблизительно 105 С до приблизительно 110 С, от приблизительно 110 С до приблизительно 120 С или 95 С, 96 С, 97 С, 98 С, 99 С, 100 С, 101 С, 102 С, 103 С, 104 С, 105 С, 106 С, 107 С, 108 С, 109 С,110 С, 111 С, 112 С, 113 С, 114 С, 115 С или более. Термоустойчивые полипептиды по этому изобретению могут сохранять активность альдолазы, такую как активность пируватальдолазы, такую как активность альдолазы HMG и/или KHG, после воздействия температуры в диапазоне от приблизительно-40 С до приблизительно -20 С, от приблизительно -20 С до приблизительно 0 С, от приблизительно 0 С до приблизительно 5 С, от приблизительно 5 С до приблизительно 15 С, от приблизительно 15 С до приблизительно 25 С, от приблизительно 25 С до приблизительно 37 С, от приблизительно 37 С до приблизительно 45 С, от приблизительно 45 С до приблизительно 55 С, от приблизительно 55 С до приблизительно 70 С, от приблизительно 70 С до приблизительно 75 С, от приблизительно 75 С до приблизительно 85 С, от приблизительно 85 С до приблизительно 90 С, от приблизительно 90 С до приблизительно 95 С, от приблизительно 95 С до приблизительно 100 С, от приблизительно 100 С до приблизительно 105 С, от приблизительно 105 С до приблизительно 110 С, от приблизительно 110 С до приблизительно 120 С или 95 С, 96 С, 97 С, 98 С, 99 С, 100 С, 101 С, 102 С, 103 С, 104 С, 105 С,106 С, 107 С, 108 С, 109 С, 110 С, 111 С, 112 С, 113 С, 114 С, 115 С или более. В некоторых вариантах осуществления термоустойчивые полипептиды по этому изобретению сохраняют активность альдолазы после воздействия температуры в диапазонах, описанных выше, при приблизительно рН 3,0, приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,5,приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или более. Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновыми кислотами по этому изобретению, включая последовательность, указанную в SEQ ID NO:1, SEQ IDNO:336, SEQ ID NO:337 или SEQ ID NO:338, или ее фрагменты или подпоследовательности. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты кодируют полипептиды, обладающие активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы HMG и/или KHG. Нуклеиновые кислоты могут обладать длиной по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700,750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 или более остатков или могут представлять собой полноразмерный ген или транскрипт. В некоторых вариантах осуществления строгие условия включают стадию промывания, включающую промывание в 0,2 Х SSC при температуре приблизительно 65 в течение приблизительно 15 мин. Это изобретение относится к зондам нуклеиновых кислот для идентификации или выделения нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, обладающие активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы HMG и/или KHG,где зонды содержат приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100,150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более последовательно расположенных оснований последовательности по этому изобретению и где зонды идентифицируют нуклеиновую кислоту посредством связывания или гибридизации. Зонды могут содержать олигонуклеотид, содержащий между приблизительно 10-100 последовательно расположенных оснований последовательности по этому изобретению, или ее фрагментов или подпоследовательностей, например,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 оснований или более, или они могут обладать любой промежуточной длиной. Это изобретение относится к зондам нуклеиновых кислот для идентификации и выделения нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, обладающие активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы HMG и/или KHG, где зонды содержат нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700,750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более остатков нуклеиновой кислоты по этому изобретению, такой как полинуклеотид, обладающий по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной (100%) идентичностью последовательностей с нуклеиновой кислотой по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием. В других вариантах осуществления зонды могут содержать олигонуклеотид, содержащий между по меньшей мере приблизительно 10-100 последовательно расположенных оснований последовательности нуклеиновых кислот по этому изобретению, или ее подпоследовательности, например 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 оснований или более, или они могут обладать любой желательной длиной между ними. Это изобретение относится к парам праймеров для амплификации (такой как амплификация посредством ПЦР) нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, обладающие активностью альдолазы,включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазыHMG и/или KHG, где каждая пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по этому изобретению или ее фрагменты или подпоследовательности (см. список последовательностей). Один или каждый член пары последовательностей праймеров для амплификации может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 или более последовательно расположенных оснований последовательности или приблизительно 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или более последовательно расположенных оснований последовательности. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к паре праймеров для амплификации, где пара праймеров включает первый член с последовательностью, представленной посредством приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или более остатков нуклеиновой кислоты по этому изобретению, и второй член с последовательностью, представленной посредством приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или более остатков цепи, комплементарной для первого члена. Это изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим альдолазу, таким как нуклеиновые кислоты, кодирующие пируватальдолазу, кодирующие альдолазу HMG и/или KHG, полученным посредством амплификации, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим альдолазу, таким как нуклеиновые кислоты,кодирующие пируватальдолазу, кодирующие альдолазу HMG и/или KHG, полученным посредством амплификации, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам получения фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза HMG и/или KHG по-7 019971 средством амплификации, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления пара праймеров для амплификации амплифицирует нуклеиновую кислоту из библиотеки, такой как библиотека генов,такая как библиотека окружающей среды. Это изобретение относится к способам амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью альдолазы, включая активность в отношении пирувата, такую как, но не ограничиваясь этим, активность альдолазы HMG и/или KHG, включающим амплификацию матричной нуклеиновой кислоты с помощью последовательностей пары праймеров для амплификации, способных амплифицировать последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению или ее фрагменты или подпоследовательности. Это изобретение относится к экспрессирующим кассетам, содержащим нуклеиновую кислоту по этому изобретению или ее подпоследовательность. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующая кассета может содержать нуклеиновую кислоту, которая функционально связана с промотором. Промотор может представлять собой вирусный, бактериальный промотор, промотор млекопитающих,грибов, дрожжей или растений. В некоторых вариантах осуществления промотор растений может представлять собой промотор картофеля, риса, кукурузы, пшеницы, табака или ячменя. Промотор может представлять собой конститутивный промотор. Конститутивный промотор может включать CaMV35S. В других вариантах осуществления промотор может представлять собой индуцибельный промотор. В некоторых вариантах осуществления промотор может представлять собой тканеспецифичный промотор или промотор, регулируемый окружающими условиями, или промотор, регулируемый в зависимости от стадии развития. Таким образом, промотор может представлять собой, например, промотор, специфичный для семян, специфичный для листьев, специфичный для корней, специфичный для стебля или индуцируемый опаданием листвы. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующая кассета далее может содержать экспрессирующий вектор растений или вирусов растений. Это изобретение относится к носителям для клонирования, включающим экспрессирующую кассету (такую как вектор) по этому изобретению или нуклеиновую кислоту по этому изобретению. Носитель для клонирования может представлять собой вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагмиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому. Вирусный вектор может включать аденовирусный вектор, ретровирусный вектор или аденоассоциированный вирусный вектор. Носитель для клонирования может включать бактериальную искусственную хромосому (ВАС), плазмиду, вектор из бактериофага Р 1(РАС), искусственную хромосому дрожжей (YAC) или искусственную хромосому млекопитающих(MAC). Это изобретение относится к трансформированным клеткам, содержащим нуклеиновые кислоты по этому изобретению или экспрессирующие кассеты (такие как векторы) по этому изобретению, или носители для клонирования по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления трансформированная клетка может представлять собой бактериальную клетку, клетку млекопитающих, клетку грибов,клетку дрожжей, клетку насекомых или клетку растений. В некоторых вариантах осуществления клетка растений может представлять собой клетку сои, рапса, масляничных растений, томата, сахарного тростника, злаковых, картофеля, пшеницы, риса, кукурузы, табака или ячменя. Это изобретение относится к трансгенным животным, не относящимся к человеку, содержащим нуклеиновую кислоту по этому изобретению или экспрессирующую кассету (такую как вектор) по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления животное представляет собой мышь, крысу, свинью, козу или овцу. Это изобретение относится к трансгенным растениям, содержащим нуклеиновую кислоту по этому изобретению или экспрессирующую кассету (такую как вектор) по этому изобретению. Трансгенное растение может представлять собой растение злаковых, растение кукурузы, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, масличное растение, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя или растение табака. Это изобретение относится к трансгенным семенам, содержащим нуклеиновую кислоту по этому изобретению или экспрессирующую кассету (такую как вектор) по этому изобретению. Трансгенное семя может представлять собой семя злакового растения, семя кукурузы, зерно пшеницы, семя масличного растения, семя рапса, семя сои, ядро пальмы, семя подсолнечника, семя кунжута, орех или семя растения табака. Это изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам, содержащим последовательности нуклеиновых кислот, комплементарные нуклеиновой кислоте по этому изобретению или способные гибридизоваться с ними в строгих условиях. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам ингибирования трансляции транскрипта фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза HMG и/или KHG, в клетке, включающим введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеиновой кислоте по этому изобретению, или способную гибридизоваться с ней в строгих условиях. В некоторых вариантах осуществления антисмысловой олигонуклеотид обладает длиной от приблизительно 10 до приблизительно 50, от приблизительно 20 до приблизительно 60, от приблизительно 30 до приблизительно 70, от приблизительно 40 до приблизительно 80 или от приблизительно 60 до приблизительно 100 оснований, такой как 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более оснований. Это изобретение относится к способам ингибирования трансляции транскрипта фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза HMG и/или KHG, в клетке, включающим введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеиновой кислоте по этому изобретению или способную гибридизоваться с ней в строгих условиях. Это изобретение относится к молекулам двухцепочечных ингибиторных РНК (RNAi или РНКинтерференция), (включая малые интерферирующие РНК, или siRNA, для ингибирования транскрипции и микроРНК, или miRNA, для ингибирования трансляции), содержащим подпоследовательность последовательности по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления длина siRNA составляет от приблизительно 21 до приблизительно 24 остатков, или по меньшей мере приблизительно 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более дуплексных нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам ингибирования экспрессии фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза HMG и/или KHG, в клетке, включающим введение в клетку или экспрессию в клетке двухцепочечной ингибиторной РНК (siRNA или miRNA), где РНК содержит подпоследовательность последовательности по этому изобретению. Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полной (100%) идентичностью последовательности с полипептидом или пептидом по этому изобретению на протяжении участка по меньшей мере приблизительно из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 или более остатков, или на протяжении полной длины полипептида. В некоторых вариантах осуществления идентичности последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием. Полипептидные или пептидные последовательности по этому изобретению включают SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:326, SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:330, SEQ ID NO:332 и SEQ ID NO:334, и их подпоследовательности, их варианты и их ферментативно активные фрагменты. Также полипептиды по этому изобретению включают фрагменты длиной по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35,40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 или более остатков, или полноразмерный фермент. Полипептидные или пептидные последовательности по этому изобретению включают последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по этому изобретению. Полипептидные или пептидные последовательности по этому изобретению включают полипептиды или пептиды,-9 019971 специфично связываемые антителом по этому изобретению (такие как эпитопы), или полипептиды или пептиды, которые могут приводить к образованию антитела по этому изобретению (такие как иммуноген). В некоторых вариантах осуществления полипептид по этому изобретению обладает по меньшей мере одним видом ферментативной активности альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. В других вариантах осуществления полинуклеотид по этому изобретению кодирует полипептид, который обладает по меньшей мере одним видом ферментной активности альдолазы,таким как ферментная активность пируватальдолазы, такой как альдолаза HMG и/или KHG. Другой вариант осуществления этого изобретения относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам или пептидам, содержащим по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150 или более последовательно расположенных оснований полипептидных или пептидных последовательностей по этому изобретению, по существу, идентичных им последовательностей, и комплементарных им последовательностей. Пептид может представлять собой, например, иммуногенный фрагмент, мотив (такой как участок связывания), сигнальную последовательность, препропоследовательность или активный участок. Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, кодирующую полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, и сигнальную последовательность, где нуклеиновая кислота содержит последовательность по этому изобретению. "Сигнальная последовательность" означает секреторный сигнал или другой домен, который способствует секреции альдолазы по этому изобретению из клетки-хозяина. Сигнальная последовательность может быть получена из другого фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG,или из (гетерологичного) фермента, не являющегося альдолазой, такого как фермент не пируватальдолаза, такой как фермент не альдолаза HMG и/или фермент не альдолаза KHG. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, кодирующую полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, где последовательность не содержит сигнальную последовательность, и нуклеиновая кислота содержит последовательность по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, содержащим полипептиды по этому изобретению, лишенные всей сигнальной последовательности или ее части. В некоторых вариантах осуществления выделенный, синтетический или рекомбинантный полипептид может содержать полипептид по этому изобретению, содержащий гетерологичную сигнальную последовательность, такую как сигнальная последовательность гетерологичного фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, или сигнальная последовательность не альдолазы, такая как сигнальная последовательность не пируватальдолазы, такая как сигнальная последовательность не альдолазы HMG и/или не альдолазы KHG. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к химерным белкам, содержащим первый домен, содержащий сигнальную последовательность по этому изобретению, и по меньшей мере второй домен. Белок может представлять собой слитый белок. Второй домен может содержать фермент. Белок может представлять собой не фермент. Это изобретение относится к химерным полипептидам, включающим по меньшей мере первый домен, содержащий сигнальный пептид (SP), препропоследовательность и/или каталитический домен (CD) по этому изобретению, и по меньшей мере второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, где гетерологичный полипептид или пептид не природным образом ассоциирован с сигнальным пептидом (SP), препропоследовательностью и/или каталитическим доменом (CD). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид или пептид не является ферментом альдолазой, таким как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. Гетерологичный полипептид или пептид может быть N-концевым, С-концевым или может находиться на обоих концах сигнального пептида (SP),препропоследовательности и/или каталитического домена (CD). Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим химерный полипептид, где химерный полипептид содержит по меньшей мере первый домен, содержащий сигнальный пептид (SP), препродомен и/или каталитический домен (CD) по этому изобретению, и по меньшей мере второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, где гетерологичный полипептид или пептид не природным образом ассоциирован с сигнальным пептидом (SP), препродоменом и/или каталитическим доменом (CD). Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным сигнальным последовательностям (таким как сигнальные пептиды), состоящим из последовательности, или содержащим ее, как указано в остатках с 1 по 14, с 1 по 15, с 1 по 16, с 1 по 17, с 1 по 18, с 1 по 19, с 1 по 20, с 1 по 21,с 1 по 22, с 1 по 23, с 1 по 24, с 1 по 25, с 1 по 26, с 1 по 27, с 1 по 28, с 1 по 28, с 1 по 30, с 1 по 31, с 1 по 32, с 1 по 33, с 1 по 34, с 1 по 35, с 1 по 36, с 1 по 37, с 1 по 38, с 1 по 39, с 1 по 40, с 1 по 41, с 1 по 42, с 1 по 43, с 1 по 44, с 1 по 45, с 1 по 46 или с 1 по 47, полипептида по этому изобретению, такого как SEQ IDNO:324, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:330, SEQ ID NO:332 или SEQ ID NO:334. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к сигнальным последовательностям, содержащим первые 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,69, 70 или более N-концевых остатков полипептида по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, включает специфичную активность от приблизительно 10 до приблизительно 12000 единиц на миллиграмм белка. В других вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, включает специфичную активность от приблизительно 1000 до приблизительно 10000 единиц на миллиграмм белка,или от приблизительно 5000 до приблизительно 7500 единиц на миллиграмм белка. Альтернативно активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, включает специфичную активность в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 7500 единиц на миллиграмм белка, или от приблизительно 5000 до приблизительно 12000 единиц на миллиграмм белка. В некоторых вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза,такая как альдолаза HMG и/или KHG, включает специфичную активность в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 5000 единиц на миллиграмм белка, или от приблизительно 7500 до приблизительно 10000 единиц на миллиграмм белка. В других вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, включает специфичную активность в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 2500 единиц на миллиграмм белка. Альтернативно активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, включает специфичную активность в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 1000 единиц на миллиграмм белка. В иллюстративном способе измерения активности различных ферментов альдолаз, таких как пируватальдолазы, такие как альдолазы HMG и/или KHG, используются основной субстрат, 4-карбокси-4-гидрокси-2-оксоадипат ("СНА"). Типичный анализ включает 50 мМ фосфат натрия рН 7,5, 1 мМ MgCl2, 1 мМ СНА, 10 мкг/мл D-лактатдегидрогеназы ("LDH") из Lactobacillusleichmanii (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 0,5 мМ NADH. Анализ начинают добавлением подлежащего измерению фермента. На спектрофотометре при 340 нм непрерывно проводят мониторинг высвобождения пирувата, сопряженного с образованием NAD+. Единицу ферментной активности определяют как количество, которое высвобождает достаточное количество пирувата для снижения поглощения при 340 нм на 1 OD в минуту. В других вариантах осуществления термоустойчивость фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, включает сохранение по меньшей мере половины специфичной активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/илиKHG, после нагревания до повышенной температуры, такой как температура от приблизительно 0 С до приблизительно 20 С, от приблизительно 20 С до приблизительно 37 С, от приблизительно 37 С до приблизительно 50 С, от приблизительно 50 С до приблизительно 70 С, от приблизительно 70 С до приблизительно 75 С, от приблизительно 75 С до приблизительно 80 С, от приблизительно 80 С до приблизительно 85 С, от приблизительно 85 С до приблизительно 90 С, от приблизительно 90 С до приблизительно 95 С, от приблизительно 95 С до приблизительно 100 С, от приблизительно 100 С до приблизительно 110 С или выше. Альтернативно термоустойчивость может включать сохранение специфичной активности от приблизительно 10 до приблизительно 12000 единиц на миллиграмм белка, или от приблизительно 5000 до приблизительно 10000 единиц на миллиграмм белка, после нагревания до повышенной температуры, как описано выше. В других вариантах осуществления термоустойчивость может включать сохранение специфичной активности в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 5000 единиц на миллиграмм белка после нагревания до повышенной температуры, как описано выше. Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам по этому изобретению, где полипептиды содержат по меньшей мере один участок гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления гликозилирование может представлять собой N-гликозилирование. В некоторых вариантах осуществления полипептид может быть гликозилирован после экспрессии в хозяине P. pastoris или S. pombe или в хозяйской клетке млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления полипептид может сохранять активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, в условиях, включающих приблизительно рН 6,5, рН 6, рН 5,5, рН 5, рН 4,5, рН 4,0, рН 3,5, рН 3,0 или более низкие (более кислые) рН. В других вариантах осуществления полипептид может сохранять активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, в условиях, включающих приблизительно рН 7, рН 7,5 рН, 8,0, рН 8,5, рН 9, рН 9,5, рН 10, рН 10,5, рН 11,0, рН 11,5, рН 12, рН 12,5 или более высокие (более щелочные) рН. В некоторых вариантах осуществления полипептид может сохранять активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, после воздействия условий, включающих приблизительно рН 6,5, рН 6, рН 5,5, рН 5, рН 4,5, рН 4,0, рН 3,5, рН 3,0 или более низкие (более кислые) рН. В других вариантах осуществления полипептид может сохранять активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG,после воздействия условий, включающих приблизительно рН 7, рН 7,5 рН 8,0, рН 8,5, рН 9, рН 9,5, рН 10, рН 10,5, рН 11,0, рН 11,5, рН 12, рН 12,5 или более высокие (более щелочные) рН. В некоторых вариантах осуществления фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG по этому изобретению обладает активностью в щелочных условиях, таких как щелочные условия кишечника, такого как тонкий кишечник. В некоторых вариантах осуществления полипептид может сохранять активность после воздействия кислых значений рН желудка. Это изобретение относится к белковым препаратам, содержащим полипептид (включая пептиды) по этому изобретению, где белковый препарат включает жидкость, твердое вещество или гель. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к гетеродимерам, содержащим полипептид по этому изобретению, и второй компонент, такой как полипептид или другой (второй) домен. В некоторых вариантах осуществления второй компонент гетеродимера может представлять собой другой фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, другой фермент или другой белок. В некоторых вариантах осуществления второй домен может представлять собой полипептид,и гетеродимер может представлять собой слитый белок. В некоторых вариантах осуществления второй домен может представлять собой эпитоп или маркер. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к гомомультимерам, включая, но не ограничиваясь ими, гомодимеры, гомотримеры,гомотетрамеры, гомопентамеры и гомогексамеры, содержащие полипептид по этому изобретению. Это изобретение относится к иммобилизованным полипептидам (включая пептиды), обладающим активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, где иммобилизованный полипептид содержит полипептид по этому изобретению, полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по этому изобретению, или полипептид, содержащийполипептид по этому изобретению, и второй домен. В некоторых вариантах осуществления полипептид может быть иммобилизован на клетке, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, частице графита, грануле,геле, планшете, матрице или капиллярной трубке. Это изобретение относится к матрицам, содержащим иммобилизованную нуклеиновую кислоту по этому изобретению, включая зонды по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к матрицам, содержащим антитело по этому изобретению. Это изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным антителам, которые специфично связываются с полипептидом по этому изобретению или с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по этому изобретению. Эти антитела по этому изобретению могут представлять собой моноклональные или поликлональные антитела. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к гибридомам, содержащим антитело по этому изобретению, такое как антитело, которое специфично связывается с полипептидом по этому изобретению или с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим эти антитела. Это изобретение относится к способам выделения или идентификации полипептидов, обладающих активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG,включающим стадии: (а) предоставления антитела по этому изобретению; (b) предоставления образца,содержащего полипептиды; и (с) контактирования образца стадии (b) с антителами стадии (а) в условиях,при которых антитело может специфично связываться с полипептидом, таким образом, выделяя или идентифицируя полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. Это изобретение относится к способам получения антитела против альдолазы, такого как антитело против пируватальдолазы, такое как антитело против фермента альдолазы HMG и/или KHG, включающим введение не относящемуся к человеку животному нуклеиновой кислоты по этому изобретению или полипептида по этому изобретению, или их подпоследовательностей, в количестве, достаточном для обеспечения гуморального иммунного ответа, получая посредством этого антитело против альдолазы,такое как антитело против пируватальдолазы, такое как антитело против фермента альдолазы HMG и/или KHG. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам обеспечения иммунного ответа (клеточного или гуморального) против фермента альдолазы, такого как иммунный ответ против пируватальдолазы, такой как иммунный ответ против альдолазы HMG и/или KHG, включающим введение не относящемуся к человеку животному нуклеиновой кислоты по этому изобретению или полипептида по этому изобретению, или их подпоследовательностей, в количестве, достаточном для обеспечения иммунного ответа (клеточного или гуморального). Это изобретение относится к способам получения рекомбинантного полипептида, включающим стадии: (а) предоставления нуклеиновой кислоты по этому изобретению, функционально связанной с промотором; и (b) экспрессии нуклеиновой кислоты стадии (а) в условиях, которые обеспечивают экспрессию полипептида, получая посредством этого рекомбинантный полипептид. В некоторых вариантах осуществления способ может дополнительно включать трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты стадии (а), получая посредством этого рекомбинантный полипептид в трансформированной клетке. Это изобретение относится к способам идентификации полипептида, обладающего активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, включающим следующие стадии: (а) предоставление полипептида по этому изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по этому изобретению; (b) предоставление субстрата фермента альдолазы,такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG; и (с) контактирование полипептида стадии (а), или его фрагмента или варианта, с субстратом стадии (b) и детекция уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, где уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции позволяет выявить полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. В некоторых вариантах осуществления субстрат представляет собой углеводород, содержащее углеводород соединение и/или миметик углеводорода. Это изобретение относится к способам идентификации субстрата фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, включающим следующие стадии: (а) предоставление полипептида по этому изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по этому изобретению; (b) предоставление анализируемого субстрата; и (с) контактирование полипептида стадии (а) с анализируемым субстратом стадии (b) и определение уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, где уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции позволяет идентифицировать анализируемый субстрат, как субстрат фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. Это изобретение относится к способам определения наличия специфичного связывания анализируемого соединения с полипептидом, включающим следующие стадии: (а) экспрессия нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, в условиях, обеспечивающих трансляцию нуклеиновой кислоты в полипептид, где нуклеиновая кислота содержит нуклеиновую кислоту по этому изобретению, или предоставление полипептида по этому изобретению; (b) предоставление анализируемого соединения; (с) контактирование полипептида с анализируемым соединением; и (d) определение наличия специфичного связывания анализируемого соединения стадии (b) с полипептидом. Это изобретение относится к способам идентификации модулятора активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, включающим следующие стадии:(а) предоставление полипептида по этому изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по этому изобретению; (b) предоставление анализируемого соединения; (с) контактирование полипептида стадии (а) с анализируемым соединением стадии (b) и измерение активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, где изменение активности, измеренной в присутствии анализируемого соединения, по сравнению с активностью в отсутствие анализируемого соединения, позволяет определить, что анализируемое соединение модулирует активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. В некоторых вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдо- 13019971 лаза HMG и/или KHG, можно измерять посредством предоставления субстрата фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, или увеличения количества субстрата или уменьшения количества продукта реакции. Уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции в присутствии анализируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без анализируемого соединения позволяет идентифицировать анализируемое соединение как активатор активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. Увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции в присутствии анализируемого соединения, по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без анализируемого соединения, позволяет идентифицировать анализируемое соединение как ингибитор активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. Это изобретение относится к компьютерным системам, включающим процессор и устройство для хранения данных, где на указанном устройстве для хранения данных сохранена последовательность полипептида или последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению (например, полипептида или пептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по этому изобретению). В некоторых вариантах осуществления компьютерная система далее может включать алгоритм для сравнения последовательностей и устройство для хранения данных по меньшей мере с одной сохраненной на нем эталонной последовательностью. В других вариантах осуществления алгоритм сравнения последовательностей включает компьютерную программу, которая показывает полиморфизмы. В некоторых вариантах осуществления компьютерная система может далее включать идентификатор, который идентифицирует один или несколько характерных элементов в указанной последовательности. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к компьютерным считываемым носителям информации, на которых сохранена последовательность полипептида или последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам идентификации характерных элементов последовательности, включающим стадии: (а) считывания последовательности с использованием компьютерной программы, которая позволяет установить один или несколько характерных элементов в последовательности, где последовательность содержит последовательность полипептида или последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению; и (b) идентификации одного или нескольких характерных элементов в последовательности с помощью компьютерной программы. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам сравнения первой последовательности со второй последовательностью, включающим стадии: (а) считывания первой последовательности и второй последовательности с использованием компьютерной программы, которая сравнивает последовательности, где первая последовательность содержит последовательность полипептида или последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению; и (b) определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью с помощью компьютерной программы. Стадия определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью может дополнительно включать стадию идентификации полиморфизмов. В некоторых вариантах осуществления способ может дополнительно включать идентификатор, который идентифицирует один или несколько характерных элементов в последовательности. В других вариантах осуществления способ может включать считывание первой последовательности с использованием компьютерной программы и идентификацию одного или нескольких характерных элементов в последовательности. Это изобретение относится к способам выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, из образца из окружающей среды, включающим стадии: (а) предоставления последовательностей пары праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолазаHMG и/или KHG, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту по этому изобретению; (b) выделения нуклеиновой кислоты из образца или обработки образца, чтобы нуклеиновая кислота в образце была доступна для гибридизации с парой праймеров для амплификации; и (с) объединения нуклеиновой кислоты стадии (b) с парой праймеров для амплификации стадии (а) и амплификации нуклеиновой кислоты из образца, выделяя или извлекая посредством этого нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, из образца. Один или каждый член пары праймеров для амплификации может включать олигонуклеотид, содержащий последовательности пары праймеров для амплификации по этому изобретению, такие как последовательности, имеющие по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 или более последовательно расположенных оснований последовательности по этому изобретению. В одном варианте осуществления этого изобретения образец представляет собой образец из окружающей среды. Это изобретение относится к способам выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, из образца из окружающей среды, включающим стадии: (а) предоставления полинуклеотидного зонда, содержащего нуклеиновую кислоту по этому изобретению или ее подпосле- 14019971 довательность; (b) выделения нуклеиновой кислоты из образца или обработки образца, чтобы нуклеиновая кислота была доступной для гибридизации с полинуклеотидным зондом стадии (а); (с) объединения выделенной нуклеиновой кислоты или обработанного образца стадии (b) с полинуклеотидным зондом стадии (а); и (d) выделения нуклеиновой кислоты, которая специфично гибридизуется с полинуклеотидным зондом стадии (а), выделяя или извлекая посредством этого нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, из образца. Образец может включать образец воды, образец жидкости, образец почвы, образец воздуха или биологический образец. В некоторых вариантах осуществления биологический образец может быть получен из бактериальной клетки, клетки простейших, клетки насекомых,клетки дрожжей, клетки растений, клетки грибов или клетки млекопитающих. В одном варианте осуществления этого изобретения образец представляет собой образец из окружающей среды. Это изобретение относится к способам получения варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, включающим стадии: (а) предоставления матричной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту по этому изобретению; и (b) модификации, делеции или вставки одного или нескольких нуклеотидов в матричной последовательности, или их сочетания, с получением варианта матричной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления способ далее может включать экспрессию варианта нуклеиновой кислоты с получением варианта полипептида фермента альдолазы,такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. Модификации, вставки и делении можно вносить способом, включающим ПЦР с пониженной точностью, перетасовку, олигонуклеотиднаправленный мутагенез, ПЦР со сборкой, мутагенез посредством половой ПЦР, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, возвратно-множественный мутагенез, экспоненциально-множественный мутагенез,сайт-специфический мутагенез, пересборку гена, мутагенез с насыщением сайтов гена (GSSM), синтетическую пересборку лигированием (SLR), хромосомный мутагенез с насыщением (CSM) или их сочетание. В других вариантах осуществления модификации, вставки или делеции вносят способом, включающим рекомбинацию, возвратную рекомбинацию последовательностей, мутагенез с модификацией ДНК фосфотиоатом, мутагенез с содержащей урацил матрицей, мутагенез с содержащими разрывы дуплексами, мутагенез с репарацией точек ошибочно спаренных оснований, мутагенез с дефектом репарации штамма-хозяина, химический мутагенез, мутагенез радиогенного происхождения, делеционный мутагенез, мутагенез с рестрикцией и селекцией, мутагенез с рестрикцией и исправлением ошибок, синтез искусственного гена, множественный мутагенез, получение химерного мультимера нуклеиновой кислоты и их сочетание. В некоторых вариантах осуществления способ можно многократно повторять до тех пор, пока не будет получен фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, с измененной или отличающейся активностью или с измененной или отличающейся стабильностью относительно активности и стабильности полипептида, кодируемого матричной нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, является термоустойчивым и сохраняет некоторую активность после воздействия повышенной температуры. В других вариантах осуществления вариант полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, обладает повышенным гликозилированием по сравнению ферментом альдолазой, такой как пируватальдолаза,такая как альдолаза HMG и/или KHG, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой. Альтернативно вариант полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/илиKHG, обладает активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, при высокой (или повышенной) температуре, где фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, не является активной при высокой температуре. В некоторых вариантах осуществления способ можно многократно повторять до тех пор, пока не будет получена последовательность, кодирующая альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как фермент альдолаза HMG и/или KHG, с измененным использованием кодонов, по сравнению с использованием кодонов матричной нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления способ можно многократно повторять до тех пор, пока не будет получен ген фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, обладающий повышенным или сниженным уровнем экспрессии транскрипта или повышенной или пониженной стабильностью относительно уровня экспрессии или стабильности матричной нуклеиновой кислоты. Это изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине, при этом способ включает следующие стадии: (а) предоставление нуклеиновой кислоты по этому изобретению, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолазаHMG и/или KHG; и (b) идентификация непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте стадии (а) и замена его предпочтительным или нейтрально используемым кодоном,кодирующим ту же аминокислоту, что и замещенный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, более часто встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, более редко встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, таким образом модифицируя нуклеиновую кислоту для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине. Это изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG; при этом способ включает следующие стадии: (а) предоставление нуклеиновой кислоты по этому изобретению; и (b) идентификация кодона в нуклеиновой кислоте стадии (а) и замена его отличающимся кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замещенный кодон, таким образом модифицируя кодоны в нуклеиновой кислоте, кодирующей фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. Это изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине, при этом способ включает следующие стадии: (а) предоставление нуклеиновой кислоты по этому изобретению, кодирующей полипептид фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG; и (b) идентификация непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте стадии (а) и замена его предпочтительным или нейтрально используемым кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замещенный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, более часто встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительной кодон представляет собой кодон, более редко встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, таким образом модифицируя нуклеиновую кислоту для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине. Это изобретение относится к способам модификации кодона в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, для снижения его экспрессии в клетке-хозяине, при этом способ включает следующие стадии: (a) предоставление нуклеиновой кислоты по этому изобретению; и (b) идентификация по меньшей мере одного предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте стадии (а) и замена его непредпочтительным или менее предпочтительным кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замещенный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, более часто встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, более редко встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, таким образом модифицируя нуклеиновую кислоту для снижения ее экспрессии в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин может представлять собой бактериальную клетку, клетку грибов, клетку насекомых, клетку дрожжей, клетку растений или клетку млекопитающих. Это изобретение относится к способам получения библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных центров или участков связывания субстрата фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, где модифицированные активные центры или участки связывания субстрата получены из первой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую первый активный центр или первый участок связывания субстрата, при этом способ включает следующие стадии: (а) предоставление первой нуклеиновой кислоты, кодирующей первый активный центр или первый участок связывания субстрата, где последовательность первой нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, и нуклеиновая кислота кодирует активный центр фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, или участок связывания субстрата фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG; (b) предоставление набора мутагенных олигонуклеотидов, которые кодируют варианты встречающихся в природе аминокислот во множестве кодонов-мишеней первой нуклеиновой кислоты; и (с) использование набора мутагенных олигонуклеотидов для получения набора вариантов кодирующих активный центр или кодирующих участок связывания субстрата нуклеиновых кислот, кодирующих ряд аминокислотных вариантов в каждом кодоне аминокислоты, который был подвергнут мутагенезу, получая, таким образом, библиотеку нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных центров фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, или модифицированных участков связывания субстрата фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. В некоторых вариантах осуществления способ включает внесение мутаций в первую нуклеиновую кислоту стадии (а) способом, включающим оптимизированную систему направленных изменений, мутагенез с насыщением сайтов гена (GSSM), синтетическую пересборку лигированием (SLR), ПЦР с пониженной точностью, перетасовку, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, мутагенез посредством половой ПЦР, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, возвратномножественный мутагенез, экспоненциально-множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез,пересборку гена и их сочетание. В других вариантах осуществления способ включает внесение мутаций в первую нуклеиновую кислоту стадии (а) или ее варианты способом, включающим рекомбинацию, возвратную рекомбинацию последовательностей, мутагенез с модификацией ДНК фосфотиоатом, мутагенез с содержащей урацил матрицей, мутагенез с содержащими разрывы дуплексами, мутагенез с репарацией точек ошибочно спаренных оснований, мутагенез с дефектом репарации штамма-хозяина, химический мутагенез, мутагенез радиогенного происхождения, делеционный мутагенез, мутагенез с рестрикцией и селекцией, мутагенез с рестрикцией и исправлением ошибок, синтез искусственного гена, множественный мутагенез, получение химерного мультимера нуклеиновой кислоты и их сочетание. Это изобретение относится к способам получения низкомолекулярного соединения, включающим следующие стадии: (а) предоставление множества биосинтетических ферментов, способных синтезировать или модифицировать низкомолекулярное соединение, где один из ферментов содержит фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG; (b) предоставление субстрата по меньшей мере для одного из ферментов стадии (а); и (с) проведение реакции субстрата стадии(b) с ферментами в условиях, которые способствуют множеству биокаталитических реакций с получением посредством серии биокаталитических реакций низкомолекулярного соединения. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам модификации низкомолекулярного соединения, включающим следующие стадии: (а) предоставление фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, где фермент содержит полипептид по этому изобретению,или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по этому изобретению, или ее подпоследовательностями; (b) предоставление низкомолекулярного соединения; и (с) проведение реакции фермента стадии(а) с низкомолекулярным соединением стадии (b) в условиях, которые способствуют ферментативной реакции, катализируемой ферментом альдолазой, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, модифицируя, таким образом, низкомолекулярное соединение посредством ферментативной реакции с ферментом альдолазой, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. В некоторых вариантах осуществления способ может включать множество низкомолекулярных субстратов фермента стадии (а), формируя, таким образом, библиотеку модифицированных низкомолекулярных соединений, получаемых по меньшей мере одной ферментативной реакцией, катализируемой ферментом альдолазой, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. В некоторых вариантах осуществления способ может включать множество дополнительных ферментов в условиях, которые способствуют множеству биокаталитических реакций ферментов, с формированием библиотеки модифицированных низкомолекулярных соединений, получаемых множеством ферментативных реакций. В других вариантах осуществления способ может дополнительно включать стадию тестирования библиотеки для определения наличия в библиотеке конкретных модифицированных низкомолекулярных соединений,которые проявляют требуемую активность. Стадия тестирования библиотеки может дополнительно включать стадии систематического удаления всех, кроме одной, биокаталитических реакций, используемых для получения части из множества модифицированных низкомолекулярных соединений, из библиотеки, с исследованием части модифицированных низкомолекулярных соединений в отношении наличия или отсутствия конкретного модифицированного низкомолекулярного соединения с требуемой активностью, и идентификации по меньшей мере одной конкретной биокаталитической реакции, в результате которой образуется модифицированное низкомолекулярное соединение с требуемой активностью. Это изобретение относится к способам определения функционального фрагмента фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, включающим стадии: (а) предоставление фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, где фермент содержит полилептид по этому изобретению или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по этому изобретению, или ее подпоследовательностью; и (b) удаление множества аминокислотных остатков из последовательности стадии (а) и тестирование оставшейся подпоследовательности в отношении активности фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/илиKHG, таким образом, определяя функциональный фрагмент фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. В некоторых вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, измеряют получением субстрата фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG,и определением уменьшения количества субстрата или повышения количества продукта реакции. Это изобретение относится к способам инженерии цельных клеток с новыми или модифицированными фенотипами с использованием анализа метаболических изменений в реальном времени, при этом способ включает следующие стадии: (а) предоставление модифицированной клетки посредством модификации генетического набора клетки, где генетический набор модифицирован добавлением в клетку нуклеиновой кислоты по этому изобретению; (b) культивирование модифицированной клетки с получением множества модифицированных клеток; (с) измерение по меньшей мере одного параметра метаболизма клетки посредством мониторинга клеточной культуры стадии (b) в реальном времени; и (d) анализ данных стадии (с) для определения наличия отличий измеренного параметра от сравнительного показателя в немодифицированной клетке в аналогичных условиях, идентифицируя, таким образом, полученный способами инженерии фенотип клетки с использованием анализа метаболических изменений в реальном времени. В некоторых вариантах осуществления генетический набор клетки может быть моди- 17019971 фицирован способом, включающим удаление последовательности или модификацию последовательности в клетке, или нокаут экспрессии гена. В некоторых вариантах осуществления способ может дополнительно включать селекцию клетки, имеющей новый полученный способами инженерии фенотип. В других вариантах осуществления способ может включать культивирование отобранной клетки с получением, таким образом, нового клеточного штамма, имеющего новый полученный способами генетической инженерии фенотип. Это изобретение относится к способам повышения термоустойчивости или термостабильности полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, при этом способ включает гликозилирование полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза,такая как альдолаза HMG и/или KHG, где полипептид содержит по меньшей мере тридцать последовательно расположенных аминокислот полипептида по этому изобретению, или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты по этому изобретению, повышая, таким образом, термоустойчивость или термостабильность полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG. В некоторых вариантах осуществления специфичная активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, может быть термостабильной или термоустойчивой при температуре в диапазоне от более чем приблизительно 37 С до приблизительно 95 С. Это изобретение относится к способам сверхэкспрессии рекомбинантного полипептида фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, в клетке, включающим экспрессию вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеиновую кислоту по этому изобретению или последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению, где идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием, где сверхэкспрессии достигают с использованием промотора с высокой активностью, бицистронного вектора или амплификацией генов вектора. Это изобретение относится к способам получения трансгенного растения, включающим следующие стадии: (а) введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты по этому изобретению, получая, таким образом, трансформированную клетку растений; и (b) предоставление трансгенного растения из трансформированной клетки. В некоторых вариантах осуществления стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты электропорацией или микроинъекцией в протопласты клеток растений. В других вариантах осуществления стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты непосредственно в ткань растений бомбардировкой частицами ДНК. Альтернативно стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в ДНК клетки растений с использованием хозяина Agrobacterium tumefaciens. В некоторых вариантах осуществления клетка растений может представлять собой клетку сахарного тростника, свеклы,сои, томата, картофеля, кукурузы, риса, пшеницы, табака или ячменя. Это изобретение относится к способам экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетке растений, включающим следующие стадии: (а) трансформация клетки растений гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором,где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислоту по этому изобретению; (b) выращивание растения в условиях, при которых гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется в клетке растений. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетке растений, включающим следующие стадии: (а) трансформация клетки растений гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность по этому изобретению; (b) выращивание растения в условиях, при которых гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот экспрессируется в клетке растений. Это изобретение относится к кормам или продуктам питания, содержащим полипептид по этому изобретению или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к продуктам питания, кормам, жидкостям, таким как напитки (такие как фруктовые соки или пиво), хлебам или продуктам из теста или хлебным продуктам, или исходным продуктам для напитков (таким как сусло), содержащим полипептид по этому изобретению. В других вариантах осуществления это изобретение относится к продуктам питания, кормам или добавкам в напитки, содержащим полипептид по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к продуктам питания или питательным добавкам, например, для человека или животного, содержащим полипептид по этому изобретению, такой как полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления полипептид в продукте питания или в пищевой добавке может быть гликозилированным. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к пищевым основам для доставки ферментов, содержащим полипептид по этому изобретению, такой как по- 18019971 липептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления основа для доставки содержит гранулу. В некоторых вариантах осуществления полипептид может быть гликозилированным. В некоторых вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, является термоустойчивый. В других вариантах осуществления активность фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, такая как альдолазаHMG и/или KHG, является термостабильной. Это изобретение относится к продуктам питания, кормам или питательным добавкам, содержащим полипептид по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам применения фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолаза HMG и/или KHG, в качестве питательной добавки в рацион животного, при этом способ включает: предоставление питательной добавки, содержащей фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза HMG и/илиKHG, содержащую по меньшей мере тридцать последовательно расположенных аминокислот полипептида по этому изобретению; и введение питательной добавки животному. Животное может представлять собой человека, жвачное или моногастрическое животное. Фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, можно получать экспрессией полинуклеотида, кодирующего фермент альдолазу, такого как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, в организме,выбранном из группы, состоящей из бактерии, дрожжей, растения, насекомого, гриба и животного. Организм может быть выбран из группы, состоящей из S. pombe, S. cerevisiae, Pichia pastoris, E. coli, Streptomyces sp., Bacillus sp. Pseudomonas sp., Aspergillus sp. и Lactobacillus sp. Это изобретение относится к пищевым основам для доставки фермента, содержащим термостабильную рекомбинантную альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как фермент альдолаза HMG и/или KHG, такой как полипептид по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к способам доставки добавки в виде фермента альдолазы, такой как пируватальдолаза, альдолазы HMG и/или KHG, животному, при этом способ включает: предоставление пищевой основы для доставки фермента в форме гранул, содержащих гранулированный пищевой носитель и термостабильную рекомбинантную альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как фермент альдолазаHMG и/или KHG, где гранулы легко распределяют фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, находящуюся в них, в водных средах, и введение пищевой основы для доставки фермента животному. Рекомбинантный фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза,такая как альдолаза HMG и/или KHG, может содержать полипептид по этому изобретению. Фермент альдолаза, такая как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, может быть гликозилирован для обеспечения термостабильности в условиях образования гранул. Основа для доставки может быть образована гранулированием смеси, содержащей зернистое ядро и фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза HMG и/или KHG. Условия гранулирования могут включать применение пара. Условия гранулирования могут включать применение температуры более приблизительно 80 С в течение приблизительно 5 мин, и фермент сохраняет специфичную активность, составляющую по меньшей мере от 350 до приблизительно 900 единиц на миллиграмм фермента. В некоторых вариантах осуществления это изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим фермент альдолазу, такую как пируватальдолаза, альдолаза HMG и/или KHG, по этому изобретению или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция действует в качестве способствующего пищеварению средства. В некоторых вариантах осуществления содержащее углерод-углеродную связь соединение подвергают контактированию с полипептидом по этому изобретению, обладающим ферментной активностью альдолазы, такой как активность пируватальдолазы, такая как ферментная активность альдолазы HMG и/или KHG, при рН в диапазоне от приблизительно рН 3,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 3,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 3,0 до приблизительно 11,0 или более. В других вариантах осуществления содержащее углерод-углеродную связь соединение подвергают контактированию с ферментом альдолазой, такой как пируватальдолаза, такая как альдолаза HMG и/или KHG, при температуре по меньшей мере приблизительно 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 С или более. Это описание относится, помимо прочего, к полипептидам, которые пригодны для облегчения реакции в ходе получения монатина, производных монатина, и их солей, например в ходе получения N-2 гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (также обозначаемой как R-альфакетокислота монатина, предшественник R-монатина, R-MP, и альфакето-форма монатина), предшественника некоторых стереоизомеров монатина, таких как R,R- и S,R-монатин. Также описание относится к способам получения монатина, производных монатина и их солей и продуктов внутренней конденсации с использованием одного или нескольких полипептидов по этому изобретению. Способы синтеза R-MP, стереоизомеров монатина и/или стереоизомеров производных монатина включают применение одного или нескольких полипептидов с активностью альдолазы любой из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ IDNO:328, SEQ ID NO:330, SEQ ID NO:332 и SEQ ID NO:334, и их ферментативно активных фрагментов. Также способы синтеза R-MP, стереоизомеров монатина и/или стереоизомеров производных монатина могут включать применение полипептида с активностью альдолазы, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, обладающей по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87,88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более, или полной (100%) идентичностью последовательности с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, включая SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ IDNO:337 и SEQ ID NO:338 на протяжении участка по меньшей мере приблизительно из 10, 15, 20, 25, 30,35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950,1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850,1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более остатков. Более того, способы синтеза R-MP, стереоизомеров монатина и/или стереоизомеров производных монатина могут включать применение полипептида с активностью альдолазы, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотойNO:335, SEQ ID NO:336, SEQ ID NO:337 и SEQ ID NO:338. Это изобретение относится к способу, включающему получение продукта, выбранного из монатина,производных монатина, их солей и их сочетаний, в многостадийном каскаде, где реакцию в способе облегчают одним или несколькими полипептидами, выбранными из выделенных или рекомбинантных полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:324, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:330, SEQ ID NO:332 или SEQ ID NO:334, или их фрагментов или подпоследовательностей, обладающих активностью альдолазы. В некоторых вариантах осуществления фрагменты или их подпоследовательности обладают активностью альдолазы, состав- 21019971 ляющей по меньшей мере 0,2 мг МР/мг белка/ч. В других вариантах осуществления фрагменты или их подпоследовательности обладают активностью альдолазы по меньшей мере 0,1 мг МР/мг белка/ч. В некоторых вариантах осуществления реакцию, облегченную одним или несколькими полипептидами по этому изобретению, проводят в от приблизительно 1,0 до приблизительно 10,0 мМ MgCl2. В других вариантах осуществления реакцию облегченную одним или несколькими полипептидами по этому изобретению, проводят при от приблизительно рН 7,0 до приблизительно рН 11,5. В других вариантах осуществления реакцию облегченную одним или несколькими полипептидами по этому изобретению, проводят в от приблизительно 0,005% до приблизительно 1% детергенте полисорбате. В некоторых вариантах осуществления реакция представляет собой реакцию между индол-3 пируватом и источником С 3-углерода. В некоторых вариантах осуществления реакция предпочтительно приводит к R-2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоте относительно 3-2-гидрокси-2(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты. В некоторых вариантах осуществления продукт, полученный в многостадийном каскаде, представляет собой монатин, его соли и их сочетания. В других вариантах осуществления по меньшей мере один из R,R-монатина, R-S-монатина или их сочетания в многостадийном каскаде получают в большем количестве, чем либо 3,3-монатин, либо S,Rмонатин. В некоторых вариантах осуществления R,R-монатин получают в многостадийном каскаде в большем количестве, чем R,S-монатин, S,S-монатин и S,R-монатин. Это изобретение относится к способу, включающему получение продукта, выбранного из монатина,производных монатина, их солей и их сочетаний, в многостадийном каскаде, где реакцию в каскаде облегчают по меньшей мере одним полипептидом, кодируемым последовательностью нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность, обладающую процентной идентичностью последовательностей по меньшей мере 50% с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQNO:333, SEQ ID NO:335, SEQ ID NO:336, SEQ ID NO:337 или SEQ ID NO:338. В некоторых вариантах осуществления процентная идентичность последовательностей составляет по меньшей мере 95%. В других вариантах осуществления процентная идентичность последовательностей составляет 100%. Это изобретение относится к способу, включающему реакцию, которая предпочтительно приводит к R-2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоте относительно S-2-гидрокси-2-(индол-3 илметил)-4-кетоглутаровой кислоты, где по меньшей мере один полипептид, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, обладающей по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей с SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:148,SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:64, SEQ IDNO:236, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:240 и SEQ ID NO:156, используют для упрощения реакции в многостадийном каскаде. Это изобретение относится к способу, включающему получение продукта, выбранного из монатина,производных монатина, их солей и их сочетаний, в многостадийном каскаде, где реакцию в каскаде облегчают посредством по меньшей мере одного полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ IDNO:338. Также это изобретение относится к способу, включающему получение продукта, выбранного из предшественника монатина, его солей и их сочетаний, в многостадийном каскаде, где реакцию в каскаде облегчают посредством одного или нескольких полипептидов, выбранных из выделенных или рекомбинантных полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ IDNO:334 или их фрагментов, или подпоследовательностей, обладающих активностью альдолазы, где указанный предшественник монатина, его соли и их сочетания обладают сладким вкусом. Кроме того, это изобретение относится к способу, включающему получение продукта, выбранного из предшественника монатина, его солей и их сочетаний, в многостадийном каскаде, где реакцию облегчают посредством по меньшей мере одного полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность, обладающую процентной идентичностью последовательностей по меньшей мере 50% с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ IDNO:337 или SEQ ID NO:338, где указанный предшественник монатина, его соли и их сочетания обладают сладким вкусом. Кроме того, это изобретение относится к способу, включающему получение продукта, выбранного из предшественника монатина, его солей и их сочетаний, в многостадийном каскаде, где реакцию в каскаде облегчают посредством по меньшей мере одного полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ IDNO:338, где указанный предшественник монатина, его соли и их сочетания обладают сладким вкусом. Для краткости, когда в описании и формуле изобретения идентифицированы в качестве образующихся какие-либо промежуточные соединения/продукты (такие как монатин, предшественник монатина или производное(ые) монатина), следует понимать, что в них включен термин "и/или их соли", где это применимо. Иными словами, например, выражение "индол-3-пируват превращается в MP" следует понимать как "индол-3-пировиноградная кислота превращается в MP и/или его соли". В действительности,специалист в данной области поймет, что в представленных условиях реакции соли промежуточных соединений/продуктов действительно присутствуют. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ приводит к композиции монатина или производного монатина, где компонент композиции, представляющий собой монатин или производное монатина, включает только R,R- и S,R-формы монатина или производного монатина. Термин "только", когда его применяют для указания на то, что образуются только определенные изомеры, означает,что каскад приведет только к указанным изомерам, в отсутствие рацемизации. Таким образом, термин"только" не следует воспринимать как отсутствие других изомеров, а специалист в данной области скорее поймет, что могут быть представлены другие изомерные формы в относительно небольшом количестве вследствие рацемизации, которая может произойти. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ приводит к композиции, где компонент композиции, представляющий собой монатин или производное монатина, включает только R,R-форму монатина или производного монатина (за исключением степени происходящей рацемизации, что приводит к другим изомерным формам). Как используют в настоящем документе, выражение "композиция монатина" означает композиции,включающие один или несколько изомеров монатина; также термин может означать только одну изомерную форму монатин и ничего более. Как используют в настоящем документе, выражение "композиция производного монатина" означает композицию, включающую один или несколько изомеров производного монатина; также термин означает только одну изомерную форму производного монатина и ничего более. Как используют в настоящем документе, выражение "производное монатина" соответствует следующей структуре: где каждый из Ra, Rb, Rc, Rd и Re независимо представляют собой любой заместитель, выбранный из атома водорода, гидроксильной группы, C1-С 3 алкильной группы, группы C1-С 3 алкокси, аминогруппы или атома галогена, такого как атом йода, атом брома, атом хлора или атом фтора. Однако Ra, Rb, Rc, Rd иRe не могут все одновременно представлять собой водород. Альтернативно Rb и Rc и/или Rd и Re могут вместе образовывать группу С 1-С 4 алкилена, соответственно. Как используют в настоящем документе, "замещенный индол-3-пируват" означает, что один или несколько атомов углерода в индольном кольце индол-3-пирувата независимо замещены одним или несколькими из групп заместителей Ra, Rb, Rc, Rd и Re, определенных выше. Однако Ra, Rb, Rc, Rd и Re не могут все одновременно представлять собой водород. Альтернативно Rb и Rc и/или Rd и Re могут совместно образовывать группу С 1-С 4 алкилена соответственно. Как используют в настоящем документе, "замещенный триптофан" означает, что один или несколько атомов углерода индольного кольца триптофана независимо замещены одной или несколькими группами заместителей Ra, Rb, Rc, Rd и Re, определенными выше. Однако Ra, Rb, Rc, Rd и Re не могут все одновременно представлять собой водород. Альтернативно Rb и Rc и/или Rd и Re могут совместно образовывать группу С 1-С 4 алкилена соответственно. В одном варианте осуществления замещенный триптофан содержит ту же группу(ы) заместителя на индольном кольце, что и конечное производное монатина. Более того, в биосинтетических каскадах образования монатина, описанных в настоящем документе, может использоваться замещенный триптофан с образованием производных монатина, которые, вероятно, будут обладать сладким вкусом. В некоторых вариантах осуществления замещенный триптофан,подлежащий применению в биосинтетических каскадах, описанных в настоящем документе, включает хлорированный триптофан и 5-гидрокситриптофан. Например, хлорированные D-триптофаны, которые обладают структурным сходством с R,Rмонатином, были идентифицированы в качестве не обладающих пищевыми качествами подсластителей(в частности 6-хлор-D-триптофан). Аналогично было выявлено, что галогенированные и гидроксизамещенные формы монатина обладают сладким вкусом. Опубликованная патентная заявка США 2005/ 0118317. Галогены и гидроксильные группы могут поддаваться замещению водородом, в частности в положениях 1-4 бензольного кольца в индоле триптофана, без препятствования последующим превращениям в D- или L-триптофан, индол-3-пируват, MP или монатин. В литературе было показано, что замещенные индолы являются пригодными субстратами для PLP-ферментов и приводят к замещенным триптофанам. Fukuda, D. S., et al., "Production of Substituted L-Thryptophans by Fermentation," Appl. Environ.Microbiol., 21:841-43 (1971). Галоген, по-видимому, не является пространственным препятствием для каталитического механизма бета-субъединиц триптофансинтетазы, и энантиоспецифичность также не изменялась. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен процесс получения композиции монатина, который включает получение индол-3-пирувата из L-триптофана, получение 2 гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты ("предшественник монатина" или "MP") из индол-3-пирувата и получение монатина из MP. Реакцию L-триптофана с получением индол-3-пирувата облегчает фермент, обладающий большей специфичностью, большей аффинностью или обеими из них, в отношении L-триптофана, чем в отношении R-MP, R,R-монатина или обоих из них. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления реакцию индол-3-пирувата облегчает фермент, обладающий Rспецифичной активностью альдолазы, и, таким образом, она приводит к R-MP. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предусмотрен фермент рацемаза, который может облегчать эпимеризацию побочного продукта в виде аминокислоты в реакции триптофана из одной изомерной формы в другую изомерную форму. В некоторых вариантах осуществления этого изобретения предусмотрен процесс получения композиции монатина, который включает получение индол-3-пирувата из L-триптофана, получение 2 гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты ("предшественника монатина" или "MP") из индол-3-пирувата и получение монатина из MP. Реакцию L-триптофана с получением индол-3-пирувата облегчает фермент, обладающий большей специфичностью, большей активностью или обеими из них, в отношении L-триптофана, чем в отношении R-MP, R,R-монатина или обоих из них, и реакцию MP с образованием монатина облегчает фермент, который является стереоселективным в отношении R-MP. Термин "стереоселективный" означает, что фермент обладает большей специфичностью, большей активностью или обеими из них, в отношении одного изомера - в этом случае в отношении R-MP против S-MP- по сравнению с другим. В предпочтительных вариантах осуществления стереоселективный фермент обладает ограниченной активностью в отношении одного изомера по сравнению с другим. "Ограниченная" активность означает активность, которая является минимальной или неразличимой, например, при определении в соответствии с экспериментами, представленными в настоящем документе. Следует отметить, что, когда приведены ссылки на серии реакций, такие как в предшествующих абзацах, это изобретение не требует точного исполнения каждой стадии; достаточно, чтобы стадии были проведены подразумеваемым образом. Иными словами, например, процесс получения композиции монатина, который включает получение индол-3-пирувата из L-триптофана, получение 2-гидрокси-2-(индол 3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты ("предшественника монатина" или "MP") из индол-3-пирувата и получение монатина из MP, где каждую реакцию облегчает соответствующий фермент, можно проводить, комбинируя L-триптофан с ферментами и условиями, чтобы могли произойти перечисленные реакции. В таком случае L-триптофан может вступать в реакцию с образованием индол-3-пирувата, индол-3 пируват, полученный реакцией L-триптофана, может вступать в реакцию с образованием MP, и MP, полученный реакцией индол-3-пирувата, может вступать в реакцию с образованием монатина. Также процесс можно проводить, в качестве примера, предоставляя соединение, которое может приводить к Lтриптофану, в условиях, пригодных для образования L-триптофана, и комбинирование этого соединения с ферментами, способными облегчать указанные серии реакций, в условиях, которые могут быть пригодными для прохождения этих реакций. В качестве другого примера процесс можно проводить посредством предоставления микроорганизма, полученного способами генетической инженерии, для продукции монатина в соответствии с описанным каскадом, и обеспечением подходящих условий для прохождения процесса ферментации. Например, микроорганизм, который в природных условиях продуцирует большие количества L-триптофана, можно преобразовывать способами генетической инженерии для продукции или сверхпродукции одного или нескольких ферментов, используемых для облегчения реакций в каскаде образования монатина, и можно обеспечить пригодные условия, чтобы микроорганизм вследствие этого продуцировал монатин. В других вариантах осуществления этого изобретения предусмотрен процесс получения монатина,в котором субстрат образует L-аминокислоту, когда L-триптофан превращается в индол-3-пируват, индол-3-пируват реагирует с образованием MP (который может включать как R-MP, так и S-MP, хотя предпочтительно он включает только или в основном R-MP), и L-аминокислота вступает в реакцию с регенерацией (также называемой "повторным циклом") субстрата, когда R-MP превращается в R,R-монатин. Реакцию R-MP с образованием R,R-монатина облегчает стереоинвертирующая аминотрансфераза, такая как D-метионинаминотрансфераза (ЕС 2.6.1.41) или фермент, обладающий активностью Dфенилглицинаминотрансферазы. В других вариантах осуществления этого изобретения предусмотрен процесс получения композиции монатина, который включает получение D-триптофана из L-триптофана, получение индол-3 пирувата из D-триптофана, получение R-MP из индол-3-пирувата и получение R,R-монатина из R-MP. Получение D-триптофана из L-триптофана облегчает триптофанрацемаза и ее функциональные эквиваленты. В некоторых следующих вариантах осуществления реакцию D-триптофана с образованием индол 3-пирувата и MP с образованием монатина облегчает тот же фермент. В следующих вариантах осуществления реакцию индол-3-пирувата облегчает фермент, обладающий R-специфичной активностью альдолазы и, таким образом, образуется R-MP, и реакции D-триптофана с образованием индол-3-пирувата и RMP с образованием R,R-монатина облегчает тот же фермент. В некоторых вариантах осуществления этого изобретения предусмотрен процесс получения производного монатина, который включает получение производного монатина из замещенного индол-3 пирувата и пирувата, с использованием фермента, обладающего R-специфичной активностью альдолазы,для катализа реакции. Подробное описание одного или нескольких вариантов осуществления этого изобретения представлено в прилагаемых ниже рисунках и описании. Другие признаки, цели и преимущества этого изобретения будут очевидны из описания и чертежей, и из формулы изобретения. Как следует понимать из представленного в настоящем документе описания, возможны модификации изобретения в различных вариантах осуществления без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения. Таким образом,чертежи и подробное описание следует понимать по своему характеру как иллюстративные, а не ограничивающие. Все публикации, патенты, патентные заявки, последовательности из GenBank и депонированные в АТСС образцы, цитированные в настоящем документе, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме для любых целей. Краткое описание чертежей Представленные рисунки иллюстрируют варианты осуществления этого изобретения и не предназначены для ограничения объема этого изобретения, охватываемого формулой изобретения. На фиг. 1 представлена блок-схема, на которой показан пример ферментативного процесса получения R,R-монатина из L-триптофана по этому изобретению. В этом примере процесс включает применение L-аминотрансферазы (примеры которой включают L-триптофанаминотрансферазу, L-ароматическую аминотрансферазу, L-аспартатаминотрансферазу и L-аланинаминотрансферазу) в реакции с Lтриптофаном, которая обладает большей специфичностью и/или селективностью в отношении Lтриптофана в качестве субстрата, чем R-MP, и/или процесс включает применение оксидазы Lаминокислот с ограниченной активностью и/или специфичностью в отношении R,R-монатина в качестве субстрата. В конкретном примере схематически представленном на фиг. 1, L-аминотрансфераза или оксидаза L-аминокислот превращает L-триптофан в индол-3-пируват, индол-3-пируват подвергают реакции с R-специфичной альдолазой и пируватом с образованием R-альфа-кетокислоты монатина (R-MP), и RMP превращается в R,R-монатин D-аминотрансферазой или дегидрогеназой D-аминокислот. Как показано на фиг. 1, реакции являются обратимыми, однако для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции проходили в обратном направлении. На фиг. 2 представлена блок-схема, на которой показан другой пример получения R,R-монатина по этому изобретению. В этом примере процесс включает применение фермента для превращения R-MP в монатин, который является стереоселективным в отношении R-MP. В конкретном примере, схематично представленном на фиг. 2, показано, что триптофан превращается в индол-3-пируват в обратимой реакции. Индол-3-пируват можно подвергать реакции с нестереоспецифичной альдолазой с обратимым образованием альфа-кетокислоты монатина (как R-, так и S-MP). R-MP обратимо превращают в R,R-монатин с помощью стереоселективной D-аминотрансферазы или дегидрогеназы D-аминокислот. Любой S-MP,который образуется с помощью нестереоспецифичной альдолазы, может превращаться обратно в индол 3-пируват, если используют стереоселективную D-аминотрансферазу или дегидрогеназу D-аминокислот. Для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции, представленные как обратимые, протекали в обратном направлении. На фиг. 3 представлена блок-схема, на которой показан другой пример получения R,R-монатина изL-триптофана по этому изобретению. В этом примере процесс включает превращение L-триптофана в Dтриптофан с применением триптофанрацемазы, и применение продукта, представляющего собой Dаминокислоту, в реакции, сопряженной с реакцией образования индол-3-пирувата в качестве субстрата в реакции, сопряженной с реакцией образования R,R-монатина. В конкретном примере, схематично представленном на фиг. 3, L-триптофан превращают в D-триптофан с помощью триптофанрацемазы в обратимой реакции. D-триптофан подвергают реакции с альфа-кетоглутаратом (-KG) и Dаминотрансферазой широкой специфичности с образованием индол-3-пирувата и D-глутамата. Индол-3 пируват подвергают реакции с пируватом и R-специфичной альдолазой, и он превращается в R-альфа- 27019971 кетокислоту монатина (R-MP), и R-MP подвергают реакции с D-аминотрансферазой широкой специфичности и D-глутаматом с образованием R,R-монатина и альфа-кетоглутарата (-KG). Как показано на фиг. 3, каждая из реакций является обратимой, однако для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции протекали в обратном направлении. На фиг. 4 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения R,Rмонатина из L-триптофана по этому изобретению. В этом примере процесс включает превращение Lаминокислоты, образованной в реакции, сопряженной с реакцией L-триптофана, в D-аминокислоту; этаD-аминокислота действует в качестве донора амино для реакции, в которой R-MP превращается в R,Rмонатин. В конкретном примере, схематично представленном на фиг. 4, L-триптофан подвергают реакции с L-аминотрансферазой и альфа-кетоглутаратом с образованием индол-3-пирувата и L-глутамата. Индол-3-пируват подвергают реакции с пируватом и R-специфичной альдолазой, и он превращается в Rальфа-кетокислоту монатина (R-MP), и R-MP подвергают реакции с D-аминотрансферазой широкой специфичности и D-глутаматом с образованием R,R-монатина и альфа-кетоглутарата. Как показано на фиг. 4, реакции являются обратимыми, однако для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции протекали в обратном направлении. На фиг. 5 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения R,Rмонатина из L-триптофана по этому изобретению. В этом примере процесс включает ферментативное облегчение превращения R-MP в R,R-монатин с использованием стереоинвертирующего фермента, так что L-аминокислоту, образованную посредством реакции, сопряженной с реакцией L-триптофана, можно использовать в качестве субстрата для реакции, сопряженной с реакцией превращения R-MP в R,Rмонатин. В конкретном примере, схематично представленном на фиг. 5, L-триптофан подвергают реакции с L-аминотрансферазой и оксалоацетатом, пируватом или альфа-кетоглутаратом (-KG) с образованием индол-3-пирувата и L-аспартата (если используют оксалоацетат), L-аланина (если используют пируват) или L-глутамата (если используют -KG). Индол-3-пируват подвергают реакции с пируватом и Rспецифичной альдолазой, и он превращается в R-альфа-кетокислоту монатина (R-MP), и R-MP подвергают реакции со стереоинвертирующей аминотрансферазой и L-аспартатом, L-аланином или Lглутаматом с образованием R,R-монатина и оксалоацетата (если используют L-аспартат), пирувата (если используют L-аланин) или альфа-кетоглутарата (-KG, если используют L-глутамат). Как показано на фиг. 5, реакции являются обратимыми, однако для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции протекали в обратном направлении. На фиг. 6 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения R,Rмонатина по этому изобретению. В этом примере процесс включает повторное использование Lаминокислоты, образующейся в реакции образования индол-3-пирувата, с D-аминокислотой, используемой в качестве вещества, реагирующего с R-MP, в реакции образования R,R-монатина посредством серии реакций превращения. В конкретном примере, представленном на фиг. 6, L-триптофан подвергают обратимой реакции с L-аминотрансферазой и оксалоацетатом с образованием индол-3-пирувата и Lаспартата. Индол-3-пируват обратимо реагирует с пируватом и R-специфичной альдолазой, и он превращается в R-альфа-кетокислоту монатина (R-MP), и R-MP подвергают обратимой реакции с Dаминотрансферазой и D-аланином с образованием R,R-монатина и пирувата. L-аспартат превращают в Lаланин и CO2 с использованием аспартат-4-декарбоксилазы. L-аланин превращают в D-аланин с помощью аланинрацемазы. Для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции, представленные как обратимые, протекали в обратном направлении. На фиг. 7 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения R,Rмонатина в соответствии с настоящим изобретением. В этом примере процесс включает смещение в прямом направлении реакции L-триптофана (т.е. направление реакции на образование индол-3-пирувата) посредством превращения побочного продукта реакции, представляющего собой L-аминокислоту, в другой продукт. В этом примере побочный продукт, представляющий собой L-аминокислоту L-аспартат,превращают в L-аланин в необратимой реакции с использованием декарбоксилазы. В конкретном примере схематично представленном на фиг. 7, L-триптофан обратимо реагирует с L-аминотрансферазой и с альфа-кетоглутаратом (-KG) или оксалоацетатом с образованием индол-3-пирувата и L-глутамата (если используют -KG) или L-аспартата (если используют оксалоацетат). Индол-3-пируват обратимо реагирует с пируватом и R-специфичной альдолазой, и он превращается в R-альфа-кетокислоту монатин (RMP). R-MP подвергают обратимой реакции с D-аминотрансферазой и D-аминокислотой с образованиемR,R-монатина и любого из оксалоацетата, пирувата или -KG. L-глутамат или L-аспартат, который является продуктом реакции L-аминотрансферазы, превращают либо в 4-аминобутаноат и СО 2 (если субстратом является L-глутамат) или в (-аланин и СО 2 (если субстратом является L-аспартат) с использованием глутаминовой кислоты или аспартатдекарбоксилазы. Для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции, показанные как обратимые, протекали в обратном направлении. На фиг. 8 представлена блок-схема, на которой показан пример другого процесса получения R,Rмонатина в соответствии с настоящим изобретением. В этом примере процесс включает повторное использование побочного продукта, представляющего собой аминокислоту, реакции L-триптофана с реак- 28019971 тантом, представляющим собой аминокислоту, реакции R-MP, через серию реакций превращения. В конкретном примере, представленном на фиг. 8, L-триптофан подвергают обратимой реакции с Lаминотрансферазой и с альфа-кетоглутаратом (-KG) с образованием индол-3-пирувата и L-глутамата. Индол-3-пируват подвергают обратимой реакции с пируватом и R-специфичной альдолазой, и он превращается в R-альфа-кетокислоту монатина (R-MP). R-MP подвергают обратимой реакции с Dаминотрансферазой и D-аланином с образованием R,R-монатина и пирувата. L-аланинаминотрансферазу и пируват используют для обратимого превращения L-глутамата, который является побочным продуктом реакции L-аминотрансферазы, обратно в -KG, с L-аланином в качестве образующегося совместно с ним продукта. Аланинрацемаза обратимо превращает L-аланин в D-аланин, который пригоден в третьей реакции, реакции D-аминотрансферазы. Для целей этого изобретения не требуется, чтобы реакции, представленные как обратимые, протекали в обратном направлении. На фиг. 9 представлена блок-схема компьютерной системы. На фиг. 10 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления процесса сравнения новой нуклеотидной или белковой последовательности с последовательностями из базы данных в целях определения гомологии между новой последовательностью и последовательностями из базы данных. На фиг. 11 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления процесса в компьютере для определения наличия гомологии двух последовательностей. На фиг. 12 представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления работы идентификатора 300 в целях детекции наличия в последовательности характерного элемента. На фиг. 13 и 14 вместе проиллюстрированы виды активности 58 различных альдолаз (каждая из которых идентифицирована ее определенным номером SEQ ID) при образовании предшественника монатина (MP), как измеряют посредством LC/MS/MS. На фиг. 15 проиллюстрирован эффект дитиотреитола на продукцию монатина посредством полипептида с активностью альдолазы SEQ ID NO:88. Одинаковыми указывающими символами на различных рисунках показаны одинаковые элементы. Подробное описание Множество вариантов осуществления описано выше и более подробно ниже. Варианты осуществления этого изобретения включают один или несколько из описанных аспектов. Сокращения и термины Следующие ниже разъяснения терминов и способов представлены для лучшего описания настоящего описания и для того, чтобы специалисты в данной области руководствовались ими при осуществлении на практике настоящего описания. Как используют в настоящем документе, "включающий" означает"содержащий". Кроме того, формы единственного числа включают множественные упоминаемые объекты, если контекст явно не указывает на иное. Например, указание на "содержащий белок" включает один или множество таких белков, и указание на "содержащий клетку" включает указание на одну или несколько клеток и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и т.д. Термин "приблизительно" включает диапазон экспериментальных ошибок, которые встречаются при любом измерении. Если нет иных указаний, все измеренные значения предполагают наличие слова "приблизительно" перед ними, даже если слово "приблизительно" прямо не используется. Консервативная замена: замена одной аминокислоты другой аминокислотой в полипептиде, при этом замена незначительно влияет на активность полипептида или не влияет на нее. Замену считают консервативной независимо от наличия структурного или функционального сходства заменяемых аминокислот. Например, в идеальном случае полипептид триптофанаминотрансферазы, включающий одну или несколько консервативных замен, сохраняет активность триптофанаминотрансферазы. Полипептид,содержащий одну или несколько консервативных замен, можно получать манипулированием с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид, с использованием, например, стандартных способов, таких как сайт-направленный мутагенез или ПЦР, или других способов, известных в данной области. Неограничивающие примеры аминокислот, которые могут замещать исходную аминокислоту в белке и которые можно считать консервативными заменами в случае небольшого влияния, или его отсутствия, на активность полипептида, включают: Ala, замещенный посредством ser или thr; arg, замещенный посредством gln, his или lys; asn, замещенный посредством glu, gln, lys, his, asp; asp, замещенный посредством asn, glu или gln; cys, замещенный посредством ser или ala; gln, замещенный посредствомphe, tyr; tyr, замещенный посредством his, phe или trp; и val, замещенный посредством met, ile, leu. Дополнительная информация в отношении консервативных замен может быть найдена, помимо