Потомство и семя растения brassica, устойчивого к sclerotinia, и их применение для получения масла или муки

ПОТОМСТВО И СЕМЯ РАСТЕНИЯ BRASSICA, УСТОЙЧИВОГО К SCLEROTINIA, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МАСЛА ИЛИ МУКИ Изобретение относится к растению Brassica, в частности его потомству и семени этого потомства,обладающему устойчивостью к заболеванию, вызванному Sclerotinia sclerotiorum, с показателемSSDI% менее чем приблизительно 60% показателя SSDI% для контрольного сорта. Также предоставлены способы скрининга растения Brassica на устойчивость к Sclerotinia в поле. Кроме того, изобретение касается применения растения Brassica и его семени, получаемых по способу,раскрытому в изобретении, для получения масла и муки. Техническая область Настоящее изобретение относится к устойчивой к Sclerotinia Brassica. Изобретение также относится к новым способам скрининга устойчивости к Sclerotinia в теплице и в поле. Предпосылки изобретенияSclerotinia инфицирует более 100 видов растений, включая многочисленные экономически важные сельскохозяйственные культуры, такие как виды Brassica, подсолнечника, зрелой фасоли, соевых бобов,полевого гороха, чечевицы, латука и картофеля (Boland and Hall, 1994). Sclerotinia sclerotiorum отвечает за более 99% заболеваний, вызванных Sclerotinia, в то время как Sclerotinia minor вызывает менее чем 1% заболеваний. Sclerotinia образует склероции неправильной формы, темные перезимовывающие тела, которые могут сохраняться в почве от четырех до пяти лет. Склероции могут развиваться с образованием плодовых тел или с образованием мицелия, в зависимости от окружающих условий и типов растительного покрова. Два типа развития вызывают два разных типа заболеваний. Склероции, которые развиваются с образованием плодовых тел, образуют апотеции и аскоспоры, которые инфицируют надземные ткани,приводя к заболеванию стеблей, стеблевой гнили, гнили кочанов, гнили бобов, белой гнили и заболеванию цветков растений. Склероции, которые развиваются с образованием мицелия, образуют мицелии,которые инфицируют ткани корня, вызывая гниль корневой шейки, корневую гниль и гниль основания стебля.Sclerotinia приводит к стеблевой гнили, вызванной Sclerotinia, также известной как белая гниль, уBrassica, включая канолу. Канола представляет собой тип Brassica, содержащий низкий уровень глюкозинолатов и эруковой кислоты в семенах. Склероции развиваются с образованием плодовых тел летом,образуя апотеции. Апотеции высвобождают разносимые ветром аскоспоры, которые распространяются вплоть до одного километра. Заболеванию способствуют условия влажной почвы (по меньшей мере 10 суток при или вблизи нормальной влагоемкости) и температуры 15-25 С перед цветением канолы и в ходе него. Споры не способны непосредственно инфицировать листья и стебли; они должны сначала попасть на цветки, опавшие лепестки и пыльцу на стеблях и листьях. Возраст лепестков влияет на эффективность инфекции, более старые лепестки с большей вероятностью подвержены инфекции (Heran et al.,1999). Грибные споры используют части цветка в качестве источника пищи по мере своего прорастания и инфицирования растения. Тяжесть инфекции, вызванной Sclerotinia, у Brassica варьирует и зависит от продолжительности инфекции и климатических условий (Heran et al., 1999). Заболеванию способствуют холодные температуры и продолжительные периоды осадков. Температуры между 20 и 25 С и относительные влажности более 80% необходимы для оптимального инфицирования растения (Heran et al., 1999). Для конкретных полей сообщали о потерях, варьирующих от 5 до 100% (Manitoba Agriculture, Food and Rural Initiatives,2004). В среднем, потери урожая равны от 0,4 до 0,5 величины процентной доли инфекции. Например,если поле инфицировано на 20% (20/100 инфицированных растений), то потеря урожая, возможно, составит приблизительно 10%. Более того, Sclerotinia может вызывать значительные потери во влажных валках. Sclerotinia sclerotiorum вызывает экономические убытки для фермеров, выращивающих канолу, в Миннесоте и Северной Дакоте в размере 17,3, 20,8 и 16,8 млн долларов в 1999, 2000 и 2001 г. соответственно (Bradley et al., 2006). Симптомы инфекции, вызванной Sclerotinia, обычно развиваются спустя несколько недель после начала цветения. На растениях развиваются участки повреждения, от бледно-серых до белых, на линии почвы или выше ее и на более высоких ветвях и стручках. Инфекции часто развиваются на месте соединения листа и стебля, так как там задерживаются инфицированные лепестки. Как только растения инфицированы, гриб продолжает врастать в стебель и проникать в здоровую ткань. Инфицированные стебли выглядят обесцвеченными и склонны к расщеплению. Твердые черные склероции гриба развиваются внутри инфицированных стеблей, ветвей или стручков. Растения, инфицированные в период цветения,производят мало семян или не производят их. Растения с окольцованными стеблями преждевременно увядают и созревают. Сильно инфицированные сельскохозяйственные культуры часто полегают, раздробляются при валковании и делают валкование занимающим более продолжительное время. Инфекции могут возникать во всех надземных частях растения, в особенности, в плотных или полегших насаждениях, где контактирование растения с растением облегчает распространение инфекции. Новые склероции переносят заболевание в следующий сезон. Общепринятые способы борьбы с заболеваниями, вызванными Sclerotinia, включают (а) химические меры борьбы, (b) устойчивость к заболеванию и (с) агротехнические меры борьбы, каждый из которых описан ниже.(a) Фунгициды, такие как беномил, винклозолин и ипродион, остаются основным способом борьбы с заболеванием, вызванным Sclerotinia (Morall et al., 1985; Tu, 1983). В последнее время разработаны дополнительные фунгицидные композиции для применения против Sclerotinia, включая азоксистробин,протиоконазол и боскалид (Johnson, 2005). Однако применение фунгицида является дорогостоящим и может приносить вред потребителю и окружающей среде. Более того, вследствие многократного применения возникла устойчивость к некоторым фунгицидам.(b) Для определенных сортов бобов, сафлоры, подсолнечника и соевых бобов, достигнут опреде-1 018509 ленный прогресс в развитии частичной (неполной) устойчивости. Частичную устойчивость часто обозначают как толерантность. Однако успех в развитии частичной устойчивости оказался очень ограниченным, вероятно вследствие того, что частичная физиологическая устойчивость является мультигенным признаком, как продемонстрировано на бобах (Fuller et al., 1984). В дополнение к частичной физиологической устойчивости, достигнут определенный прогресс в селекции на морфологические признаки, чтобы предотвратить инфекцию, вызванную Sclerotinia, такие как прямостоячая форма роста, устойчивость к полеганию и незначительный растительный покров. Например, бобовые растения с частичной физиологической устойчивостью и с прямостоячим положением, незначительным растительным покровом и неопределенной формой роста оказались лучше всего способными противостоять Sclerotinia (Saindon etal., 1993). Для рано созревающих сортов сафлора показана хорошая устойчивость на полях к Sclerotinia. В заключение, у соевых бобов характеристики сорта, такие как высота, раннее созревание и значительная устойчивость к полеганию приводят к уменьшению заболеваемости, в основном вследствие ухудшения условий микроклимата, благоприятных для заболевания (Boland and Hall, 1987; Buzzell et al., 1993).(с) Агротехнические способы, такие как использование свободных от патогена или обработанных фунгицидом семян, повышение расстояния между рядами, снижение нормы высева семян для уменьшения вторичного распространения заболевания и закапывание склероций для предотвращения развития с образованием плодовых тел могут снижать заболеваемость, вызванную Sclerotinia, но не могут эффективно бороться с заболеванием. Все генотипы канадской канолы подвержены стеблевой гнили, вызванной Sclerotinia (Manitoba Agriculture, Food and Rural Initiatives, 2004). Они включают в себя все известные яровые генотипы сортов канолы. Также отсутствует устойчивость к Sclerotinia у австралийских сортов канолы (Hind-Lanoiselet etal., 2004). Некоторые сорта с определенными морфологическими признаками лучше приспособлены противостоять инфекции, вызванной Sclerotinia. Например, польские сорта (Brassica rapa) образуют более слабый растительный покров и, как представляется, обладают значительно меньшими уровнями инфицирования. Кроме того, безлепестковые сорта (апетальные сорта) в значительной степени не подвержены инфекции, вызванной Sclerotinia (Okuyama et al., 1995; Fu, 1990). Другие примеры морфологических признаков, которые придают до некоторой степени снижение восприимчивости в полевых условиях у генотипов Brassica, включают повышенную устойчивость к полеганию, пониженное сохранение лепестков,ветвление (менее компактное и/или более высокое) и раннее опадение листьев. Jurke and Fernando (2003) осуществили скрининг одиннадцати генотипов канолы на распространенность заболевания, вызванногоSclerotinia. Значительную вариацию распространенности заболевания объясняли морфологией растения,и различия в сохранении лепестков идентифицировали в качестве наиболее важного фактора. Однако эти морфологические признаки сами по себе не придают устойчивость к Sclerotinia, и все образцы канолы в Канаде считаются подверженными инфекции, вызванной Sclerotinia. Озимые генотипы канолы также подвержены инфекции, вызванной Sclerotinia. В Германии, например, отсутствуют устойчивые к Sclerotinia сорта (Specht, 2005). Широко культивируемый немецкий сортExpress считается подверженным-умеренно подверженным и принадлежит к группе менее подверженных сортов/гибридов (см. табл. 4). Опрыскивание фунгицидом является единственным способом борьбы со Sclerotinia у сельскохозяйственных культур канолы, выращиваемых в условиях, благоприятных для заболевания в период цветения. Типичные фунгициды, используемые для борьбы со Sclerotinia у Brassica, включают роврал отBayer и ронилан/ланс от BASF. Активный ингредиент в лансе представляет собой боскалид, и его продают в США как эндуру. Фунгицид следует применять перед появлением видимых симптомов стеблевой гнили и обычно на стадии 20-30% цветения сельскохозяйственной культуры. Если инфекция уже заметна, то нет смысла в применении фунгицида, так как уже слишком поздно для развития эффекта. Следовательно, фермеры должны оценивать свои поля на риск заболевания, чтобы решить, стоит ли применять фунгицид. Это можно осуществить с использованием предоставляемого правительством проверочного листа или с использованием набора для тестирования лепестков. Любой из способов является трудоемким и склонным к ошибкам (Hind-Lanoiselet, 2004; Johnson, 2005). Осуществлены многочисленные попытки разработки устойчивых к Sclerotinia растений Brassica. Врожденная устойчивость, вероятно, является более подходящей, экономичной и безвредной для окружающей среды, чем борьба со Sclerotinia посредством применения фунгицидов. Так как признак является полигенным, он, вероятно, является стабильным и не склонным к утрате эффективности, как это может происходить с фунгицидами. Яровая канола (Brassica napus subsp. oleifera var. annua) отличается от озимой канолы (Brassica napussubsp. oleifera var. biennis) в основном отсутствием потребности в облигатной яровизации. Азиатские сорта рапса и канолы обладают потребностью в яровизации от низкой до промежуточной и известны как полуозимые типы. В то время как озимая канола не способна завершить свой репродуктивный цикл при посадке весной, посадка ранней весной и воздействие холодом позволяет азиатским растениям цвести и давать семена. Азиатские растения не способны завершить свой репродуктивный цикл при посадке поздней весной. В контролируемых условиях для озимых растений необходимо 12-14 недель яровизации, в то время как для азиатских растений необходимо 2-8 недель. В табл. 1 суммированы различия между озимыми, полуозимыми (азиатскими) и яровыми сортами канолы. Таблица 1 Основные характеристики характера роста у растений Brassica napus Канадские, европейские и австралийские яровые растения можно сажать и выращивать при любых внешних условиях или времени посадки для яровой канолы. Некоторые китайские (полуозимые) сорта рапса/канолы частично устойчивы к Sclerotinia. Например, в ChunYun et al., 2003, HanZhong et al., 2004, XeiXin et al., 2002, YongJu et al., 2000, ChaoCai et al.,1998, описаны частично устойчивые сорта рапса. Однако некоторые из этих сортов не являются сортами канолы, и все они нуждаются в яровизации. Частичная устойчивость в полевых условиях у китайских сортов берет начало преимущественно от сорта рапса Zhong you 821. Несмотря на улучшение частичной устойчивости у Zhong you 821, его реакция на заболевание менее стабильна в условиях окружающей среды, благоприятных для развития Sclerotinia (Yunchang et al., 1999). Это указывает на более низкий уровень частичной устойчивости (Li et al., 1999). Некоторые японские сорта рапса обладают частичной устойчивостью стебля к Sclerotinia. Частичную устойчивость стебля выявили испытаниями в закрытом помещении по сравнению с озимой канолой(Brun et al., 1987). Однако эти сорта не являются сортами канолы и относятся к полуозимым типам (см. табл. 1). Селекция на устойчивость к Sclerotinia в полевых условиях у канолы очень затруднена вследствие количественной природы данного признака. Более того, включение физиологической устойчивости наряду с морфологическими признаками, которые не подвержены или менее подвержены инфекции, повышает сложность селекции на устойчивость. Кроме того, как оказалось, очень сложно осуществлять скрининг на устойчивость вследствие непосредственного взаимодействия окружающей среды (т.е. требований к температуре и влажности, а также требований к микроокружению) с популяцией растений. Как указано выше, не существует канадских яровых сортов Brassica с устойчивостью к Sclerotinia, это несмотря на многие годы совместной эволюции и воздействия окружающей среды на отбор данного признака. Наиболее высокий достигнутый уровень устойчивости в полевых условиях у рапса (и, недавно, у некоторых образцов канолы) получен с помощью попыток селекции в Китае, как описано для Zhong you 821 (Yunchang et al., 1999). Уровни такой частичной устойчивости или толерантности являются относительно низкими, так как применение фунгицидов по-прежнему рекомендовано для всех сортов рапса и канолы в Китае (устное сообщение) (Baocheng et al., 1999). Очевидно, что сорта Brassica и канолы с высокими уровнями устойчивости к Sclerotinia не обнаружены в природе. Сорта канолы Brassica napus выведены в 1970 годах. Несмотря на 30 лет значительных усилий, затраченных на селекцию, до настоящего момента не выведено сортов канолы, устойчивых к Sclerotinia. Попытки селекции включали, чтобы назвать несколько, анализ локусов, ответственных за количественные признаки (Zhao-Jianwei et al., 2003), селекцию с помощью мутагенеза (Mullins et al., 1999; WuYanyou et al., 1996; LiangHong et al., 2003), попытки обширного скрининга (Sedune et al., 1989; Zhao et al.,2004), и скрининг на экспрессирующиеся маркерные последовательности (EST) (Rugang et al., 2004). Выведено несколько яровых сортов канолы с умеренной толерантностью к Sclerotinia (Ahmadi et al., 2000a;Ahmadi et al., 2000b; BaoMing et al., 1999; Liu et al., 1991), однако уровень толерантности является низким и линии не способны противостоять сильному воздействию заболевания. Недавно выведена трансгенная канола, несущая ген оксалатоксидазы (патент США 6166291 и выделенные из него патенты); однако существуют регламентирующие и социальные проблемы, связанные с трансгенными растениями. Озимые генотипы канолы с устойчивостью к Sclerotinia также нуждаются, как отмечено, в использовании фунгицидов (Johnson, 2005). Следовательно, необходимо значительное техническое вмешательство человека для выведения сортов канолы, которые устойчивы к Sclerotinia. Сущность изобретения Аспект настоящего изобретения относится к растению Brassica или группе растений с улучшенной устойчивостью к Sclerotinia sclerotiorum. В одном из аспектов изобретение относится к потомству ярового растения Brassica napus, где растение или группа растений являются представителями популяции, где популяция обладает средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного Sclerotinia sclerotiorum, (SSDI%), которое составляет менее чем приблизительно 60% показателя SSDI% для Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 76, или дляPioneer Hi-Bred сорта 46 А 65, или среднего значения показателя SSDI% для двух сортов, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле. Растение Brassica napus или группа растений могут также являться представителями популяции, где популяция обладает средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного Sclerotinia sclerotiorum, (SSDI%), которое составляет менее чем 50, 35 или 20% показателя для Pioneer Hi-Bred сорт 46 А 76, или для Pioneer Hi-Bred сорт 46 А 65, или среднего значения показателя для двух сортов. Другой аспект настоящего изобретения относится к потомству озимого растения Brassica napus, где растение или группа растений являются представителями популяции, где популяция обладает средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного Sclerotinia sclerotiorum (SSDI%), которое составляет менее чем приблизительно 60% показателя SSDI% для сорта Columbus, или для сортаExpress, или среднего значения показателя SSDI% для двух сортов, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле. Озимое растение Brassica napus или группа растений могут также являться представителями популяции, где популяция обладает средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного Sclerotinia sclerotiorum, (SSDI%), которое составляет менее чем 50, 35 или 20% показателя для сорта Columbus, или для сорта Express, или среднего значения показателя для двух сортов. При этом яровое растение или группа растений по изобретению представляет популяцию, характеризуемую, по меньшей мере, следующими признаками: (а) твердый компонент семян популяции, содержащий количество глюкозинолата менее чем 30 мкмоль/г не содержащего масла твердого вещества,(b) масло из семян растения, содержащее менее чем 2% эруковой кислоты, (с) 50% период цветения между приблизительно 30-90 сутками и (d) показатель SSDI%, который составляет менее чем приблизительно 60% показателя SSDI% для Pioneer Hi-Bred сорт 46 А 76, или для Pioneer Hi-Bred сорт 46 А 65, или среднего значения показателя для двух сортов в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле. Растение Brassica napus может также являться представителем популяции, где популяция обладает средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного Sclerotiniasclerotiorum, (SSDI%), которое составляет менее чем 50, 35 или 20% показателя для Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 76, или для Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 65, или среднего значения показателя для двух сортов. Озимое растение Brassica napus или группа растений по изобретению представляет популяцию, характеризуемую, по меньшей мере, следующими признаками: (а) твердый компонент семян популяции,содержащий количество глюкозинолата менее чем 30 мкмоль/г не содержащего масла твердого вещества, (b) масло из семян популяции, содержащее менее чем 2% эруковой кислоты, (с) 50% период цветения между приблизительно 30-90 сутками и (d) показатель SSDI%, который составляет менее чем приблизительно 60% показателя SSDI% для сорта Columbus или для сорта Express, или среднего значения показателя SSDI% для двух сортов, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле. Озимое растение Brassica napus или группа растений могут также являться представителями популяции,где популяция обладает средним значением показателя распространенности заболевания, вызванногоSclerotinia sclerotiorum, (SSDI%), которое составляет менее чем 50, 35 или 20% показателя для сорта Columbus, или для сорта Express, или среднего значения показателя для двух сортов. Растение Brassica napus по изобретению может представлять потомство яровой линии Brassica(a) Групповое добавление S3 из 03SN40341, депонированное под инвентарнымАТСС РТА-6776; или удвоенная гаплоидная линия, полученная из 03SN40341 и депонированная под инвентарнымАТСС РТА-6780.(b) Групповое добавление S3 из 03SN40441, депонированное под инвентарнымАТСС РТА-6779; или удвоенная гаплоидная линия, полученная из 03SN40441 и депонированная под инвентарнымАТСС РТА-6778.(c) Групповое добавление F4 из 02SN41269, депонированное под инвентарнымАТСС РТА-6777; или удвоенная гаплоидная пиния, полученная из 02SN41269 и депонированная под инвентарнымАТСС РТА-6781.(d) Группа S2, обозначенная 04SN41433, депонированная под инвентарнымNCIMB 41389, или удвоенная гаплоидная линия, полученная из 04SN41433 и депонированная под инвентарнымNCIMB 41391.(e) Группа S2, обозначенная 04SN41415, депонированная под инвентарнымNCIMB 41388, или удвоенная гаплоидная линия, полученная из 04SN41415 и депонированная под инвентарнымNCIMB41390.(См. также табл. 11 а). Растение Brassica napus по изобретению может представлять потомство озимой линии Brassica(См. также табл. 11b). Другой аспект изобретения относится к потомству любого из растений Brassica napus, где указанное потомство получено выделением придающего устойчивость к Sclerotinia признака с помощью удвоенной гаплоидии, и где однородная популяция, содержащая указанное потомство, обладает показателемSSDI%, который составляет менее чем приблизительно 60% показателя SSDI% для (1) Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 76, или Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 65, или среднего значения показателя для двух сортов, где популяция обладает яровым характером роста, или (2) для сорта Columbus, или сорта Express, или среднего значения показателя для двух сортов, где популяция обладает озимым характером роста, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле. Другой аспект настоящего изобретения относится к применению ярового растения Brassica napus,где растение является представителем популяции, которая обладает показателем SSDI%, который составляет менее чем приблизительно 60% показателя SSDI% для Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 76, или дляPioneer Hi-Bred сорта 46 А 65, или среднего значения показателя для двух сортов в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле, для выращивания сельскохозяйственной культуры для получения масла и кормовой муки, или для селекции новой линии Brassica. Растение можно обозначить как 03SN40341, 03SN40441, 02SN41269, 04DHS12921, 04DHS11319 или 04DHS11418, где семена представителей депонированы под инвентарнымАТСС: РТА-6776, РТА-6779, РТА-6777, РТА-6781, РТА 6780 или РТА-6778 соответственно, указанные семена депонированы 8 июня 2005 г. или приблизительно в это время; или его можно обозначить как 04SN41433, 04SN41415, 05DHS12897 или 04DHS12879, где семена представителей депонированы под инвентарнымNCIMB 41389, 41388, 41391 или 41390 соответственно. Другой аспект настоящего изобретения относится к применению озимого растения Brassica napus,где растение является представителем популяции, которая обладает показателем SSDI%, который составляет менее чем приблизительно 60% показателя SSDI% для сорта Columbus или для сорта Express,или среднему значению показателя для двух сортов, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле, для выращивания сельскохозяйственной культуры для получения масла и кормовой муки, или для селекции новой линии Brassica. Растение можно обозначить как 04CWB930127,04CWB930128, 04CWB930081, 04CWB930111, 04CWB930144, 04CWB930135 или 04CWB930015, где семена представителей депонированы под инвентарнымNCIMB: 41395, 41396, 41393, 41394, 41398,41397 или 41392 соответственно. Краткое описание фигур Фиг. 1 представляет собой гистограмму 5-10 циклов популяции Т от 2000-2005 при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях. Ось Y представляет собой частоту у потомков. Ось X представляет собой ранжирование 1-9 по SSDI для Sclerotinia, как описано в табл. 4. На фиг. 2 представлены агрономические данные и данные для Sclerotinia для конкретных устойчивых к Sclerotinia яровых линий канолы. Данные для Sclerotinia представлены в виде % для 46 А 76, 46 А 65 и их среднего значения. Часть А содержит агрономические данные и данные для Sclerotinia при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях. Часть В содержит данные для поля в естественных условиях. Часть С содержит объединенные результаты части А и части В. ЧастьD представляет собой часть В, где данные одного испытания в поле в естественных условиях (NDSU 2005) опущены. Часть Е содержит объединенные результаты части А и части D.I. Краткий обзор. В настоящем изобретении описаны первые линии канолы с низким содержанием эруковой кислоты и низким содержанием глюкозинолата, обладающие яровым или озимым характером развития и обладающие высокими уровнями устойчивости в полевых условиях к Sclerotinia. Устойчивость в полевых условиях основана на накоплении обычной частичной физиологической устойчивости к Sclerotinia в сочетании с морфологическими признаками, которые функционируют синхронно в направлении снижения развития заболевания. Существует несколько аспектов этого изобретения. Первый аспект состоит в разработке устойчивых к Sclerotinia линий канолы. Этот аспект изобретения описан в примерах 1, 2, 3, 4, 8 и 9. Это является первым сообщением о яровых линиях канолы, обладающих средним уровнем распространенности Sclerotinia менее чем приблизительно 60% от уровня распространенности для Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 76, или для Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 65, или среднего значения показателя для двух сортов в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле, как измерено с помощью показателя SSDI%; или об озимых линиях канолы, обладающих средним уровнем распространенности Sclerotinia менее чем приблизительно 60% от уровня распространенности для сорта Columbus или сорта Express, или среднего значения показателя для двух сортов в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле, как измерено с помощью показателя SSDI%. Непосредственное техническое вмешательство человека для генетического манипулирования и постепенного накопления многочисленных физиологических и морфологических признаков в течение шести лет усилий по выведению и селекции (2000-2005), обусловленное 15 годами исследований (1991-2005),привело к созданию яровых линий канолы с устойчивостью к Sclerotinia. Коллекции семян, представляющие улучшенные линии, получены, как подробно описано в других местах данного документа,включая табл. 11 а и 11b. Второй аспект изобретения состоит в разработке линий канолы с сочетанием устойчивости к Sclerotinia и устойчивости к черной ножке. Усилия по выведению и селекции, описанные в примерах 1, 2, 3 и 4, не только привели к получению линий с устойчивостью к Sclerotinia, но также привели к получению линий, обладающих устойчивостью к черной ножке. Постепенное накопление многочисленных физиологических и морфологических признаков в течение шести лет усилий по выведению и селекции, обусловленное пятнадцатью годами исследований, привело к созданию линий с устойчивостью к Sclerotinia, и также с устойчивостью к черной ножке. Этот аспект изобретения описан в примере 5. Третий аспект изобретения состоит в разработке способов скрининга на устойчивость к Sclerotinia в теплице или фитотроне и в поле. Разработка этих способов являлась одним из критических факторов успеха в разработке устойчивых к Sclerotinia линий и устойчивых к черной ножке линий по изобретению,описанных в примерах 1, 2, 3, 4 и 5. Этот аспект описан в примерах 6 и 7.II. Способы селекции канолы. В программах селекции канолы используют способы, такие как массовая и рекуррентная селекция,возвратное скрещивание, селекция "педигри" и получение удвоенных гаплоидов. Для общего описания селекции рапса и канолы см. R.K. Downey and G.F.W. Rakow, 1987: Rapeseed and Mustard (In: Fehr, W.R.Breeding winter oilseed rape Brassica napus. Advances in Applied Biology 7:1-104; Oilseed Rape, Ward, et al.,Farming Press Ltd., Wharefedale Road, Ipswich, Suffolk (1985), каждая из которых приведена здесь в качестве ссылки. Скрещивание между двумя разными гомозиготными линиями приводит к однородной популяции гибридных растений (также называемых гибридными растениями F1), которая может являться гетерозиготной по многим генным локусам. Скрещивание двух гетерозиготных растений, которые отличаются по ряду генных локусов, будет приводить к популяции растений, которые генетически различны и будут однородными. Несмотря на происхождение, растения, которые подвергали самоопылению и отбирали по типу в течение многих поколений, становятся гомозиготными почти по всем генным локусам и дают однородную популяцию потомства настоящей чистой линии. Термин "инбредный", как применяют здесь,относится к гомозиготному растению или коллекции гомозиготных растений. Рядовым специалистам станет понятно, что некоторая остаточная гетерозиготность может существовать у инбредных растений. Выбор способов выведения или селекции зависит от способа размножения растений, наследуемости признака(ов), которые подвергают улучшению, и типа коммерчески используемого сорта (например,гибридный сорт F1, сорт чистой линии и т.д.). Для очень хорошо наследуемых признаков выбор лучших индивидуальных растений, оцениваемых в одном месте, будет эффективным, в то время как для признаков с низкой наследуемостью селекция должна быть основана на средних величинах, полученных из повторных оценок семейств родственных растений. Популярные способы селекции обычно включают селекцию "педигри", модифицированную селекцию "педигри", массовую селекцию и рекуррентную селекцию. Сложность наследования влияет на выбор способа селекции. Как правило, селекцию начинают со скрещивания двух генотипов, каждый из которых может обладать одной или несколькими требуемыми характеристиками, которые отсутствуют в другом генотипе, или которые дополняют другой генотип. Если два исходных родителя не обеспечивают всех требуемых характеристик, то можно включить другие источники посредством осуществления большего количества скрещиваний. В каждом последующем дочернем поколении, от F1 к F2, от F2 к F3, от F3 к F4, от F4 к F5 и т.д., растения подвергают самоопылению для повышения гомозиготности линии. Как правило, в программе селекции используют пять или более поколений селекции и самоопыления для получения гомозиготного растения. Селекцию "педигри" обычно используют для улучшения самоопыляющихся сельскохозяйственных культур. Два родителя, которые обладают подходящими, взаимодополняющими признаками, скрещивают для получения F1. Популяцию F2 получают посредством самоопыления одного или нескольких F1 или посредством родственного опыления двух F1. Селекцию лучших индивидуумов можно начинать в популяции F2; затем, начиная в F3, отбирают лучшие индивидуумы в лучших семействах. Повторное тестирование семейств можно начинать в поколении F4 для улучшения эффективности селекции признаков с низкой наследуемостью. На поздней стадии инбридинга (т.е. F6 и F7) лучшие линии или смеси фенотипически аналогичных линий тестируют на потенциальное получение в качестве новых сортов. Селекцию с возвратным скрещиванием используют для переноса генов для легко наследуемых,очень хорошо наследуемых признаков от родителя-донора в требуемый оптимально гомозиготный сорт,который используют в качестве рекуррентного родителя. Источник признаков, которые подвергают переносу, называют родителем-донором. После начального скрещивания отбирают индивидуумы, обладающие требуемым признаком или признаками родителя-донора, и затем повторно скрещивают (подвергают возвратному скрещиванию) с рекуррентным родителем. Полученное растение, как ожидают, обладает признаками рекуррентного родителя плюс требуемый признак или признаки, перенесенные от родителя-донора. Этот способ широко используют для селекции устойчивых к заболеванию сортов. Каждая программа селекции канолы должна включать периодическую, объективную оценку эффективности процедуры селекции. Критерии оценки варьируют в зависимости от цели и требований, но должны включать выгоду от селекции за год на основе сравнений с подходящим стандартом, общую величину перспективных селекционных линий и количество успешных сортов, полученных на единицу затрат (например, за год, на потраченный доллар и т.д.). Различные способы рекуррентной селекции используют для улучшения количественно наследуемых признаков, контролируемых многими генами. Использование рекуррентной селекции в самоопыляющихся сельскохозяйственных культурах зависит от простоты опыления и количества гибридного потомства из каждого успешного скрещивания. Массовую селекцию и рекуррентную селекцию можно использовать для улучшения популяций или само- или перекрестно опыляющихся сельскохозяйственных культур. Генетически вариабельную популяцию гетерозиготных индивидуумов или идентифицируют, или получают с помощью перекрестного скрещивания нескольких разных родителей. Лучшие растения отбирают на основе индивидуального преимущества, перспективного потомства или прекрасной скрещиваемости. Селектируемые растения перекрестно скрещивают для получения новой популяции, в которой продолжают осуществлять дополнительные циклы селекции. Способ получения поколения одного семени в узком смысле относится к посадке расщепляющейся популяции, собиранию образца по одному семени с растения и использованию односемянного образца для посадки следующего поколения. Когда популяцию получают из F2 до требуемого уровня инбридинга, тогда каждое из растений, из которых получены линии, будет приводить к разным индивидуумам F2. Количество растений в популяции снижается с каждым поколением вследствие неспособности к прорастанию для некоторых семян или вследствие неспособности некоторых растений давать по меньшей мере одно семя. В результате не все растения F2, исходно взятые в качестве образцов в популяции, будут представлены в виде потомства, когда получение поколения будет закончено. В способе с использованием множества семян селекционеры канолы обычно собирают один или несколько стручков или длинных стручков с каждого растения в популяции и обмолачивают их вместе для образования массы семян. Часть массы используют для посадки следующего поколения и часть оставляют в запасе. Способ обозначают как модифицированное получение поколения одного семени или способ со смешиванием стручков. Способ с множеством семян используют для уменьшения трудозатрат при сборе урожая. Значительно быстрее обмолачивать стручки машиной, чтобы затем взять по одному семени из каждого рукой для способа с одним семенем. Способ с использованием множества семян также делает возможным посадку одинакового количества семян из популяции каждого поколения инбридинга. Собирают достаточное количество семян для компенсации тех растений, которые не прорастают или не дают семян. При необходимости можно использовать удвоенный гаплоидный способ для выделения однородных линий,таким образом повышая обеспечение семенами с требуемым генотипом. Молекулярные маркеры, включающие способы, такие как электрофорез изоферментов, полиморфизмы длин рестрикционных фрагментов (RFLP), случайным образом амплифицируемые полиморфные ДНК (RAPD), полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами (AP-PCR), фингерпринтинг амплифицированной ДНК (DAF), амплифицированные области с охарактеризованной последовательно-7 018509 стью (SCAR), полиморфизмы длин амплифицированных фрагментов (AFLP), простые повторяющиеся последовательности (SSR) и полиморфизмы одиночных нуклеотидов (SNP), можно использовать в способах селекции растений. Одно из применений молекулярных маркеров состоит в картировании локусов количественных признаков (QTL). Картирование QTL представляет собой применение маркеров, которые, как известно, тесно связаны с аллелями, которые обладают измеримыми эффектами на количественный признак. Селекция в процедуре выведения основана на накоплении маркеров, связанных с аллелями, обладающими положительным эффектом, и/или элиминацией маркеров, связанных с аллелями,обладающими отрицательным эффектом, из генома растений. Молекулярные маркеры можно также использовать в ходе процедуры селекции для селекции качественных признаков. Например, маркеры, тесно связанные с аллелями, или маркеры, содержащие последовательности в пределах фактически интересующих аллелей, можно использовать для селекции растений, которые содержат интересующие аллели, в ходе программы селекции с помощью возвратного скрещивания. Маркеры можно также использовать для отбора генома рекуррентного родителя и против маркеров родителя-донора. С использованием этого способа можно минимизировать количество генома родителя-донора, которое остается в селектируемых растениях. Его также можно использовать для уменьшения количества возвратных скрещиваний с рекуррентным родителем, необходимых для программы возвратного скрещивания. Использование молекулярных маркеров в процедуре селекции часто называют селекцией, усиленной генетическими маркерами, или маркер-вспомогательной селекцией(MAS). Получение удвоенных гаплоидов (Swanson et al., 1987) можно также использовать для получения инбредных растений в программе селекции. После осуществления скрещивания можно использовать способы с получением удвоенных гаплоидов для быстрого получения гомозиготного растения. У Brassica napus используют способ культивирования микроспор для получения гаплоидных эмбрионов. Гаплоидные эмбрионы затем регенерируют в подходящих средах в виде гаплоидных проростков, удваивание хромосом которых приводит к удвоенным гаплоидным растениям. Это может обладать преимуществами вследствие того, что из процедуры исключают поколения с самоопылением, необходимые для получения гомозиготного растения из гетерозиготного источника. Система контроля опыления и эффективный перенос пыльцы от одного родителя к другому обеспечивают улучшенную селекцию растений и эффективный способ получения семян и растений гибридов канолы. Например, система цитоплазматической мужской стерильности Ogura (cms), разработанная с помощью слияния протопластов редьки (Raphanus sativus) и рапса (Brassica napus), представляет собой один из наиболее часто используемых способов получения гибридов. Она дает стабильную экспрессию признака мужской стерильности (Ogura, 1986; Pelletier et al., 1983) и эффективный ядерный генвосстановитель (Pellan-Dourme et al., 1988). При разработке улучшенных новых гибридных сортов Brassica селекционеры используют самонесовместимые (SI), обладающие цитоплазматической мужской стерильностью (CMS) и ядерной мужской стерильностью (NMS) растения Brassica в качестве женского родителя. При использовании этих растений селекционеры пытаются улучшить эффективность получения семян и качество гибридов F1 и уменьшить затраты на селекцию. Когда гибридизацию проводят без использования растений SI, CMS или NMS, то более трудно получить и выделить требуемые признаки в потомстве (поколение F1) вследствие того, что родители могут подвергаться как перекрестному опылению, так и самоопылению. Если один из родителей является растением SI, CMS или NMS, то оно неспособно производить пыльцу, будет происходить только перекрестное опыление. При удалении пыльцы одного из родительских сортов при скрещивании селекционер растений уверен в получении гибридных семян однородного качества при условии, что родители обладают однородным качеством, и селекционер осуществляет одиночное скрещивание. В одном из случаев получение гибридов F1 включает скрещивание женского родителя CMS Brassica с продуцирующим пыльцу мужским родителем Brassica. Для эффективного воспроизведения, однако, мужской родитель гибрида F1 должен обладать геном восстановления фертильности (ген Rf). Наличие гена Rf означает, что поколение F1 не будет полностью или частично стерильным так, что может происходить или самоопыление или перекрестное опыление. Самоопыление поколения F1 для получения нескольких последующих поколений важно, чтобы гарантировать, что требуемый признак наследуется и стабилен и что выделен новый сорт. Примером растения Brassica, которое обладает цитоплазматической мужской стерильностью и его используют для селекции, является растение с цитоплазматической мужской стерильностью Ogura(OGU) (R. Pellan-Delourme et al., 1987). Восстановитель фертильности для растений с цитоплазматической мужской стерильностью Ogura перенесен от Raphanus sativus (редька) к Brassica в Instit. National deRecherche Agricole (INRA) в Rennes, Франция (Pelletier et al., 1987). Ген-восстановитель Rfl, происходящий из редьки, описан в WO 92/05251 и в Delourme et al. (1991). Разработаны улучшенные версии этого восстановителя. Например, см. WO 98/27806 для масличных культур Brassica, содержащих улучшенный ген-восстановитель фертильности для цитоплазматической мужской стерильности Ogura, который приведен здесь в качестве ссылки. Другие источники и усовершенствования стерильности CMS у канолы включают растение с цитоплазматической мужской стерильностью Polima, а также те, которые описаны в патенте США 5789566,последовательность ДНК, сообщающая цитоплазматическую мужскую стерильность, митохондриальный геном, ядерный геном, митохондрии и растение, содержащие указанную последовательность и способ получения гибридов; патенте США 5973233, система получения цитоплазматической мужской стерильности в гибридах канолы; и WO 97/02737, система получения цитоплазматической мужской стерильности в гибридах канолы; патентной заявке ЕР 0599042 А, способы введения гена-восстановителя фертильности и получения посредством этого гибридов F1 растений Brassica; патенте США 6229072, система получения цитоплазматической мужской стерильности в гибридах канолы; патенте США 4658085, гибридизация с использованием цитоплазматической мужской стерильности, цитоплазматической устойчивости к гербицидам и устойчивости к гербицидам из ядерных генов; все из которых приведены здесь. Многообещающие перспективные селекционные линии обычно тестируют и сравнивают с подходящими стандартами в окружающей среде, представляющей коммерческую целевую область(и). Лучшие линии являются кандидатами для новых коммерческих линий; и те, которые все еще лишены некоторых из признаков, можно использовать в качестве родителей для получения новых популяций для дальнейшей селекции. Для большинства признаков истинная генотипическая ценность может маскироваться другими привходящими признаками растения или факторами окружающей среды. Один из способов идентификации лучшего растения состоит в исследовании его характеристик по сравнению с другими экспериментальными растениями и с одной или несколькими широко выращиваемыми стандартными линиями. Если одиночное исследование неубедительно, то повторные исследования обеспечивают лучшую оценку генетической ценности. Селекционер использует различные способы для облегчения определения того, какие растения следует отбирать из расщепляющихся популяций и, в конечном итоге того, какие линии будут использовать с коммерческими целями. В дополнение к знанию зародышевой плазмы и другим навыкам, которые использует селекционер, часть процедуры селекции зависит от планирования эксперимента в сочетании с использованием статистического анализа. Планирование эксперимента и статистический анализ используют для облегчения определения того, какие растения, какие семейства растений и, наконец, какие линии значимо лучше или отличаются по одному или нескольким интересующим признакам. Способы планирования эксперимента используют для контролирования ошибки так, что различия между двумя линиями можно определить более точно. Статистический анализ включает вычисление средних величин,определение статистической значимости источников вариации и вычисление подходящих компонентов вариации. Значимость на уровне пяти и одного процентов, как правило, используют для определения того, является ли отличие, которое существует для данного признака, действительным, или оно возникает вследствие воздействия окружающей среды или экспериментальной ошибки. Надлежащее тестирование должно детектировать любые основные ошибки и устанавливать уровень преимущества или улучшения по сравнению с существующими линиями. В дополнение к обладанию лучшими характеристиками, должна существовать потребность в новой линии, которая совместима с промышленными стандартами или которая создает новый рынок. Внедрение новой линии, как правило,будет приводить к дополнительным затратам для производителя семян, фермера, обрабатывающего предприятия и потребителя, на специальную рекламу и маркетинг, изменение способов получения семян и коммерческого производства, и использование нового продукта. Тестирование, предшествующее выпуску в продажу новой линии, должно учитывать исследовательские затраты и затраты на разработку, а также техническое преимущество конечной линии. Для линий, размножающихся семенами, получение семян должно быть осуществимо без труда и экономично. Предпочтительно, остаточная гетерозиготность не должна превышать 5%. Эти стадии, которые приводят к последней стадии маркетинга и распределения, как правило, занимают приблизительно от шести до двенадцати лет от времени осуществления первого скрещивания. Таким образом, разработка новых линий, таких как линии по настоящему изобретению, является продолжительным по времени процессом, который требует точного перспективного планирования, эффективного использования ресурсов и минимальных изменений в направлении. Следовательно, необходимо значительное техническое вмешательство человека. Более того, как результат развития систем стерильности, получены линии, которые можно использовать в качестве сорта с открытым опылением (т.е. сорта чистой линии, проданного фермеру для посадки) и/или в качестве стерильного инбредного растения (женского), используемого для получения семян гибрида F1. В последнем случае, может потребоваться подходящая скрещиваемость с восстановителем(мужским). Полученные семена гибрида можно затем продавать фермеру для посадки. Получение гибридных семян канолы можно достичь с использованием цитоплазматической мужской стерильности. При этом типе получения гибрида используют 3 инбредных линии: линию восстановителя, А-линию и В-линию. Линию восстановителя, также называемую R-линией, используют в качестве мужского растения при получении гибридных семян. Линия восстановителя содержит доминантные ядерные гены, известные как гены-восстановители, которые отвечают за фертильность гибрида. R-линию скрещивают с А-линией для получения гибридных семян F1. А-линия обладает мужской стерильностью благодаря цитоплазме и благодаря невосстанавливающим аллелям в ядерном геноме. Вследствие того,что А-линия обладает мужской стерильностью, она не может самовоспроизводиться. Для получения Алинии разработана В-линия. В-линия, также называемая поддерживающей линией, является генетическим эквивалентом А-линии, за исключением того, что В-линия обладает нормальной цитоплазмой и обладает, таким образом, мужской фертильностью. А-линию опыляют с помощью В-линии. Семена, развивающиеся на растениях А-линии, собирают и их потомство скрещивают с R-линией для получения гибридных семян F1. Получение гибрида канолы по программе селекции растений канолы включает три стадии: (1) селекцию растений из различных пулов зародышевой плазмы для начальных селекционных скрещиваний;(2) самоопыление селектируемых растений из селекционных скрещиваний в течение нескольких поколений для получения серий инбредных линий, которые, хотя отличаются друг от друга, выводятся в чистоте и высокооднородны; и (3) скрещивание селектируемых инбредных линий с другими инбредными линиями для получения гибридов. В ходе процесса инбридинга у канолы жизнеспособность линий снижается. Жизнеспособность восстанавливается, когда две разные инбредные линии скрещивают для получения гибрида. Важное следствие гомозиготности и гомогенности инбредных линий состоит в том, что гибрид между определенной парой инбредных растений всегда будет одинаковым. Как только идентифицировали инбредные растения, которые дают лучший гибрид, гибридные семена можно воспроизводить неопределенное количество времени при условии поддержания гомогенности инбредных родителей. Скрещиваемость линии, а также характеристики линии как таковой, являются фактором в селекции улучшенных линий канолы, которые можно использовать в качестве инбредных. Скрещиваемость обозначает вклад линии в качестве родителя при скрещивании с другими линиями для образования гибридов. Гибриды, получаемые с целью отбора лучших линий, обозначают как аналитические скрещивания. Один из способов измерения скрещиваемости осуществляют с использованием селекционных показателей. Селекционные показатели основаны на суммарном среднем значении количества аналитических скрещиваний. Это среднее значение затем поправляют для исключения эффектов окружающей среды и поправляют на известные генетические взаимоотношения между линиями. Получение гибридных семян требует инактивации пыльцы, произведенной женским родителем. Неполная инактивация пыльцы дает возможность самоопыления. Эти семена, возникшие путем случайного самоопыления, можно непреднамеренно собрать и упаковать с гибридными семенами. Аналогично,вследствие того, что мужского родителя выращивают рядом с женским родителем в поле, существует также вероятность того, что семя, возникшее путем самоопыления мужского растения, можно непреднамеренно собрать и упаковать с гибридными семенами. После посадки семян из гибридной тары возможно идентифицировать и селектировать эти растения, возникшие путем самоопыления. Эти растения, возникшие путем самоопыления, будут генетически эквивалентны одной из инбредных линий, используемых для получения гибрида. Хотя существует возможность попадания инбредных семян в тару с гибридными семенами, событие является редким вследствие того, что уделяют большое внимание, чтобы избежать таких попаданий. Эти растения, возникшие путем самоопыления, может идентифицировать и селектировать специалист в данной области, или с помощью визуальных или молекулярных способов. Растения канолы Brassica napus без какой-либо системы мужской стерильности или самонесовместимости, как показано, обычно являются самофертильными с приблизительно 70-90% нормально образующихся семян в результате самоопыления. Процентную долю перекрестного опыления можно дополнительно увеличить, если популяции общепризнанных насекомых-опылителей в данном участке выращивания обладают большей численностью. Таким образом, открытое опыление часто используют для коммерческого получения канолы.III. Определения. Единицы, приставки и символы можно обозначать в принятой для них форме СИ."Подходящий контроль", как применяют здесь, означает генотип Brassica, который обеспечивает основу для оценки устойчивости к Sclerotinia для экспериментальной линии. Подходящий контроль выращивают в тех же условиях окружающей среды, включая воздействие заболевания, как экспериментальную линию, и он обладает приблизительно той же степенью зрелости, как экспериментальная линия. Например, для яровой канолы ожидают, что подходящий контроль созревает в пределах 10 суток,обычно 5 суток для экспериментальной линии. Стандарты степени зрелости хорошо известны специалисту в данной области. Подходящий контроль обычно представляет собой широкодоступный или широко выращиваемый сорт. Термин "подходящий контроль" может фактически отражать множество подходящих сортов. Например, для яровых генотипов канолы каждый из сортов Pioneer Hi-Bred 46 А 76 и 46 А 65 является подходящим контролем; средние характеристики для двух сортов являются также подходящим контролем. Для озимых генотипов канолы каждая из общедоступных линий Columbus и Express является подходящим контролем, а также средние характеристики для двух сортов. Термин "канола" означает растение Brassica, где масло должно содержать менее чем 2% эруковой кислоты, и твердый компонент семян должен содержать менее чем 30 мкмоль любого одного или любой смеси из 3-бутенилглюкозинолата, 4-пентенилглюкозинолата, 2-гидрокси-3-бутенилглюкозинолата и 2 гидрокси-4-пентенилглюкозинолата на 1 г высушенного на воздухе, не содержащего масла твердого вещества. Термин "скрещиваемый" или "скрещивание" в контексте данного изобретения означает слияние гамет посредством опыления для получения потомства (т.е. клеток, семян или растений). Термин относится как к половому скрещиванию (опыление одного растения другим), так и к самоопылению (самоопыление, т.е. когда пыльца и яйцеклетка происходят из одного и того же растения). Термин "нормальная влагоемкость" означает, что верхние 4 дюйма почвы, или приблизительно верхние 4 дюйма почвы, полностью насыщены влагой, но без стоячей воды или с небольшим ее количеством. Термин "устойчивость в полевых условиях" означает устойчивость, измеренную в полевых условиях. Он отражает устойчивость целого растения или популяции растений при воздействии вредителя или патогена в естественных полевых условиях. Устойчивость в полевых условиях можно измерять на всех стадиях развития растения и можно выразить в терминах эффекта на собранный урожай, или она может отражать целенаправленную оценку в ходе стадии роста, когда растение наиболее подвержено развитию заболевания. Термин "генетически сцепленный (связанный)" относится к генетическим локусам, которые находятся в неравновесии по сцеплению и, как статистически выявлено, не распределяются независимым образом. Генетически сцепленные локусы распределяются зависимым образом от 51 до 99% случаев или выражаются любой целочисленной величиной между этими значениями, предпочтительно по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95 или 99%. Термин "инбредный", как применяют здесь, относится к гомозиготному растению или коллекции гомозиготных растений. Рядовым специалистам станет понятно, что у инбредных растений может существовать некоторая остаточная гетерозиготность. Термин "интрогрессия" относится к введению требуемого генетического локуса в, по меньшей мере, одно потомство растения посредством полового скрещивания между родительскими растениями, и где, по меньшей мере, одно из родительских растений обладает требуемым генетическим локусом в своем геноме. Термин "частичная устойчивость листьев" означает степень устойчивости листьев к Sclerotinia по сравнению с реакцией листьев на подверженном растении. При наличии частичной устойчивости листьев заболевание развивается более медленно на растении или в меньшей степени по сравнению с подверженным растением. Термин "маркер" или "молекулярный маркер" относится к генетическому локусу, используемому в качестве контрольной точки при идентификации генетически сцепленных локусов, таких как QTL (локусы количественных признаков). Термин также относится к последовательностям нуклеиновых кислот,комплементарных геномным последовательностям, таких как нуклеиновые кислоты, используемые в качестве зондов. Термин "частичная устойчивость стебля" или "устойчивость стебля" означает неполную устойчивость стебля. Он обозначает степень устойчивости стебля к Sclerotinia по сравнению с реакцией стебля у подверженного растения. При частичной устойчивости стебля заболевание развивается более медленно на растении или в меньшей степени по сравнению с подверженным растением. Однако в случае растения, которое обладает "частичной устойчивостью стебля", растение заболевает (по сравнению с полной устойчивостью). Термин "полная устойчивость" означает устойчивую реакцию, при которой развитие аспекта заболевания, обычно проявление симптома или размножение патогена, полностью прекращается (по сравнению с частичной устойчивостью). Термин "рекуррентная селекция" означает систему селекции с целью повышения частоты подходящих генов количественно наследуемой характеристики посредством повторной гибридизации и циклов селекции. Термин "степень зрелости" или "сутки до достижения зрелости" означает количество суток от посадки семян до сбора урожая. Степень зрелости будет значительно варьировать между генотипами и внутри них, в зависимости от места, сезона выращивания и даты посадки семян. Термин "популяция", как применяют здесь, означает внутриселекционную группу растений или группу индивидуумов, которые обладают общим пулом генов. Популяция может являться гомогенной(генетически однородной), такой как популяция F1, полученная скрещиванием гомозиготных родителей; или генетически различной, такой как расщепляющееся потомство популяции, полученной самоопылением гетерозиготного растения или скрещиванием гетерозиготных родителей. Более того, гомогенную популяцию можно подвергнуть селекции, чтобы получить гомозиготность почти по всем генным локусам и получить однородную популяцию потомства настоящей чистой линии. Термин "селекция популяции" относится к улучшению популяции, осуществляемому посредством селекции с использованием индивидуумов из той же самой популяции в качестве родителей. Селекция популяции может означать осуществление рекуррентной селекции в пределах популяции. Термин "яровая Brassica" или "яровая канола" означает растение Brassica, которое не нуждается в яровизации. Термин "морфология, способствующая инфекции Sclerotinia" или "фенотип, способствующий инфекции Sclerotinia" означает фенотип Brassica, при котором инфекция Sclerotinia может возникнуть и развиться более легко по сравнению с фенотипом Brassica, который менее подвержен инфекции Sclerotinia. Например, морфология, способствующая инфекции Sclerotinia, может включать по меньшей мере один из следующих морфологических признаков: густое ветвление, низкое ветвление, увеличенная продолжительность цветения, высокая сохранность лепестков, высокая степень сохранности листьев и предрасположенность полеганию или нагибанию. Эти морфологические признаки являются хорошим источником начальной инокуляции с лепестков и повышению влажности в окружении растения. В противоположность этому, растения, обладающие морфологическими признаками, которые менее способствуют инфекции Sclerotinia, могут включать по меньшей мере один из следующих признаков: низкая сохранность лепестков, безлепестковый фенотип, хорошая устойчивость к полеганию, менее компактное ветвление, высокое ветвление и раннее опадение листьев. Эти морфологические признаки снижают инокуляцию с лепестков, а также уровень влажности в окружении растения. Термин "распространенность заболевания" означает количество растений в выборке, пораженных заболеванием. Его, как правило, представляют в виде процентной доли растений, пораженных заболеванием, по отношению к суммарному количеству растений в выборке. Термин "SSDI%" означает процентную долю распространенности заболевания, вызванного Sclerotinia Sclerotiorum, и ее измеряют как процентную долю растений в популяции, инфицированных Sclerotinia sclerotiorum. Термин "SSDI" означает ранжирование от 1 до 9 и измерение распространенности заболевания, вызванного Sclerotinia Sclerotiorum, при контролируемом экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях, как описано в примере 7 и табл. 4. Посредством SSDI измеряют процентную долю растений в популяции, которые инфицированы Sclerotinia sclerotiorum, по сравнению с подходящим контрольным сортом. Для яровой канолы подходящий контроль представляет собой PioneerHi-Bred, сорт 46 А 76, и/или Pioneer Hi-Bred, сорт 46 А 65. Для озимой канолы подходящий контроль представляет собой Columbus и/или Express. Например, для яровой канолы 5 рядов тестируемых линий засевают между одним рядом Pioneer Hi-Bred, сорт 46 А 76, с одной стороны и Pioneer Hi-Bred, сорт 46 А 65, с другой. Как правило, в экстремальных условиях для заболевания Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 76 обладает распространенностью заболевания 60% (SSDI%), и 46 А 65 обладает распространенностью заболевания 70% (SSDI%), со средним значением 65% (SSDI%). Если на каком-либо конкретном опытном участке среднее значение SSDI% для Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 65 и Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 76 не составляет 65%, показатели для Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 65 и Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 76 следует умножить на фактор, чтобы довести их среднего значения 65%. Показатели для тестируемых линий также следует умножить на этот фактор. Затем следует произвести ранжирование линий, которое соответствует SSDI%,как представлено в табл. 4. Например, если среднее значение для контролей составляет 70%, следует использовать фактор 65/70 для снижения процентной доли распространенности заболевания, измеренной для экспериментальных линий, растущих между контролями, вследствие превышения планируемого воздействия заболевания. Наоборот, если среднее значение составляет 60%, следует использовать фактор 65/60 для соответствующего увеличения (коррекции) SSDI% для экспериментальных линий вследствие снижения воздействия заболевания по сравнению с планируемым. Хотя планируемая распространенность заболевания составляет 65%, ожидается отклонение от планируемой распространенности вследствие большой выборки растений, изменений окружающей среды и изменений инокулята, таким образом,коррекции посредством контролей позволяют сравнивать линии внутри участка и предотвращают неправильную классификацию реакции в полевых условиях. Экстремальное воздействие заболевания в экспериментальных полевых условиях, как описано в примере 7, широко использовали для получения устойчивых к Sclerotinia линий по изобретению, так как условия, подходящие для Sclerotinia, не возникают в природе предсказуемым образом. Таким образом, пытаясь ускорить селекцию и обеспечить воспроизводимые условия, использовали экстремальное воздействие заболевания в экспериментальных полевых условиях. Ранжирование по SSDI для испытаний после коррекции на распространенность дополнительно корректируют, принимая в расчет тяжесть заболевания. Таким образом, после коррекции SSDI%, как объяснено выше, коррекции SSDS также осуществлены. Среднее значение SSDS у инфицированных растений для контролей (показатели 1-8) сравнивают со значением для экспериментальных образцов. Если среднее значение показателя SSDS лучше у экспериментальной линии (например, ранг 3 для контролей по сравнению с 4 для экспериментальной линии), то SSDI% корректируют умножением на 3/4. Например, еслиSSDI% экспериментальной линии составлял 20%, 3/4 умножали на 20% = 15%. Это соответствует рангу 7,5 на шкале SSDI. Наоборот, если SSDS для экспериментальных образцов составлял 2 (более пораженные) против 3 для контролей, то SSDI% следует умножить на 3/2. Например, если SSDI% составлял 20%,то при умножении на 3/2 должен равняться 30%. Это соответствует рангу 6,0 на шкале SSDI. Термин "экстремальное воздействие заболевания в экспериментальных полевых условиях" означает контролируемые условия для исследования заболевания, как описано в примере 7. Например, экстремальное воздействие заболевания получают путем применения семян масличного нуга в виде носителя,мимикрирующего колонизированные Sclerotinia лепестки. Природный инокулят может присутствовать в поле в виде резервного инокулята. Процент распространенности заболевания тестируемых растений корректируют на используемые контроли, как описано выше, и представляют в виде показателя SSDI от 1 до 9. Однако в этих экстремальных условиях растения более подвержены инфицированию Sclerotinia, по меньшей мере, по следующим причинам: (1) при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях растения подвержены воздействию влажности, обусловленной мелкокапельным орошением, которое способствует развитию Sclerotinia, (2) при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях растения находятся в полузакрытой окружающей среде благодаря искусственному навесу, который обеспечивает условия постоянной влажности, благоприятные для развития Sclerotinia, и (3) при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях используют шесть рядов разных тестируемых растений на каждом участке, таким образом,любой ряд тестируемых растений, обладающих специфическим морфологическим фенотипом, может находиться в окружении двух разных рядов растений с другими морфологическими фенотипами. Следовательно, любые преимущества морфологического фенотипа, который менее подвержен инфекции Sclerotinia (например, высокое ветвление), снижаются вследствие того, что каждый ряд может быть окружен растениями, обладающими другим морфологическим фенотипом (например, низкое ветвление). Наоборот, растение, растущее в естественных полевых условиях (1) не находится под искусственным навесом,который обеспечивает постоянную влажность, и (2) его выращивают на участках в окружении растений с таким же морфологическим фенотипом, которое обеспечивает выявление всех преимуществ морфологии. Следовательно, отобранные растения, обладающие морфологией, которая менее подвержена инфицированию Sclerotinia, например высоким ветвлением, функционируют значительно лучше в естественных полевых условиях по сравнению с экстремальным воздействием заболевания в экспериментальных полевых условиях. Термин "естественные полевые условия для заболевания" означает условия на участках для получения урожая на орошаемых или неорошаемых полях. Инфицирование происходит посредством лепестков, колонизированных мицелием. Участки для получения урожая дают пример популяции растений,который отражает естественные условия, аналогичные полям фермеров. SSDI% используют для выражения процентной доли инфицированных растений при повторных испытаниях. В дополнение к SSDI%,можно собирать данные по индивидуальным растениям для отражения тяжести (SSDS) на разных шкалах(шкала 1-9 для Pioneer и общепринятая шкала 0-5). Можно также оценивать другие параметры, которые дополнительно количественно определяют воздействие заболевания, например, тяжесть заболеванияSclerotinia sclerotiorum в поле (SSFS), как описано ниже и представлено в табл. 2. SSFS может являться информативным в особенности при высоком воздействии заболевания в естественных полевых условиях. Термин "тяжесть заболевания" означает степень повреждения растения вследствие инфекции патогеном. В данном изобретении применяют две шкалы для измерения тяжести заболевания. Первая представляет собой шкалу для Pioneer Hi-Bred от 1 до 9. Вторая представляет собой шкалу, используемую исследователями в государственных учреждениях, и ее обозначают как общепринятая шкала 0-5. Обе описаны в табл. 15. Некоторые примеры их использования представлены в табл. 2. Термин "SSDS" означает тяжесть заболевания Sclerotinia sclerotiorum и представляет собой измерение степени развития заболевания у инфицированного растения. Например, посредством него проводят различия между растениями с незначительными симптомами и мертвыми растениями. Для целей данного изобретения используют две шкалы ранжирования: (1) шкалу ранжирования SSDS для Pioneer от 1 до 9 и описанную в табл. 15; и (2) общепринятую научную шкалу, изменяющуюся от 0 до 5 и описанную в примечании к табл. 2. Термин "SSFS" означает тяжесть заболевания Sclerotinia sclerotiorum в поле и представляет собой измерение произведения распространенности заболевания (SSDI%) и степени, до которой инфицированные растения заболевают в естественных полевых условиях (SSDS). Он является мерой поражения грибом в поле и может являться более информативным при высоком воздействии заболевания, т.е. когда распространенность заболевания в поле становится значительной. Его вычисляют умножением SSDI% на тяжесть заболевания и делением на 5, где тяжесть заболевания варьирует от 0 до 5, где 0 означает отсутствие инфекции, и 5 означает мертвое растение, как описано в табл. 2. Термин "локус количественного признака" или "QTL" относится к расщепляющимся генетическим факторам, которые влияют на вариабельность экспрессии фенотипического признака.SSDI% представляет собой процентную долю растений в популяции, инфицированных Sclerotinia.SSDS представляет собой ранжирование степени развития заболевания у пораженного растения. В изобретении используют две шкалы. Шкала SSDS для Pioneer изменяется от 1 (мертвое растение) до 9(отсутствие заболевания) и общепринятая шкала изменяется от 0 (отсутствие заболевание) до 5 (мертвое растение). Для подробностей шкалы SSDS для Pioneer см. табл. 15. Общепринятая шкала представлена,как указано далее: 0 = отсутствие заболевания; 1 = поверхностные повреждения или поражение мелких ветвей; 2 = омертвение крупных ветвей; 3 = главный стебель окольцован, по меньшей мере, на 50%; 4 = главный стебель окольцован, но растение дает хорошие семена; 5 = главный стебель окольцован, значительное снижение урожайности.SSDI представляет собой ранжирование от 1 до 9, как описано в табл. 4, и он скорректирован наSSDI% для контрольных сортов 46 А 65 и/или 46 А 76 для яровой канолы, и контрольных сортов Express и/или Columbus для озимой канолы. Это ранжирование используют только при контролируемом экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях. Его вычисляют умножением наблюдаемого SSDI% на фактор X, где фактор X является фактором, который доводит среднее значениеSSDI% для подходящих контролей до 65%. Коррекцию на тяжесть осуществляют после коррекции на распространенность. SSDI затем вычисляют согласно шкале в табл. 4. Для примеров 1-5 допущения состоят в том, что среднее значение SSDI% для контролей = 65% и среднее значение SSDS для контролей = 4 для вычисления величин SSDI.SSFS является мерой как распространенности заболевания, так и тяжести при естественном воздействии заболевания в поле. Его вычисляют, как указано далее:IV. Примеры. Стеблевая гниль, вызванная Sclerotinia, развивается у канолы посредством колонизированных лепестков в условиях повышенной влажности при цветении. Опавшие лепестки позволяют Sclerotinia инфицировать листья канолы, направляя ее в сторону стеблей. Гриб вызывает обусловленную Sclerotinia стеблевую гниль. Растение преждевременно умирает, что приводит к потере урожая приблизительно на 50%. Канола подвержена вызываемой Sclerotinia стеблевой гнили. В годы с периодами повышенной влажности ущерб для канолы может являться очень значительным. Для уменьшения или предотвраще- 14018509 ния этого ущерба фермеры, как правило, используют одну или две обработки фунгицидом в зависимости от продолжительности влажного периода. Пример 1. Определение характеристик контролей канолы при низком, умеренном, высоком, очень высоком и экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях. Методы и материалы. В попытке определить уровень толерантности к Sclerotinia у доступных в настоящее время сортов яровой канолы в условиях низкой, умеренной, высокой и очень высокой заболеваемости Sclerotinia, получали данные в естественных полевых условиях в течение многих лет, включая общедоступные участки для получения урожая. Данные суммированы в табл. 3. Данные для 44 А 89 и 46 А 65 получены из испытания в естественных условиях в пяти повторностях в Миннесоте в 2001 (Jurke and Fernando, 2003). Данные для Pioneer Hi-Bred, сорт 46 А 76, являются оценкой на основании реакции аналогичных образцов в том же самом испытании в Миннесоте, а также данных по Северной Дакоте в 2003. Данные по характеристикам контролей канолы в условиях экстремального воздействия заболевания получены в этом исследовании. Озимые линии канолы Columbus и Express включали в исследовательские испытания при экстремальном воздействии заболевания в качестве текущих контролей. Как показано в табл. 4 и 10 с, они являются подверженными или умеренно подверженными линиями. Экстремальные условия заболевания являются редкими, но они могут возникать, и целью являлся скрининг линий в таких условиях. Экстремальное воздействие заболевания возникает при наличии 20-30 суток постоянной влажности и температур в среднем от 20 до 25 С. Растения, инфицируемые Scierotinia в экстремальных условиях, обычно нуждаются в двух обработках фунгицидом для сопротивления заболеванию. В среднем, фунгициды обеспечивают 10-14 суток защиты на обработку. Скрининг отобранных растений в экстремальных условиях гарантирует, что отобранные растения смогут сопротивляться обычному воздействию заболевания. Вследствие того, что экстремальные условия для заболевания в природе возникают редко, создали в поле искусственные экстремальные условия, как описано в примере 7. Они включали искусственный инокулят в форме колонизированных Scierotinia семян масличного нуга, использование орошения и использование сетчатого покрытия для поддержания влажной окружающей среды. Тестировали сорта Pioneer Hi-Bred 44 А 89, 46 А 65 и 46 А 76. Наименее подверженные 46 А 65 и 46 А 76 использовали в качестве текущих контролей для отслеживания уровней заболевания и определения характеристик (SSDI). В попытке определить эффект опрыскивания фунгицидом на инфицированных Scierotinia полях собирали и суммировали данные с участков для получения урожая в естественных полевых условиях с инокулятом и опрыскиванием фунгицидом ланс в течение 30% периода цветения. Результаты. В табл. 3 представлены характеристики контролей яровой канолы в разных условиях. Главной целью являлся скрининг на распространенность заболевания (т.е. процентную долю растений, инфицированных Scierotinia). Предыдущие данные в полевых условиях указывали, что типичное умеренное или высокое воздействие заболевания в поле приводит к 20-50% распространенности заболевания для 46 А 65 и 10-40% распространенности заболевания для 46 А 76 (табл. 3). Однако в экстремальных условиях, как показано в табл. 3, процентная доля распространенности заболевания для Pioneer Hi-Bred, сорт 46 А 65, составляет приблизительно 70%, и процентная доля распространенности заболевания для Pioneer Hi-Bred, сорт 46 А 76, составляет 60%. Если погода становится неподходящей для инфекции Sclerotinia, то контроли канолы менее поражены, и распространенность заболевания у частично устойчивых растений пропорционально минимизирована или ликвидирована. Так как для большинства ситуаций в полевых условиях воздействие заболевания меньше экстремального, контроли и селектируемые линии, как правило, будут менее поражены, чем представлено в табл. 4. Скрининг на распространенность заболевания при экстремальном воздействии заболевания и по сравнению с текущими контролями в каждом шестом ряду при мелкокапельном орошении также осуществляли, как описано в примере 7. Эти исследовательские данные по экстремальному воздействию заболевания в поле представлены в виде ранжирования SSDI от 1 до 9 в табл. 4. Как правило, 5 рядов тестируемых линий засевали между одним рядом Pioneer Hi-Bred, сорт 46 А 76, с одной стороны и одним рядомPioneer Hi-Bred, сорт 46 А 65, с другой. В экстремальных условиях для заболевания Pioneer Hi-Bred, сорт 46 А 76, обладает распространенностью заболевания 60% (SSDI%), и Pioneer Hi-Bred, сорт 46 А 65, обладает распространенностью заболевания 70% (SSDI%), со средним значением 65% (SSDI%). Если для любого конкретного опытного участка среднее значение SSDI% для Pioneer Hi-Bred сортов 46 А 65 и 46 А 76, не равнялось 65%, то показатели для Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 65 и Pioneer Hi-Bred сорта 46 А 76 следует умножить на фактор, чтобы довести их до среднего значения 65%. Показатели для тестируемых линий также следует умножить на этот фактор. После осуществления коррекции тяжести заболевания, как описано в определении SSDI, следует произвести ранжирование линий, которое соответствует SSDI, как представлено в табл. 4. Таблица 3 Вариация реакции на Sclerotinia в естественных полевых условиях для доступной в настоящее время яровой канолы (SSDI%) Экстремальное воздействие заболевания использовали для основного исследования и разработки, как описано в примере 7.Оценка частоты для каждого уровня инфицирования для полей фермеров в Западной Канаде, Северной Дакоте и Миннесоте. Таблица 4 Измерение характеристик в полевых условиях при экстремальном воздействии заболевания (исследовательские испытания)Sclerotinia Sclerotiorum, скорректированное на распространенность и тяжесть заболевания для контролей 46 А 65/4 6 А 76 для яровой канолы и Express/Columbus для озимой канолы при экстремальном воздействии заболевания (исследовательские испытания). В табл. 5 показано, что обработки фунгицидом уменьшают воздействие Sclerotinia на Brassica, и их можно использовать в качестве непрямого измерения улучшений характеристик против Sclerotinia. В табл. 5 представлен эффект одной обработки фунгицидом на параллельных участках для получения урожая при естественном уровне инфекции в Мордене и Кармане, Манитоба, в 2004. Как видно из табл. 5, в условиях более низкого воздействия заболевания почти полное сдерживание Sclerotinia достигают при однократной обработке фунгицидом, за исключением сильно подверженных растений. Эффективность фунгицида на растениях с рангом 1 (HS) ниже, чем эффективность фунгицида на растениях с рангом 2 или 3 (S или MS). Таблица 5 Инфекция Sclerotinia (SSDI%) для опрыскиваемых и неопрыскиваемых контролей на участках для получения урожая в естественных условиях в районах Мордена, Манитоба и Кармана, Манитоба, в 2004 Ланс (боскалид) = зарегистрированный BASF фунгицид для борьбы соMS = Умеренно подверженные. В табл. 6 представлены результаты испытаний в полевых условиях в Северной Дакоте/Миннесоте,проведенных в 2003. Большинство в настоящее время коммерчески доступных сортов канолы обладают рангом 1 или 2,основываясь на ранжировании SSDI для Pioneer от 1 до 9, как описано в табл. 2. Некоторые редкие сорта обладают рангом 3 и более эффективно защищены фунгицидами. Например, в табл. 6 показано, что Hyola 357, обладающий рангом устойчивости к Sclerotinia приблизительно 2, обладал 69% распространенностью при испытаниях с использованием фунгицидов в Северной Дакоте. После обработки лучшим фунгицидом распространенность снижалась до 44%. В табл. 6 также показано, что Invigor2663, обладающий рангом устойчивости к Sclerotinia от 1 до 2, обладал 22,3% распространенностью при испытании в Миннесоте, где воздействие заболевания являлось низким. После обработки фунгицидом распространенность снижалась до 5%. Таблица 6 Характеристики сортов канолы в скрининге на Sclerotinia и испытаниях с использованием фунгицида в тех же местностях, North Dakota State University Carrington Research/Extension Center и University of Minnesota Red Lake Falls, 2003 На основе распространенности заболевания и табл. 3 испытание в Северной Дакоте можно классифицировать как очень высокое-экстремальное воздействие заболевания. Результат испытания с использованием фунгицида в Северной Дакоте сравним с экстремальным воздействием заболевания на шкалеSSDI для Pioneer 1-9 и указывает на характеристики лучшего фунгицида для защиты подверженного сорта. Эндура (боскалид) обеспечивали наиболее высокий уровень защиты при испытании по сравнению с рядом других фунгицидов при этом воздействии.Из оценок 2003 года для фунгицидов для борьбы со стеблевой гнилью канолы, вызванной Sclerotinia, в Северной Дакоте и Миннесоте, служба распространения знаний NDSU, апрель 2004. Пример 2. Развитие устойчивости к Sclerotinia - выведение популяции Т. Целью исследовательского усилия являлась замена обработки фунгицидом канолы на устойчивые кSclerotinia сорта. Стратегия представляла собой использование естественно доступных источников с частичной устойчивостью и осуществление постепенного накопления этих предотвращающих заболевание морфологических признаков в ходе рекуррентной селекции в популяции для достижения очень высокого уровня частичной устойчивости. При постепенном накоплении на предотвращающем заболевание фоне устойчивость может являться полной, если ее можно получить для перенесения воздействия заболевания максимальной продолжительности, начиная от опадения лепестков до конца цветения, и, таким образом,посредством нее можно сопротивляться патогену без существенного повреждения растения. Предотвращающие заболевание морфологические признаки включают, например, хорошую устойчивость к полеганию и жесткий ствол (стебель), более позднее созревание, высокое ветвление, более низкую сохранность лепестков и быстрое опадение листьев. Физиологические признаки в основном представляют собой сильную частичную устойчивость стебля, которая может являться связанной с некоторой устойчивостью листьев. Таким образом, развитие заболевания, которое снижено морфологическими признаками, дополнительно снижено там, где присутствует устойчивость стебля и/или листьев. Суммарное воздействие гриба на стебель снижено или минимизировано тогда, когда сильная частичная устойчивость стеблей сочетается с морфологическими признаками, которые уменьшают воздействие заболевания. В отсутствие подходящих морфологических признаков суммарные характеристики снижены, но все еще значительно лучше, чем у контролей канолы. Экстремальное воздействие заболевания возникает в продолжительные периоды подходящих погодных условий для инфекции Sclerotinia. Как правило, это происходит при температурах между 20 и 25 С и относительной влажности более чем 80%. В этих условиях происходит оптимальное инфицирование растения (Heran et al., 1999). Кроме влажности другим индикатором влажного растительного покрова является свободная влажность или абсолютная влажность на растениях. Методы и материалы. В табл. 7 и 8 описаны компоненты, используемые при развитии устойчивости в полевых условиях в популяции Т, и способы, используемые для развития и скрининга устойчивости в полевых условиях. Начиная с 1986 г. приобретена зародышевая плазма рапса Brassica napus от правительственных учреждений в США (United States Department of Agriculture), Японии (Ministry of Fishery and Natural Resources) и Канады (Plant Genetic Resources). Рапс богат глюкозинолатами и эруковой кислотой и, таким образом, не является сортом канолы. Его обозначают как двойной высокий. В отличие от этого сорта канолы Brassica napus обладают низким содержанием эруковой кислоты и низким содержанием глюкозинолатов, и ее также обозначают как двойной низкий. Ее определяют как растение Brassica, в котором масло должно содержать менее чем 2% эруковой кислоты, и твердый компонент семян должен содержать менее чем 30 мкмоль любого одного или любой смеси из 3-бутенилглюкозинолата, 4 пентенилглюкозинолата, 2-гидрокси-3-бутенилглюкозинолата и 2-гидрокси-4-пентенилглюкозинолата на грамм высушенного на воздухе, не содержащего масла твердого вещества. Приобретенную зародышевую плазму рапса охарактеризовали на реакцию стебля на Sclerotinia(табл. 7). Ряд обладающих частичной устойчивостью стебля отобранных растений рапса скрещивали с линиями сортов канолы, и отбирали потомков с частичной устойчивостью стебля и признаками сортов канолы (низкое содержание эруковой кислоты и/или низкое содержание глюкозинолатов). Линии сортов канолы, которые обладали частичной устойчивостью стебля, использовали для дополнительного исследования и выведения популяции. Источники устойчивости к Sclerotinia, использованные в выведении улучшенных яровых линий канолы, перечислены в табл. 7. Поступления из USDA (США) и MAFF (Япония) также использовали при выведении улучшенных озимых линий канолы. В 1991 году в Pioneer начали программу селекции популяции для рекомбинации образцов канолы с физиологической частичной устойчивостью стебля и морфологической неподверженностью в полевых условиях. Вывели популяцию Т. Подробности циклов от 0 до 10 представлены в табл. 8. Каждый цикл описан в строке таблицы. В каждой строке описан используемый материал, перекрестное скрещивание для получения S0, увеличение количества семян и селекция в теплице S0 для получения S1, с последующим тестированием S1 в поле и селекцией, включающей агрономический анализ и анализ качества. В первых четырех циклах использовали замкнутую популяцию, как описано в табл. 8. Дополнительную вариабельность физиологической частичной устойчивости стебля вводили в циклы 5, 6, 7 и 8 (табл. 8). Линии тестировали, следуя способам селекции в теплице и поле, как описано в примерах 6 и 7. Отбирали потомков, обладающих высокими уровнями устойчивости, и исследовали постоянное улучшение в поле(фиг. 1). Следуя способу примера 6, только селектированные в теплице на устойчивость стебля потомки адаптировали к полю. Таблица 7 Выведение популяции Т - компоненты рапса, которые превратили в канолу и использовали в выведении популяции Т (данные по длине повреждения стебля в помещении и SSDS по исходным линиям или их яровым отобранным растениям (USDA) по сравнению с подверженными контролями) Подверженный контроль для японских образцов яровой канолы Westar.Подверженным контролем для образцов USDA и PGR являлась яровая линия Pioneer NS1602. Таблица 8 Выведение популяции Т посредством способа рекуррентной селекции S1 с модификациями Примечания. Повторное тестирование осуществляли с цикла 6."Материал" включает генетические источники, используемые в выведении исходных образцов сортов канолы. Замкнутая популяция = Выведение популяции основано только на потомках из предыдущего цикла,не используется никаких новых источников. Открытая популяция = Выведение популяции основано на потомках из предыдущего цикла, а также новых источниках, ранее отсутствовавших в популяции. Интрогрессия = Введение нового источника в популяцию; связана с открытой популяцией.GH = теплица. Букву F обычно используют в селекции (в селекции "педигри"), и она обозначает дочернее поколение/поколение потомства, где F1 является семенами первого поколения или растением из скрещивания.S обозначает самоопыление, F1 представляет собой S0 или отсутствие самоопыления. Таким образом, можно дифференцировать потомков из популяции (S) по сравнению с селекцией "педигри" (F).S0 представляет собой F1 и часто используется в популяционной селекции для указания на количество самоопыляющихся поколений.S1 в популяционной селекции эквивалентно F2 в селекции "педигри". Примеры разных способов, как указано далее. Образцы источника для перекрестного скрещивания 0 года для получения S0, самоопыления/отбораS0, селекции S1 в поле в замкнутой популяции. Перекрестное скрещивание 1 года S1 для получения S0, самоопыления/отбора S0, селекции S1 в поле; пример замкнутого цикла (циклы 1-4 и цикл 9, 10). Перекрестное скрещивание 2 года S1 из 1 года и новые источники - способ ВСО (цикл 8) или пример открытого цикла (цикл 8). Перекрестное скрещивание S1 из 1 года и новые источники, уже подвергнутые скрещиванию с популяцией Т - способ BC1 (циклы 5, 6, 7); пример открытого цикла (циклы 5, 6, 7). Результаты. Фиг. 1 представляет собой гистограмму линий, полученных в циклах 5-10, для популяции Т, показывая развитие по направлению к устойчивости к Sclerotinia, полученной при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях, как измерено по сравнению с контролями в циклах 5-10. С каждым годом улучшения популяции Т процентная доля распространенности заболевания снижалась, и среднее значение для популяции улучшалось на шкале SSDI 1-9. Ось Y представляет собой частоту у потомков, и на оси X представлено ранжирование устойчивости к Sclerotinia на шкале SSDI 19, как описано в табл. 4. На фиг. 1 показано, что среднее значение и мода для популяции для каждого цикла постоянно улучшались. Например, мода для популяции улучшилась от 2,5 в цикле 5 до 5,5 в цикле 8, до 7,5 в цикле 10. Кроме того, индивидуальные отобранные растения в циклах 7, 8 и 9 обладали рангами 7,5, 8,0 и 8,5. Отбирали потомков, обладающих высокими уровнями устойчивости, и исследовали постоянное улучшение в поле. Степень распространенности заболевания в тестах, представленных на фиг. 1, измеряли при экс- 21018509 тремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях. Это является наиболее высоким возможным воздействием заболевания в естественном окружении в поле. Этот уровень заболевания редко возникает на полях фермеров (табл. 3). Следовательно, ожидают, что образцы, отобранные в этом тесте, будут расти значительно лучше при более низком и более обычном воздействии заболевания. Например, при типичном умеренном воздействии заболевания в поле распространенность заболевания для Pioneer Hi-Bred сортов 46 А 65 и 46 А 76, как правило, составляет 20-30% и 10-20% соответственно(табл. 3). Однако при экстремальном воздействии заболевания уровень распространенности заболевания составляет 70% и 60% соответственно (табл. 3). Растение с частичной устойчивостью в полевых условиях обладает (i) сниженным развитием заболевания на растении, (ii) значительно отсроченным началом заболевания и (iii) устойчивостью к развитию заболевания в течение более продолжительного времени,когда инокулят находится в непосредственном контакте со стеблем. Если подходящие для заболевания условия продолжают сохраняться, наблюдают значительное уменьшение воздействия заболевания у частично устойчивых растений (табл. 3 и фиг. 1). В табл. 9 а, 9b и 9 с описаны некоторые из линий с улучшенной устойчивостью в полевых условиях и показаны их характеристики в поле в естественных условиях в тестах, выполненных независимыми третьими лицами. Данные для 2004 года по SSDI% получены в Манитобе в испытаниях в открытом поле при умеренном воздействии заболевания (как определено характеристиками для 2 из 3 контролей). Некоторые из тех же самых линий тестировали в Университете в Миннесоте (MN) при высоком воздействии в 2003 (2 из 2 контролей) и в Северной Дакоте (ND) при воздействии от очень высокого до экстремального в 2003, согласно табл. 3. Все устойчивые в поле линии обладают уровнями частичной устойчивости стебля значительно более высокими, чем у контролей. Следует обратить внимание, что во всех четырех местностях характеристики каждой из пяти перечисленных линий хорошо соответствовали требованиям настоящей формулы изобретения, т.е. обладали средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного Sclerotinia Sclerotiorum, (SSDI%), который составляет менее чем приблизительно 60% показателя SSDI% для Pioneer Hi-Bred, сорт 46 А 76, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле. Отобранные растения популяции Т также тестировали при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях (табл. 10 а и 10b). Отобранное растение 02SN41269 вводили в цикл 8. Отобранное растение 03SN40441 из цикла 8 использовали для выведения в цикле 9 в сочетании с 03SN40341 и 22 линиями S1 из предыдущего цикла 8, как описано в табл. 8. Эти три линии (т.е. 02SN41269, 03SN40341 и 03SN40441) широко использовали в скрещивании, и для потомков популяции Т обратно прослеживается часть их генетической устойчивости к одному или нескольким из них. В табл. 10 а представлены результаты трех тестов (два в 2004 и один в 2003) при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях для 03SN40341, 03SN40441 и 02SN41269. В среднем, 03SN40341, 03SN40441 и 02SN41269 обладали распространенностью заболевания (SSDI%) 39, 39 и 44% соответственно по сравнению с 46 А 76. При этих экстремальных условиях растения более подвержены Sclerotinia, по меньшей мере, по причинам, рассмотренным выше при определении "экстремального воздействия заболевания в экспериментальных полевых условиях". В отличие от этого, растение, растущее в естественных полевых условиях, (1) не покрыто искусственным навесом,который обеспечивает постоянную влажность, и (2) его выращивают на участках, окруженных растениями с тем же самым морфологическим фенотипом, который позволяет проявиться всем преимуществам морфологии. Следовательно, отобранные растения, обладающие морфологией, которая менее способствует инфекции Sclerotinia, например высоким ветвлением, растут значительно лучше в естественных полевых условиях по сравнению с экстремальным воздействием заболевания в экспериментальных полевых условиях. Например, в среднем, в естественных полевых условиях 03SN40341, 03SN40441 и 02SN41269 обладали распространенностью заболевания 23,2, 13,7 и 49,1% соответственно по сравнению с 46 А 76, как показано в табл. 9 а. Следовательно, 02SN41269 обладает морфологией, которая более способствует инфекции Sclerotinia, чем 03SN40341 и 03SN40441. 02SN41269 более склонен к полеганию по сравнению с 03SN40341 и 03SN40441 (фиг. 2 А). На фиг. 2 А показано, что 04DHS12921, удвоенная гаплоидная линия 02SN41269, а также удвоенный гаплоид 04DHS11319 также склонны к полеганию больше, чем контроль 46 А 65 и другой тестируемый материал. Низкая устойчивость к полеганию может дискредитировать характеристики устойчивости к Sclerotinia в сравнении с совокупностями данных в естественных условиях, в особенности, при обилии влаги или избыточном орошении, таких как NDSUCarrington 2005. В экспериментальных совокупностях данных обходят устойчивость к полеганию и предоставляют показатели, которые отражают потенциал генетической устойчивости в сочетании с морфологией. Эффект морфологии при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях по сравнению с естественными полевыми условиями можно показать с использованием контрольных сортов 46 А 76, 46 А 65 и 44 А 89 в качестве примеров. 46 А 76 является одним из наименее подверженных сортов в испытаниях сортов на устойчивость к Sclerotinia в организуемых университетом испытаниях в Северной Дакоте и Миннесоте (табл. 9 а и 9b, данные 2003 г.). 46 А 76 обладает морфологией, которая менее способствует инфекции Sclerotinia по сравнению с 46 А 65 или 44 А 89. Морфология включает характеристики, такие как высокое ветвление и очень хорошую устойчивость к полеганию. При рассмотрении показателей SSDI% при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях (табл. 10 а) 44 А 89 составляет 115% от 46 А 76 и 46 А 65 составляет 98% от 46 А 76. Однако в естественных испытаниях в 2004 (табл. 9 а) 44 А 89 составляет 232% от 46 А 76 и 46 А 65 составляет 199% от 46 А 76. Это ясно показывает, что 46 А 76 является высоким стандартом для измерения устойчивости в полевых условиях, в особенности в естественных полевых условиях, по сравнению с другими контролями канолы. Это также показывает различие между естественными полевыми результатами и экспериментальными полевыми результатами при экстремальном воздействии заболевания. При экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях подвергаются испытанию все генотипы, и оно представляет собой наихудший сценарий, т.е. такой, который обычно возникает только в 1-2% в естественном окружении в поле (см. табл. 3). Линия, которая хорошо растет в этих экстремальных условиях, как ожидают, растет, по меньшей мере, также хорошо в естественном окружении в поле. Включение контрольных сортов, таких как 44 А 89 и 46 А 76, помогает в оценке тестирования окружающей среды и надежности полученных данных. Например, в табл. 9b и 9 с сравниваются результаты,полученные на контрольных линиях на тестируемых участках в Северной Дакоте и Миннесоте в 2001,2003 и 2005. Эти участки являются выборкой из участков с более высоким воздействием заболевания,исключая совокупности данных по годам со следовыми уровнями заболеваемости (Bradley, et al., 2006). Низкий уровень распространенности заболевания для 46 А 76 в 2005 (NDSU-Carrington) указывает на то,что условия окружающей среды могут усложнять оценку заболевания, как предположил исследовательBob Hanson (NDSU). В этом случае избыточное орошение приводит как к избыточному полеганию более ранних линий, так и к задержке созревания более поздних линий, способствуя более поздно созревающим линиям, таким как 46 А 76. Табл. 9b и 9 с позволяют предположить, что данные, собранные на участке NDSU-Carrington 2005, не согласуются с данными, полученными на том же участке, а также на участках в Миннесоте в предыдущие два года (см. также Bradley, et al., 2006). На фиг. 2 представлены данные многочисленных испытаний яровых линий как при экстремальном воздействии заболевания, так и в естественных полевых условиях. Общие экспериментальные данные при экстремальном воздействии заболевания в поле получали, самое большее, в четырех тестах. Данные для поля в естественных условиях собирали, самое большее, в трех местностях, включая участок в Северной Дакоте, рассмотренный выше (данные 2005). При удалении результатов одиночного отклоняющегося испытания (фиг. 2D и 2 Е) все тестируемые линии отчетливо хорошо растут в пределах выбранного диапазона, т.е. показателя SSDI% менее чем 60% показателя SSDI% для Pioneer, сорт 46 А 76, или показателя SSDI% для Pioneer, сорт 46 А 65, или среднего значения показателя SSDI% для двух сортов, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле. Удвоенные гаплоидные линии, представляющие 02SN41269 (2 линии), 03SN40441 и 03SN40341,отбирали и охарактеризовывали при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях (табл. 10b). Удвоенные гаплоидные линии получали способами, известными специалистам в данной области; например, см. Swanson et al. (1987), Mollers et al. (1994), Hansen et al. (1996), патент США 6200808 и патент Канады 2145833. Четыре удвоенные гаплоидные линии обладали рангамиSSDI от 6,6 до 7,3. Это хорошо отличается от контроля, Pioneer Hi-Bred, сорт 46A76, с рангом 3,8. Удвоенные гаплоидные линии обладают морфологическими фенотипами, аналогичными своим родительским линиям, и они, вероятно, также лучше растут в естественных условиях. На табл. 10 с представлены данные по характеристикам для озимых линий канолы F3, 2005. Данные в этой таблице получены из испытания в поле в 2005, выполненного в Тавистоке (Онтарио, Канада), которое повторили три раза. Экстремальное воздействие заболевания использовали для получения этой экспериментальной совокупности данных. Реакция в полевых условиях у исследуемых образцов оказалась лучше, чем у контролей, Express и Columbus, даже в погодных условиях, которые приводили к воздействию заболевания, более высокому, чем намеченное. Показатели полегания у отобранных растений озимой канолы, полученные в Зосте (Германия),позволили осуществить селекцию устойчивых образцов с хорошей устойчивостью к полеганию. На табл. 11 а представлено происхождение пяти отобранных образцов гетерозиготной яровой канолы (02SN41269, 03SN40341, 03SN40441, 04SN41433 и 04SN41415) и их гомозиготные удвоенные гаплоидные потомки. Так как все отобранные растения происходят из одного растения (давшего 100-500 семян в первый год тестирования в поле), им требуется в дальнейшем самоопыление и увеличение количества для дальнейшего тестирования в поле и предоставления семян. В заключение, как показано на гистограмме фиг. 1, усилия по выведению и селекции в течение шести лет (2000-2005), обусловленные 15 годами исследований (1991-2005), привели к улучшению яровых линий канолы. В естественных полевых условиях эти линии обладают средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного Sclerotinia Sclerotiorum (SSDI%), который составляет менее чем приблизительно 60% показателя SSDI% для Pioneer Hi-Bred, сорт 46 А 76, или показателяSSDI% для Pioneer Hi-Bred, сорт 46 А 65, или среднего значения показателя SSDI% для двух сортов в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле. На табл. 9 а показано, что Pioneer HiBred, сорт 46 А 76, является одним из наименее подверженных контролей канолы в поле (ранг 3 на шкалеSSDI, в то время как большинство существующих образцов канолы обладают рангами 1 или 2) и представляет собой очень перспективный контроль, с которым сравнивают новые образцы. Кроме того,ланс или эндура считают наиболее эффективными фунгицидами на рынке. Это сочетание наиболее чувствительного контроля канолы и наиболее эффективного фунгицида задает очень высокие требования. Как видно из гистограммы фиг. 1, цикл 10 популяции Т обладал рангом SSDI 7,5, где некоторые индивидуумы обладали рангами 8 или 8,5. Согласно шкале ранжирования в табл. 4 и результатам, представленным на фиг. 1, выведены линии, обладающие рангами SSDI 5, 6, 7 или 8. Их классифицировали как умеренно устойчивые (ранги 5 или 6) и устойчивые (ранги 7 или 8). Таблица 9 а Суммирование результатов данных в естественных условиях в поле для Sclerotinia по выведенным устойчивым к Sclerotinia растениям в 2003/2004 Тяжесть заболевания в поле в ND и MN вычисляли умножением распространенности заболевания(SSDI%) на тяжесть заболевания инфицированных растений и делением на 5 Меньшая тяжесть "1" по сравнению с мертвым растением "5" будет значительно снижать суммарное воздействие заболевания, как видно посредством сравнения 44 А 89 и 02SN40680.MN = Миннесота. МВ = Манитоба. Таблица 9b Данные NDSU и University of Minnesota в естественных условиях по реакции в поле сортов канолы на Данные получены Bob Hanson (NDSU) и Dave Legare (University of Minnesota).Безлепестковая канола. 1 Данные по Carrington (Северная Дакота), 2003, соответствуют данным для ND, 2003, в табл. 9 а. 2 Данные по Red Lake Falls (Миннесота), 2003, соответствуют данным для MN, 2003, в табл. 9 а. Таблица 9 с Данные NDSU (Carrington) и University of Minnesota (Red Lake Falls) в естественных условиях по реакции в поле сортов канолы на Sclerotinia (распространенность заболевания), 2001/2003, выраженные в виде % от 46 А 76 Таблица 10 а Суммирование источников экспериментальных данных 2003/2004 по экстремальному воздействию заболевания (SSDI), 3 теста Преобразование 1-9 для SSDI в SSDI% в табл. 4.50% цветущих растений. Таблица 10b Экспериментальные данные по экстремальному воздействию заболевания в поле для удвоенных гаплоидных линий и их родительских источников (02SN41269, 03SN40441 и 03SN40341), селектированных на высокий уровень устойчивости в полевых условиях Таблица 10 с Характеристика озимых линий F3 канолы против Sclerotinia (Тависток, Онтарио) и их агрономические/качественные признаки (Зост, Германия), 2005 Показатели полегания (1 - полегшие, 9 - прямостоячие) и высоты (1 - низкие, 9 - высокие) для Зоста,Германия, 2005.Содержание глюкозинолатов определено на образцах F3 из Зоста, Германия, 2005. Таблица 11 а Происхождение трех отобранных образцов яровой канолы и их удвоенные гаплоидные потомки Расщепляющийся материал, происходящий из единственного растения S1 или F3 и размножаемый в течение последующих лет тестирования после первого года. Таблица 11b Происхождение 7 рассматриваемых озимых образцов канолы Потомство F1 из комплексного скрещивания [CV024201CWB940022][(00FWB940100 00FWB940919)01CWB910012] подвергали самоопылению и отбирали в теплице по реакции к Sclerotinia.Селекцию на реакцию к Sclerotinia и качество осуществляли среди 400 линий F2 в скрининге в поле без повторностей.Селекцию на реакцию к Sclerotinia, полегание и качество осуществляли среди 200 линий F3 при тестировании в поле в трех параллелях. Каждую линию F3 получали из единственного растения F2.Групповое добавление F4 на участках, урожай из Зоста, 2005, для запатентованного депонирования в виде добавления отобранного поколения F3 из единственного растения. Таблица 11c Компоненты комплексного скрещивания на устойчивость к Sclerotinia для зимней канолы Компонент 2 и 3 получали аналогично компоненту 1.Обозначения CV и NW означают чувствительные к Sclerotinia элитные сорта из коллекции озимой канолы Pioneer. Пример 3. Определение канолы. Согласно Совета по каноле (Канада), канолу определяют посредством следующих свойств: масло должно содержать менее чем 2% эруковой кислоты и твердый компонент семян должен содержать менее чем 30 мкмоль любого одного или любой смеси из 3-бутенилглюкозинолата, 4-пентенилглюкозинолата,2-гидрокси-3-бутенилглюкозинолата и 2-гидрокси-4-пентенилглюкозинолата на грамм высушенного на воздухе, не содержащего масла твердого вещества. Уровень эруковой кислоты и содержание глюкозинолатов измеряли для подтверждения того, что семена, произведенные популяцией Т, удовлетворяют определению канолы. Уровень эруковой кислоты измеряли с помощью профиля жирных кислот целых семян и уровень глюкозинолатов измеряли сканированием NIR, как описано ниже: Содержание жирных кислот. Определяют общепринятые процентные содержания по массе жирных кислот, присутствующих в эндогенно образуемом масле зрелых целых сухих семян. В ходе такого определения семена дробят и экстрагируют в виде метиловых сложных эфиров жирных кислот после реакции с метанолом и метоксидом натрия. Затем полученный сложный эфир анализируют на содержание жирных кислот газожидкостной хроматографией с использованием капиллярной колонки, которая позволяет осуществить разделение на основе степени ненасыщенности и длины цепи жирных кислот. Этот способ описан в работе J.K. Daun etal. (1983), которая приведена здесь в качестве ссылки. Содержание глюкозинолатов. Суммарное содержание глюкозинолатов в семенах при 8,5% влажности при измерении официальным способом AOCS АК-1-92 (Определение содержания глюкозинолатов в семенах рапса-кользы посредством HPLC) выражено в мкмоль на грамм. Капиллярная газовая хроматография триметилсилилпроизводных экстрагированных и очищенных десульфоглюкозинолатов с оптимизацией для получения оптимального детектирования индолглюкозинолатов описана в "Procedures of the Western Canada Canola/Rapeseed Recommending Committee Incorporated for the Evaluation and Recommendation for Registration of Canola/Rapeseed Candidate Cultivars in Western Canada". Канола должна также агрономически удовлетворять требованиям сезона выращивания. Для яровой канолы среднее количество суток до достижения 50% цветения, как правило, попадает в диапазон 30-90 суток (табл. 1). Для контролирования условий выращивания для любого года или для любого поля количество суток до цветения сравнивают с официальными контрольными сортами, растущими в том же самом поле и в тех же самых условиях. В табл. 12 суммированы результаты тестов на глюкозинолаты,эруковую кислоту, сутки до 50% цветения и сутки до достижения зрелости по сравнению с официальными контрольными сортами WCC/RRC (Western Canada Canola/Rapeseed Recommending Committee Incorporated for the Evaluation and Recommendation for Registration of Canola/Rapeseed Candidate Cultivars inWestern Canada), 46A65 и Q2. Как можно видеть из табл. 12, растения, произведенные популяцией Т,сравнимы с контролями и удовлетворяют определению яровой канолы. Изменения в пределах допустимого диапазона могут возникать из-за различий в окружающей среде. Процентное содержание суммарных жирных кислот - эруковой (С 22:1).Глюкозинолаты (мкмоль - суммарные алифатические глюкозинолаты/г высушенной на воздухе муки).Официально зарегистрированные контроли качества. Пример 4. Сложность признака. На табл. 13 показана сложность генетического расщепления при скрещиваниях с использованием подверженного элитного материала, нацеленного на выведение продукта. В то время как данные по эффективности на фиг. 1 показывают характеристики признака, данные по расщеплению в табл. 13 показывают низкий выход частично устойчивых линий. Это указывает на то, что постепенно накапливаемые генетические компоненты приводят к сложному расщеплению. Подсчитано, что придают частичную устойчивость у данных образцов три или четыре гена. Интрогрессия этих трех или четырех генов в элитный материал требует значительного усилия. Чем больше вклад подверженного элитного материала, тем сложнее интрогрессия генов устойчивости к Sclerotinia. Например, легче ввести гены устойчивости кSclerotinia в материал, который содержит 50% подверженного элитного материала, по сравнению с материалом, который содержит 75% подверженного элитного материала. Можно использовать гаплоидные способы для установления расщепляющегося потомства аналогично используемым для установления источников устойчивости, представленных в табл. 10 а, 10b и 10 с.