Способ получения растения, устойчивого к нескольким гербицидам, растение, полученное указанным способом, и способ обработки растений гербицидами

1 Объектом настоящего изобретения является способ получения растения, устойчивого к нескольким гербицидам. Далее в описании гербициды будут иметь общее название, а именно, указанное в 10-м издании "The Pesticide Manual", British Crop Protection Council. Известны растения, которые были трансформированы с целью придания им устойчивости к некоторым гербицидам, например, к дигалогеногидроксибензонитрилам, в частности, к бромоксинилу и иоксинилу, благодаря гену,кодирующему нитрилазу, разрушающую эти гербициды, или растения, устойчивые к гербицидам ингибиторам 5-енолпирувилшикимат-3 фосфатсинтазы (EPSPS), в частности, глифозату, сульфозату или фосаметину, или к ингибиторам ацетолактатсинтетазы (ALS), типа сульфонилмочевин, или к ингибиторам дигидроптероатсинтетазы, таким как азулам, или к ингибиторам глутаминсинтетазы, таким как глуфозинат. Известны некоторые гербициды, такие как изоксазолы, описанные, в частности, во французских заявках 95 06800 и 95 13570, и, в частности, изоксафлутол, селективный гербицид кукурузы, дицетонитрилы, описанные в европейских заявках 0 496 630, 0 496 631, в частности,2-циано-3-циклопропил-1-(2-SO2 СН 3-4 СF3 фенил)пропан-1,3-дион и 2-циано-3-циклопропил-1-(2-SO2CH3-4-2,3 Сl2 фенил)пропан-1,3 дион, трикетоны, описанные в европейских заявках 0 625 505 и 0 625 508, в частности, сулкотрион, или же трикетоны, описанные в USP 5 506 195, или пиразолинаты. Кроме того, был выделен ген, кодирующий гидроксифенилпируватдиоксигеназу (HPPD), с целью придания устойчивости к этим вышеназванным гербицидам,а полученные содержащие его трансгенные растения демонстрируют значительную устойчивость и являются объектом неопубликованных французских заявок 95/06800, 95/13570 и 96/05944. Однако, сельскохозяйственная практика показывает, что для обработки растений фермеры предпочитают иметь у себя ассоциации гербицидов, в частности, чтобы решать различные проблемы по уничтожению сорняков, возникающие из-за ограниченного спектра отдельно взятых гербицидов. Для фермеров также представляет интерес наличие маркерного гена селекции, ассоциированного с геном, кодирующим устойчивость к гербицидам. Таким образом, сельское хозяйство нуждается в растениях,обладающих устойчивостью к нескольким гербицидам, предпочтительно, по меньшей мере, к двум или трем. Было обнаружено, что растительной клетке и растению можно придать множественную гербицидную устойчивость. Объектом изобретения является прежде всего способ получения растения с множествен 003140 2 ной гербицидной устойчивостью путем растительного трансгенеза, отличающийся тем, что на первой стадии вводят в несколько клеток различных растений, соответственно, один из генов, содержащих элементы регуляции, необходимые для его транскрипции в растениях, и последовательность, которая кодирует фермент,сообщающий растениям устойчивость к одному гербициду, и скрещивают растения с получением растения с множественной устойчивостью к гербицидам. В качестве кодирующей последовательности можно использовать, в частности, все известные последовательности, придающие растениям устойчивость к некоторым ингибиторам. Это последовательность EPSPS, кодирующая устойчивость к глифозату, сульфозату или фосаметину, в частности, последовательности мутированного или немутированного протеина,описанные в патентах USP 4 535 060, ЕР 115 673, USP 4 769 061, USP 5 094 945; USP 4 971 908, USP 5 145 783, ЕР 293 358; ЕР 378 985, WO 91/04323, WO 92 044 449, WO 92 06201. В дальнейшем этот тип гена будет называться последовательностью или геном "EPSPS". Также можно назвать глифозатоксидоредуктазу (см. WO 92/000377) - фермент детоксификации глифозата;- последовательность гена нитрилазы Klebsiella sp., кодирующего устойчивость к дигалогенобензонитрилам, описанная в USP 4 810 648,и, в частности, гена, полученного от Klebsiellaozaenae, который в дальнейшем будет называться геном или последовательностью "OXY";- последовательность HPPD, описанная в вышеназванных неопубликованных французских заявках 95/06800, 95/13570 и 96/05944. Эта последовательность HPPD может быть любой природы. В частности, эта последовательность может иметь бактериальное происхождение, как,например, род Pseudomonas, или растительное происхождение, например, от однодольного или двудольного растения, в частности, от Arabidopsis или от зонтичных, например моркови (Daucus carota). Она может быть самородной или дикой или, при необходимости, мутированной,сохраняющей при этом свойство гербицидной устойчивости к ингибиторам HPPD, таким как гербициды семейства изоксазолов или семейства трикетонов или пиразолинатов. Можно также использовать другие последовательности: последовательность фосфинотрицинацетилтрансферазы или последовательность глутаминсинтетазы, кодирующая устойчивость к глуфозинату (см. ЕР 0 242 236); последовательность дигидроптероатсинтетазы, кодирующая устойчивость к азуламу (см. ЕР 0 369 367); 3 последовательность ALS, кодирующая устойчивость к сульфонилмочевинам; последовательность протопорфирогеноксидазы ("рrоtox"), кодирующая устойчивость к гербицидам семейства дифенилэфиров, таких как ацифторфен или оксифторфен, или последовательность оксадиазолов, таких как оксадиазон или оксадиаргил, или последовательность циклических имидов, таких как хлорфталим,или последовательность фенилпирразолов, таких как TNP, или последовательности пиридинов и фенопилаты и сходные карбаматы (см.WO 95/34659). Объектом изобретения является также трансформированное растение, устойчивое, по меньшей мере, к двум гербицидам, одним из которых является ингибитор HPPD. Это растение может быть получено скрещиванием, по меньшей мере, двух растений, каждое из которых содержит ген, кодирующий устойчивость к одному гербициду. Растения могут быть однодольными или двудольными, в частности, культурными растениями в крупном земледелии,неограничительными примерами двудольных растений являются табак, хлопок, рапс, соя,свекла, а однодольных растений - кукуруза и злаки; также это могут быть овощные культуры или цветы. Трансформация клеток на первой стадии способа по изобретению может быть осуществлена любым известным соответствующим способом, широко описанным в специальной литературе и, в частности, в заявках и патентах, приведенных в данной заявке. Одна серия методов состоит в бомбардировке клеток или протопластов частицами, к которым прикреплены последовательности ДНК. Согласно изобретению, эти ДНК могут переноситься одними и теми же частицами или разными. Другая серия методов состоит в том,что в качестве средства переноса в растение используют соответствующие векторы. Могут быть использованы и другие методы, например, микроинъекция или электропорация. Специалист может выбрать подходящий метод в зависимости от растения, в частности,от того, является оно однодольным или двудольным. Было обнаружено, что растения, трансформированные согласно изобретению, обладают значительной устойчивостью к ингибиторам гидроксифенилпируватдиоксигеназы, например, к некоторым из последних гербицидов,таким как изоксазолы, описанные, в частности,во французских заявках 9506800 и 95 13570, а именно 4-[4-СF3-2-(метилсульфонил)бензоил]-5 циклопропилизоксазол, или "изоксафлутол",селективный гербицид кукурузы, дицетонитрилы, описанные в европейских заявках 0 496 630,0 496 631, в частности, 2-циано-3-циклопропил 1-(2-SO2 СН 3-4-СF3 фенил)пропан-1,3-дион и 2 003140 4 циано-3-циклопропил-1-(2-SО 2 СН 3-4-2,3 Сl2 фенил)пропан-1,3-дион, трикетоны, описанные в европейских заявках 0 625 505 и 0 625 508, в частности, сулкотрион и пиразинолаты. Эти же растения, согласно изобретению, обладают значительной устойчивостью к другим гербицидам,например, таким как дигалогенобензонитрилы,а именно бромоксинил и иоксинил, глуфозат и его аналоги, глуфозинат. Наконец, объектом данного изобретения является способ обработки растений, в частности, культур, с помощью гербицида данного типа, отличающийся тем, что гербицид наносят на растения, полученные способом согласно изобретению, как перед посевом, перед всходом так и после всхода культуры. Под гербицидом в настоящем изобретении подразумевают активное гербицидное вещество, взятое одно или в ассоциации с добавкой, которая изменяет его эффективность, такой как вещество, повышающее активность (синергический агент), или вещество, ограничивающее активность (поанглийски "safener"); Разумеется, что вышеназванные гербициды при их практическом применении сочетают с добавками такого состава, как обычно используют в агрохимии. Согласно изобретению, один из генов гербицидной устойчивости, присутствующих в растениях, может быть использован в качестве маркера селекции, либо in vitro, либо in vivo. Различные аспекты изобретения станут более понятны с помощью экспериментальных примеров, приведенных ниже. Пример 1. Выделение гена HPPD P. fluorescens A 32. Из последовательности аминокислот HPPDU. и др. 1992. Eur. J. Biochem. 205; 459-466),выводят последовательность различных олигонуклеотидов, чтобы амплифицировать с помощью ПЦР часть кодирующей последовательности HPPD P. fluorescens А 32 (выделена МсКеllar, R.C. 1982, J. Appi. Bacteriol., 53:305-316). Фрагмент амплификации гена HPPD был использован для просеивания частичного геномного банка Р. fluorescens A 32, чтобы выделить,таким образом, ген, кодирующий этот фермент. А) Получение геномной ДНК Р. fluorescens A 32 Бактерию культивировали в 40 мл минимальной среды М 63 (КН 2 РO4 13,6 г/л, (NH4)2SO4 2 г/л, MgSO4 0,2 г/л, FeSO4 0,005 г/л рН 7 плюсL - тирозин 10 мМ в качестве единственного источника углерода) при 28 С в течение 48 ч. После промывания клетки помещают в 1 мл лизирующего буферного раствора (tris HCl 100 мМ рН 8,3, NaCl 1,4 М и EDTA 10 мМ) и инкубируют 10 мин при 65 С. После обработки смесью фенол/хлороформ (24/1) и обработки хлороформом нуклеиновые кислоты осаждают добавлением одного объма изопропанола, затем 5 помещают в 300 мкл стерильной воды и обрабатывают в растворе рибонуклеазы 10 мкг/мл конечн. ДНК снова обрабатывают смесью фенол/хлороформ, хлороформом и осаждают добавлением 1/10 объма ацетата натрия 3 М рН 5 и 2-х объмов этанола. Затем ДНК помещают в стерильную воду и дозируют. Б) Выбор олигонуклеотидов и синтезов Из последовательности аминокислот HPPDPseudomonas sp. P.J.874 выбирают пять олигонуклеотидов, из которых два - в направлении от концевой группы NH2 к концевой группе СООН протеина, а три - в противоположном направлении (см. фиг. 1). Этот выбор был продиктован двумя следующими правилами:- стабильный 3' - конец олигонуклеотида, то есть, по меньшей мере, два основания без амбивалентности,- как можно более слабая дегенерация. Выбранные олигонуклеотиды имеют следующие последовательности: Р 1: 5'TA(C/T)GA(G/A)AA(C/T)CCIATGGG3' Р 2: 5'GA(G/A)ACIGGICCIATGGA3' Р 3: 5'AA(C/T)TGGATIA(G/A)(G/A)AA(C/T)ТС(С/Т)ТС 3' Р 4: 5'AAIGCIAC(G/A)TG(С/Т)TG(T/G/A)ATICC3' Р 5: 5'GC(C/T)TT(A/G)AA(A/G)TTICC(C/T)TCICC3' Они были синтезированы на синтезаторе "Cyclone plus DNA Synthesizer" марки MILLPORE. С этими 5 олигонуклеотидами, амплифицированными с помощью ПЦР, фрагменты амплификации, которые теоретически должны быть получены из последовательности SEQ ID 1, имеют следующие размеры: с Р 1 и Р 3 приблизительно 690 нп с Р 1 и Р 4 приблизительно 720 нп с Р 1 и Р 5 приблизительно 1000 нп с Р 2 и Р 3 приблизительно 390 нп с Р 2 и Р 4 приблизительно 420 нп с Р 2 и Р 5 приблизительно 700 нп В) Амплификация кодирующей части HPPDP. fluorescens A 32 Амплификация была проведена на прибореPERKIN ELMER с е буферным раствором в стандартных условиях, то есть на 50 мкл реакции имеется dNTP в 200 мкМ, праймеры в 20 мкМ, Taq полимераза 2,5 единицы и ДНК Р. fluorescens A 32 2,5 мкг. Используемая программа амплификации: 5 мин при 95 С, затем 35 циклов (45 с 95 С, 45 с 49 С, 1 мин 72 С), затем 5 мин при 72 С. В этих условиях все полученные фрагменты амплификации имеют размер, соответствующий вышеприведенным теоретическим размерам, что является хорошим показателем специфичности амплификации. Фрагменты амплификации, полученные с Р 1/Р 4, Р 1/Р 5 и Р 2/Р 4, объединяют в pBSII SK (-) после расщепления этой плазмиды с помощью EcoRV и обработки конечной трансферазой в присут 003140 6 ствии ddTTP, как описано HOLTON Т.А. и GRAHAM M.W., 1991, N.A.R., том 19, N 5, стр. 1156. Один клон каждого из трх типов частично секвенируют, это позволяет подтвердить, что в этих трх случаях амплифицировали часть кодирующего участка HPPD P. fluorescens A 32. Фрагмент Р 1/Р 4 сохраняют как зонд для просеивания частичного геномного банка Р. fluorescens A 32 и выделения полного гена HPPD. Г) Выделение гена С помощью Southern можно показать, что фрагмент в 7 Кнп после расщепления ДНК Р. fluorescens A 32 с помощью рестрикционного фермента BamHI гибридизуется с зондом HPPD P1/P4. Таким образом, 400 мкг ДНК Р. fluorescens А 32 расщепили с помощью рестрикционного ферментаBamHI и очистили на геле агарозы фрагменты ДНК, составляющие примерно 7 Кнп. Эти фрагменты объединяют в pBSII SK (-), в свою очередь расщеплнном с помощью BamHI и дефосфорилированном обработкой щелочной фосфатазой. После трансформации в Е. coli DHlOb частичный геномный банк просеивают с помощью зонда HPPD P1/P4. Был выделен положительный клон, названный pRP А. Его упрощенная карта представлена на фиг. 2. На этой карте указано положение кодирующей части гена HPPD. Она состоит из 1077 нуклеотидов, которые кодируют 358 аминокислот(см. SEQ ID 1). Аминокислотная последовательность HPPD P. fluorescens A 32 в значительной степени гомологична последовательностиHPPD Pseudomonas sp. strain P.J.874; действительно, имеется 92% совпадений между этими двумя протеинами (см. фиг. 3). Пример 2. Трансформация промышленного табака PBD6 геном нитрилазы (дляконструкция 238). Этот табак получен согласно европейской заявке 0 337 899, страница 6, строка 50 и следующие, из конструкции 238, которая описана под названием pRPA-BL 238. Пример 3. Скрещивание опылением. В теплице проводят скрещивание опылением,соответственно линий Со 17, 173 и 238: Со 17 с 238, чтобы получить растения табакаPBD6 для тестирования на двойную устойчивость к изоксафлутолу и бромоксинилу ("растения HPPD +OXY") и Со 17 с 173, чтобы получить растения табакаPBD6 для тестирования на двойную устойчивость к изоксафлутолу и глифозату ("растения HPPD +EPSPS"). Три клона являются гомозиготными по задействованному гену, следовательно, потомство является гемизиготным для каждого из двух генов, введенных скрещиванием. Скрещенные растения получают через шесть недель. Пример 4. Измерение устойчивости табака при обработке проросшего растения изоксафлутолом и бромоксинилом или глифозатом. 7 В этой пробе каждый тест проводят на образце из 10 растений, причем ещ 10 растений оставляют необработанными. Все виды обработки осуществляют пульверизацией из расчета 500 л раствора на гектар. Для обработки проросших растений производят посев, затем пересаживают растения в чаши размером 9 см х 9 см. Обработка проросших растений производится на стадии хорошего развития (3-4 листочка). Партии растений, соответственно, "дикие" и генетически трансформированные, как описано выше, разделяют на несколько частей: а) необработанная партия,б) другие партии, обработанные, соответственно, только одним гербицидом,- проросшие растения, обработанные 2 дозами изоксафлутола (соответственно 200 и 400 г/га),- проросшие растения, обработанные 2 дозами бромоксинила (соответственно 400 и 800 г/га),- проросшие растения, обработанные 2 дозами глифозата (соответственно 800 и 1200 г/га),в) другие партии, обработанные соответственно двумя гербицидами, в проросшей стадии, смесью,приготовленной перед самым использованием:- двумя дозами изоксафлутола и бромоксинила(соответственно 200/400 и 400/800 г/га),- двумя дозами изоксафлутола и глифозата (соответственно 200/800 и 400/1200 г/га). Обработку проводят, используя следующие составы: изоксафлутол 75%, бромоксинил (товарный продукт PARDNER) в виде октаноата в эмульгирующемся концентрате 225 г/л и глифозат (RoundUP). В этих условиях через 17 дней после обработки наблюдают следующие признаки фитотоксичности,которые указаны в таблице, в процентах деструкции,а также в таблице указано число растений на партию и дозы гербицидов, выраженные в граммах активного вещества на гектар: Обработка проросших растений изоксафлутолом и бромоксинилом или глифозатом Растения с геном устойчивость Гербицид в г/л= дикие Контрольные дозы 10 10 10 Изоксафлутол 200 20 4% 20 2% 10 75% Один 400 20 5% 20 3% 85% Бромоксинил 400 10 3% 10 0% Один 800 10 0% 10 0% Глифозат 800 20 0% 10 100% Один 1200 20 0% 10 100% Изоксафлутол 200 20 20% 10 100%EPSPS мутированной кукурузы, часть из 1340 нп клона pRPA-ML-720. Для сведения прилагаются фигуры, в качестве иллюстрации изобретения. На фиг. 1 представлена белковая последовательность HPPD Pseudomonas sp. strain P.J. 874 и теоретическая нуклеотидная последовательность соответствующей кодирующей части; пять олигонуклеотидов, выбранных для амплификации одной части этого кодирующего участка, обозначены пятью стрелками. На фиг. 2 представлена картография плазмиды с фрагментом геномной ДНК из 7 kb, содержащей ген HPPD Р. fluorescens A 32. На фиг. 3 приводится сравнение аминокислотных последовательностей HPPD P.fluorescens ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения растения с множественной устойчивостью к гербицидам, отличающийся тем, что на первой стадии вводят в несколько клеток различных растений, соответственно, один из генов, содержащих элементы регуляции, необходимые для его транскрипции в растениях, и последовательность, которая кодирует фермент, сообщающий растениям устойчивость к гербициду, и скрещивают растения с получением растения с множественной устойчивостью к гербицидам. 2. Растение с множественной устойчивостью к гербицидам, полученное способом по п.1. 3. Способ обработки растения по п.2 гербицидами. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что используют, по меньшей мере, два гербицида. 5. Способ по п.3, отличающийся тем, что используют, по меньшей мере, три гербицида. 6. Способ по одному из пп.3-5, отличающийся тем, что один из гербицидов является ингибитором гидроксифенилпируватдиоксигеназы (HPPD). 7. Способ по одному из пп.4-6, отличающийся тем, что гербициды применяют одновременно. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что гербициды применяют в виде одной композиции, готовой к использованию. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что гербициды применяют в виде смеси, приготовленной перед самым использованием. 10. Способ по одному из пп.4-6, отличающийся тем, что гербициды применяют последовательно. 14 11. Способ по одному из пп.6-10, отличающийся тем, что гербицидом ингибиторомHPPD является изоксафлутол. 12. Способ по одному из пп.6-10, отличающийся тем, что гербицидом ингибиторомHPPD является сулкотрион. 13. Способ по одному из пп.4-12, отличающийся тем, что второй гербицид принадлежит к группе дигидрогеногидроксибензонитрилов. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что гербицид выбирают из группы, включающей бромоксинил и иоксинил. 15. Способ по одному из пп.4-14, отличающийся тем, что второй гербицид является ингибитором 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (EPSPS). 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что ингибитором EPSPS является глифозат или сульфозат.