Prlr-специфическое антитело и его применения
Номер патента: 17851
Опубликовано: 29.03.2013
Авторы: Мирза Амер, Ноне Женевьев, Дамиано Джейсон, Масат Линда, Бединджер Дэниел, Лукман Мохаммад
Формула / Реферат
1. Выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен рецептора пролактина (PRLR) с SEQ ID NO: 2 с равновесной константой диссоциации (KD) 10-6 М или более низкой и которое содержит: (а) определяющие комплементарность области (CDR), представленные в положениях от 24 до 38, положениях от 54 до 60 и положениях от 93 до 101 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 88, и (b) области CDR, представленные в положениях от 31 до 35, положениях от 50 до 66 и от 99 до 113 SEQ ID NO: 90.
2. Антитело по п.1, которое является химерным антителом, гуманизированным антителом, антителом человека, одноцепочечным антителом или фрагментом антитела.
3. Антитело по п.1, которое содержит константную область антитела человека и одну или несколько вариабельных каркасных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека.
4. Антитело по п.1, в котором константная область тяжелой цепи является модифицированным или немодифицированным IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, их фрагментом или их комбинациями.
5. Антитело по п.4, в котором константная область тяжелой цепи является модифицированным или немодифицированным IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
6. Антитело по п.1, которое имеет равновесную константу диссоциации (KD) 10-7, 10-8, или 10-9 М, или более низкую в отношении PRLR.
7. Антитело по п.1, в котором константная область легкой цепи является модифицированной или немодифицированной константной областью легкой цепи l, константной областью легкой цепи k, их фрагментом или их комбинациями.
8. Антитело по п.1, которое ингибирует внутриклеточное фосфорилирование PRLR.
9. Антитело по п.1, которое ингибирует индукцию фосфорилирования Stat5.
10. Антитело по п.1, которое ингибирует пролиферацию раковой клетки молочной железы.
11. Антитело по п.1, которое конъюгировано с другим диагностическим или терапевтическим агентом.
12. Антитело по п.1, которое очищено по меньшей мере до 95% гомогенности в расчете на массу.
13. Антитело по п.1, которое связывает внеклеточный домен PRLR человека с равновесной константой диссоциации (KD), по меньшей мере в 10000-15000 раз более низкой, чем внеклеточный домен мышиного PRLR.
14. Антитело по п.1, которое связывает внеклеточный домен PRLR человека, внеклеточный домен мышиного PRLR и внеклеточный домен PRLR крысы.
15. Антитело по п.14, которое связывает внеклеточный домен PRLR мыши и крысы с равновесной константой диссоциации (KD) 10-6 М или более низкой.
16. Антитело по п.15, которое связывает тот же самый эпитоп, что и антитело he.06.642-2, раскрытое в описании.
17. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по п.12 и фармацевтически приемлемый носитель.
18. Набор, содержащий терапевтически эффективное количество антитела по п.1, упакованное в контейнер, причем указанный набор содержит второй терапевтический агент и дополнительно содержит этикетку, прикрепленную к контейнеру или упакованную с контейнером, причем эта этикетка описывает содержимое этого контейнера и обеспечивает указания и/или инструкции, касающиеся применения содержимого этого контейнера для лечения рака молочной железы.
19. Набор по п.18, где контейнером является флакон, или склянка, или предварительно заполненный шприц.
20. Выделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен PRLR, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи SEQ ID NO: 88 и аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи SEQ ID NO: 90.
Текст
Перекрестная ссылка на родственные заявки По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США 60/946360, поданной 26 июня 2007 г., и предварительной заявки на патент США 60/838648, поданной 18 августа 2006 г. Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к способам профилактики и лечения рака введением PRLR-специфических антител. Уровень техники Рак является второй основной причиной смерти в Соединенных Штатах. Хотя "раком" называют многие различные типы рака, т.е. рак молочной железы, предстательной железы, легкого, ободочной кишки, поджелудочной железы, каждый тип рака отличается как на фенотипическом уровне, так и на генетическом уровне. Нерегулируемый рост, характерный для рака, происходит, когда экспрессия одного или нескольких генов становится экспрессией с нарушенной регуляцией вследствие мутаций, и рост клеток не может более контролироваться. Гены часто классифицируют на два класса, онкогены и супрессорные гены опухолей. Онкогены являются генами, нормальной функцией которых является стимуляция роста клеток, но только при конкретных условиях. При появлении мутации в онкогене и утрате затем этого контроля онкоген стимулирует рост при всех условиях. Однако было обнаружено, что для того чтобы рак был действительно успешным, этот рак должен иметь также мутации в супрессорных генах опухолей. Нормальной функцией супрессорных генов опухолей является остановка клеточного роста. Примеры супрессоров опухолей включают р 53, р 16, р 21 и АРС, все из которых при нормальном действии останавливают неконтролируемое деление и рост клеток. Когда супрессор опухоли мутирован или утрачен, это торможение роста клеток также утрачивается, позволяя клеткам расти теперь из ограничений. Рецептор пролактина (PRLR) является однократно пронизывающим через мембрану рецептором цитокинов класса 1, который является гомологичным рецепторам для членов суперсемейства цитокинов,таким как рецепторы для IL2, IL3, IL4, IL6, IL7, эритропоэтина и GM-CSF. PRLR участвует во множественных биологических функциях, включающих рост клеток, дифференцировку, развитие, лактацию и репродукцию. Он не имеет внутренней тирозинкиназной активности; связывание лиганда приводит к димеризации рецептора, перекрестному фосфорилированию Jak2 и дальнейшей передаче сигнала. кДНК рецептора пролактина человека была первоначально выделена из библиотек гепатомы и рака молочной железы (Boutin, J.-M. et al., Molec. Endocr. 3:1455-1461, 1989). Эта нуклеотидная последовательность предсказала зрелый белок из 598 аминокислот с гораздо более длинным цитоплазматическим доменом,чем домен рецептора PRL печени крысы. Ген рецептора пролактина находится в том же самом хромосомном районе, что и ген рецептора гормона роста, который был картирован в 5; 13-р 12 (Arden, K.C. etal. Cytogenet. Cell Gene 53:161-165, 1990; Arden, K.C. et al., (Abstract) AM. J. Hum. Genet. 45 (suppl.): A129 только, 1989). Гормон роста также связывается с рецептором пролактина и активирует этот рецептор. Была определена геномная организация гена PRLR человека (Hu, Z.-Z. et al., J. Clin. Endocr. Metab. 84:1153-1156, 1999). 5'-Нетранслируемый район гена PRLR содержит 2 альтернативных первых экзона: Е 13, человеческая копия крысиного и мышиного Е 13, и новый тип альтернативного первого экзона человека, названный E1N. 5'-Нетранслируемый район также содержит обычный некодирующий экзон 2 и часть экзона 3, который содержит кодон инициации трансляции. Экзоны Е 13 и E1N находятся на расстоянии 800 пар оснований друг от друга. Эти 2 экзона экспрессируются в ткани молочной железы человека, клетках рака молочной железы, гонадах и печени. В общем и целом транскрипт, содержащий Е 13,является преобладающим в большинстве тканей. Продукт гена PRLR кодируется экзонами 3-10, из которых экзон 10 кодирует большую часть внутриклеточного домена. Экзоны Е 13 и E1N транскрибируются от альтернативных промоторов PIII и PN соответственно. Промотор PIII содержит элементы Sp1 и С/ЕВР, которые идентичны этим элементам в промоторе грызунов, и является на 81% сходным с районом -480/-106 у крысы и мыши. Промотор PN содержит предположительные сайты связывания для белков семейства ETS и полсайта для ядерных рецепторов.PRLR существует в ряде различных изоформ, которые отличаются по длине их цитоплазматических доменов. Четыре изоформы мРНК PRLR (L, I, S1a и S1b) были продемонстрированы в подкожной брюшной жировой ткани и жировой ткани молочной железы человека (Ling, С. et al., J. Clin. Endocr. Metab. 88:1804-1808, 2003). Кроме того, они детектировали экспрессию белка L-PRLR и I-PRLR в подкожной брюшной жировой ткани и жировой ткани молочной железы человека при помощи иммуноблот-анализа.PRL уменьшал активность липопротеинлипазы в жировой ткани человека в сравнении с контролем. Linget al. предполагают, что эти результаты продемонстрировали прямое действие PRL через функциональные PRLR в уменьшении активности LPL в жировой ткани человека и что эти результаты позволяют предположить, что LPL может также регулироваться подобным образом во время лактации. Была выяснена функция этих изоформ PRLR у крысы (Perrot-Applanat, M. et al., Molec. Endocr. 11:1020-1032, 1997). Подобно известной длинной форме (591 аминокислот), форма Nb2, которая лишена 198 аминокислот цитоплазматического домена, способна передавать лактогенный сигнал. В противоположность этому короткая форма, которая лишена 291 аминокислоты цитоплазматического домена, является неактивной. Функцию короткой формы исследовали после котрансфекции как длинной, так и короткой форм. Эти результаты показывают, что короткая форма действует как доминантно-негативный ингибитор при образовании неактивных гетеродимеров, приводя к ингибированию активации киназы 2 Януса. PerrotApplanat et al. предполагают, что гетеродимеризация PRLR может позитивно или негативно активировать транскрипцию PRL. В недавних сообщениях предполагается, что PRLR сверхэкспрессируется в тканях рака молочной железы и рака предстательной железы человека (Li et al., Cancer Res., 64:4774-4782, 2004; Gill et al., J.Clin. Pathol., 54:956-960, 2001; Touraine et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 83:667-674, 1998). Li et al. сообщали, что активация Stat5 и экспрессия PRLR ассоциируется с высокой гистологической степенью в 54% проб рака предстательной железы (Li et al., выше). В других сообщениях также предполагается, что пробы первичного рака молочной железы чувствительны к PRL в анализах образования колоний и что концентрации PRL в плазме коррелируют с риском рака молочной железы (Tworoger et al., Cancer Res.,64:6814-6819, 2004; Tworoger et al., Cancer Res., 66:2476-2482, 2006). Другое сообщение указывало на то,что PRL-трансгенные мыши развивают злокачественные карциномы молочной железы или гиперплазию предстательной железы (Wennbo et al., J. Clin. Invest., 100:2744-2751, 1997; Wennbo et al., Endocrinology,138:4410-4415, 1997). Моноклональное антитело PRLR снижало встречаемость опухолей молочной железы у мышей (Sissom et al., Am. J. Pathol. 133:589-595, 1988). Кроме того, антагонист PRL (S179D-мутантый PRL) ингибировал пролиферацию клеточной линии карциномы предстательной железы человека, DU-145 in vitro иDU-145-индуцированные опухоли in vivo (Xu et al., Cancer Res., 61:6098-6104, 2001). Таким образом, существует потребность в идентификации композиций и способов, которые модулируют PRLR, и его роль в таких раках. Данное изобретение нацелено на эти, а также другие важные потребности. Сущность изобретения Нуклеотидная последовательность PRLR представлена в SEQ ID NO: 1, а аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 2. Внеклеточный домен (ECD) состоит из аминокислот 25-234SEQ ID NO: 2, который может быть разделен на два основных домена, S1 (аминокислоты 25-122) и S2(аминокислоты 123-234). Был идентифицирован ряд различных изоформ PRLR: длинные (L) и промежуточные (I), S1, неактивная растворимая форма (PRLBP) и неактивные короткие формы S1a и S1b. Экзоны и нуклеотидные области, содержащиеся в каждой изоформе, изображены на фиг. 1. В иллюстративных вариантах осуществления это изобретение рассматривает антитела, которые связываются с S1 доменом и/или с S2-доменом. Те антитела, которые связываются с S2-доменом, могут нацеливаться на все активные изоформы. Данное изобретение обсуждает также антитела, которые связываются специфически с одной изоформой, но не с другой (например, с промежуточной, но не с S1a или S1b), или с активными изоформами (длинными, промежуточными и AS1), но не с неактивными изоформами (S1a иS1b). Материалы и способы данного изобретения удовлетворяют вышеупомянутым и другим требованиям в данной области. В одном варианте осуществления обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный доменPRLR с равновесной константой диссоциации (KD) 10-6M или более низкой и конкурирует с любым из антител chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3,he.06.275-4, ХРА.06.128, ХРА.06.129, ХРА.06.130, ХРА.06.131, ХРА.06.141, ХРА.06.147, ХРА.06.148,ХРА.06.158, ХРА.06.159, ХРА.06.163, ХРА.06.167, ХРА.06.171, ХРА.06.178, ХРА.06.181, ХРА.06.192,ХРА.06.202, ХРА.06.203, ХРА.06.206, ХРА.06.207, ХРА.06.210, ХРА.06.212, ХРА.06.217, ХРА.06.219,ХРА.06.229, ХРА.06.233, ХРА.06.235, ХРА.06.239, ХРА.06.145, ХНА.06.567, ХНА.06.642, ХНА.06.983,ХНА.06.275, ХНА.06.189 или ХНА.06.907 за связывание с PRLR более чем на 75%. Под термином "равновесная константа диссоциации (KD) 10-6M или более низкая" подразумевают равновесную константу диссоциации, например 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 или 10-12 М (т.е. величину, более низкую, чем 10-6 М). В другом варианте осуществления антитело связывается с тем же самым эпитопом PRLR, что и любое из антител chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.2753, he.06.275-4, XPA.06.128, ХРА.06.129, ХРА.06.130, ХРА.06.131, ХРА.06.141, ХРА.06.147, XPA.06.148,XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, ХРА.06.171, ХРА.06.178, ХРА.06.181, ХРА.06.192,ХРА.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, ХРА.06.217, ХРА.06.219,ХРА.06.229, ХРА.06.233, ХРА.06.235, ХРА.06.239, ХРА.06.145, ХНА.06.567, ХНА.06.642, ХНА.06.983,ХНА.06.275, ХНА.06.189 или ХНА.06.907. В другом варианте осуществления вышеупомянутое антитело содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 областейCDR любого из антител chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2,he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147,XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181,XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, ХРА.06.217,ХРА.06.219, ХРА.06.229, ХРА.06.233, ХРА.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642,XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 или ХНА.06.907. В другом варианте осуществления вышеупомя-2 017851 нутое антитело является химерным антителом, гуманизированным антителом, сконструированным для человека антителом, антителом человека, одноцепочечным антителом или фрагментом антитела. Еще в одном варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, в котором по меньшей мере одна аминокислота в CDR заменена соответствующим остатком соответствующей CDR другого анти-PRLRантитела. В иллюстративном варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, в котором по меньшей мере одна аминокислота в CDR из антитела, выбранного из группы, состоящей изchXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4,XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158,XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202,XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, ХРА.06.219, ХРА.06.229,ХРА.06.233, ХРА.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275,XHA.06.189 или ХНА.06.907, заменена соответствующим остатком соответствующей области CDR другого анти-PRLR-антитела. В другом иллюстративном варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, в котором по меньшей мере одна аминокислота в CDR из антитела, выбранного из группы, состоящей из chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2,he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147,XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181,XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217,XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642,XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 или ХНА.06.907, заменена соответствующим остатком соответствующей CDR другого антитела, выбранного из группы, состоящей из chXHA.06.642, chXHA.06.275,he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129,XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163,XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206,XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235,XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 или ХНА.06.907. Еще в одном варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, в котором одна или две аминокислоты в CDR модифицированы. В другом варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, которое сохраняет по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность на протяжении либо вариабельной легкой, либо вариабельной тяжелой области относительно антител chXHA.06.642,chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128,XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159,XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203,XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233,XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 или ХНА.06.907. В другом варианте осуществления вышеупомянутое антитело содержит константную область последовательности антитела человека и одну или несколько вариабельных каркасных областей тяжелой и легкой цепей последовательности антитела человека. Еще в одном варианте осуществления изобретения обеспечено вышеупомянутое антитело, в котором последовательность антитела человека является индивидуальной последовательностью человека, консенсусной последовательностью человека, индивидуальной последовательностью зародышевой линии человека или консенсусной последовательностью зародышевой линии человека. Еще в одном варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, в котором константная область тяжелой цепи является модифицированным или немодифицированным IgG, IgM, IgA, IgD,IgE, их фрагментом или их комбинациями. В другом варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, в котором константная область тяжелой цепи является модифицированным или немодифицированным IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В другом варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, которое имеет равновесную константу диссоциации 10-6, 10-7, 10-8 или 10-9 М или более низкую в отношении PRLR. Еще в одном варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, содержащее консервативную замену в областях CDR. В другом варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, содержащее консервативное или неконсервативное изменение в остатках низкого или умеренного риска. Еще в одном варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, в котором константная область легкой цепи является модифицированной или немодифицированной константной областью легкой цепи лямбда, константной областью легкой цепи каппа, их фрагментом или их комбинациями. Еще в одном варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, которое ингибирует димеризацию PRLR, ингибирует внутриклеточное фосфорилирование PRLR, ингибирует индукцию фосфорилирования MARK, ингибирует индукцию фосфорилирования Stat5, ингибирует индукцию фосфорилирования AKT и/или ингибирует связывание PRL с PRLR. В других вариантах осуществления вышеупомянутое антитело дополнительно ингибирует проду-3 017851 цирование VEGF и/или ангиогенез. Еще в одном варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, которое ингибирует пролиферацию раковой клетки. Еще в одном варианте осуществления это антитело ингибирует пролиферацию клеток рака молочной железы, предстательной железы и легкого. Кроме рака, другой вариант осуществления изобретения обеспечивает вышеупомянутое антитело для профилактики и/или лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний или нарушений. Эти антитела особенно пригодны в профилактике, ослаблении или лечении заболеваний, включающих аутоиммунный и/или воспалительный компонент. Эти заболевания включают, но не ограничиваются ими,аутоиммунные и воспалительные заболевания, такие как системная красная волчанка (SLE), дискоидная(хроническая) красная волчанка, люпус-нефрит (волчаночный нефрит), саркоидоз, воспалительный артрит, в том числе, но не только, ювенильный артрит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, синдром Рейтера, анкилозирующий спондилит и подагрический артрит, отторжение трансплантата органа или ткани, гиперострое, острое или хроническое отторжение и/или болезнь трансплантат против хозяина,рассеянный склероз, гипер-IgE-синдром, нодозный полиартериит, первичный билиарный цирроз печени,воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, глютеновую болезнь (глютенчувствительную энтеропатию), аутоиммунный гепатит, пернициозную (злокачественную) анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию, псориаз, склеродермию, тяжелую псевдопаралитическую миастению, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, аутоиммунный тиреоидит, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото,болезнь иммунных комплексов, синдром хронической усталости - иммунной дисфункции (CFIDS), полимиозит и дерматомиозит, криоглобулинемию, тромболизис, кардиомиопатию, обыкновенную пузырчатку, интерстициальный легочный фиброз, сахарный диабет типа I и типа II, гиперчувствительность замедленного типа 1, 2, 3 и 4, аллергию или аллергические нарушения, нежелательные/непреднамеренные иммунные реакции на терапевтические белки, астму, синдром Черджа-Строса (аллергический гранулематоз), атопический дерматит, аллергический и раздражающий контактный дерматит, крапивницу, IgE-опосредованную аллергию, атеросклероз, васкулит, идиопатические воспалительные миопатии, гемолитическое заболевание, болезнь Альцгеймера, хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию и т.п. В другом варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, которое конъюгировано с другим диагностическим или терапевтическим агентом. Еще в одном варианте осуществления обеспечен способ скрининга на антитело против внеклеточного домена белка PRLR, пригодное для лечения рака, предусматривающий стадии контактирования полипептида, содержащего ECD PRLR, с кандидатным антителом, которое содержит по меньшей мере 1,2, 3, 4, 5 или 6 областей CDR антител chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1,he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, ХРА.06.128, ХРА.06.129, ХРА.06.130, ХРА.06.131, ХРА.06.141,ХРА.06.147, ХРА.06.148, ХРА.06.158, ХРА.06.159, ХРА.06.163, ХРА.06.167, ХРА.06.171, ХРА.06.178,ХРА.06.181, ХРА.06.192, ХРА.06.202, ХРА.06.203, ХРА.06.206, ХРА.06.207, ХРА.06.210, ХРА.06.212,ХРА.06.217, ХРА.06.219, ХРА.06.229, ХРА.06.233, ХРА.06.235, ХРА.06.239, ХРА.06.145, ХНА.06.567,ХНА.06.642, ХНА.06.983, ХНА.06.275, ХНА.06.189 и ХНА.06.907; детектирования аффинности связывания кандидатного антитела с данным полипептидом и идентификации указанного кандидатного антитела как антитела, пригодного для лечения рака, если детектирована равновесная константа диссоциации 10-6 М или более низкая. В другом варианте осуществления обеспечен способ системного изменения антител и скрининга на антитело против внеклеточного домена белка PRLR, пригодное для лечения рака, предусматривающий стадии получения кандидатного антитела, которое содержит модификации одной или двух аминокислот в областях CDR антител chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2,he.06.275-3, he.06.275-4, ХРА.06.128, ХРА.06.129, ХРА.06.130, ХРА.06.131, ХРА.06.141, ХРА.06.147,ХРА.06.148, ХРА.06.158, ХРА.06.159, ХРА.06.163, ХРА.06.167, ХРА.06.171, ХРА.06.178, ХРА.06.181,ХРА.06.192, ХРА.06.202, ХРА.06.203, ХРА.06.206, ХРА.06.207, ХРА.06.210, ХРА.06.212, ХРА.06.217,ХРА.06.219, ХРА.06.229, ХРА.06.233, ХРА.06.235, ХРА.06.239, ХРА.06.145, ХНА.06.567, ХНА.06.642,ХНА.06.983, ХНА.06.275, ХНА.06.189 и ХНА.06.907; контактирования полипептида, содержащего ECDPRLR, с указанным кандидатным антителом; детектирования аффинности связывания кандидатного антитела с этим полипептидом и идентификации указанного кандидатного антитела как антитела, пригодного для лечения рака, если детектирована равновесная константа диссоциации 10-6 М или более низкая. Еще в одном варианте осуществления обеспечен способ скрининга на антитело против внеклеточного домена белка PRLR, пригодное для лечение рака, предусматривающий стадии контактирования клетки молочной железы, легкого или предстательной железы с кандидатным антителом, которое содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 областей CDR антител chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1,he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130,XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167,ХРА.06.171, ХРА.06.178, ХРА.06.181, ХРА.06.192, ХРА.06.202, ХРА.06.203, ХРА.06.206, ХРА.06.207,ХРА.06.210, ХРА.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239,XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 и ХНА.06.907, или антите-4 017851 лом, которое содержит модификацию одной или двух аминокислот в одной или нескольких областяхCDR; детектирования пролиферации или выживаемости указанной клетки и идентификации указанного кандидатного антитела как антитела, пригодного для лечения рака, если детектировано уменьшение клеточной пролиферации или выживаемости. Еще в одном варианте осуществления обеспечен способ лечения субъекта, страдающего от рака стадий 0, I, II, III, IV или V, предусматривающий стадию введения вышеупомянутого антитела в терапевтически эффективном количестве. В родственном варианте осуществления этим раком является рак молочной железы, легкого или предстательной железы. В другом варианте осуществления вводят второй терапевтический агент. В иллюстративном варианте осуществления вторым терапевтическим агентом является доксорубицин, даунорубицин или другой антрациклиновый или топоизомеразный ингибитор. В следующих вариантах осуществления любой из предыдущих топоизомеразных ингибиторов вводят сchXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4. Еще в одном варианте осуществления субъекта дополнительно подвергают лучевой терапии или хирургическому вмешательству. В других вариантах осуществления изобретения этот субъект является положительным в отношении экспрессии PRLR и экспрессии HER2-neu, и указанным вторым терапевтическим агентом является анти-Her2-neu-антитело. В родственном варианте осуществления этот субъект является положительным в отношении экспрессии PRLR и экспрессии ER, и указанным вторым терапевтическим агентом является анти-ER-антитело. В следующем варианте осуществления изобретение обеспечивает антитело по изобретению для применения в медицине, в том числе для применения в лечении рака. В других вариантах осуществления изобретение обеспечивает применение антитела по изобретению в приготовлении лекарственного средства для лечения рака. Это лекарственное средство может быть введено пациенту в комбинации со вторым терапевтическим агентом и/или с лучевой терапией. В другом варианте осуществления изобретения обеспечен способ направленного воздействия на опухолевую клетку, экспрессирующую PRLR, предусматривающий стадию введения вышеупомянутого антитела, конъюгированного с радионуклидом или другим токсином. В другом варианте осуществления этим субъектом является млекопитающее. Еще в одном варианте осуществления этим субъектом является человек. Еще в одном варианте осуществления обеспечена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует тяжелую цепь или легкую цепь вышеупомянутого антитела. Еще в одном варианте осуществления обеспечен экспрессирующий вектор, содержащий вышеупомянутую молекулу нуклеиновой кислоты, функционально связанную с регуляторной контрольной последовательностью. Еще в одном варианте осуществления обеспечена клетка-хозяин,содержащая вышеупомянутый вектор или вышеупомянутую молекулу нуклеиновой кислоты. Еще в одном варианте осуществления обеспечен способ применения вышеупомянутой клеткихозяина для получения антитела, предусматривающий культивирование этой клетки-хозяина при подходящих условиях и извлечение указанного антитела. Еще в одном варианте осуществления обеспечено антитело, полученное вышеупомянутым способом. Еще в одном варианте осуществления обеспечено вышеупомянутое антитело, которое очищено по меньшей мере до 95% гомогенности в расчете на массу. В другом варианте осуществления обеспечена фармацевтическая композиция, содержащая вышеупомянутое антитело и фармацевтически приемлемый носитель. Еще в одном варианте осуществления обеспечен набор, содержащий вышеупомянутое антитело,содержащий терапевтически эффективное количество антитела по изобретению, упакованное в контейнер, причем этот набор необязательно содержит второй терапевтический агент и дополнительно содержит этикетку, присоединенную к контейнеру или упакованную с контейнером, причем этикетка описывает содержимое контейнера и обеспечивает указания и/или инструкции, касающиеся применения содержимого контейнера для лечения рака. В другом варианте осуществления обеспечен набор, в котором контейнером является флакон, или склянка, или предварительно заполненный шприц. В другом варианте осуществления изобретения обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный домен PRLR, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55,57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 82, 84, 86, 88, 91, 95 и 96. В другом варианте осуществления обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный домен PRLR, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26,28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 83, 85, 87, 89, 90, 93,94, 97 и 98. Еще в одном варианте осуществления обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный домен PRLR, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи SEQ ID NO: 88 и аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи SEQ ID NO: 89. Еще в одном варианте осуществления обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный домен PRLR, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи SEQ ID NO: 88 и аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи SEQ ID NO: 90. Еще в одном варианте осуществления обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный доменPRLR, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи SEQ ID NO: 91 и аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи SEQ ID NO: 93. Еще в одном варианте осуществления обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный домен PRLR, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи SEQ ID NO: 91 и аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи SEQ ID NO: 94. Еще в одном варианте осуществления обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный домен PRLR, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи SEQ ID NO: 92 и аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи SEQ ID NO: 93. Еще в одном варианте осуществления обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный домен PRLR, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи SEQ IDNO: 92 и аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи SEQ ID NO: 94. Еще в одном варианте осуществления обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный доменPRLR, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи SEQ ID NO: 95 и аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи SEQ ID NO: 97. Еще в одном варианте осуществления обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный домен PRLR, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи SEQ ID NO: 95 и аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи SEQ ID NO: 98. Еще в одном варианте осуществления обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный домен PRLR, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи SEQ ID NO: 96 и аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи SEQ ID NO: 97. Еще в одном варианте осуществления обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный домен PRLR, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи SEQ ID NO: 96 и аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи SEQ ID NO: 98. В другом варианте осуществления изобретения обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный домен PRLR человека с KD по меньшей мере в 10-25000, 100-20000, 1000-18000, 5000-17000, 800016000, 10000-15000, 12000-15000 или 13000-14000 раз более низкой, чем внеклеточный домен мышиногоPRLR. В родственном варианте осуществления вышеупомянутое антитело связывает тот же самый эпитоп, что и he.06.275-4. Еще в одном варианте осуществления обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный домен PRLR человека, внеклеточный домен PRLR мыши и внеклеточный домен PRLR крысы. В другом варианте осуществления обеспечено антитело, которое связывает внеклеточный доменPRLR человека, мыши и крысы с равновесной константой диссоциации (KD) 10-6M или менее. В родственном варианте осуществления вышеупомянутое антитело связывает тот же самый эпитоп, что иhe.06.642-2. Еще в одном варианте осуществления указанные выше способы могут быть использованы для идентификации субъекта, нуждающегося в лечении анти-PRLR-антителом, посредством, например, (а) получения пробы из этого субъекта и (b) анализа этой пробы на уровень фосфорилирования PRLR, Jak2,Марк, Stat5, Erk1/2 и/или Akt; где уровень фосфорилирования PRLR, Jak2, Mapk, Stat5, Erk1/2 и/или Akt является показателем необходимости лечения анти-PRLR-антителом. В другом варианте осуществления обеспечен способ мониторинга раковой терапии у субъекта, страдающего от рака, предусматривающий стадии: (а) анализа первой пробы из этого субъекта на уровень фосфорилирования PRLR перед началом лечения противораковым терапевтическим средством и (b) анализа второй пробы после начала лечения противораковым терапевтическим средством, где уменьшение уровня фосфорилирования PRLR после начала лечения противораковым терапевтическим средством свидетельствует о том, что этот пациент получает терапевтически эффективную дозу противоракового терапевтического средства. В родственном варианте осуществления противораковым терапевтическим средством является антитело по любому из вышеописанных вариантов осуществления. Краткое описание фигур Фиг. 1 показывает расположение генов и экзонов в различных изоформах PRLR; фиг. 2-4 - действие выбранных PRLR-специфических антител на фосфорилирование pERK1/2 [mAb 1167 является контрольным мышиным моноклональным анти-PRLR-антителом; RD Systems, catalogMAB 1167]; фиг. 5 - действие PRLR-специфического антитела на пролиферацию PRL-чувствительной линии опухолевых клеток; фиг. 6 - действие PRLR-специфического антитела на внутриклеточное фосфорилирование PRLR; фиг. 7 А-7 С - аминокислотные последовательности VH и VL, а также местоположение CDR (подчеркнутые), антител ХРА.06.128, ХРА.06.129, ХРА.06.130, ХРА.06.131, ХРА.06.141, ХРА.06.147,ХРА.06.148, ХРА.06.158, ХРА.06.159, ХРА.06.163, ХРА.06.167, ХРА.06.171, ХРА.06.178, ХРА.06.181,ХРА.06.192, ХРА.06.202, ХРА.06.203, ХРА.06.206, ХРА.06.207, ХРА.06.210, ХРА.06.212, ХРА.06.217,ХРА.06.219, ХРА.06.229, ХРА.06.233, ХРА.06.235, ХРА.06.239, которые обнаруживали более чем 80% ингибирование в анализе pERK; фиг. 8 - аминокислотную последовательность VH и VL антитела XPA.06.145; фиг. 9 - нуклеотидные последовательности лидера и VH и VL антител ХНА.06.983, ХНА.06.275 и ХНА.06.642; фиг. 10 - аминокислотные последовательности VH и VL антител ХНА.06.983, ХНА.06.275 и ХНА.06.642 (CDR подчеркнуты); фиг. 11 показывает, что химерные анти-PRLR-mAb chXHA.06.642, chXHA.06.275 и chXHA.06.983 сильно ингибируют пролиферацию и выживаемость клеток BaF/PRLR. KLH-G1 является неспецифическим изотипически сходным контрольным антителом. Панель справа показывает величины IC50 соответствующих мышиных mAb; фиг. 12 показывает, что химерные анти-PRLR-mAb ингибируют передачу сигнала STAT5 в клеткахT47D. Клетки предварительно обрабатывали 1 мкг/мл mAb перед 30-минутной стимуляцией 50 нг/млPRL. Лизаты анализировали на присутствие фосфо-PRLR с использованием антител, специфических в отношении остатков фосфотирозина 546 и 611 PRLR; фиг. 13 - действие сконструированных антител человека (Human Engineered) на фосфорилирование pERK1/2; фиг. 14 - ADCC, опосредованную химерными анти-PRLR-mAb. Клетки T47D-T2 метили CalceinAM перед нанесением mAb (1 мкг/мл) и очищенных HK-клеток человека при соотношении эффектормишень 10:1. После 4-часовой инкубации измеряли высвобождение Calcein-AM в супернатант. АнтиKLH-антитело и герцептин использовали в качестве отрицательного и положительного контролей соответственно. Специфический лизис в % рассчитывали как (экспериментальное высвобождение - самопроизвольное высвобождение)/(максимальное высвобождение - самопроизвольное высвобождение)100; фиг. 15 показывает, что анти-PRLR-mAb действуют синергически с цитотоксическими лекарственными средствами в комбинированных исследованиях. Доксорубицин (верхняя панель) и цисплатин(нижняя панель) вводили совместно с контрольным анти-KLH-Ab, анти-PRLR-mAb chXHA.06.642 или анти-PRLR-mAb chXHA.06.275 (все при 1 мкг/мл). Выживаемость клеток определяли анализом CellTiterGlo и выражали в виде RLU (у-ось); фиг. 16 показывает, что сконструированные mAb человека (Human Engineered) сохраняют функциональные характеристики анти-PRLR в анализах фосфорилирования STAT5. Клетки T47D инкубировали с 1 или 10 мкг/мл mAb, затем обрабатывали с PRL (50 нг/мл) или без него в течение дополнительных 30 мин; фиг. 17 А и В показывают, что кандидаты гуманизированного анти-PRLR-антитела сильно ингибируют рост PRL-зависимых клеток BaF3/PRLR. Клетки BaF3/PRLR выращивали в присутствии PRL (50 нг/мл) в течение 48 ч с контрольным анти-KLH-антителом (верхняя линия), химерным антителом или с версиями сконструированного антитела (Human Engineered). Величины ЕС 50 рассчитывали с использованием нелинейного регрессионного анализа с подгонками кривых; фиг. 18 А и В - ингибирование p-STAT5 в опухолях Nb2-C11 обработанных chXHA.06.642 животных. Бестимусных мышей с подкожными опухолями Nb2-c11 инъецировали внутрибрюшинноchXHA.06.642 или контрольными анти-KLH-IgG1-mAb. Спустя два дня вводили болюс 20 мкг внутрибрюшинной инъекцией oPRL. Контрольных животных инъецировали солевым раствором. Спустя два дня вводили 20 мкг болюсной инъекции oPRL и спустя 40 мин опухоли собирали и оценивали на p-STAT5 иммуноблоттингом или IHC (иммуногистохимическим анализом). Фиг. 18 А - Вестерн-блот 80 мкгNb2-c11 в мышах SCID в двух разных исследованиях; фиг. 20 А и В показывают, что chXHA.06.642 вызывает регрессию установленных опухолей лимфомы крыс Nb2-C11 в мышах SCID. Фиг. 20 А изображает объем опухоли; фиг. 20 В - условную выживаемость; фиг. 21 А и В показывают, что внутрибрюшинная болюсная инъекция oPRL индуцирует p-STAT5, и обработка chA64.1 ингибирует индукцию p-STAT5 в ксенотрансплантатах T47D молочной железы человека. chXHA.06.642 или контрольный анти-KLH-IgG1 инъецировали внутрибрюшинно в несущих опухоль T47D иммунодефицитных мышей, имплантированных гранулами эстрадиола 0,18 мг/день (Е 2) для поддержания роста. Спустя два дня внутрибрюшинно вводили болюсную инъекцию oPRL (20 мкг) и спустя 40 мин опухоли T47D собирали и оценивали на p-STAT5 иммуноблоттингом или IHC. Уровни pERK или p-AKT также оценивали с использованием иммуноблота. Фиг. 21 А - Вестерн-блот 80 мкгTyr694 p-STAT5; фиг. 21 В - IHC Tyr694 p-STAT5. Подробное описание Данное изобретение обеспечивает PRLR-специфические антитела, фармацевтические композиции,содержащие такие антитела, способы получения этих антител и фармацевтических композиций и способы лечения пациентов этими фармацевтическими композициями и соединениями. Антитела по этому изобретению могут иметь желаемую биологическую активность связывания с PRLR, и/или ингибирования димеризации PRLR, и/или внутриклеточного фосфорилирования PRLR, и/или ингибирования передачи сигнала PRLR далее по ходу процесса, например, последством фосфорилирования Jak2, Mapk, Stat5,Erk1/2 и/или Akt, и ингибирования клеточной пролиферации, ассоциированной с раком или опухолями. Таким путем предполагается прямой анализ активации PRLR детектированием его фосфорилирования или оценкой статуса фосфорилирования других расположенных далее по ходу процесса партнеров пере-7 017851 дачи сигнала, таких как Jak2, Stat5, Erk1/2 и/или Akt. Таким образом, анализ путей передачи сигнала далее по ходу процесса может быть использован для идентификации пациентов, нуждающихся в антиPRLR-антителах, или использован для мониторинга пациентов, которых лечили анти-PRLR-антителами. Антитела согласно данному изобретению могут альтернативно (или дополнительно) иметь желаемую биологическую активность связывания с PRLR, экспрессируемым на раковых клетках, служа, таким образом, для направленного воздействия цитотоксических терапевтических средств на раковые клетки. Далее это изобретение относится к анализам скрининга для идентификации антагонистов или агонистов гена или продукта гена PRLR и их вариантов. Таким образом, это изобретение относится к способам идентификации агонистов или антагонистов гена или продукта гена PRLR и их вариантов и к применению указанного агониста или антагониста для лечения или профилактики рака, как описано здесь. Кроме того, данное изобретение рассматривает применение молекул нуклеиновых кислот, полипептидов и/или антагонистов или агонистов продуктов гена, кодируемых геном PRLR, для скрининга, диагностики, профилактики и/или лечения нарушений, характеризующихся аберрантной экспрессией или активностью PRLR, которые включают раковые заболевания, такие как, но не только, рак легкого, рак молочной железы и рак предстательной железы. Несколько предпочтительных мышиных или химерных антител с высокой аффинностью и эффективностью, измеренными анализами in vitro, модифицированы для уменьшения их иммуногенности у людей на основе способа Human Engineering Studnicka et al. Вкратце, представленные на поверхности аминокислотные остатки вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи модифицируют введением аминокислотных остатков человека в положениях, которые, как было определено, имеют малую вероятность вредного действия на связывание антигена или укладку белка, с одновременным уменьшением иммуногенности в отношении окружения (среды) человека. Конструируют синтетические гены, содержащие модифицированные вариабельные области тяжелой цепи и/или легкой цепи и связывают с константными областями тяжелой цепи у и/или легкой цепи каппа. Любые константные области тяжелой цепи и легкой цепи могут быть использованы в комбинации с вариабельынми областями сконструированного человеком антитела (Human Engineered). Гены тяжелой и легкой цепей вводят в клетки млекопитающих и образованные рекомбинантные иммуноглобулиновые продукты получают и характеризуют. Примерные антитела согласно данному изобретению включают chXHA.06.642, chXHA.06.275,he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129,XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163,XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, ХРА.06.203, ХРА.06.206,ХРА.06.207, ХРА.06.210, ХРА.06.212, ХРА.06.217, ХРА.06.219, ХРА.06.229, ХРА.06.233, ХРА.06.235,ХРА.06.239, ХРА.06.145, ХНА.06.567, ХНА.06.642, ХНА.06.983, ХНА.06.275, ХНА.06.189 и ХНА.06.907. Следующие секретирующие антитела гибридомы были депонированы Американской Коллекцией Типовых Культур (АТСС) 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 (USA) в соответствии с положениями Будапештского Договора, 17 августа 2006 г. Приведенные ниже определения обеспечены в качестве помощи в более полном понимании этого изобретения. Общие определения Антиген-мишень человека "PRLR" обозначает в данном контексте полипептид человека, имеющий,по существу, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и его природные аллельные и/или сплайсинговые варианты. "ECD PRLR" обозначает в данном контексте внеклеточную часть PRLR, представленную аминокислотами 25-234 SEQ ID NO: 2."Опухолью" называют в данном контексте рост и пролиферацию всех неопластических клеток, независимо от того, являются ли они злокачественными или доброкачественными, и все предраковые и раковые клетки и ткани. Термины "рак" и "раковое" относится к физиологическому состоянию или описывает физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают, но не ограничиваются ими, рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак почки, рак печени, рак легкого, лимфоидный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки или рак кожи."Лечение" является вмешательством, выполняемым с намерением предотвращения развития или изменения патологии нарушения. Таким образом, "лечение" относится как к терапевтическому лечению,так и к профилактическим или превентивным мерам. Лица, нуждающиеся в лечении, включают лиц, которые уже имеют это нарушение, а также лиц, в которых это нарушение должно быть предотвращено. В лечении опухоли (например, рака) терапевтический агент может непосредственно уменьшать патологию опухолевых клеток или делать опухолевые клетки более чувствительными к лечению другими терапевтическими агентами, например облучению и/или химиотерапии. Лечение пациентов, страдающих от клинических, биохимических, радиологических или субъективных симптомов может включать ослабление некоторых или всех симптомов или уменьшение предрасположенности к этому заболеванию. Термин "патология" рака включает все явления, которые ухудшают хорошее самочувствие пациента. Он включает, без ограничения, аномальный или неконтролируемый рост клеток, метастазирование, препятствие нормальному функционированию соседних клеток, высвобождение цитокинов или других секреторных продуктов при отклоняющихся от нормы уровнях, супрессию или обострение воспалительной или иммунологической реакции и т.д. Таким образом, улучшение после лечения может проявляться в виде уменьшенного размера опухоли, снижения скорости роста опухоли, деструкции существующих опухолевых клеток или метастатических клеток и/или уменьшение размера или количества метастазов."Млекопитающее" для целей лечения относится к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, в том числе к людям, домашним и сельскохозяйственным животным и животным зоопарков, спортивным животным и домашним любимцам, таким как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Предпочтительно этим млекопитающим является человек. В данном контексте фраза "терапевтически эффективное количество" обозначает количество терапевтического или профилактического антитела, которое было бы подходящим для варианта осуществления данного изобретения, которое будет индуцировать желаемые терапевтические или профилактические действие или реакцию, в том числе ослабление нескольких или всех таких симптомов заболевания или уменьшения предрасположенности к этому заболеванию при введении в соответствии с желаемой схемой лечения. Антитела."Аффинность" или "аффинность связывания" часто измеряют равновесной константой ассоциации(KA) или равновесной константной диссоциации (KD). Термин "иммуноспецифическое" или "специфически связывающее" означает, что это антитело связывается с PRLR или его ECD с равновесной константой ассоциации (KA), большей чем или равной приблизительно 106 М-1, большей чем или равной приблизительно 107 М-1, большей чем или равной приблизительно 108 М-1 или большей чем или равной приблизительно 109M-1, 1010M-1, 1011M-1 или 1012 М-1. Это антитело может иметь существенно более высокую аффинность в отношении антигена-мишени в сравнении с другими неродственными молекулами. Это антитело может иметь также существенно более высокую аффинность в отношении антигена-мишени в сравнении с ортологами или гомологами, например по меньшей мере 1,5-кратную, 2-кратную, 5 кратную, 10-кратную, 100-кратную, 103-кратную, 104-кратную, 105-кратную, 106-кратную или более высокую относительную аффинность в отношении антигена-мишени. Альтернативно оно может быть применимо в качестве антитела для перекрестной реакции с известным гомологом или ортологом. Антитела по изобретению могут быть также охарактеризованы по равновесной константе диссоциации (KD) 10-4, 10-6, 10-7 или 10-8, 10-10, 10-11 или 10-12 М или более низкой. Такие аффинности могут быть легко определены с использованием общепринятых способов, например равновесным диализом; с использованием прибора BIAcore 2000, с использованием общих процедур, описанных производителем; радиоиммуноанализом с использованием радиоактивно меченого антигена-мишени или другим способом, известным квалифицированному в данной области специалисту. Данные по аффинности могут анализироваться, например, по способу Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci, 51:660 (1949). Под "нейтрализующим антителом" имеют в виду молекулу антитела, которая способна элиминировать или существенно уменьшать эффекторную функцию антигена-мишени, с которым она связывается. Таким образом, "нейтрализующее" антимишень-антитело способно элиминировать или существенно уменьшать эффекторную функцию, например активность фермента, связывание лиганда или внутриклеточную передачу сигналов. Термин "антитело" используется в его самом широком смысле и включает полностью собранные антитела, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), фрагменты антител, которые могут содержать антиген (например, Fab',F'(ab)2, Fv, одноцепочечные антитела, димерные антитела), антитела с частями антител семейства верблюдовых и рекомбинантные пептиды, содержащие все предыдущие антитела, пока они проявляют желаемую биологическую активность. Фрагменты антител могут быть получены способами рекомбинантных ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных антител и описаны дополнительно ниже. Неограничивающие примеры моноклональных антител включают мышиные, химерные,-9 017851 гуманизированные антитела, антитела человека и иммуноглобулины, антитела Human Engineered, химерные слитые белки, имеющие последовательности, произведенные из иммуноглобулинов, или их мутеины или производные, каждые из которых описаны дополнительно ниже. Рассматриваются мультимеры или агрегаты интактных молекул и/или фрагментов, в том числе химически дериватизованные антитела. Антитела любого класса или подкласса изотипа рассматриваются в соответствии с данным изобретением. Термин "моноклональное антитело" относится в данном контексте к антителу, полученному из популяции. по существу, гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, содержащие эту популяцию,являются идентичными за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, направленными против единственного антигенного сайта. Кроме того, в противоположность общепринятым (поликлональным) антителам, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на этом антигене. Кроме их специфичности, моноклональные антитела являются предпочтительными в том смысле, что они синтезируются гомогенной культурой, не загрязненной другими иммуноглобулинами с отличающимися специфичностями и характеристиками. Определение "моноклональное" указывает на характер этого антитела, как полученного, по существу, из гомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться как требующее получения этого антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые должны использоваться в соответствии с данным изобретением, могут быть получены гибридомным способом,впервые описанном Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или способами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США 4816567). "Моноклональные антитела" могут быть рекомбинантными, химерными, гуманизированными, антителами человека, сконструированными для человека (Human Engineered) или, например, фрагментами антител."Выделенное" антитело является антителом, которое было идентифицировано и отделено и извлечено из компонента его природного окружения. Компонентами загрязнения его природного окружения являются вещества, которые могли бы мешать диагностическим и терапевтическим применениям для этого антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые и небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления это антитело будет очищено (1) до более чем 95% в расчете на массу антитела, как определено при помощи способа Лоури, и наиболее предпочтительно более чем 99% в расчете на массу, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающейся чашей, или (3) до гомогенности согласно электрофорезу в ДСН-ПААГ при восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием Кумасси синего или предпочтительно содержащего серебро красителя. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, как только не будет присутствовать по меньшей мере один компонент природного окружения антитела. Однако обычно выделенное антитело должно выделяться с использованием по меньшей мере одной стадии очистки."Иммуноглобулин" или "нативное антитело" является тетрамерным гликопротеином. В природном иммуноглобулине каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну "легкую" (приблизительно 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (приблизительно 50-70 кДа). Аминоконцевая часть каждой цепи включает "вариабельную" область приблизительно 100-110 или более аминокислот, первично ответственных за узнавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константную область, первично ответственную за эффекторную функцию. Иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам в зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей. Тяжелые цепи классифицируются как , , ,ии определяют изотип антитела, такой как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. Несколько из них могут быть дополнительно подразделены на подклассы или изотипы, например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Различные изотипы имеют разные эффекторные функции; например изотипы IgG1 и IgG3 имеют ADCCактивность. Легкие цепи человека классифицируются как легкие цепии . В легкой и тяжелой цепях вариабельные и константные области соединены J-районом из приблизительно 12 или более аминокислот, причем тяжелая цепь также включает в себя D-район из приблизительно 10 или более аминокислот. См. в общем виде Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989. В отношении подробного описания структуры и генерирования антител см. работу Roth, D.B. andCraig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998), включенную здесь полностью в качестве ссылки. Вкратце, способ генерирования ДНК, кодирующей гены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, имеет место первично в развивающихся В-клетках. Перед реаранжировкой и соединением различных генных сегментов иммуноглобулина сегменты генов V, D, J и константные (С) генные сегменты обнаруживаются в относительно тесной близости на единственной хромосоме. Во время дифференцировки В-клеток один из каждого из подходящих членов семейства генных сегментов V, D, J (или только V и J в случае генов легкой цепи) рекомбинируется с образованием функционально реаранжированных генов тяжелой и легкой цепи им- 10017851 муноглобулина. Этот процесс реаранжировки генных сегментов является, по-видимому, непрерывным. Сначала образуются сочленения тяжелая цепь D-J, затем сочленения тяжелая цепь V-DJ и сочленения легкая цепь V-J. Наряду с реаранжировкой сегментов V, D и J дополнительное разнообразие генерируется в первичном репертуаре тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина посредством вариабельной рекомбинации в местоположениях, где сегменты V и J соединяются в легкой цепи и где сегменты D и J соединяются в тяжелой цепи. Такая вариация в легкой цепи обычно происходит в последнем кодоне генного сегмента V и первом кодоне сегмента J. Сходная неточность присоединения происходит на хромосоме тяжелой цепи между сегментами D и JH и может простираться на 10 нуклеотидов. Кроме того, несколько нуклеотидов могут быть инсертированы между генными сегментами D и JH и между VH и D, которые не кодируются геномной ДНК. Добавление этих нуклеотидов известно как многообразие N-района. Суммарным эффектом таких реаранжировок в генных сегментах вариабельной области и вариабельной рекомбинации, которая может происходить во время такого присоединения, является получение репертуара первичных антител."Фрагменты антител" содержат часть интактного полноразмерного антитела (в том числе антител человека), предпочтительно антигенсвязывающего района или вариабельной области интактного антитела и включают мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Неограничивающие примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')2, Fv, домен-антитело (dAb), фрагменты определяющей комплементарность области (CDR), одноцепочечные антитела (scFv), фрагменты одноцепочечных антител, димерные антитела, тримерные антитела, тетрамерные антитела, мини-антитела, линейные антитела (Zapata et al., Protein Eng., 8 (10):1057-1062 (1995; хелатообразующие рекомбинантные антитела, тримерные антитела или би-антитела, интра-антитела, нано-антитела, малые модульные иммунофармацевтические вещества (SMIP), слитый белок антигенсвязывающий домен-иммуноглобулин,"верблюдизированное" антитело, VHH-содержащее антитело или их мутеины или производные, и полипептиды, которые содержат по меньшей мере часть иммуноглобулина, которая является достаточной для придания связывания специфического антигена к этому полипептиду, такую как CDRпоследовательность, пока это антитело сохраняет желаемую биологическую активность. Расщепление антител папаином дает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых"Fab"-фрагментами, каждый из которых имеет единственный сайт связывания антигена, и остаточный"Fc"-фрагмент, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться (35). Обработка пепсином дает фрагмент F(ab')2, который дает два Fv-фрагмента. Fv-фрагмент является минимальным фрагментом антитела, который содержит полный сайт узнавания и связывания антигена. Этот район состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в плотной нековалентной ассоциации. В этой конфигурации три области CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют для определения (создания) антигенсвязывающего сайта на поверхности димера VH VL. Вместе эти шесть областей CDR сообщают этому антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже единственный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три области CDR, специфических в отношении антигена) имеет способность узнавать и связывать антиген."Одноцепочечные Fv", или "sFv", или "scFv"-фрагменты антител содержат домены VH и VL антитела, где эти домены присутствуют в единой полипептидной цепи. Предпочтительно этот Fv-полипептид дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет этому Fv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. В отношении обзора sFv см. Pluckthun inFab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН 1) тяжелой цепи. Fab-фрагменты отличаются от Fab'-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксиконце CHI-домена тяжелой цепи, в том числе одного или нескольких цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH является здесь обозначением для Fab', в котором остаток (остатки) цистеина константных доменов несет одну свободную тиоловую группу. F(ab')2-фрагменты антител первоначально были получены в виде пар Fab'-фрагментов, которые имели цистеины шарнира между ними. Термин "гипервариабельная" область относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из"определяющей комплементарность области", или CDR [т.е. остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (Н 2) и 95-102 (Н 3) в вариабельном домене тяжелой цепи, как описано Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)], и/или эти остатки из гипервариабельной петли (т.е. остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (Н 2) и 96-101 (Н 3) в вариабельном домене тяжелой цепи, как описано [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917"Каркасные" или FR-остатки являются остатками вариабельных доменов, другие, чем остатки гипервариабельной области. Фраза "константная область" относится к части молекулы антитела, которая придает эффекторную функцию. Фраза "химерное антитело" относится в данном контексте к антителу, содержащему последовательность, произведенную из двух разных антител (см., например, патент США 4816567), которая обычно происходит из разных видов. Наиболее часто, химерные антитела содержат фрагменты антител человека и мыши, обычно константную область человека и вариабельную область мыши. Термин "мутеин" или "вариант" может использоваться взаимозаменяемо и относится к полипептидной последовательности антитела, которая содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену,делецию или инсерцию в вариабельной области или части, эквивалентной вариабельной области, при условии, что этот мутеин или вариант сохраняет желаемую аффинность связывания или биологическую активность. Мутеины могут быть, по существу, гомологичны или, по существу, идентичны исходному антителу. Термин "производное" относится в контексте антител этого изобретения к антителам, ковалентно модифицированным такими способами, как убиквитинилирование, конъюгация с терапевтическими или диагностическими агентами, мечение (например, радионуклидами или различными ферментами), ковалентное присоединение полимера, такое как пэгилирование (дериватизация полиэтиленгликолем), и инсерция или замена химическим синтезом неприродных аминокислот. Производные этого изобретения будут сохранять связывающие свойства недериватизованных молекул этого изобретения. В данном контексте термин "антитело" специфически включает в себя любой из следующих компонентов, которые сохраняют способность связывания внеклеточной части PRLR: 1) аминокислотный мутеин исходного антитела, имеющий аминокислотную последовательность,представленную на фиг. 7 А-7 С или 8, в том числе мутеин, содержащий аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи, которая является по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92,93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологичной исходной аминокислотной последовательности, и/или содержащий аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи, которая является по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологичной исходной аминокислотной последовательности, с учетом сходных аминокислот для определения гомологии; 2) PRLR-связывающие полипептиды, содержащие одну или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) исходного антитела, имеющие аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 7 А-7 С или 8, предпочтительно содержащие, по меньшей мере, CDR3 тяжелой цепи и предпочтительно содержащие две или более, или три или более, или четыре или более, или пять или более, или все шесть областей CDR; 3) антитела, сконструированные для человека (Human Engineered), генерированные изменением исходной последовательности в соответствии со способами, описанными в Studnicka et al., патент США 5766886 и в примере 5 здесь, с использованием нумерации Кабата для идентификации остатков низкого, умеренного и высокого риска; такие антитела содержат по меньшей мере одну из следующих тяжелых цепей и по меньшей мере одну из следующих легких цепей: (а) тяжелую цепь, в которой все из остатков грызуна низкого риска, которые отличаются от соответствующих остатков в ссылочной последовательности иммуноглобулина человека, модифицировали, чтобы они были теми же самыми, что и остатки человека в ссылочной последовательности иммуноглобулина человека, или (b) тяжелую цепь, в которой все из остатков грызуна низкого и умеренного риска модифицировали, если необходимо, чтобы они были теми же самыми остатками, что и остатки в ссылочной последовательности иммуноглобулина человека, (с) легкую цепь, в которой все из остатков низкого риска модифицировали, если необходимо,чтобы они были теми же самыми, что и остатки в ссылочной последовательности иммуноглобулина человека, или (d) легкую цепь, в которой все из остатков низкого и умеренного риска модифицировали,если необходимо, чтобы они были теми же самыми, что и остатки в ссылочной последовательности иммуноглобулина человека; 4) мутеины вышеупомянутых антител предыдущего параграфа (3), содержащие тяжелую цепь или легкую цепь или вариабельные области тяжелой или легкой цепи, имеющие по меньшей мере 60% идентичность аминокислотной последовательности с исходной легкой цепью грызуна, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, в том числе, например, 65, 70, 75,80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и 100% идентичность; 5) PRLR-связывающие полипептиды, содержащие остатки высокого риска одной или нескольких областей CDR антитела грызуна и предпочтительно содержащие остатки высокого риска двух или более,или трех или более, или четырех или более, или пяти или более, или всех шести областей CDR и необязательно содержащие одно или несколько изменений в остатках низкого или умеренного риска; например, содержащие одно или несколько изменений в остатке низкого риска и консервативные замены в остатке умеренного риска, или например, сохраняющие аминокислотные остатки умеренного и высокого риска и содержащие одно или несколько изменений в остатке низкого риска, где изменения включают инсерции, делеции или замены и могут быть консервативными заменами или могут заставлять сконструированное антитело быть более близким в последовательности к последовательности легкой цепи или тяжелой цепи человека, последовательности легкой цепи или тяжелой цепи зародышевой линии человека, консенсусной последова- 12017851 тельности легкой цепи или тяжелой цепи человека или консенсусной последовательности легкой цепи или тяжелой цепи зародышевой линии человека. Такие рассматриваемые изменения могут быть также изображены в формате последовательности следующим образом. В гипотетической последовательностиAKKLVHTPYSFKEDF, где соответствующий риск, распределенный относительно каждого остатка в соответствии с Studnicka et al., патент США 5766886, является следующим: HMLHMLHMLHMLHML(Н=высокий, М=средний, L=низкий), примерные изменения в отношении остатков низкого риска этой гипотетической последовательности могут быть изображены как AKXLVXTPXSFXEDX, где X обозначает любую аминокислоту, или альтернативно, где X обозначает консервативную замену исходного остатка в этом положении, а примерные изменения в отношении остатков низкого и умеренного риска могут быть изображены аналогичным образом, например AYXLYXTYXSYXEYX, где X обозначает любую аминокислоту, a Y является консервативной заменой исходного остатка в этом положении. Термин "конкурирующее антитело" включает 1) не мышиное моноклональное антитело или моноклональное антитело не грызуна, которое связывается с тем же самым эпитопом PRLR, что и антитело chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1,he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130,XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167,XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207,XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239,XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 или ХНА.06.907, например, как определено при помощи рентгеновской кристаллографии; или 2) не мышиное моноклональное антитело или моноклональное антитело не грызуна, которое конкурирует с антителом chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2,he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147,XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181,XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217,XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642,XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 или ХНА.06.907 на более чем 75%, более чем 80% или более чем 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95%; альтернативно не мышиное моноклональное антитело или моноклональное антитело не грызуна, которое уменьшает связывание chXHA.06.642,chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, ХРА.06.128,ХРА.06.129, ХРА.06.130, ХРА.06.131, ХРА.06.141, ХРА.06.147, ХРА.06.148, ХРА.06.158, ХРА.06.159,ХРА.06.163, ХРА.06.167, ХРА.06.171, ХРА.06.178, ХРА.06.181, ХРА.0.6.192, ХРА.06.202, ХРА.06.203,ХРА.06.206, ХРА.06.207, ХРА.06.210, ХРА.06.212, ХРА.06.217, ХРА.06.219, ХРА.06.229, ХРА.06.233,ХРА.06.235, ХРА.06.239, ХРА.06.145, ХНА.06.567, ХНА.06.642, ХНА.06.983, ХНА.06.275, ХНА.06.189 или ХНА.06.907 по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 100 раз или более. В одном варианте осуществления это не мышиное моноклональное антитело или моноклональное антитело не грызуна находится в 50-кратном молярном избытке. Антитела по изобретению предпочтительно связываются с ECD PRLR с равновесной константой диссоциации 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12 М или более низкой и предпочтительно ингибируют внутриклеточное фосфорилирование PRLR и активацию передачи сигнала PRLR далее по ходу процесса,например, посредством активации STAT5, MAPK или AKT. Необязательно любое химерное антитело, антитело человека или гуманизированное антитело, публично раскрытое до даты подачи этой заявки или раскрытое в заявке, поданной до даты подачи этой заявки, исключено из объема этого изобретения. Моноклональным антителом "не грызуна" является любое антитело, определенное в широком смысле здесь, которое не является полным интактным моноклональным антителом грызуна, генерированным гибридомой грызуна. Таким образом, антитела не грызуна конкретно включают, но не ограничиваются ими, мутеины антител грызуна, фрагменты антител грызуна, линейные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, антитела Human Engineered и антитела человека, в том числе антитела человека, полученные из трансгенных животных или технологией фагового дисплея. Подобным образом, не мышиные антитела включают, но не ограничиваются ими, мутеины мышиных антител, фрагменты мышиных антител, линейные антитела, химерные, гуманизированные, сконструированные для человека (Human Engineered) и антитела человека. Антиген-мишень. Антигеном-мишенью для применения для получения антител может быть, например, внеклеточная часть PRLR или фрагмент, который сохраняет желаемый эпитоп, необязательно слитые с другим полипептидом, который позволяет этому эпитопу быть представленным в его нативной конформации. Альтернативно для генерирования антител может быть использован интактный PRLR, экспрессируемый на поверхности клеток. Такие клетки могут быть трансформированы для экспрессии PRLR или могут быть другими природными клетками, которые экспрессируют PRLR. Другие формы полипептидов PRLR,применимые для генерирования антител, будут очевидны квалифицированным в данной области специа- 13017851 листам. Поликлональные антитела. Поликлональные антитела предпочтительно индуцируются в животных множественными подкожными (sc) или внутрибрюшинными (ip) инъекциями соответствующего антигена и адъюванта. Улучшенная реакция в виде антител может быть получена конъюгированием соответствующего антигена с белком, который является иммуногенным в виде, который должен быть иммунизирован, например гемоцианином морского блюдечка, сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином или ингибитором трипсина сои, с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например эфира малеимидобензоилсульфосукцинимида (конъюгацией через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина), глутарового альдегида, янтарного ангидрида или других агентов, известных в данной области. Животных иммунизируют против этого антигена, иммуногенных конъюгатов или производных объединением, например, 100 или 5 мкг белка или конъюгата (для кроликов или мышей соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и инъекцией этого раствора интрадермально во множественных сайтах. Спустя один месяц этих животных вторично иммунизируют 1/5 - долей (1/10) исходного количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда подкожной инъекцией во множественных сайтах. На 7-14 дни после бустер-инъекции у животных берут кровь и полученную сыворотку анализируют на титр антител. Бустер-инъекции животных повторяют, пока титр не выйдет на плато. Предпочтительно животное реиммунизируют одним и тем же антигеном, но конъюгированным с отличающимся белком, и/или с использованием отличающегося сшивающего реагента. Конъюгаты могут быть также получены в культуре рекомбинантных клеток в виде слитых белков. Для усиления иммунной реакции удобно использовать также агрегирующие агенты, такие как квасцы. Моноклональные антитела. Моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомного способа, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены способами рекомбинантных ДНК. В гибридомном способе мышь или другое подходящее животное-хозяин, такое как хомячок или обезьяна (макак), иммунизируют, как описано здесь, для индукции лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с белком, используемым для иммунизации. Альтернативно лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты сливают с миеломными клетками с использованием подходящего агента слияния, такого как полиэтиленгликоль, для образования гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (AcademicPress, 1986, или они могут быть слиты с использованием слияния с применением электроэлемента. Гибридомные клетки, полученные таким образом, высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживаемость неслитых, исходных миеломных клеток. Например, если исходные миеломные клетки лишены фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), эта культуральная среда для гибридом будет обычно включать в себя гипоксантин, аминоптерин и тимидин(НАТ-среда), которые предотвращают рост HGPRT-недостаточных клеток. Предпочтительными миеломными клетками являются клетки, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильное продуцирование высокого уровня антитела отобранными антителопродуцирующими клетками и являются чувствительными к среде. Линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мышь-человек также были описаны для получения моноклональных антител человека(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987. Примерные линии мышиной миеломы включают в себя линии, полученные из опухолей мышей МОР-21 и М.С.-11, доступные из Salk Institute CellDistribution Center, San Diego, Calif. USA, и клетки SP-2 или X63-Ag8-653 доступны из Американской Коллекции Типовых Культур (American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA). Культуральную среду, в которой выращивают гибридомные клетки, анализируют на продуцирование моноклональных антител, направленных против этого антигена. Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, продуцированных гибридомными клетками, определяют иммунопреципитацией или при помощи анализа связывания in vitro, такого как радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Аффинность связывания моноклонального антитела может быть определена, например, анализом Скетчарда (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980. После идентификации гибридомных клеток, которые продуцируют антитела желаемой специфичности, аффинности и/или активности, эти клоны могут быть субклонированы процедурами лимитирующего разведения и выращены стандартными способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles andPractice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986. Подходящие культуральные среды для этой цели включают в себя, например, среду D-MEM или среду RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки могут быть выращены in vivo в виде асцитных опухолей в животном. Моноклональные антитела, секретируемые этими субклонами, предпочтительно отделяют от культуральной среды, асцитической жидкости или сыворотки общепринятыми процедурами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, белок А-сефарозная гидроксиапатитная хроматография, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. ДНК, кодирующая моноклональные антитела, может быть выделена и секвенирована из гибридомных клеток с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны связываться специфически с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи этих моноклональных антител). Определение последовательности будет обычно требовать выделения по меньшей мере части представляющего интерес гена или представляющей интерес кДНК. Обычно это требует клонирования ДНК или предпочтительно мРНК (т.е. кДНК), кодирующей эти моноклональные антитела. Клонирование проводят с использованием стандартных способов (см., например, руководство Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, которое включено здесь в качестве ссылки). Например, библиотека кДНК может быть сконструирована обратной транскрипцией полиА+ мРНК, предпочтительно мембраноассоциированной мРНК, и эта библиотека может быть подвергнута скринингу с использованием зондов, специфических для последовательностей генов полипептидов иммуноглобулина человека. Однако в предпочтительном варианте осуществления используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации кДНК (или частей полноразмерных кДНК), кодирующей представляющий интерес генный сегмент иммуноглобулина (например, вариабельный сегмент легкой цепи). Эти амплифицированные последовательности могут быть легко клонированы в подходящий вектор, например в экспрессирующие векторы, минигенные векторы или векторы фагового дисплея. Будет понятно, что конкретный способ клонирования не является решающим, пока можно определять последовательность некоторой части представляющего интерес полипептида иммуноглобулина. В данном контексте "выделенная" молекула нуклеиновой кислоты или "выделенная" последовательность нуклеиновой кислоты является молекулой нуклеиновой кислоты, которая либо (1) идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты,с которой она обычно ассоциирована в природном источнике этой нуклеиновой кислоты, либо (2) клонирована, амплифицирована, помечена или иным образом отличена от нуклеиновых кислот фона, так что эта последовательность представляющей интерес нуклеиновой кислоты может быть определена и считается выделенной. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты является другой, чем эта молекула в форме или окружении, в которых она обнаруживается в природе. Таким образом, выделенные молекулы нуклеиновых кислот отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты в том виде, в каком она существует в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют это антитело, где, например, эта молекула нуклеиновой кислоты находится в местоположении хромосомы, отличающемся от местоположения природных клеток. Одним источником РНК, используемым для клонирования и секвенирования, является гибридома,произведенная получением В-клетки из трансгенной мыши и слиянием этой В-клетки с иммортализованной клеткой. Преимущество использования гибридом заключается в том, что они могут быть легко подвергнуты скринингу, и отбирают гибридому, которая продуцирует представляющее интерес моноклональное антитело человека. Альтернативно РНК может быть выделена из В-клеток (или целой селезенки) иммунизированного животного. При использовании источников, других, чем гибридомы, может быть желательным скрининг на последовательности, кодирующие иммуноглобулины или полипептиды иммуноглобулинов со специфическими характеристиками связывания. Одним способом для такого скрининга является применение технологии фагового дисплея. Фаговый дисплей описан, например, в работах Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047 и Caton and Koprowski, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990), каждая из которых включена здесь в качестве ссылки. В одном варианте осуществления с использованием технологии фагового дисплея кДНК из иммунизированной трансгенной мыши (например, общую кДНК селезенки) выделяют, используют полимеразную цепную реакцию для амплификации последовательностей кДНК, которые кодируют часть полипептида иммуноглобулина, например области CDR, и амплифицированные последовательности инсертируют в фаговый вектор. КДНК, кодирующие представляющие интерес пептиды, например пептиды вариабельных областей, с желаемыми характеристиками связывания, идентифицируют стандартными способами, такими как пэннинг. Затем определяют последовательность этой амплифицированной или клонированной нуклеиновой кислоты. Обычно определяют последовательность, кодирующую полную вариабельную область полипептида иммуноглобулина, однако, иногда будет достаточным секвенирование только части вариабельной области, например CDR-кодирующей части. Обычно секвенируемая часть будет иметь длину 30 оснований, более часто будут секвенироваться основания, кодирующие по меньшей мере приблизительно одну треть или по меньшей мере приблизительно половину длины вариабельной области. Секвенирование может проводиться на клонах, выделенных из библиотеки кДНК, или при использовании ПЦР, после субклонирования амплифицированной последовательности или прямым ПЦРсеквенированием амплифицированного сегмента. Секвенирование проводят с использованием стандартных способов (см., например, руководство Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide,- 15017851Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press и Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, которые включены здесь в качестве ссылки). Посредством сравнения последовательности клонированной нуклеиновой кислоты с опубликованными последовательностями генов и кДНК иммуноглобулинов человека квалифицированный в данной области специалист будет способен легко определить в зависимости от секвенированного района (i) использование сегмента зародышевой линии гибридомного полипептида иммуноглобулина (в том числе изотипа тяжелой цепи) и (ii) последовательность вариабельных областей тяжелой и легкой цепи, в том числе последовательностей, происходящих из добавления Nобласти и процесса соматической мутации. Одним источником информации последовательностей генов иммуноглобулинов является National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine,National Institutes of Health, Bethesda, Md. Фрагменты антител. Как отмечалось выше, фрагменты антител содержат часть интактного полноразмерного антитела,предпочтительно антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела, и включают линейные антитела и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Неограничивающие примеры фрагментов антител включают в себя Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, домен-антитело (dAb),фрагменты определяющей комплементарность области (CDR), одноцепочечные антитела (scFv), фрагменты одноцепочечных антител, димерные антитела, тримерные антитела, тетрамерные антитела, миниантитела, линейные антитела, хелатообразующие рекомбинантные антитела, тримерные антитела или биантитела, интра-антитела, нано-антитела, малые модульные иммунофармацевтические вещества (SMIP),слитый белок антигенсвязывающий домен-иммуноглобулин, верблюдизированное антитело, VHHсодержащее антитело или их мутеины или производные, и полипептиды, которые содержат по меньшей мере часть иммуноглобулина, которая является достаточной для придания связывания специфического антигена этому полипептиду, такую как CDR-последовательность, пока это антитело сохраняет желаемую биологическую активность. Такие фрагменты антител могут быть получены модификацией целых антител или синтезированы de novo с использованием технологий рекомбинантных ДНК или пептидного синтеза. Термин "димерные антитела" относится к малым фрагментам антител со связывающими два антигена сайтами, причем эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH VL). Посредством применения линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между этими двумя доменами на одной и той же цепи, домены заставляют спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать связывающие два антигена сайты. Димерные антитела описаны более полно,например, в ЕР 404097; WO 93/11161 и 30 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)."Одноцепочечные Fv" или "scFv" фрагменты антител содержат домены VH и VL антитела, где эти домены присутствуют в единой полипептидной цепи и необязательно содержат полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет Fv образовывать желаемую структуру для связывания антигена (Bird et al., Science 242:423-426, 1988 и Huston et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:5879-5883,1988). Fd-фрагмент состоит из доменов VH и CH1. Дополнительный фрагмент антитела включает фрагмент домена антитела (dAb) (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), который состоит из домена VH."Линейные антитела" содержат пару тандемных Fd-сегментов (VH-CH1-VH-CH1), которые образуют пару антигенсвязывающих районов. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими (Zapata et al. Protein Eng. 8:1057-62 (1995."Мини-антитело", состоящее из scFv, слитого с СН 3 через пептидный линкер (без шарнира) или через шарнир IgG, было описано в Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr; 17(4):315-23. Функциональные антитела тяжелой цепи, лишенные легких цепей, встречаются в природе в усатых акулах-няньках (Greenberg et al., Nature 374:168-73, 1995), ковровых акулах (воббегонгах) (Nuttal et al.,Mol Immunol. 38:313-26, 2001), Camelidae (Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-8, 1993; Nguyen et al.,J. Mol. Biol. 275:413, 1998), таких как верблюды, дромедары, альпаки и ламы. Антигенсвязывающий сайт в этих животных уменьшен до единственного домена, домена VHH. Эти антитела образуют антигенсвязывающие районы с использованием только вариабельной области тяжелой цепи, т.е. эти функциональные антитела являются гомодимерами только тяжелых цепей, имеющими структуру H2L2 (называемыми"антителами тяжелых цепей" или "HCAb"). Сообщалось, что верблюдизированный VHH рекомбинируется с константными областями IgG2 и IgG3, которые содержат шарнирную область, домены СН 2 и СН 3 и лишены домена CH1 (Hamers-Casterman et al., выше). Например, IgG1 ламы является общепринятым изотипом антитела (H2L2), в котором VH рекомбинируется с константной областью, которая содержит шарнирную область, домены CH1, CH2 и СН 3, тогда как IgG2 и IgG3 ламы являются изотипами только тяжелой цепи, которые лишены доменов СН 1 и которые не содержат легких цепей. Классические только-VHфрагменты трудно получить в растворимой форме, но улучшения растворимости и специфического связывания могут быть получены при изменении остатков каркаса таким образом, что они являются болееJ. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001) и имеют высокую стабильность в растворе (Ewert et al., Biochemistry 41:3628-36, 2002). Способы генерирования антител, имеющих верблюдизированные тяжелые цепи, описаны, например, в публикациях патентов США с 20050136049 и 20050037421. Поскольку вариабельный домен антител тяжелых цепей является самым малым полностью функциональным антигенсвязывающим фрагментом с молекулярной массой только 15 кДа, эту молекулу называют нано-антителом (Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004). Библиотека наноантител может быть генерирована из иммунизированного дромедара, как описано в Conrath et al., Antimicrob Agents Chemother 45:2807-12, 2001, или с использованием рекомбинантных способов. Интра-антитела являются одноцепочечнными антителами, которые демонстрируют внутриклеточную экспрессию и могут влиять на внутриклеточную функцию белков (Biocca, et al., EMBO J. 9:101-108,1990; Colby et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:17616-21, 2004). Интра-антитела, которые содержат сигнальные последовательности клетки, которые сохраняют конструкцию антитела во внутриклеточных районах, могут быть получены, как описано у Mhashilkar et al., (EMBO J. 14:1542-51, 1995) и Wheeler etal. (FASEB J. 17:1733-5, 2003). Транс-антитела являются проникающими в клетку антителами, в которых домены трансдукции белка (PTD) слиты с одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv) (Heng etal., Med Hypotheses, 64:1105-8, 2005). Далее рассматриваются антитела, которые являются SMIP или слитыми белками домена связывания иммуноглобулина, специфическими в отношении белка-мишени. Эти конструкции являются одноцепочечными полипептидами, содержащими антигенсвязывающие домены, слитые с доменами иммуноглобулина, необходимыми для осуществления эффекторных функций антител. См., например, WO 03/041600, публикации патентов США 20030133939 и 20030118592. Мультивалентные антитела. В некоторых вариантах осуществления может быть желательным генерирование мультивалентного или даже мультиспецифического (например, биспецифического, триспецифического и т.д.) моноклонального антитела. Такое антитело может иметь специфичности связывания в отношении по меньшей мере двух различных эпитопов антигена-мишени, или оно может связываться с двумя разными молекулами, например с антигеном-мишенью и с белком или рецептором поверхности клетки. Например, биспецифическое антитело может включать в себя плечо, которое связывается с мишенью, и другое плечо,которое связывается с запускающей молекулой на лейкоците, например молекулой Т-клеточного рецептора (например, CD2 или CD3), или Fc-рецепторами для IgG (FcR), например FcRI (CD64), FcRII(CD32) и FcRIII (CD16), таким образом, чтобы сфокусировать механизмы клеточной защиты на экспрессирующей мишень клетке. В качестве другого примера биспецифические антитела могут быть использованы для локализации цитотоксических агентов в клетки, которые экспрессируют антигенмишень. Эти антитела имеют плечо связывания мишени и плечо, которое связывает цитотоксический агент (например, сапорин, антиинтерферон-60, алкалоид Vinca, цепь А рицина, метотрексат или гаптен с радиоактивным изотопом). Мультиспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител. Биспецифические антитела включают сшитые или "гетероконъюгатные" антитела. Например, одно из антител в этом гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Гетероконъюгатные антитела могут быть получены с использованием любых способов сшивания. Подходящие сшивающие агенты хорошо известны в данной области и описаны в патенте США 4676980, вместе с рядом способов сшивания. Согласно другому подходу для получения биспецифических антител, граница раздела между парой молекул антител может быть сконструирована для максимизации процента гетеродимеров, которые извлекаются из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная граница раздела содержит по меньшей мере часть домена СН 3 константного домена антитела. В этом способе малые боковые цепи одной или нескольких аминокислот из границы раздела молекулы первого антитела заменены большими боковыми цепями (например, тирозина или триптофана). Компенсирующие "впадины" идентичного или сходного размера относительно большой боковой цепи (больших боковых цепей) создаются на поверхности раздела молекулы второго антитела заменой больших боковых цепей аминокислот меньшими боковыми цепями (например, аланина или треонина). Это обеспечивает механизм для увеличения выхода этого гетеродимера в сравнении с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры. См. WO 96/27011, опубликованный 6 сентября 1996 г. Способы генерирования биспецифических антител из фрагментов антител также были описаны в литературе. Например, биспецифические антитела могут быть получены с использованием химической связи. Brennan et al., Science 229:81 (1985) описывают процедуру, в которой интактные антитела протеолитически расщепляют для генерирования фрагментов F(ab')2. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии дитиол-комплектирующего агента арсенита натрия для стабилизации вицинальных дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Затем генерированные фрагменты Fab' превращают в производные тионитробензоата (TNB). Затем одно из производных Fab'-TNB превращают обратно в Fab'-тиол восстановлением меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным ко- 17017851 личеством другого производного Fab'-TNB с образованием биспецифического антитела. Полученные биспецифические антитела могут быть использованы в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов. Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) описывают секрецию функциональных фрагментов антител из бактерий (см., например, Better et al., Skerra et al. Science 240:1038-1041 (1988. Например, Fab'-SH-фрагменты могут быть непосредственно извлечены из Е. coli и химически связаны с образованием биспецифических антител (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992); Shalaby et al., J.Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) описывают получение молекулы полностью гуманизированного биспецифического антитела F(ab')2. Каждый фрагмент Fab' секретировался по отдельности из Е. coli и подвергался направленному химическому связыванию in vitro для образования биспецифического антитела. Образованное таким образом биспецифическое антитело было способно связываться с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор HER2, и нормальными Т-клетками человека, а также запускать литическую активность цитотоксических лимфоцитов человека против опухолей-мишеней молочной железы человека. Были также описаны различные способы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела получали с использованием лейциновых молний, например GCN4 (см., в целом, Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5):1547-1553 (1992. Пептиды лейциновой молнии из белков Fos и Jun связывали с Fab'-частями двух различных антител слиянием генов. Эти гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области для образования мономеров и затем повторно окисляли для образования гетеродимеров антител. Этот способ может быть также использован для получения гомодимеров антител. Термин "димерные антитела" относится к малым фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, причем эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH VL). С использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы было возможно спаривание между этими двумя доменами на одной и той же цепи, заставляют эти домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и образовывать два антигенсвязывающих сайта. См., например, Hollinger et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, (1993). Сообщалась также другая стратегия получения фрагментов биспецифических антител с использованием одноцепочечных димеров Fv (sFv). См. Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Альтернативно биспецифическое антитело может быть "линейным антителом", получаемым, как описано в Zapata et al. Protein Eng. 8 (10):1057-1062 (1995). Вкратце, эти антитела содержат пару тандемных сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые образуют пару антигенсвязывающих районов. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими. Антитела с более чем двумя валентностями также обсуждаются. Например, могут быть получены триспецифические антитела (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991."Хелатообразующее рекомбинантное антитело" является биспецифическим антителом, которое узнает соседние и неперекрывающиеся эпитопы антигена-мишени и является достаточно гибким для связывания обоих эпитопов одновременно (Neri et al., J. Mol. Biol. 246:367-73, 1995). Получение биспецифического Fab-scFv ("би-антитела") и триспецифического Fab-(scFv)(2) ("триантитела") описано в Schoonjans et al. (J. Immunol. 165:7050-57, 2000) и Willems et al. (J. Chromatogr ВAnalyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003). Для би-антител или три-антител молекулу scFv сливают с одной или обеими цепями VL-CL (L) и VH-CH1 (Fd); например, для получения три-антитела дваscFv сливают с С-концом Fab, тогда как в би-антителе один scFv сливают с С-концом Fab. Рекомбинантное получение антител. Антитела могут быть получены методологией рекомбинантных ДНК с использованием одной из систем экспрессии антител, хорошо известных в данной области (см., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988. ДНК, кодирующая антитела по изобретению, может быть помещена в экспрессирующие векторы,которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки Е. coli, клетки COS обезьяны, клетки 293 эмбриональной почки человека (например, клетки 293 Е), клетки китайского хомячка (СНО) или миеломные клетки, которые в ином случае не продуцируют белок иммуноглобулина, для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантное получение антител хорошо известно в данной области. Фрагменты антител производят протеолитическим расщеплением интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107117 (1992) и Brennan et al., Science 229:81 (1985. Однако эти фрагменты могут теперь продуцироваться непосредственно рекомбинантными клетками-хозяевами. Другие способы получения фрагментов антител, в том числе пептидный синтез и ковалентное связывание, будут очевидными квалифицированному практику. Регуляторными последовательностями экспрессии называют последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Например, регуляторные последовательности, которые являются подходящими для прока- 18017851 риотов, включают в себя промотор, необязательно операторную последовательность и сайт связывания рибосом. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры. Нуклеиновая кислота является функционально связанной, когда она помещена в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для предпоследовательности или секреторного лидера функционально связана с ДНК для полипептида, если он экспрессируется в виде пребелка, который участвует в секреции этого полипептида; промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию этой последовательности; или сайт связывания рибосом является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, что транскрипция усиливается. Обычно термин "функционально связанные" означает, что ДНК-последовательности, будучи связанными, являются смежными и в случае секреторного лидера смежными и находящимися в рамке считывания. Однако энхансеры не должны быть обязательно смежными. Связывание выполняется лигированием в удобных сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, используют синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры в соответствии с общепринятой практикой. Термины "клетка", "клеточная линия" и "культура клеток" часто используются взаимозаменяемо, и все такие названия здесь включают в себя и потомство. Трансформанты и трансформированные клетки включают в себя первичную рассматриваемую клетку и культуры, произведенные из нее, без учета количества переносов. Должно быть также понятно, что все потомство может не быть точно идентичным по содержанию ДНК вследствие преднамеренных или неумышленных мутаций. В изобретение включено мутантное потомство, которое имеет ту же самую функцию или биологическую активность, на которую проводится скрининг в первоначально трансформированной клетке. Если имеются в виду особые значения, это будет ясно из контекста. В альтернативном варианте осуществления аминокислотная последовательность представляющего интерес иммуноглобулина может быть определена прямым секвенированием белка. Подходящие нуклеотидные последовательности могут быть сконструированы в соответствии с таблицей универсальных кодонов. Мутеины аминокислотной последовательности желаемого антитела могут быть получены введением подходящих нуклеотидных изменений в кодирующую ДНК или пептидным синтезом. Такие мутеины включают в себя, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях этих антител. Любая комбинация делеции, инсерции или замены производится для получения конечной конструкции при условии, что эта конечная конструкция имеет желаемые характеристики. Аминокислотные изменения могут также изменять посттрансляционные процессы моноклонального антитела, антитела человека, гуманизированного антитела, антитела Human Engineered или антителамутеина, например, изменением количества или положения сайтов гликозилирования. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие мутеины аминокислотной последовательности антитела, получают различными способами, известными в данной области. Эти способы включают, но не ограничиваются ими, выделение из природного источника (в случае природных мутеинов аминокислотной последовательности) или получение олигонуклеотид-опосредованным (или сайт-направленным) мутагенезом, ПЦР-мутагенезом и кассетным мутагенезом полученного ранее мутеина или не являющейся мутеином версии этого антитела. Это изобретение обеспечивает также выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитела по изобретению, необязательно функционально связанную с регуляторными последовательностями, узнаваемыми клеткой-хозяином, векторы и клетки-хозяева, содержащие эти нуклеиновые кислоты, и рекомбинантные способы для получения этих антител, которые могут предусматривать культивирование клетки-хозяина таким образом, что эта нуклеиновая кислота экспрессируется, и, необязательно, извлечение этого антитела из культуры клетки-хозяина или культуральной среды. Для рекомбинантного получения антитела нуклеиновую кислоту, кодирующую его, выделяют и инсертируют в реплицируемый вектор для дополнительного клонирования (амплификации этой ДНК) или для экспрессии. ДНК, кодирующую моноклональное антитело, легко выделяют и секвенируют с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны связываться специфически с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи этого антитела). Доступны многие векторы. Компоненты векторов обычно включают в себя, но не ограничиваются ими,один или несколько из следующих компонентов: сигнальную последовательность, сайт инициации репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции.(1) Компонент сигнальной последовательности. Антитело по изобретению может быть получено рекомбинантно не только непосредственно, но также в виде слитого полипептида с гетерологичным полипептидом, который предпочтительно является сигнальной последовательностью или другим полипептидом, имеющим сайт специфического расщепления, на N-конце зрелого белка или полипептида. Выбранная сигнальная последовательность предпочтительно является последовательностью, которая узнается и процессируется (т.е. отщепляется сигнальной пептидазой) клеткой-хозяином. Если прокариотическая клетка-хозяин не узнает и не процессирует сигнальную последовательность нативного антитела, эта сигнальная последовательность может быть заменена сигнальной последовательностью, выбранной, например, из группы, состоящей из лидеров пектатлиазы (например, pelB), щелочной фосфатазы, пенициллиназы, 1 рр, или лидерами термостабильного энтеротоксина II. Для секреции дрожжей нативная сигнальная последовательность может быть заменена,например, лидером дрожжевой инвертазы, лидером -фактора (в том числе лидерами -фактора Saccharomyces и Kluyveromyces) или лидером кислой фосфатазы, лидером глюкоамилазы С. albicans или сигналом, описанным в WO 90/13646. В экспрессии клеток млекопитающих доступными являются сигнальные последовательности млекопитающих, а также лидеры вирусной секреции, например сигнал gD вируса простого герпеса. ДНК для такого района-предшественника лигируют в рамке считывания с ДНК, кодирующей это антитело.(2) Компонент сайта инициации репликации. Как экспрессирующие, так и клонирующие векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая позволяет вектору реплицироваться в одной или нескольких клетках-хозяевах. Обычно в клонирующих векторах этой последовательностью является последовательность, которая позволяет вектору реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина и включает в себя сайты инициации репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны для различных бактерий, дрожжей и вирусов. Сайт инициации репликации из плазмидыpBR322 является подходящим для большинства грамотрицательных бактерий, сайт инициации репликации плазмиды 2 является подходящим для дрожжей, и различные вирусные сайты инициации репликации применимы для клонирующих векторов в клетках млекопитающих. Обычно компонент сайта инициации репликации не требуется для экспрессирующих векторов млекопитающих (обычно может использоваться сайт инициации репликации SV40 только потому, что он содержит ранний промотор).(3) Компонент селективного маркера. Экспрессирующие и клонирующие векторы могут содержать селективный ген, также называемый селектируемым маркером. Типичные селективные гены кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например ампициллину, неомицину, метотрексату, тетрациклину, G418, генетицину, гистидинолу или микофеноловой кислоте, (b) восполняют ауксотрофные недостаточности или (с) доставляют критические нутриенты, недоступные из комплексной среды, например ген, кодирующий D-аланинрацемазу, для бацилл. Один пример схемы отбора использует лекарственное средство для остановки роста клеткихозяина. Клетки, которые успешно трансформируются гетерологичным геном, продуцируют белок, придающий устойчивость к лекарственному средству, и, следовательно, выживают в схеме отбора. Примеры такого доминантного отбора используют лекарственные средства метотрексат, неомицин, гистидинол,пуромицин, микофеноловую кислоту и гигромицин. Другим примером подходящих селектируемых маркеров для клеток млекопитающих являются маркеры, которые делают возможной идентификацию клеток, компетентных в отношении поглощения кодирующей антитело нуклеиновой кислоты, такие как DHFR, тимидинкиназа, металлотионеин-I и -II,предпочтительно гены металлотионеина приматов, аденозиндеаминазы, орнитиндекарбоксилазы и т.д. Например, клетки, трансформированные геном отбора DHFR, сначала идентифицируют культивированием всех этих трансформантов в культуральной среде, которая содержит метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист DHFR. Подходящей клеткой-хозяином, при использовании DHFR дикого типа, является линия клеток яичника китайского хомячка (СНО), дефектная по активности DHFR. Альтернативно клетки-хозяева (в частности, хозяева дикого типа, которые содержат эндогеннуюDHFR), трансформированные или котрансформированные ДНК-последовательностями, кодирующими антитело по изобретению, белок DHFR дикого типа и другой селектируемый маркер, такой как аминогликозид-3'-фосфотрансфераза (АРН), могут быть отобраны по росту клеток в среде, содержащей агент селекции для селектируемого отбора, такой как аминогликозидный антибиотик, например канамицин,неомицин или G418. См. патент США 4965199. Подходящим селективным геном для применения в дрожжах является ген trp1, присутствующий в дрожжевой плазмиде YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979. Ген trp1 обеспечивает селектируемый маркер для мутантного штамма дрожжей, лишенного способности расти в триптофане, например АТСС No. 44076 или РЕР 4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). Присутствие повреждения trp1 в геноме дрожжевой клетки-хозяина обеспечивает затем эффективную среду для детектирования трансформации по росту в отсутствие триптофана. Подобным образом Leu2-дефицитные штаммы дрожжей (АТСС 20622 или 38626) дополняют известными плазмидами, несущими ген Leu2. Ura3-недостаточные штаммы дрожжей дополняют плазмидами, несущими ген ura3. Кроме того, векторы, произведенные из кольцевой плазмиды 1,6 мкм pKD1, могут быть использованы для трансформации дрожжей Kluyveromyces. Альтернативно для K. lactis сообщалась экспрессионная система для крупномасштабного получения рекомбинантного химозина теленка. Van den Berg,- 20017851Bio/Technology, 8:135 (1990). Описаны также стабильные мультикопийные экспрессирующие векторы для секреции зрелого рекомбинантного сывороточного альбумина человека промышленными штаммами(4) Компонент промотора. Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат промотор, который узнается организмом-хозяином и функционально связан с кодирующей антитело нуклеиновой кислотой. Промоторы,подходящие для использования с прокариотическими хозяевами, включают промотор арабинозы (например, araB), промотор phoA, промоторные системы -лактамазы и лактозы, щелочной фосфатазы,промоторную систему триптофана (trp) и гибридные промоторы, такие как промотор tac. Однако подходящими являются и другие известные бактериальные промоторы. Промоторы для использования в бактериальных системах будут также содержать последовательность Шайна-Далгарно (S.D.), функционально связанную с ДНК, кодирующей антитело по данному изобретению. Промоторные последовательности известны и для эукариот. Фактически все эукариотические гены имеют АТ-богатый район, расположенный на 25-30 оснований слева от сайта, в котором инициируется транскрипция. Другой последовательностью, обнаруженной на 70-80 оснований слева от начала транскрипции, является район CNCAAT, где N может быть любым нуклеотидом. На 3'-конце большинства эукариотических генов находится последовательность ААТААА, которая может быть сигналом для добавления поли-А хвоста к 3'-концу кодирующей последовательности. Все эти последовательности подходящим образом инсертируют в эукариотические экспрессирующие векторы. Примеры подходящих промотирующих последовательностей для использования с хозяевамидрожжами включают в себя промоторы для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, таких как энолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза,фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. Другими дрожжевыми промоторами, которые являются индуцируемыми промоторами, имеющими дополнительное преимущество транскрипции, регулируемой условиями выращивания, являются промоторные районы для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, деградирующих ферментов, ассоциированных с метаболизмом азота, металлотионеина, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящие векторы и промоторы для использования в экспрессии дрожжей описаны дополнительно в ЕР 73657. Энхансеры дрожжей также предпочтительно используются с промоторами дрожжей. Транскрипция антител из векторов в клетках-хозяевах млекопитающих регулируется, например,промоторами, полученными из геномов вирусов, таких как вирус лейкоза Абельсона, полиомавирус, вирус оспы (дифтерита) птиц, аденовирус (такой как аденовирус 2), бычий папилломавирус, вирус птичьей саркомы, наиболее предпочтительно цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В, вирус обезьян 40(SV40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, например промотор актина или промотор иммуноглобулина, из промоторов теплового шока, при условии, что такие промоторы совместимы с системами клеток-хозяев. Ранний и поздний промоторы вируса SV40 подходящим образом получают в виде рестрикционного фрагмента SV40, который содержит также вирусный сайт инициации репликации. Немедленно ранний промотор цитомегаловируса человека подходящим образом получают в виде рестрикционного фрагмента HindIII. Система для экспрессии ДНК в хозяевах-млекопитающих с использованием бычьего папилломавируса в качестве вектора описана в патенте США 4419446. Одна модификация этой системы описана в патенте США 4601978. См. также Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) в отношении экспрессии кДНК -интерферона человека в мышиных клетках под контролем промотора тимидинкиназы из вируса простого герпеса. Альтернативно в качестве промотора может быть использован длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса.(5) Компонент энхансерного элемента. Транскрипция ДНК, кодирующей антитело по изобретению, высшими эукариотами часто увеличивается инсертированием энхансерной последовательности в вектор. Многие энхансерные последовательности в настоящее время известны из генов млекопитающих (глобина, эластазы, альбумина, фетопротеина и инсулина). Однако обычно используют энхансер из вируса эукариотической клетки. Примеры включают в себя энхансер SV40 на поздней стороне сайта инициации репликации (пары нуклеотидов 100-270), энхансер раннего промотора цитомегаловируса на поздней стороне сайта инициации репликации, энхансер полиомавируса на поздней стороне сайта инициации репликации и энхансеры аденовируса. См. также Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) в отношении энхансерных элементов для активации эукариотических промоторов. Энхансер может быть сплайсирован в вектор в положении 5' или 3' относительно кодирующей антитело последовательности, но предпочтительно он находится в сайте 5' (слева) от промотора. насекомых, растении, животном или содержащих ядро клетках из других многоклеточных организмов),будут также содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доступны из 5'- и иногда 3'-нетранслируемых районов эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти районы содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслируемой части мРНК, кодирующей антитело. Одним применимым компонентом терминации транскрипции является район полиаденилирования бычьего гормона роста. См. WO 94/11026 и описанный в нем экспрессирующий вектор. Другим является терминатор транскрипции легкой цепи иммуноглобулина мыши.(7) Отбор и трансформация клеток-хозяев. Подходящими клетками-хозяевами для клонирования или экспрессии ДНК в описанных здесь векторах являются клетки прокариотов, дрожжей или высших эукариотов. Подходящие прокариоты для этой цели включают в себя эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например Е. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella,Proteus, Salmonella, например Salmonella typhimurium, Serratia, например Serratia marcescans, и Shigella, а также бациллы, такие как В. subtilis и В. licheniformis (например, В. licheniformis 41 Р, описанная в DD 266710, опубликованном 12 апреля 1989 г.), Pseudomonas, такой как P. aeruginosa, и Streptomyces. Одним предпочтительным клонирующим хозяином Е. coli является Е. coli 294 (АТСС 31446), хотя подходящими являются и другие штаммы, такие как Е. coli В, Е. coli X1776 (АТСС 31537) и Е. coli W3110 (АТСС 27325). Эти примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими. Кроме прокариотов, эукариотические микробы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, являются подходящими клонирующими или экспрессирующими хозяевами для кодирующих антитело векторов.Saccharomyces cerevisiae, или обычные пекарные дрожжи, является наиболее часто используемым среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев. Однако ряд других родов, видов и штаммов обычно являются доступными и применимыми здесь, такие как Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromycesхозяева, такие как, например, K. lactis, K. fragilis (АТСС 12424), K. bulgaricus (АТСС 16045), K. wickeramii (АТСС 24178), K. waltii (АТСС 56500), K. drosophilarum (АТСС 36906), K. thermotolerans и K.Neurospora crassa; Schwanniomyces, например, Schwanniomyces occidentalis; и нитчатые грибы, такие как,например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и Aspergillus-хозяева, такие как A. nidulans и A. niger. Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают в себя клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы и варианты и соответствующие пермиссивные клетки-хозяева насекомых из таких хозяев, как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedesmori. Различные вирусные штаммы для трансфекции являются публично доступными, например, вариантL-1 NPV Autographa californica и штамм Bm-5 NPV Bombyx mori, и такие вирусы могут быть использованы в качестве вирусов здесь согласно данному изобретению, в частности для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Культуры клеток растений хлопчатника, кукурузы, картофеля, сои, петуньи, томата, табака, ряски и клеток других растений могут также использоваться в качестве хозяев. Однако наибольший интерес представляли клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (культуре ткани) стало рутинной процедурой. Примерами применимых линий клетокхозяев млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка, в том числе клетки CHOK1(АТСС CCL61), DXB-11, DG-44 и клетки/-DHFK яичника китайского хомячка (СНО, Urlaub et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980; линия клеток CV1 обезьяны, трансформированная SV40 (COS-7,АТСС CRL 1651); линия клеток эмбриональной почки человека (клетки 293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]; клетки почки детеныша хомяка (BHK, АТСС CCL 10); клетки Сертоли мыши (ТМ 4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251(1980; клетки почки обезьяны (CV1 АТСС CCL 70); клетки почки Африканской зеленой мартышки(VERO-76, АТСС CRL-1587); клетки рака шейки матки человека (HELA, АТСС CCL 2); клетки почки собачьих (MDCK, АТСС CCL 34); клетки печени буйволовой крысы (BRL 3 А, АТСС CRL 1442); клетки легкого человека (W138, АТСС CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС CCL51); TRI-клетки (Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383:44-68 (1982; клетки MRC 5; клетки FS4 и клетки гепатомной линии человека (Hep G2). Клетки-хозяева трансформировали или трансфицировали вышеописанными экспрессирующими или клонирующими векторами для получения антител и культивировали в подходящих питательных средах, модифицированных соответствующим образом для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности. Кроме того, новые векторы и трансфицированные клеточные линии с множественными копиями транскрипционных единиц, отделенные с использованием селективного маркера, являются особенно применимыми и предпочтительными для экспрессии антител. Клетки-хозяева, используемые для получения антитела по этому изобретению, могут культивироваться в различных средах. Для культивирования клеток-хозяев пригодны коммерчески доступные среды, такие как Ham F10 (Sigma), минимальная эссенциальная среда MEM), (Sigma, RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла DMEM), Sigma). Кроме того, любые из сред,описанных в Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), патентах США с 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 или 5122469; WO 90103430; WO 87/00195 или патент США Re.30985, могут быть использованы в качестве культуральных сред для этих клеток-хозяев. Любые из этих сред могут быть дополнены, если необходимо, гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальция, магния и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как гентамицин), микроэлементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечной концентрации в диапазоне микромолярных концентраций) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые добавки, которые известны квалифицированным в данной области специалистам, могут быть также включены в подходящих концентрациях. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., являются условиями, используемыми ранее с клеткой-хозяином, выбранной для экспрессии, и будут очевидными для специалиста с обычной квалификацией в данной области.(9) Очистка антитела. При использовании рекомбинантных технологий антитело может быть получено внутриклеточно, в периплазматическом пространстве и непосредственно секретировано в среду, в том числе из микробных культур. Если это антитело продуцируется внутриклеточно, в качестве первой стадии, остатки в виде частиц, или фрагменты клеток-хозяев, или лизированные фрагменты удаляют, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. Better et al. Science 240:1041-1043 (1988); ICSU Short Reports 10:105(1990); и Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:457-461 (1993) описывают процедуру выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство Е. coli. (см. также Carter et al., Bio/Technology 10:163167 (1992. Композиция антител, приготовленная из микробных клеток и клеток млекопитающих, может быть очищена с использованием, например, гидроксиапатитной хроматографии, катионо- или анионообменной хроматографии и аффинной хроматографии, причем предпочтительным способом очистки является аффинная хроматография. Пригодность белка А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа любого Fc-домена иммуноглобулина, который присутствует в этом антителе. Белок А может быть использован для очистки антител, которые основаны на тяжелых цепях 1, 2 или 4 человека (Lindmark etal., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983. Белок G рекомендуется для всех изотипов мыши и для 3 человека(Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986. Матриксом, к которому присоединяют этот аффинный лиганд,является наиболее часто агароза, но доступны и другие матриксы. Механически стабильные матриксы,такие как стекло с контролируемыми порами или поли(стирендивинил)бензол, делают возможными более быстрые скорости потока и более короткие периоды времени обработки, чем скорости и периоды,получаемые с агарозой. Когда антитело содержит домен СН 3, для очистки применима смола BakerbondABX (J.Т. Baker, Phillipsburg, NJ). Доступны также другие способы очистки белка, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на силикагеле, хроматография на гепарине, хроматография на Сефарозе, хроматография на анионо- или катионообменной смоле (такой как колонка с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, электрофорез в ДСН-ПААГ и осаждение сульфатом аммония. Химерные антитела. Антитело грызуна после повторяемого введения in vivo человеку либо отдельно, либо в виде конъюгата будет вызывать иммунную реакцию в реципиенте против антитела грызуна; так называемую реакцию НАМА (человеческое антимышиное антитело). Реакция НАМА может ограничивать эффективность фармацевтического средства при повторяемом введении доз. Иммуногенность антитела может быть уменьшена химической модификацией этого антитела гидрофильным полимером, таким как полиэтиленгликоль, или с использованием способов генной инженерии, чтобы сделать структуру антитела более подобной структуре антитела человека, например в виде химерного, гуманизированного антитела, антитела человека или антител Human Engineered. Поскольку такие сконструированные антитела являются менее иммуногенными в людях, чем исходные мышиные моноклональные антитела, они могут быть использованы для лечения людей с гораздо меньшим риском анафилаксии. Таким образом, эти антитела могут быть предпочтительными в терапевтических применениях, которые включают в себя введение invivo человеку. Химерные моноклональные антитела, в которых вариабельные домены Ig мышиного моноклонального антитела слиты с константными доменами Ig человека, могут быть генерированы с использованием стандартных процедур, известных в данной области (см. Morrison, S.L. et al. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 81, 6841-6855; и Boulianne, G.L. et al., Nature 312, 643-646 (1984. Например, последовательности генов для вариабельных областей антитела грызуна, которые связывают СЕА, могут быть введены для замены вариабельных доменов белка миеломы человека с получением, таким образом, рекомбинантного химерного антитела. Эти процедуры подробно описаны в ЕР 194276, ЕР 0120694, ЕР 0125023, ЕР 0171496, ЕР 0173494 и WO 86/01533. Хотя некоторые химерные моноклональные антитела оказались менее иммуногенными в людях, вариабельные домены Ig мыши могут все еще приводить к значительной реакции человека против мышиных антител. Гуманизированные антитела. Гуманизированные антитела могут быть получены различными способами, включающими, например, (1) трансплантацию определяющих комплементарность областей (CDR) не человека на каркасную и константную область человека (способ, назваемый в данной области гуманизацией через "трансплантацию CDR"), или альтернативно (2) трансплантацию полных вариабельных доменов не человека, но "покрыванием" их человекоподобной поверхностью заменой поверхностных остатков (способ, называемый в данной области "облицовкой"). В данном изобретении гуманизированные антитела будут включать в себя как "гуманизированные", так и "облицованные" антитела. Эти способы описаны, например, в статьях Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851-6855 (1984);al., Protein Eng. 4(7):773-83 (1991), каждая их которых включена здесь в качестве ссылки. Например, последовательности генов областей CDR антитела грызуна могут быть выделены или синтезированы и введены для замены соответствующих областей последовательности гомологичного гена антитела человека с получением антитела человека со специфичностью исходного антитела грызуна. Эти процедуры описаны в ЕР 023940, WO 90/07861 и WO 91/09967. Трансплантация области CDR включает введение одной или нескольких из шести областей CDR из вариабельных доменов Ig тяжелой и легкой цепи мыши в соответствующие четыре каркасные области вариабельных доменов Ig человека, также называемое трансплантацией CDR. Этот способ (Riechmann,L., et al., Nature 332, 323 (1988 использует консервативные каркасные области (FR1-FR4) в качестве каркаса для поддержания петель CDR, которые являются первичными контактами с антигеном. Однако недостатком трансплантации CDR является то, что она может приводить к гуманизированному антителу,которое имеет существенно более низкую аффинность связывания, чем исходное антитело мыши, так как аминокислоты каркасных областей могут способствовать связыванию антигена и так как аминокислоты петель CDR могут влиять на ассоциацию двух вариабельных доменов Ig. Для сохранения аффинности гуманизированного моноклонального антитела этот способ трансплантации CDR может быть улучшен выбором каркасных областей человека, которые наиболее близко подобны каркасным областям исходного антитела мыши, и сайт-направленным мутагенезом отдельных аминокислот в каркасе или CDR при помощи компьютерного моделирования сайта связывания антигена (например, Со, М.S., et al. (1994), J.Immunol. 152, 2968-2976). Один способ гуманизации антител предусматривает сопоставление последовательностей тяжелой и легкой цепей не человека с последовательностями тяжелой и легкой цепей человека, отбор и замену каркаса не человека каркасом человека на основе такого сопоставления, молекулярное моделирование для предсказания конформации этой гуманизированной последовательности и сравнение с конформацией исходного антитела. За этим процессом следовала обратная мутация остатков в области CDR, которая нарушает структуру областей CDR, пока предсказанная конформация модели гуманизированной последовательности не приблизится близко к конформации областей CDR не человека исходного антитела не человека. Такие гуманизированные антитела могут быть дополнительно дериватизованы для облегчения поглощения и клиренса, например, посредством Ashwell-рецепторов (см., например, патенты США с 5530101 и 5585089, которые включены здесь в качестве ссылки). Сообщался ряд гуманизации мышиных моноклональных антител посредством рационального конструирования (см., например, 20020091240, опубликованный 11 июля 2002 г., WO 92/11018 и патенты США 5693762 и 5766866. Сконструированные для человека (Human Engineered) антитела. Фраза "сконструированное для человека (Human Engineered) антитело" относится к антителу,произведенному из антитела не человека, обычно из мышиного моноклонального антитела. Альтернативно антитело Human Engineered может быть произведено из химерного антитела, которое сохраняет или, по существу, сохраняет свойства связывания антитела исходного антитела не человека, но которое проявляет уменьшенную иммуногенность в сравнении с исходным антителом при введении людям. Конструирование для человека (Human Engineering) вариабельных доменов антитела было описано Studnicka [см., например, Studnicka et al., патент США 5766886; Studnicka et al. Protein Engineering 7:805-814 (1994)] в качестве способа для уменьшения иммуногенности при сохранении активности связывания молекул антитела. Согласно этому способу каждой аминокислоте вариабельной области приписывали риск замены. Аминокислотные замены отличаются одной из трех категорий риска: (1) измене- 24017851 ниями низкого риска являются изменения, которые имеют наивысший потенциал для уменьшения иммуногенности с наименьшим шансом нарушения связывания антигена; (2) изменениями умеренного (среднего) риска являются изменения, которые могут дополнительно уменьшать иммуногенность, но имеют больший шанс влияния на связывание антигена или укладку (фолдинг) белка; (3) остатками высокого риска являются остатки, которые являются важными для связывания или для сохранения структуры антитела и несут самый высокий риск того, что они будут влиять на связывание антигена или укладку белка. Вследствие трехмерной структурной роли пролинов, модификации в пролинах обычно считаются, по меньшей мере, изменениями умеренного (среднего) риска, даже если данное положение обычно является положением низкого риска. Вариабельные районы легкой и тяжелой цепей антитела грызуна конструируются для человека(Human Engineered) следующим образом для замены аминокислот человека в положениях, определенных как не имеющие вероятности вредного действия ни на связывание антигена, ни на укладку белка, но имеющие вероятность уменьшения иммуногенности при введении человеку. Аминокислотные остатки,которые находятся в положениях "низкого риска" и которые являются кандидатами для модификации согласно этому способу, идентифицируют сопоставлением аминокислотных последовательностей вариабельных областей грызуна с последовательностью вариабельной области человека. Может быть использована любая вариабельная область человека, в том числе отдельная последовательность VH или VL, или консенсусная последовательность VH или VL человека, или отдельная или консенсусная последовательность зародышевой линии человека. Аминокислотные остатки в любом количестве положений низкого риска или во всех положениях низкого риска могут быть изменены. Например, в каждом положении низкого риска, где сопоставленные аминокислотные остатки мыши и человека отличаются, вводят модификацию аминокислоты, которая заменяет аминокислотный остаток грызуна аминокислотным остатком человека. Альтернативно могут быть изменены аминокислотные остатки во всех положениях низкого риска и в любом положении умеренного риска. В идеале, для достижения наименьшей иммуногенности все из положений низкого и умеренного риска изменяют в последовательности грызуна с получением последовательности человека. Синтетические гены, содержащие модифицированные вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи, конструируют и связывают с константными областями тяжелой цепии/или легкой цепичеловека. Любые константные области тяжелой цепи и легкой цепи человека могут быть использованы в комбинации с вариабельными областями сконструированного для человека (Human Engineered) антитела, в том числе IgA (любого подкласса, такого как IgA1 или IgA2), IgD, IgE, IgG (любого подкласса, напримерIgG1, IgG2, IgG3 или IgG4) или IgM. Гены тяжелой и легкой цепи вводят в клетки-хозяева, такие как клетки млекопитающих, и образованные рекомбинантные иммуноглобулиновые продукты получают и характеризуют. Антитела человека из трансгенных животных. Антитела человека для нацеливания на антиген могут быть также получены с использованием трансгенных животных, которые не имеют эндогенного продуцирования иммуноглобулина, и сконструированы для содержания локусов иммуноглобулина человека. Например, WO 98/24893 описывает трансгенных животных, имеющих локус Ig человека, причем эти животные не продуцируют функциональные эндогенные иммуноглобулины вследствие инактивации эндогенных локусов тяжелой и легкой цепи. WO 91/10741 также описывает трансгенных хозяев-млекопитающих не приматов, способных образовывать иммунную реакцию на иммуноген, причем эти антитела имеют константные и вариабельные области приматов, а эндогенные кодирующие иммуноглобулин локусы заменены или инактивированы.WO 96/30498 описывает применение системы Cre/Lox для модификации локуса иммуноглобулина в млекопитающем, например замены всех или части константной или вариабельной области, для образования модифицированной молекулы антитела. WO 94/02602 описывает млекопитающих-хозяев не человека,имеющих инактивированные эндогенные локусы Ig и функциональные локусы Ig человека. Патент США 5939598 описывает способы получения трансгенных мышей, в которых эти мыши лишены эндогенных тяжелых цепей и экспрессируют экзогенный локус иммуноглобулина, содержащий одну или несколько ксеногенных константных областей. С использованием описанного выше трансгенного животного может быть получена иммунная реакция на выбранную антигенную молекулу, и продуцирующие антитело клетки могут быть удалены из животного и использованы для получения гибридом, которые секретируют моноклональные антитела человека. Протоколы иммунизации, адъюванты и т.п. известны в данной области и использовались в иммунизации, например, трансгенной мыши, как описано в WO 96/33735. Эта публикация описывает моноклональные антитела против разных антигенных молекул, в том числе IL-6, IL-8, TNFa, CD4 человека, Lселектина, gp39 и столбнячного токсина. Эти моноклональные антитела могут быть испытаны на способность ингибировать или нейтрализовать биологическую активность или физиологическое действие соответствующего белка. WO 96/33735 описывает, что моноклональные антитела против IL-8, полученные из иммунных клеток трансгенных мышей, иммунизированных IL-8, блокировали индуцируемые IL-8 функции нейтрофилов. Моноклональные антитела человека со специфичностью в отношении антигена,- 25017851 использованного для иммунизации трансгенных животных, также описаны в WO 96/34096 и заявке на патент США 20030194404; и заявке на патент США 20030031667. См. также Jakobovits et al., Proc.in Immuno, 7:33 (1993); и патент США 5591669, патент США 5589369, патент США 5545807 и заявку на патент США 20020199213, WO 96/34096, заявку на патент США 20030194404 и заявку на патент США 20030031667. Дополнительные трансгенные животные, применимые для получения моноклональных антител,включают в себя Medarex HuMAb-MOUSE, описанную в патенте США 5770429 и Fishwild, et al.(Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996), которая содержит генные последовательности из неаранжированных генов антитела человека, которые кодируют тяжелую и легкую цепи антител человека. Иммунизация с использованием HuMAb-MOUSE делает возможным продуцирование моноклональных антител к белку-мишени.Ishida et al. (Cloning Stem Cells. 4:91-102, 2002) описывают также мышь TransChromo Mouse(TCMOUSE), которая содержит сегменты с размерами порядка мега (106) нуклеотидов ДНК человека и которая включает локусы полного иммуноглобулина человека (hIg). TCMOUSE имеет полный разнообразный репертуар hIg, включающий в себя все подклассы IgG (IgG1-G4). Иммунизация ТС-мыши различными антигенами продуцирует реакции в виде антител, содержащих антитела человека. Заявка на патент США 20030092125 описывает способы смещения иммунной реакции животного на желаемый эпитоп. Антитела человека могут быть также генерированы активированными in vitro Вклетками (см. патенты США с 5567610 и 5229275). Антитела из технологии фагового дисплея. Развитие технологий для получения репертуаров рекомбинантных генов антител человека и дисплея кодируемых фрагментов антител на поверхности нитчатого бактериофага обеспечило рекомбинантные способы для прямого получения и отбора антител человека, которые могут быть также применены к гуманизированным, химерным, мышиным или мутеиновым антителам. Антитела, получаемые фаговой технологией, продуцируются в виде антигенсвязывающих фрагментов, обычно Fv- или Fab-фрагментов,в бактериях и, следовательно, лишены эффекторных функций. Эффекторные функции могут быть введены одной из двух стратегий: эти фрагменты могут быть сконструированы либо в полные антитела для экспрессии в клетках млекопитающих, либо во фрагменты биспецифического антитела со вторым сайтом связывания, способным запускать эффекторную функцию. Обычно Fd-фрагмент (VH-CH1) и легкую цепь (VL-CL) антител клонируют раздельно при помощи ПЦР и рекомбинируют случайным образом в комбинаторных библиотеках фагового дисплея, которые могут быть затем отобраны на связывание с конкретным антигеном. Fab-фрагменты экспрессируются на поверхности фага, т.е. физически связаны с генами, которые их кодируют. Таким образом, отбор Fab по связыванию антигена одновременно отбирает на кодирующие Fab последовательности, которые могут быть потом амплифицированы. Посредством нескольких циклов связывания антигена и повторяемой амплификации, процедуры, называемой пэннингом, Fab, специфический для этого антигена, обогащают и, наконец, выделяют. В 1994 г. был описан подход для гуманизации антител, названный "направляемым отбором". Направляемый отбор использует эффективность способа фагового дисплея в отношении гуманизации моноклонального антитела мыши (см. Jespers, L.S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994. Для этого Fdфрагмент моноклонального антитела мыши может быть выставлен в дисплее в комбинации с библиотекой легких цепей человека, и затем полученный гибрид может быть отобран с антигеном. Посредством этого мышиный Fd-фрагмент обеспечивает матрицу для направления отбора. Затем отобранные легкие цепи человека объединяют с библиотекой Fd-фрагментов человека. Отбор из полученных выходов библиотеки дает полностью "человеческий" Fab. Были описаны различные процедуры для создания антител человека из библиотек фагового дисплея(1991); патенты США с 5565332 и 5573905; Clackson, Т., и Wells, J.A., TIBTECH 12, 173-184 (1994. В частности, отбор in vitro и эволюция антител, произведенных из библиотек фагового дисплея, стали мощным инструментом (см. Burton, D.R., and Barbas III, C.F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); Winter,G., et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); заявку на патент США 20020004215 и WO 92/01047; заявку на патент 20030190317, опубликованную 9 октября 2003 г., и патент США 6054287; патент США 5877293.Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift", Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178:187-193, и заявка на патент США 200120030044772, опубликованная 6 марта 2003 г., описывают способы скрининга библиотек, экспрессируемых фагом антител или других связывающих молекул посредством захватывающего подъема (лифтинга), причем один способ включает в себя иммобилизацию кандидатных связывающих молекул на твердом носителе. Продукты антител могут быть подвергнуты скринингу на активность и на применимость в способах этого изобретения с использованием анализов, описанных в разделе с заголовком "Способы скрининга" здесь, или с использованием любых других подходящих анализов, известных в данной области. Мутеины аминокислотных последовательностей. Антитела по изобретению включают мутеин или варианты исходного антитела, в которых полипептидная последовательность исходного антитела была изменена по меньшей мере одной аминокислотной заменой, делецией или инсерцией в вариабельной области или части, эквивалентной вариабельной области, в том числе в области CDR, при условии, что этот мутеин или вариант сохраняет желаемую аффинность связывания или биологическую активность. Мутеины могут быть, по существу, гомологичными или, по существу, идентичными исходному антителу, например по меньшей мере на 65, 70, 75, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичными или гомологичными. Идентичность или гомология в отношении этой последовательности определяется здесь как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными с исходной последовательностью, после сопоставления этих последовательностей и введения гэпов, если необходимо, для получения максимальной процентной идентичности последовательности и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательности. Ни одна из N-концевых, Сконцевых или внутренних удлинений, делеций или инсерций в это антитело не должно рассматриваться как влияющее на идентичность или гомологию последовательностей. Таким образом, идентичности последовательности могут быть определены стандартными способами, которые обычно используют для сравнения сходства в положении аминокислот двух полипептидов. С использованием компьютерной программы, такой как BLAST или FASTA, два полипептида сопоставляют для оптимального соответствия их соответствующих аминокислот (либо по всей длине одной или обеих последовательностей, либо по заданной части одной или обеих последовательностей). Эти программы обеспечивают штраф за открытие гэпа по умолчанию и штраф за удлинение гэпа по умолчанию, и может быть обеспечена матрица оценок, такая как РАМ 250 [стандартная матрица оценок; см. Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequenceand Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)], вместе с этой компьютерной программой. Например, процентная идентичность может быть затем рассчитана как общее количество идентичных совпадений, умноженное на 100 и затем деленное на сумму длины более длинной последовательности в совпадающем расстоянии и количества гэпов, введенных в более длинные последовательности для сопоставления этих двух последовательностей. Антитела по изобретению могут также включать изменения в полипептидной последовательности константной области, которые не будут влиять на аффинность связывания, но будут изменять эффекторную функцию, такую как антителозависимая клеточная токсичность (ADCC), комплементзависимая цитотоксичность (CDC) или клиренс и поглощение (и полученное действие на полупериод существования в организме). Инсерции. Инсерции аминокислотной последовательности включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния с длиной в диапазоне от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также инсерции внутри последовательности единственных или множественных аминокислотных остатков, например 2, 3 или более. Примеры концевых инсерций включают в себя антитело с N-концевым метионильным остатком или антитело (в том числе фрагмент антитела), слитое с эпитопной меткой или эпитопом рецептора реутилизации. Другие инсерционные мутеины молекулы антитела включают в себя добавление сайтов гликозилирования, добавление цистеинов для внутримолекулярного или межмолекулярного связывания, или слияние с полипептидом, который увеличивает полупериод существования в сыворотке этого антитела, например, на N-конце или С-конце. Например, цистеиновая связь (цистеиновые связи) могут быть добавлены к антителу для улучшения его стабильности (особенно, когда это антитело является фрагментом антитела, таким как Fv-фрагмент). Гликозилирование антител обычно является N-связанным или О-связанным. N-связанным называют присоединение углеводной части молекулы к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X обозначает любую аминокислоту,кроме пролина, являются последовательностиями узнавания для ферментативного присоединения углеводной части молекулы к боковой цепи аспарагина. Присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. Таким образом, Nсвязанные сайты гликозилирования могут быть добавлены к антителу изменением аминокислотной последовательности таким образом, что она содержит одну или несколько этих трипептидных последовательностей. О-связанными сайтами гликозилирования называют присоединения одного из сахаров Nацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиламинокислоте, наиболее часто серину или треонину, хотя может быть также использован 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. О-связанные сайты гликозилирования могут быть добавлены к антителу инсертированием или заменой одного или нескольких остатков серина или треонина относительно последовательности исходного антитела. Термин "меченый эпитопом" относится к антителу, слитому с эпитопной меткой. Полипептид эпитопной метки имеет достаточно остатков для обеспечения эпитопа, против которого может быть произведено антитело, но все еще достаточно коротким, так что оно не препятствует активности этого антите- 27017851 ла. Эпитопная метка предпочтительно является достаточно уникальной, так что это антитело, по существу, не реагирует перекрестно с другими эпитопами. Подходящие полипептиды-метки обычно имеют по меньшей мере 6 аминокислотных остатков и обычно имеют приблизительно 8-50 аминокислотных остатков (предпочтительно между приблизительно 9-30 остатками). Примеры включают в себя полипептид-метку flu НА и его антитело 12 СА 5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)]; метку c-myc и антитела 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 и 9 Е 10 к ней [Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616 (1985)]; и гликопротеин D (gD)-метку вируса простого герпеса и его антитело [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)]. Другой примерной меткой является полигистидиновая последовательность, обычно около шести остатков гистидина, которая делает возможным выделение меченого таким образом соединения с использованием образования хелата никеля. Другие метки и "ярлыки", такие как метка FLAG(Eastman Kodak, Rochester, NY), хорошо известные и рутинно используемые в данной области, включены в это изобретение. В данном контексте термин "эпитоп связывания рецептора спасения" относится к эпитопу Fcрайона молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), который является ответственным за увеличение полупериода существования в сыворотке in vivo молекулы IgG. Делеции. Делеции аминокислотной последовательности включают амино- и/или карбоксилконцевые делеции с длиной в диапазоне от одного до ста или более остатков, приводящие к фрагментам, которые сохраняют аффинность связывания в отношении антигена-мишени, а также делеции внутри последовательности единственного или множественных аминокислотных остатков, например 2, 3 или более. Например, сайты гликозилирования могут быть делетированы или перемещены в другое положение делецией части или всех трипептидов или других последовательностей узнавания для гликозилирования. Замены. Другим типом мутеина является мутеин с аминокислотными заменами. Эти мутеины имеют по меньшей мере один удаленный аминокислотный остаток в молекуле антитела и вставленный на его место другой остаток. Обсуждается замещающий мутагенез в любой из гипервариабельных или CDRобластей или каркасных районов. Консервативные замены показаны в табл. 1. Наиболее консервативная замена показана под заголовком "предпочтительные замены". Если такие замены не приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены более существенные изменения, названные"примерными заменами" в табл. 1 или описанные ниже в ссылке на классы аминокислот, и продукты могут быть подвергнуты скринингу. Таблица 1 Существенные модификации в биологических свойствах антитела выполняют отбором замен, которые существенно отличаются в их действии на сохранение (а) структуры скелета полипептида в зоне замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени или (с) объема боковой цепи. Природные остатки разделены на группы на основе общих свойств боковых цепей:(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: gly, pro; и(6) ароматические: trp, tyr, phe. Консервативные замены включают замену аминокислоты другой аминокислотой ее класса. Неконсервативные замены включают замену члена одного из этих классов членом другого класса. Любой остаток цистеина, не включенный в сохранение правильной конформации антитела, также может быть заменен, обычно серином, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предотвращения аберрантного сшивания. Созревание аффинности обычно включает получение и скрининг вариантов антител, которые имеют замены в областях CDR исходного антитела, и отбора вариантов, которые имеют улучшенные биологические свойства, такие как аффинность связывания, относительно исходного антитела. Удобным путем для генерирования таких вариантов с заменами является созревание аффинности с использованием фагового дисплея. Вкратце, несколько сайтов гипервариабельных областей (например, 6-7 сайтов) мутируют для генерирования всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Генерированные таким образом варианты антител представляют в виде дисплея одновалентным образом из частиц нитчатого фага в виде слияний с продуктом гена III M13, упакованным в каждой частице. Затем эти представленные фагом варианты подвергают скринингу на их биологическую активность (например, аффинность связывания). См., например, WO 92/01047, WO 93/112366, WO 95/15388 и WO 93/19172. Существующие способы созревания аффинности антител относятся к двум категориям мутагенеза: стохастической (случайной) и нестохастической. Склонная к ошибкам ПЦР, мутаторные бактериальные штаммы (Low et al., J. Mol. Biol. 260, 359-68, 1996) и насыщающий мутагенез (Nishimiya et al., J. Biol.Chem. 275:12813-20, 2000; Chowdhury, P.S. Methods Mol. Biol. 178, 269-85, 2002) являются типичными примерами способов стохастического мутагенеза (Rajpal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102:8466-71,2005). Нестохастические способы часто используют аланин-сканирование или сайт-направленный мутагенез для генерирования ограниченных коллекций специфических вариантов. Некоторые способы описаны более подробно ниже. Созревание аффинности через способы пэннинга. Созревание аффинности рекомбинантных антител обычно выполняют посредством нескольких циклов пэннинга кандидатных антител в присутствии уменьшающихся количеств антигена. Уменьшение количества антигена на цикл отбирает антитела с наивысшей аффинностью к антигену, выдавая тем самым антитела высокой аффинности из большого пула исходного материала. Созревание аффинности посредством пэннинга хорошо известно в данной области и описано, например, в Huls et al. (Cancer Immunol Immunother. 50:163-71, 2001). Способы созревания аффинности с использованием технологий фагового дисплея описаны здесь в другом месте и известны в данной области (см., например, Daugherty etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97:2029-34, 2000). Просмотровый (Look-through) мутагенез. Просмотровый мутагенез (LTM) (Rajpal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102:8466-71, 2005) обеспечивает способ быстрого картирования антигенсвязывающего сайта. Для LTM отбирают девять аминокислот, репрезентативных для химии основных боковых цепей, обеспечиваемых 20 природными аминокислотами, для анализа функциональных вкладов боковых цепей в связывание в каждом положении во всех шести областей CDR антитела. LTM генерирует позиционный ряд моносайтовых мутаций в областиCDR, где каждый остаток "дикого типа" систематически заменяют одной из девяти выбранных аминокислот. Мутированные области CDR объединяют для генерирования комбинаторных библиотек одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv) увеличивающейся сложности и увеличивающегося размера,которые не становятся запрещающими в отношении количественного дисплея всех вариантов. После положительного отбора клоны с улучшенным связыванием секвенируют и благоприятные мутации картируют. Склонная к ошибкам ПЦР. Склонная к ошибкам ПЦР включает рандомизацию нуклеиновых кислот между разными циклами отбора. Эта рандомизация происходит при низкой скорости посредством скорости ошибок, присущей используемой полимеразе, но может быть усилена склонной к ошибкам ПЦР (Zaccolo et al., J. Mol. Biol. 285:775-783, 1999) с использованием полимеразы, имеющей высокую внутреннюю скорость ошибок во время транскрипции (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-96, 1992). После циклов мутации клоны с улучшенной аффинностью в отношении антигена отбирают при помощи рутинных способов в данной области.
МПК / Метки
МПК: A61K 39/395, C12N 5/18, C07K 16/28, A61K 31/00, C12N 15/13, A61P 35/00
Метки: применения, антитело, prlr-специфическое
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-17851-prlr-specificheskoe-antitelo-i-ego-primeneniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Prlr-специфическое антитело и его применения</a>
Рекомбинантное антитело, взаимодействующее с антигенным комплексом ior c2, fv- фрагмент указанного антитела и способ их применения
Номер патента: 5169
Опубликовано: 30.12.2004
Авторы: Моралес Моралес Алехо, Матео Де Акоста Дель Рио Кристина Мария, Айяла Авила Марта, Рамос Сусарте Майра, Дуэньяс Порто Марта, Ренхифо Кальсадо Энрике, Гавилондо Ковлей Хорхе Виктор, Роке Наварро Лоурдес Татьяна, Иснага Эскобар Нормандо, Белль Гарсия Анссель, Перес Родригес Роландо
МПК: A61P 35/00, C07K 16/00, A61K 39/395...
Метки: указанного, способ, антитело, рекомбинантное, комплексом, применения, фрагмент, антитела, взаимодействующее, антигенным
Формула / Реферат:
1. Рекомбинантное антитело, взаимодействующее с антигенным комплексом ior C2, полученное из мышиного моноклонального антитела IOR C5, продуцируемое гибридомой, депонированной под номером ECCC 97061101, при том, что последовательности участков, определяющих комплементарность связывания с антигеном (CDR), легкой и тяжелой цепей представляют собой 2. Рекомбинантное антитело по п.1, отличающееся тем, что содержит участки CDR и каркасные области...
Антитело связывающееся с ngf, и способы его применения
Номер патента: 11479
Опубликовано: 28.04.2009
Авторы: Понз Хауме, Шелтон Дэвид Л., Розенталь Арнон
МПК: A61P 29/00, A61K 39/395
Метки: связывающееся, применения, способы, антитело
Формула / Реферат:
1. Антитело к фактору роста нервов (NGF), содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую: (a) участок CDR1, имеющий SEQ ID NO: 3; (b) участок CDR2, имеющий SEQ ID NO: 4; и (c) участок CDR3, имеющий SEQ ID NO: 5. 2. Антитело по п.1, также содержащее вариабельную область легкой цепи. 3. Антитело к фактору роста нервов (NGF), содержащее вариабельную область легкой цепи, включающую: (a) участок CDR1, имеющий SEQ ID NO: 6; (b) участок CDR2,...
Антитело, взаимодействующее с доменом ed-b (+) фибронектина, и способы его применения
Номер патента: 5685
Опубликовано: 28.04.2005
Авторы: Тарли Лоренцо, Бирхлер Манфред, Вити Франческа, Нери Дарио
МПК: C07K 16/18, A61K 47/48, A61P 35/00...
Метки: доменом, взаимодействующее, применения, антитело, способы, фибронектина
Формула / Реферат:
1. Выделенное антитело, представляющее собой антитело L19 или его функционально эквивалентную вариантную форму, которое распознает характерный эпитоп ED-(B)+ домена фибронектина со специфичной аффинностью и обладает константой диссоциации (Kd) в отношении указанного домена фибронектина менее 1 x 10-9 M, или фрагмент указанного антитела. 2. Антитело или его фрагмент по п.1, отличающееся тем, что Kd составляет 5,4 x 10-11 M. 3. Антитело или его...
Моноклональное антитело к миостатину и способы его применения
Номер патента: 14112
Опубликовано: 29.10.2010
Авторы: Тобиас Линда О., Кикли Кристин Кей, Смит Росамунд Кэрол, Хан Боми
МПК: A61K 39/395, A61K 39/40, A61K 39/42...
Метки: миостатину, антитело, способы, моноклональное, применения
Формула / Реферат:
1. Моноклональное антитело к миостатину (GDF-8), включающее полипептид вариабельного участка легкой цепи (LCVR) и полипептид вариабельного участка тяжелой цепи (HCVR) соответственно, с аминокислотными последовательностями:(i) SEQ ID NO: 3 и 12;(ii) SEQ ID NO: 4 и 13;(iii) SEQ ID NO: 3 и 14;(iv) SEQ ID NO: 5 и 12;(v) SEQ ID NO: 6 и 15;(vi) SEQ ID NO: 7 и 17;(vii) SEQ ID NO: 8 и 12;(viii) SEQ ID NO: 9 и 16;(ix) SEQ ID NO: 10 и 12 или(x) SEQ ID NO:...
Антитело к cd33 и способы его применения
Номер патента: 10570
Опубликовано: 30.10.2008
Авторы: Лутц Роберт Дж., Таварес Даниел, Хоффи Мэри Г.
МПК: A61K 39/395, A61K 39/42, A61K 39/40...
Метки: способы, применения, антитело
Формула / Реферат:
1. Выделенное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, включающие по крайней мере один определяющий комплементарность участок, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID Nos: 1-6: и обладающие способностью связывать CD33. 2. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, обладающие способностью связывать CD33, включающие по крайней мере одну тяжелую цепь и по крайней мере одну легкую цепь, причем...
Предыдущий патент: Мобильный коммуникатор
Следующий патент: Производные замещенных индазолов, активные в качестве ингибиторов киназ
Случайный патент: Матрас, предотвращающий возникновение синдрома внезапной смерти младенца