Антитело связывающееся с ngf, и способы его применения

011479 Перекрестная ссылка на родственные заявки По данной заявке испрашивается приоритет на основании предварительных заявок на выдачу патента США серийный номер 60/436905, поданной 24 декабря 2002 г.; серийный номер 60/443522, поданной 28 января 2003 г.; и серийный номер 60/510006, поданной 8 октября 2003 г., которые включены в данное описание в качестве ссылки во всей их полноте. Область изобретения Данное изобретение относится к антителам против NGF (таким как антагонистические антитела против NGF). Данное изобретение также относится к применению таких антител для лечения и/или профилактики боли, в том числе послеоперационной боли, боли при ревматоидном артрите и боли при остеоартрите. Заявление, касающееся поддерживаемых правительством исследований или разработок Не применимо к данному случаю. Предпосылки создания изобретения Фактор роста нервов (NGF) был первым идентифицированным нейротрофином, и его роль в развитии и выживании как периферических, так и центральных нейронов хорошо охарактеризована. Показано,что NGF является ключевым фактором выживания и формирования нейронов при развитии периферических симпатических и эмбриональных сенсорных нейронов, а также базальных холинергических нейронов переднего мозга. Smeyne et al., Nature 368: 246-249 (1994) и Crowley et al., Cell 76: 1001-1011 (1994).NGF осуществляет повышающую регуляцию экспрессии нейропептидов в сенсорных нейронах (Lindsayand Harmer, Nature 337: 362-364 (1989, причем его активность опосредуется двумя разными мембраносвязанными рецепторами, рецептором TrkA и общим рецептором нейротрофинов р 75 (которые иногда называют рецепторами NGF "с высоким сродством" и "с низким сродством", соответственно). Chao et al.,Science 232: 518-521 (1986). Обзор по NGF смотрите в Huang et al., Annu. Rev. Neurosci. 24: 677-736(2001); Bibel et al., Genes Dev. 14: 2919-2937 (2000). Определена кристаллическая структура NGF и NGF в комплексе с рецептором trkA. См. Nature 254: 411 (1991); Nature 401: 184-188 (1996). Фактор роста нервов (NGF) был первым идентифицированным нейротрофином, и его роль в развитии и выживании как периферических, так и центральных нейронов хорошо охарактеризована. Показано,что NGF является ключевым фактором выживания и формирования нейронов при развитии периферических симпатических и эмбриональных сенсорных нейронов, а также базальных холинергических нейронов переднего мозга (Smeyne et al., Nature 368:246-249 (1994) и Crowley et al., Cell 76: 1001-1011 (1994.NGF осуществляет повышающую регуляцию экспрессии нейропептидов в сенсорных нейронах (Lindsayet al., Nature 337: 362-364 (1989, причем его активность опосредуется двумя разными мембраносвязанными рецепторами, тирозинкиназным рецептором TrkA и рецептором р 75, который по структуре близок к другим членам семейства рецепторов фактора некроза опухоли (Chao et al., Science 232: 518-521NGF активно участвует в процессах, происходящих не только в нервной системе, но и вне ее. Например, показано, что NGF повышает проницаемость сосудов (Otten, et al., Eur J Pharmacol. 106: 199-201(1984, усиливает иммунные ответы Т- и В-клеток (Otten, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1005910063 (1989, индуцирует дифференциацию лимфоцитов и пролиферацию тучных клеток, а также вызывает высвобождение растворимых биологических сигналов из тучных клеток (Matsuda, et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85: 6508-6512 (1988); Pearce, et al., J. Physiol. 372: 379-393 (1986); Bischoff, et al., Blood 79: 2662-2669 (1992); Horigome, et al., J Biol. Chera. 268: 14881-14887 (1993. Хотя показано, что экзогенно добавленный NGF способен оказывать все упомянутые эффекты, важно отметить, что существует мало данных, свидетельствующих о том, что эндогенный NGF играет важную роль в каком-либо из указанных процессов in vivo (Torcia, et al., Cell. 85 (3): 345-56 (1996. Следовательно, неясно, какой эффект может оказывать ингибирование биоактивности эндогенного NGF, если оно имеет место.NGF продуцируется многими типами клеток, включающими в себя тучные клетки (Leon, et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91: 3739-3743 (1994, В-лимфоциты (Torcia, et al., Cell 85: 345-356 (1996), кератиноциты (Di Marco, et al., J. Biol. Chem. 268: 22838-22846, гладкомышечные клетки (Ueyama, et al., J Hypertens. 11: 1061-1065 (1993, фибробласты (Lindholm, et al., Eur. J. Neurosci. 2: 795-801 (1990, клетками бронхиального эпителия (Kassel, et al., Clin. Exp. Allergy 31: 1432-40 (2001, клетками почечного мезангия (Steiner, et al., Am. J; Physiol. 261: F792-798 (1991 и мышечными трубочками скелетной мускулатуры (Schwartz, et al., J Photochem. Photobiol. B66: 195-200 (2002. Рецепторы NGF обнаружены в разных типах клеток вне нервной системы. Например, TrkA обнаружен в человеческих моноцитах, Т- и Влимфоцитах и тучных клетках. Связь между повышенными уровнями NGF и рядом воспалительных состояний наблюдали у больных-людей, а также у некоторых животных моделей. Данные состояния включают в себя системную красную волчанку (Bracci-Laudiero, et al., Neuroreport 4: 563-565 (1993, рассеянный склероз (BracciLaudiero, et al., Neurosci. Lett. 147: 9-12 (1992, псориаз (Raychaudhuri, et al., Acta Derm. Venereol. 78: 8486 (1998, артрит (Falcim, et al., Ann. Rheum. Dis. 55: 745-748 (1996, интерстициальный цистит (Okragly, et al., J. Urology 161: 438-441 (1999 и астму (Braun, et al., Eur. J Immunol. 28: 3240-3251 (1998. Соответственно, повышенные уровни NGF в периферических тканях связаны с гипералгезией и-1 011479 воспалением и наблюдаются при некоторых видах артрита. Синовиальная оболочка больных с ревматоидным артритом экспрессирует высокие уровни NGF, тогда как в невоспаленной синовиальной оболочкеNGF не детектируется (Aloe, et al., Arch. Rheum. 35: 351-355 (1992. Подобные результаты наблюдали у крыс с экспериментально индуцированным ревматоидным артритом (Aloe, et al., Clin. Exp. Rheumatol. 10: 203-204 (1992. Повышенные уровни NGF, наряду с увеличением числа тучных клеток, обнаружены у трансгенных мышей, страдающих артритом (Aloe, el al., Int. J Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15: 139-143 (1993. В PCT-публикацииWO 02/096458 раскрывается применение антител против NGF,некоторые свойства которых позволяют использовать их для лечения различных нарушений, связанных сNGF, таких как воспалительное состояние (например, ревматоидный артрит). Было описано, что очищенное антитело против NGF, введенное артритическим трансгенным мышам, несущим ген человеческого фактора некроза опухоли- (TNF-), вызывает уменьшение числа тучных клеток, а также уменьшение уровней гистамина и вещества Р в синовиальной оболочке артритических мышей (Aloe et al.,Rheumatol. Int. 14: 249-252 (1995. Было показано, что введение экзогенного антитела против NGF уменьшает повышенный уровень TNF- у артритических мышей (Manni et al., Rheumatol. Int. 18: 97-102(1998. Кроме того, повышенная экспрессия NGF и высокоаффинного рецептора NGF (TrkA) наблюдается в хондроцитах людей, страдающих от остеоартрита (Iannone et al., Rheumatology 41: 1413-1418 (2002. Описаны антагонистические антитела грызунов против NGF. См., например, Hongo et al, Hybridoma(2000) 19 (3): 215-227; Ruberti et Al. (1993) Cell. Molec. Neurobiol. 13 (5): 559-568. Однако, если для лечения людей используются антитела грызунов, у значительного числа субъектов, подвергающихся лечению, развивается иммунный ответ против мышиных антител. Кроме того, доказано, что эффекторные функции мышиных антител для человека менее эффективны. Таким образом, существует потребность в антагонистических антителах против NGF, включающих в себя гуманизированные антагонистические антитела против NGF. Все раскрытые здесь ссылки, публикации и патентные заявки включены в данное описание в качестве ссылки во всей их полноте. Краткое описание изобретения Раскрываемое в данном описании изобретение относится к антителам против фактора роста нервов. В другом аспекте данное изобретение относится к гуманизированному и аффинно-зрелому антителу, E3, которое специфически связывается с фактором роста нервов ("NGF") человека и грызунов. Аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей вариабельных областей E3 приведены на фиг. 1 А (SEQ ID NO: 1) и 1B (SEQ ID NO: 2), соответственно. Фрагменты CDR антитела E3 (в том числе фрагменты CDR Chothia и Kabat) схематически изображены на фиг. 1 А и 1 В. Аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей E3 и отдельные вытянутые CDR также приведены ниже (См. "последовательности антител", ниже). В другом аспекте данное изобретение относится к антителу, содержащему фрагмент или участок антитела E3 (в данном описании данный термин используется как взаимозаменяемый с термином "E3"). В одном воплощении фрагмент представляет собой легкую цепь антитела E3, как показано на фиг. 1 В. В другом воплощении фрагмент представляет собой тяжелую цепь антитела E3, как показано на фиг. 1 А. В следующем воплощении фрагмент содержит один или несколько вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи антитела E3. В следующем воплощении фрагмент содержит один или несколько гипервариабельных областей (CDR) из легкой и/или тяжелой цепи антитела E3, как показано на фиг. 1 А и 1 В. В другом аспекте данное изобретение относится к антителу, содержащему легкую цепь, которую кодирует полинуклеотид, продуцируемый клеткой-хозяином с депозитным номером АТССРТА-4893 или АТССРТА-4894. В другом аспекте данное изобретение относится к антителу, содержащему тяжелую цепь, которую кодирует полинуклеотид, продуцируемый клеткой-хозяином с депозитным номером АТССРТА-4895. В другом аспекте данное изобретение относится к антителу, содержащему (а) легкую цепь, которую кодирует полинуклеотид, продуцируемый клеткой-хозяином с депозитным номером АТССРТА-4894 или АТССРТА-4893; и (b) тяжелую цепь, которую кодирует полинуклеотид,продуцируемый клеткой-хозяином с депозитным номером АТССРТА-4895 (для удобства в данном описании полинуклеотидам, продуцируемым депонированными клетками-хозяевами, приписываются депозитные номера АТССРТА-4894, РТА-4893 и РТА-4895). В другом аспекте данное изобретение относится к антителу, содержащему вариабельную область легкой цепи, которую кодирует полинуклеотид, продуцируемый клеткой-хозяином с депозитным номером АТССРТА-4894 или АТССРТА 4893. В другом аспекте данное изобретение относится к антителу, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, которую кодирует полинуклеотид, продуцируемый клеткой-хозяином с депозитным номером АТССРТА-4895. В другом аспекте данное изобретение относится к антителу, содержащему (а) вариабельную область легкой цепи, которую кодирует полинуклеотид, продуцируемый клеткойхозяином с депозитным номером АТССРТА-4894 или АТССРТА-4893, и (b) вариабельную область тяжелой цепи, которую кодирует полинуклеотид, продуцируемый клеткой-хозяином с депозитным номером АТССРТА-4895. В следующем аспекте данное изобретение относится к антителу, содержа-2 011479 щему (а) один или несколько CDR, кодируемых полинуклеотидом, который продуцируется клеткойхозяином с депозитным номером АТССРТА-4894; и/или (b) тяжелую цепи, которую кодирует полинуклеотид, продуцируемый клеткой-хозяином с депозитным номером АТССРТА-4895. В некоторых воплощениях антитело содержит константный участок тяжелой цепи человеческогоIgG2a. В некоторых воплощениях антитело содержит константный участок человеческой легкой цепи каппа. В некоторых воплощениях антитело содержит модифицированный константный участок, такой как иммунологически инертный константный участок, который, например, не запускает опосредованный комплементом лизис или не стимулирует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность(ADCC). В других воплощениях константный участок модифицируют, как описано в Eur. J Immunol.(1999) 29: 2613-2624; заявке РСТPCT/GB99/01441; и/или патентной заявке Великобритании 9809951.8. В следующих воплощениях антитело содержит константный участок тяжелой цепи человеческого IgG2a, несущий следующие мутации: А 330 Р 331 заменены на S330S331 (нумерация аминокислот производится со ссылкой на последовательность IgG2a дикого типа). Eur.J Immunol. (1999) 29: 26132624. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (которые необязательно могут представлять собой антитело), содержащим какой-либо один или несколько из следующих фрагментов: а) один или несколько CDR антитела E3, показанные на фиг. 1 А и 1B; b) CDR Н 3 тяжелой цепи антителаE3, показанный на фиг. 1 А; с) CDR L3 легкой цепи антитела E3, показанный на фиг. 1B; d) три CDR легкой цепи антитела E3, показанные на фиг. 1B; e) три CDR тяжелой цепи антитела E3, показанные на фиг. 1 А; и f) три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи антитела E3, показанные на фиг. 1 А и 1 В. Данное изобретение также относится к полипептидам (которые необязательно могут представлять собой антитело), содержащие какой-либо один или несколько из следующих фрагментов: а) один или несколько(один, два, три, четыре, пять или шесть) CDR, полученных из антитела E3, показанных на фиг. 1 А и 1B;b) CDR, полученный из CDR Н 3 тяжелой цепи антитела E3, показанный на фиг. 1 А; и/или с) CDR, полученный из CDR L3 легкой цепи антитела E3, показанный на фиг. 1 В. В некоторых воплощениях CDR могут представлять собой Kabat CDR, Chothia CDR, или сочетание Kabat CDR и Chothia CDR (называемые здесь "расширенные" или "комбинированные" CDR). В некоторых воплощениях полипептиды (такие как антитело) связываются с NGF (таким как человеческий NGF). В некоторых воплощениях полипептиды содержат любые описанные здесь конфигурации CDR (в том числе сочетания, варианты и др.). В одном аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя SEQ ID NO: 9, где 134 представляет собой S, L, V, А или I; a N35 заменен на N, Т или S. Для удобства в настоящем описании термин "заменен" или "представляет собой" в данном контексте, или употребляемый в отношении аминокислот, означает выбор аминокислоты для указанного положения. Очевидно, что замена или выбор могут представлять собой аминокислоту, изображенную в SEQ ID или на фигуре. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя SEQ ID NO: 10, где М 50 представляет собой М, I, G, Q, S или L; А 62 представляет собой А или S; a L63 представляет собой L или V. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя SEQ ID NO: 11, где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собойY, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой D, N или G; и где Y110 представляет собой Y, K, S, R или Т. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя SEQ ID NO: 11, где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собойY, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой S, А, С, G, D, N, Т или G; и где Y110 представляет собой любую аминокислоту. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя SEQ ID NO: 11, где G98 представляет собой G, S, А, С, V, N, D или Т; где G99 представляет собой G, S, А, С, V, N, D или Т, где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А илиD109 представляет собой S, А, С, G, D, N, Т или G; и где Y110 представляет собой любую аминокислоту. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат вариабельную область легкой цепи, включающую в себя SEQ ID NO: 12, где S26 представляет собой S или F; D28 представляет собой D, S, А или Y; и Н 32 представляет собой Н, N или Q. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат вариабельную область легкой цепи, включающую в себя SEQ ID NO: 13, где 151 представляет-3 011479 собой I, T, V или А; и S56 представляет собой S или Т. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат вариабельную область легкой цепи, включающую в себя SEQ ID NO: 14, где S91 представляет собой S или Е; К 92 представляет собой K, Н, R или S; и где Y96 представляет собой Y или R. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат вариабельную область легкой цепи, включающую в себя SEQ ID NO: 14, где S91 представляет собой S или Е; К 92 представляет собой любую аминокислоту; Т 93 представляет собой любую аминокислоту; и где Y96 представляет собой Y или R. В одном аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9, где 134 представляет собойS, L, V, А или I; и N35 представляет собой N, Т или S. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 10, где М 50 представляет собой М, I, G, Q, S или L; А 62 представляет собой А или S; и L63 представляет собой L или V. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11, где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собойY, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой D, N или G; и где Y110 представляет собой Y, K, S, R или Т. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11, где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собойY, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой S, А, С, G, D, N, Т или G; и где Y110 представляет собой любую аминокислоту. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11, где G98 представляет собой G, S, А, С, V, N, D или Т; где G99 представляет собой G, S, А, С, V, N, D или Т; где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собойY, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой S, А, С, G, D, N, Т или G; и где Y110 представляет собой любую аминокислоту. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12, где S26 представляет собойS или F; D28 представляет собой D, S, А или Y; и Н 32 представляет собой Н, N или Q. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 13, где I51 представляет собойI, T, V или А; и S56 представляет собой S или Т. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, где S91 представляет собойS или Е; K92 представляет собой K, Н, R или S; и где Y96 представляет собой У или R. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, где S91 представляет собойS или Е; K92 представляет собой любую аминокислоту; Т 93 представляет собой любую аминокислоту; и где Y96 представляет собой Y или R. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитела, в том числе,гуманизированные антитела), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя участок CDR1 последовательности SEQ ID NO: 9, где I34 представляет собой S, L, V, А или I; и N35 представляет собой N, Т или S; участок CDR2 последовательности SEQ ID NO: 10, где М 50 представляет собой М, I, G, Q, S или L; А 62 представляет собой А или S; и L63 представляет собой L или V; и участокS105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собой Y, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой D, N или G; где Y110 представляет собой Y, K, S, R или Т. В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи содержит участок CDR3 последовательности SEQ ID NO: 11, где Y100 представляет собой Y, L или R; гдеY107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой S,А, С, G, D, N, Т или G; где Y110 представляет собой любую аминокислоту. В других воплощениях вариабельная область тяжелой цепи содержит участок CDR3 последовательности SEQ ID NO: 11, где G98Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собой Y, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой S, А, С, G, D, N, Т или G; и где Y110 представляет собой любую аминокислоту. В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) дополнительно содержит вариабельную область легкой цепи антитела. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат вариабельную область легкой цепи, включающую в себя участок CDR1 последовательности SEQS91 представляет собой S или Е; K92 представляет собой K, Н, R или S; и где Y96 представляет собой Y или R. В некоторых воплощениях вариабельная область легкой цепи содержит участок CDR3 последовательности SEQ ID NO: 14, где S91 представляет собой S или Е; K92 представляет собой любую аминокислоту; Т 93 представляет собой любую аминокислоту; и где Y96 представляет собой Y или R. В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) также содержит тяжелую цепь антитела. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат (а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя участок CDR1 последовательностиNO: 11, где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собой Y, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой D, N или G; где Y110 представляет собой Y, K, S, R или Т; и (b) вариабельную область легкой цепи, включающую в себя участок CDR1 последовательности SEQ IDR. В некоторых воплощениях вариабельная область легкой цепи содержит участок CDR3 последовательности SEQ ID NO: 14, где S91 представляет собой S или Е; K92 представляет собой любую аминокислоту; Т 93 представляет собой любую аминокислоту; и где Y96 представляет собой Y или R. В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи содержит участок CDR3 последовательности SEQ IDNO: 11, где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собой Y, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой S, А, С, G, D, N, Т или G; где Y110 представляет собой любую аминокислоту. В других воплощениях вариабельная область тяжелой цепи содержит участок CDR3 последовательности SEQ ID NO: 11, где G98 представляет собой G, S, А, С, V, N, D или Т; где G99 представляет собой G, S, А, С, V, N, D или Т; где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собой Y, R, Т или М; где Y107 представляет собойY или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой S, А, С, G, D, N, Т или G; и где Y110 представляет собой любую аминокислоту. В некоторых воплощениях полипептид также содержит легкую цепь антитела. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело, в том числе,гуманизированное антитело), которые содержат аминокислотную последовательность, приведенную вY110 представляет собой Y, K, S, R или Т. В некоторых воплощениях полипептид содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11, где Y100 представляет собой Y, L или R; и где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собой Y, R, Т или М; гдеY107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой S,А, С, G, D, N, Т или G; и где Y110 представляет собой любую аминокислоту. В других воплощениях по-5 011479 липептид содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11, где G98 представляет собой G, S, А, С, V, N, D или Т; где G99 представляет собой G, S, А, С, V, N, D или Т; где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собой Y, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой S, А, С, G, D, N, Т или G; и где Y110 представляет собой любую аминокислоту. В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) также содержит вариабельную область легкой цепи антитела. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), которые содержат аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12, где S26 представляет собойS91 представляет собой S или Е; K92 представляет собой K, Н, R или S; и где Y96 представляет собой Y или R. В некоторых воплощениях полипептид содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, где S91 представляет собой S или Е; K92 представляет собой любую аминокислоту; Т 93 представляет собой любую аминокислоту; и где Y96 представляет собой Y или R. В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) также содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело) которые содержат (а) аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9, где I34 представляет собой S, L, V, А или I; a N35 представляет собой N, Т или S; аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 10, где М 50 представляет собой М, I, G, Q, S или L; А 62 представляет собой А илиS91 представляет собой S или Е; K92 представляет собой K, Н, R или S; и где Y96 представляет собой Y или R. В некоторых воплощениях полипептид содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, где S91 представляет собой S или Е; K92 представляет собой любую аминокислоту; Т 93 представляет собой любую аминокислоту; и где Y96 представляет собой Y или R. В некоторых воплощениях полипептид содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ IDNO: 11, где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собой Y, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой S, А, С, G, D, N, Т или G; где Y110 представляет собой любую аминокислоту. В других воплощениях полипептид содержит аминокислотную последовательность,приведенную в SEQ ID NO: 11, где G98 представляет собой G, S, А, С, V, N, D или Т; где G99 представляет собой G, S, А, С, V, N, D или Т; где У 100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собой Y, R, Т или М; где Y107 представляет собойY или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой S, А, С, G, D, N, Т или G; и где Y110 представляет собой любую аминокислоту. В некоторых воплощениях полипептид также содержит вариабельную область легкой цепи антитела. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептиду (такому, как антитело), содержащему вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя: (а) участок CDR1 последовательностиNO: 11, где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собой Y, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой D, N или G; и где Y110 представляет собой Y, K, S, R или Т; где антитело связывается с NGF. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитела), содержащие вариабельную область легкой цепи, включающую в себя: (а) участок CDR1 последовательности SEQ IDK92 представляет собой K, Н, R или S; и где Y96 представляет собой Y или R; где антитело связывается сNGF. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитела), содержащим(а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя: (i) участок CDR1 последовательности SEQa L63 представляет собой L или V; и (iii) участок CDR3 последовательности SEQ ID NO: 11, где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т 104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собой Y, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой D, N или G; где Y110 представляет собой Y, K, S, R или Т; и (b) вариабельную область легкой цепи, включающую в себя: (i) участок CDR1 последовательности SEQ ID NO: 12, гдеS56 представляет собой S или Т; и (iii) участок CDR3 последовательности SEQ ID NO: 14, где S91 представляет собой S или Е; K92 представляет собой K, Н, R или S; и где Y96 представляет собой Y или R; где антитело связывается с NGF. Если не указано иначе, выбор (например, замена) аминокислоты в одном положении осуществляется независимо от выбора аминокислоты в другом положении. В некоторых воплощениях полинуклеотиды (такие как антитело) связываются с NGF (таким как человеческий NGF). В некоторых воплощениях полипептиды содержат любые описанные здесь конфигурации CDR (в том числе сочетания, варианты и др.). В данном описании используется последовательная нумерация вариабельной области. Специалисту в данной области известно, что существует несколько систем нумерации антител (таких как нумерация по Kabat и Chothia), и что от последовательной нумерации можно перейти к другой системе нумерации,такой как нумерация по Kabat или нумерация по Chothia. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептиду (такому, как антитело), содержащему аминокислотную последовательность (такую, как последовательность CDR3), выбранную из SEQ IDNO: 46 или 50. В следующих воплощениях полипептид также содержит одну или несколько из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 и 8. В следующих воплощениях полипептид также содержит одну или несколько из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептиду (такому, как антитело), содержащему аминокислотную последовательность (такую, как участок CDR, например, участок CDRH1 и/илиNO: 40 и 41. В некоторых воплощениях полипептид содержит аминокислотную последовательность (например, участок CDRH1), выбранную из SEQ ID NO: 28, 30, 32, 34, 36, 38 и 40. В некоторых воплощениях полипептид содержит аминокислотную последовательность (например, участок CDRH2) , выбранную из SEQ ID NO: 29, 31, 33, 35, 37, 39 и 41. В следующих воплощениях полипептид также содержит одну или несколько из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 и 8. В следующих воплощениях полипептид также содержит одну или несколько из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептиду (такому, как антитело), содержащему аминокислотную последовательность (например, участок CDR, такой как CDRL1 и/или CDRL2), выбранную из (a) SEQ ID NO: 18 и/или 19; (b) SEQ ID NO: 20 и/или 21; и (с) SEQ ID NO: 22 и/или 23. В некоторых воплощениях полипептид содержит аминокислотную последовательность (например, участокCDRL1), выбранную из SEQ ID NO: 18, 20 и 22. В некоторых воплощениях полипептид содержит аминокислотную последовательность (например, участок CDRL2), выбранную из SEQ ID NO: 19, 21 и 23. В следующих воплощениях полипептид также содержит одну или несколько из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8. В следующих воплощениях полипептид также содержит одну или несколько из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 9,10, 11, 12, 13, 14 и 15. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептиду (такому, как антитело), содержащему аминокислотную последовательность (например, участок CDR, такой как CDRL3 и/или CDRH3), выбранную из (a) SEQ ID NO: 51 и/или 52; (b) SEQ ID NO: 55 и/или 56; (с) SEQ ID NO: 57 и/или 58; (с) SEQID NO: 59 и/или 60; (d) SEQ ID NO: 61 и/или 62; (е) SEQ ID NO: 63 и/или 64. В некоторых воплощениях полипептид содержит аминокислотную последовательность (например, участок CDRL3), выбранную изSEQ ID NO: 51, 55, 57, 59, 61 и 63. В некоторых воплощениях полипептид содержит аминокислотную последовательность (например, участок CDRH3), выбранную из SEQ ID NO: 52, 56, 58, 60, 62 и 64. В-7 011479 следующих воплощениях полипептид также содержит аминокислотную последовательность, приведенную в одной или нескольких из SEQ ID NO: 18, 19, 30 и 31. В следующих воплощениях полипептид также содержит одну или несколько из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ IDNO:3,4, 5, 6, 7 и 8. В следующих воплощениях полипептид также содержит одну или несколько из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептиду (такому, как антитело), содержащему одну или несколько из аминокислотных последовательностей (таких как участок CDR), приведенных в SEQ ID NO: 61, 63, 18, 19, 30 и 31. В одном аспекте данное изобретение относится к антителу противNGF) с высоким сродством. В некоторых воплощениях высокое сродство означает, что антитело (а) связывается с NGF с KD менее чем приблизительно 2 нМ (например, приблизительно 1 нМ, 800 пМ, 600 пМ,400 пМ, 200 пМ, 100 пМ, 90 пМ, 80 пМ, 70 пМ, 60 пМ, 50 пМ или менее), и/или koff, менее чем приблизительно 610-5 с-1; и/или (b) ингибирует (уменьшает и/или блокирует) человеческий NGF-зависимое выживание мышиных нейронов Е 13.5 тройничного нерва с IC50 (в присутствии приблизительно 15 пМNGF) , составляющей приблизительно 200 пМ, 150 пМ, 100 пМ, 80 пМ, 60 пМ, 40 пМ, 20 пМ, 10 пМ, или менее; и/или (с) ингибирует (уменьшает и/или блокирует) человеческий NGF-зависимое выживание мышиных нейронов Е 13.5 тройничного нерва с IC50 (в присутствии приблизительно 1,5 пМ NGF), составляющей приблизительно 50 пМ, 40 пМ, 30 пМ, 10 пМ, 20 пМ, 10 пМ, 5 пМ, 2 пМ, 1 пМ, или менее; и/или(d) ингибирует (уменьшает и/или блокирует) крысиный NGF-зависимое выживание мышиных нейронов Е 13.5 тройничного нерва с IC50 (в присутствии приблизительно 15 пМ NGF), составляющей приблизительно 150 пМ, 125 пМ, 100 пМ, 80 пМ, 60 пМ, 40 пМ, 30 пМ, 20 пМ, 10 пМ, 5 пМ, или менее; и/или (е) ингибирует (уменьшает и/или блокирует) крысиный NGF-зависимое выживание мышиных нейронов Е 13.5 тройничного нерва с IC50 (в присутствии приблизительно 1,5 пМ NGF), составляющей приблизительно 30 пМ, 25 пМ, 20 пМ, 15 пМ, 10 пМ, 5 пМ, 4 пМ, 3 пМ, 2 пМ, 1 пМ, или менее; и/или (f) и/или связывает NGF с более высоким сродством, чем рецептор trkA. В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам (таким как антитело), где полипептиды (а) связываются с NGF (таким как человеческий NGF) с KD менее чем приблизительно 2 нМ(например, приблизительно 1 нМ, 800 пМ, 600 пМ, 400 пМ, 200 пМ, 100 пМ, 90 пМ, 80 пМ, 70 пМ, 60 пМ, 50 пМ, или менее), и/или koff, менее чем приблизительно 610-5 с 1; и/или (b) ингибируют человеческий NGF-зависимое выживание мьшиных нейронов Е 13.5 тройничного нерва с IC50 (в присутствии приблизительно 15 пМ NGF), составляющей приблизительно 200 пМ, 150 пМ, 100 пМ, 80 пМ, 60 пМ, 40 пМ,20 пМ, 10 пМ, или менее; и/или (с) ингибируют человеческий NGF-зависимое выживание мышиных нейронов Е 13.5 тройничного нерва с IC50 (в присутствии приблизительно 1,5 пМ NGF), составляющей приблизительно 50 пМ, 40 пМ, 30 пМ, 10 пМ, 20 пМ, 10 пМ, 5 пМ, 2 пМ, 1 пМ, или менее; и/или связывают NGF с более высоким сродством, чем рецептор trkA. В некоторых воплощениях полипептиды (а) связывают NGF с KD, менее чем приблизительно 2 нМ; и/или (b) ингибируют человеческий NGFзависимое выживание мышиных нейронов Е 13.5 тройничного нерва с IC50, составляющей приблизительно 100 пМ или менее, где IC50 измеряют в присутствии приблизительно 15 пМ NGF; и/или (с) ингибируют человеческий NGF-зависимое выживание мышиных нейронов Е 13.5 тройничного нерва с IC50, составляющей приблизительно 10 пМ или менее, где IC50 измеряют в присутствии приблизительно 1,5 пМNGF. В некоторых воплощениях полипептиды (а) связывают NGF с KD менее чем приблизительно 100 пМ; и/или (b) ингибируют человеческий NGF-зависимое выживание мышиных нейронов Е 13.5 тройничного нерва с IC50, составляющей приблизительно 20 пМ или менее, где IC50 измеряют в присутствии приблизительно 15 пМ NGF; и/или (с) ингибируют человеческий NGF-зависимое выживание мышиных нейронов Е 13.5 тройничного нерва с IC50, составляющей приблизительно 2 пМ или менее, где IC50 измеряют в присутствии приблизительно 1,5 пМ. Как следует из данного описания, из настоящего изобретения особо исключены полипептидные воплощения, включающие в себя аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности мышиного моноклонального антитела 911. Расширенные последовательности CDRMab 911 показаны на фиг. 1 А и 1 В, и в SEQ ID NO: 9-14. В некоторых воплощениях данное изобретение относится к любому из вышеуказанных полипептидов или антител, где полипептид (такой как антитело) является также выделенным. В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) является, по существу, очищенным. В следующих воплощениях полипептид (такой как антитело) является аффинно зрелым. В других воплощениях антитело является антагонистическим антителом. В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) содержит человеческие каркасные последовательности. В следующих воплощениях полипептид (такой как антитело) в каркасной части содержит один или несколько остатков, не характерных для человека. В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) связывается с NGF (таким как человеческий NGF) с KD 2 нМ или менее. В некоторых воплощениях полипептид содержит одну или несколько (например, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8 или более) человеческих аминокислотных замен в отличной от человеческой аминокислотной последовательности (такой как последовательность вариабельной области, например, последовательностьCDR, такая как каркасная последовательность). В некоторых воплощениях полипептид содержит по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, или по меньшей мере 3, 4, 5, 6 или больше аминокислотных замен в аминокислотной последовательности исходного полипептида (такой как аминокислотная последовательность антитела 911, например, одна или несколько из SED ID NO: 9-14). В некоторых воплощениях связывающее сродство антитела изменяется (в некоторых воплощениях повышается) по сравнению со сродством исходного антитела (такого, как Mab 911). В следующих воплощениях связывающее сродство антитела ниже связывающего сродства рецептора trkA NGF (такого, как человеческий NGF). В некоторых воплощениях полипептиды могут представлять собой антитела. В некоторых воплощениях антитела представляют собой человеческие антитела. В других воплощениях антитела представляют собой гуманизированные антитела. В следующих воплощениях антитела представляют собой моноклональные антитела. В некоторых воплощениях антитело представляет собой аффинно зрелое антитело. Данное изобретение относится к полинуклеотидам (в том числе выделенным полинуклеотидам),включающим в себя полинуклеотиды, кодирующие указанные выше воплощения. В другом аспекте данное изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, включающему в себя полинуклеотид, кодирующий фрагмент или участок антитела E3 (в данном описании также называется "E3"). В одном воплощении фрагмент представляет собой легкую цепь антитела E3, как показано на фиг. 1 В. В другом воплощении фрагмент представляет собой тяжелую цепь антитела E3, как показано на фиг. 1 А. В следующем воплощении фрагмент содержит один или несколько вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи антитела E3. В следующем воплощении фрагмент содержит один или несколько гипервариабельных областей (CDR) легкой и/или тяжелой цепи антитела E3, как показано на фиг. 1 А и 1 В. В другом аспекте данное изобретение представляет собой выделенный полинуклеотид, включающий в себя полинуклеотид, кодирующий антитело E3. В некоторых воплощениях полинуклеотид включает в себя один из полинуклеотидов, показанных на фиг. 2 и 3, или оба. В другом аспекте данное изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который кодирует легкую цепь E3 с депозитным номером АТССРТА-4893 или АТССРТА-4894. В другом аспекте данное изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который кодирует тяжелую цепь E3 с депозитным номером АТССРТА-4895. В следующем аспекте данное изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему (а) полинуклеотид с депозитным номером АТССРТА-4893 или РТА-4894, кодирующий вариабельную область, и (b) полинуклеотид с депозитным номером АТССРТА-4895, кодирующий вариабельную область. В другом аспекте данное изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему (а) полинуклеотид с депозитным номером АТССРТА 4893 или РТА-4894, кодирующий один или несколько CDR; и/или (b) полинуклеотид с депозитным номером АТССРТА-4895, кодирующий один или несколько CDR. В другом аспекте данное изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим описанные здесь антитела (в том числе фрагменты антител) или полипептиды. В другом аспекте данное изобретение относится к векторам (в том числе векторам экспрессии и клонирования) и клеткам-хозяевам, содержащим любой раскрытый здесь полинуклеотид. Как видно из данного описания, в настоящее изобретение особо включены полинуклеотидные воплощения, включающие в себя полинуклеотидную последовательность, идентичную полинуклеотидной последовательности мышиного моноклонального антитела 911. Расширенные последовательности CDRMab 911 показаны на фиг. 1 А и 1 В и в SEQ ID NO: 9-14. В другом аспекте данное изобретение относится к клетке-хозяину, содержащему полинуклеотид,кодирующий легкую цепь E3, и полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь E3, где полинуклеотид(ы),кодирующий легкую цепь E3, имеет депозитный номер АТССРТА-4893 и/или АТССРТА-4894, а полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь E3, имеет депозитный номер АТССРТА-4895. В некоторых воплощениях клетка-хозяин содержит полинуклеотид, включающий в себя (а) полинуклеотид с депозитным номером АТССРТА-4893 или РТА-4894, кодирующий вариабельную область, и/или (b) полинуклеотид с депозитным номером АТССРТА-4895, кодирующий вариабельную область. В некоторых воплощениях клетка-хозяин содержит полинуклеотид, кодирующий (а) один или несколько CDR,кодируемых полинуклеотидом с депозитным номером АТССРТА-4893 или РТА-4894; и/или (b) один или несколько CDR, кодируемых полинуклеотидом с депозитным номером АТССРТА-4895. В некоторых воплощениях клетка-хозяин является клеткой млекопитающего. В другом аспекте данное изобретение относится к комплексу NGF с антителом E3. В другом аспекте комплекс является выделенным. В другом аспекте комплекс является по существу очищенным. В другом аспекте данное изобретение относится к комплексу NGF с любым из описанных здесь антител или полипептидов. В другом аспекте комплекс является выделенным. В другом аспекте комплекс является по существу очищенным. В другом аспекте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей любой из описанных здесь полипептидов (в том числе антител, таких как антитело E3) или полинуклеотидов, такой как фармацевтическая композиция, содержащая антитело E3, или антитело, содержащее фрагмент антитела E3, и фармацевтически приемлемый наполнитель.-9 011479 В другом аспекте данное изобретение относится к способу получения антитела E3, включающему в себя получение клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, который кодирует антитело E3; культивирование клетки-хозяина или ее потомства в условиях, которые позволяют получить антитело E3; и очистку антитела E3. В некоторых воплощениях вектор экспрессии содержит одну из полинуклеотидных последовательностей, показанных на фиг. 2 и 3, или обе эти последовательности. В другом аспекте данное изобретение относится к способу получения антитела E3, включающему в себя экспрессию полинуклеотида, кодирующего легкую цепь E3, и полинуклеотида, кодирующего тяжелую цепь E3 в подходящей клетке, где полинуклеотид, кодирующий легкую цепь E3, имеет депозитный номер АТССРТА-4893 и/или АТССРТА-4894, а полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь E3,имеет депозитный номер АТССРТА-4 895; как правило, с последующим извлечением и/или выделением антитела. В другом аспекте данное изобретение относится к способам получения описанных здесь полипептидов (таких как антитела) путем экспрессии одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих антитело (причем легкая и тяжелая цепи могут экспрессироваться раздельно или вместе, из одного вектора), в подходящей клетке, как правило, с последующим извлечением и/или выделением представляющих интерес антител или полипептидов. В другом аспекте данное изобретение относится к способу подавления биологической активностиNGF (такого, как человеческий NGF) с помощью любого из описанных здесь полипептидов (включая антитела, такие как антитело E3). В одном воплощении способ включает в себя приведение в контакт человеческого фактора роста нервов с любым из описанных здесь полипептидов (включая антитело E3),в результате чего активность NGF (например, активность человеческого фактора роста нервов) подавляется, уменьшается, блокируется или ослабляется. В другом аспекте данное изобретение относится к способу детекции NGF с помощью любого из описанных здесь полипептидов (включая антитела, такие как антитело E3). Присутствие NGF определяют путем детекции комплекса NGF с любым из описанных здесь полипептидов (таких как антитело E3). Термин "детекция" в данном описании включает в себя качественное и/или количественное определение(измеряемых уровней) по сравнению с контролем, или без сравнения с контролем. В другом аспекте данное изобретение относится к способу лечения боли путем введения эффективного количества композиции, содержащей антитело E3, или любое из описанных здесь полипептидных(включая антитела) или полинуклеотидных воплощений. В некоторых воплощениях боль представляет собой послеоперационную боль. В другом аспекте данное изобретение относится к способу профилактики или лечения у субъекта боли при ревматоидном артрите путем введения субъекту эффективного количества антагонистического антитела против NGF. Согласно данному изобретению, было показано, что антагонистическое антитело против NGF может ингибировать или блокировать боль, связанную с ревматоидным артритом. В некоторых воплощениях боль уменьшается в течение приблизительно 24 ч после введения антагонистического антитела против NGF. В некоторых воплощениях боль уменьшается в течение приблизительно 4 дней после введения антагонистического антитела против NGF. В некоторых воплощениях боль уменьшается до появления симптомов улучшения воспалительного состояния у субъекта, или в отсутствие таких симптомов. В другом аспекте данное изобретение относится к способам снижения частоты возникновения боли при ревматоидном артрите, уменьшения боли при ревматоидном артрите, подавления боли при ревматоидном артрите, облегчения боли при ревматоидном артрите, и/или замедления возникновения, развития или прогрессирования боли при ревматоидном артрите у субъекта, причем указанные способы включают в себя введение субъекту эффективного количества антагонистического антитела против NGF. В другом аспекте данное изобретение относится к способу профилактики или лечения у субъекта боли при остеоартрите путем введения субъекту эффективного количества антагонистического антитела против NGF. В другом аспекте данное изобретение относится к способам лечения у субъекта воспалительной кахексии (потери веса), связанной с ревматоидным артритом, включающим в себя введение эффективного количества антагонистического антитела против NGF. В другом аспекте данное изобретение относится к способам снижения частоты возникновения боли при остеоартрите, уменьшения боли при остеоартрите,подавления боли при остеоартрите, облегчения боли при остеоартрите, и/или замедления возникновения,развития или прогрессирования боли при остеоартрите у субъекта, причем указанные способы включают в себя введение субъекту эффективного количества антагонистического антитела против NGF. В другом аспекте данное изобретение относится к наборам и композициям, включающим в себя одну или несколько из описанных здесь композиций. Упомянутые наборы, как правило, с подходящим комплектованием и снабженные соответствующими инструкциями, можно использовать для проведения любого из описанных здесь способов. Данное изобретение также относится к описанным композициям и наборам для любого описанного здесь применения, например, в качестве лекарственного средства, и/или для промышленного получения лекарственного средства.- 10011479 Краткое описание чертежей Фиг. 1 А: аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела E3(обозначенная "6" и "5+аффинно-зрелый H3"). CDR Chothia и CDR Kabat подчеркнуты и выделены жирным шрифтом и курсивом, соответственно. На фиг. 1 А также сравниваются первичные структуры следующих аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи: (2) акцепторной последовательности человеческой зародышевой линии VH4-59 (обозначенной "VH4-59" или "2"); (3) акцепторных последовательностей с привитыми расширенными CDR мышиного антитела 911 (обозначенных "CDR-привитые" или "3"); (4) CDR-привитых акцепторных последовательностей, содержащих замену V71K (обозначенных "3+одна каркасная мутация" или "4"); (5) клона, содержащего аффинно зрелые CDR H1 и Н 2 (обозначенного "5" или "4+аффинно-зрелые H1, H2"); и антитела E3 (как описано выше). Фиг. 1 В: аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела E3 (обозначенная "5" или "4+аффинно-зрелый L3"). CDR Chothia и CDR Rabat подчеркнуты и выделены жирным шрифтом и курсивом, соответственно. На фиг. 1 В также сравниваются первичные структуры следующих аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой цепи: (2) акцепторной последовательности человеческой зародышевой линии 08 (обозначенной "08" или "2"); (3) акцепторных последовательностей с привитыми расширенными CDR мышиного антитела 911 (обозначенных "CDR-привитые" или "3"); (4) CDR-привитых акцепторных последовательностей (обозначенных "3+аффинно-зрелые L1,L2" или "4"); (5) клона, содержащего аффинно-зрелые CDR L1 и L2 (обозначенного "5" или "4+аффиннозрелый L3"); и антитела E3 (как описано выше). Фиг. 2: полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела E3. Фиг. 3: полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела E3. Фиг. 4: график, изображающий NGF-зависимое выживание нейронов Е 13.5 в присутствии разных концентраций человеческого и крысиного NGF. На оси X откладывают значения концентрации NGF(нг/мл), а на оси Y - количество нейронов. Фиг. 5: график, в котором сравнивается блокирующие действие различных Fab на NGF в присутствии либо 0,04 нг/мл человеческого NGF (приблизительно 1,5 пМ; нижняя часть), либо 0,4 нг/мл человеческого NGF (приблизительно 15 пМ; верхняя часть). Оценивают выживание мышиных нейронов тройничного нерва Е 13.5 при разных концентрациях Fab E3; Fab мышиного 911; Fab H19-L129 и Fab 8L26D5. IC50 (пМ) рассчитывают для каждого Fab при каждой концентрации NGF, результаты приведены в таблице 9. Fab E3 сильно блокирует человеческий NGF-зависимое выживание нейронов тройничного нерва, при этом IC50 составляет приблизительно 21 пМ в присутствии 15 пМ человеческого NGF, и приблизительно 1,2 пМ в присутствии 1,5 пМ человеческого NGF. Fab 3C и H19-L129 также сильно блокируют человеческий NGF-зависимое выживание нейронов тройничного нерва. В обеих частях на оси X откладывают значения концентрации антитела (нМ), а на оси Y - количество нейронов. КонцентрацияNGF 1,5 пМ близка к IC50, тогда как 15 пМ - это насыщающая концентрация NGF. Фиг. 6: график, в котором сравнивается блокирующие действие различных Fab на NGF в присутствии либо 0,04 нг/мл крысиного NGF (приблизительно 1,5 пМ; нижняя часть), либо 0,4 нг/мл крысиногоNGF (приблизительно 15 пМ; верхняя часть). Оценивают выживание мышиных нейронов тройничного нерва Е 13,5 при разных концентрациях Fab E3; Fab мышиного 911; Fab H19-L129 и Fab 8L2-6D5, как описано выше. IC50 (пМ) рассчитывают для каждого Fab при каждой концентрации NGF, результаты приведены в таблице 9. Fab E3 сильно блокирует человеческий NGF-зависимое выживание нейронов тройничного нерва, при этом IC50 составляет приблизительно 31,6 пМ в присутствии 15 пМ крысиногоNGF, и приблизительно 1,3 пМ в присутствии 1,5 пМ крысиного NGF. Fab 3 С и H19-L129 также сильно блокируют крысиный NGF-зависимое выживание нейронов тройничного нерва. Концентрация NGF 1,5 пМ близка к IC50, тогда как 15 пМ - это насыщающая концентрация NGF. В обеих частях на оси X откладывают значения концентрации антитела (нМ), а на оси Y - количество нейронов. Фиг. 7: график, изображающий боль в состоянии покоя, оцененную через 24 ч после хирургической операции, и показывающий, что введение 0,02 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,6 мг/кг или 1 мг/кг антитела E3 противNGF уменьшает боль. означает статистически значимое различие (р 0,5) по сравнению с отрицательным контролем. Фиг. 8: график, изображающий боль в состоянии покоя, оцененную через 24 ч после хирургической операции, и показывающий, что введение 0,5 мг/кг антитела E3 против NGF значительно (р 0,005) уменьшает боль в состоянии покоя, если введение осуществляют через два часа после хирургической операции. Фиг. 9: график, демонстрирующий результаты анализа BIAcore связывающего сродства мышиного антитела 911 (Fab) к человеческому NGF. Мышиное антитело 911 связывает NGF с KD 3,7 нМ, koff 8,410-5c-1 и kon 2,2104 M-1c-1. Фиг. 10: график, демонстрирующий результаты анализа BIAcore связывающего сродства антителаE3 (Fab) (называемого "3E Fab") к человеческому NGF. E3 связывает человеческий NGF с KD, составляющей приблизительно 0,07 нМ (kon приблизительно равна 6,0105 M-1c-1, и koff приблизительно равна 4,210-5c-1). Фиг. 11: график, демонстрирующий, что антитело E3 блокирует взаимодействие NGF с рецепторами trkA и р 75, это оценивают по проценту связывания NGF с trkA (черные кружки) и NGF с р 75 (незакрашенные квадраты). На оси X откладывают значения концентрации антитела 3E (Fab), а на оси Y - связывание NGF (процент от максимального RU). Повышенные концентрации Fab E3 блокируют взаимодействие NGF как с р 75, так и с trkA, как показывает уменьшение сигнала (измеряется в RU). Если концентрация антитела E3 (Fab) равна концентрации NGF, связывание NGF не наблюдается (сигнал равен нулю). Фиг. 12: график, изображающий способность целого антитела E3 и Fab E3 блокировать человеческий NGF. Оценивают выживание мышиных нейронов тройничного нерва Е 13.5 в присутствии человеческого NGF и разных концентраций Fab E3 и антитела E3. На оси X откладывают количество участков связывания NGF (нМ), а на оси Y - нормализованное количество нейронов тройничного нерва (TG). Целое антитело E3 и Fab 3E демонстрируют одинаковые уровни ингибирования NGF-зависимого выживания нейронов тройничного нерва, если концентрацию целого антитела и Fab нормализуют по количеству участков связывания NGF (Fab имеет один участок связывания, а целое антитело имеет два участка связывания). Фиг. 13: график, демонстрирующий способность различных концентраций (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032,0,0064, 0,00128 и 0,0 нМ) антитела E3 (закрашенные треугольники; называемого "3E"), антитела 911 (закрашенные кружки) и рецептора иммуноадгезина trkA (заштрихованные квадраты; называемого "trkAFc") ингибировать NGF-зависимое выживание нейронов тройничного нерва Е 13,5 в присутствии 0,4 нг/мл человеческого NGF (условия насыщения). На оси X откладывают значения концентрации антителаNGF гораздо лучше, чем мышиное моноклональное антитело 911 против NGF или иммуноадгезин trkA. Фиг. 14: график, демонстрирующий, что антагонистическое антитело E3 против NGF (называемое на фигуре "3E") или Fab 911 не ингибируют выживание нейронов, стимулированное NT3, NT4/5 и MSP,даже при концентрации антитела 200 нМ. Данные представлены как средний процент выживания в культуре через 48 ч (каждая точка: среднее значение (n=3)стандартная ошибка) по сравнению с выживанием, наблюдаемым в положительном контроле каждого эксперимента (100% выживание нейронов тройничного нерва, выращиваемых в присутствии насыщающей концентрации NGF). Различные концентрации (20, 2 или 0,2 нМ) E3 Fab (обозначаемого на фиг. "3E") и мышиного антитела 911 Fab используют в отсутствие нейротрофина ("контроль") и в присутствии 400 пМ NGF ("NGF-400 пМ"), 10 нМ NT3 ("NT310 нМ") или 600 пМ MSP ("MSP-600 пМ"). Фиг. 15: график, демонстрирующий, что антагонистическое антитело E3 (Fab или целое антитело) против NGF (называемое на фиг. "3E") или мышиное антитело 911 (Fab или целое антитело) не ингибируют выживание нейронов, стимулированное NT3, NT4/5 и MSP, даже при концентрации антитела 200 нМ. Различные концентрации (200 нМ и 80 нМ) Fab и целого антитела E3 и Fab и целого мышиного антитела 911 используют в отсутствие нейротрофинов ("отсутствие факторов") и в присутствии 400 пМNGF ("NGF-400 пМ"), 10 нМ NT3 ("NT3-10 нМ") или 600 пМ MSP ("MSP-600 пМ"). Фиг. 16: график, демонстрирующий, что антагонистическое антитело E3 против NGF, или Fab E3,не ингибируют выживание нодозных нейронов Е 17, стимулированное BDNF, NT4/5 или LIF. Также анализируют мышиное антагонистическое антитело против NGF 911 и получают такие же результаты. Различные концентрации (200 нМ или 80 нМ) целого антитела E3 (обозначаемого на фиг. "3E"), Fab E3, целого антитела 911, или Fab 911, анализируют в отсутствие нейротрофинов ("отсутствие факторов") и в присутствии 400 пМ BDNF ("BDNF-400 пМ"), 400 пМ NT4/5 ("NT4/5-400 пМ") или 2,5 нМ LIF ("LIF-2,5 нМ"). Фиг. 17: график, демонстрирующий, что антагонистическое антитело E3 против NGF, или Fab E3,не ингибируют выживание нодозных нейронов Е 17, стимулированное BDNF, NT4/5 или LIF. Различные концентрации (200 нМ, 20 нМ, 2 нМ) Fab E3 (обозначаемого на фиг. "3E") или Fab 911 анализируют в отсутствие нейротрофинов ("контроль") и в присутствии 400 пМ BDNF ("BDNF-400 пМ"), 400 пМ NT4/5("NT4/5-400 пМ") или 2,5 нМ LIF ("LIF-2,5 нМ"). Фиг. 18: график, демонстрирующий ноцицептивный ответ у артритических крыс (модель с ревматоидным артритом) на 14 и 19 день после введения антител против NGF (E3 и 911). Артритическим мышам вводят E3 (1 мг/кг, в/в, на 14 и 19 день), 911 (10 мг/кг, в/в, на 14 и 19 день), или indo (индометацин 3 мг/кг, п.о., ежедневно в течение 10 дней). Значения интенсивности голосового сигнала выражают в mV как среднее значениеs.е.m. Фиг. 19: график, демонстрирующий влияние антител против NGF на массу тела артритических крыс (модель с ревматоидным артритом) на 14 и 19 день после введения антител против NGF. Артритическим мышам вводят E3 (1 мг/кг, в/в, на 14 и 19 день), 911 (10 мг/кг, в/в, на 14 и 19 день) или indo (индометацин 3 мг/кг, п.о., ежедневно в течение 10 дней). Значения массы тела выражают в граммах как- 12011479 среднее значениеs.e.m. Фиг. 20: график, демонстрирующий ноцицептивный ответ у артритических крыс (модель с ревматоидным артритом) на 14 и 18 день после введения разных доз антитела E3 против NGF (0,003 мг/кг, 0,03 мг/кг, 0,3 мг/кг и 5 мг/кг). Значения интенсивности голосового сигнала выражают в mV как среднее значениеs.е.m. Фиг. 21: график, демонстрирующий влияние антитела E3 против NGF на изменение массы на 14 день (нормализация по 14 дню) у артритических крыс (модель с ревматоидным артритом) на 14 и 18 день после введения разных доз антитела E3 против NGF (0,03 мг/кг, 0,3 мг/кг и 5 мг/кг). Фиг. 22: график, демонстрирующий влияние антител против NGF на потерю массу тела у артритических крыс (модель с ревматоидным артритом) на 14 и 18 день после введения разных доз антитела E3 против NGF (0,03 мг/кг, 0,3 мг/кг и 5 мг/кг). Значения массы тела нормализуют по 0 дню. Фиг. 23: аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи E3 (фиг. 23 А) и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (фиг. 23 В) изображены с использованием последовательной нумерации, нумерации Kabat и нумерации Chothia. Подробное описание изобретения Раскрытое в данном описании изобретение относится к антагонистическим антителам против NGF,которые связывают NGF (такой как человеческий NGF) с высоким сродством. Далее, данное изобретение относится к антителам и полипептидам, полученным из E3, которые связывают NGF, а также к способам получения и применения указанных антител. В некоторых воплощениях данное изобретение относится к гуманизированному антителу, E3, которое связывается с фактором роста нервов ("NGF"), а также к способам получения и применения указанного антитела. Данное изобретение также относится к полипептидам E3 (в том числе антителам), которые связывают NGF, и полинуклеотидам, кодирующим антитела и/или полипептид E3. Раскрытое в данном описании изобретение также относится к способам профилактики и/или лечения боли при ревматоидном артрите у субъекта путем введения терапевтически эффективного количества антагонистического антитела против NGF. Раскрытое в данном описании изобретение также относится к способам профилактики и/или лечения боли при остеоартрите у субъекта путем введения терапевтически эффективного количества антагонистического антитела против NGF. Данное изобретение также относится к способам регуляции сродства антитела и способы характеристики участка CDR. Общие методы Если не указано иначе, в настоящем изобретении используются традиционные методы молекулярной биологии (в том числе, рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые хорошо известны специалистам в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе, например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al.,1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell"Антитело" представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связывать мишень, например углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и др., при посредстве по меньшей мере одного антигенраспознающего участка, расположенного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. В данном описании упомянутый термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но и их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одиночные цепи (ScFv),мутанты, гибридные белки, содержащие фрагмент антитела, и любые другие модифицированные конфигурации молекул иммуноглобулина, которые содержат антигенраспознающий участок. Антитело включает в себя антитело любого класса, например, IgG, IgA или IgM (или соответствующего подкласса), и антитело не должно относится к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной- 13011479 последовательности константного домена тяжелой цепи антитела, иммуноглобулины относят к разным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, некоторые из них можно дополнительно подразделить на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4,IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие разным классам иммуноглобулинов, называют альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации иммуноглобулинов разных классов хорошо известны."Fv" представляет собой фрагмент антитела, который содержит целый антигенраспознающий и антигенсвязывающий участок. В двухцепочечных Fv данный участок включает в себя димер, содержащий один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи, связанные прочной нековалентной связью. В одноцепочечных Fv вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи могут быть связаны ковалентно через гибкий пептидный мостик, в результате легкая и тяжелая цепи могут образовывать димерную структуру, аналогичную структуре двухцепочечных Fv. В данной конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя специфичность связывания антигена на поверхности димера VH-VL. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только 3 CDR, специфичных для антигена) способен распознавать и связывать антиген, но, как правило, с более низким сродством, чем целый связывающий участок. Фрагмент Fab также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН 1) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена СН 1 тяжелой цепи, включающих в себя один или несколько цистеиновых остатков из шарнирного участка антитела. Термин "моноклональное антитело" относится к гомогенной популяции антител, где моноклональное антитело содержит аминокислоты (природные и неприродные), которые участвуют в селективном связывании антигена. Популяция моноклональных антител является высокоспецифичной, направленной против одной антигенной детерминанты. Термин "моноклональное антитело" охватывает не только интактные и полноразмерные моноклональные антитела, но и их фрагменты (такие как Fab, Fab', F (ab')2,Fv), одиночные цепи (ScFv), мутанты, гибридные белки, содержащие фрагмент антитела, и любые другие модифицированные конфигурации молекул иммуноглобулина, которые содержат антигенраспознающий участок требуемой специфичности и могут связываться с антигеном. Подразумевается, что отсутствуют ограничения, касающиеся источника антитела или способа его получения (например, с использованием гибридом, фаговой селекции, рекомбинатной экспрессии, трансгенных животных и др.). В данном описании термин "человеческое антитело" относится к антителу, аминокислотная последовательность которого аналогична аминокислотной последовательности антитела, продуцируемого в организме человека и/или полученного с помощью способов получения человеческого антитела, известных в данной области или приведенных в настоящем описании. Данное определение человеческого антитела включает в себя антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид человеческой тяжелой цепи или по меньшей мере один полипептид человеческой легкой цепи. Примером такого антитела может служить антитело, в состав которого входят полипептиды мышиной легкой цепи и человеческой тяжелой цепи. В данной области существуют разные способы получения человеческих антител. В одном воплощении человеческое антитело выбрано из антител, экспрессируемых на основе фаговой библиотеки (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14: 309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95: 6157-6162;Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Человеческие антитела также можно получить путем введения локусов человеческих иммуноглобулинов трансгенным животным, например мышам, у которых гены эндогенных иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. Данный подход описан в патентах США 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425 и 5661016. Альтернативно, человеческое антитело можно получить путем иммортализации человеческих В-лимфоцитов, которые продуцируют антитела против целевого антигена (такие Влимфоциты можно выделить из крови субъекта, или их можно получить путем иммунизации in vitro). См., например, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner etal., 1991, J Immunol., 147 (1): 86-95; и патент США 5750373. Термин "химерные антитела" относится к антителам, в которых один фрагмент каждой из аминокислотных последовательностей тяжелых и легких цепей гомологичен соответствующим последовательностям антител, полученных от определенных видов, или принадлежащих к определенному классу, тогда как другой фрагмент цепи гомологичен соответствующим последовательностям другого вида или класса. Как правило, в данных химерных антителах вариабельная область как легкой, так и тяжелой цепи имитирует вариабельные области антител, полученных от одного вида млекопитающих, тогда как константные участки гомологичны последовательностям антител, полученных от другого вида млекопитающих. Очевидное преимущество таких химерных форм заключается в том, что, например, вариабельные области могут быть получены из известных в настоящее время источников с использованием легкодоступных гибридом или В-клеток из организмов-хозяев, отличных от человека, в сочетании с константными участками, полученными из, например, препаратов клеток человека. В то время как вариабельная область имеет преимущество, заключающееся в простоте получения, причем источник не влияет на специфичность, константный участок человеческого происхождения с меньшей вероятностью вызывает иммун- 14011479 ный ответ у субъекта-человека при введении антител, чем отличный от человеческого константный участок. Однако данное определение не ограничивается приведенным примером."Функциональный Fc-фрагмент" обладает по меньшей мере одной эффекторной функцией Fcучастка нативной последовательности. Примеры "эффекторных функций" включают в себя связываниеC1q; комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC); связывание Fc-рецептора; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, рецепторов В-клеток, BCR) и др. Как правило, для выполнения таких эффекторных функций нужно, чтобы Fc-фрагмент был соединен со связывающим доменом (например,вариабельным доменом антитела), анализ указанных эффекторных функций можно проводить с помощью разных методов, известных в данной области."Fc-участок нативной последовательности" содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-участка, обнаруженного в природе. "Вариантный Fcучасток" содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности Fc-участка, по меньшей мере, модификацией одной аминокислоты, и сохраняет по меньшей мере одну эффекторную функцию Fc-участка нативной последовательности. Предпочтительно вариантный Fc-участок содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с Fc-участком нативной последовательности или с Fc-участком исходного полипептида, например, приблизительно от одной до десяти аминокислотных замен, и, предпочтительно, приблизительно от одной до пяти аминокислотных замен в Fc-участке нативной последовательности или в Fc-участке исходного полипептида. В данном описании последовательность вариантного Fc-участка предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 95%, идентична последовательности Fc-участка нативной последовательности и/или Fc-участка исходного полипептида. В данном описании термин "антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" и"ADCC" относится к клеточно-опосредованной реакции, в которой неспецифичные цитотоксичные клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcR) (например, натуральные киллеры (NK-клетки), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на поверхности клетки-мишени и затем вызывают лизис данной клетки. Активность ADCC представляющей интерес молекулы можно оценить с помощью анализа ADCC in vitro, например, описанного в патенте США 5500362 или 5821337. Эффекторные клетки,пригодные для таких анализов, включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и NK-клетки. Альтернативно, или дополнительно, активность ADCC представляющей интерес молекулы можно оценить in vivo, например, на животной модели, как раскрыто в Clynes et al., 1998, PNAS (USA),95: 652-656. В данном описании термин "Fc-рецептор" и "FcR" относится к рецептору, который связывается сIgG (гамма-рецептор) и включает в себя рецепторы подклассов FcRI, FcRII, и FcRIII, в том числе аллельные варианты и, альтернативно, сплайсированные формы данных рецеторов. Рецепторы FcRII включают в себя FcRIIA ("активирующий рецептор") и FcRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые имеют подобные аминокислотные последовательности, отличающиеся, главным образом, цитоплазматическими доменами. Обзоры по FcR опубликованы в Ravetch and Kinet, 1991,Ann. Rev. Immunol., 9: 457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4: 25-34; и de Haas et al., 1995, J. Lab.Clin. Med., 126:330-41. "FcR" также включают в себя неонатальный рецетор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG эмбриону (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117: 587; и Kim et al., 1994, J Immunol., 24: 249). Термин "комплемент-зависимая цитотоксичность" и "CDC" относится к способности вызывать лизис мишени в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется при связывании первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антитела), находящейся в комплексе с распознаваемым антигеном. Активацию комплемента можно оценить с помощью анализа CDC,например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996). В данном описании термины "E3", "3E" и "антитело E3" используются как взаимозаменяемые и относятся к антителу, содержащему аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, показанные на фиг. 1 А (SEQ ID NO: 1) и 1B (SEQ ID NO: 2), соответственно. Фрагменты CDR антитела E3 (в том числе CDR Chothia и Kabat) изображены в виде диаграмм на фиг. 1 А и 1 В. На фиг. 2 и 3 показаны полинуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепи, соответственно, содержащие вариабельные области тяжелой и легкой цепей, показанные на фиг. 1 А и 1 В, соответственно. Получение и характеристика E3 описаны в примерах. E3 выполняет разные биологические функции, которые включают в себя, без ограничения, способность связываться с NGF и ингибировать биологическую активность NGF и/или нижестоящий путь (пути), связанный с передачей сигнала, опосредованнойNGF; и способность ингибировать NGF-зависимое выживание мышиных нейронов тройничного нерва Е 13.5. Как указано в данном описании, антитела настоящего изобретения могут иметь одну или несколь- 15011479 ко из упомянутых характеристик. В некоторых воплощениях термин "E3" относится к иммуноглобулину,кодируемому (а) полинуклеотидом, кодирующим легкую цепь E3, который имеет депозитный номер АТССРТА-4893 или АТССРТА-4894, и (b) полинуклеотидом, кодирующим тяжелую цепь E3, который имеет депозитный номер АТССРТА-4895. В данном описании термин "иммуноспецифическое" связывание антитела относится к антигенспецифическому взаимодействию, происходящему между антигенсвязывающим центром антитела и конкретным антигеном, распознаваемым антителом (т.е. антитело взаимодействует с определенным белком в ELISA или другом иммунологическом анализе и не взаимодействует на детектируемом уровне с неродственными белками). Термины "специфическое связывание" или "предпочтительное связывание" (в данном описании эти термины используются как взаимозаменяемые) эпитопа с антителом или полипептидом хорошо известны в данной области, также хорошо известны способы определения такого специфического или предпочтительного связывания. Говорят, что молекула "специфически связывается" или "предпочтительно связывается", если она взаимодействует или соединяется с конкретной клеткой, или с конкретным веществом,с более высокой частотой, более высокой скоростью, большей продолжительностью и/или большим сродством, чем с другими клетками или веществами. Антитело "специфически связывается" или "предпочтительно связывается" с мишенью, если данное связывание происходит с более высоким сродством,более высокой авидностью, большей скоростью, и/или большей продолжительностью, чем связывание с другими веществами. Например, антитело, которое специфически или предпочтительно связывается с эпитопом NGF, представляет собой антитело, которое связывается с данным эпитопом с более высоким сродством, более высокой авидностью, большей скоростью, и/или большей продолжительностью, чем с другими эпитопами NGF, или эпитопами, не являющимися NGF. При толковании данного определения следует понимать, что, например, антитело (или фрагмент, или эпитоп), которое специфически или предпочтительно связывается с первой мишенью может необязательно специфически или предпочтительно связываться с другой мишенью. Как таковое, "специфическое связывание" или "предпочтительное связывание" необязательно является исключительным связыванием (хотя может включать его в себя). Как правило, но необязательно, при упоминании связывания имеется в виду предпочтительное связывание. Термины "полипептид", "олигопептид", "пептид" и "белок" используются в данном описании как взаимозаменяемые и относятся к полимерам любой длины, в которых мономерами являются аминокислоты. Такой полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и отличные от аминокислот компоненты. Данные термины также охватывают естественно или искусственно модифицированные аминокислотные полимеры, например, в результате образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования, или любой другой процедуры или модификации, такой как конъюгирование с меченным компонентом. Данное определение также охватывает, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислот (в том числе, например, неприродные аминокислоты и др.), а также другие модификации,известные в данной области. Следует понимать, что, поскольку полипептиды данного изобретения в основном представляют собой антитела, они могут находиться в виде одиночных цепей, или ассоциированных цепей. Термины "полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота" используются в данном описании как взаимозаменяемые, относятся к полимерам любой длины, в которых мономерами являются нуклеотиды, и включают в себя ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания, и/или их аналоги, или любой субстрат, который может быть введен в полимер с помощью ДНК- или РНК-полимеразы. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Модификация структуры нуклеотида может быть осуществлена до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может прерываться компонентами, отличными от нуклеотидов. Полинуклеотид также можно модифицировать после полимеризации, например, конъюгацией меченным компонентом. Другие типы модификации включают в себя, например, "кэпы", замену одного или нескольких природных нуклеотидов аналогами, межнуклеотидные модификации, такие как, например, незаряженные мостики (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и др.) и заряженные мостики (например, фосфортиоаты, фосфордитиоаты и др.), фрагменты боковых цепей, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, ply-L-lysine и др.), интеркаляторы (например, акридин, псорален и др.), хелатирующие средства (например, металлы,радиоактивные металлы, бор, окисленные металлы и др.), алкиляторы, модифицированые мостики (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и др.), а также немодифицированные формы полинуклеотидов. Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, может быть заменена, например, на фосфонатную группу, фосфатную группу, защищена стандартными защитными группами, или активирована с получением дополнительных связей с другими нуклеотидами, или ее можно конъюгировать с твердыми носителями. 5'- и 3'-концевые ОН можно фосфорилировать или заменить на амины или органические кэпирующие группы, содержащие 1-20 атомов углерода. Другие гидроксильные группы также можно дериватизировать с получением стандартных защитных групп. Полинук- 16011479 леотиды также могут содержать широко известные в данной области аналогичные формы Сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые включают в себя, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил-, 2'-фтор- или 2'азидорибозу, карбоциклические аналоги Сахаров, -аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозы, фуранозы, седогептулозы, ациклические аналоги и абазические нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Одна или несколько фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными соединяющими группами (мостиками). Такие альтернативные мостики включают в себя, не ограничиваясь ими, воплощения, в которых фосфат заменен на P(O)S ("тиоат"),Р(S)S("дитиоат"), (O)NR2 ("амидат"), P(O)R, P(O)OR', СО или СН 2 ("формацеталь"), в каждом из которыхR или R' независимо обозначает Н или замещенный или незамещенный алкил (1-20 С), необязательно содержащий эфирный (-O-) мостик, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не все мостики в полинуклеотиде должны быть идентичными. Вышесказанное относится ко всем упоминающимся здесь полинуклеотидам, включая РНК и ДНК. Термин "вариабельная область" антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или к вариабельной области тяжелой цепи антитела, взятой отдельно или в сочетании. Каждая вариабельная область тяжелой и легкой цепи состоит из четырех каркасных участков (FR), соединенных тремя участками, определяющими комплементарность к конкретному антигену (CDR), также известными как гипервариабельные области. CDR-участки в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости участками FR и вместе с CDR из другой цепи участвуют в формировании антигенсвязывающего сайта антитела. Существует по меньшей мере два метода определения CDR: (1) подход, основанный на межвидовой вариабельности последовательностей (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest,(5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD; и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Chothia et al. (1989) Nature 342: 877; Al-lazikani et al(1997) J Molec. Biol. 273: 927-948. В данном описании CDR может относится к CDR, определенным с помощью любого подхода или с помощью сочетания обоих подходов. Термин "константный участок" антитела относится к константному участку антитела легкой цепи или к константному участку антитела тяжелой цепи, взятому либо отдельно, либо в сочетании. В данном описании термин "фактор роста нервов" и "NGF" относится к фактору роста нервов и к его вариантам, которые сохраняют по меньшей мере часть биологической активности NGF. В данном описании NGF включает в себя NGF всех видов млекопитающих, включая человека, собак, кошек, лошадей или коров, имеющий нативную последовательность. Термин "рецептор NGF" относится к полипептиду, который связывается с NGF или активируетсяNGF. Рецепторы NGF включают в себя рецептор TrkA и рецептор р 75 любого вида млекопитающих,включающих в себя, без ограничения, человека, собак, кошек, лошадей, приматов или коров. В данном описании термин "антагонистическое антитело против NGF" (используется как взаимозаменяемый с термином "антитело против NGF") относится к антителу, которое может связываться с NGF и ингибировать биологическую активность NGF и/или нижестоящий путь (пути), связанный с передачей сигнала, опосредованной NGF. Термин антагонистическое антитело против NGF охватывает антитела,которые блокируют, ослабляют, подавляют или уменьшают (в том числе значительно) биологическую активность NGF, в том числе нижестоящие пути, связанные с передачей сигнала, опосредованной NGF,такие как связывание с рецептором и/или индуцирование клеточного ответа на NGF. Следует понимать,что в контексте настоящего изобретения термин "антагонистическое антитело против NGF" охватывает все ранее определенные термины, названия, функциональные состояния и характерные особенности,которые приводят к тому, что NGF как таковой, биологическая активность NGF (включая, без ограничения, его способность опосредовать любое проявление послеоперационной боли), или последствия биологической активности по существу аннулируются, уменьшаются или нейтрализуются в любой значимой степени. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против NGF связывается с NGF и предотвращает димеризацию NGF и/или связывание с рецептором NGF (таким как р 75 и/или trkA). В других воплощениях антитело против NGF связывается с NGF и предотвращает димеризацию рецептора trkA и/или аутофосфорилирование trkA. В данном описании приведены примеры антагонистических антител против NGF. Термин "биологическая активность" NGF в основном относится к способности NGF связываться с его рецепторами и/или активировать сигнальные пути, опосредованные рецептором NGF. Биологическая активность включает в себя, без ограничения, любое одно или несколько из следующих свойств: способность связываться с рецептором NGF (таким как р 75 и/или trkA); способность стимулировать димеризацию и/или аутофосфорилирование рецептора trkA; способность активировать сигнальный путь, опосредованный рецептором NGF; способность стимулировать дифференциацию, пролиферацию, выживание и рост клеток, а также другие изменения в клеточной физиологии, включающие в себя (в случае нейронов,в том числе, периферических и центральных нейронов) изменения в морфологии, синаптогенезе, синаптической функции, высвобождении нейромедиаторов и/или нейропептидов, а также в регенерации после повреждения; способность стимулировать выживание нейронов тройничного нерва Е 13.5; и способность опосредовать боль, в том числе, послеоперационную боль. В данном описании термин "по существу чистый" относится к веществу, чистота (т.е. отсутствие- 17011479 примесей) которого составляет по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 90%,более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%. Термин "клетка-хозяин" включает в себя отдельные клетки или культуры клеток, которые могут быть или являются реципиентом вектора (векторов), предназначенных для внедрения полинуклеотидных вставок. Клетки-хозяева включают в себя потомство одной клетки-хозяина, причем потомство может не быть полностью идентичным (с точки зрения морфологии или состава геномной ДНК) исходной родительской клетке вследствие естественных, случайных или преднамеренных мутаций. Клетки-хозяева включают в себя клетки, трансфицированные in vivo полинуклеотидами данного изобретения. В данном описании термин "лечение" относится к способу получения благоприятных или желательных клинических результатов. В контексте настоящего изобретения термин благоприятные или желательные клинические результаты включает в себя, не ограничиваясь ими, один или несколько из следующих эффектов: улучшение или облегчение любого проявления боли, включающего в себя острую,хроническую, воспалительную, нейропатическую, послеоперационную боль, боль при ревматоидном артрите или боль при остеоартрите. В контексте настоящего изобретения термин благоприятные или желательные клинические результаты включает в себя, не ограничиваясь ими, один или несколько из следующих эффектов: уменьшение тяжести, облегчение одного или нескольких симптомов, связанных с болью, в том числе, с любым проявлением боли (таких как уменьшение продолжительности боли, снижение болевой чувствительности или ощущения боли). Термин "эффективное количество" лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции относится к количеству, достаточному для достижения благоприятных или желательных результатов, в том числе, клинических результатов, таких как облегчение или уменьшение чувства боли. Эффективное количество можно вводить в один или несколько приемов. В контексте данного изобретения эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для лечения, облегчения, уменьшения интенсивности и/или предотвращения боли, в том числе, послеоперационной боли, боли при ревматоидном артрите и/или боли при остеоартрите. В некоторых воплощениях "эффективное количество" может уменьшать боль в состоянии покоя (боль в покое) или механически-индуцированную боль (в том числе боль, сопровождающую движение), или и ту и другую, его можно вводить до, в процессе или после рассечения, разреза,разрыва или повреждения, и/или до, в процессе или после действия раздражителя, вызывающего боль. Понятно, что с клинической точки зрения эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может быть установлено для сочетания с другим лекарственным средством, соединением или с другой фармацевтической композицией. Таким образом, термин "эффективное количество" можно рассматривать с точки зрения введения одного или нескольких терапевтических средств, при этом можно считать, что одно средство вводят в эффективном количестве, если в сочетании с одним или несколькими другими средствами возможен, или достигается, желаемый результат. Термин "уменьшение частоты возникновения" боли относится к любому из уменьшения тяжести(которое может включать в себя уменьшение потребности в других лекарственных средствах и/или методах лечения, и/или уменьшение количества других лекарственных средств, которые обычно используются при данных состояниях, в том числе, например, опиаты), продолжительности и/или частоты (включая, например, более продолжительный или увеличенный период времени до возникновения послеоперационной боли у субъекта). Специалистам в данной области известно, что субъекты могут различаться по ответу на лечение, и с этой точки зрения, например, термин "способ уменьшения частоты возникновения боли при ревматоидном артрите или боли при остеоартрите у субъекта" означает введение антагонистического антитела против NGF, исходя из обоснованного предположения, что такое введение может вызвать уменьшение частоты возникновения боли у конкретного субъекта. Термин "уменьшение интенсивности" боли или одного или нескольких симптомов боли (например,боли при ревматоидном артрите или боли при остеоартрите) означает ослабление или улучшение одного или нескольких симптомов боли после введения антагонистического антитела против NGF. Термин"уменьшение интенсивности" также включает в себя уменьшение продолжительности проявления симптома. Термин "облегчение" боли или одного или нескольких симптомов боли (например, боли при ревматоидном артрите или боли при остеоартрите) означает уменьшение степени одного или нескольких нежелательных клинических проявлений послеоперационной боли у субъекта или у популяции субъектов после введения антагонистического антитела против NGF данного изобретения. В данном описании "задержка" развития боли означает отсроченное, заторможенное, замедленное,задержанное, стабилизированное и/или отложенное развитие боли, например, послеоперационной боли,боли при ревматоидном артрите или боли при остеоартрите. Данная задержка может иметь разную продолжительность в зависимости от истории болезни и/или подвергающихся лечению субъектов. Для специалиста в данной области очевидно, что достаточная или значительная задержка фактически может охватывать предотвращение боли, при котором у субъекта не развивается боль. Способ "задержки" развития симптома представляет собой способ, который приводит к уменьшению вероятности развития сим- 18011479 птома в данный период времени и/или к уменьшению тяжести симптомов в данный период времени по сравнению с состоянием, которое наблюдается, если данный способ не используется. Такие сравнения,как правило, делают в клинических исследованиях, в которых участвует статистически значимое число субъектов. Термин "боль" в данном описании относится к боли любой этиологии, включая острую и хроническую боль, а также к любой боли с воспалительным компонентом. Примеры боли включают в себя послеоперационную боль (в том числе, зубную боль), мигрень, головную боль и невралгию тройничного нерва, боль, связанную с ожогом, ранением или почечным камнем, боль, связанную с травмой (включая травму головы), невропатическую боль, боль, связанную со скелетно-мышечными нарушениями, такими как ревматоидный артрит, остеоартрит, анкилозирующий спондилоартрит, серо-негативные (неревматоидные) артропатии, несуставный ревматизм и околосуставные нарушения, а также боль, связанную с раком (в том числе "боль пробоя" и боль, связанная с последней стадией рака), периферической невропатией и постгерпетической невралгией. Примеры боли с воспалительным компонентом (в дополнение к некоторым описанным выше) включают в себя ревматическую боль, боль, связанную с воспалением слизистой оболочки и с дисменореей. Термин "послеоперационная боль" (используется как взаимозаменяемый с терминами "постинцизионная" или "посттравматическая боль") относится к боли, возникающей после или в результате внешней травмы, такой как разрез, прокол, рассечение, разрыв или ранение ткани субъекта (включая боль, возникающую после всех хирургических процедур, как инвазивных, так и неинвазивных). В данном описании термин "послеоперационная боль" не включает в себя боль, которая проявляется (возникает или появляется) в отсутствие внешней физической травмы. В некоторых воплощениях послеоперационная боль является внутренней или внешней (в том числе периферической) болью, причем рана, разрез, травма, разрыв или рассечение могут быть случайными (как в случае с травматической раной) или преднамеренными (как в случае хирургического рассечения). В данном описании "боль" включает в себя ноцицепцию и ощущение боли, причем боль можно оценивать объективно и субъективно, используя болевую шкалу и другие методы, хорошо известные в данной области. Послеоперационная боль в данном описании включает в себя аллодинию (т.е. усиленный ответ на стимулы, которые обычно не являются вредными) и гиперальгезию (т.е. усиленный ответ на стимулы, которые обычно являются вредными или неприятными),природа которых может быть термальной или механической (осязательной). В некоторых воплощениях боль характеризуется термальной чувствительностью, механической чувствительностью и/или болью в состоянии покоя. В некоторых воплощениях послеоперационная боль включает в себя механически индуцированную боль или боль в состоянии покоя. В других воплощениях послеоперационная боль включает в себя боль в состоянии покоя. Как хорошо известно в данной области, боль может быть первичной или вторичной. Термин "биологический образец" охватывает разные типы образцов, полученных от субъекта, которые можно использовать в диагностическом анализе или для текущего контроля. Данное определение включает в себя кровь и другие жидкие образцы биологического происхождения, твердые образцы тканей,такие как биопсийный образец, или культуры тканей, или полученный из них клетки и их потомство. Данное определение также включает в себя образцы, обработанные после получения каким-либо способом, например обработанные реагентами, солюбилизированные, или обогащенные некоторыми компонентами, такими, как белки или полинуклеотиды, или внедренные в полутвердую или твердую основу с целью получения срезов. Термин "биологический образец" охватывает клинические образцы, а также включает в себя клетки в культуре, клеточные супернатанты, клеточные лизаты, сыворотку, плазму, биологическую жидкость и образцы тканей. Термин "субъект" относится к позвоночным, предпочтительно, к млекопитающим, более предпочтительно, к человеку. Млекопитающие включают в себя, без ограничения, сельскохозяйственных животных (например,коров), спортивных животных, домашних животных (например, кошек, собак и лошадей), приматов,мышей и крыс. В данном описании термин "вектор" относится к конструкции, которая способна доставлять и,предпочтительно, экспрессировать один или несколько генов или одну или несколько представляющих интерес последовательностей в клетке-хозяине. Примеры векторов включают в себя, не ограничиваясь ими, вирусные векторы, оголенные экспрессирующие векторы из ДНК или РНК, плазмидные, космидные или фаговые векторы, экспрессирующие векторы из ДНК или РНК, связанные с катионными конденсирующими средствами, вектор экспрессии из ДНК или РНК, заключенные в липосомы, а также некоторые эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты. В данном описании термин "последовательность, управляющая экспрессией" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая управляет транскрипцией нуклеиновой кислоты. Последовательность, управляющая экспрессией, может представлять собой промотор, такой как конститутивный или индуцируемый промотор, или энхансер. Последовательность, управляющая экспрессией, оперативно связана с транскрибируемой последовательностью нуклеиновой кислоты. В данном описании термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к любому вещест- 19011479 ву, которое при объединении с активным ингредиентом позволяет этому ингредиенту сохранять биологическую активность и не взаимодействует с иммунной системой субъекта. Примеры включают в себя,без ограничения, любые стандартные фармацевтические носители, такие как физиологический раствор,забуференный фосфатом, вода, эмульсии, например эмульсии масло/вода, и разные типы увлажняющих средств. Предпочтительными разбавителями для аэрозольного или парентерального введения являются забуференный фосфатом физиологический раствор или обычный (0,9%) физиологический раствор. Композиции, содержащие такие носители, получают с помощью широко известных традиционных методов(см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co.,Easton, PA, 1990; и Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000). В данном описании подразумевается, что термин "Koff" относится к константе скорости диссоциации комплекса антитело/антиген. В данном описании подразумевается, что термин "Kd" относится к константе диссоциации взаимодействия антитело-антиген. Антитело E3, производные антитела E3, композиции, полученные на их основе, и способы их применения Композиции на основе E3, композиции на основе производных E3 и способы получения данных композиций Данное изобретение включает в себя композиции, в том числе фармацевтические композиции, содержащие антитело или полипептид E3; и полинуклеотиды, содержащие последовательности, кодирующие антитело или полипептид E3. В данном описании композиции содержат одно или несколько антител или один или несколько полипептидов (которые необязательно могут представлять собой антитело), которые связываются с NGF, и/или один или несколько полинуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие одно или несколько антител или один или несколько полипептидов, которые связываются с NGF. Данные композиции могут дополнительно содержать подходящие наполнители, такие как фармацевтически приемлемые наполнители, в том числе буферы, которые хорошо известны в данной области. Данное изобретение также включает в себя воплощения выделенных антител, полипептидов и полинуклеотидов. Данное изобретение также включает в себя воплощения, по существу, чистых антител,полипептидов и полинуклеотидов. Антитела и полипептиды данного изобретения характеризуются наличием любого (одного или нескольких) из следующих свойств: (а) способности связываться с NGF; (b) способности уменьшать и/или ингибировать биологическую активность NGF и/или нижестоящий путь (пути), связанный с передачей сигнала, опосредованной NGF; (с) способности уменьшать и/или ингибировать NGF-зависимое выживание мышиных нейронов тройничного нерва Е 13,5; (d) отсутствия сколько-нибудь значимой перекрестной отвечаемости на NT3, NT4/5 и/или BDNF; (е) способности лечить и/или предотвращать боль (в том числе послеоперационную боль); (f) способности увеличивать выведение NGF; (g) способности уменьшать или ингибировать активацию рецептора trkA, определяемую, например, с помощью анализа активации киназного рецептора (KIRA) (см. патент США 6027927). Связывающие свойства антитела ЕЗ, которое связывает человеческий NGF с высоким сродством и кинетическими параметрами, соответствующими медленной диссоциации, приведены ниже в сравнении с исходным мышиным моноклональным антителом 911 против NGF. Е 3 связывает человеческий NGF со сродством, которое приблизительно в 50 раз выше, чем у исходного мышиного антитела 911. Антитело E3 и родственные антитела также проявляют сильную антагонистическую активность по отношению к человеческому NGF, что определяют с помощью in vitro анализов (см. примеры 2 и 3). Например, антитело E3 проявляет антагонистическую активность по отношению к NGF-зависимому выживанию мышиных нейронов тройничного нерва Е 13 с IC50, составляющей приблизительно 21 пМ в присутствии 15 пМ человеческого NGF, и приблизительно 1,2 пМ в присутствии 1,5 пМ человеческого NGF. Соответственно, в другом аспекте антитела и полипептиды данного изобретения дополнительно идентифицируют и характеризуют по (h) высокому сродству связывания с человеческим NGF и кинетическим параметрам, соответствующим низкой скорости диссоциации (в некоторых воплощениях KD менее чем приблизительно 2 нМ, и/или koff менее чем приблизительно 610-5 с-1); и/или (i) способности ингибировать (блокировать) NGF-зависимое выживание мышиных нейронов тройничного нерва Е 13.5 сIC50, составляющей приблизительно 100 пМ, или менее, в присутствии приблизительно 15 пМ NGF (в некоторых воплощениях, человеческого NGF) и/или приблизительно 20 пМ, или менее, в присутствии приблизительно 1,5 пМ NGF. В некоторых воплощениях антитело связывает человеческий NGF и не связывает в значительной степени NGF других видов позвоночных (в некоторых воплощениях, млекопитающих). В некоторых во- 20011479 площениях антитело связывает человеческий NGF, a также один или несколько NGF других видов позвоночных (в некоторых воплощениях, млекопитающих). В следующих воплощениях антитело связывается с NGF и не вступает в значительной степени в перекрестное взаимодействие с другими нейротрофинами (такими, как родственные нейротрофины, NT3, NT4/5 и/или BDNF). В некоторых воплощениях антитело связывается с NGF и по меньшей мере с одним другим нейротрофином. В некоторых воплощениях антитело связывается с NGF таких видов млекопитающих, как лошади или собаки, но не связывается в значительной степени с NGF других видов млекопитающих. В некоторых воплощениях данное изобретение относится к антителу, содержащему легкую цепь,которую кодирует полинуклеотид, продуцируемый клеткой-хозяином с депозитным номером АТССРТА-4893 или АТСС No.РТА-4894. В другом аспекте данное изобретение относится к антителу, содержащему а тяжелую цепь, которую кодирует полинуклеотид, продуцируемый клеткой-хозяином с депозитным номером АТССРТА-4895. Настоящее изобретение также охватывает различные варианты E3 и эквивалентные фрагменты антител (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc и др.), одиночные цепи (ScFv),мутанты, гибридные белки, содержащие фрагмент антитела, и любые другие модифицированные конфигурации E3, которые содержат антиген (NGF)-распознающий участок нужной специфичности. Эквивалентные антитела E3, включающие в себя фрагменты антител и полипептидов (которые необязательно могут представлять собой антитела) E3, а также полипептиды, содержащие фрагменты полипептида E3,идентифицируют и характеризуют по любому (одному или нескольким) из описанных выше критериев. Соответственно, данное изобретение относится к любому из следующих соединений, или композиции (в том числе фармацевтические композиции), содержащим любое из следующих соединений: (а) антитело E3; (b) фрагмент или участок антитела E3; (с) легкую цепь антитела E3, показанную на фиг. 1 В;(с) тяжелую цепь антитела E3, показанную на фиг. 1 А; (d) один или несколько вариабельных областей легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела E3; (е) один или несколько CDR (один, два, три, четыре, пять или шесть CDR) антитела E3, показанных на фиг. 1 А и 1B; (f) CDR Н 3 из тяжелой цепи антитела E3, показанный на фиг. 1 А; (g) CDR L3 из легкой цепи антитела E3, показанный на фиг. 1B; (h) три CDR из легкой цепи антитела E3, показанные на фиг. 1B; (i) три CDR из тяжелой цепи антитела E3, показанные на фиг. 1 А; (j) три CDR из легкой цепи и три CDR из тяжелой цепи антитела E3, показанные на фиг. 1 А и 1 В; и (к) антитело, содержащее любой из фрагментов (b)-(j). Как следует из данного описания, из настоящего изобретения особо исключены полипептидные воплощения, включающие в себя аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности мышиного моноклонального антитела 911. Расширенные последовательности CDR Mab 911 показаны на фиг. 1 А и 1 В, и в SEQ IDNO: 9-14. Фрагменты CDR антитела E3 (в том числе CDR Chothia и Kabat) схематично изображены на фиг. 1 А и 1 В, они состоят из следующих аминокислотных последовательностей: (a) CDR 1 тяжелой цепи ("CDRNO: 7); и (f) CDR 3 легкой цепи ("CDR L3") QQEHTLPYT (SEQ ID NO: 8). Анализ участков CDR хорошо известен специалистам в данной области. Следует понимать, что в некоторых воплощениях CDR могут представлять собой сочетание CDR Rabat и Chothia (также называемые "объединенные CDR" or "расширенные CDR"). В некоторых воплощениях CDR содержат CDR Rabat. В других воплощениях CDR содержат CDR Chothia. В некоторых воплощениях данное изобретение относится к антителу, которое содержит по меньшей мере один CDR, по существу, гомологичный по меньшей мере одному CDR, по меньшей мере двум,по меньшей мере трем, по меньшей мере четырем, по меньшей мере 5 CDR E3 (или в некоторых воплощениях, по существу, гомологичный всем 6 CDR E3 или полученным из E3). Другие воплощения включают в себя антитела, содержащие по меньшей мере два, три, четыре, пять или шесть CDR, которые по существу гомологичны по меньшей мере двум, трем, четырем, пяти или шести CDR E3 или полученных из E3. Следует понимать, что в контексте данного изобретения специфичность связывания и/или общая активность (которая может быть выражена в терминах лечение и/или профилактика боли или ингибирование NGF-зависимого выживания мышиных нейронов тройничного нерва Е 13.5), как правило, сохраняется, хотя уровень активности может варьировать по сравнению с E3 (он может быть больше или меньше). Данное изобретение также относится к полипептиду (который может необязательно представлять собой антитело), включающий в себя аминокислотную последовательность E3 (показанную на фиг. 1 А и 1 В), которая содержит любой из следующих фрагментов: по меньшей мере 5 смежных аминокислот, по меньшей мере 8 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 10 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 15 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 20 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 25 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 30 смежных аминокислот из последовательности E3, где по меньшей мере 3 аминокислоты относятся к вариабельной области E3, причем следует понимать, что особо исключаются воплощения, включающие в себя аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности- 21011479 мышиного моноклонального антитела 911. Расширенные последовательности CDR Mab 911 показаны на фиг. 1 А и 1 В и в SEQ ID NO: 9-14. В одном воплощении вариабельная область относится к легкой цепиE3. В другом воплощении вариабельная область относится к тяжелой цепи E3. В другом воплощении 5(или более) смежных аминокислот относятся к гипервариабельной области (CDR) E3, показанной на фиг. 1 А и 1 В. В другом воплощении данное изобретение относится к полипептиду, включающему в себя аминокислотную последовательность E3, которая содержит любой из следующих фрагментов: по меньшей мере 5 смежных аминокислот, по меньшей мере 8 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 10 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 15 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 20 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 25 смежных аминокислот,по меньшей мере приблизительно 30 смежных аминокислот последовательности E3, где последовательность E3 содержит любой (один или несколько) из следующих аминокислотных остатков: L29 изCDRH1, I50 из CDRH2, W101 из CDRH3, и/или А 103 из CDRH3; и/или S28 из CDRL1, N32 из CDRL1,Т 51 из CDRL2, 91 Е из CDRL3 и/или Н 92 из CDRL3, причем следует понимать, что особо исключаются воплощения, включающие в себя аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности мышиного моноклонального антитела 911. В данном описании используется последовательная нумерация аминокислотных остатков в вариабельных областях (то есть аминокислотные остатки в каждой вариабельной области нумеруются последовательно). Как хорошо известно в данной области, системы нумерации по Kabat и/или Chothia используются при сравнении двух антител или полипептидов, таких как антитело E3 и вариант E3 (или полипептид, предположительно являющийся вариантом E3). В данной области хорошо известно, как от последовательной нумерации перейти к нумерации по Chothia и/или Kabat, если требуется, например, сравнить E3 с другим полипептидом. На фиг. 23 изображены вариабельные области E3, пронумерованные в соответствии с последовательной нумерацией, нумерацией по Chothia и нумерацией по Kabat. Кроме того, понятно, что для облегчения сравнения остаткам каркасных участков часто, но не всегда, присваивают приблизительно одинаковые номера. Однако CDR могут иметь разные размеры (т.е. они могут иметь вставки и/или делеции одного или нескольких аминокислотных остатков). Сравнение антитела E3 и возможного варианта E3 (например, длина участка CDR в антителе E3, с которым проводится сравнение, больше, чем в кандидатной последовательности), проводят, используя нижеследующие действия(хотя в данной области известны другие методы). Последовательность кандидатного антитела сравнивают с последовательностями вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела E3. Сравнение последовательностей можно проводить вручную или с использованием стандартных компьютерных программ. Сравнение последовательностей можно облегчить путем использования некоторых аминокислотных остатков, присутствующих в большинстве последовательностей Fab. Например, каждая легкая и тяжелая цепь обычно содержит два остатка цистеина, которые часто обнаруживаются в консервативном положении. Следует понимать, что аминокислотная последовательность кандидатного варианта антитела может быть длиннее (т.е. иметь вставки аминокислотных остатков) или короче (иметь удаленные аминокислотные остатки). К номеру остатка можно добавить индекс, чтобы указать вставку дополнительных остатков, например, остаток 34 abc. Для кандидатных последовательностей, которые, например, совмещают с последовательностью E3, например, по остаткам 33 и 35, но которые не имеют остатка между ними, остаток 35 просто не учитывается. В другом, хорошо известном подходе для CDR разной длины сравнение проводят по структурно эквивалентным (например, имеющих одинаковое положение в комплексе антиген-антитело) аминокислотам. Например, нумерация по Chothia (Al-Lazikani et al, выше), как правило (но не во всех случаях), позволяет поместить вставки и делеции в правильные со структурной точки зрения положения. Структурную эквивалентность можно доказать или продемонстрировать с помощью рентгеноструктурного анализа или циклического анализа двойных мутантов (см. Pons et al. (1999)Prot. Sci. 8: 958-968). Связывающее сродство антитела против NGF к NGF (такому, как hNGF) может составлять приблизительно 0,10-0,80 нМ, приблизительно 0,15-0,75 нМ и приблизительно 0,18-0,72 нМ. В некоторых воплощениях связывающее сродство составляет приблизительно 2 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 15 пМ, приблизительно 20 пМ, приблизительно 40 пМ, или приблизительно более 40 пМ. В одном воплощении связывающее сродство составляет приблизительно от 2 до 22 пМ. В других воплощениях связывающее сродство составляет, менее чем приблизительно 10 нМ, приблизительно 5 нМ, приблизительно 4 нМ, приблизительно 3,5 нМ, приблизительно 3 нМ, приблизительно 2,5 нМ, приблизительно 2 нМ, приблизительно 1,5 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 900 пМ, приблизительно 800 пМ, приблизительно 700 пМ, приблизительно 600 пМ, приблизительно 500 пМ,приблизительно 400 пМ, приблизительно 300 пМ, приблизительно 200 пМ, приблизительно 150 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 90 пМ, приблизительно 80 пМ, приблизительно 70 пМ, приблизительно 60 пМ, приблизительно 50 пМ, приблизительно 40 пМ, приблизительно 30 пМ, приблизительно 10 пМ. В некоторых воплощениях связывающее сродство составляет приблизительно 10 нМ. В других воплощениях связывающее сродство составляет, менее чем приблизительно 10 нМ. В других воплощениях связывающее сродство составляет приблизительно 0,1 нМ или приблизительно 0,07 нМ. В других- 22011479 воплощениях связывающее сродство составляет менее чем приблизительно 0,1 нМ или менее чем приблизительно 0,07 нМ. В других воплощениях связывающее сродство имеет любое значение из приблизительно 10 нМ, приблизительно 5 нМ, приблизительно 4 нМ, приблизительно 3,5 нМ, приблизительно 3 нМ, приблизительно 2,5 нМ, приблизительно 2 нМ, приблизительно 1,5 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 900 пМ, приблизительно 800 пМ, приблизительно 700 пМ, приблизительно 600 пМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 400 пМ, приблизительно 300 пМ, приблизительно 200 пМ, приблизительно 150 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 90 пМ, приблизительно 80 пМ, приблизительно 70 пМ, приблизительно 60 пМ, приблизительно 50 пМ, приблизительно 40 пМ, приблизительно 30 пМ,приблизительно 10 пМ, до любого значения из приблизительно 2 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 15 пМ, приблизительно 20 пМ, или приблизительно 40 пМ. В некоторых воплощениях связывающее сродство имеет любое значение из приблизительно 10 нМ, приблизительно 5 нМ, приблизительно 4 нМ, приблизительно 3,5 нМ, приблизительно 3 нМ, приблизительно 2,5 нМ, приблизительно 2 нМ, приблизительно 1,5 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 900 пМ, приблизительно 800 пМ, приблизительно 700 пМ, приблизительно 600 пМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 400 пМ, приблизительно 300 пМ, приблизительно 200 пМ, приблизительно 150 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 90 пМ, приблизительно 80 пМ, приблизительно 70 пМ, приблизительно 60 пМ, приблизительно 50 пМ, приблизительно 40 пМ, приблизительно 30 пМ, приблизительно 10 пМ. В следующих воплощениях связывающее сродство составляет приблизительно 2 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 15 пМ, приблизительно 20 пМ, приблизительно 40 пМ, или более, чем приблизительно 40 пМ. Связывающее сродство антитела к NGF можно определить с помощью хорошо известных в данной области методов. Одним из способов определения связывающего сродства антитела к NGF является измерение сродства монофункциональных Fab-фрагментов антитела, как описано в примерах. Монофункциональные фрагменты Fab можно получить путем расщепления антитела (например, IgG) папаином или путем рекомбинантной экспрессии. Сродство Fab-фрагмента антитела против NGF можно определить с помощью поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии (система поверхностного плазмонного резонанса (SPR) BIAcore3000, BIAcore, INC, Piscaway NJ), как описано в примерах. Данный метод подходит для определения связывающего сродства антитела к NGF любых видов, включая человеческийNGF, NGF других позвоночных (в некоторых воплощениях, млекопитающих) (таких как мышиный NGF,крысиный NGF, NGF приматов), а также к другим нейротрофинам, таким как родственные нейротрофины NT3, NT4/5 и/или BDNF. В некоторых воплощениях антитела или пептиды данного изобретения могут ингибировать (уменьшать и/или блокировать) человеческий NGF-зависимое выживание мышиных нейронов тройничного нерва Е 13,5 с IC50 (в присутствии приблизительно 15 пМ NGF), имеющей любое значение из приблизительно 200, 150, 100, 80, 60, 40, 20, 10 пМ или менее. В некоторых воплощениях антитела или пептиды данного изобретения могут ингибировать (уменьшать и/или блокировать) человеческий NGF-зависимое выживание мышиных нейронов тройничного нерва Е 13,5 с IC50 (в присутствии приблизительно 1,5 пМNGF), имеющей любое значение из приблизительно 50, 40, 30, 10, 20, 10, 5, 2, 1 пМ или менее. В некоторых воплощениях антитела или пептиды данного изобретения могут ингибировать (уменьшать и/или блокировать) крысиный NGF-зависимое выживание мышиных нейронов тройничного нерва Е 13.5 с IC50(в присутствии приблизительно 15 пМ NGF), имеющей любое значение из приблизительно 150, 125, 100,80, 60, 40, 30, 20, 10, 5 пМ или менее. В некоторых воплощениях антитела или пептиды данного изобретения могут ингибировать (уменьшать и/или блокировать) крысиный NGF-зависимое выживание мышиных нейронов тройничного нерва Е 13,5 с IC50 (в присутствии приблизительно 1,5 пМ NGF), имеющей любое значение из приблизительно 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 пМ или менее. Способы измерения NGFзависимого выживания мышиных нейронов тройничного нерва Е 13 известны в данной области и описаны, например, в примере 2. Данное изобретение также относится к способам получения любого из упомянутых антител или полипептидов. Антитела данного изобретения можно получить с помощью известных в данной области способов, некоторые из них иллюстрируются в примерах. Полипептиды можно получить в результате протеолитической или другой деградации антитела рекомбинатными методами (т.е. одиночные или гибридные полипептиды), как описано выше, или химическим синтезом. Полипептиды антитела, особенно более короткие полипептиды, приблизительно до 50 аминокислот, удобно получать химическим синтезом. Методы имического синтеза известны в данной области и являются коммерчески доступными. Например, антитело E3 можно получить с помощью автоматического полипептидного синтезатора с использованием твердофазного метода. См. также патенты США 5807715, 4816567 и 6331415. Химерные или гибридные антитела также можно получить in vitro с помощью известных методов синтетической белковой химии, в том числе методов, в которых используются перекрестно-сшивающие агенты. Например, иммунотоксины можно получить с помощью реакции бисульфидного обмена или путем образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих для этой цели реагентов включают в себя иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат. Альтернативно, антитела можно получить рекомбинатными методами, хорошо известными в дан- 23011479 ной области. В одном воплощении полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельную область и участок легкой цепи E3 (показанные на фиг. 1 А и 1 В) клонируют в векторе экспрессии или размножают в клетках-хозяевах (например, в клетках СНО). В другом воплощении полинуклеотидные последовательности, показанные на фиг. 2 и 3, клонируют в одном или нескольких векторах экспрессии или размножают. Последовательность, кодирующая представляющее интерес антитело,может содержаться в векторе в клетке-хозяине, клетку-хозяина затем культивируют и замораживают для последующего применения. Векторы (в том числе экспрессирующие векторы) и клетки-хозяева также описаны в данном документе. Были раскрыты рекомбинантные методы экспрессии антитела в растениях или молоке. См., например, Peeters et al. (2001) Vaccine 19: 2756; Lonberg, N. and D. Huszar (1995) Int.Rev. Immunol 13: 65; и Pollock et al. (1999) J Immunol Methods 231: 147. Способы получения производных антител, например, гуманизированных, одноцепочечных и др., известны в данной области. Данное изобретение также охватывает одноцепочечные фрагменты вариабельных областей ("scFv") антител данного изобретения, таких как E3. Одноцепочечные фрагменты вариабельных областей получают путем сшивки вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи с помощью коротких пептидных мостиков. Bird et al. (1988) Science 242: 423-426. Примером пептидного мостика является (GS)3 (SEQ IDNO: 15), который имеет размер приблизительно 3,5 нМ и соединяет карбоксильный конец одной вариабельной области и амино-конец другой вариабельной области. Также были созданы и используются мостики, имеющие другие последовательности (Bird et al. (1988. В свою очередь, мостики можно модифицировать с приданием им дополнительных функций, например, к ним можно присоединить лекарственные средства, или их можно присоединить к твердым носителям. Одноцепочечные варианты можно получить рекомбинантными или синтетическими методами. Для получения scFv синтетическим методом можно использовать автоматический синтезатор. Для получения scFv рекомбинантным методом подходящую плазмиду, содержащую полинуклеотид, который кодирует scFv, можно ввести в подходящую клетку-хозяина, либо эукариотическую, такую как клетка дрожжей, растения, насекомого или млекопитающего, либо прокариотическую, такую как Е. coli. Полинуклеотиды, кодирующие представляющий интерес scFv, можно получить традиционными методами, например, лигированием полинуклеотидов. Полученный scFv можно выделить с помощью стандартных методов очистки белков, известных в данной области. В объем данного изобретения также входят другие формы одноцепочечных антител, таких как диантитела. Диантитела являются двухвалентными, биспецифическими антителами, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием слишком короткого линкера,который не позволяет спариваться двум доменам на одной цепи, и таким образом вынуждает домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи, в результате чего образуется два антигенсвязывающих центра (см., например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448;Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). Антитело может представлять собой биспецифическое, моноклональное антитело, которое может специфически связывать два разных антигена. Биспецифическое антитело можно получить на основе раскрытого здесь антитела. Способы получения биспецифических антител известны в данной области(см., например, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121: 210). Традиционно рекомбинантное получение биспецифических антител основано на совместной экспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулинов, причем две тяжелые цепи имеют разную специфичность (Millstein and Cuello, 1983,Nature 305, 537-539). В соответствии с одним способом получения биспецифических антител, вариабельные домены антитела с желательной специфичностью связывания (антигенсвязывающие центры антитела) гибридизуют с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов. Предпочтительно проводят гибридизацию с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирного участка, участки СН 2 и CH3. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере в одном из гибридов присутствовал первый константный участок тяжелой цепи (СН 1), содержащий сайт, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующие гибриды тяжелой цепи иммуноглобулина, и, при желании, легкую цепь иммуноглобулина, вставляют в отдельные экспрессирующие векторы и совместно трансфицируют в подходящий организм-хозяин. Такой подход обеспечивает большую гибкость при достижении таких соотношений трех полипептидных фрагментов в воплощениях, где используются неравные соотношения трех полипептидных цепей, которые позволяют получить оптимальные выходы. Однако последовательности, кодирующие две или все три полипептидные цепи, можно вставить в один вектор экспрессии, если экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях проходит с высоким выходом, или если соотношение не имеет особого значения. В одном подходе одно плечо биспецифического антитела состоит из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина, несущей первую специфичность связывания, а другое плечо состоит из пары гибридная тяжелая цепь иммуноглобулина-легкая цепь (несущей вторую специфичность связывания). Данная асимметричная структура, содержащая легкую цепь иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы, облегчает отделение целевого биспецифического соединения от соединений с нежелательными сочетаниями иммуноглобулиновых цепей. Данный подход описан в заявке РСТWO- 24011479 94/04690, опубликованной 3 марта 1994 г. В объем данного изобретения также входят гетероконъюгированные антитела, содержащие два ковалентно связанных антитела. Такие антитела используются для нацеливания иммунных клеток на нежелательные клетки (патент США 4676980) и для лечения инфекции ВИЧ (заявки РСТWO 91/00360 и WO 92/200373; ЕР 03089). Гетероконъюгированные антитела можно получить любым традиционным методом перекрестной сшивки. Подходящие перекрестносшивающие агенты и методы перекрестной сшивки хорошо известны в данной области, и описаны в патенте США 4676980. Антитело может представлять собой гуманизированное антитело, например, как известное в данной области и описанное в данном документе. Антитела могут быть модифицированными, как описано в заявке РСТWO 99/58572, опубликованной 18 ноября 1999 г. Данные антитела включают в себя, в добавление к связывающему домену, направленному на молекулу-мишень, эффекторный домен, содержащий аминокислотную последовательность, по существу гомологичную всему констаному домену тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, или его части. Данные антитела могут связывать молекулу-мишень, не инициируя при этом значительный комплемент-зависимый лизис или клеточно-опосредованное разрушение мишени. Предпочтительно эффекторный домен способен специфически связывать FcRn и/или FcRIIb. Как правило, в их основе лежат химерные домены, полученные из двух или более доменов СН 2 тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. Модифицированные таким образом антитела предпочтительны для применения в продолжительной терапии антителами, так как они позволяют избежать воспалительных и других неблагоприятных реакций, наблюдающихся при традиционном лечении антителами. Данное изобретение охватывает модификации антитела E3, в том числе функционально эквивалентных антител, которые не оказывают значительного влияния на свойства, а также варианты, которые имеют повышенную или пониженную активность. Модификация полипептидов является рутинной практикой в данной области и дополнительно разъясняется в примерах. Примеры модифицированных полипептидов включают в себя полипептиды с заменами (в том числе с консервативными заменами) аминокислотных остатков, с одной или несколькими делециями или одним или несколькими добавлениями аминокислот, которые не оказывают существенного неблагоприятного влияния на функциональную активность, или с использованием химических аналогов. Полипептидный "вариант" в данном описании представляет собой полипептид, который отличается от нативного белка одной или несколькими заменами, делециями, добавлениями и/или вставками, которые не приводят к существенному уменьшению иммунореактивности. Другими словами, способность варианта специфически связывать антиген может повыситься или остаться неизменной по сравнению с нативным белком, или она может уменьшиться менее чем на 50%, и предпочтительно менее чем на 20%,по сравнению с нативным белком. Полипептидные варианты предпочтительно обладают по меньшей мере приблизительно 80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью (как определено в данном описании) по сравнению с идентифицированными полипептидами. Варианты аминокислотных последовательностей антител можно получить путем введения соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Такие варианты включают в себя, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в описанных здесь аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 1 или 2. Чтобы получить конечную конструкцию, можно использовать любое сочетание делеции, вставки и замены, при условии, что конечная конструкция обладает желательными характеристиками. Аминокислотные изменения также могут влиять на посттрансляционный процессинг антител, например может измениться число или местоположение сайтов гликозилирования. Метод идентификации некоторых остатков или участков антитела, которые являются предпочтительными для мутагенеза или модификации, называется "мутагенезом со сканированием по аланину" и описан Cunningham and Wells, 1989, Science, 244: 1081-1085. Чтобы воздействовать на взаимодействие аминокислот с антигеном, идентифицируют остаток, или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu), и заменяют их на нейтральные или отрицательно заряженные аминокислоты (наиболее предпочтительно, на аланин или полиаланин). Затем данные положения аминокислот, демонстрирующие функциональную чувствительность к заменам, уточняют путем введения дополнительных или других вариантов в участки замещений. Таким образом, участок для введения вариации в аминокислотную последовательность определяют заранее, а природу мутации как таковой не нужно определять заранее. Например, чтобы проанализировать мутации в данном участке, проводят мутагенез со сканированием ala или случайный мутагенез в целевом кодоне или участке и экспрессированные варианты антитела анализируют на целевую активность. Для идентификации местоположений в антителе, подходящих для мутагенеза или модификации, также можно использовать мутагенез со сканированием библиотек. Вставки аминокислотной последовательности включают в себя амино и/или карбоксиконцевые вставки разной длины, от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки внутри последовательности из одного или нескольких аминокислотных остатков. Примеры кон- 25011479 цевых вставок включают в себя антитело с N-концевым метионильным остатком или антитело, гибридизованное с маркерным эпитопом. Другие варианты молекул антител, несущих вставки, включают в себя присоединение фермента или полипептида, увеличивающих время полужизни антитела в сыворотке, к Nили С-концу антитела. В вариантах, несущих замены по меньшей мере один аминокислотный остаток в молекуле антитела удален, а на его место вставлен другой остаток. Гипервариабельные области представляют наибольший интерес для замещающего мутагенеза, однако изменения в FR тоже рассматриваются. Консервативные замены приведены в табл. 1 под названием "консервативные замены". Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть сделаны более существенные замены, приведенные в табл. 1 под названием "иллюстративные замены", или дополнительно описанные ниже со ссылкой на классы аминокислот, с последующим анализом полученных продуктов. Таблица 1. Аминокислотные замены Важные изменения биологических свойств антитела можно получить путем выбора замен, которые значительно различаются по влиянию на (а) структуру полипептидного скелета в области замены, которая, например, может находиться в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряд или гидрофобность молекулы в целевом участке, или (с) объем боковой цепи. Природные остатки разделяют на группы в зависимости от общих свойств боковых цепей:(5) остатки, влияющие на конфигурацию цепи: Gly, Pro; и(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe. Неконсервативные замены производят путем замены члена одного из указанных классов на член другого класса. Для улучшения окислительной стабильности молекулы и предотвращения аномальной перекрестной сшивки любой цистеиновый остаток, не участвующий в поддержании соответствующей конформации антитела, тоже может быть заменен, как правило, на серии. И наоборот, для улучшения стабильно- 26011479 сти антитела, особенно, если антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как фрагмент Fv, в антитело можно добавить цистеиновую связь (связи). Аминокислотные модификации могут варьировать от изменения или модификации одной или нескольких аминокислот до полной реконструкции участка, такого как вариабельная область. Модификации вариабельной области могут привести к изменению сродства и/или специфичности связывания. В одном воплощении в домене CDR производится не более 1-5 замен консервативных аминокислот. В других воплощениях в домене CDR3 производится не более 1-3 замен консервативных аминокислот. В следующих воплощениях домен CDR представляет собой CDRH3 и/или CDRL3. Модифицированные полипептиды также включают в себя гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование разными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Гликозилирование антител осуществляется по консервативным положениям константных участков (Jefferis andLund, 1997, Chem. Immunol. 65: 111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15: 26-32). Олигосахаридные боковые цепи иммуноглобулинов влияют на функционирование белков (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32: 1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29: 4175-4180) и внутримолекулярные взаимодействия между фрагментами гликопротеина, которые влияют на конформацию и вносят вклад в формирование трехмерной поверхности гликопротеина (Hefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7: 409-416). Олигосахариды также могут служить для нацеливания данного гликопротеина на определенные молекулы посредством специфического распознавания структур. Было описано,что гликозилирование антител влияет на антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). В частности, было описано, что в клетках СНО с регулируемой тетрациклином экспрессией (1,4)-Nацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII), гликозилтрансферазы, катализирующей расщеплениеGIcNAc, наблюдается повышенная активность ADCC (Umana et al., 1999, Mature Biotech. 17: 176-180). Гликозилирование антитела обычно бывает либо N-связанным, либо О-связанным. N-связанное получается в результате присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту кроме пролина, являются последовательностями распознавания при ферментативном присоединении углеводного фрагмента к аспарагиновой боковой цепи. Следовательно, указанные трипептидные последовательности образуют в полипептиде сайт возможного гликозилирования. Oсвязанное гликозилирование получается в результате присоединения одного из следующих Сахаров: Nацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего, к серину или треонину, хотя присоединение Сахаров также может происходить к 5-гидроксипролину или 5-гидроксилизину. Добавление сайтов гликозилирования к антителу удобно проводить путем изменения аминокислотной последовательности, в результате которого получается последовательность, содержащая одну или несколько из вышеописанных трипептидных последовательностей (в случае N-связанных сайтов гликозилирования). Изменение также можно проводить путем добавления к последовательности исходного антитела одного или нескольких сериновых или треониновых остатков, или замены одного или нескольких остатков в последовательности на сериновые или треониновые остатки (для О-связанных сайтов гликозилирования). Характер гликозилирования антитела может быть изменен без изменения нуклеотидной последовательности, кодирующей антитело. Гликозилирование сильно зависит от клетки-хозяина, используемой для экспрессии антитела. Поскольку для экспрессии рекомбинантных гликопротеинов, например антител, как потенциальных лекарственных средств, редко используются нативные клетки, можно ожидать вариаций в характере гликозилирования антитела (см., например, Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 9062-9070). Факторы, влияющие на гликозилирование в процессе рекомбинантной продукции антител, кроме выбора клеток-хозяев, включают в себя способ выращивания, состав среды, плотность культуры, окислительные условия, рН, схему очистки и т.п. Для изменения характера гликозилирования в конкретном организме-хозяине были предложены разные методы, в том числе, внедрение или сверхэкспрессия некоторых ферментов, участвующих в продукции олигосахаридов (патенты США 5047335; 5510261 и 5278299). Углеводный фрагмент, или некоторые типы углеводных фрагментов, можно ферментативно удалить из гликопротеина, например, с помощью эндогликозидазы Н (Endo H). Кроме того, методом генной инженерии можно создать рекомбинантную клетку-хозяин с дефектом процессинга некоторых типов полисахаридов. Эти и другие методы хорошо известны в данной области. Другие способы модификации включают в себя применение методов присоединения, известных в данной области, в том числе, без ограничения, ферментативные способы, окислительное замещение и хелатообразование. Модификации можно использовать, например, для присоединения маркеров для иммунологического анализа. Модифицированные полипептиды E3 получают с помощью широко известных в данной области методов, и анализировать их можно с помощью стандартных методов, известных в данной области, некоторые описаны ниже и приведены в примерах. Другие модифицированные антитела включают в себя антитела, модифицированные по способу,описанному в заявке РСТWO 99/58572, опубликованной 18 ноября 1999. Данные антитела содержат,- 27011479 кроме связывающего домена, направленного на молекулу-мишень, эффекторный домен, содержащий аминокислотную последовательность, по существу гомологичную всему константному домену тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, или его части. Указанные антитела могут связывать молекулумишень, не инициируя при этом значительный комплемент-зависимый лизис или клеточноопосредованное разрушение мишени. В некоторых воплощениях эффекторный домен может специфически связывать FcRn и/или FcRIIb. Как правило, в их основе лежат химерные домены, полученные из двух или более доменов СН 2 тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. Модифицированные таким образом антитела предпочтительны для применения в продолжительной терапии антителами, так как они позволяют избежать воспалительных и других неблагоприятных реакций, наблюдающихся при традиционном лечении антителами. Данное изобретение также охватывает гибридные белки, содержащие один или несколько фрагментов или участков антител (такого, как E3) или полипептидов данного изобретения. В одном воплощении предлагается гибридный полипептид, который содержит по меньшей мере 10 смежных аминокислот вариабельной области легкой цепи, показанной на фиг. 1 В и/или по меньшей мере 10 аминокислот вариабельной области тяжелой цепи, показанной на фиг. 1 А. В другом воплощении гибридный полипептид содержит вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи E3, показанные на фиг. 1 А и 1 В. В другом воплощении гибридный полипептид содержит один или несколько CDR E3. В следующих воплощениях гибридный полипептид содержит CDR H3 и/или CDR L3 антитела E3. В другом воплощении гибридный полипептид содержит любой один или несколько из: аминокислотного остатка L29 из CDRH1, 150 из CDRH2, W101 из CDRH3, и/или А 103 из CDRH3; и/или аминокислотного остатка S28 из CDRL1, N32 из CDRL1, Т 51 из CDRL2, 91 Е из CDRL3 и/или Н 92 из CDRL3. В соответствии с данным изобретением, гибридный белок E3 содержит одно или несколько антител E3 и другую аминокислотную последовательность, которая не присоединена к антителу в нативной молекуле, например, гетерологичную последовательность или гомологичную последовательность из другого участка. Примеры гетерологичных последовательностей включают в себя, не ограничиваясь ими, "маркер", такой как FLAG или 6His. Маркеры хорошо известны в данной области. Гибридный полипептид E3 можно получить с помощью известных в данной области методов, например, синтетических или рекомбинантных. Как правило, гибридные белки E3 данного изобретения получают путем экспрессии кодирующего их полинуклеотида рекомбинантными методами, описанными в данном документе, хотя их также можно получить другими методами, известными в данной области, в том числе, например, химическим синтезом. Данное изобретение также относится к композициям, содержащим антитела или полипептиды E3,конъюгированные (например, связанные) с агентом, который обеспечивает их присоединение к твердому носителю (таким как биотин или авидин). Для простоты здесь будет упоминаться, как правило, E3 или антитело, однако следует понимать, что данные методы применимы к любому из описанных в данном документе NGF-связывающих воплощений. Конъюгирование, как правило, относится к связыванию указанных компонентов, как описано в данном документе. Связывание (которое обычно фиксирует указанные компоненты в непосредственной близости, по меньшей мере, для введения) можно осуществить с помощью любого набора способов. Например, непосредственное взаимодействие между агентом и антителом возможно, если каждый из них содержит заместитель, способный взаимодействовать с другим компонентом. Например, нуклеофильная группа, такая как аминогруппа или сульфгидрильная группа,может взаимодействовать с карбонилсодержащей группой, такой как ангидрид или галогенангидрид, или с алкильной групой, содержащей подходящую уходящую группу (например, галогенид), другого компонента. Антитело или полипептид данного изобретения могут быть связаны с агентом-маркером (альтернативно называемым "маркер"), таким как флуоресцентная молекула, радиоактивная молекула, или с любым другим маркером, известным в данной области. В данной области обычно используются ' маркеры,которые предоставляют (непосредственно или косвенно) сигнал. Соответственно, данное изобретение включает в себя меченные антитела и полипептиды. Свойства антител и полипептидов данного изобретения, такие как связывание NGF; уменьшение или ингибирование биологической активности NGF; уменьшение и/или блокирование NGFиндуцированного выживания мышиных нейронов тройничного нерва Е 13,5, можно анализировать с помощью известных в данной области методов, некоторые из них описаны в примерах. Данное изобретение также относится к композициям (в том числе, фармацевтическим композициям) и наборам, содержащим антитело E3, и, как следует из данного описания, любым из описанных здесь антител и/или полипептидов или всем описанным здесь антителам и/или полипептидам. Полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева Данное изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим антитела и полипептиды данного изобретения (в том числе, антитела, содержащие полипептидные последовательности вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи, показанные на фиг. 1 А и 1 В), векторы и клеткихозяева, содержащие указанные полинуклеотиды. Соответственно, данное изобретение относится к полинуклеотидам (или композициям, в том числе,- 28011479 фармацевтическим композициям), содержащим полинуклеотиды, кодирующие любое из следующих соединений: (а) антитело E3; (b) фрагмент или участок антитела E3; (с) легкая цепь антитела E3, показанная на фиг. 1B; (d) тяжелая цепь антитела E3, показанная на фиг. 1 А; (е) одна или несколько вариабельных областей легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела E3; (f) один или несколько CDR (один, два, три,четыре, пять или шесть CDR) антитела E3, показанных на фиг. 1 А и 1B; (g) CDR H3 из тяжелой цепи антитела E3, показанный на фиг. 1 А; (h) CDR L3 из легкой цепи антитела E3, показанный на фиг. 1B; (i) три CDR из легкой цепи антитела E3, показанные на фиг. 1B; (j) три CDR из тяжелой цепи антитела E3,показанные на фиг. 1 А; (k) три CDR из легкой цепи и три CDR из тяжелой цепи антитела E3, показанные на фиг. 1 А и 1 В; или (1) антитело, содержащее любое из соединений (b)-(k). В некоторых воплощениях полинуклеотид содержит любой из полинуклеотидов, показанных на фиг. 2 и 3, или оба. В другом аспекте данное изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который кодирует легкую цепь E3 с депозитным номером АТССРТА-4893 или АТССРТА-4894. В другом аспекте данное изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который кодирует тяжелую цепь E3 с депозитным номером АТССРТА-4895. В следующем аспекте данное изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему (а) полинуклеотид с депозитным номером АТССРТА-4894,кодирующий вариабельную область, и (b) полинуклеотид с депозитным номером АТССРТА-4895,кодирующий вариабельную область. В другом аспекте данное изобретение относится к выделенному полинуклертиду, содержащему (а) полинуклеотид с депозитным номером АТССРТА-4894, кодирующий один или несколько CDR; и/или (b) полинуклеотид с депозитным номером АТССРТА- 4895, кодирующий один или несколько CDR. В другом аспекте данное изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим любые из описанных в данном документе антител (в том числе, фрагментов антител) и полипептидов. Полинуклеотиды можно получить с помощью известных в данной области методов. В другом аспекте данное изобретение относится к композициям (таким как фармацевтические композиции), содержащим любой из полинуклеотидов данного изобретения. В некоторых воплощениях композиция содержит вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, кодирующий антитело E3, как описано в данном документе. В другом воплощении композиция включает в себя вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, кодирующий любое из антител или полипептидов, описанных в данном документе. В следующих воплощениях, композиция содержит любой из полинуклеотидов, показанных на фиг. 2 и 3, или оба. Экспрессирующие векторы и введение полинуклеотидной композиции далее описаны в данном документе. В другом аспекте данное изобретение относится к способу получения полинуклеотидов, описанных в данном документе. Полинуклеотиды, комплементарные любой из таких последовательностей, также входят в объем настоящего изобретения. Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут представлять собой молекулы ДНК (геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК включают в себя молекулы HnRNA, которые содержат интроны и взаимно однозначно соответствуют молекуле ДНК, и молекулы мРНК, которые не содержат интронов. В полинуклеотиде настоящего изобретения могут присутствовать, но необязательно, другие кодирующие или некодирующие последовательности, и полинуклеотид может быть связан, но необязательно, с другими молекулами и/или веществами носителя. Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, которая кодирует антитело или его фрагмент), или они могут содержать вариант такой последовательности. Полинуклеотидные варианты содержат одну или несколько замен, добавлений, делеций и/или вставок, которые не приводят к уменьшению иммунореактивности кодируемого полипептида по сравнению с нативной иммунореактивной молекулой. Влияние на иммунореактивность кодируемого полипептида можно оценить с помощью методов, описанных в данном документе. Варианты идентичны полинуклеотидной последовательности, кодирующей нативное антитело или его фрагмент, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90%. Считается, что две полинуклеотидные или полипептидные последовательности "идентичны", если последовательности нуклеотидов или аминокислот являются одинаковыми при выравнивании с максимальным соответствием, как описано ниже. Для сравнения двух последовательностей обычно используют окно сравнения, которое позволяет идентифицировать и сравнить локальные участки подобия последовательности. Термин "окно сравнения" в данном описании относится к сегменту, содержащему по меньшей мере приблизительно 20 смежных положений, как правило, приблизительно от 30 до 75, приблизительно от 40 до 50, по которому последовательность можно сравнивать с последовательностью отнесения, включающей в себя такое же количество смежных положений, после того как две последовательности будут выровнены оптимальным образом. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно осуществить с помощью программы Megalign в системе Lasergene программного обеспечения для биоинформатики (DNASTAR,Inc., Madison, WI), с использованием параметров по умолчанию. Данная программа осуществляет неко- 29011479 торые схемы выравнивания, описанные в следующих ссылках: Dayhoff, M. О. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships; Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of ProteinJ., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730. Предпочтительно "процент идентичности последовательностей" определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, включающем в себя по меньшей мере 20 положений, причем для оптимального выравнивания двух последовательностей фрагмент полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать 20%, или менее, как правило, 5-15% или 10-12% добавлений или делеций (т.е. пробелов) по сравнению с последовательностями отнесения (которые не содержат добавлений или делеций). Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых у обеих последовательностей содержатся идентичные нуклеотидные основания или аминокислотные остатки, с получением числа совпадающих положений,деления числа совпадающих положений на общее число положений в последовательности отнесения (т.е. на размер окна) и умножения результата на 100 с получением процента идентичности последовательности. Варианты также могут быть, или альтернативно могут быть, по существу, гомологичными нативному гену, или его фрагменту, или комплементарной ему последовательности. Такие полинуклеотидные варианты могут гибридизоваться в умеренно жестких условиях с природной последовательностью ДНК,кодирующей нативное антитело (или комплементарную последовательность). Подходящие "умеренно жесткие условия" включают в себя предварительную промывку раствором 5SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (рН 8,0); гибридизацию при 50-65 С, 5SSC, в течение ночи; затем две промывки при 65 С в течение 20 мин, в каждой используется 2, 0,5 и 0,2 SSC, содержащий 0,1% SDS. В данном описании "очень жесткие условия" или "условия высокой жесткости" представляют собой условия, в которых: (1) для промывки используется низкая ионная сила и высокая температура, например, 0,015 М хлорид натрия/0,0015 М цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия и 50 С; (2) в процессе гибридизации используется денатурирующий агент, такой как формамид, например 50% (об./об.) раствор формамида, содержащий 0,1% бычьего сывороточного альбумина/0,1% фиколла/0,1% поливинилпирролидона/50 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 6,5, содержащий 750 мМ хлорид натрия, 75 мМ цитрат натрия, при 42 С; или (3) используется 50% формамид, 5SSC (0,75M NaCl, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 раствор Денхардта, обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS, и 10% декстрансульфат при 42 С, промывки проводятся при 42 С в 0,2SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамиде при 55 С, с последующей промывкой высокой жесткости в 0,1SSC, содержащем EDTA при 55 С. Опытному специалисту в данной области известно, как подобрать значения температуры, ионной силы и др., чтобы получить нужные характеристики, такие как длина зонда и т.п. Рядовому специалисту в данной области известно, что вследствие вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, как описано в данном документе. Некоторые из указанных полинуклеотидов обладают минимальной гомологией по отношению к нуклеотидной последовательности нативного гена. Тем не менее, в настоящее изобретение отдельно включены полинуклеотиды, которые различаются по употреблению кодона. Кроме того, в объем настоящего изобретения входят аллели генов, содержащих полинуклеотидные последовательности,описанные в данном документе. Аллели представляют собой эндогенные гены, изменившиеся в результате одной или нескольких мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Кодируемые аллелями мРНК и белок могут иметь, но необязательно, измененную структуру или функцию. Аллели можно идентифицировать с помощью стандартных методов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение последовательностей с использованием базы данных). Полинуклеотиды данного изобретения можно получить с помощью химического синтеза, рекомбинантных методов или ПЦР. Методы химического синтеза полинуклеотидов хорошо известны в данной области и нет необходимости описывать их здесь подробно. Для получения целевой последовательности ДНК специалист в данной области может использовать предлагающиеся в данном описании последовательности и коммерческий ДНК-синтезатор. Для получения полинуклеотидов с помощью рекомбинантных методов полинуклеотид, содержащий целевую последовательность, можно вставить в подходящий вектор, а вектор, в свою очередь, можно ввести в подходящую клетку-хозяина для репликации и амплификации, как описано ниже. Полинуклеотиды можно ввести в клетки-хозяева любым известным вданной области методом. Трансформацию клеток экзогенным полинуклеотидом проводят путем непосредственного поглощения, эндоцитоза,- 30