Антитела против cd19 с пониженной иммуногенностью

Раскрыты антитела В 4 против CD19 с модифицированными вариабельными областями. Полипептиды модифицированных вариабельных областей антитела против CD19 имеют изменения в одной или более чем в одной каркасной области или участке, определяющем комплементарность,вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, что приводит к ослаблению Т-клеточного ответа.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: МЕРК ПАТЕНТ ГМБХ (DE) 016429 Область изобретения Изобретение относится в основном к вариабельным областям легкой цепи и тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела B4 против CD19, модифицированным с целью снижения их иммуногенности. Предшествующий уровень техникиCD19 представляет собой поверхностный белок, найденный на В-клетках и на некоторых раковых клетках, происходящих от В-клеток, например на многих В-клеточных лимфомах. Уже получены в мышах моноклональные антитела против CD19, и в доклинических экспериментальных моделях на животных с В-клеточными раковыми опухолями показана их перспективность. Однако антитела, происходящие от мыши, обычно являются иммуногенными для человека. С целью минимизации их иммуногенности для человека разработано несколько стратегий изменения антител, происходящих от мыши. Одна из таких стратегий, химеризация, включает слияние вариабельных областей мышиного антитела с константными областями антитела человека. Однако остающиеся после химеризации последовательности вариабельных областей, происходящие от мыши, часто являются иммуногенными. Другая такая стратегия, гуманизация, включает замещение происходящих от мыши каркасных областей (FR), расположенных в вариабельных областях, последовательностями, происходящими от организмов, наиболее близкородственных человеку, с возможной реверсией некоторых аминокислот снова к соответствующим мышиным аминокислотам для сохранения связывающей активности. Однако даже гуманизированные антитела могут быть иммуногенными, так как участки антитела, определяющие комплементарность (CDR),обычно содержат эпитопы, распознаваемые В-клетками, и эпитопы, распознаваемые Т-клетками, являющиеся "не-своими". Действительно, даже полностью человеческие антитела являются иммуногенными, и это является основой для образования антиидиотипических антител в процессе иммунного ответа. Все эти проблемы можно отнести к антителам против CD19, происходящим от мыши, точно так же, как они относятся к любому другому типу антитела. Поэтому существует необходимость в антителах противCD19 с пониженной иммуногенностью. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к мышиному моноклональному антителу В 4 против CD19, которое модифицировано с целью снижения его иммуногенности по сравнению с антителом В 4 дикого типа. Более конкретно, вариабельная область антитела В 4 по изобретению модифицирована с целью удаления потенциальных эпитопов, распознаваемых Т-клетками. В результате, антитела В 4 по изобретению имеют улучшенные биологические свойства по сравнению с антителами В 4 дикого типа. Соответственно, в одном аспекте отличительным признаком изобретения является аминокислотная последовательность, определяющая модифицированную каркасную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащая аминокислотные остатки 1-30 SEQ ID NO: 22, где один или более чем один из аминокислотных остатков в позициях Х 5, Х 12, Х 19, Х 20, Х 23 и Х 24 является следующим: Х 5 представляет собой Q или Е, Х 12 представляет собой V или K, Х 19 представляет собой R или K, Х 20 представляет собой L или V, Х 23 представляет собой K, Е или D, или Х 24 представляет собой Т или А. Согласно данному аспекту изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков в позициях Х 5, Х 12, Х 19,Х 20, Х 23 или Х 24 отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в немодифицированной каркасной области тяжелой цепи иммуноглобулина, соответствующей аминокислотным остаткам 1-30 вSEQ ID NO:13. В одном воплощении Х 23 представляет собой Е или D. В другом аспекте отличительным признаком изобретения является аминокислотная последовательность, определяющая модифицированную каркасную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащая аминокислотные остатки 1-14 SEQ ID NO: 23, где один или более чем один из аминокислотных остатков в позициях Х 3, Х 5, Х 7 и Х 8 является следующим: Х 3 представляет собой K или R, Х 5 представляет собой R, Т или А, Х 7 представляет собой G, D или Е, или Х 8 представляет собой Q или K. Согласно данному аспекту изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков в позициях Х 3,Х 5, Х 7 или Х 8 отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в немодифицированной каркасной области тяжелой цепи иммуноглобулина, соответствующей аминокислотным остаткам 36-49 в SEQID NO: 13. В одном воплощении Х 7 представляет собой Е или D. В другом аспекте отличительным признаком изобретения является аминокислотная последовательность, определяющая модифицированную каркасную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащая аминокислотные остатки 1-39 SEQ ID NO: 24, где один или более чем один из аминокислотных остатков в позициях Х 6, Х 10, Х 26, Х 29 и Х 34 является следующим: Х 6 представляет собой K, D или Е,Х 10 представляет собой K, Е или D, X26 представляет собой S, D или Е, Х 29 представляет собой S или А, или Х 34 представляет собой V или Т. Согласно данному аспекту изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков в позициях Х 6, Х 10, Х 26, Х 29 или Х 34 отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в немодифицированной каркасной области тяжелой цепи иммуноглобулина, соответствующей аминокислотным остаткам 60-98 в SEQ ID NO: 13. В одном воплощении Х 10 представляет собой Е или D. Согласно другому аспекту отличительным признаком изобретения является аминокислотная последовательность, определяющая модифицированную каркасную область легкой цепи иммуноглобулина,-1 016429 содержащая аминокислотные остатки 1-23 SEQ ID NO: 32, где один или более чем один из аминокислотных остатков в позициях Х 1, Х 3, Х 7, Х 10, Х 11 и Х 19 является следующим: Х 1 представляет собой Q илиD, Х 3 представляет собой V или А, Х 7 представляет собой S или Е, Х 10 представляет собой I или Т, Х 11 представляет собой М или L, или Х 19 представляет собой V или А. Согласно данному аспекту изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков в позициях Х 1, Х 3, Х 7, Х 10, Х 11 или Х 19 отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в немодифицированной каркасной области легкой цепи иммуноглобулина, соответствующей аминокислотным остаткам 1-23 в SEQ ID NO: 25. В одном воплощении Х 3 представляет собой А и Х 7 представляет собой Е. В другом воплощении Х 1 представляет собой D, X10 представляет собой I и Х 11 представляет собой L. В другом аспекте отличительным признаком изобретения является аминокислотная последовательность, определяющая модифицированный участок, определяющий комплементарность, легкой цепи иммуноглобулина, содержащая аминокислотные остатки 24-33 в SEQ ID NO: 28. В другом аспекте отличительным признаком изобретения является аминокислотная последовательность, определяющая модифицированную каркасную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащая аминокислотные остатки 56-87 в SEQ ID NO: 28. Согласно другому аспекту отличительным признаком изобретения является вариабельная область антитела, содержащая аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31, где вариабельная область антитела специфически связывается с CD19. Согласно другому аспекту отличительным признаком изобретения является полипептид, который по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичен вариабельной области тяжелой цепи антитела В 4, содержащий аминокислотную замену одного или более чем одного остатка, соответствующего Val12, Leu20, Lys23, Thr24, Lys38, Gly42, Gln43, Lys65, Lys69, Ser85, Ser88 или Val93. В одном из воплощений данный полипептид содержит одну или более чем одну замену, выбранную из Gln5Glu,Val12Lys, Arg19Lys, Leu20Val, Lys23Glu, Lys23Asp, Thr24Ala, Lys38Arg, Arg40Thr, Gly42Asp, Gly42Glu,Gln43Lys, Lys65Asp, Lys65Glu, Lys69Glu, Lys69Asp, Ser85Asp, Ser85Glu, Ser88Ala или Val93Thr. Согласно другому аспекту отличительным признаком изобретения является полипептид, который по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичен вариабельной области легкой цепи антитела В 4, содержащий аминокислотную замену одного или более чем одного остатка, соответствующего Val3, Ser7, Ile10, Met11, Val19, Val29, Ser51, Leu53, Ala54 или Ser75. В одном из воплощений данный полипептид содержит одну или более чем одну замену, выбранную из Gln1Asp, Val3Ala, Ser7Glu,Ile10Thr, Met11Leu, Val19Ala, Val29Ala, Ser51Asp, Leu53Thr, Ala54Asp или Ser75Glu. В другом аспекте отличительным признаком изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по любому из воплощений изобретения. В другом аспекте отличительным признаком изобретения является способ лечения пациента, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества полипептида по любому из воплощений изобретения пациенту. В другом аспекте отличительным признаком изобретения является способ направленной доставки к клетке, имеющей на своей поверхности CD19, включающий стадию введения вариабельной области антитела по любому из воплощений изобретения. В одном из воплощений данного способа данная клетка представляет собой опухолевую клетку. Таким образом, изобретение относится к модифицированному антителу В 4, которое является менее иммуногенным, чем немодифицированное антитело В 4 при введении человеку, но все еще остается способным специфически связываться с CD19 и распознавать клетки-мишени, экспрессирующие CD19, и которое содержит по меньшей мере одну из следующих каркасных областей тяжелой цепи иммуноглобулина:K, Х 20 представляет собой L или V, Х 23 представляет собой K, Е или D и X24 представляет собой Т или А,при условии, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков в указанных позициях отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в аминокислотных остатках 1-30 в SEQ ID NO: 13;(2) WVX3QX5PX7X8GLEWIG (SEQ ID NO: 23),где Х 3 представляет собой K, Х 5 представляет собой R, А или Т, Х 7 представляет собой G и Х 8 представляет собой Q или K, при условии, что один из аминокислотных остатков в позиции Х 5 или Х 8 отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в аминокислотных остатках 36-49 в SEQ ID NO: 13;(3) YNQKFX6GKAX10LTVDKSSSTAYMEVSX26LTX29EDSAX34YYCAR (SEQ ID NO: 24),где Х 6 представляет собой K, D или Е, Х 10 представляет собой K, Е или D, Х 26 представляет собой S,D или Е, Х 29 представляет собой S или А и Х 34 представляет собой V или Т, при условии, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков в указанных позициях отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в аминокислотных остатках 60-98 в SEQ ID NO: 13. Соответствующему модифицированному антителу, содержащему каркасные области тяжелой цепи(1), (2) и (3). Соответствующему модифицированному антителу В 4, которое является менее иммуногенным, чем немодифицированное антитело В 4 при введении человеку, но все еще остается способным специфически связываться с CD19 и распознавать клетки-мишени, экспрессирующие CD19, и которое содержит следующие каркасные области легкой цепи иммуноглобулина:(4) X1IX3LTQX7PAX10X11SASPGEKX19TMTC (SEQ ID NO: 32), где X1 представляет собой Q или D,Х 3 представляет собой V или А, Х 7 представляет собой S или Е, Х 10 представляет собой I или Т, X11 представляет собой М или L и Х 19 представляет собой V или А, при условии, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков в указанных позициях отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в аминокислотных остатках 1-23 в SEQ ID NO: 25. Соответствующему модифицированному антителу В 4, где Х 3 представляет собой А и Х 7 представляет собой Е. Соответствующему модифицированному антителу В 4, где X1 представляет собой D, Х 10 представляет собой I и X11 представляет собой L. Соответствующему модифицированному антителу В 4, содержащему каркасные области тяжелой цепи (1), (2) и (3) и каркасную область легкой цепи (4). Соответствующему модифицированному антителу В 4, содержащему следующий участок, определяющий комплементарность, (CDR) легкой цепи иммуноглобулина: SASSGANYMH (аминокислотные остатки 24-33 в SEQ ID NO: 28). Модифицированному антителу В 4, которое является менее иммуногенным, чем немодифицированное антитело В 4 при введении человеку, но все еще остается способным специфически связываться сCD19 и распознавать клетки-мишени, экспрессирующие CD19, и которое содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ IDNO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21. Модифицированному антителу В 4, которое является менее иммуногенным, чем немодифицированное антитело В 4 при введении человеку, но все еще остается способным специфически связываться сCD19 и распознавать клетки-мишени, экспрессирующие CD19, и которое содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ IDNO: 30 и SEQ ID NO: 31. Соответствующему модифицированному антителу В 4, содержащему по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:18, SEQ IDNO:19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, и по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26,SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO:31. Соответствующему модифицированному антителу В 4, содержащему следующие тяжелую и легкую цепи, выбранные из группы, включающей:(1) вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 14, и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 26;(2) вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 27;(3) вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 28;(4) вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 17, и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 29; что является предпочтительным;(5) вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 18, и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 29, что является предпочтительным;(6) вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 30; и(7) вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 31. Соответствующему модифицированному антителу В 4, содержащему следующий участок, определяющий комплементарность, (CDR) легкой цепи иммуноглобулина: SASSGANYMH (аминокислотные остатки 24-33 в SEQ ID NO: 28). Полипептиду, который по меньшей мере на 90% идентичен вариабельной области тяжелой цепи антитела В 4, которое является менее иммуногенным, чем немодифицированное антитело В 4 при введении человеку, но все еще остается способным специфически связываться с CD19 и распознавать клеткимишени, экспрессирующие CD19, и который содержит аминокислотную замену одного или более чем одного остатка, соответствующего Val12, Leu20, Lys23, Thr24, Gly42, Lys38, Lys65, Lys69, Ser85 или-3 016429 Соответствующему полипептиду, где полипептид по меньшей мере на 95% идентичен вариабельной области тяжелой цепи антитела В 4. Соответствующему полипептиду, где полипептид содержит одну или более чем одну замену, выбранную из Gln5Glu, Val12Lys, Arg19Lys, Leu20Val, Lys23Glu, Lys23Asp, Thr24Ala, Lys38Arg, Gly42Asp,Gly42Glu, Lys65Asp, Lys65Glu, Lys69Glu, Lys69Asp, Ser85Asp, Ser85Glu или Val93Thr. Соответствующему полипептиду, который по меньшей мере на 90% идентичен вариабельной области легкой цепи антитела В 4, которое является менее иммуногенным, чем немодифицированное антитело В 4 при введении человеку, но все еще остается способным специфически связываться с CD19 и распознавать клетки-мишени, экспрессирующие CD19, и который содержит аминокислотную замену одного или более чем одного остатка, соответствующего Val3, Ser7, Ile10, Met11, Val19, Val29, Ser51, Leu53,Ala54 или Ser75. Соответствующему полипептиду, где полипептид по меньшей мере на 95% идентичен вариабельной области легкой цепи антитела В 4. Соответствующему полипептиду, где полипептид содержит одну или более чем одну замену, выбранную из Gln1Asp, Val3Ala, Ser7Glu, Ile10Thr, Met11Leu, Val19Ala, Val29Ala, Ser51Asp, Leu53Thr,Ala54Asp или Ser75Glu. Модифицированному антителу В 4, содержащему полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотные замены Gln5Glu, Val12Lys, Arg19Lys, Leu20Val, Lys23Glu, Lys23Asp, Thr24Ala, Lys38Arg,Gly42Asp, Gly42Glu, Lys65Asp, Lys65Glu, Lys69Glu, Lys69Asp, Ser85Asp, Ser85Glu или Val93Thr, и полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотные замены Gln1Asp, Val3Ala, Ser7Glu, Ile10Thr,Met11Leu, Val19Ala, Val29Ala, Ser51Asp, Leu53Thr, Ala54Asp или Ser75Glu. Молекуле ДНК, кодирующей модифицированное антитело В 4 или соответствующий полипептид,такие, как определено выше и ниже. Экспрессирующему вектору, содержащему соответствующую молекулу ДНК. Клетке-хозяину, экспрессирующей модифицированное антитело В 4 или соответствующий полипептид, такие, как определено в данном описании. Фармацевтической композиции, подходящей для лечения онкологического заболевания и аутоиммунных заболеваний, содержащей фармакологически эффективное количество антитела или полипептида, таких как определено выше и ниже, возможно вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или эксципиентом. Применению соответствующей фармацевтической композиции в изготовлении лекарства для лечения аутоиммунных заболеваний или онкологического заболевания. Краткое описание графических материалов На фиг. 1 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела В 4 (В 4 VH0) (SEQ ID NO: 1). На фиг. 2 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область тяжелой цепи антитела В 4, включающая кодоны для мутаций K23 Е, G42D, K69 Е и S85D(В 4 VHv1) (SEQ ID NO: 2). На фиг. 3 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область тяжелой цепи антитела В 4, включающая кодоны для мутаций K69 Е и S85D (В 4 VHv2) (SEQID NO: 3). На фиг. 4 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область тяжелой цепи антитела В 4, включающая кодоны для мутаций Q5E, V12K, R19K, L20V,Т 24 А, S85D и S88A (В 4 VHv3) (SEQ ID NO: 4). На фиг. 5 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область тяжелой цепи антитела В 4, включающая кодоны для мутаций Q5E, R19K, L20V, R40T,Q43K, K65D, S85D, S88A и V93T (В 4 VHv4) (SEQ ID NO:5). На фиг. 6 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область тяжелой цепи антитела В 4, включающая кодоны для мутаций Q5E, V12K, R19K, L20V,Т 24 А, K38R, R40A, Q43K, K65D, S85D и V93T (В 4 VHv5) (SEQ ID NO: 6). На фиг. 7 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область тяжелой цепи антитела В 4, включающая кодоны для мутаций Q5E, R19K, L20V, K65D,S85D и V93T (В 4 VHv6) (SEQ ID NO: 7). На фиг. 8 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела В 4 (В 4 VK0) (SEQ ID NO: 8). На фиг. 9 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область легкой цепи антитела В 4, включающая кодоны для мутаций V3A, S7E и A54D (В 4 VKv1)(SEQ ID NO: 9). На фиг. 10 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область легкой цепи антитела В 4, включающая кодоны для мутаций Q1D, I10 Т, M11L и A54D (В 4VKv2) (SEQ ID NO: 10). На фиг. 11 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область легкой цепи антитела В 4, включающая кодоны для мутаций I10 Т, M11L, V19A, V29A иS75E (В 4 VKv3) (SEQ ID NO: 11). На фиг. 12 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область легкой цепи антитела В 4, включающая кодоны для мутаций I10 Т, M11L, V19A, S51D иL53T (В 4 VKv4) (SEQ ID NO: 12). На фиг. 13 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела В 4 (В 4 VH0) (SEQ ID NO: 13). На фиг. 14 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В 4 с мутациями K23 Е, G42D, K69 Е и S85D (В 4 VHv1) (SEQ ID NO: 14). На фиг. 15 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В 4 с мутациями K69 Е и S85D (В 4 VHv2) (SEQ ID NO: 15). На фиг. 16 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В 4 с мутациями Q5E, V12K, R19K, L20V, Т 24 А, S85D и S88A (В 4 VHv3) (SEQ ID NO: 16). На фиг. 17 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В 4 с мутациями Q5E, R19K, L20V, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A и V93T (В 4 VHv4)(SEQ ID NO: 17). На фиг. 18 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В 4 с мутациями Q5E, V12K, R19K, L20V, Т 24 А, K38R, R40A, Q43K, K65D, S85D и V93T(В 4 VHv5) (SEQ ID NO: 18). На фиг. 19 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В 4 с мутациями Q5E, R19K, L20V, K65D, S85D и V93T (В 4 VHv6) (SEQ ID NO: 19). На фиг. 20 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В 4 с мутациями V12K, K23 Е, G42D, K65D, К 69 Е и S85D (В 4 VHv11) (SEQ ID NO: 20). На фиг. 21 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В 4 с мутациями Q5E, V12K, R19K, L20V, Т 24 А, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A и V93T(В 4 VHv34) (SEQ ID NO: 21). На фиг. 22 показана аминокислотная последовательность типичной каркасной области тяжелой цепи антитела В 4 с неопределенными аминокислотными остатками Х 5, Х 12, Х 19, Х 20, Х 23 и Х 24 (В 4VHfr1) (SEQ ID NO: 22). На фиг. 23 показана аминокислотная последовательность типичной каркасной области 2 тяжелой цепи антитела В 4 с неопределенными аминокислотными остатками Х 3, Х 5, Х 7 и Х 8 (В 4 VHfr2) (SEQ IDNO: 23). На фиг. 24 показана аминокислотная последовательность типичной каркасной области 3 тяжелой цепи антитела В 4 с неопределенными аминокислотными остатками Х 6, Х 10, Х 26, Х 29 и Х 34 (В 4 VHfr3)(SEQ ID NO: 24). На фиг. 25 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела В 4 (В 4 VK0) (SEQ ID NO: 25). На фиг. 26 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области легкой цепи антитела В 4 с мутациями V3A, S7E и A54D (В 4 VKv1) (SEQ ID NO: 26). На фиг. 27 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области легкой цепи антитела В 4 с мутациями Q1D, I10 Т, M11L и A54D (В 4 VKv2) (SEQ ID NO: 27). На фиг. 28 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области легкой цепи антитела В 4 с мутациями I10 Т, M11L, V19A, V29A и S75E (В 4 VKv3) (SEQ ID NO: 28). На фиг. 29 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области легкой цепи антитела В 4 с мутациями I10 Т, M11L, V19A, S51D и L53T (В 4 VKv4) (SEQ ID NO: 29). На фиг. 30 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области легкой цепи антитела В 4 с мутациями V3A, S7E, V19A, A54D и S75E (В 4 VKv11) (SEQ ID NO: 30). На фиг. 31 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области легкой цепи антитела В 4 с мутациями I10 Т, M11L, V19A, V29A, S51D, L53T и S75E (В 4 VKv34) (SEQ ID NO: 31). На фиг. 32 показана аминокислотная последовательность типичной каркасной области легкой цепи антитела В 4 с неопределенными аминокислотными остатками Х 1, Х 3, Х 7, Х 10, Х 11 и Х 19 (В 4 VKfr1)(SEQ ID NO: 32). На фиг. 33 показана аминокислотная последовательность типичного участка, определяющего комплементарность, легкой цепи антитела В 4 с неопределенными аминокислотными остатками Х 3, Х 5 и Х 6(В 4 VKcdr2) (SEQ ID NO: 33). На фиг. 34 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела В 4. Участки, определяющие комплементарность, подчеркнуты. Модифицируемые аминокислотные остатки выделены жирным шрифтом. На фиг. 35 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела В 4. Участки, определяющие комплементарность, подчеркнуты. Модифицируемые аминокислотные остатки выделены жирным шрифтом. На фиг. 36 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области-5 016429 тяжелой цепи антитела В 4 VH0 (SEQ ID NO: 13), VHv1 (SEQ ID NO: 14), VHv2 (SEQ ID NO: 15), VHv3ID NO: 21). На фиг. 37 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи антитела В 4 VK0 (SEQ ID NO: 25), VKv1 (SEQ ID NO: 26), VKv2 (SEQ ID NO: 27), VKv3(SEQ ID NO: 28), VKv4 (SEQ ID NO: 29), VKv11 (SEQ ID NO: 30) и VKv34 (SEQ ID NO: 31). На фиг. 38 приведены результаты анализа ADCC (антитело-зависимой клеточной цитотоксичности), выполненного на клетках лимфомы Беркитта линии Дауди с использованием антитела В 4VHv4/VKv4, экспрессированного либо в клетках HEK 293 Т (незакрашенные треугольники), либо в клетках YB2/0 (закрашенные треугольники), и антитела В 4 VHv5/VKv4, экспрессированного либо в клетках линии NS/0 (незакрашенные кружки), либо в клетках YB2/0 (закрашенные кружки), в соответствии с тем,как описано в примере 4. На фиг. 39 приведены результаты лечения мышей, которым трансплантировали РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) человека и давали в качестве лечения либо антитело по изобретению В 4 VHv4/VKv4 (заштрихованные прямоугольники), либо Leu 16 антитело (белые прямоугольники),либо PBS (фосфатно-солевой буфер) (черные прямоугольники) в соответствии с тем, как описано в примере 5. На фиг. 40 приведены результаты лечения мышей, несущих клетки лимфомы линии Намальва, которые получали в качестве лечения либо антитело по изобретению В 4 VHv4/VKv4 (незакрашенные кружки), либо PBS (звездочки) в соответствии с тем, как описано в примере 6. На фиг. 41 приведены результаты лечения мышей, несущих клетки лимфомы Беркитта линии Дауди, которые получали в качестве лечения либо антитело по изобретению В 4 VHv4/VKv4 (незакрашенные треугольники), либо циклофосфамид (незакрашенные квадраты), либо комбинацию антитела В 4VHv4/VKv4 и циклофосфамида (незакрашенные кружки), либо PBS (звездочки) в соответствии с тем, как описано в примере 7. На фиг. 42 приведены результаты лечения мышей, несущих клетки лимфомы линии Намальва, антителом по изобретению в комбинации с различными химиотерапевтическими агентами в соответствии с тем, как описано в примере 8. На фиг. 42(а) приведены результаты лечения циклофосфамидом (незакрашенные квадраты), антителом В 4 VHv4/VKv4 (X), комбинацией антитела В 4 VHv4/VKv4 и циклофосфамида (закрашенные квадраты) или PBS (звездочки). На фиг. 42(б) приведены результаты лечения винкристином (незакрашенные треугольники), антителом В 4 VHv4/VKv4 (X), комбинацией антитела В 4VHv4/VKv4 и винкристина (закрашенные треугольники) или PBS (звездочки). На фиг. 42(в) приведены результаты лечения доксорубицином (незакрашенные кружки), антителом В 4 VHv4/VKv4 (X), комбинацией антитела В 4 VHv4/VKv4 и доксорубицина (закрашенные кружки) или PBS (звездочки). Подробное описание изобретения Изобретение относится к белкам В 4, которые обладают пониженной иммуногенностью по сравнению с В 4 дикого типа, а также к способам получения и применения таких белков. Более конкретно, в изобретении предложены мутации в антителе В 4, которые приводят к снижению иммуногенности антитела В 4, в основном за счет удаления распознаваемых Т-клетками эпитопов, имеющихся на В 4, которые могут стимулировать иммунный ответ. Настоящее изобретение относится к семейству модифицированных вариабельных областей тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VK) мышиного антитела В 4 против CD19 (Nadler et al., (1983) J. Immunol. 130:2947 - 2951; Roguska et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969 - 973), которые в данном описании имеют общие названия "В 4 VHvx" и "В 4 VKvy" соответственно. Для сравнения, последовательность вариабельной области тяжелой цепи исходного мышиного антитела В 4 (В 4 VH0) и последовательность вариабельной области легкой цепи исходного мышиного антитела В 4 (В 4 VK0), с подчеркнутыми CDR,приведены на фиг. 34 и 35 соответственно. По сравнению с исходными полипептидами В 4 VH0 и B4 VK0 полипептиды В 4 VHvx и В 4 VKvy обладают пониженной иммуногенностью. Более конкретно, в изобретении предложены мутации в В 4 VH и/или В 4 VK, которые приводят к снижению иммуногенности полипептидов вариабельной области В 4, в основном за счет удаления распознаваемых Т-клетками эпитопов, имеющихся на этих полипептидах,которые могут стимулировать иммунный ответ. Согласно изобретению белковые композиции, содержащие модифицированные формы вариабельных областей В 4, являются менее иммуногенными при введении человеку, но все еще остаются способными специфически связываться с CD19 и распознавать клетки-мишени, экспрессирующие CD19. В контексте данного описания подразумеваться, что термины "участки, определяющие комплементарность" и "CDR" означают гипервариабельные области или петли вариабельной области иммуноглобулина, которые в основном и взаимодействуют с антигеном. Вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина (VH) и вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина (VK) содержат по три CDR,расположенные между каркасными областями, как показано на фиг. 34 и 35 соответственно. Например,согласно аминокислотной последовательности, определяющей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина для антитела В 4, приведенной на фиг. 34 (SEQ ID NO: 13), CDR определены аминокис-6 016429 лотными последовательностями от Ser31 до His35 (CDR1), от Glu50 до Asn59 (CDR2) и от Gly99 до Тук 109 (CDR3). Согласно аминокислотной последовательности, определяющей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина для антитела В 4, приведенной на фиг. 35 (SEQ ID NO: 25), CDR определены аминокислотными последовательностями от Ser24 до His33 (CDR1), от Asp49 до Ser55 (CDR2) и отHis88 до Thr94 (CDR3). В контексте данного описания подразумеваться, что термины "каркасные области" и "FR" означают области вариабельной области иммуноглобулина, примыкающие к участкам, определяющим комплементарность. Вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина (VH) и вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина (VK) содержат по четыре FR, как показано на фиг. 34 и 35. Например, согласно аминокислотной последовательности, определяющей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина для антитела В 4, приведенной на фиг. 34 (SEQ ID NO: 13), FR определены аминокислотными последовательностями от Gln1 до Thr30 (FR1), от Trp36 до Gly49 (FR2), от Tyr60 до Arg98 (FR3) и отTrp110 до Ser120 (FR4). Согласно аминокислотной последовательности, определяющей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина для антитела В 4, приведенной на фиг. 35 (SEQ ID NO: 25), FR определены аминокислотными последовательностями от Gln1 до Cys23 (FR1), от Trp34 до Tyr48 (FR2),от Gly56 до Cys87 (FR3) и от Phe95 до Lys104 (FR4). Кроме того, аминокислотные остатки, выделенные жирным шрифтом на фиг. 34 и 35, представляют собой аминокислотные остатки, которые могут быть мутированы согласно различным воплощениям изобретения. Эпитопы, распознаваемые Т-клетками, могут быть идентифицированы с помощью ряда компьютерных и некомпьютерных методик, включая предсказания на основе компьютерного моделирования,основанного на анализе структур, или путем синтеза пептидов и тестирования их связывания со специфическими молекулами МНС класса II или анализа их иммуногенности. Согласно изобретению потенциальный эпитоп, распознаваемый Т-клетками, представляет собой последовательность, которая, будучи представленной в виде отдельного пептида, согласно предсказанию связывается с молекулой МНС класса II или ее эквивалентом в другом виде, не относящемся к человеку. Потенциальный эпитоп, распознаваемый Т-клетками, определяют без учета других аспектов процессинга антигена, таких как эффективность поглощения белка антиген-презентирующими клетками, эффективность расщепления в сайтах,находящихся на интактном белке, с получением пептида, который может связываться с МНС класса II, и так далее. Соответственно, популяция эпитопов, распознаваемых Т-клетками, которые после введения белка животному фактически презентированы на МНС класса II, представляет собой субпопуляцию потенциальных эпитопов, распознаваемых Т-клетками. Согласно изобретению эпитоп, распознаваемый Тклетками, представляет собой эпитоп белка, который взаимодействует с молекулой МНС класса II. Безотносительно к какой-либо теории понятно, что эпитоп, распознаваемый Т-клетками, представляет собой аминокислотную последовательность в белке, которая не исключается в процессе отрицательной селекции Т-клеток во время формирования Т-клеток, и поэтому можно ожидать, что она будет презентирована молекулой МНС класса II и будет распознаваться Т-клеточным рецептором. Согласно одному из воплощений в изобретении предложены способы, относящиеся к снижению иммуногенности областей В 4 VH и В 4 VK. Согласно одному из воплощений изобретения потенциальныеVK. Например, потенциальные "не-свои" эпитопы, распознаваемые Т-клетками, идентифицируют с помощью компьютерных методик, основанных на моделировании связывания пептидов с молекулами МНС класса II. Затем производят замены на такие специфические аминокислотные остатки, что способность пептидов, содержащих потенциальные эпитопы, распознаваемые Т-клетками, связываться с МНС класса II уменьшается или полностью подавляется. Модифицированные белковые последовательности вариабельных областей по изобретению. Согласно одному из воплощений эффект от конкретной аминокислотной мутации или мутаций предсказывают на основе компьютерного моделирования, основанного на анализе структур. Например,ProPred (http://www.imtech.res.in/raghava/propred; Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17:1236 - 1237) представляет собой программу, находящуюся в открытом доступе в сети, которая может быть использована для предсказания пептидов, которые связываются с аллелями HLA-DR. ProPred основана на матричном алгоритме предсказания, описанном Sturniolo для популяции 50 аллелей HLA-DR (Sturniolo et al.,(1999) Nature Biotechnol. 17:555 - 561). В результате использования такого алгоритма в В 4 VH и В 4 VK были обнаружены последовательности различных пептидов, которые, согласно предсказанию, связываются с несколькими аллелями МНС класса II и поэтому, по-видимому, являются иммуногенными. Последовательности данных пептидов и их предсказанная частотность связывания (binding frequency) с аллелями HLA-DR приведены в табл. 1. В табл. 1 последовательность каждого 9-членного пептида, который связывается с по меньшей мере 5 аллелями HLA-DR, приведена вместе с его позициейв области В 4 VH (левая колонка) или в области В 4 VK (правая колонка). "Частотность связывания" относится к количеству аллелей, из общего количества возможных 50 аллелей, связывание пептида с которыми превышает произвольно заданный порог связывания, в данном случае 20%. Частотность связывания "+" показывает, что пептид связывается с 5-9 аллелями, показывает, что пептид связывается с 10-19 аллелями, и показывает, что пептид-7 016429 связывается с 20-50 аллелями. 20% порог связывания указан относительно теоретической максимальной оценки связывания, рассчитанной с помощью алгоритма, в соответствии с тем, как описано Sturniolo etal. Таблица 1. Выборка пептидов из областей В 4 V, связывающихся согласно предсказанию с аллелями HLA-DR человека Данные потенциально иммуногенные последовательности в полипептидах В 4 VH и В 4 VK могут быть сделаны менее иммуногенными путем введения специфических мутаций, которые уменьшают или полностью подавляют связывание конкретного пептида с аллелью HLA-DR человека (см., напримерWO98/52976 и WO00/34317). Альтернативно, распознаваемые Т-клетками эпитопы, не относящиеся к человеку, мутируют таким образом, чтобы они соответствовали "своим" эпитопам человека, которые присутствуют у человеческих антител эмбрионального типа (см., например US 5712120). Руководством для выбора подходящих мутаций могут служить данные по третичной и четвертичной структуре вариабельных областей антител. Кристаллические структуры вариабельных доменов антител известны в данной области техники, и установлено, что структуры FR обычно имеют большое сходство. Теоретическая модель вариабельной области антитела против CD19 В 4 VH0/VK0 может быть сконструирована исходя из наиболее близкородственных вариабельных областей тяжелых и легких цепей антител, структуры которых уже определены и которые могут быть идентифицированы путем выравнивания первичных структур (Altschul et аl., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-415). Для моделирования легкой и тяжелой цепей В 4 на рассчитанных структурах (solved structures) использован алгоритм прошивания (threading algorithm) (Marti-Renom ef al., (2000) Annu Rev Biophys Biomol Struct 29:291-325), и данные прошитые структуры могут быть дополнительно улучшены с целью получения стереохимически подходящих энергий (Weiner ef al., (1984) J Am Chem Soc 106:765-784). Установлено, что для этой цели полезными базовыми структурами являются рассчитанные структуры тяжелой цепи и легкой цепи, имеющие в базе данных PDB (банка белковых структур) регистрационные коды 1FBI (Fab-фрагмент моноклонального антитела F9.13.7) и 1MIM (Fab-фрагмент химерного антитела против CD25 Sdz Chi621) соответственно. Предпочтительные мутации чрезмерно не нарушают экспрессию, фолдинг или активность белка. Согласно изобретению аминокислоты в позициях Q5, V12, R19, L20, К 23, Т 24, К 38, R40, G42, Q43, К 65,К 69, S85, S88 или V93 в В 4 VH и аминокислоты в позициях Q1, V3, S7, I10, М 11, V19, V29, S51, L53,А 54 или S75 в В 4 VK могут быть мутированы, но антитело все еще сохраняет способность экспрессироваться и связываться с CD19 на уровне, сравнимом с немодифицированной формой В 4. Соответственно,изобретение включает антитела В 4, имеющие по меньшей мере одну модификацию в VHпоследовательности в аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из Q5, V12, R19,L20, K23, Т 24, К 38, R40, G42, Q43, K65, K69, S85, S88 и V93, и/или имеющие по меньшей мере одну модификацию в VK-последовательности в аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей изQ1, V3, S7, I10, М 11, V19, V29, S51, L53, А 54 и S75. Неполный перечень конкретных позиций, в которых, как установлено, допустимы аминокислотные замены по изобретению, приведен в табл. 2 вместе с типичными заменами в данных позициях. Один ряд воплощений включает аминокислотные замены в полипептиде В 4 VH, выбранные изQ5E, V12K, R19K, L20V, K23 Е, Т 24 А, K38R, R40T, G42D, Q43K, K65D, К 69 Е, S85D, S88A и V93T. Дополнительно используемые замены представляют собой K23D, G42E, К 65 Е и K69D. Также установлено,что являются полезными определенные комбинации мутаций. Например, одно конкретное воплощение включает замены K23 Е и K69 Е. Другое конкретное воплощение дополнительно включает замены G42D и S88A, как показано, например, для В 4 VHv1 (SEQ ID NO: 14). Согласно еще одному конкретному воплощению VHv1 дополнительно включает замены V12K и K65D (В 4 VHv11) (SEQ ID NO: 20). Другое конкретное воплощение включает замены Q5E, V12K, R19K, L20V, S85D и S88A, в качестве примера можно привести В 4 VHv3 (SEQ ID NO: 16). Еще одно конкретное воплощение включает замены Q5E,R19K, L20V, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A и V93T, в качестве примера можно привести В 4 VHv4(SEQ ID NO: 17). Еще одно конкретное воплощение включает замены Q5E, R19K, L20V, K38R, R40A,Q43K, K65D, S85D и V93T, в качестве примера можно привести В 4 VHv5 (SEQ ID NO: 18). В другом конкретном воплощении использованы комбинации замен из В 4 VHv3 и В 4 VHv4, как показано на последовательности В 4 VHv34 (SEQ ID NO: 21). Другой ряд воплощений включает аминокислотные замены в полипептиде В 4 VK, выбранные изQ1D, V3A, S7E, I10 Т, M11L, V19A, V29A, S51D, L53T, A54D и S75E. Одно из конкретных воплощений включает замену A54D. Также установлено, что являются полезными определенные комбинации мутаций. Например, более конкретные воплощения дополнительно включают замены V3A и S7E, в качестве примера можно привести В 4 VKv1 (SEQ ID NO: 26), или включают замены Q1D, I10 Т и M11L, в качестве примера можно привести В 4 VKv2 (SEQ ID NO: 27). В другом воплощении В 4 VK1 дополнительно включает замены V19A и S75E, в качестве примера можно привести В 4 VKv11 (SEQ ID NO: 30). Еще одно воплощение включает замены I10 Т, M11L, V19A, V29A и S75E, в качестве примера можно привести В 4 VKv3 (SEQ ID NO: 28). Еще одно конкретное воплощение включает замены I10 Т, M11L, V19A,S51D и L53T, в качестве примера можно привести В 4 VKv4 (SEQ ID NO: 29). В другом конкретном воплощении использованы комбинации замен из В 4 VKv3 и В 4 VKv4, как показано на последовательности В 4 VKv34 (SEQ ID NO: 31). Выравнивание первичных структур нескольких типичных последовательностей В 4 VHvx и В 4VKvx по изобретению, описанных выше, представлено на фиг. 36 и 37 соответственно. Аминокислоты,выделенные жирным шрифтом, находятся в тех позициях VH0 и VK0, которые могут быть мутированы согласно изобретению, и подчеркнутые аминокислоты представляют собой CDR. VHv1 - VHv34 и VKv1- VKv34 представляют собой, соответственно, типичные тяжелые и легкие цепи с конкретными аминокислотными заменами, которые снижают иммуногенность. Композиции вариабельных областей по изобретению включают по меньшей мере тяжелую цепь или легкую цепь по изобретению. Например, в одном воплощении вариабельная область содержит В 4VHv1 (SEQ ID NO: 14) и B4 VK0 (SEQ ID NO: 25). В другом воплощении вариабельная область содержит В 4 VHv1 (SEQ ID NO: 14) и В 4 VKv1 (SEQ ID NO: 26). В еще одном воплощении вариабельная область содержит В 4 VHv4 (SEQ ID NO: 17) и В 4 VKv4 (SEQ ID NO: 29). В еще одном воплощении вариабельная область содержит В 4 VHv5 (SEQ ID NO: 23) и В 4 VKv4 (SEQ ID NO: 29). Понятно, что путем комбинаторного паросочетания В 4 VHvx и В 4 VKvy из полного набора полипептидов В 4 VHvx и В 4VKvy, предполагаемых согласно изобретению, легко получить другие воплощения изобретения. Затем полезные комбинации определяют экспериментально, путем анализа содержащих данные комбинации-9 016429 белковых композиций, таких как антитело В 4 VHvx/VKvy, на способность экспрессироваться и связываться с CD-19, а также на пониженную иммуногенность, в соответствии с тем, как описано более подробно ниже. Подтверждение пониженной иммуногенности вариабельных областей по изобретению Для подтверждения того факта, что мутация по изобретению действительно приводит к снижению иммуногенности, могут быть использованы стандартные экспериментальные тесты, которые хорошо известны в данной области техники. Например, может быть использован анализ стимуляции Т-клеток(например, Jones et al., (2004), J. Interferon Cytokine Res., 24:560). Для выполнения такого анализа получают и культивируют в стандартных условиях мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) человека. После возможной предварительной стимуляции пептид, соответствующий потенциальному эпитопу, презентируемому молекулой МНС класса II, добавляют к культуре РВМС; РВМС дополнительно инкубируют и затем добавляют меченый тритием тимидин. Минимальный пептид может представлять собой 9-мер или может содержать приблизительно от 10 до 15 или более 15 аминокислот. После дополнительной инкубации клеток с помощью стандартных методик измеряют включение меченого тритием тимидина в ДНК. Считают, что анализ стимуляции Т-клеток основан на следующих механизмах. Во-первых, если пептид используют в качестве стимулятора, данный пептид должен сначала связаться с молекулой МНС класса II, присутствующей на клетке РВМС-популяции. Во-вторых, комплекс МНС класса II/пептид должен эффективно взаимодействовать с Т-клеточным рецептором на CD4+ Т-клетке. Если тестируемый пептид не способен связываться с молекулой МНС класса II достаточно сильно, сигнал будет отсутствовать. Если пептид способен связываться с молекулой МНС класса II и существуют Т-клетки, экспрессирующие Т-клеточный рецептор с подходящей структурой, способный распознавать конкретный комплекс МНС класса II/пептид, должен появляться сигнал. Однако, если такие Т-клетки были элиминированы в результате процесса отрицательной селекции, сигнал будет отсутствовать. Считают, что данные механизмы имеют отношение к иммуногенности белковой последовательности, такой вывод основан на том факте, что данный пептид способен или не способен вызывать стимуляцию. Если распознающие Т-клетки присутствуют в РВМС-популяции в очень низком количестве по случайным причинам, относящимся к недостатку подходящего Т-клеточного рецептора, что может случиться, или к пролиферации других, неродственных Т-клеток с последующим гомеостазом популяции Тклеток, сигнал также может отсутствовать, даже несмотря на то, что следовало ожидать появление сигнала. Соответственно, может иметь место ложный отрицательный результат. На основе этих соображений важно использовать РВМС из большого числа различных источников и тестировать данные пробы независимо. Обычно также является полезным тестирование РВМС от этнически разных популяций людей и определение аллелей МНС класса II, присутствующих в каждой РВМС-популяции. Стандартный анализ с участием Т-клеток имеет тот недостаток, что сигнал от включения трития часто только в два раза превышает сигнал фонового включения. Белки и пептиды по изобретению также могут быть тестированы с использованием модифицированного анализа с участием Т-клеток, в котором,например, очищенные CD4+ Т-клетки и очищенные дендритные клетки культивируют вместе в присутствии тестируемого пептида, затем подвергают воздействию меченого тритием тимидина и затем анализируют включение меченого тритием тимидина. Второй анализ имеет то преимущество, что включение меченого тритием тимидина в другие клетки, такие как CD8+ Т-клетки, по существу, исключается, и фон, соответственно, уменьшается. Третий анализ включает тестирование белка-кандидата с пониженной иммуногенностью в животном, например в приматах. Такой анализ обычно включал тестирование белковой композиции В 4VHvx/VKvy, например антитела, которая была создана путем тестирования потенциальной иммуногенности отдельных пептидных компонентов с использованием анализа, предполагающего участие клеток,например такого, как описано выше. Когда такая белковая композиция-кандидат В 4 VHvx/VKvy создана и экспрессирована, иммуногенность белка тестируют путем инъекции животному. Инъекцию белковой композиции В 4 VHvx/VKvy обычно выполняют таким же путем, как предполагаемый путь доставки при терапевтическом применении в лечении человека. Например, может быть использована интрадермальная, подкожная, внутримышечная, внутрибрюшинная инъекция или внутривенная инфузия. Если используют более одного введения, введение может осуществляться разными путями. Для целей тестирования иммуногенности может оказаться полезным совместное введение с адъювантом для усиления сигнала и сведения к минимуму количества животных, которое необходимо использовать. Если используют адъювант, можно использовать адъювант, не содержащий белковый компонент, такой как ДНК с неметилированными динуклеотидами CpG, бактериальный липид А, Nформилметионин или другие бактериальные небелковые компоненты. Безотносительно к какой-либо теории обоснование исключения белок-содержащих адъювантов состоит в том, что другие белки могут иметь эпитопы, распознаваемые Т-клетками, которые, в конечном счете, будут способствовать образованию антител против белка-кандидата. После одного или более чем одного введения белковой композиции-кандидата В 4 VHvx/VKv при- 10016429 сутствие антиидиотипических антител тестируют в соответствии со стандартными методиками, такими как методика ELISA. Установлено, что белковые композиции В 4 VHvx/VKvy по изобретению индуцируют образование антител менее часто и в меньшей степени, чем соответствующие молекулы, содержащие исходные последовательности В 4 VH/VK. Другие конфигурации вариабельных областей по изобретению Кроме применения V-областей по изобретению в "голом" антителе (naked antibody) V-области по изобретению также можно использовать в конфигурациях слитых белков-антител, которые распознают мишени-токсины, иммуностимуляторы и другие белка, а также в Fab, одноцепочечных Fv, биспецифических антителах и в других конфигурациях, известных в области инженерии антител. В некоторых воплощениях изобретения вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи могут быть соединены, соответственно, с константной областью легкой цепи и константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина. Легкие цепи иммуноглобулина содержат константные области, которые созданы на основе либо каппа-, либо лямбда-цепей. В конкретном воплощении по изобретению константная область легкой цепи представляет собой каппа-цепь. Константные области тяжелой цепи и их различные модификации и комбинации более подробно рассмотрены ниже.Fc-фрагмент Вариабельные домены антитела по настоящему изобретению возможно слиты с Fc-фрагментом. В контексте данного описания Fc-фрагмент включает домены, происходящие от константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, предпочтительно иммуноглобулина человека, включая фрагмент, аналог,вариант, мутант или производное константной области. Константную область тяжелой цепи иммуноглобулина определяют как природный или искусственно полученный полипептид, гомологичный по меньшей мере части С-концевой области тяжелой цепи, включающей домены СН 1, шарнирный, СН 2, СН 3 и,для некоторых классов тяжелых цепей, СН 4. "Шарнирная" область свывает СН 1-домен с областью СН 2 СН 3 Fc-фрагмента. Аминокислотные последовательности константной области тяжелых цепей иммуноглобулинов у всех млекопитающих проявляют большое сходство. Последовательности ДНК данных областей иммуноглобулина хорошо извести в данной области техники. (См., например, Gillies et al. (1989)J. Immunol. Meth. 125:191). В настоящем изобретени Fc-фрагмент обычно включает по меньшей мере СН 2-домен. Например,Fc-фрагмент может включать всю константную область тяжелой цепи иммуноглобулина (СН 1 шарнирная область-СН 2-СН 3). Альтернативно, Fc-фрагмент может включать всю шарнирную область или ее часть, СН 2-домен и СН 3-домен. Константная область иммуноглобулина ответственна за многие важные эффекторные функции антитела, включая функции, которые опосредованы связыванием с Fc-рецептором (FcR) и связыванием с комплементом. Существует пять основных классов константной области тяжелой цепи, классифицированных как IgA, IgG, IgD, IgE и IgM, каждый со своими характерными эффекторными функциями, определяемыми изотипом.IgG, например, представлен четырьмя -изотипами: 1, 2, 3 и 4, которые также известны какlgG1, lgG2, lgG3 и lgG4 соответственно. Молекулы IgG могут взаимодействовать с несколькими классами клеточных рецепторов, включая три классса Fc-рецепторов (FcR) со специфичностью к антителамlgG-класса, а именно FcYRI, FCyRII и FCyRIII. Согласно опубликованным данным, последовательности,важные для связывания IgG с FCyR-рецепторами, находятся в СН 2- и СН 3-доменах. Наиболее известные эффекторные функции антител, в особенности антител lgG-класса, включают комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) и антитело-зависимую клеточную цитотоксичность(ADCC). Все подклассы IgG (lgG1, lgG2, lgG3, lgG4) в некоторой степени опосредуют CDC и ADCC, но наиболее эффективно обе эти функции осуществляют lgG1 и lgG3 (Chapter 3, Table 3 in Paul, EssentialImmunology 4.sup.th Ed., p. 62). Считается, что существует несколько механизмов CDC; один механизм инициируется, когда антитело связывается с антигеном на поверхности клетки. Считается, что после образования комплекса антиген-антитело молекула C1q связывается с комплексом антиген-антитело. ЗатемC1q саморасщепляется и инициирует каскад ферментативной активации и расщепления других белков комплемента, которые затем связываются с поверхностью клетки-мишени и способствуют ее гибели в результате, например, клеточного лизиса и/или разрушения макрофагом. Считается, что ADCC имеет место в том случае, когда Fc-рецепторы цитотоксических клеток, таких как природные киллеры (NKклетки), макрофаги и нейтрофилы, связываются с Fc-областью антител, связанных с антигеном на поверхности клетки. Связывание Fc-рецептора является сигналом для цитотоксической клетки к уничтожению клетки-мишени. Характерно, что NK-клетки, которые, как считают, являются первичными медиаторами ADCC, экспрессируют только FcRIIIa. Часто является полезным изменение эффекторных функций антитела. Например, для лечения онкологических заболеваний, ассоциированных с В-клеточной неоплазией, или для лечения аутоиммунных заболеваний с В-клеточным компонентом, является полезным повышение ADCC-активности антитела. В особенности полезным может оказаться повышение ADCC-активности антитела против поверхностых антигенов В-клетки, плотность которых является относительно низкой (Niwa et al., (2005) Clin. CancerRes. 11:2327-2336), такого как антитело против CD19. Считается, что плотность антигена CD19 по сравнению с плотностью CD20 на поверхности В-клеток приблизительно в 10 раз ниже. Изменения антител,которые повышают ADCC-активность антитела относительно соответствующего исходного антитела известны в данной области техники и обычно коррелируют с модификациями, которые повышают аффинность связывания вариантного антитела с FcRIII (см., например, патент US 6737056). Например,мутации вводят в Fc-область в одной или более чем одной позиции (согласно их позиции в lgG1), выбранной из 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 339, 360, 378 и 430 (нумерация согласно Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991). Предпочтительно мутации вводят в одну или более чем одну позицию, выбранную из 298, 333 и 334. Например, могут быть введены аланиновые замены. На ADCC-активность антитела также оказывает влияние конкретная клеточная линия, используемая для получения антитела. Например, антитела, продуцированные в клетках мышиной миеломы NS/0(или в клетках SP2/0) обычно имеют низкую ADCC-активность, а антитела, продуцированные в клетках крысиной миеломы YO (или в клетках YB2/0) имеют высокую ADCC-активность (Lifely et al., (1995)Glycobiology 5:813 - 822). В данной области техники известно, что тип клеточной линии, используемой для экспрессии антитела, влияет на углеводную структуру N-связанной гликозильной цепи, которая соединена с Fc-областью антитела в позиции, соответствующей N297 в lgG1. Углеводная структура антител, продуцированных в клетках СНО, фукозилирована, тогда как на углеводной цепи антител, продуцированных в YB2/0, фукоза почти совершенно отсутствует (Shinkawa et al., (2003) JBC 278:3466- 3473). Антитела, у которых углеводная структура не содержит фукозы, связываются с FcRIIIa человека с большей аффинностью (Shields et al., (2002) JBC 277:26733-26740). В некоторых воплощениях антитела против CD19 с вариабельными областями по изобретению отличаются уменьшенным фукозилированиемN-связанной гликозильной цепи Fc-фрагмента антитела. Часто является полезным изменение времени полужизни антитела в сыворотке крови. На время полужизни в сыворотке крови такого антитела, как слитый белок иммуноглобулина, оказывает влияние способность этого антитела связываться с Fc-рецептором (FcR) (Gillies et al., Cancer Research (1999) 59:2159-66). CH2- и СН 3-домены lgG2 и lgG4 имеют необнаруживаемую или уменьшенную аффинность связывания с Fc-рецепторами по сравнению с СН 2- и СН 3-доменами lgG1. Соответственно, время полужизни в сыворотке крови антитела по изобретению может быть увеличено путем использования СН 2 и/или СН 3-домена от изотипов lgG2 или lgG4. Альтернативно, антитело может включать СН 2- и/или СН 3-домен от lgG1 или lgG3 с одной или более чем одной модифицированной аминокислотой в данных доменах для уменьшения аффинности связывания с Fc-рецепторами (см., например, заявку на патент США 09/256156, опубликованную как публикация заявки на патент США 2003-0105294). Шарнирная область Fc-фрагмента в норме примыкает к С-концу СН 1-домена константной области тяжелой цепи. Шарнирная область, включенная в белки по настоящему изобретению, гомологична природной области иммуноглобулина и обычно включает цистеиновые остатки, связывающие две тяжелые цепи посредством дисульфидных связей, как в природных иммуноглобулинах. Типичные последовательности шарнирных областей иммуноглобулинов человека и мыши можно найти в ANTIBODY ENGINEERING, a PRACTICAL GUIDE, (Borrebaeck, ed., W. H. Freeman and Co., 1992). Подходящие шарнирные области по настоящему изобретению могут происходить от lgG1, lgG2,lgG3, lgG4 и других изотипов иммуноглобулинов. Изотип lgG1 имеет две дисульфидные связи в шарнирной области, что позволяет образовать эффективную и прочную дисульфидную связь. Поэтому предпочтительная шарнирная область по настоящему изобретению происходит от lgG1. Возможно, чтобы первый с N-конца цистеин шарнирной области lgG1 был мутирован с целью повышения экспрессии и эффективности сборки антител или слитых белков антител по изобретению (см., например, заявку на патент США 10/093958, опубликованную как публикация заявки на патент США 2003-0044423). Как известно, в отличие от lgG1, образование межцепочечных дисульфидных связей в шарнирной области lgG4 происходит неэффективно (Angal et al., (1993), Mol. Immunol. 30:105-8). Также, шарнирная область lgG2 имеет четыре дисульфидные связи, которые имеют тенденцию увеличивать олигомеризацию и вероятность неправильного дисульфидного связывания во время секреции в рекомбинантных системах. Одна подходящая шарнирная область по настоящему изобретению может происходить от шарнирной области lgG4, предпочтительно содержащей мутацию, которая повышает вероятность образования правильных дисульфидных связей между группировками, происходящими от тяжелых цепей (Angalet al., (1993), Mol. Immunol. 30(1):105-8). Другая предпочтительная шарнирная область происходит от шарнирной области lgG2, в которой первые два цистеина мутированы путем замены на другую аминокислоту, такую как (в порядке предпочтения) серин, аланин, треонин, пролин, глутаминовая кислота,глутамин, лизин, гистидин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, глицин, метионин, валин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, триптофан или селеноцистеин (см., например, публикацию заявки на патент США 2003-0044423).Fc-фрагмент, слитый с вариабельной областью антитела по изобретению, может содержать СН 2 и/или СН 3-домены и шарнирную область, которые происходят от разных изотипов антител. Например,Fc-фрагмент может содержать СН 2- и/или СН 3-домены от lgG2 или lgG4 и шарнирную область от IgG1- 12016429 Сборка таких гибридных Fc-фрагментов описана в публикации заявки на патент США 2003-0044423.Fc-фрагмент, слитый с вариабельной областью антитела по изобретению, может содержать одну или более чем одну аминокислотную модификацию, которая обычно увеличивает время полужизни в сыворотке крови слитого белка, включающего Fc. Такие аминокислотные модификации включают мутации, по существу, уменьшающие или полностью подавляющие связывание с Fc-рецептором или комплемент-фиксирующую активность. Например, один тип такой мутации удаляет сайт гликозилирования наFc-фрагменте тяжелой цепи иммуноглобулина. В lgG1 сайтом гликозилирования является Asn297 (см.,например, заявку на патент США 10/310719, опубликованную как публикация заявки на патент США 2003-0166163). Вариабельные области антитела по изобретению могут быть присоединены к диагностическому и/или терапевтическому агенту. Данный агент может быть слит с антителом с получением слитого белка. Альтернативно, данный агент может быть химически соединен с антителом с получением иммуноконъюгата. Данный агент может представлять собой, например, токсин, радиоактивную метку, радиофармацевтический агент, иммуностимулирующую группировку или тому подобное. Вариабельная область антитела по изобретению может быть присоединена к цитокину. Предпочтительные цитокины включают интерлейкины, такие как интерлейкин-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10,IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21 и IL-23, гемопоэтические факторы, такие как гранулоцитмакрофаг колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцит-колониестимулирующий фактор (GCSF) и эритропоэтин, факторы некроза опухоли (TNF), такие как TNF, лимфокины, такие как лимфотоксин, регуляторы метаболических процессов, такие как лептин, интерфероны, такие как интерферон ,интерферони интерферон , и хемокины. Предпочтительно, слитый белок или иммуноконъюгат антитело-цитокин обладают биологической активностью цитокина. В одном воплощении вариабельный домен антитела слит с IL-2. Предпочтительно, чтобы несколько аминокислот IL-2-группировки были мутированы с целью уменьшения токсичности, как описано в публикации заявки на патенте США 20030166163. Возможно, белковые комплексы могут дополнительно включать второй агент, например второй цитокин. В одном воплощении слитый белок антитела В 4 VHvx/VKvy включает IL-12 и IL-2. Конструкция белковых комплексов, содержащих домен иммуноглобулина и два разных цитокина, подробно описана в патенте U.S. 6617135. Продуцирование антител Для продуцирования антител по изобретению, а также других белков, содержащих вариабельные области, по изобретению, используют методики, хорошо известные в области белковой инженерии. Нуклеиновую кислоту векторов, способных экспрессировать тяжелую цепь и легкую цепь, которые содержат последовательности по изобретению, вводят в подходящую клетку и продукт, представляющий собой рекомбинантный белок, экспрессируют и очищают. Например, антитела по изобретению могут быть продуцированы в специализированных линиях клеток млекопитающих, таких как клетки NS/0, клетки СНО, клетки SP2/0 (SP2/0-Ag14; ATCC-CRL 1581), клетки YB2/0 (YB2/3HLP2.G11,16Ag.20; ATCC CRL1662), или в других клетках млекопитающих, хорошо известных в области продуцирования антител. В одном воплощении антитела В 4 VHvx/VKvy продуцируют в клетках NS/0. В другом воплощении антитела В 4 VHvx/VKvy продуцируют в клетках YB2/0. Альтернативно, для продуцирования белков, содержащих вариабельные области по изобретению, могут быть использованы клетки дрожжей, растений, насекомых или бактерии. Введение Антитела по изобретению предпочтительно применяют в лечении пациентов с В-клеточными расстройствами, такими как В-клеточные лимфомы или аутоиммунные расстройства с В-клеточным компонентом, такие как ревматоидный артрит, злокачественная миастения, рассеянный склероз, системная красная волчанка и так далее. В зависимости от заключения врача, они могут оказаться полезными в лечении пациента с В-клеточной лимфомой, когда другие терапии не дают положительных результатов. Например, некоторые пациенты, которых лечат Rituxan, сначала могут отвечать на это лечение, но могут возникнуть Rituxan-резистентные раковые клетки. Такие пациенты в большинстве случаев все еще должны реагировать на лечение антителами по изобретению. В случае антител против CD19 иногда полезно вывести из организма нормальные В-клетки, так как существует вероятность, что эти клетки будут оттитровывать антитело по изобретению. Для этой цели может быть использован Rituxan, в соответствии со стандартными методиками. Альтернативно, для выведения из организма нормальных В-клеток могут быть использованы антитела против CD 19 по изобретению, например, таким образом, как описано в примере 5 и примере 9. Предпочтительным способом введения является инфузия. Другие способы введения включают инъекцию, такую как подкожная, интрадермальная, внутримышечная, внутрибрюшинная или внутривенная(болюсная) доставка. Ингаляция и пероральная доставка также являются возможными путями доставки. Для человека с массой тела 70 кг типичная доза находится в диапазоне от приблизительно 50 мг до 2 гм, предпочтительная доза находится в диапазоне приблизительно 400-600 мг. Введение можно повто- 13016429 рять приблизительно один раз кажды три - шесть недель, например, в течение которых осуществляют мониторинг нормальных В-клеток и опухолевых клеток. Слитые белки по настоящему изобретению являются полезными в лечении у человека такого заболевания, как онкологическое заболевание. При лечении онкологического заболевания является полезным, например, введение слитого белка антитело-IL-2, содержащего вариабельные области по изобретению, путем инфузии или подкожной инъекции, с использованием доз от 0,1 до 100 мг/метер 2/пациента. В предпочтительном воплощении в особенности полезным является введение слитого белка антитело-IL-2,содержащего вариабельные области по изобретению, путем инфузии или подкожной инъекции, с использованием доз от 1 до 10 мг/метер 2/пациента и более предпочтительно с использованием доз приблизительно 3-6 мг/метер 2/пациента. Фармацевтические композиции по изобретению можно применять в форме твердых, полутвердых или жидких лекарственных форм, таких как, например, пилюли, капсулы, порошки, жидкости, суспензии или тому подобное, предпочтительно в стандартных лекарственных формах, подходящих для введения точных доз. Данные композиции включают стандартный фармацевтический носитель или эксципиент и,кроме того, могут включать другие лекарственные агенты, фармацевтические агенты, носители, адъюванты и так далее. Такие эксципиенты могут включать другие белки, такие как, например, человеческий сывороточный альбумин или белки плазмы. Современные методики приготовления таких лекарственных форм являются известными или обычно очевидны специалистам в данной области техники. Композиция или препарат, которые будут вводить, в любом случае, должны содержать активный(е) компонент(ы) в количестве, эффективном для достижения желаемого эффекта у субъекта, которого лечат. Введение композиций по изобретению может быть выполнено любым способом введения, принятым для агентов, которые обладают такой активностью. Данные способы представляют собой местное или системное введение. Предпочтительным способом введения является внутривенная инъекция в фармацевтически приемлемом носителе. Количество вводимого активного соединения, конечно, должно зависеть от субъекта, которого лечат, тяжести заболевания, способа введения и заключения врача, назначающего лекарство. Изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами. Пример 1. Конструирование антител против CD19, содержащих вариабельную область тяжелой и легкой цепей по изобретению. Для введения последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих область тяжелой цепи и область легкой цепи по изобретению, в подходящий вектор для экспрессии в клетках млекопитающих использовали стандартные методики генной инженерии. Типичные стратегии клонирования описаны ниже. Экспрессирующий вектор pdHL12 представляет собой вектор, который относится к более поздней генерации экспрессирующего вектора pdHL и содержит уникальные рестрикционные сайты для встраивания кассет нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепей. КонструкцияpdHL12 позволяет встраивать нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи,как Nhe I/Hind III фрагмент, а нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельную область легкой цепи,как Afl II/Bam HI фрагмент, и совместно экспрессировать интактные тяжелую и легкую цепи антитела(смотри, например, заявку на патент США 2003/0157054). Последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующие вариабельным областям тяжелой цепи по изобретению, фланкированные последовательностями, содержащими последовательности, узнаваемые эндонуклеазами рестрикции, а именно последовательностью 5-CTTAAGC-3' (на 5'-конце; содержащей Nhe I сайт) и последовательностью 5-CGTAAGTGGATCC-3' (на 3'-конце; содержащей Hind III сайт), синтезировали de novo и встраивали в плазмидный вектор, являющийся производным pUC-вектора(Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA). Нуклеиновую кислоту вырезали из плазмидного вектора в видеNhe I/Hind III фрагмента и лигировали с подходящим фрагментом вектора плазмиды pdHL12, расщепленной таким же образом. Последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующие В 4 VH0 (SEQID NO: 5), B4 VHv5 (SEQ ID NO: 6) и В 4 VHv6 (SEQ ID NO: 7) приведены. Аналогично, нуклеиновые кислоты вариабельных областей легкой цепи по изобретению, фланкированные последовательностями, содержащими последовательности, узнаваемые эндонуклеазами рестрикции, а именно последовательностью 5'-GCTAGCTCCAGC-3' (на 5'-конце; содержащей Afl II сайт) и последовательностью 5-GGTAAGCTT-3' (на 3'-конце; содержащей Bam HI сайт), синтезировали de novo и встраивали в плазмидный вектор, являющийся производным pUC-вектора (Blue Heron Biotechnology,Bothell, WA). Нуклеиновую кислоту вырезали из плазмидного вектора в виде Afl II/Bam HI фрагмента и лигировали с подходящим фрагментом вектора плазмиды pdHL12, расщепленной таким же образом. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие В 4 VK0 (SEQ ID NO: 8), В 4 VKv1 (SEQ ID NO: 9),B4 VKv2 (SEQ ID NO: 10), B4 VKv3 (SEQ ID NO: 11) и В 4 VKv4 (SEQ ID NO: 12) приведены. В результате комбинаторного встраивания в pdHL12 последовательностей нуклеиновой кислоты,кодирующих разные вариабельные области тяжелой и легкой цепей, получали набор плазмид, кодирующих антитела В 4 по изобретению, В 4 VHvx/VKvy. Пример 2. Экспрессия и очистка антител по изобретению. Далее в примерах использованы сле- 14016429 дующие общие методики. 1A. Культура клеток и трансфекция. Для временной экспрессии антител в клетках млекопитающих плазмидную ДНК вводят в клетки почек эмбриона человека (линии 293) или в клетки почек детеныша хомяка (ВНК) путем копреципитации плазмидной ДНК фосфатом кальция и клетки выращивают без использования селекции для поддерживания плазмиды [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,N.Y.]. Стабильно трансфицированные клоны получают с помощью одной из стандартных методик, например, путем электропорации или путем нуклеофекции. Электропорацию ДНК в клетки мышиной миеломы NS/0 выполняют следующим образом. Клетки NS/0 выращивают в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM, Life Technologies) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 1 пенициллина/срептомицина. Приблизительно 5106 клеток промывают один раз PBS и ресуспендируют в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Затем 10 мкг линеаризованной плазмидной ДНК инкубируют с данными клетками в Gene Pulser Cuvette (межэлектродное расстояние 0,4 см, BioRad) в течение 10 мин на льду. Электропорацию выполняют с использованием Gene Pulser (BioRad) в режиме 0,25 V и microF. Клетки выдерживают на льду в течение 10 мин для регенерации, затем их ресуспендируют в ростовой среде, и затем высевают в два 96-луночных планшета. Стабильно трансфицированные клоны отбирают по их способности расти в присутствии 100 нМ метотрексата (МТХ), который вводят через двое суток после трансфекции. Клеткам заменяют питательную среду каждые 3 суток, эту операцию повторяют два-три раза, и клоны, устойчивые к МТХ, обычно появляются через 2-3 недели. С целью идентификации суперпродуцентов супернатанты клонов анализируют с помощью anti-huFc ELISA [Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:191]. Клоны-суперпродуценты выделяют и размножают в ростовой среде, содержащей 100 нМ МТХ. Аналогично, для получения стабильно трансфицированных клонов с помощью, по существу, той же самой методик могут быть использованы другие клеточные линии, такие как клетки СНО, клетки ВНК,клетки SP2/0 и клетки YB2/0. Когда использовали клетки YB2/0, стабильно трансфицированные клоны обычно отбирали по их способности расти в присутствии 50 нМ МТХ. Стабильно трансфицированные клоны, например, клеток крысиной миеломы YB2/0 также получали путем нуклеофекции. Приблизительно 2106 клеток YB2/0, выращенных в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением инактивированной теплом 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 1 пенициллина/срептомицина, центрифугировали при 90g при комнатной температуре в течение 10 мин и ресуспендировали в 100 мкл раствора Nucleofector Solution V (из набора). 100 мкл данной клеточной суспензии смешивали с 2 мкг линеаризованной плазмидной ДНК (линеаризованной по Fsp I сайту в последовательности -лактамазы), переносили в кювету (Amaxa) и выполняли нуклеофекцию с использованием подходящей Nucleofector (Amaxa) программы, Q-20. Добавляли 500 мкл предварительно нагретой культуральной среды и данную пробу переносили в лунку 12-луночного планшета. Через сутки после трансфекции клетки ресуспендировали в ростовой среде и высевали в 96-луночные планшеты с плотностью клеток в диапазоне от приблизительно 10 клеток/лунку до приблизительно 600 клеток/лунку. Стабильно трансфицированные клоны отбирали по способности расти в присутствии 50 нМ метотрексата (МТХ), который вводили через двое суток после трасфекции. Клеткам заменяли питательную среду каждые 2 или 3 суток, эту операцию повторяли дважды, и клоны, устойчивые к МТХ, обычно появлялись через 2-3 недели. С целью идентификации суперпродуцентов супернатанты клонов анализировали с помощью anti-huFc ELISA [Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:191]. Клоны-суперпродуценты выделяли и размножали в ростовой среде, содержащей 50 нМ МТХ. Клетки могут быть выращены в другой среде, известной в данной области техники, такой какHSFM с добавлением 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки и 100 нМ метотрексата, или безбелковая среда, такая как среда CD. 1 Б. ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). Для определения концентрации белковых продуктов в супернатантах клонов, устойчивых к МТХ, и в других тестируемых пробах используют различные ва рианты ELISA. Например, anti-huFc ELISA используют для измерения количества белков, содержащих человеческий Fc, например, химерных антител,а anti-hu kappa ELISA используют для измерения количества легкой цепи каппа (химерных или человеческих иммуноглобулинов).Anti-huFc ELISA описан подробно ниже. А. Покрытие планшетов. Планшеты для ELISA покрывают антителом AffiniPure Goat Anti-Human IgG (H+L) (Jackson Immuno Research) в концентрации 5 мкг/мл в PBS, внося в 96-луночные планшеты (Nunc-Immuno plate Maxisorp) 100 мкл/лунку. Покрываемые планшеты накрывают крышкой и инкубируют при 4 С в течение ночи. Затем планшеты промывают 4 раза 0,05% Твином (Твин 20) в PBS и блокируют 1% BSA/1% сывороткой козы в PBS, 200 мкл/лунку. После инкубации с блокирующим буфером при 37 С в течение 2 ч- 15016429 планшеты промывают 4 раза 0,05% Твином в PBS, и удаляют жидкость путем стряхивания на бумажные полотенца. Б. Инкубация с тестируемыми пробами и вторичным антителом. Тестируемые пробы разбавляют до подходящих концентраций в буфере для проб, который содержит 1% BSA/1% сыворотку козы/0,05% Твин в PBS. Для построения калибровочной кривой используют химерное антитело (с человеческим Fc), концентрация которого известна. Для построения калибровочной кривой выполняют серию разведений в буфере для проб, и получают калибровочную кривую в диапазоне от 125 до 3,9 нг/мл. Разбавленные пробы и стандарты добавляют в планшет, 100 мкл/лунку, и данный планшет инкубируют при 37 С в течение 2 ч. После инкубации планшет промывают 8 раз 0,05% Твином в PBS. Затем в каждую лунку добавляют 100 мкл вторичного антитела, антитела Anti-Human IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP)(Jackson Immuno Research), разбавленного приблизительно 1:120000 буфером для проб. Точное разбавление вторичного антитела должно определяться для каждой партии HRP-конъюгированного Anti-HumanIgG. После инкубации при 37 С в течение 2 ч планшет промывают 8 раз 0,05% Твином в PBS. В. Проявление. В планшет добавляют раствор субстрата, 100 мкл/лунку. Раствор субстрата готовят путем растворения 30 мг дигидрохлорида орто-фенилендиамина (OPD) (1 таблетка) в 15 мл буфера 0,025 М лимонная кислота/0,05 М Na2HPO4, pH 5, который содержит 0,03% свежедобавленной Н 2 О 2. Для появления окраски выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Время проявления меняется от партии к партии в зависимости от возможных изменений, связанных с покрытием планшетов, вторичного антитела и так далее. Для определения момента остановки реакции наблюдают за появлением окраски в стандартах, соответствующих калибровочной кривой. Реакцию останавливают путем добавления 4 н. H2SO4, 100 мкл/лунку. Планшет считывают с помощью планшет-ридера, который настраивают на 490 нм и 650 нм и программируют на вычитание фонового значения OD при 650 нм из OD при 490 нм.Anti-hu kappa ELISA выполняют в соответствии с той же методикой, которая описана выше, за исключением того, что используемое вторичное антитело представляет собой антитело Goat Anti-hu kappa,конъюгированное с пероксидазой хрена (Southern Biotechnology Assoc. Inc., Birmingham, Ala.), которое используют в разведении 1:4000. Очистка. Стандартные методики очистки антител заключались в следующем. Обычно композиции антитела В 4 VHvx/VKvy по изобретению очищали из супернатантов клеточных культур путем хроматографии на сорбентах с белком А, которая основана на аффинности Fc-фрагмента к белку А. Подготовленный супернатант клеток, экспрессирующих композиции антитела В 4 VHvx/VKvy, загружали на предварительно уравновешенную колонку Fast-Flow Protein A-Sepharose. Колонку интенсивно промывали натрийфосфатным буфером (50 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, нейтральный рН). Связанный белок элюировали натрий-фосфатным буфером с низким рН (рН 2,5-3) (состав см. выше), и элюированные фракции сразу нейтрализовали 1 М Tris-base до приблизительно рН 6,5. Композиции хранили в буфере 50 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, pH 6,5 с добавлением Твина 80 до 0,01%. Степень чистоты и целостности продукта обычно определяли путем ЖХВД эксклюзионной хроматографии и путем ДСН-ПААГ-электрофореза. Результаты показывали, что антитела В 4 VHvx/VKvy по изобретению обычно более чем на 90% являются неагрегированными и интактными, с небольшими признаками продуктов деградации. Пример 3. Определение относительной аффинности связывания антител В 4 по изобретению с CD19-презентирующими клетками. Чтобы убедиться в том, что антитела по изобретению сохраняют способность связываться с CD19,использовали конкурентный анализ, где измеряли эффективность, с которой данные антитела ингибируют связывание меченого исходного антитела В 4 (В 4 VH0/VK0) с клетками лимфомы линии Дауди, которые несут антиген CD19. Меченое биотином антитело В 4 VH0/VK0 получали с использованием набора EZ-link Sulfo-NHSLC-Biotinylation Kit (Pierce,21430) согласно прилагаемому протоколу. Продукт диализировали на Slidea-lyzer (Pierce,66425) и анализировали путем ЖХВД эксклюзионной хроматографии. В общих чертах, готовили серию титрований меченого биотином антитела В 4 VH0/VK0, предварительно смешанного в конечной концентрации 100 нг/мл с одним из немеченых тестируемых антител В 4VHvx/VKvy в концентрации 800 нг/мл, 400 нг/мл, 200 нг/мл, 100 нг/мл и 50 нг/мл в буфере PBS/2% сыворотка. В качестве контроля использовали меченое биотином антитело, предварительно смешанное с немеченым антителом В 4 VH0/VK0 в тех же концентрациях, что и выше (контроль ингибирования), или только с одним буфером (положительный контроль связывания). Смешанные антитела добавляли к клеткам Дауди и выдерживали в течение 30 мин при 4 С. К клеткам добавляли стрептавидин, меченый FITC(флюоресцеин-изотиоцианатом), в разведении 1:200, и данные пробы инкубировали дополнительно в течение 30 минут при 4 С. Количество связанного меченого антитела В 4 VH0/VK0 измеряли с помощьюFACS-анализа и результаты измерений выражали в виде "процента ингибирования" относительно положительно контроля связывания. Тестировали антитела В 4 VH0/VK0 (С), B4 VHv1/VKv1 (1), В 4VHv3/VKv4 (7), В 4 VHv4/VKv4 (8), В 4 VHv5/VKv4 (9) и В 4 VHv6/VKv4 (10). Типичные результаты двух экспериментов приведены в табл. 3 и 4. Таблица 3. Ингибирование связывания биотин-В 4 VH0/VK0 с клетками Дауди антителами по изобретению Таблица 4. Ингибирование связывания биотин-В 4 VH0/VK0 с клетками Дауди антителами по изобретению Данные, приведенные в табл. 3 и 4, показывают, что антитела В 4 VHvx/VKvy ингибируют связывание меченого антитела В 4 с клетками Дауди в такой же степени, как и немеченое антитело В 4 VH0/VK0,что свидетельствует о том, что антитела В 4 VHvx/VKvy и антитело В 4 VH0/VK0 обладают сходной аффинностью. Пример 4. ADCC-активность антител по изобретению. Оценивали ADCC-активность, опосредуемую антителами по изобретению, продуцированными различными клеточными линиями. ADCC определяли путем стандартного анализа высвобождения 51Cr, как практикуется в данной области техники. Готовили последовательные разбавления антител (4-кратные разбавления в диапазоне от 100 до 0,025 нг/мл), и лизис 51Cr-меченых клеток Дауди (мишеней; отношение Е:Т составляло 100:1) в присутствии антител, вызываемый очищенными РВМС (эффекторными клетками) человека, измеряли по специфическому высвобождению 51Cr относительно общего клеточного 51Cr (корректировка для спонтанного высвобождения 51Cr). Тестировали антитела В 4 VHv4/VKv4, продуцированные эмбриональными клетками почки человека 293 Т или клетками YB2/0, и антитела В 4VHv5/VKv4, продуцированные клетками линии NS/0 или клетками YB2/0. На фиг. 38 приведены результаты такого эксперимента. Оба антитела, полученнные путем экспрессии в клетках YB2/0, проявляли равную активность, приводящую к опосредованной ADCC, и по меньшей мере 50-кратную активность по сравнению с соответствующим антителом, полученным путем экспрессии в клетках линии S/0 или в клетках 293 Т. В 4 VHv4/VKv4, продуцированное клетками 293 Т, проявляло большую активность, чем В 4 VHv5/VKv4, продуцированное клетками линии NS/0. Пример 5. Истощение В-клеток человека, привитых SCID-мышам, антителами по изобретению. Истощение В-клеток является полезным в нескольких терапевтических аспектах. Например, аутоиммунные и воспалительные расстройства, стимулированные антителами, можно лечить антителами по изобретению, уменьшая или, по существу, элиминируя В-клетки. Альтернативно, при лечении агентом для направленной доставки к опухоли, таким как Zevalin или Bexxar или слитый белок Leu16-IL2(WO2005/016969), сначала полезно элиминировать нормальные В-клетки. Чтобы выяснить, можно ли применять антитело по изобретению для истощения В-клеток человека,проводили следующий эксперимент. В начале эксперимента (0-е сутки) самцам мышей SCID CB17 (n = 3) прививали очищенные РВМС человека путем интраперитонеальной инъекции приблизительно 4,5107 клеток в 0,2 мл PBS, по существу, в соответствии с описанным ранее протоколом переноса клеток селезенки человека (Yacoub-Youssef et al., Transpl. Immunol. (2005) 15:157-164). Ha 3 сутки мышам интраперитонеально инъецировали либо PBS, либо 50 мкг Leu16, антитела против CD20, или K4 Н 4, антитела против CD19. Уровень IgM человека измеряли с помощью набора human IgM ELISA quantitation kitPBS, титр IgM человека постоянно увеличивался и достигал приблизительно 800 мкг/мл на 42 сутки. У мышей, которые получали лечение либо антителом Leu 16, либо антителом В 4 VHv5/VKv4, титры IgM- 17016429 человека по существу отсутствовали, что свидетельствовало о том, что В-клетки человека истощались при лечении данными антителами. Пример 6. Лечение лимфомы у млекопитающего антителом по изобретению. Чтобы выяснить, являются ли антитела по изобретению функциональными in vivo, антитело В 4VHv4/VKv4, экспрессированное в клетках YB2/0, тестировали на животной модели лимфомы человека. В начале эксперимента (0-е сутки) мышам SCID CB17 в возрасте восьми недель (n = 6) внутривенно инъецировали приблизительно 1106 жизнеспособных клеток Намальвы Nalm-6-UM-1. На 1, 3 и 5 сутки мыши получали в качестве лечения 500 мкг антитела интраперитонеально или PBS. Приблизительно один - два раза в неделю мышей обследовали, чтобы выяснить, у каких из мышей развитие болезни достигло стадии, требующей эвтаназии. На фиг. 40 приведены типичные результаты такого эксперимента. Все мыши, получавшие в качестве лечения PBS, заболевали в течение 10 недель после инъекции опухолевых клеток, тогда как мыши,которые получали лечение антителом В 4 VHv4/VKv4, заболевали позднее, и три из шести мышей в данной группе оставались здоровыми на протяжении всего 30-недельного эксперимента. Пример 7. Лечение лимфомы Беркитта у млекопитающего антителом по изобретению в комбинации с химиотерапией. Чтобы выяснить, можно ли применять антитела по изобретению in vivo в комбинации с химиотерапией, антитело В 4 VHv4/VKv4 тестировали на животных моделях лимфомы человека, которые были более убедительными, чем в предыдущем примере, соответствуя более запущенным или с трудом поддающимся лечению формам лимфомы. В одном типичном эксперименте лимфому, моделированную с помощью клеточной линии Дауди, которая представляет собой клеточную линию лимфомы Беркитта, лечили антителом В 4 VHv4/VKv4, экспрессированным в клетках YB2/0, с циклофосфамидом (СРА) или без циклофосфамида. В начале эксперимента (0-е сутки) мышам SCID CB17 в возрасте восьми недель (n= 6) инъецировали внутривенно приблизительно 5106 жизнеспособных клеток Дауди. На 8 и 12 сутки мыши получали в качестве лечения 100 мкг антитела или PBS. На 7 сутки мыши получали в качестве лечения PBS или 75 мкг СРА на килограмм массы тела. Для лечения использовали интраперитонеальное введение в объеме 0,2 мл. Приблизительно один - два раза в неделю мышей обследовали, чтобы выяснить, у каких из мышей развитие болезни достигло стадии, требующей эвтаназии. На фиг. 41 приведены данные типичного эксперимента. В контрольной группе, которая не получала лечения ни антителом, ни СРА, все мыши заболевали в течение четырех недель после инъекции клеток лимфомы. В группе мышей, которые получали лечение либо только одним антителом В 4 VHv4/VKv4,либо только одним СРА, 5 из 6 мышей оставались здоровыми в течение по меньшей мере пяти недель, но заболевали в течение приблизительно шести недель. В группе мышей, которые получали лечение как антителом В 4 VHv4/VKv4, так и СРА, все мыши оставались здоровыми в течение по меньшей мере восьми недель. Пример 8. Лечение диссеминированной лимфомы антителом по изобретению в комбинации с химиотерапией. В другой серии экспериментов мышам внутривенно инъецировали клетки Намальвы, в соответствии с тем, как описано в предыдущем примере, за исключением того, что использовали 2106 клеток вместо 1106 клеток. Данное увеличение количества клеток приводит к более активному развитию болезни, на что указывает сравнение фиг. 42, где все мыши, получавшие в качестве лечения PBS, заболевали в течение трех недель, с фиг. 40, где в отличие от фиг. 42, мыши, получавшие в качестве лечения PBS,заболевали в диапазоне от 5 и 10 недель. Мыши (n = 5) получали в качестве лечения 500 мкг антитела интраперитонеально или PBS на 3, 7 и 11 сутки. На 3, 7 и 11 сутки мыши также получали лечение либо циклофосфамидом (75 мг/кг, интраперитонеально), либо винкристином (0,4 мг/кг, внутривенно), либо доксорубицином (3 мг/кг, внутривенно), либо PBS (внутривенно). Результаты приведены на фиг. 42 (а-в). Данные результаты свидетельствуют о том, что каждый из трех химиотерапевтических агентов мог бы применяться в комбинации с антителом по изобретению. Пример 9. Применение антител и способов по изобретению в лечении пациента-человека. Антитела против CD19 по изобретению применяют в лечении заболеваний и расстройств человека следующим образом. В общем случае предпочтительным способом введения является внутривенная инфузия или внутривенная инъекция, хотя также возможна подкожная инъекция, ингаляция, пероральная доставка и другие способы доставки. Введение выполняют приблизительно один раз каждые 2, 3 или 4 недели, хотя частота введения может изменяться в зависимости от потребностей пациента. Типичная доза для взрослого человека составляет приблизительно 100-800 мг. За пациентами, которых лечат, осуществляют наблюдение с целью выявления признаков инфекции, которая может быть вызвана иммунодепрессией. Например, пациент с болезнью Кастлемена получает лечение антителом В 4 VHv4/VKv4 противCD19 по изобретению приблизительно один раз каждые две недели с использованием дозы приблизительно 8 мг/кг, которую вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 1 ч. Пациент с ревматоидным артритом получает лечение антителом В 4 VHv4/VKv4 против CD19 при- 18016429 близительно один раз каждые четыре недели с использованием дозы приблизительно 8 мг/кг, которую вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 1 ч. Установлено, что монотерапия в значительной степени ингибирует прогрессирование разрушения суставов, даже по сравнению с симптоммодифицирующими противоревматическими лекарствами. Пациент с болезнью Крона получает лечение антителом В 4 VHv4/VKv4 против CD19 приблизительно один раз каждые четыре недели с использованием дозы приблизительно 8 мг/кг, которую вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 1 ч. Пациент с множественной миеломой получает лечение антителом В 4 VHv4/VKv4 против CD19 приблизительно один раз каждые три недели с использованием дозы приблизительно 8 мг/кг, которую вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 1 ч. Лечение антителом В 4 VHv4/VKv4 против CD19 комбинируют со стандартным лечением множественной миеломы, назначаемым врачом в качестве лечения, подходящего для данного пациента. Пациент с В-клеточной лимфомой получает лечение антителом В 4 VHv4/VKv4 против CD19 приблизительно один раз каждые три недели с использованием дозы приблизительно 8 мг/кг, которую вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 1 ч, возможно в комбинации с таким антителом,как Rituxan, приблизительно 375 млг/м 2 площади поверхности тела, которое вводят каждую неделю,или с эпратузумабом, антителом против CD22. Альтернативно, в случае пациента с рефрактерной лимфомой, лечение антителом В 4 VHv4/VKv4 против CD19 комбинируют с радиоиммуноконъюгатом, таким как Bexxar или Zevalin. Более конкретно, пациент с В-клеточной лимфомой получает лечение антителом В 4 VHv4/VKv4 против CD19 приблизительно один раз каждые три недели с использованием дозы приблизительно 8 мг/кг, которую вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 1 ч, возможно в комбинации с химиотерапевтической схемой лечения, такой как циклофосфамид плюс винкристин плюс доксорубицин плюс преднизолон ("CHOP"), или CHOP плюс блеомицин, или CHOP плюс этопозид, или митоксантрон плюс винкристин плюс тиотепа, или этопозид плюс преднизолон плюс цитарабин плюс цисплатин,или месна плюс ифосфамид плюс митоксантрон плюс этопозид, или бендамустин, или флударабин и 2CdA. Согласно альтернативной стратегии лечения пациент с В-клеточной лимфомой сначала получает лечение антителом В 4 VHv4/VKv4 против CD19 с использованием дозы приблизительно 8 мг/кг и, кроме того, затем получает лечение слитым белком анти-CD20-IL2, таким, как описано в WO2005/016969. Например, в первый день пациент получает лечение антителом В 4 VHv4/VKv4 против CD19, которое вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 1 ч, и затем, на второй день и на четвертый день, получает лечение слитым белком анти-CD20-IL2 с использованием дозы приблизительно 150 мкг/кг, которую вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 4 ч, и данный цикл повторяют приблизительно каждые 3 недели. Безотносительно к какой-либо теории антитело В 4 VHv4A/Kv4 против CD19 обладает действием, которое приводит к очищению организма пациента от большей части нормальных В-клеток, так что слитый белок анти-CD20-IL2 оказывает действие, связываясь с оставшимися опухолевыми клетками.