Анти-αvβ6-антитела и их применение
Номер патента: 16342
Опубликовано: 30.04.2012
Авторы: Вайолетт Шейла, Ван Влеймен Герман, Купман Луиз А., Луговской Алексей А., Сальданха Хосе, Саймон Кеннет Дж., Вейнреб Пол Х.
Формула / Реферат
1. Гуманизированное антитело, полученное из исходного антитела мыши, которое специфически связывается с αvβ6, где указанное гуманизированное антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1 и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2.
2. Гуманизированное антитело по п.1, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит определяющие комплементарность области (CDR), характеризуемые аминокислотными остатками 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) и 98-109 (CDR3) последовательности SEQ ID NO: 1; и/или
вариабельный домен легкой цепи содержит определяющие комплементарность области (CDR), характеризуемые аминокислотными остатками 24-35 (CDR1), 51-57 (CDR2) и 90-98 (CDR3) последовательности SEQ ID NO:2; и/или
вариабельный домен тяжелой цепи содержит каркасные участки (FR), характеризуемые аминокислотными остатками 1-30 (FR1), 36-49 (FR2), 66-97 (FR3) и 110-120 (FR4) последовательности SEQ ID NO: 1; и/или
вариабельный домен легкой цепи содержит каркасные участки (FR), характеризуемые аминокислотными остатками 1-23 (FR1), 36-50 (FR2), 58-89 (FR3) и 99-108 (FR4) последовательности SEQ ID NO: 2.
3. Гуманизированное антитело по п.1, содержащее по меньшей мере одну аминокислотную замену в вариабельном домене тяжелой цепи или легкой цепи в последовательностях CDR1, последовательностях CDR2, последовательностях CDR3 или каркасных последовательностях.
4. Гуманизированное антитело по п.3, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 144.
5. Гуманизированное антитело по п.3, специфически связывающееся с αvβ6 и полученное из исходного гибридомного штамма 3G9 АТСС РТА-3649, где указанное гуманизированное антитело содержит CDR1, CDR2, CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи и где указанное антитело содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 или SEQ ID NO: 146.
6. Гуманизированное антитело по п.3, специфически связывающееся с αvβ6 и полученное из исходного гибридомного штамма 3G9 АТСС РТА-3649, где указанное гуманизированное антитело содержит CDR1, CDR2, CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи и где указанное антитело содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 и SEQ ID NO: 143.
7. Гуманизированное антитело, полученное из исходного антитела мыши, которое специфически связывается с αvβ6, где гуманизированное антитело содержит каждую из CDR1, CDR2, CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи и где указанное антитело содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 146 (HV3) и последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 143 (LV5).
8. Гуманизированное антитело по п.1 или 7, где исходное антитело представляет собой мышиное антитело 3G9.
9. Гуманизированное антитело по п.1 или 7, где указанное антитело может конкурировать с мышиным антителом 3G9 за связывание с αvβ6.
10. Гуманизированное антитело по п.1 или 7, где указанное антитело получают с использованием рекомбинантного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую указанное антитело.
11. Гуманизированное антитело по п.10, где указанный рекомбинантный вектор является плазмидой, выбранной из группы, состоящей из pKJS195, pKJS189 и pKJS196, где плазмида pKJS195 содержит SEQ ID NO: 5; плазмида pKJS189 содержит SEQ ID NO: 6 и плазмида pKJS196 содержит SEQ ID NO: 7.
12. Гуманизированное антитело, полученное из исходного антитела мыши 3G9, которое специфически связывается с αvβ6, причем гуманизированное антитело содержит версию 3 вариабельного домена тяжелой цепи (HV3), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду pKJS189 (SEQ ID NO: 6), и версию 5 вариабельного домена легкой цепи (LV5), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду pKJS195 (SEQ ID NO: 5).
13. Гуманизированное антитело, полученное из исходного антитела мыши 3G9, которое специфически связывается с αvβ6, причем гуманизированное антитело содержит дегликозилированную версию 3 вариабельного домена тяжелой цепи (a-HV3), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду pKJS196 (SEQ ID NO: 7), и версию 5 вариабельного домена легкой цепи (LV5), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду pKJS195 (SEQ ID NO: 5).
14. Выделенное антитело, которое специфически связывается с αvβ6, или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которое связывается с αvβ6, где антитело содержит любую из последовательностей тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 и SEQ ID NO: 146, или любую из последовательностей легкой цепи, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 и SEQ ID NO: 143.
15. Способ рекомбинантного получения антитела по любому из пп.1-14, включающий получение рекомбинантного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, которая кодирует любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:1, 2, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 или 146, и экспрессию указанного рекомбинантного вектора в клетке-хозяине в условиях, обеспечивающих продукцию антитела с любой из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 или 146, и выделение указанного антитела, продуцированного указанной клеткой-хозяином.
16. Способ по п.15, в котором указанный рекомбинантный вектор дополнительно содержит слитый ген, кодирующий легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина, причем указанный ген содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую CDR, происходящую из легкой цепи нечеловеческого антитела, имеющего специфичность связывания в отношении αvβ6, и каркасную область, происходящую из легкой цепи антитела человека.
17. Способ по п.15, в котором указанный рекомбинантный вектор выбран из группы, состоящей из плазмиды pKJS195, плазмиды pKJS189 и плазмиды pKJS196.
18. Способ по п.15, в котором указанный рекомбинантный вектор дополнительно содержит слитый ген, кодирующий тяжелую цепь гуманизированного иммуноглобулина, причем указанный ген содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую CDR, происходящую из тяжелой цепи нечеловеческого антитела, имеющего специфичность связывания в отношении αvβ6, и каркасную область, происходящую из тяжелой цепи антитела человека.
19. Способ по п.16 или 18, в котором нечеловеческим антителом является мышиное антитело 3G9.
20. Способ по п.16 или 18, в котором нечеловеческим антителом является мышиное антитело 8G6.
21. Рекомбинантная клетка-хозяин, которая экспрессирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело по любому из пп.1-14, содержащее любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 1, 2, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 или 146.
22. Гуманизированное антитело, полученное из исходного антитела мыши, которое специфически связывается с αvβ6, причем указанное гуманизированное антитело содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3 и вариабельный домен легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4.
23. Гуманизированное антитело по п.22, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит определяющие комплементарность области (CDR), характеризуемые аминокислотными остатками 31-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) и 99-115 (CDR3) последовательности SEQ ID NO: 3; и/или
вариабельный домен легкой цепи содержит определяющие комплементарность области (CDR), характеризуемые аминокислотными остатками 24-38 (CDR1), 54-60 (CDR2) и 93-101 (CDR3) последовательности SEQ ID NO: 4; и/или
вариабельный домен тяжелой цепи содержит каркасные участки (FR), характеризуемые аминокислотными остатками 1-30 (FR1), 36-49 (FR2), 67-98 (FR3) и 116-126 (FR4) последовательности SEQ ID NO: 3; и /или
где вариабельный домен легкой цепи содержит каркасные участки (FR), характеризуемые аминокислотными остатками 1-23 (FR1), 39-53 (FR2), 61-92 (FR3) и 102-111 (FR4) последовательности SEQ ID NO: 4.
24. Гуманизированное антитело по любому из пп.22 или 23, содержащее по меньшей мере одну аминокислотную замену в вариабельном домене тяжелой цепи или легкой цепи в последовательностях CDR1, последовательностях CDR2, последовательностях CDR3 или каркасных участках.
25. Гуманизированное антитело по п.24, содержащее по меньшей мере одну из аминокислотных замен в вариабельном домене тяжелой цепи, состоящих из A24G, G26S, Q39L, M48I, V68A, R72V и T74K последовательности SEQ ID NO: 3.
26. Гуманизированное антитело по п.25, содержащее аминокислотные замены в вариабельном домене тяжелой цепи (HV1'), состоящие из A24G, G26S, Q39L, M48I, V68A, R72V и T74K последовательности SEQ ID NO: 3; и/или
содержащее аминокислотные замены в вариабельном домене тяжелой цепи (HV2'), состоящие из M48I, V68A, R72V и T74K последовательности SEQ ID NO: 3; и/или
содержащее аминокислотные замены в вариабельном домене тяжелой цепи (HV3'), состоящие из V68A, R72V и T74K последовательности SEQ ID NO: 3.
27. Гуманизированное антитело по п.24, специфически связывающееся с αvβ6 и полученное из исходного гибридомного штамма 8G6 АТСС РТА-3645, причем указанное гуманизированное антитело содержит CDR1, CDR2, CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи и содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в вариабельном домене тяжелой или легкой цепи в последовательностях CDR1, CDR2, CDR3 или каркасных последовательностях, где последовательность вариабельного домена тяжелой цепи имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 или SEQ ID NO: 80, причем CDR1 легкой цепи имеет последовательность SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76 или SEQ ID NO: 77.
28. Гуманизированное антитело по любому из пп.22 или 23, где исходное антитело представляет собой мышиное антитело 8G6.
29. Гуманизированное антитело по любому из пп.22-28, где указанное антитело может конкурировать с мышиным антителом 8G6 за связывание с αvβ6.
30. Композиция для предотвращения или лечения заболевания, опосредованного αvβ6, у млекопитающего, содержащая антитело по любому из пп.1, 7, 22 или 23 и фармацевтически приемлемый носитель.
31. Композиция по п.30, где указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом.
32. Способ получения гуманизированного антитела по любому из пп.1-14, предусматривающий культивирование клетки-хозяина по п.21 в условиях, подходящих для экспрессии гуманизированного антитела, в которых экспрессируются цепи гуманизированного антитела и образуется гуманизированное антитело.
33. Способ по п.32, дополнительно предусматривающий выделение гуманизированного антитела.
34. Способ по п.32, где клеткой-хозяином является клетка СНО.
35. Способ лечения субъекта, имеющего заболевание, опосредованное αvβ6, или рискующего приобрести такое заболевание, предусматривающий введение указанному субъекту композиции по п.30, где указанное введение приводит к уменьшению или отсрочке начала указанного заболевания.
36. Способ по п.35, где субъектом является человек.
37. Способ по п.35, где заболеванием является фиброз.
38. Способ по п.37, где фиброзом является склеродермия, образование рубцов, фиброз печени, фиброз почек или фиброз легких.
39. Способ по п.35, где заболеванием является псориаз.
40. Способ по п.35, где заболеванием является рак.
41. Способ по п.40, где раком является эпителиальный рак.
42. Способ по п.40, где раком является рак полости рта, рак кожи, рак шейки матки, рак яичника, фарингеальный, ларингеальный рак, рак пищевода, рак легкого, рак почки, рак молочной железы или колоректальный рак.
43. Способ по п.35, где заболеванием является синдром Альпорта.
44. Способ уменьшения или предотвращения вторичной локализации метастазов первичной опухоли у пациента, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких антител по любому из пп.1-14, 22-29 или их αvβ6-эпитоп-связывающих фрагментов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина αvβ6 на одной или нескольких клетках в указанной первичной опухоли, причем связывание указанного антитела или его αvβ6-эпитоп-связывающего фрагмента с указанным интегрином приводит к гибели, чувствительности к химиотерапии или пониженной инвазивности указанной опухолевой клетки.
45. Способ элиминации αvβ6-положительных метастатических опухолевых клеток у пациента, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких антител по любому из пп.1-14, 22-29 или их αvβ6-эпитоп-связывающих фрагментов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина αvβ6 на одной или нескольких αvβ6-положительных метастатических опухолевых клетках, причем такое связывание указанного антитела или его αvβ6-эпитоп-связывающего фрагмента с указанным интегрином приводит к гибели, чувствительности к химиотерапии или пониженной инвазивности указанной метастатической опухолевой клетки.
46. Способ элиминации оставшихся αvβ6-положительных опухолевых клеток из организма пациента после хирургического удаления опухоли из ткани или органа указанного пациента, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких антител по любому из пп.1-14, 22-29 или их αvβ6-эпитоп-связывающих фрагментов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина αvβ6 на одной или нескольких оставшихся опухолевых клетках в указанной ткани или органе, причем такое связывание указанного антитела или его αvβ6-эпитоп-связывающего фрагмента с указанным интегрином приводит к гибели, чувствительности к химиотерапии или пониженной инвазивности указанной опухолевой клетки.
47. Способ уменьшения или предотвращения прогрессирования первичной преметастатической или прединвазивной опухоли в метастатическую или инвазивную опухоль у пациента, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких антител по любому из пп.1-14, 22-29 или их αvβ6-эпитоп-связывающих фрагментов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина αvβ6 на одной или нескольких клетках в указанной преметастатической или прединвазивной опухоли, причем такое связывание указанного антитела или его αvβ6-эпитоп-связывающего фрагмента с указанным интегрином приводит к уменьшению или предотвращению инвазии клеток указанного преметастатического или прединвазивного рака в области ткани, окружающей указанную первичную опухоль у указанного пациента.
48. Способ по п.47, где указанная преметастатическая или прединвазивная опухоль является карциномой.
49. Способ диагностики карциномы, которая с большей вероятностью будет прогрессировать в инвазивную карциному, предусматривающий:
(a) получение из организма пациента пробы раковой эпителиальной ткани, содержащей опухоль или ее часть, и пробы нераковой эпителиальной ткани;
(b) обеспечение контактирования указанных проб ткани с одним или несколькими антителами по любому из пп.1-14, 22-29, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина αvβ6, или их αvβ6-эпитоп-связывающими фрагментами; и
(c) определение уровня экспрессии интегрина αvβ6 в указанных пробах ткани,
причем увеличение уровня экспрессии интегрина αvβ6 в указанной пробе раковой ткани относительно уровня экспрессии интегрина αvβ6 в указанной пробе нераковой ткани указывает на наличие у пациента карциномы, которая имеет большую вероятность прогрессирования в инвазивную карциному.
50. Способ по пп.44-47 или 49, где указанные опухолевые клетки являются клетками из метастатической карциномы.
51. Способ по п.44-46 или 47, где указанная опухоль является карциномой.
52. Способ по пп.49, 51, где указанной карциномой является аденокарцинома.
53. Способ по пп.49, 51, где указанная карцинома выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рака эндометрия, рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака легкого, рака яичника, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака печени, рака пищевода, рака головы и шеи, рака желудка и рака селезенки.
54. Способ по п.53, где указанной карциномой является рак молочной железы.
55. Способ по п.54, где указанной карциномой является рак молочной железы in situ.
56. Способ по п.55, где указанный рак молочной железы in situ выбран из группы, состоящей из внутрипротокового рака in situ (DCIS) и дольчатого рака in situ (LCIS).
57. Способ по пп.49, 51, где указанная карцинома является раком эндометрия.
58. Способ по пп.49, 51, где указанная карцинома является раком поджелудочной железы.
59. Способ по пп.49, 51, где указанная карцинома является колоректальным раком.
60. Способ по пп.49, 51, где указанная карцинома является раком шейки матки.
61. Способ по пп.49, 51, где указанная карцинома является раком легкого.
62. Способ по пп.44-47 или 49, где указанным антителом является hu3G9 (BG00011).
63. Способ по пп.44-47 или 49, где указанным антителом является hu8G6.
64. Способ по пп.44-47, где указанное антитело или его αvβ6-эпитоп-связывающий фрагмент конъюгировано по меньшей мере с одним цитотоксическим соединением.
65. Способ по пп.44-47, где указанное антитело или его αvβ6-эпитоп-связывающий фрагмент вводят указанному пациенту вместе с введением указанному пациенту по меньшей мере одного цитотоксического соединения.
66. Способ по п.64 или 65, где указанное цитотоксическое соединение выбрано из группы, состоящей из цисплатина, карбоплатина, оксалиплатина, паклитаксела, мелфалана, доксорубицина, метотрексата, 5-фторурацила, этопозида, мехлоретамина, циклофосфамида, блеомицина, калихеамицина, майтансина, трихотена, СС1065, А-цепи дифтерийного токсина, А-цепи экзотоксина Pseudomonas aeruginosa, А-цепи рицина, А-цепи абрина, А-цепи модекцина, α-сарцина, белка Aleurites fordii, белка диантина, белка Phytolacca americana, ингибитора Momordica charantia, курцина, кротина, ингибитора Saponaria officinalis, гелонина, митогеллина, рестриктоцина, феномицина, эномицина, трикотецена, рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы.
67. Способ по п.64 или 65, где указанное цитотоксическое соединение выбрано из группы, состоящей из радиоизотопа и активирующего пролекарство фермента.
68. Способ по п.67, где указанный радиоизотоп выбран из группы, состоящей из 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P и радиоактивных изотопов Lu.
69. Способ по п.67, где указанный активирующий пролекарство фермент выбран из группы, состоящей из щелочной фосфатазы, арилсульфатазы, цитозиндезаминазы, протеазы, D-аланилкарбоксипептидазы, расщепляющего углеводы фермента, Р-лактамазы и пенициллинамидазы.
70. Способ по пп.44-47, где указанное антитело или его αvβ6-эпитоп-связывающий фрагмент вводят указанному пациенту в виде фармацевтической композиции, содержащей указанное антитело или его αvβ6-эпитоп-связывающий фрагмент и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов.
71. Способ по п.70, где указанные антитело или его αvβ6-эпитоп-связывающий фрагмент или композицию вводят указанному пациенту способом, выбранным из группы, состоящей из перорального введения, парентерального введения, внутричерепного введения, внутрилегочного введения и интраназального введения.
72. Способ по п.71, где указанные антитело или его αvβ6-эпитоп-связывающий фрагмент или композицию вводят указанному пациенту парентеральным путем, выбранным из группы, состоящей из внутримышечного введения, внутривенного введения, внутриартериального введения и подкожного введения.
73. Способ по п.72, где указанный парентеральный способ предусматривает введение указанных антитела или его αvβ6-эпитоп-связывающего фрагмента или композиции указанному пациенту посредством инъекции.
74. Способ по п.49, где указанное антитело или его αvβ6-эпитоп-связывающий фрагмент конъюгировано по меньшей мере с одной детектируемой меткой.
75. Способ по п.51, где указанная детектируемая метка выбрана из группы, состоящей из хромогенной метки, ферментной метки, радиоизотопной метки, нерадиоизотопной метки, флуоресцентной метки, токсической метки, хемилюминесцентной метки, рентгенографической метки, спиновой метки и метки контрастного агента ядерного магнитного резонанаса.
76. Способ по п.75, где указанная хромогенная метка выбрана из группы, состоящей из диаминобензидина и 4-гидроксиазобензол-2-карбоновой кислоты.
77. Способ по п.75, где указанная ферментная метка выбрана из группы, состоящей из малатдегидрогеназы, стафилококковой нуклеазы, дельта-5-стероидизомеразы, дрожжевой алкогольдегидрогеназы, α-глицеролфосфатдегидрогеназы, триозофосфатизомеразы, пероксидазы, щелочной фосфатазы, аспарагиназы, глюкозооксидазы, β-галактозидазы, рибонуклеазы, уреазы, каталазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глюкоамилазы и ацетилхолинэстеразы.
78. Способ по п.75, где указанная радиоизотопная метка выбрана из группы, состоящей из 3Н, 111In, 125I, 131I, 35S, 14C, 51Cr, 57Fe, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217At, 211At, 212Pb, 47Sc и 109Pd.
79. Способ по п.75, где указанная нерадиоактивная изотопная метка выбрана из группы, состоящей из 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, 56Fe, 99mTc или 112In.
80. Способ по п.75, где указанная флуоресцентная метка выбрана из группы, состоящей из метки 152Eu, флуоресцеиновой метки, изотиоцианатной метки, родаминовой метки, фикоэритриновой метки, фикоцианиновой метки, аллофикоцианиновой метки, зеленого флуоресцирующего белка (GFP), метки в виде о-фталевого альдегида и флуорескаминовой метки.
81. Способ по п.75, где указанная токсическая метка выбрана из группы, состоящей из метки в виде дифтерийного токсина, рициновой метки и метки в виде холерного токсина.
82. Способ по п.75, где указанная хемилюминесцентная метка выбрана из группы, состоящей из люминоловой метки, изолюминоловой метки, метки в виде акридинийзамещенного ароматического сложного эфира, имидазольной метки, метки в виде соли акридиния, метки в виде оксалатного эфира, люцифериновой метки, люциферазной метки или эквориновой метки.
83. Способ по п.75, где указанной меткой для рентгеновской радиографии является барий или цезий.
84. Способ по п.75, где указанной спиновой меткой является дейтерий.
85. Способ по п.75, где указанная метка контрастного агента для ядерного магнитного резонанса выбрана из группы, состоящей из Gd, Mn и железа.
Текст
Данное изобретение относится к клеточной биологии, иммунологии и онкологии. Это изобретение обеспечивает гуманизированные антитела, которые узнают интегрины v6,причем эти антитела содержат вариабельную область, происходящую из нечеловеческого антитела, и по меньшей мере часть иммуноглобулина, происходящую из антитела человека. Данное изобретение обеспечивает также способы получения таких антител, фармацевтические композиции, содержащие их, и способы лечения, диагностики и/или предупреждения различных заболеваний и нарушений путем введения гуманизированных анти-v6-антител согласно изобретению. Это изобретение относится также к идентификации дифференциальной экспрессии интегрина v6 на поверхностях опухолевых клеток и тканей, применению этой дифференциальной экспрессии в определении метастатического потенциала опухолевых клеток и способам диагностики и лечения/предотвращения метастазирования опухолей, а также элиминации оставшихся метастатических опухолевых клеток с использованием лигандов, в частности антител,которые связываются с интегрином v6. Вайолетт Шейла, Купман Луиз А.,Саймон Кеннет Дж., Вейнреб Пол Х. (US), Ван Влеймен Герман (NL),Сальданха Хосе (GB), Луговской Алексей А. (US) Медведев В.Н. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: БАЙОДЖЕН АЙДЕК МА ИНК. (US) 016342 Уровень техники Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к областям клеточной биологии, иммунологии и онкологии. Конкретно, данное изобретение относится к гуманизированным антителам, которые узнают интегрины v6,которые содержат вариабельную область, происходящую не из человека, и по меньшей мере часть иммуноглобулина человека. Данное изобретение относится также к способам их получения, к фармацевтическим композициям, содержащим их, и к способам лечения различных заболеваний введением гуманизированных анти-v6-антител. Данное изобретение относится также к идентификации дифференциальной экспрессии интегрина v6 на поверхностях опухолевых клеток и тканей, применению этой дифференциальной экспрессии в определении метастатического потенциала опухолевых клеток и способам диагностики и лечения/предупреждения опухолевого метастазирования и для элиминации остаточных метастатических опухолевых клеток с использованием лигандов, в частности антител, которые связываются с интегрином v6. Известный уровень техники Интегрины являются гликопротеиновыми рецепторами клеточной поверхности, которые связывают белки внеклеточного матрикса и опосредуют межклеточные взаимодействия и взаимодействия клеткавнеклеточный матрикс (обычно называемые событиями клеточной адгезии) (Ruoslahti, E., J. Clin. Invest. 87:1-5 (1991); Hynes, R.O., Cell 69:11-25 (1992. Эти рецепторы состоят из нековалентно ассоциированных альфаи бетацепей, которые объединяются с образованием различных гетеродимерных белков с разными клеточными и адгезивными специфичностями (Albeda, S.M., Lab. Invest. 68:4-14 (1993. Недавние исследования указывали на участие определенных интегринов в регуляции различных клеточных процессов, в том числе адгезии, миграции, инвазии, дифференцировки, пролиферации, апоптоза клеток и экспрессии генов (Albeda, S.M., Lab. Invest. 68:4-14 (1993); Juliano, R., Cancer Met. Rev. 13:25-30v6-Рецептор является одним из членов семейства интегринов, которые экспрессируются в виде гетеродимерных белков клеточной поверхности (Busk, M. et al., J. Biol. Chem. 267 (9): 5790-5796 (1992). Хотя субъединица v может образовывать гетеродимер с различными субъединицами(1, 3, 5, 6 и 8), только субъединица 6 может быть экспрессирована с субъединицей v в виде гетеродимера. Известно, что интегрин v6 является рецептором клеточной поверхности, связывающим фибронектин, ассоциированный с латентностью пептид (LAP) и тенасцин С, взаимодействующим с внеклеточным матриксом через трипептидные RGD-сайты, находящиеся на нем (Busk, M. et al., J. Biol. Chem. 267:5790-5796USA 90:10154-10158 (1993. Хотя интегрин v6 был впервые идентифицирован и секвенирован более 10 лет назад, биологическое значение v6, в частности, в заболевании, все еще находится в стадии исследования. Экспрессия v6 ограничена эпителиальными клетками, где он экспрессируется при относительно низких уровнях в здоровой ткани и значительно положительно регулируется во время развития,патологического изменения и заживления ран (Breuss, J.M. et al., J. Histochem. Cytochem. 41:1521-1527Cytochem. 48(6):985-998 (2000. Увеличивающееся число недавних сообщений показывает, что v6 положительно регулируется на раковых опухолях эпителиального происхождения, включающих в себя рак ободочной кишки (Niu, J. et al., Int. J. Cancer 92:40-48 (2001); Bates, R.C. et al., J. Clin. Invest. 115:339-347(Koivisto, L. et al., Exp. Cell. Res. 255:10-17 (2000); Xue, H. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 288:610618 (2001); Thomas, G.J. et al., J. Invest. Dermatol. 117:67-73 (2001); Thomas, G.J. et al., Int. J. Cancer 92:641-650 (2001); Ramos, D.M. et al., Matrix Biol. 21:297-307 (2002); (Agrez, M. et al., Br. J. Cancer 81:9097 (1999); Hamidi, S. et al., Br. J. Cancer 82(8):1433-1440 (2000); Kawashima, A. et al., Pathol. Res. Pract. 99(2):57-64 (2003) и рак молочной железы (Arihiro, K. et al., Breast Cancer 7:19-26 (2000. Сообщалось также, что субъединица v может участвовать в метастазировании опухолей и что блокирование этой субъединицы может в результате предотвращать метастазирование (в отношении обзора см. Imhof, В.A.Springer-Verlag, pp. 195-203 (1996. Интегрин v6 может иметь множественные регуляторные функции в клеточной биологии опухолей. Недавние исследования продемонстрировали, что внеклеточный и цитоплазматический домены субъединицы 6 опосредуют различные клеточные активности. Было показано, что внеклеточный и трансмембранный домены опосредуют активацию TGF- и адгезию (Sheppard, D., Cancer and MetastasisRev. 24:395-402 (2005); Munger, J.S. et al., Cell. 96:319-328 (1999. Цитоплазматический домен субъединицы 6 содержит уникальную 11-аминокислотную последовательность, которая является важной в опо-1 016342 средовании v6-регулируемой пролиферации клеток, образовании ММР, миграции и провыживании (Li,X. et al., J. Biol. Chem., 278 (43): 41646-41653 (2003); Thomas, G.I. et al., J. Invest. Derm. 117(1): 67-73(2001); Thomas, G.J. et al., Br. J. Cancer 87 (8): 859-867 (2002); Janes, S.M. and Watt, F.M., J. Cell. Biol.,166(3):419-431 (2004. Субъединица 6 была клонирована, экспрессирована и очищена (Sheppard et al.,U.S. Patent6787322 B2, описание которого включено здесь в качестве ссылки в его полном объеме), и были сообщены блокирующие функцию антитела, которые селективно связываются с интегрином v6(Weintryb et al., J. Biol. Chem. 279:17875-17877 (2004), описание этой статьи включено здесь в качестве ссылки в полном объеме). Антагонисты v6 (в том числе определенные моноклональные антитела) были также предложены в качестве возможных средств лечения для определенных форм острого легочного повреждения и фиброза (см. патент США 6692741 В 2 и WO 99/07405, описания которых включены здесь в качестве ссылок в полном объеме).v6 может связываться с несколькими лигандами, включающими в себя фибронектин, тенасцин и ассоциированные с латентностью пептиды 1 и 3 (LAP1 и LAP3), N-концевые 278 аминокислот латентной формы-предшественника TGF-1, через прямое взаимодействие с мотивом аргинин-глицин-аспартат(39):24144-24150 (1996); Huang, X.Z. et al., J. Cell. Sci. 111:2189-2195 (1998); Munger, J.S. et al., Cell. 96:319-328 (1999. Цитокин TGF- синтезируется в виде латентного комплекса, который имеет Nконцевой LAP, нековалентно ассоциированный со зрелым активным С-концевым цитокином TGF-. Этот латентный комплекс TGF- не может связываться с его родственным рецептором и, следовательно,не является биологически активным, пока он не превращается в активную форму (Barcellos-Hoff, M.H., J.LAP1 или LAP3 приводит к активации латентной формы-предшественника TGF-1 и TGF-3 (Munger,J.S. et al., Cell. 96:319-328 (1999, предлагаемой в качестве результата конформационного изменения в этом латентном комплексе, позволяющей TGF- связываться с его рецептором. Таким образом, положительно регулируемая экспрессия v6 может привести к локальной активации TGF-, которая, в свою очередь, может активировать каскад событий далее по ходу развертывания событий. Цитокин TGF-1 является плейотропным фактором роста, который регулирует пролиферацию клеток, дифференцировку клеток и иммунные реакции (Wahl, S.M., J. Exp. Med. 180:1587-1590 (1994); Massague, J., Annu. Rev. Biochem. 67:753-791 (1998); Chen, W. and Wahl, S.M., TGF-: Receptors, SignalingPathways and Autoimmunity, Basel: Karger, pp. 62-91 (2002); Thomas, D.A. and Massague, J., Cancer Cell. 8:369-380 (2005. Роль, которую играет TGF- в раке, является двусторонней. TGF- считают опухолевым супрессором и ингибирующей рост активностью, но все-таки многие опухоли развивают устойчивость к супрессирующим рост активностям TGF-1 (Yingling, J.M. et al., Nature Rev. Drug Discov. 3(12):1011-1022 (2004); Akhurst, R.J. et al., Trends Cell. Biol. 11 (11):S44-S51 (2001); Balmain, A and Akhurst, R.J., Nature 428 (6980):271-272 (2004. В развившихся опухолях экспрессия и активность TGF-1 участвовали в стимуляции выживания, прогрессирования и метастазирования опухолей (Akhurst, R.J. etal., Trends Cell Biol. 11(11):S44-S51 (2001); Muraoka, R.S. et al., J. Clin. Invest. 109(12):1551 (2002); Yang,Y.A. et al., J. Clin. Invest. 109(12):1607-1615 (2002. Постулируется, что это опосредовано как аутокринными, так и паракринными действиями в локальной опухоль-стромальной среде, в том числе действиямиTGF- на иммунологический надзор, ангиогенез и увеличенное опухолевое интерстициальное давление. Несколько исследований в настоящее время показали противоопухолевое и антиметастатическое действия TGF-1 (Akhurst, R.J. et al., J. Clin. Invest. 109(12):1533-1536 (2002); Muraoka, R.S. et al., J. Clin. Invest. 109(12):1551 (2002); Yingling, J.M. et al., Nat. Rev. Drug Discov. 3(12):1011-1022 (2004); Yang, Y.A. et al., J.Clin. Invest. 109(12):1607-1615 (2002); Haider, S.K. et al., Neoplasia 7(5):509-521 (2005); Iyer, S. et al., Cancer Biol. Ther. 4(3):261-266 (2005. Увеличенная экспрессия v6 на опухолях, в частности на границе опухоль-строма, может отражать уникальный механизм для локальной активации TGF-1 и способности стимулировать выживание, инвазию и метастазирование опухоли. Высокий уровень экспрессии в метастазах человека означает потенциальную роль v6 в образовании метастазов, что согласуется с более ранними сообщениями о том, чтоv6 может опосредовать переход из эпителия в мезенхиму, инвазию опухолевых клеток in vitro и экспрессию, коррелированную с метастазами в мышиной модели (Bates, R.C. et al., J. Clin. Invest. 115Chem., 279 (25):26533-26539 (2004. Авторы изобретения описали ранее генерирование активных и селективных моноклональных антиv6-антител (mAb), которые связываются с формами v6 как человека, так и мышей и блокируют связывание v6 с его лигандами и v6-опосредованную активацию TGF-1 (Weinreb, P.H. et al., J. Biol.Chem. 279 (17):17875-17887 (2004. Как также описано в публикации РСТ WO 03/100033, включенной здесь в качестве ссылки, были раскрыты и охарактеризованы высокоаффинные антитела против v6, в том числе идентификация и анализ ключевых аминокислотных остатков в определяющих комплемен-2 016342 тарность районах (CDR) таких антител. В частности, эти высокоаффинные антитела (а) специфически связываются с v6; (b) ингибируют связывание v6 с его лигандом, таким как LAP, фибронектин, витронектин и тенасцин, с величиной IC50, меньшей, чем величина IC50 10D5 (публикация международной заявки на патент WO 99/07405); (с) блокируют активацию TGF-; (d) содержат определенные аминокислотные последовательности в CDR, которые обеспечивают специфичность связывания с v6; (e) специфически связываются с субъединицей 6; и/или (f) узнают v6 в процедурах иммуноокрашивания, таких как иммуноокрашивание залитых в парафин тканей.WO 03/100033 описывает также обнаружение того, что антитела, которые связываются с v6, могут быть сгруппированы в биофизически различные классы и подклассы. Один класс антител проявляет способность блокировать связывание лиганда (например, LAP) с v6 (блокаторы). Этот класс антител может быть дополнительно подразделен на субклассы катионзависимых блокаторов и катионнезависимых блокаторов. Некоторые из катионзависимых блокаторов содержат последовательность пептида аргинин-глицин-аспартат (RGD), тогда как катионнезависимые блокаторы не содержат последовательностиRGD. Другой класс антител проявляет способность связываться с v6, но все еще не блокирует связывание v6 с лигандом (не блокаторы). Кроме того, WO 03/100033 описывает антитела, содержащие тяжелые цепи и легкие цепи, определяющие комплементарность, районы (CDR) 1, 2 и 3 которых состоят из определенных аминокислотных последовательностей, которые обеспечивают специфичность связывания с v6. WO 03/100033 обеспечивает также антитела, которые специфически связываются с v6, но не ингибируют связывание v6 с ассоциированным с латентностью пептидом (LAP), а также антитела, которые связываются с тем же самым эпитопом.WO 03/100033 дополнительно раскрывает клетки гибридом 6.1 А 8, 6.2 В 10, 6.3G9, 6.8G6, 6.2 В 1,6.2 А 1, 6.2 Е 5, 7.1G10, 7.7G5 и 7.1C5, причем выделенные нуклеиновые кислоты содержат кодирующие последовательности, а выделенные полипептиды содержат аминокислотные последовательности антиv6-антител. В частности, WO 03/100033 раскрывает анти-v6-антитела, содержащие полипептидные последовательности тяжелой и легкой цепей в виде антител, продуцируемых гибридомами 6.1 А 8,6.2 В 10, 6.3G9, 6.8G6, 6.2 В 1, 6.2 А 1, 6.2 Е 5, 7.1G10, 7.7G5 или 7.1C5. Несколько из этих гибридом были депонированы в Американской Коллекции типовых культур (АТТС; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA), согласно Будапештскому договору. В частности, гибридомные клоны 6.3G9 и 6.8G6 были депонированы 16 августа 2001 г. и имеют номера доступа АТСС РТА-3649 и РТА-3645 соответственно. Мышиные антитела, продуцируемые гибридомами 6.3G9 и 6.8G6, исследуются дополнительно в данной заявке в отношении их потенциального развития в качестве гуманизированных антител. Мышиное моноклональное антитело 3G9 является мышиным IgG1, -антителом, выделенным из 6 интегрин -/- мыши (Huang et al., J. Cell Biol., 133:921-928 (1996, иммунизированной растворимым v6 человека. Антитело 3G9 специфически узнает эпитоп интегрина v6, который экспрессируется при положительно регулируемых уровнях во время патологического изменения, фиброза и рака (см., например,Thomas et al., J. Invest. Dermatology 117:67-73 (2001); Brunton et al., Neoplasia 3:215-226 (2001); Agrez etal., Int. J. Cancer 81:90-97 (1999); Breuss, J. Cell Science 108:2241-2251 (1995. Оно не связывается с другими v-интегринами и перекрестно реагирует с молекулами как человека, так и мыши. Было описано,что мышиное моноклональное антитело 3G9 блокирует связывание v6 с LAP, как определено по блокированию связывания лиганда либо с очищенным растворимым v6 человека, либо с 6 экспрессирующими клетками, ингибируя посредством этого профиброзную активность активации рецептора TGF- (см. WO 03/100033). Было также показано, что оно ингибирует v6-опосредованную активацию TGF- с величиной IC50, более низкой, чем величина IC50 известных v6-антител, 10D5 (Huanget al., J. Cell Sci. 111:2189-2195 (1998. Мышиное моноклональное антитело 8G6 является мышиным IgG1, -антителом, которое узнает также эпитоп интегрина v6, как описано в WO 03/100033. Это мышиное моноклональное антитело 8G6 является катионзависимым, высокоаффинным блокатором v6, обнаруживающим способность ингибировать v6-опосредованную активацию TGF- с величиной IC50 более низкой, чем величина IC50 10D5(см. WO 03/100033). Мышиные антитела как 3G9, так и 8G6, были эффективны в предупреждении фиброза почки и легкого, как описано в WO 03/100033. Кроме того, мышиное антитело 3G9 было способно эффективно ингибировать рост опухоли в модели ксенотрансплантата опухоли человека, что предполагает потенциальную роль v6 в патологии рака и эффективность такой блокады с использованием антител, направленных на v6. Таким образом, существует потребность в развитии v6-антител, которые являются менее антигенными в людях и которые могут быть применимы в лечении заболеваний, включающих в себя v6 путь. С появлением методологии рекомбинантных ДНК стало возможным структурное конструирование генов антител и получение модифицированных молекул антител со свойствами, не получаемыми технологией гибридом. В терапевтической области одной из задач этой методологии было уменьшение имму-3 016342 ногенности моноклональных антител грызунов в людях модификацией их первичной аминокислотной структуры. Уменьшение иммуногенности терапевтических антител является желательным, так как индукция иммунного ответа может вызывать спектр побочных (вредных) действий в пациенте, в диапазоне от усиленной элиминации этого терапевтического антитела, с последующей потерей эффективности, до фатальной анафилаксии в наиболее тяжелом случае. Одной стратегией уменьшения иммуногенности чужеродных моноклональных антител была замена константных доменов легких и тяжелых цепей моноклонального антитела аналогичными доменами человеческого происхождения, с оставлением доменов вариабельной области чужеродного антитела интактными. Домены вариабельной области легкой и тяжелой цепей являются ответственными за взаимодействие между антителом и антигеном. Химерные молекулы антител, имеющие вариабельные домены мыши, присоединенные к константным доменам человека, обычно связывают антиген с той же самой константой аффинности, что и мышиное антитело, из которого получена эта химера. Такие химерные антитела являются менее иммуногенными в людях, чем их полные мышиные копии. Тем не менее, антитела, которые сохраняют целые мышиные вариабельные домены, склонны провоцировать иммунные реакции у существенной части пациентов. То, что люди могут генерировать иммунную реакцию на целые мышиные вариабельные домены,было предсказуемым, и, следовательно, начались попытки получения вариабельных доменов с более человеческой природой, даже до того, как были сообщены клинические испытания таких стандартных химерных антител. Одна категория способов, часто называемых гуманизацией, направлена на превращение вариабельных доменов мышиных моноклональных антител в более человеческую форму рекомбинантным конструированием вариабельного домена антитела, имеющего как мышиную природу, так и природу домена человека. Стратегии гуманизации основываются на нескольких согласованных пониманиях данных по структуре антитела. Во-первых, вариабельные домены содержат смежные участки пептидной последовательности, которые являются консервативными в пределах вида, но которые различаются между эволюционно удаленными видами, такими как мыши и люди. Во-вторых, другие смежные участки не являются консервативными в пределах вида, но различаются даже между продуцирующими антитело клетками в одном и том же индивидууме. В-третьих, контакты между антителом и антигеном происходят в принципе посредством неконсервативных областей вариабельного домена. В-четвертых,молекулярная архитектура вариабельных доменов антитела является достаточно сходной во всех видах,чтобы соответствующие положения аминокислотных остатков между видами могли быть идентифицированы на основе только положения, без экспериментальных данных. Стратегии гуманизации имеют общую предпосылку, что замена аминокислотных остатков, которые являются характерными для мышиных последовательностей, будет уменьшать иммуногенность в людях полученного антитела. Однако замена последовательностей между видами обычно приводит к уменьшению связывания антитела с его антигеном. Таким образом, этот тип гуманизации лежит в балансировании замены исходной мышиной последовательности для уменьшения иммуногенности с необходимостью сохранения гуманизированной молекулой достаточного связывания антигена, чтобы быть терапевтически применимой. Этот баланс был найден с использованием двух подходов. В одном подходе, приведенном в качестве примера в патенте США 5869619, остатки антитела человека обычно заменяют остатками мышиного вариабельного домена,которые, как определено или предсказано, (i) не играют значимой химической роли во взаимодействии с антигенами и (ii) расположены с боковыми цепями, выступающими в растворитель. Таким образом, наружные остатки, удаленные от сайта связывания антигена, являются гуманизированными, в то время как внутренние остатки, антигенсвязывающие остатки и остатки, образующие границу между вариабельными доменами, остаются мышиными. Одним недостатком этого подхода является то, что требуются довольно обширные экспериментальные данные для определения, играет ли остаток незначимую химическую роль в связывании антигена или будет расположен в растворителе в виде конкретной трехмерной структуры антитела. В другом более общем подходе, приведенном в примере патента США 5225539, смежные участки пептидной последовательности мышиного вариабельного домена, рассматриваемые как консервативные, заменяют соответствующими участками из антитела человека. В еще более общем подходе все остатки вариабельного домена гуманизируют, за исключением неконсервативных районов, участвующих в связывании антигена. Для определения подходящих смежных участков для замены патент США 5225539 использовал классификацию последовательностей вариабельных доменов, которая была разработана ранее Wu and Kabat, J. Exp. Med. 132 (2):211-250 (1970).Wu и Kabat первыми выполнили сопоставление пептидных последовательностей антител, и их вклад в этом отношении был многосторонним: во-первых, посредством исследования сходства последовательностей между вариабельными доменами они идентифицировали соответствующие остатки, которые были в большей или меньшей степени гомологичными во всех антителах во всех видах позвоночных, в том, что они принимали сходную трехмерную структуру, играли сходные функциональные роли,взаимодействовали сходным образом с соседними остатками и существовали в сходных химических окружениях. Во-вторых, они предложили систему нумерации пептидных последовательностей, в которой-4 016342 гомологичные остатки иммуноглобулинов были отнесены к одному и тому же номеру положения. Специалист с квалификацией в данной области может недвусмысленно применить эту нумерацию, которую теперь обычно называют нумерацией Кабата, к любой последовательности вариабельного домена, без ссылки на какие-либо экспериментальные данные, кроме самой этой последовательности. В-третьих, для каждого нумерованного по Кабату положения последовательности, Кабат и By рассчитали вариабельность, под которой они имеют в виду обнаружение нескольких или многих возможных аминокислот при сопоставлении последовательностей вариабельных доменов. Они идентифицировали три смежных района высокой вариабельности, заключенных в четырех менее вариабельных смежных районах. Другие исследователи ранее отмечали вариабельность приблизительно в этих районах (гипервариабельных районах) и постулировали, что эти высоковариабельные районы представляли аминокислотные остатки, используемые для связывания антигена. Кабат и By официально разграничили остатки, составляющие эти вариабельные участки, и назвали их определяющими комплементарность районами (CDR), ссылаясь на химическую комплементарность между антителом и антигеном. Роль в трехмерной укладке вариабельного домена, но не в узнавании антигена была приписана остальным менее вариабельным районам, которые теперь называют каркасными районами. В-четвертых, Кабат и By создали публичную базу данных пептидных последовательностей антител и последовательностей нуклеиновых кислот антител, которая продолжает сохраняться и хорошо известна специалистам с квалификацией в данной области. Способ гуманизации, описанный патентом США 5225539 с использованием классификации Кабата, приводит к химерному антителу, содержащему CDR из одного антитела и каркасные районы из другого антитела, которое отличается по видовому происхождению, специфичности, подклассу или другим характеристикам. Однако каркасным районам не приписывают никаких конкретных последовательностей или свойств, действительно, патент США 5225539 утверждает, что любой ряд каркасов мог бы быть объединен с любым набором из CDR. С тех пор каркасные последовательности были признаны как важные для придания трехмерной структуры вариабельной области антитела, необходимой для поддержания хорошего связывания антигена. Последующие развития в этой области были усовершенствованиями в объеме патента США 52215539, связанными с устранением потери авидности в отношении антигена, наблюдаемой с некоторыми гуманизированными антителами, относительно авидности соответствующих мышиных антител. Патент США 5693761 описывает одно усовершенствование относительно патента США 5225539 в отношении гуманизации антител и основывается на предпосылке, которая приписывает потерю авидности проблемам в структурных мотивах в гуманизированном каркасе, которые вследствие стерической или другой химической несовместимости мешают фолдингу (укладке) CDR в способную к связыванию конформацию, обнаруживаемую в мышином антителе. Для решения этой проблемы патент США 5693761 предлагает использование каркасных последовательностей человека, близко гомологичных в линейной пептидной последовательности, каркасным последовательностям мышиного антитела, которое подлежит гуманизации. Таким образом, способы патента США 5693761 фокусируются на сравнении каркасных последовательностей между видами. Обычно, все доступные последовательности вариабельных доменов человека сравнивают с конкретной мышиной последовательностью и рассчитывают процентную идентичность между соответствующими каркасными остатками. Выбирают вариабельный домен человека с наивысшим процентом для обеспечения каркасных последовательностей для плана гуманизации. Патент США 5693761 утверждает также, что важно сохранять в гуманизированном каркасе некоторые аминокислотные остатки из мышиного каркаса, критические для поддержания CDR в способной к связыванию конформации. В других подходах решающую роль конкретных аминокислотных остатков каркаса определяют экспериментально, как только получают гуманизированную конструкцию низкой авидности, возвратом отдельных остатков мышиной последовательности и анализом связывания антигена, как описано Riechmann et al., Nature 332(6162):323-327 (1988). Другой примерный подход к идентификации решающей роли аминокислот в каркасных последовательностях описан в патенте США 5821337 и патенте США 5859205. Эти ссылки описывают конкретные положения остатков Кабата в каркасе, которые в гуманизированном антителе могут требовать замены соответствующей мышиной аминокислотой для сохранения авидности. Таким образом, полученные сконструированные каркасы, которые являются частично человеческими и частично мышиными, все еще часто проявляют иммуногенность в человеке или пониженную авидность связывания, требуя вследствие этого многочисленных повторений в конструировании каркаса для получения подходящего каркаса для терапевтических применений. Таким образом, существует потребность в данной области в развитии v6-антител, которые являются менее антигенными в людях. Данное изобретение обеспечивает генерирование гуманизированных антител, которые являются специфически реактивными с v6. Данное изобретение обеспечивает также способы приготовления таких гуманизированных антител обеспечением гуманизированных антител, которые надежно идентифицируют подходящие каркасные последовательности человека для поддержания районов нечеловеческого CDR и, кроме того, для обеспечения гуманизированных антител, которые сохраняют высокое связывание антигена с низкой иммуногенностью в людях. Данное изобретение обеспе-5 016342 чивает также применения таких гуманизированных антител, реактивных с v6, в лечении, диагностике и/или предотвращении различных заболеваний и нарушений. Сущность изобретения Данное изобретение основано, по меньшей мере частично, на раскрытии и характеристике высокоаффинных гуманизированных антител против v6, в том числе идентификации и анализе ключевых аминокислотных остатков в определяющих комплементарность районах (CDR) таких антител, а также идентификации и анализе критических аминокислотных остатков в каркасных последовательностях. В одном варианте осуществления данное изобретение относится к гуманизированным моноклональным антителам, имеющим специфичность связывания в отношении интегринов v6, причем указанное антитело содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 соответственно. Такие гуманизированные антитела получают из гуманизации мышиного антитела 3G9. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат тяжелую цепь, определяющие комплементарность районы (CDR) 1, 2 и 3 которой определяются аминокислотными остатками 31-35, 50-65 и 98-109, соответственно, SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат легкую цепь, CDR 1, 2 и 3 которой определяются аминокислотными остатками 24-35, 51-57 и 90-98, соответственно, SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат тяжелую цепь, каркасные районы (FR) 1, 2, 3 и 4 которой определяются аминокислотными остатками 1-30, 36-49, 66-97 и 110-120, соответственно, SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат легкую цепь, каркасные районы (FR) 1, 2, 3 и 4 которой определяются аминокислотными остатками 1-23, 36-50, 58-89 и 99-108, соответственно, SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен в тяжелой цепи, состоящих из Q3M и N74S SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен в легкой цепи, состоящих из E1Q, L47W, I58V, A60V и Y87F SEQ IDNO: 2. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 1 тяжелой цепи ("HV1"), в которой эта тяжелая цепь состоит из аминокислотных замен Q3M и N74S SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 2 тяжелой цепи("HV2"), в которой эта тяжелая цепь состоит из аминокислотной замены N74S SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 3 тяжелой цепи ("HV3"),в которой эта тяжелая цепь состоит из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 1 легкой цепи ("LV1"), в которой эта легкая цепь состоит из аминокислотных замен L47W, I58V, A60V и Y87FSEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 2 легкой цепи ("LV2"), в которой эта легкая цепь состоит из аминокислотных замен L47W и I58V SEQ IDNO: 2. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 3 легкой цепи ("LV3"), в которой эта легкая цепь состоит из аминокислотной замены L47W SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 4 легкой цепи("LV4"), в которой эта легкая цепь состоит из аминокислотных замен E1Q и L47W SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 5 легкой цепи("LV5"), в которой эта легкая цепь состоит из SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит вариабельный домен тяжелой и легкой цепей, содержащий HV3, где эта тяжелая цепь состоит из SEQ ID NO: 1, и LV5,где эта легкая цепь состоит из SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела имеют CDR, произведенные из мышиного антитела 6.3G9 (АТСС AccessionРТА-3649). В родственных вариантах осуществления данное изобретение относится также к гуманизированным моноклональным антителам, имеющим специфичность связывания в отношении интегринов v6, где эти антитела содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4. Такие гуманизированные антитела получены из гуманизации мышиного антитела 8G6. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат тяжелую цепь, определяющие комплементарность районы (CDR) 1, 2 и 3 которой определяются аминокислотными остатками (т.е. за исключением некоторых консервативных вариаций) 31-35, 50-66 и 99-115, соответственно, SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат легкую цепь, CDR 1, 2 и 3 которой определяются аминокислотными остатками 24-48, 54-60 и 93-101, соответственно, SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат тяжелую цепь, каркасные районы (FR) 1, 2, 3 и 4 которой определяются аминокислотными остатками 1-30, 36-49, 67-98 и 116-126,соответственно, SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат легкую цепь, каркасные районы (FR) 1, 2, 3 и 4 которой определяются аминокислотными остатками 1-23, 39-53, 61-92 и 102-111, соответственно, SEQ ID NO: 4.-6 016342 В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен в тяжелой цепи, состоящих из A2 4G, G26S, Q39L, M48I,V68A, R72V и T74K, SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен в легкой цепи, состоящих изE1D, L46F и Y49K, SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 1 тяжелой цепи ("HV1"), в которой эта тяжелая цепь состоит из аминокислотных замен A24G, G2 6S, Q39L, M48I,V68A, R72V и Т 74K, SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 2 тяжелой цепи ("HV2"), в которой эта тяжелая цепь состоит из аминокислотных замен M48I, V68A, R72V и T74K, SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 3 тяжелой цепи ("HV3"), в которой эта тяжелая цепь состоит из аминокислотных замен V68A, R72V и T74K, SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 1 легкой цепи ("LV1"), в которой эта легкая цепь состоит из аминокислотных замен E1D, L46F и Y49K, SEQ IDNO: 4. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 2 легкой цепи ("LV2"), в которой эта легкая цепь состоит из аминокислотных замен L46F и Y49K, SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 3 легкой цепи("LV3"), в которой эта легкая цепь состоит из аминокислотной замены Y49K, SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела имеют CDR, произведенные из мышиного антитела 6.8G6. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела могут конкурировать за связывание с v6 с мышиным антителом 8G6. Данное изобретение включает в себя также гуманизированные антитела, которые связываются с тем же самым эпитопом, что и вышеописанные антитела. Данное изобретение включает в себя также гуманизированные антитела, продуцируемые рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую указанные антитела. В некоторых вариантах осуществления этим рекомбинантным вектором может быть плазмида, выбранная из группы,состоящей из pKJS195 (SEQ ID NO: 5), pKJS189 (SEQ ID NO: 6) и pKJS196 (SEQ ID NO: 7). Данное изобретение включает в себя также выделенные нуклеиновые кислоты, содержащие кодирующую последовательность для любой из SEQ ID NO: 1-7, и выделенные полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 1-7. Данное изобретение включает в себя также рекомбинантные векторы, содержащие нуклеиновые кислоты любого из вышеописанных гуманизированных антител. Данное изобретение включает в себя также клетки-хозяева, содержащие рекомбинантные векторы,содержащие нуклеиновые кислоты любого из вышеописанных гуманизированных антител. Данное изобретение включает в себя также композиции, содержащие одно или несколько гуманизированных антител этого изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых из этих композиций гуманизированные антитела конъюгированы с цитотоксическим агентом (т.е. агентом, который ухудшает жизнеспособность и/или функции клетки), таким как токсин или радионуклид. Эти композиции могут вводиться субъекту (например, млекопитающему, такому как человек), имеющему заболевание, опосредованное v6, или находящемуся при риске возникновения заболевания, опосредованногоv6, для лечения (например, ослабления симптомов, смягчения, уменьшения, предупреждения, задержки возникновения) этого заболевания. Примеры таких заболеваний включают в себя, но не ограничиваются ими фиброз (например, склеродермию, образование рубцов, фиброз печени, фиброз легких и фиброз почки); псориаз; рак (как описано в другом месте здесь, например, эпителиальный рак, рак полости рта, кожи, рак шейки матки, яичников, фарингеальный рак, рак гортани, рак пищевода, легкого, молочной железы, почки, поджелудочной железы, предстательной железы или колоректальный рак) ; синдром Альпорта; острые и хронические патологические изменения легкого, печени, почки и других внутренних органов; и склероз легкого, печени, почки и других внутренних органов. Риск возникновения таких заболеваний могут происходить из генетического предрасположения; некоторых типов образа жизни, например, курения и алкоголизма; воздействия загрязнителей окружающей среды, таких как асбест; физиологических состояний, таких как диабет, инфекции вирусов гепатита (например, инфекция вируса гепатита С), аутоиммунные заболевания; и медицинских обработок, таких как лучевая терапия. Данное изобретение включает в себя также способы получения любого из вышеописанных гуманизированных антител культивированием любой из вышеописанных клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии гуманизированного антитела, в которых экспрессируются цепи гуманизированного антитела и продуцируются гуманизированные антитела. В некоторых вариантах осуществления эти способы дополнительно предусматривают стадии выделения гуманизированных антител. В некоторых вариантах осуществления клеткой-хозяином является клетка СНО. Гибридомные клоны 6.3G9 и 6.8G6 были депонированы 16 августа 2001 г. в Американской Коллекции типовых культур ("АТСС"; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA) согласно Будапештскому Договору и имеют номера доступа АТСС РТА-3649 и 3645 соответственно.-7 016342 Гуманизированным антителом этого изобретения называют полноразмерное антитело, например антитело, содержащее две тяжелые цепи и две легкие цепи, или антигенсвязывающий фрагмент полного антитела, такой как Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')2-фрагмент и F(v)-фрагмент. Гуманизированное антитело данного изобретения может быть антителом любого изотипа и подтипа, например IgA (например, IgA1 и IgA2), IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), IgE, IgD, IgM, где легкие цепи иммуноглобулина могут быть легкими цепями типаили . В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело данного изобретения может содержать мутацию (например, делецию, замену или добавление) в одном или нескольких (например, 2, 3,4, 5 или 6) определенных положениях в тяжелой цепи, так что эффекторная функция этого антитела (например, способность этого антитела связываться с Fc-рецептором или фактором комплемента) изменяется без влияния на антигенсвязывающую активность антитела. В других вариантах осуществления гуманизированное антитело данного изобретения может содержать мутацию в аминокислотном остатке, который является сайтом гликозилирования, так что этот сайт гликозилирования элиминируется. Такое гуманизированное антитело может иметь клинически благоприятные уменьшенные эффекторные функции или другие нежелательные функции при сохранении его антигенсвязывающей аффинности. Мутация сайта гликозилирования может быть также благоприятной для развития технологического процесса (например, экспрессии и очистки белка). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения гуманизированное антитело содержит дегликозилированную легкую цепь, CDR которой получены из мышиного антитела 3G9. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 3G9 содержит вариабельный домен легкой цепи,где CDR1 содержит замену аспарагина (N) на серин (S) в аминокислотном остатке 26 SEQ ID NO: 2. Мышиный район CDR1 3G9 содержит аспарагин в этом положении аминокислоты. Однако в гуманизированной версии антитела 3G9 все пять версий легкой цепи (LV1, LV2, LV3, LV4 и LV5) содержат серин в районе CDR1 3G9 в этом положении. Было показано, что дегликозилирование этого сайта во всех версиях легкой цепи гуманизированного антитела 3G9 является благоприятным как для экспрессии, так и для очистки этих легких цепей. В некоторых других вариантах осуществления гуманизированное антитело 3G9 содержит мутацию в сайте гликозилирования, который обычно требуется для нормального связывания Fc-рецептора. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 3G9 содержит аминокислотную замену аспарагина (N) на глутамин (Q). В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 3G9 содержит аминокислотную замену N на Q в версии 3 тяжелой цепи (HV3), продуцируемой рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду pKJS196 (SEQ ID NO:7). В некоторых вариантах осуществления аминокислотная замена N на Q происходит в аминокислотном положении 319SEQ ID NO: 7. Было показано, что дегликозилирование этого сайта в версии 3 тяжелой цепи (HV3) гуманизированного антитела 3G9 удаляет сигнал гликозилирования, требуемый для нормального связыванияFc-рецептора без влияния на антигенсвязывающую активность гуманизированного антитела. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 3G9 содержит версию 3 тяжелой цепи (HV3),продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду pKJS189 (SEQ ID NO: 6), и версию 5 легкой цепи (LV5), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду pKJS195 (SEQ IDNO: 5). В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 3G9 содержит дегликозилированную версию 3 тяжелой цепи (a-HV3), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду pKJS196 (SEQ ID NO: 7), и версию 5 легкой цепи (LV5), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду pKJS195 (SEQ ID NO: 5). В других дополнительных вариантах осуществления эти тяжелые или легкие цепи могут содержать мутации, которые увеличивают аффинность или активность. Гуманизированные антитела данного изобретения применимы для лечения любого клинически нежелательного состояния или заболевания (обсуждаемых здесь), которое опосредовано связыванием v6 с его лигандом, таким как LAP и фибронектин. Эти гуманизированные антитела могут быть более эффективными через более высокую аффинность или авидность и зависимость или независимость от катиона связывания с лигандом, чем ранее известные v6-антитела. В отличие от мышиных моноклональных антител гуманизированные антитела этого изобретения не будут вызывать продуцирования антител против мышиного иммуноглобулина в субъекте, в частности в теле человека, и вместо этого обнаруживают пролонгированный полупериод существования в крови с уменьшенной частотой побочных (вредных) эффектов, так что можно ожидать, что они превосходят мышиные моноклональные антитела по эффективности в лечении заболеваний, опосредованных v6. В дополнительных аспектах данное изобретение относится к способам диагностики, лечения и предупреждения рака с использованием v6-связывающих лигандов, таких как v6-связывающие антитела. В одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способы уменьшения или предупреждения вторичной локализации метастазов первичной опухоли у пациента, предусматривающие введение пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких лигандов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина v6 на одной или нескольких клетках в первичной опухоли, где связывание этого лиганда с интегрином приводит к смерти, чувствительности к-8 016342 химиотерапии или увеличенной инвазивности опухолевой клетки. В родственных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы уменьшения или предотвращения прогрессирования преметастатической опухоли в метастатическую опухоль у пациента, предусматривающие введение пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких лигандов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина v6 на одной или нескольких клетках в преметастатической опухоли, где связывание этого лиганда с интегрином приводит к уменьшению или предотвращению инвазии клеток преметастатической опухоли в зоны тканей, окружающие первичную опухоль. В некоторых подобных вариантах осуществления данного изобретения опухолевой клеткой является клетка карциномы, например аденокарциномы. В более конкретных вариантах осуществления этой карциномой является карцинома молочной железы, карцинома эндометрия, карцинома поджелудочной железы,колоректальная карцинома, карцинома легкого, карцинома печени, карцинома яичника, карцинома шейки матки, карцинома предстательной железы, карцинома печени, карцинома пищевода, карцинома головы и шеи, карцинома желудка или карцинома селезенки. Более конкретно, эта карцинома является раком молочной железы (в том числе, но не только, раком in situ молочной железы, таким как внутрипротоковый преинвазивный рак in situ (рак на месте) (DCIS) или дольчатый рак in situ (LCIS, раком эндометрия, панкреатическим раком, колоректальным раком, раком шейки матки или раком легкого. Подходящие варианты осуществления по этому аспекту изобретения используют v6 связывающие лиганды, которые являются v6-антителами или их v6-эпитопсвязывающими фрагментами. Согласно некоторым таким вариантам осуществления этими антителами являются моноклональные антитела (которые могут быть химерными, приматизированными или гуманизированными), в том числе моноклональные антитела, описанные в публикации заявки на патент СШАUS 2005/0255102 А 1, описание которой включено здесь в качестве ссылки в полном виде. Такие подходящие антитела включают в себя, но не ограничиваются ими, v6-связывающие моноклональные антитела, названные 1 А 8, 3G9, 8G6, 2 В 1, 2 В 10, 2 А 1, 2 Е 5, 1G10, 7G5, 1 С 5, 10D5 (депозит АТССНВ 12382) и CSP6, также как их фрагменты, химеры и гибридомы. Особенно подходящими для применения в таких вариантах осуществления данного изобретения являются моноклональные антитела 3G9 и 8G6. Особенно подходящими для применения в таких вариантах осуществления этого изобретения являются также гуманизированные моноклональные антитела, такие как гуманизированное антитело 3G9, названное hu3G9(BG00011), и гуманизированное антитело 8G6, названное hu8G6. В некоторых таких терапевтических вариантах данного изобретения v6-связывающие лиганды(например, v6-связывающие антитела) конъюгированы или связаны с одним или несколькими цитотоксическими соединениями или агентами, которые приводят к смерти или вызывают смерть клетки или ткани после связывания конъюгата v6-связывающий лигандтоксическое соединение с одним или несколькими интегринами v6 на этой клетке или ткани. В дополнительных терапевтических вариантах осуществления этого изобретения v6-связывающие лиганды (например, v6-связывающие антитела) вводят пациенту вместе с одним или несколькими цитотоксическими соединениями или агентами. Цитотоксические соединения или агенты, которые могут быть подходящим образом использованы в соответствии с этими аспектами данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, цитотоксические агенты (например, цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, паклитаксел, мелфалан, доксорубицин,метотрексат, 5-фторурацил, этопозид, мехлоретамин, циклофосфамид, блеомицин, калихеамицин, майтансин, трихотен, СС 1065, А-цепь дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина Pseudomonas aeruginosa,А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модекцина, -сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolacca americana, ингибиторы Momordica charantia, курцин, кротин, ингибиторы Saponaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин, трикотецены, рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы), радиоактивные изотопы (такие как 211At, 131I,125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, и радиоактивные изотопы Lu) и активирующие пролекарство ферменты (такие как щелочная фосфатаза, арилсульфатаза, цитозиндезаминаза, протеазы, D-аланилкарбоксипептидазы, расщепляющие углеводы ферменты,Р-лактамаза и пенициллинамидаза). В некоторых вариантах осуществления один или несколько v6 интегринсвязывающие лиганды вводят пациенту в форме фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество одного или нескольких v6-интегринсвязывающих лигандов и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов. Эти один или несколько v6 интегринсвязывающих лигандов и/или одна или несколько фармацевтических композиций, содержащих один или несколько v6-интегринсвязывающих лигандов, могут вводиться пациенту любым подходящим способом введения фармацевтических композиций, в том числе, но не только, оральным введением,парентеральным введением (в том числе, например, инъекцией с использованием внутримышечного,внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного или подкожного способа), внутричерепным введением, чрескожным введением, внутрилегочным введением и интраназальным введением. В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы диагностики или идентификации карциномы, такой как аденокарцинома, которая, более вероятно, будет прогрессировать в инвазивную карциному и/или которая, более вероятно, будет отвечать на лечение лигандом, который связывается с одной или несколькими субъединицами интегрина v6. Такие подходящие способы могут-9 016342 предусматривать, например, (а) получение от пациента пробы раковой эпителиальной ткани, содержащей опухоль или ее часть, и пробы нераковой эпителиальной ткани; (b) контактирование этих проб ткани с одним или несколькими лигандами, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина v6; и (с) определение уровня экспрессии интегрина v6 в этих пробах ткани, причем увеличение уровня экспрессии интегрина v6 в пробе раковой ткани относительно уровня экспрессии интегрина v6 в пробе нераковой ткани указывает на наличие у пациента карциномы, которая (а) имеет увеличенную вероятность прогрессирования из in situ или неинвазивной формы в инвазивную, метастатическую форму; и/или (b) должна, более вероятно, отвечать на лечение одним или несколькими из вышеуказанных способов лечения, которые основаны на связывании v6-связывающего лиганда, в частности,v6-связывающего лиганда, который конъюгирован или который вводят вместе с одним или несколькими цитотоксическими соединениями или агентами, такими, как описанные выше. Такие способы пригодны для диагностики или идентификации различных карцином, в том числе, но не только, карцином, в которых участвуют эпителиальные ткани, как отмечалось выше. В некоторых подобных вариантах осуществления лигандом, который связывается с одной или несколькими субъединицами интегрина v6,является v6-интегринсвязывающее антитело (которое может быть моноклональным антителом, таким как моноклональные антитела, описанные выше) или его эпитоп v6-связывающий-фрагмент. Особенно подходящими для применения в таких диагностических способах этого изобретения являются v6 связывающие лиганды (например, антитела), которые являются детектируемо меченными, т.е. которые содержат по меньшей мере одну детектируемую метку или конъюгированы или связаны по меньшей мере с одной детектируемой меткой, такой как хромогенная метка (например, диаминобензидин или 4 гидроксиазобензол-2-карбоновая кислота), ферментная метка (например, малатдегидрогеназа, стафилококковая нуклеаза, дельта-5-стероидизомераза, дрожжевая алкогольдегидрогеназа, -глицеролфосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, пероксидаза, щелочная фосфатаза, аспарагиназа, глюкозооксидаза, -галактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глюкоамилаза или ацетилхолинэстераза), радиоизотопная метка (например, 3 Н, 111In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co,59Dy, 52Tr, 56Fe, 99mTc или 112In), флуоресцентная метка (например, метка 152Eu, флуоресцеиновая метка,изотиоцианатная метка, родаминовая метка, фикоэритриновая метка, фикоцианиновая метка, аллофикоцианиновая метка, Зеленый Флуоресцирующий Белок (GFP), метка в виде о-фталевого альдегида или флуорескаминовая метка), токсическая метка (например, метка в виде дифтерийного токсина, рициновая метка или метка в виде холерного токсина), хемилюминесцентная метка (например, люминоловая метка,изолюминоловая метка, метка в виде акридинийзамещенного ароматического сложного эфира, имидазольная метка, метка соли акридиния, метка оксалатного эфира, люцифериновая метка, люциферазная метка или эквориновая метка), рентгенографическая метка (например, барий или цезий), спиновая метка(например, дейтерий) и метка в виде контрастного агента для ядерного магнитного резонанса (например,Gd, Mn и железо). В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы элиминации v6-положительных метастатических опухолевых клеток в пациенте, предусматривающие введение пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких лигандов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина v6 на одной или нескольких v6 положительных метастатических опухолевых клетках, причем связывание этого лиганда с интегрином приводит к смерти, чувствительности к химиотерапии или пониженной инвазивности этой метастатической опухолевой клетки. Такие способы пригодны для элиминации различных метастатических опухолевых клеток в пациенте, например, возникающих из метастатических карцином, в том числе, но не только,карцином, включающих в себя эпителиальные ткани, которые отмечались выше. Подходящие варианты в соответствии с этим аспектом данного изобретения используют v6-интегринсвязывающие лиганды,которые являются v6-связывающими антителами или их v6-эпитопсвязывающими фрагментами, в частности моноклональными антителами или их вариантами или фрагментами, описанными выше. В некоторых подобных терапевтических вариантах осуществления данного изобретения v6-связывающие лиганды (например, v6-связывающие антитела) конъюгированы или связаны с одним или несколькими цитотоксическими соединениями или агентами, которые приводят к смерти или вызывают смерть клетки или ткани после связывания конъюгата v6-связывающий лиганд-токсическое соединение с одним или несколькими интегринами v6 на этой клетке или ткани. В дополнительных терапевтических вариантах осуществления этого изобретения v6-связывающие лиганды (например, v6-связывающие антитела) вводят пациенту вместе с одним или несколькими цитотоксическими соединениями или агентами. Цитотоксические соединения или агенты, которые могут быть подходящим образом использованы в соответствии с этими аспектами данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, цитотоксические агенты, радиоизотопы и активирующие пролекарство ферменты, описанные выше. В соответствии с этим аспектом данного изобретения v6-интегринсвязывающий лиганд или фармацевтическая композиция, содержащая этот лиганд и один или несколько фармацевтических носителей или эксципи- 10016342 ентов, могут быть введены пациенту в соответствии с описанными выше способами введения. В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы элиминации оставшихся v6-положительных опухолевых клеток из пациента после хирургического удаления опухоли из ткани или органа пациента, предусматривающие введение этому пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких лигандов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина v6 на одной или нескольких оставшихся опухолевых клеток в ткани или органе, причем связывание этого лиганда с указанным интегрином приводит к смерти, чувствительности к химиотерапии или пониженной инвазивности раковой клетки. Такие способы являются подходящими для элиминации различных метастатических опухолевых клеток в различных тканях пациента,таких как ткани, возникающие из карцином, в том числе, но не только, карцином, включающих в себя эпителиальные ткани, которые отмечались выше. Подходящие варианты в соответствии с этим аспектом данного изобретения используют v6 интегринсвязывающие лиганды, которые являются v6-связывающими антителами или их v6-эпитопсвязывающими фрагментами, в частности моноклональными антителами или их вариантами или фрагментами, описанными выше. В некоторых подобных терапевтических вариантах осуществления данного изобретения v6-связывающие лиганды (например, v6-связывающие антитела) конъюгированы или связаны с одним или несколькими цитотоксическими соединениями или агентами, которые приводят к смерти или вызывают смерть клетки или ткани после связывания конъюгата v6-связывающий лигандтоксическое соединение с одним или несколькими интегринами v6 на этой клетке или ткани. Цитотоксические соединения или агенты, которые могут быть подходящим образом использованы в соответствии с этим аспектом данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, цитотоксические агенты, радиоизотопы и активирующие пролекарство ферменты, описанные выше. Другие предпочтительные варианты осуществления данного изобретения будут очевидными для специалиста с квалификацией в данной области в свете следующего графического материала и описания изобретения и из формулы изобретения. Краткое описание графического материала Фиг. 1 является ELISA-анализом связывания очищенных химерных вариантов 3G9 с v6. Планшеты, покрытые растворимым v6, инкубировали с очищенным полученным из гибридомы мышиным антителом 3G9 (m3G9), очищенным химерным антителом 3G9 (ch3G9) или очищенным химерным антителом 3G9, содержащим замену N на S в N-связанном сайте гликозилирования в первом CDR легкой цепи(ch3G9S). После промывания промывным буфером эти планшеты инкубировали с конъюгированным с пероксидазой антителом против мышиного IgG (для полученного из гибридомы материала) или антителом против IgG человека (для химерных антител) с последующим промыванием промывным буфером. Эти планшеты проявляли ТМВ-раствором, реакции останавливали серной кислотой и анализировали с использованием планшет-ридера при А 450. Не было детектируемого значимого различия между этими 2 формами химерного антитела 3G9. Фиг. 2 изображает результаты, показывающие экспрессию гуманизированных вариантов 3G9 из трансфицированных клеток 293 Е с использованием анализа Easy Titer (Pierce). Супернатанты из транзиторно-трансфицированных клеток 293 Е анализировали на титр антител при помощи способа Easy Titer в соответствии с протоколом изготовителя (Pierce). Экспрессию различных вариантов гуманизированного антитела 3G9 анализировали. Варианты 3G9, содержащие версию 1 легкой цепи, слабо экспрессируются,тогда как варианты, содержащие версию 2 легкой цепи, экспрессируются при более высоких уровнях. С увеличением гуманизации наблюдается склонность к более высокой экспрессии. Фиг. 3 показывает результаты анализа FACS связывания вариантов hu-3G9 антитела с экспрессирующими интегрин v6 клетками SW480, определенные анализом проточной цитометрии. КлеткиSW480 собирали трипсинизацией, промывали и ресуспендировали в FACS-буфере. Затем 2105 клеток инкубировали на льду в течение 1 ч в FACS-буфере, содержащем указанный супернатант трансфектанта,титры которого определяли при помощи способа Easy Titer в соответствии с протоколом изготовителя(Pierce). После инкубирования клетки промывали FACS-буфером и ресуспендировали в FACS-буфере,содержащем конъюгированное с фикоэритрином антитело против IgG человека (Jackson ImmunoResearch) и инкубировали на льду в течение 30 мин. Затем клетки промывали и ресуспендировали в 200 мкл FACS-буфера. Связывание меченого вторичного антитела наблюдали при помощи проточной цитометрии. Все испытанные гуманизированные версии связывались с клетками SW480, по меньшей мере, так же хорошо, как химерное антитело 3G9. Варианты, содержащие версию 2 легкой цепи, значительно превосходят активность химерного антитела 3G9. В качестве отрицательного контроля служило антитело против -рецептора лимфотоксина Hu-BHA10. Фиг. 4 изображает анализ FACS связывания версий 2-5 антитела hu-3G9 с клетками FDCP1-6. Анализ FACS проводили, как описано для фиг. 3, за исключением того, что использовали клетки FDCP1-6 вместо клеток SW480. Версия 5 полностью гуманизированного варианта (H3/L5) связывалась с клеткамиFDCPl-6 лучше, чем все другие версии гуманизации. Фиг. 5 изображает анализ FACS связывания очищенных версий 2-5 антитела hu-3G9 с клеткамиFDCP1-6. Анализ FACS проводили, как описано для фиг. 4, с использованием очищенных вариантов гуманизации 3G9. Версия 5 (H3/L5) полностью гуманизированного варианта связывалась с FDCP1-6 значимо лучше, чем другие версии гуманизации. Фиг. 6 является ELISA-анализом связывания очищенных версий 2-5 антитела hu-3G9 с v6. Связывание ELISA проводили, как описано для фиг. 1. По-видимому, гуманизированная версия 5 (H3/L5) 3G9 связывается с v6 слегка лучше, чем другие производные этого антитела. Фиг. 7 является блокирующим ELISA-анализом связывания очищенных версий 2-5 антитела hu-3G9 с v6. Планшеты покрывали 0,3 мкг/мл LAP или 2,5 мкг/мл слитого белка LAP-Fc и инкубировали при 4 С в течение ночи. Раствор для нанесения покрытия удаляли и эти планшеты блокировали, промывали и инкубировали со смесью биотинилированного v6 и производными 3G9, как указано в подписи к этой фигуре, в присутствии кальция и магния. Планшет опять промывали и инкубировали с конъюгатом экстравидин-пероксидаза хрена (Sigma). Связанный белок детектировали с использованием субстрата ТВМ с последующим детектированием в планшет-ридере при A450. Гуманизированная версия 5 3G9 (H3/L5), повидимому, блокирует связывание v6 с LAP слегка лучше, чем другие производные этого антитела. Фиг. 8 изображает результаты из анализа клеточной адгезии очищенных версий 2-5 hu-3G9. Микротитрационные планшеты покрывали 50 мкл на лунку 0,5 мкг/мл LAP при 4 С в течение ночи. Затем эти планшеты промывали и блокировали. Клетки FDCP1-6 (5106 клеток/мл) отделяли из культуральных колб, метили флуоресцентным красителем (Calcein-AM, Molecular Probes, Eugene, OR) и ресуспендировали в буфере для анализа. Эти планшеты инкубировали с указанными выше очищенными антителами и мечеными клетками FDCP1-6 в присутствии кальция и магния. Планшеты промывали и регистрировали флуоресценцию, вызванную захваченными на планшете клетками. Процентное связывание определяли сравнением флуоресценции всех клеток с флуоресценцией связанных клеток. Версия 5 (H3/L5) гуманизированного антитела 3G9, по-видимому, блокирует связывание v6-экспрессирующих клеток с LAP слегка лучше, чем другие производные этого антитела. Фиг. 9 является схематическим представлением карты плазмиды pKJS195 и последовательности легкой цепи версии 5 3G9. Эта плазмида содержит гены легкой цепи версии 5 (LV5) 3G9 и устойчивости к неомицину. Эта экспрессионная кассета легкой цепи содержит немедленно ранний промотор CMV человека и первый интрон (содержащий небольшую делецию), а также последовательность полиаденилирования гормона роста человека. Фиг. 10 является схематическим представлением карты плазмиды pKJS189 и последовательности тяжелой цепи версии 33G9. Эта плазмида содержит гены тяжелой цепи версии 3 (HV3) 3G9 и дигидрофолатредуктазы (dhfr). Эта экспрессионная кассета тяжелой цепи содержит немедленно ранний промотор CMV человека и первый интрон (содержащий небольшую делецию), а также последовательность полиаденилирования гормона роста человека. Экспрессионная кассета dhfr содержит ранний промоторSV40 и последовательность полиаденилирования SV40. Фиг. 11 является схематическим представлением карты плазмиды pKJS196 и последовательности тяжелой цепи версии 3 дегликозилированного антитела, агликозил-3G9. Эта плазмида содержит гены тяжелой цепи версии 3 (HV3) агликозил-3G9 (a-HV3) и дигидрофолатредуктазы (dhfr). Эта конструкция идентична pKJS189, за исключением замены N319Q, которая уничтожает N-связанный сайт гликозилирования в константной области тяжелой цепи. Фиг. 12 изображает результаты сборки и экспрессии экспрессирующих векторов CHO hu-3G9, транзиторно трансфицированных в клетки СНО, с использованием анализа Easy Titer (Pierce). Анализ EasyTiter проводили, как описано для фиг. 2, в соответствии с протоколом изготовителя (Pierce). Векторы версии 5 дикого типа (H3/L5) и дегликозилированного (а-H3/L5) гуманизированного антитела 3G9 транзиторно трансфицировали в клетки СНО для демонстрации эффективной сборки и секреции гуманизированного антитела 3G9 из этих клеток. Обе формы антител hu-3G9 равным образом собирались и экспрессировались в клетках СНО. Фиг. 13 является комбинацией микрофотографий, изображающих уровни экспрессии v6 (темные зоны) в некоторых карциномах человека, которые метастазировали в лимфатический узел (фиг. 13A13D) или легкое (фиг. 13E-13F) из указанных местоположений первичных опухолей. Фиг. 14 является комбинацией микрофотографий, изображающих уровни экспрессии v6 (темные зоны) в некоторых карциномах человека, которые метастазировали из указанных сайтов первичных опухолей в указанные местоположения метастатических опухолей. Фиг. 15 является комбинацией микрофотографий, изображающих уровни экспрессии v6 (темные зоны), наблюдаемые в первичных опухолях карциномы эндометрия (фиг. 15 А, 15 С) и в соответствующих метастазах лимфатических узлов (фиг. 15 В, 15D). Фиг. 16 является комбинацией микрофотографий, изображающих уровни экспрессии v6 (темные зоны), наблюдаемые в пробах опухоли молочной железы человека. Фиг. 16 А: экспрессия в пробе первичной опухоли от пациента с внутрипротоковой преинвазивной карциномой in situ (DCIS); фиг. 16 В: экспрессия в пробе первичной опухоли от пациента с инвазивной карциномой молочной железы. Фиг. 17 является комбинацией микрофотографий, изображающих уровни экспрессии v6 (темные- 12016342 зоны), наблюдаемые в соответствующих пробах первичных и метастатических опухолей аденокарциномы протоков поджелудочной железы от трех разных пациентов. Фиг. 17 А-17 С: экспрессия в пробах первичных опухолей от трех разных пациентов; фиг. l7D-17F: экспрессия в соответствующих метастазах лимфатических узлов тех же самых трех пациентов; фиг. l7G-17H: экспрессия в нормальной ткани поджелудочной железы двух из этих трех пациентов. Фиг. 18 является комбинацией микрофотографий, изображающих уровни экспрессии v6 (темные зоны) , наблюдаемые в соответствующих пробах первичных и метастатических опухолей внутрипротоковой аденокарциномы поджелудочной железы от пяти разных пациентов. Фиг. 18 А-18 Е: экспрессия в пробах первичных опухолей от пяти разных пациентов, трех с опухолями, характеризуемыми как аденосквамозные опухоли (фиг. 18 А-18 С), и двух с опухолями, характеризуемыми как слабо дифференцированные опухоли (фиг. 18D-18E); фиг. 18F-18J: экспрессия в соответствующих метастазах лимфатических узлов тех же самых пяти пациентов; фиг. 18K-18L: экспрессия в нормальной панкреатической ткани,полученной от двух из этих пяти пациентов. Фиг. 19 демонстрирует способность моноклонального анти-v6-антитела (3G9) ингибировать рост опухоли в модели мыши ВхРС-3 с ксенотрансплантатом рака поджелудочной железы человека. Фиг. 19 А: микрофотография среза опухоли ксенотрансплантата, окрашенного с использованием иммуногистохимии с моноклональным анти-v6-антителом (3G9); фиг. 19 В: кривые роста опухоли ксенотрансрастворимым слитым белком TGFbRII-Fc-Ig плантата ВхРС-3 во время обработки v6-mAb 3G9 или носителем ЗФР; фиг. 19 С: диаграмма рассеивания (разброса) размеров отдельных опухолей в конце этого исследования (день 66). Фиг. 20 является серией диаграмм в виде столбцов, демонстрирующих действия моноклонального анти-v6-антитела (3G9) и растворимого конъюгата TGFрецептор-фрагмент антитела (sTGF-pRII-Fc) на миграцию через матрикс, инвазию и продуцирование матриксной металлопротеиназы 9 (ММР 9) клетками VB6, экспрессирующими 6 (трансфицированными 6) и ложнотрансфицированными клетками. Фиг. 20 А и 20 В: миграция (фиг. 20 А) или инвазия (фиг. 20 В) клеток через внеклеточный матрикс. "Unt": необработанные клетки; "3G9": клетки, обработанные 10 мкг/мл моноклонального анти-v6-антитела 3G9; "sTGFbR-Fc": клетки, обработанные 10 мкг/мл растворимого конъюгата sTGF-pRII-Fc. Незакрашенные столбцы: клетки, трансфицированные интегрином 6 и экспрессирующие интегрин 6 (VB6 клетки); закрашенные столбцы: ложнотрансфицированные клетки, не экспрессирующие интегрин 6 (С 1 клетки); фиг. 20 С: продуцирование ММР 9 (нг/мл) клетками C1 или VB6, которые были необработанными (незакрашенные столбцы), были обработаны 10 мкг/мл 3G9 (заштрихованные столбцы) или были обработаны 10 мкг/мл конъюгата sTGF-pRII-Fc (закрашенные столбцы). Фиг. 21 является микрофотографией иммуногистохимического среза, демонстрирующей экспрессию v6 (темные зоны) на опухолевых клетках, проникающих в строму в модели ксенотрансплантатаLIM1863. Окрашивание антителами против кератина человека на последующих срезах (не показано) подтвердило, что эти клетки были эпителиальными (т.е. LIM1863), происходящими из опухоли. Фиг. 22A-22F изображают действия v6-mAb 3G9 и рекомбинантного растворимого слитого белкаTGFbR-Fc-Ig на рост опухоли и инфазию в строму в модели опухоли ксенотрансплантата LIM1863. Фиг. рас 22 А: кривые роста опухоли ксенотрансплантата LIM1863 во время обработки v6-mAb 3G9 или носителем ЗФР; фиг. 22 В: диаграмма рассеивания творимым слитым белком TGFbRII-Fc-Ig(разброса) размеров отдельных опухолей в конце этого исследования (день 52); фиг. 22 С: количествоv6 положительных зон в срезах опухоли; фиг. 22D-22F: микрофотографии, изображающие репрезентативное окрашивание v6 в опухолях, собранных из каждой указанной группы обработки. Фиг. 23 А-23D являются гистограммами из анализа с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS) различных клеточных линий, обработанных мышиным 3G9-mAb или контрольным mAb, демонстрирующими уровень связывания m3G9 с NHP v6-экспрессирующих клеточных линий (A, Vero; В, LLC-MK2; С, 12MBr6; D, 4MBr5). Фиг. 24 А-24 В являются кривыми титрования, демонстрирующими уровень связывания мышиного 3G9 с NHP v6-экспрессирующих клеточных линий (А, 12MBr6; В, 4MBr5). Фиг. 25 является диаграммой в виде столбцов, демонстрирующей адгезию NHP v6 экспрессирующих клеточных линий с LAP (А, 12MBr6; В, 4MBr5). Фиг. 26 А-26 В являются кривыми титрования, демонстрирующими уровень ингибирования мышиным 3G9 адгезии NHP v6-экспрессирующих клеточных линий с LAP (А, 12MBr6; В, 4MBr5). Фиг. 27 является диаграммой в виде столбцов, демонстрирующей активацию латентного TGFv6-экспрессирующими клеточными линиями человека и примата. Фиг. 28 является кривой титрования, демонстрирующей ингибирование активации TGF- мышиным 3G9 на клеточных линиях SW4806 и 4MBr5. Фиг. 29 является серией микрофотографий, демонстрирующих v6-иммуноокрашивание в заболевании почки человека. (А) Замороженные срезы почки человека, иммуноокрашенные v6-mAb (красный цвет) и mAb пан-цитокератина (зеленый цвет). (В) Залитые в парафин срезы почки человека, иммуноо- 13016342 крашенные с использованием v6-mAb. Фиг. 30 демонстрирует v6-иммуноокрашивание в почках Col4 А 3 +/- и Col4 А 3 -/- мыши. Фиг. 30 А: микрофотография замороженных срезов почки 7-недельных Col4 А 3 +/- мышей и Col4 А 3 -/- мышей,иммуноокрашенных v6-mAb (красный цвет) и mAb пан-цитокератина (зеленый цвет); фиг. 30 В: залитые в парафин срезы почки 4- и 8-недельных Col4 А 3 +/- и Col4 А 3 -/- мышей, иммуноокрашенные v6mAb; фиг. 30 С: диаграмма в виде столбцов, демонстрирующая количество v6-иммуноокрашивания в почках из 4-, 7- и 8-недельных Col4 А 3 +/- и Col4 А 3 -/- мышей (n=3). Фиг. 31 демонстрирует специфичность связывания v6-mAb. Фиг. 31 А: проточный цитометрический анализ связывания v6-mAb (3G9, 8G6, 8 В 3), анти-v-mAb (RMV-7), mAb отрицательного контроля (1 Е 6 и МОРС 21) и контроля на изотип (IgG1 крысы) с клетками NIH3T3 и клетками NIH3T3b6; фиг. 31 В: иммуноокрашивание Col4 А 3 -/- и Col4 А 3 -/-; 6 -/- срезов почек с использованием анти-v6-mAbCol4 А 3 -/- мышей, обработанных с 3-недельного до 8,5-недельного возраста, и для необработанных мышей Col4 А 3 +/- соответствующего возраста. Показано иммуноокрашивание (коркового вещества и мозгового вещества почки) репрезентативного среза для каждой группы обработки (n=8 на группу); фиг. 32 В и 32C: количественное определение SMA в почках необработанных Col4 А 3 +/- мышей и Col4 А 3 -/- мышей, обрабатыаемых разными агентами в возрасте от 3- до 7-недельного или от 3- до 8,5-недельного возраста. Показано процентное положительное иммуноокрашивание для коркового вещества (32 В) и мозгового вещества почки (32C) относительно общего размера изображения. N-величина для каждой группы обработки обозначена в диаграмме рассеивания (=р 0,001, =р 0,05, =р 0,001 при сравнении групп обработки с обработанными mAb отрицательного контроля, 1E6, мышами). Фиг. 33 А и 33 В являются графиками разброса, представляющими анализ Такмана уровней мРНК коллагена 11 (фиг. 33 А) и коллагена 12 (фиг. 33 В). РНК выделяли из почек 7-недельных необработанных или обработанных Col4 А 3 -/- мышей и 7-недельных необработанных Col4 А 3 +/+ мышей. Фиг. 34 является парой графиков разброса, демонстрирующих SMA-иммуноокрашивание Col4 А 3(=р 0,0005, сравнение обработки с отрицательным контролем, 1 Е 6-обработанными Col4 А 3 -/- мышами,=р 0,02, сравнение обработки с необработанными 6-недельными Col4A3 -/- мышами). Фиг. 35 изображает картины распределения экспрессии и модуляции генов в почках 7-недельныхCol4 А 3 -/- мышей. Показаны 395 наборов зондов чипа генов (GeneChip), отобранных на 2-кратное или большее изменение между группами дикого типа (WT) и необработанными Альпорт-(UN)-группами при р 0,01. Столбцы карты (heat map) изображают картины распределения относительных уровней экспрессии для отдельных экспериментальных групп. Каждый столбец представляет 395 нормализованных средних величин интенсивности сигнала набора зондов для единственной экспериментальной группы из 5 мышей. Изменения в экспрессии генов по всем экспериментальным условиям отражены изменением окраски, как показано на окрашенном столбце. Двухмерное иерархическое разбиение на кластеры выполняли для исследования родства (показанного дендрограммой) среди этих экспериментальных групп. Фиг. 36 А-36D являются диаграммами в виде столбцов, демонстрирующими функциональную аннотацию v6-зависимых генов, ассоциированных с почечным заболеванием в Col4 А 3 -/- почках. IngenuityPathways Analysis (IPA) выполняли отдельно на перечне наборов зондов, соответствующих генам, сверхэкспрессируемым или недостаточно экспрессируемым в почках Альпорта в сравнении с диким типом. Перечнями, используемыми для IPA, были наборы субпопуляций из 395 наборов зондов, первоначально отобранных на значимое (2-кратного, р 0,01) изменение между группами мышей с синдромом Альпорта и группами мышей дикого типа. Показаны ранжированные перечни биологических функций (А, C) и канонические пути (B, D), ассоциированные с генами, сверхэкспрессированными (А, С) и отрицательно модулированными (C, D) в почках 7-недельных мышей с синдромом Альпорта. Фиг. 37 А-37 С являются схематичными представлениями анализа. Субпопуляции и сети генов,дифференциально экспрессируемых в Col4A3 -/- почках и модулируемых обработкой блокирующимиv6 mAb. Фиг. 37 А: диаграмма Венна перечня наборов зондов. Площади кругов Венна, их объединения и пересечения являются пропорциональными количествам наборов зондов в соответствующих перечнях; фиг. 37 В, 37 С: регуляторные сети наивысшей оценки, выведенные из перечней наборов зондов, на которые значимо (более чем 2-кратное изменение между обработанными и необработанными почками Альпорта, р 0,05) влияют v6-блокирующие mAb 3G9 (фиг. 37 В) и 8G6 (фиг. 37 С). Острия этих сетей показывают направления взаимодействий среди генов, изображенных в виде узлов и расположенных в соответствии с их клеточной локализацией. Фиг. 38 изображает иммуногистохимический анализ и анализ Такмана экспрессии TGF-1. Фиг.- 14016342 38 А: срезы почек из Col4 А 3 +/- и Col4 А 3 -/- мышей, обработанных указанными агентами, иммуноокрашенные на экспрессию TGF-1. Окрашивание показано для репрезентативного среза из каждой группы обработки; фиг. 38 В: анализ Такмана уровней мРНК TGF-1 в группах обработки. Фиг. 39 изображает окрашивание трехцветным красителем (трихромом) на экспрессию коллагена в почках. Окрашивание для 10-недельных Col4 А 3 +/+; 6 +/+; Col4 А 3 -/-; 6 +/+ и Col4 А 3 -/-; 6 -/- мышей. Репрезентативные срезы тканей показаны для областей коркового вещества почки (фиг. 39 А) и мозгового вещества почки (фиг. 39 В). Фиг. 40 А и 40 В являются графиками разброса, изображающими SMA-окрашивание с титрованием доз обработки 3G9. Количественный анализ иммуноокрашивания SMA показан для гломерулярной (корковое вещество почки) (фиг. 40 А) и интерстициальной (мозговое вещество) (фиг. 40 В) областей почек после обработки указанными дозами mu3G9 или 10 мг/кг mu1 Е 6 (IgG-контроль), 3 раза в неделю, с 3-7 недельного возраста. ED50 коркового вещества почки = 0,4 мг/кг; ED50 для мозгового вещества почки = 0,3 мг/кг. Горизонтальные линии представляют средние величины. Фиг. 41 является серией микрофотографий, демонстрирующих иммуногистохимический анализ экспрессии v6 в здоровой почке и почке после UUO. Фиг. 41 А: здоровая неповрежденная почка; фиг. 41 В: 7 дней после UUO; фиг. 41 С: 10 дней после UUO; фиг. 41D: 14 дней после UUO. Фиг. 42 является серией микрофотографий, демонстрирующих, что положительная регуляция v6 происходит при 18 неделях после облучения. Мышей C57BL/6, облученных 14 Гр (джоули/кг массы тела), умерщвляли в указанных временных точках, и срезы легких окрашивали анти-6-антителом. Фиг. 43 является парой микрофотографий, демонстрирующих, что в зонах фиброза стойко сохраняется положительно регулируемая экспрессия v6. Срезы легких окрашивали на экспрессию 6, как на фиг. 1. Срезы были из мышей, умерщвленных при 24 неделях (слева) или при 27 неделях (справа) после облучения 14 Гй. Оба среза обнаруживают фиброзные повреждения с многочисленными эпителиальными клетками, экспрессирующими высокие уровни v6. В соседнем нефиброзном эпителии экспрессияv6 остается высокой при 24 неделях, но является гораздо менее очевидной при 27 неделях. Фиг. 44 является серией микрофотографий, демонстрирующих, что Itgb6-/- мыши защищены от индуцированного облучением фиброза легких. Мышей Itgb6+/+ и Itgb6-/- (фенотип C57BL/6) подвергали торакальному облучению 14 Гр. После 27 недель мышей умерщвляли и левые легкие окрашивали трехцветным красителем (Трихромом) Массона. Показаны репрезентативные легкие: в общем и целом, 21 из 23 Itgb6+/+ мышей имела явный фиброз, тогда как ни одна из 17 Itgb6-/- мышей не имела фиброза. Фиг. 45 является диаграммой в виде столбцов, демонстрирующей, что Itgb6-/- мыши защищены от индуцированного облучением фиброза легких, как измерено по гидроксипролину. Содержание коллагенаItgb6+/+ мышей является значимо более высоким, чем содержание коллагена необлученных Itgb6+/+ легких и облученных Itgb6-/- легких (р 0,03 против Itgb6+/+, N=5-6 для каждой группы). Фиг. 46 является линейным графиком, демонстрирующим, что отсутствие интегрина v6 не влияет на выживание после облучения легких. Группы Itgb6+/+ и Itgb6-/- мышей облучали 14 Гр. Кривые выживания для этих двух групп не отличаются значимо (WT=Itgb6+/+, KO = Itgb6-/-). Фиг. 47 является графиком разброса, изображающим измерения фиброза легких в мышах, получающих 3G9, растворимый TGF-R или контрольное антитело (Ab) IP, умерщвленных при 26 неделях после облучения. Фиброз легких предотвращается в мышах, получающих 1 мг/кг 3G9. Каждая точка представляет отдельную мышь, горизонтальные стержни представляют средние величины. Не было различий в фиброзе между группой 0,3 мг/кг и контрольной группой. Группа 1 мг/кг имела значимо меньший фиброз, чем контроли. Группы 10 мг/кг и группы с растворимым рецептором TGF- имели меньший фиброз, но различия в сравнении с контролем не достигали значимости. Фиг. 48 является графиком разброса, изображающим измерения фиброза легких у всех мышей(умерщвленных мышей, умирающих мышей и мышей, найденных мертвыми, от 20 до 26 недель после облучения), получающих 3G9, растворимый TGF-R или контрольное антитело (Ab) IP. Данные представлены, как на фиг. 47. Не было различия в фиброзе между группой 0,3 мг/кг и контрольной группой. Группы 1 мг/кг, 10 мг/кг и растворимого рецептора TGF- имели значимо меньший фиброз, чем контроли. Фиг. 49 является диаграммой в виде столбцов, изображающей определения лейкоцитарных формул по Шиллингу клеток БАЛ мышей, получающих 3G9, растворимый TGF-R или контрольное антитело(Ab) IP, умерщвленных при 26 неделях после облучения. Фиг. 50 является линейным графиком, демонстрирующим, что облученные 14 Гр мыши, получающие IP инъекции антитела 3G9, имели выживание, сходное с контролями. Анализ выживания выполняли на всех группах в виде комбинированного анализа (р=0,088, С=контроль, 0,3=0,3 мг/кг, SolR=растворимый рецептор TGF-, 10=10 мг/кг). Фиг. 51 является диаграммой в виде столбцов, изображающей измерения фиброза легких в мышах,обработанных 3G9 (1, 3, 6 или 10 мг/кг) один раз в неделю SC. Показаны отдельные результаты для всех мышей (мышей, обнаруженных мертвыми/умирающими и умерщвленных мышей), мышей, умерщвленных при 28 или 32 неделях, и мышей, обнаруженных мертвыми/умирающими. Значимо увеличенный- 15016342 фиброз присутствовал в контролях в сравнении со всеми группами с антителом (р 0,05 для всех доз в сравнении с контролями). Фиг. 52 является диаграммой в виде столбцов, изображающей определения лейкоцитарных формул по Шиллингу клеток БАЛ мышей, получающих 3G9 или контрольное антитело (Ab) SC, умерщвленных при 28 или 32 неделях после облучения. Дозы 3G93, 6 и 10 мг/кг приводят к значимо увеличенным процентам как нейтрофилов, так и лимфоцитов (р 0,05 для всех сравнений). Фиг. 53 является серией микрофотографий, изображающих вид клеток БАЛ в контроле против обработанных 3G9 мышей. В контрольном цитоспине видны нормальные альвеолярные макрофаги. Клетки БАЛ из мышей, обработанных 1 мг/кг 3G9, похожи на контрольные клетки. При дозе 3 мг/кг становятся видны пенистые макрофаги (подобные макрофаги видны в Itgb6-/- мышах). При более высоких дозах (6 мг/кг и показанных здесь 10 мг/кг) видны увеличенные количества нейтрофилов (острие стрелки) и лимфоцитов, а также некоторые остатки клеток. Фиг. 54 является линейным графиком, изображающим кривые выживания Каплана-Мейера для когорты мышей, умерщвленных при 28 неделях после облучения. Фиг. 55 является линейным графиком, изображающим кривые выживания Каплана-Мейера для когорты мышей, умерщвленных при 32 неделях после облучения. Фиг. 56 является диаграммой в виде столбцов, демонстрирующей, что массовое отношение RV/LV увеличивается в мышах, которые умирали в диапазоне 29-32 недель после облучения, в сравнении с мышами, которые выживали до 32 недель после облучения. Сердца мышей фиксировали в формалине. Правый желудочек (RV) отсекали от левого желудочка плюс межжелудочковая перегородка (LV) и эти ткани взвешивали. Семь необлученных мышей той же самой расы использовали в качестве контролей. Столбцы представляют средние величины +/- SD (стандартное отклонение). Данные для облученных мышей показаны для всех обработанных мышей (обработанных контрольным антителом 1 Е 6 или любой дозой 3G9), мышей, обработанных контрольным антителом 1 Е 6, и мышей, обработанных любой дозой 3G9. Количества мышей были следующими: необлученные мыши, N=7; 1 Е 6-обработанные мыши: выжилиN=10, умерли N=5; 3G9-обработанные мыши: выжили N=8, умерли N=9. Отношение RV/LV не отличалось значимо от необлученных контролей в мышах, которые выживали. В противоположность этому,отношение RV/LV значимо увеличивалось у мышей, которые умирали (всех мышей и мышей субпопуляций 1E6 и 3G9), по сравнению с необлученными мышами (Р 0,02). Отношение RV/LV было также значимо повышено у мышей (всех мышей и мышей субпопуляций 1 Е 6 и 3G9) в сравнении с эквивалентными группами мышей, которые выживали (Р 0,0007). Фиг. 57 является парой микрофотографий, изображающих легкие из мышей, которые умирали, которые были обработаны контрольным антителом (1 Е 6), слева, или анти-v6-антителом (3G9, 1 мг/кг/неделя), справа. Обратите внимание на периферические зоны с отсутствием эритроцитов в альвеолярных стенках. Этот вид согласуется с потерей перфузии. Фиг. 58 является серией микрофотографий, изображающих экспрессию v6 в заболевании легкого человека, демонстрирующих, что экспрессия v6 в сильной степени положительно регулируется в заболевании легкого человека. Срезы тканей в парафине легкого человека и мыши иммуноокрашивали v6 специфическим антителом для визуализации относительных уровней экспрессии в нормальном (фиг. 58 А) и пораженном болезнью легком: идиопатический фиброз легкого (фиг. 58 В), диффузное интерстициальное заболевание легкого (фиг. 58 С) и диффузное интерстициальное заболевание легкого (фиг. 58D). Окрашивание является характеристикой уровня положительной регуляции, наблюдаемой в сорока одной пробе разных пациентов, представленных ниже в табл. 16-1 (пример 16). Фиг. 59 является серией микрофотографий, изображающих экспрессию v6 в модели индуцированного блеомицином фиброза легкого, демонстрирующих, что экспрессия v6 в сильной степени положительно регулируется в мышиной модели индуцированного блеомицином фиброза легкого. Срезы тканей в парафине легкого мыши иммуноокрашивали v6-специфическим антителом для визуализации относительных уровней экспрессии в легком, в которое инстиллировали блеомицин. Фиг. 60 является серией диаграмм в виде столбцов, изображающих действие обработки mu3G9 на содержание гидроксипролина легкого в обработанных блеомицином мышах SV129. Каждая из мышей получала 4 мг/кг mu3G9 (блокирующего v6-mAb), 1 Е 6 (контрольный IgG1) в первых трех экспериментах, показанных для разных перечисленных периодов обработки. В четвертом варианте каждая из мышей получала ЗФР, 4 мг/кг mu3G9 (блокирующего v6-mAb), 4B4 (неблокирующего v6-mAb) или 8G6(второго блокирующего v6-mAb) три раза в неделю в течение дней 15-60 после обработки блеомицином. Стержни ошибок представляют собой стандартные ошибки. Средние величины для групп и стандартные отклонения приведены в приложении А примера 16. Фиг. 61 является серией диаграмм в виде столбцов, изображающих действие обработки mu3G9 на содержание коллагена (гистоморфометрию) в обработанных блеомицином мышах С 57 В 16. Мыши получали 3 дозы в неделю mu3G9 (блокирующего v6-mAb), 8G6 (второго блокирующего v6-mAb), 8B3(неблокирующего v6-mAb), 1 Е 6 (контрольного IgG1-mAb) или sTGFbR (растворимого TGF-рецептора-положительного контроля на ингибирование TGF-). В первых трех показанных эксперимен- 16016342 тах (фиг. 61 А, 61 В и 61 С) мышей обрабатывали, начиная со дня 1 перед введением блеомицина, и эвтанизировали в день 14. В первых двух экспериментах (фиг. 61 А и 61 В) дозы каждого агента были 4 мг/кг,тогда как в третьем эксперименте (фиг. 61 С) дозу mu3G9 варьировали, как указано. В конечном эксперименте (фиг. 61D) мышей обрабатывали, начиная с 14 дней перед введением блеомицина, и эвтанизировали в день 28. Гистологические срезы окрашивали красителем Трихром (дающим трехцветную окраску), визуализировали и площадь окрашенной в синий цвет (содержащей коллаген) ткани рассчитывали в виде процента общей площади ткани с использованием программы Metamorph. Стержни ошибок представляют собой стандартные ошибки. Средние величины для групп и стандартные отклонения приведены в приложении В примера 16 ( = значимо отличающиеся от ЗФР-обработанной группы согласноANOVA). Фиг. 62 является серией диаграмм в виде столбцов, изображающих mu3G9 в индуцированном блеомицином фиброзе легкого с использованием мышей с коллагеном в качестве репортера. Блеомицин инстиллировали интратрахеально в мышей с люциферазой-коллагеном в качестве репортера. Мышей обрабатывали, начиная со дня перед индукцией патологического изменения блеомицином, один раз в неделю в течение двух недель с использованием ЗФР, 5 мг/кг растворимого TGFRII-Ig или mu3G9 в дозах 0,1,0,3, 1,0, 3 и 10 мг/кг. Включали также дополнительную группу мышей, получавших 3 раза в неделю 4 мг/кг mu3G9 (3X 4 мг/кг). Ложнообработанным мышам инстиллировали интратрахеально солевой раствор и обрабатывали их ЗФР. Содержание люциферазы легкого анализировали в день 14. Стержни ошибок представляют собой стандартные ошибки. Средние величины для групп и стандартные отклонения приведены в приложении С примера 16 ( = значимо отличающиеся от ЗФР-обработанной группы согласно ANOVA). Фиг. 63 является серией линейных графиков, изображающих временной ход для оценки действия низких эффективных доз mu3G9 на основные популяции клеток БАЛ в индуцированных блеомицином мышах. Мышам вводили блеомицин в легкие в день 0. Мышей обрабатывали ЗФР, mu3G9 в дозах 0,3, 1,0 и 3,0 мг/кг или контрольным IgG1 (1E6) в дозе 1,0 мг/кг в дни -1 и +6. Мышей умерщвляли в дни 2, 5, 8 и 11 и легкие собирали и оценивали на общее количество клеток БАЛ. Популяции макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов анализировали дифференциальным окрашиванием цитоспинов. Средние величины для групп и стандартные отклонения приведены в приложении С примера 16. Фиг. 64 является серией диаграмм в виде столбцов, изображающих действие высоких доз mu3G9 на основные популяции клеток БАЛ в день 5 в получавших блеомицин мышах. Мышам вводили блеомицин инстилляцией в легкие в день 0. Мышей обрабатывали ЗФР, mu3G9 в дозах 4, 20 и 40 мг/кг или контрольным IgG1-mAb (1 Е 6) в дозах 20 и 40 мг/кг в дни -1, +1 и +3. Мышей умерщвляли в день 5 и легкие собирали и оценивали на общее количество клеток БАЛ. Популяции макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов анализировали дифференциальным окрашиванием цитоспинов. Средние величины для групп и стандартные отклонения приведены в приложении D примера 16 (=р 0,05 относительно получавших блеомицин контролей, обработанных ЗФР, но не относительно контролей, обработанных IgG1-mAb 1E6). Фиг. 65 изображает отсутствие эффективности mu3G9 в модели с множественными дозами блеомицина в хомячках. Хомячкам вводили блеомицин (BL) или солевой раствор (SA) в легкие в дни 0, 7 и 14. Хомячков обрабатывали ЗФР, mu3G9 (Ab1) или контрольным IgG (1 Е 6), начиная в день 0. Дополнительные группы обрабатывали mu3G9 в день 7 (Ab2) или день 3 (Ab3). Все антитела вводили три раза в неделю в дозе 5 мг/кг. Хомячков, которые выживали, умерщвляли в день 28 и легкие собирали и оценивали на содержание гидроксипролина (фиг. 65 А) и перокисление липидов (фиг. 65 В). Указанный разброс представляет собой стандартную ошибку. Выживаемость хомяков в процессе исследования множественных доз (фиг. 65 С). Не наблюдали значимого различия в выживании хомячков, обработанных mu3G9,при сравнении с ЗФР- или IgG-обработанными контрольными группами. Средние величины для групп и стандартные отклонения приведены в приложении С примера 16. Фиг. 66 изображает профили нормализованных интенсивностей сигналов для генов, идентифицированных как гены, на которые значимо действуют экспериментальные обработки. Мышей обрабатывали 5 мг/кг sTGFbRII-Ig (sR) или ЗФР или mu3G9 в дозах, указанных между 0,3 и 30 мг/кг, в дни 1, 8, 15 и 22 и эвтанизировали их в день 29 (без периода восстановления) или в день 78 (7-недельный период восстановления). РНК получали из легких обработанных мышей и анализировали транскрипты. Фиг. 67 изображает профили экспрессии для генов, показывающих тенденцию к повышению при 3 мг/кг 3G9 в этой группе обработки. Мышей обрабатывали 5 мг/кг sTGFbRII-Ig (sR) или ЗФР или mu3G9 в дозах, указанных между 0,3 и 30 мг/кг в дни 1, 8, 15 и 22, и эвтанизировали их в день 29 (без периода восстановления) или в день 78 (7-недельный период восстановления). РНК получали из легких обработанных мышей и анализировали транскрипты. Фиг. 68 является парой графиков, изображающих IPA-аннотацию генов, на которые значимо действует mu3G9. Фиг. 69 А и 69 В являются картами-схемами, схематически изображающими регуляторные схемы, на которые действует mu3G9 в легком мыши. Фиг. 70 является диаграммой в виде столбцов, изображающей зависимость реакции от дозы транскрипта ММР-12 на обработку mu3G9.- 17016342 Фиг. 71 является серией диаграмм рассеивания уровней белков в жидкости БАЛ в нормальных и облученных мышах. Фиг. 72 является серией диаграмм рассеивания, изображающих белки, которые положительно регулируются индуцированным облучением фиброзом и которые отрицательно регулируются обработкойmu3G9 при 28 неделях. Подробное описание изобретения Если нет других указаний, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют значения, обычно понимаемые специалистом с обычной квалификацией в области, к которой принадлежит это изобретение. Хотя любые способы и материалы, сходные со способами и материалами, описанными здесь, или эквивалентные способам и материалам, описанным здесь, могут быть использованы в практике или испытании данного изобретения, далее описываются предпочтительные способы и материалы. Ниже описаны примерные способы и материалы, хотя способы и материалы, сходные со способами и материалами, описанными здесь, или эквивалентные способам и материалам, описанным здесь, могут быть также использованы в практике данного изобретения. Все публикации и другие ссылки, упоминаемые здесь, включены в качестве ссылки в их полном виде. В случае противоречия, контролем будет данное описание, включающее в себя определения. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Во всем описании слово содержат или вариации,такие как содержит или содержащий, будут предполагать включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключение какого-либо другого целого числа или группы целых чисел. Определения Приблизительно (около). В данном контексте при ссылке на любую численную величину термин приблизительно означает величину 10% указанной величины (например, приблизительно 50 С включает в себя диапазон температур от 45 до 55 С включительно; приблизительно 100 мМ включает в себя диапазон концентраций от 90 до 110 мМ включительно). Антагонист. В данном контексте термин антагонист относится к соединению, молекуле, части молекулы или комплексу, которые уменьшают, существенно уменьшают или полностью ингибируют биологические и/или физиологические действия интегрина v6 в клетке, ткани или организме. Антагонисты, которые могут быть лигандами для v6, могут проводить такие действия различными путями, в том числе, но не только, конкуренцией с другим лигандом за связывание с v6 на поверхности клетки; взаимодействием с v6 таким образом, чтобы уменьшить, существенно уменьшить или ингибировать способность этого интегрина связывать другие лиганды; связыванием с v6 и индукцией конформационного изменения v6 в клеточной поверхности, так что этот интегрин принимает структуру, с которой уже не могут связываться другие лиганды (или могут связываться только с уменьшенной или существенно уменьшенной аффинностью и/или эффективностью); индукцией физиологического изменения (например, увеличения комплексов внутриклеточной передачи сигналов; увеличения ингибиторов транскрипции; уменьшения экспрессии v6 в клеточной поверхности; и т.д.) в клетках, тканях или организмах, так что связывание других лигандов или физиологический сигнал, индуцированный такими лигандами после связывания с v6, уменьшается, существенно уменьшается или полностью ингибируется; и другими механизмами, при помощи которых антагонисты могут проводить их активности, которые известны специалисту с обычной квалификацией в данной области. Как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, антагонист может иметь сходную структуру относительно другойv6-связывающей части (например, v6-связывающего лиганда), в отношении которой он действует антагонистически (например, этим антагонистом может быть вариант, фрагмент или производное агониста), или может иметь совершенно неродственную структуру. Связанный. В данном контексте термин связанный относится к связыванию или присоединению,которое может быть ковалентным, например, посредством химического связывания, или нековалентным,например, посредством ионных взаимодействий, гидрофобных взаимодействий, водородных связей и т.д. Ковалентными связями могут быть, например, сложноэфирные связи, простые эфирные, сложные фосфоэфирные, сложные тиоэфирные, простые тиоэфирные, уретановые, амидные, аминные, пептидные,имидные, гидразоновые, гидразидные, углерод-серные связи, углерод-фосфорные связи и т.п. Термин связанные является более широким, чем соединенные сочетанием, конъюгированные и присоединенные. Конъюгат/конъюгация. В данном контексте термин конъюгат относится к продукту ковалентного присоединения части молекулы, например химического соединения или радиоактивного изотопа, к лиганду, который связывается с v6, например v6-связывающему антителу или его фрагменту. Конъюгация обозначает образование конъюгата, определенного в предыдущем предложении. Любой способ,обычно используемый специалистами с квалификацией в области конъюгации химических соединений или радиоактивных изотопов к биологически активным веществам, таким как белки или полипептиды (в том числе антитела), может быть использован в данном изобретении. Заболевание, нарушение, состояние. В данном контексте термин заболевание или нарушение- 18016342 относится к любому неблагоприятному состоянию человека или животного, включающему в себя опухоли, рак, аллергии, привыкание (к лекарствам, наркотикам и т.д.), аутоиммунную реакцию, инфекцию,отравление или ухудшение оптимальной умственной или соматической функции. Состояния в данном контексте включают в себя заболевания и нарушения, но обозначают также физиологические состояния. Например, фертильность является физиологическим состоянием, но не заболеванием или нарушением. Таким образом, композиции этого изобретения, подходящие для предотвращения беременности посредством уменьшения фертильности, могли бы быть описаны как лечение состояния (фертильности), но не лечение нарушения или заболевания. Другие состояния известны квалифицированным в данной области специалистам. Эффективное количество. В данном контексте термин эффективное количество относится к количеству указанных соединения, конъюгата или композиции, которое является необходимым или достаточным для реализации желаемого биологического эффекта. Эффективным количеством указанных соединения, конъюгата или композиции в соответствии со способами данного изобретения было бы количество, которое дает этот выбранный результат, и такое количество может быть определено рутинным способом лицом с квалификацией в данной области с использованием анализов, которые известны в данной области и/или которые описаны здесь, без необходимости чрезмерного экспериментирования. Например, эффективным количеством для лечения или предупреждения метастазирования рака могло бы быть количество, необходимое для предотвращения миграции и инвазии опухолевой клетки через базальную мембрану или через эндотелиальный барьер in vivo. Этот термин является также синонимом термина достаточное количество. Эффективное количество для любого конкретного применения может варьироваться в зависимости от таких факторов, как подлежащее лечению заболевание, нарушение или состояние, конкретная вводимая композиция, способ введения, размер субъекта и/или тяжесть заболевания или состояния. Специалист с обычной квалификацией в данной области может определить эмпирически эффективное количество конкретного соединения, конъюгата или композиции данного изобретения в соответствии с обеспеченным здесь руководством, без необходимости чрезмерного экспериментирования. Термин один. Использование термина один в этом описании обозначает по меньшей мере один или один или несколько, если нет других указаний. Термины один или несколько и по меньшей мере один могут использоваться здесь взаимозаменяемо. Пептид, полипептид, белок. В данном контексте термин полипептид включает в себя единственный полипептид, а также множественные полипептиды и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин полипептид относится к любой цепи или любым цепям двух или более аминокислот и не относится к какой-либо конкретной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, цепь аминокислот или любой другой термин, используемый для ссылки на цепь или цепи двух или более аминокислот, может быть использован вместо любого из этих терминов или взаимозаменяемо с любым из этих терминов. Термин полипептид относится также к продуктам постэкспрессионных модификаций полипептида, включающих в себя гликозилирование, ацетилирование,фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами,протеолитическое расщепление или модификацию не встречающимися в природе аминокислотами. Полипептид может быть получен из природного биологического источника или продуцирован рекомбинантной технологией, но необязательно транслирован из указанной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть генерирован любым образом, в том числе химическим синтезом. В соответствии с этим определением используемые в данном изобретении полипептиды могут иметь размер приблизительно 3 или более, 5 или более, 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более,100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более или 2000 или более аминокислот. Полипептиды могут иметь определенную трехмерную структуру, хотя они необязательно имеют такую структуру. Полипептиды с определенной трехмерной структурой называют уложенными, а полипептиды, которые не имеют определенной трехмерной структуры, но могут принимать большое число различных конформаций, называют неуложенными. В данном контексте термин гликопротеин относится к белку, связанному по меньшей мере с одной углеводной группой, которая присоединена к этому белку через содержащую кислород или содержащую азот боковую цепь аминокислотного остатка, например остатка серина или остатка аспарагина. Предпочтительные полипептиды, используемые в соответствии с этим изобретением, включают в себя полипептиды, которые являются лигандами или которые связываются с интегрином v6 на поверхности клетки, в том числе, но не только, антителами (в частности, моноклональными антителами), которые узнают один или несколько эпитопов на v6 и связываются с одним или несколькими эпитопами на v6. Под выделенным полипептидом или его фрагментом, вариантом или производным имеют в виду полипептид, который не находится в его природном окружении. Не требуется какой-либо конкретный уровень очистки. Например, выделенный полипептид может быть удален из его природного окружения. Рекомбинантно полученные полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках-хозяевах, считаются вы- 19016342 деленными для целей этого изобретения, так же как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были отделены, фракционированы или частично или, по существу, очищены любым подходящим способом. В качестве полипептидов данного изобретения включены также фрагменты, производные, аналоги или варианты предыдущих полипептидов и любые их комбинации. Термины фрагмент, вариант,производное и аналог при ссылке на анти-v6-антитела или полипептиды антител включают в себя любые полипептиды, которые сохраняют, по меньшей мере, некоторые из антигенсвязывающих свойств соответствующего нативного антитела или полипептида, т.е. те полипептиды, которые сохраняют способность связываться с одним или несколькими эпитопами на интегрине v6. Фрагменты полипептидов данного изобретения включают в себя протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты,наряду со специфическими фрагментами антител, обсуждаемыми здесь в другом месте. Варианты антиv6-антител и полипептиды антител, используемые в соответствии с данным изобретением, включают в себя фрагменты, описанные выше, а также полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями вследствие аминокислотных замен, делеций или инсерций. Варианты могут встречаться природно или не быть природно встречающимися. Не встречающиеся в природе варианты могут быть получены с использованием известных в данной области способов мутагенеза. Вариантные полипептиды могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеции или добавления. Производные анти-v6-антител и полипептидов антител, применимые в соответствии с данным изобретением, являются полипептидами, которые были изменены таким образом, что они проявляют дополнительные признаки, не обнаруживаемые в случае природного полипептида. Примеры включают в себя слитые белки. Вариантные полипептиды могут также называться здесь полипептидными аналогами. В данном контексте производное анти-v6-антитела или полипептида антитела обозначает рассматриваемый полипептид, имеющий один или несколько остатков, химически дериватизованных реакцией функциональной боковой группы. Включены также в качестве производных пептиды, которые содержат одно или несколько производных природно встречающихся аминокислот из двадцати стандартных аминокислот. Например, пролин может быть заменен 4-гидроксипролином; лизин может быть заменен гидроксилизином; гистидин может быть заменен 3-метилгистидином; серин может быть заменен гомосерином, и лизин может быть заменен орнитином. По существу, существенный. В данном контексте говорят, что конъюгация белка по существу не мешает способности этого белка связываться с его рецептором (рецепторами), если степень и/или величина связывания конъюгированного белка с рецептором составляет не менее чем приблизительно 40%,приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%,приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100% или более, степени и/или величины связывания соответствующего цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона, которые не были конъюгированы. Лечение. В данном контексте термины лечение, лечить, леченный или выполнение лечения относятся к профилактике и/или терапии, в частности, когда целью является предотвращение или замедление (ослабление) нежелательного физиологического изменения или нарушения, такого как, например,рассеянный склероз. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают в себя, но не ограничиваются ими, уменьшение симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизированное (т.е. не ухудшающееся) состояние заболевания, задержка или замедление прогрессирования заболевания,уменьшение интенсивности симптомов или временное облегчение состояния заболевания и ремиссию(частичную или полную), независимо от того, являются ли они детектируемыми или недетектируемыми. Лечение может также означать пролонгирование выживания в сравнении с ожидаемым выживанием в случае неполучения лечения. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают в себя субъекты, уже имеющие это состояние или нарушение, а также субъекты, склонные иметь это состояние или нарушение, или субъекты, у которых это состояние или нарушение должно быть предотвращено. Под субъектом или индивидуумом, или животным, или пациентом или млекопитающим имеется в виду любой субъект, в частности субъект-млекопитающее, для которого являются желательными диагностика,прогноз или терапия. Субъекты-млекопитающие включают в себя других приматов, домашних животных, сельскохозяйственных животных и животных зоопарков, спортивных животных или животныхлюбимцев, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот и т.п. Обзор Данное изобретение описывает гуманизированные антитела, которые являются специфическими для интегрина v6. Здесь описаны различные способы получения этих антител данного изобретения. Способы, которые известны в данной области, но не описаны конкретно здесь, также находятся в объеме этого изобретения. Данное изобретение основывается также, по меньшей мере частично, на открытиях, что интегринv6 дифференциально экспрессируется на поверхностях опухолевых клеток, в том смысле, что он экспрессируется в увеличенных количествах на опухолевых клетках, которые являются метастатическими или имеют более высокий метастатический потенциал относительно уровней экспрессии, наблюдаемых на опухолевых клетках, которые являются неметастатическими или которые имеют более низкий метастатический потенциал. Для анализа этой дифференциальной экспрессии данное изобретение использует применение лигандов, в частности антител (и, более конкретно, гуманизированных антител, обеспеченных данным изобретением), которые связываются с интегрином v6. В других вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает также способы, использующие идентификацию этой дифференциальной экспрессии в определении инвазивного и/или метастатического потенциала опухолевых клеток и в идентификации тех карцином, таких как некоторые аденокарциномы и преинвазивные in situ карциномы(в том числе DCIS и LCIS), которые могут с большей вероятностью прогрессировать в инвазивные или метастатические карциномы. В настоящем изобретении представлены также способы идентификации таких опухолей, в которых клетки опухоли с большей вероятностью являются оказывающими на лечение одним или более лигандами, которые связываются с v6-интегринами. Данное изобретение обеспечивает также способы диагностики и лечения/предупреждения метастазирования опухолей и элиминации оставшихся клеток метастатических опухолей после хирургического удаления опухолей. Гуманизированные антитела В одном варианте осуществления антителами, обеспеченными данным изобретением, являются моноклональные антитела, которые в предпочтительном варианте осуществления являются гуманизированными версиями когнатных анти-v6-антител, полученных из другого вида. Гуманизированным антителом является антитело, продуцируемое технологией рекомбинантных ДНК, в котором некоторые или все аминокислоты легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которые не требуются для связывания антигена (например, константные области и каркасные области вариабельных доменов), используют для замены соответствующих аминокислот из легкой или тяжелой цепи когнатного нечеловеческого антитела. В качестве примера, гуманизированная версия мышиного антитела к конкретному антигену имеет как на его тяжелой, так и на его легкой цепи (1) константные области антитела человека; (2) каркасные районы из вариабельных доменов антитела человека и (3) CDR из мышиного антитела. При необходимости, один или несколько остатков в каркасных районах человека могут быть изменены в остатки соответствующих положений в мышином антителе, чтобы сохранить аффинность связывания этого гуманизированного антитела с антигеном. Это изменение называют иногда обратной мутацией. Гуманизированные антитела обычно с меньшей вероятностью индуцируют иммунную реакцию в людях в сравнении с химерными антителами человека, так как первые содержат значительно меньше нечеловеских компонентов. Подходящие способы получения гуманизированных антител данного изобретения описаны, например, в Winter ЕР 0239400; Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327(1989); U.S. Patent 6180370 и Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833 (1989), описания которых включены здесь в качестве ссылки в полном виде. Обычно трансплантация мышиных (или других животных, не являющихся человеком) CDR на антитело человека достигается следующим образом. кДНК,кодирующие вариабельные домены легкой и тяжелой цепей, выделяют из гибридомы. Последовательности ДНК вариабельных доменов, включающих в себя CDR, определяют секвенированием. ДНК, кодирующие эти CDR, переносят в соответствующие районы кодирующей последовательности вариабельных доменов тяжелой или легкой цепей сайт-направленным мутагенезом. Затем добавляют сегменты генов константной области человека желаемого изотипа (например, 1 для CH идля CL). Гуманизированные гены тяжелой и легкой цепей коэкспрессируют в клетках-хозяевах млекопитающего (например, клетках СНО или NSO) для получения растворимого гуманизированного антитела. Для облегчения крупномасштабного получения антител часто желательно производить такие гуманизированные антитела в биореакторах, содержащих антитело-экспрессирующие клетки, или получать трансгенных млекопитающих(например, коз, коров или овец), которые экспрессируют указанное антитело в молоке (см., например,патент США 5827690). Иногда прямой перенос CDR в каркас человека приводит к потере антигенсвязывающей аффинности полученного антитела. Это происходит вследствие того, что в некоторых когнатных антителах определенные аминокислоты в этих каркасных областях взаимодействуют с CDR и, следовательно, влияют на общую антигенсвязывающую аффинность этого антитела. В таких случаях, могло бы быть решающим введение обратных мутаций (выше) в каркасные области акцепторного антитела для сохранения антигенсвязывающей активности этого когнатного антитела. Общий подход получения обратных мутаций известен в данной области. Например, Queen et al.(выше), Со et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869-2873 (1991) и WO 90/07861 (Protein Design Labs Inc.) описывают подход, который включает в себя две ключевые стадии. Сначала вариабельные каркасные области человека выбирают компьютерным анализом на оптимальную гомологию белковой последовательности относительно каркаса вариабельной области когнатного мышиного антитела. Затем третичную- 21016342 структуру мышиной вариабельной области моделируют при помощи компьютера для визуализации аминокислотных остатков каркаса, которые имеют вероятность взаимодействия с мышиными CDR, и затем эти мышиные аминокислотные остатки накладывают на гомологичную каркасную область человека. При этом двухстадийном подходе имеются несколько критериев для конструирования гуманизированных антител. Первым критерием является использование в качестве человеческого акцептора каркаса из конкретного иммуноглобулина человека, который обычно является гомологичным донорскому нечеловеческому иммуноглобулину, или использование консенсусного каркаса из многих антител человека. Вторым критерием является использование донорского аминокислотного остатка, а не акцепторного аминокислотного остатка, если акцепторный остаток каркаса человека является необычным, а донорский остаток является типичным для последовательностей человека в конкретном остатке этого каркаса. Третьим критерием является использование донорского аминокислотного остатка, а не акцепторного аминокислотного остатка в положениях, смежных с этими CDR. Можно также использовать другой подход, описанный, например, Tempest, Biotechnology 9:266-271(1991). Согласно этому подходу каркасы вариабельной области, полученные из тяжелой и легкой цепейNEWM и REI, соответственно, используют для CDR-трансплантации без радикального введения мышиных остатков. Преимуществом использования этого подхода является то, что трехмерные структуры вариабельных областей NEWM и REI известны из рентгеновской кристаллографии, и, следовательно, могут быть легко моделированы специфические взаимодействия между CDR и остатками каркаса вариабельной области. Авторы данного изобретения получали кДНК вариабельной области тяжелой цепи и кДНК вариабельной области легкой цепи из мРНК, выделенных из гибридом 6.3G9 и 6.8G6, как описано в WO 03/100033. Эти гибридомы продуцируют мышиные моноклональные антитела класса IgG1, которые связываются с интегрином v6. Экспрессирующие векторы химерных антител человека конструировали инсертированием этих кДНК в экспрессирующий вектор, содержащий кодирующие последовательности константной области тяжелой цепи антитела человека или константной области легкой цепи антитела человека. Затем такие векторы вводили в клетки животного для выполнения продуцирования химерных анти-v6-антител человека. Было обнаружено, что среди этих полученных химерных антител химерные анти-v6-антитела 3G9 и 8G6 взаимодействуют с интегрином v6 и проявляют блокирующую активность. С использованием вышеописанных подходов генерировали гуманизированные версии химерных антител 3G9 и 8G6. Для антитела 3G9 этот подход включал в себя клонирование вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, как описано в примерах здесь. Затем кДНК, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепей мышиного антитела 3G9, использовали для конструирования векторов для экспрессии химер мышь-человек, в которых вариабельные области мышиного 3G9 были связаны с константными областями IgG1 человека (для тяжелой цепи) ичеловека (для легкой цепи), как описано в примерах здесь. Экспрессия экспрессирующих векторов легкой цепи и тяжелой цепи 3G9 после трансфекции в клетки 293-EBNA показала, что трансфицированные химерным 3G9 клетки синтезировали и эффективно собирали тяжелые и легкие цепи, и секретировали антитело (см. пример 2). Кроме того, была создана также дегликозилированная (агликозильная) мутантная форма химерного антитела 3G9. Было показано, что аминокислотная замена аспарагина (N) на серин (S) в N-связанном сайте гликозилирования в первом CDR легкой цепи 3G9 в значительной степени улучшала экспрессию и очистку белка без изменения связывающей аффинности (фиг. 1). Для получения гуманизированных антител 3G9 акцепторные каркасные домены человека выбирали по соответствию гомологии с последовательностями зародышевой линии человека. Для легкой цепи было обнаружено, что акцепторные каркасы L6 человека были наиболее гомологичными, а для тяжелой цепи было обнаружено, что акцепторные каркасы 3-7 человека были наиболее гомологичными, как описано в примере 3. С использованием этих акцепторных каркасов человека конструировали вариабельные домены легкой и тяжелой цепей и генерировали, и экспрессировали ряд вариантов/версий каждого из них (пример 4). Данное изобретение описывает гуманизированные антитела 3G9, содержащие вариабельный доменSEQ ID NO: 1 тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 2.- 22016342 Различные варианты/версии тяжелой и легкой цепей 3G9 генерировали с различными степенями обратных мутаций для определения, какая комбинация продуцировала наилучшее гуманизированное антитело с превосходной связывающей аффинностью и блокирующей активностью в отношении v6. Из генерированных пяти различных версий легких цепей и трех различных версий тяжелых цепей спаривание версии 3 (HV3) тяжелой цепи 3G9 с версией 5 (LV5) легкой цепи 3G9 генерировало наилучшее гуманизированное антитело (пример 4). Это гуманизированное антитело 3G9 версии 5 (H3/L5) получают экспрессией рекомбинантного вектора для версии 3 (Н 3) тяжелой цепи, содержащего плазмиду pKJS189(SEQ ID NO: 6), в комбинации с рекомбинантным вектором для версии 5 легкой цепи (LV5), содержащим плазмиду pKJS195 (SEQ ID NO: 5). Генерировали также другую версию гуманизированного антитела 3G9 версии 5 (H3/L5), в которой тяжелую цепь мутировали для удаления сайта гликозилирования в константной области, который, как было показано, является необходимым для нормального связывания Fc-рецептора (пример 5). Эту дегликозилированную (агликозильную) форму гуманизированного антитела 3G9 (aH3/L5) получают заменой аминокислотного остатка аспарагина (N) глутамином (Q) в константной области версии 3 тяжелой цепи(Н 3). Дегликозилированное гуманизированное антитело 3G9 (a-H3/L5) получают экспрессией рекомбинантного вектора для версии 3 агликозильной тяжелой цепи (а-Н 3), содержащего плазмиду pKJS196(SEQ ID NO: 7), в комбинации с рекомбинантным вектором для версии 5 легкой цепи (L5), содержащим плазмиду pKJS195 (SEQ ID NO: 5; см. выше). Подобные подходы использовали в конструировании гуманизированного антитела 8G6 (пример 7). Конструировали три версии вариабельной легкой цепи и вариабельной тяжелой цепи 8G6, причем первая версия содержит наибольшую часть обратных мутаций, а третья версия содержит наименьшую часть обратных мутаций (т.е. является наиболее гуманизированной) (пример 5). Другие части молекул антител Как описано более подробно ниже, гуманизированные моноклональные антитела этого изобретения могут дополнительно содержать другие части молекул для выполнения желаемых функций. Например,гуманизированные антитела могут включать в себя токсиновую часть (например, столбнячный токсоид или рицин) или радионуклид (например, 111In или 90Y) для убивания клеток, на которые нацелены эти антитела (см. патент США 6307026). Гуманизированные антитела могут содержать часть (например,- 24016342 биотин, флуоресцентные части, радиоактивные части, гистидиновую метку или другие пептидные метки) для легкости выделения или очистки. Гуманизированные антитела могут также содержать часть молекулы, которая может пролонгировать их полупериод существования в сыворотке, например полиэтиленгликоль (ПЭГ). Различные химиотерапевтические агенты могут быть связаны с этим нацеливающим гуманизированным антителом. Предпочтительно наилучшим было бы гуманизированное антитело, которое интернализуется после связывания, однако, не исключается использование неинтернализующихся гуманизированных антител. Например, использование конъюгатов антитело-лекарственное средство, которые связываются с поверхностью опухолевой клетки, высвобождает это лекарственное средство в опухоли или вблизи опухолевых клеток, и диффузия или транспорт в эту клетку может осуществлять противоопухолевую активность в зависимости от используемого лекарственного средства. Перечень лекарственных средств, которые можно было бы использовать для получения конъюгатов, является обширным, и специалисту с квалификацией в данной области известно, как получать химические модификации в отношении желаемого соединения, чтобы сделать реакции этого соединения более удобными для целей получения конъюгатов данного изобретения. Например, лекарственное средство могло бы быть связано через высвобождаемые линкеры, которые являются дифференциально более стабильными в сыворотке, но высвобождают активное лекарственное средство внутри опухолевой клетки. Могут быть использованы несколько механизмов высвобождения в зависимости от конкретного лекарственного средства. Примеры этих механизмов высвобождения включают в себя использование чувствительных к кислотам гидразонов, чувствительных к окислению-восстановлению линкеров, например дисульфида, и протеолитически расщепляемых пептидных линкеров. Далее приведены некоторые репрезентативные лекарственные средства из нескольких различных классов:(A) алкилирующие агенты. Некоторыми конкретными примерами этих лекарственных средств являются циклофосфамид, хлорамбуцил, бусульфан, мелфалан и нитрозомочевина;(C) гормоны и антагонисты гормонов, такие как кортикостероиды, прогестины и эстрогены. Пролекарства определяются как лекарственные средства, которые существуют в менее активной химической форме при присоединении к антителу, но после интернализации отщепляются ферментативно с образованием более активной лекарственной формы. То же самое применение может быть получено с конъюгатами антител, которые не интернализуются, например ферментативное расщепление происходит на поверхности опухолевой клетки и лекарственное средство высвобождается в непосредственное окружение опухоли и ассимилируется опухолевой клеткой. Некоторыми примерами этого являются лекарственные средства, содержащие фосфаты, сульфаты и пептиды. Присоединение биологически активных белковых токсинов, таких как А-цепь рицина, дифтерийный токсин, шигатоксин (из Shigella dysenteriae), столбнячный токсин или токсичный фермент, является другой формой конъюгата антитела, рассматриваемой данным изобретением. Такие конъюгаты могут быть получены с использованием способов химической конъюгации или с использованием способов генетической инженерии, которые делают возможной прямую экспрессию конструкции антитело-токсин,которые хорошо известны специалисту с квалификацией в данной области. Гуманизированные моноклональные антитела этого изобретения могут также содержать другие части, такие как радионуклиды. Для целей радиоиммунотерапии этим изобретением рассматривается применение гуманизированных v6-антител для специфического нацеливания терапевтических радиоактивных изотопов для лечения рака. Перечень релевантных изотопов может включать в себя, но не ограничивается ими, 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re и 188Re. Рассматриваются также изотопы-излучатели -излучения, такие как 211At, 212Bi. Способы присоединения изотопов варьируются и зависят от конкретного используемого изотопа. Специалист с квалификацией в данной области сможет определить химический способ конъюгации для присоединения любого конкретного изотопа. Для целей радиоиммунодиагностики гуманизированные v6-антитела могут предоставлять возможность визуализации и выполнения дозиметрии для рака-мишени и/или заболевшего органа/ткани любого конкретного заболевания. Это может быть применимо для подтверждения локализации относительно известных участков опухоли, а также оптимизированного предоставления доз терапевтического введения. В частности, позитронные радиоизотопы (например, 86Y), наряду с чистым -изотопом 99MTc,могли бы предоставляться во время терапевтического введения. Вышеописанные применения радиоиммунотерапии/радиоиммунодиагностики не ограничиваются применением неинтернализующихся антител. Имеются примеры эффективного использования интерна- 25016342 лизующихся антител для нацеливания радиоизотопов, в частности, с изотопами, которые сохраняются в клетке в виде хелата после катаболизма. Например, 90Y-меченные антитела получали с использованием высокоаффинных хелаторов, таких как MX-DTPA или CHX-DTPA. Любой из вышеописанных конъюгатов антител включает в себя также использование фрагментовFab, F(ab')2, scFv, минител, СН 2-домен-делетированных конструкций антител и FcRn-мутантов. Эти фрагменты антител или происходящие из них модифицированные конструкции имеют фармакокинетику,проникновение в опухоль и свойства локализации в опухоли, отличающиеся от интактного IgG, что может предоставлять преимущества в конкретных приложениях. Например, Fab с более быстрым клиренсом может быть применим для диагностических применений и для радиоиммунодиагностических применений. С другой стороны, для радиоиммунотерапии или нацеливания лекарственных средств может быть более эффективным выбор нацеливающего носителя с более продолжительным t1/2 в сыворотке. Патологические состояния и модели животных Гуманизированные антитела данного изобретения применимы в диагностике и лечении, в том числе предупреждении, v6-опосредованных заболеваний. Например, эти гуманизированные антитела могут быть использованы для лечения фиброза (например, фиброза легкого, острого легочного патологического изменения, фиброза почки, фиброза печени, синдрома Альпорта и склеродермии) и других заболеваний и нарушений, описанных здесь в другом месте, блокированием активации TGF- или блокированием связывания v6 с любыми другими лигандами, такими как фибронектин, витронектин и тенасцин. В частности, гуманизированные антитела этого изобретения могут быть использованы для лечения заболеваний легких, ассоциированных с повреждением/фиброзом, таких как, но не только, идиопатический легочный фиброз, индуцированный радиацией фиброз, хроническая обструктивная болезнь легких(ХОБЛ), склеродермия, индуцированный блеомицином фиброз, хроническая астма, силикоз, индуцированный асбестом фиброз, острое повреждение легкого и острый респираторный дистресс-синдром (в том числе, индуцированный бактериальной пневмонией, индуцированный травмой, индуцированный вирусной пневмонией, индуцированный респиратором (аппаратом искусственной вентиляции легких), индуцированный нелегочным сепсисом и индуцированный аспирацией). Гуманизированные антитела этого изобретения могут быть также использованы для лечения хронических нефропатий, ассоциированных с повреждением/фиброзом, таких как, но не только, волчанка, диабет, склеродермия, гломерулярный нефрит, очаговый сегментарный гломерулярный склероз, IgA-нефропатия, гипертензия, аллотрансплантат и болезнь Альпорта. Гуманизированные антитела могут быть также применимы для лечения фиброза кишечника, склеродермии, индуцированного радиацией фиброза. Гуманизированные антитела этого изобретения могут быть также использованы для лечения фиброза печени, например, но не только, индуцированного повреждением желчных протоков фиброза. Другие показания, для лечения которых могут быть использованы гуманизированные антитела этого изобретения, включают в себя также фиброз головы и шеи, индуцированный облучением фиброз, рубцевание роговицы, LASIX, трансплантат роговицы, трабекулэктомию, гипертрофическое рубцевание, индуцированный ожогом фиброз, хирургический фиброз, саркоидоз, псориаз и повреждение/фиброз спинного мозга. Как описано подробно ниже, кроме фиброзных заболеваний и состояний гуманизированные антитела этого изобретения применимы в лечении рака или метастазирования рака (в том числе роста и инвазии опухоли), в частности эпителиальных типов рака. Подклассом эпителиальных типов рака является плоскоклеточный рак, например, головы и шеи (включающий в себя рак ротовой полости, рак гортани,рак глотки, рак пищевода), рак молочной железы, рак легкого, рак предстательной железы, рак шейки матки, рак ободочной кишки, рак поджелудочной железы, рак кожи (базальноклеточные карциномы) и рак яичников. Исследования авторов изобретения с использованием новых моноклональных v6 антител показали, что v6 в высокой степени экспрессируется во многих эпителиальных типах рака,особенно на основном крае этих опухолей. Эти новые антитела могут быть также использованы для любых других заболеваний, опосредованных v6, в том числе псориаза. Эффективность антител данного изобретения может быть испытана в различных моделях животных, некоторые из которых описаны в неограничивающих примерах ниже. Модели фиброза легкого мыши включают в себя индуцированный блеомицином (Pittet et al., J. Clin. Invest. 107(12):1537-1544 (2001) иMunger et al., выше) и индуцированный облучением фиброз легких (Franko et al., Rad. Res. 140:347-355(1994. В обработанных блеомицином мышах экспрессия v6 увеличивается в эпителиальных альвеолярных клетках легких. Но мыши с нокаутом 6 защищены от индуцированного блеомицином патологического изменения и фиброза. Модели мышей для фиброза почки включают в себя Col4A3 -/- мышей (см., например, Cosgrove etal., Amer. J. Path. 157:1649-1659 (2000), мышей с индуцированным адриамицином повреждением (Wanget al., Kidney International 58:1797-1804 (2000); Deman et al., Nephrol Dial Transplant 16:147-150 (2001,мышей db/db (Ziyadeh et al., PNAS USA 97:8015-8020 (2000 и мышей с односторонней уретральной обструкцией (Fogo et al., Lab Investigation 81:189A (2001); и Fogo et al., Journal of the American Society ofNephrology 12:819A (2001. Во всех этих моделях мыши развивали повреждение и фиброз почек, кото- 26016342 рые могли прогрессировать до почечной недостаточности. v6 положительно регулируется в эпителиальной выстилке восходящих и нисходящих почечных канальцев Col4A3 -/- мышей, обработанных адриамицином мышей, и мышей, которые были подвергнуты односторонней уретральной обструкции. Вероятно, экспрессия v6 также увеличивается в различных моделях повреждений почек. Как описано также подробно ниже, моноклональные анти-v6-антитела могут быть также испытаны на их способность ингибировать рост, прогрессирование и метастазирование опухолей в таких моделях животных в качестве стандартных in vivo моделей роста и метастазирования опухолей. См., например, Rockwell et al., J. Natl. Cancer Inst. 49:735 (1972); Guy et al., Mol. Cell Biol. 12:954 (1992); Wyckoff etal., Cancer Res. 60:2504 (2000) и Oft et al., Curr. Biol. 8:1243 (1998). Важные v6-лиганды в случае рака могут включать в себя TGF-, который участвует в метастазировании (в отношении обзора см. Akhurst etal., Trends in Cell Biology 11:S44-S51 (2001, фибронектин и витронектин. Эффективность лечения данного изобретения может быть измерена с использованием ряда доступных диагностических инструментов, включающих в себя физическое обследование, анализы крови, измерения протеинурии, уровней креатинина и клиренса креатинина, тесты легочной функции, уровни азота крови (BUN) в плазме, наблюдение и оценка рубцевания или фиброзных повреждений, отложение внеклеточного матрикса, такого как коллаген, актин гладких мышц и фибронектин, тесты функции почек, ультразвук, магнитно-резонансную томографию (MRI) и сканирование при помощи компьютерной томографии (СТ). Фармацевтические композиции Данное изобретение обеспечивает также фармацевтические композиции, которые содержат одно или несколько гуманизированных антител данного изобретения или их фармацевтически приемлемых производных, необязательно с любым фармацевтически приемлемым носителем. Термин носитель в данном контексте включает в себя известные приемлемые адъюванты и носители. В соответствии с этим изобретением эти фармацевтические композиции могут быть в форме стерильного инъекционного препарата, например стерильной инъекционной водной или масляной суспензии. Эта суспензия может быть приготовлена в соответствии со способами, известными в данной области, с применением подходящих диспергирующих, увлажняющих и суспендирующих агентов. Фармацевтические композиции этого изобретения могут предоставляться местно, внутривенно,подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно, интрамедуллярно, интраартикулярно, внутрисуставно,внутригрудинно, внутриоболочечно, внутрипеченочно или интракраниально, по мере необходимости,или просто локально в местах воспаления или в местах опухолевого роста. Фармацевтические композиции данного изобретения могут также вводиться ингаляцией с использованием, например, распылителя,ингалятора для сухого порошка или ингалятора с отмеренными дозами. Доза и мощность дозы антител данного изобретения, эффективная для получения желаемых эффектов, будут зависеть от подлежащего лечению заболевания, размера субъекта, задачи лечения, конкретной используемой фармацевтической композиции и суждения лечащего врача. Применимы уровни доз приблизительно 0,001-100 мг/кг массы тела в день, например приблизительно 0,1-50 мг/кг массы тела в день активного соединения-ингредиента. Например, антитело этого изобретения будет вводиться в дозе в диапазоне приблизительно 0,01-20 мг/кг массы тела в день, например примерно от 0,1 до 10 мг/кг, при интервалах каждые один-четырнадцать дней. В другом варианте осуществления указанное антитело вводят в дозе приблизительно 0,3-1 мг/кг массы тела при внутрибрюшинном введении. Еще в одном варианте осуществления указанное антитело вводят в дозе приблизительно 5-12,5 мг/кг массы тела при внутривенном введении. В одном варианте осуществления композицию антител вводят в количестве, эффективном для обеспечения уровня антитела в плазме по меньшей мере 1 мг/мл. Другие подходящие дозы и схемы введения и способы введения будут известны специалистам с обычной квалификацией в данной области; другие дозы описаны с дополнительными подробностями ниже. Лиганды, связывающиеся с интегрином v6 В дополнительном варианте осуществления данное изобретение относится также к способам идентификации метастатических раковых клеток или предсказания метастатического потенциала клеток в опухоли (т.е. вероятности, что клетки в этой опухоли будут метастазировать из участка первичной опухоли во вторичный, или метастатический, участок in vivo) определением уровня экспрессии интегринаv6 этими клетками, причем увеличение экспрессии v6 в поверхности клетки указывает на то, что эта раковая клетка с большей вероятностью должна быть метастатической. В родственных вариантах осуществления данное изобретение относится к способам элиминации оставшихся опухолевых клеток, которые экспрессируют v6, в частности метастатических опухолевых клеток, после медицинского вмешательства для удаления опухоли (например, хирургического удаления этой опухоли или химиотерапевтического или радиотерапевтического уменьшения или удаления этой опухоли). В дополнительных родственных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы идентификации неинвазивных форм карциномы, в частности аденокарцином или карцином in situ (таких как внутрипротоковая карцинома преинвазивная in situ (DCIS) или дольчатая карцинома in situ (LCIS) молочной железы), кото- 27016342 рые с большей вероятностью прогрессируют в инвазивную или метастатическую форму. Некоторые подобные варианты осуществления предусматривают определение уровня экспрессии интегрина v6 в клетках этой карциномы или в миоэпителии, окружающем эту карциному, в срезах ткани, полученной от пациента, страдающего от такой карциномы, причем увеличенный уровень экспрессии интегрина v6 относительно проб неопухолевой ткани (в идеале, из того же самого органа того же самого пациента) указывает на то, что эта карцинома с большей вероятностью будет прогрессировать в инвазивную или метастатическую форму рака через некоторое время в ближайшем будущем. В каждом таком варианте осуществления данное изобретение основывается на идентификации или эксплуатации увеличенной экспрессии v6 в опухолевых клетках, причем эту идентификацию выполняют контактированием ткани,опухоли или опухолевых клеток с одним или несколькими лигандами, которые связываются с интегрином v6 в этой ткани, опухоли или опухолевых клетках. В некоторых вариантах осуществления эти ткань, опухоль или опухолевые клетки являются тканями, опухолями или опухолевыми клетками карциномы, в том числе тканями, опухолями или опухолевыми клетками из таких карцином, как аденокарциномы. В более конкретных вариантах осуществления этой карциномой является карцинома молочной железы, эндометриальная карцинома, панкреатическая карцинома, колоректальная карцинома, карцинома легкого, карцинома яичника, карцинома шейки матки, карцинома предстательной железы, карцинома печени, карцинома пищевода, карцинома головы и шеи, карцинома желудка или карцинома селезенки. Более конкретно, этой карциномой является карцинома молочной железы (в том числе карцинома молочной железы in situ, такая как внутрипроточная карцинома in situ (DCIS) или дольчатая карцинома insitu (LCIS), карцинома эндометрия, панкреатическая карцинома, колоректальная карцинома, карцинома шейки матки или карцинома легкого). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения лиганды, которые связываются с v6,являются антагонистами v6. Такие антагонисты включают в себя, но не ограничиваются ими, антитела,которые специфически связываются с v6; антитела, которые специфически связываются с 6; антитела,которые специфически связываются с v; антитела, которые специфически связываются с лигандами дляv6; лиганды для v6; антисмысловые нуклеиновые кислоты и пептидные, непептидные и пептидомиметические аналоги таких лигандов. В некоторых подобных вариантах данного изобретения лигандом, который связывается с интегрином v6, является антитело, которое связывается с интегрином v6, или его интегрин v6 связывающие фрагменты, варианты или производные. Такие антитела могут связываться с одной субъединицей этого интегрина (например, антитела, которые связываются с эпитопом, расположенным на vсубъединице, или с эпитопом, который расположен на 6-субъединице) или с обеими субъединицами(например, антитела, которые связываются с эпитопом, который расположен в области гетеродимера интегрина, которая связывает в виде мостиковой связи как v-, так и 6-субъединицы). Если нет специальной ссылки на полноразмерные антитела, такие как природно встречающиеся антитела, термин v6 антитела включает в себя полноразмерные антитела, а также v6-связывающие фрагменты, варианты,аналоги или производные таких антител, например природно-встречающееся антитело или молекулы иммуноглобулина, или сконструированные молекулы или фрагменты антител, которые связывают антиген способом, сходным со связыванием молекулами антитела. Антитела могут быть синтетическими,моноклональными или поликлональными и могут быть получены способами, хорошо известными в данной области. Для терапевтических применений часто являются предпочтительными моноклональные антитела человека, имеющие константные и вариабельные области иммуноглобулина человека, например, для минимизации иммунной реакции пациента против этого антитела. Такие антитела могут быть получены иммунизацией трансгенных животных, которые содержат гены иммуноглобулина человека(см., например, Jakobovits et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:525-535 (1995. В связи с синтетическими и полусинтетическими антителами, такие термины включают в себя, но не ограничиваются ими, фрагменты антител, антитела с переключенным изотипом, гуманизированные антитела (например, мышьчеловек, человек-мышь и т.п.), гибриды, антитела, имеющие множественные специфичности, полностью синтетические антителоподобные молекулы и т.п. Термины антитело и иммуноглобулин используются здесь взаимозаменяемо. Антитело или иммуноглобулин содержит, по меньшей мере, вариабельный домен тяжелой цепи и обычно содержит, по меньшей мере, вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи. Базовые структуры иммуноглобулина в системах позвоночных являются относительно хорошо исследованными. См., например, Harlow et al.,Antibodies: A Laboratoty Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988). Как будет понятно специалистам с обычной квалификацией в данной области, термины антитело и иммуноглобулин включают в себя разные широкие классы полипептидов, которые могут различаться биохимически. Квалифицированным в данной области специалистам будет понятно, что тяжелые цепи классифицируются как , , ,илис некоторыми подклассами среди них (например, 1-4). Природу этой цепи определяет класс антитела, например IgG, IgM, IgA, IgD или IgE соответственно. Подклассы (изотипы) иммуноглобулинов, например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и т.д., хорошо охарактеризованы и, как известно,- 28016342 придают функциональную специализацию. Модифицированные версии каждого из этих классов и изотипов легко распознаются квалифицированным в данной области специалистом с учетом данного описания и, соответственно, находятся в объеме данного изобретения. Антитела, которые связываются с интегрином v6, или их v6-связывающие фрагменты, варианты или производные, которые пригодны для применения в данном изобретении, включают в себя, но не ограничиваются ими, поликлональные, моноклональные, мультиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные, приматизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитоп-связывающие фрагменты, например Fab, Fab' и F(ab')2, Fd, Fv, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, дисульфид-связанные Fv (sdFv), фрагменты, содержащие VL- или VH-домен, фрагменты, продуцируемые библиотекой экспрессии Fab, и антиидиотипические (anti-Id) антитела (в том числе,например, anti-Id-антитела к анти-v6-антителам, описанным здесь). Молекулы scFv известны в данной области и описаны, например, в патенте США 5892019. Молекулы иммуноглобулина или антител данного изобретения могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY), класса (например,IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекулы иммуноглобулина. Фрагменты антител, включающие в себя одноцепочечные антитела, могут содержать вариабельную область (вариабельные области) отдельно или в комбинации со всеми или частью из следующих компонентов: шарнирной области, доменов CH1, CH2 и CH3. В данное изобретение включены также антигенсвязывающие фрагменты, также содержащие любую комбинацию вариабельной области (вариабельных областей) с шарнирной областью, доменами CH1, СН 2 и CH3. Антитела или их иммуноспецифические фрагменты для применения в описанных здесь диагностических и терапевтических способах могут происходить из любого животного, в том числе птиц и млекопитающих. Предпочтительно эти антитела являются антителами человека, мышей, крысы, осла, кролика, козы, морской свинки, верблюда, ламы, лошади,коровы или курицы. Наиболее предпочтительно эти антитела являются антителами человека, гуманизированными или приматизированными антителами или химерными антителами, предпочтительно моноклональными антителами. В данном контексте антитела человека включают в себя антитела, имеющие аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека, и включают в себя антитела, выделенные из библиотек иммуноглобулинов человека или из животных, трансгенных в отношении одного или нескольких иммуноглобулинов человека, которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины, как описано infra и, например, в патенте США 5939598, Kucherlapati et al. В этом контексте термин химерное антитело будет обозначать любое антитело, в котором иммунореактивная область или участок получены или произведены из первого вида, а константная область (которая может быть интактной, частичной или модифицированной в соответствии с данным изобретением) получена из второго вида. В предпочтительных вариантах осуществления мишень-связывающий район или сайт будет происходить из нечеловеческого источника (например, мыши или примата), а константная область является константной областью человека. Особенно предпочтительные антитела для применения в соответствии с данным изобретением являются моноклональными анти-v6-антителами, такими как описанные в статье Weinreb et al., J. Biol.Chem. 279(17):17875-17877 (2004) (описание которой включено здесь в качестве ссылки в полном виде),в том числе моноклональными антителами 6.8G6 (8G6) и 6.3G9 (3G9), описанными в этой статье. Дополнительные антитела, которые связываются с v6 и которые, следовательно, пригодны для применения в соответствии с данным изобретением, включают в себя антитела (или их фрагменты, варианты или производные), которые связываются с субъединицей 6 интегрина v6 (и которые, следовательно,считаются анти-6-антителами), такие как антитела, описанные в статье Weinacker et al., J. Cell Biol. 269:1-9 (1994), которая включена здесь в качестве ссылки в полном виде; и в патенте США 6692741 В 2, который включен здесь в качестве ссылки в его полном виде, в частности в столбцах 2-3 и 7-8 этого патента, в том числе антитела, названные 10D5 (депозит АТССНВ 12382, депонированный 6 августа 1997 г., American Type Culture Collection, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108) (см. патент США 6692741 в столбцах 3, строчках 7-13 и в столбцах 7-8) и CS6 (см. патент США 6692741 в столбцах 78). Подходящие варианты в соответствии с этим аспектом данного изобретения используют v6 интегрин-связывающие лиганды, которые являются v6-связывающими антителами или их v6-эпитопсвязывающими фрагментами. Дополнительные антитела, подходящие для применения в соответствии с этим аспектом данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, v6-связывающие моноклональные антитела, описанные в публикации заявки на патент СШАUS 2005/0255102 A1, описание которой включено здесь в качестве ссылки в полном виде, в том числе антитела, названные в ней как 3G9, 8G6, 1 А 8, 2 В 1, 2 В 10, 2 А 1, 2 Е 5, 1G10, 7G5, 1 С 5, а также их фрагменты, химеры и гибриды. Особенно предпочтительными антителами для применения в соответствии с данным изобретением являются моноклональные антитела 2 В 1, 3G9 и 8G6. В некоторых вариантах осуществления эти антитела содержат те же самые полипептидные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомой 6.1 А 8, 6.3G9,6.8G6, 6.2 В 1, 6.2 В 10, 6.2 А 1, 6.2 Е 5, 7.1G10, 7.7G5 или 7.1C5. Особенно подходящими антителами для применения в соответствии с данным изобретением являются моноклональные антитела, которые содер- 29
МПК / Метки
МПК: C12P 21/04, A61P 19/04, G01N 33/574, G01N 33/53, A61K 39/395, A61P 43/00, C12P 21/08, C07K 16/00, A61P 35/00, C07H 21/04
Метки: применение, анти-αvβ6-антитела
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-16342-anti-alphavbeta6-antitela-i-ih-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Анти-αvβ6-антитела и их применение</a>
Анти-aβ антитела
Номер патента: 9872
Опубликовано: 28.04.2008
Авторы: Ян Си-Чиун, Дематтос Рональд Брэдли, Кучибхотла Ума, Макклур Дон Б.
МПК: C07K 16/18, A61K 39/395, A61P 25/28...
Метки: анти-a&beta, антитела
Формула / Реферат:
1. Композиция, пригодная для введения человеку, отличающаяся тем, что содержит очищенное анти-Аb, где антитело экспрессируется в линии клеток, которые эндогенно продуцируют Аb-пептид, и где антитело выделено очисткой из клеточной линии, имеет недетектируемую концентрацию или имеет допустимо низкие уровни эндогенно продуцируемого Аb-пептида. 2. Способ получения анти-Аb антитела, отличающийся тем, что включает в себя стадии: a) экспрессии анти-Аb...
Анти-il-17-антитела
Номер патента: 14298
Опубликовано: 29.10.2010
Авторы: Аллан Барретт, Тетро Джонатан Уэнделл, Вернер Эндрю Гордон, Чоу Чи-Кин, Лю Лин, Лу Цзижун, Хуан Лихуа, Нг Кингман
МПК: A61K 39/395, C07K 16/24
Метки: анти-il-17-антитела
Формула / Реферат:
1. Гуманизированное анти-IL-17 моноклональное антитело, содержащее:(a) вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR), содержащий полипептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:56-121; и(b) вариабельный участок легкой цепи (LCVR), содержащий полипептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:178-243.2. Гуманизированное анти-IL-17 антитело по п.1, которое содержит...
Применение анти-cd3 антитела для изготовления лекарственного средства для лечения или облегчения симптома воспалительного расстройства и способ лечения или облегчения воспалительного расстройства
Номер патента: 12725
Опубликовано: 30.12.2009
Авторы: Коско-Вильбуа Мари, Деан Иянн, Маш Бернар
МПК: A61P 27/00, A61K 39/395, A61P 37/00...
Метки: воспалительного, антитела, анти-cd3, лечения, симптома, лекарственного, способ, изготовления, расстройства, средства, облегчения, применение
Формула / Реферат:
1. Применение анти-CD3 антитела для изготовления лекарственного средства для лечения или облегчения симптома воспалительного расстройства, где указанным воспалительным расстройством является увеит, васкулит или атеросклероз. 2. Применение по п.1, где указанное анти-CD3 антитело ингибирует экспрессию воспалительного цитокина или увеличивает экспрессию противовоспалительного цитокина. 3. Применение по п.1, где указанное анти-CD3 антитело...
Композиция поликлональных анти-rhd антител, способ её получения и применение композиции
Номер патента: 14182
Опубликовано: 29.10.2010
Авторы: Хаурум Йохн, Фредериксен Серен Брегенхолт, Толструп Анне Бонгор, Расмуссен Серен Кофод
МПК: C07K 16/34, A61K 39/395
Метки: получения, композиция, поликлональных, анти-rhd, способ, антител, применение, композиции
Формула / Реферат:
1. Композиция различных рекомбинантных молекул поликлональных анти-RhD антител, в которой индивидуальные молекулы способны связывать по меньшей мере один эпитоп резус-антигена D, причем указанные молекулы содержат домены CDR1, CDR2, CDR3, выбранные из одной из пар VH:LC, которые соответствуют парам аминокислотных последовательностей, определяемым по названиям отдельных клонов, перечисленных в табл. 3, и обладают константными областями IgG1 и/или...
Антиидиотипические моноклональные антитела, их применение в активной иммунотерапии злокачественных опухолей и содержащие их композиции
Номер патента: 3366
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Перес Родригес Роландо, Иглесиас Сьерра Эладио, Перес Гонсалес Алексис, Босолей Дельгадо Ирене, Васкес Лопес Ана Мария, Бомбино Лопес Гумерсинда
МПК: A61K 39/395, A61P 35/00, C07K 16/42...
Метки: содержащие, антитела, антиидиотипические, моноклональные, активной, применение, иммунотерапии, опухолей, композиции, злокачественных
Формула / Реферат:
1. Штамм гибридных клеток ECACC ь 97112901, продуцирующий антиидиотипическое моноклональное антитело 1E10, специфичное в отношении антител мыши к N-гликолилсодержащим ганглиозидным опухолевым антигенам. 2. Антиидиотипическое моноклональное антитело 1E10, специфичное в отношении антител мыши к N-гликолилсодержащим ганглиозидным опухолевым антигенам, продуцируемое штаммом гибридных клеток по п.1 и обладающее защитным действием в отношении...
Предыдущий патент: Одноцентровые каталитические системы, имеющие скорпионоподобную трехмерную структуру
Следующий патент: Активирующие фторированные носители с неметаллоценовыми комплексами на основе железа
Случайный патент: Эластичная плитка напольного покрытия