Определение нуклеиновой кислоты

013373 Область техники Настоящее изобретение относится к области определения нуклеиновой кислоты. Уровень техники В области молекулярной диагностики важной задачей является определение небольших различий в содержании нуклеиновых кислот. Наиболее часто используемый для обнаружения небольших количеств нуклеиновых кислот способ осуществляют с использованием ПЦР или ОТ-ПЦР. Эти способы работают исключительно хорошо при определении того, присутствует ли представляющая интерес последовательность в данном образце или ее там нет, но для определения того, существует ли между концентрациями двух последовательностей различие, необходимо двукратное различие. Количественный анализ нуклеиновой кислоты используют, например, при проверке качества, анализе экспрессии гена, медицинском мониторинге и диагностике. Здесь описываются способы, значительно улучшающие точность этих измерений и открывающие новые возможности для науки и медицины. Изложение сущности изобретения В одном аспекте настоящим изобретением обеспечиваются улучшенные способы определения количества последовательности нуклеиновой кислоты в образце нуклеиновых кислот. Заявленные способы могут сделать возможным точное определение в образце количества нуклеиновой кислоты, имеющей установленную последовательность, в том числе точное определение менее чем двукратных различий. В одном аспекте способы основываются на способе дисбалансировки ПЦР-реакции. Когда реакция таким образом не сбалансирована, между матричной и комплементарной цепями возникает асимметрия,делающая возможной последующую дифференциацию между желаемыми и нежелаемыми продуктами реакции, что делает возможным чувствительное определение даже небольших различий в количестве последовательностей нуклеиновых кислот в образцах нуклеиновых кислот. В таком случае, в одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечивается способ дисбалансировки ПЦР, включающий стадии: а) образования в ПЦР продуктов, которые включают представляющую интерес первоначальную последовательность нуклеиновой кислоты (матрицу), комплементарную ей последовательность нуклеиновой кислоты и соответствующие первый и второй ПЦРпраймеры, и б) добавления избытка нарушающей последовательности нуклеиновой кислоты, которая комплементарна одному или другому из первого и второго ПЦР-праймеров. В приведенном ниже обсуждении нарушающая последовательность комплементарна первому праймеру. Когда нарушающей последовательности позволяют гибридизоваться в следующем цикле отжига, она преимущественно образует включающие нарушающую последовательность пары путем отжига к первому праймеру и к одной или другой, но не к обеим, из первоначальной (матричной) последовательности или комплементарной ей последовательности (в зависимости от того, какая из этих двух цепей комплементарна нарушающей последовательности). Продукты, образуемые в результате последующего удлинения, не сбалансированы, так что образуется одна цепь, или матрица, или ее комплемент, а не обе цепи. Т.е. при удлинении после гибридизации нарушающей(их) последовательности(ей) преимущественно образуется или а) двухцепочечная первоначальная (матричная) последовательность с разрывом в одной из цепей и одноцепочечная комплементарная последовательность, или б) двухцепочечная комплементарная последовательность с разрывом в одной из цепей и одноцепочечная первоначальная (матричная) последовательность. То, какой продукт образуется в одноцепочечной или двухцепочечной форме, определяется тем, какой из двух ПЦР-праймеров комплементарен нарушающей последовательности. Обнаружение одноцепочечного продукта делает возможным чувствительное измерение первоначальных количеств последовательностимишени. В другом аспекте обеспечивается способ блокирования основанной на ПЦР амплификации в будущем в реакционной смеси путем "запирания" двухцепочечной ДНК с помощью сшивания. Сшивание предотвращает амплификацию и, следовательно, обнаружение ДНК, которая была двухцепочечной во время сшивания. Эта блокировка амплификации может сделать более чувствительным обнаружение продуктов, которые не были сшиты. Сшивание можно осуществить с помощью, например, обработки УФ или химической обработки. В другом аспекте обеспечивается способ определения количества нуклеиновой кислоты-мишени относительно количества ссылочной нуклеиновой кислоты в образце нуклеиновых кислот. Способ включает выполнение ПЦР с использованием объединенной смеси ссылочной нуклеиновой кислоты и нуклеиновой кислоты-мишени вместе с прямыми и обратными ПЦР-праймерами и для ссылочной нуклеиновой кислоты, и для нуклеиновой кислоты-мишени. Обратный ПЦР-праймер для ссылочной нуклеиновой кислоты содержит хвостовую последовательность, которая идентична последовательности, обнаруживаемой в нуклеиновой кислоте-мишени. После выполнения установленного количества циклов ПЦР симметрия реакции нарушается добавлением избыточных количеств двух нарушающих последовательностей нуклеиновых кислот и разрешением их гибридизации с одноцепочечными ПЦР-продуктами. Первая нарушающая последовательность комплементарна обратному праймеру для мишеневого зонда, а вторая нарушающая последовательность комплементарна обратному праймеру для ссылочного зонда, но не включает хвостовой район, который идентичен последовательности, обнаруживаемой на нуклеиновой-1 013373 кислоте-мишени. После нарушения симметрии реакции обнаруживают остающуюся одноцепочечную нуклеиновую кислоту-мишень или одноцепочечную ссылочную нуклеиновую кислоту, так что определяется количество нуклеиновой кислоты-мишени относительно ссылочной нуклеиновой кислоты. Описание чертежей На фиг. 1 представлена схема контролируемого нарушения ПЦР для создания одноцепочечной матрицы (ABC) и двухцепочечного комплемента (С'В'А'). На первой стадии демонстрируются первоначальная геномная ДНК-последовательность (матрица, ABC) и соответствующие прямой и обратный ПЦРпраймеры (А и С', соответственно). На второй стадии демонстрируются продукты нескольких ПЦРциклов. После завершения желаемого числа ПЦР-циклов, на схеме демонстрируется добавление нарушающей последовательности (С), комплементарной обратному праймеру (С'), в избытке относительно количества ПЦР-праймеров. При охлаждении нарушающая последовательность, присутствующая в избыточном количестве, связывается с обратным праймером и комплементарными последовательностями. В то же самое время прямой праймер связывается с комплементом и удлиняется, создавая двухцепочечный комплемент с разрывом в месте соединения В и С. Следовательно матрица (ABC) остается одноцепочечной. На фиг. 2 представлена схема того, как элиминировать двухцепочечную ДНК из последующей ПЦР или другого способа обнаружения посредством сшивания. На стадии 1 демонстрируется присутствие последовательности и в одноцепочечной форме, и в двухцепочечной форме. Добавляемый сшивающий агент связывает вместе двухцепочечную ДНК постоянно или полупостоянно, предотвращая полную диссоциацию во время высокотемпературной стадии ПЦР-цикла (стадия 3). Это предотвращает амплификацию двухцепочечной ДНК, например, с помощью ПЦР, но не ограничивает амплификацию одноцепочечной ДНК, избирательно. На фиг. 3 представлена схема метода относительной амплификации в одной пробирке, с помощью которого можно обнаружить намного меньшие различия в содержании нуклеиновых кислот, чем ранее считалось возможным. На стадии 1 продемонстрированы исходные материалы: две геномные ДНКпоследовательности, которые хотят сравнить, и соответствующие прямые и обратные ПЦР-праймеры,причем обратный праймер для ссылочной последовательности имеет "хвост" с частичной последовательностью В. После проведения нескольких циклов ПЦР образуются продукты, продемонстрированные на стадии 2. Если после этой стадии добавить в реакции избыток праймеров С и F, они смогут гибридизоваться с обратными праймерами и комплементарными последовательностями, при этом ни один из двух вновь добавленных праймеров С и F не затрагивает матричные цепи или раннее добавленные прямые праймеры. Затем одноцепочечные ссылочная матрица и матрица-мишень могут гибридизоваться друг с другом и образовывать пару. Любая неспаренная ссылочная матрица и матрица-мишень остается одноцепочечной. На стадии 4 продемонстрировано, что случится, если двухцепочечную ДНК сшить. Должно произойти только сшивание последовательностей С/С' и рВ/рВ'. Если имеет место постоянное или полупостоянное сшивание, можно провести прямую ПЦР с использованием праймеров, которые перекрывают место сшивания для обнаружения только одноцепочечной матрицы (ABC как показано). На фиг. 4 представлена схема осуществления изобретения, при котором за сшиванием двухцепочечных матричных пар следует обнаружение одноцепочечных матриц, используя ПЦР. На фигуре демонстрируется возможный выбор ПЦР-праймеров для дальнейшего анализа, при котором прямые праймеры А и D уже находятся в конечном образце, представленном на стадии 4 фиг. 3, а праймеры R1 и R2 добавляются позже. Как показано, праймеры только амплифицируют одноцепочечные матрицы и не способны амплифицировать сшитые двухцепочечные матрицы, показанные наверху. Подробное описание изобретения Определения. Используемый здесь термин "полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота" относится к ковалентно связанной последовательности нуклеотидов (т.е. рибонуклеотидов для РНК и дезоксирибонуклеотидов для ДНК), в которой 3'-положение пентозы одного нуклеотида соединяется с помощью фосфодиэфирной группы с 5'-положением пентозы следующего нуклеотида. Термин "полинуклеотид" включает, без ограничения, одно- и двухцепочечные полинуклеотиды. Термин "полинуклеотид", применяемый здесь, охватывает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы полинуклеотида,включающие, например, ДНК, РНК, ПНК, их комбинации и/или полимеры, содержащие один или несколько аналогов нуклеотидов. Термин "аналог нуклеотида", используемый здесь, относится к нуклеотиду, в котором сахар пентоза и/или один или несколько фосфатных эфиров заменены их соответствующими аналогами. Примеры аналогов фосфатных эфиров включают, но не ограничиваются перечисленными, алкилфосфонаты, метилфосфонаты, фосфорамидаты, фосфотриэфиры, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфороселеноаты, фосфородиселеноаты, фосфоранилотиоаты, фосфоранилидаты, фосфорамидаты, борофосфаты и т.п., включающие любой ассоциированный противоион, если он присутствует. В определение "аналог нуклеотида" также включены содержащие азотистое основание мономеры, которые могут полимеризоваться в аналоги полинуклеотидов, в которых фосфатный эфир и/или сахарофосфатный остов ДНК/РНК заменен другим типом связи. Кроме того, в определение "аналоги нуклеотидов" также включены нуклеотиды, в которых остаток азотистого основания является необычным, т.е.-2 013373 отличается от одного из G (Г), А (А), Т (Т), U (У) или С (Ц). Например, можно использовать такой галогенизированный нуклеотид, как бромдезоксиуридин. Как правило, необычные азотистые основания имеют способность образовывать водородные связи по меньшей мере с одним остатком азотистого основания, присутствующим на примыкающей, противоположно ориентированной полинуклеотидной цепи,или обеспечивают не взаимодействующее, не мешающее основание. Термином "полинуклеотид" также охватывается короткий полинуклеотид, часто называемый олигонуклеотид (например, праймер или зонд). Полинуклеотид имеет 5'-конец и 3'-конец, поскольку фосфодиэфирные связи в полинуклеотиде соединяют 5'-углеродный атом и 3'-углеродный атом пентозного кольца замещающих мононуклеотидов. Конец полинуклеотида, в котором новая связь будет с 5'углеродным атомом, является его 5'-концевым нуклеотидом. Конец полинуклеотида, в котором новая связь будет с 3'-углеродным атомом, является его 3'-концевым нуклеотидом. Используемый здесь термин"концевой нуклеотид" означает нуклеотид в концевом положении, на 3'- или 5'-конце. Об используемой в контексте настоящего изобретения "полинуклеотидной последовательности", даже если она находится внутри большего полинуклеотида (например, район последовательности внутри полинуклеотида), также говорят, что она имеет 5'- или 3'-концы. Применяемый здесь термин "химически модифицированный" при использовании в контексте нуклеотида относится к нуклеотиду, имеющему различие по меньшей мере в одной химической связи относительно стандартного нуклеотида АТР (АТФ), СТР (ЦТФ), GTP (ГТФ), UTP (УТФ), dATP (дАТФ),dCTP (дЦТФ), dGTP (дГТФ) или dTTP (дТТФ). Термин "химическая модификация" не относится к модификации, происходящей во время встраивания нуклеотида в полинуклеотид с помощью 5'-3'фосфодиэфирной связи. Используемый здесь термин "гибридизации" применяется в отношении к физическому взаимодействию комплементарных (в том числе частично комплементарных) полинуклеотидных цепей путем формирования водородных связей между комплементарными нуклеотидами, когда цепи расположены антипараллельно по отношении друг к другу. На гибридизацию и прочность гибридизации (т.е. прочность ассоциации полинуклеотидных цепей) оказывают влияние много факторов, хорошо известных в данной области техники, в том числе степень комплементарности между полинуклеотидами и жесткость включенных условий, на которую влияют такие условия, как концентрация солей, присутствие других компонентов (например, присутствие или отсутствие полиэтиленгликоля), молярность гибридизующихся цепей и содержание G+C в полинуклеотидных цепях, все из которых приводят к характерной температуре плавления (Tm) образованного гибрида. Когда здесь говорят, что один полинуклеотид "гибридизуется" с другим полинуклеотидом, это означает, что два полинуклеотида образуют связанный водородными связями антипараллельный гибрид в условиях высокой жесткости. Для гибридизации требуется частичная или полная комплементарность последовательностей полинуклетидов, которые гибридизуются. Когда говорят, что один полинуклеотид не гибридизуется с другим полинуклеотидом, это означает, что существует недостаточная комплементарность последовательностей двух полинуклеотидов для образования связанного водородными связями гибрида, или что гибрид не образуется между двумя полинуклеотидами в условиях высокой жесткости. Используемый здесь термин "специфическая гибридизация" относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы нуклеиновой кислоты только с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, а с молекулами нуклеиновых кислот, не являющими мишенями, в смеси последовательности нуклеиновой кислоты-мишени и последовательности нуклеиновой кислоты, не являющейся мишенью. Используемые здесь термины "условия низкой жесткости", "условия средней жесткости", "условия высокой жесткости" или "условия очень высокой жесткости" описывают условия гибридизации нуклеиновых кислот и отмывки. Руководство для проведения реакций гибридизации можно найти в источникеCurrent Protocols in Molecular Biology, John WileySons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, который полностью включен сюда посредством ссылки. В данном ссылочном источнике описываются водные и неводные способы, и любой из них можно использовать. Условия специфической гибридизации, на которые здесь ссылаются, представляют собой следующее: (1) в условиях низкой жесткости гибридизация в 6 Х хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при приблизительно 45 С с последующими двумя отмывками в 0,2XSSC,0,1%SDS (ДДС-Na) при по меньшей мере 50 С (температуру отмывок можно увеличить до 55 С для условий низкой жесткости); (2) в условиях средней жесткости гибридизация в 6XSSC при приблизительно 45 С с последующей одной или несколькими отмывками в 0,2XSSC, 0,1%SDS при 60 С; (3) в условиях высокой жесткости гибридизация в 6XSSC при приблизительно 45 С с последующей одной или несколькими отмывками в 0,2XSSC, 0,1%SDS при 65 С; (4) в условиях очень высокой жесткости гибридизация в 0,5 М фосфате натрия, 7%SDS при приблизительно 65 С с последующей одной или несколькими отмывками в 0,2XSSC, 0,1%SDS при 65 С. Используемый в контексте настоящего изобретения полинуклеотид, "выделенный" из образца,представляет собой встречающуюся в природе полинуклеотидную последовательность внутри этого образца, которую удалили из ее нормальной клеточной или внеклеточной среды. Таким образом, "выделенный" полинуклеотид, который находился в нормальной клеточной среде, может находиться в бескле-3 013373 точном растворе, или он может быть помещен в другую клеточную среду. Так же "выделенный" полинуклеотид, который находился в нормальной бесклеточной среде, может находиться в другом бесклеточном растворе, или он может быть помещен в клеточную среду. Используемые здесь термины "кровь", "плазма" и "сыворотка" специально охватывают их фракции или обработанные части. Так же, когда образец взят из биопсии, мазка и т.п., термин "образец" специально охватывает обработанную фракцию или часть, происходящие из биопсии, мазка и т.п. Как используется здесь в контексте образец, образец, который получают "по меньшей мере, частично" из данного источника, включает по меньшей мере один компонент образца, полученный из такого источника. Термин "комплементарные" последовательности, используемый здесь, относится к последовательностям, в которых при антипараллельном выравнивании остатки А на одной цепи сопоставляются с остатками Т или U, а остатки G с остатками С на другой цепи так, что могут образовываться связанные водородными связями пары оснований А:Т, A:U и G:C. Это стандартные пары оснований "УотсонаКрика", встречающиеся в громадном большинстве ДНК- и РНК-гибридов in vivo. В контексте настоящего изобретения, если не указано иное, термин "комплементарная", используемый при описании первой нуклеотидной последовательности относительно второй нуклеотидной последовательности, относится к способности олигонуклеотида или полинуклеотида, включающего первую нуклеотидную последовательность, гибридизоваться и образовывать дуплексную структуру при определенных условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, включающим вторую нуклеотидную последовательность, как понятно квалифицированному специалисту. "Комплементарные" последовательности могут также настолько включать пары оснований не Уотсона-Крика и/или пары оснований, образованных из не встречающихся в природе и модифицированных нуклеотидов, или быть полностью сформированными из таких пар оснований, насколько выполнены вышеуказанные требования в отношении их способности гибридизоваться. Термины "комплементарное", "полностью комплементарное" и "по существу комплементарное",применяемые здесь, могут использоваться в отношении спаривания оснований между смысловой и антисмысловой цепями образованного из нуклеиновых кислот двухцепочечного гибрида. В "полностью комплементарном" гибриде каждый нуклеотид одной цепи образует пару оснований с сопоставленным нуклеотидом противоположной цепи. В "по существу комплементарном" гибриде две цепи могут быть полностью комплементарны, или они могут включать одну или несколько, но предпочтительно не более 10,не спаренных при гибридизации пар оснований, тогда как их способность гибридизоваться в условиях,используемых в описываемых здесь способах, сохраняется. Термин "хромосомное нарушение", используемый здесь, относится к любому отклонению в составе ДНК или структуре хромосомы от того состава или структуры, которые наиболее распространены в данной популяции. Он включает, но не ограничивается перечисленным, делеции, мутации, дупликации, перестановки, ковалентные модификации, дисомию одного из родителей и измененную структуру хроматина. Описанные здесь способы пригодны для определения, среди прочего, числа аномальных хромосом(например, Дауна, Клайнфельтера, Патау, Эдварда, Тернера, трех Х-хромосом, XYY и т.п.) и числа аномальных последовательностей (нарушение, при котором только часть хромосомы присутствует в аномальных количествах). Термин "олигонуклеотид" определяется как молекула, включающая два или несколько дезоксирибонуклеотидов и/или рибонуклеотидов, предпочтительно более трех. Его точный размер зависит от многих факторов, которые в свою очередь зависят от конечного назначения и использования олигонуклеотида. Размер олигонуклеотида, используемого в описанных здесь способах, наиболее часто составляет от 15 до 600 нуклеотидов. Используемый здесь термин "праймер" относится к олигонуклеотиду, либо встречающемуся в природе, как в случае очищенного рестрикционного продукта, либо полученному синтетически, который способен действовать в качестве точки инициации зависимого от матрицы синтеза нуклеиновой кислоты. Праймер может быть или одноцепочечным, или двухцепочечным, и он должен быть достаточно длинным, чтобы инициировать синтез желаемого продукта удлинения в присутствии выбранной полимеразы. Точный размер праймера зависит от многих факторов, в том числе температур гибридизации и полимеризации, источника праймера и используемого способа. Например, при применении в диагностике в зависимости от сложности последовательности-мишени олигонуклеотидный праймер обычно содержит 15-25 или более нуклеотидов, хотя он может содержать меньше или больше нуклеотидов. Факторы, включенные в определение подходящего размера праймера, хорошо известны специалисту со средней квалификацией в данной области техники. Используемый здесь термин "индивидуум" относится к субъекту, являющемуся человеком, а также к субъекту, не являющемуся человеком, такому как млекопитающее, беспозвоночное, позвоночное, крыса, лошадь, собака, кошка, корова, курица, птица, мышь, грызун, примат, рыба, лягушка, олень, гриб,дрожжи, бактерия и вирус. Приведенные здесь примеры не подразумевают ограничение методологии настоящего изобретения только субъектом, являющим человеком, поскольку текущая методология также применима в области ветеринарии, науках о животных, научных лабораториях и т.д. Используемый здесь термин "диагностика" относится к способности демонстрировать увеличенную-4 013373 вероятность того, что у индивидуума имеется специфическое состояние или состояния. Диагностика также относится к способности демонстрировать увеличенную вероятность того, что у индивидуума нет специфического состояния. Наиболее часто "диагностика" относится к способности демонстрировать увеличенную вероятность того, что у индивидуума имеется одно состояние по сравнению со вторым состоянием. Наиболее часто "диагностика" относится к процессу, посредством которого существует увеличенная вероятность того, что индивидуум правильно охарактеризован в качестве индивидуума, имеющего состояние ("действительно позитивный"), или в качестве индивидуума, не имеющего состояния ("действительно негативный"), при минимизации вероятности того, что индивидуум неправильно охарактеризован в качестве индивидуума, пораженного указанным состоянием ("ложно позитивный"), или в качестве индивидуума, не пораженного указанным состоянием ("ложно негативный"). Используемый здесь термин "соответствующий" относится к нуклеотиду в последовательности первой нуклеиновой кислоты, который выстраивается в линию с установленным нуклеотидом в последовательности ссылочной нуклеиновой кислоты при выравнивании последовательности первой нуклеиновой кислоты и последовательности ссылочной нуклеиновой кислоты. Выравнивание проводится, например, квалифицированным в данной области специалистом с помощью компьютерных программ, разработанных для этой цели. В качестве примера нуклеотида, который "соответствует", Т в положении 11 последовательности 5'-GTATCACTGATAAAGGAGAA-3' (SEQ ID NO: 1) "соответствует" нуклеотиду Т в положении 27091 доступа в Банк генов GI:1552506 TCRB и наоборот. Термин "соответствующий" также относится, например, к отношению между двумя партнерами по специфическому связыванию, т.е. один член пары партнеров по связыванию "соответствует" другому члену такой пары. Применяемый здесь термин "близка к количеству присутствующей ссылочной последовательности или последовательности-мишени", при использовании в отношении концентрации зонда, означает, что концентрация обсуждаемого зонда или зондов находится в пределах 80% от концентрации ссылочной последовательности или последовательности-мишени, которая могла бы обсуждаться. Используемый здесь термин "зонд" относится к типу олигонуклеотида, имеющему или содержащему последовательность, которая комплементарна другому полинуклеотиду, например, последовательности-мишени, или другому олигонуклеотиду. Размер зондов, используемых в описанных здесь способах,идеально составляет менее 600 нуклеотидов или равен 600 нуклеотидам, как правило, между 40 и 600 нуклеотидами. Используемый здесь термин "спаренные зонды" относится к двум зондам, которые физически ассоциированы или связаны друг с другом. Спаренные зонды могут связываться друг с другом путем ассоциации двух составляющих, являющихся партерами по связыванию, определение данного термина дано здесь, в том числе, но не ограничиваясь перечисленным, по связыванию через образование гибридов нуклеиновых кислот, связыванию через образование ковалентных химических связей или связыванию через белково-белковые взаимодействия. Термин "спаренные зонды" заключает в себе не только зонды,которые спарены в отношении 1:1, но также зонды, ассоциированные в отношениях более высокого порядка, например, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8 и т.п. (т.е. одна молекула одного зонда, спаривающаяся с 2,3, 4, 5, 6, 7 или 8 молекулами и т.п. другого зонда), при условии, что отношение известно, или оно, по меньшей мере, является постоянным для данного набора зондов. "Не спаренный зонд" представляет собой зонд (например, первый зонд), который физически не ассоциирован или не связан с другим (например, вторым) зондом. Спаривание может происходить посредством одной или нескольких адаптерных молекул. Используемая здесь фраза "превращение гибридизованных зондов в зонды, не поддающиеся определению" и "превращение спаренных зондов в зонды, не поддающиеся определению" относится к обработке гибридизованных или спаренных зондов так, что они, по существу, не определяются в способе определения нуклеиновых кислот, применяемом для обнаружения не спаренного зонда. Под "по существу не определяемый" подразумевается, что вклад в сигнал в способе определения нуклеиновых кислот,применяемом для обнаружения не спаренного зонда, гибридизованных или спаренных зондов, обработанных для превращения их в зонды, не поддающиеся определению, составляет менее 10%, а предпочтительно менее 2%. Фраза "превращение гибридизованных зондов в зонды, не "поддающиеся" определению" эквивалентна терминам "сокрытие" или "изолирование" при применении к зондам. Не ограничивающие примеры обработок, которые превращают гибридизованные зонды в зонды, не поддающиеся определению, включают химическое сшивание и УФ-сшивание зонда с последовательностью-мишенью или ссылочной последовательностью или другим зондом или физическое удаление указанных гибридизованных или спаренных зондов. Используемый здесь термин "партнер по связыванию" или "составляющая, являющаяся партнером по связыванию", относится к члену пары по специфическому связыванию. Пара по специфическому связыванию - это пара составляющих, которые специфически связываются друг с другом при установленном наборе условий; "специфическое связывание" относится к связыванию одного члена пары с другим членом пары и существенному исключению связывания других составляющих, присутствующих в этой среде. Используемая здесь фраза "условия, которые позволяют первой составляющей, являющейся парте-5 013373 ром по связыванию, взаимодействовать со второй составляющей, являющейся партером по связыванию",относится к таким условиям окружающей среды, которые благоприятствуют физическому и/или химическому взаимодействию двух членов пары по специфическому связыванию. Такие условия варьируют в зависимости от природы взаимодействия связывающейся пары, но они могут быть определены квалифицированным в данной области специалистом. Примеры условий включают условия гибридизации, описанные здесь или известные в данной области техники, например, условия высокой жесткости или ниже,когда, например, партнеры по связыванию представляют собой комплементарные последовательности нуклеиновых кислот. Такие условия также включают, по существу, отсутствие конкурентных последовательностей, в том числе последовательностей, присутствующих в образце нуклеиновых кислот, в котором должно быть определено количество последовательности-мишени. В описанных здесь способах стадию помещения составляющих, являющихся партнерами по связыванию, или зондов, включающих их, в условия, которые позволяют первой составляющей, являющейся партнером по связыванию, взаимодействовать со второй составляющей, являющейся партнером по связыванию, можно проводить в виде отдельной стадии, например, после приведения в контакт зондов с нуклеиновыми кислотами образца, или она может происходить во время такого контакта. Используемый здесь термин "нуклеиновая кислота-мишень" относится к полинуклеотиду, чье количество должно быть определено в образце относительно ссылочной нуклеиновой кислоты. "Нуклеиновая кислота-мишень" содержит известную последовательность по меньшей мере из 20 нуклеотидов,предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидов, более предпочтительно между 80 и 500 нуклеотидами, но она может быть и длиннее. "Нуклеиновая кислота-мишень" настоящего изобретения может представлять собой встречающийся в природе полинуклеотид (т.е. полинуклеотид, существующий в природе без вмешательства человека) или рекомбинантный полинуклеотид (т.е. полинуклеотид, существующий только при вмешательстве человека), в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, геномную ДНК,кДНК, плазмидную ДНК, общую РНК, мРНК, тРНК, рРНК. Полинуклеотид-мишень также включает сами амплифицированные продукты, например, как в случае полимеразной цепной реакции. Используемые в контексте настоящего изобретения "полинуклеотид-мишень" или "нуклеиновая кислота-мишень" могут содержать модифицированные нуклеотиды, которые могут включать фосфоротиоаты, фосфиты, производные с модифицированным кольцевым атомом и т.п. Последовательность нуклеиновой кислотымишени обязательно отличается от последовательности ссылочной нуклеиновой кислоты, так что последовательность нуклеиновой кислоты-мишени и последовательность ссылочной нуклеиновой кислоты не могут гибридизоваться друг с другом при жестких условиях. Используемый здесь термин "сшивание" относится к ковалентному соединению одного зонда с другим после специфического физического взаимодействия между двумя зондами. Используемый здесь термин "гомология", или "идентичность", иди "сходство" относится к сходству между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или между двумя полипептидными последовательностями. Гомологию можно определить с помощью сравнения позиции в каждой последовательности, которую можно выравнить с целью сравнения. Когда несколько позиций сравниваемых последовательностей заняты одними и теми же основаниями или аминокислотами, тогда последовательности молекул гомологичны. Степень гомологии между последовательностями зависит от числа совпадений или гомологичных позиций, которыми совместно обладают последовательности. "Не родственные" или "не гомологичные" последовательности идентичны менее чем на 40%, хотя предпочтительно менее чем на 25%. Используемый здесь термин "биологическая жидкость" относится к взятой из биологического источника жидкости и включает, например, кровь, сыворотку, плазму, мокроту, лаважную жидкость, спинно-мозговую жидкость, мочу, сперму, пот, слезы, слюну и т.п. Используемая здесь фраза "устойчивый к расщеплению нуклеазами" означает, что данный полинуклеотидный зонд содержит одну или несколько химических модификаций или структурных свойств,которые делают его менее чувствительным к расщеплению нуклеазами, чем сходная последовательность без модификации или структурного свойства. Не ограничивающие примеры включают изменения в фосфодиэфирных связях, например включение тиоловой связи, и наличие вторичной структуры, например двухцепочечность в сравнении с одноцепочечностью во всей молекуле зонда или в части такой молекулы. Под "менее чувствительным" подразумевается по меньшей мере на 10% меньше событий расщепления относительно немодифицированного зонда при тех же самых условиях расщепления нуклеазами. Используемый здесь термин "анеуплодия" относится к состоянию обладания числом хромосом, которое не кратно гаплоидному числу для данных видов. Например, диплоидная клетка или диплоидный организм, обладающие общим числом хромосом, которое отличается (например, или больше, или меньше) от двухкратного гаплоидного числа хромосом, являются анеуплоидными. Используемый здесь термин "полимеразная цепная реакция" или "ПЦР" относится к in vitro методу амплификации специфической полинуклеотидной последовательности-мишени. ПЦР включает повторяющиеся серии температурных циклов и, как правило, проводится в объеме 10-100 мкл. Реакционная смесь включает dNTP (каждый из четырех дезоксинуклеотидов dATP, dCTP, dGTP и dTTP), праймеры,буферы, ДНК-полимеразу, например термостабильную ДНК-полимеразу, и полинуклеотид-мишень. Од-6 013373 на ПЦР может состоять, например, из 5-100 "циклов" денатурации и синтеза полинуклеотидной молекулы. Используемая в контексте настоящего изобретения "шпилечная последовательность" включает две самокомплементарные последовательности, которые могут образовывать двухцепочечный осевой район,разделенные последовательностью петли. Два района олигонуклеотида, которые включают двухцепочечный осевой район, по существу, комплементарны друг другу, что приводит к их гибридизации на себя. Однако ось может включать один или несколько дефектов комплементарного спаривания, вставок,побочных петель или делеций. Используемая в контексте настоящего изобретения "шпилечная последовательность" может, кроме того, включать одноцепочечный(ые) район(ы), которые продлеваются от двухцепочечного осевого сегмента. Описание Дисбалансировка ПЦР в благоприятное время, позволяющее перенаправить процесс Хотя ПЦР является обычно приемлемой методологией в молекулярной биологии, основная идея,лежащая в основе этой методологии, изменилась очень мало за последние 20 лет. Главная причина этого заключается в том, что ПЦР хорошо служила молекулярно-биологическому сообществу. Она является инструментом, с помощью которого можно обнаружить чрезвычайно низкие количества последовательностей нуклеиновых кислот, и она может даже обеспечить грубый количественный анализ. Одна из текущих проблем с ПЦР, однако, сконцентрирована вокруг образования ряда побочных продуктов в конечной ПЦР-смеси, которое делает эти ПЦР-продукты неподходящими для многих применений. Здесь описывается способ, с помощью которого ПЦР может быть избирательно не сбалансирована. Используемый здесь термин "не сбалансированная" или "дисбалансировка" в отношении ПЦР относится к использованию ПЦР или варианта ПЦР для образования продуктов амплификации, содержащих и одноцепочечные, и двухцепочечные нуклеиновые кислоты, т.е. для создания или одноцепочечной матрицы и двухцепочечного комплемента, или для создания двухцепочечной матрицы и одноцепочечного комплемента. Целью такой дисбалансировки является облегчение дифференциации между матрицей и ее комплементом, в связи с этим делаются возможными последующие реакции с одним, но не с другим. После нескольких циклов ПЦР реакционная смесь содержит ассортимент продуктов. Способом осуществления дисбалансировки реакции на этой стадии является введение избытка полного или частичного комплемента прямого или обратного праймеров (или возможно обоих). Добавляемый в избытке праймер называют здесь "нарушающей последовательностью". Если этой нарушающей последовательности позволить гибридизоваться с одноцепочечными ПЦР-продуктами, половина этих продуктов станет двухцепочечной, в то время как другая половина останется одноцепочечной (фиг. 1). Следует заметить,что двухцепочечный комплемент или двухцепочечная матрица не будут непрерывной цепью, а будут иметь разрыв в том месте последовательности, где нарушающая последовательность встретится с продуктом удлинения первоначального праймера, который не комплементарен нарушающей последовательности. Таким образом, хотя это простой способ дисбалансировки конечной ПЦР, данный способ позволяет осуществить дифференциацию между желаемыми ПЦР-продуктами и их комплементами. Исключение нуклеиновых кислот из обнаружения в будущем с помощью ПЦР или других способов, для которых необходима одноцепочечная ДНК После достижения состояния, при котором желаемые продукты являются одноцепочечными, а нежелаемые продукты являются двухцепочечными, можно "запереть" двухцепочечные нуклеиновые кислоты посредством постоянного или полупостоянного (т.е. стабильного) сшивания (фиг. 2). Сшитые двухцепочечные ДНК впоследствии будут инертным игроком в большинстве реакций, для которых требуется одноцепочечная форма, таких как гибридизация нуклеиновых кислот, взаимодействие с определенными флуоресцентными красителями, специфичными в отношении одноцепочечных нуклеиновых кислот, ПЦР и различные модифицированные формы ПЦР. Таким образом, по существу то, что достигается посредством сшивания, представляет собой ингибирование дальнейшей активности с помощью теперь ненужных комплементов и изоляцию желаемого продукта для дальнейшего тестирования или других применений. Использование дисбалансировки ПЦР и сшивания для обнаружения небольших различий в содержании нуклеиновых кислот Обнаружение небольших различий в содержании нуклеиновых кислот или обеспечение точного количественного определения нуклеиновых кислот в низких концентрациях является важной целью для широкого ряда диагностических и исследовательских подходов. В описанном ниже способе сравниваются относительные концентрации двух нуклеиновых кислот с помощью элиминирования общего фона посредством стехиометрического спаривания (которое может не быть в соотношении 1:1). В последующем описании обсуждается спаривание нуклеиновых кислот в соотношении 1:1 и дается ссылка с иллюстративной целью на фиг. 3 и примечанию, приведенному на фиг. 3. Для этого подхода примем, что две нуклеиновые кислоты, нуклеиновая кислота-мишень (ABC) и ссылочная нуклеиновая кислота (DEF), которые необходимо сравнить друг с другом, находятся в низких концентрациях. В результате проведения ПЦР количество желаемых последовательностей может быть-7 013373 увеличено. Теперь примем, что эту ПЦР-стадию проводят так, что обратный праймер (F') для ссылочной нуклеиновой кислоты был предварительно модифицирован для включения частичной последовательности (рВ), которая приблизительно эквивалента району на матрице-мишени (В). Под выражением "приблизительно эквивалента" подразумевается, что комплемент приблизительно эквивалентной частичной последовательности (рВ') будет связываться с желаемым районом первоначальной последовательности на матрице-мишени (В). Этот обратный праймер для ссылочной матрицы называют pBF'. После нескольких ПЦР-циклов, например 2, 3, 4, 5, 10, 15 и т.п., в смеси можно обнаружить продукты, продемонстрированные на стадии 2 фиг. 3. Трудность состоит в том, что присутствие многочисленных фрагментов, которые могут связываться с нашим желаемым продуктом, будет препятствовать проведению многих дальнейших анализов, что будет в дальнейшем служить препятствием для многих методологий. Это то, где дисбалансировка ПЦР становится важна. При добавлении избытка комплементов (С, F) обратного праймера для последовательности-мишени(С') и обратного праймера для ссылочной последовательности (F') и установлении условий гибридизации предпочтительной является двухцепочечность этих праймеров. Если условия являются правильными,последующее удлинение обратного праймера на комплемент рВ' превратит район рВ в двойную цепь. С и F называют нарушающими последовательностями. Нарушающие последовательности не останавливаются на превращении обоих обратных праймеров в двойные цепи в условиях гибридизации/удлинения. Они также связываются с комплементарными матрицами (С'В'А' и pBF'E'D'), и на ссылочной матрице будет наблюдаться короткое удлинение с превращением последовательности рВ в двойную цепь. Прямые праймеры также не будут оставаться неактивными. Они также в конечном счете (хотя статистически позже из-за относительных концентраций) найдут комплементарные матрицы, и посредством гибридизации и удлинения они превратят в двойную цепь остаток комплементарной матрицы с небольшим разрывом в том месте новой двойной цепи, в котором продукты удлинения прямых праймеров встречаются с нарушающими последовательностями. Теперь, когда нарушающие праймеры и прямые праймеры в более высоких концентрациях сделали свою работу, первоначальные матрицы находят время и место для связывания друг с другом и удлинения в заранее определенном соотношении 1:1. То, что остается, продемонстрировано на стадии 3 фиг. 3. Вследствие спаривания первоначальных матриц в соотношении 1:1, если существует избыток мишени,одноцепочечными будут оставаться ABC. Если существует избыток ссылочной последовательности, одноцепочечными будут оставаться DEFpB'. Даже если реакция спаривания матриц не совершенна, относительная разница между матрицей-мишенью и ссылочной матрицей будет увеличена при сохранении абсолютной разницы и уменьшении общего фона на равные абсолютные количества. Следующей стадией является "сокрытие" двухцепочечных нуклеиновых кислот от дальнейших реакций. Это можно осуществить с помощью, например, их избирательного, физического удаления, их ферментативной деградации или их сшивания. На стадии 4 фиг. 3 продемонстрировано "сокрытие" двухцепочечных нуклеиновых кислот с помощью их постоянного или полупостоянного сшивания друг с другом. Если последующий способ обнаружения является специфичным в отношении одноцепочечной ДНК или ДНК, способной стать одноцепочечной, необходимо успешно устранить взаимодействия цепей всех двухцепочечных молекул. Одним из инструментов обнаружения, который работает хорошо после постоянного или полупостоянного сшивания, является ПЦР. Большие относительные различия даже небольших количеств нуклеиновых кислот могут быть легко обнаружены с помощью ПЦР, хотя необходимо предотвратить дальнейшее сшивание двухцепочечных молекул для ПЦР. В предшествующем описании прямые праймеры для матрицы-мишени и ссылочной матрицы (А и D соответственно) уже присутствуют. Необходимо только добавить новые обратные праймеры (фиг. 4). Отмеченную выше методологию можно просто модифицировать так, что последовательностьмишень и ссылочная последовательность поменяются местами, или сфокусироваться на извлечении комплементов, а не первоначальных матричных последовательностей. В другом варианте осуществления изобретения можно создать системы, в которых ссылочная нуклеиновая кислота, с которой сравнивают мишень, представляет собой часть стандартного разведения с известной концентрацией. Это позволит точно определить граничные значения концентраций нуклеиновых кислот с помощью определения, между какими двумя концентрациями находится нуклеиновая кислота-мишень, и возможно наблюдением за конечными относительными количествами мишени и ссылочной последовательности, и оценки, например, расстояния от одного из двух стандартов или обоих стандартов. Образец нуклеиновой кислоты Образец нуклеиновой кислоты, к которому применимы описанные здесь способы, может быть из любого источника. Часто образец может представлять собой биологический материал, выделенный из его природной среды и содержащий полинуклеотид. Образец может представлять собой очищенный или выделенный полинуклеотид, или он может включать такой биологический образец, как образец ткани,образец биологической жидкости или клеточный образец, включающий полинуклеотид. Биологическая жидкость включает, не ограничиваясь перечисленными примерами, кровь, плазму, мокроту, мочу, спин-8 013373 но-мозговую жидкость, лаважи и лейкофоретические образцы. Образец нуклеиновой кислоты может происходить из растительного, животного, бактериального или вирусного источника. Образцы можно получить из различных источников, включающие, но не ограничивающиеся перечисленным, образцы от различных индивидуумов, одного и того же индивидуума или различных индивидуумов на различных стадиях развития, индивидуумов, страдающих различными заболеваниями (например, индивидуумов,страдающих раком или у которых подозревается наличие генетического нарушения), нормальных индивидуумов, одного и того же индивидуума или различных индивидуумов на различных стадиях заболевания, индивидуумов, подвергнутых различным видам лечения, индивидуумов, подвергнутых воздействию различных факторов окружающей среды, или индивидуумов с предрасположенностью к патологии, или индивидуумов, на которых воздействовал агент инфекционных заболеваний (например, HIV). Образцы можно также получить из культивируемых in vitro тканей, клеток или других содержащих полинуклеотид источников. Культивируемые образцы можно взять из источников, включающих, но не ограничивающихся перечисленным, культуры (например, тканей или клеток), сохраняемые в различных средах и при различных условиях (например, рН, давлении или температуре), культуры (например, тканей или клеток), сохраняемые в течение периодов различной протяженности, или культуры различных типов тканей или клеток. Кроме того, образцы можно получить в виде продукта полинуклеотидного синтеза. Образец предпочтительно включает нуклеиновую кислоту, выделенную из описанного выше источника. Способы выделения нуклеиновых кислот из биологических источников хорошо известны и отличаются в зависимости от природы источника. Квалифицированный в данной области специалист может без труда выделить из источника нуклеиновую кислоту, требуемую для описанных здесь методов. В некоторых случаях может быть выгодно фрагментировать молекулы нуклеиновых кислот в образце нуклеиновых кислот. Фрагментация может быть случайной, или она может быть специфической, достигаемой, например, при использовании расщепления рестрикционными эндонуклеазами. Способы случайной фрагментации хорошо известны в данной области техники и включают, например, ограниченное расщепление ДНКазой, щелочную обработку и гидродинамическое фрагментирование. В одном варианте осуществления настоящего изобретения образец собирают от беременной самки,например беременной женщины. В этом случае образец можно анализировать с помощью способов, описанных здесь для пренатальной диагностики хромосомных нарушений у плода. Образец можно собрать из биологических жидкостей, например крови, сыворотки, плазмы или некоторых их фракций. В предпочтительном варианте осуществления образец представляет собой очищенную нуклеиновую кислоту,выделенную из крови беременной женщины. С помощью анализа ДНК плазмы крови обнаружено, что она составлена главным образом из коротких фрагментов ДНК, и что интересно, средний размер фрагментов выше у беременных женщин, чем у не беременных женщин. Кроме того, по-видимому, фрагменты плода в плазме беременных женщин в среднем короче материнских фрагментов (Chan et al., 2004, Clin. Chem. 50: 88-92). Способы выделения нуклеиновой кислоты из крови, сыворотки или их обработанных фракций хорошо известны в данной области техники. Способы выделения нуклеиновых кислот из крови или сыворотки описаны, например,Chen и др., 1996, Nature Med. 2: 1033-1036 и Lo и др., 1997, Lancet 350: 485-487. Lo и др. особо подчеркнули наличие ДНК плода в материнской плазме и сыворотке. Кроме того, Dhallan и др. (2004, J.A.M.A. 291: 1114-1119) и WO 95/08646 описывают способы обогащения ДНК плода из материнской сыворотки. Несмотря на то, что такое обогащение не является необходимым для вариантов осуществления настоящего изобретения, представляющих собой пренатальную диагностику, возможность такого обогащения могла бы быть выгодна в некоторых аспектах описанных здесь способов. Клетки плода можно также отобрать и получить из кровотока матери (см., например, Bischoff et al., Hum. Reprod. Update 8, 493-500(2002) и Merchant et al., Hum. Reprod. Update 8, 509-521 (2002, и они могут служить в качестве источника последовательностей нуклеиновой кислоты-мишени и ссылочной нуклеиновой кислоты. Например,отсортированные клетки плода могут служить в качестве источника последовательности-мишени и ссылочной последовательности, получаемых с помощью ПЦР (см., например, Geifman-Holtzman et al., Am. J.Obstet. Gynecol. 174:818-22 (1996. Если плод является самцом, другой подход состоит в использовании ссылочной последовательности из Y-хромосомы, такую последовательность можно получить из свободной от клеток ДНК плода в кровотоке матери (см., например, Sekizawa et al., Am. J. Pharmacogenomics 1:111-7 (2001. В дополнение к раннему обнаружению врожденных дефектов описанные здесь способы могут применяться для обнаружения любого нарушения в представленности генетических последовательностей внутри генома. Показано, что ДНК плазмы крови и сыворотки от больных раком содержит обнаруживаемые количества опухолевой ДНК (Chen et al., 1996, Nature Med. 2: 1035; Nawroz et al., 1996, Nature Med. 2: 10351037). Опухоли характеризуются анеуплоидией или несоответствующим числом генных последовательностей или даже целых хромосом. Обнаружение разницы в количестве установленной последовательности в образце от индивидуума может, таким образом, использоваться для диагностики рака.-9 013373 Нуклеиновая кислота-мишень. Описанные здесь способы облегчают обнаружение различий в количестве нуклеиновой кислотымишени в сравнении с количеством последовательности ссылочной нуклеиновой кислоты. Нуклеиновые кислоты-мишени включают любую последовательность нуклеиновой кислоты, которая ассоциируется с различием в представленности последовательности у здоровых индивидуумов в сравнении с больными индивидуумами. Геномная ДНК особенно пригодна в качестве источника нуклеиновой кислоты-мишени и ссылочной нуклеиновой кислоты. Таким образом, последовательность нуклеиновой кислоты-мишени может представлять собой последовательность на хромосоме, которая не представлена при болезни, например последовательность на хромосоме, отмеченную в табл. 1. Последовательности-мишени также включают, например, последовательности, для которых известно, что они существуют в полиморфном состоянии. Последовательности-мишени могут также включать,например, последовательности, для которых известно, что они амплифицированы или сверхпредставлены, но не у индивидуума в целом, а в определенных клетках индивидуума, как это видно, например, в клетках некоторых типов рака. Наконец, последовательности-мишени также включают последовательности, находящиеся в стадии исследования, например, для дифференциальной экспрессии генов. Количество РНК-транскрипта можно измерить относительно ссылочной последовательности, применяя описанные здесь способы к образцу,содержащему продукты представляющего интерес источника РНК в реакции обратной транскрипции. Ссылочная нуклеиновая кислота. Ссылочная нуклеиновая кислота, требуемая для описанных здесь способов, представляет собой последовательность, с которой сравнивают количество последовательности-мишени. Наиболее часто ссылочной последовательностью является последовательность, имеющая известную или ожидаемую представленность в образце нуклеиновых кислот. Для геномной ДНК, например, ссылочная последовательность может представлять собой последовательность, которая присутствует в единственной копии на геном, например у гетерозиготных индивидуумов, или в двух копиях, например у гомозиготных индивидуумов. Если последовательность-мишень должна быть измерена в виде РНК, например, для определения уровня экспрессии данной информационной РНК, ссылочная последовательность может представлять собой, например, последовательность гена "домашнего хозяйства", например, последовательностьGAPDH, актина или гистона, или другую последовательность, для которой уровень известен или, по меньшей мере, известно, что он является относительно инвариантным. Наиболее часто ссылочной последовательностью является последовательность, уже присутствующая в биологическом образце, предпочтительно в известной представленности. Например, если хотят исследовать количество последовательности, ассоциируемой с таким генетическим нарушением, как трисомия хромосомы 21, указывающая на синдром Дауна, ссылочной последовательностью будет последовательность, не присутствующая на хромосоме 21, в то время как последовательностью-мишенью будет последовательность, присутствующая на хромосоме 21. В этом примере, в котором ссылочная последовательность присутствует в двух копиях (гомозиготная последовательность), если при использовании описанных здесь способов обнаруживается, что в материнской сыворотке больше последовательностимишени, чем ссылочной последовательности, эти данные будут указывать на синдром Дауна у плода. В альтернативном случае ссылочная последовательность может представлять собой последовательность, которая введена в образец в известном или постоянном количестве и которая отличается от последовательности-мишени. Этот подход дает результаты, указывающие на количество последовательностимишени относительно только количества внешней введенной ссылочной последовательности, но он может использоваться для стандартизации между образцами уровня другой ссылочной последовательности,которая является внутренней по отношению к образцу. Использование внутренних стандартных последовательностей особенно полезно для определения и корреляции различий в эффективности амплификации, что обычно известно в данной области техники. Зонды. Зонды, используемые в описанных здесь способах, относятся к одноцепочечной амплифицированной мишеневой или ссылочной матрице или комплементу в зависимости от того, какой набор будет в дальнейшем исследоваться. Эти зонды могут быть точными ПЦР-амплифицированными копиями или комплементами первоначальных последовательностей, или они могут проявлять модификации, введенные во время начальных ПЦР-стадий. Мишеневый зонд соответствует исследуемой последовательности,которая произошла из последовательности-мишени. Ссылочный зонд соответствует исследуемой последовательности, которая произошла из ссылочной последовательности. Партнеры по связыванию. В каждом случае зонд также включает район или составляющую, которая делает возможным физическое спаривание мишеневого и ссылочного зондов при определенных условиях. Район или составляющая (называемая "составляющая, являющаяся партнером по связыванию"), которая делает возможным физическое спаривание, включает средство специфического связывания одного зонда (при определенных условиях) с зондом, который связывается с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Такая способность мишеневого зонда связываться со ссылочным зондами позволяет"удалить" или изолировать пропорциональное число мишеневого и ссылочного зондов. Такое "удаление" делает возможным обнаружение неспаренной последовательности-мишени или неспаренной ссылочной последовательности, которое указывает на различие в количестве одной последовательности в сравнении с другой в образце нуклеиновых кислот. В предпочтительном аспекте район или составляющую для связывания ссылочного зонда с мишеневым зондом создают путем включения соответствующего члена пары партнеров по специфическому связыванию в каждый из мишеневого и ссылочного зондов. Партнеры по связыванию могут взаимодействовать путем, например, гибридизации (в которую вовлечена водородная связь), белковых взаимодействий, ковалентного связывания, ионного связывания, Вандерваальсовых взаимодействий и гидрофобных взаимодействий. Партнеры по связыванию обязательно связываются друг с другом с хорошо известной стехиометрией. Это не означает, что партнеры по связыванию связываются со стехиометрией 1:1. Но то, что является важным, - это то, что стехиометрия известна. Например, авидин связывается с биотином со стехиометрией до 8:1. Однако в действительности наблюдаемая стехиометрия биотин:авидин может варьировать в зависимости от влияний стерических помех, вызванных находящейся на конце последовательностью нуклеиновой кислоты (находящимися на концах последовательностями нуклеиновых кислот). Однако для данного биотинилированного зонда предполагают, что стехиометрия связывания авидина или стрептавидина остается постоянной. Партнеры по связыванию, применимые в описанных здесь способах, предпочтительно условно способны связываться друг с другом. Под "условно способны связываться друг с другом" подразумевается,что связыванием одного партнера с другим можно манипулировать так, что определяемое связывание происходит только тогда, когда хотят, чтобы оно происходило. Условным аспектом можно манипулировать путем, например, изменения температуры, соли или некоторых других физических или химических параметров среды. Например, понижение температуры раствора ниже Tm для связывающихся пар, представляющих собой нуклеиновые кислоты, делает эти пары способными связываться друг с другом. Условного связывания можно также добиться посредством конкуренции за сайты связывания, применяя"удаляемые" конкуренты. Под "удаляемыми" конкурентами подразумеваются молекулы, которые конкурируют за связывание зондов друг с другом, но которые при желании могут быть или физически удалены, или сделаны инертными для того, чтобы сделать возможным связывание зондов друг с другом. Условного связывания можно также добиться через добавление катализатора, который вызывает связывание. Например, воздействие УФ на комплементарные последовательности, включающие галогенизированные нуклеозиды, может привести к ковалентному связыванию последовательностей. Квалифицированным в данной области специалистам также известны химические сшивающие агенты. В одном варианте осуществления настоящего изобретения партнеры по связыванию представляют собой, по существу, комплементарные последовательности нуклеиновых кислот, которые включены в соответствующие зонды. В этом аспекте последовательность нуклеиновой кислоты, являющаяся партнером по связыванию, в одном зонде способна гибридизоваться с последовательностью нуклеиновой кислоты, являющейся партнером по связыванию, в другом зонде при установленном наборе условий. Параметры, схожие с теми, которые принимаются во внимание при разработке последовательностей ПЦР-праймеров, принимаются во внимание при разработке последовательностей нуклеиновых кислот, являющихся партнерами по связыванию, для включения в описанные здесь зонды. Например, квалифицированный в данной области специалист примет во внимание влияние размера и содержания G+C на поведение при гибридизации последовательностей, являющихся партнерами по связыванию. Часто,хотя не обязательно, последовательность, являющаяся партнером по связыванию, в зонде, в котором используется нуклеиновая кислота в качестве партнера по связыванию, равна или короче (например, короче по меньшей мере на один нуклеотид или несколько нуклеотидов) той части зонда, которая связывается с последовательностью-мишенью или ссылочной последовательностью. В альтернативном случае партнеры по связыванию могут являться соответствующим членами любой пары по специфическому связывания, которая совместима со средой, требуемой для гибридизации нуклеиновых кислот. Т.е. составляющие, являющиеся партнерами по связыванию, могут также взаимодействовать посредством других способов, отличных от гибридизации. Например, составляющие, являющиеся партнерами по связыванию, могут представлять собой пары составляющих, которые связываются друг с другом посредством ковалентных или нековалентных взаимодействий. Примеры таких составляющих, являющихся партнерами по связыванию, включают в себя, но не ограничиваются перечисленным, биотин-стрептавидин, биотин-авидин, пары рецептор-лиганд, пары мотивов гетеродимеризации(например, комплементарные мотивы "лейциновые молнии", комплементарные мотивы спираль-петляспираль и т.п.), взаимодействия антиген-антитело, взаимодействия аптамер-лиганд или многокомпонентные химические реакции. Способы связывания с зондами партнеров по связыванию, не являющихся нуклеиновыми кислотами, хорошо известны в данной области техники. Кроме того, квалифицированный в данной области специалист может легко определить, имеет ли среда, требуемая для гибридизации нуклеиновых кислот, неблагоприятный эффект на составляющие, являющиеся партнерами по связыванию,или на их способности связываться друг с другом. Составляющие, являющиеся партнерами по связыванию, могут также взаимодействовать непрямо- 11013373 через "адаптерную молекулу". Используемая здесь адаптерная молекула представляет собой любую молекулу, способную связываться специфически с составляющей, являющейся партнером по связыванию,таким образом соединяя вместе последовательности ссылочного и мишеневого зондов. В одном варианте осуществления настоящего изобретения адаптерная молекула включает последовательности нуклеиновых кислот, которые могут гибридизоваться с составляющими-партнерами по связыванию - нуклеиновыми кислотами первого и второго зондов. Адаптерная молекула может быть одноцепочечной, двухцепочечной или двухцепочечной с одной или несколькими концевыми избыточностями одной цепи. В качестве одного из не ограничивающих примеров адаптера можно привести двухцепочечную нуклеиновую кислоту с двумя различными одноцепочечными избыточностями, одна избыточность, по существу, комплементарна последовательности, являющейся партнером по связыванию, в мишеневом зонде, а вторая избыточность, по существу, комплементарна последовательности, являющейся партнером по связыванию, в ссылочном зонде. Адаптерная молекула может также включать составные нуклеиновые кислоты. При использовании адаптерной молекулы является предпочтительным, чтобы сайты, которые взаимодействуют с являющимися партнерами по связыванию составляющими, были способны различать между составляющими, являющимися партнерами по связыванию, в первом и втором зонде. Также является предпочтительным, чтобы соотношение между первым зондом и вторым зондом, с каждым из которых взаимодействует адаптерная молекула, являлось установленным числом. В одном варианте осуществления настоящего изобретения адаптерная молекула способна связываться с первым и вторым зондами в соотношении 1:1. Не является обязательным, чтобы адаптерная молекула взаимодействовала с первым и вторым зондами в соотношении 1:1. В альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения единственная адаптерная молекула может связываться с множеством копий (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и т.п.) первого и второго зондов. Например, адаптерная молекула может представлять собой твердую подложку, содержащую множество сайтов, с которыми могут специфически взаимодействовать первый и второй зонды. В качестве не ограничивающего примера, являющаяся партнером по связыванию составляющая в первом зонде может представлять собой поли-А "хвост", а являющаяся партнером по связыванию составляющая во втором зонде может представлять собой поли-С "хвост". Адаптерная молекула может представлять собой твердую подложку, например шарик, включающую множество поли-Т- и поли-Gолигонуклеотидов, с которыми могут специфически взаимодействовать первый и второй зонды посредством их составляющих, являющихся партнерами по связыванию, соответственно. В другом альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения можно использовать более одной (например, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8 и т.п.) адаптерной молекулы. Изоляция или удаление комплексов мишеневый зонд:ссылочный зонд. В описанных здесь способах используется образование комплексов между ссылочным зондом и мишеневым зондом. Для обнаружения не вошедших в комплексы или "отложенных" молекул зондов после связывания зондов друг с другом может быть полезным удаление, "сокрытие" или изоляция комплексов мишеневый зонд:ссылочный зонд. Существует несколько способов для выполнения этого удаления, "сокрытия" или изоляции. Один подход состоит в "сокрытии" комплексов мишеневый зонд:ссылочный зонд от обнаружения. Этого можно достичь с помощью постоянного сшивания комплексов мишеневый зонд:ссылочный зонд таким образом, что блокируется способ обнаружения. Например, если для обнаружения неспаренных зондов используется ПЦР, комплементарные последовательности в мишеневом и ссылочном зондах можно использовать для их связывания, и этот дуплекс можно сшить с помощью таких химических или физических средств, как УФ, митомицин С и другие средства, описанные ранее. Если праймеры, предназначенные для обнаружения, сконструированы с перекрыванием места постоянного сшивания, или их можно обнаружить на противоположных сторонах мест сшивания, ПЦР-амплификация спаренных зондов ингибируется, поэтому только неспаренные зонды амплифицируются и поэтому обнаруживаются. Введение галогенизированных нуклеозидов (например, в ПЦР-праймеры или нарушающие последовательности) может улучшить эффективность УФ-сшивания (см. Web-сайт Qiagen). Другие применимые химические модификации нуклеозидов или нуклеотидоввключают в качестве не ограничивающих примеров тиолирование, амидирование и биотинилирование. При желании можно модифицировать более одного (например, 2, 3, 4 или более) праймера в реакции, включая различные модификации в различные праймеры. Можно также использовать такие химические сшивающие агенты, как митомицин С (Bizanek et al., Biochemistry 1992, 31, 3084-3091) или его производные, оксид азота (Caulfield et al. Chem Res.Toxicology, 16(5):571-574, 2003), конъюгаты пиррол/имидазол CPI (Bando et al., J. Am. Chem. Soc., 2003,125, 3471-3485), карцинофилин, бизелезин, азотистый иприт, нетропсин и их производные. Как отмечено выше, сшитые гибриды не являются матрицами, эффективными для обнаружения с помощью, например,ПЦР. Следовательно, ПЦР с использованием праймеров, которые амплифицируют мишеневые и/или ссылочные зонды или последовательности, приводят к образованию продуктов амплификации только тогда, когда существуют последовательности несшитых матриц. Как обсуждается здесь по отношению к способам конечного обнаружения, праймеры для амплификации следует разрабатывать или так, чтобы они гибридизовались с районом, в котором зонды сшиты, или так, чтобы в амплифицируемой последова- 12013373 тельности содержался бы сшитый район, таким образом ингибируя удлинение ПЦР-цепи. В любом из двух случаев присутствие сшитых зондов блокирует ПЦР-амплификацию, и, следовательно, прочтение ПЦР соответствует последовательностям, не сшитым благодаря этим способам. Обнаружение неспаренных зондов. После физического спаривания мишеневых и ссылочных зондов пропорционально количеству присутствующей последовательности-мишени для описанных здесь способов необходимо обнаружение неспаренных зондов. Такое обнаружение можно выполнить посредством одного из нескольких различных подходов. В одном из способов обнаружения неспаренных зондов используется амплификация с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) молекул зондов, пригодных для того, чтобы служит в качестве матриц для амплификации. ПЦР хорошо известна в данной области техники, и в ней используется термостабильная зависимая от матрицы полимераза и олигонуклеотидные праймеры, которые отжигаются к матричной нуклеиновой кислоте на противоположных цепях в циклах прижигания праймеров, удлинения праймеров и разделения цепей с образованием экспоненциально увеличивающегося числа копийдублетов матричной последовательности. См., например, Mullis et al., патент США 4683202. Обнаружение с помощью ПЦР неспаренных зондов можно выполнить посредством использования ПЦР-праймеров, которые амплифицируют последовательности неспаренных зондов. ПЦР-праймеры можно сконструировать так, чтобы использовать природу неспаренных зондов. Например, если мишеневый и ссылочный зонды связываются друг с другом посредством гибридизации маркеров, являющихся комплементарными последовательностями, один из праймеров, используемый для амплификации неспаренных зондов, можно сконструировать так, чтобы он был комплементарен последовательностимаркеру. Если, например, мишеневый и ссылочный зонды сшивают друг с другом после гибридизации маркеров, являющихся комплементарными последовательностями, маркеры сшитых молекул будут не пригодны для связывания праймеров для амплификации, что исключит амплификацию сшитых зондов с использованием праймера, который гибридизуется с маркером. При таком подходе только неспаренные зонды останутся пригодными для амплификации и последующего обнаружения. Обнаружение ПЦР-продукта, указывающее на присутствие неспаренного зонда и различий в количестве нуклеиновой кислоты-мишени, можно использовать с помощью любых средств, обычно используемых для обнаружения ПЦР-продуктов. Например, в ПЦР можно ввести флуоресцентный или радиоактивномеченный нуклеотид или праймер, а обнаружение флуоресценции или изотопа можно использовать для прочтения реакции. В альтернативном случае можно использовать способ в режиме реального времени, такой как TaqMan, и способы молекулярных маяков или родственные способы. В TaqMan-анализе (см., например, патент США 5723591) два ПЦР-праймера фланкируют центральный олигонуклеотид зонда. Олигонуклеотид зонда включает две флуоресцентные составляющие. Во время стадии полимеризации ПЦР-процесса полимераза расщепляет олигонуклеотид зонда. Расщепление вызывает то, что две флуоресцентные составляющие становятся физически разделены, что вызывает изменение длины волны флуоресцентной эмиссии. По мере образования большего количества ПЦРпродуктов увеличивается интенсивность новой длины волны. Альтернативой TaqMan являются молекулярные маяки (см. патенты США 6277607, 6150095,6037130). Молекулярные маяки подвергаются конформационному изменению при связывании с комплементарной матрицей. Конформационное изменение маяка увеличивает физическое расстояние между составляющей-флуорофором и составляющей-тушителем маяка. Это увеличение физического расстояния вызывает то, что действие тушителя ослабляется, таким образом увеличивая сигнал, исходящий от флуорофора. Можно также использовать другие применимые флуоресцентные и ферментативные ПЦР-методы,такие как Scorpions (Solinas et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29:596), Sunrise-праймеры (Nazarenko et al.,1997, Nucleic Acids Res., 25, 2516-2521) и ДНКзимы. При основанном на ПЦР обнаружении неспаренных зондов можно также использовать капиллярный электрофорез для быстрого обнаружения. Как правило, при использовании капиллярного электрофореза в амплифицируемую последовательность включают флуоресцентный нуклеотид или праймер,который затем обнаруживают при прохождении образца через капилляр. Капиллярный электрофорез можно также использовать без потребности в амплификации с помощью ПЦР, если сигнал от неспаренных зондов достаточен для надежного сигнала. В альтернативном случае можно использовать флуоресцентные маркеры или "докеры" флуоресцентных маркеров, которые селективно связываются с неспаренными зондами. Под "докерами" флуоресцентных маркеров подразумеваются молекулы, которые могут связываться с заранее определенным числом флуоресцентных маркеров или непосредственно, или через адаптерные молекулы с тем, чтобы облегчить обнаружение. Еще один способ состоит в добавлении неактивных ферментов, которые можно активировать, или непосредственно, или через адаптерные молекулы, с помощью исключительно неспаренных зондов. Ферментативную активность можно затем определить по изменению цвета, флуоресценции или с помощью похожего прочтения. Другие способы обнаружения могут включать радиоактивное маркирование или другие- 13013373 методы. Хромосомные нарушения и болезни. В описанных здесь способах отклонения отношения гена-мишени к ссылочному гену от 1:1 указывают на вероятное хромосомное нарушение. Не ограничивающие примеры хромосомных нарушений,которые ассоциируются с болезнью и которые можно оценить, используя способ в соответствии с описанными здесь способами, предоставлены ниже в табл. 1. Как правило, оценку числа хромосом или аллелей в геноме выполняют в сочетании с другими оценками, такими как клинические оценки симптомов у больных. Например, пренатальная оценка может быть особенно уместной, когда в истории болезни родителей имеются самопроизвольные аборты, мертворождения и смерти новорожденных, или когда имеют место престарелый возраст матери, результаты аномальных маркеров в сыворотке матери или хромосомные нарушения в семейном анамнезе. Постнатальное тестирование может быть уместным, когда имеют место множественные врожденные нарушения, клинические проявления, согласующиеся с известными хромосомными синдромами, необъяснимая задержка психического развития, первичная и вторичная аменорея, бесплодие и т.п. Обнаружение заболеваний и нарушений Как указано выше, описанные здесь способы могут обнаружить различие между концентрациями нуклеиновых кислот. В качестве таковых эти способы можно использовать для обнаружения заболеваний и нарушений, которые связаны с генетическим дисбалансом в концентрации ДНК или РНК. Для того чтобы это сделать, необходимо только определить, каково то отклонение от нормы, которое указывает на болезнь. При условии следующих возможных сценариев, примерами возможных решений с использованием вышеуказанных способов являются следующие. Концентрация последовательности-мишени в норме равна концентрации внутренней ссылочной последовательности, но в случае заболевания концентрация последовательности-мишени относительно ссылочной последовательности уменьшается или увеличивается. Последовательность-мишень и ссылочная последовательность в этом случае, после экстрагирования из биологического образца, эквиваленты последовательности-мишени и ссылочной последовательности, соответственно, в вышеуказанном анализе. Исходные образцы готовят таким образом, чтобы относительные количества последовательности-мишени и ссылочной последовательности сохранялись,поэтому делая возможным выполнение стадий, описанных в предшествующем разделе. Конечная стадия обнаружения с помощью ПЦР позволяет определить, равны ли концентрации последовательностимишени и внутренней ссылочной последовательности, или, альтернативно, существует ли отклонение в концентрации последовательности-мишени по сравнению со ссылочной последовательностью. Это знание указывает на лежащее в основе наличие или отсутствие заболевания или нарушения. Концентрация последовательности-мишени в норме ниже (выше) концентрации внутренней ссылочной последовательности, но в случае заболевания концентрация последовательности-мишени становится относительно выше (ниже) концентрации внутренней ссылочной последовательности. Последовательность-мишень и ссылочная последовательность в этом случае, после экстрагирования из биологического образца, эквиваленты последовательности-мишени и ссылочной последовательности, соответственно, в вышеуказанном анализе. Исходные образцы готовят таким образом, чтобы относительные количества последовательности-мишени и ссылочной последовательности сохранялись,- 17013373 поэтому делая возможным выполнение стадий, описанных в предшествующем разделе. Конечная стадия обнаружения с помощью ПЦР позволяет определить, является ли концентрация последовательностимишени выше или ниже концентрации внутренней ссылочной последовательность. Это знание указывает на лежащее в основе наличие или отсутствие заболевания или нарушения. Концентрация последовательности-мишени в норме ниже (выше) предельной концентрации X, но в случае заболевания концентрация последовательности-мишени становится выше (ниже) предельной концентрации X. Последовательность-мишень в этом случае, после экстрагирования из биологического образца, эквивалента последовательности-мишени в вышеуказанном анализе. Ссылочная последовательность представляет собой внешнюю стандартную последовательность, добавляемую в предельной концентрации X. Исходные образцы готовят таким образом, чтобы относительные количества последовательностимишени и ссылочной последовательности сохранялись, поэтому делая возможным выполнение стадий,описанных в предшествующем разделе. Конечная стадия обнаружения с помощью ПЦР позволяет определить, является ли концентрация последовательности-мишени выше или ниже концентрации ссылочной последовательность, которая находится в предельной концентрации X. Это знание указывает на лежащее в основе наличие или отсутствие заболевания или нарушения. Обнаружение синдрома Дауна или других генетических нарушений с использованием внеплодной ДНК, обнаруживаемой в материнской сыворотке или плазме 1 из 20 детей рождается с генетическим нарушением. Синдром Дауна является наиболее часто встречающимся хромосомным нарушением, поражающим приблизительно 1 на 750 родов (табл. 1). Частота синдрома Дауна увеличивается с увеличением среднего возраста, в котором женщины вынашивают детей. Синдром Дауна вызван трисомией-21 - случаем трех копий хромосомы-21 вместо нормальных двух копий. Индивидуумы с синдромом Дауна страдают задержкой психического развития, пороками сердца,преждевременной смертью и анатомическими деформациями, для большинства из них требуется попечение в течение всей жизни. Они сильно напрягают эмоционально, физически и финансово семьи и общество. Поэтому многие женщины хотят иметь выбор относительно того, рожать ли ребенка с синдромом Дауна, или хотят быть эмоционально готовыми к родам. Синдром Дауна - это пример болезни, при которой желательно раннее обнаружение. Используемыми сегодня тестами являются амниоцентез, постоянный отбор пробы синовиальной оболочки, отбор пробы пупочного канатика, биопсия плода и скрининги материнской сыворотки и мочи и ультразвуковые скрининги. Амниоцентез представляет собой инвазивный тест, для которого требуется пункционная биопсия с ультразвуковым контролем направления амниотической жидкости, окружающей плод, через брюшную полость матери. Клетки плода из амниотической жидкости культивируют, а хромосомы визуализируют с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Для получения результатов требуется 2-4 недели. Амниоцентез рекомендуется только между 15 и 18 неделями беременности. Он приводит к 1% случаев выкидышей и незначительному увеличению риска нарушений в виде хромоты. Установлено, что чувствительность амниоцентеза составляет 99,3%, а его специфичность - 99,9%. Сывороточные скрининги в отношении синдрома Дауна представляют собой неинвазивные тесты, в которых измеряется уровень конкретных сывороточных маркеров. Маркеры включают в себя альфафетопротеин (AFP), хронический гонадотропин человека (hCG), неконъюгированный эстриол, ингибин А и РАРР-А. Большинство маркеров тестируют между 16 и 18 неделями беременности, и чувствительность их комбинации составляет менее 75% при 95% специфичности. В 1979 г. обнаружили, что кровь матери содержит эритроциты плода (fRBC), но на сегодняшний день в коммерческих диагностиках это знание не используется. В 1997 г. в сыворотке крови и плазме матери также обнаружили внеплодную ДНК (патент США 5641268). Однако эти клетки и ДНК плода разведены значительными количествами клеток и ДНК матери (Lo et al., J. Hum Genet. 1998, 62, 768-75),что усложняет обнаружение генетических нарушений у плода.- 18013373 Тем не менее внеплодная ДНК, обнаруженная в сыворотке крови и плазме матери, гипотетически присутствует в средних относительных концентрациях (по сравнению с материнской ДНК), составляющих до 20-25% в среднем (Dhallan et al., JAMA 291:1114-1119, 2004; Benachi, Clin Chem 51:1-3, 2004; Loet al., Am. J. Hum Genet 64:218-224, 1999). Смесь из 20% ДНК плода с синдромом Дауна и 80% ДНК здоровой матери приведет к содержанию ДНК хромосомы-21, превышающему на 10% содержание ДНК ссылочной хромосомы, например содержание ДНК хромосомы-10. Эта 10% разница может быть обнаружена с помощью вышеуказанных способов. После выделения свободной ДНК из сыворотки крови или плазмы матери с ней можно осуществить описанный здесь способ для определения относительных количеств последовательности-мишени и ссылочной последовательности. Для обнаружения синдрома Дауна, например, выбирают последовательность-мишень на хромосоме-21 и ссылочную последовательность на любой другой хромосоме, например хромосоме-10. Рабочим вопросом является, равна ли концентрация последовательности-мишени концентрации ссылочной последовательности, что указывает на здоровый плод, или последовательностьмишень обнаруживается в избытке по сравнению со ссылочной последовательностью, что указывает на синдром Дауна. Результаты вышеуказанной методологии обеспечивают измерение этой относительной концентрации, обеспечивая способ обнаружения синдрома Дауна у плода с использованием образца крови матери. Данный подход применим к широкому ряду таких генетических нарушений. Описание дополнительных способов и материалов, которые дополнительно поддерживают описанные здесь новые способы, обеспечено в заявке на патент США 11/036833, поданной 14 января 2005 г.,и в заявке на патент США 60/622522, поданной 27 октября 2004 г., которые полностью включены сюда в виде ссылки. Примеры Пример 1. Определение количества последовательности хромосомы-18 относительно последовательности хромосомы-10 с использованием иммобилизации с помощью биотина ссылочной последовательности. Описанные здесь способы применимы для обнаружения трисомии-21 в материнской сыворотке следующим образом. Используемыми мишеневым и ссылочным зондами являются следующие последовательности (номенклатура которых соответствует номенклатуре, используемой на фиг. 3). Последовательность-мишень из 18q: 5'-GAGGAGACCAGGGGCTCAAGTGAGCCCCTCCGAGGGGATGGCTGTGCTGCAGCAGAGATID NO: 2),где первая линия эквивалента последовательности А, вторая и третья линии эквиваленты последовательности В, третья линия также эквивалента рВ, а четвертая линия эквивалента последовательности С, продемонстрированной на фиг. 3. Ссылочная последовательность из 10 р: 5'-ACAAGCTGCAAGCTCACGACTTACCATTCCGTAACGCTTTTATGGGCTCTGATGACCGAGGTCTCAATGTCGATTGGGTGGT-3' (SEQ ID NO: 3),где первая линия эквивалента последовательности D, вторая линия эквивалента последовательности Е, а третья линия эквивалента последовательности F, продемонстрированной на фиг. 3. Вышеуказанные последовательности сначала амплифицируют с помощью ПЦР. Праймерами являются прямой праймер для последовательности-мишени (А): 5'-GAGGAGACCAGGGGCTCAAG-3' (SEQID NO: 5),прямой праймер для ссылочной последовательности (D): 5'-ACAAGCTGCAAGCTCACGAC-3' (SEQID NO: 6),обратный праймер для ссылочной последовательностиCTAGAGAACAACCACCCAATCGACATTGAG-3'(SEQ ID NO: 7). Первая половина обратного праймера для ссылочной последовательности представляет собой последовательность размером 20 п.н., которая эквивалента последовательности на третьей линии, продемонстрированной выше. Заметьте, что это последовательность рВ в соответствии с фиг. 3. На этой стадии амплификации с помощью ПЦР начинают с 5 мкл последовательности-мишени и ссылочной последовательности, служащих в качестве матриц, затем добавляют 10 мкл раствора праймеров с 450 нМ каждого праймера и 15 мкл 2 Х ПЦР-смеси (например, буфера IV Advanced Biotechnologies). Примерными условиями ПЦР-цикла являются следующие: а) 95 С в течение 15 мин (активировать фермент, если необходимо),б) повторить 10-20 раз следующий цикл,i) 94 С в течение 20 с,ii) 55 С в течение 30 с,iii) 72C в течение 40 с,- 19013373 в) держать при 4 С. После извлечения вышеуказанной пост-ПЦР-смеси добавить описанные выше нарушающие последовательности в конечной концентрации 10 мкМ: нарушающая последовательность последовательности-мишени (С): 5'-GCAGCGCCACTGTTGCGTCT-3' (SEQ ID NO: 8),нарушающая последовательность ссылочной последовательности (F'): 5'-CTCAATGTCGATTGGGTGGT-3' (SEQ ID NO: 9). За этим следует другой тепловой цикл: г) 95 С в течение 15 мин (активировать фермент, если необходимо),д) провести только один раз следующий цикл,i) 94 С в течение 20 с,ii) 55 С в течение 30 с,iii) 72 С в течение 40 с,iv) 55C в течение 1 ч,v) 72 С в течение 40 с,е) держать при 4 С. Для дисбалансировки ПЦР-смеси можно затем добавить димер митомицина, представленный ниже Димер митомицина активируют с помощью кислотного рН (рН 4,0), и образцы инкубируют в течение 3 ч для достижения максимальной эффективности сшивания. После стадии сшивания вновь устанавливают нейтральный рН для того, чтобы сделать возможной другую ПЦР-реакцию. Аликвоты вышеуказанных сшитых образцов затем используют в другом ПЦР-цикле. Так как предшествующие ПЦР и, следовательно, раствор уже содержат необходимые прямые праймеры, необходимо только добавить два новых обратных праймера (фиг. 4). Такими праймерами, например, являются праймер R1: 5'-AGGAGGGTTGTCTCTAGTCA-3' (SEQ ID NO: 10),праймер R2: 5'-GGGCCGACTGCTAGAGAACA-3' (SEQ ID NO: 11). Используя новые обратные праймеры, старые прямые праймеры и аликвоты образца из сшитой смеси, затем добавляют в равном объеме 2 Х ПЦР-смесь для проведения цикла ПЦР в режиме реального времени с использованием усложненных Taqman-зондов для определения относительной концентрации мишеневого и ссылочного зондов. Снова примерный тепловой ПЦР-цикл представляет собой следующее: а) 95 С в течение 15 мин (активировать фермент, если необходимо),б) повторить 50 раз следующий цикл,i) 94C в течение 20 с,ii) 55C в течение 30 с,iii) 72 С в течение 40 с,в) держать при 72 С в течение 15 с,г) держать при 4 С. Другие варианты осуществления настоящего изобретения Для квалифицированных в данной области специалистов будут очевидны другие варианты осуществления настоящего изобретения. Должно быть понятно, что предшествующее детальное описание предоставлено только с целью внесения ясности и только с иллюстративной целью. Сущность и объем настоящего изобретения не ограничиваются вышеуказанными примерами, а определяются следующей формулой. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ определения того, присутствует ли в образце в большем количестве нуклеиновая кислотамишень или эталонная нуклеиновая кислота, предусматривающий: а) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени и эталонной нуклеиновой кислоты с помощью полимеразной цепной реакции с использованием прямого и обратного праймеров для нуклеиновой кислоты-мишени и прямого и обратного праймеров для эталонной нуклеиновой кислоты, при этом обратный праймер для эталонной нуклеиновой кислоты содержит хвостовую последовательность, которая идентична части последовательности-мишени; б) добавление первой нарушающей последовательности, которая комплементарна обратному праймеру для нуклеиновой кислоты-мишени, и добавление второй нарушающей последовательности, которая- 20013373 комплементарна части, но не хвостовой последовательности, обратного праймера для эталонной нуклеиновой кислоты; и в) обнаружение присутствия одноцепочечной нуклеиновой кислоты-мишени или эталонной нуклеиновой кислоты, при этом присутствие одноцепочечной нуклеиновой кислоты-мишени указывает на присутствие большего количества нуклеиновой кислоты-мишени в первоначальном образце, а присутствие одноцепочечной эталонной нуклеиновой кислоты указывает на присутствие большего количества эталонной нуклеиновой кислоты в первоначальном образце. 2. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий после добавления первой и второй нарушающих последовательностей, но до стадии обнаружения,отжиг обратного праймера для нуклеиновой кислоты-мишени к комплементу последовательностимишени, отжиг обратного праймера для эталонной нуклеиновой кислоты к комплементу эталонной последовательности и отжиг хвостовой последовательности обратного праймера для эталонной нуклеиновой кислоты к последовательности-мишени; и удлинение обратных праймеров для нуклеиновой кислоты-мишени и эталонной нуклеиновой кислоты и хвостовой последовательности обратного праймера для эталонной нуклеиновой кислоты, при этом каждый из комплемента последовательности-мишени, комплемента эталонной последовательности и по меньшей мере части последовательности-мишени и по меньшей мере части эталонной последовательности превращается в двухцепочечный продукт, а любой избыток последовательности-мишени или эталонной последовательности остается одноцепочечным. 3. Способ по п.2, в котором двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит галогенизированный нуклеотид. 4. Способ по п.1, в котором двухцепочечную нуклеиновую кислоту сшивают после добавления первой и второй нарушающих последовательностей, но до стадии обнаружения. 5. Способ определения того, присутствует ли в образце в большем количестве нуклеиновая кислотамишень или эталонная нуклеиновая кислота, предусматривающий: а) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени и эталонной нуклеиновой кислоты путем проведения одного или нескольких циклов полимеразной цепной реакции; б) дисбалансировку полимеразной цепной реакции с обеспечением смеси продуктов амплификации,которая содержит и одноцепочечные нуклеиновые кислоты, и двухцепочечные нуклеиновые кислоты,в) сшивание двухцепочечных нуклеиновых кислот в смеси и г) обнаружение присутствия одноцепочечной нуклеиновой кислоты-мишени или эталонной нуклеиновой кислоты, при этом присутствие одноцепочечной нуклеиновой кислоты-мишени указывает на присутствие большего количества нуклеиновой кислоты-мишени в первоначальном образце, а присутствие одноцепочечной эталонной нуклеиновой кислоты указывает на присутствие большего количества эталонной нуклеиновой кислоты в первоначальном образце. 6. Способ по п.4 или 5, в котором сшивание осуществляют с помощью ультрафиолетового света. 7. Способ по п.1 или 5, в котором сшивание осуществляют с помощью химического сшивающего агента. 8. Способ по п.7, в котором химический сшивающий агент выбирают из группы, состоящей из митомицина, карцинофилина, бизелезина, азотистого иприта, нетропсина и их производных. 9. Способ по п.1 или 5, в котором стадию обнаружения осуществляют с помощью полимеразной цепной реакции. 10. Способ по п.1 или 5, в котором стадию обнаружения осуществляют с помощью флуоресценции,капиллярного электрофореза, радиоактивности или ферментативной активности. 11. Способ по п.1 или 5, в котором указанный образец является биологическим образцом. 12. Способ по п.11, в котором биологический образец выбирают из группы, состоящей из крови,сыворотки, плазмы, биопсийной пробы, мазка, клеточной культуры, РНК и кДНК. 13. Способ по п.1 или 5, в котором указанный образец не является биологическим образцом. 14. Способ по п.12, в котором образец получают от беременной женщины. 15. Способ по п.14, в котором последовательность нуклеиновой кислоты-мишени или эталонной нуклеиновой кислоты является последовательностью нуклеиновой кислоты плода. 16. Способ по п.15, в котором различие между количеством последовательностей нуклеиновой кислоты-мишени и эталонной нуклеиновой кислоты связано с хромосомным нарушением у плода. 17. Способ по п.16, в котором указанное различие связано с синдромом Дауна у плода. 18. Способ по п.16, в котором указанное различие связано с синдромом Тернера, синдромом Эдварда, синдромом Патау, синдромом Клайнфельтера, синдромом трех Х-хромосом или синдромом XYY у плода. 19. Способ по п.1 или 5, в котором различие между количеством последовательностей нуклеиновой кислоты-мишени и эталонной нуклеиновой кислоты связано с анеуплоидией. 20. Способ по п.19, в котором анеуплоидия связана с раком.