Антисмысловые соединения, нацеленные на коннексины, и способы их применения

ИСПРАВЛЕННОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Обеспечены способы и композиции для модуляции активностей коннексинов, в том числе,например, для применения в постхирургических применениях, применениях при травме или применениях для конструирования ткани. Эти соединения и способы могут быть использованы терапевтически, например, для уменьшения тяжести связанных с побочными эффектами заболеваний и нарушений, при которых является желательным локализованное разрушение прямой коммуникации клетка-клетка. Примечание: библиография отражает состояние при переиздании 015670 Область техники, к которой относится данное изобретение Данное изобретение относится к агентам, композициям и способам и описывает агенты, композиции и способы применения соединений для модуляции экспрессии белка, ассоциированного со щелевым контактом. Эти агенты, композиции и способы применимы, например, для конструирования ткани invivo и in vitro, в том числе, например, в коже, в ткани роговицы и в связи с хирургическими процедурами глаза. Уровень техники Декомпенсация ткани или органа, связанная с заболеванием или повреждением, является главной проблемой здравоохранения во всем мире с низкой возможностью выбора для полного восстановления,другого, чем трансплантация органа или ткани. Однако проблемы нахождения подходящего донора означают, что эта возможность выбора является недоступной для большинства пациентов. В качестве замен в настоящее время исследуется конструирование или ремоделирование ткани посредством синтетических или полусинтетических миметиков ткани или органа, которые либо являются полностью функциональными, либо приобретают желаемую функциональность. В частности, одной областью, в которой эта технология становится все более важной, является область, касающаяся роговицы глаза. Трансплантация роговицы является наиболее обычной формой трансплантации твердых органов, проводимой во всем мире. Каждый год приблизительно 80000 трансплантаций роговицы выполняют только в США и Соединенном Королевстве Великобритании и Северной Ирландии. Преобладание рефракционной хирургии для коррекции миопической рефракции глаза(близорукости), такой как фоторефрактивная кератэктомия (иссечение роговицы) (PRK) и лазерное insitu изменение рефракции роговицы удалением ее слоев, их замораживанием и шлифовкой для изменения кривизны и последующим возвращением на тот же участок (LASIK), привело к дефициту подходящей роговицы для трансплантата для ремоделирования ткани после хирургии или патологических процессов и для манипуляции ткани in vivo для конструирования изменений. Кроме того, приблизительно 5% пациентов, подвергающихся лазерной хирургии, претерпевают неожиданные результаты. Роговица представляет собой прозрачную ткань, которая включает в себя центральную одну шестую часть наружной оболочки глазного яблока. Ее унифицированная структура и функция обеспечивают глаз прозрачной рефракционной поверхностью раздела, прочностью на разрыв и защитой от внешних факторов. Роговица построена из трех различных основных слоев клеток: эпителия, стромы и эндотелияYear Book, 1992, 29-47; Spencer, W.H., "The cornea; Ophthalmic Pathology: an atlas and textbook; 4th ed.,Philadelphia: W.B. Saunders Co., 1996, 157-65). Кроме того, Десцеметова оболочка, оболочка Боумана и базальная мембрана являются структурами, которые образуются некоторыми путями из одного из этих основных клеточных слоев. Роговичный эпителий является слоем, находящимся в прямом контакте с наружной средой. Он является слоистой, сквамозной, некератинизированной структурой с толщиной в диапазоне 40-100 мкм у крыс и у людей, соответственно. Он состоит из поверхностной зоны, обычно образованной двумя-тремя слоями плоских сквамозных клеток; средней зоны, образованной двумя-тремя слоями полиэдрических крылатых клеток; и базальной зоны, состоящей из единственного ряда цилиндрических клеток (столбчатых эпителиоцитов). Этот слоистый роговичный эпителий характеризуется как плотный транспортирующий ионы функциональный синцитий, который служит как в качестве защитного барьера для поверхности глаза, так и в качестве вспомогательного секретирующего жидкость слоя, помогающего роговичному эндотелию в регуляции гидратации стромы и способствующего тем самым поддержанию прозрачности роговицы. Было показано, что эти уникальные и специализированные качества, предоставляемые роговичным эпителием, являются важными для функционирования роговицы в качестве главного рефракционного элемента глаза. Таким образом, важно, чтобы его слоистая структура поддерживалась независимо от любых стрессов окружающей среды. Травма поверхности роговицы является широко распространенной; например небольшие царапины,глазные инфекции и заболевания, химические или механические травмы и хирургическая практика, - все могут повреждать роговицу. Одним основным осложнением в заживлении ран после травмы роговицы является потеря остроты зрения вследствие реорганизации ткани. Пациенты, имеющие риск возникновения проблем офтальмологического заживления, включают в себя пациентов, которые были подвергнуты хирургии. Примеры такой хирургии включают в себя, но не ограничиваются ими, удаление катаракты, с заменой или без замены хрусталика; трансплантацию роговицы или другие проникающие процедуры,такие как проникающая кератопластика (пересадка роговицы) (PKR); эксимерная лазерная фоторефрактивная кератэктомия; фильтрующая хирургия глаукомы; радиальная кератотомия и другие типы хирургии для коррекции рефракции или замены хрусталика. Роговица обеспечивает наружную оптически гладкую поверхность для передачи света в глаз. Хирургия нарушает силы, которые удерживают роговицу в ее нормальной конфигурации. У пациентов с катарактой хирургический разрез полной толщины делают в участке лимба (края) роговицы. Роговица сокращается при заживлении, вызывая локальную деформацию ткани и сопутствующее искажение в по-1 015670 ле зрения в пораженном участке (астигматизм). Другие хирургические раны в роговице могут инициировать процесс заживления раны, который вызывает заранее определенное локальное смещение в кривизне роговицы. Наиболее широко известным из этих способов является радиальная кератотомия (RK), в которой делают несколько разрезов частичной толщины для индуцирования центрального уплощения роговицы. Однако этот способ является ограниченным вследствие отсутствия предсказуемых результатов и значительных флуктуаций в зрении, оба из которых связаны с характером и степенью заживления раны (Jester et al., Cornea (1992) 11: 191). Например, у большинства пациентов с RK наблюдали уменьшение периферического вспучивания ткани роговицы с ассоциированным регрессом в начальном улучшении зрения (McDonnel and Schanzlin, Arch.Ophtalmol. (1988), 106: 212). Раны в роговице также медленно заживают, и неполное заживление имеет тенденцию быть ассоциированным с нестабильностью остроты зрения (с флюктуациями в зрении с утра до вечера, а также со сдвигом остроты зрения, наблюдающимся на протяжении периода недель-месяцев). Это может быть причиной того, что 34% или более пациентов, которые имели радиальную кератотомию, жаловались на флюктуирующее (меняющееся) зрение спустя один год после хирургии (Waring et al., Amer. J. Ophthalmol. (1991) 111: 133). Кроме того, если ранение роговицы не заживляется полностью, может встречаться раскрывание раны, приводящее к эффекту дальнозоркости. До 30% пациентов, имеющих RKпроцедуру, подвержены сдвигам в сторону дальнозоркости, ассоциированным с раскрытием раны (Dietzet al., Ophthalmology (1986) 93: 1284). Регенерация роговицы после травмы является комплексной и не вполне понимаемой. Она включает в себя регенерацию трех тканей: эпителия, стромы и эндотелия. Считается, что три основных пути передачи сигналов координируют регенерацию ткани: один, опосредованный факторами роста (Baldwin, Н.С.and Marschall, Acta Ophthalmol. Scand., (2002) 80: 238-47), цитокинами (Ahmadi, A.J. and Jacobiec, F.A.,Int. Ophthalmol. Clinics, (2002) 42(3): 13-22) и хемокинами (Kurpakus-Wheater, M., et al., Biotech. Histochem. (1999) 74: 146-59); другой, опосредованный взаимодействиями клетка-матрикс (Tanaka, Т., et al.,Jpn. J. Ophthalmol., (1999) 43: 348-54); и другой, опосредованый щелевыми контактами клеток и семейством коннексинов, образующих каналы белков. Щелевые контакты (нексусы) являются структурами клеточных мембран, которые облегчают прямую коммуникацию клетка-клетка. Канал щелевого контакта образуется двумя коннексонами, каждый из которых состоит из шести субъединиц коннексинов. Каждый гексамерный коннексон стыкуется с коннексоном в противолежащей мембране с образованием единого щелевого контакта. Каналы щелевых контактов могут быть обнаружены по всему телу. Ткань, например роговичный эпителий, имеет шестьвосемь слоев клеток, но все еще экспрессирует каналы щелевых контактов в различных слоях с коннексином-43 в базальном слое и коннексином-26 от базального до среднего слоя крылатых клеток. В целом, коннексины являются семейством белков, обычно называемых в соответствии с их молекулярной массой или классифицируемых на филогенетической основе на подклассы альфа, бета и гамма. К настоящему времени были идентифицированы 20 изоформ для человека и 19 изоформ для мышей(Willecke, K. et al., Biol. Chem., (2002) 383, 725-37), что, возможно, свидетельствует о том, что каждый отличающийся белок коннексин может быть функционально специализирован. Различные типы тканей и клеток имеют характерные картины экспрессии белков коннексинов, и было показано, что такие ткани,как роговица, изменяют картину экспрессии белков-коннексинов после повреждения или трансплантации (Qui, С. et al., (2003) Current Biology, 13: 1967-1702; Brander et al., (2004) J. Invest. Dermatol. 122 (5): 1319-20). Процесс регенерации роговицы после травмы может приводить к потере прозрачности роговицы и,следовательно, влиять на результат рефракционной хирургии. Существующие способы обработки для поврежденной роговицы включают в себя трансплантацию роговицы или попытки использования роговичных клеток/тканей для ремоделирования. Однако послеоперационная травма роговицы и окружающей мягкой ткани после хирургических процедур, таких как, например, эксимерная лазерная фоторефрактивная кератэктомия, часто приводит к образованию рубцов вследствие гиперцеллюлярности (повышенного содержания клеток), связанной с модификацией внеклеточного матрикса, включающей в себя изменение паттернинга эпителиальных клеток, дифференцировки миофибробластов, стромального ремоделирования и эпителиальной гиперплазии в участке индуцированного лазером повреждения. При тяжелых повреждениях спинного мозга патологические изменения, которые происходят независимо от того, вызваны ли они рассечением, закрытой травмой или сдавливанием, имеют некоторые сходные признаки с послеоперационным образованием рубцов и ремоделированием ткани. В пределах 24-48 ч после повреждения это повреждение распространяется и значительно увеличивает размер пораженной зоны. В этом может принимать участие опосредованный щелевым контактом эффект свидетеля(Lin, J.H. et al., 1998, Nature Neurosci. 1: 431-432), при помощи которого каналы щелевого контакта распространяют волны нейротоксинов и кальция из участка повреждения к здоровой в остальном ткани. Это сопровождается характерным воспалительным опуханием. Участок повреждения в спинном мозгу заменяется полостью или рубцом из соединительной ткани, которые в каждом случае препятствуют регенерации аксонов (McDonald, J.W. et al., (September 1999) Scientific American, 55-63; Ramer, M.S. et al., SpinalCord. (2000) 38: 449-472; Schmidt, C.E. and Baier Leach, J., (2003) Ann. Rev. Biomed. Eng. 5: 293-347). Хотя был достигнут прогресс с некоторыми существующими терапевтическими способами, все еще остаются основные ограничения в отношении репарации спинного мозга, в том числе то, что само инвазивное вмешательство может дополнительно расширять повреждение и образование глиальных рубцов, препятствуя процессу заживления, и увеличивать риск дополнительной потери нервной функции (Raisman, G.J.Royal Soc. Med. 96: 259-261). Антисмысловую технологию использовали для модуляции экспрессии генов, участвующих в вирусных, грибковых и метаболических заболеваниях. В патенте США с номером 5166195 предложены олигонуклеотидные ингибиторы ВИЧ. В патенте США с номером 5004810 предложены олигомеры для гибридизации с мРНК вируса простого герпеса Vmw65 и ингибирования репликации. См. также WO 00/44409, выданный Becker et al., поданный 27 января 2000 г. и озаглавленный "Formulations ComprisingAntisense Nucleotides to Connexins", содержание которого включено тем самым путем отсылки в его полном объеме и который описывает применение антисмысловых (AS) олигодезоксинуклеотидов для понижающей регуляции экспрессии коннексина для лечения локального нейронного повреждения в головном мозгу, спинном мозгу или зрительном нерве, в стимуляции заживления ран и уменьшения образования рубцов ткани кожи после хирургии или ожогов. Однако остаются многочисленные трудности, которые требуется преодолеть. Часто бывает так, например, что понижающая регуляция продукта конкретного гена в типе клеток, не являющихся мишенью, может быть губительной. Дополнительные проблемы, которые должны быть преодолены, включают в себя короткий полупериод существования в теле такихODN (немодифицированных фосфодиэфирных олигомеров), которые имеют внутриклеточный полупериод существования только 20 мин вследствие деградации внутриклеточной нуклеазой (Wagner 1994,supra), и их стойкую и надежную доставку к тканям-мишеням. Таким образом, существует потребность, и имеются огромные потенциальные преимущества в развитии соединений, требуемых для описанных выше проблем. Такие соединения, родственные композиции и способы их применения описаны и заявлены здесь. Сущность изобретения Описанные и заявленные здесь изобретения имеют много признаков и вариантов осуществления, в том числе, но не только, признаки и варианты осуществления, представленные или описанные, или упоминаемые в этом разделе Сущность изобретения. Изобретения, описанные и заявленные здесь, не ограничиваются признаками или вариантами осуществления, идентифицированными в этом разделе Сущность изобретения, который включен только с целью иллюстрации, а не с целью ограничения. Здесь обеспечены соединения, применимые для конструирования ткани, в том числе антисмысловые соединения. Обеспечены также антисмысловые соединения и способы уменьшения повреждения ткани, связанного с офтальмологическими процедурами. Эти способы предусматривают, например, введение антисмыслового соединения в глаз субъекта в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина в глазу или в клетках, ассоциированных с глазом этого субъекта. Хотя предпочтительно ингибирование экспрессии белка коннексина, ожидается, что другие белки могут быть мишенями для модуляции этими соединениями, в том числе антисмысловыми соединениями, либо отдельно, либо в комбинации с антисмысловыми или другими соединениями, которые ингибируют экспрессию коннексинов человека. В некоторых вариантах осуществления офтальмологической процедурой является офтальмологическая хирургия, в том числе, но не только, эксимерная лазерная фоторефрактивная кератэктомия, удаление катаракты, трансплантация роговицы, хирургия для коррекции рефракции (преломления), радиальная кератотомия, фильтрующая хирургия глаукомы, кератопластика, эксимерная лазерная фоторефрактивная кератэктомия, трансплантация роговицы, хирургия для коррекции рефракции (преломления), иссечение неоплазии глазной поверхности, трансплантация конъюнктивы или амниотической оболочки,иссечение птеригия и пингвекулы, глазная пластическая хирургия, иссечение опухоли века, процедуры ремоделирования века для врожденных патологий, репарация эктропиона и энтропиона глазного века,хирургия по поводу страбизма (косоглазия) или любой проникающей травмы глаза. Обычно известна по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности для коннексинов, в которой желательно ингибирование экспрессии. Предпочтительно антисмысловое соединение нацелено на один или несколько специфических типов коннексинов. Специфические изотипы коннексинов, на которые могут быть нацелены антисмысловые соединения, включают в себя, без ограничения, коннексины 43, 37, 31.1 и 26. Предпочтительно, но необязательно, коннексины-мишени являются коннексинами человека. Коннексин (например, человека) может, например, иметь последовательность нуклеотидов, выбранную из SEQ ID NO:12-31. В некоторых вариантах осуществления антисмысловые соединения нацелены, по меньшей мере, на приблизительно 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин,имеющей последовательность нуклеотидов, выбранную из SEQ ID NO:12-31. В некоторых других вариантах осуществления второе антисмысловое соединение вводят субъекту(например, в глаз), причем один или несколько других антисмысловых соединений нацелены, по мень-3 015670 шей мере, на приблизительно 8 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин(например, человека), имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из SEQ IDNO:12-31. По меньшей мере, второе антисмысловое соединение может быть, например, нацелено на коннексин, другой, чем коннексин, на который нацелено первое антисмысловое соединение. Примеры типов антисмысловых соединений, которые могут быть использованы в различных аспектах данного изобретения, включают в себя антисмысловые олигонуклеотиды, антисмысловые полинуклеотиды, дезоксирибозимы, морфолиноолигонуклеотиды, dsRNA (двухцепочечные РНК), молекулыRNAi (интерферирующие РНК), молекулы ПНК, ДНКзимы и мутированные по 5'-концу малые ядерные РНК U1, аналоги вышеупомянутых молекул, а также другие соединения, обеспеченные здесь или известные в данной области, в том числе, но не только, например, неспецифические разобщители, такие как октанол, глицеретиновые кислоты и гептанол. В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловыми соединениями являются антисмысловые олигонуклеотиды, которые содержат природные нуклеотиды и немодифицированную межнуклеозидную связь. В других вариантах осуществления, например, антисмысловыми соединениями являются антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, в том числе антисмысловые олигонуклеотиды с фосфоротиоатной связью. Подходящие антисмысловые олигонуклеотиды включают в себя также, например, олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере одну модифицированную сахарную часть молекулы. Подходящие антисмысловые соединения включают в себя также, например, олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере одно модифицированное нуклеотидное основание. В некоторых вариантах осуществления обеспеченные здесь антисмысловые соединения вводят в комбинации с другим соединением, например, соединением, полезным для уменьшения повреждения ткани, уменьшения воспаления, стимуляции заживления или некоторой другой желаемой активности. В другом аспекте данное изобретение включает в себя способы лечения субъекта (например, пациента) введением антисмысловых соединений этому субъекту. В некоторых вариантах осуществления обеспеченные здесь антисмысловые соединения вводят путем локального или местного введения. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть также введены системно или внутриглазной инъекцией. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены субъекту в заранее определенное время, например, относительно образования раны, так, как это имеет место в офтальмологической процедуре (например, хирургической). Например, антисмысловые соединения могут быть введены перед офтальмологической процедурой, во время офтальмологической процедуры или после офтальмологической процедуры. Например, антисмысловые соединения могут быть введены субъекту в пределах минут или часов до или после выполнения офтальмологической процедуры. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение вводят после выполнения офтальмологической процедуры и,например, антисмысловое соединение вводят в пределах приблизительно 4 ч от этой процедуры, в пределах приблизительно 3 ч от этой процедуры и, более часто, в пределах приблизительно 2 ч от офтальмологической процедуры или в пределах приблизительно 1 ч от офтальмологической процедуры. В другом аспекте обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены в способах для выполнения конструирования ткани. Например, обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены в сочетании со способом, который увеличивает толщину ткани роговицы в субъекте. Такой способ может быть связан или может не быть связан с офтальмологической процедурой (например, хирургией). В качестве примера, обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены в сочетании со способом, который стимулирует заживление или предотвращает повреждение ткани в клетках, ассоциированных с роговицей этого субъекта (например, клетках роговицы). В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение уменьшает образование рубцов. В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение уменьшает воспаление. В некоторых вариантах осуществления, например антисмысловое соединение стимулирует заживление ран. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение используют вместе с хирургической процедурой имплантации. В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение нацеливают на коннексин 43 и вводят для регуляции деления и роста эпителиальных базальных клеток. В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение нацеливают на коннексин 31.1 и вводят для регуляции кератинизации наружного слоя. Согласно некоторым вариантам осуществления, например, офтальмологической процедурой является удаление катаракты. В других вариантах осуществления, например, этой офтальмологической процедурой является трансплантация роговицы. В других вариантах осуществления, например, этой офтальмологической процедурой является хирургия для коррекции рефракции. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является радиальная кератотомия. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является фильтрующая хирургия глаукомы. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является ис-4 015670 сечение неоплазмии глазной поверхности. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является трансплантация конъюнктивы или амниотической оболочки. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является иссечение птеригия или пингвекулы. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является глазная пластическая хирургия. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является иссечение опухоли века. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является реконструктивная процедура века для врожденных патологий. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является репарация эктропиона и энтропиона глазного века. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является хирургия страбизма (косоглазия) (глазной мышцы). В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является проникающая глазная травма. В некоторых дополнительных вариантах осуществления соединения и композиции используют для стимуляции заживления или для предотвращения повреждения ткани в клетках, связанных с роговицей,где этими клетками, связанньми с роговицей, могут быть любые клетки в глазу, в том числе, но не только, роговичные клетки. Обеспеченные здесь агенты, в том числе антисмысловые соединения, могут увеличивать толщину ткани роговицы в субъекте. В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение используют в комбинации с другим соединением, применимым для уменьшения повреждения ткани или стимуляции заживления. Например, антисмысловые соединения могут вводиться совместно с фактором роста, цитокином или т.п. В другом аспекте, например, обеспечена фармацевтическая композиция для уменьшения повреждения ткани, связанного с офтальмологической хирургией. Эту фармацевтическую композицию готовят подходящим образом, например, для местного или локального введения в глаз субъекта, и эта композиция содержит антисмысловое соединение, присутствующее в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина человека в клетках, ассоциированных с глазом этого субъекта. Это антисмысловое соединение, например, нацелено предпочтительно по меньшей мере на 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин (например, человека), имеющей последовательность нуклеотидов, выбранную из SEQ ID NO:12-31. В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловые соединения находятся в форме фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель или переносчик, и этот агент или антисмысловое соединение присутствует в количестве, эффективном для стимуляции заживления раны в субъекте. В некоторых вариантах осуществления эти фармацевтические композиции могут быть, например, в форме, подходящей для местного введения, в том числе в форме, подходящей для местного или локального введения в глаз субъекта. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, например, эти композиции и готовые формы могут быть в форме геля, крема или любой из форм, описанных здесь или известных в данной области, независимо от того, существуют ли они в настоящее время или будут созданы в будущем. В другом аспекте данное изобретение включает в себя фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения. В одном варианте осуществления, например, обеспечена фармацевтическая композиция для уменьшения повреждения ткани, связанного с офтальмологической процедурой (например, хирургией), так что эту фармацевтическую композицию готовят для местного или локального введения в глаз субъекта, и она содержит антисмысловое соединение, присутствующее в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина человека в клетках, связанных с глазом этого субъекта. В некоторых вариантах осуществления, например, это антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин(например, человека), имеющей последовательность нуклеотидов, выбранную из SEQ ID NO:12-31. В некоторых вариантах осуществления, например, эта фармацевтическая композиция включает в себя фармацевтически приемлемый носитель, содержащий Плюроник (кислоту или гель). В одном варианте осуществления она включает в себя, например, до приблизительно 30% Плюроника в виде кислоты в забуференном фосфатом солевом растворе. В другом аспекте обеспечены способы конструирования антисмысловых олигонуклеотидов, которые нацелены на один или несколько коннексинов. Этот способ может включать в себя оптимизацию выбранных параметров, таких как термостабильность, аффинность и специфичность конкретного олигонуклеотида в отношении выбранной мишени. Этот способ может быть использован для отбора и разработки олигонуклеотидов, содержащих одну или несколько конкретных желаемых полинуклеотидных последовательностей. Испытание антисмысловых олигонуклеотидов может выполняться в сочетании со способом, например, на их способность расщеплять мРНК или блокировать трансляцию белка коннексина. Описание фигур Фиг. 1 показывает конфокальные микроскопические изображения in vivo роговицы спустя 12 ч после фоторефрактивной кетатэктомии в контрольных и обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами глазах.-5 015670 Фиг. 2 показывает гистологическое исследование ремоделирования роговицы в контрольных (2 А,2 В, 2 С) и обработанных антисмысловым олигодезоксинуклеотидом роговицах крыс (2D, 2 Е) спустя 24 ч после эксимерного лазерного фотоиссечения. Фиг. 3 обеспечивает микрофотографические изображения, показывающие экспрессию белка коннексина 43 в контрольной (3 А, 3 В, 3C) и обработанных антисмысловым олигонуклеотидом роговицах(3D, 3 Е, 3F) спустя 24 ч после эксимерного лазерного иссечения. Эти результаты демонстрируют, что уровни белка коннексина 43 уменьшаются после обработки ODN против коннексина 43 и это приводит к меньшей степени рекрутинга клеток в строме. Фиг. 4 показывает мечение миофибробласта спустя 1 неделю после хирургии с использованием антител против альфа-актина гладких мышц. Фиг. 4 А, 4 В и 4 С являются контролями, и 4D, 4 Е и 4F являются обработанными антисмысловым соединением роговицами. Фиг. 5 показывает мечение ламинином-1 контрольных (5 А, 5 В) и обработанных антисмысловым олигонуклеотидом против коннексина 43 роговиц спустя 24 ч (5 А -5D) и 48 ч (5 Е -5 Н) после фоторефрактивной кератэктомии. При 24 ч контроля имели небольшое и/или неравномерное отложение ламинина на краю иссеченной зоны (5 А) и более центрально (5 В), тогда как обработанные антисмысловым олигонуклеотидом роговицы показали более регулярное отложение ламинина на обоих из этих участков (5 С,5D). При 48 ч контроля все еще не имеют непрерывного отложения ламинина (5 Е -край иссеченной зоны; фиг. 5F - центральное положение), и отложение было очень неравномерным (5 Е). В противоположность этому, обработанные ODN роговицы имели непрерывный и относительно ровный базальный слой на краю раны (5G) и в центре (5H). Фиг. 6 показывает схематическую диаграмму количественного определения нерегулярности ламинина-1. Фиг. 7 показывает иммуногистохимическое мечение для коннексинов 26 и 43 в контрольных культурах (7 А) и после трех обработок олигодезоксинуклеотидами против коннексина 43 на протяжении 24 часового периода (7 В) и после обработки специфическим в отношении коннексина 31.1 антисмысловым соединением (7 С, 7D). Фиг. 8 показывает сегменты спинного мозга из детенышей крыс P7 спустя 24 ч после помещения в культуру. Контрольный сегмент (1) является распухшим (стрелки), с тканью, выступающей из концов разреза. Пунктирные линии отмечают начальные разрезы. Гистологическое исследование показывает,что клетки являются вакуолизированными и отечными. В день 5 эти сегменты имеют активированную микроглию повсюду и несколько выживших нейронов. В противоположность этому обработанный антисмысловым соединением сегмент (2) имеет значимо уменьшенное опухание в сравнении с контролями(р 0,001) с минимальным отеком и минимальной вакуолизацией. Даже после 20 дней в культуре нейроны в сером веществе остаются жизнеспособными и имеют активированную микроглию, ограниченную наружными краями. Фиг. 9 показывает нейроны из обработанного контролем сегмента (9 А) и обработанного антисмысловым соединением в отношении коннексина 43 сегмента (9 В). Нейроны в контрольном сегменте являются вакуолизированными и отечными, и окружающая ткань разрушена, но нейроны в обработанном сегменте кажутся здоровыми и жизнеспособными. Фиг. 10 иллюстрирует МАР-2-иммуномечение вблизи концов культивируемых сегментов спинного мозга спустя пять дней после помещения в культуру. Контрольные сегменты имеют небольшое количество жизнеспособных нейронов и низкое МАР-2-мечение (16% обнаруживают какую-либо МАР-2-метку)(10 А), тогда как 66% обработанных сегментов имеют зоны экспрессии МАР-2 на сторонах разрезов, экспонированных в среду и/или смежных с остальным материалом белого вещества. Фиг. 11 иллюстрирует, что дезоксирибозимы селективно расщепляют специфические районы мРНК-мишени коннексина-43 in vitro. мРНК 2,4 т.п.н. крысы (11 А) и мРНК 1,2 т.п.н. коннексина-43 мыши (11 В) транскрибировали in vitro из плазмиды и инкубировали с различными дезоксирибозимами в течение 1 ч. Район 896-953 крысиной мРНК (11 А) был неубедительным, так как дезоксирибозимы не были сконструированы для соответствующего района в мыши. Расщепление дезоксирибозимами района 367-466 в мышиной мРНК не согласуется с результатами из мРНК крысиного коннексина-43, возможно,вследствие присутствия 200 п.н. 5'-нетранслируемого района в крысиной мРНК. Дефектные контрольные дезоксирибозимы с единственной точковой мутацией, df605 и df783, показали, что такие расщепления были специфическими. Некоторый неспецифический ошибочный прайминг дезоксирибозимами против мышиной мРНК наблюдали в случае мышиных dz1007 и dz1028. В целом, дезоксирибозимы, нацеленные на районы нуклеотидов 526-622, 783-885 и 1007-1076, обнаруживали значимое расщепление в мРНК как крысы, так и мыши. Фиг. 12 показывает, что дезоксирибозимы селективно расщепляют специфические районы мРНКмишени коннексина-26 in vitro. мРНК 0,7 т.п.н. крысы (12 А) и мРНК коннексина-43 мыши (12 В) транскрибировали in vitro из плазмиды и инкубировали с различными дезоксирибозимами в течение 1 ч. Результаты расщепления показывают, что мРНК коннексина-26 грызунов имеет, по меньшей мере, два района, на которые нацелены дезоксирибозимы, в районах нуклеотидов 318-379 и 493-567. Дефектные контрольные дезоксирибозимы с единственной точковой мутацией, df351 и df379, показали, что такие-6 015670 расщепления были специфическими. Фиг. 13 показывает проникновение и стабильность антисмыслового олигомера в культивируемых роговицах в течение до одного часа. Су 3-меченые олигомеры показывают пятнистое ядерное и цитоплазматическое мечение спустя один час после доставки с использованием геля Плюроника (13 А). Скорость видимого проникновения Су 3 была 10-15 мкм спустя один час в роговичном эпителии (13 В).Taqman-меченые олигомерные зонды использовали для измерения стабильности антисмысловых олигомеров внутри эпителиальных клеток с использованием Лямбда-сканирования, причем каждая панель показывает спектр испускания света 5 нм в направлении красного цвета (13 В). Интактный Taqman-зонд показывает резонансный перенос энергии флуоресценции с красным флуоресцентным светом TAMRA,представленным на шкале уровней серого цвета (нейтральной) (13D), тогда как продукты распада представлены в виде зеленой флуоресценции, как и ожидалось от FAM (также показанные на шкале уровней серого цвета (13 С. Эффективная концентрация антисмыслового олигомера в клетках могла бы быть более низкой, чем эффективная концентрация, которая может быть детектирована флуоресцентным способом. Фиг. 14 иллюстрирует эффекты различных антисмысловых олигомеров на экспрессию белка коннексина-43 (светлый, шкала уровней серого цвета) и белка коннексина-26 (темный, шкала уровней серого цвета), которые были показаны расщеплением in vitro мРНК дезоксирибозимом. Фиг. 4 А показывает нормальную экспрессию белка коннексина-43 (светлый, шкала уровней серого цвета) в базальных клетках и экспрессию белка коннексина-26 (темный, шкала уровней серого цвета) в базальных - промежуточных клетках обработанного гелем Плюроника роговичного эпителия. As 14 (14 В), as769 (14D), as892(14F) (все три не обнаруживающие расщепления дезоксирибозимом in vitro) и смысловые контрольные олигомеры DB1 (14 Н) не влияли на экспрессию обоих коннексинов в культурах ex vivo. as605 (14C),as783 (14E) и DB1 (14G) (все три обнаруживающие положительный эффект in vitro расщепления дезоксирибозимом) обнаруживали только специфическое снижение коннексина-43 в эпителии обработанных роговиц. Фиг. 15 показывает, что антисмысловые олигомеры коннексина-43 селективно уменьшают экспрессию белков коннексина-43 в роговицах крыс. Каждое пятно представляет единственную роговицу с различными обработками. Сплошное пятно (окрашенное в черный цвет, DB1, as605, as783, as885, as953 иas1076) показало в среднем уменьшение 36-85% в экспрессии коннексина-43 в сравнении с окрашенными в белый цвет пятнами (DB1 смысловой олигомер, as14, as769 и as892). Все антисмысловые олигомеры, которые согласно способу тройственного предсказания дезоксирибозима имели низкий эффект или не имели эффекта, обнаруживали в среднем 85-134% нормальной экспрессии коннексина-43. Все эксперименты нормализовали с использованием средней плотности коннексина-43 при обработке DB1, и в результате два отрицательных олигомера (as769 и as892) показали более высокую плотность коннексина 43, чем контрольная обработка смысловым олигомером DB1. Фиг. 16 иллюстрирует сравнение уровней мРНК коннексина-43 в роговицах крыс, обработанных антисмысловыми или смысловыми олигомерами, оцениваемых с использованием ПЦР реального времени. Этот уровень выражали в виде процента обработанной только гелем Плюроника роговицы. Три антисмысловых олигодезоксинуклеотида, которые были предсказаны анализом in vitro как функциональные,DB1 As, As605 и As783 (черные столбцы), уменьшали экспрессию мРНК коннексина-43 до 46,8%, 44% и 25% нормальных (только гель, белые столбцы) уровней, соответственно (р 0,001). Не наблюдали уменьшения для смыслового контрольного олигомера DB1 (106%) (белый столбец, DB1 смысловой олигомер). As769, который не обнаруживал какого-либо расщепления мРНК Сх 43 в способе тройственного предсказания дезоксирибозима in vitro, служил в качестве отрицательного контроля (148%) (белый столбец, As769). Фиг. 17 иллюстрирует сравнение уровней мРНК коннексина-26 в роговицах крыс, обработанных антисмысловыми или смысловыми (контрольными) олигомерами, оцениваемых с использованием ПЦР реального времени. Этот уровень выражали в виде процента обработанной только гелем Плюроника роговицы (белый столбец, только гель). As330 и As375 уменьшали экспрессию мРНК Сх 26 до 33% и 71%,соответственно (р 0,001). Не наблюдали уменьшения для смыслового олигомера Rv330 (109%)(Rv330, белый столбец). Подробное описание Практика данных изобретений может использовать различные общепринятые способы молекулярной биологии (в том числе рекомбинантные способы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии,химии нуклеиновых кислот и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации в данной области. Такие способы полностью объяснены в литературе и включают в себя, но не ограничиваются ими,например, Molecular Cloning: A Laboratoty Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) и Molecular Cloning: A Laboratoty Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), вместе и индивидуально называемые здесь Sambrook"; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed.,1987); Handbook of Experimental Immunology (D.M. WeirC.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors forHarlow and Lane), Beaucage et al., eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John WileySons, Inc.,New York, 2000); и Agrawal, ed., Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties Humana Press Inc., New Jersey, 1993). Определения Перед дальнейшим описанием данных изобретений в общем и в виде различных неограничивающих конкретных вариантов осуществления приводятся некоторые термины, используемые в контексте описания данного изобретения. Если нет других указаний, следующие термины имеют следующие значения при применении их здесь и в прилагаемой формуле изобретения. Термины, которые не определены ниже или в другом месте в этом описании, должны иметь их общепринятое в данной области значение. Антисмысловые соединения включают в себя различные типы молекул, которые действуют ингибирующим образом на экспрессию, трансляцию или функцию гена, в том числе типы молекул, которые действуют последовательность-специфическим нацеливанием на мРНК для терапевтических применений. Таким образом, антисмысловые соединения включают в себя, например, основные молекулы сайленсинга генов на основе нуклеиновых кислот, такие как, например, химически модифицированные олигодезоксирибонуклеиновые кислоты (ODN), рибозимы и siRNA (короткие интерферирующие РНК)(Scherer, L.J. and Rossi, J.J. Nature Biotechnol. 21: 1457-1465 (2003). Антисмысловые соединения могут также включать в себя антисмысловые молекулы, такие как, например, пептиднуклеиновые кислотыNatl. Acad. Sci. USA 94, 4262-4266 (1997), и недавно разработанные короткие ядерные РНК, мутированные на 5'-конце, U1 (Fortes, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 8264-8269. Термин антисмысловые последовательности относится к полинуклеотидам, имеющим активность антисмыслового соединения, и включает в себя, но не ограничивается ими, последовательности, комплементарные или частично комплементарные, например, последовательности РНК. Таким образом, антисмысловые последовательности включают в себя, например, последовательности нуклеиновых кислот,которые связываются с мРНК или их частями, блокируя транскрипцию мРНК рибосомами. Антисмысловые способы обычно хорошо известны в данной области. См., например, РСТ publication WO94/12633 иEckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991); Antisense Research and Applications (1993, CRC Press). В данном контексте информационная РНК включает в себя не только информацию последовательности для кодирования белка с использованием трехбуквенного генетического кода, но также ассоциированные рибонуклеотидные последовательности, которые образуют 5'-нетранслируемый район. 3'нетранслируемый район и 5'-кэп-район, а также рибонуклеотидные последовательности, которые образуют различные вторичные структуры. В соответствии с данным изобретением могут быть образованы олигонуклеотиды, которые нацелены полностью или частично на любую из этих последовательностей. Обычно нуклеиновые кислоты (в том числе олигонуклеотиды) могут быть описаны как ДНКподобные (т.е. имеющие 2'-дезоксисахара и обычно нуклеотиды Т, а не U) или "РНК-подобные" (т.е. имеющие 2'-гидроксил или 2'-модифицированные сахара и обычно нуклеотиды Т, а не U). Спирали нуклеиновых кислот могут принимать более чем один тип структуры, наиболее часто А- и В-формы. Обычно считают, что олигонуклеотиды, которые имеют структуру, подобную В-форме, являются ДНКподобными, а олигонуклеотиды, которые имеют структуру, подобную А-форме, являются РНКподобными. Термин комплементарный обычно относится к природному связыванию полинуклеотидов при пермиссивных условиях соли и температуры посредством спаривания оснований. Например, последовательность A-G-T связывается с комплементарной последовательностью Т-С-А. Комплементарность между одноцепочечными молекулами может быть "частичной", так что только некоторые части нуклеиновых кислот связываются, или может быть "полной", так что существует полная комплементарность между одноцепочечными молекулами. Степень комплементарности между молекулами нуклеиновых кислот имеет значимые влияния на эффективность и прочность гибридизации между ними. "Гибридизуемые" и "комплементарные" являются терминами, которые используют для указания достаточной степени комплементарности, так что происходит стабильное связывание между ДНК- или РНК-мишенью и олигонуклеотидом. Понятно, что олигонуклеотид не должен быть обязательно на 100% комплементар-8 015670 ным его последовательности нуклеиновой кислоты-мишени для того, чтобы быть гибридизуемым, и понятно также, что это связывание может быть мишень-специфическим, или олигонуклеотид может связываться с другими молекулами, не являющимися мишенями, пока это неспецифическое связывание не мешает значимо или нежелательным образом терапевтической или другой цели. Олигонуклеотид используют для препятствования нормальной функции молекулы-мишени для индуцирования потери или уменьшения активности, и, предпочтительно, существует достаточная степень комплементарности для избегания неспецифического или нежелательного связывания этого олигонуклеотида с последовательностями, не являющимися мишенями, в условиях, в которых является желательным специфическое связывание, или, в случае анализов in vitro, в условиях, в которых проводят эти анализы. В контексте некоторых вариантов данного изобретения абсолютная комплементарность не требуется. Полинуклеотиды, которые имеют достаточную комплементарность для образования дуплекса, имеющего температуру плавления, большую, чем 20, 30 или 40 С при физиологических условиях, обычно являются предпочтительными. Нарушением является любое состояние, которое получило бы пользу от обработки молекулой или композицией данного изобретения, в том числе состояния, описанные и заявленные здесь. Нарушение включает в себя хронические и острые нарушения или заболевания, в том числе патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к рассматриваемому нарушению. Нацеливание олигонуклеотида на выбранную нуклеиновую кислоту-мишень может быть многоступенчатым процессом. Этот процесс может начинаться идентификацией последовательности нуклеиновой кислоты, функция которой должна быть модулирована. Это может быть, например, клеточный ген(или мРНК, полученная из этого гена), экспрессия которого ассоциирована с конкретным состоянием заболевания, или чужеродная нуклеиновая кислота (РНК или ДНК) из инфекционного агента. Процесс нацеливания может включать в себя также определение сайта или сайтов в последовательности нуклеиновой кислоты для взаимодействия с олигонуклеотидом, происходящего таким образом, что будет происходить желаемый эффект, т.е. ингибирование экспрессии белка, уменьшенное детектирование белка или другая модуляция активности. После идентификации сайта-мишени или сайтов-мишеней выбирают антисмысловые соединения (например, олигонуклеотиды), которые являются достаточно или желательным образом комплементарными этой мишени, т.е. гибридизуются в достаточной степени и с адекватной или иным образом желаемой специфичностью, с обеспечением желаемой модуляции. В данном изобретении мишени включают в себя молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие один или несколько коннексинов. Процесс нацеливания может включать в себя также определение сайта или сайтов в последовательности нуклеиновой кислоты для антисмыслового взаимодействия, происходящего таким образом,что будет получен желаемый эффект. Предпочтительным внутригенным сайтом является, например,район, включающий в себя кодон инициации или терминации трансляции открытой рамки считывания(ORF) этого гена. Кодоном инициации трансляции является обычно 5'-AUG (в транскрибируемых мРНКмолекулах; 5'-ATG в соответствующей ДНК-молекуле), и он может называться "кодоном AUG", стартовым кодоном или стартовым кодоном AUG. Небольшое число генов имеют кодон инициации трансляции, имеющий РНК-последовательность 5'-GUG, 5'-UUG или 5'-CUG, и было показано, что 5'-AUA, 5'ACG и 5'-CUG функционируют in vivo. Таким образом, термины кодон инициации трансляции и стартовый кодон могут включать в себя многочисленные последовательности кодонов, даже хотя инициаторной аминокислотой в каждом случае является обычно метионин (в эукариотах) или формилметионин(в прокариотах). В данной области известно также, что эукариотические и прокариотические гены могут иметь два или более альтернативных стартовых кодонов, любой из которых может быть предпочтительно используемым для инициации трансляции в конкретном типе клеток или в конкретной ткани, или при конкретном наборе условий. Термин олигонуклеотид включает в себя олигомер или полимер нуклеотидных или нуклеозидных мономеров, состоящий из природно встречающихся оснований, сахаров и межсахарных (скелетных) связей. Термин олигонуклеотид включает в себя также олигомеры или полимеры, содержащие не встречающиеся в природе мономеры или их части, которые функционируют сходным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто являются более предпочтительными, чем природные формы вследствие таких свойств, как, например, увеличенное клеточное поглощение, увеличенная стабильность в присутствии нуклеаз или повышенная аффинность в отношении мишени. Было показано, что ряд нуклеотидных и нуклеозидных модификаций делает олигонуклеотид, в который они включены, более устойчивым к расщеплению нуклеазами, чем природный олигодезоксинуклеотид (ODN). Устойчивость к нуклеазам измеряют рутинным образом инкубированием олигонуклеотидов с клеточными экстрактами или растворами выделенных нуклеаз и измерением степени оставшегося интактного олигонуклеотида во времени, обычно с использованием гель-электрофореза. Олигонуклеотиды, которые были модифицированы для увеличения их устойчивости к нуклеазам, могут выживать в интактном виде в течение более продолжительного времени, чем немодифицированные олигонуклеотиды. Было показано, что ряд модификаций увеличивает связывание (аффинность) олигонуклеотида в отношении его мишени. Аффинность олигонуклеотида в отношении его мишени определяют рутинным образом измерени-9 015670 ем Tm (температуры плавления) пары олигонуклеотид/мишень, которая является температурой, при которой олигонуклеотид и мишень диссоциируются друг от друга. Диссоциацию детектируют спектрофотометрически. Чем больше Tm, тем большую аффинность имеет этот олигонуклеотид в отношении мишени. В некоторых случаях модификации олигонуклеотида, которые увеличивают аффинность связывания мишени, способны также увеличивать устойчивость к нуклеазам. Термин "полинуклеотид" обозначает множество нуклеотидов. Таким образом, термины "нуклеотидная последовательность" или "нуклеиновая кислота", или "полинуклеотид", или "олигонуклеотид",или "олигодезоксинуклеотид", - все относятся к гетерополимеру нуклеотидов или последовательности этих нуклеотидов. Эти выражения относятся также к ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечнными и могут представлять смысловую или антисмысловую цепь, к пептиднуклеиновой кислоте (ПНК) или к любому ДНК-подобному или РНК-подобному материалу. Полинуклеотид, который кодирует коннексин, фрагмент коннексина или вариант коннексина,включает в себя полинуклеотид, кодирующий зрелую форму коннексина, обнаруживаемую в природе; зрелую форму коннексина, обнаруживаемую в природе, и дополнительную кодирующую последовательность, например лидерную или сигнальную последовательность или последовательность пробелка; либо предыдущее и некодирующие последовательности (например, интроны или некодирующую последовательность 5'- и/или 3' (слева или справа) от кодирующей последовательности для зрелой формы полипептида, обнаруживаемого в природе); фрагменты зрелой формы коннексина, обнаруживаемой в природе; и варианты зрелой формы коннексина, обнаруживаемой в природе. Таким образом, "кодирующий коннексин полинуклеотид" и т.п. включает в себя полинуклеотиды, которые включают в себя только кодирующую последовательность для желаемого коннексина, фрагмента или варианта, а также полинуклеотид,который включает в себя дополнительные кодирующие и/или некодирующие последовательности. Термины "пептидомиметик" и "миметик" относятся к синтетическому химическому соединению,которое может иметь, по существу, те же самые структурные и функциональные характеристики антисмысловых полипептидов, обеспеченных здесь, и которые имитируют коннексин-специфическую ингибиторную активность, по меньшей мере, частично и до некоторой степени. Аналоги пептидов обычно используют в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарственных средств со свойствами, аналогичными свойствам пептида-шаблона. Эти типы непептидного соединения называютJun; 12(6): 213-6; Kieber-Emmons T, et al.; Curr. Opin Biotechnol. 1997 Aug; 8(4): 435-41). Миметики пептидов, которые являются структурно сходными с терапевтически применимыми пептидами, могут быть использованы для получения эквивалентного или усиленного терапевтического или профилактического эффекта. Обычно пептидомиметики являются структурно сходными с полипептидом-шаблоном (т.е. полипептидом, который имеет биологическую или фармакологическую активность), таким как антисмысловой полинуклеотид, но имеют одну или более пептидных связей, необязательно замененных связью,выбранной из группы, состоящей, например, из -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -СН=СН- (цис и транс),-СОСН 2-, -СН(ОН)СН 2- и -CH2SO-. Миметик может либо быть полностью составлен из синтетических,неприродных аналогов аминокислот, либо является химерной молекулой частично природных аминокислот пептидов и частично неприродных аналогов аминокислот. Миметик может также включать в себя любое количество консервативных замен природных аминокислот, пока такие замены также, по существу, не изменяют структуру и/или активность миметика. Например, композиция миметика находится в объеме данного изобретения, если она способна отрицательно регулировать биологические активности белков коннексинов, таких как, например, опосредованную щелевым контактом коммуникацию клеткаклетка. Термин "композиция" включает в себя продукт, содержащий один или более ингредиентов. Термины "модулятор" и "модуляция" активности коннексина, используемые в данном контексте в их различных формах, обозначает ингибирование полностью или частично экспрессии или активности коннексина. Такие модуляторы включают в себя малые молекулы, агонисты и антагонисты функции или экспрессии коннексина, антисмысловые молекулы, рибозимы, триплексные молекулы и полинуклеотиды интерференции РНК, способы генотерапии и другие. Фраза "процент (%) идентичности" относится к проценту сходства последовательности, обнаруженному в сравнении двух или более последовательностей. Процентная идентичность может быть определена электронными способами с использованием любого подходящего программного обеспечения. Подобным образом "сходство" между двумя последовательностями (или одной или нескольких частей любой или обеих их них) определяют сравнением нуклеотидной последовательности одной последовательности с нуклеотидной последовательностью другой последовательности. Фармацевтически приемлемые обозначает, например, носитель, разбавитель или эксципиент, который является совместимым с другими ингредиентами композиции и пригоден для введения его реципиенту.- 10015670 Обычно термин белок относится к любому полимеру двух или более индивидуальных аминокислот (независимо от того, являются или не являются они природно встречающимися), связанных пептидными связями, которые образуются, когда атом углерода карбоксила группы карбоновой кислоты, связанный с альфа-углеродом одной аминокислоты (или аминокислотного остатка), становится ковалентно связанным с атомом азота амино аминогруппы, связанным с альфа-углеродом соседней аминокислоты. Эти пептидные связи и атомы, составляющие их (т.е. атомы альфа-углерода, атомы углерода карбоксила(и их заместители атомы кислорода), и атомы азота амино (и их заместители атомы водорода) образуют полипептидный скелет белка. Кроме того, в данном контексте термин "белок" включает в себя термины "полипептид" и "пептид" (которые, иногда, могут быть использованы здесь взаимозаменяемо). Подобным образом фрагменты, аналоги, производные и варианты белков могут называться здесь "белками" и будут считаться "белками", если нет других указаний. Термин "фрагмент белка" относится к полипептиду, содержащему меньшее число аминокислотных остатков, чем число аминокислотных остатков данного белка. Как будет понятно, "фрагмент белка" может быть формой белка, укороченной на аминоконце, карбоксиконце и/или внутри (например, природным сплайсингом) и может быть также вариантом или производным. "Домен" белка является также фрагментом и содержит аминокислотные остатки белка, требующиеся для придания биохимической активности, соответствующей природно встречающемуся белку. Укороченные молекулы, которые являются линейными биологическими полимерами, такими как молекулы нуклеиновых кислот или полипептиды, могут иметь одну или более делеций из любого конца этой молекулы и/или одну или несколько делеций из неконцевого района этой молекулы, где такими делециями могут быть делеций из приблизительно 1-1500 смежных нуклеотидных или аминокислотных остатков, предпочтительно приблизительно 1-500 смежных нуклеотидных или аминокислотных остатков и более предпочтительно приблизительно 1-300 смежных нуклеотидных или аминокислотных остатков,в том числе делеций приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31-40, 41-50, 51-74, 75-100, 101-150, 151-200, 201-250 или 251-299 смежных нуклеотидных или аминокислотных остатков. Термин строгие условия относится к условиям, которые делают возможной гибридизацию между полинуклеотидами. Строгие условия могут определяться концентрацией соли, концентрацией органического растворителя (например, формамида), температурой и другими условиями, хорошо известными в данной области. Строгость может быть увеличена уменьшением концентрации соли, увеличением концентрации органических растворителей (например, формамида) или повышением температуры гибридизации. Например, строгая концентрация соли будет обычно менее чем приблизительно 750 мМ NaCl и 75 мМ тринатриевой соли цитрата, предпочтительно менее чем приблизительно 500 мМ NaCl и 50 мМ тринатриевой соли цитрата и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 250 мМ NaCl и 25 мМ тринатриевой соли цитрата. Гибридизация низкой строгости может быть получена в отсутствие органического растворителя, например, формамида, тогда как гибридизация высокой строгости может быть получена в присутствии органического растворителя (например, по меньшей мере приблизительно 35% формамида, наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 50% формамида). Строгие условия температуры будут обычно включать в себя температуры по меньшей мере приблизительно 30 С,более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 37 С и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 42 С. Варьирование дополнительных параметров, например, времени гибридизации, концентрации детергента, например, додецилсульфата натрия (ДСН) и включение или исключение ДНК-носителя, хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области. Различные уровни строгости выполняются комбинированием этих различных условий, как это необходимо, и они находятся в пределах квалификации в данной области. Строгие условия гибридизации могут определяться также условиями в диапазоне приблизительно 5 С - приблизительно 20 С ниже температуры плавления (Tm) последовательности-мишени и зондом с точной или почти точной комплементарностью с мишенью. В данном контексте температура плавления является температурой, при которой популяция двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты становится наполовину диссоциированной до отдельных цепей. Способы расчета Tm нуклеиновых кислот хорошо известны в данной области (см., например, Berger andSpring Harbor Laboratory). Как указано стандартными ссылками, простая оценка величины Tm может быть рассчитана с использованием уравнения: Tm = 81,5 + 0,41 (% G + С), когда нуклеиновая кислота находится в водном растворе при 1 М NaCl (см., например, Anderson and Young, "Quantitative Filter Hybridization"in Nucleic Acid Hybridization (1985. На температуру плавления гибрида (и, следовательно, условия для строгой гибридизации) влияют различные факторы, такие как длина и природа (ДНК, РНК, состав оснований) зонда и природа мишени (ДНК, РНК, состав оснований, присутствует ли она в растворе или иммобилизована и т.п.), и концентрация солей и других компонентов (например, присутствие или отсутствие формамида, сульфата декстрана, полиэтиленгликоля). Влияния этих факторов хорошо известны и обсуждены в стандартных ссылках в данной области, см., например, Sambrook, supra, и Ausubel, supra. Обычно строгими условиями гибридизации являются концентрации солей, менее чем приблизительно- 11015670 1,0 М ион натрия, обычно приблизительно 0,01-1,0 М ион натрия при рН 7,0-8,3, и температуры по меньшей мере приблизительно 30 С для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60 С для длинных зондов (например, больших, чем 50 нуклеотидов). Как отмечалось, строгие условия могут быть также достигнуты добавлением дестабилизирующих агентов, таких как формамид, и в этом случае могут использоваться более низкие температуры. В данном изобретении полинуклеотидном может быть полинуклеотид, который гибридизуется с мРНК коннексина при условиях средней-высокой строгости, такой как 0,03 М хлорид натрия и 0,03 М цитрат натрия при приблизительно 50 С, приблизительно 60 С. Термин "терапевтически эффективное количество" обозначает количество рассматриваемого соединения, которое будет индуцировать желаемую реакцию, например, биологическую или медицинскую реакцию ткани, системы, животного или человека, которая является желательной, например, для исследователя, ветеринара, медицинского доктора или другого клинициста. Термин "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают в себя субъектов, которые уже имеют нарушение, а также субъектов, у которых необходимо предупредить это нарушение. Термин вектор относится к носителю для амплификации, репликации и/или экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в форме плазмиды, фага, вирусной или другой системы (независимо от того, является она природно встречающейся или синтетической) для доставки нуклеиновых кислот в клетки, где эти плазмида, фаг или вирус могут быть функциональными с бактериальными, дрожжевыми клеткамихозяевами, клетками-хозяевами позвоночных и/или клетками-хозяевами млекопитающих. Этот вектор может оставаться независимым от геномной ДНК клетки-хозяина или может интегрироваться полностью или частично в геномную ДНК. Этот вектор будет обычно, но необязательно, содержать все необходимые элементы, так чтобы быть функциональным в любой клетке-хозяине, с которой он является совместимым. "Экспрессионный вектор" является вектором, способным направлять экспрессию экзогенного полинуклеотида, например, полинуклеотида, кодирующего слитый белок домена связывания, при подходящих условиях. Как описано здесь, термины "гомология и гомологи" включают в себя полинуклеотиды, которые могут быть гомологом последовательности полинуклеотида коннексина (например, мРНК). Такие полинуклеотиды обычно имеют по меньшей мере, приблизительно 70% гомологию, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80, 90, 95, 97 или 99% гомологию с релевантной последовательностью,например, на протяжении района из по меньшей мере приблизительно 15, 20, 30, 40, 50, 100 или более смежных нуклеотидов (гомологичной последовательности). Гомология может быть рассчитана на основе любого способа в данной области. Например, пакетUWGCG обеспечивает программу BESTFIT, которая может быть использована для расчета гомологии(например, используемую с ее установками по умолчанию) (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). Алгоритмы PILEUP и BLAST могут быть использованы для расчета гомологии или выравнивания последовательностей (обычно с установками по умолчанию), например, как описано в AltschulS.F. (1993); J Mol Evol 36: 290-300; Altschul, S.F. et al.; (1990); J Mol Biol 215: 403-10. Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST является публично доступным через Национальный Центр Информации по Биотехнологии (http://www.ncbi.nlm,nih.gov./L). Этот алгоритм включает в себя сначала идентификацию пары последовательностей с высокой оценкой посредством идентификации коротких слов длины W в запрашиваемой последовательности, которые либо соответствуют, либо удовлетворяют некоторой положительной пороговой оценке Т при выравнивании со словом той же длины в базе данных. Т обозначает порог оценки слова окружения (Altschul et al., supra). Эти исходные соседние словасовпадения действуют в качестве начальных средств для инициации поисков для нахождения HSP, содержащих их. Эти слова-совпадения продлеваются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько может быть увеличена кумулятивная оценка выравнивания. Удлинения для слов-совпадений в каждом направлении останавливают, когда: кумулятивная оценка выравнивания уменьшается на количество X от ее максимально достигаемой величины; кумулятивная оценка опускается до нуля или ниже вследствие накопления одного или нескольких выравниваний остатков, имеющих отрицательную оценку; или достигается конец любой последовательности. Параметры W, Т и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLAST использует по умолчанию длину слова (W) 11, матрицу оценок BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89: 10915-10919), число выравниваний 50, ожидание (Е) 10, M=5, N=4 и сравнение обеих цепей. Алгоритм BLAST выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями; см., например, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Одной мерой сходства,обеспечиваемой алгоритмом BLAST, является наименьшая вероятность суммы (Р (N, которая обеспечивает указание вероятности, посредством которой соответствие между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями могло бы встречаться случайным образом. Например, последовательность считается сходной с другой последовательностью, если наименьшая вероятность суммы в сравнении с первой последовательностью меньше, чем приблизительно 1, предпочтительно меньше, чем- 12015670 приблизительно 0,1, более предпочтительно меньше, чем приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше, чем приблизительно 0,001. Гомологичная последовательность обычно отличается от релевантной последовательности, по меньшей мере (или не более чем), приблизительно 1, 2, 5, 10, 15, 20 или более мутациями (которые могут быть заменами, делециями или инсерциями). Эти мутации могут быть измерены в любом из районов,упомянутых выше в отношении расчета гомологии. Гомологичная последовательность обычно гибридизуется селективно с исходной последовательностью при уровне, значимо более высоком, чем фон. Селективная гибридизация обычно достигается с использованием условий средней -высокой строгости (например, 0,03 М хлорид натрия и 0,03 М цитрат натрия при приблизительно 50-60 С). Однако такая гибридизация может проводиться при любых подходящих условиях, известных в данной области (см. Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Например, если требуется высокая строгость,подходящие условия включают в себя 0,1SSC при 60 С. Если требуется более низкая строгость, подходящие условия включают в себя 2SSC при 60 С."Клетка" обозначает любую живую клетку, подходящую для желаемого применения. Клетки включают в себя эукариотические и прокариотические клетки. Термин "продукт гена" относится к молекуле РНК, транскрибированной с гена, или полипептиду,кодируемому этим геном или транслируемому с этой РНК. Термин "рекомбинантный" относится к полинуклеотиду, синтезированному или иным образом подвергнутому манипуляции in vitro (например, "рекомбинантный полинуклеотид"), к способам применения рекомбинантных полинуклеотидов для получения продуктов генов в клетках или других биологических системах, или к полипептиду ("рекомбинантный белок"), кодируемому рекомбинантным полинуклеотидом. Таким образом, "рекомбинантный" полинуклеотид определяется либо способом его получения, либо его структурой. При ссылке на его способ получения этот способ относится к использованию рекомбинантных способов нуклеиновых кислот, в том числе, например, вмешательству человека в данную нуклеотидную последовательность, обычно отбору или продуцированию. Альтернативно это может быть полинуклеотид, полученный генерированием последовательности, содержащей слияние двух или более фрагментов, которые в природе не являются смежными одна с другой. Так, например, включены продукты, производимые трансформацией клеток любым природно не встречающимся вектором, а также полинуклеотиды, содержащие последовательность, полученную с использованием любого способа синтеза олигонуклеотидов. Подобным образом "рекомбинантный" полипептид является полипептидом, экспрессируемым из рекомбинантного полинуклеотида."Рекомбинантной клеткой-хозяином" является клетка, которая содержит вектор, например клонирующий вектор или экспрессирующий вектор, или клетка, которая была другим образом подвергнута манипуляции рекомбинантными способами для экспрессии представляющего интерес белка. Данное изобретение включает в себя способы применения соединений и композиций для сайтспецифического модулирования связанной со щелевым контактом клеток экспрессии белка для заживления ран, например, связанного с хирургией заживления ран и/или для применений в ремоделировании тканей. Данное изобретение применимо, например, для коррекции дефектов зрения вместе с лазерной хирургией, для конструирования роговицы in vitro и для прямых обработок глаз, когда желательным является ремоделирование роговицы, в том числе прямых обработок, выполняемых независимо или альтернативно, в сочетании с процедурой (например, хирургией), выполняемой на глазу. Антисмысловая модуляция прямой коммуникации клетка-клетка предпочтительно опосредована молекулами, которые прямо или опосредованно уменьшают связывание между клетками в тканях. Такие молекулы включают в себя полинуклеотиды, такие как антисмысловые дезоксинуклеотиды, морфолинонуклеотиды, интерферирующие РНК и дезоксирибозимы, нацеленные на специфические изоформы коннексинов, которые приводят к уменьшенной трансляции этой изоформы белка и препятствуют функции клеточных щелевых контактов. Введение этих антисмысловых соединений приводит к уменьшению опосредованной щелевым контактом межклеточной коммуникации в сайте, в котором отрицательно регулируется экспрессия коннексина. Коннексины играют важные роли в опосредованной щелевым контактом клеток передаче сигналов от клетки к клетке. Сверхэкспрессия коннексина связана с послехирургическим образованием рубцов и индуцируемым после травмы ремоделированием ткани. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения коннексины представляют собой ценные мишени для лечения вредных эффектов, связанных с травмой роговицы и послехирургического ремоделирования ткани; и для заболеваний и нарушений, в которых желательно локализованное разрушение прямой коммуникации клеткаклетка. В частности, модуляция экспрессии коннексинов может быть полезной для сайт-специфической модуляции, связанной со щелевым контактом клеток экспрессии белка, для применений в ремоделировании/конструировании тканей. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть использованы для модуляции коннексинов в связи с офтальмологическими процедурами или хирургиями, такими как,например, хирургия по поводу катаракты, внутриглазная хирургия хрусталика, хирургия трансплантации роговиы и некоторые типы хирургии глаукомы, и другие описанные здесь процедуры.- 13015670 В некоторых вариантах осуществления модуляция коннексинов может быть использована в офтальмологических нарушениях, поражающих задний сегмент, включающий в себя сетчатку и хрусталик. В другом аспекте данного изобретения модуляция коннексинов может быть использована в офтальмологических нарушениях, влияющих на передний сегмент, который включает в себя роговицу, конъюнктиву и склеру. В контексте данного изобретения нарушения заднего сегмента включают в себя разрывы и дегенерацию желтого пятна, разрывы сетчатки, диабетическую ретинопатию, витреоретинопатию и разнообразные нарушения. В контексте этого изобретения нарушения хрусталика могут включать в себя катаракты. Еще в одном аспекте, обсуждается, что нарушения роговицы и рефракционные нарушения, такие как осложнения радиальной кератотомии, сухие глаза, вирусный конъюнктивит, язвенный конъюнктивит и образование рубцов в заживлении ран, таких как, например, раны эпителия роговицы, и осложнения синдрома Шегрена. Данное изобретение описывает антисмысловые соединения, в частности олигонуклеотиды, для применения в модуляции функции молекул нуклеиновых кислот, кодирующих коннексины, в конечном счете, модуляции количества продуцируемых коннексинов. Это выполняют обеспечением олигонуклеотидов, которые специфически гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, предпочтительно мРНК, кодирующими коннексины. Эту взаимосвязь между антисмысловым соединением, таким как олигонуклеотид, и его комплементарной нуклеиновой кислотой-мишенью, с которой он гибридизуется, обычно называют антисмысловой. Как описано здесь, нацеливание олигонуклеотида на выбранную нуклеиновую кислоту-мишень является обычно многоступенчатым процессом. Этот процесс обычно начинается идентификацией последовательности нуклеиновой кислоты, функция которой должна быть модулирована. Это может быть,например, клеточный ген (или мРНК, полученная из этого гена), экспрессия которого ассоциирована с конкретным состоянием заболевания. В данном изобретении мишенями являются нуклеиновые кислоты,кодирующие коннексин, или мРНК, экспрессируемые из этого гена коннексина. мРНК, которая кодирует коннексин, является в настоящее время предпочтительной мишенью. Процесс нацеливания включает в себя также определение сайта или сайтов в последовательности нуклеиновой кислоты для антисмыслового взаимодействия, происходящего таким образом, что будет происходить модуляция экспрессии гена. В контексте данного изобретения информационная РНК включает в себя не только информацию для кодирования белка с использованием трехбуквенного генетического кода, но также ассоциированные рибонуклеотиды, которые образуют район, известный специалистам как 5'-нетранслируемый район, 3'нетранслируемый район и 5'-кэп-район и рибонуклеотиды интрон/экзонных стыков. Таким образом, в соответствии с данным изобретением могут быть образованы олигонуклеотиды, которые нацелены полностью или частично на эти ассоциированные рибонуклеотиды. Таким образом, этот олигонуклеотид может быть специфически гибридизуемым с районом сайта инициации транскрипции районом кодона инициации трансляции, 5'-кэп-районом, интрон/экзонным сочленением, кодирующими последовательностями, районом кодона терминации трансляции или последовательностями в 5'- или 3'-нетранслируемом районе. Поскольку кодоном инициации трансляции является обычно 5'-AUG (в транскрибируемых мРНК-молекулах; 5'-ATG в соответствующей ДНК-молекуле), кодон инициации трансляции называют также "кодоном AUG", стартовым кодоном или стартовым кодоном AUG. Небольшое число генов имеют кодон инициации трансляции, имеющий РНК-последовательность 5'-GUG, 5'-UUG или 5'-CUG, и было показано, что 5'-AUA, 5'-ACG и 5'-CUG функционируют in vivo. Таким образом, термины "кодон инициации трансляции" и стартовый кодон могут включать в себя многочисленные последовательности кодонов, даже хотя инициаторной аминокислотой в каждом случае является обычно метионин (в эукариотах) или формилметионин (в прокариотах). В данной области известно также, что эукариотические и прокариотические гены могут иметь два или более альтернативных стартовых кодонов, любой из которых может быть предпочтительно используемым для инициации трансляции в конкретном типе клеток или в конкретной ткани или при конкретном наборе условий. В контексте данного изобретения "стартовый кодон" и "кодон инициации трансляции" обозначают кодон или кодоны, которые используются invivo для инициации трансляции молекулы мРНК, транскрибированной из гена, кодирующего коннексин,независимо от последовательности (последовательностей) таких кодонов. В данной области известно также, что кодон терминации трансляции (или "стоп-кодон") гена может быть одной из трех последовательностей, т.е. 5'-UAA, 5'-UAG и 5'-UGA (соответствующими ДНК-последовательностями являются 5'ТАА, 5'-TAG и 5'-TGA, соответственно). Термины область стартового кодона, область AUG и область кодона инициации трансляции относятся к части такой мРНК или к части такого гена, которая включает в себя приблизительно 25-50 смежных нуклеотидов в любом направлении (т.е. 5' или 3' (слева или справа от кодона инициации трансляции. Эта область является предпочтительной областьюмишенью. Подобным образом термины "область стоп-кодона" и "область кодона терминации трансляции" относятся к части такой мРНК или к части такого гена, которая включает в себя приблизительно 25-50 смежных нуклеотидов в любом направлении (т.е. 5' или 3' (слева или справа от кодона терминации трансляции. Эта область является предпочтительной областью-мишенью. Открытая рамка считывания (ORF) или"кодирующая область", которая, как известно в данной области, обозначает область между кодоном ини- 14015670 циации трансляции и кодоном терминации трансляции, является также областью, на которую может эффективно производиться нацеливание. Другие предпочтительные области-мишени включают в себя 5'нетранслируемый район (5'UTR), известный в данной области как часть мРНК в 5'-направлении (слева) от кодона инициации трансляции, и, следовательно, включающий в себя нуклеотиды между 5'-кэпсайтом и кодоном инициации трансляции мРНК или соответствующими нуклеотидами на этом гене, и 3'нетранслируемый район (3'UTR), известный в данной области как часть мРНК в 3'-направлении (справа) от кодона терминации трансляции, и, следовательно, включающий в себя нуклеотиды между кодоном терминации трансляции и 3'-концом мРНК или соответствующими нуклеотидами на этом гене. 5'-кэп мРНК содержит остаток N7-метилированного гуанозина, присоединенный к 5'-крайнему остатку мРНК через 5'-5'-трифосфатную связь. Считается, что 5'-кэп-район мРНК включает в себя саму 5'-кэпструктуру, а также первые 50 нуклеотидов, смежные с этим кэпом. 5'-кэп-область также может быть предпочтительной областью-мишенью. Хотя некоторые эукариотические мРНК-транскрипты транслируются непосредственно, многие содержат один или несколько областей, известных как "интроны", которые вырезаются из пре-мРНКтранскрипта с образованием одной или нескольких зрелых мРНК. Остальные (и, следовательно, транслируемые) области известны как "экзоны" и сплайсируются вместе с образованием непрерывной мРНКпоследовательности. Сайты сплайсинга мРНК, т.е. экзон-экзонные или интрон-экзонные стыки, могут быть также предпочтительными областями-мишенями и применимы, в частности, в ситуациях, в которых в заболевании предполагают участие аномального сплайсинга или в которых в заболевании предполагают участие сверхпродуцирования конкретного продукта сплайсинга мРНК. Аберрантные слитые стыки вследствие перегруппировок или делеций также являются предпочтительными мишенями. Нацеливание на конкретные экзоны в альтернативно сплайсированных мРНК может быть также предпочтительным. Было также обнаружено, что интроны могут быть также эффективными и, следовательно,предпочтительными областями-мишенями для антисмысловых соединений, нацеленных, например, на ДНК или пре-мРНК. В контексте данного изобретения антисмысловой полинуклеотид может, например, гибридизоваться со всей или с частью мРНК коннексина. Обычно антисмысловой полинуклеотид гибридизуется с участком связывания рибосом или с кодирующим районом мРНК коннексина. Например, этот полинуклеотид может быть точным комплементом всей или части мРНК коннексина. Антисмысловой полинуклеотид может ингибировать транскрипцию и/или трансляцию коннексина. Предпочтительно этот полинуклеотид является специфическим ингибитором транскрипции и/или трансляции гена коннексина и не ингибирует транскрипцию и/или трансляцию других генов. Этот продукт может связываться с геном коннексина или мРНК или (i) 5' (слева) относительно кодирующей последовательности, и/или (ii) с кодирующей последовательностью, и/или (iii) 3' (справа) относительно кодирующей последовательности. Обычно антисмысловой полинуклеотид будет вызывать уменьшение экспрессии мРНК и/или белка коннексина в клетке. Антисмысловой полинуклеотид является обычно антисмысловым в отношении мРНК коннексина. Такой полинуклеотид может быть способен гибридизоваться с мРНК коннексина и может ингибировать экспрессию коннексина, подавляя один или несколько аспектов метаболизма мРНК коннексина, в том числе транскрипцию, процессинг мРНК, транспорт мРНК из ядра, трансляцию или деградацию мРНК. Антисмысловой полинуклеотид обычно гибридизуется с мРНК коннексина с образованием дуплекса, который может вызывать прямое ингибирование трансляции и/или дестабилизацию этой мРНК. Такой дуплекс может быть чувствительным к деградации нуклеазами. Гибридизация антисмысловых олигонуклеотидов с мРНК интерферирует с одной или несколькими из нормальных функций мРНК. Функции мРНК, которые должны подавляться, включают в себя все жизненно важные функции, такие как, например, транслокация этой РНК к сайту трансляции белка,трансляция белка из этой РНК, сплайсинг этой РНК с получением одной или нескольких разновидностей мРНК и каталитическая активность, которая может быть привлечена этой РНК. Связывание специфического белка (специфических белков) с этой РНК может быть также подавлено гибридизацией антисмыслового олигонуклеотида с этой РНК. Общим эффектом интерференции с функцией мРНК является модуляция экспрессии коннексина. В контексте этого изобретения "модуляция" включает в себя либо ингибирование, либо стимуляцию, т.е. либо уменьшение, либо увеличение экспрессии. Эта модуляция может быть измерена способами, которые являются рутинными в данной области, например, Нозерн-блот-анализом экспрессии мРНК или ПЦР с обратной транскриптазой, как описано в примерах данной заявки, или Вестерн-блоттингом или анализом ELISA экспрессии белка или анализом иммунопреципитации экспрессии белка. Могут быть также измерены действия на пролиферацию клеток или рост опухолевых клеток, как описано в примерах данной заявки. Ингибирование является в настоящее время предпочтительным. После идентификации сайта-мишени или сайтов-мишеней выбирают олигонуклеотиды, которые являются достаточно комплементарными мишени, т.е. гибридизуются достаточно хорошо и с достаточной специфичностью с генерированием желаемой модуляции. Антисмысловые нуклеиновые кислоты(ДНК, РНК, модифицированные нуклеиновые кислоты, аналоги и т.п.) могут быть получены с использованием любого подходящего способа получения нуклеиновой кислоты. Олигодезоксинуклеотиды, на- 15015670 правленные на другие белки коннексина, могут быть отобраны в отношении их нуклеотидной последовательности с использованием любого общепринятого подхода, такого как, например, компьютерные программы MacVector и OligoTech (из Oligos etc. Eugene, Oregon, USA). В отношении общих способов,относящихся к антисмысловым полинуклеотидам, см. Antisense RNA and DNA, D.A. Melton, Ed., ColdSpring Harbor Laboratoty, Cold Spring Harbor, NY (1988. См. также Dagle et al., Nucleic Acids Research,19: 1805 (1991). В отношении антисмысловой терапии, см., например, Uhlmann et al., Chem. Reviews, 90: 543-584 (1990). Обычно по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности известна для коннексинов, в случае которых желательным является ингибирование экспрессии. Предпочтительно антисмысловое соединение нацелено на один или более конкретных изотипов коннексинов. Конкретные изотипы коннексинов, на которые могут быть нацелены антисмысловые соединения, включают в себя, без ограничения, коннексины 43, 37, 31.1, 26 и другие, описанные здесь. Предпочтительно, но необязательно,коннексины-мишени являются коннексинами человека. Коннексин может, например, иметь последовательность нуклеотидов, выбранную из SEQ ID NO:12-31. В некоторых вариантах осуществления антисмысловые соединения нацелены по меньшей мере на 8 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты,кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидов, выбранную из SEQ ID NO:12-31. В некоторых других вариантах осуществления второе антисмысловое соединение вводят в глаз субъекта, причем это второе антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на приблизительно 8 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидов, выбранную из SEQ ID NO:12-31, причем указанное второе антисмысловое соединение нацелено на другой коннексин, чем коннексин, являющийся мишенью первого антисмыслового соединения. Коннексины-мишени будут варьировать в зависимости от типа ткани, которая должна быть сконструирована или ремоделирована, и точная последовательность антисмыслового полинуклеотида, используемого в данном изобретении, будет зависеть от белка коннексина-мишени. Белок коннексин или белки коннексины, на которые нацелены эти олигонуклеотиды, будут зависеть от сайта, в котором должна быть осуществлена отрицательная регуляция. Это отражает неоднородное устройство щелевого контакта(щелевых контактов) между клетками в различных сайтах по всему телу в отношении субъединичного состава коннексинов. Однако некоторые белки коннексины являются более повсеместными, чем другие,в отношении распределения в ткани. Как описано здесь, связанные с роговицей коннексины, такие как коннексин 43, являются предпочтительными в некоторых вариантах осуществления. Таким образом, в контексте данного изобретения олигонуклеотиды либо отдельно, либо в комбинации были нацелены на коннексины 43, 26, 37, 30 и/или 31.1 (например, см. SEQ ID NO:1-11), которые являются подходящими для применения в конструировании или ремоделировании роговицы. В одном аспекте данного изобретения олигодезоксинуклеотидами могут быть немодифицированные фосфодиэфирные олигомеры. В другом аспекте данного изобретения эти полинуклеотиды могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Предполагается также, что олигонуклеотиды, нацеленные на отдельные белки коннексины, могут быть использованы в комбинации (например, они могут быть нацелены на один, два, три, четыре или более разных коннексинов). Например, 0DN, нацеленный на коннексин 43 и один или несколько других членов семейства коннексинов (такие как коннексин 26, 30, 31.1 и 43), могут быть использованы в комбинации. Предполагается также, что индивидуальные антисмысловые полинуклеотиды могут быть специфическими в отношении конкретного коннексина или могут быть нацелены на 1, 2, 3 или более различных коннексинов. Специфические полинуклеотиды будут обычно нацелены на последовательности в гене или мРНК коннексина, которые не являются консервативными среди коннексинов, тогда как неспецифические полинуклеотиды будут нацелены на консервативные последовательности. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антисмысловые соединения нацелены по меньшей мере на 8 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин 26, коннексин 30, коннексин 31.1,коннексин 37, коннексин 43 человека, причем указанное антисмысловое соединение ингибирует экспрессию белка коннексина человека в клетках, ассоциированных с глазом указанного пациента. В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие коннексин,имеют последовательность нуклеотидов, выбранную из SEQ ID NO:12-31. В некоторых вариантах осуществления, эти композиции нацелены на два или более белков коннексина человека и ингибируют экспрессию двух или более белков коннексинов человека. В некоторых дополнительных вариантах осуществления антисмысловые соединения являются антисмысловыми олигонуклеотидами. Примеры антисмыслового олигонуклеотида в отношении выбранного коннексина 43 включают в себя GTA ATT GCGGTC (SEQ ID NO:2); и GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT (SEQ ID NO:3). Пример антисмыслового олигонуклеотида в отношении коннексина 26 имеет последовательность ТСС TGA GCAATA CCT AAC GAA CAA ATA (SEQ ID NO:4). Примеры антисмыслового олигонуклеотида в отношении выбранного коннексина 37 включают в себя 5' CAT CTC CTT GGT GCT CAA CC 3' (SEQ ID NO:5) и 5' CTG AAG TCG ACT TGG CTT GG 3' (SEQ ID NO:6). Примеры антисмыслового олигонуклеотида в отношении выбранного коннексина 30 включают в себя 5' CTC AGA TAG TGG CCA GAA TGC 3' (SEQID NO:7) и 5' TTG TCC AGG TGA CTC CAA GG 3' (SEQ ID NO:8). Примеры антисмыслового олигонуклеотида в отношении выбранного коннексина 31.1 включают в себя 5' CGT CCG AGC CCA GAA AGACAA TGA AGA TGT T 3' (SEQ ID NO:11). В дополнительном варианте осуществления олигодезоксинуклеотиды, выбранные из следующих последовательностей, являются особенно подходящими для отрицательной регуляции экспрессии коннексина 43: 5' GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC 3' (SEQ ID NO:1) 5' GTA ATT GCGCAG CAT 3' (SEQ ID NO:3) Еще в одном варианте осуществления олигодезоксинуклеотиды, выбранные из группы следующих последовательностей, являются особенно подходящими для отрицательной регуляции экспрессии коннексинов 26, 37, 30 и 31.1: 5' ТСС TGA GCA ATA CCT AAC GAA САА АТА 3'GAA AGA TGA GGT С 3' (коннексин 31.1) (SEQ ID NO:9) 5' AGA GGC GCA CGT GAG АСА С З' (коннексин 31.1) (SEQ ID NO:10) 5' TGA AGA CAA TGA AGA TGT T 3' (коннексин 31.1) (SEQ ID NO: 11) Антисмысловые соединения, обеспеченные здесь, обычно содержат приблизительно 8-40 нуклеотидных оснований (т.е. приблизительно 8-40 связанных нуклеозидов) и более обычно приблизительно 12-40 нуклеотидных оснований и даже более обычно приблизительно 30 нуклеотидных оснований. Антисмысловые соединения, содержащие полинуклеотиды, могут иметь длину по меньшей мере приблизительно 40,например, по меньшей мере, приблизительно 60 или по меньшей мере приблизительно 80 нуклеотидов и до 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 или 3000 или более нуклеотидов. Подходящие антисмысловые соединения включают в себя, например, 30-мерный ODN. В некоторых вариантах осуществления антисмысловые соединения нацелены, по меньшей мере, на приблизительно 8 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из SEQ ID NO:12-31. В других вариантах осуществления, антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на приблизительно 10, по меньшей мере на приблизительно 12, по меньшей мере на приблизительно 14, по меньшей мере на приблизительно 16, по меньшей мере на приблизительно 18, по меньшей мере на приблизительно 20, по меньшей мере на приблизительно 25, по меньшей мере на приблизительно 30 и по меньшей мере на приблизительно 35 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из SEQ ID NO:12-31. Размер длины антисмысловых соединений, в том числе олигонуклеотидов, нацеленных по меньшей мере на 8-35 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин человека, может быть равен 8 нуклеотидным основаниям или более, 8-100 нуклеотидным основаниям, 8-50 нуклеотидным основаниям, 8-40 нуклеотидным основаниям, 10-50 нуклеотидным основаниям, 12-50 нуклеотидным основаниям, 14-50 нуклеотидным основаниям, 16-50 нуклеотидным основаниям, 18-50 нуклеотидным основаниям, 20-50 нуклеотидным основаниям, 25-50 нуклеотидным основаниям, 15-35 нуклеотидным основаниям и т.п. Другие антисмысловые соединения данного изобретения могут быть меньшими или большими по размеру, например, имеющими длину, большую чем 100 нуклеотидных оснований. Антисмысловые соединения включают в себя антисмысловые олигонуклеотиды (ODN), антисмысловые полинуклеотиды, дезоксирибозимы, морфолинолигонуклеотиды, молекулы интерференции РНК или их аналоги, короткие интерферирующие молекулы РНК (siRNA) или их аналоги, молекулы РНК или их аналоги, ДНКзимы или их аналоги, мутированные по 5'-концу малые ядерные РНК U1-типа и их аналоги. Как описано здесь, антисмысловое соединение может включать в себя использование олигодезоксинуклеотидов (ODN). ODN имеют обычно длину приблизительно 20 нуклеотидов и действуют посредством гибридизации с пре-мРНК и мРНК с образованием субстрата для рибонуклеазы Н (РНКазы Н),которая специфически деградирует РНК-цепь образованных РНК-ДНК-дуплексов. При модификации таким образом, чтобы предотвращать действие РНКазы Н, ODN могут ингибировать трансляцию мРНК посредством стерического несоответствия или ингибировать сплайсинг пре-мРНК. ODN и их модификации использовали для нацеливания на двухцепочечную ДНК (dsDNA) для ингибирования транскрипции посредством образования тройных спиралей. ODN могут быть получены известными в данной области способами автоматизированного синтеза, и получение ODN любой последовательности и блокирование экспрессии генов посредством антисмыслового спаривания оснований является относительно простым. В некоторых аспектах фосфодиэфирный скелет ODN может быть модифицирован для увеличения эффективности в качестве мишень-специфических агентов для блокирования экспрессии генов. Эти модификации скелета были разработаны для улучшения стабильности ODN и для усиления их поглощения клетками. Наиболее широко используемой модификацией является модификация, в которой не образующий мостиковую связь кислород заменен атомом серы с образованием фосфоротиоатных ODN. По меньшей мере, один фосфоротиоатный ODN был одобрен FDA, и несколько других фосфоротиоатных- 17015670 антисмысловых ODN находятся на ранних стадиях клинических испытаний в отношении различных раков и воспалительных заболеваний. Механизмы действия ODN в отношении блокирующей гены функции варьируют в зависимости от скелета ODN (Branch, A.D. Hepatology 24, 1517-1529 (1996); Dias, N. and Stein, C.A. Mol. Cancer Thor. 1,347-355 (2002); Stein, C.A. and Cohen, J.S., Cancer Res. 48, 2659-2668 (1988); Zon, G. Ann. N.Y. Acad Sci.,616, 161-172 (1990). Отрицательно заряженные, в целом, ODN, такие как фосфодиэфиры и фосфоротиоаты, индуцируют опосредованное РНКазой Н расщепление мРНК-мишени. Другие модификации скелета,которые не рекрутируют РНКазу Н, вследствие отсутствия у них заряда или типа спирали, образуемой с РНК-мишенью, могут быть классифицированы как ODN стерического несоответствия. Предпочтительно используемые члены этой последней группы включают в себя содержащие морфолино, U-O-метильные группы, 2"-О-аллильные группы, замкнутые нуклеиновые кислоты и пептиднуклеиновые кислоты(ПНК). Эти ODN могут блокировать сплайсинг, трансляциию, транспорт ядро-цитоплазма и трансляцию,среди других мишеней ингибирования. В другом аспекте модуляция экспрессии коннексинов включает в себя использование рибозимов. Рибозимы являются РНК-молекулами, которые действует в качестве ферментов даже при полном отсутствии белков. Они имеют каталитическую активность разрывания и/или образования ковалентных связей с необычайной специфичностью, ускоряя посредством этого спонтанные скорости нацеленных реакций на много порядков величин. Рибозимы связываются с РНК спариванием оснований по Уотсону-Крику и действуют, деградируя РНК-мишень посредством катализа гидролиза фосфодиэфирного скелета. Имеются несколько различных классов рибозимов, причем наиболее широко исследованным является "молотоголовый" рибозим. Как подразумевает его название, молотоголовый рибозим образует уникальную вторичную структуру при гибридизации с его мРНК-мишенью. Каталитически важные остатки внутри этого рибозима фланкированы мишень-комплементарными последовательностями, которые фланкируют сайт расщепления РНКмишени. Расщепление рибозимом требует двухвалентных ионов, таких как магний, и зависит также от структуры и доступности РНК-мишени. Колокализация рибозима с РНК-мишенью в клетке посредством использования сигналов локализации в значительной степени увеличивает их эффективность сайленсинга. Молотоголовые рибозимы являются достаточно короткими для возможности их химического синтеза или могут быть транскрибированы из векторов, позволяющих непрерывное продуцирование рибозимов в клетках. Способность РНК служить в качестве катализатора была впервые продемонстрирована для интрона группы I с автономным сплайсингом Tetrahymena thermophila и РНК-части РНКазы. После обнаружения этих двух РНК-ферментов был обнаружен РНК-опосредованный катализ, ассоциированный с нитронами автономного сплайсинга группы II митохондрий дрожжей, грибов и растений (а также хлоропластов),одноцепочечными РНК вироидов и вирусоидов растений, вирусом гепатита дельта и сателлитной РНК из митохондрий Neurospora crassa. Рибозимы встречаются в природе, но могут быть искусственно сконструированы для экспрессии и нацеливания на специфические последовательности в цис (на той же самой цепи нуклеиновой кислоты) или транс (нековалентно связанной нуклеиновой кислоте). Новые биохимические активности разрабатываются с использованием протоколов отбора in vitro, а также генерирования новых мотивов рибозимов, которые действуют на субстраты, другие, чем РНК. Интрон группы I Т. thermophila был первым цис-расщепляющим рибозимом, который должен был быть превращен в транс-реагирующую форму, которую авторы данного изобретения называют интрон/рибозимом, делающую его применимым как в исследованиях генома, так и в качестве возможного терапевтического средства. В этой реакции транс-сплайсинга дефектный экзон мРНК-мишени может быть заменен правильным экзоном, который ковалентно присоединяется к интрон-рибозиму. Это осуществляется через реакцию сплайсинга, в которой экзон, присоединенный к интрону, помещают спариванием оснований в мРНК-мишень таким образом, что он может быть ковалентно присоединен к 5'-концу транскрипта-мишени в реакции переэтерификации. Эту реакцию использовали для транс-сплайсинга последовательностей дикого типа в транскриптах глобина серповидных клеток и мутантных транскриптах р 53 и замены триплетов в 3'-UTR транскриптах протеинкиназы в аллеле миотонической дистрофии. Эндонуклеаза РНКаза Р обнаружена в организмах в природе. Этот фермент имеет РНК-компонент и один или несколько белковых компонентов в зависимости от организма, из которого он выделен. Этот РНК-компонент из ферментов Escherichia coli и Bacillus subtilis может действовать в качестве агента сайт-специфического расщепления в отсутствие белка при определенных солевых и ионных условиях. Исследования требований в отношении субстратов для ферментов человека и бактерий показало, что минимальные субстраты для любого из этих ферментов похожи на сегмент молекулы транспортной РНК. Эта структура может быть имитирована уникально сконструированными антисмысловыми РНК, которые спариваются с РНК-мишенью и служат в качестве субстратов для опосредованного РНКазой Р, сайтспецифического расщепления как в тест-пробирке, так и в клетках. Было также показано, что антисмысловой компонент может быть ковалентно присоединен к РНК РНКазы Р для направления этого фермента только на представляющую интерес РНК-мишень. Исследователи использовали преимущество этого свойства в конструировании антисмысловых РНК, которые спариваются с представляющими интерес- 18015670 мРНК-мишенями для стимуляции сайт-специфического расщепления мишени и для нацеленного ингибирования как вируса простого герпеса, так и цитомегаловируса в культуре клеток. Ряд малых РНК, патогенных для растений (вироиды, сателлитные РНК и вирусоиды), транскрипт из митохендриальной ДНК-плазмиды N. crassa и вирус гепатита дельта животных подвергаются реакции саморасщепления in vitro в отсутствие белка. Эти реакции требуют нейтрального рН и Mg2+. Эта реакция саморасщепления является интегральной частью механизма репликации in vivo, называемого механизмом катящегося кольца. Эти саморасщепляющиеся РНК могут быть подразделены на группы в зависимости от последовательности и вторичной структуры, образуемой около сайта расщепления. Малые рибозимы были получены из мотива, обнаруженного в одноцепочечных РНК вироидов и вирусоидов растений. На основе общей вторичной структуры и консервативного набора нуклеотидов термин молотоголовые был дан одной группе этого домена саморасщепления. Молотоголовый рибозим состоит из 30 нуклеотидов. Простота молотоголового каталитического домена сделала его предпочтительным выбором в конструировании транс-действующих рибозимов. С использованием спаривания Уотсона-Крика может быть сконструирован молотоголовый рибозим для расщепления любой РНК-мишени. Требования к сайту расщепления являются относительно простыми, и фактически может производиться нацеливание на любой мотив UH-последовательности (где Н обозначает U, С или А). Второй полученный из растений мотив саморасщепления, первоначально идентифицированный в отрицательной цепи сателлитной РНК кольцевой пятнистости табака, был назван шпилькой или скрепкой для бумаг. Эти рибозимы-шпильки расщепляют РНК-субстраты в обратимой реакции, которая генерирует 2',3'-циклический фосфат и сконструированные по 5'-гидроксиконцам версии этот каталитического мотива также расщепляют и обновляют многочисленные копии различных мишеней in trans. Требования к субстрату включают в себя GUC, причем расщепление происходит непосредственно слева от G. Этот рибозимы-шпилька катализирует также реакцию лигирования, хотя более часто его используют для реакций расщепления. Имеются многочисленные применения как молотоголовых, так и шпилечных рибозимов в клетках для отрицательной регуляции специфических клеточных и вирусных мишеней. Haseloff and Gerlach сконструировали молотоголовый мотив (Haseloff and Gerlach; Nature, 1988 Aug 18; 334(6183):585-91),который может быть сконструирован расщеплением любой мишени модификацией плеч, которые спариваются по принципу спаривания оснований Уотсона-Крика с правильной мишенью. Ramemzani et al. показали, что этот мотив молотоголового рибозима имел потенциальные терапевтические применения в исследовании, в котором наблюдали фактически полное ингибирование экспрессии и репликации вирусных генов, с использованием клеток, сконструированных для экспрессии рибозима gag против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (Ramezani A. et al., Frontiers in Bioscience 7:a, 29-36; 2002). В другом аспекте модуляция экспрессии коннексина включает в себя использование каталитических ДНК (или ДНКзимов). Малые ДНК, способные сайт-специфически расщеплять РНК-мишени, были разработаны с использованием эволюции in vitro (так как неизвестно присутствие ДНК-ферментов в природе). Были идентифицированы два различных каталитических мотива с различными специфичностями в отношении сайта расщепления. Наиболее часто используемые 10-20 ферментов связываются с их РНК-субстратами посредством спаривания оснований по принципу Уотсона-Крика и сайт-специфически расщепляют РНК-мишень, как и молотоголовые и шпилечные рибозимы, приводя к 2',3'-циклическому фосфату и 5'-ОН-концам. Расщепление мРНК-мишеней приводит к их деструкции, а ДНКзимы рециклируют и расщепляют множество субстратов. Синтез каталитических ДНК является недорогим, и они имеют хорошие каталитические свойства, что делает их ценными заменителями либо антисмысловой ДНК, либо рибозимов. Были опубликованы несколько применений ДНКзимов в культуре клеток, в том числе ингибирование мРНК veg F и последующее предотвращение ангиогенеза и ингибирование экспрессии слитого транскрипта bcr/abl, характерного для хронического миелогенного лейкоза. Каталитические ДНК могут доставляться экзогенно, и они могут иметь модифицированный скелет для оптимизации системной доставки в отсутствие носителя. В другом аспекте данного изобретения модуляция конститутивного гена коннексина включает в себя использование олигонуклеотидов, имеющих структуры морфолиноскелета. Summerton, J.E. andWeller, D.D. US. Pat. No. 5034506. В другом аспекте данного изобретения антисмысловые полинуклеотиды могут быть химически модифицированы для усиления их устойчивости к нуклеазам и увеличения эффективности вхождения в клетку. Например, могут быть использованы олигонуклеотиды со смешанным скелетом (МВО), содержащие сегменты фосфоротиоатных олигодезоксинуклеотидов и подходящим образом помещенные сегменты модифицированных олигодезокси- или олигорибонуклеотидов. МВО имеют сегменты фосфоротиоатных связей и другие сегменты других модифицированных олигонуклеотидов, таких как метилфосфонаты, фосфорамидаты, фосфородитиоаты, N3'Р 5'-фосфорамидаты и олигорибонуклеотидфосфоротиоаты и их 2'-О-алкил-аналоги и 2'-О-метилрибонуклеотид-метилфосфонаты, которые является неионными и очень устойчивы к нуклеазам, или 2'-O-алкилолигорибонуклеотиды.- 19015670 Как известно в данной области, нуклеозид является комбинацией азотистое основание-сахар. Часть основания этого нуклеозида обычно является гетероциклическим основанием. Двумя наиболее обычными классами таких гетероциклических оснований являются пурины и пиримидины. Нуклеотиды являются нуклеозидами, которые дополнительно содержат фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью этого нуклеозида. Для тех нуклеозидов, которые включают в себя пентофуранозильный сахар, фосфатная группа может быть связана с 2'-, 3'- или 5'-гидроксильной частью этого сахара. При образовании олигонуклеотидов фосфатные группы ковалентно связывают соседние нуклеозиды друг с другом с образованием линейного полимерного соединения. В свою очередь, соответствующие концы этой линейной полимерной структуры могут быть дополнительно соединены с образованием кольцевой структуры, однако открытые линейные структуры обычно являются предпочтительными. В структуре олигонуклеотида фосфатные группы обычно называют образующими межнуклеозидный скелет олигонуклеотида. Обычной связью или скелетом РНК и ДНК является 3'-5'-фосфодиэфирная связь. Антисмысловые соединения, применимые в данном изобретении, могут включать в себя олигонуклеотиды, содержащие модифицированные скелеты или неприродные межнуклеозидные связи. Олигонуклеотиды, имеющие модифицированные скелеты, включают в себя олигонуклеотиды, которые сохраняют атом фосфора в скелете, и олигонуклеотиды, которые не имеют атома фосфора в скелете. В контексте данного изобретения модифицированные олигонуклеотиды, которые не имеют атома фосфора в их межнуклеозидном скелете, могут также рассматриваться как олигонуклеозиды. Антисмысловые соединения с модифицированными олигонуклеотидными скелетами, применимые в данном изобретении, могут включать в себя, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты,фосфородитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другой алкил-фосфонаты, в том числе 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, в том числе 3'аминофосфорамидаты и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5'-связи, их 2'-5'-связанные аналоги и аналоги, имеющие обращенную полярность, в которых соседние пары нуклеозидных единиц связаны 3'-5' с 5'-3' или 2'-5' с 5'-2'. Включены также различные соли, смешанные соли и формы свободной кислоты. В одном аспекте рассматривается, что модифицированные скелеты олигонуклеотидов, которые не включают в себя атом фосфора, имеют скелеты, которые образованы короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают в себя скелеты,имеющие морфолиносвязи (образованные частично из сахарной части нуклеозида); силоксановые скелеты; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые скелеты; формацетильные и тиоформацетильные скелеты; метиленформацетильные и тиоформацетильные скелеты; алкенсодержащие скелеты; сульфаматные скелеты; метиленимино- и метиленгидразминоскелеты; сульфонатные и сульфонамидные скелеты; амидные скелеты и другие скелеты, имеющие смешанные N-,O-,S- и СН 2-компоненты. В одном аспекте предусмотрены олигонуклеотидные миметики, в которых как сахарная, так и межнуклеозидная связь, т.е. скелет нуклеотидных единиц, заменены новыми группами. Единицы азотистых оснований сохраняются для гибридизации с соответствующим соединением-мишенью нуклеиновой кислоты. Одно из таких олигомерных соединений, олигонуклеотидный миметик, который, как было показано, имеет превосходные свойства гибридизации, называют пептиднуклеиновой кислотой (ПНК). В ПНК-соединениях сахарный скелет олигонуклеотида заменен амидсодержащим скелетом, в частности,аминоэтилглициновым скелетом. Нуклеотидные основания сохраняются и связываются прямо или опосредованно с аза-атомами азота амидной части этого скелета. Дополнительное описание ПНКсоединений может быть найдено в Mielsen et al. (Science, 1991, 254, 1497-1500). В одном аспекте рассматриваются олигонуклеотиды с фосфоротиоатными скелетами и олигонуклеозиды с гетероатомными скелетами и, в частности, -CH2-NH-O-СН 2-, -CH-2N(CH)3-O-CH-2 [известными как метиленовый (метилимино) или MMI-скелет], -CH2-O-N(CH)3-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- и -ON(CH3)-CH2-CH2- [где природный фосфодиэфирный скелет представлен как -О-Р-О-СН 2-]. Еще в одном аспекте, рассматриваются также олигонуклеотиды, имеющие морфолино- и амидные структуры скелета молекулы. В другом аспекте предусмотрено, что модифицированные олигонуклеотиды могут также содержать один или несколько замещенных сахарных остатков. Например, олигонуклеотиды, содержащие один из следующих радикалов в положении 2': ОН, F, O-, S- или N-алкил, O-алкил-О-алкил, О-, S- или Nалкенил, О-, S- или N-алкинил, где эти алкил, алкенил и алкинил могут быть необязательно замещенными или замещены C1-С 10 алкилом или С 2-С 10 алкенилом и алкинилом. Особенно предпочтительными являются O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)2ON(CH3)2, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 иO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, где n и m равны 1 - приблизительно 10. Другие предпочтительные олигонуклеотиды могут содержать один из следующих радикалов в положении 2': C1-С 10 низший алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3,SOCF3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, поли- 20015670 алкиламино, замещенный силил, расщепляющую РНК-группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотида или группу для улучшения фармакодинамических свойств олигонуклеотида и другие заместители, имеющие сходные свойства. Предпочтительная модификация включает в себя 2'-метоксиэтокси (2'-О-СН 2 СН 2 ОСН 3, также известную как 2'-О(2-метоксиэтил) или 2'-MOE) (Martin et al. Helv. Chim. Acta 1995, 78, 486-504), т.е. алкоксиалкоксигруппу. Другая модификация включает в себя 2'-диметиламинооксиэтокси, т.е. группу О(СН 2)2ON(CH3)2, также известную как 2'-DMAOE, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (2'-DMAEOE), т.е. 2'-O-CH2-O-CH2N(CH2)2. Дополнительно предусмотрено, что модификации могут включать в себя 2'-метокси (2'-О-СН 3), 2'аминопропокси (2'-OCH2CH2NH2) и 2'-фтор (2'-F). Подобные модификации могут быть также произведены в других положениях на олигонуклеотиде, в частности, 3'-положении сахара на 3'-концевом нуклеотиде или в 2'-5'-связанных олигонуклеотидах и в 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды также могут иметь сахарные миметики, такие как циклобутильные радикалы вместо пентофуранозильного сахара. В другом аспекте предусмотрено, что олигонуклеотиды могут также включать в себя модификации или замены нуклеотидного основания (часто называемого в данной области просто основанием). В данном контексте немодифицированные или природные нуклеотидные основания включают в себя пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G) и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеотидные основания включают в себя другие синтетические и природные нуклеотидные основания, такие как 5-метилцитозин (5-m-С или m5 с), 5-гидроксиметилцитозин,ксантин, гипоксантин, 2-аминкаденин, 6-метил- и другие алкилпроизводные аденина и гуанина, 2 пропил- и другие алкилпроизводные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5 галогенурацил и -цитозин, 5-пропинилурацил и -цитозин, 6-азоурацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил(псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил, 8-гидроксил- и другие 8 замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, в частности, 5-бром-, 5-трифторметил- и другие 8 замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7 деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Дополнительные нуклеотидные основания включают в себя нуклеотидные основания, описанные в патенте США с номером 3687808, нуклеотидные основания, описанные в Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering 1990, pages 858-859,Kroschwitz, J. John WileySons, нуклеотидные основания, описанные Englisch et al, (Angewandte Chemie, International Edition 1991, 30, 61'3-722), и нуклеотидные основания, описанные Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications 1993, pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, В., ed., CRC Press. Некоторые из этих нуклеотидных оснований являются особенно полезными для увеличения аффинности связывания олигомерных соединений. Они включают в себя 5-замещенные пиримидины, 6 азапиримидины и N-2-, N-6- и O-6-замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5 пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что замещения 5-метилцитозин увеличивают стабильность дуплексов нуклеиновых кислот на 0,6-1,2 С (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, В., eds.,Antisense Research and Applications 1993, CRS Press, Boca Raton, pages 276-378) и являются в настоящее время предпочтительными заменами оснований, еще более предпочтительно при комбинировании с 2'-Ометоксиэтильными модификациями сахара. В другом аспекте предусмотрено, что модификация этих олигонуклеотидов включает в себя химическое связывание с этим олигонуклеотидом одного или нескольких радикалов или конъюгатов, которые усиливают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение данного олигонуклеотида. Такие радикалы включают в себя, но не ограничиваются ими, липидные молекулы, такие как радикал холестерина (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 6553-6556), холевую кислоту (Manoharan(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993,3, 2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res. 1992, 20, 533-538), алифатическую цепь,например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al., EMBO J. 1991, 10, 1111-1118;Kabanov et al., FEBS Lett. 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie 1993, 75, 49-54), фосфолипид,например, дигексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-О-гексадецил-рац-глицеро-3 Н-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al., Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res. 1990, 18, 37773783), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (Manoharan et al., NucleosidesNucleotides 1995, 14, 969973) или адамантануксусную кислоту (Manoharan et al., Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651-3654), пальмитильный радикал (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta 1995, 1264, 229-237) или радикал октадециламина или гексиламинокарбонилоксихолестерина (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996, 277, 923-937). Предусмотрено также использование олигонуклеотидов, которые являются химерными олигонуклеотидами. Химерные олигонуклеотиды или химеры, в контексте данного изобретения, обозначают олигонуклеотиды, которые содержат два или более отличающихся районов, каждый из которых произведен по меньшей мере из одного нуклеотида. Эти олигонуклеотиды обычно содержат по меньшей мере один район, в котором этот олигонуклеотид модифицирован таким образом, чтобы придать этому олиго- 21015670 нуклеотиду увеличенную устойчивость к нуклеазной деградации, увеличенное клеточное поглощение и/или увеличенную аффинность связывания в отношении нуклеиновой кислоты-мишени. Дополнительный район этого олигонуклеотида может служить в качестве субстрата для фермента, способного расщеплять гибриды РНК:ДНК или РНК:РНК. Например, РНКаза Н является клеточной эндонуклеазой, которая отщепляет РНК-цепь дуплекса РНК:ДНК. Таким образом, активация РНКазы Н приводит к расщеплению РНК-мишени с увеличением в значительной степени эффективности антисмыслового ингибирования экспрессии гена. Расщепление РНК-мишени может рутинным образом детектироваться гельэлектрофорезом и, если необходимо, ассоциированными способами гибридизации нуклеиновых кислот,известными в данной области. РНКаза Н-модифицированное расщепление РНК-мишени отличается от применения рибозимов для расщепления нуклеиновых кислот. Примеры химерных олигонуклеотидов включают в себя, но не ограничиваются ими, "гэпмеры", в которых присутствуют три различающихся района, обычно имеющие центральный район, фланкированный двумя районами, которые химически эквивалентны один другому, но отличаются от гэпа (центральной части). Предпочтительным вариантом гэпмера является олигонуклеотид, в котором центральная часть ("гэп") этого олигонуклеотида служит в качестве субстрата для РНКазы Н и предпочтительно состоит из 2'-дезоксинуклеотидов, тогда как фланкирующие части (5'- и 3'-"крылья") модифицированы таким образом, что они имеют более высокую аффинность в отношении РНК-молекулы-мишени, но не способны поддерживать нуклеазную активность (например, фтор- или 2'-О-метоксиэтилзамещенные). Химерные олигонуклеотиды не ограничиваются олигонуклеотидами, имеющими модификации по сахару, но могут также включать в себя олигонуклеозиды или олигонуклеотиды с модифицированными скелетами, например, с районами фосфоротиоатных (P=S) и фосфодиэфирных (Р=О) модифицированных связей или с остатками MMI- и P=S скелетных связей. Другие химеры включают в себя вингмеры, также известные как гемимеры, т.е. олигонуклеотиды с двумя отличающимися районами. В предпочтительном варианте "вингмера" 5'-часть этого олигонуклеотида служит в качестве субстрата для РНКазы Н и предпочтительно состоит из 2'-дезоксинуклеотидов, тогда как 3'-часть модифицирована таким образом,что она имеет более высокую аффинность в отношении РНК-молекулы-мишени, но не способна поддерживать нуклеазную активность (например, является 2'-фтор- или 2'-О-метоксиэтилзамещенной), или наоборот. В одном варианте осуществления олигонуклеотиды данного изобретения содержат модификацию 2'-О-метоксиэтил (2'-О-СН 2 СН 2 ОСН 3) на сахарной части по меньшей мере одного нуклеотида. Было показано, что эта модификация увеличивает как аффинность этого олигонуклеотида в отношении его мишени, так и устойчивость к нуклеазам этого олигонуклеотида. Согласно данному изобретению одна субъединица, множество субъединиц или все нуклеотидные субъединицы этих олигонуклеотидов могут нести модификацию 2'-О-метоксиэтил (-O-СН 2 СН 2 ОСН 3). Олигонуклеотиды, содержащие множество нуклеотидных субъединиц, имеющих 2'-О-метоксиэтильную модификацию, могут иметь такую модификацию на любой из нуклеотидных субъединиц в этом олигонуклеотиде и могут быть химерными олигонуклеотидами. Кроме 2'-О-метоксиэтильной модификации или наряду с 2'-O-метоксиэтильной модификацией обсуждаются также олигонуклеотиды, содержащие другие модификации, которые усиливают антисмысловую эффективность, силу или аффинность в отношении мишени. Данное изобретение обеспечивает также полинуклеотиды (например, ДНК, РНК, ПНК или т.п.), которые связываются с двухцепочечными или дуплексными нуклеиновыми кислотами коннексина (например, в уложенном районе РНК коннексина или в гене коннексина), образуя содержащую тройную спираль, или триплексную нуклеиновую кислоту. Образование тройной спирали приводит к ингибированию экспрессии коннексина, например, предотвращением транскрипции гена коннексина, уменьшая или элиминируя, следовательно, активность коннексина в клетке. Не желая быть связанными каким-либо конкретным механизмом, авторы данного изобретения считают, что спаривание тройной спирали нарушает способность двойной спирали открываться достаточным образом для связывания полимераз, факторов транскрипции или связывания с регуляторными молекулами. Триплексные олиго- и полинуклеотиды конструируют с использованием правил спаривания оснований образования тройной спирали (см., например, Cheng et al., J. Biol. Chem. 263: 15110 (1988); Ferrinand Camerini-Otero, Science 354:1494 (1991); Ramdas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9591 (1986 и последовательности мРНК и/или гена коннексина. Обычно образующие триплекс олигонуклеотиды содержат специфическую последовательность из приблизительно 10-25 нуклеотидов или более длинную последовательность, "комплементарную" специфической последовательности в РНК или гене коннексина (т.е. достаточно большую для образования стабильной тройной спирали, но достаточно малую, в зависимости от способа доставки, для введения in vivo, если желательно). В этом контексте "комплементарные" обозначает "способные к образованию тройной спирали". В одном варианте осуществления олигонуклеотиды конструируют для специфического связывания с регуляторными районами гена коннексина (например, фланкирующей 5'-последовательностью, промоторами и энхансерами) или с сайтом инициации транскрипции (например, между -10 и +10 от сайта инициации транскрипции). В отношении недавних терапевтических достижений с использованием триплексной ДНК см. Gee et al., in Huber and Carr,1994, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co, Mt Kisco NY и Rininsland et al., 1997,- 22015670Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5854. Данное изобретение обеспечивает также рибозимы, применимые для ингибирования активности коннексина. Рибозимы связывают и специфически расщепляют и инактивируют мРНК коннексина. Применимые рибозимы могут содержать 5'- и 3'-концевые последовательности, комплементарные мРНК коннексина, и могут быть сконструированы специалистом в данной области на основе мРНКпоследовательности коннексина. Обсуждается, что обеспеченные здесь рибозимы включают в себя рибозимы, имеющие характеристики интронов-рибозимов группы I. (Chech, Biotechnology 13:323 (1995, и характеристики молотоголовых рибозимов (Edgington, Biotechnology 10:256 (1992. Рибозимы включают в себя рибозимы, имеющие сайты расщепления, такие как GUA, GUU и GUC. Короткие РНК-олигонуклеотиды с длиной 15-20 рибонуклеотидов, соответствующие району гена коннексина-мишени, содержащему этот сайт расщепления, могут оцениваться в отношении вторичных структурных признаков, которые могут делать этот олигонуклеотид более желательным. Пригодность сайтов расщепления может быть оценена также испытанием доступности для гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами с использованием анализов рибонуклеазной защиты или испытанием invitro рибозимной активности в соответствии со стандартными процедурами, известными в данной области. Далее предусмотрены антисмысловые соединения, в которых антисмысловая и рибозимная функции могут быть объединены в едином олигонуклеотиде. Кроме того, рибозимы могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов или модифицированных связей между нуклеотидами,как описано выше в связи с описанием иллюстративных обеспеченных здесь антисмысловых олигонуклеотидов. Данное изобретение обеспечивает также полинуклеотиды, применимые для ингибирования активности коннексина такими способами, как интерференция РНК (RNAi) (тип сайленсинга генов). Этот и другие способы супрессии генов хорошо известны в данной области. Обзор этого способа можно найти вScience 288:1370-1372 (2000). RNAi действует на посттранскрипционном уровне и является последовательность-специфической. Этот способ предусматривает введение РНК с частично или полностью двухцепочечной природой или предшественников такой РНК или РНК, способной кодировать такую РНК, в клетку или во внеклеточную среду. Как описано Fire et al., U.S. Patent No. 6,506,559, эта РНК может содержать одну или несколько цепей полимеризованного рибонуклеотида. Двухцепочечная структура может быть образована отдельной самокомплементарной цепью РНК или двумя комплементарными РНК-цепями. Эти РНК могут включать в себя модификации либо в отношении фосфатсахарного скелета, либо в отношении нуклеозидов. Образование РНК-дуплекса может быть инициировано либо внутри, либо снаружи клетки. Исследования продемонстрировали, что одна или несколько рибонуклеаз специфически связываются с двухцепочечной РНК и расщепляют двухцепочечную РНК на короткие фрагменты. Рибонуклеаза(рибонуклеазы) остаются связанными с этими фрагментами, которые, в свою очередь, специфически связываются с комплементарной мРНК, т.е. специфически связываются с цепью транскрибированной мРНК для гена коннексина. Эта мРНК для гена коннексина также деградируется рибонуклеазой (рибонуклеазами) на короткие фрагменты, с устранением посредством этого транскрипции и экспрессии гена коннексина и ингибированием, таким образом, активности коннексина. Кроме того, РНК-полимераза может действовать, облегчая синтез многочисленных копий этих коротких фрагментов, который экспоненциально увеличивает эффективность этой системы. Уникальным признаком этого пути супрессии генов является то, что сайленсинг не ограничен клетками, в которых он инициируется. Эффекты сайленсинга генов могут распространяться в другие части организма и даже переноситься через зародышевую линию в несколько поколений. В одном аспекте зависимая от двухцепочечной РНК (dsRNA) специфическая посттранскрипционная стратегия интерференции РНК (RNAi) включает в себя использование коротких интерферирующих РНК (siRNA). Использование общего RNAi-подхода подвержено определенным недостаткам, в том числе неспецифическому антивирусному механизму защиты в клетках млекопитающих, активируемых в ответ на длинные dsRNA-молекулы (Gil J, Esteban M, "Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent proteinkinase (PKR): Mechanism of action". Apoptosis 2000, 5:107-114). Прогресс в данной области был достигнут демонстрацией того, что синтетические дуплексы РНК из 21 нуклеотида могли опосредовать генспецифическую интерференцию РНК (RNAi) в клетках млекопитающих без индуцирования общих антивирусных механизмов защиты (Elbashir S, et al., "Duplex of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interferencein cultured mammalian cells". Nature 2001, 411:494-498; Caplen N, et al., Proc. Natl. Acad. Sci 2001, 98:97429747). Таким образом, siRNA все больше признаются в качестве мощных инструментов для генспецифической модуляции. Как описано здесь, интерференция РНК (RNAi) включает в себя группу связанных с сайленсингом генов механизмов, имеющих многочисленные общие биохимические компоненты, в которых конечной эффекторной молекулой является, например, но не только, малая, состоящая из 21-23 нуклеотидов, антисмысловая РНК. Один механизм использует относительно длинный dsRNA-триггер", который процессируется клеточным ферментом Dicer на короткие, например, но не только, состоящие из 21-23 нуклео- 23015670 тидов dsRNA, называемые siRNA. Цепь siRNA, комплементарная РНК-мишени, становится включенной в мультибелковый комплекс, называемый РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (RISC), где она служит гидом для эндонуклеолитического расщепления цепи мРНК в сайте-мишени. Это приводит к деградации всей мРНК; затем эта антисмысловая siRNA может рециклировать. В низших организмах РНК-зависимая РНК-полимераза также использует отожженную siRNA-гида в качестве праймера, генерирующего больше dsRNA из мишени, которая, в свою очередь, служит в качестве субстрата Dicer, генерируя больше siRNA и амплифицируя сигнал siRNA. Этот путь обычно используется в качестве защитного механизма против вирусов в растениях. Как описано здесь, siRNA может состоять из двух отдельных, отожженных отдельных цепей, например, из 21-23 нуклеотидов, где концевые два З'-нуклеотида являются неспаренными (3'-выступ). Альтернативно, эти siRNA могут быть в форме единой структуры стебель-петля, часто называемой короткой шпилечной РНК (shRNA). Обычно, но не всегда, эта антисмысловая цепь shRNA является также полностью комплементарной смысловой цепи партнера si/shRNA. В клетках млекопитающих длинные dsRNA (обычно имеющие длину, большую, чем 30 нуклеотидов) запускают интерфероновый путь активацией протеинкиназы R и 2',5'-олигоаденилатсинтазы. Активация интерферонового пути может приводить к глобальной понижающей регуляции трансляции, а также к глобальной деградации РНК. Однако сообщалось, что более короткие siRNA, экзогенно введенные в клетки млекопитающих, обходят этот интерфероновый путь. Антисмысловой продукт siRNA может быть также получен из эндогенных микро-РНК. В клетках человека, независимо от начальной формы (siRNA или микро-РНК) или пути процессинга, конечная зрелая, например, но не только) состоящая из 21-23 нуклеотидов антисмысловая РНК, которая является полностью гомологичной мРНК, будет управлять расщеплением мРНК. Обычно действие ошибочных оснований между siRNA и сайтами-мишенями может варьироваться от почти нулевой до полной нейтрализации активности по причинам, которые являются только частично понимаемыми; однако по меньшей мере в одном случае частичная гомология приводила к ингибированию трансляции мРНК. ОбычноsiRNA с ошибочными спариваниями, сконструированная для имитации прототипического взаимодействия микро-РНК/мишень, может опосредовать варьирующиеся степени трансляционного регресса, в зависимости как от специфического взаимодействия, так и от числа сайтов-мишеней в данной мРНК. RNAi может быть активирована либо экзогенной доставкой предобразованных siRNA, либо через экспрессию на основе промотора siRNA или shRNA. Короткие интерферирующие РНК (siRNA) могут быть синтезированы химически или генерированы системами векторов на основе ДНК. Обычно это включает в себя транскрипцию коротких шпилечных РНК (shRNA), которые эффективно процессируются с образованием siRNA в клетках (Paddison P, CaudiAcad. Sci. USA 2002, 8:5515-5520; Brummelkamp T, et al., Science 2002, 296:550-553). Таким образом, в данном контексте siRNA могут быть использованы в качестве эффективной стратегии для тканеспецифического нацеливания и модуляции экспрессии генов. Олигонуклеотиды, используемые в соответствии с данным изобретением, могут быть получены удобным и рутинным образом с использованием хорошо известного способа твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза продается несколькими продающими фирмами, известными в данной области. Могут быть использованы также любые другие способы; фактический синтез олигонуклеотидов хорошо известен в данной области. Хорошо известно использование сходных способов для получения олигонуклеотидов, таких как производные фосфоротиоата и 2'-алкокси- или 2'-алкоксиалкоксипроизводные, в том числе 2'-О-метоксиэтилолигонуклеотиды (Martin, P. Helv. Chim. Acta 1995, 78, 486504). Хорошо известно также использование сходных способов и коммерчески доступных модифицированных амидитов и стекла с контролируемым размером пор (CPG), таких как модифицированные биотином, флуоресцеином, акридином или псораленом амидиты и/или CPG (доступные из Glen Research, Sterling, Va.), для синтеза флуоресцентно меченых, биотинилированных или других конъюгированных олигонуклеотидов. Способы В другом аспекте данное изобретение включает в себя способы лечения субъекта (например, пациента) введением антисмысловых соединений этому субъекту. В общем, эти способы включают в себя способы конструирования ткани и способы уменьшения повреждения ткани, связанного с медицинскими процедурами, в том числе, но не только, с офтальмологическими процедурами. Этот способ может предусматривать, например, введение антисмыслового соединения в глаз указанного субъекта в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина человека в глазу или в клетках, ассоциированных с глазом этого субъекта. Хотя предпочтительно, чтобы ингибировалась экспрессия белка коннексина человека, ожидается, что и другие белки могут быть мишенями для модуляции антисмысловыми соединениями либо отдельно, либо в комбинации с антисмысловыми соединениями, которые ингибируют экспрессию коннексинов человека.- 24015670 В некоторых вариантах осуществления офтальмологической процедурой является офтальмологическая хирургия, в том числе, но не только, эксимерная лазерная фоторефрактивная кератэктомия, удаление катаракты, трансплантация роговицы, хирургия для коррекции рефракции (преломления), радиальная кератотомия, фильтрующая хирургия по поводу глаукомы, кератопластика, эксимерная лазерная фоторефрактивная кератэктомия, трансплантация роговицы, хирургия для коррекции рефракции (преломления), иссечение неоплазмы глазной поверхности, трансплантация конъюнктивы или амниотической оболочки, иссечение птеригия и пингвекулы, глазная пластическая хирургия, иссечение опухоли века,процедуры ремоделирования века для врожденных патологий, репарация эктропиона и энтропиона глазного века, хирургия по поводу страбизма (косоглазия) (глазной мышцы) или любой проникающей травмы глаза. В некоторых вариантах осуществления обеспеченные здесь антисмысловые соединения вводят локальным или местным введением. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть также введены системно или внутриглазной инъекцией. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены субъекту в заранее определенное время, например, относительно образования раны, так как это имеет место в офтальмологической процедуре (например, хирургической). Например, антисмысловые соединения могут быть введены перед офтальмологической процедурой, во время офтальмологической процедуры или после офтальмологической процедуры. Например, антисмысловые соединения могут быть введены субъекту в пределах минут или часов до или после выполнения офтальмологической процедуры. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение вводят после выполнения офтальмологической процедуры и, например, антисмысловое соединение вводят в пределах приблизительно 4 ч этой процедуры, в пределах приблизительно 3 ч этой процедуры и, более часто, в пределах приблизительно 2 ч офтальмологической процедуры или в пределах приблизительно 1 ч офтальмологической процедуры, например, в пределах 5, 10, 15, 20, 30, 45 мин офтальмологической процедуры. В другом аспекте обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены в способах для выполнения конструирования ткани. В этих вариантах осуществления и некоторых других обеспеченных здесь антисмысловые соединения обычно вводят на протяжении более продолжительных периодов времени, например на протяжении ряда дней, недель, месяцев или даже более длительных периодов,и антисмысловые соединения могут вводиться независимо от конкретной процедуры, выполняемой на пациенте, например процедуры, выполняемой на глазу. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены вместе со способом, который увеличивает толщину ткани роговицы в субъекте, в том числе в способах, которые не связаны с офтальмологической процедурой и в способах, в которых антисмысловые соединения вводят в связи с офтальмологической процедурой (например, хирургией). Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены вместе со способом, который стимулирует заживление или предотвращает повреждение ткани в клетках, ассоциированных с роговицей этого субъекта (например, роговичных клетках). Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены в сочетании со способом, который уменьшает образование рубцов в глазу пациента. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены в сочетании со способом, который уменьшает помутнение в глазу субъекта. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который модулирует гиперцеллюлярность (повышенное содержание клеток), ассоциированную с дифференцировкой миофибробластов, ассоциированной с местом индуцированного лазером повреждения, предпочтительно в 24-часовом - 48-часовом периоде после хирургии. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который модулирует стромальное ремоделирование и уменьшает помутнение зрения, связанное с местом индуцированного лазером повреждения, предпочтительно в 24-часовом - 72-часовом периоде после хирургии. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который увеличивает движение эпителиальных клеток в глазу субъекта. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который приводит к увеличению движения эпителиальных клеток в пределах 12 ч введения антисмыслового соединения в глаз пациента. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который приводит к увеличению движения эпителиальных клеток в пределах 24 часов введения антисмыслового соединения в глаз субъекта. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который предотвращает увеличение плотности стромальных клеток. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который ингибирует стромальный отек, связанный с местом индуцированного лазером повреждения, в 24-часовом - 72-часовом периоде после хирургии. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который уменьшает эпителиальную гиперплазию в 24-часовом - 72-часовом периоде после хирургии. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который уменьшает активацию миофибробластов в периоде до 1 недели после хирургии. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который модулирует дифференцировку клеток, которая модифицирует внеклеточный матрикс. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения мо- 25015670 гут вводиться в сочетании со способом, который уменьшает пролиферацию клеток. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение уменьшает образование рубцов. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение уменьшает воспаление. В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение стимулирует заживление ран. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антисмысловое соединение используют вместе с хирургической процедурой имплантации. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, антисмысловое соединение направлено на коннексин 43 и вводится для регуляции деления и роста эпителиальных базальных клеток. В некоторых вариантах осуществления, антисмысловое соединение направлено на коннексин 31.1 и вводится для регуляции кератинизации наружного слоя. В других вариантах осуществления этот способ стимулирует заживление или предотвращает повреждение ткани в клетках, ассоциированных с роговицей субъекта. Согласно определенному варианту осуществления, антисмысловые соединения используют в способах, которые увеличивают толщину ткани роговицы в субъекте, или в способе, который приводит к уменьшению повреждения ткани в корнеальных клетках в субъекте, или в способе, который приводит к уменьшению повреждения ткани в клетках, связанных с роговицей субъекта, или в способе, выполняемом вместе с процедурой эксимерной лазерной фоторефрактивной кератэктомии в субъекте, или в способе, который модулирует гиперцеллюлярность (повышенное содержание клеток), ассоциированную с дифференцировкой миофибробластов,связанной с местом индуцированного лазером повреждения, предпочтительно в 24-часовом - 48-часовом периоде после хирургии, или в способе, который модулирует стромальное ремоделирование и уменьшает помутнение зрения, ассоциированное с местом индуцированного лазером повреждения, предпочтительно в 24-часовом - 72-часовом периоде после хирургии, или в способе, который ингибирует стромальный отек, ассоциированный с местом индуцированного лазером повреждения, в 24-часовом - 72-часовом периоде после хирургии, или в способе, который уменьшает эпителиальную гиперплазию, предпочтительно в 24-часовом - 72-часовом периоде после хирургии, или в способе, который уменьшает активацию миофибробластов, в периоде до 1 недели после хирургии, или в способе, который модулирует дифференцировку клеток, которая модифицирует внеклеточный матрикс, или в способе, который уменьшает пролиферацию клеток. В некоторых вариантах осуществления офтальмологической процедурой является удаление катаракты. В других вариантах осуществления офтальмологической процедурой является трансплантация роговицы. В других вариантах осуществления офтальмологической хирургической процедурой является радиальная кератотомия. В других вариантах осуществления офтальмологической процедурой является фильтрующая хирургия по поводу глаукомы. В других вариантах осуществления офтальмологической процедурой является кератопластика. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение или композицию вводят локальным или местным введением. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение или композицию вводят прямым нанесением в хирургическую рану. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение или композицию вводят внутриглазной инъекцией. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение или композицию вводят перед выполнением хирургической процедуры. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение или композицию вводят во время хирургической процедуры. В некоторых неограничивающих вариантах осуществления антисмысловое соединение или композицию вводят в пределах приблизительно 15 мин перед выполнением офтальмологической процедуры или в пределах до приблизительно 2 ч после офтальмологической процедуры. В некоторых других вариантах осуществления, например, при конструировании ткани, обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в течение дней или даже месяцев. В некоторых дополнительных вариантах осуществления соединения и композиции используют для стимуляции заживления или для предотвращения повреждения ткани в клетках, ассоциированных с роговицей, где клетками, ассоциированными с роговицей, могут быть любые клетки в глазу, в том числе,но не только, корнеальные клетки. Обеспеченные здесь агенты, включающие в себя антисмысловые соединения, могут увеличивать толщину ткани роговицы в субъекте. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение используют в комбинации с другим соединением, применимым для уменьшения повреждения ткани или стимулирующим заживление. Например, антисмысловое соединение может вводиться совместно с фактором роста, цитокином или т.п., в том числе, но не только, FGF,NGF, NT3, PDGF, TGF, VEGF, BDGF, EGF, KGF, интегринами, интерлейкинами, плазмином и семафоринами. В другом аспекте обеспечена фармацевтическая композиция для уменьшения повреждения ткани,ассоциированного с офтальмологической хирургией. Фармацевтическую композицию готовят подходящим образом для местного или локального введения в глаз субъекта, и она содержит антисмысловое соединение, присутствующее в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина человека в клетках, связанных с глазом этого субъекта. Это антисмысловое соединение нацелено предпочтительно, по меньшей мере, на приблизительно 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из SEQ ID NO:12-31. В некоторых вариантах осуществления эти антисмысловые соединения находятся в- 26015670 форме фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель или переносчик, и агент или антисмысловое соединение присутствует в количестве, эффективном для стимуляции заживления раны в субъекте. В некоторых вариантах осуществления эти фармацевтические композиции могут находиться, например, в форме, подходящей для местного введения, в том числе в форме,подходящей для местного или локального введения в глаз субъекта. В некоторых дополнительных вариантах осуществления эти композиции и формы могут быть в форме геля, крема или любой из описанных здесь форм. В другом аспекте обеспечены способы лечения повреждения центральной нервной системы. Этот способ предусматривает введение антисмыслового соединения в участок, проксимальный в отношении предсуществующей раны в центральной нервной системе, связанной с хирургической процедурой, выполняемой на пациенте для лечения указанного повреждения центральной нервной системы, где указанное антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на приблизительно 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из SEQ ID NO:12-31. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение вводят для уменьшения потери нейронов вследствие физической травмы спинного мозга. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение вводят в участок, смежный с раной, которая является результатом травмы. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение вводят в участок, смежный с раной, которая является результатом хирургии. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение вводят в участок, смежный с повреждением спинного мозга. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение нацелено на коннексин 43 и вводится для регуляции деления и роста эпителиальных базальных клеток. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение стимулирует заживление раны. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение уменьшает воспаление. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение уменьшает образование рубцов. В некоторых вариантах этого способа повреждением центральной нервной системы является повреждение спинного мозга. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение вводят пациенту при по меньшей мере приблизительно 24 ч после физической травмы спинного мозга. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение используют в сочетании с хирургической процедурой трансплантации. В некоторых дополнительных вариантах этого способа хирургическая процедура трансплантации связана с имплантатом, предобработанным антисмысловым соединением для ускорения заживления раны. В другом аспекте обеспечены антисмысловые соединения,способные стимулировать регенерацию нейронов в ассоциации с процедурой для лечения предсуществующей раны в пациенте, отличающейся потерей нейронов. В некоторых вариантах осуществления эти агенты являются антисмысловыми соединениями, имеющими длину 40 нуклеотидных оснований, которые нацелены по меньшей мере на 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин человека, в связи с процедурой для стимуляции регенерации нейронов для лечения предсуществующей раны в пациенте. Эта рана включает в себя раны, отличающиеся потерей нейронов. Коннексины, на которые может проводиться нацеливание, включают в себя коннексины, имеющие последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из SEQ ID NO:12-31. В этих вариантах осуществления, антисмысловые соединения могут быть выедены пациенту при по меньшей мере 24 ч после физической травмы спинного мозга указанного пациента, которая привела к потере нейронов. Антисмысловые соединения могут вводиться пациенту при более чем 24 ч, после физической травмы, которая привела к потере нейронов. В некоторых вариантах фармацевтических композиций и способов антисмысловое соединение нацелено, по меньшей мере, на приблизительно 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин 30 человека или коннексин 37 человека. Предпочтительно, антисмысловое соединение ингибирует экспрессию белка коннексина 30 или 37 человека в клетках, ассоциированных с глазом пациента. Другие фармацевтические композиции содержат антисмысловое соединение, нацеленное, по меньшей мере, на приблизительно 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты,кодирующей коннексин (например, человека), имеющей последовательность нуклеотидных оснований,выбранную из SEQ ID NO:12-31, и предпочтительно это антисмысловое соединение ингибирует экспрессию коннексина человека в связи с процедурой для стимуляции регенерации нейронов для лечения предсуществующей раны в пациенте, которая отличается потерей нейронов. Фармацевтические композиции В другом аспекте данное изобретение включает в себя фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения. В одном варианте осуществления обеспечена фармацевтическая композиция для уменьшения повреждения ткани, связанного с офтальмологической процедурой (например, хирургией), так что эту фармацевтическую композицию готовят для местного или локального введения в глаз субъекта, и она содержит антисмысловое соединение, присутствующее в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина человека в клетках, связанных с глазом этого субъекта. В некоторых вариантах осуществления это антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин (например, человека), имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из SEQ ID NO:12-31. В некото- 27015670 рых вариантах осуществления эта фармацевтическая композиция включает в себя фармацевтически приемлемый носитель, содержащий забуференный Плюроник (кислоту или гель), например, до приблизительно 30% Плюроника (кислоты) в забуференном фосфатом солевом растворе. Антисмысловая композиция может содержать различные количества Плюроника (кислоты или геля), в том числе, без ограничения, в количествах до приблизительно 5% Плюроника (кислоты) в забуференном фосфатом солевом растворе, до приблизительно 10% Плюроника (кислоты) в забуференном фосфатом солевом растворе, до приблизительно 15% Плюроника (кислоты) в забуференном фосфатом солевом растворе, до приблизительно 20% Плюроника (кислоты) в забуференном фосфатом солевом растворе, до приблизительно 25% Плюроника (кислоты) в забуференном фосфатом солевом растворе, до приблизительно 30% Плюроника(кислоты) в забуференном фосфатом солевом растворе. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут также включать в себя биоэквивалентные соединения, в том числе фармацевтически приемлемые соли и пролекарства. Предполагается, что они включают в себя любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров, или любое другое соединение, которое, после введения животному, в том числе человеку, способно обеспечивать (прямо или опосредованно) биологически активный метаболит или его остаток. Таким образом, например, описаны также фармацевтически приемлемые соли нуклеиновых кислот и пролекарств таких нуклеиновых кислот. "Фармацевтически приемлемые соли" являются физиологически или фармацевтически приемлемыми солями обеспеченных здесь нуклеиновых кислот, т.е. соли, которые сохраняют желаемую биологическую активность исходного соединения и не сообщают ему нежелательных токсикологических эффектов (см., например, Berge et al., J. of Pharma Sci. 1977, 66,1-19). Для олигонуклеотидов примеры фармацевтически приемлемых солей включают в себя, но не ограничиваются ими, (а) соли, образованные с катионами, такими как натрий, калий, аммоний, магний, кальций, полиаминами, такими как спермин и спермидин, и т.д.; (b) кислотно-аддитивные соли, образованные с неорганическими кислотами, например, хлористо-водородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и т.п.; (с) соли, образованные с органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, танниновая кислота, пальмитиновая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, нафталиндисульфоновая кислота, и т.п.; и (d) соли, образованные из элементарных анионов, таких как хлор, бром и иод. Обеспеченный здесь олигонуклеотид может быть приготовлен дополнительно или альтернативно для доставки в форме пролекарства. Термин пролекарство обозначает, что терапевтический агент,который приготовлен в неактивной форме, превращается в активную форму (т.е. в лекарственное средство) в организме или его клетках под действием эндогенных ферментов или других химических соединений и/или условий. В частности, варианты пролекарств олигонуклеотидов могут быть получены в виде производных SATE [(S-ацетил-2-тиоэтил)фосфата] в соответствии со способами, описанными в WO 93/24510 to Glosselin et al., published Dec. 9, 1993. Антисмысловые соединения могут быть составлены в фармацевтическую композицию, которая может включать в себя фармацевтически приемлемые носители, загустители, разбавители, буферы, консерванты, поверхностно-активные вещества, нейтральные или катионные липиды, липидные комплексы,липосомы, усилители проницаемости, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты и т.п., наряду с рассматриваемым олигонуклеотидом. Фармацевтические композиции могут также включать в себя один или несколько активных ингредиентов, таких как интерфероны, антимикробные агенты, противовоспалительные агенты, анестетики и т.п. Формы для парентерального введения могут включать в себя стерильные растворы, которые могут также содержать буферы, липосомы, разбавители и другие подходящие добавки. Фармацевтические композиции, содержащие обеспеченные здесь олигонуклеотиды, могут включать в себя усилители проницаемости для ускорения доставки через пищеварительный тракт. Усилители проницаемости могут быть классифицированы как принадлежащие к одной из пяти широких категорий, а именно, жирным кислотам, хелатообразующим агентам, поверхностно-активным веществам и агентам, не являющимся поверхностно-активными веществами (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1991,8, 91-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1990, 7, 1-33). Могут быть включены один или более усилителей проницаемости из одной или нескольких из этих широких категорий. Различные жирные кислоты и их производные, которые действуют в качестве усилителей проницаемости, включают в себя, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту,миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, рицинолеат, моноолеин (также называемый 1-моноолеоил-рацглицерином), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, глицерил-1-монокапрат, 1 додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, моно- и диглицериды и их физиологически приемлемые соли (т.е. олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т.д.). Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeu- 28015670tic Drug Carrier Systems 1990, 7,1; ElHariri et al., J. Pharm. Pharmacol. 1992 44, 651-654. Физиологическая роль желчи включает в себя облегчение дисперсии и абсорбции липидов и жирорастворимых витаминов (Branton, Chapter 38 In: GoodmanGilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Mc Graw-Hill, New York, N.Y., 1996, pages 934-935). Различные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют в качестве усилителей проницаемости. Таким образом, термин соль желчной кислоты включает в себя любой из природно встречающихся компонентов желчи, а также любое из их синтетических производных. Могут быть использованы комплексные составы, содержащие один или несколько усилителей проницаемости. Например, соли желчных кислот могут быть использованы в комбинации с жирными кислотами с получением комплексных форм. Хелатообразующие агенты включают в себя, но не ограничиваются ими, динатрий-этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат, 5-метоксисалицилат и гомованилинат натрия), N-ацилпроизводные коллагена, laureth-9 и Nаминоацилпроизводные бета-дикетонов (енамины) [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutical Drag Carrier Systems 1990, 7, 1033; Buur et al., J. Control Rel. 1990, 14, 43-51]. Хелатообразующие агенты имеют дополнительное преимущество, служа также в качестве ингибиторов ДНКазы. Поверхностно-активные вещества включают в себя, например, лаурилсульфат натрия, простой полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и простой полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutical Drag Carrier Systems 1991, page 92); и эмульсии перфторированных химических соединений, таких как FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol. 1988, 40, 252-257). He являющиеся поверхностно-активными веществами агенты включают в себя, например, ненасыщенные циклические мочевины, производные 1-алкил- и 1-алкенилазациклоалканона (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutical Drag Carrier Systems 1991, page 92); и нестероидные противовоспалительные агенты, такие как диклофенак-натрий, индометацин и фенилбутазон (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol. 1987, 39, 621-626). В данном контексте соединение-носитель обозначает нуклеиновую кислоту или ее аналог, которые являются инертными (т.е. не обладают как таковые биологической активностью), но узнаются в качестве нуклеиновой кислоты процессами in vivo, которые уменьшают биодоступность нуклеиновой кислоты, имеющей биологическую активность, например, деградацией биологически активной кислоты или усилением ее удаления из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединенияносителя, обычно с избытком последнего вещества, может приводить к существенному уменьшению количества нуклеиновой кислоты, извлекаемого в печени, почке или других находящихся вне кровотока резервуаров, предположительно вследствие конкуренции между соединением-носителем и нуклеиновой кислотой за общий рецептор. В отличие от этого соединения-носителя фармацевтически приемлемый носитель (эксципиент) является фармацевтически приемлемым растворителем, суспендирующим агентом или любым другим фармакологически инертным носителем для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот животному. Фармацевтически приемлемый носитель может быть жидкостью или твердым веществом и может быть выбран в зависимости от планируемого способа введения таким образом, чтобы обеспечивать желаемую массу, консистенцию и т.д., при комбинировании с нуклеиновой кислотой и другими компонентами конкретной фармацевтической композиции. Типичные фармацевтически приемлемые носители включают в себя, но не ограничиваются ими, связывающие агенты (например,предварительно желатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксиметилцеллюлозу и т.д.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу,пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или гидрофосфат кальция и т.д.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, диоксид кремния, коллоидальный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металлов, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.д.); дезинтегрирующие агенты (например, крахмал, натриевый гликолят крахмала и т.д.) или смачивающие агенты (например, лаурилсульфат натрия и т.д.). Обеспеченные здесь композиции могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, обычно используемые в фармацевтических композициях, при их установленных в данной области уровнях использования. Так, например, эти композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически активные материалы, такие как, например, противозудные агенты, вяжущие средства,локальные анестетики или противовоспалительные агенты, или могут содержать дополнительные материалы, применимые в физическом приготовлении различных дозированных форм композиции данного изобретения, такие как красители, вкусовые агенты, консерванты, антиоксиданты, вещества, делающие материал непрозрачным, загущающие агенты и стабилизаторы. Однако такие материалы при их добавлении не должны чрезмерно препятствовать биологической активности компонентов обеспеченных здесь композиций. Независимо от способа, при помощи которого эти олигонуклеотиды вводят пациенту, могут быть использованы коллоидные дисперсионные системы в качестве доставляющих носителей для усиления стабильности in vivo этих олигонуклеотидов и/или для нацеливания этих олигонуклеотидов на конкретные орган, ткань или тип клеток. Коллоидные дисперсионные системы включают в себя, но не ограничи- 29