Рекомбинантный аденовирусный вектор и способы его получения и применения

010828 Область изобретения Изобретение относится к носителям для доставки нуклеиновых кислот и их применению, более конкретно изобретение относится к рекомбинантным аденовирусным векторам и их применению. Предпосылки изобретения До настоящего времени идентифицирован 51 серотип аденовирусов человека, которые подразделяют на 6 подгрупп (А, В, С, D, E и F) на основании свойств гемагглютинации и гомологии последовательностей (Francki et al. 1991). Инфекционный цикл аденовирусов делится на раннюю и позднюю фазы. В ранней фазе вирус теряет оболочку и геном транспортируется в ядро, после этого области ранних генов (E1, Е 2, Е 3 и Е 4) становятся транскрипционно активными. Область E1 содержит две области транскрипции: E1A и E1B. E1A кодирует белки, которые принимают участие в модификации клеточного цикла хозяина и активации других областей транскрипции вируса (обзор Russell 2000). Область E1B кодирует два основных белка: E1B19 К и Е 1 В-55 К, которые предотвращают индукцию апоптоза из-за активности белков ElA (Rao et al. 1992; Yew and Berk 1992; Shenk 1996). Кроме того, белок Е 1 В-55 К необходим в поздней фазе для избирательного транспорта вирусной мРНК и ингибирования экспрессии белков хозяина (Pilder et al. 1986). Е 2 также делится на два субдомена: Е 2 А и Е 2 В, которые вместе кодируют три белка (ДНК-связывающий белок, вирусную полимеразу и претерминальный белок), которые все вовлечены в репликацию вирусного генома (Van der Vliet 1995) . Е 3 не требуется для репликации in vitro, но кодирует несколько белков,которые разрушают механизм защиты хозяина от вирусной инфекции (Horwitz 2001). Е 4 содержит по меньшей мере 6 открытых рамок считывания (orf), которые кодируют белки, вовлеченные в несколько отдельных функций, связанных со сплайсингом и транспортом вирусной мРНК, транспортом мРНК клетки-хозяина, вирусной и клеточной транскрипцией и трансформацией (обзор Leppard 1997). Все поздние белки, необходимые для образования вирусных капсидов и упаковки вирусных геномов, образуются с главной поздней транскрипционной единицей (MLTU), которая становится полностью активной после начала репликации. Сложный процесс дифференциального сплайсинга и полиаденилирования приводит к образованию более 15 видов мРНК, которые имеют общую, состоящую из трех частей лидерную последовательность. Белки Е 1 В-55 К, E4-orf3 и E4-orf6 играют центральную роль в регуляции процессинга и транспорта из ядра поздней вирусной мРНК. В случае указанного процесса Е 1 В-55 К взаимодействует с E4-orf6 с образованием функционального комплекса, который стимулирует транспорт вирусных мРНК в цитоплазму, наряду с тем, что комплекс также вовлечен в ингибирование транспорта клеточных мРНК из ядра в цитоплазму (обзор в Leppard 1997 и 1998). Получение Е 1-делетированных векторов, основанных на серотипах подгруппы С, Ad5 или Ad2,осуществляют в линиях клеток, комплементирующих El, таких как 293 (Graham et al. 1970), 911 (FallauxWO 01/05945, векторы и линия клеток могут быть подобраны так, чтобы избежать образования компетентных по репликации аденовирусов в результате гомологичной рекомбинации между аденовирусными последовательностями в линии клеток и векторе. Для эффективной продукции некомпетентных по репликации аденовирусов, полученных их группы С, предпочтительно используют линию клеток PER.C6. Используя данную линию клеток, можно подобрать аденовирусные векторы, тем самым обеспечив продуцирование аденовирусных векторов группы С в отсутствии компетентного по репликации аденовируса(Fallaux et al. 1998; патент США 6033908). Однако векторы группы С не всегда могут быть идеальными носителями для прямых применений in vivo, так как эффективность инфекции значительно ослаблена из-за присутствия высоких титров нейтрализующей активности у большинства людей и отсутствия достаточных количеств клеточных рецепторов (рецептор аденовируса коксаки, CAR) на специфичных первичных клетках-мишенях (например, эндотелиальных клетках, гладко-мышечных клетках, синовиоцитах, моноцитах и дендритных клетках). Введение высоких количеств вирусов для того, чтобы увеличить трансдукцию, может привести к повышенной токсичности и непредсказуемому клиническому исходу вследствие изменения в нейтрализующих титрах у субъектов, подвергаемых лечению. Указанные ограничения могут быть преодолены в результате использования других серотипов аденовирусов. Например,связывающая рецептор часть фибриллы вирусов подгруппы В частности, серотипа 16), при экспрессии в векторе, основанном на Ad5, опосредовала в значительной степени повышенную инфекцию эндотелиальных клеток и гладко-мышечных клеток человека (WO 00/31285) и синовиоцитов человека (WO 00/52186). Фибрилла другого аденовируса подгруппы В, Ad35, наиболее эффективна в опосредовании инфекции моноцитов и дендритных клеток человека (WO 00/03029). Кроме того, Ad35 идентифицирован как вирус, к которому у огромного большинства людей в популяции отсутствует нейтрализующая активность (WO 00/70071). В данной области, в общем, существует ощутимая необходимость в разработке методики, которая применима в случае более широкого спектра серотипов. Особой проблемой является отсутствие подходящих линий пакующих клеток для указанных других серотипов. Линии пакующих клеток для векторовAd5 обычно содержат кодируемые El белки, полученные из аденовируса серотипа 5. Примерами таких"стандартных" линий пакующих клеток являются 293, 911 и PER.C6. Попытки продуцировать векторы,имеющие происхождение из других серотипов, на указанных стандартных линиях пакующих клеток ока-1 010828 зались трудными, если не безуспешными. Иногда наблюдается некоторая продукция в зависимости от конкретного используемого серотипа. Однако выходы рекомбинантных аденовирусных векторов, полученных из подгрупп аденовирусов, отличных от подгруппы С, продуцируемых в линиях клеток, трансформированных и иммортализованных с помощью E1 из Ad5, являются низкими. В публикации Abrahamsen et al. (1997), повышенная очистка из бляшек Е 1 А-делетированного аденовирусного вектора серотипа 7 (подгруппа В) наблюдалась на клетках 293, содержащих E4-orf6, полученный из аденовируса серотипа 5, по сравнению с клетками 293, не содержащими последовательности E4-orf6 из Ad5. Однако при этом столкнулись с проблемой стабильности вектора, так как наблюдались неожиданные рекомбинации в очищенных из бляшек культурах. Встретилась дополнительная проблема, связанная с вирусным загрязнением аденовирусом дикого типа во время продуцирования. Более того, в случае крупномасштабного получения аденовирусов бесполезно котрансфицировать E4-orf6, чтобы получить титры, которые достаточны высоки для применения. Одним вариантом выращивания таких аденовирусов является снабжение клеток геном E4-orf6, стабильно интегрированным в геном линии комплементирующих/пакующих клеток. Такие клетки описаны в данной области (например, WO 96/22378). Недостатком данной системы является тот факт, что необходимо создавать новые стабильные линии клеток и необходимо осуществлять многочисленные раунды селекции перед тем, как будут созданы стабильные и соответствующие клетки. Указанный процесс является сложным и трудоемким. В общем можно констатировать, что показано, что образование и размножение аденовирусов других серотипов, отличных от серотипа 5 (подгруппа С), таких как вирусы подгруппы В, трудно осуществить на клетках, комплементирующих Ad5. Как описано заявителями в WO 00/70071, рекомбинантные вирусы, основанные на вирусе Ad35 подгруппы B,можно получить с помощью контрансфекции экспрессирующей конструкции, содержащей последовательности ранней области-1 Ad35 (Ad35-E1). Кроме того, показано, что основанные на Ad35 вирусы, которые делетированы только по последовательностям E1A, но не по E1B, эффективно реплицируются в клетках PER.C6, свидетельствуя о том, что белки E1A Ad5 способны комплементировать функции Ad35E1A (международная заявка на выдачу патента авторов данного изобретения PCT/NL01/00824, еще не опубликована). Кроме того, эксперименты показывают, что отсутствие Ad35-E1B приводит к низким выходам на клетках, комплементирующих Ad5. В WO 00/70071 также заявлены линии клеток для продуцирования Е 1-делетированных аденовирусных векторов, не относящихся к группе С, с помощью дополнительной модификации клеточных линий, которые способны комплементировать аденовирус серотипа 5. В WO 00/70071 кроме того высказано предложение о том, что следует разработать новые линии клеток, несущие последовательности Ad35-E1, для комплементации рекомбинантных аденовирусных векторов серотипа 35, не: содержащих области El (см. также международную заявку на выдачу патента авторов данного изобретения PCT/NL01/00824). Однако как обсуждалось выше, если требуется применить конкретный серотип для конкретных нужд, то пришлось бы создавать новую линию клеток для каждого конкретного серотипа, или пришлось бы модифицировать имеющиеся линии клеток, которые могут комплементировать аденовирус серотипа 5, для комплементации представляющего интерес серотипа. Очевидно, было бы выгодно применять созданные линии клеток, доступные в данной области, и не модифицировать указанные линии, а использовать их для продуцирования всех других серотипов, не являющихся серотипом Ad5, применяя разработанные и эффективные способы, известные в данной области. Сделано заключение, что до настоящего изобретения в данной области не имелось гибкой и надлежащей"платформы для получения", которая позволяет получать значительные выходы аденовирусных серотипов, которые отличаются от серотипов подгруппы С. Краткое описание фигур Фиг. 1 является схематичным изображением плазмиды pMT.Orf6.Hygro (ECACCдепозита Р 02041226). Для ясности, прописная буква D означает дельта . Фиг. 2 является схематичным изображением плазмиды pAd35.MT.Orf6. Для ясности, прописная буква D означает дельта . Фиг. 3 является схематичным изображением pUC.35-5E9. Фиг. 4 является изображением стадий клонирования, приводящих к pUC.35-5E4. Фиг. 5 является схематичным изображением pBr.Ad35.PRn. Фиг. 6 является схематичным изображением pBr.Ad35.PR5E4 (ECACCдепозита Р 02041229). Фиг. 7 является схематичным изображением pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4. Фиг. 8 является схематичным изображением pCRscriptAmp.NFI-NcoIR. Фиг. 9 является схематичным изображением pCRscriptAmp.NcoIF-NR2 . Фиг. 10 является схематичным изображением pCR.NF1-NR2. На фиг. 11 показано выравнивание между аминокислотной последовательностью E4-orf6 аденовируса серотипа 5 (SEQ ID NO: 21; верхняя последовательность), аминокислотной последовательностью белка E4-orf6 из аденовируса серотипа 5, клонированного в остове Ad35 (SEQ ID NO: 21; средняя последовательность; NB. идентичная E4-orf6 Ad5, верхней последовательности), которая получена в результате определения порядка нуклеотидов, и аминокислотной последовательностью белка E4-orf6 аденовируса серотипа 35 (SEQ ID NO: 22; нижняя последовательность), свидетельствующее о том, что полный-2 010828 фрагмент, кодирующий белок E4-orf6 в остове аденовируса серотипа 35, был заменен фрагментом, кодирующим белок E4-orf6 аденовируса серотипа 5. На фиг. 12 показано выравнивание между аминокислотной последовательностью белка E4-orf6/7 аденовируса серотипа 5 (SEQ ID NO: 23; верхняя последовательность), аминокислотной последовательностью слитого белка E4-orf6/7, частично кодируемого фрагментом E4-orf6/7 аденовируса серотипа 5,заменяющим соответствующую часть фрагмента E4-orf6/7 аденовируса серотипа 35 в остове аденовируса серотипа 35 (SEQ ID NO: 24; средняя последовательность) и аминокислотной последовательностью белка E4-orf6/7 аденовируса серотипа 35 (SEQ ID NO: 25; нижняя последовательность), свидетельствующее, что последовательность orf6/7 является частично химерной, при этом слияние осуществлено примерно у остатка лизина (К) в положении 138. Для ясности, обозначение orf6+7 следует читать как открытая рамка считывания orf6/7, которая является отдельной открытой рамкой считывания в области Е 4 аденовируса помимо orf6 и orf7, причем обозначение является хорошо известным специалистам в данной области. Фиг. 13 является схематичным изображением pBr.Ad35.PR.50rf6 (ECACCдепозита Р 02041227). Фиг. 14 является схематичным изображением pWE.Ad35.pIX-rITR.50rf6. Фиг. 15 является схематичным изображением pBr.Ad35.PRnE3. Для ясности, прописная буква D означает дельта . Фиг. 16 является схематичным изображением pBr.Ad35.Е 3.PR5E4. Для ясности, прописная букваD означает дельта . Фиг. 17 является схематичным изображением pBr.Ad35.Е 3.PR5Orf6. Для ясности, прописная букваD означает дельта . На фиг. 18 показана система для продуцирования рекомбинантных аденовирусных частиц в таких клетках, как PER.C6, посредством события двойной гомологичной рекомбинации. Фиг. 19 является схематичным изображением pWE.Ad35.pIX-EcoRV. Сущность изобретения Данное изобретение относится к рекомбинантным аденовирусным векторам, содержащим структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, при этом указанный вектор кроме того содержит последовательность, кодирующую белок E4-orf6, где указанная последовательность выбрана из группы, состоящей из: а) последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса второго серотипа, отличного от указанного первого серотипа; b) последовательности, кодирующей E4-orf6,полученной из аденовируса указанного первого серотипа путем делеции, мутации, добавления и/или замены в одном или нескольких кодонах; и с) последовательности, кодирующей E4-orf6, содержащей слияние между частью последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса второго серотипа, отличного от указанного первого серотипа, и частью последовательности, кодирующей E4orf6, полученной из аденовируса третьего серотипа, при этом указанный третий серотип может быть идентичным указанному первому серотипу или отличным от него. Изобретение кроме того относится к способам получения таких рекомбинантных аденовирусных векторов, содержащих структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, при этом указанный способ включает в себя стадии: а) обеспечения комплементирующей клетки, несущей последовательность, кодирующую Е 1 В-55 К, полученную из аденовируса второго серотипа в экспрессируемой форме, необходимыми элементами аденовируса, такими как элементы, обеспечивающие сборку указанного рекомбинантного аденовирусного вектора указанной комплементирующей клеткой, при этом указанные элементы содержат по меньшей мере некоторые структурные и неструктурные элементы из аденовируса указанного первого серотипа, отличного от указанного второго серотипа, и последовательностью, кодирующей функциональный белок E4-orf6 или его функциональную часть, производное и/или аналог, который совместим с указанным экспрессируемым белком Е 1 В-55 К в указанной комплементирующей клетке; b) культивирования указанной комплементирующей клетки в среде в условиях, позволяющих происходить продуцированию и сборке аденовирусного вектора; и с) сбора рекомбинантного аденовирусного вектора, полученного таким образом, из среды и/или комплементирующей клетки, при этом последовательность, кодирующая совместимый белок E4-orf6, присутствует в полученном таким образом рекомбинантном аденовирусном векторе. Изобретение кроме того относится к фармацевтическим композициям, содержащим аденовирусные векторы согласно изобретению, и лечению индивидуумов с использованием аденовирусных векторов,предлагаемых в данном изобретении. Изобретение также относится к наборам частей, содержащим клеточные линии и аденовирусные векторы, предлагаемые в изобретении, для осуществления способов,предлагаемых в изобретении. Подробное описание В данном изобретении предлагаются способы и средства для решения некоторых трудностей, связанных с ослабленной комплементацией аденовирусных векторов, не относящихся к группе С, в Ad5 пакующих/комплементирующих клетках. Хотя в линиях клеток, комплементирующих Ad5, присутствует экспрессия функционального Ad5E1B-55K, было обнаружено, что могут быть получены только очень-3 010828 низкие титры аденовирусных векторов в том случае, когда остов аденовируса имеет происхождение из аденовируса, не относящегося к группе С; полученные данные свидетельствуют о связанной с серотипом специфичности взаимодействия Е 1 В-55 К с другим (вирусным) белком. В данном описании заявлено, что указанную зависимость от серотипа можно обойти, предоставляя белком E4-orf6, совместимый с белком Е 1 В-55K, предоставляемым линий комплементирующих клеток. Как обсуждается в данном описании,Е 1 В-55K и E4-orf6 образуют комплекс, который участвует в ингибировании транспорта клеточных мРНК из ядра в цитоплазму, при этом комплекс также вовлечен в стимулирование транспорта вирусных мРНК из ядра в цитоплазму. Авторами данного изобретения обнаружено, что для правильной комплементации вирусных векторов в пакующих клетках требуется присутствие продуктов генов Е 1 В-55K E4-orf6, которые являются совместимыми. Пакующие клетки также называют комплементирующими клетками, если клетки содержат определенные последовательности, кодирующие белки, которые комплементируют функции, не предоставляемые вектором, который должен быть упакован. Следовательно, "совместимые" в используемом в данном описании смысле означает, что в случае комплекса с имеющимися генным продуктом Е 1 В-55K возможно образование функционального комплекса с имеющимся генным продуктом E4-orf6 в том смысле, что данный белковый комплекс поддерживает репликацию, размножение и/или упаковку вируса на уровне, который сравним с ситуацией в случае дикого типа или который сравним с ситуацией, обнаруженной в том случае, когда рекомбинантный аденовирусный вектор серотипа 5 получают в такой линии клеток, комплементирующих Ad5, как 293 или PER.С 6. Репликация вектора в пакующих клетках эффективна, если в течение периода продуцирования, в ходе которого образуется вектор, клетка содержит по меньшей мере белок Е 1 В-55K и белок E4-orf6, которые совместимы. Предпочтительно последовательности Е 1 В-55K и E4-orf6 являются последовательностями из аденовирусов,относящихся к одной и той же подгруппе аденовирусов (такой как А, В, С, D, E или F) . Более предпочтительно последовательности Е 1 В-55K и E4-orf6 происходят из одного и того же серотипа. Так как в данной области имеются созданные линии клеток, которые способны поддерживать рост аденовирусов подгруппы С, таких как аденовирусов серотипа 5, еще более предпочтительно, чтобы гены Е 1 В-55K иE4-orf6 были получены из аденовируса серотипа 5. Как будет понятно специалисту, совместимость можно определить в тестах или анализах комплементации, по существу известных специалистам в области получения аденовирусных векторов. Специалисту в данной области также будет понятно, что данное изобретение также можно применять для получения любого аденовирусного серотипа в любой комплементирующей линии клеток, при условии, что белки Е 1 В-55 К и E4-orf6 являются совместимыми. Кроме того, было обнаружено, что продукт гена E4-orf6 "сочетающийся" с E1B в комплементирующей линии клеток, может быть предоставлен аденовирусным вектором при замене E4-orf6 в выбранном аденовирусном векторе последовательностью, кодирующей E4-orf6, которая совместима с геномE1B, присутствующем в пакующей линии клеток. Неожиданно обнаружено, что данная модификация не оказывает сильного влияния на стабильность, репликацию, упаковку, сборку и продуцирование вектора. Особым аспектом изобретения является то, что теперь можно эффективно продуцировать аденовирусы других серотипов, отличных от серотипов подгруппы С, на линиях клеток, обычно применяемых для получения аденовируса серотипа 5 или другого серотипа из подгруппы С, такого как серотип 1, 2 и 6. В данном изобретении предлагаются способы получения аденовирусов, не относящихся к группе С, без необходимости отдельно обеспечивать комплементирующую (пакующую) клетку E4-orf6, так как последовательность E4-orf6, которая совместима с комплементирующей последовательностью Е 1 В-55 К,включают в остов аденовируса. В данном изобретении предлагается рекомбинантный аденовирусный вектор, содержащий структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, при этом указанный вектор кроме того содержит последовательность, кодирующую функциональный белок E4-orf6 или его функциональную часть, производное и/или аналог, где указанная последовательность выбрана из группы состоящей из: а) последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса второго серотипа, отличного от указанного первого серотипа; b) последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса указанного первого серотипа, содержащей делецию, мутацию, добавление и/или замену в одном или нескольких кодонах; и с) последовательности, кодирующей E4-orf6, содержащей слияние между частью последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из второго серотипа, отличного от указанного первого серотипа, и частью последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из третьего серотипа,при этом, указанный третий серотип может быть идентичным указанному первому серотипу или отличным от него. В одном варианте данное изобретение относится к рекомбинантному аденовирусному вектору согласно изобретению, причем указанный первый серотип и указанный второй серотип относятся к разным подгруппам аденовирусов. В предпочтительном варианте предлагается рекомбинантный аденовирусный вектор согласно изобретению, причем указанный первый серотип относится к другой подгруппе, отличной от подгруппы С, и указанная последовательность, кодирующая E4-orf6, получена из аденовируса серотипа подгруппы С. Более предпочтительным является рекомбинантный аденовирус согласно изобретению, где указанный первый серотип относится к подгруппе В, а указанный второй серотип относится к подгруппе С. Еще более предпочтительно - указанная последовательность, кодирующаяE4-orf6, получена из аденовируса серотипа 5.-4 010828 Специалистам в данной области известно, что у людей циркулируют различные уровни нейтрализующих антител, которые направлены против различных серотипов. Обнаружено, что некоторые серотипы аденовирусов сталкиваются с высокими титрами таких нейтрализующих антител и что многие люди в разных популяциях несут нейтрализующие антитела против таких серотипов. Также обнаружено, что некоторые серотипы нейтрализовались только в малой части образцов (WO 00/70071). По-видимому,некоторые серотипы из подгруппы В нейтрализовались только в небольшой группе образцов. Таким образом, в предпочтительном варианте данного изобретения предлагаются рекомбинантные аденовирусные векторы согласно изобретению, где указанный первый серотип выбран из группы, состоящей из серотипов аденовирусов 11, 14, 16, 21, 34, 35 и 50. В высокой степени предпочтительны рекомбинантные аденовирусные векторы в случае, когда указанный первый серотип является серотипом 11 или 35, при этом они встречаются с нейтрализующими антителами только в небольшом проценте тестируемых образцов. Векторы согласно данному изобретению можно применять в различных направлениях, таких как генная терапия, функциональная геномика, противоопухолевая вакцинация и/или противовирусная вакцинация. Для этого необходимо, чтобы аденовирусный вектор функционировал как носитель для доставки генов, в котором ненативный ген включен в аденовирусный геном. Затем аденовирусная частица может быть специфично направлена к представляющим интерес клеткам-мишеням; аденовирус связывается с такой специфичной клеткой либо посредством связывания капсид-рецептор, либо другими способами и доставляет трансген. Направление аденовируса к мишени можно осуществить многими различными способами. Специалистам в области направления к мишени аденовирусных векторов будут известны все различные возможности, которые используются для доставки аденовирусных векторов к представляющим интерес клеткам. Такие возможности включают, но не ограничены указанным, изменения капсида(модификации фибриллы, гексона и/или пентона, такие как делеции, перестановки между фибриллами различных серотипов и присоединения пептидов и/или других связывающих остатков), при этом получают химерные фибриллы, которые узнают рецептор, присутствующий на представляющей интерес клетке, или используют связывание пентонного основания. Другими возможностями являются связывание направляющих к мишени остатков с белками капсида, при этом, например, связывающие пептиды,известные и сильно связывающие белки или антитела или их части связывают с белками капсида, чтобы осуществить специфичное направление к мишени. Все указанные векторы можно получить, используя способы и средства, предлагаемые в данном изобретении. Таким образом, в данном изобретении также заявлены рекомбинантные аденовирусные векторы согласно изобретению, кроме того содержащие последовательность, кодирующую неаденовирусный белок, полипептид или пептид. Такие последовательности могут присутствовать в различных положениях в остове аденовируса, но предпочтительно расположены в области El, которая отсутствует в рекомбинантных аденовирусных векторах согласно изобретению. Область El комплементируется элементами (комплементации), присутствующими в комплементирующих клетках. Направление промотора, трансгена и других регуляторных последовательностей может быть ориентировано к левому, а также к правому инвертированному концевому повтору. Данное изобретение также можно использовать для получения вирусных векторов, основанных на аденовирусе и/или на других вирусах, таких как аденоассоциированный вирус (AAV), при чем такая комбинация, как химерный вирус Ad-AAV, может быть интегрирована в геном клетки-хозяина. В данной области известно несколько способов создания интегрирующихся аденовирусов. В общем, изобретение также применимо для получения форм аденовирусов, которые могут (специфично или неспецифично) интегрироваться. Как указано, несколько неаденовирусных трансгенов можно клонировать в рекомбинантных аденовирусных векторах согласно данному изобретению. Указанные трансгены включают не только регуляторные последовательности нуклеиновых кислот, такие как энхансеры, промоторы (например, сильные неаденовирусные промоторы, такие как промотор цитомегаловируса, промотор SV40 и промотор RSV) и сигналы полиаденилирования, но также гетерологичные гены для терапевтических целей. Таким образом, в одном аспекте изобретения предлагаются рекомбинантные аденовирусные векторы согласно изобретению, где указанный неаденовирусный белок, полипептид или пептид выбран из группы, состоящей из полипептида, индуцирующего гибель клетки, антигенной детерминанты патогенного организма, антигена, специфичного для опухоли, вирусного белка, гормона и цитокина. Примерами патогенных организмов являются, но не ограничены указанным, бактерии, вирусы и грибы. Неограничивающими примерами неаденовирусных факторов, белков, полипептидов и пептидов являются транскрипционные факторы, внутриклеточные сигнальные белки, фосфатазы, киназы, факторы, ингибирующие апоптоз, антагонисты рецепторов, растворимые формы связанных с мембранами рецепторов, ингибиторы РНК, антисмысловые РНК, факторы-приманки, рибозимы и более конкретно, тимидинкиназа, эритропоэтин, новый стимулирующий эритропоэз белок (NESP), IL3, ceNOS, гамма-интерферон и gp100. Неаденовирусные вирусные белки можно клонировать в рекомбинантных аденовирусных векторах, приготовленных с помощью способов и средств согласно данному изобретению в целях вакцинации. Такие вирусные белки включают, но не ограничены указанным, gag, pol, env, nef и т.д. для HIV-вакцин, белки Е 6 и Е 7 для вакцин против вируса папилломы человека, белки циркумспорозоита из простейших Plasmodium для вакцин против малярии, компоненты ротавируса для ротавирусных вакцин, белки эбола для вакцин против эбо-5 010828 ла, продукты генов F и G из респираторно-синцитиального вируса (RSV) для RSV-вакцин. НА и NA для вакцин против гриппа и т.д. Рекомбинантные аденовирусы согласно данному изобретению содержат структурные и неструктурные элементы. Примерами структурных элементов являются гены, кодирующие белки капсида, такие как гены фибриллы, гексона и пентона, а также продукты данных генов. Примерами неструктурных элементов являются ранние гены, которые экспрессируются во время инфицирования клетки и которые подвергаются понижающей регуляции, когда продолжается инфекционный цикл. Другими примерами неструктурных элементов являются гены, кодирующие белки, активные во время репликации, такие какpol и рТР. Следует понимать, что рекомбинантные аденовирусные векторы могут содержать структурные и неструктурные элементы, полученные из различных серотипов. Примерами таких векторов, например, являются аденовирусные частицы, несущие химерные фибриллы (см. заявку на выдачу патента авторов данного изобретения WO 00/03029). Методы молекулярной биологии сделали возможным конструирование бесконечного числа комбинаций последовательностей нуклеиновых кислот. Специалисту в области молекулярной биологии понятно, что комбинирование различных последовательностей можно осуществить с использованием различных методов молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР), а также прямое субклонирование. Многие последовательности, используемые в данном изобретении, а также последовательности и химерные конструкции, известные в данной области,получены из аденовирусов разных серотипов. Следовательно "получены" в используемом в данном описании смысле означает, что такие комбинации последовательностей могут быть получены с помощью прямого клонирования из последовательностей дикого типа, полученных из вирусов дикого типа, наряду с тем, например, что они также могут быть получены с помощью ПЦР с использованием различных частей ДНК в качестве матрицы. Это означает также, что такие последовательности могут быть в форме дикого типа, а также в измененной форме. Другой вариант достижения такого же результата осуществляют посредством комбинирования синтетической ДНК. Следует понимать, что "получены" не означает только прямое клонирование ДНК дикого типа. Специалисту в данной области также будут известны возможности молекулярной биологии для получения мутантных форм определенного участка нуклеиновой кислоты. Указанные мутации могут придавать различную функциональность, но они также могут быть молчащими в том отношении, что некоторые мутации не изменяют функциональность данного конкретного участка ДНК и кодируемого им белка. Следовательно термины "ее функциональная часть, производное и/или аналог" следует понимать как эквиваленты нуклеиновой кислоты, с которой они являются родственными Специалисту в данной области будет понятен тот факт, что некоторые делеции, замены, (точечные) мутации, присоединения и т.д. кроме того могут приводить к нуклеиновой кислоте, которая имеет сходную функцию, что и исходная нуклеиновая кислота. Таким образом, следует понимать,что такие изменения, которые существенно не изменяют функциональность белков, таких как продукты генов E4-orf6 и Е 1 В-55 К, входят в объем данного изобретения. Некоторые изменения нуклеиновой кислоты, такие как делеция, мутация, добавление и/или замена в одном или нескольких кодонах также могут существенно изменять структуру и/или функциональность кодируемого генного продукта. Таким образом, данное изобретение также относится к последовательностям, кодирующим E4-orf6, которые получены из аденовируса того же серотипа, что и остов, несущим гены, например, структурные и неструктурные элементы, но при этом последовательность, кодирующаяE4-orf6, мутирована так, что она стала совместимой с белками E1 (такими как продукт гена Е 1 В-55 К),присутствующими в комплементирующей клетке, в которой необходимо продуцировать аденовирусный вектор. Кодон может быть изменен полностью, чтобы изменить кодируемую аминокислоту, а также он может быть мутирован частично, чтобы изменить кодируемую аминокислоту. Делеции нуклеиновых кислот могут приводить к утрате одной или нескольких кодируемых аминокислот; наряду с этим они могут также приводить к сдвигам рамки считывания. Данное изобретение также относится к последовательностям E4-orf6, присутствующим в аденовирусной нуклеиновой кислоте, которые содержат различные части, полученные из разных серотипов, в которых домены, которые делают белок функциональным при совместимости, можно использовать из одного серотипа, тогда как остаток последовательности E4orf6 или его часть получают из другого (не)родственного серотипа (например, из той же подгруппы, из других подгрупп или из других видов, или их комбинации). Следовательно, в объем данного изобретения также входит применение слитых белков E4-orf6, которые являются совместимыми. Такой слитый белок может быть продуктом нескольких частей нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области будет известен тот факт, что в данной области кроме всех аденовирусов человека идентифицировано множество аденовирусов других организмов, отличных от человека. Очевидно аденовирусы, не являющиеся аденовирусами человека, также можно применять для достижения такого же результата, который заявлен в данном изобретении. Специалисту будет понятно, что совместимость между Е 1 В-55 К и E4-orf6 не может быть ограничена аденовирусами человека и что элементы аденовирусов, специфичных для других видов, также могут быть совместимыми. Таким образом, другой аспект изобретения также состоит в том, что аденовирусы других организмов, отличных от человека,можно получать с высокими титрами на известных линиях пакующих клеток, доступных в данной области, при условии, что продукты генов Е 1 В-55 К и E4-orf6 являются совместимыми. Неограничивающими-6 010828 примерами аденовирусов других организмов, отличных от человека, которые можно получать с использованием способов и средств согласно данному изобретению, являются аденовирусы собаки, быка, овцы,лягушки, свиньи, лошади, обезьяны и птиц. Следовательно, серотипы в используемом в данном описании смысле выходят за пределы ограниченных видом серотипов. Если, например, продукт гена E4-orf6 аденовируса обезьян совместим с Е 1 В-55K, предоставляемым пакующей клеткой, то данная комбинация входит в объем данного изобретения. Также в том случае, когда применяют слияния между разными серотипами или между последовательностями E4-orf6, полученными, например, из аденовируса человека и птицы, которые являются совместимыми с геном E1B пакующей клетки, то данная конкретная комбинация также входит в объем данного изобретения. Данное изобретение относится к способу получения рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, при этом указанный способ включает в себя стадии: а) обеспечения комплементирующей клетки, несущей последовательность, кодирующую Е 1 В-55K, или ее функциональную часть, производное и/или аналог, полученные из аденовируса второго серотипа в экспрессируемой форме, необходимыми элементами аденовируса, такими как элементы, обеспечивающие сборку указанного рекомбинантного аденовирусного вектора указанной комплементирующей клеткой, при этом указанные элементы содержат по меньшей мере некоторые структурные и неструктурные элементы из аденовируса указанного первого серотипа, отличного от указанного второго серотипа, и последовательностью, кодирующей функциональный белок E4-orf6 или его функциональную часть, производное и/или аналог, который совместим с указанным экспрессируемым белком Е 1 В-55K в указанной комплементирующей клетке; b) культивирования указанной комплементирующей клетки в среде в условиях, позволяющих происходить продуцированию и сборке аденовирусного вектора; и с) сбора рекомбинантного аденовирусного вектора, полученного таким образом, из среды и/или комплементирующей клетки, при этом последовательность, кодирующая совместимый белок E4orf6, присутствует в полученном таким образом рекомбинантном аденовирусном векторе. В одном аспекте изобретения предлагается способ согласно изобретению, при котором указанная последовательность, кодирующая E4-orf6, выбрана из группы, состоящей из: i) последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса указанного второго серотипа; ii) последовательности,кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса третьего серотипа, отличного от указанного первого и второго серотипа; iii) последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса указанного первого серотипа, содержащей делецию, мутацию, добавление и/или замену в одном или нескольких кодонах; и iv) последовательности, кодирующей E4-orf6, содержащей слияние между частью последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из третьего серотипа, и частью последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса указанного второго серотипа, при этом указанный третий серотип может быть идентичным указанному первому серотипу или быть отличным от него. В предпочтительном варианте указанные первый и указанный второй серотипы относятся к разным подгруппам. В более предпочтительном варианте указанный второй серотип является серотипом аденовируса подгруппы С. В еще более предпочтительном варианте указанный второй серотип является серотипом аденовируса 5. В другом конкретном аспекте изобретения указанный первый серотип является серотипом аденовируса подгруппы В. Предпочтительно указанный первый серотип выбран из группы, состоящей из серотипов аденовирусов 11, 14, 16, 21, 34, 35 и 50. Существует несколько пакующих клеток, известных в данной области, которые используют для комплементации рекомбинантных аденовирусных векторов и продуцирования, сборки и упаковки аденовирусных частиц. Неограничивающими примерами таких линий клеток являются клетки НЕK-293, 911 иPER.C6. Предпочтительно использование линий клеток, которые уже были испытаны в отношении доставки высоких титров аденовирусных культур. Такие линии клеток стабильным образом экспрессируют белки E1, следовательно предпочтительным аспектом изобретения является применение линий клеток и способов в том случае, когда указанная последовательность, кодирующая Е 1 В-55K, интегрирована в геном указанной комплементирующей клетки. Более предпочтительными являются комплементирующие клетки, которые получены из первичной диплоидной клетки человека или ее клеткипредшественника. Еще более предпочтительно указанную комплементирующую клетку получают из первичной клетки ретинобласта человека, первичной клетки эмбриональной почки человека, первичной нейронной клетки человека или первичного амниоцита человека. В высокой степени предпочтительным является применение комплементирующей клетки в способах, предлагаемых в данном изобретении, когда указанная комплементирующая клетка является клеткой PER.C6 или ее производной. Клетки PER.C6 хорошо известны в данной области, как клетки, которые не приводят к появлению компетентного по репликации аденовируса, когда используют аденовирусную ДНK, которая не имеет перекрывания с нуклеиновой кислотой, предоставляемой клетками. Во многих аденовирусных векторах, используемых в данном области, отсутствует область El, следовательно в одном аспекте изобретения указанная комплементирующая клетка содержит интегрированную в ее геном нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере аденовирусный белок E1A. Предпочтительно указанная нуклеиновая кислота, кодирующая по меньшей мере один аденовирусный белок E1A, получена из аденовирусного серотипа, относящегося к подгруппе, отличной от подгруппы В. Более предпочтительно указанная нуклеиновая кислота,-7 010828 кодирующая по меньшей мере один аденовирусный белок E1A, получена из аденовируса серотипа подгруппы С. Высоко предпочтительными являются варианты, в которых указанная нуклеиновая кислота,кодирующая по меньшей мере один аденовирусный белок E1A, получена из аденовируса серотипа 5. В другом варианте изобретения изобретение относится к способу, при котором указанная последовательность, кодирующая E4-orf6, и указанная последовательность, кодирующая Е 1 В-55K, получены из аденовирусов разных серотипов и при котором указанные разные серотипы аденовирусов являются членами одной и той же подгруппы аденовирусов. Предпочтительно указанная последовательность, кодирующаяE4-orf6, и указанная последовательность, кодирующая Е 1 В-55K, получены из аденовирусов разных серотипов, и при этом указанные разные серотипы аденовирусов оба являются членами подгруппы С. Более предпочтительно указанная последовательность, кодирующая E4-orf6, и указанная последовательность,кодирующая Е 1 В-55K, получены из одного и того же серотипа аденовирусов. Высоко предпочтительными являются способы, при которых указанная последовательность, кодирующая E4-orf6, и указанная последовательность, кодирующая Е 1 В-55K, получены из аденовируса серотипа 5. Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный аденовирусный вектср согласно изобретению или получаемой способом, предлагаемом в данном изобретении. Фармацевтическая композиция кроме того содержит приемлемый фармацевтический носитель, обычно применяемый специалистами в области приготовления фармацевтических препаратов. Кроме того, данное изобретение относится к способу лечения организма человека, включающему в себя введение в организм человека рекомбинантного аденовирусного вектора согласно изобретению или фармацевтической композиции, предлагаемой в данном изобретении. Изобретение также относится к способам, которыми можно получить аденовирусные векторы, используя надлежащие комплементирующие/пакующие клетки и представляющий интерес аденовирусный вектор. Для эффективного процесса продуцирования полезно использовать правильно выбранные клетки и соответствующий аденовирусный вектор. Следовательно, изобретение также относится к набору частей, содержащему: а) комплементирующую клетку для продуцирования рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, при этом указанная клетка несет последовательность, кодирующую Е 1 В-55K, или ее функциональную часть, производное и/или аналог, полученную из аденовируса второго серотипа, в экспрессируемой форме; и b) одну или несколько реплицируемых векторных нуклеиновых кислот, для всех из которых требуются аденовирусные элементы, такие как элементы, обеспечивающие сборку указанного рекомбинантного аденовирусного вектора указанной комплементирующей клеткой, при этом указанные элементы содержат по меньшей мере некоторые структурные и неструктурные элементы из аденовируса указанного первого серотипа, отличного указанного второго серотипа, и последовательность, кодирующую функциональный белок E4-orf6 или его функциональную часть, производное или аналог, который совместима с указанным экспрессируемым белком Е 1 В-55K в указанной комплементирующей клетке. Предпочтительно используют набор частей,где указанная последовательность, кодирующая E4-orf6, выбрана из группы, состоящей из: а) последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса указанного второго серотипа; b) последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса третьего серотипа, отличного от указанного первого и второго серотипа, с) последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса указанного первого серотипа, содержащей делецию, мутацию, добавление и/или замену в одном или нескольких кодонах; и d) последовательности, кодирующей E4-orf6, содержащей слияние между частью последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из третьего серотипа, и частью последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса указанного второго серотипа, при этом указанный третий серотип может быть идентичным указанному первому серотипу или отличным от него. Изобретение особенно применимо для репликации Е 1-делетированных химерных аденовирусов,которые получены почти полностью из серотипа, отличного от аденовируса 5. Такие векторы нуждаются только в том, чтобы они были снабжены нуклеиновой кислотой, кодирующей E4-orf6 аденовируса 5, или его функциональную часть, производное и/или аналог. После обеспечения указанного вектор может эффективно реплицироваться на стандартных комплементирующих E1 аденовируса 5 пакующих линиях клеток. Стабильность векторов повышена, и векторы могут быть комплементированы в отношении делеций как в E1A, так и E1B. Обеспечивая такие векторы нуклеиновой кислотой, кодирующей E4-orf6 аденовируса, можно обеспечить возможность эффективной очистки из бляшек и хорошие выходы в отсутствии дополнительной проблемы, связанной с загрязнением диким типом, при выращивании на клетках 293 или 911. Конечно в PER.C6 загрязнение аденовирусом дикого типа, также может быть предотвращено другими способами. Дополнительное преимущество рекомбинантного вектора согласно изобретению состоит в том, что нет необходимости в создании специальных линий клеток, экспрессирующих E4-orf6 аденовируса с нуклеиновой кислоты, интегрированной в геном. Хотя такие линии клеток существуют, их трудно поддерживать в хорошем состоянии. По меньшей мере частично это является следствием того факта, что со все большим числом чужеродных генов, встроенных в геном линии клеток, трудно сохранять стабильность всех чужеродных последовательностей (или их экспрессию). В данном изобретении обнаружено, что по меньшей мере некоторые из проблем, связанные с низкими выходами векторов, основанных на аденови-8 010828 русах, не относящихся к серотипу 5, и стабильностью аденовирусных векторов серотипов из подгруппы В, таких как аденовирусов серотипов 7, 11 и 35 на линиях клеток, пакующих аденовирусы серотипа 5,можно преодолеть с помощью рекомбинантного аденовирусного вектора согласно изобретению. Примеры Пример 1. Образование Е 1-делетированных Ad35-вирусов, экспрессирующих E4-Orf6 Ad5, на линии клеток, комплементирующих Ad5. Секвенирование генома аденовируса серотипа 35, а также конструирование основанной на плазмиде векторной системы и создание рекомбинантных основанных на Ad35 вирусов подробно описаны вWO 00/70071. Клонирование последовательности, кодирующей Ad5-E4-orf6, в pAdApt35IP1 (ECACCдепозита Р 02041228, подробности клонирования данной плазмиды см. в WO 00/70071) осуществляли следующим образом. Плазмиду расщепляли NheI и AvrII и дефосфорилировали фосфатазой кишечника теленка (NewEnglanc. Biolabs). Расщепленную ДНК выделяли из геля, используя набор GeneClean. Плазмиду рМТ.Orf6.Hygro (фиг. 1, ECACCдепозита Р 02041226) расщепляли NheI и затем частично расщепляли XbaI. После разделения полученных в результате полос в геле из геля очищали фрагмент длиной 1350 п.о., соответствующий промотору MT, связанному с последовательностью E4-orf6. Затем оба выделенных фрагмента лигировали и ими трансформировали электрокомпетентные клетки DH10B (Invitrogen/LifeTechnologies), после этого отбирали колонию со вставкой в правильной ориентации по отношению к поли (А)-сигналу SV40 для крупномасштабного получения ДНК. В результате получена конструкция pAd35.МТ.Orf6 (фиг. 2), которая содержит последовательность, кодирующую E4-orf6 Ad5, функционально связанную с мутантным промотором металлотионеина (MT). Промотор MT описан Hagmeyer et al. (1996). Последовательность E4-orf6 Ad5 соответствует нуклеотидам с 33193 по 34077 в последовательности Ad5 (Genbank, номер доступа М 73260). Чтобы проверить может ли экспрессия белковE4-orf6 Ad5 сделать возможной продуцирование полностью E1-делетированных Ad35-векторов на клетках, комплементирующих Ad5, pAd35.MT.Orf6 трансфицировали совместно с конструкцией на основеpWE.Ad35.pIX-rITR расщепляли NotI, чтобы высвободить аденовирусные вставки из остова. 2 мкг расщепленного pAd35.МТ.Orf6 и 6 мкг расщепленного pWE.Ad35.pIX-rITR трансфицировали, используяLipofectAmine. Смесь для трансфекции добавляли к клеткам PER.C6, которые высевали за день до этого при плотности 3,5 х 106 клеток на флакон Т 25. На следующий день среду заменяли на среду для культивирования PER.C6 (DMEM с 10% FBS и 10 мМ MgCl2) и клетки продолжали инкубировать при 37 С/10%CO2. Контрольные трансфекции осуществляли с использованием pAdApt35.Luc, трансфицированным совместно с pWE.Ad35.pIX-rITR, и отдельно pWE.Ad35.pIX-rITR. Через два дня после трансфекции клетки пересевали из флаконов Т 25 в Т 80 и инкубировали как описано. Спустя еще три дня в культуре,трансфицированной pAd35.МТ.Orf6 вместе с остовом Ad35, наблюдали цитопатогенное действие(CPE), являющееся показателем репликации вируса, и культуру собирали (включая клетки и среду) после инкубации еще в течение 2 дней. Суспензию клеток подвергали 2 раундам циклов замораживания/оттаивания и полученный в результате материал (неочищенный лизат) хранили при -20C вплоть до дальнейшего использования. В других флаконах не наблюдалось CPE, и клетки пересевали 1:3 во флаконы Т 80 через 6 дней после переноса в Т 80. Еще спустя 5 дней во флаконах, где проводили трансфекциюpAdApt35.Luc+pWE.Ad35.pIX-rITR, наблюдали несколько CPE-подобных событий, но дальнейшего прогрессирования не было. 0,2 и 0,5 мл неочищенного лизата, полученного после трансфекцииpAd35.МТ.Orf6, использовали для повторной инфекции клеток PER.C6 при слиянии примерно на 85% во флаконах Т 80. Это приводило к полному CPE после одного дня инкубации, свидетельствуя о том, что в неочищенных лизатах присутствовал инфекционный вирус. Полученные культуры также собирали,используя два цикла замораживания/оттаивания. Проводили дополнительные контрольные трансфекции отдельной конструкции pAd35.МТ.Orf6 в PER.C6, чтобы подтвердить, что экспрессия orf6 сама по себе не приводит к клеточной токсичности и СРЕ-подобной гибели клеток. В заключение, только трансфекции pAd35.МТ.Orf6 вместе с pWE.Ad35.pIX-rITR не приводили к CPE и репликации вируса. Проводили ПЦР-анализ, чтобы подтвердить наличие основанных на Ad35 вирусных геномов с Ad5E4-orf6, заменяющей прежнюю E1-область. Для этого вирусную ДНК выделяли из образцов неочищенного лизата следующим образом. 275 мкл материала неочищенного лизата инкубировали с 10 мкл ДНКазы I (10 мг/мл) при 37C в течение 30 мин. Затем добавляли 6,0 мкл 0,5 M EDTA (рН 8,0), 7,5 мкл 20%SDS и 1,5 мкл 20 мг/мл протеиназы K и смешивали встряхиванием. Затем смесь инкубировали при 50C в течение 1 ч. Наконец выделяли вирусную ДНК, используя набор для выделения центрифугированиемGeneClean (Bio 101, Inc.). Затем 2 мкл выделенной ДНК амплифицировали в ПЦР, используя праймеры 35psi-For и 35R4 (таблица 1). Программа была установлена при 94 С в течение 2 мин с последующими 30 циклами при 94 С в течение 30 с, 58C в течение 30 с и 72 С в течение 5 мин, и заканчивалась инкубацией при 72 С в течение 10 мин. Праймеры специфичны в отношении последовательностей Ad35 и создают фрагмент длиной 2,9 т.о., имеющий пределы от пакующей последовательности до нуклеотида 4669 (нумерация как в последовательности Ad35 дикого типа), таким образом включающий в себя кассету транс-9 010828 гена Orf6 Ad5. Электрофорез полученных ПЦР-фрагментов показал, что фрагменты имели ожидаемую длину, совпадающую с контрольными ПЦР-фрагментами, создаваемыми на адаптерной плазмидеpAd35.МТ.Orf6. Таким образом, можно создавать полностью Е 1-делетированные основанные на Ad35 векторы на клетках, комплементирующих Ad5, если вирус также экспрессирует Ad5-E4orf6. Пример 2. Конструирование pWE.Ad35.pIX-rITR5E4. Первый ПЦР-фрагмент амплифицировали, используя праймеры DF35-1 и 35FR (таблица 1). Амплификацию осуществляли с pWE.Ad35.pIX-rITR (см. WO 00/70071) в качестве ДНК-матрицы, используя ДНК-полимеразу Pwo (Roche) с добавлением ДМСО (Sigma, конечная концентрация 3%). Программа представляла собой следующее: 94 С в течение 2 мин с последующими 30 циклами (94 С в течение 30 с,52C в течение 30 с, 72 С в течение 3 мин) и конечная стадия при 72 С в течение 8 мин, чтобы обеспечить, образование полных фрагментов. Результатом амплификации был фрагмент длиной 1,6 т.о., соответствующий нуклеотидам 30224-31805 последовательности Ad35. B 3'-конец был введен сайт BamHI. Амплифицированную ДНК очищали из геля, используя набор GeneClean, и лигировали в клонирующий вектор pCRScript/Amp из набора (Stratagene). После трансформации элетрокомпетентных клеток DH10B отбирали белые колонии для дальнейшего анализа. В результате получали конструкцию pCR-fiber35. B результате клонирования с использованием тупых концов фрагмент ПЦР можно было встроить в 2 ориентациях. Отбирали клон, который имел инсерцию с сайтом BamHI в полилинкере вектораpCRScript/Amp на 5'-конце. Соответственно расщепление BamHI приводило к образованию фрагмента длиной 1,6 т.о. Секвенирование подтвердило правильную амплификацию ПЦР-фрагмента. Второй ПЦРфрагмент амплифицировали, используя праймеры: 5E4F и 5E4R (таблица 1). Амплификацию осуществляли, используя pWE.Ad5.AflII-rITRsp, который является космидным вектором, содержащим дополнительный сайт PacI в pWE.Ad5.AflII-rITR (ECACCдепозита Р 97082116, описан авторами данного изобретения в международной заявке на выдачу патента PCT/NL01/00824). pWE.Ad5.AflII-rITRsp служил в качестве матрицы при использовании ДНК-полимеразы Pwo DNA, как описано выше, хотя для такой же цели можно было использовать pWE.Ad5.AflII-rITR. После очистки из геля ДНК расщепляли SstI иBamHI (оба сайта введены во время ПЦР) и фрагмент длиной 3 т.о. очищали из агарозного геля, используя набор GeneClean. Область Е 4 Ad5, которую амплифицировали, соответствует 32794-35828 п.о. последовательности Ad5. Третий ПЦР-фрагмент создавали на pWE.Ad35.pIX-rITR, используя праймеры: 355ITR и 353ITR (таблица 1). ПЦР-амплификацию осуществляли как описано выше. Полученный в результате фрагмент длиной 160 п. о. фланкирован сайтом SstI (5'-конец) и сайтом EcoRI (3'-конец). После очистки из геля, как описано выше, ДНК расщепляли SstI и EcoRI. Затем фрагмент длиной 160 п.о., соответствующий правому ITR Ad35 отделяли от отщепленных концов на низкоплавком агарозном геле и собирали в геле. Затем pUC119 расщепляли BamHI и EcoRI и фрагмент длиной 3,1 т.о. очищали из геля,используя набор GeneClean. Затем обработанные, как указано выше, второй и третий ПЦР-фрагменты лигировали с BamHI/EcoRI-расщепленной pUC119, получая pUC.Ad5E4-35ITR. Клонированные полученные в ПЦР вставки секвенировали, чтобы подтвердить правильную амплификацию. Затем вставку длиной 1,6 т.о. в pCR-fiber35 вырезали BamHI и фрагмент очищали из геля, как описано выше.pUC.Ad5E4-35ITR также расщепляли BamHI и линейный фрагмент очищали из геля. Лигирование обоих фрагментов и отбор клонов, которые имели правильную ориентацию относительно друг друга, давалиpUC.35-5E4 (фиг. 3). Стадии, приводящие к конструированию pUC.35-5E4 схематично изображены на фиг. 4. Аденовирусную вставку в pUC.35-5E4 субклонировали в pBr.Ad35.PRn (фиг. 5; см. WO 00/70071),конструкции с 3'-последовательностями Ad35. Для этого конструкцию pUC.35-5E4 расщепляли MluI иNotI и фрагмент длиной 4,7 т.о. очищали из геля, используя набор GeneClean. Затем данный фрагмент лигировали с фрагментом вектора, полученным в результате расщепления MluI и NotI конструкцииpBr.Ad35.PRn. Полученный фрагмент длиной 16,3 т.о. очищали из геля, используя фермент агаразу(Roche). Затем продуктами лигирования трансформировали компетентные клетки DH10B. Полученная в результате конструкция названа pBr.Ad35.PR5E4 (фиг. 6, ECACCдепозита Р 02041229). Последняя стадия приводит к клонированию модифицированного 3'-конца последовательности Ad35 в вирусном космидном клоне pWE.Ad35.pIX-rITR. Для этого два фрагмента объединяли в реакции упаковки фага лямбда (Stratagene) согласно инструкциям производителя. Первый представляет собой модифицированную вставку Ad35 длиной 16,8 т.о. из pBr. Ad35. PR5E4, полученную расщеплением PacI и SwaI, а второй представляет собой фрагмент длиной 22,8 т.о., полученный расщеплением pWE.Ad35.pIX-rITR ферментами PacI и SwaI. Правильная комбинация двух фрагментов дает pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4 (фиг. 7). Таким образом, в данной конструкции область Е 4 в остове Ad35 заменена соответствующей областью, полученной из Ad5. Пример 3. Конструирование pWE.Ad35 .pIX-rITR5Orf6. Чтобы получить конструкцию остова аденовируса, которая содержит последовательности Ad35 от гена pIX (нуклеотид 3401 в последовательности Ad35) до конца правого ITR, но с последовательностямиE4-orf6 и -orf6/7, замененными на соответствующие последовательности Ad5, последовательности Ad35 и Ad5 амплифицировали в ПЦР и объединяли, как описано ниже. ПЦР-фрагменты создавали, используя ДНК-полимеразу Pwo с добавлением ДМСО до 3%. Первую ПЦР осуществляли, используя pBr.Ad35.PRn(фиг. 5; см. WO 00/70071) в качестве матрицы и праймеры E4-F1 и E4-R2 (таблица 1). Программу уста- 10010828 навливали следующим образом: 94 С в течение 2 мин, 5 циклов (94 С в течение 30 с, 50C в течение 30 с и 72C в течение 1 мин) с последующими 30 циклами (99 С в течение 30 с, 60C в течение 30 с и 72 С в течение 1 мин) и заканчивали конечной стадией при 68 С в течение 8 мин. Полученный в результате фрагмент длиной 1,8 т.о. очищали, используя набор GeneClean. Вторую ПЦР осуществляли, используяpWE. Ad5. AflII-rITRsp, который является космидным вектором, содержащим сайт PacI в pWE.Ad5.AflIIrITR (ECACCдепозита Р 97082116, описан авторами данного изобретения в международной заявке на выдачу патента PCT/NL01/00824, еще не опубликованной), в качестве матрицы и праймеры E4-F3 и E4R4 (табл. 1). Программу устанавливали следующим образом: 94C в течение 2 мин, затем 30 циклов(94 С в течение 30 с, 62C в течение 30 с и 72C в течение 1 мин) и заканчивали конечной стадией при 68C в течение 8 мин. Фрагмент длиной 1,1 т.о. очищали как описано выше. Третью ПЦР выполняли,используя в качестве матрицы pBr.Ad35.PRn и праймеры E4-F5 и E4-R6 (табл. 1). Программу устанавливали следующим образом 94 С в течение 2 мин, 5 циклов (94C в течение 30 с, 48C в течение 30 с и 72C в течение 45 с), затем 30 циклов (94C в течение 30 с, 56C в течение 30 с и 72 С в течение 45 с) и заканчивали конечной стадией при 68C в течение 8 мин. Фрагмент длиной 366 п. о. очищали, как описано выше. Образцы очищенных фрагментов наносили на гель, чтобы оценить концентрацию, и затем фрагменты смешивали вместе так, чтобы в общем объеме 30 мкл содержалось 700 нг ПЦР-1, 650 нг ПЦР 2 и 430 нг ПЦР-3. К полученной смеси добавляли 3 мкл буфера EcoPol (New England Biolabs), 3 мкл 2 мМ раствора dNTP и 3 мкл H2O milliQ. Полученную в результате смесь инкубировали при 94 С в течение 3 мин и затем охлаждали до 65 С в устройстве для ПЦР со скоростью 0,5 С/с. После инкубации при 65 С в течение 10 мин смесь охлаждали далее до 20C со скоростью 0,05C в сек и инкубировали в течение 10 мин при 20C. Затем добавляли 1 мкл (5 единиц) фермента Кленова (New England Biolabs) с последующей инкубацией в течение 60 мин при 37C. 5 мкл полученной смеси Кленова использовали в качестве матрицы, чтобы отдельно амплифицировать два фрагмента следующим образом. Набор праймеров 1: NF-1 и NcoI-R (таблица 1) использовали в реакции с применением ДНК-полимеразы Pwo(Roche) с добавлением ДМСО до конечной концентрации 3% и используя следующие установки устройства для ПЦР: 94 С в течение 2 мин, затем 30 циклов (94 С в течение 30 с, 66 С в течение 30 с и 72 С в течение 3 мин) с последующей конечной инкубацией при 68 С в течение 8 мин. Набор праймеров 2:NcoI-F и NR-2 (таблица 1) использовали в реакции с применением ДНК-полимеразы Pwo (Roche) с добавлением ДМСО до конечной концентрации 3% и используя следующие установки устройства для ПЦР: 94 С в течение 2 мин, затем 30 циклов (94C в течение 30 с, 62C в течение 30 с и 72C в течение 90 с) с последующей конечной инкубацией при 68C в течение 8 мин. Полученные в результате фрагменты длиной 2,7 т.о. (набор праймеров 1) и 1,1 т.о. (набор праймеров 2) очищали из геля, используя наборGeneClean, и каждый лигировали с вектором pCRscriptAmp (Stratagene) и ими трансформировали электрокомпетентные клетки DHlOB. В результате получали конструкцию pCRscriptAmp.NFI-NcoIR (фиг. 8) и конструкцию pCRscriptAmp.NcoIF-NR2 (фиг. 9). Так как вставки содержали тупые концы, в каждом клонировании получали две ориентации. Используя расщепления KpnI, отбирали конструкции с ориентацией, необходимой для дальнейшего клонирования (см. фиг. 8 и 9). Затем вставки секвенировали, чтобы подтвердить правильную амплификацию. Затем часть вставки из pCRscriptAmp-NcoIF-NR2 вырезали,используя BamHI и NcoI, и очищали из геля, как описано выше. pCRscriptAmp-NFI-NcoIR расщепляли такими же ферментами и содержащий вектор фрагмент также очищали из геля. Лигирование полученных фрагментов приводило к созданию pCR.NF1-NR2 (фиг. 10). pCR.NF1-NR2 содержит последовательностиAd35 между нуклеотидами 30162 и 33234 последовательности Ad35, при этом последовательности E4orf6 и E4-orf6/7 между нуклеотидами 31879 и 32974 заменены последовательностями, полученными изAd5, расположенными между 32 968 и 34077 в опубликованной последовательности Ad5 в Genbank (номер доступа М 73260). Таким образом, как можно видеть на выравниваниях аминокислот, изображенных на фигуре 11 и 12, аминокислотная последовательность клонированного белка E4-orf6 идентична последовательности E4-orf6, обнаруженной в Ad5, и аминокислотная последовательность E4-orf6/7 в большей части идентична последовательности E4-orf6/7, присутствующей в Ad5. Очевидно, различные гибридные конструкции Ad35-Ad5 Е 4 могут быть сконструированы с использованием общего способа, описанного выше, не выходя за рамки объема изобретения. Затем указанную химерную вставку из pCR.NF1-NR2 клонировали в pWE.Ad35.pIX-rITR: pCR.NF1-NR-2 расщепляли MluI и NdeI и полученный в результате фрагмент длиной 2,8 т.о. очищали из геля, используя набор GeneClean. Конструкцию pBr.Ad35.PRn также расщепляли MluI и NdeI и фрагмент вектора длиной 18 т.о. выделяли из геля, используя фермент агаразу (Roche). Результатом лигирования обоих фрагментов была конструкция pBr.Ad35.PR.5Orf6 (фиг. 13,ECACCдепозита Р 02041227). Затем последовательности Ad35 между PacI и SwaI, содержащие химерную область Е 4, в данной конструкции клонировали в конструкции pWE.Ad35.pIX-rITR, используя упаковку фага лямбда, как описано выше. Затем полученный в результате pWE.Ad35pIX-rITR.5Orf6(фиг. 14) использовали для создания рекомбинантных вирусов, основанных на Ad35, с помощью котрансфекции пакующих клеток PER.C6 с адаптерной плазмидой Ad35. Пример 4. Конструирование pWE.Ad.35 .pIX-rITRE3, pWE.Ad35.pIX-rITRE3.5E4 и pWE.- 11010828 Остов Ad35 дополнительно модифицировали с помощью делеции последовательностей Е 3. Известно, что белки Е 3 модулируют иммунный ответ хозяина по отношению к аденовирусной инфекции и поэтому не обязательны для размножения рекомбинантных вирусов in vitro. Кроме того, делеция последовательностей Е 3 позволяет осуществлять инсерцию более крупных гетерологичных последовательностей в векторы без риска для эффективности упаковки. Также в случае применения аденовирусных векторов в качестве носителей для вакцинации экспрессия иммуномодулирующих генов, кодируемых областью ЕЗ,не является предпочтительной. Способы делетирования последовательностей Е 3 в плазмидеpBr.Ad35.PRn (фиг. 5) описаны ниже. Сначала создавали продукт ПЦР с помощью праймеров 35E3for и 35E3rev (таблица 1), используя ДНК-полимеразу Pwo (Roche) согласно инструкциям производителей и pBr.Ad35.PRn в качестве ДНКматрицы. Программу устанавливали при 94 С в течение 2 мин и 30 циклов 94 С в течение 30 с, 58C в течение 30 с и 72 С в течение 1 мин, затем 68 С в течение 8 мин. Амплифицированный фрагмент содержит последовательности Ad35 от нуклеотида 26814 до 27647 (см. WO 00/70071) и фланкирован на 3'конце сайтом MluI. Полученный в результате фрагмент длиной 833 п.о. очищали, используя набор для очистки продуктов ПЦР Qiaquick (Qiagen) и расщепляли MluI и StuI. Затем расщепленный ПЦРфрагмент очищали из низкоплавкого агарозного геля, используя набор для экстракции из геля Qiaquick(Qiagen). Конструкцию pBr.Ad35.PRn также расщепляли, используя MluI и StuI, и содержащий вектор фрагмент длиной 17,3 т.о. выделяли из агарозного геля, используя фермент агаразу (Roche), используя способы, известные специалистам в данной области. Обе выделенные ДНК лигировали и ими трансформировали максимально эффективные компетентные бактерии DH5 (Invitrogen/LTI), получая pBr. Ad35.PRnE3 (фиг. 15). Делетированные последовательности охватывают нуклеотиды от 27648 до 30320 последовательности Ad35, приводя к делеции 2673 п.о. Затем вводили делецию Е 3 в конструкциюpWE.Ad35.pIX-rITR, используя экстракты для упаковки фага лямбда (Stratagene). Для этого оба вектораpWE.Ad35.pIX-rITR и pBr. Ad35. PRnE3 расщепляли PacI и SwaI и соответствующие фрагменты длиной 22,8 т.о. и 14 т.о. выделяли из низкоплавких агарозных гелей, используя фермент агаразу (Roche). После лигирования и упаковки с использованием клеток STBL-2 (Invitrogen/LTI) получали конструкциюpWE.Ad35.pIX-rITRE3. Чтобы сконструировать Е 3-делетированные варианты конструкций Е 4-модифицированного остова,описанных выше, вводили модификации Е 4 в конструкцию pBr.Ad35.PRnE3 следующим образом. Конструкцию pUC.35-5E4 (фиг. 3) расщепляли, используя MluI и NotI, и фрагмент длиной 4,7 т.о. выделяли из геля, используя набор GeneClean II. Конструкцию pBr.Ad35.PRnE3 также расщепляли MluI и NotI и фрагмент вектора длиной 13,6 т.о. выделяли из геля, используя набор для выделения центрифугированием GeneClean. Лигирование указанных фрагментов приводило к образованию конструкцииpBr.Ad35.Е 3.PR5E4 (фиг. 16). Конструкцию pCR.NF1-NR2 (фиг. 10) расщепляли, используя MluI, NdeI и BglI (последний фермент для расщепления фрагмента вектора на более мелкие фрагменты), и фрагмент длиной 2,8 т.о. выделяли из геля, используя набор для выделения центрифугированием GeneClean. Конструкцию pBr.Ad35.PRnE3 расщепляли, используя MluI и NdeI, дефосфорилировали, используя фермент CIP (New England Biolabs), и фрагмент вектора длиной 15,2 т.о. также выделяли, используя набор для выделения центрифугированием GeneClean. Лигирование указанных фрагментов давало конструкцию pBr.Ad35.Е 3.PR5Orf6 (фиг. 17). Затем pBr.Ad35.E3.PR5E4 и pBr.Ad35.Е 3.PR5Orf6 использовали,чтобы заменить 3'-PacI-SwaI-фрагмент в pWE.Ad35.pIX-rITR на соответствующие области изpBr.Ad35.Е 3.PR5E4 и pBr.Ad35.Е 3.PR5Orf6, как описано ниже. Это дает конструкции pWE.Ad35.pIXrITRE3.5E4 и pWE.Ad35.pIX-rITRE3.5Orf6. Альтернативный способ создания указанных крупных космид заключается в применении трех фрагментов в реакции лигирования для упаковки: NotI-PacI-фрагмент длиной 14,7 т.о. из pWE.Ad35.pIXrITR, PacI-NotI-инсерцию из pBr.Ad35.Е 3.PR5E4 или pBr.Ad35.Е 3.PR5Orf6 и фрагмент NotIрасщепленного космидного вектора pWE15 (Stratagene). Указанный последний фрагмент также можно выделить из продуктов NotI/PacI-расщепления pWE.Ad35.pIX-rITR. Пример 5. Образование E1- и Е 1/Е 3-делетированных векторов на основе Ad35 на клетках PER.C6. Чтобы сделать возможным образование рекомбинантных вирусов Ad35 на комплементирующей линии клеток PER.C6 с использованием конструкций, основанных на pBr.Ad35.PRn, авторы сначала создали новую конструкцию, содержащую последовательности Ad35 от 3401 до 24650 п.о. последовательности Ad35 (WO 00/70071) и следовательно перекрывающуюся как с адаптерными плазмидами, так и с конструкциями на основе pBr.Ad35.PRn. Трансфекция указанных трех плазмид в клетки PER.C6 и событие двойной гомологичной, рекомбинации приводит к образованию полного вирусного генома и репликации рекомбинантных вирусов, как изображено на фиг. 18. Требуемую плазмиду получали с помощью делеции большой части последовательностей Ad35 в pWE.Ad35.pIX-rITR. Для этого pWE.Ad35.pIX-rITR расщепляли EcoRV и содержащий вектор фрагмент длиной 29 т.о. очищали из низкоплавкого геля, используя набор для выделения центрифугированием Geneclean. Очищенную ДНК подвергали самолигированию и использовали для трансформации электрокомпетентных бактерий DH10B (Invitrogen/LTI) с получением в результате pWE.Ad35.pIX-EcoRV (фиг. 19).- 12010828 Все ДНК, используемые для трансфекции, расщепляли, как указано в табл. 2, инактивировали нагреванием при 65 С в течение 15 мин и использовали без дальнейшей обработки для трансфекции. Клетки PER.C6 высевали за день до трансфекции во флаконы Т 25 при плотности 3106 клеток/флакон и трансфицировали, как указано в таблице 2, используя LipofectAmine (Invitrogen/LTI) согласно инструкциям производителей, за исключением того, что смесь для трансфекции в бессывороточной среде DMEM(Gibco/BRL) заменяли на среду для культивирования PER.C6 (DMEM, 10% FBS и 10 мМ MgCl2) через 5 час. Спустя день эффективность трансфекции оценили с помощью флуоресцентной микроскопии на уровне 50%. Через два дня клетки обрабатывали трипсином и пересевали во флаконы Т 80 и дополнительно инкубировали при 37 С/10% CO2. Через шесть дней после трансфекции во всех культурах наблюдали цитопатогенное действие (CPE, показатель размножения вируса), за исключением культурыPER.C6, трансфицированной Ad35.AdApt. eGFP+pWE. Ad35.pIX-rITR. Спустя один день клетки и среду во флаконах с CPE собирали и подвергали двум циклам замораживания/оттаивания, очищали от обломков клеток центрифугированием (10 мин при 1500 об/мин) и 100 мкл полученных неочищенных лизатов использовали для повторной инфекции свежих клеток PER.C6 при слиянии на 85% во флаконах Т 80. Клетки, трансфицированные Ad35.AdApt.eGFP+pWE.Ad35.pIX-rITR, которые не проявляли признаковCPE, собирали трипсинизацией и также обрабатывали, как описано выше. Через два дня после инфекции свежих клеток PER.C6 во всех флаконах наблюдали полное CPE, за исключением одного, в котором не наблюдалось признаков CPE во время первоначального сбора. Это ясно свидетельствует о том, что полностью Е 1-делетированные вирусы, основанные на Ad35, можно получить на клетках PER.C6 в том случае, когда продукт гена E4-orf6 Ad5 экспрессируется с остова Ad35. Таблица 1 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Рекомбинантный аденовирусный вектор, содержащий структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, причем указанный вектор дополнительно содержит последовательность,кодирующую функциональный белок E4-orf6 или его функциональную часть, производное и/или аналог,совместимые с белком Е 1 В-55K, экспрессируемым в линии комплементирующих клеток, в которой получают указанный рекомбинантный аденовирусный вектор, где указанная последовательность выбрана из группы, состоящей из: 1) последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса второго серотипа, отличного от указанного первого серотипа; 2) последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса указанного первого серотипа, содержащей делецию, мутацию, добавление и/или замену в одном или нескольких кодонах; и 3) последовательности, кодирующей E4-orf6, в которой часть последовательности, кодирующей E4orf6, полученная из аденовируса второго серотипа, отличного от указанного первого серотипа, слита с- 23010828 частью последовательности, кодирующей E4-orf6, полученной из аденовируса третьего серотипа, причем указанный третий серотип может быть идентичным указанному первому серотипу или отличным от него. 2. Рекомбинантный аденовирусный вектор по п.1, где указанный первый серотип и указанный второй серотип являются серотипами из разных подгрупп аденовирусов. 3. Рекомбинантный аденовирусный вектор по п.1, где указанный первый серотип является серотипом подгруппы, отличной от подгруппы С, и где указанная последовательность, кодирующая E4-orf6,получена из аденовируса серотипа подгруппы С. 4. Рекомбинантный аденовирус по п.1, где указанный первый серотип является серотипом подгруппы В и указанный второй серотип является серотипом подгруппы С. 5. Рекомбинантный аденовирусный вектор по п.1, в котором последовательность, кодирующая E4orf6, получена из аденовируса серотипа 5. 6. Рекомбинантный аденовирусный вектор по любому из пп.1-5, где указанный первый серотип аденовируса является серотипом 11, 14, 16, 21, 34, 35 или 50. 7. Рекомбинантный аденовирусный вектор по любому из пп.1-6, дополнительно содержащий последовательность, кодирующую неаденовирусный белок, полипептид или пептид. 8. Рекомбинантный аденовирусный вектор по п.7, где указанный неаденовирусный белок, полипептид или пептид выбран из группы, состоящей из полипептида, индуцирующего гибель клеток, антигенной детерминанты патогенного организма, антигена, специфичного для опухоли, вирусного белка, гормона и цитокина. 9. Способ получения рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, по п.1, включающий следующие стадии:a) получение линии комплементирующих клеток, экспрессирующих белок Е 1 В-55K или его функциональную часть, производное и/или аналог аденовируса второго серотипа с необходимыми элементами аденовируса, такими как элементы, обеспечивающие сборку указанного вектора в указанных комплементирующих клетках, причем указанные элементы содержат, по меньшей мере, некоторые структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, отличного от указанного второго серотипа, и последовательность, кодирующую функциональный белок E4-orf6 или его функциональную часть, производное и/или аналог, где белок E4-orf6 совместим с указанным белком Е 1 В-55K, экспрессируемым в указанных комплементирующих клетках;b) культивирование указанных комплементирующих клеток в среде в условиях, обеспечивающих продуцирование и сборку аденовирусного вектора; иc) сбор полученного рекомбинантного аденовирусного вектора из среды и/или комплементирующих клеток,причем последовательность, кодирующая совместимый белок E4-orf6, присутствует в полученном таким образом рекомбинантном аденовирусном векторе. 10. Способ по п.9, где указанный первый и указанный второй серотип являются серотипами аденовирусов разных подгрупп. 11. Способ по п.9 или 10, где указанный первый серотип является серотипом аденовируса подгруппы В и указанный второй серотип является серотипом аденовируса подгруппы С. 12. Способ по п.11, где указанный второй серотип является серотипом аденовируса 5. 13. Способ по любому из пп.9-12, где указанный первый серотип аденовируса является серотипом 11, 14, 16, 21, 34, 35 или 50. 14. Способ по любому из пп.9-13, где последовательность, кодирующая Е 1 В-55K, интегрирована в геном указанных комплементирующих клеток. 15. Способ по любому из пп.9-14, где указанные комплементирующие клетки получены из первичной диплоидной клетки человека или ее клетки-предшественника. 16. Способ по п.15, где указанная первичная диплоидная клетка представляет собой клетку ретинобласта человека, клетку эмбриональной почки человека, нейронную клетку человека или амниоцит человека. 17. Способ по любому из пп.9-16, где нуклеиновая кислота, кодирующая аденовирусные белки E1A,интегрирована в геном указанных комплементирующих клеток. 18. Способ по п.17, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая указанные аденовирусные белки E1A, получена из серотипа аденовируса подгруппы, отличной от подгруппы В. 19. Способ по п.18, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая указанные аденовирусные белки E1A, получена из серотипа аденовируса подгруппы С. 20. Способ по п.18, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая указанные аденовирусные белки E1A, получена из серотипа аденовируса 5. 21. Способ по любому из пп.9-20, где указанная последовательность, кодирующая E4-orf6, и указанная последовательность, кодирующая Е 1 В-55K, получены из аденовирусов разных серотипов и где указанные разные серотипы аденовирусов являются членами одной и той же подгруппы аденовирусов. 22. Способ по п.21, где указанные разные серотипы аденовирусов являются членами подгруппы С.- 24010828 23. Способ по любому из пп.9-20, где указанная последовательность, кодирующая E4-orf6, и указанная последовательность, кодирующая Е 1 В-55K, получены из аденовируса одного и того же серотипа. 24. Способ по п.23, где указанная последовательность, кодирующая E4-orf6, и указанная последовательность, кодирующая Е 1 В-55K, получены из аденовируса серотипа 5. 25. Способ по п.9, где указанные комплементирующие клетки являются клетками PER.C6 или производными клеток PER.С 6. 26. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения инфекционного заболевания, содержащая рекомбинантный аденовирусный вектор по любому из пп.1-8. 27. Набор для получения рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего структурные и неструктурные элементы аденовируса первого серотипа, по п.1, содержащий:a) комплементирующие клетки для получения указанного вектора, экспрессирующие белки E1,включая белок Е 1 В-55K или его функциональную часть, производное и/или аналог, полученные из аденовируса второго серотипа; иb) один или несколько векторов реплицируемых нуклеиновых кислот, кодирующих все остальные необходимые аденовирусные элементы, такие как элементы, обеспечивающие сборку указанного рекомбинантного аденовирусного вектора в указанных комплементирующих клетках, причем указанные элементы содержат, по меньшей мере, некоторые структурные и неструктурные элементы из аденовируса указанного первого серотипа, отличного от указанного второго серотипа, и последовательность, кодирующую функциональный белок E4-orf6 или его функциональную часть, производное или аналог, который совместим с указанным белком Е 1 В-55K, экспрессируемым в указанных комплементирующих клетках.