Рекомбинантные мутанты интерферона α2 (ifnα2)

(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЙЕДА РИСЕРЧ ЭНД ДИВЕЛОПМЕНТ КО. ЛТД. (IL) Настоящее изобретение представляет мутанты IFN2 и их активные фрагменты, аналоги, производные и варианты, обладающие повышенной специфической агонистической или антагонистической активностью в сравнении с IFN2 дикого типа. Настоящее изобретение также представляет фармацевтические композиции, включающие мутанты IFN2, пригодные для лечения или предупреждения раковых заболеваний, аутоиммунных заболеваний, инфекционных заболеваний или расстройств, связанных с повышенной экспрессией IFN2. 014157 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к рекомбинантным мутантным интерферонам 2 (IFN2), их фрагментам, аналогам, производным и вариантам, обладающим повышенной специфической агонистической или антагонистической активностью в сравнении с IFN2 дикого типа, и к их фармацевтическим композициям, пригодным для лечения или профилактики рака, аутоиммунных заболеваний, инфекционных заболеваний и расстройств, связанных с повышенной экспрессией IFN2. Предпосылки создания изобретения Интерфероны (IFN) были открыты в 1957 г. Исааксом и Линденманном (Isaacs and Lindenmann) и были так названы в соответствии с их способностью создавать помехи вирусной пролиферации. Интерфероны могут также препятствовать развитию бактериальной и паразитарной инфекций, ингибировать клеточное деление, подавлять спонтанный апоптоз, способствовать или препятствовать дифференциации клеток. На основе рецепторной специфичности интерферонов различают два типа интерферонов: интерферон типа I и интерферон типа II. Интерфероны типа I являются семейством мономерных белков,включающих IFN и IFN, которые являются продуктами лейкоцитов, IFN, продуцируемые фибробластами, и IFN, который был описан только у видов копытных животных. Единственным известным интерфероном типа II является димерный IFN, который продуцируется исключительно лимфоцитами. Семейство интерферонасостоит из 13 полностью транслированных генов без интронов (исключая псевдогены). Каждый представитель указанного семейства включает зрелые белки, состоящие из 165 или 166 аминокислотных остатков, содержащие две консервированные дисульфидные связи: Cys1-Cys98 и Cys29-Cys138. Среди различных подтипов интерферонаотмечается высокий уровень гомологии по последовательности (80%), а между указанными подтипами и IFNP имеется примерно 35% уровень гомологии. Несмотря на высокую гомологию различных подтипов, их биологические активности, в том числе антипролиферативная, антивирусная и иммуномодулирующая активность, в существенной мере различаются. Была определена структура нескольких интерферонов типа I, включая мышиный IFN (1IFNA,1RMI), человеческий IFN (1AU1), человеческий IFN2 (1RH2, 1ITF) и овечий интерферон IFN (1B5L). Структурно интерфероны являются представителями семействаспиральных цитокинов. Все интерфероны типа I осуществляют сигнальную функцию через общий рецепторный комплекс, состоящий из IFNAR1 и IFNAR2. Основной лигандсвязывающий компонент рецептора интерферона типа I представляет собой IFNAR2, с аффинностью связывания IFN2 10 нМ. Структура внеклеточной части IFNAR2 состоит из двух доменов иммуноглобулинового типа, а сайт связывания IFN2 расположен в N-концевом домене и соединительной петле. Зрелый IFNAR1 представляет собой белок из 530 аминокислот, включающий трансмембранный сегмент, состоящий из 21 остатка, и цитоплазматический домен, состоящий из 100 остатков. Структура внеклеточной части IFNAR1 неизвестна, но, исходя из известной последовательности, можно рассчитать,что она состоит из четырех доменов, относящихся к типу иммуноглобулиновых доменов. СвязываниеIFN2 с IFNAR1 слабое, и в этом случае аффинность, определяемая применительно к искусственной мембране, составляет 1,5-5 мкМ. Бычий IFNAR1 (BoIFNARl) и человеческий IFNAR1 (HuIFNARl) идентичны на 68%. Субдомены 2 и 3 в HuIFNARl, как было показано, играют важную роль в связывании сIFN2. Путем обмена указанных субдоменов с гомологичным BoIFNARl, аффинность была существенно повышена. Растворимый BoIFNARl может связываться с человеческими интерферонами с аффинностью 10 нМ, что в 500 раз выше аффинности HuIFNARl. Мышиные клетки, экспрессирующие IFNAR2, связываются IFN2 с аффинностью 8 нМ, тогда как клетки, экспрессирующие только IFNAR1, не демонстрируют связывание лиганда. При совместной экспрессии IFNAR1 и IFNAR2 наблюдалось десятикратное повышение аффинности для IFN2. В рамках исследования in vitro с использованием искусственных мембран было показано, что величина IFNAR1-индуцированного повышения аффинности по связыванию тройного комплекса определяется относительной концентрацией данного рецептора на поверхности. Локализация сайта связывания IFNAR1 на интерфероне была картирована на IFN и было показано,что он находится на В, С и D спиралях и петле DE, тогда как результаты исследования по методу Alaсканирующего мутагенеза IFN2 позволили предположить, что сайт связывания IFNAR1 ограничивается спиралями В и С. Результаты ряда исследований позволили предположить, что образование тройного комплекса происходит в последовательном режиме и начинается со связывания интерферона с IFNAR2 с образованием промежуточного комплекса с последующим привлечением IFNAR1. Было показано, что комплексIFNAR1-IFN-IFNAR2 характеризуется стехиометрическим соотношением 1:1:1. Рецептор IFNAR1 представляет собой обязательный компонент рецепторного комплекса интерферона, причем null-мутация в IFNAR1 или добавление нейтрализующего Ат против данного рецептора приводят к полной потере антивирусного и антипролиферативного ответа на IFN2 и IFN. Ассоциация IFNAR1 и IFNAR2 стимулирует активацию конститутивно-ассоциированных внутриклеточных киназ Jak и Tyk2, что приводит к каскаду фосфорилирования тирозина, который, в свою очередь, приводит к димеризации фосфорилиро-1 014157 ванных сигнальных трансдукторов и активаторов транскрипции (STST) и их транспорту в ядро, где они связываются со специфическими последовательностями ДНК и стимулируют транскрипцию сотен отзывчивых генов. Остается открытым вопрос, каким образом очень близкие IFN индуцируют разные активности на одном и том же типе клеток. Было высказано предположение, что биологические активности различных подтипов IFN коррелируют с их соответствующей связывающей аффинностью и с типом используемых клеток. Интерфероны позвоночных типа I распознаются одним, общим для всех рецептором, состоящим из двух трансмембранных белков (IFNAR1 и IFNAR2), и осуществляют свою активность через ассоциированные Jak киназы, содержащие факторы транскрипции Stat в качестве основных мишеней (Brierley,M.M.Fish, E.N. 2002 J Interferon Cytokine Res. 22, 835-845). IFNAR2 и IFNARl, обычно распознаваемые по IgG-подобной складчатой структуре внеклеточных доменов (hCR домены), рассматриваются соответственно, как связывающие белки и вспомогательные трансдуцирующие факторы, т.е. как - и -цепи гетеродимерных рецепторов. Различия в константах диссоциации лиганда двух цепей явно выражены в их определении. Тем не менее обе цепи вносят вклад в создание высокоаффинных сайтов связывания. Комбинация "общей" -цепи с разными распознаваемыми цепями представляет собой особенность гетеромерных рецепторов, которые по-разному реагируют на присутствие разных лигандов. Способность взаимодействовать с разными -цепями создает потенциальные сетевые связи для экспрессии разных рецепторов (Kotenko, S.V.Langer, J. A. 2004. Int. Immunopharmacol. 4, 593-608). В том случае, когда подобно IFNARl они обладают способностью взаимодействовать с элементами разных сигнальных путей, они могут создать связи для экспрессии различных генов (Platanias, L.C.Fish, E.N. 1999. Experemental Hematology 27, 1583-1592). Человеческие IFN насчитывают 12 разных неаллельных -белков, один -белок и один -белок. Как ожидается от семейства с выраженной гомологией по последовательности и с наличием общей 3D ядерной структуры и общего рецептора, активности IFN типа I перекрываются. Тем не менее они могут распознаваться и их даже можно распределить по разным классам на основе различия в аминокислотах, а также были отмечены различные примеры относительных различий в активности. Создаваемая при этом картина свидетельствует о том, что функциональные различия появляются лишь применительно к специфическому физиологическому контексту. В дополнение к локальному действию, определяемому создаваемой противовирусной защитой почти для всех клеток, они связаны с развитием второй линии противовирусной защиты. Было отмечено, что возможным различием между IFN могла бы быть их способность к жесткому связыванию с IFNARl (Roisman et al., 2005. J. Mol. Biol. 353, 271-281). Различающиеся активности IFN типа I стали предметом интенсивных исследований на протяжении многих лет. В частности, было отмечено, что IFN имеет дополнительный репертуар активностей в сравнении с IFN. Подробный анализ различий между указанными двумя IFN показал, что IFN обладает в целом более высоким потенциалом по активации транскрипции IFN-отзывчивых генов и демонстрирует активность при сниженных уровнях IFN. Исследования уровня связывания позволили предположить, что аффинность в отношении дополнительной субъединицы IFNAR1 представляет собой ключевое различие между IFN2 и IFN (Jaitin, 2006, Mol. Cell. Biol. 26, 1888-1897). Известно, что IFN2 оказывает противораковый эффект. Однако лечение с его использованием не всегда эффективно и иногда приводит к непереносимым побочным эффектам, определяемым дозировкой и длительностью лечения. В WO 97/12630 описывается лечение раковых пациентов с использованием темозоломида в сочетании с IFN2. В WO 01/54678 описывается лечение раковых пациентов с использованием темозоломида и ПЭГилированного интерферона. Инфекция вируса гепатита С (HCV) представляет собой самую распространенную в США хроническую инфекцию крови. Несмотря на то что число новых инфекций снижается, уровень хронической инфекции остается существенным, по данным Центра по контролю заболеваемости (Center for Disease Control) число инфицированных людей в Соединенных Штатах составляет 3,9 млн (1,8%). Хроническое заболевание печени представляет собой десятую по распространенности причину смертности среди взрослого населения Соединенных Штатов, и в целом это заболевание ответственно за примерно 25000 летальных исходов ежегодно или примерно 1% всех смертельных исходов. Исследования показывают, что 40% хронических заболеваний печени имеет отношение к HCV, что приводит ежегодно к 8000-10000 смертельных исходов. HCV-ассоциированное заболевание печени на конечной стадии заболевания представляет собой наиболее частое показание для трансплантации печени у взрослых людей. Антивирусная терапия хронического гепатита С интенсивно развивалась в последние десятилетия и были достигнуты существенно улучшенные результаты с точки зрения эффективности лечения. Тем не менее даже при проведении комбинированной терапии с использованием ПЭГилированного IFN- плюс рибавирин у 40-50% пациентов проводимое лечении не давало успеха, т.е. указанные пациенты либо не отвечали на лечение, либо имели рецидивы. В настоящее время для таких пациентов отсутствует эффективная терапевтическая альтернатива. В частности, пациенты, у которых по данным биопсии выявлен выраженный фиброз или цирроз печени, имеют серьезный риск развития осложнений заболевания пече-2 014157 ни, включая асциты, желтуху, кровотечение из варикозных вен, энцефалопатию и прогрессирующую печеночную недостаточность, а также существенно повышенный риск развития гепатокарциномы. Рассеянный склероз (PC) представляет собой хроническое неврологическое аутоиммунное демиенилизирующее заболевание. PC может вызвать неясность зрения (по типу "пелены перед глазами"), одностороннее ухудшение зрения (неврит зрительного нерва), ухудшение баланса, плохую координацию,невнятную речь, тремор, чувство онемения, чрезмерную усталость, изменения со стороны интеллекта(такие как снижение памяти и внимания), мышечную слабость, парестезии и слепоту. У многих субъектов развиваются хронические прогрессирующие заболевания, в случае которых длительные периоды клинической стабильности могут прерываться периодами ухудшения состояния. Неврологические дефициты могут быть постоянными или непродолжительными. Патология PC характеризуется аномальным иммунным ответом, направленным против центральной нервной системы. В частности, Т-лимфоциты активируются против миелиновой оболочки центральной нервной системы, что вызывает демиелинизацию. В процессе демиелинизации миелин разрушается и замещается рубцами затвердевшей "склеротизированной" ткани, известной как "бляшка". Указанные повреждения появляются в разрозненных местах по всему мозгу, в зрительном нерве и в спинном мозге. Для лечения PC в Соединенных Штатах разрешены два типа интерферона : интерферон 1 а и интерферон 1b. Диабет типа I, также известный как аутоиммунный диабет или инсулинзависимый сахарный диабет(ИЗСД), представляет собой аутоиммунное заболевание, характеризующееся селективным разрушением клеток поджелудочной железы аутореактивными Т-лимфоцитами (Bach, 1994, Endocr. Rev. 15:516-542). Патогенез ИЗСД очень сложен и вовлекает у генетически чувствительного организма-хозяина взаимодействие между эпигенетическим событием (возможно, вирусной инфекцией), островковыми клетками поджелудочной железы и иммунной системой. Как было показано для человека и на моделях животных данного заболевания, в патогенез ИЗСД вовлекается множество цитокинов, включая IFN и IFN (Campbell et al., 1991, J. Clin. Invest. 87: 739-742). Представляется возможным, что локальная экспрессия IFN островковыми клетками поджелудочной железы в ответ на потенциальные диабетогенные стимулы, такие как вирусы, может запускать инсулитический процесс. В документе WO 9304699 описывается способ лечения инсулинзависимого сахарного диабета,включающий введение антагониста IFN. Исходя из повышения уровня экспрессии IFN у пациентов с системной красной волчанкой (СКВ),был сделан вывод о том, что IFN также вовлекается в патогенез СКВ (Ytterberg and Schnitzer, 1982, Arthritis Rheum. 25: 401-406). В документе WO 02066649 описываются специфические антитела противIFN для лечения инсулинзависимого сахарного диабета (ИЗСД) и системной красной волчанки (СКВ). В публикации по заявке на патент США 20040230040 описываются вариантыинтерферона-2 по цистеину. В публикации по заявке на патент США 20040002474 описываются гомологиинтерферона, обладающие антипролиферативной активностью для клеточной линии клеток человека Daudi, в соответствующем тесте. В патенте США 4588585 описывается мутированный IFN1, в котором Cys17 изменен на Ser17 за счет перехода Т в А в первом основании кодона 17, что препятствует некорректному образованию дисульфидной связи. В документе WO 2005016371 описывается фармацевтическая композиция, включающая улучшенный рекомбинантный человеческий вариант IFN1b с более высокой специфической активностью. Доступные способы лечения рака, инфекционных заболеваний, рассеянного склероза и аутоиммунных расстройств, связанных с повышенной экспрессией IFN2, являются дорогостоящими и эффективными лишь у определенного процента пациентов, тогда как они нередко вызывают неблагоприятные побочные эффекты. В этой связи, сохраняется неотложная медицинская потребность в подходящих терапевтических методах, которые были бы безопасными, надежными, эффективными и приемлемыми по стоимости. Краткое описание сущности изобретения Настоящее изобретение относится к новым мутантам IFN2, характеризующимся важной терапевтической применимостью. Варианты согласно настоящему изобретению обладают улучшенной специфичностью в качестве агонистов или антагонистов в сравнении с IFN2 дикого типа. Настоящее изобретение впервые делает то открытие, что рекомбинантный IFN2 мутант имитирует связывающие свойства IFN (SEQ ID NO: 3) и демонстрирует ключевые показатели, характерные для различных видов активности IFN. Указанные свойства включают более высокую антипролиферативную активность in vitro и in vivo и специфическую регуляцию рецептора IFNAR2 по типу отрицательной обратной связи. В соответствии с первым аспектом настоящее изобретение относится к рекомбинантному полипептиду интерферона 2 (IFN2), его активному фрагменту, аналогу, производному и варианту, где указанный полипептид включает мутацию, выбранную по меньшей мере из одного аминокислотного замещения на участке аминокислотных остатков 57-89 и по меньшей мере одного аминокислотного замещения С-концевых аминокислотных остатков на участке 159-165 остатков, а также их сочетаний, где указанный-3 014157 полипептид обладает повышенной специфической агонистической или антагонистической активностью в сравнении с IFN2 дикого типа (SEQ ID NO: 2). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения указанный полипептид включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из Н 57 А (SEQ IDNO: 24), Е 58 А (SEQ ID NO: 25), Q61A (SEQ ID NO: 26), H57Y (SEQ ID NO: 27), E58N (SEQ ID NO: 28),Q61S (SEQ ID NO: 29) и их сочетаний, где указанный полипептид обладает повышенной специфической агонистической или антагонистической активностью в сравнении с IFN2 дикого типа (SEQ ID NO: 2). В соответствии с одним вариантом настоящее изобретение относится к тройному мутанту Н 57 А,Е 58 А, Q61A (SEQ ID NO: 5), обладающему повышенной специфической активностью в сравнении сIFN2 дикого типа (SEQ ID NO: 2). В соответствии с другим вариантом настоящее изобретение относится к четверному мутанту N65A,L80A, Y85A, Y89A (SEQ ID NO:6), обладающему антагонистической активностью в сравнении с IFN2 дикого типа. В соответствии с еще одним вариантом настоящее изобретение относится к белку IFN2, включающему замещение С-концевой последовательности ESLRSKE на KRLKSKE (SEQ ID NO: 7), обладающему улучшенной специфической активностью в сравнении с IFN2 дикого типа. Каждая из специфических мутаций IFN2 мутантов согласно настоящему изобретению расположена в соответствующем, отличном от других, положении на белке и, в этой связи, возможно их объединение для достижения дополнительного или улучшенного эффекта. В соответствии с одним вариантом настоящее изобретение относится к варианту IFN2, включающему сочетание тройного мутанта Н 57 А, Е 58 А, Q61A и замещение С-концевой последовательностиESLRSKE на KRLKSKE (SEQ ID NO: 8), который имеет очень высокую специфическую активность. В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к варианту IFN2, включающему сочетание четверного варианта N65A, L80A, Y85A, Y89A и замещение С-концевой последовательности ESLRSKE на KRLKSKE (SEQ ID NO: 9), что дает повышенную аффинность связывания IFNAR2,но с очень низкой биологической активностью. Указанный вариант IFN2 теперь раскрывается в качестве антагониста IFN, блокирующего природную активность разных IFN через их рецепторы. В соответствии с другим вариантом настоящее изобретение относится к тройному мутанту Н 57 М,E58D, Q61L (SEQ ID NO: 10), обладающему повышенной специфической активностью в сравнении сIFN2 дикого типа (SEQ ID NO: 2). В соответствии с еще одним вариантом настоящее изобретение относится к тройному мутантуH57Y, E58N, Q61S (SEQ ID NO: 11), обладающему повышенной специфической активностью в сравнении с IFN2 дикого типа (SEQ ID NO: 2). В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к варианту IFN2, включающему сочетание тройного мутанта Н 57 М, E58D, Q61L и замещение С-концевой последовательностиESLRSKE на KRLKSKE (SEQ ID NO: 12), который характеризуется повышенной специфической активностью в сравнении с IFN2 дикого типа (SEQ ID NO: 2). В соответствии с еще одним вариантом настоящее изобретение относится к варианту IFN2, включающему сочетание тройного мутанта H57Y, E58N, Q61S и замещение С-концевой последовательностиESLRSKE на KRLKSKE (SEQ ID NO: 13), который характеризуется повышенной специфической активностью в сравнении с IFN2 дикого типа (SEQ ID NO: 2). В соответствии с некоторыми воплощениями настоящее изобретение относится к ПЭГилированным мутантам IFN2 с повышенной специфической активностью. В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к молекулам ДНК, кодирующим полипептиды согласно настоящему изобретению. В соответствии с одним вариантом молекула ДНК включает последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15-23 и SEQ ID NO: 30-35. В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к вектору, включающему молекулу ДНК, согласно настоящему изобретению, где указанный вектор способен экспрессировать мутантный полипептид IFN2 в прокариотической клетке-хозяине или в эукариотической клеткехозяине. В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, включающей вектор, согласно настоящему изобретению. В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента рекомбинантный полипептид интерферона 2(IFN2), его активный фрагмент, аналог, производное и вариант, где указанный полипептид включает мутацию, выбранную по меньшей мере из одного замещения аминокислотного остатка на участке аминокислот 57-89, по меньшей мере одного замещения аминокислоты на участке С-концевых аминокислотных остатков 159-165, а также их сочетаний, где указанный полипептид обладает повышенной специфической агонистической или антагонистической активностью в сравнении с IFN2 дикого типа (SEQID NO: 22), а также включает фармацевтически приемлемый носитель.-4 014157 В соответствии с некоторыми вариантами фармацевтическая композиция, включающая рекомбинантный полипептид интерферона 2 (IFN2), характеризуется наличием любой последовательности из числа SEQ ID NO: 5-13 и SEQ ID NO: 24-29, их фрагментов, аналогов, производных и вариантов. В соответствии с одним вариантом указанная фармацевтическая композиция, включающая рекомбинантный полипептид интерферона 2 (IFN2), характеризуется наличием любой из последовательностей SEQ ID NO: 5, 7, 8, 10, 11, 12 и 13, их фрагментов, аналогов, производных и вариантов, где указанный полипептид обладает повышенной специфической агонистической активностью. В соответствии с одним вариантом указанная фармацевтическая композиция, включающая рекомбинантный полипептид интерферона 2 (IFN2), характеризуется наличием любой из последовательностей SEQ ID NO: 6 и 9, их фрагментов, аналогов, производных и вариантов, где указанный полипептид обладает повышенной специфической антагонистической активностью. В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу лечения или предотвращения расстройства или заболевания, связанных с модуляцией IFN, включающему введение субъекту, при наличии такой необходимости, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, где указанное расстройство или заболевание выбирают из группы, состоящей из рака, аутоиммунного заболевания и инфекционного заболевания. В соответствии с одним вариантом указанное аутоиммунное заболевание представляет собой рассеянный склероз (PC). В соответствии с предпочтительным вариантом указанный PC выбирают из группы,состоящей из рецидивирующе-ремитирующего PC, вторичного прогрессирующего PC, первичного прогрессирующего PC и прогрессивного рецидивирующего PC. В соответствии с некоторыми вариантами мутанты IFN2, содержащие любую из последовательностей SEQ ID NO: 5, 7, 8, 10, 11, 12 и 13, используются для лечения или профилактики PC. В соответствии с одним вариантом указанный рак выбирают из группы, состоящей из лейкемического ретикулеза, саркомы Капоши, множественной миеломы, хронического миелогенного лейкоза, неходжкинской лимфомы и меланомы. В соответствии с другим вариантом настоящее изобретение относится к способу подавления роста раковых клеток, включающему воздействие на раковые клетки терапевтически эффективным количеством мутантного IFN2, содержащего любую из последовательностей SEQ ID NO: 5, 7, 8, 10, 11, 12 и 13 и их фрагменты, аналоги и производные. В соответствии с одним вариантом указанное инфекционное заболевание представляет собой инфекцию вируса гепатита. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения указанный гепатит выбирают из группы, состоящей из гепатита А, гепатита В и гепатита С. В соответствии с другим вариантом мутанты IFN2, включающие любую из последовательностейSEQ ID NO: 5, 7, 8, 10, 11, 12 и 13, используются для лечения и профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита. В соответствии с еще одним вариантом настоящее изобретение относится к способам лечения или профилактики расстройств, связанных с повышенной экспрессией IFN2, таких как, без ограничения,инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД) и системную красную волчанку (СКВ), включающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, мутантного IFN2, содержащего последовательности SEQ IDNO: 6 и 9, их фрагменты, аналоги и производные. В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к использованию мутантовIFN2 согласно настоящему изобретению при получении лекарственного средства для лечения или профилактики расстройств или заболеваний, связанных с модуляцией IFN. Указанные и другие варианты осуществления настоящего изобретения станут понятными из прилагаемых фигур, текста описания и формулы изобретения. Краткое описание фигур На фиг. 1 А-1 С показана картина иммобилизации внеклеточного домена рецептора интерферона типа I (IFNAR1-EC) при проведении анализа по методу аффинного захвата и связывания IFN2. На фиг. 1 А показана кривая связывания, характеризующая захват IFNAR1 иммобилизованными мАв DB2 с последующим перекрестным связыванием с мАв АА 3. На фиг. 1 В показаны результаты анализа аффинности в стабильном состоянии. Связывание FN2 E58A (жирный серый шрифт) и Е 96 А (слабо черный шрифт),при различных концентрациях в диапазоне от 0,25 до 4 мкМ (см. числовые показатели на фигуре), с IFNAR1, иммобилизованными на поверхности. На фиг. 1 С проиллюстрирована реакция диссоциацииIFN2, IFN и тройного мутанта Н 57 А, Е 58 А, Q61A (SEQ ID NO: 5) на основе иммобилизованного на поверхности IFNAR-EC в масштабе реального времени. Скорость диссоциации непосредственно определяется аффинностью связывания, полученные результаты приведены в табл. 1 и 3. На фиг. 2 приведены результаты анализа связывания IFNAR1 и IFNAR2 с IFN2. Интерфероны типа I выравнивают относительно IFN2. На чертеже подчеркнуты остатки, которые при мутировании вAla не меняют своего связывания с рецептором. Знаки "+" и "-", приведенные выше, указывают, что вызывает данная мутация: повышение или снижение связывающей аффинности с IFN2 при мутации (см.-5 014157 табл. 1). Показанные выше числа означают, к чему относится данное изменение: к связыванию с IFNAR1(1) или с IFNAR2 (2). С-концевые остатки на IFN 8 показаны жирным шрифтом и означают изменения,введенные в SEQ ID NO: 7. Остатки, обведенные прямоугольной рамкой, представляют собой остатки,описываемые SEQ ID NO: 5-13. На фиг. 3 А, 3 В показан функциональный эпитоп для связывания IFNAR1 на IFN2. На фиг. 3 А показан график, демонстрирующий изменения связывающей аффинности всех мутантных белков, проанализированных авторами, с IFNAR1 и с IFNAR2. На фиг. 3 В показан вид поверхности в рамках описанной ранее модели комплекса IFN2 с IFNAR2. Остатки, которые при мутации меняют свое связывание с IFNAR1, отмечены соответствующими цифрами. Остатки, которые при мутации повышают свою связывающую аффинность более чем в 2 раза, подчеркнуты (57, 58, 61). Данная картина была создана с помощью программы PyMol. На фиг. 4 А-4 С показана концентрационная зависимость антивирусного и антипролиферативного ответа интерферонов на клетках WISH. На фиг. 4 А приведена одна группа предварительных данных по оценке антипролиферативного ответа, полученных при введении серийных разбавлений интерферона в диапазоне 250 нМ-0,48 пМ IFN2 и 125 нМ-0,24 пМ IFN. На фиг. 4 В и 4 С показаны результаты денситометрической оценки антипролиферативной (4 В) и антивирусной (4 С) активности в формате трех независимых экспериментов, включая также тройной мутант Н 57 А, Е 58 А, Q61A (SEQ ID NO: 5). Приведенные данные представляют собой результаты 6 повторов и включают значение стандартной ошибки. Приведенная кривая сопровождается уравнением, описывающим зависимость ответа от дозы, и отражает наилучший вариант объединения данных. На фиг. 5 А,5 В продемонстрированы биологические активности мутантных интерферонов. На фиг. 5 А показан график взаимозависимости относительной (применительно к дикому типу) антивирусной активности и относительной антипролиферативной активности 21 единичного мутанта IFN2, тройного мутанта Н 57 А, Е 58 А, Q61A (SEQ ID NO: 5), четверного мутанта N65A, L80A, Y85A, Y89A (SEQ IDNO: 6), (SEQ ID NO: 7), тройного мутанта H57Y, E58N, Q61S (SEQ ID NO: 11) и IFN. На фиг. 5B показаны относительная антивирусная и антипролиферативная активности тех же белков, приведенные на графике против их соответствующей связывающей аффинности для IFNAR1-EC. Все данные взяты из табл. 1-4. Линейная кривая отражает теоретическое родство между биологической активностью и аффинностью. Точки, расположенные выше кривой, соответствуют тем мутантам, для которых изменения биологической активности (антивирусной или антипролиферативной) выражены слабее, чем изменения в аффинности, а точки, расположенные под кривой, описывают противоположную ситуацию. На фиг. 6 А-6 С показан эффект интерферона на генную экспрессию, выявленный в экспериментах на микрочипах с олигонуклеотидами. Оценивают результаты четырех разных вариантов лечения интерфероном длительностью 16 ч с использованием 0,3 нМ (1000 единиц) IFN2-wt; 3 нМ (10000 единиц)IFN2-wt; 0,3 нМ HEQ (SEQ ID NO: 5) и 0,15 нМ IFN (1000 единиц). Каждое условие описывается как лечение IFN против варианта в отсутствие лечения с использованием микрочипов, окрашенных соответствующими красителями, в двойном повторе. Кроме того, используют четыре реплики в эксперименте с микрочипом, включающие вариант без обработки в сравнении с вариантом без обработки применительно к другому образцу, представляющему собой вариант без лечения IFN, в качестве контроля. На фиг. 6 А показаны относительные (относительно варианта без лечения) уровни экспрессии 395 генов, нанесенные на график в порядке возрастания, в соответствии с создаваемой ими кратностью изменений. На фиг. 6 В показаны уровни экспрессии, значения которых нанесены на график относительно уровней экспрессии,достигаемых при добавлении 0,15 нМ IFN. Единственным исключением является показатель экспрессии необработанного контроля (черные пунктирные линии), для которого полученные значения наносят на график против второй контрольной группы, используемой для оценки уровня случайных флуктуаций. На фиг. 6 С показаны результаты кластерного анализа индуцированных интерфероном генов для четырех вариантов лечения. Профили генной экспрессии IFN и НЕО (SEQ ID NO: 5) объединяются в один кластер с очень коротким расстоянием между ними. Профили экспрессии в клетках, обработанных 3 нМIFN2-wt, группируются в более дальний кластер, тогда как профили генной экспрессии в случае введения 0,3 нМ IFN2-wt, располагаются еще дальше. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к мутантным IFN2 и их активным фрагментам, аналогам, производным и вариантам, которые характеризуются повышенной агонистической или антагонистической активностью в сравнении с IFN2 (SEQ ID NO: 2) дикого типа. Мутанты согласно настоящему изобретению представляют улучшенную возможность их терапевтического применения, которая может включать по меньшей мере одно преимущество, выбранное из повышенной специфичности или селективности, увеличенной длительности действия, улучшенной стабильности и меньшего количества пагубных эффектов. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим мутантные IFN2, используемые для лечения или профилактики рака, рассеянного склероза, инфекционных заболеваний и расстройств, связанных с повышенной экспрессии IFN2, таких как инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД) и системная красная волчанка (СКВ).-6 014157 Определения. Термин интерферон (IFN) или интерфероны (IFN) относится к семейству секретируемых белков,представляющих собой цитокины с антивирусной, антипротозойной, иммуномодулирующей активностью и активностью, направленной на регуляцию клеточного роста. Первоначально IFN классифицировали по их источникам: лейкоцитарные IFN1 (SEQ ID NO: 1) и IFN2 (SEQ ID NO: 2), фибробластныеIFN (SEQ ID NO: 3) и IFN иммунных клеток (SEQ ID NO: 4). Особо выделяют IFN,и . Интерферонпредставляет собой основной тип интерферона, продуцируемый белыми кровяными клетками. Термины "аналог", "фрагмент", "производное" и "вариант", применительно к усовершенствованным полипептидам IFN2 согласно настоящему изобретению, включают аналоги, фрагменты, производные и варианты таких улучшенных полипептидов IFN2, которые сохраняют по существу сходную функциональную активность или по существу те же самые биологические функции или активность, что и усовершенствованные полипептиды IFN2 согласно настоящему описанию. Термин "аналог" включает усовершенствованный IFN2 полипептид, в котором по меньшей мере одна аминокислота замещена другой аминокислотой с образованием активного аналога полипептида согласно настоящему изобретению, характеризующегося повышенной активностью, стабильностью или увеличенным периодом полувыведения, в сравнении с полипептидами согласно настоящему описанию. Термин "фрагмент" представляет собой часть усовершенствованного IFN2 полипептида согласно настоящему изобретению, который сохраняет по существу сходную функциональную активность или по существу ту же биологическую функцию или активность, что и усовершенствованный полипептидIFN2, продемонстрированные в тестах in vitro, согласно настоящему изобретению, как будет приведено ниже в описании. Термин "производное" включает все модификации, введенные в усовершенствованный полипептидIFN2 согласно настоящему изобретению, которые, по существу, сохраняют описанные функции и включают дополнительную структуру и сопровождающую ее функцию, например ПЭГилированные полипептиды, которые характеризуются увеличенным периодом полувыведения. Термин "вариант" включает полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая включает сочетание мутантных полипептидов IFN2 согласно настоящему изобретению, которые, в свою очередь, сохраняют по существу сходную биологическую активность или повышенную функциональную активность в сравнении с исходными мутантными полипептидами IFN2. Фраза "по существу сходная функциональная активность" и фраза "по существу та же биологическая функция или активность", каждая из них, означает, что уровень биологической активности составляет 50-100% или более, предпочтительно 80-100% или более и наиболее предпочтительно 90-100% или более относительно биологической активности, демонстрируемой полипептидом, с которым проводят сравнение, где указанную биологическую активность каждого полипептида определяют в рамках одной и той же процедуры или одного и того же теста."Сходство" между двумя полипептидами определяют при сравнении аминокислотной последовательности одного полипептида с последовательностью второго полипептида. Аминокислота одного полипептида близка к соответствующей аминокислоте второго полипептида, если она ей идентична или содержит консервативное аминокислотное замещение. Консервативные замещения включают замещения, описанные в соответствующих руководствах (Dayhoff, М.О., ed., The Atlas of Protein Sequence andStructure 5, National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C. (1978), и Argos, P. (1989) EMBO J. 8: 779-785). Например, аминокислоты, принадлежащие к одной из нижеприведенных групп, отражают консервативные изменения или замещения: Ala: - Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr: - Cys, Ser, Tyr, Thr - Val, Ile,Leu, Met, Ala, Phe; - Lys, Arg, His; -Phe, Tyr, Trp, His; и -Asp, Glu."Специфическая активность" в контексте настоящего изобретения применительно к мутанту IFN2 согласно настоящему изобретению означает биологическую активность или функцию IFN2. Биологические активности или функции IFN2 известны в данной области и включают, без ограничения, его антипролиферативную активность. Такая специфическая активность может быть выявлена и измерена в соответствии с методиками, приведенными в настоящем описании, или с использованием любого известного в данной области способа. Фраза "повышенная специфическая активность" в контексте настоящего описания означает, что специфическая активность или антагонистическая активность композиции IFN2 согласно настоящему изобретению выше, чем соответствующая активность композиции с эталонным IFN2 дикого типа. Специфическая активность композиции IFN2 согласно настоящему изобретению может быть протестирована в сравнении с специфической активностью композиции с эталонным IFN2 дикого типа с использованием методики выявления и/или измерения специфической активности IFN2, например, согласно настоящему описанию или как это известно в данной области. Термин "композиция IFN2" относится к полипептиду IFN2, его фрагменту, аналогу, производному, варианту или к композиции (например, фармацевтической композиции), включающей полипептид-7 014157 Термин "рекомбинантные белки или полипептиды" относится к белкам или полипептидам, получаемым согласно методикам рекомбинантных ДНК, например, получаемым из прокариотических или эукариотических клеток, включая, например, микробные клетки или клетки млекопитающих, трансформированные конструкцией экспрессии экзогенной рекомбинантной ДНК, кодирующей желаемый белок или полипептид. Белки или полипептиды, экспрессируемые в большинстве культур бактериальных клеток, будут в типичном случае свободны от гликана. Белки или полипептиды, экспрессируемые в дрожжах, могут иметь картину гликозилирования, которая отличается от соответствующей картины гликозилирования в клетках млекопитающих. Термин "вектор экспрессии" в контексте настоящего описания относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к репликации и экспрессии интересующего гена, в случае ее трансформации, трансфекции или трансдукции в клетку-хозяин. Векторы экспрессии включают один или несколько фенотипических маркеров селекции и участков начала репликации, для гарантии поддержания жизни вектора и, при желании, для обеспечения амплификации в соответствующем организме-хозяине. Селектируемые маркеры включают, например, последовательности, придающие резистентность к маркерам-антибиотикам, которые могут использоваться для успешного получения нужных трансформантов путем селекции, такие,как последовательности, устойчивые к ампициллину, тетрациклину и канамицину, или поставляющие ключевые питательные компоненты, непредоставляемые сложными средами. Подходящие векторы экспрессии могут быть получены из плазмид, например из плазмид pBR322 или различных pUC плазмид,доступных в коммерческом варианте. Другие векторы экспрессии могут быть получены из векторов экспресиии, таких как бактериофаг, фагемид или космида, которые описаны в разделах 1.12-1.20 руководства Самбрука с соавт. (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edn., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Выделенные плазмиды и фрагменты ДНК расщепляют, нагружают соответствующими фрагментами и лигируют в определенном порядке с образованием желаемых векторов, в соответствии с известными в данной области методиками (см., например, Sambrook et al., ibid.). Термин "нативный", "природный" или "дикого типа" (wt) применительно к белкам или полипептидам относится к белкам или полипептидам, выделяемым из природного источника. Термин "нативныйIFN, содержащие посттрансляционные модификации, включающие, без ограничения, ацетилирование,карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидирование, ацилирование и расщепление. Термин "рекомбинантный экспрессионный вектор или рекомбинантная экспрессионная плазмида" означает реплицирующийся вектор ДНК или плазмидную конструкцию, используемые для амплификации или экспрессии ДНК, кодирующей белки или полипептиды, согласно настоящему изобретению. Вектор или плазмида экспрессии содержат контрольные последовательности ДНК и кодирующую последовательность. Контрольные последовательности ДНК включают промоторные последовательности,сайты связывания рибосом, сигналы полиаденилирования, последовательности терминации транскрипции, регуляторные домены выше начала транскрипции и энхансеры. Рекомбинантная система экспрессии согласно настоящему описанию будет экспрессировать рассматриваемые белки или полипептиды при индукции регуляторных элементов. Термин "трансформированные хозяйские клетки/клетки-хозяева" относится к клеткам, которые были трансформированы и трансфицированы экзогенной ДНК. Экзогенная ДНК может быть интегрирована, но может быть и не интегрирована (например, ковалентно связана) с хромосомной ДНК, составляющей геном клетки-хозяина. У прокариотов и дрожжей, например, экзогенная ДНК может поддерживаться на эписомальном элементе, таком как плазмида, или может быть интегрирована в хромосомную ДНК. Применительно к эукариотическим клеткам стабильно трансформированная клетка представляет собой клетку, в которой экзогенная ДНК становится интегрированной в хромосому. Стабильность демонстрируется по способности эукариотических клеточных линий или клонов к продукции за счет репликации популяции дочерних клеток, содержащих экзогенную ДНК. Термин "праймер" в контексте настоящего описания относится к олигонуклеотиду природному, в виде очищенного фрагмента рестрикции или получаемому синтетически, который способен действовать как точка инициации синтеза при помещении в условия, при которых индуцируется синтез продукта праймерного удлинения, который комплементарен к цепи нуклеиновой кислоты, например, в присутствии нуклеотидов и индуцирующего агента, такого как ДНК-полимераза, при соответствующих значениях температуры и pH. Праймер может быть одноцепочечным или двуцепочечным и должен иметь достаточную длину с тем, чтобы праймировать синтез желательного продукта расширения в присутствии индуцирующего агента. Термин "терапевтически эффективное количество" относится к такому количеству усовершенствованного полипептида IFN2 согласно настоящему изобретению, которого при введении субъекту, нуждающегося в нем, достаточно для лечения соответствующего состояния или расстройства, например в случае рецидивирующе-ремитирующего рассеянного склероза (PC), рака, инфекционных заболеваний или расстройств, связанных с повышенной экспрессией IFN2, таких как инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД) и системная красная волчанка (СКВ).-8 014157 Термин "субъект" относится к человеку и субъектам, отличным от человека. Термин "рак" в контексте настоящего описания включает все типы ракового роста или онкогенных процессов, метастазирующие ткани или злокачественно-трансформированные клетки, ткани или органы,независимо от их гистопатологического типа или стадии инвазии. Примеры рака включают, без ограничения, твердые опухоли и лейкозы, включая апудому, хористому, бранхиому, злокачественный карциноидный синдром, карциноидную болезнь сердца, карциному (например, карциному Уокера, плоскоклеточную карциному, базально-плоскоклеточную карциному, карциному Брауна-Пирса, карциному протоков, опухоль Эрлиха, немелкоклеточный рак легкого, овсяноклеточную карциному, папиллярную карциному, бронхиолярную карциному, бронхогенную карциному, плоскоклеточную карциному и карциному"переходных" клеток), гистиоцитарные расстройства, лейкозы (например, В-клеточный лейкоз, лейкоз смешанных клеток, лейкоз null-клеток, лейкоз Т клеток, Т-клеточный хронический лейкоз, HTLV-IIассоциированный лейкоз, лимфоцитарный острый лейкоз, лимфоцитарный хронический лейкоз, лейкоз тучных клеток и миелоидный лейкоз), злокачественный гистиоцитоз, болезнь Ходжкина, иммунопролиферативный мелкоклеточный лейкоз, неходжкинскую лимфому, плазмацитому, ретикулоэндотелиоз,меланому, ходробластому, хондрому, хондросаркому, фиброму, фибросаркому, гигантоклеточные опухоли, гистиоцитому, липому, липосаркому, мезотелиому, миксому, миксосаркому, остеому, остеосаркому, саркому Эвинга, синовиому, аденофиброму, аденолимфому, карциносаркому, хордому, краниофарингиому, дисгерминому, гамартому, мезенхимому, мезонефрому, миосаркому, амелобластому, цеместому, одонтому, тератому, тимому, тромфобластную опухоль, аденокарциному, аденому, холангиому,холестеатому, цилиндрому, цистаденокарциному, цистаденому, опухоль гранулезных клеток, гинандробластому, гепатому, гидраденому, опухоль островковых клеток, опухоль клеток Лейдига, папиллому,опухоль клеток Сертоли, опухоль оболочечных клеток, лейомиому, лейомиосаркому, миобластому, миосаркому, рабдомиому, рабдомиосаркому, эпендимому, ганглионеврому, глиому, медуллобластому, менингиому, неврилеммому, нейробластому, нейроэпителиому, нейрофиброму, нейрому, параганглиому,параганглиому нехромаффинную, ангиокератому, ангиолимфоидную гиперплазию с эозинофилией,склерозирующую ангиому, ангиоматоз, гломангиому, гемангиоэндотелиому, гемангиому, гемангиоперицитому, гемангиосаркому, лимфангиому, лимфангиомиому, лимфангиосаркому, пинеалому, карциносаркому, хондросаркому, цистосаркому, филлодез, фибросаркому, гемангиосаркому, леймиосаркому, лейкосаркому, липосаркому, лимфангиосаркому, миосаркому, миксосаркому, карциному яичника, рабдомиосаркому, саркому (например, саркому Эвинга, экспериментальную саркому, саркому Капоши и саркому тучных клеток), нейрофиброматоз и дисплазию клеток шейки и другие состояния, при которых клетки становятся иммортализованными или трансформированными. Термин "лечение PC" в контексте настоящего описания охватывает все виды лечения болезненного состояния у субъекта, где болезненное состояние характеризуется симптомами, связанными с PC, такими, как слабость, онемение, тремор, ухудшение зрения, боль, паралич, ухудшение баланса, дисфункция мочевого пузыря и кишечника и когнитивные изменения (первичные симптомы); повторные инфекции мочевых путей, слабость, ухудшенный контроль положения тела, мышечный дисбаланс, сниженная плотность кости, мелкое, укороченное дыхание и пролежни (вторичные симптомы) и включает: (i) ингибирование состояния, например остановку его развития; или (ii) облегчение состояния, например, за счет регрессии данного состояния. Термин "инфекция вирусом гепатита" относится к инфекции одним или несколькими вирусами гепатита А, В, С, D или Е, где инфекция вирусом гепатита крови представляет особый интерес. В контексте настоящего описания термин "печеночный фиброз" используется взаимозаменяемо с термином "фиброз печени" и относится к росту рубцовой ткани в печени, который отмечается при хронической инфекции вирусом гепатита. Термин "ПЭГилированные мутанты IFN2" в контексте настоящего описания относится к конъюгатам мутантов IFN2. Предпочтительные модифицированные полиэтиленгликолем мутантные конъюгатыIFN2 представляют собой обратимые конъюгаты, которые медленно превращаются в лекарственные средства в физиологических условиях, такие как конъюгаты, получаемые по методикам, описанным вWO 2004089280. Другие конъюгаты мутантных IFN2 могут быть получены связыванием IFN2 мутанта с водорастворимым полимером. Неограничивающий перечень таких полимеров включает другие полиалкиленоксидные гомополимеры, такие как полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиолы,сополимеры указанных полиолов и их блок-сополимеры. В качестве альтернативы полиалкиленоксидным полимерам могут эффективно использоваться не антигенные материалы, такие как декстран, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, углеводные полимеры и т.п. Такие конъюгаты интерферона и -полимера описаны в патенте США 4766106 и патенте США 4917888. В контексте настоящего описания термин "микрочип" относится к совокупности выделенных молекул нуклеиновой кислоты или олигонуклеотидных зондов, присоединенных к подложке, где каждая из молекул нуклеиновой кислоты или каждый олигонуклеотидный зонд присоединены к подложке на уникальном подобранном участке. Термин "нуклеиновая кислота" используется взаимозаменяемо с термином "полинуклеотид". Термин "полинуклеотид" относится к цепи нуклеотидов. Предпочтительно цепь-9 014157 содержит примерно от 20 до 10000 нуклеотидов, более предпочтительно примерно от 150 до 3500 нуклеотидов. Термин "зонд" относится к полинуклеотидной последовательности, способной гибридизоваться с генным транскриптом или его комплементом с образованием комплекса полинуклеотидный зонд/генный транскрипт. Термин "ген" включает участок, который может быть транскрибирован в РНК, и при этом настоящее изобретение включает выявление РНК или ее эквивалентов, например, кДНК и кРНК. Термин "ген" включает участок, который может быть транскрибирован в РНК, и настоящее изобретение включает выявление РНК или ее эквивалентов, например кДНК и кРНК. Ген согласно настоящему изобретению включает, без ограничения, гены, специфичные для конкретного биологического процесса или вовлекаемые в него, и/или которые являются индикативными для биологического процесса, такого как апоптоз,дифференцировка, стресс, старение, пролиферация и т.п.; гены клеточного механизма, например клеточного цикла, сигнальной трансдукции, метаболизма токсических соединений и т.п.; гены, связанные с заболеванием, например гены, вовлекаемые в развитие рака, рассеянного склероза, инфекции и т.п. Например, ген может представлять собой онкоген, экспрессия которого вызывает превращение клетки из нормальной в опухолевую клетку. Другие примеры таких генов включают, без ограничения, гены цитокинов, гены приона, гены, кодирующие молекулы, которые индуцируют ангиогенез, гены, кодирующие молекулы адгезии, гены, кодирующие рецепторы клеточной поверхности, гены, кодирующие белки, которые вовлекаются в процесс метастазирования и/или в инвазивные процессы, гены протеаз, а также молекулы, регулирующие апоптоз и клеточный цикл. Согласно настоящему изобретению уровень генного транскрипта может быть определен путем измерения уровня генного транскрипта, например РНК, с использованием полуколичественных методик,таких как гибридизация на микрочипе, или более точные количественные методики, такие как количественная qPCR. В контексте настоящего описания термин "регуляция экспрессии/или активности" в основном относится к процессу, функционирующему в направлении контроля или модуляции количества или активности (функциональности) клеточного компонента. Статическая регуляция поддерживает экспрессию и/или активность на некотором определенном уровне. Позитивная регуляция относится к относительному повышению уровня экспрессии и/или активности. Соответственно отрицательная регуляция относится к относительному снижению уровня экспрессии и/или активности. Отрицательная регуляция является синонимом ингибирования активности данного клеточного компонента. Характеристики усовершенствованных полипептидов IFN2 согласно настоящему изобретению Были введены три одиночные мутации (Н 57 А, Е 58 А, Q61A) (SEQ ID NO: 5) в IFN2, которые специфически повышают его аффинность связывания в отношении рецептора IFNAR1 примерно в 30 раз в сравнении с белком дикого типа (SEQ ID NO: 2). Аффинность мутантного белка IFN2, обозначенного в настоящем изобретении как HEQ, аналогична аффинности IFN (табл. 3), который значительно превышает аффинность интерферона любого другого подтипа. Результаты оценки биологической активностиHEQ четко демонстрируют у него характеристики, очень сходные с IFN (SEQ ID NO:3). Так, HEQ вызывает лишь двукратное повышение антивирусной активности, тогда как его антипролиферативная активность повышается в 25 раз в сравнении с IFN2-wt (SEQ ID NO: 2) (табл. 4). Вводят две дополнительных группы мутаций в те же самые положения в IFN2, что и в случаеHEQ: H57M, E58D, Q61L, обозначенных в настоящем описании как MDL (SEQ ID NO: 10) и H57Y,E58N, Q61S, которые обозначены здесь как YNS (SEQ ID NO: 11). Антивирусная активность обоих вариантов примерно в 3 раза превышает активность дикого типа (табл. 4). Однако их антипролиферативная активность выше, чем HEQ для IFN. В случае MDL указанная активность в 40 раз превышает активность дикого типа, а активность YNS в 160 раз выше в клетках WISH и в 70 раз выше в клетках MDA231,что превышает в 3-7 раз активность, определенную для IFN (SEQ ID NO: 3). Профиль генной транскрипции HEQ (SEQ ID NO: 5) отслеживают в экспериментах с олигонуклеотидными микрочипами. Активация гена HEQ намного выше, чем уровень активации IFN2 при одинаковой концентрации белка, что аналогично генной активации, зафиксированной для IFN (SEQ ID NO: 3).YNS или HEQ потенциально могут быть более эффективными лекарственными препаратами при лечении соответствующего заболевания в сравнении с IFN2-wt или IFN. Преимущество YNS или HEQ в сравнении с IFN2-wt заключается в их более высокой антипролиферативной специфичности, что может способствовать снижению побочных эффектов при лечении рака или рассеянного склероза. Преимущество YNS заключается в его более высоком антипролиферативном эффекте в сравнении с IFN, в частности при определении данной активности в раковых клетках молочной железы человека MDA231. Настоящее изобретение также относится к четверному мутанту N65A, L80A, Y85A, Y89A (SEQ IDNO: 6), обозначенному в настоящем описании как NLYY, который обладает в 1000 раз сниженной антипролиферативной активностью и в 100 раз сниженной антивирусной активностью в сравнении с белком дикого типа, но который все еще связывается с IFNAR2 с аффинностью, характерной для дикого типа(табл. 2). Настоящее изобретение относится к белку IFN2, включающему замещение С-концевой последова- 10014157 тельности ESLRSKE на KRLKSKE (SEQ ID NO: 7), обозначенной в настоящем описании как 8 фрагмент. Был сконструирован мутант по 8-фрагменту так, чтобы он содержал присоединенный фрагмент интерферона 8, с целью оптимизации энергии электростатического связывания между IFN2 и его рецептором IFNAR2. Определение уровня связывания показало, что мутант с 8-фрагментом обладает повышенной в 18 раз аффинностью связывания в отношении IFNAR2, в сравнении с белком дикого типа(табл. 2). Антивирусная активность мутанта по 8-фрагменту в 3 раза превышает, а его антипролиферативная активность - в 10 раз превышает соответствующие активности белка дикого типа (табл. 2). Каждая из специфических мутаций трех мутантов IFN2 согласно настоящему изобретению локализована в соответствующем, отличном от других, положении на белке, так что они могут быть объединены с достижением дополнительного или улучшенного эффектов. Настоящее изобретение относится к вариантам, которые включают сочетание тройного мутанта HEQ (SEQ ID NO: 5); MDL (SEQ ID NO: 10) или YNS (SEQ ID NO: 11) и замещение С-концевой последовательности ESLRSKE на KRLKSKE (SEQID NO: 7). Указанные варианты (SEQ ID NO: 8, 12 и 13) могут демонстрировать большую эффективность при лечении рака, поскольку их антипролиферативная активность повышается. Более того, их более высокая связывающая эффективность дает возможность решить проблему отрицательной регуляции рецептора в раковой клетке. Поскольку HEQ состоит из трех точечных мутаций до Ala, и мутант 8-фрагмента включает замещение С-конца IFN2 С-концевым фрагментом нативного IFN8, возможность специфического иммуногенного ответа мала. Настоящее изобретение также относится к варианту, включающему сочетание четверного мутантаID NO: 9), с повышением аффинности по связыванию с IFNAR2, но с очень низкой биологической активностью. Указанный вариант IFN2 представляет собой антагонист IFN, блокирующий природную активность IFN через воздействие на эти рецепторы. Улучшенные композиции на основе IFN2 согласно настоящему изобретению включают мутантные полипептиды IFN2 или их фрагменты, аналоги, производные и варианты, которые обладают повышенной по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере в 10 раз и более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз специфической активностью, по сравнению с активностью композиции с эталонным IFN2 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения описываемые в нем композиции на основе IFN2 обладают антагонистической активностью против IFN2 дикого типа. Антагонисты согласно настоящему изобретению Антагонист IFN определяется как любое вещество, способное препятствовать проявлению биологической активности IFN in vivo. Совсем необязательно, чтобы при этом антагонист полностью нейтрализовывал активность IFN, но, возможно, лишь до некоторой степени, достаточной для того, чтобы проявлял терапевтическую активность в отношении ИЗСД или СКВ in vivo. Известно, что IFN обладает множеством биологических активностей. Антагонисты, применяемые согласно настоящему изобретению, будут снижать, ингибировать или нейтрализовать любую одну или несколько из указанных активностей. Обычно антагонист препятствует проявлению по меньшей мере одной (и предпочтительно всех) активностей IFN, включая антивирусную, антипролиферативную или иммуномодулирующую активность. Антагонистов в основном выбирают из нескольких категорий, таких как растворимая форма рецептораинтерферона, антитела к рецептору интерферон , которые блокируют способность интерферонак связыванию или к соответствующему взаимодействию с его рецептором, антитела, способные связываться и нейтрализовать сам -интерферон и отличные от интерферона полипептиды, конкурирующие с интерферономза сайты связывания рецептора, но которые сами не демонстрируют существенной активности интерферона . Антагонисты согласно настоящему изобретению представляют собой мутантыIFN, которые являются антагонистами активности IFN и IFN. Мутагенез IFN2 Эффекты изменений аминокислот в конкретных положениях могут быть протестированы экспериментально путем введения замен аминокислот и оценки биологической активности измененных полипептидов IFN2 с использованием приведенных в настоящем описании тестов. Любая методика мутагенеза, известная в данной области, может быть использована, включая, без ограничения, химический мутагенез, сайт-направленный мутаганез in vitro с использованием, например, набора для сайтнаправленного мутагенеза QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) и т.п. Особенно подходят для данной стратегии такие методики, как мутагенез на основе аланинового сканирования. Нуклеиновые кислоты Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим усовершенствованные полипептиды IFN2 согласно настоящему изобретению. Молекула нуклеиновой кислоты может быть получена с использованием технологии рекомбинантных ДНК (например, путем амплификации в рамках полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР), клонирова- 11014157 ния) или с помощью химического синтеза. Последовательности нуклеиновых кислот охватывают природные последовательности нуклеиновых кислот и их гомологи, включающие, без ограничения, природные аллельные варианты и модифицированные последовательности нуклеиновых кислот, в состав которых нуклеотиды могут быть встроены или они могут быть делетированы, замещены и/или инвертированы таким образом, что такие модификации по существу не будут препятствовать способности молекулы нуклеиновой кислоты кодировать рекомбинантные полипептиды IFN2 согласно настоящему изобретению. Полинуклеотидная или олигонуклеотидная последовательность может быть определена на основе информации о генетическом коде белка, однако должна быть принята во внимание вырожденность кода,так что последовательности нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению также включают последовательности, которые являются вырожденными в результате вырожденности генетического кода,при этом указанные последовательности могут быть легко определены любым специалистом со средним уровнем знаний в данной области. Термины "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" в контексте настоящего изобретения относятся к олигонуклеотиду, полинуклеотиду или нуклеотиду или к их фрагментам или частям и к ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными, двуцепочечными и которые могут представлять собой смысловую или антисмысловую цепь. Указанный термин также включает в качестве эквивалентов аналоги РНК или ДНК, полученные на основе нуклеотидных аналогов, которые применимы в вариантах осуществления настоящего изобретения. Термин "олигонуклеотид" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, включающей по меньшей мере от примерно 6 нуклеотидов до примерно 60 нуклеотидов, предпочтительно примерно от 15 до 30 нуклеотидов и более предпочтительно примерно от 20 до 25 нуклеотидов, которые могут быть использованы в реакции амплификации в рамках ПЦР или в тесте на гибридизацию либо в микрочипе. В контексте настоящего изобретения термин "олигонуклеотид" по существу эквивалентен терминам "амплимеры", "праймеры", "олигомеры" и "зонды", которые соответствуют общепринятым в данной области определениям. В контексте настоящего описания условия высокой жесткости включают такие условия, которые являются толерантными до уровня различия последовательностей, которые составляет от примерно 5 до примерно 25%, предпочтительно от примерно 5 до примерно 15%. Без ограничения, примеры условий высокой жесткости (на -10 С ниже вычисленного значения температуры плавления (Tm) для гибрида) включают использование промывного раствора 0,1X SSC (стандартный солевой раствор цитрата) и 0,5% ДСН при соответствующем значении Ti (температура инкубации), которая ниже расчетного значения Tm для гибрида. Условия очень высокой жесткости относятся, в первую очередь, к условиям промывки, в частности, если используемые условия гибридизации таковы, что они позволяют образование менее стабильных гибридов вместе со стабильными гибридами. Условия промывки при повышенной жесткости позволяют удалить менее стабильные гибриды. Обычные условия гибридизации, которые могут быть использованы в условиях промывки от высокой жесткости до умеренной жесткости, как было описано выше, включают гибридизацию в растворе 6 Х SSC (или 6 Х SSPE), 5 Х реагент Денхарда, 0,5% ДСН,100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при соответствующем значенииTi (см. в основном руководство Самбрука (Samrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2rd edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) с описанием подходящих условий высокой жесткости). Условия жесткости представляют собой функцию температуры, использованной в эксперименте гибридизации, и условия промывки, а также молярность одновалентных катионов в растворе для гибридизации и в одном или нескольких промывочных растворах, а также процентное содержание формамида в растворе для гибридизации. В основном чувствительность к гибридизации с определенным зондом определяется количеством и специфической активностью зонда, количеством целевой нуклеиновой кислоты, выявляемостью метки, скоростью гибридизации и длительностью процесса гибридизации. Скорость гибридизации становится максимальной при значении Ti, которое примерно на 20-25 С ниже значенияTm для гибридов ДНК:ДНК и примерно на 10-15 С ниже значения Tm для гибридов ДНК-РНК. Она также становится максимальной при ионной силе примерно 1,5 М Na+. Указанная скорость прямо пропорциональна длине дуплекса и обратно пропорциональна числу ошибочных спариваний. Однако специфичность гибридизации является функцией различия в стабильности между желательным гибридом и "фоновыми" гибридами. Стабильность гибрида является функцией длины дуплекса,состава оснований, ионной силы, числа ошибочных спариваний, дестабилизирующих агентов (если они имеются). Показатель Tm корректного гибрида может быть оценен для гибридов ДНК:ДНК с использованием уравнения Майнкота с соавт. (Meinkoth et al., Anal. Biochem. 1984; 138(2): 267-84). Экспрессия и очистка улучшенных полипептидов IFN2 Имеется несколько путей достижения экспрессии и очистки рекомбинантного человеческого IFN в бактериях, в частности в клетках Е.coli, которые приводят к получению полипептидов IFN2, обладающих повышенной агонистической или антагонистической активностью. Известные методы могут- 12014157 использоваться для экспрессии клонированных генов в бактериях. Для достижения высокого уровня экспрессии клонированного эукариотического гена в прокариотической системе предпочтительно сконструировать векторы экспрессии, которые будут содержать сильный промотор, направляющий транскрипцию мРНК. Примеры регуляторных участков, приемлемые для данных целей, включают промотор и участок оператора в гене -галактозидазы E.coli, путь биосинтеза триптофана в Е.coli или левосторонний промотор из фага А. Встраивание маркеров селекции в ДНК плазмид, трансформированных в E.coli, также может быть применимо с этой целью. Примеры таких маркеров включают гены, определяющие резистентность к ампициллину, тетрациклину или хлорамфениколу. В прокариотической системе экспрессии,функционирующей в E.coli, отсутствуют посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование. Кроме того, белки со сложной картиной дисульфидных связей могут образовывать некорректную конформацию при экспрессии в E.coli. В прокариотической системе экспрессированный белок либо присутствует в цитоплазме клеток в нерастворимой форме, в так называемых телах включения, найденных в растворимой фракции после лизирования клеток, либо направляется в периплазму добавлением соответствующих сигнальных последовательностей секреции. Если экспрессированный белок находится в нерастворимых телах включения, то может потребоваться солюбилизация с последующим сворачиванием заново таких тел включения. Многие прокариотические векторы экспрессии известны специалистам в данной области и коммерчески доступны, такие как pKK223-2 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), pKK233-3 (Clontech,Palo Alto, CA, USA) и pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WI, USA). Промоторы, которые обычно используются в рекомбинантных микробных системах экспрессии, включают промоторную систему лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (Chang, А.С. et al. 1978, Nature, 275: 617-624). К ним также относится промоторная система триптофана (trp) и Тас промотор (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). В другой системе бактериальной экспрессии используется промотор фага лямбда pL и термоиндуцибельный репрессор clts857(Bernard et al., 1979, Gene 5: 59-76). В настоящее время используют следующий протокол: ген, кодирующий IFN2, клонировали в двухцистронном векторе экспрессии на основе плазмиды pT7T3-18U, к которому добавляли второй цистрон непосредственно перед начальным кодоном. Второй цистрон представляет собой первые 9 аминокислот гена lpp 5', включающие его сайт SD, фланкированный сайтами рестрикции XbaI и NdeI. Встраивание второго цистрона проводили для повышения выхода гетерологичного белка экспрессии. Кроме того, для повышения уровня экспрессии кодоны для первых 23 аминокислот заменяли на TGT GAT CTG(SEQ ID NO: 14). Белки подвергали экспрессии в клетках BL21 в течение ночи в обогащенной среде.IFN2 находили в телах включения, которые растворяли в 8 М мочевине, содержащей 5 мМ ДТТ. IFN2 подвергали повторному структурированию в течение ночи при 20-кратном разбавлении. Очистку белка проводили с использованием стандартных методик. В типичном случае выход белка составлял 10 мг/л культуры клеток. IFN2 при анализе методом электрофореза в ДСН-ПААГ двигался в виде одной полосы размером 18 кДа. Аналоги, фрагменты, производные и варианты усовершенствованных полипептидов IFN2. Аналог, фрагмент, производное и вариант усовершенствованных полипептидов IFN2 согласно настоящему изобретению могут представлять: (i) такой аналог, фрагмент, производное и вариант, в котором один или несколько аминокислотных остатков замещены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком; или (ii) такой аналог, фрагмент, производное или вариант, в котором один или несколько аминокислотных остатков включают замещающую группу, или (iii) такой аналог, фрагмент, производное или вариант, в котором усовершенствованный полипептид IFN2 слит с другим соединением, таким как соединение, увеличивающее период полувыведения усовершенствованного полипептида IFN2 (например, с полиэтиленгликоль); или (iv) такой аналог, фрагмент, производное или вариант, в котором дополнительные аминокислоты слиты со зрелым усовершенствованным полипептидомIFN2, таким как лидерная или секреторная последовательность или последовательность, которая используется для очистки зрелого усовершенствованного полипептида IFN2; или (v) такой аналог, фрагмент, производное или вариант, в котором последовательность усовершенствованного полипептидаIFN2 слита с более крупным полипептидом, например с человеческим альбумином, антителом или Fc,для повышения длительности эффекта. Такие аналоги, фрагменты, производные или варианты будут понятны специалистам в данной области из приведенного описания. Термин "консервативное замещение аминокислоты" относится к такому замещению, при котором один аминокислотный остаток замещается другим аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, известны в данной области. Указанные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), с кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота), с незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глютамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), с неполярны- 13014157 ми боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин,триптофан), с -разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и с ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Неконсервативные замещения не делаются для консервативных аминокислотных остатков или для аминокислотных остатков, находящихся в консервативном домене белка. Фрагменты или биологически активные части включают полипептидные фрагменты, пригодные для использования в качестве лекарственного средства или в качестве исследовательского инструмента и т.п. Указанные фрагменты включают пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, обладающие достаточной степенью сходства с аминокислотными последовательностями усовершенствованного полипептида IFN2 согласно настоящему изобретению, или которые были получены из них и демонстрируют по меньшей мере одну из активностей, характерных для данного полипептида, но при этом включают меньшее число аминокислот, чем полноразмерные полипептиды согласно настоящему описанию. В типичном случае биологически активные части включают домен или мотив, обладающий по меньшей мере одной активностью полипептида. Такие биологически активные части могут быть получены путем синтеза или в соответствии с рекомбинантными методиками и могут быть проанализированы на наличие одной или нескольких функциональных активностей полипептида согласно настоящему изобретению в рамках процедур, приведенных в настоящем описании и/или известных в данной области. Предпочтительные производные согласно настоящему изобретению включают усовершенствованные полипептиды IFN2, которые были слиты с другим соединением, таким как соединение, способное повысить период полувыведения полипептида и/или снизить возможную иммуногенность полипептида(например, полиэтиленгликоль, ПЭГ). ПЭГ может использоваться для достижения растворимости в воде,изменения размера, снижения скорости почечного клиренса и снижения иммуногенности белка слияния. См., например, патент США 6214966. В случае ПЭГилирования, слияние усовершенствованного полипептида IFN2 с ПЭГ может быть достигнуто с использованием любой методики, известной специалистам в данной области. Например, ПЭГилирование может быть осуществлено путем введения мутации цистеина в усовершенствованном полипептиде IFN2 с последующей сайт-специфической дериватизацией ПЭГ-малеимидом. Цистеиновый остаток может быть добавлен к С-концу усовершенствованного полипептида IFN2. См., например, работу Цуцуми с соавт. (Tsutsumi et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 97: 8548-8553). Варианты усовершенствованных полипептидов IFN2 согласно настоящему изобретению включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, обладающую достаточной степенью сходства с аминокислотной последовательностью исходных усовершенствованных полипептидовIFN2 или их сочетания. Указанные варианты включают усовершенствованные полипептиды IFN2,отличающиеся по аминокислотной последовательности за счет мутагенеза. Указанные варианты с усовершенствованной активностью могут быть идентифицированы путем скрининга комбинаторных библиотек мутантов, например усеченных мутантов или точечных мутантов, на основе усовершенствованных полипептидов IFN2 согласно настоящему изобретению. В одном аспекте вариегированную библиотеку разных вариантов получают путем комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновой кислоты с последующим кодированием библиотеки вариегированных генов. Вариегированная библиотека вариантов может быть получена, например, путем энзиматического лигирования смеси синтетических нуклеотидов с образованием генных последовательностей, так чтобы вырожденный набор потенциальных вариантов аминокислотных последовательностей мог экспрессироваться в виде отдельных полипептидов или, альтернативно, в виде набора более крупных усовершенствованных полипептидов IFN2 (например, для проявления фага), содержащих набор данных последовательностей. Имеется множество методик, которые могут использоваться для получения библиотек возможных вариантов вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Химический синтез вырожденной генной последовательности может быть проведен с помощью автоматического синтезатора ДНК и далее проводят лигирование синтезированного гена в соответствующий вектор экспрессии. Использование вырожденного набора генов позволяет иметь в виде одной смеси все последовательности, кодирующие желательный набор возможных вариантных последовательностей. Методы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в данной области (см., например, Itakura, K. et al. 1984, Annu. Rev. Biochem. 53: 323-356). В данной области известно несколько методик, применяемых для скрининга продуктов комбинаторных библиотек, получаемых путем точечного мутагенеза или путем усечения, а также для скрининга библиотек кДНК в случае генных продуктов, обладающих выбранным свойством. Такие методики могут быть адаптированы для быстрого скрининга библиотек, созданных путем комбинаторного мутагенеза усовершенствованных полипептидов IFN2, для оценки их специфической активности. Чаще всего используемые методики, которые применимы для крупномасштабного анализа при скрининге крупных генных библиотек, в типичном случае включают клонирование генной библиотеки в реплицируемых векторах экспрессии, трансформацию соответствующих клеток полученной библиотекой векторов, экспрессию комбинаторных генов в условиях, при которых выявление желательной активности облегчает- 14014157 выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого был обнаружен. Может быть использован рекурсивный ансамблевый мутагенез (REM), представляющий собой методику, позволяющую повысить частоту функциональных мутантов в библиотеке, в сочетании с методами скрининга, для идентификации желаемых вариантов. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые могут быть введены пациенту с достижением терапевтического эффекта. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению для целей введения могут быть получены путем объединения усовершенствованного полипептида IFN2, обладающего желаемой степенью чистоты, в фармацевтически эффективном количестве, с фармацевтически приемлемыми носителями. Усовершенствованные полипептиды IFN2 и фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению используются для парентерального введения (например, внутривенного, внутримышечного и подкожного), местного, перорального введения, введения путем ингаляции или для локального введения. Усовершенствованные полипептиды IFN2 согласно настоящему изобретению могут использоваться в фармацевтических композициях в режиме любого способа введения, включая, без ограничения,внутривенное, подкожное, внутримышечное и интратекальное введение. Таким образом, описанные выше полипептиды предпочтительно могут быть объединены с приемлемым стерильным фармацевтическим носителем, таким как пятипроцентная декстроза, содержащим лактат раствора Рингера, нормальный солевой раствор, стерильную воду или любой другой полученный в коммерческом варианте физиологический буферный раствор, предназначенный для внутривенной инфузии. Следует понимать, что выбор раствора носителя и дозировки, а также способа введения композиции будет варьироваться в зависимости от субъекта, которому надлежит провести введение и от конкретных клинических показателей,и определяется с использованием стандартных медицинских процедур. В соответствии с методами согласно настоящему изобретению указанные фармацевтические композиции могут вводиться в количествах, эффективных для подавления или ослабления патологических последствий или симптомов, связанных с PC, раком, ИЗСД или СКВ. Введение усовершенствованных полипептидов IFN2 согласно настоящему изобретению может проводиться путем внутривенной инъекции болюсом, путем постоянной внутривенной инфузии или сочетанием указанных способов. Альтернативно или в дополнение, усовершенствованные полипептидыIFN2, смешанные с соответствующими эксципиентами, могут быть введены в кровоток через внутримышечный сайт введения. Очевидно, что полипептиды в меньшей степени пригодны для перорального введения в связи с их чувствительностью к расщеплению кислотами желудка или ферментами кишечника, однако в некоторых вариантах специфические композиции могут использоваться и для перорального введения. При изготовлении композиций в виде пероральных жидких дозированных форм (таких как суспензии, эликсиры и растворы) могут использоваться типичные фармацевтические среды, такие как вода,гликоли, масла, спирты, вкусовые вещества, консерванты, красители и т.п. Аналогично, при изготовлении пероральных твердых дозированных форм (таких как порошки, таблетки и капсулы) могут использоваться носители, такие как крахмалы, сахара, разбавители, гранулирующие агенты, лубриканты, связующие вещества, дезинтегрирующие агенты и т.п. В связи с легкостью введения таблетки, капсулы представляют собой желательную пероральную дозированную форму для фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Полипептиды менее пригодны для местного введения, однако для локального лечения могут быть использованы специфические композиции. Для местного введения усовершенствованные полипептиды IFN2 согласно настоящему изобретению могут быть изготовлены с использованием легких увлажняющих основ, таких как мази или кремы. Примеры подходящих мазевых основ включают вазелин, вазелин + летучие силиконы, ланолин и эмульсии типа "вода-в-масле". В случае введения путем ингаляции полипептиды IFN2 согласно настоящему изобретению могут доставляться в форме аэрозольного спрея из баллона под давлением или из небулайзера при использовании подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана или диоксида углерода. В случае аэрозольного баллона под давлением дозированная единица может быть определена с помощью клапана, доставляющего отмеренное количество агента. Капсулы и картриджи, например из желатина, используемые в ингаляторе или инсуффляторе, могут быть изготовлены на основе порошковой смеси пептида и соответствующей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал. Усовершенствованные полипептиды IFN2 и фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению особенно полезны для внутривенного введения. Композиции для осуществления указанного введения обычно включают раствор усовершенствованного полипептида IFN2, который растворен в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно в водном носителе. Может использоваться множество водных носителей, например забуференный солевой раствор и т.п. Указанные растворы яв- 15014157 ляются стерильными и в основном не содержат нежелательных примесей. Композиции могут быть простерилизованы с использованием обычных известных методик стерилизации. В типичном случае пригодность фармацевтической композиции для внутривенного введения может быть легко определена специалистом в данной области. Очевидно, что вводимые количества зависят от белка и определяются также его эффективностью и фармакокинетическим профилем. Методики, фактически используемые для изготовления парентерально вводимых композиций, известны специалистам в данной области или могут быть взяты из соответствующих руководств (Remington's Pharmaceutical Science, 18t ed., Mack PublishingCompany, Easton, PA, 1990). Композиции, содержащие усовершенствованные полипептиды IFN2 согласно настоящему изобретению или их коктейль (т.е. в сочетании с другими белками), могут вводиться в варианте терапевтического лечения. При терапевтическом применении композицию вводят пациенту, страдающему от PC,рака и расстройств, связанных с повышенной экспрессией IFN2, в количестве, достаточном для излечивания или, по меньшей мере, для частичной остановки развития расстройства. Количество, адекватное для достижения этой цели, определяется как "терапевтически эффективная доза". Количество, эффективное для данной цели, зависит от тяжести заболевания и от общего состояния здоровья пациента. Может осуществляться как однократное введение, так и множественное введение композиции в зависимости от дозировки и частоты, требуемых для лечения, и в зависимости от переносимости их пациентом. В любом случае композиция должна обеспечивать поступление достаточного количества усовершенствованных полипептидов IFN2 согласно настоящему изобретению для эффективного лечения пациента. В основном, в зависимости от выбранного способа введения, фармацевтически приемлемые композиции будут содержать от примерно 1 до примерно 99 вес.% усовершенствованного полипептидаIFN2 согласно настоящему изобретению и от 99 до 1 вес.% подходящего фармацевтического эксципиента или носителя. Предпочтительно композиция содержит примерно от 5 до 75 вес.% усовершенствованных одного или нескольких полипептидов IFN2 согласно настоящему изобретению, тогда как остаточное количество будет представлено соответствующими фармацевтическими эксципиентами или носителями. Усовершенствованные полипептиды IFN2 согласно настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемые композиции вводят в терапевтически эффективном количестве, которое варьируется в зависимости от множества факторов, включающих специфическую активность конкретного используемого усовершенствованного полипептида IFN2; метаболической стабильности и длительности действия усовершенствованного полипептида TFN2; возраста, веса тела, общего состояние здоровья, пола и пищевых привычек пациента; от способа и времени введения; от скорости экскреции; от наличия дополнительного лекарственного средства, применяемого в сочетании, от тяжести конкретной стадии заболевания и от природы организма-хозяина, подлежащего лечению. В основном терапевтически эффективная дневная доза составляет от примерно 0,1 мкг до примерно 1000 мкг/кг веса тела на одно введение усовершенствованного полипептида IFN2 согласно настоящему изобретению, предпочтительно от примерно 0,5 мкг до примерно 100 мкг/кг веса тела на одно введение. Например, в случае введения индивидууму весом 70 кг диапазон дозировок будет составлять от примерно 10 мкг до примерно 100 мкг на введение усовершенствованного полипептида IFN2 согласно настоящему изобретению, в зависимости от режима лечения. Так, например, если усовершенствованный полипептид IFN2 согласно настоящему изобретению или композицию, содержащую полипептид, вводят от одного до нескольких раз в день, то может потребоваться меньшая доза, чем в том случае, когда указанную композицию вводят еженедельно,или ежемесячно, или еще реже. Ожидается, что полипептиды IFN2 согласно настоящему изобретению будут вводиться в соответствующих дозах. Дозы в основном подбираются к максимально переносимой дозе или к уровню ниже указанной дозы (MTD). Признаки, являющиеся показателями интерфероновой токсичности, включают гематологическую токсичность, анемию, тромбоцитопению, лейкопению; что касается токсичности для желудочно-кишечного тракта, то они включают диарею, диспепсию, дисфагию, тошноту и рвоту, боль в брюшной полости; применительно к печеночной токсичности, указанные признаки включают повышение уровней билирубина, щелочной фосфатазы и функциональной пробы печени; показатели токсичности для почек и мочевого пузыря включают микроскопические признаки гематурии, пиурию, азотемию,протеинурию, острую почечную недостаточность, нефротический синдром, глюкозурию, альбуминурию; применительно к легочной токсичности указанные признаки включают ортопноэ, одышку, бронхоспазм,кашель, отек легкого, ОРЗ; применительно к сердечной токсичности указанные признаки включают обморок, ишемию миокарда, синусовую тахикардию, брадикардию, тахикардию, головокружение, гипотензию и гипертензию. Неврологическая токсичность включает спутанность сознания, тремор, онемение,парестезию, неспособность к концентрации внимания, сонливость, галлюцинации, энцефалопатию, судороги, кому, психомоторную задержку, ослабление памяти, сухость во рту, потение, личностное расстройство, возбуждение, нейропатию, депрессию, беспокойство, афазию, инфаркт почки с ухудшением зрения, боль в глазах, гемианопсию, изменение вкусовых ощущений, головную боль, обмороки, бессонницу. Дермальная токсичность включает кожную сыпь, крапивницу, эпидермальный некроз, макулопа- 16014157 пулярную сыпь. Метаболическая токсичность проявляется в виде гипергликемии. Кроме того, оценивают показатели коагуляции крови для выявления повышения показателей теста РТ/РТТ. Кроме того, потенциальным токсическим ответом на интерферон может быть фарингит, алопеция, усталость, общее недомогание, анорексия, снижение веса, лихорадка, озноб, миалгия, артралгия, цианоз. Терапевтические показатели Рассеянный склероз (PC) Разрешены две формы IFN, IFN и IFN 1b, для лечения рецидивирующе-ремитирующего PC. IFN также используется для лечении генитальных бородавок. Усовершенствованные полипептиды IFN2 согласно настоящему изобретению используются при указанных выше заболеваниях, расстройствах и состояниях, а также могут использоваться для лечения других форм PC, включая вторичный прогрессирующий PC, первичный прогрессирующий PC и прогрессирующий рецидивирующий PC. Термин "используют" в данном контексте означает, что усовершенствованный полипептид IFN2 используется для лечения заболевания, например, либо для профилактики заболевания, либо для предупреждения прогрессирования заболевания в более тяжелое состояние, либо для облегчения или снижения симптома или последствия заболевания, такого как PC. Рак Несмотря на различные достижения в области лечения рака, а также несмотря на хорошо известные данные о тех изменениях образа жизни, которые могут серьезно снизить риск развития рака, и на возможность выявления ранних угрожающих признаков развития рака, у многих пациентов развитие рака достигает такой степени, при которой отсутствуют доступные традиционные методы, позволяющие надеяться на излечивание или на существенное ослабление заболевание. IFN2 известен как препарат, обладающий противораковым эффектом. Индивидуум, страдающий от развитого рака, может демонстрировать один или несколько следующих признаков или симптомов: наличие раковой опухоли, слабость, боль, сниженный тонус, определяемый наличием опухоли, а также известные симптомы, которые ассоциированы с конкретными видами рака. Для осуществления настоящего изобретения пациенту с одним или несколькими указанными признаками или симптомами рака вводят мутантные формы IFN2 в количестве, достаточном для устранения или, по меньшей мере, ослабления одного или нескольких указанных признаков или симптомов. Инфекции вирусом гепатита (HCV) Применяемые в настоящее время терапевтические стратегии, направленные на лечение HCV инфекции, имеют ряд недостатков. Режимы дозирования, включающие инъекционное введение дозы IFN2 ежедневно (QD), через день (QOD) или три раза в неделю (TIW) в течение длительного периода времени,характеризуются наличием одного или нескольких приведенных ниже недостатков: (1) режимы дозирования является некомфортными для пациента и в ряде случаев приводят к снижению степени согласия пациента с проводимым лечением; (2) режимы дозирования часто ассоциированы с побочными эффектами и вызывают дополнительный дискомфорт для пациента, что в ряде случаев приводит к снижению степени согласия пациента с предписанным лечением; (3) режимы дозирования приводят к достижению пиков (Cmax) и "впадин" (Cmin) сывороточных концентраций IFN2 и в ходе указанных периодов "впадин" вирус может реплицироваться и/или инфицировать дополнительные клетки и/или мутировать; (4) во многих случаях логарифм снижения титра вируса в ходе раннего вирусного ответа недостаточен для достижения длительного вирусного ответа, который в итоге приводит к клиренсу вируса. Настоящее изобретение могло бы внести существенный вклад в улучшение терапевтического потенциала при лечении инфекции вирусом гепатита. Инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД) Этиология ИЗСД является предметом больших дебатов. Очевидно, что это многофакторное заболевание, включающее генетическую предрасположенность и воздействие факторов окружающей среды. Были идентифицированы тесные взаимосвязи между ИЗСД и специфическими HLA, кодируемыми комплексом главной системы гистосовместимости на участке,который расположен на коротком плече хромосомы 6. Основные аллели, определяющие высокий риск,включают DR3 и DR4. Считается, что вирусы, как факторы внешней среды, могут вносить серьезный вклад в этот процесс, и ряд результатов подтверждают данную точку зрения. Некоторые диабетогенные или связанные вирусы (вирусы эпидемического паротита, кори, краснухи, энцефаломиокардита М, коксакивирус В и реовирусы) по результатам эпидемиологических исследований ассоциированы с развитием ИЗСД и могут вызвать диабет при инокуляции грызунам. Диабетогенные вирусы могут непосредственно инфицировать В-клетки в культуре. Кроме того, коксакивирус В был выделен из поджелудочной железы новорожденного ребенка с ИЗСД, который умер от тяжелого кетоацидоза, кроме того, указанный вирус приводил к развитию диабета у экспериментальных животных вместе с вирусными антигенами в В-клетках у инфицированных животных. В-клетки пациентов с ИЗСД секретируют -интерферон, так что антагонистические полипептиды IFN2 согласно настоящему изобретению могут оказывать значимый эффект с точки зрения повышения терапевтического потенциала при ИЗСД.KB представляет собой аутоиммунное заболевание, которые вызывает воспаление и повреждение различных тканей и частей организма, включая суставы, почки, сердце, легкие, мозг, кровеносные сосуды и кожу. Наиболее частыми симптомами KB являются болезненные или набухшие суставы (артрит),лихорадка, длительная или сильная усталость, сыпь на коже, почечные проблемы. Хотя истинная причина KB все еще неизвестна, существует мнение, что KB запускается сочетанием генетических факторов,факторов окружающей среды и, возможно, гормональных факторов. KB характеризуется наличием периодов заболевания или вспышек и периодов нормального самочувствия или ремиссии. Соответственно целью эффективного лечения KB является предупреждение вспышек, минимизация поражения органов и соответствующих осложнений и поддержание нормальных функций организма. Обычно предписываемые при KB препараты включают нестероидные противовоспалительные средства(НСПВС), ацетаминофен, кортикостероиды, противомалярийные и иммуномодулирующие средства. В связи с тем, что лечение доступными в настоящее время препаратами приводит к положительному результату в ограниченном диапазоне случаев и сопряжено с возможностью серьезных побочных эффектов от них, крайне важно иметь в качестве альтернативы эффективную терапию КВ. Композиция согласно настоящему изобретению может быть эффективна для минимизации и/или устранения различных симптомов у пациентов с КВ. Настоящее изобретение, представленное в целом выше, будет далее более подробно описано посредством приведенных примеров, которые даны с целью иллюстрации и никоим образом не должны трактоваться в плане ограничения настоящего изобретения. Примеры Методы(i) Сайт-направленный мутагенез. Сайт-направленный мутагенез проводят путем амплификации по методу ПЦР плазмиды экспрессии рТ 72 С 2 с использованием праймеров из 18-21 нуклеотидов, содержащих мутированный кодон, а также высокоточных полимераз pwo (Boehrmger Mannheim) и pfu (Stratagene) по описанной ранее методике(Piehler, J.Schreiber, G. 1999, J. Mol. Biol. 294, 223-237). После фосфорилирования и лигирования мутированные плазмиды подвергают трансформации в клетки Е.coli TGI. Последовательность полностью экспрессированного гена, содержащего мутацию, анализируют путем секвенирования ДНК.IFN2 и IFNAR2-EC подвергают экспрессии в клетках Е.coli с последующей очисткой путем ионообменной хроматографии и хроматографии с разделением по размеру по описанной ранее методике(Piehler, J.Schreiber, G. 1999, J. Mol. Biol. 289, 57-67). Концентрации белков определяют на основе данных по их поглощению при длине волны 280 нм с использования уравнения 280=18070 см-1 М-1 для IFN2 и уравнения 280=26500 см-1 М-1 для IFNAR2-EC.IFNAR1-EC подвергают экспрессии в клетках насекомых Sf9 и далее очищают по описанной ранее методике (Arduini, R.М. et al., 1999, Protein Science 8, 1867-1977). Чистоту белка анализируют при проведении электрофореза в ДСН-ПААГ в невосстановительных условиях. Концентрацию активного белка IFN2 определяют для всех мутантов при проведении аналитической гель-фильтрации с использованием IFNAR2-EC по описанной ранее процедуре (Piehler, J.Schreiber, G. 1999, J. Mol. Biol. 289, 57-67). Для проведения исследований по связыванию с лигандом осуществляют сайт-специфическое мечение IFN2 и IFN с использованием процедур малеимидной химии. IFN метят непосредственно по его свободному цистеиновому остатку С 17 в ходе инкубации с двукратным молярным избытком Орегона зеленого 488 (Oregon Green 488) (OG488) малеимида (MolecularProbes) в течение 2 ч в HBS. IFN2 метят с использованием OG4 88 после включения в него дополнительного цистеинового остатка (мутация S136C), которое, как было показано, не влияет на взаимодействие IFNAR1-EC или IFNAR2-EC (Gavutis et al., 2005, Biophysical Journal 88(6): 4289-4302).(iii) Рост и повторное структурирование мутантного IFN2-YNS. Клетки Е.coli растят в колбе на 750 мл. Бактериальную культуру центрифугируют, ресуспендируют в 30 мл лизирующего буфера и подвергают ультразвуку в бактериологической камере в течение 30 с 5 раз. После центрифугирования со скоростью 16000 об/мин в течение 30 мин осадок (тела включения) ресуспендируют примерно в 30 мл тритонового промывного раствора (0,5% тритон, 50 мМ Трис 8 и 100 мМ NaCl). Тела включения центрифугируют при 25000 g (14500 об/мин в роторе ss34 sorval) и промывают 4-5 раз. Окончательную промывку проводят с целью избавления от тритона, используя для этого 50 мМ Трис (8,4) с содержанием 100 мМ NaCl. Очищенные тела включения растворяют в 5 мл 6 М гуанидина и выдерживают в течение примерно 12 ч при температуре 4 С при слабом перемешивании. После центрифугирования при 25000 g в течение 20 мин супернатант выстаивают и отделяют осадок. Для повторного реструктурирования супернатант разбавляют в соотношении 1:20 с использованием 0,8 М аргинина, pH 9,3, медленно перемешивают с использованием вихревого смесителя и встряхивают при температуре 20 С в течение 2 ч. После центрифугирования со скоростью 16000 об/мин в течение 20 мин и диализа против Трис 7,4, белок очищают ионообменной хроматографией с получением примерно 5 мг/мл чистого белка.(iv) Определение аффинности связывания. Взаимодействие между рекомбинантным IFNAR1-EC и IFN2 отслеживают с использованием данных спектроскопии отражательной интерференции (RIfS) в условиях свободного протекания (Schmitt,H.M., et al., 1997, Biosens.Bioelectron. 12, 809-816). Данная методика позволяет выявить наличие биомолекулярного взаимодействия на интерфейсах в виде изменения кажущейся оптического толщины тонкого слоя силикагеля. Связывание с поверхностью отслеживают в виде сдвига спектра интерференции. Сдвиг в 1 пм соответствует наличию примерно 1 пг/мм 2 белка на поверхности. Вторая методика, используемая в масштабе реального времени для оценки уровня связывания, включает SPR (поверхностный плазмон-резонанс), в процедуре которого используется ProteON (Biorad). Все измерения проводят с использованием HBS (20 мМ HEPES, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,01% Тритон Х 100) в качестве элюирующего буфера. Связывание субъединицы рецептора IFNAR1 с поверхностью чипа проводят с использованием двух методов. В соответствии с одним методом нейтрализующие мАв против IFNAR1-EC DB2 связывают с поверхностью (декстран AMD 500, содержащий аминогруппировку) через его открытые аминогруппы с использованием процедур аминного связывания. Происходит аффинный захват IFNAR1-EC на поверхности, который далее сшивается вторым мАв АА 3. В соответствии со вторым методом Hisмеченый фрагмент IFNAR1 непосредственно присоединяют к NTA на поверхности чипа. Подробное описание методики, используемой для оценки взаимодействия интерферона-IFNAR2-ЕС, приведено в работе Пилера и Шрайбера (Piehler, J. and Schreiber, G. 2001, Anal. Biochem. 289, 173-186). В случае слабого связывания определение константы диссоциации KD проводят с использованием графика зависимости равновесного ответа от концентрации белка с использованием принципов закона действия массы. В случае более жестких связывающих взаимодействий определяют кинетические константы и вычисляют показатель аффинности из соотношения Koff/Kon=KD, а также непосредственно на основании значения равновесного ответа.(v) Тест на активность в направлении антивирусной защиты. Антивирусную активность IFN2 дикого типа и мутантного IFN2 оценивают по ингибированию цитопатического эффекта вируса везикулярного стоматита (VSV) в культуре клеток человека WISHIFN2 определяют как концентрацию, необходимую для 50% защиты клеток, относительно концентрации IFN дикого типа, необходимой также для 50% защиты.(vi) Тест на антипролиферативную активность. Антипролиферативную активность IFN2 на клетках лимфомы Буркитта Daudi оценивают по описанной ранее процедуре (Piehler, J. et al., 2000, J. Biol. Chem., 275, 40425-40433). Клетки обрабатывают в течение 60 ч при добавлении IFN. Число живых клеток определяют с использованием набора для окрашивания клеток (Biological Industries Co, Israel) на основании калориметрического выявления расщепления тетразолиевой соли ХТТ до формазана. Антипролиферативный тест на WISH клетках проводят при добавлении интерферона в разных разбавлениях к ростовой среде и через 72 ч отслеживают плотность клеток при окрашивании кристаллическим фиолетовым.RIfS, которая составляет 20%, а относительная аффинность (wt/mut) составляет 30%. В случае IFN2IFNAR1 ошибказначения KD составляет 35%, а относительная аффинность (wt/mut) составляет 50%. С использованием 2 (95% доверительный интервал) в качестве основного доверительно интервала можно предположить, что минимум двукратных изменений может выглядеть как значимый. Значение ошибкидля индивидуальных измерений биологической активности (независимо антивирусной или антипролиферативной) составляет 35%. В этой связи, 2 доверительный интервал между двумя измерениями позволяет сделать вывод о том, что различия меньше, чем в два раза, находятся в пределах экспериментальной ошибки.(viii) Эксперименты на микрочипах с нанесенными олигонуклеотидами. Стеклянные микрочипы, покрытые поли-L-лизином и содержащие почти 19000 разных зондов (набор человеческих олигонуклеотидов от компании Compugen), приобретают от компании CAG (Center forApplied Genomics, New Jersey). Микрочипы зондируют смесью, содержащей цианин (Су) 3 или Су 5 меченую кДНК, в формате обработки IFN, в сравнении с вариантом без обработки (контроль). КлеткиWISH подвергают воздействию разных IFN в течение 16 ч и экстрагируют их РНК (набор RNeasy Midi,Qiagen) и 100 мкг полученной РНК подвергают обратной транскрипции (Н-клеточный мутант ОТ фермента M-MLV, Promega) со смесью аминоаллил-модифицированных dUPT нуклеотидов (Ambion) в нуклеотидной композиции в соотношении 4:1, aa-dUPT-dTTP. Полученные кДНК метят NHSактивированным Су 3 или Су 5 флуоресцентным зондом (Amersham), который связывается с аа-dUTP. Оценивают наличие включения (спектрофотометр NaNo.Drop) и меченые кДНК смешивают (опытный вариант окрашивают один цветом, а контроль окрашивают другим цветом) в эквивалентных количествах с флуоресцентными красителями (по 100 пмоль каждого) в 100 мкл целевого объема смеси: 2 Х SSC,0,08% ДСН и 6 мкл блокирующего раствора (Amersham), денатурируют при температуре 95 С в течение- 19014157 3 мин, охлаждают и вносят в пространство между чипом и покровным стеклом (LifterSlip, Erie ScientificCompany). Гибридизацию проводят при температуре 55 С в течение 12 ч в темноте. По прошествии указанного срока стекло промывают пять раз в среде, включающей 2 Х SSC, 0,5% ДСН при температуре 55 С, выдерживают 5 мин в 0,5 Х SSC при комнатной температуре и в итоге - 5 мин в 0,05 Х SSC при комнатной температуре. Затем все сушат центрифугированием в течение 3 мин со скоростью 1000 об/мин и хранят в темноте до сканирования.(ix) Визуализация микрочипов и анализ данных. Сканирование полученных после гибридизации микрочипов проводят с использованием сканера для ДНК-микрочипов (Agilent). Автоматизированное выявление пятен и определение интенсивности при вычитании фоновых значений проводят с использованием программного обеспечения SpotReader (Niles Scientific). Нормализацию полученных данных, их фильтрование и кластерный анализ проводят с использованием программного обеспечения GeneSpring (SiliconGenetics). Данный анализ основан на определении соотношения опытных и контрольных показателей для каждого пятна и включает такие манипуляции, как фильтрация данных по выходным символам SpotReader, в качестве показателя качества сигнала относительно фона(шум). Каждая опытная обработка (в соответствующих условиях) оценивается по двум окрашенным разными красителями микрочиповым репликам. Исходный набор модулированных интерфероном генов интегрируют по генам, расположенным выше порогового показателя 1,7 по меньшей мере в двух условиях, при этом рассматривается как толерантный лишь один "отсутствующий" ("А") знак, который является показателем шумового "пятна" во всех условиях в расчете на один ген. Данный критерий был выбран с учетом того, что фактическую позитивную или отрицательную регуляцию можно увидеть в том случае,когда проводится более чем одна обработка IFN, так что при выборе двух условий, в качестве минимального критерия, низкая жесткость порога будет требовать включение ISG, модифицированных на относительно низких уровнях. Информация по набору указанных генов была перенесена в систему Excel, и она содержала данные по среднему значению соотношения результатов опытных вариантов обработки к контрольному варианту, значения, относящиеся к репликам, р-значения, полученные в t-тесте, которые представляют собой оценку технической ошибки теста на микрочипах, основанную на определении расстояния между репликами и символьными кодами. Гены подвергают скринингу для оценки значимости путем визуального сравнения расстояния между каждой парой реплик и соответствующими условиями, уделяя внимание показателю р-значения и наличию "А" символа. Указанный анализ является утомительным, но необходимым, поскольку статистический отбор позволяет четко разделить позитивную и отрицательную регуляцию, в связи с относительно большим шумовым фоном при использовании малого числа реплик, в расчете на каждое из исследуемых условий. Показатель среднего значения за пределами порога 1,7, при наличии одной из реплик ниже данного порога или при наличии большого расстояния между репликами относительно среднего значения и при отсутствии других условий со сходными и значимыми уровнями,не рассматривается как bona-fide модуляция, но лишь как технический шум, и такой ген исключается из перечня. Окончательный перечень составил из 395 генов, которые подвергаются позитивной или отрицательной регуляции интерфероном при 16-часовой обработке. На указанном наборе генов был проведен кластерный анализ в формате программы GeneSpring. Пример 1. Характеристика взаимодействия IFN2-IFNAR1-EC с использованием оптической биосенсорной системы. Взаимодействие IFNAR1-EC и IFN2 исследуют путем выявления не содержащей метки твердой фазы с использованием для выявления методики RIfS. В рамках данной методики проводят иммобилизацию на поверхности чипа одного из взаимодействующих соединений. Эта методика ранее с успехом использовалась для исследования взаимодействия IFNAR2-EC, где соответствующий рецептор иммобилизовали с использованием мАт, которые сами были иммобилизованы на поверхности через аминное связывание (Piehler, J. and Schreiber, G. 2001, J. Anal. Biochem. 289, 173-186). Проводят связывание не нейтрализующего IFNAR1-EC мАв DB2 с аминным фрагментом поверхностно локализованного декстранаAMD 500 через открытые аминогруппы. IFNAR1-EC подвергают аффинному захвату на поверхности соответствующим мАв с последующей сшивкой его со вторым мАв АА 3. Указанный процесс проводят по методике RIfS в масштабе реального времени, как показано на фиг. 1 А. Связывающая активность IFNAR1-EC с поверхностным RIfS определяют путем инъекции белка IFN2 в концентрациях, варьирующихся от 0,12 до 4 мкМ. Из-за низкой аффинности связывания IFN2 с IFNAR1-EC, не удалось определить кинетические характеристики ассоциации и диссоциации. Исходя из этого, аффинность связывания определяют по графику зависимости ответа в стационарном состоянии от концентрации белка в соответствии с законом действия масс. Для IFN2 дикого типа этот результат представляет собой константу аффинности, равную 1,5 мкМ (Lamken, P. et al., 2004, J. Mol. Biol. 341, 303-318). Пример 2. Картирование сайта связывания IFN2 с IFNAR1. Для локализации сайта связывания IFNAR1 на IFN2 проводят Ala сканирование большинства остатков, расположенных на В и С спиральных структурах (фиг. 2 и 3). Получают в целом 21 единичную- 20014157 точечную мутацию и определяют аффинность связывания с IFNAR2 и IFNAR1 в формате RIfS или ProteON. Поскольку мутации локализованы на противоположной поверхности относительно сайта связывания IFNAR2 с IFN2, аффинности связывания различных мутантных белков в отношении IFNAR2 очень близки к соответствующей аффинности связывания IFN2 дикого типа (табл. 1). Этого достаточно для подтверждения правильной укладки всех мутантных белков и их активных концентраций. В то время как связывание IFN2 с IFNAR2-EC дает четкий кинетический сигнал, связывание с IFNAR1-EC намного слабее, и это связывание может быть проанализировано в единицах отражательного сигнала (RU), характеризующего аффинность в стационарном состоянии, путем варьирования концентрации лиганда. В этом случае, знание корректных и точных концентраций всех белков IFN2 является необходимым. Таким образом, все концентрации мутантного белка подтверждаются при проведении аналитической гельфильтрации на колонке по их способности связываться с IFNAR2-EC. Результаты всех определений связывающих способностей объединены и показаны в табл. 1 и 3, а также на фиг. 3 А. Три единичных мутации вызывают повышение связывания с (Н 57 А, Е 58 А, Q61A), тогда как 6 мутаций вызывают снижение связывания (F64A, N65A, Т 69 А, L80A, Y85A, Y89A). Однако при этом не были идентифицированы зоны,соответствующие связыванию, так что можно констатировать, что ни одна из мутаций не ведет к изменению аффинности более чем в 5 раз. Для подтверждения эффектов единичных мутаций был получен тройной мутант, содержащий единичные мутации L80A, Y85A, Y89A (далее обозначенный как LYY) и четверной мутант, содержащий мутации N65A, L80A, Y85A, Y789A (SEQ ID NO:6) (обозначенный в настоящем описании как NLYY). Показатели связывания указанных двух мутантных белков были ниже порогового значения для данного метода определения. Таблица 1 Термодинамические и кинетические константы, описывающие взаимодействие мутантного IFN2 (В и С спиральные структуры и C-D петля) с IFNAR2-EC и IFNAR1-ECG0 вычисляют из уравнения G0=RTlnKD; bG0=G0mut-G0wt; CKD определяют по уравнению равновесного связывания на поверхности; d - данные взяты из работы Lamken et al., 2004, J. Mol. Biol. 341, 303-318. Пример 3. Антипролиферативная и антивирусная активность IFN2 мутантов. Антивирусную активность оценивают по ингибированию цитопатического эффекта вируса везику- 21014157 лярного стоматита (VSV) на человеческих клетках WISH (линия эпителиальных клеток человека из амниотической жидкости). Антипролиферативную активность определяют на клетках WISH и на клеткахDaudi как 50% ингибирование роста клеток (см. раздел "Методы"). На фиг. 4 А показаны результаты тестирования серийных разведений IFN2 и IFN в течение 72 ч по интенсивности окрашивания клетокWISH, на основе которых может быть вычислена концентрация интерферона, усиливающая антипролиферативный ответ. Ячейки сканируют в рамках денситометрического анализа и строят график зависимости полученных результатов от соответствующей концентрации белка (фиг. 4 В). Ту же самую процедуру используют для определения антивирусной эффективности интерферона в клетках WISH (фиг. 4 С). Вычисляют точку 50% активности, а также скорость изменения активности (по наклону кривой) с использованием кривой зависимости ответа от дозы IFN где у означает пропускающую способность, которая связана с числом клеток, А 0 означает смещение, А означает амплитуду, с означает концентрацию, С 50 означает концентрацию, соответствующую 50% активности, и s означает угол наклона кривой. Средние значения концентраций IFN2 и IFN, приводящие к 50% антивирусной защите, составляют 0,85 и 0,43 пМ соответственно (среднее значение для 6 экспериментов). Средние значения концентраций IFN2 и IFN, соответствующие 50% антипролиферативной активности, составляют 1360 и 29 пМ (среднее значение 17 и 7 экспериментов соответственно). Интересно отметить, что концентрация IFN2, соответствующая 50% антипролиферативной активности в клетках Daudi, составляет всего 0,5 пМ (табл. 2), что более чем в 1000 раз ниже, чем соответствующее значение, определенное для клеток WISH, и это указывает на важность использования одной и той же клеточной линии во всех экспериментах. Антивирусную и антипролиферативную активность всех мутантных белков интерферона определяют относительно таковых для IFN2 дикого типа (wt/mut) и результаты исследования приведены в суммированном виде в табл. 2 и 4. Согласно данным по связывающей аффинности, полученным для IFNAR1-EC, антивирусная и антипролиферативная активности резко не меняются при мутации. Единственным мутантом, вызывающим существенное повышение антивирусной активности (2 раза), является Е 58 А. L80A, Y85A и Y89A вызывают существенное снижение антивирусной активности (но ни один из них не вызывает снижение свыше 6 раз). Однако объединенные LYY и NLYY мутанты снижают антивирусную эффективность в 30 и в 100 раз соответственно. В целом указанное снижение можно рассматривать как аддитивные эффекты единичных мутаций (для LYY 0,50,260,20=0,029, что аналогично результату, полученному для тройного мутанта). Влияние на антипролиферативную активность того же набора мутантов более выражено, при этом и Е 58 А, и Q61A вызывают существенное повышение активности, тогда как N65A, Т 69 А, L80A, Y85A и Y89A вызывают выраженное снижение активности. Кроме того, величина снижения активности, при ее оценке в рамках антипролиферативного теста с использованием WISH клеток, значительно выше, чем данная величина, определенная применительно к антивирусной защите. Тройные мутанты LYY и NLYY снижают активность в 190 и 1100 раз соответственно. В данном случае, единичные мутации перевешивают эффект, определенный для тройных мутантов, примерно в 30 раз (для LYY 0,140,0350,044=0,00022 в сравнении с экспериментально полученной величиной 0,0057; и для NLYY 0,160,140,0350,044=0,000035 в сравнении с экспериментально полученной величиной 0,00092). Результаты оценки антивирусной и антипролиферативной защиты для всех мутантов были проанализированы и приведены в виде графика на фиг. 5 А. Авторы также добавили с целью сравнения соответствующие значения IFN. При анализе данного графика можно сделать вывод, что антипролиферативный ответ является значительно более чувствительным к специфическому мутантуIFN2, чем антивирусный ответ. Кроме того, указанная тенденция также применима к данным по IFN,для которого антивирусная активность примерно в 2 раза выше, чем в случае IFN2 (аналогично вирусной активности мутанта Е 58 А), тогда как его антипролиферативная активность выше примерно в 50 раз. Сравнение биологической активности с показателем связывающей активности для IFNAR1 указывает на то, что обе активности в основном соизмеримы со связывающей активностью, но не по всему диапазону измерений (фиг. 5 В).- 22014157 Таблица 2 Биологическая активность мутантов IFN2LYY представляет собой тройной мутант L80A, Y85A, Y89A. NLYY (SEQ ID NO: 6) представляет собой четверной мутант, включающий LYY и N65A. Значение точки 50% активности получают при введении полученных данных в уравнение 1; а- угол наклона, полученный из уравнения 1. Пример 4. Стабильность тройного комплекса повышается под действием HEQ в сравнении с IFN2. Поскольку было показано, что три мутации в Ala повышают связывание в 2-4 раза, указанные три мутации IFN2 (H57A, ЕТ 58 А, Q61A) были объединены в одном мутантном белке IFN2, обозначенном в тексте настоящего описания как HEQ (SEQ ID NO: 5). Связывание IFN с внеклеточным доменом рецептора интерферона типа I (IFNAR1-EC) и с тройным комплексом, включающим IFNAR1-EC и IFNAR2-EC, было исследовано по методу общей внутренней отражательной флуоресцентной спектроскопии (TIRES). IFNAR2-EC и IFNAR1-EC были присоединены через их С-концевые гистидиновые метки к липидным бислоям на твердой подложке. Кинетика диссоциации IFN2-wt, HEQ и IFN из IFNAR1-ЕС по результатам оценок методом TIRES показана в сравнительном аспекте на фиг. 1 С. Отмечается 20-кратное повышение срока жизни комплекса в случае использования HEQ в сравнении с IFN2 и аналогичная кинетика диссоциации выявлена для IFN (табл. 3). И,наоборот, получены очень близкие значения констант, ассоциации для всех трех видов. На основании указанных данных, была определена равновесная константа диссоциации KD=83 нМ для комплекса HEQ/IFNAR1-EC, для комплекса YNS /IFNAR1-EC было получено значение KD=33 нМ, для комплекса IFN2wt/IFNAR1-EC было получено значение KD=1,6 мкМ и для комплекса IFN/IFNAR1-EC было получено значение KD=66 нМ. Аффинность по связыванию HEQ с IFNAR2-EC аналогична таковой для IFN2-wt(5 нМ), что примерно в 10 раз слабее, чем соответствующая аффинность для IFN (табл. 3). Таким образом, лишь аффинность HEQ относительно IFNAR1 аналогична аффинности IFN, но не в отношенииIFN индуцирует биологическую активность за счет образования тройного комплекса (IFNAR1-IFNIFNAR2) в стехиометрическом соотношении 1:1:1. Из-за кооперативного связывания с двумя рецепторными субъединицами, соединенными с поверхностью, кажущаяся аффинность связывания лиганда выше, чем связывание с одним IFNAR2, и зависит от относительной и абсолютной концентраций рецептора на поверхности (Lamken, P. et al., 2004, J. Mol. Biol. 314, 303-328). Повышенная стабильность тройного комплекса за счет повышения аффинности в отношении IFNAR1 может быть зондирована по характеру кинетики диссоциации лиганда. В этой связи, диссоциацию IFN2 (SEQ ID NO: 2), HEQ (SEQ ID NO: 5),YNS (SEQ ID NO: 11), 8-фрагмента (SEQ ID NO: 7) и IFN (SEQ ID NO:3) сравнивают с вариантами разных концентраций IFNAR1-EC и IFNAR2-EC в стехиометрическом соотношении. В случае IFN были проведены измерения с использованием I47A мутанта на IFNAR2, который связывает IFN с аффинностью 5 нМ, что аналогично аффинности IFN2 в отношении IFNAR2 (табл. 3). Исходя из этого, сравнению подлежит только эффект поверхностной концентрации IFNAR1 на диссоциацию лиганда. В то время как в случае IFN2 кинетика диссоциации сильно зависит от поверхностной концентрации рецептора,для IFN и HEQ были выявлены кривые, характерные для перекрывающейся диссоциации. Это четко указывает на повышенную стабильность тройного комплекса, образованного на основе IFN и HEQ. Даже при более высокой концентрации рецептора (которая значительно выше, чем клеточная концентрация рецептора, составляющая 1000 рецепторов на клетку), наблюдается более быстрая диссоциация IFN2 дикого типа, чем IFN и HEQ при более низких концентрациях рецептора. Однако если поверхностные концентрации рецептора повышаются и далее, то в итоге IFN2-wt диссоциирует со скоростями, сравнимыми с соответствующими скоростями IFN или HEQ. Стабильность тройного комплекса представляет собой объединенную функцию поверхностных концентраций рецептора и связывающих аффинностей в отношении индивидуальных рецепторов. Полагая, что стабильность тройного комплекса связана с биологической активностью, неудивительно, что различная активация более прочно связывающихся IFN может приводить к их выделению в клетках с большим числом рецепторов либо в ходе природного процесса (как в клетках Daudi), либо в связи с трансфекцией. Это также указывает на опасность трансфекции клеток рецепторами клеточной поверхности на уровнях, отличающихся от нативных, хотя этот факт обычно игнорируется. Таблица 3 Значение констант и аффинностей взаимодействия IFN2 дикого типа,IFN и IFN2 мутантов с IFNAR1-EC и IFNAR2-EC сайт-специфическое мечение Орегоном зеленым - малеимидом по свободному С 17 остатку; взаимодействие IFNAR2-EC I47 А. Пример 5. Антивирусная и антипролиферативная активность IFN2 мутантов: HEQ, MDL, а 8 фрагмента и YNS. Было отмечено, что антивирусная эффективность IFN на клетках WISH лишь в 2 раза превышает соответствующую эффективность IFN2, тогда как его пролиферативная активность примерно в 50 раз выше. На фиг. 4 В, 4 С проиллюстрированы антивирусная и антипролиферативная активности IFN2-wt,HEQ (SEQ ID NO: 5) и IFN по результатам тестирования в клетках WISH. В рамках данного теста проводят сравнение профилей активности HEQ с соответствующим профилем для IFN. Несмотря на значительное повышение связывающей аффинности HEQ в отношении IFNAR1, его антивирусная активность всего в 2 раза превышает антивирусную активность IFN2 дикого типа. Однако его антипролиферативная активность повышается примерно в 25 раз, в сравнении с 42-кратным повышением антипролиферативной активности IFN (табл. 4). Та же тенденция наблюдается для MDL (SEQ ID NO: 10) и YNS (SEQID NO: 11). В то время как их антивирусная активность в целом близка к таковой для IFN2, их антиви- 24014157 русная активность значительно выше. MDL активность находится на том же уровне, что и IFN, тогда как YNS демонстрирует еще более высокий уровень антипролиферативной активности. При этом повышенные уровни антипролиферативной активности согласуются с повышением аффинности двух указанных IFN в отношении IFNAR1. Как отмечалось ранее, IFN, по всей видимости, останавливает рост быстрее, чем IFN2. В результате число клеток после применения высоких концентраций IFN меньше в случае IFN. Данный феномен не может быть компенсирован использованием более высокой концентрации IFN2, поскольку представляет собой качественное различие (фиг. 4 В). В этом аспекте HEQ и YNS ведут себя аналогично IFN2-wt, но отличаются от IFN. Угол наклона кривой титрования HEQ (который соответствует начальной стадии графика концентрационной зависимости) характеризуется показателями в диапазоне между wt-IFN2 и IFN. Таблица 4 Относительные показатели биологической активности IFN2 дикого типа, мутантов и IFN Пример 6. Изучение активации гена с использованием технологии генных чипов. Методика на основе генных чипов в последнее время стала стандартной процедурой, применяемой с целью получения полной информации о дифференциальной активации генов. Фактически, было проведено множество исследований для выявления профиля генной экспрессии в ответ на индукцию IFN (deVeer, M. J. et al., 2001, J. Leukoc Biol, 69, 912-920). Влияние IFN на генную экспрессию исследовали в экспериментах с микрочипами, на которые были нанесены микродозы олигонукпеотидов. Клетки WISH обрабатывают в течение 16 ч с использованием 0,3 нМ IFN2; 3 нМ (10000 единиц) IFN2; 0,3 нМ HEQ и 0,15 нМ IFN (1000 единиц). Указанные концентрации выбирают таким образом, чтобы достичь 90% антипролиферативного ответа (IFN2-wt-3 нМ, HEQ и IFN) или ниже 10% антипролиферативного ответа (IFN2-wt-0, 3 нМ) на клетках WISH. В каждом случае эксперимент по обработке IFN в сравнении с условиями без обработки проводят с использованием дубликатов микрочипов со сменными красителями. Кроме того, в качестве дополнительного контроля используют четыре реплики в эксперименте с микрочипами, состоящие из вариантов без обработки в сравнении с вариантами без обработки. Нормализованный коэффициент соотношения между двумя вариантами по интенсивности окрашивания красителями рассматривается в качестве показателя уровня индукции. Критерии, выбранные для определения набораIFN-регулируемых генов, описаны в разделе "Методы". Результаты оценки экспериментов с генными микрочипами могут быть проанализированы на основе оценки каждого гена или при установлении общей тенденции в процессе генной индукции. На фиг. 6 проиллюстрирован общий обзор тенденций, зафиксированных с точки зрения изменения уровней экспрессии 395 IFN-регулируемых генов через 16 ч после обработки IFN (0,15 нМ), HEQ и IFN2-wt(0,3 и 3 нМ соответственно). На фиг. 6 А приведен график, описывающий зависимость относительных уровней экспрессии (против варианта без обработки) 395 генов в порядке возрастания кратности изменений. Черные пунктиры относятся к контрольному чипу, который содержит смесь только необработанных образцов на каналах, окрашенных обоими красителями. Это дает возможность оценить ожидаемый уровень случайных флуктуаций. Минимальные и максимальные изменения уровней экспрессии, фиксируемые для контрольного чипа, составляют 0,65-1,6 раз, при этом соотношение между двумя каналами составляет лишь 0,75-1,4 раза для верхних 95% генов. Низкий уровень случайных флуктуации генной экспрессии обеспечивает высокий уровень доверительности применительно к качеству получаемых данных. В целом, уровни генной экспрессии аналогичны таковым для IFN (0,15 нМ) и HEQ (0,3 нМ) (фиг. 6 А),что намного ниже уровня индукции, показанного для IFN2-wt (0,3 нМ). Показатель, описывающий ген- 25014157 ную индукцию при добавлении 3 нМ IFN2-wt, находится в диапазоне между уровнями, выявленными для IFN2-wt (0,3 нМ) и IFN (0,15 нМ) или HEQ (0,3 нМ). В качестве альтернативы описанному методу анализа дифференциальных уровней экспрессии был использован метод построения графика, описывающий соотношение коэффициентов изменения генной активации применительно к разным условиям обработки (фиг. 6 В). Поскольку IFN индуцирует наибольшее изменение, все другие показатели вычисляют относительно индукции под действием IFN. Контроль берут тот же, что и в случае, проиллюстрированном на фиг. 6 А. И снова, IFN и HEQ индуцируют, как видно, одинаковые уровни изменений для всех генов (на графике видно, что зеленая линия идет рядом с черной линией, которая относится к контролю). Это означает, что ни один из генов существенно не отличается по своей реакции на индукциюIFN в сравнении с HEQ. Этот удивительный результат показывает, насколько близки между собой оба использованных IFN. Наиболее заметная разница в экспрессии была обнаружена между IFN и IFN2-wt(0,3 нМ). И вновь, результаты, полученные для IFN2-wt (03 нМ), находятся между значениями, зафиксированными для IFN2-wt (0,3 НМ) и HEQ. Был проведен кластерный анализ IFN-индуцированных генов в четырех исследованных вариантах обработки с целью независимого подтверждения результатов, представленных графически на фиг. 6 А и 6 В. На фиг. 6 С показано, что профили генной экспрессии IFN и HEQ объединяются в один кластер с очень небольшим расстоянием между ними. Профиль экспрессии клеток, обработанных 3 нМ IFN2-wt,объединяется в кластер, следующий за ним, тогда как профиль гена экспрессии клеток, обработанных 0,3 нМ IFN2-wt, расположен еще дальше. Профиль генной экспрессии прекрасно согласуется с различной биологической активностью, выявленной для IFN и IFN2, и лишний раз подтверждает, что HEQ представляет собой IFN2 со всеми характерными особенностями IFN. Метод анализа на основе генных чипов позволяет получить подробную информацию об уровнях экспрессии отдельных генов, составляющих геном. Одним из наиболее интересных аспектов анализа профиля генной экспрессии IFN в сравнении с IFN2-wt является исследование дифференциальной активации и связи между дифференциальной активацией и концентрацией IFN (Der, S.D., et al., 1998, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 95, 15623-15628). Из 395 индуцированных генов были выбраны 59 генов, подвергающиеся позитивной регуляции и 9 генов, подвергающихся отрицательной регуляции, на основе характерных уровней активации, различающихся при разных видах обработки (Jaitin et al., 2006, Mol. Cell.Biol. 26(5): 1888-1897, табл. 3). Влияние экспрессии IFN и HEQ (SEQ ID NO: 5) на большинство генов был более сильно выражено, чем влияние, индуцированное IFN2, в эквивалентных антивирусных концентрациях, т.е. 0,15 и 0,3 нМ соответственно, включая множество генов, на которые не оказывал воздействие IFN2 в концентрации 0,3 нМ. Пример 7. Модель профилактики опухоли MDA231. Для установления подкожных (п/к) опухолей клетки MDA231 растят in vitro до 70% слияния, обрабатывают трипсином и суспендируют в ФБР в концентрации 108 клеток/мл и 107 клеток инъецируют п/к в боковую часть мышей nude. Затем мышей распределяют случайным образом по группам, включающим три разных вида обработки, по 6 животных в каждой группе. Режим лечения начинают в день 1 и продолжают до 34 дня. Мышам инъецируют п/к либо ФБР, либо проводят специфическое лечение два раза в неделю в течение 34 дней. После 34 дней эксперимента животных умерщвляют, удаляют опухоли и определяют размер опухоли. Полученные результаты представлены в суммарном виде в табл. 5. Приведенные результаты четко показывают, что, как и в эксперименте с культурой ткани, YNS характеризуется высокой эффективностью по супрессии роста клеток рака молочной железы MDA231 in vivo. После 34 дней использования YNS все мыши, которым вводили YNS, не содержали вздутий, тогда как пять из шести мышей, получавших IFN2, и все шесть мышей, которым вводили ФБР, имели вздутия различного размера.- 26014157 Таблица 5 Результаты оценки модели профилактики роста опухоли клеток MDA231 Мышам инъецируют MDA213 клетки в нулевой день эксперимента и затем проводят инъекции разных агентов по 20 мкг/мышь, в зависимости от вариантов эксперимента, в указанное время. Для оценки каждого варианта эксперимента используют по шесть мышей. Рост опухоли оценивают визуально для всех животных до 34 дня. В последний день (34 день) мышей умерщвляют, опухоль вырезают и измеряют ее размер. Символы L, M, S и N относятся к размеру опухоли (указывается диаметр опухоли в день 34), L - крупная опухоль (5 мм), М - опухоль среднего размера (2,5 мм), S - малая опухоль (2,5 мм), N опухоль отсутствует. Пример 8. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ). Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), также известный как экспериментальный аллергический энцефаломиелит, представляет собой модель рассеянного склероза (PC), полученную в эксперименте на животных. В данной области известны различные модели ЭАЭ, определяемые способом индукции ЭАЭ, а также видом взятого животного и антигеном, используемым для индукции заболевания. ЭАЭ представляет собой острое или хроническое приобретенное воспалительное и демиелинизирующее аутоиммунное заболевание. Различные формы ЭАЭ отражают очень близкие, но различающиеся формы и стадии PC. В рамках настоящего исследования ЭАЭ индуцируют путем инъекции миелинового основного протеина (МВР), в соответствии с известной процедурой, используемой для моделирований острой фазы PC. В рамках данной модели начало заболевания выявляется по появлению клинических симптомов, примерно через 10 дней после индукции. Заболевание прогрессирует при параллельном росте клинических показателей, достигая пика примерно на 15 день и далее, примерно на 23 день после индукции заболевания, наблюдается спонтанное восстановление. Самкам крыс Lewis (средний вес тела 130-180 г, Harlan, Israel) инъецируют п/к в задние лапы по 25 мкг очищенного миелинового основного протеина морских свинок (МВР, Sigma) эмульгированного в 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда (Difco). Животных поддерживают в условиях свето-темнового дня,включающего 12 часов света/12 часов темноты, при постоянной температуре 22 С, при свободном доступе к пище и воде. Начиная с 8 дня после индукции состояние животных отслеживают ежедневно. Результаты мониторинга регистрируют в виде показателей клинического состояния: балльный показатель 0 указывает на нормальное состояние животного без клинических признаков, балльный показатель 0,5 указывает на снижение тонуса дистальной части хвоста, балльный показатель 1 означает полный паралич хвоста, балльный показатель 1,5 указывает на слабость одной задней ноги, балльный показатель 2 указывает на слабость обеих задних ног, балльный показатель 2,5 указывает на слабость одной передней лапы,балльный показатель 3 указывает на паралич всех четырех лап, балльный показатель 4 указывает на полный паралич тела и предсмертное состояние и показатель 5 означает смерть животного. Показатели клинического состояние животных регистрируются в течение примерно 15 дней после начала заболевания до окончания эксперимента на 25 день после индукции и определяют площадь под кривой (AUC) в течение всего времени эксперимента. Животным, демонстрирующим симптомы заболевания, которые не могут быть клинически дифференцированы по указанным балльным показателям от 0,5 до 1, вводят композиции HEQ (SEQ ID NO: 5),YNS (SEQ ID NO: 11) или контрольный носитель в течение трех последовательных дней, начиная с первых признаков заболевания (примерно в период 9-11 дня после индукции заболевания). Оценивают несколько способов введения, например внутривенное введение (в носителе) или пероральное введение- 27014157 через зонд (в составе носителя) в объемной дозе 5 мл/кг. В последний день исследования (примерно 25 день) животных подвергают эвтаназии пентобарбитоном натрия в дозе 100 мг/кг, в/б. Полученные результаты выражают в виде среднего значения СКО и различия между разными группами обработки анализируют по методу анализа вариантов (ANO.VA) с последующим анализом в тесте Tukey's post hoc. Значение р 0,05 рассматривается как статистически значимое и оно показано на фигуре стрелкой для соответствующей группы обработки. Приемлемость данной модели анализа устанавливают с использованием метилпреднизолона в качестве положительного контроля. В том случае, когда стероид вводят в/в ежедневно в течение 5 последовательных дней в дозе 30 мг/кг, начиная с дня индукции заболевании путем инъекции МВР, отмечается 34% снижение AUC. Пример 9. Модель животного с системной красной волчанкой (СКВ). У самок (NZB X NZW)F1 гибридных мышей (далее называемых как "NZB/W мыши") наблюдается спонтанное развитие заболевания, похожего на волчанку, которое характеризуется наличием сывороточных аутоантител к двуцепочечной ДНК (дцДНК). Таких мышей, у которых постепенно развиваются общая почечная недостаточность, часто используют в качестве модели в экспериментах, направленных на исследование и лечение волчанки у людей. Со временем указанное состояние у мышей NZB/W прогрессирует до развития нарушения функции почек, что сопровождается появлением протеинурии. Самки 32-недельных мышей NZB/W были использованы в эксперименте с целью выявления, может ли NLYY (SEQ ID NO: 6) задержать развитие волчаночного заболевания. Мыши были разделены на две группы и животным в каждой группе проводили внутрибрюшинную инъекцию через день либо NLYY (в группе из 10 мышей), либо крысиного IgG (в группе из 10 мышей) в качестве контроля. Соответствующие обработки проводили в течение пяти недель и еженедельно мышей исследовали на наличие протеинурии. Приведенное выше описание конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения полностью очерчивает его общую направленность, тогда как другие специалисты могут при использовании доступной в данной области информации легко модифицировать и/или адаптировать его для различных применений, в определенных направлениях, без длительных и трудоемких экспериментов, на основе принципов и основных идей изобретения, и, в этой связи, такие адаптации и модификации должны рассматриваться как входящие в область и диапазон эквивалентов, раскрываемых в описании. Несмотря на то что настоящее изобретение было описано применительно к конкретным вариантам его осуществления, вполне очевидно, что многие его альтернативы, модификации и вариации будут очевидны для специалистов в данной области. Соответственно, настоящее изобретение охватывает все такие альтернативы, модификации и вариации, как соответствующие принципам и широкой области изобретения и входящие в объем прилагаемой формулы изобретения. Следует понимать, что детальное описание и конкретные примеры, сопровождающие предпочтительные варианты осуществления изобретения, даны лишь для иллюстрации, и различные изменения и модификации входят в область и соответствуют принципам настоящего изобретения, что станет очевидным специалистам в данной области на основе приведенного подробного описания. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Рекомбинантный полипептид интерферона 2 (IFN2), его активный фрагмент, аналог, производное и вариант, где указанный полипептид включает мутацию глутамина в положении 61 в остаток,выбранный из группы, состоящей из серина, лейцина и аланина, и по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутации гистидина в положении 57 в остаток, выбранный из группы,состоящей из аланина, тирозина и метионина, и мутации глутамата в положении 58 в остаток, выбранный из группы, состоящей из аспарагина, аспартата и аланина, где указанный полипептид обладает повышенной специфической агонистической или антагонистической активностью в сравнении с IFN2 дикого типа (SEQ ID NO: 2). 2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид включает мутации во всех трех положениях 61, 57 и 58. 3. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из Н 57 А, Е 58 А, Q61A, H57Y, E58N, Q61S, Н 57 М,E58D, Q61L. 4. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид включает тройной мутант,выбранный из группы, состоящей из Н 57 А, Е 58 А, Q61A (SEQ ID NO: 5); Н 57 М, E58D, Q61L (SEQ IDNO: 10); H57Y, E58N, Q61S (SEQ ID NO: 11). 5. Рекомбинантный полипептид интерферона 2 (IFN2), его активный фрагмент, аналог, производное и вариант, где указанный полипептид включает четверной мутант N65A, L80A, Y85A, Y89A(SEQ ID NO: 6), обладающий антагонистической активностью в сравнении с IFN2 дикого типа (SEQ IDNO: 2). 6. Полипептид по п.1 или 5, отличающийся тем, что указанный полипептид дополнительно включа- 28014157 ет по меньшей мере одно аминокислотное замещение в С-концевых аминокислотных остатках 159-165. 7. Полипептид по п.6, включающий замещение С-концевой последовательности ESLRSKE наKRLKSKE (SEQ ID NO: 7). 8. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид включает сочетание тройного мутанта Н 57 А, Е 58 А, Q61A и замещение С-концевой последовательности ESLRSKE на KRLKSKE (SEQID NO: 8). 9. Полипептид по п.5, отличающийся тем, что указанный полипептид включает сочетание четверного мутанта N65A, L80A, Y85A, Y89A и замещение С-концевой последовательности ESLRSKE наKRLKSKE (SEQ ID NO: 9), обладающий антагонистической активностью в сравнении с IFN2 дикого типа (SEQ ID NO: 2). 10. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид включает тройной мутант Н 57 М, E58D, Q61L (SEQ ID NO: 10). 11. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид включает тройной мутантH57Y, E58N, Q61S (SEQ ID NO: 11). 12. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид включает сочетание тройного мутанта Н 57 М, E58D, Q61L и замещение С-концевой последовательности ESLRSKE на KRLKSKE(SEQ ID NO: 12). 13. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид включает сочетание тройного мутанта H57Y, E58N, Q61S и замещение С-концевой последовательности ESLRSKE на KRLKSKE(SEQ ID NO: 13). 14. Полипептид по п.1 или 5, отличающийся тем, что указанный полипептид также подвергают конъюгации с ПЭГ. 15. Молекула ДНК, кодирующая полипептид по п.1 или 5. 16. Молекула ДНК по п.15, отличающаяся тем, что указанная молекула ДНК включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-23 и SEQ ID NO: 30-35. 17. Вектор, включающий молекулу ДНК по любому из пп.15, 16, оперативно связанный с одним или более элементами контроля транскрипции. 18. Клетка-хозяин, включающая вектор по п.17. 19. Фармацевтическая композиция, включающая в качестве активного ингредиента рекомбинантный полипептид интерферона 2 (IFN2), его активный фрагмент, аналог, производное и вариант по п.1 или 5, а также включающая фармацевтически приемлемый носитель. 20. Фармацевтическая композиция по п.19, включающая рекомбинантный полипептид интерферона 2 (IFN2), содержащий любую из последовательностей SEQ ID NO: 5-13 и SEQ ID NO: 24-29, его фрагменты, аналоги, производные и варианты. 21. Фармацевтическая композиция по п.20, включающая рекомбинантный полипептид интерферона 2 (IFN2), содержащий любую из последовательностей SEQ ID NO: 5, 7, 8, 10-13, его фрагменты, аналоги, производные и варианты, где указанный полипептид обладает повышенной специфической агонистической активностью. 22. Фармацевтическая композиция по п.20, включающая рекомбинантный полипептид интерферона 2 (IFN2), содержащий любую из последовательностей SEQ ID NO: 6 и 9, его фрагменты, аналоги,производные и варианты, где указанный полипептид обладает повышенной специфической антагонистической активностью. 23. Способ лечения или предупреждения расстройства или заболевания, связанного с модуляцией интерферона (IFN), включающий введение субъекту, которому это необходимо, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.21, где указанное расстройство или заболевание выбирают из группы, состоящей из ракового заболевания, аутоиммунного заболевания и инфекционного заболевания. 24. Способ по п.23, где указанное раковое заболевание выбирают из группы, состоящей из лейкемического ретикулеза, саркомы Капоши, множественной миеломы, хронического миелогенного лейкоза,неходжкинской лимфомы и меланомы. 25. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанное аутоиммунное заболевание представляет собой рассеянный склероз (PC). 26. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанный PC выбирают из группы, состоящей из рецидивирующе-ремитирующего PC, вторичного прогрессирующего PC, первичного прогрессирующего PC и прогрессирующего рецидивирующего PC. 27. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанное инфекционное заболевание представляет собой инфекцию вирусом гепатита. 28. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанный вирус гепатита выбирают из группы, состоящей из гепатита А, гепатита В и гепатита С. 29. Способ лечения или предупреждения расстройств, связанных с повышенной экспрессией IFN2,включающий введение субъекту, которому это необходимо, эффективного количества фармацевтической