Поливалентные вакцины, содержащие рекомбинантные вирусные векторы

012037 Область изобретения Настоящее изобретение относится к области рекомбинантной ДНК и вирусных векторных вакцин. Более конкретно, настоящее изобретение относится к рекомбинантной ДНК и вирусным векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, кодирующие множественные антигены и/или адъюванты. Уровень техники изобретения Туберкулез (ТБ) в течение нескольких тысяч лет является одной из основных угроз здоровью человека во всем мире. ТБ, вызываемый Mycobacterium tuberculosis, представляет собой инфекционное заболевание легких, передаваемое в результате воздушно-капельной инфекции бациллами М. tuberculosis. Эти бациллы чрезвычайно контагиозны, и, по современным оценкам, в настоящее время около одной трети мирового населения (2 млрд человек) являются инфицированными. Кроме того, считается, что ежегодно туберкулез является причиной смерти более 2 млн человек во всем мире. Только от 5 до 10% иммунокомпетентных людей восприимчивы к ТБ, и из них более чем у 85% заболевание будет развиваться исключительно в легких, тогда как у ВИЧ-инфицированных возможно также развитие системных заболеваний, ускоряющих летальный исход. Заболевание не развивается примерно у 90% людей, инфицированных М. tuberculosis. Вместе с тем,у таких латентно инфицированных индивидуумов бациллы могут продолжать существовать много лет и повторно активироваться, например, в случае ослабления иммунной системы, как после ВИЧ-инфекции. В силу латентного характера инфекции, обычно для лечения инфицированных индивидуумов необходимо вводить несколько антибиотиков в течение периода до 12 месяцев, что является не очень привлекательным лечением, в целом, и по причине его дороговизны, а также возможного возникновения мультирезистентности к лекарственным препаратам, в то время как в большинстве развивающихся стран такое лечение не является также и достаточно эффективным. Была разработана одна относительно успешная ТБ-вакцина: в начале двадцатого столетия была создана вакцина из бацилл Кальметта-Герена (БЦЖ), и впервые у людей ее применили в 1921 г. Вакцина БЦЖ представляет собой ослабленный штамм бактерий, основанных на изоляте Mycobacterium bovis,полученном из коровы. Эта вакцина относительно безопасна, считается легкой и достаточно дешевой для производства. В 2000 г. вакцинацией БЦЖ было охвачено 86% мирового населения. Вместе с тем, оказалось, что вакцина не особенно эффективна для легочной формы ТБ у взрослых, и во многих регионах в развивающихся странах, несмотря на программы вакцинации БЦЖ, тем не менее, наблюдается очень высокий уровень ТБ. Было выявлено, что вакцина БЦЖ предотвращает только 5% всех летальных исходов ТБ, которые можно предотвратить с помощью вакцины (Kaufmann, 2000). В силу недостаточной степени защиты вакцины БЦЖ, в целом, и из-за специфической защиты в отношении индивидуумов детского возраста и диссеминированной формы ТБ на разработку новых, более широко применимых вакцин против ТБ было направлено много усилий, основанных на альтернативных системах и знаниях, приобретенных в других областях, как, например, на основе вакцинации против других тропических инфекционных болезней и ВИЧ (данные Wang и Xing, 2002 г.). Предпринимались различные подходы для разработки новых вакцин против ТБ, начиная от субъединичных вакцин и ДНК-вакцин до модифицированных штаммов mycobacterium. Кроме того, были также созданы рекомбинантные вирусные вакцины, позволяющие переносить антигены М. tuberculosis в антигенпредставляющие клетки посредством доставки генными носителями, такими как векторы модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA) и аденовирусные векторы с дефективной репликацией. В патенте WO 96/15241 (см. также ЕР 0792358) были описаны вакцины депротеинизированной ДНК против ТБ, и также во многих сообщениях описано использование многочисленных антигеновMycobacterium tuberculosis как в рекомбинантной, так и в очищенной формах для их применения в вакцинах: в патентах WO 95/01441, WO 95/14713, WO 96/37219, США 6599510, WO 98/31388, WO 98/44119,WO 99/04005, WO 99/24577, WO 00/21983, WO 01/04151, WO 01/79274, WO 2004/006952, в патенте US 2002/0150592. Также предложено использовать слитые белки, содержащие различные ТБ-антигены: см. патенты WO 98/44119, ЕР 0972045 и ЕР 1449922, раскрывающие использование слитого полипептидаESAT-6 и МРТ 59 (МРТ 59 также упоминается как антиген Ag85B или 85 В). Несмотря на все эти и другие усилия по созданию вакцины против туберкулеза, которая одновременно обеспечит сильный клеточный и сильный гуморальный ответ, а также высокоэффективную досрочную защиту, в настоящее время такой вакцины не существует. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Карта pAdApt35Bsu.myc. Фиг. 2. Карта pAdApt35Bsu. TB.LM. Фиг. 3. Карта pAdApt35Bsu. TB.SM. Фиг. 4. Карта pAdApt35Bsu. TB.FLM. Фиг. 5. Карта pAdApt35Bsu. TB.3M. Фиг. 6. Карта pAdApt35Bsu. TB.4M. Фиг. 7. Карта pAdApt35Bsu. TB.5M. Фиг. 8. Карта pAdApt35Bsu. TB.6M. Фиг. 9. Карта pAdApt35Bsu. TB.7M.-1 012037 Фиг. 10. Вестерн-блоттинг с поликлональным антителом против туберкулезного ТБ-антигена на лизатах клеток А 549, инфицированных вирусами Ad35, содержащими нуклеиновые кислоты, кодирующие различные наборы ТБ-антигенов с меткой myc (А) и без метки myc (В). (С) подобно (В), с маркерами молекулярного веса. См. примечания в табл. 1. Фиг. 11. Схема эксперимента с протоколом иммунизации, с использованием 7 различных аденовирусных векторов (ДНК), содержащих различные наборы нуклеиновых кислот, кодирующих туберкулезные антигены. Фиг. 12. Процент антигенспецифических спленоцитов, которые положительно окрашиваются при продуцировании гамма-интерферона (IFN+) при стимуляции в отсутствие пептида (А: клетки CD4+, В: клетки CD8+). Фиг. 13. Процент антигенспецифических спленоцитов, которые положительно окрашиваются при продуцировании гамма-интерферона (IFN+) при стимуляции пептидным пулом, соответствующим антигену Ag85 А (А: клетки CD4+, В: клетки CD8+). Фиг. 14. Процент антигенспецифических спленоцитов, которые положительно окрашиваются, если продуцируют гамма-интерферон (IFN+), при стимуляции пептидным пулом, соответствующим антигенуAg85 В (А: клетки CD4+, В: клетки CD8+). Фиг. 15. Процент антигенспецифических спленоцитов, которые положительно окрашиваются, если продуцируют гамма-интерферон (IFN+), при стимуляции пептидным пулом, соответствующим антигену ТВ 10.4 (А: клетки CD4+, В: клетки CD8+). Фиг. 16. Анализ процентного содержания положительно окрашивающихся в ICN спленоцитовCD4+ и CD8+ в сыворотке, полученной от мышей, которым вводили тройные вставки TB-L (А) и TB-S (В). Фиг. 17. Дозозависимый эффект, полученный с использованием различных доз TB-S, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую антигены Ag85 А, Ag85 В и ТВ 10.4. Ответ CD4 на Ag85 А(А), наAg85 В с отрегулированным пептидным пулом (см. пример 6), в левом столбце показан ответ на инфицирование TB-L, в правом столбце - на инфицирование TB-S. Фиг. 18. Ответы CD4 и CD8 после примирования БЦЖ и бустер-иммунизацией различными Ad-TB-векторами. Ответ CD4 на Ag85 А (А), Ag85 В (С) и ТВ 10.4 (Е). Ответ CD8 на Ag85 А (В), Ag85 В (D) и ТВ 10.4 (F). Фиг. 19. Нуклеотидная последовательность TB-LM. Фиг. 20. Нуклеотидная последовательность TB-SM. Фиг. 21. Нуклеотидная последовательность TB-FLM. Фиг. 22. Аминокислотная последовательность TB-LM. Фиг. 23. Аминокислотная последовательность TB-SM. Фиг. 24. Аминокислотная последовательность TB-FLM. Фиг. 25. Стимуляция Ag85 А в эксперименте примирования БЦЖ/бустер-иммунизации Ad35-TB с долговременным считыванием. Верхний список: CD4-ответ, нижний список: CD8-ответ. Ad35. Е=пустой вирус Ad35. Фиг. 26. Стимуляция Ag85 В в эксперименте примирования БЦЖ/бустер-иммунизации Ad35-TB с долговременным считыванием. Верхний список: CD4-ответ, нижний список: CD8-ответ. Ad35. Е=пустой вирус Ad35. Фиг. 27. Стимуляция ТВ 10.4 в эксперименте примирования БЦЖ/бустер-иммунизации Ad35-TB с долговременным считыванием. Верхний список: CD4-ответ, нижний список: CD8-ответ. Ad35. Е=пустой вирус Ad35. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к рекомбинантным вирусным векторам, предпочтительно к реплицирующимся дефективным аденовирусам, более предпочтительно к рекомбинантным человеческим аденовирусам серотипов Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 и Ad50, при этом вирусные векторы содержат гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую (слитые) полипептиды по меньшей мере двух антигенов из одной или более бацилл, вызывающих туберкулез. Кодируемые антигены могут быть связаны непосредственно, то есть могут образовывать один-единственный полипептид. В одном предпочтительном варианте осуществления антигены присутствуют в полипротеинепредшественнике, в том смысле, что они связаны посредством линкерной последовательности, распознаваемой коэксперссируемой специфической протеазой. Гетерологичная нуклеиновая кислота может содержать ген, кодирующий протеазу. Слитые белки с прямыми связями вызывают желаемые иммунные ответы благодаря антигенам, присутствующим в слитом продукте, тогда как белки, содержащие сайты протеаз, расщепляются на отдельные дискретные антигенные формы, каждая из которых способствует желаемому иммунному ответу. Протеаза предпочтительно связана с антигенами сайтом распознавания протеаз, который распознается клеточной протеазой. Обе структуры обеспечивают дополнительные или даже синергичные эффекты по сравнению с вакцинацией или способом лечения, в котором применяют вирусные векторы, содержащие только единственную трансгенную кодирующую единицу. Более обобщенно, настоящее изобретение также относится к вирусным векторам, содержащим гетерологичную по-2 012037 следовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую множественные антигены, разделенные сайтами специфического расщепления протеазами. Понятно, что такие антигены могут происходить из множества разнообразных источников, включая, без ограничения, возбудителей инфекции, таких как вирусы, бактерии и паразиты, и, таким образом, согласно данному аспекту настоящего изобретения, не ограниченных антигенами бацилл, вызывающих туберкулез. Антигены Mycobacterium tuberculosis служат неограничивающими примерами способов создания таких поливалентных вирусных векторных вакцин и примерами разделения внедряемых в клетку-хозяин антигенов и их способности содействовать иммунному ответу. Настоящее изобретение относится также к использованию генетических адъювантов, которые коэкспрессируются из вирусного вектора. Эти адъюванты кодируются нуклеиновой кислотой, которая является частью гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, внедренной в геном вирусного вектора. Адъювант коэкспрессируется со специфическим антигеном (антигенами) и, таким образом, способен стимулировать иммунный ответ на антиген (антигены). Ясно, что последовательность, кодирующая адъювант, может быть непосредственно связана с последовательностью, кодирующей антиген (антигены), но предпочтительно отделена от последовательности, кодирующей этот один антиген или большее количество антигенов, линкерной последовательностью, кодирующей сайт узнавания протеаз. В последнем случае адъювант присутствует в клетке-хозяине отдельно от антигена (антигенов) и способен,наряду с антигеном (антигенами), обеспечивать его иммунно-стимулирующие эффекты. Подробное описание Настоящее изобретение относится к поливалентным вакцинам, содержащимрекомбинантный вирусный вектор. Предпочтительный вирусный вектор представляет собой рекомбинантный аденовирусный (Ad) вектор. Рекомбинантный аденовирусный вектор согласно настоящему изобретению содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере два различных антигена. Антигены могут находиться в пределах единственного полипептида. Эти эпитопы могут являться как антигенами вирусных, бактериальных и паразитических патогенов, так и антигенами хозяина, такими как аутоантигены или опухолевые антигены, однако, ими не ограничиваясь. В предпочтительном варианте осуществления антигены происходят из бацилл, вызывающих туберкулез (ТБ), более предпочтительно из Mycobacterium tuberculosis, M. africanum или М. bovis или из их комбинации. Антигены могут быть полноразмерными нативными белками, химерными слитыми белками из антигена и белка хозяина или миметиками, их фрагментом или фрагментами антигена, происходящего из этого патогена, или другими мутантами, вызывающими, тем не менее, желаемый иммунный ответ. Гены, кодирующие ТБ-антигены, которые обычно можно использовать в вирусных векторах согласно изобретению,включают в себя, не ограничиваясь нижеперечисленным, следующие: Ag85A (MPT44), Ag85 В (МРТ 59),Ag85 С (МРТ 45), ТВ 10.4 (CFP7), ESAT-6, CFP7A, CFP7B, CFP8A, CFP8B, CFP9, CFP10, CFP10A, CFP11,CFP16, CFP17, CFP19, CFP19A, CFP19B, CFP20, CFP21, CFP22, CFP22A, CFP23, CFP23A, CFP23B,CFP25, CFP25A, CFP26 (МРТ 51), CFP27, CFP28, CFP29, CFP30A, CFP30B, CWP32, CFP50, МРТ 63,МТС 28, LHP, MPB59, МРВ 64, МРТ 64, ТВ 15, ТВ 18, ТВ 21, ТВ 33, ТВ 38, ТВ 54, ТВ 12.5, ТВ 20.6, ТВ 40.8,ТВ 10 С, ТВ 15 А, ТВ 17, ТВ 24, ТВ 27 В, ТВ 13 А, ТВ 64, ТВ 11 В, ТВ 16, ТВ 16 А, ТВ 32, ТВ 32 А, ТВ 51, ТВ 14,ТВ 27, НВНА, GroEL, GroES (патенты WO 95/01441, WO 98/44119, US 6596281, US 6641814, WO 99/04005,WO 00/21983, WO 99/24577), и антигены, раскрытые в патентах WO 92/14823, WO 95/14713, WO 96/37219,US 5955077, US 6599510, WO 98/31388, US 2002/0150592, WO 01/04151, WO 01/70991, WO 01/79274, WO 2004/006952, WO 97/09428, WO 97/09429, WO 98/16645, WO 98/16646, WO 98/53075, WO 98/53076, WO 99/42076, WO 99/42118, WO 99/51748, WO 00/39301, WO 00/55194, WO 01/23421, WO 01/24820, WO 01/25401, WO 01/62893, WO 01/98460, WO 02/098360, WO 03/070187, US 6290969, US 6338852, US 6350456,US 6458366, US 6465633, US 6544522, US 6555653, US 6592877, US 6613881, US 6627198. Антигенные слияния, которые могут иметь конкретное использование, впервые раскрыты в настоящем изобретении(такие, как Ag85A-Ag85B-TB10.4 и их комбинации), но также известны слияния, такие как ESAT-6MPT59 и MPT59-ESAT-6, раскрытые в WO 98/44119 и в вышеупомянутых документах. Одним из подходов к применению множественных антигенов может быть присутствие в единственном векторе двух или более отдельных кассет экспрессии при содержании в каждой кассете отдельного рассматриваемого гена. Ясно, что такой подход имеет недостатки, например, связанные с наличием пространства в векторе: раздельные кассеты обычно содержат раздельные промоторы и/или индукторы и раздельные последовательности сигнала полиаденилирования. Обычно для таких кассет необходимы раздельные положения в вирусном векторе, что затрудняет процедуры клонирования, тогда как феномен, известный как "промотор интерференции" или "подавление" (ограниченная пригодность клеточных факторов,необходимых для действия промотора), может ограничивать уровни экспрессии с различных промоторов. Как показано на примере раскрытых в настоящем изобретении рекомбинантных вирусных векторов в отношении слияний между множественными ТБ-антигенами, в настоящее время возможно создание рекомбинантных аденовирусных векторов, содержащих несколько нуклеиновых кислот, кодирующих более одного антигена, вирусных векторов, которые вызывают сильный иммунный ответ, тогда как использование единственной вставки вызывает ограниченный эффект. Ясно, что эти векторы кодируют рекомбинантные генетические химеры, экспрессирующие два или более антигенов в единственной цистронной иРНК, например, в виде слитого белка. Этот подход может быть эффективен при использовании ДНК-3 012037 вакцин или вирусных векторов для того, чтобы вызвать Т-клеточный иммунитет к слабым антигенам. Вместе с тем, такие слитые белки могут иметь дополнительные недостатки, которые не всегда можно предположить заранее, поскольку было выявлено, что такие слияния способны искажать иммунодоминантные структуры и не всегда вызывают иммунитет с равным потенциалом ко всем антиген-мишеням,тогда как второй и, возможно, более существенный недостаток экспрессии генетических слияний состоит в том, что отдельные компоненты не могут складываться в нативную конформацию в силу близкого расположения своего партнера слияния или в силу других причин. В результате этого генетические слияния могут вызывать гуморальные иммунные ответы к бессмысленным эпитопам, и такие антитела не распознают нативные эпитопы, показываемые патогенами-основателями, и могут быть слабыми для борьбы с инфекцией. Авторы настоящего изобретения разработали систему, где множественные антигены кодируются единственной гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в которой экспрессируемый полипротеин подвергается процессингу, превращаясь в дискретные антигенные полипептиды. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к вирусным векторам, способствующим экспрессии множественных антигенов, которые впоследствии подвергаются процессингу в дискретные антигены, и, таким образом, удается избежать возможных ограничений, связанных с генетическими слияниями, и в то же время исключается необходимость в раздельных кассетах экспрессии. Ранее не было описано каких-либо композиций или способов, способствующих точному процессингу экспрессируемых вирусным вектором генетических слияний в дискретные антигены. Экспрессия множественных антигенов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, содержащимися в ДНК или вирусном векторе,которые вследствие процессинга превращаются в дискретные антигены, показана с использованием протеазы (PR), такой как вирусная протеаза, кодируемая вирусом птичьего лейкоза (ALV; упоминаемая в настоящем изобретении как PR-ALV). В ALV-вирусе ALV-PR образует С-концевую область белка gag,которая, как известно, катализирует процессинг предшественников gag и gag-pol, что представляет собой решающий этап в ходе ALV-репликации (обзор Skalka, 1989). Была создана уникальная ALV-PR-система направленного процессинга. Полипротеин, содержащийALV-PR и данные антигены, экспрессируется ДНК или вирусными векторами, в которых ALV-PR предпочтительно образует N-концевую область полипротеина и, далее, антигенные последовательности, связанные с сайтами расщепления ALV-PR. В системе предпочтительно используются два различных сайта расщепления. Один сайт расщепления (GSSGPWPAPEPPAVSLAMTMEHRDRPLV; SEQ ID NO: 22) должен высвобождать ALV-PR, и другой сайт расщепления (PPSKSKKGGAAAMSSAIQPLVMAVVNRERDGQTG;SEQ ID NO: 21) распознается ALV-PR и используется для разделения других кодируемых антигенов в дискретных полипептидах. Альтернативно, PR и его сайт расщепления можно кодировать посредством или на основе других ретровирусов, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус лейкемии мышей, вирус иммунодефицита обезьяны (ВИО) и вирус саркомы Рауса. Согласно предпочтительному варианту осуществления в настоящем изобретении раскрываются рекомбинантные вирусные векторы, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие множественные антигены Mycobacterium tuberculosis, в которых различные последовательности нуклеиновых кислот отделены друг от друга последовательностями, кодирующими сайт узнавания ALV-протеаз. В этом варианте дискретные ТБ-антигены создаются в виде полипротеина и затем подвергаются процессингу таким образом, что расщепляются на дискретные антигенные полипептиды, каждый из которых способствует иммунному ответу. Необходимо понимать, что система ALV-протеаз не должна ограничиваться использованием ТБ-специфических антигенов. Специалист в данной области сможет оценить возможность системы по применению других антигенов, отличных от ТБ-антигенов или в комбинации с ними, и ее применимость для других терапевтических назначений, таких как генная терапия и противоопухолевая вакцинация. Предпочтительно вирусный вектор, содержащий множественные антиген-кодирующие последовательности, разделенные сайтами протеаз, представляет собой аденовирусный вектор. Вирусным вектором может являться непосредственно вирусная частица, с учетом того, что термин "вирусный вектор" также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей вирусную частицу. Аденовирусный вектор предпочтительно является рекомбинантным вектором на основе вида или серотипа аденовирусов, или происходящим из этого вида или серотипа, который борется с нейтрализующим действием у небольшого процента населения-мишени. Такие аденовирусы иногда также упоминаются как "редкие" аденовирусы, поскольку обычно в человеческой популяции они постоянно не циркулируют. Поэтому предпочтительными серотипами являются Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 и Ad50. Используемый в настоящем изобретении термин "антиген" означает белок или его фрагмент, который при экспрессии в клетке животного, или человека, или ткани способен вызывать иммунный ответ. Примеры включают в себя вирусные белки, бактериальные белки, паразитарные белки, цитокины, хемокины, иммунорегуляторные агенты и терапевтические агенты, но не ограничены вышеперечисленным. Антиген может являться белком дикого типа, усеченной формой этого белка, мутированной формой этого белка или любым другим вариантом этого белка, в каждом случае способным содействовать иммун-4 012037 ным ответам после экспрессии в вакцинированном организме-хозяине животного или человека. Необходимо понимать, что когда антигены слиты прямым образом, это слияние является результатом рекомбинантной молекулярной биологии; таким образом, используемое в настоящем изобретении прямое слияние двух антигенов не относится к двум антигенным частям одного и того же белка дикого типа, как это происходит в природе. Следует пояснить, что, когда две антигенных части одного и того же белка дикого типа (две части, которые обычно связаны прямым образом в пределах белка) связаны посредством линкеров, согласно раскрытию настоящего изобретения (как, например, посредством сайта ALV-протеаз,что обсуждается ниже) такое слияние является частью настоящего изобретения. В предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к различным белкам (обладающим антигенной активностью), которые или связаны прямым образом, или связаны посредством одного или более сайтов, чувствительных к действию протеаз. В более предпочтительном варианте осуществления ген,кодирующий протеазу, связан с рассматриваемым белком (белками) даже более предпочтительно посредством еще одного сайта действия протеаз. Различные антигены не обязательно происходят из одного вида патогенов. Комбинации различных антигенов из множества видов, в которых различные антигены кодируются последовательностями нуклеиновых кислот в пределах одного вектора, также входят в объем настоящего изобретения."Антиген хозяина" означает белок или его часть, который присутствует в клетке или ткани животного-реципиента, как, например, клеточный белок, иммунорегуляторный агент или терапевтический агент, но не ограничены вышеперечисленным. Антиген может кодироваться оптимизированным по кодонам синтетическим геном, и его можно конструировать, используя общепринятые способы рекомбинантной ДНК. Как упомянуто выше, антиген, экспрессируемый рекомбинантным вирусным вектором, содержащим систему ALV-протеазы, может быть любой молекулой, которая экспрессируется любым вирусным,бактериальным или паразитарным организмом перед внедрением в животную клетку-хозяин, во время внедрения, в ходе колонизации или репликации в животной клетке-хозяине. Эти патогены могут вызывать инфекции у людей, домашних животных или диких животных-хозяев. Вирусные патогены, из которых получают вирусные антигены, включают в себя ортомиксовирусы,такие как вирусы гриппа; ретровирусы, такие как RSV, HTLV-I, и HTLV-II, вирусы герпеса, такие какEBV; CMV или вирус простого герпеса herpes simplex; лентивирусы, такие как HIV-I и HIV-2; рабдовирусы, такие как вирус бешенства; пикорнавирусы, такие как полиовирус; поксвирусы, такие как вирус коровьей оспы; ротавирус; и парвовирусы, такие как аденоассоциированные вирусы (AAV), но не ограничены вышеперечисленными. Примеры вирусных антигенов можно найти в группе, включающей в себя антигены вируса иммунодефицита человека (HIV) Rev, Pol, Nef, Gag, Env, Tat, мутантные производные Tat, такие как Tat-31-45,T- и В-клеточные эпитопы gp120, химерные производные: HIV-I Env и gp120, такие как слияния gp120 иCD4, усеченные или модифицированные HIV-I Env, такие как gp140 или производные HIV-I Env и/илиgp140, но не ограничены вышеперечисленными. Другими примерами являются поверхностный антиген гепатита В, ротавирусные антигены, такие как VP4 и VP7, антигены вируса гриппа, такие как гемагглютинин, нейраминидаза или нуклеопротеин, и антигены вируса простого герпеса, такие как тимидинкиназа. Примеры бактериальных патогенов, из которых можно получать бактериальные антигены, включают в себя Mycobacterium tuberculosis spp., Helicobacter pylori, Salmonella spp., Shigella spp., E. coli,Rickettsia spp., Listeria spp., Legionella pneumoniae, Fansicella spp., Pseudomonas spp., Vibrio spp. и Borelliaburgdorferi, но не ограничены вышеперечисленными. Примеры протективных антигенов бактериальных патогенов включают в себя соматические антигены энтеротоксигенной Е. coli, такие как фимбриальный антиген CFA/I и нетоксичная В-субъединица термолабильного токсина; пертактин Bordetella pertussis, аденилатциклаза-гемолизин В. pertussis, фрагмент С столбнячного токсина Clostridium tetani, OspA из Borellia burgdorferi, протективные паракристаллические белки поверхностного слоя Rickettsia prowazekii и Rickettsia typhi, листериолизин (также известный как "Llo" и "Hly") и/или супероксиддисмутаза (также известная как "SOD" и "р 60") из Listeriamonocytogenes, уреаза из Helicobacter pylori и рецепторсвязывающий домен летального токсина и/или протективного антигена из Bacillus anthrax. Паразитарные патогены, из которых получают паразитарные антигены, включают в себя PlasmodiumEntamoeba histolytica, Eimeria spp., такие как Eimeria maxima, Leishmania spp., Schistosome spp., Brugia spp.,Fascida spp., Dirofilaria spp., Wuchereria spp., и Onchocerea spp, но не ограничены вышеперечисленными. Примеры протективных антигенов паразитарных патогенов включают в себя специфические антигены циркумспорозоита (CS) или печеночной стадии (LSA) LSA-I и LSA-3 Plasmodium spp., такие как антигены P. bergerii или P. falciparum, или их иммуногенные мутанты; мерозоитный поверхностный антиген Plasmodium spp., галактозоспецифический лектин Entamoeba histolytica, gp63 из Leishmania spp.,gp46 из Leishmania major, парамиозин из Brugia malayi, триозофосфатизомераза из Schistosoma mansoni,секретируемый глобиноподобный белок из Trichostrongylus colubriformis, глутатион-S-трансфераза изFrasciola hepatica, Schistosoma bovis, и S. japonicum, и KLH из Schistosoma bovis и S. japonicum. Как упоминалось ранее, рекомбинантные вирусные векторы, содержащие нуклеиновые кислоты,кодирующие ALV или ALV-подобную протеазу, могут кодировать антигены хозяина, которые могут представлять собой любой клеточный белок, иммунорегуляторный агент, или терапевтический агент,или его части, способные экспрессироваться в клетке-реципиенте, включающие в себя и опухолевые,трансплантационные антигены, и аутоантигены, или фрагменты и производные опухолевых, трансплантационных антигенов и их аутоантигенов, но не ограничены вышеперечисленным. Таким образом, в настоящем изобретении вирусные векторы могут кодировать опухолевые, трансплантационные антигены,или аутоантигены, или их части, или их производные. Альтернативно, вирусные векторы могут кодировать синтетические гены (созданные согласно вышеприведенному описанию), которые кодируют опухолеспецифические, трансплантационные антигены, или аутоантигены, или их части. Примеры таких антигенов включают в себя простатоспецифический антиген, MUC1, gp100, HER2, TAG-72, СЕА, MAGE-1,тирозиназу, CD3 и бета цепочку IAS, но не ограничены вышеперечисленными. Очевидно, что технология сайта ALV протеазы, раскрытая в настоящем изобретении, также применима для использования в генной терапии, путем введения множественных полипептидов в состав единственного полипротеина и процессинга полипротеина в дискретные полипептиды у хозяина, нуждающегося в таких множественных (дискретных) полипептидах. В качестве средства дополнительного повышения иммуногенности вирусных векторов конструируют кассеты экспрессии, которые кодируют по меньшей мере один антиген и адъювант и могут использоваться для усиления ответов хозяина на антиген, экспрессируемый указанными вирусными векторами. Такие адъюванты также упоминаются в настоящем изобретении как "генетические адъюванты", поскольку гены кодируют белки, действующие в качестве адъюванта. Для расщепления антигена из адъюванта после трасляции предпочтительно использовать протеазу и сайты распознавания протеазами, как описано выше, хотя в некоторых вариантах осуществления адъювант может также быть связан с антигеном прямым образом. Кодируемый вирусными векторами конкретный адъювант можно выбирать из широкого разнообразия генетических адъювантов. В предпочтительном варианте осуществления адъювант представляет собой А-субъединицу холерного токсина (CtxA; примеры: инвентарный номер GenBank X00171, AF175708,D30053, D30052), или их функциональные части, и/или их функциональные мутантные производные,такие как А 1 домены А-субъединицы (CtxA1; инвентарный номер GenBank K02679). Альтернативно,можно использовать любой бактериальный токсин, являющийся членом семейства бактериальных аденозиндифосфат-рибозилирующих экзотоксинов. Неограничивающими примерами являются А-субъединица термолабильного токсина (EltA) энтеротоксикогенной Е. coli и S1-субъединица коклюшного токсина. Другими примерами являются аденилатциклазные гемолизины, такие как гены суаА из Bordetella pertussis,В. bronchiseptica или В. parapertussis. Альтернативно, конкретным токсином АДФ-рибозилтрансферазы может быть любое производное от А-субъединицы холерного токсина (а именно, CtxA) или его части (а именно, А 1 домен А-субъединицы Ctx (т.е. CtxA1 из любого классического штамма Vibrio cholerae (например, штамм 395) или El Tor V. cholerae (например, штамм 2125), которые показывают сниженную АДФ-рибозилтрансферазную каталитическую активность, но сохраняют структурную целостность и включают в себя, без ограничения, замены аргинина-7 лизином (R7K), серина-41 фенилаланином (S41F),серина-61 лизином (S61K), серина-63 лизином (S63K), валина-53 аспарагиновой кислотой (V53D), валина-97 лизином (V97K) или тирозина-104 лизином (Y104K) или их комбинации. Альтернативно, конкретным токсином АДФ-рибозилтрансферазы может быть любое производное холерного токсина, являющееся полностью собранными, но нетоксичными белками, в силу мутаций в каталитическом сайте или, соответственно, в сайте, смежном с каталитическим сайтом. Такие мутанты создаются согласно общепринятым процедурам сайт-направленного мутагенеза, как описано ниже. В другом варианте осуществления токсином АДФ-рибозилтрансферазы является любое производное А-субъединицы термолабильного токсина (LtxA) энтеротоксикогенной Escherichia coli, выделенное из любой энтеротоксикогенной Е. coli, включающей в себя, без ограничения, штамм Е. coli H10407, который проявляет сниженную активность АДФ-рибозилтрансферазы, но сохраняет структурную целостность и включает в себя, без ограничения, R7K, S41F, S61K, S63K, V53D, V97K, или Y104K, или их комбинации. Альтернативно, конкретным токсином АДФ-рибозилтрансферазы может быть любое производное холерного токсина, являющееся полностью собранными, но нетоксичными белками, в силу мутаций в каталитическом сайте или, соответственно, в сайте, смежном с каталитическим сайтом. Создание таких мутантов осуществляют согласно общепринятым процедурам сайт-направленного мутагенеза, как описано ниже. Поскольку АДФ-рибозилирующие токсины являются мощными адъювантами, адъювантом, кодируемым вирусными векторами настоящего изобретения, может быть также любой биоактивный белок из вирусных, бактериальных или протозойных организмов, их иммунорегуляторной ДНК, двухцепочечной РНК или малой интерферирующей РНК (упоминаемой в настоящем изобретении как siRNA). Специфический биоактивный белок можно выбирать без ограничений из следующих классов. Класс 1. Этот класс адъювантов индуцирует апоптоз путем ингибирования Rho, малой GTP-азы хо-6 012037 зяина. Ингибирование Rho отчетливо связано с индукцией апоптоза. Индукция апоптоза представляет собой полезный способ переноса фоновых Т-клеточных ответов и мощный способ для индукции цитотоксических Т-клеток CTL. До настоящего времени не было оценки такой стратегии в какой-либо экспериментальной системе. Активный домен SopE содержится в аминокислотах 78-240 и для экспрессии нуждается только в гене 486bp. Вероятно, что каталитический домен CNF-1 Е. coli будет обладать подобными свойствами. Класс 2. Показано, что бактериальные порины обладают иммуномодулирующей активностью. Такие гидрофобные гомотримерные белки образуют поры, которые позволяют молекулам с молекулярным весом 600 Да проходить через мембраны. Примеры поринов включают в себя белки OmpF, OmpC иOmpD Enterobacteriaceae. Класс 3. Двунитевая РНК (dsPHK) активизирует клетки-хозяева, включающие в себя дендритные клетки. Экспрессия иРНК, которая кодирует инвертированный повтор, отделенный intro или рибозимом,приводит к экспрессии dsPHK. Класс 4. Известно, что пептидный мотив [WYF]xx[QD]xx[WYF] индуцирует Т-клеточные ответы CD1dрестриктированных NK (Kronenberg and Gapin, 2002). Экспрессия пептида с этим мотивом, слитым с биспиральным Т 4 фибритин-мотивом, создаст тримерный пептид, который будет сшит TCR на CD1d-рестриктированных Т-клетках, таким образом активизировавших генетически детерминированные ответы хозяина. Класс 5. Можно использовать siPHK для направленного транспорта молекул-хозяев иРНК, которые подавляют иммунные реакции (например, kir), регулируют иммунные реакции (например, В 7.2) или предотвращают взаимное представление (например, Rho). Класс 6. Можно использовать siPHK для вакцин, направленно транспортирующих костимулирующие молекулы, такие как CD80 и CD86. Ингибирование этих молекул предотвратит костимуляцию, что таким образом приведет к иммунологической толерантности Т-клеток. Неожиданно, как раскрыто в настоящем изобретении, было выявлено, что антигены из вызывающих туберкулез бацилл, такие как белок ТВ 10.4, могут действовать не только как антиген сами по себе,но даже действовать в качестве адъюванта к другим ТБ-антигенам, например Ag85 А. Неожиданно было выявлено, что в случае, когда присутствовала тройная вставка (Ag85A-Ag85B-ТВ 10.4), присутствие ТВ 10.4 в этой конструкции стимулировало иммунный ответ на Ag85 А, тогда как отсутствие ТВ 10.4 проявляло незначительный эффект на спленоциты CD8+ (см. пример 4 и фиг. 13 В). Дополнительно, при изучении адъювантного эффекта ТВ 10.4 было выявлено, что ТВ 10.4, действительно, стимулировал активацию CD8 клеток, направленных против Ag85 А, если присутствовал в тройной конструкции, тогда как инфицирование раздельными векторами, каждый из которых кодировал раздельные антигены, не приводило к такой стимуляции, и было высказано убедительное предположение о необходимости присутствия антигена ТВ 10.4 или в том же векторе, или в пределах того же продукта трансляции. Настоящее изобретение также относится к вирусным векторам, которые кодируют по меньшей мере один антиген и цитокин, слитый посредством сайта узнавания протеаз. Такие векторы используют для усиления ответов хозяина на слабый антиген (антигены), экспрессируемый указанными вирусными векторами. Примерами цитокинов, кодируемых вирусными векторами, являются интерлейкин-4(IL-4), IL-5,IL-6, IL-10, IL-12p4o, IL-12p7o, TGF и TNF. В данной области известны методики рекомбинантной ДНК и РНК для внедрения функциональных кассет экспрессии для создания вирусных векторов, способных к экспрессированию иммунорегуляторного агента в клетках или тканях эукариот. В настоящем изобретении описаны композиции и способы конструирования вирусных векторов, которые экспрессируют более одного антигена из вызывающих ТБ бацилл, предпочтительно из Mycobacteriumtuberculosis, M. africanum и/или М. bovis. Предпочтительно вирусный вектор является рекомбинантным аденовирусным вектором с дефективной репликацией. Одним из наиболее изученных и общепринято применяемых серотипов аденовируса является аденовирус 5 (Ad5). В исследованиях на макаках резус и мышах показано, что существование анти-Ad5 иммунитета существенно подавляет иммуногенность вакцин, основанных на Ad5. Предыдущие данные 1 фазы клинических испытаний показывают, что эта проблема может также возникать у людей. Одна из многообещающих стратегий для того, чтобы обойти предшествующий иммунитет у индивидуумов, ранее инфицированных наиболее распространенными человеческими аденовирусами (такими,как Ad5), включает в себя разработку рекомбинантных векторов из серотипов аденовируса, которые не борются с этим предшествующим иммунитетом. Человеческие аденовирусные векторы, идентифицированные как особо полезные, основаны на серотипах 11, 26, 34, 35, 48, 49 и 50, что показано в патентахWO 00/70071, WO 02/40665 и WO 2004/037294 (см. также Vogels et al., 2003). Другие авторы выявили,что аденовирус 24 (Ad24) также вызывает особый интерес, поскольку представляет собой редкий серотип (WO 2004/083418). В предпочтительном варианте осуществления указанный вирусный вектор, таким образом, является аденовирусом, полученным из серотипов, выбираемых из группы, состоящей из Ad11,Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 и Ad50. Преимущество выбора этих человеческих аденовирусов в качестве вакцинных векторов ясно отражает тот факт, что у людей не наблюдается постоянного инфицирования этими дикими типами аденовирусов. Как следствие, нейтрализующие антитела против этих се-7 012037 ротипов менее распространены, в целом, в человеческой популяции. Этим они отличаются от серотипа 5,так как люди достаточно постоянно инфицируются этим серотипом дикого типа. Возникающие в течение инфекции иммунные ответы на родительский серотип дикого типа могут иметь отрицательное воздействие на эффективность аденовирусного рекомбинантного серотипа при использовании его в качестве последовательного рекомбинантного вакцинного вектора, как, например, в качестве вакцины против малярии, в которой применяют аденовирусы. Распространение различных серотипов аденовируса в человеческой популяции во всем мире в разных географических областях является различным. В общем, в большинстве регионов мира предпочтительные серотипы борются с низкой нейтрализующей активностью хозяев, как отмечено в патенте WO 00/70071. В другом предпочтительном варианте осуществления аденовирус является обезьяньим, собачьим или бычьим аденовирусом, поскольку эти вирусы также не борются с предшествующим иммунитетом у хозяина (человеческого происхождения), которому нужно вводить рекомбинантный вирус. Рядовые специалисты в данной области техники высоко оценят применимость аденовирусов обезьяны для использования в генной терапии или в вакцинах у человека. Помимо этого, было выявлено, что собачьи и бычьи аденовирусы in vitro инфицируют человеческие клетки и поэтому также применимы для использования у человека. Особенно предпочтительными аденовирусами обезьяны являются аденовирусы, выделенные у шимпанзе. Подходящими примерами являются аденовирусы, включающие в себя С 68 (также известный как Pan 9; US 6083716) и Pan 5, 6 и 7 (WO 03/046124); см. также патент WO 03/000851. Таким образом, выбор рекомбинантного вектора обусловлен векторами, которые борются с нейтрализующей активностью в небольшом проценте человеческой популяции, нуждающейся в вакцинации. Настоящее изобретение имеет множество преимуществ. Рекомбинантные вирусы, такие как рекомбинантные аденовирусы, можно производить с очень высокими титрами, используя клетки с обоснованной безопасностью, которые могут расти в суспензии в очень больших объемах, с использованием среды, не содержащей каких-либо компонентов животного или человеческого происхождения. Также известно, что рекомбинантные аденовирусы вызывают сильнейший иммунный ответ на белок, кодируемый гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты в аденовирусном геноме. Авторы настоящего изобретения выявили, что вакцина, содержащая множественные антигены,обеспечит более сильный и более широкий иммунный ответ на бациллы, вызывающие ТБ. Кроме того,несмотря на факт, что единственный антиген сам по себе мог индуцировать защиту у инбредных мышиных линий, очевидно, что коктейль, содержащий несколько антигенов, представляет собой более хорошую вакцину для применения у людей, поскольку маловероятно, что она обладает недостатком иммунологической толерантности, связанной с главным комплексом гистосовместимости МНС у гетерогенного населения. Вместе с тем, с практической точки зрения разработки вакцины, состоящая из множественных конструкций вакцина должна быть очень дорогой для производства и создания. Единственная конструкция,в дополнение к упрощению производственного процесса, может гарантировать эквивалентный захват компонентов антигенпредставляющей клеткой и, в свою очередь, вызывать широко специфический иммунный ответ. В одном конкретном аспекте настоящего изобретения рекомбинантный вирусный вектор с дефективной репликацией содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенную детерминанту, в котором указанная гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты является кодон-оптимизированной для повышенной экспрессии у млекопитающего, предпочтительно у человека. Кодон-оптимизация основана на необходимом общем содержании аминокислот, оптимальном использовании кодона у рассматриваемого млекопитающего и на ряде аспектов, которых нужно избежать для гарантии надлежащей экспрессии. Такими аспектами могут быть сплайс-донорные или -акцепторные сайты, терминирующие кодоны, Chi-сайты, поли(А)отрезки, GC- и АТ-богатые последовательности,внутренние ТАТА-боксы и т.д. Способы оптимизации кодона для хозяев-млекопитающих известны специалистам в данной области техники и могут быть найдены в нескольких источниках в литературе по молекулярной биологии. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному аденовирусному вектору с дефективной репликацией согласно изобретению, в котором содержание аденина плюс тимин в указанной гетерологичной нуклеиновой кислоте по сравнению с содержанием цитозина плюс гуанин составляет менее 87%, предпочтительно менее 80%, более предпочтительно менее 59% и наиболее предпочтительно равно примерно 45%. Изготовление рекомбинантных аденовирусных векторов, содержащих гетерологичные гены, хорошо известно в данной области техники и обычно охватывает использование клеточной линии с дефектом упаковки, адаптерных конструкций и космид и делецию, по меньшей мере, функциональной части Е 1-области аденовирусного генома (см. также ниже о системах упаковки и предпочтительных клеточных линиях). Вакцины настоящего изобретения обычно сохраняют в фармацевтически приемлемых носителях или наполнителях. Фармацевтически приемлемые носители или наполнители хорошо известны в данной области техники и широко применяются в многочисленных терапевтических продуктах. Предпочтительно применение носителей, которые хорошо работают в вакцинах. Более предпочтительно вакцины дополнительно содержат адъювант. В данной области техники известно, что адъюванты дополнительно-8 012037 усиливают иммунный ответ на применяемую антигенную детерминанту. Настоящее изобретение относится также к использованию комплекта согласно изобретению для терапии, профилактики или диагностики в лечении ТБ. Можно использовать рекомбинантные вирусные векторы, содержащие ТБ-антигены настоящего изобретения, для вакцинации, где они предназначены для применения в комбинации с БЦЖ. Также их можно применять в качестве примирующего агента или средства для бустер-иммунизации, соответственно, предшествующего вакцинации БЦЖ или после вакцинации, с целью повышения желательных иммунных ответов. Также можно предположить, что различные вирусные векторы, раскрываемые в настоящем изобретении, используются в примирующих-бустерных системах, в которых за одним вектором следует другой. Кроме того, векторы, содержащие связанные прямым образом антигены, можно объединять также с векторами, содержащими антигены, связанные сайтами протеаз. Также предполагается применение примирующих-бустерных систем, использующих один серотип аденовируса в качестве примирующего и другой серотип в качестве бустерного (выбираемого из предпочтительных человеческого,обезьяньего, собачьего или бычьего аденовирусов). Вирусные векторы согласно настоящему изобретению также можно использовать в комбинации с вакцинами, содержащими очищенные (рекомбинантно полученные) антигены, и/или с вакцинами, содержащими депротеинизированную ДНК или РНК, кодирующую сходные или те же самые антигены. Таким образом, настоящее изобретение относится к рекомбинантному аденовирусу с дефективной репликацией, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей два или более антигенов по меньшей мере из одной вызывающей туберкулез (ТБ) бациллы. Необходимо понимать, что полипептид может содержать несколько антигенных частей или антигенных фрагментов (=антигенов). Также сам белок может считаться "антигеном". Предпочтительно указанный рекомбинантный аденовирус представляет собой человеческий или обезьяний аденовирус. Более предпочтительно аденовирус,используемый в настоящем изобретении в качестве рекомбинантного вектора, выбирают из группы, состоящей из человеческих серотипов аденовируса Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 и Ad50. Вызывающие ТБ бациллы, используемые для обеспечения предпочтительного антигена (антигенов), предпочтительно представляют собой Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum и/или Mycobacterium bovis, и указанные два или более антигенов предпочтительно выбирают из группы, состоящей из кодируемых открытыми рамками считывания антигенов М. tuberculosis Ag85A, Ag85B, ESAT-6, f72 и ТВ 10.4. В очень предпочтительном варианте осуществления указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по меньшей мере два антигена, выбираемых из группы, состоящей из кодируемых открытыми рамками считывания антигенов М. tuberculosis Ag85A, Ag85B и ТВ 10.4. В наиболее предпочтительном варианте осуществления аденовирус согласно настоящему изобретению содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белки полной длины Ag85 А, Ag85 В и ТВ 10.4, в котором даже более предпочтительно, что эти три белка кодируются нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, в которой гены, кодирующие соответствующие белки, клонированы в порядке от 5'- к 3'концу (Ag85A-Ag85B-TB10.4). Настоящее изобретение относится к рекомбинантным аденовирусам согласно изобретению, в которых по меньшей мере два из указанных антигенов экспрессируются из одного полипротеина. В одном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере два из указанных антигенов связаны для образования слитого белка. Связь по меньшей мере с одной аминокислотой может являться прямой или посредством соединяющего линкера. Если для соединения двух раздельных антигенов используют линкер и таким образом обеспечивают слитый белок двух или более антигенов согласно настоящему изобретению, предпочтительно применение одного или более линкеров, соответствующих SEQ ID NO: 23. Настоящее изобретение также относится к поливалентной ТБ-вакцине, содержащей рекомбинантный аденовирус согласно изобретению или рекомбинантный полинуклеотидный вектор согласно изобретению,дополнительно содержащий фармацевтически приемлемый наполнитель и, необязательно, адъювант. В данной области техники известно множество фармацевтически приемлемых наполнителей и адъювантов. Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу вакцинации млекопитающего для предотвращения или лечения ТБ, включающему в себя введение указанному млекопитающему рекомбинантного аденовируса, поливалентной ТБ-вакцины или рекомбинантного полинуклеотидного вектора согласно изобретению. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу вакцинации млекопитающего для предотвращения или лечения ТБ, содержащему этапы введения указанному млекопитающему рекомбинантного аденовируса, поливалентной ТБ-вакцины или рекомбинантного полинуклеотидного вектора согласно изобретению в качестве примирующей вакцинации и введения указанному млекопитающему рекомбинантного аденовируса, поливалентной ТБ-вакцины или рекомбинантного полинуклеотидного вектора согласно изобретению в качестве бустер-иммунизации. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантному аденовирусу, поливалентной ТБ-вакцине или рекомбинантному полинуклеотидному вектору согласно изобретению как к применяемым или в качестве лекарства, предпочтительно для профилактики, терапии при лечении туберкулеза, или для диагностики туберкулеза. Настоящее изобретение также относится к использованию рекомбинантного аденовируса, поливалентной ТБ-вакцины или рекомбинантного полинуклеотидного вектора согласно изобретению для изготовления лекарства для-9 012037 профилактики или терапии при лечении туберкулеза. В одном конкретном аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному полинуклеотидному вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей два или более антигенов и сайт узнавания протеаз, в котором указанные антигены экспрессируются в виде полипротеинов, указанные полипротеины содержат сайт узнавания протеаз, разделяющий по меньшей мере два из двух или более антигенов. Предпочтительно указанный полинуклеотидный вектор представляет собой вектор депротеинизированной ДНК, депротеинизированной РНК, плазмиды или вирусный вектор. В предпочтительном варианте осуществления указанный вирусный вектор упакован в человеческий или обезьяний аденовирус с дефективной репликацией. Необходимо понимать, что вирусный вектор можно рассматривать как объект двух видов: кодирующую вирус вирусную ДНК можно использовать в качестве вектора нуклеиновой кислоты, тогда как вирус (содержащий ДНК вирусного вектора) можно использовать также для переноса рассматриваемой нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин посредством инфицирования указанной клетки-хозяина. Таким образом, используемый в настоящем изобретении термин "вектор" относится к средству переноса рассматриваемого гена или множественных генов в хозяин. Этого можно достичь путем прямого введения ДНК, РНК,плазмиды или вирусного вектора нуклеиновой кислоты, а также инфицированием клетки-хозяина рекомбинантным вирусом (который в этом случае действует как вектор). Как показано в примерах настоящего изобретения, можно использовать вирусы для иммунизации млекопитающих (например, мышей), тогда как ДНК (например, в виде адаптерной плазмиды, несущей рассматриваемый ген (гены) и части вирусной ДНК) также можно прямым образом вводить млекопитающему для иммунизации указанного млекопитающего. Вакцины на основе депротеинизированной ДНК или РНК или плазмид известны в данной области, в то время как вакцины на основе рекомбинантных вирусов также являются известными. С точки зрения ясности, в качестве "векторов" расцениваются все объекты, которые доставляют рассматриваемый один ген или больше генов в клетку-хозяин. В одном предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота, присутствующая в указанном векторе, содержит последовательность, кодирующую протеазу, при этом предпочтительно, чтобы указанная экспресированная протеаза экспрессировалась в виде части полипротеина и была связана по меньшей мере с одним из указанных антигенов посредством сайта узнавания протеаз. Особенно предпочтительный сайт узнавания протеаз содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 21 или 22. Более предпочтительным является рекомбинантный полинуклеотидный вектор согласно настоящему изобретению, в котором указанная протеаза происходит из вируса птичьего лейкоза (ALV). В предпочтительном аспекте антигены, которые связаны посредством сайта узнавания протеаз, происходят по меньшей мере от одной вызывающей туберкулез (ТБ) бациллы, указанная вызывающая ТБ бацилла предпочтительно представляет собой Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum и/или Mycobacteriumbovis. Два или более антигенов предпочтительно выбирают из группы, состоящей из кодируемых открытыми рамками считывания антигенов М. tuberculosis Ag85A, Ag85B, ESAT-6 и ТВ 10.4, в которой указанная гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты наиболее предпочтительно кодирует по меньшей мере два антигена, выбираемые из группы, состоящей из кодируемых открытыми рамками считывания антигенов M. tuberculosis Ag85A, Ag85B и ТВ 10.4. Наиболее предпочтительными являются полинуклеотиды согласно изобретению, в которых антигены представляют собой полипептиды полной длиныAg85A, Ag85B и ТВ 10.4, кодируемые гены которых клонированы в порядке от 5'- к 3'-концу. Слитые белки на основе этих и других антигенов туберкулеза были описаны в патентах США 5916558, WO 01/24820, WO 03/070187 и WO 2005/061534. Вместе с тем, не было раскрыто использование нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, кодирующих слитые белки, раскрытые в настоящем изобретении, для внедрения в рекомбинантные аденовирусные векторы. Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному полинуклеотидному вектору, содержащему гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген и генетический адъювант. Термин "генетический адъювант" относится к белковоподобной молекуле,кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты. Указанный антиген и указанный генетический адъювант могут быть связаны прямым образом или связаны опосредованно, как в другом варианте осуществления, например связью, содержащей первый сайт узнавания протеаз. В другом предпочтительном аспекте указанный полинуклеотидный вектор представляет собой вектор депротеинизированной ДНК,депротеинизированной РНК, плазмиды или вирусный вектор. Вирусный вектор предпочтительно упакован в человеческий или обезьяний аденовирус с дефективной репликацией, причем указанный аденовирус наиболее предпочтительно выбирают из группы, состоящей из человеческих аденовирусов серотиповAd11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 и Ad50. Также предпочтительными являются нуклеиновые кислоты, содержащие последовательности, кодирующие протеазу, в которых указанная протеаза предпочтительно связана с указанным антигеном и/или с указанным генетическим адъювантом посредством второго сайта узнавания протеаз. Предпочтительный второй сайт узнавания протеаз содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 22, тогда как предпочтительный первый сайт узнавания протеаз содержит последовательность соответствующую SEQ ID NO: 21. Предпочтительной протеазой является протеаза вируса птичьего лейкоза (ALV), в то время как антигены происходят предпочтительно от одной вызывающей туберкулез (ТБ) бациллы, более предпочтительно от Mycobacterium tuberculosis,- 10012037Mycobacterium africanum и/или Mycobacterium bovis. Предпочтительные антигены выбирают из группы,состоящей из Ag85A, Ag85B, ESAT-6 и ТВ 10.4. Наиболее предпочтительный вариант осуществления представляет собой вектор, в котором указанная гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по меньшей мере два антигена, выбираемых из группы, состоящей из антигенов М. tuberculosisAg85A, Ag85B и ТВ 10.4, в котором дополнительно предпочтительным является наличие слитого полипептида, содержащего белки полной длины Ag85 А, Ag85 В и ТВ 10.4, в порядке от N- до С-конца. Согласно раскрытию настоящего изобретения было неожиданно выявлено, что ТВ 10.4 обладает адъювантной активностью, поскольку он стимулирует иммунный ответ на другой антиген (особенноAg85 А), присутствующий в полипротеине. Предпочтительным генетическим адъювантом является адъювант ТВ 10.4. Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую ТВ 10.4-антиген, по меньшей мере с одним другим антигеном, который предпочтительно является антигеном туберкулеза, более предпочтительно антигеномAg85 А. В наиболее предпочтительном варианте осуществления вектор содержит нуклеиновую кислоту,кодирующую ТВ 10.4-антиген и по меньшей мере антигены Ag85 А и Ag85 В. Как отмечено ниже, предполагается, что ТВ 10.4 повышает процессирование продукта трансляции множественного антигена до протеосомы, что приводит к очень значительному усилению ответа CD8. Вероятно, эффект не ограничен только Ag85 А и ТВ 10.4, при более широкой применимости ТВ 10.4-антигена, а ограничен только туберкулезными вакцинами. Таким образом, настоящее изобретение еще в одном варианте осуществления также относится к рекомбинантным векторам, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую ТВ 10.4 и по меньшей мере один другой антиген, в которой другой антиген не является антигеномMycobacterium. Настоящее изобретение раскрывает использование ТВ 10.4-антигена Mycobacterium в качестве генетического адъюванта. Кроме того, настоящее изобретение раскрывает использование ТВ 10.4-антигена для производства лекарства для лечения, диагностики и/или профилактики заболевания,отличного от туберкулеза, и, по меньшей мере, для заболевания, в котором для иммунного ответа на рассматриваемый антиген необходима стимулирующая активность адъюванта. То есть в настоящем изобретении раскрыто, что антиген из ТВ 10.4, происходящий из Mycobacterium tuberculosis, может действовать как адъювант по отношению к другим антигенам, таким как Ag85A. Таким образом, настоящее изобретение также относится к использованию антигена ТВ 10.4 из Mycobacterium в качестве генетического адъюванта. Кроме того, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к использованию антигена ТВ 10.4 из Mycobacterium для изготовления лекарства для лечения или профилактики заболевания, при котором необходима стимуляция иммунного ответа хозяина на определенный антиген или рассматриваемый терапевтический компонент. Специалист в данной области техники сможет определить у субъекта, подвергаемого лечению, уровень иммунного ответа на данный рассматриваемый антиген и степень полезности дополнительной стимуляции с применением адъюванта, такого как генетический адъювант, показываемого в настоящем изобретении на примере ТВ 10.4. Настоящее изобретение дополнительно относится к рекомбинантному полинуклеотидному вектору согласно настоящему изобретению, в котором указанный генетический адъювант содержит холерный токсин (CtxA1) или его мутантное производное, содержащее замену серина на лизин в 63 аминокислотном положении (А 1K63). Настоящее изобретение также относится к поливалентной ТБ-вакцине, содержащей рекомбинантный полинуклеотидный вектор согласно изобретению, дополнительно содержащий фармацевтически приемлемый наполнитель и, необязательно, адъювант. Примеры Пример 1. Конструкция адаптерных плазмид на основе Ad35, несущих антигены М. tuberculosis. Приведено описание конструирования адаптерных плазмид, подходящих для создания векторов на основе Ad35 с делецией Е 1, способных к экспрессии единственных или множественных ТБ-антигенов. Примеры относятся к ТБ-антигенам Ag85A (Swissprot Р 17944), Ag85 В (Swissprot P31952) и ТВ 10.4(Swissprot 053693) и являются примерами средств и способов создания вакцинных препаратов с единственным и множественными антигенами с использованием векторов с дефективной репликацией на основе аденовирусов, не ограничивающими объем настоящего изобретения. Как утверждается выше, принципы, применяемые в настоящем изобретении, также можно применять к любой комбинации профилактических или терапевтических полипептидов. Конструирование pAdApt35Bsu.myc. Адаптерная плазмида pAdApt35Bsu описана в патентной заявке WO 2004/001032. Эта плазмида содержит левую часть генома Ad35 (включающую в себя левый инвертированный терминальный повтор(ITR, дополнительно не имеющего функциональной E1-области, и кассеты экспрессии, содержащиеCMV-промотор, вставленный в E1-область. Адаптер также содержит функциональный промотор pIX и область Ad35, расположенную ниже E1-области, которая, в свою очередь, достаточна, чтобы происходила гомологичная рекомбинация с содержащей космиду остальной частью генома Ad35, что приводит к созданию рекомбинантного аденовируса с дефективной репликацией в клетке с дефектом упаковки, которая обеспечивает все необходимые элементы и функции для функциональной репликации и упаковки продуцируемого вируса. Создание рекомбинантных аденовирусов с применением таких адаптерных плазмид является методикой, хорошо известной специалисту в данной области техники.PAdApt35Bsu расщепляли с NheI и XbaI и содержащий вектор фрагмент 5 kb выделяли из агарозного геля с использованием набора Qiaquick для выделения геля (Qiagen) согласно инструкциям изготовителя. Двунитевой (ds) линкер изготовляли из следующих однонитевых (ss) олиго- (синтезируемыхTTC TGC TCG GTT TTC TTG-3' (SEQ ID NO: 2). Эти два олигонуклеотида смешивали, используя из 20 мкл общего объема гибридизационного буфера (10 мМ Трис-HCl с уровнем рН 7,9, 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола) 2 мкл из исходного раствора 0,5 мкг/мкл, инкубировали при 98 С в течение 2 мин и затем охлаждали до 4 С при скорости охлаждения 0,6 С/мин, используя ПЦР-оборудование. Получаемый ds-линкер затем лигировали в вышеуказанный подготовленный вектор pAdApt35Bsu с 3-, 6- или 9-кратным молярным избытком линкера. Тестировали колонии на правильную ориентацию вставки линкерной последовательности расщеплением с NheI или XbaI, то есть сайтов, которые восстанавливаются только в правильной ориентации. Секвенирование подтверждало, что линкер состоит из ожидаемой последовательности. Получаемая адаптерная плазмида имела название pAdApt35Bsu.myc (фиг. 1). Ниже приводятся способы, обеспечиваемые для клонирования большого набора различных конструкций. Краткий обзор всех конструкций и их соответствующих вставок приведен в табл. 1. Таблица 1 Названия конструкций и их соответствующих вставок, содержащих нуклеиновые кислоты,кодирующие ТБ-антигены. ALV=протеаза вируса птичьего лейкоза; dig=сайт узнавания протеаз,распознаваемый клеточной протеазой; dig=сайт узнавания протеаз, распознаваемый ALV протеазой; Х=шарнирный линкер, не являющийся сайтом узнавания протеаз; myc=myc-tag Конструирование pAdApt35Bsu на основе адаптерных плазмид, содержащих три ТБ-антигена Гетерологичные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения кодируют три антигена М. tuberculosisAg85A, Ag85B и ТВ 10.4 в виде полипротеина из одной иРНК. Все слитые последовательности, отмеченные "М", содержат myc-эпитоп (myc-tag: SKKTEQKLISEEDL; SEQ ID NO: 9), присоединены к 3'-концу последовательности, чтобы иметь возможность анализировать экспрессию с использованием myc-специфических антител в случае, если специфические для раздельных ТБ-антигенов антитела должным образом не распознают слияния. Таким образом, "М" в названиях всех нижеописанных конструкций относится к myc-tag, также принимая во внимание, что все конструкции были созданы без myc-tag. В первом варианте осуществления (TB-SM) эти три антигена экспрессируются в виде слитых прямым образом полипротеинов: Ag85A-Ag85B-TB10.4-myc (TB-S=Ag85A-Ag85B-TB10.4). Во втором варианте осуществления (TB-LM) полипротеиновый предшественник содержит протеазу, которая внутриклеточно расщепляет эти три антигена на внедренных сайтах усвоения, разделяющих их: последовательность линкерного сайта/сайта расщепления: PPSKSKKGGAAAMSSAIQPLVMAVVNRERDGQTG(SEQ ID NO: 21). Это расщепление происходит посредством протеазы специфической последовательности,слитой с N-концом слитого белка. Эта протеаза, полученная из gag-гена вируса птичьего лейкоза (ALV), также расщеплена, что приводит к образованию четырех отдельных белков после расщепления протеазой. Полипротеины могут быть следующими: ALV-dig-Ag85A-dig-Ag85B-dig-TB10.4-myc (в котором "dig" относится к сайту расщепления, разделяющему протеазу с антигенами [GSSGPWPAPEPPAVSLAMTMEHRDRPLV;SEQ ID NO: 22] протеазы и "dig" относится к сайту расщепления между антигенами, см. выше; TB-L=ALVdig-AG85A-dig-AG85B-dig-TB10.4). В векторах настоящего изобретения можно использовать как расщепляемые протеазами линкеры, так и саморасщепляющиеся линкеры, и они входят в объем настоящего изобретения. Использование самопроцессирующихся сайтов расщепления было описано в патенте WO 2005/017149. В третьем варианте осуществления полипротеин (TB-FLM) содержит упомянутые антигены М. tuberculosis,разделенные линкерной последовательностью, которая не является расщепленной (как во втором варианте осуществления, описанном выше), но способствует нормальной и независимой укладке каждого из этих трех антигенов: Ag85A-X-Ag85B-X-TB10.4-myc (в котором "X" относится к шарнирному линкеру:GTGGSGGTGSGTGGSV; SEQ ID NO: 23). Все эти слитые белки (упоминаемые, соответственно, как ТВ-S,TB-L и TB-FL) также были созданы без myc-tag с использованием сходных способов конструирования(см. ниже). Сборку желательных белковых последовательностей осуществляли с использованием вышеуказанных опубликованных белковых последовательностей для антигенов М. tuberculosis, последовательностиPR p15 ALV протеазы согласно публикации Genbank (Acc. No. CAA86524) и сайта расщепления протеаз согласно Genbank Acc. No. AAK13202, аминокислоты 476-500. Затем эти три белковых последовательности подвергали обратной трансляции до последовательностей, кодирующих ДНК, оптимизированных для экспрессии у людей и после этого синтезированных, собранных и клонированных в векторы pCRScript vectors Geneart (Германия). Обеспечены кодон-оптимизированные ДНК последовательности TB-LM (фиг. 19; SEQ ID NO: 3),TB-SM (фиг. 20; SEQ ID NO: 4) и TB-FLM (фиг. 21; SEQ ID NO: 5), а также белковые последовательности TB-LM (фиг. 22; SEQ ID NO: 6), TB-SM (фиг. 23; SEQ ID NO: 7) и TB-FLM (фиг. 24; SEQ ID NO: 8). В пределах С-концевой последовательности SKKTEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 9) содержится myc-эпитоп в каждом из слитых белков, и указанная последовательность в случае TB-L, TB-S и TB-FL, соответственно, не присутствует. Клонированные слитые гены затем расщепляли с HindIII, XbaI и ApaLI, после чего фрагменты 2,7 kb(TB-L), 2,2 kb (TB-FL) и 2,1 kb TB-S выделяли из агарозного геля согласно вышеприведенному описанию. Расщепление ApaLI проводили для расщепления плазмидного вектора во фрагментах, которые лучше отделялись от вставок. Плазмиду pAdApt35Bsu также расщепляли с HindIII и XbaI и содержащий вектор фрагмент выделяли из геля, как описано выше. Выделенный вектор pAdApt35Bsu лигировали в раздельных реакциях в каждый из изолированных фрагментов, содержащих ТВ последовательности, и трансформировали в компетентные бактерии DH5 (Invitrogen). Получаемые колонии анализировали расщеплением с HindIII и XbaI и выбирали плазмидные клоны, содержащие ожидаемую вставку. Это приводило к получениюpAdApt35Bsu.TB.LM (фиг. 2), pAdApt35Bsu.TB.SM (фиг. 3) и pAdApt35Bsu.TB.FLM (фиг. 4), все из которых содержали myc-tag. Для создания адаптерных плазмид без myc-tag, экспрессирующих слитые гены, вставки представляли собой первую ПЦР-амплификацию с использованием следующих праймеров и матриц. Фрагмент TB-L.ALVprot.FW: 5'-GCC CAA GCT TGC CAC CAT GCT GGC CAT GAC CAT GG -3' (SEQ ID NO: 10),и 10.4.RE.stop: 5'-GCT AGT СТА GAT TAT CAG CCG CCC CAC TTG GC-3' (SEQ ID NO: 11) с TB-LM в качестве матрицы. Фрагменты TB-FL и TB-S. 85A.FW: 5'-GCC CAA GCT TGC CAC CAT GTT CAG C-3' (SEQ ID NO: 12), и 10.4.RE.stop с TBFLM или TB-SM в качестве матрицы. Амплификацию проводили с ДНК полимеразой Phusion (Bioke) согласно инструкциям изготовителя. Использовали следующую схему: 2 мин при 98 С с последующими 30 циклами (20 с при 98 С, 30 с при 58 С и 2 мин+30 с при 72 С), и заканчивали 10 мин при 72 С. Полученные фрагменты очищали с использованием очищающего набора Qiaquick PCR (Qiagen) и расщепляли с HindIII и XbaI. Затем расщепленные фрагменты снова очищали на очистительной колонке Qiaquick PCR, как указано выше, и лигировали в pAdApt35Bsu, расщепленный теми же ферментами и очищенный на очистительной колонкеQiaquick PCR. Трансформация в компетентные бактерии DH5 (Invitrogen) и выбор клонов, содержащих правильные вставки с использованием в качестве диагностических ферментов HindIII и XbaI, приводили к получению pAdApt35Bsu.TB-L, pAdApt35Bsu.TB-S и pAdApt35Bsu.TB-FL. Эти конструкции отличаются от конструкций, представленных на фиг. 2, 3 и 4, в которых они на С-конце не содержат myc-эпитоп. Конструирование pAdApt35Bsu на основе адаптерных плазмид, содержащих два ТВ-антигена В этом разделе в качестве примера также описано конструирование адаптерных плазмид, содержащих два ТБ-антигена, использующих Ag85 А и Ag85 В. Для рядового специалиста в данной области техники будет очевидна возможность создания других комбинаций и различного порядка антигенов М. tuberculosis,используя выделяемую в настоящем изобретении общую стратегию. Слияния, которые здесь описаны,представляют собой ТВ-3 М: ALV-dig-Ag85A-dig-Ag85B-myc, и ТВ-4 М: Ag85A-Ag85B-myc, и те же конструкции без myc-tag. Были разработаны специфические праймеры для амплификации последовательностей Ag85 А и Ag85 В из вышеуказанных слитых белков TB-LM и TB-SM (см. ниже). Слияния созда- 13012037 вали с myc-tag и без нее (ТВ-3 и ТВ-4, соответственно), как указано выше. В этом случае применяли различные наборы праймеров и матриц. Фрагмент ТВ.3 М.ALVprot.FW и 85 В.RE myc: 5'-GCC TAG СТА GCG CCG GCT ССС AGG CTG С-3' (SEQ ID NO: 13) с TB-LM в качестве матрицы. Фрагмент ТВ.4 М. 85A.FW.TB.L: 5'-GCC CAA GCT TGC CAC CAT GTT CAG CAG АСС CGG ССТ G -3' (SEQ ID NO: 14),и 85 В.RE myc (см. выше) с TB-SM в качестве матрицы. Все реакции проводили с использованием ДНК полимеразы Phusion (Bioke) при описанных выше условиях. ПЦР-фрагменты очищали с применением очищающего набора Qiaquick PCR (Qiagen), расщепляли с HindIII и NheI и снова очищали на очищающей колонке Qiaquick PCR. После этого амплифицированные фрагменты лигировали в плазмиду pAdApt35Bsu.myc, которую расщепляли этими же ферментами. После трансформации в компетентные DH5 бактерии (Invitrogen) выбирали клоны, содержащие вставку правильной длины. Это приводило к получению конструкции pAdApt35Bsu.ТВ.3 М (фиг. 5) иpAdApt35Bsu.TB.4M (фиг. 6). Фрагменты ТВ.3 и ТВ.4 изготовляли с применением тех же прямых праймеров и матриц, указанных выше для фрагментов ТВ.3 М и ТВ.4 М, но с использованием различных обратных праймеров, называемых 85 В.RE.stop: 5'-GCT AGT СТА GAT TAT CAG CCG GCT ССС AGG CTG С-3' (SEQ ID NO: 15). Амплифицированные фрагменты очищали, как указано выше, расщепляли с HindIII и XbaI, и повторно очищали, как описано в данном примере, и клонировали в pAdApt35Bsu, используя HindIII и XbaI в качестве сайтов клонирования. Это в результате приводило к получению pAdApt35Bsu.ТВ.3 и pAdApt35Bsu.ТВ.4,которые отличаются от конструкции фиг. 5 и 6 только тем, что они не имеют каких-либо myc-эпитопов на С-конце. Ниже приведены другие комбинации, которые могут быть полезны, но не описаны в подробных процедурах клонирования: Все отметки dig, dig, myc и X относятся к тем же признакам, как отмечено выше. Необходимо понимать, что эти конструкции также можно изготовлять без myc-tag.- 14012037 Конструирование pAdApt35Bsu на основе адаптерных плазмид,содержащих единственные ТБ-антигены В этом разделе также описаны адаптерные плазмиды Ad35, содержащие единственные ТБ-антигены. Как указано выше, белки экспрессируются с myc-tag или без нее. К этому были амплифицированы подходящие области кодирования из TB-L и TB-S матриц с применением наборов специфических праймеров. Фрагмент ТВ.5 М. 85A.FW.TB.L и 85A.RE myc: 5'-GCC TAG СТА GCG CCC TGG GGG G-3' (SEQ ID NO: 16), использующий TB-LM в качестве матрицы. Фрагмент ТВ.6 М. 85 В.FW: 5'-GCC CAA GCT TGC CAC CAT GTT CAG CCG GCC TGG ССТ G-3' (SEQ ID NO: 17), и 85 В.RE myc, использующий TB-LM в качестве матрицы. Фрагмент ТВ.7 М. 10.4.FW: 5'-GCC CAA GCT TGC CAC CAT GAG CCA GAT CAT GTA CAA СТА CCC-3' (SEQ IDNO: 18), и 10.4.RE myc: 5'-GCT AGT СТА GAT TAT CAC AGG TCC TCC TCG -3' (SEQ ID NO: 19), использующий TB-LM в качестве матрицы. Фрагменты без myc-tag создавали с теми же прямыми праймерами, но с различными обратными праймерами. 85A.RE.stop (для ТВ.5): 5'-GCT AGT СТА GAT TAT CAG CCC TGG GGG GCA G-3' (SEQID NO: 20), 85 В.RE.stop (для ТВ.6) и 10.4. RE.stop (для ТВ.7). Все реакции проводили с Phusion (Bioke),как описано выше. Все амплифицированные фрагменты очищали, используя очищающий набор QiaquickPCR (Qiagen). После этого фрагменты ТВ-5 М и ТВ-6 М расщепляли с HindIII и NheI и после очистки согласно вышеприведенному описанию клонировали в pAdApt35Bsu.myc, расщепленный теми же ферментами. Фрагменты ТВ-7 М, ТВ-5, ТВ-6 и ТВ-7 расщепляли с HindIII и XbaI. После очистки согласно вышеприведенному описанию фрагменты лигировали в pAdApt35Bsu, расщепляли с указанными ферментами рестрикции. Это приводило к получению pAdApt35Bsu.ТВ. 5 М (фиг. 7), pAdApt35Bsu.TB.6M (фиг. 8),pAdApt35Bsu.ТВ.7 М (фиг. 9), pAdApt35Bsu.TB.5, pAdApt35Bsu.ТВ.6 и pAdApt35Bsu.ТВ.7. Последние три отличаются от указанных на фиг. 7, 8 и 9 только тем, что нет каких-либо myc-tag на в С-конце. Пример 2. Создание Ad35 вирусов с дефективной репликацией, несущих нуклеиновые кислоты, кодирующие ТБ-антигены. Специалисту в данной области техники известны способы создания устойчивых рекомбинантных аденовирусных векторов с дефективной репликацией на основе ad35, несущих гетерологичные кассеты экспрессия, и ранее эти способы были описаны в опубликованных патентных заявках WO 00/70071, WO 02/40665, WO 03/104467 и WO 2004/001032. Этот пример описывает создание ТБ-векторов на основеAd35 с использованием клеток PER.C6 и Ad35-вирусов, содержащих гены E4-Orf6 и E4-Orf6/7, происходящие из Ad5, замещающие гомологичные последовательности E4-Orf6 и 6/7 в скелете Ad35 (в общем,согласно описанию в патентах WO 03/104467 и WO 2004/001032). Для задач настоящего изобретения клетки PER.C6 относятся к клеткам, аналогичным депонированным 29 февраля 1996 как патентный депозит под номером 96022940 в Европейской Коллекции клеточных культур (ЕСАСС) в Центре прикладной микробиологии и исследований (Centre of Applied MicrobiologyResearch (CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Великобритания. Изготовленные адаптерные плазмиды, описываемые в настоящем изобретении, содержащие различные ТВ-антигены, расщепляли с Pi-PspI для высвобождения последовательности Ad35 и трансгенной кассетыWO 03/104467 и WO 2004/001032) расщепляли с Pad и NotI (фрагмент 3). Для инактивации ферментов смесь расщепленных ДНК инкубировали при 65 С. Для каждой трансфекции расщепленный адаптерный фрагмент (360 нг), фрагмент 2 (1,4 мкг) и фрагмент 3 (1 мкг) смешивали до объема (максимального) 15 мкл и доводили до 25 мкл культуральной средой Игла в модификации Дульбекко DMEM (Invitrogen). Вторую смесь подготовливали смешиванием 14,4 мкл липофектамина (Invitrogen) с 10,6 мкл DMEM, после чего обе смеси совместно добавляли и смешивали проколом пробирки. Затем получаемую смесь ДНК-липофектамин инкубировали от 30 до 40 мин при комнатной температуре, после чего в пробирку добавляли 4,5 мл DMEM. Во время инкубирования клетки PER.C6, которые засевали за 1 день в 6-луночные планшеты в количестве 1,510 клеток/на лунку в DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сывороткиFBS (Invitrogen/GIBCO) и 10 мм MgCl2, промывали с DMEM. Затем в первые две лунки добавляли 0,5 млDMEM и 0,5 мл инкубированной трансфекционной смеси. Во вторые две лунки добавляли 0,25 мл среды и 0,75 мл трансфекционной смеси. В последние два лунки добавляли 1 мл трансфекционной смеси. Затем 6-луночные планшеты инкубировали при условиях 37 С и 10% СО 2 в течение 4 ч, после чего верхний слой агара размещали следующим образом. За 30 мин до конца 4 ч периода инкубации подготавливали смесь, содержащую 9 мл 2 МЕМ (Invitrogen), 0,36 мл FBS, 0,18 мл 1 М MgCl2 и 1,3 мл PBS, и помещали ее в инкубатор при 37 С. Предварительно сделанный стерильный раствор 2,5% агарозы (Seaplaque; Cambrex) в Н 2 О оттаивали и также сохраняли при 37 С (по меньшей мере в течение 15 мин до использования). За- 15012037 тем удаляли из клеток трансфекционную среду и клетки однократно промывали фосфатно-буферным раствором ФБР. Затем добавляли 7,5 мл раствора агара к смеси среды MEM, смешивали и в каждую лунку быстро добавляли 3 мл. Затем допускали коагуляцию в потоке верхнего слоя, после чего планшеты инкубировали при 37 С и 10% СО 2 в течение по меньшей мере 7 дней. При достаточно большом количестве из лунок с самым низким количеством бляшек собирали единственные бляшки с использованием пипеток с наконечником со стерильным фильтром (20 мкл). Каждую собранную бляшку смешивали с 200 мкл культуральной среды и использовали 100 мкл этой смеси для инокуляции клеток PER.C6 в 6-луночных планшетах. После СРЕ и после еще одной амплификации вирусов на клетках PER.C6 клетки и среду собирали во флаконы Т 25, и однократно замораживали/оттаивали, и сохраняли в виде сырых лизатов. Эти исходные растворы вирусов использовали для подтверждения присутствия правильного ПЦРтрансгена на изолированном вирусе ДНК и для проверки экспрессии. Затем выбирали одну из амплифицированных бляшек для создания вирусных маточных растворов и для изготовления партий очищенного вируса согласно методикам, известным в данной области техники, используя двухэтапный способ очистки CsCl. Обычно концентрацию очищенных вирусов определяли высокоэффективной жидкостной хроматографией ВЭЖХ, как описано авторами Shabram et al. (1997). Пример 3. Анализ экспрессии ТБ-антигенов после инфицирования вирусными векторами Ad35. Экспрессию слитых ТБ-антигенов определяли вестерн-блоттингом. Для этого клетки А 549 инфицировали различными вирусами Ad35, содержащими гены, кодирующие ТБ-антигены. Через 48 ч после инфицирования клетки дважды промывали ФБР (NPBI), лизировали и очищали в лизирующем буфере(20 мМ Трис-HCl, уровень рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,5% DOC, 1% Tween-20 в dH2O с добавлением 1% додецилсульфата натрия SDS и ингибитора протеазы, добавленного в виде таблетки (Roche. После 5-10 мин в лизирующем буфере на льду собирали лизаты и очищали центрифугированием. Равные количества цельноклеточных экстрактов фракционировали с использованием 4-12% гелей Bis-Tris NuPAGE Pre-CastGels (Invitrogen). Белки переносили на мембраны Immobilon-P (Millipore) и инкубировали с поликлональным антителом, направленным на культуральный фильтрат белка М. tuberculosis. На кроликах выполняли подъем этой поликлональной сыворотки против культуры М. tuberculosis, содержащей секретируемые белки. В принципе, поликлональная сыворотка содержит антитела против Ag85A, Ag85B и ТВ 10.4, все из которых являются секретируемыми белками. Вторичным антителом являлось коньюгированное с пероксидазой хрена-анти-козье кроличье антитело (Biorad). Методику вестерн-блоттинга и инкубирования выполняли согласно общепринятым способам, известным в данной области техники. Комплексы визуализировали системой выявления ECL (Amersham) согласно протоколу изготовителя. Фиг. 10 А показывает результаты использования вирусов Ad35, несущих кодирующие ТБ нуклеиновые кислоты, включающие в себя myc-эпитоп, согласно описанию настоящего изобретения. Разные строки на фиг. 10 А показывают разные используемые вирусные векторы, и в табл. 1 указано, какие названия соотносятся к той или иной вставке. Таким же образом измеряли экспрессию ТБ-антигенов из вирусов Ad35, не содержащих myc-эпитоп (фиг. 10 В). Фиг. 10 С показывает сходный результат с обозначенным справа молекулярным весом. Таким способом определяли специфические ТБ-белки (слитые),экспрессируемые из вирусов Ad35, и, дополнительно, некоторые продукты расщепления ТВ-3 и TB-L. Из фиг. 10 А можно сделать вывод, что экспрессируется полипротеин, включающий все три ТБ-антигена,поскольку в строке TB-LM присутствует более высокая полоса по сравнению с ТВ-3 М (и полоса в строкеTB-S выше, чем специфическая полоса в ТВ-4 М). Поскольку ТВ 10.4, в основном, является С-концевым полипептидом в TB-LM и TB-SM полипротеинах, это указывает на трансляцию всех полипротеинов. Также отмечено, что расщепление является незавершенным, хотя продукты расщепления можно заметить в строках ТВ-ЗМ и TB-LM. Антигены Ag85 А и Ag85 В (строки ТВ-5 (М) и ТВ-6 (М), соответственно) являются экспрессируемыми. В строках ТВ-7 (М), относящихся к ТВ 10.4-антигену, не выявлено какого-либо специфического окрашивания. Причиной этого может быть неузнавание антигена в ходе вестерн-блоттинга поликлональными CFP (цианофлуоресцентными белками), в то время как это также может происходить из-за утечки белка из геля или слабой экспрессии в клетках А 549, если он присутствует в единственной экспрессирующей конструкции (ТВ-7 М), а не в тройной конструкции (как TB-LM, TB-L и TB-S). На фиг. 10 А в строке TB-LM заметна слегка более короткая полоса под самой высокой (вероятно, нерасщепленной) полосой. Предполагается, что это расщепление ТВ 10.4-антигена из остальной части полипротеина. Дальнейшие эксперименты должны показать физическое присутствие белка, хотя ясно, что ТВ 10.4 антиген способствует иммунному ответу (см. ниже), убедительно указывая на присутствие и активное вовлечение антигена в иммунный ответ. Пример 4. Иммуногенность векторов, кодирующих антигены М. tuberculosis у мышей. Вначале изучали иммуногенность адаптерных плазмид, как описано в примере 1 (конструкции ДНК) у мышей. Конструкции кодировали один, два или три ТБ-антигена: Ag85 А, Ag85 В и ТВ 10.4. Дизайн конструкции ДНК, кодирующих множественные ТБ-антигены, осуществляли двумя способами, как описано выше, то есть экспрессией полипротеина, содержащего прямые слияния, не содержащие mycметку, и экспрессией полипротеина, содержащего последовательность, кодирующую протеазу и сайт- 16012037 узнавания протеаз, что приводило к расщеплению полипротеина (также не содержащего myc-метку) в дискретные полипептиды. Использовали следующие конструкции ДНК (см. пример 1). Конструкции единственного антигена. ТВ-5 (Ag85 А), ТВ-6 (Ag85 В) и ТВ-7 (ТВ 10.4). Конструкции двойного антигена. Прямые слияния ТВ-3 (ALV-dig-AG85A-dig-AG85B) и ТВ-4 (Ag85 А-Ag85 В). Конструкции тройного антигена. Прямые слияния TB-L (ALV-dig-AG85A-dig-AG85B-dig-TB10.4) и TB-S (Ag85 А-Ag85 В-ТВ 10.4 направляют слияние). Схема эксперимента приведена на фиг. 11. Семь групп мышей иммунизировали отдельными ТБконструкциями ДНК (см. ниже два эксперимента). Для каждой иммунизации внутримышечно 3 раза вводили ДНК (350 мкг) с интервалами в 2,5 недели. В качестве отрицательного контроля одна группа мышей получала ФБР, введенный 3 раза. Дополнительной контрольной группе вводили подкожно единственную дозу 6105 колониеобразующих единиц КОЕ БЦЖ (штамм SSI1331). Через 1 неделю после последней ДНК-иммунизации и через 6 недель после БЦЖ-иммунизации мышей забивали. Селезенку выделяли в качестве источника клеток для клеточного иммунологического анализа. Сыворотку, необходимую для анализа гуморального ответа, собирали пункцией сердца и объединяли на группу. Уровень специфического клеточного иммунного ответа определяли, используя внутриклеточное окрашивание IFN (ICS) в анализе FACS клеточным сортером с возбуждением флуоресценции, путем измерения частоты спленоцитов IFN+ CD4+ и IFN+ CD8+ после рестимуляции in vitro пептидным пулом соответствующих антигенов. Иммунную сыворотку тестировали, применяя иммунофлуоресценцию клеток А 549, трансдуцированных аденовирусом, кодирующим соответствующий антиген. Проводили два независимых эксперимента по иммунизации. Для первого эксперимента использовали по 3 мыши на группу и отдельно у каждой мыши анализировали иммунную реакцию. Для второго эксперимента для иммунизации ДНК использовали по 8 мышей на группу и по 4 мыши на группу для контрольных иммунизаций. После стимуляции in vitro пептидами образцы мышей попарно из одной и той же группы объединяли и окрашивали для FACS анализа. Сходные результаты получали в обоих экспериментах и данные объединяли для статистического анализа. Внутриклеточное окрашивание IFN (ICS) выполняли следующим образом. Спленоциты (в количестве 106 на лунку в 96-луночной планшете) стимулировали, как указано, дважды соответствующим пептидным пулом (конечная концентрация составляла 2 мкг/мл на пептид) в присутствии костимулирующих антител: антимышиного антитела CD49d и антимышиного антитела CD28 (Pharmingen) в конечном разведении 1:1000. Пептидные пулы состояли из 15-мерных пептидов, охватывающих целые антигены, с 10 мерными (Ag84 В) или 11-мерными (Ag85 А, ТВ 10.4) перекрывающимися последовательностями, или отрегулированными для Ag85 В с пептидом p1 и р 2 из Ag85 А, как указано ниже, в примерах 6 и 7. Образцы от иммунизированных БЦЖ и ФБР мышей стимулировали дополнительно CFP (культуральный фильтрат белка; конечная концентрация 10 мкг/мл) и PPD (очищенное белковое производное; конечная концентрация 10 мкг/мл), которые являются антигенами, обычно используемыми для стимуляции in vitro при иммунизации БЦЖ. В качестве положительного контроля образцы стимулировали с форболмиристатацетатом ФМА/иономицином (конечные концентрации: 50 нг/мл и 2 мкг/мл, соответственно), в то время как инкубирование со средой служило отрицательным контролем (без стимуляции). После 1 ч стимуляции при 37 С добавляли блокатор секреции GolgiPlug (Pharmingen; конечное разведение 1:200) и продолжали инкубирование в течение 5 ч дополнительного времени. Соответствующие двойные образцы объединяли и обрабатывали для FACS анализа. Кратко, клетки промывали ФБР, содержащим 0,5% альбумин бычьей сыворотки BSA, и инкубировали с блокатором FcR (Pharmingen; разведение 1:50) в течение 10 мин на льду. После этапа промывания клетки инкубировали с CD4-FITC (Pharmingen; разведение 1:250) и CD8-АРС (Pharmingen; разведение 1:50) в течение 30 мин на льду. После фиксации промытых клеток их пермеабилизовали с Cytofix/Cytoperm (Pharmingen) в течение 20 мин на льду с последующим этапом промывания Perm/Wash буфером (Pharmingen). Выполняли внутриклеточное окрашивание IFN с использованием анти-IFN-PE (Pharmingen; разведение 1:100) в течение 30 мин на льду. После последних промывочных этапов клетки ресуспендировали в CellFix (BD) и анализировали с использованием проточного цитометра. Измерение проводили по меньшей мере на 10000 CD8+ клетках для каждого отдельного образца. Результаты выражены в виде процентного содержания клеток CD4+ или CD8+, экспрессирующих IFN. Обзор рестимуляции образцов in vitro приведен в табл. 2. Результаты ICS представлены на фиг. 12-16.- 17012037 Таблица 2 Обзор рестимуляции образцов in vitro Фиг. 12 А и В показывают, что в отсутствие стимуляции клеток исходные уровни были очень низкими. Фиг. 13 А показывает высокую частоту спленоцитов IFN+ CD4 + после стимуляции пептидным пулом Ag85 А. Наблюдается отчетливая кросс-реактивность с клетками CD4+, полученными от мышей,которым вводили конструкцию, содержащую ген, кодирующий Ag85 В, что не являлось неожиданностью в силу высокой структурной гомологии между Ag85 А и Ag85 В. В отличие от результатов, выявленных у клеток CD4+, не было обнаружено какой-либо стимуляции спленоцитов CD8+ (см. фиг. 13 В) из клеток от мышей, которым вводили конструкции, кодирующие или Ag85 А единственный, или в соединении сIFN+ CD8+ в спленоцитах мышей, которым вводили тройные конструкции TB-L и TB-S, что ясно указывало на важную роль дополнительного антигена (ТВ 10.4), присутствующего в этих конструкциях. Из этой схемы очевидно, что ТВ 10.4 антиген способен значительно повышать частоту спленоцитов CD8+,реактивных к пептидам Ag85 А, при том, что Ag85 А единственный (или в комбинации с Ag85 В) не обеспечивает каких-либо ответов. Фиг. 14 А показывает, что во всех схемах, где присутствовал Ag85 В, он был способен повышать частоту спленоцитов IFN+ CD4+, в то время как эффект на спленоциты IFN+CD8+ был минимальным (см. фиг. 14 В). Также при этом выявлена кросс-реактивность между Ag85 В иAg85 А (фиг. 14 А), как обсуждалось выше. Фиг. 15 А показывает выявление частоты спленоцитов IFN+CD4+, отвечающих на связанный с пептидным пулом ТВ 10.4, и не было найдено каких-либо существующих отличий у мышей, которым вводили или единственную конструкцию ТВ 10.4, или конструкцию, содержащую тройные вставки. Вместе с тем, как показано на фиг. 15 В, частота спленоцитов IFN+ CD8+ у мышей, которым вводили конструкции, содержащие ген, кодирующий антиген ТВ 10.4, значительно повышается при стимуляции пептидами, относящимися к ТВ 10.4, в особенности в составе тройных вставок(примечание: ось Y показывает, что, в среднем, 1,5% спленоцитов были реактивными). Результаты суммированы на фиг. 16 А (тройная вставка в TB-L: с протеазой и сайтом расщепления протеаз) и на фиг. 16 В(TB-S: антигены, связанные прямым образом). Понятно, что различные антигены различным образом способствуют иммунному ответу: Ag85 А индуцирует ответы и CD4 и CD8; Ag85 В индуцирует только сильный ответ CD4 и почти не индуцирует любой ответ CD8. В отличие от Ag85B, TB10.4 антиген вызывает сильный ответ CD8 и незначительный ответ CD4. Это указывает на убедительный выгодный вспомогательный эффект различных антигенов, кодируемых последовательностями, присутствующими в тройных вставках. Иммунизация БЦЖ не приводила к существенным реакциям ICS. Вместе с тем, спленоциты иммунизированных БЦЖ мышей продуцировали высокие уровни IFN после стимуляции в течение 72 ч с CFP или PPD, что определяли применением IFN набора для твердофазного иммуноферментного анализаELISA, показывающего эффективность иммунизации мышей (данные не показаны). Для определения фактического повышения каких-либо антигенспецифических антител у мышей,которым вводили различные конструкции ДНК, в клетки А 549 трансдуцировали рекомбинантные аденовирусы Ad35, кодирующие ТБ-антигены в 96-луночной планшете. Аденовирусы изготовляли согласно описанию примера 2. Для этого клетки в количестве 1104 засевали в лунки и вирусы инфицировали множеством инфекций 5000. Через 2 дня после инфицирования клетки фиксировали Cytofix/Cytoperm (20 мин при 40 С) с последующим этапом промывания буфером Perm/Wash. Клетки инкубировали с иммунной мышиной сывороткой, разведенной 1:2 в буфере Perm/Wash, в течение 1 ч при 37 С. После промывания добавляли антимышиную козью FITC, разведенную 1:5 в буфере Perm/Wash, и инкубировали в течение 30 мин при 37 С. После заключительного промывания клетки анализировали с использованием флуорес- 18012037 центного микроскопа. Иммунофлуоресцентный анализ выявлял сильное антигенспецифическое окрашивание клеток с сывороткой, полученной от мышей, иммунизированных ТВ-6 (Ag85 В единственный), ТВ-3 (ALV-digAg85A-dig-Ag85B), ТВ-4 (прямое слияние Ag85A-Ag85B) и TB-L (ALV-dig-Ag85A-dig-Ag85B-digTB10. 4). Слабое окрашивание наблюдалось с сывороткой от мышей, иммунизированных TB-S (прямое слияние Ag85A-Ag85B-TB10.4), в то время как сыворотка, полученная при иммунизации ТВ-5 (Ag85 А единственный) и ТВ-7 (ТВ 10.4 единственный), не проявляла какого-либо окрашивания. Это показывает,что, по меньшей мере, некоторые из антигенов способны вызывать гуморальный иммунный ответ. В данном эксперименте не выполняли определения полного расщепления протеазы остальной части полипротеина и уровней экспрессии отдельных антигенов. Пример 5. Конструирование векторов rAd, кодирующих антиген и адъювант. В этом примере осуществляли конструирование нового рекомбинантного аденовирусного вектора с дефективной репликацией, обозначенного в настоящем изобретении как Ad35-X-А 1K63, который коэкспрессирует антиген (упоминаемый как X) и мутантное производное CtxA1, которое, вместо серина, присутствующего в родительском CtxA1, содержит замену лизина в 63 аминокислоте (то есть упоминаемую здесь как А 1K63). Конструирование адаптерных плазмид, подходящих для создания векторов на основе Ad35 с делецией Е 1, способных к экспрессии X и А 1K63, достигают введением ПЦР-амплифицированного X с применением стандартных процедур ПЦР, известных специалистам в данной области техники, и введением подходящих клонирующих сайтов рестрикции. Получаемый фрагмент ДНК, созданный ПЦР, расщепляли соответствующей эндонуклеазой (эндонуклеазами) рестрикции и гибридизировали с адаптерной плазмидой, в общем, как описано выше для Ag85 А, Ag85 и ТВ 10.4. Выполняли дополнительный анализ с расщеплением эндонуклеазами рестрикции, ПЦР и секвенированием клонированного фрагмента ПЦР для проверки отсутствия повреждения ДНК в ходе конструирования. ДНК, кодирующую А 1K63, амплифицировали из плазмиды pOGL1-A, содержащей копии CtxA1. Нуклеотидная последовательность CtxA1 доступна в Genbank (инвентарныйА 16422), и ее модифицируют заменой серина-63 ТСА кодона (187189 нт) на лизин кодона ААА. Мутантное производное создают с применением комплекта сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene). Методика сайт-направленного мутагенеза влечет за собой ПЦР всей плазмиды с использованием ДНК pOGL1-A1 в качестве матрицы, прямого праймера 5'-TGT ТТС ССА ССА AAA ТТА GTT TGA GAA GTG С-3' (SEQ ID NO: 24) и обратного праймера 5'-САА ACTAAT TTT GGT GGA ААС АТА ТСС АТС-3' (SEQ ID NO: 25). Эта процедура модифицирует нуклеотиды 187-189 путем замены кодона ТСА на кодон ААА (см. выделенные последовательности). Получаемую в результате ПЦР плазмиду расщепляли с DpnI для удаления матрицы ДНК, расщепленную ДНК вводили в Е. coli посредством химической трансформации и выращивали на агаре при 30 С в течение 16 ч. Выбирали изолированные колонии и экстрагировали ДНК из жидких культур в течение ночи. Проводили ПЦР плазмиды с использованием праймеров, специфических для А 1K63, и агарозный гель-электрофорез для скрининга на подходящие производные. После этого клонировали мутантную вставку или выше, или ниже X в ту же адаптерную плазмиду, которая содержит X, и изготовляли аденовирусы, как описано выше. Пример 6. Реакции на дозы ТБ-векторов Ad35 у мышей. Для проверки антигенности у мышей использовали рекомбинантные вирусы Ad35, экспрессирующие различные единственные и слитые ТБ-антигены. Количественное определение Т-клеток, вырабатывающих гамма-интерферон (IFN-) после стимуляции белками или пептидным пулом, обычно осуществляют с применением способов, известных в данной области техники и описанных, например, в патентеWO 2004/037294 авторами Sander et al. (1991) и Jung et al. (1993). Подробное описание приведено ниже. Для теста реакции иммуногенности на дозу использовали вектор TB-S с тройной вставкой. Четыре разные дозы вирусных частиц (107, 108, 109 и 1010 вирусных частиц) вводили внутримышечно разным группам мышей C57BL/6 (5 мышей на группу), в то время как 3 мыши являлись отрицательным контролем и им вводили 1010 вирусных частиц пустого вирусного вектора. Через 2 недели после иммунизации мышей забивали и выделяли спленоциты в качестве источника клеток для клеточных иммунологических анализов. Уровень антигенспецифических клеточных иммунных ответов определяли, используя внутриклеточное окрашивание IFN (отображение стандартной цитометрии ICS) в анализе FACS путем измерения частоты IFN спленоцитов CD4+ и CD8+, как описано выше. Результаты показаны на фиг. 17. Ясно,что TB-S вектор на основе Ad35 стимулирует антигенспецифический иммунный ответ дозозависимым образом, в особенности в отношении повышения в ответе клеток CD4 на Ag85 В-специфический антиген(фиг. 17 С). Не было выявлено какого-либо ответа клеток CD4, связанного с ТВ 10.4-специфическими антигенами (фиг. 17 Е), и не выявлено какого-либо ответа клеток CD8, связанного с Ag85 В-специфическим антигеном (фиг. 17D). В дозах 107 и 108 в отношении Ag85A- и ТВ 10.4-специфических клеток, практически, не было обнаружено каких-либо ответов (фиг. 17 В и 17F, соответственно), тогда как заметное повышение было выявлено при применении доз 109 и 1010. В дозе 107 не проявлялось каких-либо существенных эффектов ни в одном из случаев, в то время как доза 108 также приводила к повышению Ag85 Аи Ag85 В-специфических клеток CD4 (фиг. 17 А и 17 С, соответственно). Сходные данные были выявлены- 19012037 при применении TB-L конструкции (данные не показаны). В ходе оценки картирования CD8 эпитопов иммунодоминантных последовательностей антигенов М. tuberculosis у мышей было выявлено, что пептиды Ag85 А, указанные как p1 (FSRPGLPVEYLQVPS;SEQ ID NO: 26) и р 2 (GLPVEYLQVPSPSMG; SEQ ID NO: 27), представляли собой единственные основные эпитопы CD8 у мышей C57BL/6. Подчеркнутый фрагмент секвенирования, теоретически, должен соответствовать молекулам МНС у мышей C57BL/6. Последовательность антигена Ag85 А в этой области белка (аминокислоты 1-19: FSRPGLPVEYLQVPSPSMG; SEQ ID NO: 28) была идентична последовательности Ag85B в той же области. Вместе с тем, несмотря на то, что пептиды p1 и р 2 из пула Ag85 В содержатся в той же последовательности, что и пептиды из Ag85 А, они не приводили к какому-либо ответуCD8 (см. фиг. 17D). Предполагается, что у пептидов p1 и р 2 из Ag85 В был нарушен порядок, возможно, в силу эффектов изготовления или загрязнения. Поэтому выполняли дополнительный эксперимент реакции на дозу, в котором стимуляцию in vitro пептидным пулом Ag85 В восстанавливали пептидами p1 и р 2 из пула Ag85 А. Эксперимент выполняли как с TB-S, так и с TB-L векторами, используя дозы 107, 108,109, и 1010 вирусных частиц. Ответ Т-клетки определяли через 2 недели после иммунизации, в общем, как описано выше. Одной группе мышей в качестве отрицательного контроля вводили ФБР, тогда как другой группе вводили пустой вирус Ad35 (1010 вирусных частиц). Результаты, касающиеся клеток CD8, представлены на фиг. 17G (TB-L, левый столбец, TB-S, правый столбец). Понятно, что измерение положительных клеток CD8 проводили после стимуляции in vitro с отрегулированным пулом Ag85 В, при этом пептиды антигена Ag85 А были идентичны пептидам антигена Ag85 В, который применялся первоначально и не обеспечивал каких-либо положительных результатов. Тем не менее, эти наблюдения показывают, что белок Ag85 В, так же, как кодируемый на основе аденовирусов Ad35 белок, может стимулировать CD8-положительный Т-клеточный ответ после инфицирования указанными вирусами. Пример 7. ТБ-векторы на основе Ad35, используемые в качестве бустера после примирования с БЦЖ. В другом эксперименте Ad35 векторы, экспрессирующие ТБ-антигены, тестировали в качестве бустерных агентов для иммунизации БЦЖ. В этом примере группе мышей подкожно водили БЦЖ вакцину(бациллы Кальметта-Герена; со ссылкой на стандарт FDA и, в общем, известные в области техники противотуберкулезной вакцинации) согласно протоколам, предоставленным FDA (стандарты и тестовый раздел CBER). Четыре группы мышей (по 8 мышей в группу) подкожно примировали БЦЖ (6105 КОЕ/на мышь) за 10 недель до инфицирования аденовирусными векторами на основе Ad35, несущими три связанных прямым образом ТБ-антигена (TB-S), или аденовирусными векторами Ad35, несущими следующие комбинации антигенов: ТВ-4 единственный (содержащий прямое слияние Ag85 А и Ag85 В),ТВ-4+ ТВ-7 (содержащие ТВ 10.4 единственный),ТВ-5 (содержащий Ag85 А единственный) + ТВ-6 (содержащий Ag85 В единственный) + ТВ-7. Две контрольные группы (по 4 мыши на группу) примировали с ФБР или БЦЖ, тогда как группе ФБР вводили ФБР в качестве ложной иммунизации, и примированная БЦЖ контрольная группа получала 109 вирусных частиц пустого вектора Ad35. Внутримышечные инъекции вектора на основе Ad35 во всех случаях проводили с 109 вирусных частиц. Через 4 недели после инфицирования (через 14 недель после примирования) мышей забивали и спленоциты выделяли и использовали, как описано выше. Результаты показаны на фиг. 18. Присутствие антигена Ag85 А приводило к существенным эффектам наAg85 А-специфические клетки CD4 (фиг. 18 А). Как предполагалось (см. также фиг. 13 В), тройная конструкция TB-S вызывала Ag85 А-специфический ответ CD8, тогда как ТВ-4 вектор не индуцировал такого ответа (фиг. 18 В). Ранее были выявлены сходные результаты (фиг. 13 В), указывающие на то, что присутствие Ag85 А единственного или в комбинации с Ag85B не приводит к ответу CD8, тогда как в присутствии ТВ 10.4 такой ответ выявляется. Интересно, что не было обнаружено какого-либо эффекта при введении отдельных векторов, в отличие от совместного одномоментного введения (ТВ-4/ТВ-7 или ТВ-5/ТВ 6/ТВ-7 на фиг. 18 В), что указывает на то, что антиген ТВ 10.4 не способен к индукции Ag85 А-специфического ответа CD8 при совместном введении, а, скорее, что антиген должен присутствовать в той же конструкции или, по меньшей мере, в той же клетке. Механизм для эффекта адъюванта ТВ 10.4 остается неясным. Эффекты, отмеченные у Ag85 В антигена, согласуются с ранее выявленными эффектами (фиг. 18 С и 18D). Необходимо отметить, что присутствие антигена ТВ 10.4 в тройной конструкции TB-S не вызываетAg85 В-специфического ответа CD8, в отличие от выявленного эффекта у Ag85 А. Оба антигена хорошо экспрессируются из конструкций, что показано на фиг. 10 В. Отрицательный эффект может наблюдаться в силу нарушенного пептидного пула, используемого для измерения любого ответа CD8 на Ag85 В (см. пример 6 и ниже). Индукция CD4+ клеток при использовании ТВ 10.4 является очень низкой (фиг. 18 Е). При использовании ТВ 10.4 в отдельном векторе (ТВ-5/ТВ-6/ТВ-7) индукция CD8+ клеток является значительной(примечание: см. масштаб оси Y; также см. фиг. 15 В). Индукция ТВ 10.4-специфических CD8 клеток при использовании TB-S очень высока (фиг. 18F), при среднем значении около 12% IFN-положительных- 20012037 клеток CD8. Можно прийти к заключению, что антиген ТВ 10.4 способен к индукции ответа CD8 на антиген, который в виде единственной конструкции не вызывает ответ CD8 (Ag85 А). Известно, что для активации клеток CD8 требуется несколько более высокий антигенный порог, чем для активации клеток CD4, что происходит, по меньшей мере, отчасти, в силу сложности механизма, вовлеченного в процессирование антигена и представление молекул МНС I класса (Storin et Bachman, 2004). В этом примере было выявлено, что при связывании ТВ 10.4 с антигенами Ag85 А и Ag85 В в конструкции тройного антигена запускались сильные ответы CD8, не только непосредственно против ТВ 10.4, но также и против Ag85 А. Вероятно, что физическое присутствие в конструкции ТВ 10.4 повышало эффективность транспорта слитого белка в протеосому, что необходимо для эффективного представления и активации клеток CD8. Наиболее вероятной причиной более высокого ТВ 10.4-специфического ответа клеток CD8 является повышение уровня экспрессии из тройных конструкций по сравнению с вектором, несущим единственный антиген ТВ 10.4. Ответ CD8 на единственный ТВ 10.4 был также значительным, но вместе с тем было невозможно определить какие-либо уровни экспрессии ТВ 10.4 в силу недостатка ТВ 10.4-специфической антисыворотки для вестерн-блоттинга. Повышение направленного транспорта в протеосомы могло быть результатом присутствия специфических сайтов в молекуле ТВ 10.4, таких как последовательности, вовлеченные в связывание убиквитина (или других молекул, отвечающих за метку созданных для процессирования белков), или транспортные белки, или последовательности, которые иначе повышают процессирование и представление в контексте молекул МНС I класса (Wang et al., 2004). Альтернативно, присутствие в конструкции белка ТВ 10.4 способно физически дестабилизировать слитый белок, что приводит к повышенной скорости разрушения молекулы. Увеличенный уровень процессирования антигена обычно приводит к повышению активации клеток CD8. Кроме того, если в протеосоме оказывается много белков для представления класса I, меньшее количество белков будет присутствовать в цитозоле и вне клетки и, таким образом, не будет доступно для активации В-клеток. Сообщалось, что существует обратная корреляция между процессированием антигена (т.е. активацией CD8) и титром антигенспецифических антител (Delogu et al.,2000). Интересно напомнить, что намного более сильная антиген-иммунофлуоресценция наблюдалась в сыворотке мышей, иммунизированных конструкцией двойного антигена, в отличие от мышей, иммунизированных конструкцией тройного антигена. Эти результаты предполагают, что наши молекулы тройного антигена, содержащие ТВ 10.4, являются высоковосприимчивыми к разрушению протеосомами и к активации клеток CD8 и, таким образом, менее доступны для индукции антител. Поскольку предпочтительным ответом против туберкулеза является сильный ответ Т-клеток, пришли к заключению, что вектор тройного антигена на основе Ad35, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген ТВ 10.4 и, по меньшей мере, один другой ТБ-антиген, предпочтительно Ag85 А и более предпочтительно иAg85 А, и Ag85 В, очень подходит для использования в вакцине против туберкулеза. Выявленные эффекты даже можно дополнительно усиливать использованием БЦЖ в качестве примирующего агента, что указано в результатах, показанных на фиг. 18. Применяя новый пептидный пул для Ag85B с пептидами p1 и р 2 добавленного Ag85 А (как описано в примере 6), также повторяли анализ примирования/бустер-иммунизации с примированием БЦЖ и бустер-иммунизацией Ad35-TB, хотя в этом случае спленоциты извлекали из мышей, которых забивали на 26 неделе после примирования (через 16 недель после иммунизации). Мышей (по 8 на группу) иммунизировали с ФБР, пустым Ad35, Ad35.TB-S или Ad35.TB-L при дозах как 109, так и 1010 вирусных частиц соответствующих вирусных векторов. Результаты показаны на фиг. 25 (стимуляция Ag85 А), фиг. 26(стимуляция Ag85 В) и фиг. 27 (стимуляция ТВ 10.4). Результаты убедительно указывают, что значительные ответы CD4 и CD8 можно, тем не менее, выявить после длительного периода времени. Пример 8. Эксперимент с провокационной пробой примирования/бустер-иммунизации у морских свинок. В последующем эксперименте исследовали возможность защиты против инфицирования Mycobacteriumtuberculosis в эксперименте с провокационной пробой путем примирования с БЦЖ и бустер-иммунизацией ТБ-векторами на основе Ad35. Морских свинок вначале обычным способом примировали БЦЖ, как указано выше (6105 КОЕ на животное). Через 14 недель животных иммунизировали или вирусными частицами 1010 Ad35.TB-S(Ag85A-Ag85B-TB10.4), или рекомбинантными вирусами Ad35.TB-4 (Ag85A-Ag85B), или введением ФБР (контрольная группа). Через 8 недель животным проводили провокационную пробу с 100 КОЕ М.tuberculosis на животное. Животных наблюдали на выживаемость примерно до 78 недель после примирования. По промежуточным наблюдениям, предположили, что примирование БЦЖ, сопровождаемое бустер-иммунизацией Ad35-TB, гарантирует более высокую выживаемость, чем применение БЦЖ единственной.