Конструкции-”шпильки” р15 и применение

Изобретение относится к генетически модифицированным вирусным последовательностям TGB3, подходящим для индукции генного сайленсинга. В частности, доказано, что шпилечные конструкции, основанные на таких последовательностях, высокоэффективны при индукции механизма ПТГС (посттранскрипционного генного сайленсинга) и, таким образом, разрушения всей РНК 2. Соответственно, когда растения трансформированы, распространение вируса в растении в значительной степени снижено или блокировано. Изобретение относится к шпилечным конструкциям, к их применению, а также к растениям, к растительным клеткам и растительным тканям, несущим эти конструкции. 013911 Область изобретения Настоящее изобретение относится к шпилечным конструкциям ДНК и к их применению для индукции посттранскрипционного генного сайленсинга (ПТГС) в растениях, и в наибольшей степени в растениях сахарной свеклы, с целью получения растений, проявляющих повышенную устойчивость или толерантность к вирусу, такому как вирус некротического пожелтения жилок свеклы (ВНПЖС). Кроме того,настоящее изобретение относится к трансгенным клеткам и растениям, которые проявляют повышенную устойчивость, например, к ВНПЖС, и к их потомству. Предшествующий уровень техники Областью глубокого интереса является придание растениям устойчивости или толерантности к вирусам. У сельскохозяйственных культур большие доли урожая могут быть потеряны вследствие вирусных инфекций. Широко распространенное вирусное заболевание растения сахарной свеклы (Beta vulgaris), названное ризоманией, вызвано фуровирусом, вирусом некротического пожелтения жилок свеклы (ВНПЖС) (1,2), который передается к корням свеклы почвенным грибом Polymyxa betae (3). Заболевание значительно поражает посевные площади районов, где выращивают сахарную свеклу для промышленного применения, в Европе, США и Японии, и все еще распространено в некоторых областях Западной Европы (4, 5). С 1986 года в ряде докладов и публикаций описано применение изолированных вирусных нуклеотидных последовательностей, экспрессируемых в растениях для придания высокого уровня толерантности против специфичного инфекционного вируса или даже для придания широкого спектра устойчивости против ряда родственных вирусов (6, 7, 8). Одной из наиболее широко отраженных в документах стратегий вирусной устойчивости, основанных на генной инженерии, у многих видов культурных растений, таких как картофель, тыква, огурец или томат, является применение вирусной нуклеотидной последовательности, которая под контролем регуляторных элементов растения кодирует белок оболочки вируса-мишени (9). Тем не менее, даже при устойчивости, опосредованной белком оболочки, экспрессия определенного уровня устойчивости в трансгенном растении может быть свойственна различным механизмам, таким как косупрессия РНК или устойчивость, опосредованная белком, запускаемая продукцией белковой последовательности. Как правило, вирусную последовательность следует трансформировать в подходящую клеточную или тканевую культуру видов растений, используя систему трансформации, опосредованной Agrobacterium, или методом прямого переноса генов, в соответствии с ограничениями способа культивирования тканевой культуры или клеточной культуры, который может быть успешно применен у данных видов. Нужно регенерировать целое растение и охарактеризовать экспрессию трансгена. Хотя сахарная свекла известна как растение, с трудом поддающееся культивированию клеток, что ограничивает степень применения практической генной инженерии для этого вида, в настоящее время все возрастает количество сообщений об успешной трансформации и регенерации целых растений (38). Также опубликовано несколько примеров генно-инженерной толерантности к ВНПЖС посредством трансформации и экспрессии последовательности белков оболочки ВНПЖС в геноме сахарной свеклы(11, WO91/13159), хотя в них редко приводят данные о полностью функциональных трансгенных растениях сахарной свеклы (12). В частности, в этих сообщениях показаны ограниченные данные относительно уровня действительной устойчивости, наблюдаемой в условиях инфекции, когда трансгенные растения сахарной свеклы трансформированы геном, кодирующим последовательность белка оболочки ВНПЖС (13, 14). Полный технологический пакет, включающий способ трансформации сахарной свеклы и применение экспрессии последовательности белка оболочки ВНПЖС в качестве источника устойчивости в трансгенном растении сахарной свеклы, полученном указанным способом трансформации, описан в патентной заявке WO91/13159. На основании опубликованной информации невозможно сделать заключение, что механизм устойчивости, опосредованный белком оболочки, обеспечивает какие-либо возможности для придания растению сахарной свеклы общего иммунитета к инфекции ВНПЖС в результате полного ингибирования механизмов размножения и диффузии вируса. Идентификация механизма устойчивости, который значительно блокирует распространение вируса на ранней стадии инфекционного процесса, могла бы быть главным критерием успеха развития такой трансгенной устойчивости. Кроме того, такая устойчивость могла бы разнообразить существующие механизмы устойчивости. Поскольку показано, что заболевание распространяется во многих странах или областях со скоростью, зависящей от сочетания многочисленных местных особенностей окружающей среды и агрономических особенностей, основной интерес заключается во внесении многообразия и усовершенствования в механизмы генетической устойчивости, которые могут, отдельно или в комбинации, создавать стратегию стабильной и длительно действующей устойчивости настоящих и будущих сортов растений сахарной свеклы, выращиваемых для промышленного применения. Геном фуровируса некротического пожелтения жилок свеклы (ВНПЖС) состоит из пяти плюс-1 013911 смысловых РНК, две из которых (РНК 1 и 2) кодируют функции, существенные для инфицирования всех растений, тогда как остальные три (РНК 3, 4 и 5) вовлечены в опосредованное вектором инфицирование корней сахарной свеклы (Beta vulgaris). Межклеточный перенос ВНПЖС управляется набором трех последовательных, незначительно перекрывающихся вирусных генов на РНК 2, известных как тройной блок генов (TGB), кодирующих в следующей последовательности вирусные белки Р 42, Р 13 и Р 15 (генные продукты обозначены по их расчетным молекулярным массам (Mr) в килодальтонах). В последующем описании гены TGB и соответствующие им белки определены следующими терминами TGB-1, TGB-2, TGB-3, либо по номерам кодируемых ими вирусных белков Р 42, Р 13 и Р 15. Аналоги TGB присутствуют в других фуровирусах, а также в потекс-, карла- и гордеивирусах (15, 18, 19, 20,21 и 22). Во вложенной таблице 1 представлены вирусы, имеющие последовательность TGB-3, молекулярная масса TGB-3 указанных вирусов, их хозяева и ссылки. Ранее показано, что независимая экспрессия Р 15 с репликационных видов вирусной РНК, известных как "репликон", имеющих происхождение от РНК 3 ВНПЖС, ингибирует инфицирование ВНПЖС посредством препятствования межклеточному переносу (16). Для введения вируса, содержащего нуклеиново-кислотную последовательность TGB-3, в растительную клетку или в растение, предложено включение нуклеиново-кислотной конструкции, содержащей указанную нуклеиново-кислотную последовательность TGB-3, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в указанном растении (WO 98/07875). Тем не менее, хотя экспрессия вирусной последовательности TGB-3 дикого типа в трансгенном растении дает возможность блокирования указанной вирусной инфекции, присутствие указанной последовательности дикого типа может вызывать вредные эффекты на агрономические свойства трансформированных растений или растительных клеток. Настоящее изобретение заключается в открытии того, что некоторые мутированные (генетически модифицированные) вирусные последовательности TGB-3, раскрытые в настоящем изобретении, являются весьма полезными в генной инженерии растений (сахарной) свеклы, устойчивых к ВНПЖС. Цели изобретения Целью настоящего изобретения является разработка более надежных способов и средств придания растениям устойчивости к вирусам, например устойчивости к вирусу ВНПЖС, преимущественно чрезвычайной устойчивости к ВНПЖС, более конкретно растениям сахарной свеклы, путем генетической модификации или трансформации растительных клеток. Кроме того, целью настоящего изобретения является разработка генетически модифицированных или трансформированных растительных клеток, которые могут быть получены таким образом, что их можно регенерировать в растения, проявляющие повышенную толерантность или устойчивость к растительному вирусу, например к ВНПЖС. Еще одной целью является разработка устойчивого потомства, например потомства, устойчивого к ВНПЖС, семян и других репродуктивных органов или структур, имеющих происхождение от таких трансформированных растений и растительных клеток. Краткое изложение сущности изобретения Предполагают, что в функцию последовательности TGB-3 дикого типа при межклеточном переносе вовлечены, по меньшей мере частично, "мостиковые" взаимодействия между элементом растенияхозяина (предпочтительно компонентом плазмодесмы) и элементом вирусного происхождения (предпочтительно другим вирусным белком, вовлеченным в межклеточный перенос). Разрушение либо домена последовательности TGB-3 дикого типа (который предположительно взаимодействует с элементом хозяина), либо домена последовательности TGB-3 дикого типа (который предположительно взаимодействует с вирусным элементом) дает возможность ингибирования межклеточного переноса. Кроме того, по-видимому, указанные специфичные мутации в последовательности TGB-3 дикого типа дают возможность получения мутантов, продуцирующихся в трансгенном растении, которые все же будут взаимодействовать с вирусным элементом, но не с элементом хозяина. Эти мутанты могут конкурировать за сайты связывания на вирусном элементе последовательности TGB-3 дикого типа, продуцируемой на начальной стадии вирусной инфекции, и прерывать инфицирование посредством ингибирования перемещения вируса к соседней клетке. Предпочтительно замену по меньшей мере одной аминокислоты другой отличающейся аминокислотой указанной последовательности осуществляют в участках, богатых гидрофильными аминокислотами, обычно присутствующих на поверхности белка в своей нативной конфигурации. Предпочтительно точечная(ые) мутация(и) дает возможность замены одной или двух аминокислот одной или двумя отличающимися аминокислотами. Во вложенной табл. 1 описаны предпочтительные примеры указанных вирусов, имеющих вирусную последовательность TGB-3 дикого типа, молекулярная масса соответствующего TGB-3 пептида, их хозяева и ссылка. Также уже описаны специфичные нуклеотидные и аминокислотные последовательности Р 15 ВНПЖС дикого типа (17, последовательности дикого типа, включено здесь путем ссылки). Вышеописанные точечные мутации осуществляли общепринятыми способами, известными специалистам в данной области техники.-2 013911 Вышеупомянутые мутанты, содержащие точечную мутацию, тестировали на их способность к стимуляции межклеточного переноса вирусного мутанта (с дисфункциональной последовательностью TGB3, предпочтительно мутанта ВНПЖС с дисфункциональным геном р 15) при экспрессии в трансположении по отношению к репликону. Эти мутанты были неспособны к стимуляции такого переноса, и они были протестированы на их способность к ингибированию инфекции совместно инокулированным вирусом TGB-3 дикого типа, предпочтительно совместно инокулированным ВНПЖС дикого типа, когда мутантная форма последовательности TGB-3, предпочтительно гена р 15, была экспрессирована с репликона. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что способ генетической модификации по изобретению (предпочтительно точечную мутацию) можно использовать для получения модифицированной вирусной последовательности TGB-3 (предпочтительно модифицированной последовательности р 15 ВНПЖС), которая способна блокировать вирусную инфекцию, не вызывая вредных эффектов при встраивании в геном растения или растительной клетки растения. К этому относится первый аспект изобретения. Под "способностью к блокированию вирусной инфекции в растении или в растительной клетке" подразумевают возможность получения высокой степени толерантности растением или растительной клеткой, трансформированной указанной модифицированной вирусной последовательностью TGB-3, к указанной вирусной инфекции, в частности, возможность обеспечивать быстрое и полное блокирование механизмов размножения и диффузии вируса в растении, предпочтительно блокирование механизмов размножения и диффузии вируса ВНПЖС в растении сахарной свеклы (Beta vulgaris), включая кормовую свеклу, листовую свеклу и столовую свеклу, которые также могут быть подвержены указанной инфекции ВНПЖС. Указанная толерантность или устойчивость могут быть легко измерены различными способами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Предпочтительно генетические модификации в вирусной последовательности TGB-3 дикого типа представляют собой точечные мутации в участках указанной вирусной последовательности дикого типа,вовлеченной в механизмы вирусного межклеточного переноса. Настоящее изобретение также относится к модифицированным вирусным нуклеотидным и аминокислотным последовательностям TGB-3, полученным (выделенным) указанным способом (модификация и отбор), более предпочтительно к модифицированным нуклеотидным и аминокислотным последовательностям Р 15 ВНПЖС, полученным (выделенным) указанным способом. Предпочтительно указанные нуклеотидные и аминокислотные последовательности Р 15 ВНПЖС выбраны из группы, состоящей из приведенных ниже нуклеотидных или соответствующих аминокислотных последовательностей: В последующем описании различные модифицированные последовательности TGB-3 ВНПЖС будут обозначены как "мутанты р 15", идентифицируемые приведенной ниже ссылкой: BNP15-Ala1, соответствующий SEQ ID NO 1; BNP15-Ala4, соответствующий SEQ ID NO 3; BNP15-Asp9, соответствующий SEQ ID NO 5. Нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 5 можно сравнивать с SEQ ID NO 7, которая представляет собой уже описанную нуклеотидную и аминокислотную последовательность (SEQ ID NO 8) p15 дикого типа (17). Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему указанную модифицированную нуклеотидную последовательность или ее фрагмент, возможно, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении или в растительной клетке. Предпочтительно указанный вектор представляет собой плазмиду, содержащую уже указанные регуляторные последовательности, активные в растении или в растительной клетке. Вектор также может представлять собой кассетную нуклеотидную последовательность, состоящую только из интересующей нуклеотидной последовательности, которую нужно встраивать в геном растения (в данном случае из модифицированной последовательности TGB-3 ВНПЖС или ее фрагмента), которая сцеплена с одним или более чем одним промотором, концевыми нуклеотидными последовательностями и, возможно, с регуляторной последовательностью, достаточной для получения эффективной экспрессии интересующих последовательностей, которые, кроме того, еще (по существу) свободны от других прокариотических или плазмидных нуклеотидных последовательностей (см. ЕР 1174513). Настоящее изобретение также относится к способу индукции устойчивости к вирусу, содержащему последовательность TGB-3, предпочтительно к одному из вирусов, описанных во вложенной табл. 1, и более предпочтительно к вирусу ВНПЖС, где указанный способ включает следующие стадии: получения нуклеиново-кислотной конструкции, содержащей нуклеиново-кислотную последовательность, генетически модифицированную в соответствии со способом по изобретению, или содержащей фрагмент такой модифицированной последовательности, и оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении или в растительной клетке,трансформации растительной клетки этой нуклеиново-кислотной конструкцией и,возможно, регенерации трансгенного растения из трансформированной растительной клетки.-4 013911 Предпочтительно указанный способ применяют для индукции устойчивости к ВНПЖС у растения сахарной свеклы или в клетке сахарной свеклы. Указанный способ включает следующие стадии: получения нуклеиново-кислотной конструкции, содержащей модифицированную нуклеиновокислотную последовательность, полученную способом по изобретению, или содержащей фрагмент такой модифицированной последовательности, предпочтительно получения нуклеиново-кислотной конструкции, содержащей нуклеиново-кислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQID NO 1, SEQ ID NO 3 или SEQ ID NO 5 или фрагмента любой из них, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении,трансформации растительной клетки сахарной свеклы этой нуклеиново-кислотной конструкцией и возможно, регенерации трансгенного растения сахарной свеклы из трансформированной растительной клетки сахарной свеклы. Настоящее изобретение также относится к полученному (регенерированному) трансгенному растению или клетке трансгенного растения, устойчивому к инфицированию вирусом, содержащим последовательность TGB-3, предпочтительно одним из вирусов, описанных во вложенной табл. 1, более предпочтительно вирусом ВНПЖС, указанного растения или растительной клетки, содержащего нуклеиновокислотную конструкцию, имеющую модифицированную нуклеиново-кислотную последовательностьTGB-3, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, способной быть активной в растении или в растительной клетке. Предпочтительно указанная модифицированная нуклеиново-кислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 5, оперативно сцепленных с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении или в растительной клетке. Предпочтительно клетка представляет собой устьичную клетку, а регуляторная последовательность включает промоторную последовательность и терминаторную последовательность, способную быть активной в растении. Указанная промоторная последовательность может быть конститутивной или может быть получена из чужеродной промоторной последовательности и предпочтительно выбрана из группы,состоящей из промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и/или промотора полиубиквитина Arabidopsis thaliana. Преимущественно промоторная последовательность представляет собой промотор, специфичный для корня, который, в основном, способен быть активным в корневой ткани растений, в частности растений сахарной свеклы, такой как промотор par или гена гемоглобина из Perosponia andersonii. Следующий аспект настоящего изобретения относится к трансгенной растительной ткани, такой как плод, стебель, корень, клубень, семя трансгенного растения по изобретению, или к репродуктивной структуре (предпочтительно выбранной из группы, состоящей из каллюсов, почек или зародышей), полученной из трансгенного растения или из растительной клетки по изобретению. Методики трансформации растений, тканевой культуры и регенерации, используемые в способе по изобретению, представляют собой методики, хорошо известные специалистам в данной области техники. Такие методики предпочтительно представляют собой методики, описанные в Международных патентных заявках WO 95/101778, WO 91/13159 (соответствующей Европейской патентной публикации ЕР-В 0517833), WO 98/07875, которые включены здесь путем ссылки. Протопласты замыкающих клеток являются предпочтительными тканями для трансформации растений сахарной свеклы. Эти методики предпочтительно используют для получения трансгенных растений и растительных клеток сахарной свеклы по изобретению. Среди растений сахарной свеклы, трансформированных мутированными или генетически модифицированными последовательностями TGB-3 (р 15) по изобретению (SEQ ID NOS 1, 3, 5), были обнаружены растения, которые четко проявляли сильную устойчивость к ВНПЖС в биологических анализах, и эти открытия были подтверждены в полевых испытаниях. Сильная устойчивость к ВНПЖС была, в частности, обнаружена среди растений, трансформированных SEQ ID NO 3. Оказывается, продукция мутированного белка р 15 запускает устойчивость. Путем вестерн-блотанализа продемонстрировано, что экспрессия мутированного белка Р 15 в высокоустойчивых растениях,трансформированных SEQ ID NO 3, была сильно снижена, но, тем не менее, все же присутствовала, что указывает на то, что полученный механизм сайленсинга все же недостаточно эффективен, чтобы разрушить каждую мРНК Р 15. Количество Р 15, продуцируемое трансгенными растениями со сверхсинтезом Р 15, который не подвержен сайленсингу ПТГС, сравнивали с количеством Р 15, продуцируемым устойчивыми растениями,где механизм ПТГС активен. При более подробной молекулярной характеристике растительного материала продемонстрировано присутствие малых молекул РНК, комплементарных как смысловой, так и антисмысловой нитям последовательности TGB-3 (р 15) ДТ (дикого типа) ВНПЖС. В целом полагают, что присутствие этих малых смысловых и антисмысловых РНК, несомненно, связано с механизмом устойчивости, индуцированным посттранскрипционным генным сайленсингом (ПТГС). Путем нозерн-блот-анализа устойчивых растений, инфицированных вирусом ВНПЖС, было под-5 013911 тверждено отсутствие РНК 2 ВНПЖС по сравнению с чувствительными контролями. Вследствие высокой зависимой от гомологии специфичности последовательности малых молекул РНК Р 15, образующихся в устойчивых растениях, эти транскрипты активируют процесс деградации всей (целостной) РНК 2. У этих растений механизм ПТГС был сформирован без запуска посредством самой генетической конструкции, более вероятно, являясь результатом перестроек вставок. Авторами изобретения было неожиданно сделано открытие, что шпилечные конструкции с мутированными последовательностями TGB-3 (р 15) по изобретению или их фрагменты в смысловой и антисмысловой ориентации могут эффективно запускать ПТГС, направленный на деградацию РНК2, например,ВНПЖС. В частности, доказано, что мутированная последовательность TGB-3 SEQ ID NO 3 (возможно,дополнительно модифицированная, например, для ингибирования трансляции) и ее фрагменты или участки весьма эффективны при запуске ПТГС с высокой воспроизводимостью. Еще один следующий аспект изобретения, таким образом, относится к этим двухцепочечным самокомплементарным молекулам РНК, к нуклеиново-кислотным конструкциям, в частности, конструкциям или нуклеотидным последовательностям ДНК, векторам или экспрессионным кассетам для их экспрессии в растительных клетках, к способам и применениям, основанным на них. В настоящем изобретении предложена нуклеиново-кислотная конструкция, в частности конструкция ДНК, изменяющая экспрессию белка переноса TGB-3, где указанная нуклеиново-кислотная конструкция содержит первую последовательность ДНК, способную экспрессировать в клетке смысловой фрагмент мутированного TGB-3 ВНПЖС, имеющую, например, (модифицированную) SEQ ID NO 1, 3 или 5, либо фрагмент или участок (указанной модифицированной) SEQ ID NO 1, 3 или 5, и вторую последовательность ДНК, способную экспрессировать в указанной клетке антисмысловую последовательность указанного мутированного TGB-3 ВНПЖС, имеющую (модифицированную) SEQ ID NO 1, 3 или 5,либо участок или фрагмент (указанной модифицированной) SEQ ID NO 1, 3 или 5. Под "экспрессией" подразумевают прежде всего "транскрипцию" или "образование фрагмента (м)РНК" (см. следующий абзац). За транскрипцией может следовать "трансляция". Кроме того, предпочтительно трансляция ингибирована (см. ниже). Под 'модифицированным' подразумевают, что исследуемая последовательность может быть дополнительно модифицирована, например, для ингибирования трансляции. Термин "SEQ ID NO 3", например, понимают как относящийся к SEQ ID NO 3 как таковой, а также к "модифицированным" последовательностям SEQ ID NO 3, таким как SEQ ID NO 10. В настоящем изобретении предложена сама вирусная генетически модифицированная последовательность TGB-3, содержащая последовательность (модифицированной) SEQ ID NO 3 или ее фрагмент,и содержащая антисмысловую последовательность указанной (модифицированной) SEQ ID NO 3 или антисмысловую последовательность указанного (модифицированного) фрагмента SEQ ID NO 3, где вирусная последовательность TGB-3 при транскрипции в клетке способна к образованию двухцепочечной самокомплементарной молекулы РНК. Предложена, например, генетически модифицированная вирусная последовательность TGB-3, содержащая последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 3 и антисмысловую последовательностьSEQ ID NO: 3; (б) нуклеотидной последовательности, включающей фрагмент SEQ ID NO: 3 и антисмысловую последовательность указанного фрагмента SEQ ID NO: 3; (в) нуклеотидной последовательности,включающей модифицированную SEQ ID NO: 3 и антисмысловую последовательность указанной модифицированной SEQ ID NO: 3; и (г) нуклеотидной последовательности, включающей фрагмент модифицированной SEQ ID NO:3 и антисмысловую последовательность указанного фрагмента модифицированной SEQ ID NO: 3, где указанная модифицированная вирусная последовательность при транскрипции в клетке способна образовывать двухцепочечную самокомплементарную молекулу РНК. Предпочтительно смысловая и антисмысловая последовательности включены в одну единую нуклеиново-кислотную последовательность, одну единую нить или молекулу ДНК. Тем не менее, они могут присутствовать в двух или на двух различных нуклеиново-кислотных последовательностях, нитях или молекулах ДНК, которые способны к спариванию оснований и, таким образом, к образованию двухцепочечной самокомплементарной молекулы РНК. При транскрипции генетически модифицированная вирусная последовательность TGB-3 по изобретению позволяет получить молекулу РНК с нуклеотидной последовательностью или нуклеиновокислотной последовательностью, содержащей 1) смысловую нуклеотидную последовательность по меньшей мере примерно из 10 последовательных нуклеотидов (нт), предпочтительно по меньшей мере примерно из 15, 20, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, или даже еще более предпочтительно примерно из 400 последовательных нуклеотидов (нт), например, последовательность (модифицированную)SEQ ID NO 3 или ее фрагмент, имеющую идентичность последовательности примерно 75 и примерно 100% по меньшей мере с частью последовательности р 15 ВНПЖС ДТ (SEQ ID NO 7), и 2) антисмысловую нуклеотидную последовательность, которая является достаточно комплементарной этой смысловой нуклеотидной последовательности. Как таковая, молекула РНК, которая экспрессируется (транскрибируется и предпочтительно не транслируется), способна к образованию двухцепочечной самокомплементарной молекулы РНК при экспрессии (транскрипции) в достаточных количествах,-6 013911 такой как искусственная шпилечная структура РНК, с образованием стебля двухцепочечной РНК за счет спаривания оснований между участками со смысловой и антисмысловой нуклеотидной последовательностью. Под "достаточными количествами" подразумевают количество, которое является достаточным для индукции ПТГС, предпочтительно для индукции полного генного сайленсинга. На самокомплементарные шпилечные конструкции по изобретению также ссылаются, как на мутированные шпилечные конструкции р 15 (ВНПЖС) (hp15). Предпочтительно каждая из смысловой и антисмысловой нуклеотидных последовательностей комплементарны друг другу. Желательно, чтобы между смысловым и антисмысловым фрагментом РНК в комплементарном участке было менее чем примерно 50% ошибочного спаривания оснований, более желательно менее чем примерно 30% ошибочного спаривания оснований, предпочтительно менее чем примерно 20% ошибочного спаривания оснований, более предпочтительно менее чем примерно 10% ошибочного спаривания оснований, еще более предпочтительно менее чем примерно 5, 4, 3, 2 или 1% ошибочного спаривания оснований. Предпочтительно общая длина смысловой нуклеотидной последовательности или последовательности ДНК составляет по меньшей мере примерно 10, 15 нт, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 20 нт, 25 нт, в частности по меньшей мере примерно 50 нт, более конкретно по меньшей мере примерно 100 нт, особенно по меньшей мере примерно 150 нт, более конкретно по меньшей мере примерно 200, 250, 300 нт, особенно по меньшей мере примерно 350 нт или примерно 400 нт. Понятно, что, чем больше общая или полная длина смысловой нуклеотидной последовательности,тем менее строгими становятся требования к идентичности последовательности между общей или полной смысловой нуклеотидной последовательностью (в данном случае, в частности, последовательностью, соответствующей SEQ ID NO 3 или ее части) и соответствующей последовательностью в генемишени (в данном случае, например, последовательностью р 15 ДТ ВНПЖС). Предпочтительно смысловая нуклеотидная последовательность должна обладать идентичностью последовательности по всей ее длине по меньшей мере примерно 75% с последовательностью р 15 ВНПЖС ДТ или ее частью, в частности по меньшей мере примерно 80%, более конкретно по меньшей мере примерно 85%, особенно примерно 90%, особенно примерно 95%, особенно примерно 99% или даже более чем 99% (даже предпочтительно менее чем 100%). Предпочтительная мутированная последовательность TGB-3, p15-ala4 (SEQ IDNO 3), имеет три мутированных основания по сравнению с ДТ р 15, что соответствует 99,24% гомологии или идентичности последовательностей. Другая предпочтительная последовательность по изобретению,SEQ ID NO 10, имеет пять мутированных оснований по сравнению с ДТ р 15, что соответствует 98,74% гомологии или идентичности последовательностей (см. фиг. 8). Тем не менее, предпочтительно, чтобы смысловая нуклеотидная последовательность всегда включала последовательность примерно из 10 последовательных нуклеотидов, в частности, примерно из 20 нт, более конкретно примерно из 50 нт, особенно примерно из 100 нт, особенно примерно из 150 нт со 100% идентичностью последовательности с соответствующей частью нуклеиновой кислоты-мишени (в данном случае, последовательности р 15 ВНПЖС ДТ). Предпочтительно для расчета идентичности последовательности и дизайна соответствующей смысловой нуклеотидной последовательности число пробелов должно быть минимизировано, в частности, для более коротких смысловых нуклеотидных последовательностей. Предпочтительно модифицированная смысловая последовательность TGB-3 содержит по меньшей мере следующие модификации по сравнению с последовательностью р 15 ДТ (дикого типа): ген ДТр 15 мутирован в положении 3 нуклеиновой кислоты, в котором G заменен на С, другая специфичная замена включает мутацию положения 158 нуклеиновой кислоты, в котором А заменен на С, дополнительные специфичные замены направлены на мутации в положениях 160 и 161, в которых пара AG заменена наGC, с добавлением дополнительной мутации в положении 397, в котором Т заменен на С (SEQ ID NO 10,см. также фиг. 8). Такая модификация в положении 3 ингибирует инициацию трансляции, а модификация в положении 397 разрушает стоп-сигнал трансляции. Другой предпочтительной модифицированной смысловой последовательностью TGB-3 по изобретению является SEQ ID NO 3, которая содержит следующие модификации по сравнению с геном р 15 ДТ: мутацию в положении 158 нуклеиновой кислоты,где А заменен на С, а также другие специфичные замены, направленные на мутации в положениях 160 и 161, где пара AG заменена на GC. Длина антисмысловой нуклеотидной последовательности в значительной степени определена длиной смысловой нуклеотидной последовательности и предпочтительно должна соответствовать длине последней последовательности. Тем не менее, можно использовать антисмысловую последовательность,которая отличается от смысловой нуклеотидной последовательности по длине примерно на 10-50%, более предпочтительно примерно на 10-15%. Аналогично, нуклеотидная последовательность антисмыслового участка в значительной степени определена нуклеотидной последовательностью смыслового участка и предпочтительно идентична комплементу нуклеотидной последовательности смыслового участка. В частности, при более длинных антисмысловых участках, однако, возможно использование антисмысловых последовательностей с меньшей идентичностью последовательности комплементу смысловой нуклеотидной последовательности, пред-7 013911 почтительно по меньшей мере примерно с 75% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере примерно с 80%, особенно по меньшей мере примерно с 85%, более конкретно по меньшей мере примерно с 90% идентичностью последовательности, особенно по меньшей мере примерно с 95% идентичностью последовательности комплементу смысловой нуклеотидной последовательности. Тем не менее, предпочтительно, чтобы антисмысловая нуклеотидная последовательность всегда включала последовательность примерно из 10, примерно из 15 последовательных нуклеотидов (нт),предпочтительно примерно из 20 нт, более предпочтительно примерно из 50 нт, особенно примерно из 100 нт, особенно примерно из 150 нт со 100% идентичностью последовательности комплементу соответствующей части смысловой нуклеотидной последовательности. Ясно, что длина отрезка из последовательных нуклеотидов со 100% идентичностью последовательности комплементу смысловой нуклеотидной последовательности не может быть больше, чем сама смысловая нуклеотидная последовательность. Опять же, предпочтительно, чтобы число пробелов было минимизировано, в частности, для более коротких антисмысловых последовательностей. Кроме того, также предпочтительно, чтобы антисмысловая последовательность имела между примерно 75 и 100% идентичности последовательности комплементу последовательности-мишени. Порядок смысловой и антисмысловой нуклеотидных последовательностей в нуклеотидных последовательностях или конструкциях ДНК по изобретению, как полагают, не является критическим. Предпочтительно смысловая и антисмысловая последовательности модифицированной вирусной последовательности TGB-3 по изобретению разделены линкерной или спейсерной нуклеотидной последовательностью, которая предпочтительно представляет собой интрон. Этот интрон предпочтительно представляет собой растительный интрон, более предпочтительно интрон (сахарной) свеклы. Предпочтительно используют интрон высоко транскрибируемых генов, более предпочтительно интрон высокотранскрибируемых генов сахарной свеклы. Предпочтительно высокотранскрибируемые гены представляют собой гены рибосомной РНК (24, 25). Предпочтительно смысловой фрагмент TGB-3 в генетически модифицированной последовательности TGB-3 по изобретению включает (модифицированные) SEQ ID NO 1, 3 или 5, либо их участки или фрагменты. Например, генетически модифицированная вирусная последовательность TGB-3 по изобретению может включать по меньшей мере от нт 100 до нт 399, нт 150 до нт 399 или нт 163 до нт 399 (модифицированных) SEQ ID NO 1, 3 или 5 . Наиболее предпочтительно смысловой фрагмент TGB-3 в генетически модифицированной последовательности TGB-3 по изобретению включает (модифицированную) SEQ ID NO 3 или ее участки или фрагменты. Например, генетически модифицированная вирусная последовательность TGB-3 по изобретению может включать по меньшей мере от нт 100 до нт 399, от нт 150 до нт 399 или от нт 163 до нт 399(модифицированной) SEQ ID NO 3. Еще более предпочтительно смысловой фрагмент TGB-3 в конструкции ДНК по изобретению состоит из (модифицированной) SEQ ID NO 3 или ее участков (фрагментов),например, он может состоять по меньшей мере из нт 100 - нт 399, нт 150 - нт 399 или нт 163 - нт 399 (модифицированной) SEQ ID NO 3. Преимущественно смысловой фрагмент TGB-3 в генетически модифицированной последовательности TGB-3 по изобретению дополнительно мутируют таким образом, чтобы он содержал по меньшей мере один стоп-кодон трансляции, с целью ингибирования трансляции. Преимущественно стоп-кодон(ы) указанного смыслового фрагмента TGB-3 в генетически модифицированной последовательности TGB-3 по изобретению разрушены. Стартовый кодон трансляции также может быть модифицирован, чтобы ингибировать инициацию трансляции. Например, стартовый кодон ATG SEQ ID NO 3 модифицирован до АТС, а стоп-кодон ТАА модифицирован до САА (см. фиг. 8). Эта конкретная последовательность названа "модифицированной" SEQ ID NO 3. Специалисты в данной области техники могут обдумать множество других возможностей. Предпочтительными конструкциями по изобретению являются конструкции или нуклеотидные последовательности ДНК, где смысловой фрагмент TGB-3 в генетически модифицированной вирусной последовательности TGB-3 по изобретению содержит SEQ ID NO 10. Еще более предпочтительны конструкции ДНК, где смысловой фрагмент TGB-3 в генетически модифицированной вирусной последовательности TGB-3 по изобретению состоит из SEQ ID NO 10. Предпочтительные генетически модифицированные последовательности TGB-3 по изобретению содержат SEQ ID NO 9 или 13. Еще более предпочтительны генетически модифицированные последовательности TGB-3, которые состоят из SEQ ID NO 9 или 13. Преимущественно генетически модифицированная вирусная последовательность TGB-3 по изобретению оперативно сцеплена с промотором, предпочтительно с гетерологичным промотором, который активен в корнях. Предпочтительными промоторными последовательностями, активными в корневой ткани растений, являются промотор par и промотор гена гемоглобина из Perosponia andersonii. Наиболее предпочтительны специфичные промоторы для корней свеклы, которые активны в корнях растения свеклы. Возможно, участок ДНК, вовлеченный в терминацию транскрипции и/или в полиаденилирование,или другие регуляторные последовательности (например, последовательности, усиливающие транскрип-8 013911 цию), могут быть оперативно сцеплены с конструкцией ДНК по изобретению. Далее само изобретение относится к вектору, в частности к экспрессионному вектору или экспрессионной кассете, содержащим генетически модифицированную последовательность TGB-3 по изобретению, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью. Настоящее изобретение далее относится к двухцепочечной самокомплементарной молекуле РНК,экспрессируемой генетически модифицированной последовательностью TGB-3 по изобретению, либо вектором или экспрессионной кассетой по изобретению. Другой аспект изобретения относится к клетке-хозяину, трансформированной генетически модифицированной последовательностью TGB-3 по изобретению и/или вектором по изобретению и/или молекулой РНК по изобретению. Клетка-хозяин предпочтительно представляет собой растительную клетку,более предпочтительно клетку свеклы и наиболее предпочтительно клетку сахарной свеклы. Настоящее изобретение далее относится к трансформированному растению, предпочтительно к трансформированному растению свеклы, наиболее предпочтительно к трансформированному растению сахарной свеклы, содержащему в своем геноме конструкцию ДНК и/или вектор по изобретению, и/или содержащему в своих клетках молекулу РНК по изобретению. Предпочтительно конструкцию ДНК, содержащую генетически модифицированную вирусную последовательность TGB-3 по изобретению и/или вектор, содержащий эту последовательность, используют для трансформации растительного материала, такого как растительные клетки и/или растительные ткани. Предпочтительно модифицированная последовательность TGB-3 по изобретению стабильно интегрирована в геном (растительной) клетки. Альтернативно она может присутствовать в эписомной форме. Таким образом, настоящее изобретение также относится к трансформированным или генетически модифицированным растительным клеткам, содержащим такую конструкцию ДНК и/или вектор и/или молекулу РНК по изобретению. Возможно также использовать молекулы РНК по изобретению сами по себе, чтобы придать устойчивость или толерантность к ВНПЖС (см. ниже). Другой аспект настоящего изобретения относится к трансгенному растению, предпочтительно к растению сахарной свеклы, регенерированному из клетки-хозяина, предпочтительно из растительной клетки, трансформированной такой конструкцией ДНК, вектором и/или молекулой РНК по изобретению и проявляющей измененную экспрессию белка переноса TGB-3. Предпочтительно экспрессия молекулы(ВНПЖС) TGB-3 (р 15) сильно снижена по сравнению с контролем (не трансформированным или не трансформированным шпилечной конструкцией р 15 по изобретению). Здесь приведен пример для (сильно) сниженной экспрессии р 15 ВНПЖС. Экспрессия р 15 ВНПЖС в присутствии шпилечной молекулы РНК р 15 по изобретению, таким образом, должна быть ниже, чем экспрессия в ее отсутствие, предпочтительно составляя только примерно 25%, в частности, только примерно 10%, более конкретно составляя только примерно 5% экспрессии в отсутствие шпилечной молекулы РНК р 15 по изобретению или в отсутствие генетически модифицированной вирусной последовательности TGB-3, кодирующей эту молекулу. Преимущественно экспрессия р 15 ВНПЖС снижена до такого уровня, что она более не обнаружима. Присутствие белка Р 15 может быть обнаружено с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против Р 15. Альтернативно уровни этого белка могут быть определены с помощью массспектрометрии, что хорошо известно в данной области техники. Наиболее предпочтительно, чтобы белок Р 15 или белковые фрагменты вообще не продуцировались, что означает, что все его мРНК разрушены или по меньшей мере инактивированы. Преимущественно экспрессия гена р 15 ДТ с вируса подавлена в растительных клетках и в растениях, трансформированных посредством способов или средств по изобретению. Преимущественно репликация вируса отсутствует в растении или в растительной клетке, трансформированной генетически модифицированной вирусной последовательностью TGB-3, конструкцией ДНК, вектором или молекулой РНК по изобретению. Еще один другой аспект настоящего изобретения относится к потомству трансформированных растений по изобретению, которое содержит в геноме по меньшей мере части своих клеток генетически модифицированную вирусную последовательность TGB-3 и/или вектор по изобретению, и/или которое содержит, по меньшей мере, в части своих клеток молекулу РНК по изобретению. Предпочтительно этот материал (модифицированная вирусная последовательность, вектор и/или молекула РНК) присутствует,по существу во всех клетках растения. Преимущественно потомство трансформированного растения по изобретению проявляет измененную экспрессию белка переноса TGB-3 (ВНПЖС). Такая же стратегия может быть применена к каждому вирусу, перечисленному в табл. 1, тем не менее, последовательность р 15, описанная здесь, направлена только на вирус ВНПЖС. Примеры потомства представляют собой такие растительные ткани, как плод, стебель, корень, клубень и семя. Еще один другой аспект изобретения относится к семенам трансформированного растения, предпочтительно трансформированного растения сахарной свеклы по изобретению. Настоящее изобретение также относится к (вегетативно) репродуктивным структурам, таким как каллюсы, почки, зародыши, происходящие от трансформированного растения по изобретению. Преимущественно это потомство, семена, репродуктивные структуры и т.д. содержат в геноме, по-9 013911 меньшей мере, части своих клеток, предпочтительно, по существу, во всех клетках, генетически модифицированную вирусную последовательность TGB-3 и/или вектор по изобретению и/или молекулу РНК по изобретению. Преимущественно эти растительные материалы могут быть регенерированы до растений или растительных материалов, устойчивых к ВНПЖС. Еще один другой аспект изобретения относится к применению таких семян или вегетативно репродуктивных структур для регенерации из них растения, которое предпочтительно представляет собой растение сахарной свеклы, устойчивое, например, к ВНПЖС, и/или проявляющее значительно повышенную толерантность к ВНПЖС. Еще один другой аспект изобретения относится к способу изменения экспрессии целостной РНК 2,и более конкретно белка переноса TGB-3 (ВНПЖС), в растении или растительной клетке, включающему стадии: введения в клетки растения, которое предпочтительно представляет собой растение сахарной свеклы, генетически модифицированной вирусной последовательности TGB-3 (конструкции ДНК) и/или вектора, содержащего эту последовательность, по изобретению с получением трансформированной растительной клетки, где экспрессия в указанных растительных клетках молекулы РНК, способной к образованию двухцепочечной молекулы РНК, изменяет экспрессию целостной РНК 2, и более конкретно белка переноса TGB-3 (ВНПЖС) в указанном растении или растительной клетке, и преимущественно экспрессию любого другого вирусного белка, локализованного на той же РНК в указанном растении или в указанной клетке. Еще один другой аспект изобретения относится к способу индукции посттранскрипционного генного сайленсинга целостной РНК 2, и более конкретно белка переноса TGB-3 (ВНПЖС) в растении или в растительной клетке, включающему стадию введения в клетки растения, которое предпочтительно представляет собой растение сахарной свеклы, генетически модифицированной вирусной последовательности TGB-3 (конструкции ДНК) и/или вектора, содержащего эту последовательность, по изобретению с получением трансформированной растительной клетки, где экспрессия в указанных растительных клетках молекулы РНК, способной к образованию двухцепочечной молекулы РНК, запускает механизм посттранскрипционного генного сайленсинга. С помощью способа по изобретению, представленного в предыдущих абзацах, целостная РНК 2 преимущественно разрушается. Еще один другой аспект изобретения относится к способу придания растению или растительной клетке устойчивости или большей толерантности к вирусам растений, перечисленным в табл.1, например к ВНПЖС, включающему стадию введения в клетки растения, которое предпочтительно представляет собой растение сахарной свеклы, генетически модифицированной вирусной последовательности TGB-3 (конструкции ДНК) и/или вектора, содержащего эту последовательность, по изобретению с получением трансформированной растительной клетки, где экспрессия в указанных растительных клетках молекулы РНК, способной к образованию двухцепочечной молекулы РНК, ответственна за устойчивость и/или повышенную толерантность указанного растения к вирусу растений, например, к ВНПЖС. Еще один другой аспект изобретения относится к способу индукции чрезвычайной устойчивости(высоких уровней иммунитета) в растении или в растительной клетке, включающему стадию введения в клетки растения, которое предпочтительно представляет собой растение сахарной свеклы, генетически модифицированной вирусной последовательности TGB-3 (конструкции ДНК) и/или вектора, содержащего эту последовательность, по изобретению с получением трансформированной растительной клетки, где экспрессия в указанных растительных клетках молекулы РНК, способной к образованию двухцепочечной молекулы РНК, способна индуцировать чрезвычайную устойчивость (высокие уровни иммунитета) в растениях, содержащих конструкцию ДНК и/или вектор по изобретению по меньшей мере в части, предпочтительно, по существу, во всех своих клетках. Еще один другой аспект изобретения относится к способу (значительного) уменьшения или блокирования распространения вируса [предпочтительно одного из описанных в табл. 1, такого как ВНПЖС] в растении, включающему стадию введения в клетки растения, которое предпочтительно представляет собой растение сахарной свеклы, генетически модифицированной вирусной последовательности TGB-3 (конструкции ДНК) и/или вектора, содержащего эту последовательность, по изобретению с получением трансформированной растительной клетки, где экспрессия в указанных растительных клетках молекулы РНК, способной к образованию двухцепочечной молекулы РНК, способна уменьшать или блокировать распространение вируса в трансформированном таким образом растении или в растительной клетке. Распространение вируса может быть уменьшено/блокировано путем уменьшения/блокирования размножения вируса (во всех или в некоторых типах клеток), переноса вируса по растению (например, путем блокирования дистанционного переноса или межклеточного переноса), или путем ограничения распространения вируса только определенными тканями (например, сосудистой паренхимой и клетками, не относящимися к флоэме). Преимущественно распространение вируса уменьшено/блокировано до такой степени, что в корнях растений,- 10013911 трансформированных шпилечной конструкцией р 15 по изобретению, измерено значение OD405 (см. пример 7) 0,2 или менее. Более предпочтительно это значение максимально составляет 0,1. Наиболее предпочтительно это значение OD405 максимально составляет 0,05, максимально 0,01 или даже близко к нулю(уровни ниже предела обнаружения). Альтернативно молекула РНК по изобретению может быть введена в растительные клетки с целью изменения экспрессии белка переноса TGB-3 ВНПЖС, индуцирующего посттранскрипционный генный сайленсинг белка переноса TGB-3, придавая растению или растительной клетке устойчивость или большую толерантность к ВНПЖС, с целью индукции чрезвычайной устойчивости у растения или растительной клетки, либо с целью блокирования или уменьшения распространения вируса в растении. Способ по изобретению может дополнительно включать стадию регенерации трансгенного растения из трансформированной растительной клетки. Способы по изобретению включают (по меньшей мере) стадию получения подходящей конструкции и трансформации растения (клетки) этой конструкцией для достижения одного из вышеописанных эффектов (см. абзац 36). Обнаружено, что растения, трансформированные в соответствии с изобретением, преимущественно дают более высокие уровни устойчивости к ВНПЖС по сравнению с природными источниками толерантности/устойчивости к вирусу (такими как источники устойчивости, хорошо известные в области техники, "Rizor", "Holly" или Beta maritima подвид, maritime, номер по каталогу WB42). Оказывается, что трансформация растения генетически модифицированной последовательностьюTGB-3 по изобретению, предпочтительно способной к образованию шпилечной структуры, блокирует и/или значительно уменьшает распространение вируса через корневую систему. Преимущественно таким образом можно предотвратить достижение вирусом системы дистанционного переноса. Преимущественно трансформация растения в соответствии с изобретением предотвращает и/или значительно уменьшает размножение вируса в коре. Способы по изобретению преимущественно снижают способность вируса к поддержанию инфекционного потенциала в почве. Устойчивость патогенного происхождения по изобретению, кроме того, оказалась отличной от устойчивости, присутствующей в природных источниках. Устойчивость патогенного происхождения сама по себе может быть преимущественно объединена с природными механизмами устойчивости. Преимущественно сочетание различных источников устойчивости (природной и патогенного происхождения) может привести к (дополнительно) повышенной стабильности сорта, устойчивого к ризомании, а также может способствовать обеспечению долгосрочной устойчивости к одному или более чем одному патотипу (по меньшей мере к одному патотипу). Краткое описание графических материалов На фиг. 1 представлена генетически модифицированная вирусная последовательность TGB-3 по изобретению (фиг. 1 а и б, SEQ ID NO 9) со смысловой мутированной нуклеотидной последовательностью р 15 (SEQ ID NO 10, модификации по сравнению с ДТ здесь выделены жирным подчеркнутым шрифтом) и антисмысловой нуклеотидной последовательностью р 15 (жирный курсив, SEQ ID NO 12),разделенными интронной последовательностью из 91 п.о. (выделены жирным подчеркнутым шрифтом,SEQ ID NO 11). Несколько нуклеотидов на фиг. 16 выделены курсивом (двойное подчеркивание). Они не принадлежат ни р 15, ни интрону, но присутствуют как оставшиеся после стратегии клонирования, окружая сайты рестрикции. Конструкция, содержащая SEQ ID NO 9, также названа конструкцией 2 hp15. На фиг. 2 представлена генетически модифицированная вирусная последовательность TGB-3 по изобретению (фиг. 2 а и б, SEQ ID NO 13) со смысловой мутантной нуклеотидной последовательностью р 15 и антисмысловой нуклеотидной последовательностью р 15 (жирный курсив), разделенными интронной последовательностью, состоящей из 550 п.о. (жирный подчеркнутый шрифт, SEQ ID NO 14). Несколько нуклеотидов на фиг. 26 выделены курсивом (двойное подчеркивание). Они не принадлежат ни р 15, ни интрону, но присутствуют как оставшиеся после стратегии клонирования, окружая сайты рестрикции. Смысловая и антисмысловая нуклеотидные последовательности р 15 представляют собой такие же последовательности, как те, которые продемонстрированы на фиг. 16. Конструкция, содержащая SEQID NO 13, также названа конструкцией 3 hp15. На фиг. 3 представлена последовательность р 15 ДТ (SEQ ID NO 7 и 8). Фиг. 4 представляет собой схематическое изображение вектора pFGC5 941, в который был введен ген BNP15-ala4 в смысловой и антисмысловой ориентации, разделенных интронной последовательностью гена синтазы А петунии (CHSA). Промотор CaMV 35S: промотор 35S CaMV; OCS3: сигнал полиаденилирования гена октопинсинтазы; MAS3: сигнал полиаденилирования гена маннопинсинтазы; BAR: ген гербицидной устойчивости Basta; Km: ген устойчивости к канамицину; RB, LB: левая и правая границы t-ДНК. Фиг. 5 представляет собой схематическое изображение векторов pS140 и pS142, в которые был введен ген BNP15-ala4 в смысловой и антисмысловой ориентации, разделенных интронной последовательностью свеклы из 550 нт (фиг. 5 А, pS140, конструкция 3) и 91 нт (фиг. 5 Б, pS142, конструкция 2) соответственно. Промотор CaMV 35S: промотор 35S CaMV; NOS 3': терминатор нопалинсинтазы; Kan: ген устойчивости к канамицину; RB, LB: левая и правая границы t-ДНК.- 11013911 Фиг. 6 представляет собой статистический анализ данных по ПТГС, полученных для конструкции 1(hp15 с интроном петунии). Каждая гистограмма представляет число (Y) и размер (-Y) повреждений на зараженный лист./: отсутствие повреждений; v: вирус St1234, tp: буфер; hp: шпилька. По оси Y: 1, 10, 20, 30, 100. По оси -Y: 4. По оси X, слева направо: v; v + буфер MA; v + hpGF; v + hp15. Фиг. 7 представляет собой статистический анализ данных по ПТГС, полученных для конструкций 1, 2 и 3 соответственно. Каждая гистограмма представляет количество (Y) и размер (-Y) повреждений на зараженный лист.v; v + буфер MA; v + hpGF; v + hp15 (конструкция 1); v + pS140 (конструкция 3); v + pS142 (конструкция 2). На фиг. 8 подчеркнуты различия в SEQ ID NO 10 в сравнении с последовательностью р 15 ВНПЖС ДТ, представленной SEQ ID NO 7. На фиг. 9 приведены результаты теста твердофазного иммуноферментного анализа (ЭЛАЙЗА) в качестве меры присутствия вирусных частиц в корнях растений, выращенных в почве, инфицированной ВНПЖС. Biotest Rz2007-001A. THPR: трансформация, индуцированная полиэтиленгликолем (ПЭГ). На фиг. 10 приведены результаты теста ЭЛАЙЗА в качестве меры присутствия вирусных частиц в корнях растений, выращенных в почве, инфицированной ВНПЖС. Biotest Rz2007-002A. THPR: трансформация, индуцированная ПЭГ. AgHP: трансформация Agrobacterlum. На фиг. 11 представлен вектор pS138, использованный в экспериментах по прямой индуцированной ПЭГ трансформации гена. На фиг. 12 представлен вектор pS143, использованный для трансформации, опосредованной Agrobacterium. Подробное описание изобретения В предпочтительном воплощении изобретения смысловая и антисмысловая модифицированная нуклеотидная последовательность TGB-3 включены в одну молекулу, что означает, что смысловой мутированный фрагмент РНК TGB-3 и антисмысловой мутированный фрагмент РНК TGB-3 включены в одну единую молекулу РНК. Преимущественно молекула РНК по изобретению способна к такой укладке, что указанные фрагменты РНК, включенные в нее, образуют двухцепочечную шпилечную молекулу РНК. Используемый здесь термин "шпилечная РНК" относится к двухцепочечной молекуле РНК, способной к самоотжигу. В самом простом виде шпилечная РНК состоит из двухцепочечного стебля, образованного отожженными нитями РНК, соединенными петлей одноцепочечной РНК, и ее также называют"РНК в форме ручки сковородки". Тем не менее, в термин "шпилечная РНК" также следует включать более сложные вторичные структуры РНК, содержащие двухцепочечные последовательности РНК, способные к самоотжигу, а также внутренние выпячивания и петли. Конкретная адаптированная вторичная структура определяется свободной энергией молекулы РНК и может быть предсказана для различных ситуаций с использованием подходящего программного обеспечения, такого FOLDRNA (23). Альтернативно смысловая и антисмысловая модифицированные нуклеотидные последовательностиTGB-3 могут присутствовать в двух или на двух отдельных молекулах или нуклеотидных последовательностях, которые могут быть введены в растительную клетку или предоставлены растительной клетке одновременно и/или последовательно, предпочтительно при не слишком большом промежутке времени между предоставлением первой и второй нуклеотидной последовательности, так что при транскрипции может образоваться двухцепочечная молекула РНК в результате спаривания оснований. Предпочтительно последовательности ДНК по изобретению стабильно интегрированы в геном растительной клетки, трансформированной генетически модифицированными вирусными последовательностями TGB-3 по изобретению и/или вектором, содержащим их. Альтернативно трансген, содержащий генетически модифицированную вирусную последовательность TGB-3 по настоящему изобретению, может быть локализован на эписоме или самореплицирующемся векторе. Примерами самореплицирующихся векторов являются вирусы, в частности геминивирусы. Генетически модифицированная вирусная последовательность TGB-3 по настоящему изобретению также может быть трансформирована непосредственно в пластидный геном. Методика пластидной трансформации подробно описана в патентах США 5451513, 5545817 и 5545818, в заявке РСТWO 95/16783 и в McBride et al. (1994) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91: 73 01-73 05, которые включены здесь путем ссылки. Основная методика трансформации хлоропластов включает введение областей клонированной пластидной ДНК, фланкирующих селективный маркер вместе с интересующей нуклеотидной последовательностью в подходящую ткань-мишень, с использованием, например биолистики или трансформации протопластов (например, трансформации, опосредованной хлоридом кальция или полиэтиленгликолем (ПЭГ. Фланкирующие области размером 1-1,5 кб способствуют гомологичной рекомбинации с пластидным геномом, и, таким образом, дают возможность для замещения или модификации специфичных областей пластома (генома хлоропласта).- 12013911 Способы трансформации и регенерации растений хорошо известны в данной области техники. Например, Ti-плазмидные векторы использованы как для доставки чужеродной ДНК, так и для прямого захвата ДНК, липосом, электропорации, микроинъекции и микрочастиц. Кроме того, для трансформации растительных клеток могут быть использованы бактерии рода Agrobacterium. Различные векторы для трансформации, доступные для трансформации растений, известны специалистам в данной области техники, и ДНК или нуклеотидные конструкции по данному изобретению (содержащие генетически модифицированную вирусную последовательность TGB-3) могут быть использованы в сочетании с любыми такими векторами. Выбор вектора зависит от предпочтительной методики трансформации. Селективные маркеры, обычно используемые при трансформации, включают ген nptll, придающий устойчивость к канамицину и родственным антибиотикам (MessingVierra. Gene 19: 259-268 (1982);(1983, ген EPSP3, придающий устойчивость к глифосату (патенты США 4940935 и 5188642), ген аас(6'), кодирующий устойчивость к гентамицину (WO 94/01560), или гены pat и imi, хорошо известные в данной области техники. Множество векторов доступно для трансформации или генетической модификации растительных клеток с использованием Agrobacterium tumefaciens. Эти векторы типично несут по меньшей мере одну пограничную последовательность Т-ДНК и включают векторы, такие как pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res.(1984. Типичные векторы, подходящие для трансформации с помощью Agrobacterium, включают бинарные векторы pCIB200 и рС 1 В 2001, а также бинарный вектор рС 1 В 10 и его производные для отбора по гигромицину (см., например, патент США 5639949). Преимуществом использования методик сAgrobacterium tumefaciens для трансформации растений является присутствие низкой копийности и минимальных перестроек по сравнению с другими методиками. Трансформация без применения Agrobacterium tumefaciens позволяет избежать необходимости в последовательностях Т-ДНК в выбранном для трансформации векторе, и, следовательно, векторы, лишенные этих последовательностей, используют в дополнение к векторам, таким как описаны выше, содержащим последовательности Т-ДНК. Методики трансформации, которые не основаны на Agrobacterium, включают трансформацию путем прямого переноса генов, бомбардировку частицами, захват протопластом (например, посредством ПЭГ и электропорации), трансформацию, опосредованную пыльцой,трансформацию, опосредованную растительными РНК вирусами, микроинъекцию, трансформацию порезанных и/или расщепленных ферментами эмбриогенных тканей и/или незрелых зародышей, трансформацию, опосредованную липосомами и т.п. Выбор вектора в значительной степени зависит от предпочтительного выбора трансформируемого вида и используемого селективного маркера. Типичные векторы,подходящие для трансформации без Agrobacterium, включают pCIB3064, pSOG19 и pSOG35 (см., например, патент США 5639949, включенный здесь путем ссылки). Компоненты экспрессионной системы могут быть модифицированы, например, для усиления экспрессии смыслового и антисмыслового фрагментов РНК. Используемый здесь термин "экспрессионная кассета" означает последовательность ДНК, способную направлять экспрессию конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клеткехозяине, содержащую промотор, оперативно сцепленный с интересующей нуклеотидной последовательностью, которая оперативно сцеплена с сигналами терминации транскрипции. Экспрессионная кассета, содержащая интересующую нуклеотидную последовательность, в настоящем случае генетически модифицированная вирусная последовательность TGB-3 по изобретению, может быть химерной, что означает, что по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным по отношению по меньшей мере к одному из остальных компонентов. Экспрессионная кассета также может представлять собой встречающуюся в природе последовательность, но полученную в рекомбинантной форме, полезной для гетерологичной экспрессии. Тем не менее, обычно экспрессионная кассета является гетерологичной по отношению к хозяину, то есть конкретная последовательность ДНК экспрессионной кассеты в природе не встречается в клетке-хозяине и должна быть введена в клетку-хозяина или предшественник клетки-хозяина посредством события трансформации. Экспрессионные кассеты также могут содержать любые дополнительные последовательности, необходимые или выбранные для экспрессии (и, возможно, для трансляции) трансгена. Такие последовательности, например, включают, но не ограничены ими, терминаторы транскрипции, чужеродные последовательности для усиления экспрессии, такие как интроны, жизненно важные последовательности и последовательности, предназначенные для направления генного продукта в конкретные органеллы и клеточные компартменты. Затем эти экспрессионные кассеты могут быть легко перенесены в векторы для трансформации растений, описанные выше. Ниже представлено описание различных компонентов типичных экспрессионных кассет.- 13013911 к экспрессии нуклеотидной последовательности. Регуляторные элементы обычно включают промотор,оперативно сцепленный с интересующей нуклеотидной последовательностью, и сигналы терминации. Они также могут включать последовательности, требующиеся для правильной трансляции интересующей нуклеотидной последовательности. В настоящем случае трансляция смысловой нуклеотидной последовательности генетически модифицированной вирусной последовательности TGB-3 предпочтительно ингибирована в результате модификации предсказанного стартового и/или стоп-кодона трансляции(см. ниже). Экспрессия нуклеотидной последовательности в экспрессионной кассете может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию только тогда, когда клетка-хозяин подвергается какому-либо конкретному внешнему стимулу. В случае многоклеточного организма, такого как растение, промотор также может быть специфичным для конкретной ткани или органа, либо стадии развития. Промотор, оперативно сцепленный со смысловой и/или антисмысловой нуклеотидными последовательностями по изобретению, может представлять собой нативный промотор трансформируемой клетки. Альтернативно промотор может представлять собой гетерологичный промотор, например тканеспецифичный промотор, промотор, регулируемый в процессе развития, конститутивный промотор или индуцибельный промотор. Подходящие промоторы хорошо известны специалистам в данной области техники. В настоящем изобретении предпочтительны сильные гетерологичные промоторы, которые активны в корневых тканях или первично активны в них (когда экспрессия в других тканях нежелательна). Для использования в экспрессионных кассетах имеется множество терминаторов транскрипции. Они ответственны за терминацию транскрипции за пределами трансгена и его правильное полиаденилирование. Подходящими терминаторами транскрипции являются те, которые известны как функционирующие в растениях, и они включают терминатор CaMV 35S, tm/терминатор, терминатор нопалинсинтазы и терминатор rbcS E9 гороха и тому подобное. Обнаружены многочисленные последовательности, усиливающие экспрессию гена в пределах транскрипционной единицы, и эти последовательности можно использовать в сочетании с генетически модифицированными последовательностями TGB-3 по изобретению для усиления их экспрессии в трансгенных растениях. Например, показано, что различные интронные последовательности, такие как интроны гена Adhl кукурузы, усиливают экспрессию. Кроме того, также известно, что ряд нетранслируемых лидерных последовательностей, выделенных из вирусов, усиливает экспрессию. Предпочтительно по меньшей мере один "экспрессирующийся в растении" промотор оперативно сцеплен со смысловой нуклеотидной последовательностью и/или антисмысловой нуклеотидной последовательностью (см. выше). Предпочтительно смысловая и антисмысловая нуклеотидные последовательности в генетически модифицированной последовательности TGB-3 по изобретению находятся под контролем одного и того же промотора(ов). Используемый здесь термин "промотор, экспрессирующийся в растениях" означает последовательность ДНК, которая способна регулировать (инициировать) транскрипцию в растительной клетке. Он включает любой промотор растительного происхождения, а также любой промотор не растительного происхождения, который способен направлять транскрипцию в растительной клетке или ткани, то есть некоторые промоторы вирусного или бактериального происхождения, такие как CaMV35S, промотор почвенного вируса клевера 4 или 7, или промоторы генов Т-ДНК. Ниже описаны некоторые возможности в отношении выбора промоторов и расположения, зависящие от того, включены ли генетически модифицированные смысловая и антисмысловая нуклеотидные последовательности TGB-3 по изобретению в единую нуклеотидную последовательность или нить ДНК. Смысловая и антисмысловая нуклеотидные последовательности в генетически модифицированной вирусной последовательности TGB-3 по изобретению предпочтительно находятся под контролем одного единого промотора, особенно, когда обе включены в единую нуклеотидную последовательность. Тем не менее, каждая из них также может находиться под контролем разных промоторов (например, при расположении на двух разных последовательностях). Или, другими словами, смысловая последовательность ДНК может быть оперативно сцеплена с первым промотором, а антисмысловая последовательность ДНК оперативно сцеплена со вторым промотором. Первый промотор и второй промотор могут представлять собой одинаковые промоторы или могут представлять собой разные промоторы. Промотор может представлять собой дивергентно транскрибируемый или двунаправленный промотор, способный инициировать транскрипцию последовательностей ДНК с каждой стороны промотора. Когда смысловой фрагмент РНК и антисмысловой фрагмент РНК включены в две молекулы или экспрессируются в виде двух молекул РНК (двух отдельных нитей РНК), смысловая последовательность ДНК и антисмысловая последовательность ДНК могут быть, например, оперативно сцеплены с двунаправленным промотором. Альтернативно смысловая последовательность ДНК может быть оперативно сцеплена с первым промотором, а антисмысловая последовательность ДНК оперативно сцеплена со вторым промотором. Первый промотор и второй промотор могут представлять собой одинаковые промоторы или разные промоторы. Антисмысловая последовательность может представлять собой нить ДНК, комплементарную смы- 14013911 словой модифицированной последовательности TGB-3 в указанной молекуле ДНК (в этом случае молекула ДНК имеет две нити). В этом случае возможно, чтобы промотор был оперативно сцеплен с указанной смысловой или указанной антисмысловой последовательностью ДНК, где первый сайт сайтспецифической рекомбинации находится между указанным промотором и указанной смысловой или указанной антисмысловой последовательностью ДНК, а второй сайт сайт-специфической рекомбинации находится на 3'-конце указанной смысловой или указанной антисмысловой последовательности ДНК, где указанный первый и указанный второй сайты сайт-специфической рекомбинации способны инвертировать указанную первую или вторую последовательность ДНК между указанным первым и указанным вторым сайтом рекомбинации в присутствии сайт-специфической рекомбиназы. В результате указанного инвертирования указанный первый промотор способен экспрессировать указанную антисмысловую (или смысловую, в зависимости от того, какая последовательность ДНК исходно была сцеплена с промотором) последовательность ДНК. Растительная клетка предпочтительно дополнительно содержит сайт-специфическую рекомбиназу, способную распознавать указанные сайты сайт-специфической рекомбинации. Конструкция или последовательность ДНК по изобретению, помимо смысловой и антисмысловой модифицированной вирусной последовательности TGB-3, преимущественно дополнительно содержит линкерную или спейсерную нуклеотидную последовательность между последовательностями ДНК, кодирующими смысловой и антисмысловой фрагменты РНК. В отсутствие такой спейсерной последовательности молекула РНК все же должна быть способна к образованию двухцепочечной РНК, в частности, если смысловая и антисмысловая нуклеотидная последовательность длиннее, чем, примерно, 10 нуклеотидов, и часть смысловой и/или антисмысловой нуклеотидной последовательности будет использована для образования петли, дающей возможность для спаривания оснований между участками со смысловой и антисмысловой нуклеотидной последовательностью и образования двухцепочечной РНК. Ожидают, что не существует ограничений длины или требований к последовательности, связанной со спейсерным участком, до той степени, чтобы параметры не препятствовали способности участков РНК со смысловой и антисмысловой нуклеотидной последовательностями к образованию двухцепочечной РНК. В предпочтительном воплощении длина спейсерного участка варьирует от 5 до примерно 1000 п.о. В предпочтительном воплощении шпилечная РНК, образованная смысловым и антисмысловым участками, и, если пригодно, спейсерным участком, представляет собой искусственную шпилечную РНК. Под "искусственной шпилечной РНК" или "искусственной структурой РНК стебель-петля" подразумевают, что такая шпилечная РНК естественно не встречается в природе. Предпочтительная спейсерная или линкерная нуклеотидная последовательность представляет собой интронную последовательность, предпочтительно в смысловой ориентации, усиливающую эффективность снижения экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени, р 15 ВНПЖС или РНК 2 ВНПЖС в контексте настоящего изобретения. Усиление эффективности может быть выражено в повышении частоты растений, где имеет место сайленсинг, или в увеличении уровня снижения экспрессии р 15 или РНК 2 ВНПЖС. Предпочтительные интронные нуклеотидные последовательности имеют происхождение из генов растений, подобных предсказанным генам рибосомной РНК или высоко транскрибируемым генам растений. Такие интроны могут иметь происхождение из любого растительного гена, но предпочтительно имеют происхождение из генов двудольных растений, например из генов петунии, наиболее предпочтительно они имеют происхождение из генов (сахарной) свеклы. Возможно также использовать только участок этих (растительных) интронов, например, по меньшей мере границы, содержащие сигналы сплайсинга (см. ниже). Все эти интроны и их участки в контексте изобретения названы "фрагментами интронов" или "интронными последовательностями". Предпочтительная длина для таких интронных нуклеотидных последовательностей составляет от примерно 5 до примерно 1000 п.о., предпочтительно от примерно 50 до примерно 600 п.о., более предпочтительно от примерно 90 до примерно 550 п.о. Предпочтительные интронные последовательности включают SEQ ID NO 11 или 14 или даже более предпочтительно состоят из SEQ ID NO 11 или 14. Процессинг интронов зависит от правильных последовательностей 5' и 3' границ сплайсинга, и, по меньшей мере, они должны быть сохранены в интронной последовательности. Согласованные последовательности для этих границ выведены для мРНК как растений, так и животных, но только несколько нуклеотидов известны как инвариантные. Обнаружено, что оба интрона свеклы, описанные ниже (SEQ ID NO 11 и 14), в высокой степени пригодны, причем более короткая последовательность функционирует несколько лучше, чем более длинная последовательность. Молекула РНК, содержащая смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, способная к образованию, например, шпилечной структуры, которая образуется в результате транскрипции химерных генов, также может быть введена непосредственно в растительную клетку. Такие молекулы РНК могут быть получены, например, путем клонирования под контролем промотора, пригодного для распознавания ДНК-зависимой РНК полимеразой в реакции транскрипции in vitro, такого как, но не ограниченного им, промотора, специфичного для Т 7-полимеразы, участка ДНК, способного транскрибиро- 15013911 ваться в молекулу РНК с нуклеотидной последовательностью, содержащей смысловую нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 10 последовательных нуклеотидов, обладающую 75 и 100% идентичностью последовательности по меньшей мере с частью нуклеотидной последовательности интересующей нуклеиновой кислоты, и антисмысловую нуклеотидную последовательность, включающую по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 15, 20 нт, в частности по меньшей мере примерно 50 нт, более конкретно по меньшей мере примерно 100 нт, особенно по меньшей мере примерно 150 нт, более конкретно по меньшей мере примерно 200, 250, 300 нт, особенно по меньшей мере примерно 350 нт или примерно 400 нт, и обладающую 75 и 100% идентичностью последовательности с комплементом по меньшей мере примерно из 10 последовательных нуклеотидов смысловой нуклеотидной последовательности, посредством чего РНК способна к образованию двухцепочечной РНК в результате спаривания оснований между участками со смысловой и антисмысловой нуклеотидной последовательностью, результатом чего является, например, образование шпилечной структуры РНК; проведения реакции транскрипции in vitro путем добавления среди прочего подходящей ДНКзависимой РНК полимеразы, а также необходимых реагентов для образования молекул РНК; и выделения молекул РНК. Способы транскрипции in vitro, также как и другие способы получения РНК in vitro, хорошо известны специалистам в данной области техники, и доступны имеющиеся в продаже наборы. Способы прямого введения РНК в растительные клетки также доступны для специалистов в данной области техники, и включают, но не ограничены ими, электропорацию, микроинъекцию и тому подобное. Кроме того, в изобретении также предложено растение, обладающее устойчивостью или толерантностью к ВНПЖС, содержащее в геноме, по меньшей мере, части своих клеток, предпочтительно, по существу, во всех своих клетках, генетически модифицированную вирусную последовательность TGB-3 по изобретению и/или вектор, содержащий эту последовательность, которые при транскрипции дают молекулу РНК, которая запускает ПТГС и посредством этого разрушение РНК 2 ВНПЖС. Также предложено растение, обладающее устойчивостью или толерантностью к ВНПЖС, которое содержит, по меньшей мере, в части своих клеток, предпочтительно во всех своих клетках, молекулу РНК по изобретению для достижения вышеописанного эффекта."Растение" относится к любому растению или части растения на любой стадии развития. В этот термин также включены черенки, клеточные или тканевые культуры и семена. При использовании в связи с настоящим изобретением термин "растительная ткань" включает, но не ограничен ими, целые растения, клетки растений, органы растений, семена растений, протопласты, каллюс, клеточные культуры, а также любые группы растительных клеток, организованных в структурные и/или функциональные единицы. Последние также относятся к (вегетативно) репродуктивным структурам, подразумевая, что они могут быть регенерированы до целого растения. Полученное трансформированное растение, растительные ткани и растительный материал может быть применен в общепринятом скрещивании и размножении растения или в общепринятых схемах регенерации для получения большего количества трансформированных растений с такими же свойствами(устойчивости или толерантности к вирусам) или для введения конструкции ДНК по настоящему изобретению в другие сорта того же вида или родственных видов растений."Устойчивость или толерантность к вирусам" здесь означает, что устойчивая или толерантная клетка или растение невосприимчива или обладает пониженной восприимчивостью к одному или более чем одному вирусу по сравнению с чувствительной клеткой или растением. В настоящем случае рассмотрена устойчивость и предпочтительно чрезвычайная устойчивость к инфекциям ВНПЖС. Устойчивость или толерантность, например, означает, что обычные симптомы вирусной инфекции, например инфекции ВНПЖС, отсутствуют или уменьшены, либо что накопление или репликация вируса в клетке предотвращена или уменьшена, либо что перенос вируса, например, от клетки к клетке, предотвращен или уменьшен. Настоящее изобретение относится к способам регуляции, то есть изменения и предпочтительно значительного снижения или даже полного ингибирования экспрессии гена р 15 вирусной (ВНПЖС) РНК 2 в клетках, предпочтительно в растительных клетках, или в растениях. ПТГС должен ингибировать экспрессию каждого гена, расположенного на РНК 2. Было обнаружено, что обычно доступные способы не обладают предсказуемостью. Способы по настоящему изобретению облегчают эти проблемы и обеспечивают воспроизводимую и более эффективную регуляцию вирусной устойчивости у растений. Далее изобретение описано путем ссылки на приведенные ниже подробные примеры. Эти примеры приведены только в целях иллюстрации и не предназначены для какого-либо ограничения, если не указано иное. Принципы, продемонстрированные здесь для ВНПЖС и Р 15 ВНПЖС, в равной степени применимы к вирусам, перечисленным в табл.1.- 16013911 Примеры Пример 1. Характеристика трансгенных растений, устойчивых к ВНПЖС. Были созданы три независимых трансгенных линии Beta vulgaris, которые экспрессировали белокBNP15-Ala4 (кодируемый SEQ ID NO 3). Обнаружено, что две из трех линий устойчивы к ВНПЖС. Было обнаружено, что экспрессия белка Р 15 значительно выше в чувствительной линии, чем в устойчивых линиях. Были обнаружены миРНК (малые интерферирующие РНК), но только в растениях линии, устойчивой к ВНПЖС (табл. 2). Таким образом, устойчивость к ВНПЖС, может запускаться посредством ПГТС. Для дальнейшей проверки этой гипотезы по одному листу от каждой линии инфицировали вирусным инокулумом (Stras 1234, обеспечивающий РНК 1, РНК 2, РНК 3 и РНК 4). На листьях устойчивых растений, инфицированных таким образом, развивалось от нескольких поражений до полного их отсутствия, в то время как на листьях чувствительных растений развились многочисленные поражения. В растениях линий, устойчивых к ВНПЖС, обнаружены Р 15-специфичные молекулы миРНК, но они не обнаружены ни в одном из чувствительных растений. Невозможно было обнаружить никакой модификации последовательности гена р 15 или в последовательности терминатора транскрипции. Пример 2. Шпилечные конструкции Р 15. Для изучения функциональности (мутированной) последовательности Р 15, индуцирующей ПТГС,был сконструирован бинарный вектор Agrobacterium, содержащий генетически модифицированный ген р 15 (например, (модифицированная) SEQ ID NO 3) в смысловой и антисмысловой ориентациях, разделенных интроном петунии или интроном сахарной свеклы. Ниже представлены результаты, полученные с тремя конструкциями hp15 (см. фиг. 4, 5). Интронная последовательность в конструкции 1 получена из петунии (см. фиг. 4), тогда как интронная последовательность в конструкциях 2 и 3 получена из свеклы. Конструкции 2 и 3 различаются только по длине интронов: 550 нт в случае вектора pS140 и только 91 нт в случае вектора pS142 (фиг. 5 А и Б соответственно). Создание конструкций ДНК по изобретению и клонирование этих конструкций в Agrobacterium tumefaciens (например, (обезвреженном) штамме GV3101) проводили в соответствии со способами и методиками, хорошо известными в данной области техники. Смысловые и антисмысловые фрагменты р 15, а также интроны, были получены с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающей специфичные сайты рестрикции на концах. При смешивании с векторным каркасом возможна только одна рекомбинация/вставка фрагментов, основанная на совместимости этих специфичных сайтов на концах фрагментов. Правый сайт рестрикции первого фрагмента был таким же, как левый сайт рестрикции второго фрагмента. Для каждой из выше описанных конструкций был создан шпилечный гомолог, содержащий (первые 400 нт) последовательность GFP [вместо генетически модифицированной последовательности р 15], и использован в качестве контроля (шпилечный контроль, названный hpGF). Буфер МА (10 мМ MgCl2, 200 мкМ ацетосирингон) дополнительно служил в качестве контроля обработки. Пример 3. Протоколы экспериментов. Листовой материал Tetragonia expensa, Beta macrocarpa и Beta vulgaris (растения, выдерживающие искусственное заражение листьев ВНПЖС) был инфильтрирован агрономическим путем с последующим инфицированием ВНПЖС (Stras 1234 или Stras 12 (обеспечивающие РНК 1 и РНК 2. Протоколы см. ниже, а конструкции см. выше.Agrobacterium tumefaciens, содержащую шпилечную конструкцию, выращивают в течение ночи при 28 С. Клетки осаждают центрифугированием (15 мин при 5000 g) и ресуспендируют в 10 мМ буфереMgCl2, содержащем ацетосирингон (200 мкМ), и OD 600 нм доводят до 1. Клеточную суспензию хранят при комнатной температуре в течение 3 ч до инфильтрации. Инфильтрацию агрономическим путем проводят с помощью впрыскивания раствора Agrobacterium в листья сеянцев (например, Beta macrocarpa, Beta vulgaris, Tertragonia expansa, Nicotiana benthamina,Chenopodium quinoa) на стадии 4 листьев. Шприцом без иглы объемом 2 мл надавливают на верхнюю сторону проколотого иголкой листа. Инфильтрируют каждый лист за исключением семядолей. Через четыре дня после инфильтрации агрономическим путем обработанные листья инфицировали механической инокуляцией путем втирания на предварительно опыленные карборундом листья 10-25 мкл раствора инокулума (1 мкг вирусной РНК (Stras 1234 или Stras 12), 0,04% макалоида, 50 мМ калийфосфатного буфера, рН 7,5). Листья от Beta macrocarpa, Beta vulgaris, Tertragonia expansa и Nicotiana benthamina обрабатывали таким же образом (см. выше) и наблюдали в них наличие симптомов ризомании в течение 10-13 спи (су- 17013911 ток после инокуляции). Пример 4. Эффект экспрессии мРНК hp15 на размножение ВНПЖС. А. Конструкции с интроном петунии. В приведенных ниже примерах описаны некоторые результаты, полученные на свекле с использованием конструкций hp15 по изобретению. Результаты, полученные с конструкцией 1 (фиг. 4), представлены на фиг. 6. На листьях Betavulgaris, которые были подвергнуты агрономической инфильтрации суспензией, экспрессирующей конструкцию hpGF, и на листьях, инфильтрированных буфером МА, обнаружены желтые хлоротические поражения. Эти поражения были подобны поражениям, наблюдаемым на листьях, которые не были инфильтрированы и инокулированы. Такие поражения не развивались на листьях растений, которые были инфильтрированы агрономическим путем суспензией, экспрессирующей конструкцию hp15 (конструкция 1). Если наблюдали вообще какие-либо поражения, они были гораздо меньше, и, как полагают, соответствовали зонам, где инфильтрация листьев не была оптимальной. Эти предварительные результаты указывают на то, что конструкции hp15 пригодны для индукции ПТГС в растениях В. vulgaris и могут вызывать устойчивость к ВНПЖС. Б. Конструкции с интроном свеклы. Вышеописанные эксперименты повторяли с большим числом растений свеклы и с использованием конструкций 2 и 3, которые различались только по длине интронов. Было обнаружено, что все листья, инфильтрированные буфером МА или суспензией Agrobacteriumtumefaciens, экспрессирующей гомолог hpGF, проявляют большое поражений примерно 3-4 мм в диаметре. На листьях растений, инфильтрированных агрономическим путем hp15 (конструкции 2 или 3) вообще не развивались поражения или очень малое число поражений с максимальным диаметром 1 мм. Результаты, представленные на фиг. 7, указывают на то, что конструкция 2 (с интроном свеклы, размером 91 нт), по-видимому, придает лучшую защиту против ВНПЖС. В. Защита против инфекции изолята Р-типа. Р-тип ВНПЖС, обнаруженный в районе Питивье во Франции, состоит из пяти плюс-смысловых РНК. Этот изолят является высоко патогенным для свеклы. Предполагают, что экспрессия белка Р 26 ухудшает симптомы ризомании (26). Результаты, описанные выше (в разделе Б), были повторены с использованием Р-типа ВНПЖС в качестве вирусного инокулума. Никаких поражений не наблюдали на листьях растений, инфильтрированных агрономическим путем суспензией Agrobacterium tumefaciens, экспрессирующей конструкцию hp15. Таким образом, индукция ПТГС предшественником шпилечной конструкции, по-видимому, является хорошим источником устойчивости против вирусной инфекции, и, в частности, против ВНПЖС. Устойчивость у растений была получена даже против наиболее агрессивных изолятов. Предполагают, что экспрессия конструкции hp15 (в растениях) приводит к образованию днРНК, которая распознается и разрезается на фрагменты размером примерно 21-23 нт (миРНК) ферментом Dicer. Р 15-специфичные миРНК должны образовать комплекс с РИСК (РНК-индуцированным сайленсингкомплексом), который, в свою очередь, направлен на гомолог РНК, РНК 2, а также некоторые субгеномные виды РНК ВНПЖС, и индуцирует расщепление этих РНК. Таким образом, вирус больше не способен к переносу от одной клетки к другой. Пример 5. Конструкции hp15 по изобретению блокируют размножение вируса в клетках коры. Присутствие и распространение ВНПЖС (А, В, Р-типов) изучали в чувствительной диплоидной выращиваемой линии сахарной свеклы 4D6834 ('4D') в источниках природной устойчивости (Holly-1-4,номер по каталогу ('Но') и Beta vulgaris ssp. maritima WB42 ('Bm', и в растениях свеклы, трансформированных по изобретению. В сосудистых тканях белок оболочки вируса обнаружен в пределах ситовидных элементов флоэмы и сосудистой паренхимы. Эти наблюдения подтверждают дистанционный перенос по флоэме. Подробные протоколы, например, по вирусной инфекции и иммунологическому обнаружению, см. Doucet, 2006,диссертация на соискание ученой степени кандидата наук, глава 5, включенная здесь путем ссылки. Показано, что источники природной устойчивости, такие как 'Но', устойчивы только частично. Устойчивость 'Но' разрушалась, например, при наличии высоких титров вируса. Устойчивые растения по изобретению и растения генотипов 'Bm' проявляли такое же ограничение распространения вируса. Важным различием между ними, тем не менее, является то, что 'Bm' все же дает возможность вирусу размножаться в клетках коры. Таким образом, вирусные частицы все же доступны для P. betae (грибковый вектор), который, по-видимому, инфицирует преимущественно кору. Размножение вируса и, следовательно, поддержание инфекционного потенциала, даже если и в меньшей степени,чем у чувствительного сорта, возможно и поддерживает нарастание инфекционной популяции. Преимущество устойчивого генотипа по изобретению является следствием его способности предотвращать размножение вируса в коре. По сравнению с 'Bm' он должен снижать способность вируса к поддержанию инфекционного потенциала в почве.- 18013911 Пример 6. Общие выводы. Из вышеприведенных примеров авторы изобретения могут заключить, что устойчивость к патогенам, опосредованная hp15 по изобретению, является высоко эффективной даже против более агрессивных изолятов ВНПЖС. Конструкции hp15 по изобретению успешно индуцируют устойчивость растения патогенного происхождения. Все протестированные конструкции hp15 индуцируют разрушение РНК 2 посредством ПТГС. Гомологи hpGF никогда не запускают механизм ПТГС (визуальное наблюдение). В этом случае никогда не наблюдали разрушение РНК 2 ВНПЖС (анализ путем нозерн-блоттинга). Вышеописанные примеры относятся к конструкциям hp15, содержащим полноразмерную последовательность р 15. Положительные результаты, тем не менее, также были получены, когда фрагмент (часть или участок) кодирующей последовательности р 15 клонировали в подходящем векторе в смысловой и антисмысловой ориентациях. Например, конструкция, содержащая две трети гена р 15 ВНПЖС, также представляла собой мишень миРНК (малых интерферирующих РНК). Вышеописанное свидетельствует о том, что шпилечные конструкции Р 15, содержащие генетически модифицированную последовательность TGB-3 ВНПЖС по изобретению или ее часть или фрагмент,высокопригодны для индукции ПТГС, который приводит в результате к появлению растений, устойчивых к ВНПЖС. Трансформированные растения предпочтительно отбирают по следующим критериям для максимального успеха. Отбирают трансформанты, несущие однокопийную конструкцию, и растения анализируют на устойчивость к инфекции ВНПЖС. Растения, продуцирующие высокие уровни малых РНК,должны проявлять очень высокие и прочные уровни устойчивости. Трансформация Agrobacterium и/или трансформация растения в соответствии с принципами, описанными в ЕР 1174513, предпочтительны в качестве методики трансформации, поскольку эти методики минимизируют перестройки. Пример 7. Скрининг трансформированных растений, выращенных в инфицированной почве, с помощью ЭЛАЙЗА. Конструкции: вектор pS138 (фиг. 11) использовали для прямой трансформации гена с помощью ПЭГ; и вектор pS143 (фиг. 12) использовали для трансформации, опосредованной Agrobactehum. Обе плазмиды содержат шпилечную конструкцию Р 15-4 (BNP15-Ala4) с короткой интронной последовательностью (91 п.о.), как показано на фиг. 1 А и 1 Б. В указанных конструкциях смысловая последовательность р 15-4 соответствует SEQ ID NO 3, антисмысловая последовательность р 15-4 - SEQ ID NO 12, а интрон - SEQ ID NO 11. Трансформация с помощью ПЭГ: трансформацию с помощью ПЭГ проводили на протопластах замыкающих клеток сахарной свеклы в соответствии со способом, описанным в WO 95/10178. Отбор протопласта и каллюса проводили на 0,2 нМ имазамоксе; всходы и растения отбирали на 20 нМ имазамоксе. Проростки, трансформированные с помощью ПЭГ, были отмечены как THPRxxx. Трансформация, опосредованная Agrobacterium: исходный материал для трансформаций, опосредованных Agrobacterium, состоял из каллюсов, полученных из протопластов замыкающих клеток сахарной свеклы, развивающихся на альгинатных дисках, выращиваемых на твердой среде PG1B (как описано вWO 95/10178). Штамм Agrobacterium (HAT 8000) выращивали в течение ночи на среде LB с добавлением 25 мг/л стрептомицина и 2 мг/л тетрациклина. Перед трансформацией бактериальную культуру центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин, и осадок ресуспендировали в среде PGo с добавлением 100 мкМ ацетосирингона с получением плотности инокулума OD550 1,0. Для инокуляции бактериальную суспензию выливают в чашку Петри с альгинатом, содержащим развивающиеся каллюсы, происходящие из замыкающих клеток устьиц. Через 10 мин альгинат удаляют и высушивают на фильтровальной бумаге, после чего помещают в среду для совместного культивирования (среда PG1B с добавлением 100 мкМ ацетосирингона и 0,9% агарозы Seaplaque, pH 5,8). Культуры инкубировали в темноте при 27 С в течение 1-2 суток, после чего индивидуальные каллюсы переносили на селективную среду с добавлением 125 мг/л цефотаксима, 0,2 нМ имазамокса и 0,8% агарозы, рН 5,8. Две недели спустя выросшие каллюсы переносили в среду PBN с добавлением 0,2 нМ имазамокса и выращивали при свете при 25 С. Развивающиеся всходы и растения отбирали на 20 нМ имазамоксе. Проростки, трансформированные посредством Agrobacterium, были отмечены как AgHPxxx. Скрининг ЭЛАЙЗА: для скрининга ЭЛАЙЗА использовали трансформанты, содержащие только 1 или 2 копии шпилечной конструкции. Проростки, полученные in vitro, переносили на среду для укоренения. Через 6-8 недель трансформанты, укорененные in vitro, обладающие хорошо развитой корневой системой, переносили в смесь почвы с песком, зараженную Polymyxa betae, содержащим ВНПЖС патотипа Р, собранную в районе Питивье (Франция). После четырех недель инкубации при 18-19 С и 70% относительной влажности песок и почву отмывали от корней, и нижние части корней использовали для теста ЭЛАЙЗА. Кусочки корней высушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали и переносили в микропробирки, которые замораживали при 60 С в течение одной ночи с последующей лиофилизацией в течение 2-3 суток. После лиофилизации- 19013911 образцы измельчали (21 мин при 30 об/с). Соответствующее количество экстракционного буфера добавляли в каждую пробирку. Пробирки встряхивали до тех пор, пока порошок не был ресуспендирован,и центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин. В анализе использовали 150 мкл надосадочной жидкости. Содержание вируса в корнях каждого проростка анализировали с помощью иммуноферментного сэндвич-анализа с тремя антителами (TAS-ELISA), используя антитела, образованные против белка оболочки вируса от Neogen (www.neogen.com). Отсекаемым значением для устойчивых растений было принято значение OD405, равное 0,2. Результаты. Чем ниже значение ЭЛАЙЗА, тем ниже количество вируса, присутствующего в корневой системе анализируемых растений. Результаты двух различных биотестов (Rz2007-001A и Rz2007002A) суммированы на фиг. 9 и 10. Следующие растения сахарной свеклы служили в качестве положительного и отрицательного контролей: 4D6834, чувствительный контроль; DKI 8, устойчивый контроль,выделенный из коммерческого селекционного материала; ТМОС 1867 и MOX63MSF1, растения, трансформированные конструкцией р 15-ALA4 (смысловая конструкция, не является шпилечной конструкцией). У растений MOX63MSF1 были обнаружены фрагменты малых РНК. Таким образом, у этих растений был генерирован механизм ПТГС, не запускаемый самой по себе генетической конструкцией, более вероятно, в результате перестроек вставок. Это, возможно, объясняет высокий уровень устойчивости,наблюдаемый у этих растений. Суммарно 20 из 29 линий, трансформированных шпилечной конструкцией р 15 по изобретению,обеспечивали устойчивость к ризомании. Было обнаружено, что только следующие линии являются чувствительными: THPR82, THPR90, AgHp150, AgHp155, THPR12, THPR15, THPR53, THPR239 и THPR270. Вышеописанные данные подтверждают еще раз, что устойчивость к патогенам, опосредованнаяhp15 по изобретению, действительно является высоко эффективной даже против более агрессивных изолятов ВНПЖС. Высокие уровни иммунитета наблюдали, например, в следующих линиях трансформированных растений биотеста RZ2007-002A: THPR26, THPR118, THPR222 и THPR289. Растения с высоким уровнем иммунитета преимущественно имеют значение OD400 ниже 0,05, более предпочтительно ниже 0,01 или близкое к 0 (нулю). ССЫЛКИ 1. Tamada Т.Baba Т., Annals of the Phytopathological Society of Japan 39, pp. 325-332(1973). 2. Kuszala M. Putz C, Annals of Phytopathology 9, pp. 435-446 (1977). 3. Keskin В., Archiv fur Mikrobiology 49, pp. 348-374 (1964). 4. Asher M.J.C., Rhizomania In The sugar beet crop, ed. 10 D.A. Cooke and R.K. Scott, ChapmanHall,London, pp. 312-338 (1993). 5. Richard-Molard M., Rhizomanie In Institut frangais de la betterave industrielle. Compte-rendu des Таблица 2. Выявление экспрессии белка Р 15 Р 15-специфичных миРНК в трансгенных растениях ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Генетически модифицированная вирусная последовательность TGB-3, содержащая последовательность, выбранную из группы, состоящей из(б) нуклеотидной последовательности, включающей фрагмент SEQ ID NO: 3 и антисмысловую последовательность указанного фрагмента SEQ ID NO: 3;(в) нуклеотидной последовательности, включающей модифицированную SEQ ID NO: 3 и антисмысловую последовательность указанной модифицированной SEQ ID NO: 3; и(г) нуклеотидной последовательности, включающей фрагмент модифицированной SEQ ID NO:3 и антисмысловую последовательность указанного модифицированного фрагмента SEQ ID NO: 3,где указанная модифицированная вирусная последовательность при транскрипции в клетке способна к образованию двухцепочечной самокомплементарной молекулы РНК. 2. Вирусная последовательность TGB-3 по п.1, где смысловая и антисмысловая последовательности включены в одну последовательность нуклеиновой кислоты.- 21013911 3. Вирусная последовательность TGB-3 по п.1 или 2, дополнительно содержащая интронный фрагмент, разделяющий смысловую и антисмысловую последовательности, где вирусная последовательностьTGB-3 при транскрипции в клетке способна к образованию шпилечной молекулы РНК. 4. Вирусная последовательность TGB-3 по п.3, где интронный фрагмент имеет происхождение из гена растения. 5. Вирусная последовательность TGB-3 по п.4, где ген растения представляет собой ген свеклы. 6. Вирусная последовательность TGB-3 по п.3, где интронный фрагмент представляет собой интронный фрагмент высоко транскрибируемых генов. 7. Вирусная последовательность TGB-3 по п.6, где высоко транскрибируемые гены представляют собой гены рибосомной РНК. 8. Вирусная последовательность TGB-3 по п.6, где высоко транскрибируемые гены представляют собой высоко транскрибируемые гены сахарной свеклы. 9. Вирусная последовательность TGB-3 по любому из пп.1-8, где в указанной модифицированной последовательности SEQ ID NO:3 стартовый и/или стоп-кодон трансляции последовательности SEQ IDNO: 3 модифицирован(ы) таким образом, чтобы ингибировать трансляцию. 10. Вирусная последовательность TGB-3 по любому из пп.1-9, включающая SEQ ID NO: 9 или SEQID NO: 13. 11. Вирусная последовательность TGB-3 по любому из пп.1-10, состоящая из SEQ ID NO: 9 илиSEQ ID NO: 13. 12. Вектор, содержащий генетически модифицированную вирусную последовательность TGB-3 по любому из пп.1-11. 13. Вектор по п.12, оперативно сцепленный с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растительной клетке. 14. Двухцепочечная самокомплементарная молекула РНК, экспрессируемая вектором по п.12 или 13. 15. Способ индукции устойчивости к вирусу в растении или в растительной клетке, включающий получение конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей генетически модифицированную вирусную последовательность TGB-3 по любому из пп.1-14, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении или в растительной клетке, и трансформацию растительной клетки конструкцией нуклеиновой кислоты, индуцируя посредством этого устойчивость к вирусу в растении или в растительной клетке. 16. Способ по п.15, где вирус выбран из группы, состоящей из вируса растрескивания ствола яблони, вируса пятнистости черники, вируса картофеля М, вируса мозаики белого клевера, вируса мозаикиCymbidium, вируса ложной штриховатости ячменя, вируса курчавости верхушки картофеля, вируса кустистости земляного ореха, передающегося через почву вируса свеклы и вируса ВНПЖС. 17. Способ индукции посттранскрипционного генного сайленсинга целой РНК 2, и более конкретно белка переноса TGB-3 в растении или в растительной клетке, включающий стадии получения конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей генетически модифицированную вирусную последовательность TGB-3 по любому из пп.1-16, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении или в растительной клетке, и трансформации растительной клетки нуклеиново-кислотной конструкцией, в результате чего экспрессия в указанных растительных клетках молекулы РНК, которая способна к образованию двухцепочечной молекулы РНК, запускает механизм посттранскрипционного генного сайленсинга. 18. Способ по п.17, где растительная клетка представляет собой устьичную клетку. 19. Способ по п.17 или 18, где растение выбрано из группы, состоящей из яблока, черники, картофеля, клевера, орхидеи, ячменя, земляного ореха или сахарной свеклы. 20. Способ по любому из пп.17-19, дополнительно включающий регенерацию трансгенного растения из трансформированной растительной клетки. 21. Способ по любому из пп.17-20, где регуляторная последовательность включает промоторную последовательность или терминаторную последовательность, активную в растениях. 22. Способ по п.21, где промоторная последовательность представляет собой конститутивную или чужеродную промоторную последовательность. 23. Способ по п.21, где промоторная последовательность выбрана из группы, состоящей из промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и полиубиквитинового промотора Arabidopsis thaliana. 24. Способ по п.21, где промоторная последовательность представляет собой промотор, активный в корневой ткани растений. 25. Способ по п.24, где промоторная последовательность представляет собой промотор, активный в корневой ткани растений свеклы. 26. Способ по п.24, где указанный промотор, активный в корневой ткани растений, представляет собой промотор par гена гемоглобина из Perosponia andersonii. 27. Трансгенное растение или трансгенная растительная клетка, устойчивые к вирусу и содержащие конструкцию нуклеиновой кислоты, имеющую генетически модифицированную вирусную последова- 22013911 тельность TGB-3 по любому из пп.1-11, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении или в растительной клетке, содержащие вектор по любому из пп.12-13 или содержащие двухцепочечную самокомплементарную молекулу РНК по п.14. 28. Трансгенное растение или трансгенная растительная клетка по п.27, где вирус выбран из группы, состоящей из вируса растрескивания стебля яблони, вируса пятнистости черники, вируса картофеля М, вируса мозаики белого клевера, вируса мозаики Cymbidium, вируса картофеля X, вируса ложной штриховатости ячменя, вируса курчавости верхушки картофеля, вируса кустистости земляного ореха,передающегося через почву вируса свеклы и вируса ВНПЖС. 29. Трансгенное растение или трансгенная растительная клетка по п.27 или 28, выбранные из группы, состоящей из яблока, черники, картофеля, клевера, орхидеи, ячменя, земляного ореха или сахарной свеклы. 30. Трансгенное растение или трансгенная растительная клетка по любому из пп.27-29, где регуляторная последовательность включает промоторную последовательность и терминаторную последовательность, которые активны в растении. 31. Трансгенное растение по п.30, где указанный промотор активен в корневой ткани растений. 32. Трансгенное растение по п.30 или 31, где указанный промотор представляет собой промотор par гена гемоглобина из Perosponia andersonii. 33. Трансгенное растение или трансгенная растительная клетка по любому из пп.27-32, где указанное трансгенное растение представляет собой сахарную свеклу и указанная трансгенная растительная клетка представляет собой клетку сахарной свеклы. 34. Трансгенное растение или трансгенная растительная клетка по любому из пп.27-33, где регуляторная последовательность(и) включает промоторную последовательность, которая представляет собой конститутивную или чужеродную растительную промоторную последовательность. 35. Трансгенное растение или трансгенная растительная клетка по любому из пп.27-34, где промотор выбран из группы, состоящей из промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и полиубиквитинового промотора Arabidopsis thaliana. 36. Трансгенная растительная ткань, полученная из трансгенной растительной клетки по любому из пп.27-35, где указанная ткань выбрана из группы, состоящей из плода, стебля, корня, клубня и семени. 37. Трансгенная репродуктивная структура, полученная из трансгенной растительной клетки по любому из пп.27-35, где указанная репродуктивная структура выбрана из группы, состоящей из каллусов, почек и зародышей.