Конструкции нуклеиновых кислот
Формула / Реферат
1. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность промотора и кодирующую последовательность, функционально связанную с промотором, где кодирующая последовательность кодирует
антиген вируса гриппа, его иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант любого из них, обладающий по меньшей мере 80% аминокислотной гомологией с указанным антигеном или фрагментом; и/или
ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или вариант любого из них, обладающий адъювантной активностью и обладающий по меньшей мере 80% аминокислотной гомологией, с указанной субъединицей или фрагментом,
где конструкция обладает одной или несколькими характеристиками (А)-(С):
(A) промотор является химерным промотором, где последовательность химерного промотора содержит:
(i) последовательность предраннего промотора hCMV,
(ii) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 главного предраннего гена hCMV и
(iii) гетерологичный интрон, размещенный вместо области интрона А главного предраннего гена hCMV;
(B) конструкция содержит нетранслируемую лидерную последовательность, которая происходит из последовательности антигена HBV preS2, последовательности е-антигена HBV или последовательности антигена HSV типа 2gD, которая функционально связана с кодирующей последовательностью и промотором, который гетерологичен кодирующей последовательности; и
(С) конструкция содержит энхансерную последовательность с 3'-конца от кодирующей последовательности и функционально связанную с ней, где энхансерная последовательность происходит из 3'-UTR последовательности HBsAg или последовательности предраннего гена CMV обезьян и кодирующая последовательность гетерологична 3'-энхансерной последовательности.
2. Конструкция по п.1, где конструкция содержит (А).
3. Конструкция по п.1 или 2, где конструкция содержит по меньшей мере одну из (В) и (С).
4. Конструкция по любому из предшествующих пунктов, где конструкция содержит все три (А), (В) и (С).
5. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где конструкция кодирует антиген гриппа, который является:
(a) гемагглютинином гриппа (HA), его иммуногенным фрагментом или иммуногенным вариантом по меньшей мере с 80% гомологией аминокислотной последовательности с любым из них и/или
(b) нейраминидазой гриппа (NA), М2, иммуногенным фрагментом любого из них или иммуногенным вариантом, обладающим по меньшей мере 80% гомологией аминокислотной последовательности с любым указанным NA, M2 или фрагментом.
6. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где кодирующая последовательность кодирует антиген гриппа, его фрагмент или вариант, относящийся к любому пандемическому штамму гриппа.
7. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где конструкция кодирует антиген пандемического гриппа, его иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант указанного антигена или фрагмента и один или несколько антигенов непандемического гриппа, его(их) иммуногенный(е) фрагмент(ы) или иммуногенный(е) вариант(ы) указанного(ых) антигена(ов) или фрагмента(ов).
8. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где:
(i) кодирующая последовательность кодирует более одного антигена гриппа, фрагмента или иммуногенного варианта;
(ii) кодирующая последовательность кодирует более одного антигена гриппа и по меньшей мере два разных антигена, фрагмента или варианта, кодирует один полипептид гриппа из разных штаммов вируса гриппа;
(iii) кодирующая последовательность кодирует антиген гриппа, фрагмент или вариант любых, от трех до пяти, разных штаммов гриппа и/или
(iv) кодирующая последовательность кодирует антиген гриппа, фрагмент или вариант, относящийся к любым трем или четырем непандемическим штаммам гриппа.
9. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где конструкция кодирует ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или вариант любого из них, обладающий адъювантной активностью и обладающий по меньшей мере 80% аминокислотной гомологией с указанной субъединицей или фрагментом, где ADP-рибозилирующая субъединица бактериального токсина выбрана из субъединицы А холерного токсина, субъединицы В холерного токсина, субъединицы А термолабильного токсина E.coli и субъединицы В термолабильного токсина E.coli.
10. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.9, где конструкция нуклеиновой кислоты содержит две кодирующие последовательности, каждая из которых содержит другую указанную субъединицу, фрагмент или вариант и каждый из которых связан с указанным химерным промотором.
11. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.10, где две кодирующие последовательности кодируют субъединицу А холерного токсина и субъединицу В холерного токсина соответственно или субъединицу А термолабильного токсина E.coli и субъединицу В термолабильного токсина E.coli соответственно.
12. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из пп.9-11, где:
(i) указанные две кодирующие последовательности расположены в противоположной ориентации или
(ii) указанные две кодирующие последовательности расположены в одинаковой ориентации.
13. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где конструкция содержит химерный промотор, как определено в п.1, часть (А), который обладает одним или несколькими признаками из (А)-(Е), как указано далее:
(A) последовательность предраннего промотора hCMV (a) содержит:
(i) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, нуклеотиды с 903 по 1587 SEQ ID NO:54, нуклеотиды с 1815 по 1935 SEQ ID NO:61, нуклеотиды с 1948 по 2632 SEQ ID NO:61, нуклеотиды с 1002 по 1686 SEQ ID NO:62 и/или нуклеотиды с 2624 по 3308 SEQ ID NO:62,
(ii) функциональный вариант (i), который обладает по меньшей мере 80% гомологией нуклеотидной последовательности с одной или несколькими последовательностями (i), или
(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii);
(B) последовательность экзона (b) содержит:
(i) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, нуклеотидную последовательность нуклеотидов с 1588 по 1718 SEQ ID NO:54, нуклеотиды с 1684 по 1814 SEQ ID NO:61, нуклеотиды с 2633 по 2763 SEQ ID NO:61, нуклеотиды с 1687 по 1817 SEQ ID NO:62 и/или нуклеотиды с 3309 по 3439 SEQ ID NO:62,
(ii) функциональный вариант (i), который обладает по меньшей мере 80% гомологией нуклеотидной последовательности с одной или несколькими последовательностями (i), или
(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii);
(C) гетерологичный интрон является последовательностью интрона А гена инсулина крысы и содержит:
(i) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3, нуклеотидную последовательность нуклеотидов с 1725 по 1857 SEQ ID NO:54, нуклеотиды с 1545 по 1677 SEQ ID NO:61, нуклеотиды с 2770 по 2902 SEQ ID NO:61, нуклеотиды с 1824 по 1956 SEQ ID NO:62 и/или нуклеотиды с 3446 по 3578 SEQ ID NO:62,
(ii) функциональный вариант (i), который обладает по меньшей мере 80% гомологией нуклеотидной последовательности с одной или несколькими последовательностями (i), или
(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii);
(D) химерная промоторная последовательность содержит:
(i) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:4 или нуклеотидную последовательность нуклеотидов с 903 по 1857 SEQ ID NO:54,
(ii) функциональный вариант (i), который обладает по меньшей мере 80% гомологией нуклеотидной последовательности с (i), или
(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii);
(E) гетерологичный интрон (с), содержащий последовательность, выбранную из последовательности интрона А гена инсулина крысы, последовательности интрона А гена кератина курицы, последовательности интрона А гена сердечного актина курицы, функционального фрагмента любого из них или функционального варианта любого из вышеперечисленного.
14. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где конструкция обладает одним или несколькими признаками из (А)-(Е), как указрэю далее:
(А) конструкция содержит энхансерную последовательность, как определено в п.1, часть (С), где энхансерная последовательность содержит:
(i) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, нуклеотиды с 3699 по 4231 SEQ ID NO:54, нуклеотиды с 3831 по 4363 SEQ ID NO:61 и/или с 4507 по 5038 SEQ ID NO:62,
(ii) функциональный вариант (i), который обладает по меньшей мере 80% гомологией нуклеотидной последовательности с указанной последовательностью (i), или
(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii);
(B) конструкция содержит нетранслируемую лидерную последовательность, как определено в п.1, часть (А), где нетранслируемая лидерная последовательность содержит:
(i) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или нуклеотиды с 1864 по 1984 SEQ ID NO:54,
(ii) функциональный вариант (i), который обладает по меньшей мере 80% гомологией нуклеотидной последовательности с (i), или
(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii);
(C) конструкция является плазмидой;
(D) конструкция содержит сигнал полиаденилирования и/или
(E) конструкция дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, который функционально связан с последовательностью, кодирующей антиген, субъединицу экзотоксина, фрагмент или вариант.
15. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.14, где конструкция обладает одним или несколькими признаками из (А)-(С), как указано далее:
(А) сигнальный пептид выбран из сигнального пептида активатора плазминогена ткани человека (hTPAsp), сигнального пептида апротинина, сигнального пептида экстенсина табака и сигнального пептида лизоцима курицы;
(B) последовательность полиаденилирования является последовательностью полиаденилирования гена, выбранного из гена b-глобина кролика, раннего или позднего генов вируса папилломы человека (HPV), гена HSV-2gB, предраннего гена CMV обезьян и позднего гена HSV gD; и
(C) последовательность полиаденилирования выбрана из:
(i) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, нуклеотидов с 4243 по 4373 SEQ ID NO:54, нуклеотидов с 906 по 1038 SEQ ID NO:61, нуклеотидов с 4375 по 4050 SEQ ID NO:61 или нуклеотидов с 2463 по 2593 SEQ ID NO:62,
(ii) функционального варианта (i), который обладает по меньшей мере 80% гомологией нуклеотидной последовательности с указанной последовательностью (i), или
(iii) функционального фрагмента (i) или (ii).
16. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, которая содержит:
(i) последовательность вектора pPJV7563, представленную как SEQ ID NO:14, или
(ii) последовательность по меньшей мере с 60% идентичности последовательности с последовательностью (i), и
последовательность, кодирующая указанный антиген, фрагмент или вариант, расположена в указанной последовательности (i) или (ii) так, что она функционально связана с химерным промотором.
17. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, которая содержит:
(a) последовательность вектора pPJV1671, представленную как SEQ ID NO:54, или последовательность по меньшей мере с 60% идентичностью последовательности к ней;
(b) последовательность вектора pPML7789, представленную как SEQ ID NO:59, или последовательность по меньшей мере с 60% идентичностью последовательности к ней;
(c) последовательность вектора pPJV2012, представленную как SEQ ID NO:61, или последовательность по меньшей мере с 60% идентичностью последовательности к ней или
(d) последовательность вектора pPJV7788, представленную как SEQ ID NO:62, или последовательность по меньшей мере с 60% идентичностью последовательности к ней.
18. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где промотор не является химерным промотором из (А) и вместо этого выбран из последовательности предраннего промотора hCMV, последовательности промотора вируса ложного бешенства и последовательности промотора вируса саркомы Рауса.
19. Популяция конструкций нуклеиновых кислот, где популяция содержит по меньшей мере две разные конструкции по любому из предшествующих пунктов.
20. Популяция конструкций нуклеиновых кислот по п.19, где популяция содержит:
(i) по меньшей мере две разные конструкции, кодирующие антигены гриппа, их иммуногенные фрагменты или иммуногенные варианты любого из них и/или
(ii) по меньшей мере одну конструкцию, кодирующую ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент или ее вариант.
21. Популяция конструкций нуклеиновых кислот по п.20, где:
(a) по меньшей мере два разных антигена происходят из одинакового полипептида гриппа из разных штаммов гриппа и/или
(b) по меньшей мере два разных антигена, фрагмента или варианта происходят из разных полипептидов гриппа из того же или другого штамма гриппа.
22. Популяция конструкций нуклеиновых кислот по любому из пп.19-21, где популяция содержит по меньшей мере три разные конструкции, каждая из которых кодирует другой антиген гриппа, иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант.
23. Популяция конструкций нуклеиновых кислот, которая обладает одним или несколькими признаками из (А)-(D):
(A): (i) по меньшей мере одна из конструкций кодирует ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или вариант любого из них, обладающий адъювантной активностью и обладающий по меньшей мере 80% аминокислотной гомологией с указанной субъединицей или фрагментом; и
(ii) по меньшей мере одна из конструкций кодирует антиген вируса простого герпеса (HSV);
где последовательность, кодирующая указанную субъединицу, фрагмент или вариант и/или антиген HSV, функционально связана с химерным промотором, который содержит:
(а) последовательность предраннего промотора hCMV,
(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 главного предраннего гена hCMV и
(c) гетерологичный интрон, размещенный вместо области интрона А главного предраннего гена hCMV;
(В): (i) по меньшей мере одна из конструкций кодирует ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или вариант любого из них, обладающий адъювантной активностью и обладающий по меньшей мере 80% аминокислотной гомологией с указанной субъединицей или фрагментом; и
(ii) по меньшей мере одна из конструкций кодирует антиген HSV,
где по меньшей мере одна из указанных конструкций дополнительно содержит:
(a) нетранслируемую лидерную последовательность, которая происходит из последовательности антигена HBV preS2, последовательности е-антигена HBV или последовательности антигена HSV типа 2gD, которая функционально связана с кодирующей последовательностью указанной конструкции и промотором, который гетерологичен кодирующей последовательности, и/или
(b) энхансерную последовательность с 3'-конца от кодирующей последовательности указанной конструкции и функционально связанную с ней, где энхансерная последовательность происходит из 3'-UTR последовательности HBsAg или последовательности предраннего гена CMV обезьян и кодирующая последовательность гетерологична 3'-энхансерной последовательности;
(С): (i) первая конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая химерную промоторную последовательность и кодирующую последовательность, функционально связанную с химерным промотором, где кодирующая последовательность кодирует ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или вариант любого из них, обладающий адъювантной активностью и обладающий по меньшей мере 80% аминокислотной гомологией с указанной субъединицей или фрагментом; и химерная последовательность промотора содержит:
(a) последовательность предраннего промотора hCMV,
(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 главного предраннего гена hCMV и
(c) гетерологичный интрон, размещенный вместо области интрона А главного предраннего гена hCMV, и
(ii) вторая конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере один антиген HSV;
(D): (i) первая конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность промотора и кодирующую последовательность, функционально связанную с промотором, где кодирующая последовательность кодирует ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или вариант любого из них, обладающий адъювантной активностью и обладающий по меньшей мере 80% аминокислотной гомологией с указанной субъединицей или фрагментом; и конструкция дополнительно содержит:
(а) нетранслируемую лидерную последовательность, которая происходит из последовательности антигена HBV preS2, последовательности е-антигена HBV или последовательности антигена HSV типа 2gD, которая функционально связана с кодирующей последовательностью и промотором, который гетерологичен кодирующей последовательности; и/или
(b) энхансерную последовательность с 3'-конца от кодирующей последовательности и функционально связанную с ней, где энхансер происходит из 3'-UTR последовательности HBsAg или последовательности предраннего гена CMV обезьян, и кодирующая последовательность гетерологична 3'-энхансерной последовательности;
(ii) вторая конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере один антиген HSV.
24. Популяция конструкций нуклеиновых кислот по любому из пп.19-23, содержащая:
(i) первую конструкцию нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность вектора pPJV2012, представленную как SEQ ID NO:61, или последовательность по меньшей мере с 60% идентичностью последовательности к ней; и
(ii) вторую конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген HSV.
25. Покрытые частицы, которые содержат частицы носителя, покрытые конструкцией нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-18 или популяцией конструкций нуклеиновых кислот по любому из пп.19-24.
26. Покрытые частицы по п.25, обладающие одним или несколькими признаками из (А)-(G), как указано далее:
(A) частицы носителя покрыты по меньшей мере двумя разными конструкциями нуклеиновых кислот, как определено в п.1, где каждая указанная конструкция кодирует указанный HA, фрагмент или вариант другого штамма гриппа;
(B) частицы носителя покрыты, от трех до пяти, разными указанными конструкциями;
(C) три или четыре указанные конструкции кодируют указанный HA, фрагмент или вариант разных непандемических штаммов гриппа;
(D) частицы покрыты указанной конструкцией, которая кодирует указанный HA, фрагмент или вариант пандемического штамма гриппа;
(E) частицы также покрыты конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность промотора и кодирующую последовательность, функционально связанную с промотором, где кодирующая последовательность кодирует ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или вариант любого из них, обладающий адъювантной активностью и обладающий по меньшей мере 80% аминокислотной гомологией с указанной субъединицей или фрагментом;
(F) частицы также покрыты конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность промотора и кодирующую последовательность, функционально связанную с промотором, где кодирующая последовательность кодирует ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или вариант любого из них, обладающий адъювантной активностью и обладающий по меньшей мере 80% аминокислотной гомологией с указанной субъединицей или фрагментом, где конструкция является такой, как определено в любом из пп.1-18; и/или
(G) частицы носителя являются частицами золота.
27. Дозировочная емкость устройства для опосредованной частицами доставки, содержащая покрытые частицы, определенные в пп.25, 26.
28. Устройство для опосредованной частицами доставки, заполненное покрытыми частицами, как определено в п.25 или 26.
29. Устройство для опосредованной частицами доставки по п.28, которое является безыгольным шприцем.
30. Фармацевтическая или вакцинная композиция, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-18 или популяцию конструкций нуклеиновых кислот по любому из пп.19-24 вместе с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом.
31. Вакцинная композиция по п.30, которая является поливалентной вакциной, содержащей по меньшей мере две разные конструкции, которые кодируют разные антигены гриппа, их иммуногенные фрагменты или иммуногенные варианты любого из них.
32. Вакцинная композиция по п.30, которая является тривалентной, тетравалентной или пентавалентной вакциной против гриппа.
33. Применение конструкции нуклеиновой кислоты, определенной в любом из пп.1-18, популяции конструкций нуклеиновых кислот определяют в любом из пп.19-24, или покрытых частиц, определенных в п.25 или 26, для изготовления лекарственного средства, используемого при профилактике гриппа.
34. Применение по п.33, где лекарственное средство предназначено для доставки путем безыгольной инъекции.
35. Способ профилактики гриппа, включающий введение конструкции нуклеиновой кислоты, определенной в любом из пп.1-18, популяции конструкций нуклеиновых кислот, определенной в любом из пп.19-24, или покрытых частиц, определенных в пп.25, 26.
36. Способ по п.35, где введение осуществляют безыгольной инъекцией.
Текст
011557 Область изобретения Изобретение относится к молекулярной биологии и иммунологии и, в целом, к реагентам, пригодным в способах иммунизации нуклеиновыми кислотами. Более конкретно, изобретение относится к конструкциям нуклеиновых кислот для экспрессии полипептидов и, в частности, антигенных полипептидов,в частности антигенов гриппа, а также экспрессии адъювантных полипептидов, и к способам иммунизации нуклеиновыми кислотами с использованием таких реагентов. Предпосылки изобретения Генная терапия и иммунизация нуклеиновыми кислотами являются перспективными подходами для лечения и профилактики как приобретенных, так и наследуемых заболеваний. Данные способы включают перенос требуемой нуклеиновой кислоты субъекту с последующей экспрессией in vivo. Перенос можно осуществлять трансфицированием клеток или тканей субъекта ex vivo и повторным введением трансформированного материала хозяину. Альтернативно, нуклеиновую кислоту можно вводить in vivo непосредственно реципиенту. Для каждого из этих способов необходима эффективная экспрессия нуклеиновой кислоты в трансфицированной клетке, чтобы обеспечить достаточное количество терапевтического или антигенного генного продукта. Несколько факторов, как известно, влияют на полученные уровни экспрессии, включая эффективность трансфекции и эффективность, с которой транскрибируется ген или интересующая последовательность и транслируется мРНК. В данной области описан ряд систем экспрессии, каждая из которых, как правило, состоит из вектора, содержащего ген или интересующую нуклеотидную последовательность, функционально связанную с последовательностями, управляющими экспрессией. Данные управляющие последовательности содержат последовательности промотора транскрипции и последовательности начала и терминации транскрипции. Обычно используемые промоторы для систем экспрессии в клетках млекопитающих включают,среди других, ранний промотор SV40, промотор цитомегаловируса (CMV), такой как предранний промотор CMV (Chapman et al. (1991), Nucl. Acids Res. 19:3979-3986), промотор длинного концевого повтора(LTR) вируса опухоли молочной железы мыши, главный поздний промотор аденовируса (Ad MLP) и промотор вируса простого герпеса (HSV). Также обычно используют невирусные промоторы, такие как промотор, происходящий из гена металлотионеина мышиных. Системы экспрессии часто содержат элементы, модулирующие транскрипцию, обозначаемые как энхансеры. Энхансеры широко определяют как цис-действующие элементы, которые, при функциональной связанности с последовательностью промотора/гена, будут усиливать транскрипцию последовательности данного гена. Энхансеры могут функционировать в положениях, которые находятся очень далеко от интересующей последовательности по сравнению с другими элементами, управляющими экспрессией (например, промоторами), и могут действовать при расположении в любой ориентации по отношению к интересующей последовательности (Banerji et al. (1981), Cell. 22:299-308, deVilleirs et al.(1981), Nucl. Acids Res, 9:6251-6264). Энхансеры идентифицировали из ряда вирусных источников, включая вирус полиомы, вирус ВК, цитомегаловирус (CMV), аденовирус, вирус 40 обезьян (SV40), вирус саркомы Молони, вирус папилломы быка и вирус саркомы Рауса (deVilleirs et al., выше, Rosenthal et al.(1983), Science, 222:749-755, Hearing et al. (1983), Cell. 33:695-703, Weeks et al. (1983), Mol. Cell. Biol. 3:1222-1234, Levinson et al. (1982), Nature, 295:568-572 и Luciw et al. (1983), Cell. 33:705-716). В ряде систем экспрессии для иммунизации нуклеиновыми кислотами и генной терапии применяют предранний промотор hCMV. См., например, патенты США 5168062 и 5385839 для Stinski и описание патента ЕР 0323997 В 1. Экспрессирующие векторы с использованием предраннего промотора hCMV включают, например, pWRG7128 (Roy et al., Vaccine 19, 764-778, 2001), pBC12/CMV и pJW4303, которые упомянуты в WO 95/20660. Chapman et al. (1991), выше, сообщают о пониженных уровнях экспрессии с предраннего промотора hCMV в отсутствие интрона A hCMV. Сущность изобретения Конструкцию нуклеиновой кислоты (нуклеиновокислотный конструкт) разработали с использованием управляемых вирусных промоторных/экспрессирующих последовательностей, которые обеспечивают повышенную экспрессию гетерологичных кодирующих последовательностей в клетках-хозяевах. Конструкция пригодна для эффективной экспрессии генов и, в частности, генов, кодирующих антигены,и ее можно, таким образом, применять для иммунизации нуклеиновыми кислотами. Конструкцию можно также применять для экспрессии адъювантных полипептидов. Конструкцию можно предоставить на частицах носителя для применения в опосредованной частицами иммунизации нуклеиновыми кислотами. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения конструкция кодирует антиген гриппа, его иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант того и другого. В другом, особенно предпочтительном варианте осуществления конструкция кодирует адъювантный полипептид. Таким образом, настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, пригодной для доставки субъекту для индукции иммунного ответа против антигена гемагглютинина (HA) вируса гриппа; данная конструкция включает в себя:(a) последовательность предраннего промотора hCMV,-1 011557(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 главного предраннего гена hCMV и(c) гетерологичный интрон, предусмотренный вместо области интрона А главного предраннего гена(ii) кодирующую последовательность, функционально связанную с химерным промотором, где кодирующая последовательность кодирует антиген гемагглютинина (HA) вируса гриппа, его иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант указанного антигена или фрагмент, обладающий по меньшей мере 80% аминокислотной гомологией с указанным антигеном или фрагментом;(iii) нетранслируемую лидерную последовательность, которая происходит из последовательности антигена HBV preS2, последовательности е-антигена HBV или последовательности антигена HSV типа 2gD и которая функционально связана с химерным промотором; и(iv) энхансерную последовательность, которая происходит из 3'-нетранслируемой области (UTR) последовательности HBsAg или последовательности предраннего гена CMV обезьян, которая функционально связана с химерным промотором и которая расположена ниже кодирующей последовательности. Настоящее изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, пригодной для доставки субъекту для индукции иммунного ответа против антигена гемагглютинина (HA) вируса гриппа; данная конструкция включает в себя:(a) последовательность предраннего промотора hCMV,(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 главного предраннего гена hCMV и(c) гетерологичный интрон, предусмотренный вместо области интрона А главного предраннего гена(ii) кодирующую последовательность, функционально связанную с химерным промотором, где кодирующая последовательность кодирует антиген гемагглютинина (HA) вируса гриппа, его иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант указанного антигена или фрагмент, обладающий по меньшей мере 80% аминокислотной гомологией с указанным антигеном или фрагментом. Далее, настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей химерную промоторную последовательность и участок клонирования для вставки кодирующей последовательности, функционально связанной с химерным промотором, где химерная промоторная последовательность содержит:(a) последовательность предраннего промотора hCMV;(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 главного предраннего гена hCMV и(с) гетерологичный интрон, предусмотренный вместо области интрона А главного предраннего генаhCMV. В предпочтительном варианте конструкция содержит кодирующую последовательность, вставленную в участок клонирования. Таким образом, кодирующую последовательность можно предоставить в участке клонирования. В другом предпочтительном варианте осуществления конструкция по изобретению может дополнительно содержать:(a) нетранслируемую лидерную последовательность, которая происходит из последовательности антигена HBV preS2, последовательности е-антигена HBV или последовательности антигена HSV типа 2gD и которая функционально связана с химерным промотором; и/или(b) энхансерную последовательность, которая происходит из 3'-нетранслируемой области (UTR) последовательности HBsAg или 3'-UTR последовательности предраннего гена CMV обезьян и которая функционально связана с химерным промотором, где энхансерная последовательность расположена ниже участка клонирования. Изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей промоторную последовательность и кодирующую последовательность, функционально связанную с промотором, где конструкция дополнительно содержит:(a) нетранслируемую лидерную последовательность, которая происходит из последовательности антигена HBV preS2, последовательности е-антигена HBV или последовательности антигена HSV типа 2gD, которая функционально связана с кодирующей последовательностью и промотором, который гетерологичен кодирующей последовательности; и/или(b) энхансерную последовательность с 3'-конца от кодирующей последовательности и функционально связанную с ней, где энхансерная последовательность происходит из 3'-UTR последовательностиHBsAg или 3'-UTR последовательности предраннего гена CMV обезьян и кодирующая последовательность гетерологична 3'-энхансерной последовательности. Изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, которая включает в себя:(a) последовательность предраннего промотора hCMV,(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 главного предраннего гена hCMV и(c) гетерологичный интрон, предусмотренный вместо области интрона А главного предраннего гена(ii) участок клонирования для вставки кодирующей последовательности, функционально связанной с химерным промотором; и(а) нетранслируемую лидерную последовательность, которая происходит из последовательности антигена HBV preS2, последовательности е-антигена HBV или последовательности антигена HSV типа 2gD и которая функционально связана с химерным промотором; и/или(b) энхансерную последовательность, которая происходит из 3'-нетранслируемой области (UTR) последовательности HBsAg или 3'-UTR последовательности предраннего гена CMV обезьян и которая функционально связана с химерным промотором, где энхансерная последовательность расположена ниже участка клонирования. Изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей:(ii) нетранслируемую лидерную последовательность, происходящую из последовательности антигена HBV preS2, последовательности е-антигена HBV или последовательности антигена HSV типа 2gD; и(iii) кодирующую последовательность, функционально связанную с (i) и (ii), где кодирующая последовательность гетерологична нетранслируемой лидерной последовательности. Изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей:(iii) энхансерную последовательность с 3'-конца от кодирующей последовательности (ii) и функционально связанную с ней; где энхансерная последовательность (iii) происходит из 3'-UTR последовательности HBsAg или 3'-UTR последовательности предраннего гена CMV обезьян, и кодирующая последовательность (ii) гетерологична 3'-энхансерной последовательности. Настоящее изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей промоторную последовательность и кодирующую последовательность, функционально связанную с промотором, где конструкция дополнительно содержит:(a) нетранслируемую лидерную последовательность, которая происходит из последовательности антигена HBV preS2, последовательности е-антигена HBV или последовательности антигена HSV типа 2gD, которая функционально связана с кодирующей последовательностью и промотором, который гетерологичен кодирующей последовательности; и/или(b) энхансерную последовательность с 3'-конца от кодирующей последовательности, и функционально связанную с ней, где энхансерная последовательность происходит из 3'-UTR последовательностиHBsAg или 3'-UTR последовательности предраннего гена CMV обезьян, и кодирующая последовательность гетерологична 3'-энхансерной последовательности. Настоящее изобретение, кроме того, относится к популяции конструкций нуклеиновых кислот, где популяция содержит по меньшей мере две разные конструкции по изобретению. В другом варианте изобретение относится к очищенной выделенной химерной промоторной последовательности, которая содержит(a) последовательность предраннего промотора hCMV;(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 главного предраннего гена hCMV; и(c) гетерологичный интрон, предусмотренный вместо области интрона А главного предраннего генаhCMV. Изобретение также относится к способу, обеспечивающему экспрессию в клетках млекопитающих интересующего полипептида,где способ включает перенос в указанные клетки конструкции нуклеиновой кислоты, популяции конструкций нуклеиновых кислот или покрытых частиц по изобретению; покрытым частицам, пригодным для доставки с помощью устройства для опосредованной частицами доставки, где частицы включают частицы носителя, покрытые конструкцией нуклеиновой кислоты по изобретению, конструкции, содержащей кодирующую последовательность, кодирующую полипептид; дозировочной емкости устройства для опосредованной частицами доставки, содержащей покрытые частицы; устройству для опосредованной частицами доставки, нагруженному покрытыми частицами; способу иммунизации нуклеиновыми кислотами, включающему введение субъекту эффективного количества покрытых частиц по изобретению; фармацевтической композиции, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению или популяцию конструкций нуклеиновых кислот по изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом; вакцинной композиции, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению, или популяцию конструкций нуклеиновых кислот или покрытых частиц по изобретению.-3 011557 Также предоставлено применение конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению, популяции конструкций нуклеиновых кислот по изобретению или покрытых частиц по изобретению в изготовлении лекарственного средства для иммунизации нуклеиновыми кислотами. Эти и другие объекты, аспекты, варианты осуществления и преимущества настоящего изобретения станут легко понятны специалистам в данной области, принимая во внимание данное описание. Краткое описание чертежей На фиг. 1 представлены уровни экспрессии поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg),полученного с использованием разных плазмидных экспрессирующих векторов. На фиг. 2 показано действие вставки интрона на экспрессию HBsAg в клетках SCC15 и-галактозидазы в клетках В 16 (среднее значение трех экспериментов). На фиг. 3 показано действие интрона А инсулина крысы и 3'-UTR HBV на экспрессию-галактозидазы в клетках SCC15 (среднее значение трех экспериментов). На фиг. 4 показано действие интрона А инсулина крысы и 3'-UTR HBV на экспрессию HSV gD в клетках SCC15 (среднее значение трех экспериментов). На фиг. 5 показано действие интрона А инсулина крысы и 3'-UTR HBV на экспрессию SEAP в клетках SCC15 и В 16 (три повторности на линию клеток). На фиг. 6 показана способность гетерологичных сигнальных пептидов направлять секрецию SEAP или hFc-фрагмента в клетках В 16. На фиг. 7 приведены уровни антител, детектируемых в сыворотках мышей, иммунизированных нуклеиновыми кислотами, кодирующими антиген, содержащимися в ряде плазмидных экспрессирующих векторов. На фиг. 8 представлено схематическое изображение экспрессирующего вектора pPJV. На фиг. 9 представлено схематическое изображение pPJV7389. На фиг. 10 представлено схематическое изображение pPJV7400. На фиг. 11 представлено схематическое изображение pPJV7468. На фиг. 12 представлено схематическое изображение pPJV7563. На фиг. 13 представлен нуклеотидный состав pPJV7563. На фиг. 14 представлена блок-схема модификации плазмид pPJV7563 и pPJV1671. На фиг. 15 представлены карты ключевых плазмид в конструировании pPJV1671. На фиг. 16 представлена характеристическая карта pPJVl671 и представлено сравнение последовательности N-концевых последовательностей природного антигена H3 Panama HA и антигена H3 PanamaHA, кодируемого pPJV1671. На фиг. 17 показаны титры антител при ингибировании гемагглютинации у свиней, вакцинированных pPJV1671. На фиг. 18 показаны местные кожные реакции после опосредованного частицами введения в кожуpPJV1671 у человека. На фиг. 19 показаны титры антител при ингибировании гемагглютинации у свиней, иммунизированных тривалентной вакциной посредством PMED. Титры HI, специфичные к вирусам H3, HI и В, показаны для двух устройств PMED. На фиг. 20 представлено схематическое изображение pPML7789. На фиг. 21 показана аннотированная последовательность pPML7789. На фиг. 22 представлено схематическое изображение pPJV2012. На фиг. 23 представлена блок-схема конструирования pPJV2012. На фиг. 24 представлена аннотированная последовательность pPJV2012. На фиг. 25 представлено схематическое изображение вектора pPJV7788. На фиг. 26 представлено схематическое изображение вектора pPJV7788, на котором показаны участки рестрикции. На фиг. 27 представлено схематическое изображение pICP27. На фиг. 28 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:65) ICP27 HSV-2 из штамма MS на основе нуклеотидной последовательности pICP27. Единственное аминокислотное отличие между опубликованной последовательностью ICP27 HSV-2 из штамма MS (аспарагин=N) и штаммаHG52 (лизин) выделено полужирным шрифтом. Последовательность, идентифицированная в качестве предположительного эпитопа CD8 в штамме MS HSV-2, подчеркнута. На фиг. 29 показана идентификация доминантного эпитопа ICP27 у мышей Balb/c. А: Клетки селезенки (S) и лимфатического узла (N) из инфицированных HSV-2 мышей Balb/c (BS иBN соответственно) или мышей C57BL/6 (CS и CN) анализировали на активность IFN- ELISPOT с использованием разных пептидных пулов (С 1-С 12, R1-R6), описанных в примере 22. 5105 клеток помещали в каждую лунку и результаты вносили в таблицу как отрицательные (пустые клетки), слабые (25ELISPOT/лунка, серые клетки) или сильные (25 ELISPOT/лунка, черные клетки). В: Последовательности двух пептидов (SEQ ID NO:66 и 67), которые распознаются клетками мышей Balb/c, что выявляет потенциальный эпитоп HSV-2Dd (полужирный шрифт) и область (подчеркну-4 011557 то), соответствующую ранее идентифицированному эпитопу HSV-1 (Banks et al., J. Virol. 67, 613-616,1993). На фиг. 30 приведена характеристика реакции Balb/c на ICP27 с использованием анализаIFN- ELISPOT. Клетки селезенки инфицированных мышей Balb/c анализировали на активность IFNELISPOT с использованием пептидного пула, полученного из всех пептидов ICP27 (пул), или индивидуальных пептидов HGPSLYRTF (P1, SEQ ID NO:68) и LYRTFAANPRA (Р 2, SEQ ID NO:69). 5105 клеток помещали в каждую лунку и результаты выражали в виде числа ELISPOT/лунка. Кроме того, аликвоту образца клеток селезенки обрабатывали магнитными бусами, чтобы удалить из образца клетки CD8+, как описано в примере 22. Исходный образец (+CD8) и истощенный образец (-CD8) анализировали на активность IFN- ELISPOT с использованием пептидного пула, полученного из всех пептидов ICP27 (пул). На фиг. 31 показана корреляция между устойчивостью к заражению HSV-2 и выработкой цитокинов, специфичной для ICP27. Группам из 16 мышей производили первичную и повторную иммунизации ДНК посредством PMED, состоящие из ДНК-вакцины pICP27, содержащей и не содержащей векторCT-DEI pPJV2013 (двойная субъединица А+В) или вектор pPJV2012 с субъединицей LT-DEI (двойная А+В). Отношение pICP27 к вектору DEI составляло 9:1. Панель А: данные по выживаемости после заражения. Половине животных в каждой группе вводили через две недели после второй иммунизации 50 LD50HSV-2. Панели В и С: выработка IFN- и TNF-, специфичная для ICP27, в каждой группе соответственно. Оставшихся животных умерщвляли в одно и то же время и собирали спленоциты для измерения выработки цитокинов, специфичной для ICP27, с использованием набора для цитометрического анализа частиц. На фиг. 32 показана роль IFN- и TNF- в защите от летального заражения HSV-2 - оценка заболеваемости. Группам из 4 мышей проводили первичную и повторную иммунизации посредством PMED ДНК-вакциной pICP27, содержащей (4 группы) или не содержащей (1 группа) вектор pPJV2012 с двойной А+В LT-DEI. Отношение pICP27 к вектору DEI составляло 9:1. Две недели спустя животным интраназально вводили 50 LD50 HSV-2. Для снижения количества Т-клеток мышам производили внутрибрюшинные инъекции, содержащие 200 мкг моноклональных антител, специфичных к IFN- и/или TNF-, на-2, 0, 2, 4, 6 и 8 сутки по отношению к заражению вирусом, как описано в примере 22. Животных контролировали на смертность (% жизнеспособности) и заболеваемость, определяемые по шкале от 0 до 4, согласно следующему списку: 4 - здоровые; 3 - взъерошенный мех, чихание; 2 - изъязвления на глазах или ягодичной области, сниженная подвижность; 1 - сгорбленность, малая подвижность; 0 - смерть. На фиг. 33 показана роль популяций Т-клеток в защите от летального заражения HSV-2. Пяти группам из 4 мышей производили первичную и повторную иммунизации посредством PMED ДНК-вакцинойpICP27, содержащей (+LT, 4 группы) или не содержащей (-LT, 1 группа) вектор pPJV2012 с двойной А+В LT-DEI. Отношение pICP27 к вектору DEI составляло 9:1. Две недели спустя животным интраназально вводили 50 LD50 HSV-2. Три группы животных, иммунизированных ICP27+LT-DEI, обрабатывали внутрибрюшинными инъекциями 90 мкг моноклональных антител, специфичными к CD4 и/или CD8 на -2 и 0 сутки по отношению к заражению вирусом. Чтобы поддерживать количество суммарной ДНК в группе, где только pICP27 (обозначенной как -LT), равным с группами pICP27+LT, пустой вектор добавляли к группе, где только pICP27. Подробное описание изобретения Перед подробным описанием настоящего изобретения следует понимать, что это изобретение не ограничено, в частности, приведенными в качестве примера молекулами или параметрами способов, так как они, конечно, могут варьировать. Также следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена только для цели описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не предполагается исчерпывающей. Кроме того, при осуществлении на практике настоящего изобретения будут применять, если не указано иначе, общепринятые способы вирусологии, микробиологии, молекулярной биологии, технологии рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые все доступны среднему специалисту в данной области. Такие способы полностью объяснены в литературе. См., например, Sambrook, et(1984) и Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. III (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.). Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые или выше, или ниже, приведены здесь в виде ссылки в полном объеме. Следует указать, что, как используется в данном описании и приложенной формуле изобретения,формы единственного числа включают в себя ссылки на множественное число, если только из содержания ясно не предписано обратное. В вариантах, где конкретное вещество описано, как содержащее конкретные компоненты, в предпочтительном варианте вещество может состоять существенным образом из таких компонентов. А. Определения. Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые здесь, обладают таким же значением, как его обычно понимают специалисты в данной области, к которым относится изобретение. Хотя ряд способов и материалов, аналогичных или эквивалентных тем, которые описаны здесь, можно применять при осуществлении на практике настоящего изобретения, здесь описаны предпочтительные способы и материалы.-8 011557 При описании настоящего изобретения будут использованы следующие термины, и их следует определять, как указано ниже. Термин иммунизация нуклеиновой кислотой используют здесь для обозначения введения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей один или несколько выбранных антигенов или полипептидов, в клетку-хозяина для экспрессии in vivo антигена или антигенов. Молекулу нуклеиновой кислоты можно вводить непосредственно принимающему субъекту, как, например, общепринятой внутримышечной или внутрикожной инъекцией; чрескожной доставкой частиц; ингаляцией; местным, или пероральным, интраназальным или посредством нанесения на слизистую оболочку способами введения. В частности,нуклеиновую кислоту можно вводить посредством чрескожной доставки частиц. Молекулу альтернативно можно вводить ex vivo в клетки, которые извлекли из субъекта. В этом последнем случае клетки, содержащие интересующую молекулу нуклеиновой кислоты, вводят повторно субъекту, так что можно усиливать иммунный ответ против антигена, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты. Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые в такой иммунизации, в целом обозначают здесь как нуклеиновокислотные вакцины. Любую из нуклеиновых кислот, упоминаемых здесь, можно предоставить в виде таких вакцин и, в частности, можно предоставить конструкции нуклеиновых кислот, упоминаемые здесь. Термин адъювант предназначен для вещества или композиции, способных специфически или неспецифически изменять, повышать, направлять, перенаправлять, усиливать или вызывать антигенспецифический иммунный ответ. Таким образом, совместное введение адъюванта с антигеном может приводить к более низкой дозе или меньшему количеству доз антигена, которые необходимы для достижения требуемого иммунного ответа у субъекта, которому вводят антиген, или совместное введение может приводить к качественно и/или количественно отличному иммунному ответу у субъекта. В частности, введение адъюванта может приводить к усилению иммунного ответа, как, например, в виде большей величины и/или продолжительности. Эффективность адъюванта можно определить введением адъюванта с вакцинной композицией в параллели с только вакцинной композицией животным и сравнением иммунитета, опосредованного антителами и/или клетками, в двух группах с использованием общепринятых анализов, таких как радиоиммунный анализ, ELISA и анализы CTL. Конструкции по изобретению могут экспрессировать один или несколько адъювантных полипептидов. Коровый носитель означает носитель, который покрывают нуклеиновой кислотой хозяина (например, ДНК, РНК), чтобы обеспечить определенный размер частиц, а также достаточно высокую плотность для достижения импульса, необходимого для проникновения через клеточную мембрану, так что гостевую молекулу можно доставлять с использованием способов на основе частиц (см., например, патент США 5100792). Коровые носители, как правило, включают вещества, такие как вольфрам, золото, платину, феррит, полистирол и латекс. См., например, Particle Bombardment Technology for GeneTransfer, (1994), Yang, N. ed., Oxford University Press, New York, NY, p. 10-11. Безыгольный шприц означает инструмент, который доставляет композицию в виде частиц чрескожно без помощи общепринятой иглы для прокалывания кожи. Здесь обсуждаются безыгольные шприцы для применения по настоящему изобретению. Термин чрескожная доставка предназначен для внутрикожного (например, в дерму или эпидермис), чрескожного (например, подкожного) введения и введения через слизистую оболочку, т.е. доставки посредством прохождения вещества в или через кожу или слизистую ткань. См., например, Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker,Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson and Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987) и Transdermal Delivery of Drugs, vols. 1-3, Kydonieus and Berner (eds.), CRC Press, (1987). Таким образом, термин относится к доставке посредством безыгольного шприца, как описано в патенте США 5630796, а также опосредованной частицами доставке, как описано в патенте США 5865796. Полипептид используют в самом широком смысле для обозначения соединения из двух или более субъединиц аминокислот, аналогов аминокислот или других пептидомиметиков. Субъединицы можно соединять пептидными связями или другими связями, например, сложноэфирными, простыми эфирными и т.п. Как применяют здесь, термин аминокислота относится к любым природным и/или неприродным или синтетическим аминокислотам, включая глицин и/или D-, или L-оптические изомеры, и аналоги аминокислот и пептидомиметики. Пептид из трех или более аминокислот обычно называют олигопептидом, если пептидная цепь короткая. Если пептидная цепь длинная, пептид, как правило, называют полипептидом или белком. Антиген относится к любому веществу, в основном к макромолекуле, которая может вызывать иммунный ответ у индивидуума. Термин можно использовать для обозначения индивидуальной макромолекулы или гомогенной, или гетерогенной популяции антигенных макромолекул. Как применяют здесь, антиген в основном используют для обозначения белковой молекулы или ее части, которая содержит один или несколько эпитопов. Антиген может включать, например, полипептид естественного происхождения, фрагмент такого полипептида, который является иммуногенным, или вариант того и другого, который сохраняет иммуногенность. В предпочтительном варианте, где ссылаются на фрагмент или вариант, вызываемый иммунный ответ может предпочтительно обладать способностью распознавать исходный полипептид, из которого получен фрагмент или вариант.-9 011557 Для целей настоящего изобретения антигены можно получать или производить из любого подходящего источника. Для целей настоящего изобретения антиген включает белок, обладающий модификациями, такими как делеции, добавления и замещения (в основном консервативные в природе) в природной последовательности, до тех пор, пока белок сохраняет достаточную иммуногенность. Данные модификации могут являться преднамеренными, например посредством сайт-специфического мутагенеза, или могут являться случайными, такими как вследствие мутаций в хозяевах, которые вырабатывают антигены. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения применяемый или кодируемый антиген может являться антигеном гриппа, иммуногенным фрагментом антигена гриппа или иммуногенным вариантом того и другого. Иммунный ответ на интересующий антиген представляет собой развитие у индивидуума гуморального и/или клеточного иммунного ответа на этот антиген. Для целей настоящего изобретения гуморальный иммунный ответ относится к иммунному ответу, опосредованному молекулами антител, в то время как клеточный иммунный ответ опосредован Т-лимфоцитами и/или другими белыми кровяными клетками. Термины молекула нуклеиновой кислоты и полинуклеотид используют здесь взаимозаменяемо, и они обозначают полимерную форму нуклеотидов любой длины, или дезоксирибонуклеотидов, или рибонуклеотидов, или их аналогов. Полинуклеотиды могут обладать трехмерной структурой и могут осуществлять любую функцию, известную или неизвестную. Неограничивающие примеры полинуклеотидов включают ген, фрагмент гена, экзоны, интроны, матричную РНК (мРНК), транспортную РНК, рибосомную РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды,плазмиды, векторы, выделенную ДНК любой последовательности, выделенную РНК любой последовательности, зонды из нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид, как правило, состоит из специфической последовательности из четырех нуклеотидных оснований: аденина (А), цитозина (С), гуанина (G) и тимина (Т) (урацил (U) вместо тимина (Т),если полинуклеотид является РНК). Таким образом, термин последовательность нуклеиновой кислоты является буквенным представлением молекулы полинуклеотида. Данное буквенное представление можно вводить в базы данных в компьютере, обладающем центральным процессором, и использовать для приложений в биоинформатике, таких как функциональная геномика и поиск гомологии. Вектор способен переносить последовательности нуклеиновых кислот в клетки-мишени (например, вирусные векторы, невирусные векторы, носители на основе частиц и липосомы). Клетки-мишени могут являться прокариотическими или эукариотическими. Как правило, векторная конструкция, экспрессирующий вектор и вектор для переноса гена относятся к любой конструкции нуклеиновой кислоты, способной управлять экспрессией интересующего гена и которая может переносить последовательности гена в клетки-мишени. Таким образом, термин включает векторы для клонирования и экспрессии, а также вирусные векторы. Плазмида представляет собой вектор в форме внехромосомного генетического элемента. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует выбранный антиген, является молекулой нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) и транслируется (в случае мРНК) в полипептид in vivo или in vitro при помещении под управление подходящих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяют по начальному кодону на 5' (амино) конце и трансляционному стоп-кодону на 3' (карбокси) конце. Для целей изобретения такие последовательности нуклеиновых кислот могут включать в качестве неограничивающих примеров кДНК из вирусной, прокариотической или эукариотической мРНК, геномные последовательности вирусной или прокариотической ДНК или РНК и даже синтетические последовательности ДНК. Последовательность терминации транскрипции может располагаться с 3'-конца кодирующей последовательности. В некоторых случаях транскрибируемая последовательность может давать начало нескольким полипептидам, например транскрипт может содержать несколько открытых рамок считывания (ORF), и также один или несколько внутренних участков посадки рибосомы (IRES), чтобы дать возможность транслировать ORF после первой ORF. Транскрипт можно транслировать, чтобы получить полипептид,который затем расщепляют, чтобы получить множество полипептидов. В некоторых случаях конструкция нуклеиновой кислоты может дать начало нескольким транскриптам, и, таким образом, множеству полипептидов. Промотор является нуклеотидной последовательностью, которая инициирует и регулирует транскрипцию кодирующего полипептид полинуклеотида. Промоторы могут включать индуцибельные промоторы (где экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором,индуцируется аналитом, кофактором, регуляторным белком и т.п.), репрессируемые промоторы (где экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, репрессируется аналитом, кофактором, регуляторным белком и т.п.) и конститутивные промоторы. Предполагается,что термин промотор или управляющий элемент включает полноразмерные промоторные области и функциональные (например, управляющие транскрипцией или трансляцией) участки данных областей. Функционально связанный относится к расположению элементов, в котором описанные компоненты расположены так, чтобы осуществлять свою обычную функцию. Таким образом, данный промо- 10011557 тор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, способен влиять на экспрессию данной последовательности при наличии подходящих ферментов. Нет необходимости в том,чтобы промотор примыкал к последовательности до тех пор, пока он функционирует, управляя ее экспрессией. Таким образом, например, вставка нетранслируемых, но транскрибируемых последовательностей может находиться между последовательностью промотора и последовательностью нуклеиновой кислоты, и последовательность промотора можно все еще рассматривать как функционально связанную с кодирующей последовательностью. Рекомбинантный используют здесь для описания молекулы нуклеиновой кислоты (полинуклеотида) геномного, из кДНК, полусинтетического или синтетического происхождения, которая, в силу своего происхождения или манипулирования, не ассоциирована со всем полинуклеотидом или его частью, с которым она ассоциирована в природе, и/или связана с полинуклеотидом, другим, чем тот, с которым она связана в природе. Две последовательности нуклеиновых кислот, которые содержатся в одной рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, являются гетерологичными по отношению друг к другу, если обычно они не ассоциированы друг с другом в природе. Здесь рассматривают гомологи полинуклеотидов. Как правило, полинуклеотид, который гомологичен другому полинуклеотиду, является по меньшей мере на 70% гомологичным полинуклеотиду, предпочтительно по меньшей мере на 75, 80 или 90% и более предпочтительно по меньшей мере на 95, 97 или 99%. Способы измерения гомологии хорошо известны в данной области, и будет понятно специалистам в данной области, что в существующем контексте гомологию вычисляют на основе идентичности нуклеиновых кислот. Такая гомология может, например, распространяться на область по меньшей мере из 15, предпочтительно по меньшей мере из 30, например по меньшей мере из 40, 60 или 100 или более смежных нуклеотидов. Область гомологии может распространяться по меньшей мере на 150, предпочтительно по меньшей мере на 200 и даже более предпочтительно по меньшей мере на 300 нуклеотидов. Область гомологии может относиться к любому из элементов, упоминаемых здесь в связи с конструкциями нуклеиновых кислот по изобретению. В некоторых случаях область гомологии может распространяться на всю интересующую область, такую как, например, всю область любого из элементов, описанных здесь. Могут существовать уровни аминокислотной гомологии, эквивалентные тем, которые рассматривают в связи с вышеупомянутой нуклеотидной гомологией. Таким образом, любой из вышеупомянутых уровней гомологии можно прилагать к аминокислотному уровню. Гомология на аминокислотном уровне может, например, распространяться по меньшей мере на 15, предпочтительно по меньшей мере на 25,более предпочтительно по меньшей мере на 50, еще более предпочтительно по меньшей мере на 75 и даже более предпочтительно по меньшей мере на 100 аминокислот. Область гомологии может распространяться на всю длину интересующего элемента. Способы определения гомологии или идентичности полинуклеотидов известны из уровня техники. Например, пакет UWGCG содержит программу BESTFIT, использование которой позволяет рассчитать гомологию (с использованием установок по умолчанию) (Devereux et al. (1984), Nucleic Acid Research 12,p. 387-395). Алгоритмы PILEUP и BLAST можно также применять для вычисления гомологии или выравнивания последовательностей (как правило, при настройках по умолчанию), например, как описано вAltshul S.F. (1993), J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul, S.F. et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10. Программное обеспечение для осуществления анализа BLAST является общедоступным посредством National Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Данный алгоритм предусматривает сначала идентификацию пары участков с высокими показателями (HSP) посредством идентификации коротких слов длины W в интересующей последовательности,которые или совпадают, или удовлетворяют некоторому положительно-нормированному пороговому значению Т при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных. Т обозначают как порог значения близкого слова (Altschul et al., выше). Данные начальные наложения близких слов действуют в качестве затравок для инициирующих поисков, чтобы найти содержащие их HSP. Наложения слов расширяются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности, по мере того как может возрастать кумулятивное значение выравнивания. Расширения наложений слов в каждом направлении прекращаются, когда кумулятивное значение выравнивания достигает нуля или ниже, вследствие накопления одного или нескольких выравниваний с остатками с отрицательными значениями или при достижении конца любой из последовательностей. Параметры W, Т и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLAST используют по умолчанию слово длины (W) 11, выравнивания на основе матрицы значений BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff (1992),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919) (B) 50, ожидание (Е) 10, M=5, N=4 и сравнение обеих цепей. Алгоритм BLAST осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями; см. например, Karlin and Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787. Одно из измерений сходства, предусмотренное в алгоритме BLAST, представляет собой наименьшую суммарную вероятность (P(N, которая представляет показание вероятности, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может произойти случайно. Например, последо- 11011557 вательность считают сходной с другой последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении первой последовательности со второй последовательностью меньше чем приблизительно 1, предпочтительно меньше чем приблизительно 0,1, более предпочтительно меньше чем приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше чем приблизительно 0,001. Гомологи, как правило, гибридизуют с соответствующим полинуклеотидом на уровне значительно выше фона. Уровень сигнала, вызываемый взаимодействием между гомологом и полинуклеотидом, как правило, по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз интенсивнее, чем фоновая гибридизация. Интенсивность взаимодействия можно измерить, например, радиоактивным мечением зонда, например 32 Р. Селективную гибридизацию, как правило, получают с использованием условий от средней до высокой строгости (например, 0,03 М хлорид натрия и 0,003 М цитрат натрия от приблизительно 50 до приблизительно 60 С). Условия строгой гибридизации могут включать 50% формамид, 5 раствор Денхардта, 5 SSC,0,1% SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, и условия отмывки могут включать 2 SSC, 0,1% SDS при 37 С с последующим 1 SSC, 0,1% SDS при 68 С. Определение подходящих условий гибридизации в пределах компетенции специалиста в данной области см., например, Sambrook etal., выше. Гомолог может отличаться от последовательности соответствующего полинуклеотида менее чем на 3, 5, 10, 15, 20 или более мутаций (каждая из которых может являться замещением, дупликацией, делецией или вставкой). Количество данных мутаций можно измерить по области по меньшей мере из 30,например по меньшей мере 40, 60 или 100 или более смежных нуклеотидов гомолога. В некоторых случаях количество мутаций можно измерить по всей области гомолога. Если полинуклеотид кодирует полипептид, то замещения предпочтительно приводят к консервативным изменениям кодируемой аминокислоты. Они определены согласно табл. 1. Аминокислоты в одной и той же ячейке второй колонки и предпочтительно в одной и той же строке третьей колонки можно замещать одну на другую в случае консервативных изменений. Таблица 1 Термин фрагмент обозначает меньшую часть большего объекта. Фрагменты конкретных элементов, упоминаемых здесь, можно применять по изобретению. В частности, такие фрагменты будут сохранять некоторые или все функции исходного элемента и, в частности, любую из упоминаемых здесь функций. В предпочтительных вариантах фрагмент антигена может сохранять иммуногенность и фрагмент адъюванта - способность действовать как адъювант. В некоторых вариантах фрагмент может составлять по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере 95% длины оригинала. Фрагмент может обладать равной или меньшей длиной, чем такие процентные доли длины оригинала. Термины индивидуум и субъект используют здесь взаимозаменяемо для обозначения любого члена подтипа хордовых, включая без ограничения человека и других приматов, включая приматов, не являющихся человеком, таких как шимпанзе и другие виды человекообразных обезьян и мартышек; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашних млекопитающих, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки, а также свиней; птиц, включая домашних, диких и промысловых птиц, таких как куры, индейки и другие куриные, утки, гуси и т.п. Термины не относятся к конкретному возрасту. Таким образом, подразумевается, что термины относятся как к взрослым, так и к новорожденным индивидуумам. Способы, описанные здесь, предназначены для применения на любом из вышеописанных видов позвоночных, так как иммунные системы всех этих позвоночных функционируют сходным образом. В некоторых вариантах изобретение можно применять для иммунизации любого подходящего субъекта и, в частности, любого подходящего субъекта данного вида. В предпочтительном варианте можно иммунизировать любого подходящего человека. Таким образом, настолько много субъектов, насколько возможно, можно, например, иммунизировать без акцента на любой конкретной группе субъектов. Например, можно иммунизировать популяцию субъектов как целое или настолько много, насколько- 12011557 возможно. В частности, в случае применения изобретения для лечения гриппа, и особенно для иммунизации против пандемического штамма гриппа, конструкции по изобретению можно применять, чтобы иммунизировать любого субъекта и предпочтительно настолько много субъектов, насколько возможно. В других случаях субъект или индивидуум может подвергаться риску инфекции или являться тем,кому инфекция может принести особенный вред. Инфекция в предпочтительном варианте может являться респираторной инфекцией. В частности, при применении изобретения для профилактики или лечения респираторной инфекции, в частности гриппа, субъект может являться человеком. В некоторых случаях конструкции нуклеиновых кислот по изобретению можно вводить преимущественно, или в первую очередь, группам особого риска. Это может, например, представлять собой случай введения конструкций для иммунизации против непандемических штаммов гриппа. В некоторых случаях субъекты могут, например, попадать в одну или более из следующих категорий: субъект с респираторным расстройством и/или проблемами с сердцем и, в частности тот, кто страдает астмой, эмфиземой, бронхитом и/или хроническим обструктивным заболеванием легких (COPD); субъект с хронической медицинской патологией, такой как диабет, иммуносупрессия, иммунодефицит, серповидноклеточное заболевание и/или заболевание почек; субъект в возрасте по меньшей мере 50 лет, предпочтительно по меньшей мере 60 лет, более предпочтительно по меньшей мере 65 лет, еще более предпочтительно по меньшей мере в возрасте 75 лет и еще более предпочтительно по меньшей мере в возрасте 80 лет; ребенок в возрасте 2 лет или менее, в частности от 6 до 23 месяцев, например, 18 месяцев или менее; субъект на постоянном лечении аспирином и, в частности, в возрасте от 6 месяцев до 18 лет; беременная женщина и, в частности, находящаяся на втором или третьем триместре беременности в течение периода заболеваемости гриппом; проживающий в интернате или лечебном учреждении для хронических больных и/или обслуживающий работник для любой из вышеперечисленных групп или тот, кто, возможно, вступает в регулярный контакт с ними. В. Общие положения. Изобретение относится к конструкциям нуклеиновых кислот, которые обеспечивают эффективную экспрессию гетерологичных кодирующих последовательностей и, в частности, антигенкодирующих генов, в клетках-хозяевах. Конструкции могут, в некоторых вариантах, экспрессировать один или несколько адъювантных полипептидов. Более конкретно, изобретение относится к конструкциям нуклеиновых кислот, содержащих или, в некоторых вариантах осуществления, состоящих существенным образом из химерной последовательности промотора и участка клонирования, так что при вставке кодирующей последовательности в участок клонирования кодирующая последовательность функционально связана с химерным промотором. Изобретение также относится к конструкциям с кодирующими последовательностями, вставленными в участок или участки клонирования. Кодирующие последовательности могут кодировать любой из полипептидов, упоминаемых здесь, и, в частности, антиген и, в особенности, любой из антигенов и адъювантных полипептидов, упоминаемых здесь. В особенно предпочтительном варианте осуществления конструкции содержат кодирующую последовательность и, в частности, кодирующую последовательность, кодирующую антиген, его иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант того и другого. В особенно предпочтительном варианте осуществления кодирующие последовательности кодируют антиген гриппа, его иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант того и другого. В другом предпочтительном варианте осуществления кодирующая последовательность может кодировать адъювантный полипептид и, в частности,ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или вариант того и другого с адъювантной активностью. Химерный промотор содержит или, в некоторых вариантах осуществления, состоит существенным образом из:(a) последовательности предраннего промотора hCMV;(b) экзона 1 и по меньшей мере части экзона 2 главного предраннего гена hCMV и(c) гетерологичного интрона, предусмотренного вместо области интрона А главного предраннего гена hCMV. Последовательность предраннего промотора hCMV (а) может содержать:(i) природную последовательность предраннего промотора hCMV;(ii) ее функциональный гомологичный вариант; или(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). Как правило, последовательность (а) содержит приблизительно от 100 до 600, предпочтительно от 200 до 600, например, от 400 до 600 нуклеотидов. Как правило, последовательность (а) содержит последовательности, присутствующие в (i), которые связываются с факторами транскрипции или РНКполимеразой, или вместо любой из этих последовательностей - гомологи этих последовательностей, способные связываться с теми же самыми факторами транскрипции и РНК-полимеразой. Как правило, такие последовательности или их гомологи присутствуют в последовательности промотора (а) в том же самом- 13011557 порядке и/или, по существу, в том же самом относительном расположении, как в (i). В целом, (i) состоит, по меньшей мере, из нуклеотидов от -100 до -1, как правило, от -150 до -1, например, от -500 до -1 или от -600 до -1 главного предраннего гена hCMV. Последовательность (i), как правило, содержит последовательность корового промотора hCMV и может также содержать один или несколько энхансерных элементов, присутствующих в предраннем промоторе hCMV. Например, (i) может состоять из нуклеотидов от -118 до -1 или от -524 до -1, как в US 6218140, или из нуклеотидов от -62 до 1 или от -465 до -1, как в US 5385839. В целом, (i) содержит TATA-бокс или СААТ-бокс, обычно обнаруживаемые в промоторных последовательностях. Предпочтительно последовательность включает одну или несколько повторяющихся последовательностей в предраннем промоторе hCMV. В предпочтительном варианте осуществления (i) содержит SEQ ID NO:1. В другом предпочтительном варианте осуществления (i) содержит нуклеотиды с 903 по 1587 SEQ ID NO:54. В другом варианте осуществления (i) может содержать нуклеотиды с 903 по 1587 SEQ ID NO:14. В другом предпочтительном варианте осуществления (i) может содержать нуклеотиды с 1002 по 1686 или с 2624 по 3308SEQ ID NO:57. В другом предпочтительном варианте осуществления (i) может содержать нуклеотиды с 1815 по 1935 и/или с 1948 по 2632 SEQ ID NO:61 и, в частности, нуклеотиды с 1948 по 2632SEQ ID NO:61. В другом предпочтительном варианте осуществления можно применять нуклеотиды с 1815 по 1935. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность предраннего промотора hCMV (a) содержит:(ii) функциональный вариант (i), который обладает по меньшей мере 80% гомологией нуклеотидной последовательности с одной или несколькими последовательностями (i); и/или(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). В некоторых вариантах фрагмент может содержать по меньшей мере 300 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 400 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 500 нуклеотидов и еще более предпочтительно по меньшей мере 600 нуклеотидов таких последовательностей. Фрагмент может содержать вплоть до 800, вплоть до 600 или вплоть до 400 нуклеотидов. Последовательность предраннего промотора hCMV можно получать с использованием известных способов. Природный предранний промотор hCMV можно выделять непосредственно из образца вируса с использованием общепринятых способов. В US 5385839, например, описано клонирование промоторной области hCMV. Последовательность предраннего промотора hCMV доступна в Genbank М 60321(штамм hCMV Towne) и Х 17403 (штамм hCMV Ad169). Природную последовательность можно, таким образом, выделять посредством PCR с использованием праймеров для PCR на основе известной последовательности. См., например, Sambrook et al., выше, для описания способов, используемых для получения и выделения ДНК. Подходящую последовательность промотора hCMV можно также выделять из существующего плазмидного вектора. Промоторные последовательности можно также получать синтетически. Функциональный вариант (ii) или фрагмент (iii) в основном сохраняет и/или дополняет активность природного промотора (i). Как правило, данная активность является способностью вызывать (включая инициирование и регулирование) транскрипцию функционально связанного полинуклеотида, в частности главного предраннего гена hCMV. В одном из вариантов осуществления вариант или фрагмент могут обладать способностью дополнять активность природного промотора вируса hCMV, например, давая возможность вирусу сохранять способность инфицировать клетки и/или реплицироваться в них. Гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) можно анализировать на способность сохранять и/или дополнять активность (i). Например, вариант или фрагмент можно анализировать на способность восстанавливать функциональность (такую как способность к инфекции и/или репликации) мутантного hCMV,в котором природный предранний промотор hCMV является дефектным. Гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) можно тестировать на пригодность с использованием сравнительного анализа экспрессии ниже. Тестируемую последовательность промотора вставляют в базовый вектор вместо природного предраннего промотора hCMV. Как правило, функциональный вариант или фрагмент обеспечивает по меньшей мере 50, например, 60, 70, 80, 90% или более от экспрессии, получаемой с использованием базового вектора. Функциональный вариант или фрагмент может обеспечить любые уровни экспрессии, упоминаемые здесь. В некоторых вариантах осуществления вариант или фрагмент могут обеспечить более высокий уровень экспрессии, такой как, по меньшей мере, увеличение активности на 50, 100, 150, 200, 300% или более. В целом, экспрессию получают по меньшей мере в одном, но предпочтительно в двух контрольных типах клеток. Как правило, контрольными клетками являются клетки млекопитающих HEK 293 Т, СНО, HeLa, BHK, 3T3 или COS. Контрольными клетками могут являться, в некоторых вариантах, клетки-хозяева SSC-15 или В 16.- 14011557 Дополнительно или альтернативно, последовательность промотора можно тестировать в сравнительном анализе иммуногенности ниже. Тестируемую последовательность промотора вставляют в базовый вектор вместо природного предраннего промотора hCMV. Функциональная последовательность промотора, как правило, дает титры антител, по меньшей мере, такие же высокие или более высокие по сравнению с теми, которые дает базовый вектор по меньшей мере с одним, предпочтительно с двумя антигенами. Предпочтительно титры антител выше по меньшей мере на 5, 10, 20, 30 или 40% по сравнению с базовым вектором. В некоторых случаях уровень титров антигенов может являться любым из упоминаемых здесь. Подходящими антигенами являются антигены HBsAg, HSV-2gD и flu-M2. В частности,предпочтительными антигенами являются антигены гриппа. Антигены гриппа включают антигены HA,NA, M2, NP, M1, РВ 1, РВ 2, PA, NS1 и NS2 и в особенности антигены HA, NA и М 2. В особенно предпочтительном варианте осуществления антиген является HA или его фрагментом, или вариантом того и другого. Согласно анализу функциональный гомологичный вариант (ii) или функциональный фрагмент(iii) природной последовательности промотора (i), как правило, обеспечивает наиболее высокие титры антител, даваемые природной последовательностью. В некоторых вариантах титр антител может являться слегка более низким, включая любой из упомянутых здесь уровней. В случаях, где конструкция по изобретению кодирует адъювантный полипептид, тест на сравнительную иммуногенность можно использовать со стандартным антигеном и сравнивать тестируемый вектор, кодирующий полипептид с неизвестной адъювантной активностью, со стандартным адъювантным вектором. Например, тестируемый адъювантный вектор может кодировать фрагмент или вариант известного адъювантного полипептида, и его можно сравнивать со стандартным вектором, экспрессирующим известный адъювантный полипептид, по их способности вызывать иммунный ответ при введении с антигеном. Фрагмент или вариант могут обладать любыми из упоминаемых здесь уровней активности и, в частности, будут обеспечивать по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 75%,более предпочтительно по меньшей мере 85% и еще более предпочтительно по меньшей мере 100% адъювантной активности стандартного адъюванта. Предпочтительно тестируемый вектор и стандартный вектор будут идентичны или, по меньшей мере, по существу идентичны, кроме последовательностей,кодирующих тестируемый адъювант/полипептид. Как упомянуто выше, конструкция может содержать последовательность экзона (b), которая содержит последовательность, полученную из экзона 1 и экзона 2 главного предраннего гена hCMV. Экзоны являются кодирующими последовательностями, которые в природе в основном разделены нитронами. В природном главном предраннем гене hCMV экзоны 1 и 2 обычно разделены природным интроном А. В существующей химерной конструкции последовательность экзона 2 в основном расположена с 3'-конца от последовательности экзона 1 без разделяющей последовательности интрона, так что последовательности экзона 1 и экзона 2 являются смежными. Последовательность экзона (b) может содержать:(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). Последовательность (i) может содержать приблизительно от 50 до 100% последовательности экзона 1 природного главного предраннего гена hCMV, например, от 60 до 90% или от 70 до 80%. Как правило,присутствует по меньшей мере 50% природной последовательности экзона 1, как, например, 60, 70, 80,90% или более. Последовательность экзона (b) также содержит по меньшей мере часть последовательности экзона 2. В последовательности (i) присутствуют, как правило, 2 или более оснований природного экзона 2, например, от 2 до 9, от 2 до 7 или от 3 до 5 оснований. Может присутствовать вплоть до 100% включительно природной последовательности экзона 2, например, от 5 до 95%, от 20 до 80% или от 40 до 60% природной последовательности экзона 2. Как правило, гомологичный вариант обладает любой длиной из вышеупомянутых для природной последовательности. Предпочтительно (i) содержит SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном варианте осуществления(i) содержит нуклеотиды с 1588 по 1718 SEQ ID NO:54. В другом предпочтительном варианте осуществления (i) содержит нуклеотиды с 1588 по 1718 SEQ ID NO:14. В другом предпочтительном варианте(i) содержит нуклеотиды с 1684 по 1814 и/или с 2633 по 2763 SEQ ID NO:51. В другом предпочтительном варианте осуществления (i) может содержать нуклеотиды с 1687 по 1817 и/или с 3309 по 3439SEQ ID NO:62. Таким образом, в особенно предпочтительном варианте осуществления последовательность экзона(i) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, нуклеотидную последовательность из нуклеотидов с 1588 по 1718 SEQ ID NO:54, нуклеотидов с 1684 по 1814 SEQ ID NO:61, нуклеотидов с 2633 по 2763 SEQ ID NO:61, нуклеотидов с 1687 по 1817 SEQ ID NO:62 и/или нуклеотидов с 3309 по 3439 SEQ ID NO:62;(ii) функциональный вариант (i), который обладает по меньшей мере 80% гомологией нуклеотидной последовательности с одной или несколькими последовательностями (i); и/или- 15011557 Подходящую последовательность экзона (b) можно получать с использованием известных способов. См., например, Sambrook et al., выше, для описания способов, используемых для получения и выделения ДНК. Природную последовательность главного предраннего гена hCMV можно выделять непосредственно из образца вируса с использованием общепринятых способов (см., например, MacLean, ABrown, A. Maclean, editors, Humana Press, Totowa, NJ, p.19-26). Последовательность главного предраннего гена hCMV, включая местоположение экзона 1 и экзона 2, доступна в Genbank M60321, Х 17403. Природные последовательности экзона 1 и 2 можно, таким образом, выделить расщеплением природной главной последовательности гена в подходящих участках рестрикции или с помощью PCR с использованием праймеров для PCR на основе известной последовательности. Подходящие последовательности экзона, альтернативно, можно выделить из существующего плазмидного вектора, такого как pWRG7128. Последовательности экзона можно также получить синтетически, а не клонировать. Варианты последовательностей можно легко сконструировать общепринятыми способами, такими как сайт-специфический мутагенез. В целом, последовательность экзона, при наличии в конструкции по изобретению, будет повышать экспрессию, как правило, вызывая повышение, сравнимое с природной последовательностью экзона 1 и экзона 2 (i), упомянутой выше. Последовательность экзона можно анализировать на функциональность с использованием сравнительного анализа экспрессии ниже. Тестируемую последовательность экзона помещают в базовый вектор вместо ранее присутствовавшей последовательности экзона. В целом, последовательность экзона функциональна, если последовательность не нарушает экспрессию, но предпочтительно повышает экспрессию по меньшей мере в одном, предпочтительно в двух контрольных типах клеток, при сравнении с базовым вектором. Как правило, контрольные клетки являются клетками млекопитающих HEK 293 Т, СНО,HeLa, BHK, 3T3 или COS. Можно использовать клетки SSC15 или В 16. Предпочтительно экспрессия повышается по меньшей мере на 5, 10, 20, 30 или 40%. Экспрессию можно повышать на любой из уровней, упомянутых здесь. Согласно данному анализу функциональный гомологичный вариант (ii) или функциональный фрагмент (iii) природной последовательности экзона (i), как правило, обеспечивает по меньшей мере 50% улучшения экспрессии, даваемого природной последовательностью. В некоторых вариантах, где уровень экспрессии ниже по сравнению с базальным уровнем, уменьшение может являться любым из уровней, упомянутых здесь. Дополнительно или альтернативно, последовательность экзона можно тестировать в сравнительном анализе иммуногенности ниже. Тестируемую последовательность экзона помещают в базовый вектор вместо ранее присутствовавшей последовательности экзона. Функциональная последовательность экзона дает титры антител, которые, как правило, по меньшей мере, такие же высокие или более высокие по сравнению с теми, которые дает базовый вектор по меньшей мере с одним, предпочтительно с двумя антигенами. Предпочтительно титры антител выше по меньшей мере на 5, 10, 20, 30 или 40% по сравнению с базовым вектором. Повышение может являться любым из уровней, упомянутых здесь. Предпочтительными антигенами являются антигены HBsAg, HSV-2gD и flu-M2. Особенно предпочтительными антигенами являются антигены гриппа, включая любой из здесь упомянутых антигенов, и в особенности антигены HA, NA и М 2. Использование антигена HA, его иммуногенного фрагмента или иммуногенного варианта того и другого является особенно предпочтительным. Согласно данному анализу функциональный гомологичный вариант (ii) или функциональный фрагмент (iii) природной последовательности экзона (i), как правило, обеспечивает самые высокие титры антител, которые дает природная последовательность. В случаях, где уровень титра антител слегка ниже, уменьшение может являться любым из уровней, упомянутых здесь. Адъювантные векторы можно оценивать эквивалентным способом, как обсуждено выше. Конструкция химерного промотора содержит гетерологичный интрон (с) вместо природной области интрона А главного предраннего гена hCMV. Интрон является некодирующей последовательностью,которая получается в результате сплайсинга гяРНК, транскрибируемой с гена. Гетерологичный интрон является интроном, который не присутствует в кодирующей последовательности в природе. Гетерологичный интрон (с) замещает полностью или частично природный интрон А главного предраннего гена hCMV. Как правило, природный интрон А отсутствует. Как правило, гетерологичный интрон (с) находится с 3'-конца от последовательности экзона (b). Как правило, гетерологичный интрон (с) содержит:(ii) функциональный гомологичный вариант (i) или(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). Гетерологичный интрон (с) является, как правило, вирусным или эукариотическим интроном. Предпочтительно интрон является интроном млекопитающих, в частности интроном не из человека, например можно использовать интрон крысы. В некоторых вариантах можно использовать интрон курицы. Предпочтительно интрон является интроном А, например интроном А инсулина крысы, интроном А кератина курицы или интроном А сердечного актина курицы. В особенно предпочтительном варианте- 16011557 осуществления интрон является интроном А инсулина крысы. В предпочтительном варианте осуществления гетерологичный интрон (с) содержит последовательность, выбранную из последовательности интрона А гена инсулина крысы, последовательности интрона А гена кератина курицы, последовательности интрона А гена сердечного актина курицы, функционального фрагмента любой из них или функционального вариант любого из вышеперечисленного. Как правило, интрон (с) обладает длиной от приблизительно 50 до приблизительно 1000 нуклеотидов, например, от приблизительно 100 до приблизительно 500 нуклеотидов. Интрон (с) может, например,содержать от 50 до 500 нуклеотидов, как, например, вплоть до 100, 200, 300 или 400 нуклеотидов. Предпочтительно интрон содержит последовательность, содержащую приблизительно от 50 до 133 нуклеотидов природного интрона А инсулина крысы или гомолога этой последовательности. Предпочтительно гетерологичный интрон (с) способен получаться в результате сплайсинга транскрипта РНК в эукариотической клетке-хозяине. Как правило, интрон содержит одну или несколько донорных последовательностей (таких как GT), акцепторную последовательность (такую как AG),3'-область, богатую пиримидином, и последовательность точки ветвления. Область, богатая пиримидином, при наличии, может содержать, например, по меньшей мере 5, 8, 10 или более пиримидинов. Предпочтительно интрон содержит, по меньшей мере, донорную последовательность, акцепторную последовательность и последовательность точки ветвления. Как правило, в химерной конструкции интрон (с) содержит неинтронные фланкирующие последовательности, которые происходят из последовательностей экзона, найденных на границах между интроном/экзоном природного интрона (i). Фланкирующая последовательность экзона может являться природной последовательностью экзона или гомологом этой последовательности, который сохраняет, по существу, ту же самую активность, что и природная последовательность, например сохраняет функцию сплайсинга. Как правило, от 5 до 10, предпочтительно от 7 до 10 оснований последовательности экзона содержатся на каждом конце интрона. Интрон (с) может являться искусственным интроном при условии, что интрон является функциональным. Например, можно использовать рекомбинантный или химерный интрон. Такой интрон может содержать последовательность из более чем одного природного интрона. Как правило, интрон (с) содержит последовательности, присутствующие в интроне A hCMV, которые связываются с факторами транскрипции или регуляторными белками, или вместо любой из этих последовательностей, гомологи этих последовательностей, способные связываться с теми же факторами или белками. Как правило, такие последовательности или их гомологи присутствуют в интроне (с) в том же самом порядке и/или, по существу, том же самом относительном расположении, как в интроне AhCMV. Интрон (с) может содержать гомологичный вариант (ii), в котором последовательность природного интрона (i) модифицирована, чтобы удалить внутренний участок рестрикции. Например, можно использовать гомологичный вариант интрона А инсулина крысы, в котором нарушен внутренний участок Nhel. Предпочтительно интрон (с) содержит:(ii) функциональный гомологичный вариант (i) или(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). В другом предпочтительном варианте (i) может содержать нуклеотиды с 1725 по 1857SEQ ID NO:54 или те же нуклеотиды SEQ ID NO:14. В другом предпочтительном варианте осуществления (i) может содержать нуклеотиды с 1545 по 1677 и/или с 2770 по 2902 SEQ ID NO:61. В другом предпочтительном варианте (i) может содержать нуклеотиды с 1824 по 1956 и/или с 3446 по 3578 SEQ ID NO:62. В одном из предпочтительных вариантов последовательность интрона А гена инсулина крысы содержит:(i) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3, нуклеотидную последовательность из нуклеотидов с 1725 по 1857 SEQ ID NO:54, нуклеотидов с 1545 по 1677 SEQ ID NO:61, нуклеотидов с 2770 по 2902 SEQ ID NO:61, нуклеотидов с 1824 по 1956 SEQ ID NO:62 и/или нуклеотидов с 3446 по 3578 SEQ ID NO:62;(ii) функциональный вариант (i), который обладает по меньшей мере 80% гомологией нуклеотидной последовательности с одной или несколькими последовательностями (i); и/или(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). Последовательность интрона (с) можно получить с использованием общепринятых способов клонирования. Например, последовательность интрона А инсулина крысы доступна в GenBank J00748, последовательность интрона А кератина курицы - в GenBank J00847 и последовательность интрона А сердечного актина курицы - в GenBank X02212. Последовательность интрона можно выделять из природных источников с использованием праймеров на основе известной последовательности. Последовательность можно получить синтетически. Варианты последовательностей можно получить мутагенезом. Как правило, функциональная последовательность интрона, например функциональный вариант (ii) или функциональный фрагмент (iii), обладает, по существу, такой же активностью и/или дополняет активность природного интрона (i). В одном из вариантов осуществления активность является активностью- 17011557 сплайсинга. Последовательности интрона (с) можно тестировать на активность сплайсинга с использованием общепринятого анализа сплайсинга. Как правило, функциональный гомолог (ii) или функциональный фрагмент (iii) будет обладать по меньшей мере 50%, например, 60, 70, 80, 90 и вплоть до 100% или более эффективностью сплайсинга природного интрона (i) в анализе. Как правило, гетерологичная последовательность интрона, при наличии в конструкции по изобретению, будет усиливать экспрессию. Как правило, вариант (ii) или фрагмент (iii) интрона будут вызывать усиление, сравнимое с природным интроном (i). В некоторых случаях можно наблюдать снижение экспрессии, включая любой из уровней, упомянутых выше. Функциональность возможной последовательности интрона (с) можно тестировать с использованием сравнительного анализа экспрессии ниже. Гетерологичный интрон вставляют в базовый вектор. В целом, гетерологичная последовательность интрона является функциональной, если добавление последовательности повышает экспрессию по меньшей мере в одном, но предпочтительно в двух контрольных типах клеток на 25% или более по сравнению с базовым вектором. Как правило, контрольные клетки являются клетками млекопитающих HEK 293 Т, СНО, HeLa, BHK, 3T3 или COS. Можно использовать клетки SSC15 или В 16. Повышение экспрессии может составлять по меньшей мере 35, 45, 55% или более. Повышение может являться любым из уровней, упомянутых здесь. Согласно данному анализу функциональный вариант (i) или функциональный фрагмент (ii) природной последовательности интрона (i),как правило, обеспечивают более чем 50% улучшения экспрессии, которое дает природная последовательность. В случаях, где наблюдают снижение экспрессии, снижение может, например, являться одним из уровней, упомянутых здесь. Последовательность гетерологичного интрона (с) можно, дополнительно или альтернативно, тестировать на функциональность с использованием сравнительного анализа иммуногенности ниже. Последовательность интрона (с) вставляют в базовый вектор. Последовательность функционального интрона (с) дает титры антител, которые выше, чем те, которые дает базовый вектор по меньшей мере с одним, предпочтительно двумя антигенами. Предпочтительно титры антител являются по меньшей мере на 5 или 10%, например, на 20, 30 или 40% выше, чем у базового вектора. Предпочтительными антигенами являются антигены HBsAg, HSV-2gD и Flu-M2. Особенно предпочтительными антигенами являются антигены гриппа, включающие любые из здесь упомянутых, и, в частности, антигены HA, NA и М 2. В частности, можно использовать антиген HA, его иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант того и другого. Согласно данному анализу функциональный вариант (ii) или функциональный фрагмент (iii) природной последовательности интрона (i), как правило, обеспечивают наиболее высокие титры антител,которые дает природная последовательность. В некоторых случаях можно наблюдать уменьшение; уровни, например, могут являться любыми из уровней, упомянутых здесь. Адъювантные векторы можно оценивать эквивалентным способом, как обсуждено в других местах данного описания. Подходящую гетерологичную последовательность интрона можно получать с использованием общепринятых способов клонирования. Например, последовательность интрона А инсулина крысы доступна в GenBank J00748, интрона А кератина курицы в - GenBank J00847 и интрона А сердечного актина курицы - в Х 02212. Последовательность интрона можно выделять из природных источников с использованием праймеров на основе данных об известной последовательности. Подходящую последовательность можно также получать синтетически. Составляющие последовательности (а), (b) и (с) можно получить подходящим образом соединенными вместе с формированием химерного промотора с использованием общепринятых способов клонирования или молекулярной биологии. Предпочтительно последовательность интрона (с) размещают с 3'-конца последовательности экзона (b). Конструкцию химерного промотора соединяют с участком клонирования таким образом, что промотор будет влиять на экспрессию кодирующей последовательности,вставленной в участок, если присутствуют подходящие ферменты. Подходящие участки клонирования,включая участки множественного клонирования, известны в данной области, например участок множественного клонирования pUC19, pBC SK, pBluescript II KS, CDNA3.1, pSP72, pGEM 7Z. Любой подходящий участок рестрикции можно, например, использовать как участок клонирования для вставки кодирующих последовательностей. В одном из предпочтительных вариантов осуществления применяемый химерный промотор содержит:(i) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:4 или нуклеотидную последовательность из нуклеотидов с 903 по 1857 SEQ ID NO:54;(ii) функциональный вариант (i), который обладает по меньшей мере 80% гомологией нуклеотидной последовательности с (i); и/или(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). В другом предпочтительном варианте применяемый химерный промотор может содержать последовательность SEQ ID NO:14. Как правило, нуклеиновая кислота для вставки (или вставленная) в участок клонирования кодирует терапевтически значимый полипептид. Предпочтительно, чтобы кодирующая последовательность под- 18011557 ходила для применения в иммунизации нуклеиновыми кислотами или генной терапии. Вставка нуклеиновой кислоты может, таким образом, содержать последовательность, способную вызывать иммунитет,например иммуногенную последовательность, которая вызывает гуморальный и/или клеточный иммунный ответ при введении субъекту. Альтернативно, нуклеиновая кислота может содержать один или несколько генов, кодирующих терапевтический полипептид, например белок, который дефектен или отсутствует в геноме клетки-мишени, или чужеродный белок, обладающий требуемым биологическим или терапевтическим эффектом (например, противовирусной функцией). Конструкция может кодировать адъювантный полипептид. Для лечения генетических расстройств можно вводить субъекту функциональные гены, соответствующие генам, о которых известно, что они дефектны в конкретном расстройстве. Предпочтительно нуклеиновая кислота является ДНК. Нуклеиновая кислота может в некоторых вариантах являться РНК или ПНК. В некоторых вариантах некодирующую РНК можно экспрессировать посредством конструкции по изобретению. Таким образом, вектор может содержать вставленную в участок клонирования область,которая может давать начало такой РНК, например антисмысловой РНК или миРНК. Антисмысловая РНК или миРНК может, например, ингибировать экспрессию любого из генов, упомянутых здесь, или гена любого из патогенов, упомянутых здесь. Однако в наиболее предпочтительном варианте осуществления кодируется полипептид. Подходящие нуклеиновые кислоты для вставки включают в себя те, которые используют для лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных, хронических и инфекционных заболеваний, включая такие расстройства, как СПИД, рак, неврологические заболевания, сердечно-сосудистое заболевание,гиперхолестеринемию; различных болезней крови, включая различные анемии, талассемию и гемофилию; генетических дефектов, таких как кистозный фиброз, болезнь Гоше, аденозиндезаминазная (ADA) недостаточность, эмфизема и т.п. Конструкции по изобретению можно применять для лечения или профилактики состояния. Конструкции можно применять для улучшения состояния и/или устранения или уменьшения части или всех симптомов расстройства. В особенно предпочтительном варианте конструкции можно применять для вакцинации субъекта против патогена. Например, в способах лечения солидных опухолей можно вводить для экспрессии в участок опухоли или рядом с ним гены, кодирующие токсичные пептиды (т.е. химиотерапевтические средства, такие как рицин, дифтерийный токсин и фактор из яда кобры), гены опухолевой супрессии, такие как р 53, гены, кодирующие последовательности мРНК, которые являются антисмысловыми по отношению к трансформирующим онкогенам, антинеопластические пептиды, такие как фактор некроза опухолей (TNF) и другие цитокины, или трансдоминантные негативные мутанты трансформирующих онкогенов. В одном из предпочтительных вариантов осуществления конструкция по изобретению может кодировать полипептид для лечения или профилактики рака. В особенно предпочтительном варианте осуществления конструкция по изобретению может кодировать опухолевый антиген. Примеры антигенов, ассоциированных с опухолями, включают в качестве неограничивающих примеров, антигены рака яичек,такие как члены семейства MAGE (MAGE 1, 2, 3 и т.п.), NY-ESO-1 и SSX-2, антигены дифференцировки,такие как тирозиназа, gp100, PSA, Her-2 и СЕА, мутантные аутоантигены и вирусные опухолевые антигены, такие как Е 6 и/или Е 7 из онкогенных типов HPV. Дальнейшие примеры конкретных опухолевых антигенов включают в себя MART-1, Melan-A, p97, beta-HCG, GaINAc, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-4,MAGE-12, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC18, CEA, DDC, P1A, EpCam, антиген меланомы gp75,Hker 8, высокомолекулярный антиген меланомы, K19, Tyr1, Tyr2, члены генного семейства pMel 17,c-Met, PSM (антиген муцина предстательной железы), PSMA (специфический мембранный антиген предстательной железы), секреторный белок предстательной железы, альфа-фетопротеин, антиген СА 125,СА 19.9, TAG-72, BRCA-1 и BRCA-2. Примерами конкретных типов рака, из которых может происходить антиген, являются типы рака легкого, предстательной железы, молочной железы, толстой кишки, яичника, яичек, кишечника, меланома, лимфома и лейкоз. Конструкции по изобретению можно также применять для лечения или профилактики таких типов рака. Сходным образом, можно также включать нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, о которых известно, что они обладают противовирусной и/или антибактериальной активностью или стимулируют иммунную систему хозяина. Нуклеиновая кислота может кодировать один из различных цитокинов (или их функциональные фрагменты), такие как интерлейкины, интерфероны и колониестимулирующие факторы. В предпочтительном варианте кодирующие последовательности могут кодировать антиген, его иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант того и другого. Антиген может, в частности, являться антигеном вирусного, бактериального, паразитарного или грибкового патогена или опухолевым антигеном. В предпочтительном варианте антиген представляет собой вирусный антиген, его иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант того и другого. Нуклеиновая кислота может кодировать антиген для лечения или профилактики ряда состояний,включая в качестве неограничивающих примеров рак, аллергии, интоксикацию и инфекцию патогеном,- 19011557 таким как, в качестве неограничивающих примеров, грибок, вирусы, включающие вирусы папилломы человека (HPV), HIV, HSV-2/HSV-1, вирус гриппа (типы А, В и С), полиовирус, вирус RSV, риновирусы,ротавирусы, вирус гепатита А, группу вирусов Норволк, энтеровирусы, астровирусы, вирус кори, вирус парагриппа, вирус свинки, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, аденовирусы,вирус краснухи, вирус Т-клеточной лимфомы I типа человека (HTLV-I), вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV), вирус гепатита D, поксвирус, вирусы Марбурга и Эбола; бактерии, включающие М.tuberculosis, Chlamydia, N.gonorrhoeae, Shigella, Salmonella, Vibrio Cholera, Treponema pallidua,Pseudomonas, Bordetella pertussis, Brucella, Franciscella tulorensis, Helicobacter pylori, Leptospria interrogaus,Legionella pnumophila, Yersinia pestis, Streptococcus (типы А и В), Pneumococcus, Meningococcus,Hemophilus influenza (тип b), Toxoplama gondii, Complybacteriosis, Moraxella catarrhalis, Donovanosis иActinomycosis; грибковые патогены, включая кандидоз и аспергиллез; паразитарные патогены, включая цепней, трематод, круглых червей, амебиаз, лямблиоз, Cryptosporidium, Schitosoma, Pneumocystis carinii,трихомоноз и трихинеллез. Нуклеиновую кислоту можно также применять для вызывания соответствующего иммунного ответа против многочисленных ветеринарных заболеваний, таких как ящур, коронавирус, Pasteurella multocida, Helicobacter, Strongylus vulgaris, Actinobacillus pleuropneumonia, вирус диареи крупного рогатого скота (BVDV), Klebsiella pneumoniae, E.coli, Bordetella pertussis, Bordetellaparapertussis и Bordetella brochiseptica. Таким образом, в одном из аспектов конструкции нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут найти применение в качестве вакцины. Вакцины по изобретению можно применять для вакцинации против любого из патогенов и состояний, упомянутых здесь. Таким образом, изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению или популяцию конструкций нуклеиновых кислот по изобретению или покрытые частицы по изобретению. В одном из предпочтительных вариантов конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению может кодировать антиген члена adenoviridae (включая, например, аденовирус человека), herpesviridae (включая, например, HSV-1, HSV-2, EBV, CMV и VZV), papovaviridae (включая, например, HPV), poxviridae(включая полиомиелит, риновирус и гепатит А), togaviridae (включая, например, вирус краснухи),filoviridae (включая, например, вирусы Марбурга и Эбола), paramyxoviridae (включая, например, вирус парагриппа, респираторный синцитиальный вирус, свинку и корь), rhabdoviridae (включая, например,вирус бешенства), bunyaviridae (включая, например, вирус Хантаан), orthomyxoviridae (включая, например, вирусы гриппа А, В и С), retroviridae (включая, например, HIV и HTLV) и hepadnaviridae (включая,например, гепатит В). В другом предпочтительном варианте антиген может происходить из патогена, ответственного за ветеринарное заболевание и, в частности, происходить из вирусного патогена, включая, например, реовирус (такой как вирус африканской чумы лошадей или вирус синего языка) и вирусы герпеса (включая герпес лошадей). Антиген может происходить из вируса ящура. В другом предпочтительном варианте антиген может происходить из вируса клещевого энцефалита, вируса денге, SARS, вируса Западного Нила и вируса Хантаан. В другом предпочтительном случае антиген может происходить из retroviridae (например, HTLV-1,HTLV-11 или HIV-1 (также известного, как HTLV-111, LAV, ARV, hTLR и т.п., в частности, из HIV и, в частности, изолятов HIVIllb, HIVSF2, HTVLAV, HIVLAI, HIVMN; HIV-1CM235, HIV-1 или HIV-2. В особенно предпочтительном варианте осуществления антиген может являться антигеном вируса иммунодефицита человека (HIV). Примеры предпочтительных антигенов HIV включают, например, gp120,gp160, gp41, gag-антигены, такие как р 24 gag и р 55 gag, а также, белки, происходящие из областей HIVpol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu или LTR. В особенно предпочтительном случае антиген может являтьсяHIV gp120 или частью HIV gp120. Антиген может происходить из вируса иммунодефицита и может, например, происходить из SIV или вируса иммунодефицита кошек. Таким образом, кодируемый полипептид может являться антигеном, его иммуногенным фрагментом или его иммуногенным вариантом. Фрагмент или вариант может, например, обладать любой степенью гомологии, пропорционально длине исходного антигена, и функциональностью, указанной здесь, и,в частности, способностью вызывать иммунный ответ. В некоторых вариантах кодирующую последовательность конструкции нуклеиновой кислоты можно модифицировать для оптимизации экспрессии. Например, частоту использования кодонов можно модифицировать до той, которая типична для субъекта. Консенсусную последовательность Kozak для субъекта можно также заменить последовательностью вблизи инициирующего кодона, встречающуюся в природе. В особенно предпочтительном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению содержит кодирующую последовательность, кодирующую антиген гриппа, его иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант того и другого. Фрагмент и/или вариант могут обладать любыми степенями гомологии последовательности, длинами фрагмента и/или степенями функциональности, указанными здесь. В частности, предпочтительно кодирующая последовательность конструкции кодирует- 20011557 антиген вируса гриппа, иммуногенный фрагмент антигена вируса гриппа или иммуногенный вариант с 80% аминокислотной гомологией с любым из вышеперечисленного. Например, антиген гриппа может представлять собой антигены гриппа NP (белок нуклеопротеин/нуклеокапсид), HA (гемагглютинин), NA (нейраминидазу), M1, М 2, РВ 1, РВ 2, PA, NS1 и/или NS2 или может являться фрагментом или вариантом таких антигенов. В предпочтительном варианте осуществления кодируемый антиген может являться антигенами гриппа HA, NA и/или М 2 либо фрагментом или вариантом таких антигенов. В особенно предпочтительном варианте кодируемый антиген может являться антигенами HA или NA либо фрагментом или вариантом таких антигенов и, в частности, антигеномHA либо фрагментом или вариантом такого антигена. Таким образом, в особенно предпочтительной конструкции по изобретению кодируемый антиген является гемагглютинином гриппа (HA), его иммуногенным фрагментом или иммуногенным вариантом с 80% гомологией аминокислотной последовательности с любым из них. В другом предпочтительном варианте кодируемый антиген является нейраминидазой гриппа (NA), М 2, иммуногенным фрагментом того и другого или иммуногенным вариантом с 80% гомологией аминокислотной последовательности с любым из вышеперечисленного. В предпочтительном варианте конструкция по изобретению может кодировать более одного полипептида и, в частности, более одного антигена гриппа, иммуногенного фрагмента или иммуногенного варианта того и другого. В случаях, где следует применять более одного антигена, в предпочтительном варианте можно применять вместе антигены HA и NA либо фрагмент или вариант таких антигенов. В случаях, где конструкция по изобретению экспрессирует более одного антигена гриппа, иммуногенного фрагмента или иммуногенного варианта того и другого, по меньшей мере два разных кодируемых антигена, фрагмента или варианта происходят из одного полипептида гриппа из разных штаммов вируса гриппа. В одном из предпочтительных вариантов осуществления антиген может происходить из штамма гриппа H5N1 и можно применять его иммуногенные фрагменты и варианты тех и других, которые сохраняют иммуногенность. В частности, антиген может происходить из штамма H5N1 или являться фрагментом такого антигена. В некоторых вариантах антиген может являться фрагментом или вариантом существующего в природе полипептида гриппа. Например, антиген может соответствовать подобласти существующего в природе полипептида гриппа, включая любые из разных длин фрагментов, рассматриваемые здесь. Антиген может являться вариантом существующего в природе антигена гриппа или фрагментом такого антигена. Предпочтительно такие варианты и/или фрагменты будут способны вызывать иммунный ответ, способный узнавать антиген и, в частности, вирус гриппа, из которого происходят фрагмент или вариант. Антиген гриппа может происходить из любого вируса гриппа. Антиген может происходить из вируса гриппа А, В или С, в частности из вируса гриппа А и/или В. Антиген может происходить из варианта штамма гриппа и, в частности, варианта штамма, ассоциированного с повышенной инфекционностью или патогенностью штамма гриппа. Антиген может, например,происходить из одного из штаммов, идентифицируемых ежегодно Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) для применения в вакцинах против гриппа и, в частности, может являться антигеном,идентифицированным ВОЗ для такого применения. В предпочтительном варианте конструкция нуклеиновой кислоты, популяция нуклеиновых кислот, фармацевтическая композиция или вакцина по изобретению могут кодировать антиген каждого из трех штаммов гриппа и, в частности, трех штаммов, идентифицированных ВОЗ или другими аналогичными уполномоченными организациями в конкретном году. В предпочтительном варианте один или более из кодируемых антигенов гриппа могут происходить из пандемического штамма гриппа. Таким образом, антиген гриппа, иммуногенный фрагмент или вариант того и другого могут происходить из пандемического штамма гриппа. Конструкцию, кодирующую антиген из пандемического штамма, можно, например, вводить или она может присутствовать самостоятельно. В других случаях конструкция может также кодировать или ее можно вводить с другой конструкцией, которая кодирует другие антигены. В предпочтительном случае или одна и та же, или отдельные конструкции могут кодировать антиген из пандемического штамма гриппа и антиген из непандемического штамма гриппа. В частности, можно вводить пандемический антиген гриппа и антиген из 1, 2, 3,4, 5, 6 или более непандемических штаммов гриппа, предпочтительно можно вводить антиген любого из 3, 4 или 5 непандемических штаммов гриппа и еще более предпочтительно можно вводить антиген любого из 3 или 4 непандемических штаммов гриппа. В некоторых вариантах конструкция может кодировать более одного полипептида. В частности,конструкция может кодировать более одного антигена и особенно более одного антигена гриппа. Например, конструкция может экспрессировать 2, 3, 4, 5, 6 или более полипептидов и, в частности, антигенов. В предпочтительном случае конструкция может кодировать 3, 4, 5 или более разных полипептидов и, в частности, антигенов. В еще более предпочтительном случае конструкция может кодировать 3, 4 или 5 разных полипептидов и, в частности, антигенов. В еще более предпочтительном случае конструкция может кодировать 3 или 4 разных полипептида, в частности, антигена и особенно антигены гриппа. По меньшей мере один из антигенов будет экспрессирован с использованием химерного промотора по изо- 21011557 бретению и предпочтительно все антигены будут экспрессированы таким образом. Как правило, каждый антиген можно экспрессировать с отдельного химерного промотора по изобретению. В некоторых случаях один промотор можно использовать для получения транскрипта, который дает начало нескольким полипептидам. В некоторых вариантах несколько антигенов можно экспрессировать в виде слитого белка. В предпочтительном варианте конструкция по изобретению кодирует пандемический антиген гриппа, его иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант того и другого и один или несколько непандемических антигенов гриппа, их иммуногенные фрагменты или иммуногенные варианты того и другого. Конструкции нуклеиновых кислот по изобретению можно применять в вакцине. Таким образом,изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты, популяцию конструкций нуклеиновых кислот или покрытые частицы носителя по изобретению. Вакцина может содержать подходящий фармацевтический носитель или эксципиент. Вакцина может содержать адъювант и, в частности, адъювантную конструкцию по изобретению. Альтернативно, вакцину можно вводить отдельно, после такого адъюванта или одновременно с ним. В одном из предпочтительных вариантов изобретение относится к поливалентной вакцине, содержащей по меньшей мере две разные конструкции по изобретению, которые кодируют разные антигены,их иммуногенные фрагменты, или иммуногенные варианты тех и других. Антиген может являться любым из здесь упомянутых. В предпочтительном варианте изобретение относится к поливалентной вакцине, содержащей по меньшей мере две разные конструкции по изобретению, которые кодируют разные антигены гриппа, их иммуногенные фрагменты или иммуногенные варианты тех и других. В альтернативных случаях несколько антигенов можно экспрессировать с одной и той же конструкции, чтобы получить поливалентную вакцину, или можно применять сочетания конструкций, кодирующих один и несколько антигенов. В другом предпочтительном варианте поливалентная вакцина по изобретению может являться тривалентной, тетравалентной или пентавалентной вакциной, кодирующей три, четыре или пять разных антигенов, иммуногенных фрагментов или иммуногенных вариантов и, в частности, антигенов гриппа,фрагментов или вариантов тех и других. В другом предпочтительном варианте вакцина по изобретению, включая поливалентные вакцины,может содержать конструкцию, которая кодирует пандемический антиген гриппа, его иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант того и другого. Поливалентная вакцина может кодировать пандемический антиген гриппа, иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант того и другого и также,например, антиген каждого из трех, четырех или пяти разных штаммов гриппа, их иммуногенных фрагментов или иммуногенных вариантов тех и других. Адъювант может присутствовать в вакцине по изобретению или его можно вводить одновременно с вакциной по изобретению, отдельно от нее или последовательно с ней. В частности, изобретение относится к вакцине, которая содержит по меньшей мере одну конструкцию по изобретению, кодирующуюADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или ее вариант с адъювантной активностью. Конструкции нуклеиновых кислот, экспрессирующие более одного антигена, можно применять для получения поливалентных вакцин, т.е. вакцины, предназначенной для иммунизации против нескольких разных антигенов и, в частности, против антигенов гриппа. В некоторых вариантах будут получены антиген или антигены гриппа и антиген или антигены из другого патогена. Таким образом, любая из конструкций, популяций конструкций нуклеиновых кислот, вакцин, фармацевтических композиций и покрытых частиц носителя, упомянутых здесь, может содержать конструкцию, кодирующую антиген гриппа, и любая из той же конструкции или разных конструкций, может кодировать антигены из разных патогенов. Разные поливалентные конструкции гриппа, популяции и вакцины, упомянутые здесь, могут также кодировать антиген или антигены из другого патогена. В некоторых случаях кодируемые антигены будут происходить из одного патогена. В некоторых вариантах разные антигены все будут происходить из одного вируса. Таким образом, в предпочтительном варианте все из антигенов будут являться антигенами гриппа. Множество антигенов может происходить из одного штамма вируса гриппа и, таким образом, может происходить из нескольких разных полипептидов вируса гриппа. Альтернативно, множество антигенов может происходить из разных штаммов вируса и, в частности, вируса гриппа. В случае поливалентных конструкций и/или вакцин можно выбрать антигены по меньшей из мере 2 и предпочтительно по меньшей мере 3, 4 или 5 разных штаммов гриппа. Антигены могут, например, происходить из 2, 3, 4, 5, 6 или более разных штаммов, в частности,можно применять антигены из 3, 4 или 5 штаммов и еще более предпочтительно из 3 или 4 разных штаммов. Поливалентные вакцины могут, альтернативно или дополнительно, содержать несколько разных конструкций по изобретению с разными конструкциями, кодирующими разные антигены. Например, по меньшей мере, можно применять 2, 3, 4, 5 или 6 разных конструкций. В особенно предпочтительном варианте можно применять 2, 3, 4 или 5 разных конструкций и особенно 3 или 4 конструкции. В одном из вариантов, где присутствует более одной конструкции, каждая конструкция кодирует один антиген. В- 22011557 другом варианте конструкции могут кодировать 2, 3, 4, 5 или более разных антигенов, в частности 3 или 4 разных антигена. Изобретение также относится к популяции конструкций нуклеиновых кислот, где популяция содержит несколько конструкций по изобретению и, в частности, любое из сочетаний, упомянутых выше. Таким образом, изобретение относится к популяции конструкций нуклеиновых кислот, где популяция содержит по меньшей мере две разные конструкции по изобретению. Конструкции нуклеиновых кислот могут присутствовать в любых подходящих количествах по отношению друг к другу. Как правило, каждая конструкция нуклеиновой кислоты присутствует в массовом соотношении приблизительно 1:10 друг к другу. Популяции конструкций нуклеиновых кислот можно применять для получения поливалентных вакцин и в разных способах по изобретению. Поливалентные вакцины могут также являться поливалентными, потому что они содержат любую из конструкций по изобретению, которая кодирует более одного антигена. В одном из предпочтительных вариантов предоставлена популяция нуклеиновых кислот, где популяция содержит по меньшей мере две разные конструкции, которые кодируют разные антигены. В частности, изобретение относится к популяции, содержащей по меньшей мере две разные конструкции, которые кодируют антигены гриппа, их иммуногенные фрагменты или иммуногенные варианты тех и других. В такой популяции конструкций нуклеиновых кислот предпочтительно, что по меньшей мере два разных антигена могут происходить из одного полипептида гриппа, такого как HA, из разных штаммов гриппа. В популяциях, в которых присутствуют по меньшей мере две разные конструкции, которые кодируют антигены гриппа, предпочтительно по меньшей мере два разных антигена, фрагмента или варианта происходят из разных полипептидов гриппа, которые могут происходить из одного или разных штаммов гриппа. Другие предпочтительные популяции включают популяцию конструкций нуклеиновых кислот, где популяция содержит по меньшей мере три разные конструкции, каждая из которых кодирует антиген из разных штаммов гриппа, или иммуногенный фрагмент, или иммуногенный вариант. В другом предпочтительном варианте изобретение относится к популяции конструкций нуклеиновых кислот, которая содержит по меньшей мере одну конструкцию, кодирующую антиген, его иммуногенный фрагмент, или иммуногенный вариант того и другого, и по меньшей мере одну конструкцию,кодирующую ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или ее вариант с адъювантной активностью. Данная или каждая конструкция, кодирующая антиген, иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант, как правило, присутствует в массовом соотношении приблизительно от 10:1 до 1:10 по отношению к данной или каждой конструкции, кодирующей ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или ее вариант с адъювантной активностью. Массовое соотношение может составлять от приблизительно 10:1 до приблизительно 1:1, например приблизительно 9:1. В случаях, где необходимо кодировать несколько полипептидов, можно применять любое сочетание конструкций, кодирующих один или несколько полипептидов и несколько конструкций. Например,если необходимо кодировать 3 антигена, одна конструкция может кодировать все 3, одна конструкция может кодировать 2 и другая конструкция 1 антиген, или можно, например, применять три конструкции,каждая кодирует 1 антиген. В случаях, когда необходимо кодировать 4 антигена, их можно кодировать с помощью четырех, трех, двух или одной конструкции, где каждая конструкция кодирует 1, 2, 3 или 4 разных антигена. В одном из вариантов можно применять минимальное количество конструкций, например можно применять только одну или две конструкции. Изобретение также относится к популяциям нуклеиновых кислот и вакцинам, содержащим такие сочетания конструкций нуклеиновых кислот. В предпочтительном варианте изобретение относится к поливалентной вакцине или популяции нуклеиновых кислот, содержащих конструкцию, кодирующую антиген из пандемического вируса гриппа, и которая также кодирует 3, 4 или 5 и, в частности, 3 или 4 непандемических антигена гриппа. Непандемические антигены гриппа можно кодировать с помощью той же конструкции, что и пандемический антиген гриппа, или с помощью разных конструкций. В предпочтительном варианте 3, 4 или 5 других непандемических антигенов гриппа можно кодировать с помощью отдельной конструкции или конструкций и,в частности, с помощью одной отдельной конструкции. В другом варианте конструкция, кодирующая пандемический антиген, может также кодировать один или несколько других антигенов. В некоторых вариантах осуществления конструкция нуклеиновой кислоты будет кодировать адъювант или это может делать отдельная конструкция. Любая из популяций, композиций и вакцин по изобретению может содержать, или их можно вводить одновременно с такой адъювантной конструкцией,последовательно с ней или отдельно от нее. Таким образом, последовательности, вставленные в участок клонирования для вставки кодирующей последовательности, могут кодировать полипептид, который может действовать как адъювант. Таким образом, в одном из вариантов изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты,где кодирующая последовательность кодирует ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или вариант того и другого с адъювантной активностью,который также обладает 80% аминокислотной гомологией с любым из вышеперечисленного. В предпоч- 23011557 тительном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит две кодирующие последовательности,содержащие ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или вариант того и другого с адъювантной активностью, где каждый соединен с таким химерным промотором. Две кодирующие последовательности, кодирующие ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или вариант того и другого с адъювантной активностью, могут находиться в одном из вариантов в обратной ориентации. В другом варианте две кодирующие последовательности, кодирующие ADP-рибозилирующую субъединицу бактериального токсина, ее фрагмент с адъювантной активностью или вариант того и другого с адъювантной активностью, могут находиться в одной ориентации. В любой из конструкций по изобретению, содержащих более одной кодирующей последовательности, соединенной с химерным промотором, промоторы могут находиться в одной ориентации, в разных ориентациях или представлять собой смесь двух ориентаций при наличии трех или более таких промоторов. В предпочтительном варианте кодируемый адъювант в любой из адъювантных конструкций может являться ADP-рибозилирующим бактериальным токсином. Он включает дифтерийный токсин (DT), коклюшный токсин (РТ), холерный токсин (СТ), термолабильные токсины E.coli (LT1 и LT2), эндотоксин AC2 и C3, экзофермент С.limosum, а также токсины из С.perfringens, С.spiriforma и С.difficile и Staphylococcus aureus EDIN. Большинство ADP-рибозилирующих бактериальных токсинов содержат субъединицы А и В. Конструкция может экспрессировать А-субъединицу, В-субъединицу и/или обе субъединицы. В предпочтительном варианте конструкция нуклеиновой кислоты может кодировать термолабильный токсин E.coli и/или холерный токсин и, в частности, может экспрессировать термолабильный токсинE.coli. Местоположение в GenBank для полных последовательностей генов СТ-субъединицы А и В можно найти в локусе VIBCTXABB (инвентарныйD30053), в то время как местоположение в GenBank для полных последовательностей генов LT-субъединицы А и В можно найти в локусе АВ 0116677 (инвентарныйАВ 011677). В особенно предпочтительном варианте конструкция по изобретению может кодировать субъединицы LT А и/или LT В, кодируемые векторами pPJV2012 и/или pPJV7788, или фрагмент такой субъединицы, который сохраняет адъювантную активность, или вариант того и другого, который сохраняет адъювантную активность. Конструкция по изобретению может содержать кодирующие последовательности субъединиц LT А и/или LT В в векторах pPJV2012 и/или pPJV7788, их фрагмент, который кодирует полипептид, который обладает адъювантной активностью, или вариант того и другого, который обладает адъювантной активностью. В предпочтительном варианте конструкция по изобретению обладает кодирующими последовательностями как LT А, так и LT В. В другом предпочтительном варианте конструкция может содержать последовательность вектораPJV2012, представленную в виде SEQ ID NO:61, или последовательность с 60% идентичности последовательности по отношению к ней. В другом варианте конструкция может содержать последовательность вектора PJV7788, представленную в виде SEQ ID NO:62, или последовательность с 60% идентичности последовательности по отношению к ней. Конструкция может экспрессировать активный вариант или фрагмент конкретного адъюванта. Говорят, что вариант или фрагмент является активным, если он сохраняет, по меньшей мере, некоторую адъювантную активность полипептида, из которого он происходит. Таким образом, вариант и/или фрагмент все еще будут способны усиливать иммунный ответ на конкретный антиген по сравнению с иммунным ответом, который наблюдают, когда с антигеном не вводят никакого адъюванта. Кодируемая последовательность может представлять собой активные фрагменты или варианты субъединиц СТ А и/или В и, в частности, может представлять собой активные фрагменты субъединиц LT А и/или В. Варианты и фрагменты, которые можно применять, могут, например, обладать любой длиной, степенью гомологии последовательности или другими характеристиками, упомянутыми здесь для вариантов и фрагментов. Их можно, например, оценивать с использованием сравнительного анализа иммуногенности с использованием конкретного антигена и затем сравнивать результаты для адъювантного базового вектора и варианта вектора, кодирующего адъювант. В особенно предпочтительном варианте осуществления конструкция может кодировать субъединицы LT A и/или LT B и, в частности, обе из них. Конструкция может, в особенно предпочтительном варианте, являться pPJV2012 или pPJV7788, последовательности которых здесь представлены. Любую из адъювантных конструкций по изобретению можно вводить одновременно, последовательно или по отдельности с антигеном или нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген. В предпочтительном варианте адъювантную конструкцию по изобретению можно вводить одновременно, последовательно или по отдельности с конструкцией по изобретению, кодирующей антиген. Композиции и вакцины, содержащие адъювантную конструкцию и конструкцию, кодирующую антиген, представлены в виде коровых носителей, покрытых обоими типами конструкций, нанесенных на них, или смесями коровых носителей, покрытых адъювантной конструкцией, и других коровых носителей, покрытых конструкцией,кодирующей антиген.- 24011557 У субъединицы токсина можно удалить существующую в природе сигнальную последовательность. Природные сигнальные последовательности экзотоксинов можно замещать эукариотической сигнальной последовательностью и, в частности, сигнальным пептидом лизоцима курицы. Существующую в природе субъединицу экзотоксина можно модифицировать для детоксикации токсина. А-субъединицу можно модифицировать для нарушения или инактивации ADP-рибозилтрансферазной активности. В некоторых случаях субъединицы экзотоксина могут сохранять токсичность. Таким образом, в некоторых вариантах субъединицы экзотоксина не будут подвергнуты детоксикации. Таким образом, адъювантные конструкции по изобретению можно применять для усиления иммунного ответа на конкретный антиген. Усиленный иммунный ответ может включать иммунный ответ большей силы или продолжительности. Это может означать, что при повторной встрече с антигеном иммунный ответ сильнее по сравнению с ответом без введения адъюванта. Усиленный иммунный ответ может приводить к более высоким титрам антител. В случае некоторых конструкций и, в частности, тех,которые экспрессируют субъединицы экзотоксина, адъювант может приводить к усилению клеточного ответа и Т-хелпер 1-подобного иммунного ответа на рассматриваемый антиген. Адъювантные конструкции можно вводить, они могут находиться в вакцине или находиться в популяции нуклеиновых кислот с любыми другими конструкциями, упомянутыми здесь. Адъювантные конструкции могут также кодировать или их можно вводить с конструкцией, которая кодирует антиген,включая любую из упомянутых здесь, и, в частности, кодирует грипп. В одном из вариантов осуществления конструкция по изобретению может кодировать иммуностимулятор и/или иммуносупрессор. В предпочтительном варианте конструкция может кодировать один или несколько из интерферона альфа, бета и/или гамма, интерлейкина-1, -2, -4, -5, -7, -10, -12, -13, -18,-23 и -24, GM-CSF, G-CSF, TGF-бета, В 7.1, В 7.2, CTLA-4, лиганда CD40, CD40, OX40, лиганда OX40,лиганда Flt-3, TRAIL, TRANCE, лиганда Fas, TNF-альфа, МСР-1-альфа, PF-4, SLC, MIP-3-альфа, IP-10. В некоторых случаях такую конструкцию можно вводить одновременно, по отдельности или последовательно с любой другой конструкцией, в частности конструкцией по изобретению и особенно конструкцией, кодирующей антиген. Конструкция по изобретению может содержать сигнал полиаденилирования. Нуклеиновая кислота для вставки в участок клонирования может содержать последовательность полиаденилирования(поли-А). Такая поли-А-последовательность является в основном природной по отношению к кодирующей последовательности. Альтернативно, можно предусмотреть в конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению гетерологичную поли-А-последовательность. Как правило, поли-А-последовательность будет предусмотрена ниже участка клонирования так, что она окажется функционально связанной с кодирующей последовательностью, вставленной в участок клонирования. Любую подходящую поли-А-последовательность можно вставить в конструкцию с использованием общепринятых способов клонирования. Такие поли-А-последовательности известны в данной области. Поли-А-последовательность может являться:(ii) функциональным гомологичным вариантом (i) или(iii) функциональным фрагментом (i) или (ii). Природная поли-А-последовательность (i) может являться, например, поли-А гена -глобина кролика, поли-А раннего или позднего гена вируса папилломы человека (HPV), поли-А гена HSV-2gB, полиА предраннего гена CMV обезьян или поли-А позднего гена HSV gD. Последовательность полиаденилирования может происходить из последовательности полиаденилирования гена, выбранного из гена глобина кролика, раннего или позднего генов вируса папилломы человека (HPV), гена HSV-2gB, предраннего гена CMV обезьян и позднего гена HSV gD. Предпочтительно природная поли-А-последовательность (i) выбрана из группы, состоящей изSEQ ID NO:13 (GenBank K02718). Особенно предпочтительная поли-А-последовательность содержит нуклеотиды с 4243 по 4373 SEQ ID NO:54 или является ее функциональным гомологичным вариантом или фрагментом. Предпочтительная поли-А-последовательность также представлена нуклеотидами с 2556 по 2686 SEQ ID NO:14 или можно также применять функциональный фрагмент или вариант того и другого. В другом предпочтительном варианте сигнал полиаденилирования, применяемый в конструкции по изобретению, может содержать:(ii) функциональный вариант (i), который обладает по меньшей мере 80% гомологией нуклеотидной последовательности с одной или несколькими последовательностями (i); и/или- 25011557 Как правило, функциональная поли-А-последовательность сохраняет активность полиаденилирования. Поли-А-последовательность можно тестировать на способность осуществлять полиаденилирование РНК-транскрипта с использованием общепринятого анализа экспрессии. Функциональный гомологичный вариант (ii) или функциональный фрагмент (iii), как правило, обладает по меньшей мере 50%, например, 60, 70, 80% или более поли-А-активности природной поли-А-последовательности в анализе. В целом, поли-А-последовательность при наличии в конструкции по изобретению будет усиливать экспрессию, как правило, вызывая усиление, сравнимое с природной поли-А-последовательностью (i),упомянутой выше. Поли-А-последовательность можно также анализировать на функциональность с использованием сравнительного анализа экспрессии ниже. Тестируемую поли-А-область вставляют в базовый вектор вместо RBGpA. Тестируемую поли-А считают функциональной, если поли-А не нарушает экспрессию,но предпочтительно повышает экспрессию по меньшей мере в одном, но предпочтительно в двух контрольных типах клеток по сравнению с базовым вектором. Предпочтительно повышение экспрессии составляет по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40 или 50% или более. Повышение может являться любым из уровней, упомянутых здесь. В некоторых случаях может происходить уменьшение, включая любой из упомянутых здесь уровней. Предпочтительными типами клеток являются клетки млекопитающих HEK 293 Т, СНО, HeLa, BHK, 3T3 или COS. Можно также применять клетки SSC15 или В 16. Согласно анализу, как правило, гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) является функциональным, если он дает более чем 50% улучшение экспрессии, достигаемое природной поли-А-последовательностью (i). Альтернативно или дополнительно, поли-А-последовательности можно тестировать на активность в сравнительном анализе иммуногенности ниже. Поли-А-последовательность вставляют в базовый вектор вместо RBGpA. Функциональная поли-А-последовательность дает титры антител, которые, по меньшей мере, такие же высокие или более высокие по сравнению с теми, которые дает базовый вектор по меньшей мере с одним, предпочтительно с двумя антигенами. Предпочтительно титры антител по меньшей мере на 5, 10, например, 20, 30 или 40% выше по сравнению с титрами, которые дает базовый вектор. В некоторых вариантах можно наблюдать любое из повышений или понижений, упомянутых здесь. Предпочтительными антигенами являются антигены HBsAg, HSV-2gD и Flu-M2. Особенно предпочтительными антигенами являются антигены гриппа, включая любые из упомянутых здесь, и, в частности, антигены HA, NA и М 2. В частности, можно применять антиген HA или его иммуногенный фрагмент или иммуногенный вариант того и другого. Гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii), как правило, функционален, если он дает наиболее высокие титры антител из достигаемых природной поли-Апоследовательностью (i). Конструкция нуклеиновой кислоты может содержать дополнительные управляющие последовательности, которые влияют на экспрессию кодирующей последовательности, вставленной в участок клонирования. Конструкция может содержать нетранслируемую лидерную последовательность. Последовательность предусмотрена в конструкции, функционально связанной с химерным промотором и, таким образом, также с кодирующей последовательностью, вставленной в участок клонирования. Лидерная последовательность дает участок инициации трансляции для экспрессии вставленной кодирующей последовательности и, как правило, содержит последовательность Kozak. Как правило, нетранслируемая лидерная последовательность содержит:(i) природную нетранслируемую лидерную последовательность;(ii) функциональный гомологичный вариант (i) или(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). Как правило, лидерная последовательность содержит последовательности, присутствующие в (i),которые связываются с компонентами транскрипции или регуляторными белками, или гомологи этих последовательностей, которые способны связываться с такими же компонентами или белками. Как правило, такие последовательности или их гомологи присутствуют в лидерной последовательности в том же порядке и/или, по существу, в том же относительном расположении, как в (i). Как правило, лидерная последовательность содержит участок инициации трансляции для экспрессии вставленной кодирующей последовательности. Как правило, лидерная последовательность содержит последовательность Kozak. Как правило, нетранслируемая лидерная последовательность обладает длиной от приблизительно 10 до приблизительно 200 нуклеотидов, например, от приблизительно 15 до 150 нуклеотидов, предпочтительно от 15 до приблизительно 130 нуклеотидов. Можно применять лидерные последовательности,содержащие, например, 15, 50, 75 или 100 нуклеотидов. В целом, функциональная нетранслируемая лидерная последовательность способна давать участок инициации трансляции для экспрессии кодирующей последовательности, функционально связанной с лидерной последовательностью. Как правило, функциональный вариант (ii) или фрагмент (iii) обладает,по существу, той же активностью, что и активность природной последовательности (i), и/или дополняет ее, обычно облегчая или усиливая экспрессию кодирующей последовательности, функционально связанной с последовательностью.- 26011557 Вариант (ii) или фрагмент (iii) можно тестировать на активность в качестве нетранслируемой лидерной последовательности по отношению к природной лидерной последовательности с использованием общепринятых способов. Например, экспрессирующие векторы можно получить содержащими природную лидерную последовательность (i), функционально связанную со своей природной кодирующей последовательностью, и наблюдать экспрессию в подходящих клетках-хозяевах, например клетках млекопитающих HEK 293 Т, СНО, HeLa, BHK, 3T3 или COS. Можно получить тестируемые конструкции, в которых природная лидерная последовательность замещена гомологичным вариантом или фрагментом, и снова наблюдать экспрессию в тех же самых клетках-хозяевах. Как правило, вариант (ii) или фрагмент(iii) дает по меньшей мере 50%, как, например, 60, 70, 80, 90 или 100% экспрессии или более, которую дает природная последовательность. В некоторых случаях можно наблюдать любые из повышений или понижений экспрессии, упомянутые здесь. Предположительную лидерную последовательность можно также тестировать на пригодность в сравнительном анализе экспрессии ниже. Тестируемую лидерную последовательность вставляют в базовый вектор вместо HBV pre S2 5'-UTR. Функциональная лидерная последовательность не нарушает экспрессии, но предпочтительно повышает экспрессию по меньшей мере в одном, но предпочтительно в двух контрольных типах клеток по сравнению с базовым вектором. Как правило, экспрессия возрастает по меньшей мере на 5, 10, 20, 30, 40 или 50%. Предпочтительными типами клеток являются клетки млекопитающих HEK 293 Т, СНО, HeLa, BHK, 3T3 или COS. Согласно анализу гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii), как правило, является функциональным, если он дает больше чем на 50% улучшение экспрессии, которое дает природная лидерная последовательность. Альтернативно или дополнительно, лидерную последовательность можно тестировать на активность в сравнительном анализе иммуногенности ниже. Лидерную последовательность вставляют в базовый вектор вместо HBV pre S2 5'-UTR. Функциональная лидерная последовательность дает титры антител, по меньшей мере, такие же высокие как или более высокие, чем те, которые дает базовый вектор по меньшей мере с одним, предпочтительно с двумя антигенами. Предпочтительно титры антител по меньшей мере на 5, 10, 20, 30 или 40% выше титров базового вектора. Предпочтительными антигенами являются антигены HBsAg, HSV-2gD и Flu-M2. Особенно предпочтительными антигенами являются антигены гриппа, включая любые из упомянутых здесь, и, в частности, антигены HA, NA и М 2. В частности,можно использовать антиген HA либо его фрагмент или вариант. Гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii), как правило, функционален, если он дает наиболее высокие титры антител, которые дает природная лидерная последовательность (i). Однако в некоторых вариантах можно наблюдать один из сниженных уровней экспрессии, упомянутых здесь. Подходящую лидерную последовательность можно получать с использованием общепринятых способов. Например, последовательность антигена HBV preS2, последовательность е-антигена HBV и последовательность антигена HSV-2gD доступны в GenBank M54923, М 54923 и Z86099 соответственно. Праймеры можно конструировать на основе этой известной последовательности и использовать для выделения гомологичных последовательностей. Лидерные последовательности можно синтезировать на основе известных последовательностей. Как правило, природная последовательность (i) является эукариотической последовательностью или вирусной последовательностью, в частности вируса, который инфицирует эукариоты. Предпочтительно природная последовательность (i) является последовательностью HBV или HSV, например последовательностью антигена HBV preS2, последовательностью е-антигена HBV или последовательностью антигена HSV-2gD. В частности, предпочтительно (i) выбран из группы, состоящей изSEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7. В другом предпочтительном варианте нетранслируемая лидерная последовательность содержит нуклеотиды 1864-1984 SEQ ID NO:54 или SEQ ID NO:14. Можно также применять функциональные фрагменты или варианты любой из этих последовательностей. В одном из вариантов нетранслируемая лидерная последовательность содержит:(ii) функциональный вариант (i), который обладает по меньшей мере 80% гомологией нуклеотидной последовательности с (i); и/или(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). Такую нетранслируемую лидерную последовательность можно применять в любой из конструкций по изобретению. Конструкция нуклеиновой кислоты может содержать энхансерную последовательность. Энхансерная последовательность, как правило, предусмотрена с 3'-конца от участка клонирования в функциональной связи как с химерным промотором, так и с вставленной кодирующей последовательностью и действует, усиливая транскрипцию вставленной последовательности. Как правило, энхансер содержит:(ii) функциональный гомологичный вариант (i) или- 27011557 Энхансерная последовательность в основном содержит от приблизительно 50 до приблизительно 850 нуклеотидов, например, от приблизительно 75 до приблизительно 500 нуклеотидов. Можно применять энхансеры приблизительно из 100, 200, 300 или 400 нуклеотидов. Как правило, (i) является эукариотическим или вирусным энхансером, в частности вируса, который инфицирует эукариоты. Обычно такие энхансеры расположены в 3'-нетранслируемой области (3'-UTR) гена. Предпочтительно (i) является энхансером HBV или CMV, например 3'-UTR HBs Ag или 3'-UTR предраннего гена CMV обезьян. Предпочтительно (i) содержит SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:9. Предпочтительно (i) может содержать нуклеотиды 3699-4231 SEQ ID NO:54. В другом предпочтительном варианте (i) может содержать нуклеотиды с 2012 по 2544 SEQ ID NO:14. Можно применять функциональные фрагменты или варианты любой из этих последовательностей. Как правило, энхансер в конструкции содержит последовательности, найденные в (i), которые связываются с компонентами транскрипции или регуляторными белками, например факторами транскрипции, или гомологи этих последовательностей, которые связываются с теми же самыми компонентами или белками. Предпочтительно данные последовательности присутствуют в энхансере в том же самом порядке и/или, по существу, в том же самом относительном расположении, как в (i). В целом, функциональный энхансер усиливает или повышает экспрессию полинуклеотида, например, кодирующей последовательности, которая функционально связана с энхансерной последовательностью. Как правило, функциональный гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) обладает, по существу, той же активностью (например, усиление экспрессии), что и активность природного энхансера (i),и/или дополняет ее. Энхансерную активность можно анализировать с использованием анализа ловушки энхансеров. Протоколы известны в данной области. Функциональный гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) предпочтительно дает по меньшей мере 50% энхансерной активности, которой обладает природный энхансер в таком анализе. Как правило, активность составляет по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 100% или более активности природного энхансера. Как правило, функциональный вариант (ii) или фрагмент (iii) способен дополнять активность природного энхансера (i) в анализе. Можно, например, наблюдать любое из повышений или понижений, рассматриваемых здесь. В одном из предпочтительных вариантов энхансерная последовательность содержит:(ii) функциональный вариант (i), который обладает по меньшей мере 80% гомологией нуклеотидной последовательности с одной или несколькими последовательностями (i); и/или(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). Пригодность энхансера можно также тестировать с использованием сравнительного анализа экспрессии, представленного ниже. Тестируемую 3'-UTR последовательность вставляют в базовый вектор. 3'-UTR пригодна, если она не нарушает экспрессии, но предпочтительно повышает экспрессию по меньшей мере в одном, но предпочтительно в двух контрольных типах клеток по сравнению с базовыми векторами в анализе. Предпочтительно экспрессия возрастает по меньшей мере на 5, 10, 20, 30, 40 или 50%. Предпочтительными типами клеток являются клетки млекопитающих HEK 293 Т, СНО, HeLa, BHK, 3T3 или COS. Согласно этому анализу гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii), как правило, функционален, если он дает более чем 50% улучшения экспрессии, которое дает природная энхансерная последовательность (i). Дополнительно или альтернативно, энхансерные последовательности можно тестировать на активность в сравнительном анализе иммуногенности ниже. 3'-UTR вставляют в базовый вектор. Функциональная энхансерная последовательность дает титры антител, которые, по меньшей мере, такие же высокие или более высокие по сравнению с теми, которые дает базовый вектор по меньшей мере с одним,предпочтительно с двумя антигенами. Предпочтительно титры антител по меньшей мере на 5, 10, 20, 30 или 40% выше, чем титры базового вектора. Предпочтительными антигенами являются антигеныHBs Ag, HSV-2gD и Flu-M2. Особенно предпочтительными антигенами являются антигены гриппа,включая любые из упомянутых здесь, и, в частности, антигены HA, NA и М 2. В частности, можно применять HA или его фрагмент или вариант. Гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) функционален,если он дает наиболее высокий титр антител, который дает природная энхансерная последовательность (i). Подходящую энхансерную последовательность можно получать с использованием общепринятых способов клонирования. Например, 3'-UTR-последовательность HBsAg или 3'-UTR-последовательность предраннего гена CMV обезьян можно получить в GenBank AF143308 и М 16019. Праймеры можно сконструировать на основе данной известной последовательности и использовать для выделения гомологичных последовательностей. В некоторых вариантах, где одна конструкция кодирует несколько полипептидов, может потребоваться удалить конкретные последовательности для уменьшения размера конструкции. В частности, в конструкции может отсутствовать энхансер и/или область, кодирующая нетранслируемую лидерную последовательность, функционально связанную с последовательностью или последовательностями, кодирующими экспрессируемый полипептид. Таким, например, может являться случай, где одна и та же- 28011557 конструкция экспрессирует 3, 4, 5 или более полипептидов и, в частности, одна и та же конструкция экспрессирует 3, 4 или 5 полипептидов. В предпочтительном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит гетерологичную поли-А-последовательность, гетерологичную лидерную последовательность и гетерологичный энхансер, все в функциональной связи с химерным промотором, для эффективной экспрессии вставленной кодирующей последовательности. В дополнительном аспекте настоящее изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей или иногда состоящей существенным образом из:(ii) нетранслируемой лидерной последовательности, происходящей из последовательности антигенаHBV preS2, последовательности е-антигена HBV или последовательности антигена HSV типа 2gD и(iii) кодирующей последовательности, функционально связанной с (i) и (ii), где кодирующая последовательность гетерологична нетранслируемой лидерной последовательности. Как правило, последовательность промотора (i) происходит из вирусной или эукариотической последовательности промотора. Последовательность промотора может являться природной последовательностью промотора, функциональным гомологом природной последовательности или функциональным фрагментом того и другого. Подходящие природные промоторы включают, например, предранний промотор hCMV, промотор вируса ложного бешенства (PRV) или промотор вируса саркомы Рауса (RSV). Предпочтительно природный промотор содержит SEQ ID NO:52 или SEQ ID NO:53. Можно применять искусственную промоторную конструкцию, такую как химерный промотор, описанный выше, при условии, что промотор функционален. Функциональная последовательность промотора, как правило, способна вызывать (включая инициацию и регуляцию) транскрипцию функционально связанной кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине. Последовательность промотора можно тестировать на промоторную активность с использованием общепринятого анализа экспрессии. Функциональный гомолог или фрагмент природной последовательности промотора, как правило, дает по меньшей мере 50%, например, или по меньшей мере 60, 70, 80 или 90% экспрессии, которую дает природная последовательность в таком анализе. Нетранслируемая лидерная последовательность (ii) описана выше. Подходящие кодирующие последовательности (iii) включают в себя уже описанные в связи с конструкцией химерного промотора. Однако в настоящем аспекте изобретения кодирующая последовательность гетерологична нетранслируемой лидерной последовательности. Настоящая конструкция, как правило, содержит поли-А-последовательность, которая уже описана, которая может являться природной по отношению к кодирующей последовательности, или ее можно представить в виде гетерологичной поли-А-последовательности конструкции. Подходящие поли-А-последовательности уже описаны. Конструкция может, кроме того, содержать энхансерную последовательность с 3'-конца от кодирующей последовательности. Подходящие энхансерные последовательности описаны выше в связи с конструкцией химерного промотора. В другом аспекте изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей или в некоторых вариантах осуществления состоящей существенным образом из:(iii) энхансерной последовательности с 3'-конца от кодирующей последовательности (ii) и функционально связанной с ней; где энхансерная последовательность (iii) происходит из 3'-UTR последовательности HBsAg или 3'-UTR последовательности предраннего гена CMV обезьян и кодирующая последовательность (ii) гетерологична энхансерной последовательности. Конструкция может содержать нетранслируемую лидерную последовательность, такую как одну из уже описанных в связи с конструкцией химерного промотора. Как правило, последовательность промотора (i) происходит из вирусной или эукариотической последовательности промотора. Последовательность промотора может являться природной последовательностью промотора, функциональным гомологом природной последовательности или функциональным фрагментом того и другого. Подходящие природные промоторы включают, например, предранний промотор hCMV, промотор вируса ложного бешенства (PRV) или промотор вируса саркомы Рауса (RSV). Предпочтительно природный промотор содержит SEQ ID NO:52 или SEQ ID NO:53. Можно применять искусственную промоторную конструкцию, такую как химерный промотор, описанный выше, при условии, что промотор функционален. Функциональная последовательность промотора, как правило, способна вызывать (включая инициацию и регуляцию) транскрипцию функционально связанной кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине.- 29011557 Последовательность промотора можно тестировать на промоторную активность с использованием общепринятого анализа экспрессии. Функциональные гомологи или фрагменты природной последовательности промотора, как правило, дают по меньшей мере 50%, например, или по меньшей мере 60, 70,80 или 90% экспрессии, которую дает природная последовательность в таком анализе. Подходящие кодирующие последовательности (ii) включают уже упомянутые в связи с конструкцией химерного промотора. Однако в настоящем аспекте кодирующая последовательность гетерологична 3'-энхансерной последовательности. Энхансерная последовательность (iii) конструкции описана выше. Настоящая конструкция также, как правило, содержит поли-А-последовательность. Как в случае конструкции химерного промотора, эта поли-А-область может являться природной по отношению к кодирующей последовательности (ii) или ее можно представить в виде гетерологичного поли-Акомпонента конструкции. Конструкция согласно любому из аспектов настоящего изобретения может содержать последовательность сигнального пептида. Таким образом, конструкция нуклеиновой кислоты может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, который функционально связан с кодирующей последовательностью. Последовательность сигнального пептида вставлена в функциональной связи с промотором так, что сигнальный пептид экспрессируется и облегчает секрецию полипептида,кодируемого кодирующей последовательностью, также функционально связанной с промотором. Как правило, последовательность сигнального пептида кодирует пептид от 10 до 30 аминокислот,например, от 15 до 20 аминокислот. Часто аминокислоты преимущественно гидрофобные. В обычной ситуации сигнальный пептид направляет растущую полипептидную цепь, несущую сигнальный пептид,в эндоплазматический ретикулум экспрессирующей клетки. Сигнальный пептид отщепляется в эндоплазматическом ретикулуме, позволяя секретировать полипептид аппаратом Гольджи. Сигнальный пептид для применения по изобретению может содержать:(i) природную последовательность сигнального пептида;(ii) гомологичный вариант (i), который сохраняет активность сигнального пептида; или(iii) фрагмент (i) или (ii), который сохраняет активность сигнального пептида. Последовательность (i) может являться, например, сигнальным пептидом активатора плазминогена ткани человека (hTPAsp) (GenBank L00141), сигнальным пептидом апротинина (GenBank AAD13685),сигнальным пептидом экстенсина табака (GenBank JU0465) или сигнальным пептидом лизоцима курицы(GenBank AF410481). Сигнальный пептид, подходящий для применения по настоящему изобретению, дает возможность секретировать гетерологичные белки. Функциональный сигнальный пептид можно идентифицировать в анализе, в котором сравнивают эффект тестируемого сигнального пептида с эффектом известного сигнального пептида, например сигнального пептида активатора плазминогена ткани человека (hTPAsP), и с эффектом отсутствия сигнального пептида. Сравнительный анализ экспрессии, представленный ниже,можно применять, но со следующей модификацией. Экспрессирующие векторы для секреции сконструированы содержащими базовый вектор или с тестируемым сигнальным пептидом, или с hTPAsp, или без сигнального пептида. Кодирующие последовательности для полипептидов, лишенные своих существующих в природе сигнальных пептидов, вставляют в векторы, и векторами трансформируют контрольные клетки-хозяева. Предпочтительно клетки являются клетками млекопитающих HEK 293 Т, СНО,HeLa, BHK, 3T3 или COS. Клеточные среды анализируют на уровни экспрессии полипептида. Функциональный сигнальный пептид дает возможность секретировать полипептид на более высоком уровне по сравнению с вектором без сигнального пептида по меньшей мере с одним, предпочтительно с двумя полипептидами. Как правило, уровень секреции на 5% выше, или более предпочтительно на 10% выше, или более, например, на 20 или 50% выше, или более. Как правило, уровни секреции сравнимы с уровнями,полученными с использованием hTPAsp. В некоторых случаях можно наблюдать любые повышения или понижения, рассматриваемые здесь. В предпочтительном варианте сигнальный пептид выбран из сигнального пептида активатора плазминогена ткани человека (hTPAsp), сигнального пептида апротинина, сигнального пептида экстенсина табака и сигнального пептида лизоцима курицы. Обладание возможностью секретировать кодируемый белок вовне экспрессирующей клетки может давать ряд преимуществ, в частности там, где белок является антигеном. Например, повышенная секреция антигена может обеспечить более значительное поглощение антигена и реакцию иммунных клеток(макрофагов, клеток Лангерганса, В-клеток, Т-клеток и т.п.), облегчить способность антигена достичь кровотока и дать сигнал клеткам (цитокины), дать возможность антигену обнаружить клеточные лиганды, воздействовать на функцию (антитела, токсины, такие как холерный токсин, LT E.coli) и участвовать в нормальных клеточных биохимических процессах (клеточные рецепторы). Конструкция по изобретению может находиться в форме плазмиды. Конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению может находиться в форме плазмидного экспрессирующего вектора. В предпочтительном варианте конструкция по изобретению может являться конструкцией ДНК. В альтернативных случаях конструкция может являться конструкцией РНК или ПНК.
МПК / Метки
МПК: A61K 39/39, C12N 15/38, A61K 9/16, A61K 39/245, C12N 15/44, C12N 15/85, A61K 39/145, C12N 15/31, C12N 15/36
Метки: конструкции, кислот, нуклеиновых
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-11557-konstrukcii-nukleinovyh-kislot.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Конструкции нуклеиновых кислот</a>
Конструкции нуклеиновых кислот
Номер патента: 10056
Опубликовано: 30.06.2008
Автор: Фуллер Джеймс
МПК: A61K 9/14, A61J 1/22, A61K 31/7088...
Метки: кислот, нуклеиновых, конструкции
Формула / Реферат:
1. Конструкция нуклеиновой кислоты, включающая в себя: (i) последовательность химерного промотора, которая содержит: (a) последовательность предраннего промотора hCMV, (b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена hCMV и (c) гетерологичный интрон, расположенный на месте участка интрона A в основном предраннем гене hCMV; (ii) кодирующую последовательность в функциональной связи с химерным промотором; (iii)...
Конструкции нуклеиновых кислот для экспрессии генов
Номер патента: 8247
Опубликовано: 27.04.2007
Автор: Браун Ральф Патрик
МПК: C12N 15/86, C12N 15/869
Метки: экспрессии, кислот, нуклеиновых, конструкции, генов
Формула / Реферат:
1. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеиновую кислоту вирусного генома, которая представляет собой нуклеиновую кислоту генома вируса герпеса или последовательность, по меньшей мере на 80% ей гомологичную, где указанная нуклеиновая кислота вирусного генома содержит по меньшей мере два эндогенных регуляторных элемента экспрессии гена, каждый из которых содержит эндогенный промотор, способный экспрессироваться в клетках млекопитающего,...
Абсолютное количественное определение нуклеиновых кислот от-пцр
Номер патента: 8742
Опубликовано: 31.08.2007
Автор: Аллер Норманд Е.
МПК: C12Q 1/68, C12P 19/34
Метки: определение, количественное, нуклеиновых, кислот, от-пцр, абсолютное
Формула / Реферат:
1. Способ получения калибровочных данных для абсолютного количественного определения РНК с помощью ОТ-ПЦР, где способ предусматривает: a) получение синтетического олигонуклеотида, содержащего ампликон и промоторную последовательность, расположенную в 3'-направлении по отношению к ампликону; b) синтез комплементарной РНК (кРНК) с помощью транскрипции олигонуклеотида in vitro; c) количественное определение кРНК; и d) получение калибровочных данных...
Способы амплификации нуклеиновых кислот
Номер патента: 6066
Опубликовано: 25.08.2005
Авторы: Сагава Хироаки, Еноки Тацудзи, Като Икуносин
МПК: C12Q 1/68, G01N 33/53, C12N 15/09...
Метки: нуклеиновых, способы, кислот, амплификации
Формула / Реферат:
1. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий (a) получение реакционной смеси путем смешивания нуклеиновой кислоты как матрицы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, ДНК-полимеразы с активностью вытеснения цепи по меньшей мере одного химерного олигонуклеотидного праймера по меньшей мере одного верхнего (upstream) блокирующего олигонуклеотида и РНКазы H, где химерный олигонуклеотидный праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный...
Способ амплификации нуклеиновых кислот
Номер патента: 5739
Опубликовано: 30.06.2005
Авторы: Сагава Хироаки, Асада Киезо, Ямамото Дзунко, Томоно Дзун, Мукаи Хироюки, Като Икуносин, Еноки Тацудзи, Кобаяси Еидзи, Уемори Такаси
МПК: C12N 15/09, C12Q 1/68
Метки: амплификации, нуклеиновых, кислот, способ
Формула / Реферат:
1. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий (a) получение реакционной смеси посредством смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы H, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и...
Предыдущий патент: Способ разложения циклогексилгидропероксида
Следующий патент: Промежуточное соединение и способ получения обогащенных β-аномером 21-дезокси-21, 21-дифтор-d-рибофуранозилнуклеозидов
Случайный патент: Ступень движущейся дорожки или подобного устройства