Способы и нуклеиновые кислоты для анализов клеточных пролиферативных нарушений

013634 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к последовательностям геномной ДНК, которые проявляют измененные типы экспрессии относительно нормы при болезненных состояниях. Конкретные варианты осуществления представляют, среди прочего, новые способы, нуклеиновые кислоты, ряды нуклеиновых кислот и наборы, используемые для детекции или для детекции и определения различий между клеточными пролиферативными нарушениями. Предпочтительно, когда способы, нуклеиновые кислоты, чипы нуклеиновых кислот и наборы для детекции и диагностики клеточных пролиферативных нарушений используют для диагностики рака, и в частности колоректального рака и/или рака печени. Перекрестная ссылка на родственные заявки Заявка на данное изобретение утверждает преимущество приоритета предварительных патентных заявок США 60/672242, поданной 15 апреля 2005 г., 60/676997, поданной 02 мая 2005 г., 60/697521, поданной 08 июля 2005 г., 60/704860, поданной 01 августа 2005 г., 60/709318, поданной 17 августа 2005 г.,60/723602, поданной 04 октября 2005 г., и 60/787402, поданной 30 марта 2006 г, которые включены в виде ссылки в данном контексте во всей своей полноте. Перечень последовательностей Перечень последовательностей в соответствии с 37 C.F.R. (Сводом федеральных правил)1.52(е),(5) представлен на компакт-диске (1 из 1) в виде текстового файла 1,82 MB под названием "47675-187 Последовательность Listing.txt" и включен в виде ссылки в данном контексте во всей своей полноте. Уровень техники Частота заболевания и диагностика рака. Рак является второй ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах Америки. Уровень смертности можно было значительно улучшить, если бы современные методы скрининга были усовершенствованы в плане удобства для пациента, чувствительности и простоты скрининга. Современные рекомендованные методы диагностики рака часто являются дорогостоящими и не подходят для применения в качестве тестов для широкого скрининга населения. Гепатоцеллюлярный рак (НСС) является четвертой из наиболее распространенных форм рака в мире, его частота варьирует от 2,1/100000 в Северной Америке до 80/100000 в Китае. В Соединенных Штатах Америки по приблизительной оценке в 2005 г. будет диагностировано 17550 новых случаев и 15420 смертей от данного заболевания. Ультразвуковое исследование печени, уровни -фетопротеина и принятое СТ-сканирование (компьютерная томография), постоянно получаемые при диагностической оценке НСС (гепатоцеллюлярного рака или первичного рака печени), часто слишком нечувствительны в плане детекции многоочаговых мелких поражений и для планирования лечения. В Соединенных Штатах Америки ежегодная заболеваемость колоректальным раком составляет приблизительно 150000 человек, при том, что 56600 больных умирают от колоректального рака каждый год. Риск колоректального рака в течение жизни среди населения в целом составляет приблизительно 5-6%. Несмотря на напряженные усилия в последние годы в скрининге и ранней детекции рака толстой кишки, до настоящего времени большинство случаев диагностируют в запущенной стадии с регионарными или отдаленными метастазами. Хотя терапевтические возможности включают хирургию и вспомогательную или паллиативную химиотерапию, большинство пациентов умирает от развития у них рака в течение нескольких месяцев. Выявление молекулярных изменений, которые лежат в основе рака толстой кишки, могут помочь в разработке новых возможностей мониторинга, скрининга, диагностики и терапии, которые могли бы улучшить общий неблагоприятный прогноз для данных пациентов. В современном руководстве по колоректальному скринингу согласно Американскому противораковому обществу используют один из пяти различных вариантов скрининга среди пациентов со средним уровнем риска в возрасте 50 лет и старше. Данные варианты включают 1) ежегодный тест на скрытую кровь в кале (FOBT); 2) гибкую сигмоидоскопию каждые пять лет; 3) ежегодное проведение FOBT и сигмоидоскопии каждые пять лет; 4) контрастную клизму с двумя контрастными агентами (DCBE) каждые пять лет или 5) колоноскопию каждые десять лет. Несмотря на то что данные методы тестирования широко приняты медицинским сообществом, осуществление широкого скрининга колоректального рака не реализовано. Удобство для пациентов является основным фактором, связанным с ограниченным применением в связи с дискомфортом или неудобством, связанными с методами. Тестирование FOBT, несмотря на неинвазивность метода, требует пищевых и других ограничений за 3-5 дней до тестирования. Уровни чувствительности для данного теста являются очень низкими для колоректальной аденокарциномы с широкой вариабельностью в зависимости от испытания. Измерения чувствительности для выявления аденом являются даже более низкими, поскольку большинство аденом не кровоточит. Напротив,чувствительность более инвазивных методов, таких как сигмоидоскопия и колоноскопия, является весьма высокой вследствие прямой визуализации просвета толстой кишки. Эффективность данных методик не оценена ни в каких рандомизированных исследованиях, однако при использовании данных, полученных в исследованиях методом случай-контроль, и данных Национального исследования полипов (США) показано, что удаление аденоматозных полипов приводит в результате в 76-90% к снижению заболеваемости КРК. Сигмоидоскопия имеет ограничение в том, что осуществляют визуализацию только левой стороны толстой кишки, оставляя повреждения в правой стороне толстой кишки невыявленными. Оба-1 013634 метода с использованием оптических устройств являются дорогостоящими, требуют применения слабительного препарата и имеют повышенный риск заболеваемости и смертности. Усовершенствованные тесты с повышенной чувствительностью, специфичностью, простотой применения и уменьшенными затратами явно необходимы, прежде чем общий широкий скрининг колоректального рака станет рутинным. Ранняя детекция колоректального рака в основном основана на тесте на скрытую кровь в кале(FOBT), проводимом ежегодно у пациентов без симптомов. Современные рекомендации, принятые рядом организаций здравоохранения, включая Американское противораковое общество, предусматривают тестирование скрытой крови в кале начиная с возраста 50 лет, ежегодное повторение то тех пор, пока пациент более не будет получать положительный эффект от скрининга. Положительный результат FOBT ведет к колоноскопическому исследованию кишки, дорогостоящему и инвазивному методу с уровнем серьезных осложнений одно на 5000 исследований. Только у 12% пациентов с гемположительным калом диагностируют рак или крупные полипы во время колоноскопии. Ряд исследований показывает, что скрининг FOBT не улучшает показатель смертности, связанной с раком, или общего выживания. Соответствие в тестировании скрытой крови было очень низким, менее чем 20% населения предложено или осуществлено FOBT, как рекомендовано. Если FOBT сделано соответствующим образом, пациент собирает образец кала из трех последовательных движений кишки. Образцы получают, когда пациент придерживается рекомендаций о диете и избегает лекарственных препаратов, которые, как известно, вызывают скрытое желудочно-кишечное кровотечение. В действительности врачи часто не инструктируют пациентов соответствующим образом, пациенты часто не следуют протоколу, и некоторые пациенты находят задачу сбора образцов кала трудной или неприятной, следовательно, удобство ежегодного тестирования скрытой крови находится на низком уровне. Если можно было бы повысить чувствительность и специфичность тестирования относительно современных методов, частоту тестирования можно было бы уменьшить, модификация схемы приема пищи и лекарственных препаратов была бы исключена и уровень удобства для пациента был бы повышен. Проблемы удобства, чувствительность и специфичность FOBT для детекции рака толстой кишки плохо сочетаются. Низкая специфичность теста приводит к необязательной колоноскопии, добавляя существенные затраты к скринингу рака толстой кишки. Рассчитано, что специфичность FOBT в лучшем случае составляет 96% при чувствительности 43% (аденомы) и 50% (колоректальная карцинома). Чувствительность можно повысить, используя иммуноанализ FOBT, такой как производят под торговым названием "InSure" с повышенной чувствительностью 77% (аденома) и 88,9% (колоректальная карцинома). Молекулярные маркеры заболевания. Молекулярные маркеры заболевания представляют ряд преимуществ относительно других типов маркеров, одно из преимуществ состоит в том, что даже образцы очень маленьких размеров и/или образцы, архитектура ткани которых не сохранилась, можно проанализировать достаточно эффективно. В последнее десятилетие показано, что ряд генов дифференцированно экспрессируется в норме и в карциномах толстой кишки. Однако, как показано, ни одиночный маркер, ни их комбинация недостаточны для диагностики карцином толстой кишки. Недавно показано, что подходы на основе большемерной мРНК способны представить улучшенные средства для дифференцировки различных типов опухолей, а также доброкачественных и злокачественных повреждений. Однако их применение в качестве рутинного диагностического инструмента затруднено чрезвычайной нестабильностью мРНК, быстро происходящими изменениями экспрессии после некоторых запускающих событий (например, сбора образца), и, что наиболее важно, для анализа необходимо большое количество мРНК (см. статьи Lipshutz, R.J. et al., NatureGenetics, 21: 20-24, 1999; Bowtell, D.D.L. Nature genetics suppl. 21: 25-32, 1999), которое часто нельзя получить из рутинного биоптата. Предполагают применение биологических маркеров для дальнейшего улучшения чувствительности и специфичности FOBT, примеры данных тестов включают анализ кала PreGen-Plus, доступный в фирме EXACT Sciences, который обладает чувствительностью 20% (аденома) и 52% (колоректальная карцинома) и специфичностью 95% в обоих случаях. Данный тест служит для анализа на присутствие 23 мутаций ДНК, ассоциированных с развитием новообразований толстой кишки. Известно использование метилирования ДНК как маркеров рака толстой кишки. Например, в статье Sabbioni et al. (MolecularDiagnosis, 7: 201-207, 2003) обнаружено гиперметилирование панели генов, состоящих из TPEF, HICl,DAPK и MGMT, в периферической крови у 98% пациентов с карциномой толстой кишки. Однако это представляет подходящую основу теста для коммерческой продажи, поскольку специфичность данного теста также должна быть достаточно высокой. Современная модель колоректального патогенеза поддерживает поэтапное развитие аденом, которое включает развитие дисплазии и в конце - признаков инвазивного рака. Молекулярные изменения,лежащие в основе данной последовательности аденома-карцинома, включают генетические и эпигенетические изменения генов-супрессоров опухоли (АРС, р 53, DCC), активацию онкогенов (K-ras) и инактивацию генов репарации ошибочного спаривания ДНК. Недавно показаны дальнейшие молекулярные изменение и генетические дефекты. Таким образом, активация пути передачи сигнала Wnt включает не-2 013634 только мутации гена АРС, но может также являться результатом мутаций -катенина. Кроме того, изменения в пути передачи сигнала TGF- (фактора роста опухоли) вместе с его сигнальными трансдукторами SMAD4 и SMAD2 связаны с развитием рака толстой кишки. Несмотря на прогресс в наши дни в понимании патогенеза аденом и карцином толстой кишки и их генетических и молекулярных изменений, генетические и эпигенетические изменения, лежащие в основе развития метастазов, менее понятны. Однако в целом вполне допускают, что развитие инвазии и протеолиза экстрацеллюлярного матрикса, а также инфильтрация базальной мембраны сосудов включают белки адгезии, такие как члены семейства рецепторов интегринов, кадгеринов, суперсемейства иммуноглобулинов, белок связывания ламинина и рецептор CD44. Кроме адгезии, развитие образования метастазов также включает индукцию и регуляцию ангиогенеза (VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия), bFGF(фактор роста фибробластов b), индукцию пролиферации клеток (EGF (эпидермальный фактор роста),HGF (фактор роста гепатоцитов), IGF (инсулиноподобный фактор роста и активацию протеолитических ферментов (MMPs, TIMPs, uPAR), а также ингибирование апоптоза (Bcl-2, Bcl-X). Позднее проведено сравнение генетических и молекулярных изменений других групп в метастатических повреждениях с изменениями, обнаруженными при первичном колоректальном раке. Так, в работе Kleeff et al. показана утрата DOC-2, потенциального гена-супрессора опухоли, как в первичном, так и в метастазирующем колоректальном раке. Кроме того, в работе Zauber et al. показано, что в их серии из 42 образцов колоректального рака мутации Ki-ras в первичных формах рака идентичны во всех из 42 парных первичных и синхронных метастатических повреждений. Аналогично, потеря гетерозиготности в локусе АРС идентична для 39 парных карцином и синхронных метастаз. Авторы заключают, что для генов Ki-ras и АРС генетические изменения в метастазах идентичны первичному колоректальному раку. Однако в других группах обнаружены генетические и молекулярные изменения в метастатических раках толстой кишки,которые не присутствуют в первичных формах рака. Так, показано развитие LOH хромосомы 3 р в колоректальных метастазах. Кроме того, при использовании сравнительной геномной гибридизации обнаружен ряд изменений в метастазах в печени, которые являются уникальными для метастатических повреждений (-9q, -11q, и -17q). Метилирование островка CpG. Отдельно от мутаций показано, что аберрантное метилирование островков CpG приводит к транскрипционному молчанию некоторых генов, которые ранее связывали с патогенезом различных форм рака. Островки CpG представляют собой короткие последовательности, которые богаты динуклеотидамиCpG и обычно могут быть обнаружены на 5'-участке приблизительно 50% всех генов человека. Метилирование цитозинов в данных островках приводит к утрате экспрессии гена, и, как показано, к инактивации Х-хромосомы, и геномному импринтингу. Недавно в ряде групп анализировали также метилирование ряда генов в колоректальном раке и показали транскрипционный сплайсинг вследствие метилирования промоторов для p16INK4, p14ARF,p15INK4b, MGMT, hMLH1, GSTP1, DAPK, CDH1, TIMP-3 и АРС среди прочих. Таким образом, кроме мутационной инактивации ряда генов, гиперметилирование данных генов также вносит существенный вклад в патогенез данного заболевания. В последние годы несколько генов, которые метилированы при раке толстой кишки, идентифицировано с помощью MS-APPCR. Данная группа генов, среди прочих, включает TPEF/HPP1, который часто метилируется при раке толстой кишки и который был независимо идентифицирован двумя различными группами с использованием метода MS-APPCR (см., например, статью Young J., Biden K.G., Simms L.A.,HuggarD.P., Karamatic R., Eyre H.J., Sutherland G.R., Herath N., Barker M., Anderson G.J., Fitzpatrick D.R.,Ramm G.A., Jass J.R., Leggett В.А. НРР 1: A transmembrane protein-encoding gene commonly methylated incolorectal polyps and cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 265-270, 2001). Многофакторный подход. Диагностика рака традиционно основана на детекции отдельных молекулярных маркеров (например, мутации генов, повышенные уровни PSA (простата-специфического антигена. К сожалению, рак представляет собой болезненное состояние, при котором отдельные маркеры, как правило, не могут выявить или дифференцировать многие формы заболевания. Таким образом, анализы, которые распознают только один маркер, как показано, имеют ограниченное предсказательное значение. Фундаментальным аспектом данного изобретения является метилирование основных диагностикумов рака, а также то, что скрининг, диагностика и терапевтический мониторинг этого заболевания обладают значительным преимуществом по сравнению с используемым в уровне техники анализом, предусматривающим применение одного маркера по сравнению с применением отобранных множественных маркеров. Многофакторный аналитический подход наиболее приемлем для раковых диагностических агентов, поскольку рак не является простой болезнью, данный подход с использованием многофакторной "панели" согласуется с гетерологичной природой рака как цитологически, так и клинически.-3 013634 Ключом к успешному осуществлению подхода с использованием панели к диагностическим тестам на основе метилирования является создание и разработка оптимизированных панелей маркеров, которые могут охарактеризовать и дифференцировать болезненные состояния. Настоящее изобретение описывает множество особенно эффективных и уникальных панелей генов, причем анализ метилирования одного или комбинации членов панели дает возможность детекции пролиферативных нарушений клеток толстой кишки с особенно высокой чувствительностью, специфичностью и/или предсказательным значением. Разработка медицинских тестов. Двумя ключевыми оценочными измерениями любого медицинского скрининга или диагностического теста являются их чувствительность и специфичность, которые определяют, насколько хорошо тест подходит для точного выявления всех пораженных пациентов без исключения и без ложного включения пациентов, у которых отсутствует целевое заболевание (предсказательное значение). Исторически ко многим диагностическим тестам относились отрицательно вследствие низкой чувствительности и специфичности. Истинно положительный (ТР) результат получают, когда тест является положительным и присутствует состояние. Ложный положительный (FP) результат получают, когда тест является положительным,но состояние отсутствует. Истинно отрицательный (TN) результат получают, когда тест является отрицательным, но состояние отсутствует. Ложный отрицательный (FN) результат получают, когда тест является отрицательным, но состояние присутствует. В данном контексте чувствительность = TP/(TP+FN); специфичность = TN/(FP+TN) и предсказательное значение = TP/(TP+FP). Чувствительность является мерой способности теста правильно выявлять целевое заболевание в тестируемого пациента. Тест с низкой чувствительностью дает высокий уровень ложных отрицательных результатов, т.е. пациентов, у которых есть заболевание, но ложно идентифицированных как не имеющие данного конкретного заболевания. Потенциальная опасность ложных отрицательных результатов состоит в том, что пациент, имеющий заболевание, будет оставаться недиагностированным и нелеченым в течение определенного периода, во время которого заболевание может прогрессировать до более поздней стадии, когда лекарственные препараты (при их наличии) могут быть менее эффективными. Примером теста, который имеет низкую чувствительность, является анализ крови на ВИЧ на основе белка. Данный тип теста проявляет низкую чувствительность, поскольку он не может выявить присутствие вируса до тех пор, пока заболевание хорошо не разовьется и вирус не проникнет в кровоток в значительном количестве. Напротив, примером теста, который имеет высокую чувствительность, является детекция вирусной нагрузки с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Высокая чувствительность достигается, потому что данный тип теста может выявлять очень маленькие количества вируса. Высокая чувствительность является особенно важной при значительных последствиях упущенного диагноза. Специфичность, с другой стороны, является мерой способности теста точно выявлять пациентов, у которых отсутствует болезненное состояние. Тест, имеющий низкую специфичность, дает высокий уровень ложных положительных результатов, т.е. пациентов, которые ложно выявлены как имеющие заболевание. Недостаток ложных положительных результатов состоит в том, что они заставляют пациентов проходить ненужные медицинские процедуры, лечение с сопровождающим его риском, эмоциональный стресс и финансовую нагрузку, которые при этом могут оказывать неблагоприятные воздействия на состояние здоровья пациента. Признаком заболеваний, который затрудняет разработку диагностических тестов с высокой специфичностью, является то, что механизмы развития заболевания, особенно при раке, часто включают множество генов и белков. Кроме того, некоторые белки могут иметь повышенный уровень по причинам, не связанным с болезненным состоянием; примером теста, который имеет высокую специфичность, является тест на основе генов, который может выявлять мутацию р 53. Специфичность важна, когда стоимость или риск, связанный с дальнейшими диагностическими процедурами или дальнейшим медицинским вмешательством, является очень высоким. Явно выраженная потребность в области техники. В целом считают, что в области техники имеется явно выраженная потребность в усовершенствованном скрининге и раннем выявлении рака. Например, если бы можно было повысить специфичность скрининга рака толстой кишки, снижалась бы проблема ложных положительных результатов теста, ведущих к ненужному колоноскопическому исследованию, приводя к снижению затрат и повышенной безопасности. В свете заболеваемости раком в целом и, более детально, неудобствами, связанными с современными методами скрининга колоректальных и гепатоцеллюлярных нарушений клеточной пролиферации,в области техники существует значительная потребность в усовершенствованных способах ранней диагностики рака, в частности рака толстой кишки, для применения в дополнение или как замену имеющихся в настоящее время тестов.-4 013634 Среда генов, представленных в настоящем изобретении. Человеческий ген септина 9 (известного также как септиноподобный слитый белок MLL, септиноподобный слитый белок MLL MSF-A, Slpa, эсептин, Msf, септиноподобный белок яичников/септин молочной железы (септин Ov/Br) и септин D1) находится на хромосоме 17q25 рядом с АС 068594.15.1.168501 и является членом семейства генов септина. На фиг. 1 представлено описание группы гена септина 9 и показано 4 варианта транскриптов, варианты септина 9 и варианты Q9HC74 (которые представляют собой укороченные варианты транскриптов септина 9). SEQ ID NO:1 представляет последовательность указанного гена, включающую участки транскриптов как септина 9, так и Q9HC74 и промоторные участки. SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 представляют собой их субучастки, которые представляют последовательность богатых CpG промоторных участков транскриптов септина 9 и Q9HC74 соответственно. Допускают, что члены семейства генов септина ассоциированы с множеством клеточных функций в диапазоне от транспорта носителей до цитокинеза. Нарушение действия септина 9 приводит в результате к неполному делению клеток, см. статью Surka, M.С, Tsang, C.W. and Trimble, W.S. Mol. Biol. Cell, 13: 3532-45 (2002). Септин 9 и другие белки, как показано, являются партнерами слияния протоонкогенаMLL, позволяя предположить их роль в онкогенезе, см. статью Osaka, M., Rowley, J.D. и Zeleznik-Le, N.J.PNAS, 96: 6428-6433 (1999). В статье Burrows et al. описано глубокое исследование экспрессии множества изоформ гена септина 9 при раке яичников и показана тканеспецифическая экспрессия различных транскриптов, см. статью Burrows, J.F., Chanduloy, et al. S.E.H. Journal of Pathology, 201: 581-588 (2003). Недавнее исследование (предшествующий уровень техники, опубликованный после даты приоритета) более чем 7000 нормальных и опухолевых тканей показывает, что существует согласующаяся сверхэкспрессия изоформ септина 9 в ряде опухолевых тканей, см. статью Scott, M., Hyland, P.L., et al.Oncogene, 24: 4688-4700 (2005). Авторы предполагают, что ген, по-видимому, представляет собой раковый ген типа II, в котором изменения в процессинге транскрипта РНК контролируют регуляцию различных белковых продуктов и уровни данных изоформ измененного белка могут дать ответы относительно роли гена в злокачественном заболевании. Белок MSF (фактора стимуляции миграции), транскрибируемый с гена FN1, также участвует в канцерогенезе (см. WO 99/31233), однако следует заметить, что данный белок не является объектом настоящего изобретения и в настоящее время не известно, ассоциирован ли он с геном септина 9/MSF и транскрибируемыми с них продуктами. Из вышеприведенных ссылок видно, что биологические механизмы, связывающие данный ген с онкогенезом, остаются неясными. В WO 200407441 заявлено, что увеличенное число копий и сверхэксрессия гена являются маркером рака и, кроме того, представляют собой средство его диагностики и лечения согласно данному наблюдению. WO 200407441 соответственно представляет собой наиболее близкий уровень техники, поскольку имеет наибольшее число признаков, общих со способом и нуклеиновыми кислотами, представленными в настоящем изобретении, поскольку они относятся к той же самой области (диагностика рака). Основное отличие настоящего изобретения от представленного в WO 200407441 состоит в том, что настоящее изобретение впервые показывает, что пониженная экспрессия гена септина 9 ассоциирована с раком. Более подробно это иллюстрируют посредством анализа метилирования. Корреляция между экспрессией и метилированием ДНК и методы определения метилирования ДНК известны в области техники (см. WO 99/28498). Тем не менее для компетентного специалиста в области техники не было бы очевидным, что пониженная экспрессия будет также ассоциирована с развитием рака, в частности, поскольку WO 200407441 описывает модуляцию указанной экспрессии до более низких уровней как потенциальное средство для терапии рака.SEQ ID NO:28 представляет богатую CpG последовательность, находящуюся на хромосоме 17q в перекрывающихся промоторных участках витронектина (VTN, OMIM 193190, регистр, номерNM000638) и генах SARM (белок, включающий мотивы Steril Alpha And Heat/Armadillo, OMIM 607732). Ген VTN кодирует гликопротеин 75 кД (называемый также сывороточный фактор распространения или S-белок комплемента), который способствует присоединению и распространению клеток животныхin vitro, ингибирует цитолиз посредством комплекса комплемента С 5b-9 и модулирует действие антитромбина III-тромбина при свертывании крови. Повышенный уровень экспрессии витронектина наблюдают в клетках рака толстой кишки (см. Exp. Cell Res. 1994 Sep.; 214 (1): 303-12.). Кроме того, экспрессия данного гена связана с развитием и инвазивностью раковых клеток. Полагают, что VTN активируется в опухолях и, блокируя витронектиновый рецептор посредством специфического пептида, уменьшает размер опухоли (см. статьи Bloemendal H.J., de Boer Н.С., Koop E.A., van Dongen A.J., Goldschmeding R.,Landman W.J., Logtenberg T., Gebbink M.F., Voest Е.Е Cancer Immunol Immunother. 2004 Sep.; 53 (9): 799808.; Haier J., Goldmann U., Hotz B.l. Runkel N., Keilholz U. Clin Exp Metastasis. 2002; 19 (8): 665-72). Белок SARM состоит из 690 аминокислот и включает стерильный -домен (SAM) из 65 аминокислот, окруженный короткими повторяющимися последовательностями HEAT/armadillo. Анализ нозерн-блот показал, что антисмысловая РНК SARM определяется на повышенных уровнях в линиях раковых клеток независимо от природы или метастатического потенциала ткани (см. статью Mink, M.;Fogelgren, В.; Olszewski, K.; Maroy, P.; Csiszar, K. Genetics, 74: 234-244, 2001). Указанное исследование,-5 013634 кроме того, продемонстрировало, что кодирующий белок транскрипт SARM экспрессирует только одна из исследованных клеточных линий карциномы простаты.SEQ ID NO:24 представляет богатую CpG последовательность, находящуюся на хромосоме 3q23 ниже по ходу транскрипции гена раздвоенного фактора транскрипции генов L2 (FOXL2, гипофизарный раздвоенный фактор, OMIM 605597). SEQ ID NO:1 ранее не была ассоциирована с раком какого-либо типа. Участок, кодирующий FOXL2, является высококонсервативным среди млекопитающих, иммуногистохимические данные показывают, что FOXL2 представляет собой ядерный белок, специфически экспрессирующийся в веках и фолликулярных клетках яичников эмбриона и взрослой особи. Предполагают,что FOXL2 может играть роль в дифференцировке соматических клеток яичников и в дальнейшем развитии и/или поддержании фолликул (см. J. Med. Genet. 39: 916-922, 2002). Более того, мутации в гене FOXL2 ассоциированы с синдромом блефарофимоза/птоза/инверсии эпикантуса (BPES), синдромом, который поражает веки и яички (см. Am. J. Hum. Genet. 72: 478-487,2003.; Hum. Mutat. 24: 189-193, 2004). Ген FOXL2 ранее не был ассоциирован с раком, однако другие члены семейства FOX участвуют в онкогенезе. Ген FOXA1 амплифицируется и сверхэкспрессируется в опухоли пищевода и легкого, ген FOXM1 положительно регулируется в опухоли поджелудочной железы и карциноме базальных клеток вследствие транскрипционной регуляции с помощью пути SonicSEQ ID NO:27 представляет часть гена Six6 (белок гомеобокса SIX6), находящегося на хромосоме 14q, синонимы включают белок гомеодомена ОРТХ 2, глазной гомеобокс 2, ОРТХ 2, гомолог гомеобокса глазного синуса 6, гомолог гомеобокса глазного синуса 6 (Drosophila), Six9, SIX9. Ген Six6 связан с путями развития, и его аберрантная экспрессия связана с онкогенезом Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза.SEQ ID NO:25 находится на хромосоме 17q21.31 и включает промоторный участок гена NGFR, а также части самого гена NGFR (рецептора фактора роста нервов, известного как р 75, OMIM 162010).NGFR связывается один или в комбинации с другими рецепторами с нейротрофинами и факторами, ингибирующими отрастание невритов. Показано, что NGFR играет роль в апоптозе, в миелинизации периферических нервов и в ингибировании регенерации центральной нервной системы после повреждения аксона (см. статьи Dobrowsky, R.Т.; Werner, М.Н.; Castellino, А.М.; Chao, М.V.; Hannun, Y.A. Science 265: 1596-1599, 1994; Cosgaya, J.М.; Chan, J.R.; Shooter, E.M. Science 298: 1245-1248, 2002; Wang, K.С;Kim, J.A.; Sivasankaran, R.; Segal, R.; He, Z. Nature 420: 74-78, 2002). Метилирование гена NGFR ранее было ассоциировано с развитием рака толстой кишки (PCT/US04/020336).SEQ ID NO:26 находится на хромосоме 17q21.31 и включает участок промотора гена TMEFF2. Метилирование TMEFF2 связано с раком толстой кишки, см. Cancer Res. 1 sept. 2000.; 60 (17): 4907-12. Раскрытие изобретения Настоящее изобретение представляет способ выявления и/или классификации клеточных пролиферативных нарушений у пациента, заключающийся в определении уровней экспрессии по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT иSEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165, в биологическом образце, выделенном у указанного пациента, причем пониженная экспрессия и/или метилирование CpG являются показателем присутствия или класса указанного нарушения. Различные аспекты настоящего изобретения представляют эффективный и уникальный генетический маркер, причем анализ экспрессии данного маркера дает возможность выявления клеточных пролиферативных нарушений с особенно высокой чувствительностью, специфичностью и/или предсказательным значением. Более того, указанный маркер обеспечивает дифференцировку неопластических клеточных пролиферативных нарушений (включая предраковые состояния) от доброкачественных клеточных пролиферативных нарушений. Маркер, представленный в настоящем изобретении, особенно подходит для выявления колоректальных и гепатоцеллюлярных карцином. В контексте колоректальной карциномы предложенные в изобретении способы тестирования имеют конкретное применение для скрининга популяций группы риска. Способы, представленные в изобретении, имеют преимущества относительно методов, соответствующих предшествующему уровню техники (включая промышленный стандартный FOBT) вследствие улучшенной чувствительности, специфичности и, вероятно, удобства для пациента. Наиболее предпочтительно, когда способы и нуклеиновые кислоты, представленные в настоящем изобретении, используют для выявления рака печени или дифференцирования его от других клеточных пролиферативных нарушений печени или для выявления колоректальной карциномы или предраковых колоректальных клеточных пролиферативных нарушений. В одном варианте осуществления изобретение представляет способ выявления и/или классификации клеточных пролиферативных нарушений у пациента, заключающийся в определении уровней экспрессии по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165, в биологическом образце, выделенном у указанного субъекта, причем пониженная экспрессия и/или метилирование CpG являются указателем присутствия или класса указан-6 013634 ного нарушения. В одном варианте осуществления указанный уровень экспрессии определяют по детекции присутствия, отсутствия или уровня мРНК, транскрибируемой с указанного гена. В следующем варианте осуществления указанный уровень экспрессии определяют по детекции присутствия, отсутствия или уровня полипептида, кодируемого указанным геном или его последовательностью. В следующем предпочтительном варианте осуществления указанную экспрессию определяют по детекции присутствия или отсутствия метилирования CpG в указанном гене, причем присутствие метилирования указывает на наличие клеточного пролиферативного нарушения. Указанный способ включает следующие стадии:i) контактирование геномной ДНК, выделенной из биологического образца (предпочтительно выбранного из группы, состоящей из плазмы крови, сыворотки крови, цельной крови, выделенных клеток крови, клеток, выделенных из крови), полученного от пациента, по меньшей мере с одним реагентом или серией реагентов, которые дифференцируют метилированные и неметилированные динуклеотиды CpG по меньшей мере на одном целевом участке геномной ДНК, причем нуклеотидная последовательность указанного целевого участка включает по меньшей мере одну динуклеотидную последовательность CpG по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT иii) детекцию и/или классификацию клеточных пролиферативных нарушений, по меньшей мере частично. Предпочтительно, когда целевой участок включает или гибридизуется в жестких условиях с последовательностью по меньшей мере из 16 следующих друг за другом нуклеотидов по меньшей мере одной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167. Предпочтительно, когда чувствительность данной детекции составляет от приблизительно 75 до приблизительно 96%, или от приблизительно 80 до приблизительно 90%, или от приблизительно 80 до приблизительно 85%. Предпочтительно, когда специфичность составляет от приблизительно 75 до приблизительно 96%, или от приблизительно 80 до приблизительно 90%, или от приблизительно 80 до приблизительно 85%. Способ является новым, поскольку в настоящее время отсутствуют способы, которые обеспечивают выявление рака путем анализа жидкостей тела с чувствительностью и специфичностью, достаточно высокими для применения в коммерчески доступном и одобренном регулятивными органами анализе. Например, современные методы, используемые для выявления и диагностики колоректальной карциномы,включают колоноскопию, сигмоидоскопию и анализ фекальной скрытой крови рака толстой кишки. По сравнению с данными методами описанное изобретение является значительно менее инвазивным, чем колоноскопия, и настолько же, если не более чувствительным, чем сигмоидоскопия и FOBT. Разработка анализа жидкости тела представляет явное техническое преимущество относительно современных методов, известных в области техники, в том, что он предусматривает, что, по меньшей мере, уровень удобства для пациента при скрининге колоректальной карциномы с использованием теста на основе одной жидкости тела будет выше, чем трехкратный анализ кала, в настоящее время рекомендованный дляFOBT. В качестве дальнейшей иллюстрации современные методы, используемые для детекции и диагностики рака печени, включают визуализацию с помощью ПЭТ (позитронная эмиссионная томография) и ЯМР-томографию и цитологический скрининг аспирата или биоптата. Методы радиологического скрининга обычно не выявляют рак на ранних стадиях и являются дорогостоящими и трудоемкими при проведении. Цитологический скрининг представляет риск, ассоциированный с биопсией (внутреннее кровотечение) и аспирацией (обсеменение игольного канала и кровотечение, желчный перитонит и пневмоторакс). Соответственно выявление рака печени на ранних стадиях в настоящее время невозможно, более того, поскольку прогноз для пациента значительно улучшается при раннем выявлении, в области техники имеется потребность в данном тесте для скрининга. Конкретный вариант осуществления метода заключается в использовании по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9(включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT иSEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165, как маркера для выявления и определения различий клеточных пролиферативных нарушений. Настоящее изобретение особенно подходит для выявления неопластических клеточных пролиферативных нарушений (включая преднеопластическую стадию). Более того, способы и нуклеиновые кислоты, представленные в настоящем изобретении, обеспечивают определение различий между злокачественными и доброкачественными клеточными пролиферативными нарушениями. Способы и нуклеиновые кислоты, представленные в настоящем изобретении, особенно эффективны в плане выявления колоректальных или печеночных неопластических и пренеопластических нарушений. Кроме того, они находят применение в определении различий между неопластическими и доброкачественными клеточными пролиферативными колоректальными и гепатоцеллюлярными нарушениями.-7 013634 Указанное применение гена может быть обеспечено посредством любого анализа экспрессии гена,посредством анализа экспрессии мРНК или анализа экспрессии белка. Однако в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения детекцию, дифференцировку и определение различий между колоректальными или печеночными клеточными пролиферативными нарушениями обеспечивают посредством анализа статуса метилирования по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2,SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165 и его промотора или регуляторных элементов. Изобретение представляет способ анализа биологических образцов на признаки, ассоциированные с развитием клеточных пролиферативных нарушений, причем способ, отличающийся тем, что по меньшей мере одна нуклеиновая кислота или ее фрагмент из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167, контактирует с реагентом или серией реагентов, способных различать метилированные и неметилированные динуклеотиды CpG в геномной последовательности или последовательностях, представляющих интерес. Настоящее изобретение представляет способ подтверждения эпигенетических параметров геномной ДНК, ассоциированных с развитием неопластических клеточных пролиферативных нарушений (например, форм рака). Способ имеет применение в усовершенствованной диагностике, лечении и мониторировании указанных заболеваний. Предпочтительно, когда источник тест-образца выбран из группы, состоящей из клеток, клеточных линий, гистологических срезов, биоптатов, ткани, заключенной в парафин, жидкостей тела, семенной жидкости, кала, крови и их комбинаций. Более предпочтительно, когда источник выбран из группы, состоящей из кала, плазмы крови, сыворотки крови, цельной крови, выделенных клеток крови клеток, выделенных из крови, полученной от пациента. В частности, настоящее изобретение представляет способ выявления неопластических клеточных пролиферативных нарушений (предпочтительно колоректальных клеток и/или клеток печени), включая раннюю предраковую стадию, и определения различий между неопластическими и доброкачественными клеточными пролиферативными нарушениями, заключающийся в получении биологического образца,включающего геномную нуклеиновую кислоту(ы); контактировании нуклеиновой кислоты(кислот) или ее фрагмента с одним реагентом или множеством реагентов, достаточных для определения различий между метилированными и неметилированными динуклеотидными последовательностями CpG по меньшей мере в одной целевой последовательности нуклеиновой кислоты пациента, причем целевая последовательность включает или гибридизуется в жестких условиях с последовательностью,включающей по меньшей мере 16 следующих друг за другом нуклеотидов последовательности,выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167, причем указанные следующие друг за другом нуклеотиды включают по меньшей мере одну динуклеотидную последовательность CpG, и определении, основываясь по меньшей мере отчасти на указанном распознавании метилированного состояния по меньшей мере одной целевой динуклеотидной последовательности CpG или среднего или отражающего величину среднего состояния метилирования множества целевых динуклеотидных последовательностей CpG. Предпочтительно, когда определение различий между метилированными и неметилированными динуклеотидными последовательностями CpG в целевой последовательности включает зависимое от состояния метилирования конвертирование или неконвертирование по меньшей мере одной данной динуклеотидной последовательности CpG в соответствующую конвертированную или неконвертированную динуклеотидную последовательность в последовательности, выбранной из группы, состоящей изSEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203, и их соседние участки, соответствующие целевой последовательности. Дополнительные варианты осуществления представляют способ выявления неопластических клеточных пролиферативных нарушений (или определения различий между ними и доброкачественными клеточными пролиферативными нарушениями), наиболее предпочтительно колоректальными или гепатоцеллюлярными, заключающийся в получении биологического образца, включающего геномную ДНК пациента; экстракции геномной ДНК; обработке геномной ДНК или ее фрагмента одним или более реагентов для превращения неметилированных цитозиновых оснований в положении 5 в урацил или другое основание, которое заметно отличается от цитозина в плане гибридизационных свойств; контактировании обработанной геномной ДНК или ее обработанного фрагмента амплификационным ферментом и по меньшей мере двумя праймерами, включающими в каждом случае прилежащую последовательность длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая комплементарна или гибридизуется в умеренно жестких или жестких условиях с последовательностью, выбранной из группы, состоящей изSEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 и их комплементов, причем обработанную ДНК или ее фрагмент либо амплифицируют с получением продукта амплификации, либо не амплифицируют; и в определении на-8 013634 основании присутствия или отсутствия или свойств указанного продукта амплификации состояния метилирования или среднего или отражающего величину среднего уровня метилирования по меньшей мере одной, но более предпочтительно множества динуклеотидов CpG последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159SEQ ID NO:167. Предпочтительно, когда определение включает применение по меньшей мере одного способа, выбранного из группы, состоящей из:i) гибридизации по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей прилежащую последовательность длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая комплементарна или гибридизуется в умеренно жестких или жестких условиях с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 и их комплементов;ii) гибридизации по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, связанной с твердой фазой, включающей прилежащую последовательность длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая комплементарна или гибридизуется в умеренно жестких или жестких условиях с последовательностью,выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 и их комплементов;iii) гибридизации по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей прилежащую последовательность длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая комплементарна или гибридизуется в умеренно жестких или жестких условиях с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 и их комплементов, и удлинения по меньшей мере одной данной гибридизованной молекулы нуклеиновой кислоты по меньшей мере на одно нуклеотидное основание; иiv) секвенирования продукта амплификации. Следующие варианты осуществления представляют способ анализа (т.е. выявления и/или классификации) клеточных пролиферативных нарушений, заключающийся в получении биологического образца, включающего геномную ДНК пациента; экстракции геномной ДНК; контактировании геномной ДНК или ее фрагмента, включающего одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167, или последовательности, которая гибридизуется с ней в жестких условиях, с одним или более чувствительных к метилированию рестрикционных ферментов, причем геномная ДНК либо расщепляется ими с образованием фрагментов расщепления, либо не расщепляется ими; и в определении на основе присутствия или отсутствия или свойств по меньшей мере одного из данных фрагментов состояния метилирования по меньшей мере одной динуклеотидной последовательности CpG по меньшей мере одной геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167, или среднего или значения, отражающего средний уровень состояния метилирования множества их последовательностей динуклеотидов CpG. Предпочтительно, когда расщепленную или нерасщепленную геномную ДНК амплифицируют перед указанным определением. Дополнительные варианты осуществления представляют новые геномные и химически модифицированные последовательности нуклеиновой кислоты, а также олигонуклеотиды и/или ПНК-олигомеры для анализа типов метилирования цитозина в последовательностях из группы, состоящей изSEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показан комментарий к программе человеческого генома Ensembl транскриптов генов септина 9 и Q9HC74. Показаны также относительные положения SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3. На фиг. 2 представлены три графика. Два графика слева показывают чувствительность анализаSEQ ID NO:1 (анализ 2) в образцах колоректальной карциномы и крови в примере 2. График справа представляет ROC выявления колоректальной карциномы. На фиг. 3 показаны уровни метилирования, измеренные в других формах рака согласно примеру 4. На фиг. 4 показаны уровни метилирования, измеренные при других нераковых заболеваниях согласно примеру 4. На фиг. 5-29 показаны матрицы данных секвенирования с использованием бисульфита согласно примеру 5. Каждая колонка матрицы представляет данные по секвенированию для повторности одного образца, все повторности по каждому образцу сгруппированы вместе в одном блоке. Каждый ряд матрицы представляет один сайт CpG во фрагменте. Число CpG продукта амплификации показано в левой части матрицы. Число измеренного уровня метилирования в каждом положении CpG представлено цветом от светло-серого (0% метилирования) до серого средней интенсивности (50% метилирования) до темносерого (100% метилирования). Некоторые продукты амплификации, образцы или положения CpG не бы-9 013634 ли успешно амлифицированы, и они показаны белым цветом. На фиг. 5-12 представлен общий вид секвенирования конвертированных бисульфитом продуктов амплификации геномной последовательности, соответствующей табл. 21, в 4 образцах, которые ранее были количественно оценены (посредством анализа HeavyMethyl), как имеющие уровень метилирования от 10 до 20%. На фиг. 13-20 представлен общий вид секвенирования конвертированных бисульфитом продуктов амплификации геномной последовательности, соответствующей табл. 21, в 2 образцах, которые ранее были количественно оценены (посредством анализа HeavyMethyl), как имеющие уровень метилирования более 20%. На фиг. 21, 22 представлен общий вид секвенирования конвертированных бисульфитом продуктов амплификации геномной последовательности, соответствующей табл. 21, в образцах крови, полученных от трех здоровых пациентов. На фиг. 23-29 представлен общий вид секвенирования конвертированных бисульфитом продуктов амплификации геномной последовательности, соответствующей табл. 21, в 6 образцах, которые ранее были количественно оценены (посредством анализа HeavyMethyl), как имеющие уровень метилирования менее 10% (но более чем 0%). На каждой из фиг. 30-37 представлены три графика. Два графика слева показывают чувствительность анализа согласно табл. 12 в образцах колоректальной карциномы и крови в примере 2. Верхний график показывает бинарное распределение двух типов образцов, тогда как нижний график представляет мультиклассное распределение. Ось Y данных графиков показывает соотношение анализируемых образцов с уровнем метилирования, превышающим количественно оцененное значение, показанное на оси X. График справа представляет ROC выявления колоректальной карциномы. Детальное описание изобретения Определения. Термин "наблюдаемое/ожидаемое соотношение" ("соотношение О/Е") относится к частоте динуклеотидов CpG в определенной последовательности ДНК и соответствует [число сайтов CpG/(число оснований Счисло оснований G)]/длина полосы для каждого фрагмента. Термин "островок CpG" относится к прилегающему участку геномной ДНК, который удовлетворяет критерию (1) наличия частоты динуклеотидов CpG, соответствующей "наблюдаемому/ожидаемому соотношению" 0,6; и (2) наличия "содержание GC" 0,5. Островки CpG, как правило, но не всегда, составляют от приблизительно 0,2 до приблизительно 1 т.п.н. или до приблизительно 2 т.п.н. в длину. Термин "состояние метилирования" или "статус метилирования" относится к присутствию или отсутствию 5-метилцитозина ("5-mCyt") в одном или множестве динуклеотидов CpG в последовательности ДНК. Состояния метилирования в одном или более сайтов метилирования CpG (каждый из которых имеет две динуклеотидные последовательности CpG) в последовательности ДНК включают "неметилированный", "полностью метилированный" и "гемиметилированный". Термин "гемиметилирование" относится к состоянию метилирования двунитевой ДНК, когда только одна из ее нитей является метилированной. Термин "AUC", как используют в данном контексте, представляет собой сокращение выражения"площадь под кривой". В частности, он относится к площади под кривой оперативной характеристики приемника (ROC). Кривая ROC представляет собой график истинно положительного уровня относительно ложного положительного уровня для разных возможных разделяющих точек диагностического теста. Она показывает трейдоф (отрицательную корреляцию) между чувствительностью и специфичностью в зависимости от выбранной разделяющей точки (любой повышение чувствительности будет сопровождаться снижением специфичности). Площадь под кривой ROC (AUC) представляет собой меру точности диагностического теста (чем больше площадь, тем лучше, оптимум составляет 1, случайный тест будет иметь кривую ROC, лежащую на диагонали с площадью 0,5; для ссылки см.: JP. Egan. Signal DetectionTheory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975). Термин "гиперметилирование" относится к среднему состоянию метилирования, соответствующему повышенному уровню присутствия 5-mCyt в одном или множестве динуклеотидов CpG в последовательности ДНК тест-образца ДНК относительно количества 5-mCyt, обнаруживаемого в соответствующих динуклеотидах CpG в образце нормальной контрольной ДНК. Термин "гипометилирование" относится к среднему состоянию метилирования, соответствующему пониженному уровню присутствия 5-mCyt в одном или множестве динуклеотидов CpG в последовательности ДНК тест-образца ДНК относительно количества 5-mCyt, обнаруживаемого в соответствующих динуклеотидах CpG в образце нормальной контрольной ДНК. Термин "микроряд" в широком смысле относится к "микрорядам ДНК" и "чипу(ам) ДНК", как признано в области техники, он охватывает все признаваемые в области техники твердые носители и охватывает все методы фиксации на них молекул нуклеиновой кислоты или синтеза на них нуклеиновых кислот."Генетические параметры" представляют собой мутации и полиморфизмы генов и последовательностей, далее требующихся для их регуляции. К создаваемым в качестве мутаций относятся, в частности,инсерции, делеции, точечные мутации, инверсии и полиморфизмы и особенно предпочтительны SNP"Эпигенетические параметры" представляют собой, в частности, метилирование цитозина. Далее эпигенетические параметры включают, например, ацетилирование гистонов, которое, однако, не может быть непосредственно проанализировано с использованием описанного способа, но которое, в свою очередь, коррелирует с метилированием ДНК. Термин "бисульфитный реагент" относится к реагенту, включающему бисульфит, дисульфит, сульфит водорода или их комбинации, используемые, как описано в данном контексте, для выявления отличий между метилированными и неметилированными динуклеотидными последовательностями CpG. Термин "анализ метилирования" относится к любому анализу, направленному на определение состояния метилирования одной или более динуклеотидных последовательностей CpG в последовательности ДНК. Термин "ЧМПП-ПЦР" (чувствительная к метилированию произвольно примированная полимеразная цепная реакция) относится к признанному в области техники методу, который дает возможность общего сканирования генома с использованием богатых CG праймеров для концентрирования на участках,вероятно, включающих динуклеотиды CpG и описанных в статье Gonzalgo et al., Cancer Research, 57: 594-599, 1997. Термин "MethyLight" относится к признанному в области техники, основанному на флуоресценции методу ПЦР в режиме реального времени, описанному в статье Eads et al., Cancer Res. 59: 2302-2306,1999. Термин анализ "HeavyMethyl" в его варианте осуществления, применяемом в данном контексте,относится к анализу, в котором специфические в отношении метилирования блокирующие зонды (называемые также в данном контексте блокаторами), покрывающие положения CpG между амплификационными праймерами или покрываемые ими, дают возможность специфической в отношении метилирования избирательной амплификации образца нуклеиновой кислоты. Термин анализ "HeavyMethyl MethyLight" в его варианте осуществления, применяемом в данном контексте, относится к анализу HeavyMethyl MethyLight, который представляет собой вариант анализа MethyLight, в котором анализ MethyLight комбинируют со специфическими в отношении метилирования блокирующими зондами, покрывающими положения CpG между амплификационными праймерами. Термин "Ms-SNuPE" (чувствительное к метилированию удлинение праймера на один нуклеотид) относится к признанному в области техники анализу, описанному в статье GonzalgoJones, NucleicAcids Res. 25: 2529-2531, 1997. Термин "MSP" (специфическая в отношении метилирования ПЦР) относится к признанному в области техники анализу метилирования, описанному в статье Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9821-9826, 1996 и в патенте США 5786146. Термин "COBRA" (комбинированный рестрикционный анализ с использованием бисульфита) относится к признанному в области техники анализу метилирования, описанному в статье XiongLaird,Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534, 1997. Термин "MCA" (амплификация островка метилированного CpG) относится к анализу метилирования, описанному в статье Toyota et al., Cancer Res. 59: 2307-12, 1999 и в WO 00/26401A1. Термин "гибридизация" следует понимать как связывание олигонуклеотида с комплементарной последовательностью вдоль линий спаривания оснований Уотсона-Крика в образце ДНК с формированием структуры дуплекса."Жесткие условия гибридизации", как определено в данном контексте, включают гибридизацию при 68 С в 5SSC (сукцинат цитрат натрия)/5 раствор Денхардта/1,0% SDS (додецилсульфат натрия) и промывание в 0,2SSC/0,1% SDS при комнатной температуре или включает ее признанный в области техники эквивалент (например, условия, в которых гибридизацию проводят при 60 С в 2,5 буфер SSC с последующими несколькими стадиями промывания при 37 С при низкой концентрации буфера при сохранении стабильности). Умеренно жесткие условия, как определено в данном контексте, включают промывание в 3SSC при 42 С или его эквивалент, признанный в области техники. Параметры концентрации соли и температуры можно варьировать для достижения оптимального уровня идентичности между зондом и нуклеиновой кислотой-мишенью. В области техники имеется руководство относительно данных условий, например монографии Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press, N.Y. ed. Ausubel et al., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John WileySons, N.Y.) at Unit 2.10.- 11013634 Термины "специфические в отношении метилирования рестрикционные ферменты" или "чувствительные к метилированию рестрикционные ферменты" будут использовать для обозначения фермента,который избирательно расщепляет нуклеиновую кислоту в зависимости от состояния метилирования ее сайта распознавания. В случае данных рестрикционных ферментов, которые специфически разрезают,если сайт распознавания является неметилированным или гемиметилированным, разрезание не будет иметь место или будет происходить с существенно пониженной эффективностью, если сайт распознавания является метилированным. Предпочтительны специфические в отношении метилирования рестрикционные ферменты, последовательность распознавания которых включает динуклеотид CG (например,cgcg или cccggg). Кроме того, предпочтительными для ряде вариантов осуществления являются рестрикционные ферменты, которые не разрезают, если цитозин в данном динуклеотиде является метилированным по атому углерода С 5."Неспецифические в отношении метилирования рестрикционные ферменты" или "нечувствительные к метилированию рестрикционные ферменты" представляют собой рестрикционные ферменты, которые разрезают последовательность нуклеиновой кислоты независимо от состояния метилирования почти с одинаковой эффективностью. Их также называют "неспецифические в отношении метилирования рестрикционные ферменты". Термин "ген" следует использовать для включения всех его вариантов транскриптов (в частности,термин "септин 9" должен включать, например, его укороченный транскипт Q9HC74) и всех его промоторных и регуляторных элементов. Более того, поскольку в данном гене известно множество SNP, термин следует использовать для включения всех вариантов его последовательности. Термины "предраковый" или "преднеопластический" и их эквиваленты следует использовать для обозначения любого клеточного пролиферативного нарушения, которое представляет собой происходящую злокачественную трансформацию. Примеры данных состояний включают в контексте колоректальных клеточных пролиферативных нарушений клеточные пролиферативные нарушения с высокой степенью дисплазии и следующие классы аденом: уровень 1: проникновение злокачественных желез через мышечную пластинку слизистой оболочки в подслизистую оболочку в головке полипа; уровень 2: такая же инвазия в подслизистую оболочку, но присутствует в месте соединения головки с ножкой; уровень 3: инвазия ножки и уровень 4: инвазия основания ножки в месте соединения стенки кишки (данный уровень соответствует стадии Дьюкса А). Обзор. Настоящее изобретение представляет способ выявления и/или классификации клеточных пролиферативных нарушений у пациента, заключающийся в определении уровней экспрессии по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9(включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT иSEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165, в биологическом образце, выделенном у данного пациента, причем пониженный уровень экспрессии и/или метилирование CpG является показателем присутствия или класса указанного нарушения. Указанные маркеры можно использовать для диагностики неопластических клеточных пролиферативных нарушений (рака), включая раннее выявление во время предраковых стадий заболевания, и, кроме того, для дифференцировки неопластических клеточных пролиферативных нарушений от доброкачественных. Настоящее изобретение раскрывает способ, в котором неопластическое клеточное пролиферативное нарушение отличают от доброкачественного клеточного пролиферативного нарушения, который отличается тем, что пониженный уровень экспрессии и/или присутствие метилирования CpG является показателем присутствия неопластического клеточного пролиферативного нарушения или преднеопластического нарушения, и его отсутствие является показателем присутствия доброкачественного клеточного пролиферативного нарушения. Маркеры, представленные в настоящем изобретении, особенно эффективны при детекции и определении различий между клеточными пролиферативными нарушениями печени или, альтернативно, для детекции или определения различий между колоректальными клеточными пролиферативными нарушениями, обеспечивая, таким образом, усовершенствованное средство для ранней детекции, классификации и лечения указанных нарушений. Кроме вышеописанных вариантов осуществления, в которых проводят анализ метилирования по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN,PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165, изобретение представляет дополнительную панель генов, включающую по меньшей мере один ген или геномную последовательность, выбранную из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN,PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165, с новым применением для выявления форм рака, в частности рака печени и/или колоректального рака.- 12013634 В первом дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение основано на анализе статуса метилирования CpG по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN,PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165. Кроме того, предпочтительно, когда последовательности указанных генов соответствуют табл. 1. Бисульфитная модификация ДНК является признанным в области техники инструментом, используемым для оценки статуса метилирования CpG. 5-Метилцитозин представляет собой наиболее часто встречающуюся ковалентную модификацию основания в ДНК эукариотических клеток. Он играет роль,например, в регуляции транскрипции, в генетическом импринтинге и в онкогенезе. Вследствие этого идентификация 5-метилцитозина как компонента генетической информации представляет значительный интерес. Однако положения 5-метилцитозина не могут быть идентифицированы секвенированием, поскольку 5-метилцитозин имеет такое же поведение спаривания, как цитозин. Более того, эпигенетическая информация, которую несет 5-метилцитозин, полностью теряется во время, например, ПЦРамплификации. Наиболее часто используемый метод анализа ДНК на присутствие 5-метилцитозина основан на специфической реакции бисульфита с цитозином, в которой при последующем щелочном гидролизе цитозин превращают в урацил, который соответствует тимину в поведении спаривания оснований. Существенно, однако, что 5-метилцитозин остается немодифицированным в данных условиях. Следовательно,исходную ДНК конвертируют таким образом, что метилцитозин, который исходно не дифференцировался от цитозина по своему гибридизационному поведению, теперь можно определить как единственный оставшийся цитозин, используя стандартные, признанные в области техники молекулярнобиологические методы, например, путем амплификации и гибридизации или посредством секвенирования. Все данные методы основаны на разных свойствах спаривания оснований, которые теперь можно полностью использовать. Предшествующий уровень техники в отношении чувствительности определяют методом, заключающимся в помещении предназначенной для анализа ДНК в агарозную матрицу, предупреждая тем самым диффузию и ренатурацию ДНК (бисульфит реагирует только с однонитевой ДНК), и замене всех стадий осаждения и очистки быстрым диализом (см. статью Olek A., et al., A modified and improvedmethod for bisulfite based cytosine methylation analysis, Nucleic Acids Res., 24: 5064-6, 1996). Таким образом, можно анализировать отдельные клетки на статус метилирования, иллюстрируя применение и чувствительность метода. Обзор признанных в области техники методов детекции 5-метилцитозина представлен в статье Rein, Т., et al., Nucleic Acids Res., 26: 2255, 1998. Бисульфитный метод, кроме нескольких исключенией (см., например, статью Zeschnigk M., et al.,Eur. J. Hum. Genet. 5: 94-98, 1997), в настоящее время является единственным, используемым в исследовании. Во всех случаях короткие специфические фрагменты известного гена амплифицируют после обработки бисульфитом и либо полностью секвенируют (см. статью OlekWalter, Nat. Genet. 1997, 17: 275-6, 1997), подвергая одной или более реакций удлинения праймера (см. статью GonzalgoJones,Nucleic Acids Res., 25: 2529-31, 1997; заявку WO 95/00669; патент США 6251594) с целью анализа положений отдельных цитозинов, либо обрабатывают, расщепляя ферментами (см. статью XiongLaird,Nucleic Acids Res., 25: 2532-4, 1997). Детекция путем гибридизации также описана в области техники (см. Olek et al., WO 99/28498). Кроме того, описано использование бисульфитного метода для детекции метилирования в отношении отдельных генов (см. статьи GriggClark, Bioessays, 16: 431-6, 1994; Zeschnigk M., et al., Hum. Mol.Genet., 6: 387-95, 1997; FeN R., et al., Nucleic Acids Res., 22: 695-, 1994; Martin V., et al., Gene, 157: 261-4,1995; WO 9746705 и WO 9515373). Настоящее изобретение представляет применение бисульфитного метода в комбинации с одним или более анализов метилирования для определения статуса метилирования динуклеотидных последовательностей CpG по меньшей мере в одной последовательности, выбранной из группы, состоящей изSEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167. Геномные динуклеотиды CpG могут быть метилированными или неметилированными (альтернативно известные как с повышенным и пониженным уровнем метилирования соответственно). Однако способы, представленные в настоящем изобретении, подходят для анализа биологических образцов гетерогенной природы,например низкой концентрации опухолевых клеток с фоном крови или кала. Соответственно при анализе статуса метилирования положения CpG в данном образце специалист, компетентный в области техники,может использовать количественный анализ для определения уровня (например, процента, фракции, соотношения, доли или степени) метилирования в определенном положении CpG в противопоставление статусу метилирования. Соответственно термин "статус метилирования или состояние метилирования" следует также использовать для обозначения величины, отражающей степень метилирования в положении CpG. До тех пор пока специально не установлено, термины "гиперметилированный" или "метилированный на повышенном уровне" следует использовать для обозначения уровня метилирования, превышающего данный уровень в определенной разделяющей точке, причем указанное разделение может являться величиной, представляющей средний или срединный уровень метилирования для заданной попу- 13013634 ляции, или предпочтительно является оптимизированным уровнем разделения. "Разделение" также называют в данном контексте "порогом". В контексте настоящего изобретения термины "метилированный","гиперметилированный" или "метилированный на повышенном уровне" следует использовать с включением уровня метилирования выше раздела, равного 0% (или его эквивалентам) метилированию для всех положений CpG внутри или в ассоциации с (например на промоторных или регуляторных участках) генами или геномной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из септина 9(включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT иSEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165. Согласно настоящему изобретению определение статуса метилирования динуклеотидных последовательностей CpG в SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159SEQ ID NO:167 имеет применение как в диагностике, так и в характеризации клеточных пролиферативных нарушений. Процедуры анализа метилирования. Различные процедуры анализа метилирования известны в области техники и могут быть использованы в сочетании с настоящим изобретением. Данные анализы позволяют определить состояние метилирования одного или множества динуклеотидов CpG (например, островки CpG) в последовательности ДНК. Данные анализы включают, среди других методов, секвенирование ДНК обработанной бисульфитом ДНК, ПЦР (для специфической в отношении последовательности амплификации), анализ саузернблот и использование чувствительных к метилированию рестрикционных ферментов. Например, секвенирование генома упрощено для анализа типов метилирования ДНК и распределения 5-метилцитозина посредством использования обработки бисульфитом (см. статью Frommer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1827-1831, 1992). Кроме того, используют расщепление рестрикционными ферментами продуктов ПЦР, амлифицированных из конвертированной бисульфитом ДНК, см., например, метод, описанный в статье SadriHornsby (Nucl. Acids Res., 24: 5058-5059, 1996) или COBRA (Комбинированный анализ рестрикции с использованием бисульфита) (см. статью XiongLaird, NucleicCOBRA. Анализ COBRA представляет собой количественный анализ метилирования, используемый для определения уровней метилирования ДНК в специфических локусах генов в небольших количествах геномной ДНК (см. статью XiongLaird, Nucleic Acids Res., 25: 2532-2534, 1997). Вкратце, разложение рестрикционными ферментами используют для обнаружения зависимых от метилирования различий последовательности в продуктах ПЦР ДНК, обработанной бисульфитом натрия. Зависимые от метилирования различия последовательности сначала интродуцируют в геномную ДНК путем стандартной обработки бисульфитом согласно методу, описанному в статье Frommer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1827-1831, 1992). Затем проводят ПЦР-амплификацию конвертируемой бисульфитом ДНК, используя праймеры, специфические в отношении островков CpG, представляющих интерес, с последующим разложением рестрикционной эндонуклеазой, проведением гель-элекстрофореза и определением с использованием специфических меченых гибридизационных зондов. Уровни метилирования в исходном образце ДНК представляют относительными количествами разложенного и неразложенного продукта ПЦР линейно-количественно через широкий спектр уровней метилирования ДНК. Кроме того, данный метод можно надежно применять к ДНК, полученной из микросрезов погруженных в парафин образцов тканей. Типичные реагенты (например, как можно было бы обнаружить в типичном наборе на основеCOBRA) для анализа COBRA могут включать, но без ограничения перечисленным, ПЦР-праймеры для специфического гена (или обработанную бисульфитом последовательность ДНК или островок CpG); рестрикционный фермент или соответствующий буфер; олигонуклеотид для гибридизации с геном; олигонуклеотид для контрольной гибридизации; меченный киназой набор для олигонуклеотидного зонда и меченые нуклеотиды. Кроме того, реагенты для бисульфитной конверсии могут включать буфер для денатурации ДНК; буфер для сульфонирования; реагенты или наборы для выделения ДНК (например, осаждения, ультрафильтрации, аффинной колонки); буфер для десульфонирования и компоненты для выделения ДНК. Предпочтительно, когда анализы, такие как "MethyLight" (основанный на флуоресценции метод ПЦР в режиме реального времени; см. статью Eads et al., Cancer Res., 59: 2302-2306, 1999), реакцииMs-SNuPE (чувствительного к метилированию удлинения праймера на один нуклеотид; см. статьюGonzalgoJones, Nucleic Acids Res., 25: 2529-2531, 1997), специфическая в отношении метилирования ПЦР ("MSP"; см. статью Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 9821-9826, 1996; патент США 5786146) и амплификация островка метилированного CpG ("MCA"; см. статью Toyota et al., CancerRes., 59: 2307-12, 1999), используют отдельно или в комбинации с другими из данных методов. Анализ "HeavyMethyl", технология представляет собой количественный метод, предназначенный для оценки различий метилирования на основе специфической в отношении метилирования амплификации обработанной бисульфитом ДНК. Специфические в отношении метилирования блокирующие зонды(также называемые в данном контексте блокаторами), покрывающие положения CpG между или покры- 14013634 ваемые амплификационными праймерами, осуществляют специфическую в отношении метилирования избирательную амплификацию образца нуклеиновой кислоты. Термин анализ "HeavyMethyl MethyLight" в его варианте осуществления, применяемом в данном контексте, относится к анализу HeavyMethyl MethyLight, который представляет собой вариант анализа MethyLight, в котором анализ MethyLight комбинируют со специфическими в отношении метилирования блокирующими зондами, покрывающими положения CpG между амплификационными праймерами. Анализ HeavyMethyl можно также использовать в комбинации со специфическими в отношении метилирования амплификационными праймерами. Типичные реагенты (например, какие можно было бы обнаружить в типичном наборе на основеMethyLight) для анализа HeavyMethyl могут включать, но без ограничения перечисленным,ПЦР-праймеры для специфических генов (или обработанную бисульфитом последовательность ДНК или островок CpG); блокирующие олигонуклеотиды; оптимизированные буферы и дезоксинуклеотиды для ПЦР и полимеразу Taq.MSP (специфическая в отношении метилирования ПЦР) дает возможность оценки статуса метилирования действительно любой группы сайтов CpG внутри островка CpG независимо от использования чувствительных к метилированию рестрикицонных ферментов (см. статью Herman et al. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 93: 9821-9826, 1996; патент США 5786146). Вкратце, ДНК модифицируют превращением с помощью бисульфита натрия всех неметилированных, но не метилированных цитозинов в урацил и затем амплифицируют с использованием праймеров, специфических в отношении метилированной относительно неметилированной ДНК. Для MSP требуются только маленькие количества ДНК, она чувствительна к 0,1% метилированных аллелей заданного локуса островка CpG и может быть осуществлена на ДНК, экстрагированной из образцов, погруженных в парафин. Типичные реагенты (например, которые можно обнаружить в типичном наборе на основе MSP) для анализа MSP могут включать, но без ограничения перечисленным, метилированные и неметилированные ПЦР-праймеры для специфического гена(или обработанную бисульфитом последовательность ДНК или островок CpG), оптимизированные буферы для ПЦР и дезоксинуклеотиды, а также специфические зонды.MethyLight. Анализ MethyLight представляет собой высокоэффективный количественный анализ метилирования, в котором используют технологию основанной на флуоресценции ПЦР в режиме реального времени(TaqMan), для которой не требуются дальнейшие манипуляции после стадии ПЦР (см. статью Eads etal., Cancer Res., 59: 2302-2306, 1999). Вкратце, осуществление метода MethyLight начинают с того, что смешанный образец геномной ДНК превращают в реакции с бисульфитом натрия в смешанную группу зависимых от метилирования различающихся последовательностей согласно стандартным методам (бисульфитный метод превращает неметилированные остатки цитозина в урацил). Затем основанную на флуоресценции ПЦР проводят в "асимметричной" (с ПЦР-праймерами, которые перекрывают известные динуклеотиды CpG) реакции. Определение различий последовательностей можно осуществить как на уровне процесса амплификации, так и на уровне процесса детекции флуоресценции. Анализ MethyLight можно использовать как количественный тест на типы метилирования в образце геномной ДНК, причем определение различий последовательностей осуществляют на уровне гибридизации зонда. В данном количественном варианте реакция ПЦР обеспечивает специфическую в отношении метилирования амплификацию в присутствии флуоресцентного зонда, который перекрывает определенный заданный сайт метилирования. Симметричный контроль количества введенной ДНК проводят посредством реакции, в которой ни праймеры, ни зонд не перекрывают никакие динуклеотиды CpG. Альтернативно, качественный тест на геномное метилирование осуществляют зондированием асимметричной группы ПЦР либо контрольными олигонуклеотидами, которые не "покрывают" известные сайты метилирования (основанный на флуоресценции вариант методов HeavyMethyl и MSP), или олигонуклеотидами, покрывающими потенциальные сайты метилирования. Метод MethyLight можно использовать с подходящими зондами, например "TaqMan",Lightcycler и т.п. Например, двунитевую геномную ДНК обрабатывают бисульфитом натрия и подвергают одному или двум группам реакций ПЦР с использованием зондов TaqMan; например с праймерами MSP и/или блокирующими олигонуклеотидами HeavyMethyl и зондом TaqMan. Зонд TaqMan имеет две метки - флуоресцентной "сигнальной" молекулой и молекулой-"гасителем" - и разработан так,чтобы он был специфическим к участку с относительно высоким содержанием GC, так что он плавится при температуре приблизительно на 10 С выше в цикле ПЦР, чем прямой и обратный праймеры. Это позволяет зонду TaqMan оставаться полностью гибридизованным во время стадии отжига/удлинения ПЦР. Поскольку полимераза Taq ферментативно синтезирует новую нить во время ПЦР, она в конечном счете достигает зонда TaqMan при отжиге. 5'-3'-Эндонуклеазная активность полимеразы Taq затем замещает зонд TaqMan путем его разложения с высвобождением флуоресцентной сигнальной молекулы- 15013634 для количественной детекции ее теперь непогашенного сигнала с использованием системы детекции флуоресценции в режиме реального времени. Типичные реагенты (например, какие можно было бы обнаружить в типичном наборе на основеMethyLight) для анализа MethyLight могут включать, но без ограничения перечисленным,ПЦР-праймеры для специфических генов (или обработанную бисульфитом последовательность ДНК или островок CpG); зонды TaqMan или Lightcycler, оптимизированные буферы и дезоксинуклеотиды и полимеразу Taq. Анализ QM (количественного метилирования) представляет собой альтернативный количественный тест типов метилирования в образцах геномной ДНК, в котором определение различий последовательности происходит на уровне гибридизации зонда. В данном количественном варианте реакция ПЦР обеспечивает симметричную амплификацию в присутствии флуоресцентного зонда, который перекрывает определенный заданный сайт метилирования. Симметричный контроль количества введенной ДНК осуществляют реакцией, в которой ни праймеры, ни зонд не перекрывают никакие динуклеотиды CpG. Альтернативно, качественный тест на геномное метилирование осуществляют зондированием асимметричного пула ПЦР с помощью либо контрольного олигонуклеотида, который не "покрывает" известные сайты метилирования (основанные на флуоресценции варианты методов HeavyMethyl и MSP), либо с помощью олигонуклеотидов, покрывающих потенциальные сайты метилирования. Метод QM можно использовать с любыми подходящими зондами, например "TaqMan",Lightcycler и т.п., в процессе гибридизации. Например, двунитевую геномную ДНК обрабатывают бисульфитом натрия и подвергают воздействию симметричных праймеров и зонда TaqMan. ЗондTaqMan имеет две метки - флуоресцентной "сигнальной" молекулой и молекулой-"гасителем"- и разработан так, чтобы он был специфическим к участку с относительно высоким содержанием GC, так что он плавится при температуре приблизительно на 10 С выше в цикле ПЦР, чем прямой и обратный праймеры. Это позволяет зонду TaqMan оставаться полностью гибридизованным во время стадии отжига/удлинения ПЦР. Поскольку полимераза Taq ферментативно синтезирует новую нить во время ПЦР,она в конечном счете достигает зонда TaqMan при отжиге. 5'-3'-Эндонуклеазная активность полимеразы Taq затем замещает зонд TaqMan путем его разложения с высвобождением флуоресцентной сигнальной молекулы для количественной детекции ее теперь непогашенного сигнала с использованием системы детекции флуоресценции в режиме реального времени. Типичные реагенты (например, какие можно было бы обнаружить в типичном наборе на основе QM) для анализа QM могут включать, но без ограничения перечисленным, ПЦР-праймеры для специфических генов (или обработанную бисульфитом последовательность ДНК или островок CpG); зонды TaqMan или Lightcycler, оптимизированные буферы и дезоксинуклеотиды и полимеразу Taq.Ms-SNuPE. Метод Ms-SNuPE представляет собой количественный метод оценки различий метилирования в специфических сайтах CpG на основе обработки бисульфитом ДНК с последующим удлинением праймера на один нуклеотид (см. статью GonzalgoJones, Nucleic Acids Res., 25: 2529-2531, 1997). Вкратце,проводят реакцию геномной ДНК с бисульфитом натрия, чтобы превратить неметилированный цитозин в урацил, оставляя 5-метилцитозин неизмененным. Затем проводят амплификацию желательной целевой последовательности, используя ПЦР-праймеры, специфические в отношении конвертированной бисульфитом ДНК, и полученный в результате продукт выделяют и используют как матрицу для анализа метилирования в представляющем интерес сайте(ах) CpG. Можно проанализировать маленькие количества ДНК (например, микросрезы патологических образцов), и это позволяет избежать использования рестрикционных ферментов для определения статуса метилирования сайтов CpG. Типичные реагенты (например, какие можно было бы найти в наборе на основе Ms-SNuPE) для анализа Ms-SNuPE могут включать, но без ограничения перечисленным, ПЦР-праймеры для специфического гена (или обработанной бисульфитом последовательности ДНК или островка CpG); оптимизированные буферы и дидезоксинуклеотиды для ПЦР; набор для гель-экстракции; праймеры положительного контроля; праймеры Ms-SNuPE для специфического гена; реакционный буфер (для реакцииMs-SNuPE) и меченые нуклеотиды. Кроме того, реагенты для бисульфитного превращения могут включать буфер для денатурации ДНК; буфер для сульфонирования; реагенты или набор для выделения ДНК(например, осаждения, ультрафильтрации, аффинной колонки), буфер для десульфонирования и компоненты для выделения ДНК. Определяют, что геномная последовательность согласно SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167 и их неприродные обработанные варианты согласно SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 имеют новое применение для раннего выявления, классификации и/или лечения клеточных пролиферативных нарушений, в частности колоректальных клеточных пролиферативных нарушений и/или клеточных пролиферативных нарушений печени.- 16013634 В одном варианте осуществления изобретения способ включает следующие стадии:i) контактирование геномной ДНК (предпочтительно выделенной из жидкостей тела), полученной у пациента с помощью по меньшей мере одного реагента или серии реагентов, которые определяют различия между метилированными и неметилированными динуклеотидами CpG по меньшей мере в одном гене или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ IDii) детекцию или детекцию и определение различий между или среди клеточных пролиферативных нарушений толстой кишки и печени, получаемых с чувствительностью более или равной 80% и специфичностью более или равной 80%. Предпочтительно, когда чувствительность составляет от приблизительно 75 до приблизительно 96%, или от приблизительно 80 до приблизительно 90%, или от приблизительно 80 до приблизительно 85%. Предпочтительно, когда специфичность составляет от приблизительно 75 до приблизительно 96%,или от приблизительно 80 до приблизительно 90%, или от приблизительно 80 до приблизительно 85%. Геномную ДНК можно выделить любыми методами, стандартными для области техники, включая использование коммерчески доступных наборов. Вкратце, когда ДНК, представляющая интерес, инкапсулирована в клеточной мембране, биологический образец необходимо разрушить и лизировать ферментативными, химическими или механическими средствами. Раствор ДНК затем можно очистить от белков и других примесей, например, расщеплением протеинкиназой K. Затем геномную ДНК выделяют из раствора. Это можно осуществить с помощью ряда методов, включая высаливание, экстракцию органическими материалами или связывание ДНК с твердофазным носителем. На выбор метода будет влиять ряд факторов, в том числе время, стоимость и необходимое количество ДНК. Все типы клинических образцов, включающие неопластическую субстанцию или пренеопластическую субстанцию, подходят для применения в настоящем способе, предпочтительными являются клеточные линии, гистологические срезы, биоптаты, заключенная в парафин ткань, жидкости тела, кал, истечения из толстой кишки, моча,плазма крови, сыворотка крови, цельная кровь, выделенные клетки крови, клетки, выделенные из крови,и их комбинации. Жидкости тела являются предпочтительным источником ДНК, особенно предпочтительными являются плазма крови, сыворотка крови, цельная кровь, выделенные клетки крови, клетки,выделенные из крови. Затем образец геномной ДНК обрабатывают по меньшей мере одним реагентом или серией реагентов, которые определяют различия между метилированными и неметилированными динуклеотидамиCpG по меньшей мере на одном целевом участке геномной ДНК, причем целевой участок включает или гибридизуется в жестких условиях с последовательностью по меньшей мере из 16 следующих друг за другом нуклеотидов по меньшей мере одной последовательности, выбранной из группы, состоящей изSEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167 соответственно, причем указанные следующие друг за другом нуклеотиды включают по меньшей мере одну динуклеотидную последовательность CpG. Особенно предпочтительно, когда данный реагент превращает цитозиновые основания, которые неметилированы по 5'-положению, в урацил, тимин или другое основание, которое отлично от цитозина в отношении гибридизационного поведения. Однако в альтернативном варианте осуществления указанный реагент может представлять собой чувствительный к метилированию рестрикционный фермент. Когда образец геномной ДНК обрабатывают так, что цитозиновые основания, которые являются неметилированными по 5'-положению, превращаются в урацил, тимин или другое основание, которое отличается от цитозина в плане гибридизационного поведения, предпочтительно, когда данную обработку проводят бисульфитом (гидросульфитом, дисульфитом) с последующим щелочным гидролизом. Данная обработка в результате приводит к превращению SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:30-SEQ IDNO:31, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:185 (соответственно), где указанные динуклеотиды CpG являются метилированными, или SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:42-SEQCpG являются неметилированными. Затем обработанную ДНК анализируют с целью определения состояния метилирования последовательностей целевого гена (по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN,PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165 перед обработкой). Особенно предпочтительно,когда целевой участок включает или гибридизуется в жестких условиях по меньшей мере с 16 следующими друг за другом нуклеотидами по меньшей мере одного гена или геномной последовательности,выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2,SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165. Предпочтительно, когда анализируют последовательность данных генов согласно SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167. Метод анализа можно выбрать из известных в области техники, включая те, которые перечислены в данном контексте. Особенно предпочтительными являютсяMethyLight, MSP и применение блокирующих олигонуклеотидов (HeavyMethyl), как описано в данном контексте. Кроме того, предпочтительно, чтобы любые олигонуклеотиды, используемые в данном анализе (включая праймеры, блокирующие олигонуклеотиды и зонды для детекции), были бы обратно комплементарными, идентичными или гибридизовались в жестких или сильно жестких условиях с сегментом длиной по меньшей мере 16 пар оснований последовательностей оснований одной или более изSEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 и комплементарных им последовательностей. Аберрантное метилирование, более специальное гиперметилирование генов или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов),FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165 (включая их промоторные и/или регуляторные участки), ассоциировано с присутствием неопластических клеточных пролиферативных нарушений и особенно преобладает в колоректальных и гепатоцеллюлярных карциномах. Соответственно, когда присутствует биологический образец с любой степенью метилирования, указанный образец следует определять как неопластический. Анализ одного из генов или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT иSEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165, впервые обеспечивает возможность детекции или детекции и определения различий между или среди клеточных пролиферативных нарушений толстой кишки и печени, дающей чувствительность больше или равную 80% и специфичность больше или равную 80%. Чувствительность рассчитывают как определяемое новообразование/все новообразования; например определяемое новообразование толстой кишки/все новообразования толстой кишки, и специфичность рассчитывают как неопределенные отрицательные анализы/все отрицательные анализы. Предпочтительно, когда чувствительность составляет от приблизительно 75 до приблизительно 96%, или от приблизительно 80 до приблизительно 90%, или от приблизительно 80 до приблизительно 85%. Предпочтительно, когда специфичность составляет от приблизительно 75 до приблизительно 96%,или от приблизительно 80 до приблизительно 90%, или от приблизительно 80 до приблизительно 85%. Новообразование толстой кишки в данном контексте определяют как все злокачественные новообразования и аденомы толстой кишки, превышающие 1 см, или их подгруппы. Отрицательные анализы можно определить как здоровые пациенты. В одном варианте осуществления способ раскрывает применение по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165 (их промоторные и/или регуляторные участки), в качестве маркера для дифференцирования, выявления и определения различий клеточных пролиферативных нарушений (в частности, неопластических нарушений толстой кишки или печени). Указанный способ можно осуществить посредством любого анализа экспрессии транскрибируемой с них РНК или полипептида либо белка, транслируемых с данной РНК, предпочтительно посредством анализа экспрессии мРНК или анализа экспрессии полипептида. Соответственно настоящее изобретение представляет также диагностические анализы и способы, как количественные, так и качественные, детекции экспрессии по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6,NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165, у пациента и их определения на их основе присутствия или отсутствия рака у данного пациента. Аберрантная экспрессия мРНК, транскрибируемой с генов или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1,VTN, PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165, ассоциирована с присутствием рака у пациента. Соответственно настоящему изобретению пониженная экспрессия (и/или присутствие метилирования) ассоциирована с присутствием рака и, наоборот, сверхэкспрессия (и/или отсутствие метилирования) ассоциирована с отсутствием рака. Особенно предпочтительно, когда определяют экспрессию по меньшей мере одного из вариантов транскриптов, как описано в SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:19 гена септина 9. Для детекции присутствия мРНК, кодирующей ген или геномную последовательность, получают образец от пациента. Образец может представлять собой любой подходящий образец, включающий клеточный материал опухоли. Типы подходящих образцов включают клеточные линии, гистологические срезы, биоптаты, ткани, заключенные в парафин, жидкости тела, кал, истечения из толстой кишки, мочу,плазму крови, сыворотку крови, цельную кровь, выделенные клетки крови, клетки, выделенные из крови,и все их возможные комбинации. Предпочтительно, когда указанными типами образцов являются кал или жидкости тела, выбранные из группы, состоящей из истечений из толстой кишки, мочи, плазмы крови, сыворотки крови, цельной крови, выделенных клеток крови, клеток, выделенных из крови.- 18013634 Образец можно обработать для того, чтобы экстрагировать содержащуюся в них РНК. Затем анализируют полученную в результате нуклеиновую кислоту из образца. Из уровня техники известно много методов определения абсолютного и относительного уровней экспрессии гена; обычно используемые методы, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают гибридизацию in situ (например, FISH), нозерн-анализ, анализы защиты РНКазы (RPA), микрочипы и методы на основе ПЦР, такие как количественная ПЦР и ПЦР с дифференцированным представлением, либо любой другой метод детекции нуклеиновой кислоты. Особенно предпочтительным является применение метода цепной реакции полимеризации с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР хорошо известен в области техники (например, см.Watson and Fleming, выше). Метод ОТ-ПЦР можно осуществить следующим образом. Общую клеточную РНК выделяют, например, стандартным методом с использованием гуанидин изотиоцианата и проводят обратную транскрипцию общей РНК. Метод обратной транскрипции включает синтез ДНК на матрице РНК при использовании фермента обратной транскриптазы и 3'-концевого олигонуклеотидного dT праймера и/или случайным гексамерным праймером. Полученную таким образом кДНК затем амплифицируют с помощью ПЦР (см. статьи Belyavsky et al., Nucl. Acid. Res., 17: 2919-2932, 1989; Krug and Berger, Methods inEnzymology, Academic Press, N.Y., vol. 152, p. 316-325, 1987, которые включены в виде ссылки). Более предпочтительным является вариант ОТ-ПЦР в режиме реального времени, в котором продукт ПЦР определяют посредством гибридизационных зондов (например, TaqMan, Lightcycler, Molecular BeaconsScorpion) или SYBR зеленым. Определяемый сигнал от зондов или SYBR зеленого затем количественно оценивают либо относительно стандартной кривой, либо сравнением значений Ct со значениями калибровочного стандарта. Анализ генов "домашнего хозяйства" часто используют для нормализации результатов. В анализе нозерн-блот общую или поли(А)+ мРНК проводят на денатурирующем агарозном геле и определяют гибридизацией с меченым зондом в самом сухом геле или на мембране. Полученный в результате сигнал пропорционален количеству целевой РНК в популяции РНК. Сравнение сигналов от двух или более клеточных популяций или тканей показывает относительные различия в уровнях экспрессии генов. Абсолютное количественное определение можно провести путем сравнения сигнала со стандартной кривой, генерированной с использованием известных количеств invitro транскрипта, соответствующего целевой РНК. Анализ генов домашнего хозяйства, генов, уровни экспрессии которых, как ожидают, остаются относительно постоянными независимо от условий, часто используют для нормализации результатов, исключая какие-либо очевидные различия, обусловленные неравным переносом РНК на мембрану или неравной нагрузкой РНК на гель. Первой стадией нозерн-анализа является выделение чистой интактной РНК из клеток или ткани,представляющей интерес. Поскольку нозерн-блоты различают РНК по размеру, целостность образца влияет на степень, в которой сигнал локализуется в одной полосе. Частично разложенные образцы РНК будут давать в результате смазанный или распределенный на несколько полос сигнал с общей потерей чувствительности и возможностью ошибочной интерпретации данных. В анализе нозерн-блот можно использовать ДНК, РНК и олигонуклеотидные зонды, и данные зонды предпочтительно являются мечеными (например, радиоактивными метками, метками массы или флуоресцентными метками). Размер РНК-мишени, не зонда, будет определять размер определяемой полосы, поэтому такие методы, как случайно примированное введение метки, которые генерируют зонды различной длины, подходят для синтеза зондов. Специфическая активность зонда будет определять уровень чувствительности, вследствие чего предпочтительно, когда используют зонды с высокой специфической активностью. В анализе защиты РНКазы РНК-мишень и зонд РНК определенной длины гибридизуются в растворе. После гибридизации РНК разлагают РНКазами, специфическими в отношении однонитевых нуклеиновых кислот, с целью удаления какой-либо негибридизованной однонитевой РНК-мишени и зонда. РНКазы инактивируют и РНК отделяют, например, в помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле. Количество интактного РНК-зонда пропорционально количеству РНК-мишени в популяции РНК. RPA можно использовать для относительной и абсолютной количественной оценки экспрессии гена, а также для картирования структуры РНК, такой как связи интрон/экзон и сайты начала транскрипции. Анализ защиты РНКазы предпочтителен относительно анализа нозерн-блот, поскольку он, как правило, имеет более низкий предел детекции. Антисмысловые РНК-зонды, используемые в RPA, генерируют путем транскрипции in vitro ДНКматрицы с определенной конечной точкой, и они, как правило, лежат в интервале 50-600 нуклеотидов. Применение РНК-зондов, которые включают дополнительные последовательности, негомологичные РНК-мишени, дают возможность определения отличий защищенного фрагмента от зонда полной длины. РНК-зонды, как правило, используют вместо ДНК-зондов вследствие простоты генерации однонитевых РНК-зондов и воспроизводимости и надежности разложения дуплекса РНК:РНК РНКазами (см. Ausubelet al. 2003), особенно предпочтительными являются зонды с высокими специфическими активностями.- 19013634 Особенно предпочтительным является использование микрочипов. Процесс анализа микрочипов можно разделить на две основные части. Первая представляет собой иммобилизацию последовательностей известного гена на стеклянных предметных стеклах или другом твердом носителе с последующей гибридизацией флуоресцентно меченой кДНК (включающей запрашиваемые последовательности) с известными генами, иммобилизованными на стеклянном предметном стекле (или другой твердой фазе). После гибридизации чипы сканируют, используя флуоресцентный сканер для микрочипов. Анализ относительной интенсивности флуоресценции различных генов дает возможность измерения различий в экспрессии генов. Чипы ДНК можно генерировать иммобилизацией предварительно синтезированных олигонуклеотидов на подготовленных стеклянных предметных стеклах или других твердых поверхностях. В данном случае репрезентативные последовательности генов производят и получают с использованием стандартных методов синтеза и очистки олигонуклеотидов. Данные синтезированные последовательности генов комплементарны транскрипту(ам) РНК генов, представляющих интерес (в данном случае генов или геномных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165), и имеют тенденцию к более коротким последовательностям в интервале 25-70 нуклеотидов. В предпочтительном варианте осуществления указанные олигонуклеотиды или полинуклеотиды включают по меньшей мере 9, 18 или 25 оснований последовательности, комплементарной или гибридизующейся по меньшей мере с одной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:19 и комплементарных им последовательностей. Альтернативно, иммобилизованные олигонуклеотиды можно химическим путем синтезировать in situ на поверхности предметного стекла. Синтез олигонуклеотидовin situ включает последовательное добавление соответствующих нуклеотидов к пятнам на микрочипе; пятна, не получающие нуклеотид, защищают во время каждой стадии процесса, используя физические или фактические маскирующие маски. Предпочтительно, когда указанные синтезированные нуклеиновые кислоты представляют собой заблокированные нуклеиновые кислоты. В экспериментах по определению профиля экспрессии на микрочипах РНК-матрицы используют как представляющие профиль транскрипции исследуемых клеток или тканей. Сначала из сравниваемых клеточных популяций или тканей выделяют РНК. Затем каждый образец РНК используют как матрицу для генерации кДНК с флуоресцентной меткой посредством реакции обратной транскрипции. Введение флуоресцентной метки в кДНК можно осуществить методами либо прямого мечения, либо непрямого мечения. В процессе прямого мечения флуоресцентно модифицированные нуклеотиды (например,Cy3- или Cy5-dCTP) инкорпорируют непосредственно в кДНК во время обратной транскрипции. Альтернативно, непрямое мечение можно осуществить инкорпорацией модифицированных аминоаллилом нуклеотидов в процессе синтеза кДНК с последующим конъюгированием красителя сложного эфираN-гидроксисукцинимида в модифицированную аминоаллилом кДНК после завершения реакции обратной транскрипции. Альтернативно, зонд может быть немеченым, но может определяться путем специфического связывания с лигандом, который является меченым либо прямо, либо непрямо. Подходящие метки и методы мечения лигандов (и зондов) известны в области техники и включают, например, радиоактивные метки, которые можно инкорпорировать известными методами (например, ник-трансляцией или воздействием киназ). Другие подходящие метки включают, но без ограничения перечисленным, биотин, флуоресцентные группы, хемилюминесцентные группы (например, диоксетаны, особенно возбужденные диоксетаны), ферменты, антитела и т.п. Для проведения анализа дифференцированной экспрессии гена кДНК, генерированную из различных образцов РНК, метят Су 3. Полученную в результате меченую кДНК очищают для удаления неинкорпорированных нуклеотидов, свободного красителя и остаточной РНК. После очистки образцы меченой кДНК гибридизуют с микрочипом. Жесткость гибридизации определяют рядом факторов во время гибридизации и во время процедуры промывания, включая температуру, ионную силу, длительность времени и концентрацию формамида. Данные факторы приведены, например, в монографии Sambrook etal. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2nd ed., 1989). Микрочип сканируют после гибридизации,используя сканер для флуоресцентных микрочипов. Интенсивность флуоресценции каждого пятна указывает на уровень экспрессии анализируемого гена; яркие пятна соответствуют сильно экспрессирующимся генам, тогда как неяркие пятна указывают на слабую экспрессию. После получения изображений можно проанализировать необработанные данные. Во-первых, из флуоресценции каждого пятна необходимо вычесть фоновую флуоресценцию. Затем данные нормализуют относительно контрольной последовательности, такой как экзогенно добавленные нуклеиновые кислоты (предпочтительно РНК или ДНК) или панели генов домашнего хозяйства, чтобы учесть неспецифическую гибридизацию, несовершенство чипа или вариабельность структуры чипа, мечение кДНК, гибридизацию или промывание. Нормализация данных позволяет сравнить результаты множества анализов.- 20013634 Другой аспект изобретения относится к набору для применения в диагностике рака у пациента согласно способам, представленным в настоящем изобретении, который включает средства измерения уровня; транскрипции генов или геномных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT иSEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165. В предпочтительном варианте осуществления средства измерения уровня транскрипции включают олигонуклеотиды или полинуклеотиды, способные гибридизоваться в жестких или умеренно жестких условиях с продуктами транскрипции гена или геномной последовательности,выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2,SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165. Предпочтительно, когда указанные олигонуклеотиды или полинуклеотиды способны гибридизоваться в жестких или умеренно жестких условиях по меньшей мере с одним из продуктов транскрипции гена или геномной последовательности,выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2,SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165, как представлено вSEQ ID NO:16-SEQ ID NO:19. В одном варианте осуществления указанные олигонуклеотиды или полинуклеотиды включают по меньшей мере 9, 18 или 25 оснований последовательности, комплементарной или гибридизующейся по меньшей мере с одной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:19 и комплементарных им последовательностей. В наиболее предпочтительном варианте осуществления уровень транскрипции определяют методами, выбранными из группы анализа нозерн-блот, ПЦР с использованием обратной транскриптазы, ПЦР в режиме реального времени, защиты РНКазы и микрочипов. В другом варианте осуществления изобретения набор, кроме того, включает средства для получения биологического образца от пациента. Предпочтительным является набор, который далее включает контейнер, который, как наиболее предпочтительно,является пригодным для того, чтобы содержать средства для измерения уровня транскрипции и биологический образец, полученный от пациента, и наиболее предпочтительно, когда он далее включает инструкции по применению и интерпретации результатов, полученных с набором. В предпочтительном варианте осуществления набор включает (а) множество олигонуклеотидов или полинуклеотидов, способных гибридизоваться в жестких или умеренно жестких условиях с продуктами транскрипции по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы,состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6,NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165; (б) контейнер, предпочтительно пригодный для того,чтобы содержать олигонуклеотиды или полинуклеотиды и биологический образец, полученный от пациента, включающий продукты транскрипции, причем олигонуклеотиды или полинуклеотиды могут гибридизоваться в жестких или умеренно жестких условиях с продуктами транскрипции; (в) средства детекции гибридизации стадии (б) и, необязательно, (г) инструкции по применению и интерпретации результатов, полученных с набором. Кроме того, предпочтительно, когда указанные олигонуклеотиды или полинуклеотиды (а) включают в каждом случае по меньшей мере 9, 18 или 25 оснований последовательности, комплементарной или гибридизующейся по меньшей мере с одной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:19 и комплементарных им последовательностей. Набор может также включать другие компоненты, такие как буфер для гибридизации (в котором олигонуклеотиды предназначены для использования в качестве зонда), упакованные в отдельный контейнер. Альтернативно, когда олигонуклеотиды предназначены для использования с целью амплификации целевого участка, набор может включать упакованные в раздельные контейнеры полимеразы и реакционный буфер, оптимизированный для удлинения праймера, опосредованного полимеразой, такого как ПЦР. Предпочтительно, когда указанная полимераза представляет собой обратную транскриптазу. Кроме того, предпочтительно, когда указанный набор далее включает реагент РНКазы. Настоящее изобретение далее представляет способы детекции присутствия полипептида, кодируемого последовательностями указанного гена, в образце, полученном от пациента. Аберрантные уровни экспрессии полипептида среди полипептидов, кодируемых генами или геномными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165, ассоциированы с присутствием рака. Согласно настоящему изобретению пониженный уровень экспрессии указанных полипептидов ассоциирован с присутствием рака. Особенно предпочтительно, когда указанные полипептиды соответствуют по меньшей мере одной из последовательностей аминокислот в полипептидахSEQ ID NO:20-SEQ ID NO:23, транскрибированных с гена септина 9. Можно использовать любой известный в уровне техники метод, применяемый для детекции полипептидов. Данные способы включают, но без ограничения перечисленным, масс-спектрометрию, иммунодиффузию, иммуноэлектрофорез, иммунохимические методы, анализы связывающий агент-лиганд,иммуногистохимические методики, анализы агглютинации и комплемента (например, см. монографиюBasic and Clinical Immunology, Sites and Terr, by ed. AppletonLange, Norwalk, Conn, p. 217-262, 1991,которая включена в виде ссылки). Предпочтительными являются методы иммуноанализа типа связывающий агент-лиганд, включая реакцию антител с эпитопом или эпитопами и конкурентное замещение- 21013634 меченого полипептида или его производного. Ряд вариантов осуществления настоящего изобретения включает использование антител, специфических в отношении полипептида, кодируемого геном или геномной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN,PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165. Особенно предпочтительно, когда данные полипептиды соответствуют по меньшей мере одной из последовательностей аминокислот, представленных вSEQ ID NO:20-SEQ ID NO:23. Данные антитела используют для диагностики рака. В ряде вариантов осуществления продукцию моноклональных или поликлональных антител индуцируют использованием эпитопа, кодируемого полипептидом SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:23, в качестве антигена. Данные антитела можно, в свою очередь,использовать для детекции экспрессируемых полипептидов как маркеров для диагностики рака. Уровни данных присутствующих полипептидов можно количественно оценить принятыми методами. Связывание антитела с полипептидом можно определить и количественно оценить рядом известных в области техники методов, таких как мечение флуоресцентными или радиоактивными лигандами. Изобретение,кроме того, включает наборы для осуществления вышеуказанных способов, причем данные наборы включают антитела, специфические в отношении исследуемых полипептидов. В области техники хорошо известны многочисленные конкурентные и неконкурентные иммуноанализы связывания полипептидов, связывающий агент-лиганд. Антитела, используемые в данных анализах,могут быть немечеными, например как используют в тестах на агглютинацию, или мечеными для применения в широком круге методов анализа. Метки, которые могут быть использованы, включают радионуклиды, ферменты, флуоресцирующие агенты, хемилюминесцентные агенты, субстраты ферментов или кофакторы, ингибиторы ферментов, частицы, красители и т.п. Предпочтительные анализы включают, но без ограничения перечисленным, радиоиммуноанализ (RIA), ферментные иммуноанализы, например твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), флуоресцентные иммуноанализы и т.п. Можно получить поликлональные или моноклональные антитела или их эпитопы для применения в иммуноанализах любым их ряда методов, описанных в области техники. В альтернативном варианте осуществления способа белки можно определить посредством анализа вестерн-блот. Данный анализ является стандартным в области техники; вкратце, белки разделяют посредством электрофореза, например SDS-PAGE. Затем разделенные белки переносят на подходящую мембрану (или бумагу), например нитроцеллюлозу, сохраняющую пространственное разделение, достигаемое электрофорезом. Затем мембрану инкубируют с блокирующим агентом для связывания оставшихся липких частей мембраны, обычно используемые агенты включают родовой белок (например, молочный белок). Затем добавляют антитело, специфическое в отношении белка, представляющего интерес, причем указанное антитело является меченым, например красителями или ферментными средствами(например, щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена). Затем определяют положение антитела на мембране. В альтернативном варианте осуществления способа белки можно определить посредством иммуногистохимических методов (использования антител к зонд-специфическим антигенам в образце). Указанный анализ является стандартным в области техники, причем определение антигенов в тканях известно как иммуногистохимический метод, тогда как определение в культивируемых клетках обычно называют иммуноцитохимическим методом. Вкратце, первичное антитело следует определять по связыванию со своим специфическим антигеном. Комплекс антитело-антиген затем связывается вторичным конъюгированным с ферментом антигеном. В присутствии необходимого субстрата и хромогена связанный фермент определяют по цветным отложениям в центрах связывания антитела с антигеном. Существует широкий круг подходящих типов образцов, аффинность типа антиген-антитело, типы антител и методы усиления детекции. Таким образом, оптимальные условия для иммуногистохимической или иммуноцитохимической детекции должны определяться компетентным специалистом в области техники для каждого отдельного случая. Одним подходом к получению антител к полипептиду является выбор и получение последовательности аминокислот всего или части полипептида, химический синтез последовательности аминокислот и ее инъекция подходящему животному, как правило кролику или мыши (см. статью Milstein and KohlerTechniques. 73: 1-46, by ed. Langone and Banatis, Academic Press, 1981, которые включены в виде ссылки во всей своей полноте). Методы получения полипептидов и их эпитопов включают, но без ограничения перечисленным, химический синтез, технологии рекомбинантной ДНК или выделение из биологических образцов. На последней стадии способа определяют диагноз пациента, в котором пониженная экспрессия (по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2 SARM1, VTN, PRDM6, NR2E1, FAT иSEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165), является показателем присутствия рака. Термин пониженная экспрессия будут использовать для обозначения экспрессии на определяемом уровне, который меньше, чем предварительно определенная точка отсечения, которая может быть выбрана из средней, срединной или- 22013634 оптимизированной пороговой величины. Другой аспект изобретения представляет набор для применения при диагностике рака у пациента согласно способам, представленным в настоящем изобретении, включающий средства для детекции полипептидов по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN PRDM6, NR2E1,FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165. Предпочтительно, когда последовательность указанных полипептидов представлена в SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:23, средства для детекции полипептидов предпочтительно включают антитела, производные антител или фрагменты антител. Наиболее предпочтительно,когда полипептиды определяют посредством вестерн-блоттинга с использованием меченого антитела. В другом варианте осуществления изобретения набор далее включает средства получения биологического образца пациента. Предпочтительным является набор, который далее включает контейнер, подходящий для содержания средств детекции полипептидов в биологическом образце пациента, и наиболее предпочтительно, когда он далее включает инструкции по применению и интерпретации результатов, полученных с помощью набора. В предпочтительном варианте осуществления набор включает (а) средства для детекции полипептидов по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTNPRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165; (б) контейнер, подходящий для содержания указанных средств и биологического образца пациента, включающего полипептиды, причем средства могут образовывать комплексы с полипептидами; (в) средства для детекции комплексов (б) и, необязательно,(г) инструкции по применению и интерпретации результатов, полученных с помощью набора. Предпочтительно, когда указанные средства для детекции полипептидов по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из септина 9 (включая все варианты его транскриптов), FOXL2, SARM1, VTN PRDM6, NR2E1, FAT и SEQ ID NO:160-SEQ ID NO:165, являются специфическими в отношении по меньшей мере одной из полипептидных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:23. Набор может также включать другие компоненты, такие как буферы или растворы, пригодные для блокирования, промывания или покрытия, упакованные в отдельном контейнере. Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения представляют новое применение анализа уровней и/или типов метилирования в указанных последовательностях, которое обеспечивает точное определение, характеризацию и/или лечение печеночных и/или колоректальных клеточных пролиферативных нарушений. Ранняя детекция рака непосредственно связана с прогнозом заболевания, и раскрытый способ, таким образом, дает возможность лечащему врачу и пациенту принять более подходящие и в большей степени основанные на информации решения относительно лечения. Дальнейшие усовершенствования Настоящее изобретение представляет новые варианты применения геномной последовательностиSEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167. Дополнительные варианты осуществления представляют модифицированные варианты SEQ ID NO:1SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167, а также олигонуклеотиды и/или ПНК-олигомеры для анализа типов метилирования цитозина в SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167. Цель изобретения включает анализ состояния метилирования одного или более динуклеотидовCpG по меньшей мере в одной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167 и комплементарных им последовательностей. Раскрытое изобретение представляет обработанные нуклеиновые кислоты, выделенные из геномных SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167, причем обработка подходит для превращения по меньшей мере одного неметилированного цитозинового основания геномной последовательности ДНК в урацил или другое основание, которое заметно отличается от цитозина в плане гибридизации. Рассматриваемые геномные последовательности могут включать одно или более следующих друг за другом положений метилированных CpG. Указанная обработка предпочтительно включает применение реагента, выбранного из группы, состоящей из бисульфита, сульфита водорода, дисульфита и их комбинаций. В предпочтительном варианте осуществления изобретения данное изобретение представляет неприродную модифицированную нуклеиновую кислоту, включающую последовательность длиной по меньшей мере 16 следующих друг за другом нуклеотидных оснований последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ IDNO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203. В следующих предпочтительных вариантах осуществления изобретения длина указанной нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 50, 100, 150, 200, 250 или 500 пар оснований сегмента последовательности нуклеиновой кислоты,описанной в SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203. Особенно предпочтительной является молекула нуклеиновой кислоты,- 23013634 которая не является идентичной или комплементарной всей или части последовательностейSEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203, но не SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167 или других природных ДНК. Предпочтительно, когда указанная последовательность включает по меньшей мере один динуклеотид CpG, TpA или СрА и комплементарные им последовательности. ПоследовательностиSEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 представляют неприродные модифицированные варианты нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ IDNO:167, в которых модификация каждой геномной последовательности приводит в результате к синтезу нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, которая уникальна и отличается от указанной геномной последовательности следующим образом. Для каждой смысловой нити геномной ДНК, напримерSEQ ID NO:1, описано четыре конвертированных варианта. Первый вариант, в котором "С" превращают в "Т", но "CpG" остается "CpG" (т.е. соответствует случаю, в котором для геномной последовательности все остатки "С" динуклеотидных последовательностей CpG являются метилированными и, таким образом, неконвертированными); второй вариант раскрывает комплемент описанной геномной последовательности ДНК (т.е. антисмысловую нить), в которой "С" превращают в "Т", но "CpG" остается "CpG"(т.е. соответствует случаю, в котором все остатки "С" динуклеотидных последовательностей CpG являются метилированными и, таким образом, неконвертированными). Конвертированные последовательности с "повышенным уровнем метилирования" SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167 соответствуют SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:30-SEQ IDNO:31, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:185. Представлен третий химически конвертированный вариант каждой геномной последовательности, в котором "С" превращают в "Т" для всех остатков "С", включая остатки динуклеотидных последовательностей "CpG" (т.е. соответствуют случаю, в котором для геномных последовательностей все остатки "С" динуклеотидных последовательностей CpG являются неметилированными); последний химически конвертированный вариант каждой последовательности раскрывает комплемент описанной геномной последовательности ДНК (т.е. антисмысловую нить), в которой "С" превращают в "Т" для всех остатков "С", включая остатки динуклеотидных последовательностей "CpG" (т.е. соответствует случаю, в котором для комплемента (антисмысловой нити) каждой геномной последовательности все остатки "С" динуклеотидных последовательностей CpG являются неметилированными). Конвертированные последовательности с пониженным уровнем метилирования SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167 соответствуют SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:186-SEQ ID NO:203. Важно, что ранее последовательности нуклеиновой кислоты и молекулы, соответствующиеSEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203, не включали или не связывали в детекцией, классификацией или лечением клеточных пролиферативных нарушений. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления изобретение далее представляет олигонуклеотиды или олигомеры, предназначенные для применения в представленных в изобретении способах детекции состояния метилирования цитозина в геномной или обработанной (химически модифицированной) ДНК, соответствующиеSEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167,SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31,SEQ ID NOD:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NOD:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203. Указанные олигонуклеотидные или олигомерные нуклеиновые кислоты представляют новое диагностическое средство. Указанный олигонуклеотид или олигомер включает последовательность нуклеиновой кислоты длиной по меньшей мере девять (9) нуклеотидов,которая идентична, гибридизуется в умеренно жестких или жестких условиях (как определено выше в данном контексте) с обработанной последовательностью нуклеиновой кислоты, соответствующейSEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 и/или комплементарным им последовательностям, или с геномной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167 и/или комплементарным им последовательностям. Таким образом, настоящее изобретение включает молекулы нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотиды и молекулы пептид-нуклеиновой кислоты (ПНК) (ПНК-олигомеры, которые гибридизуются в умеренно жестких и/или жестких условиях гибридизации со всей последовательностью или ее частью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33,- 24013634SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 или их комплементов. Особенно предпочтительной является молекула нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в умеренно жестких и/или жестких условиях гибридизации со всей последовательностью или ее частьюSEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203, но не SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167 или другой геномной ДНК человека. Идентичная или гибридизующаяся часть гибридизующихся нуклеиновых кислот, как правило, имеет длину по меньшей мере 9, 16, 20, 25, 30 или 35 нуклеотидов. Однако более длинные молекулы имеют изобретательское применение и, таким образом, входят в объем настоящего изобретения. Предпочтительно, когда гибридизующаяся часть представленных в изобретении гибридизующихся нуклеиновых кислот по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, или на 100% идентична последовательности или части последовательности, выбранной из группы, состоящей изSEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167,SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 или их комплементов. Гибридизующиеся нуклеиновые кислоты описанного в данном контексте типа можно использовать,например, в качестве праймера (например, ПЦР-праймера) или диагностического и/или прогностического зонда или праймера. Предпочтительно, когда гибридизацию олигонуклеотидного зонда с образом нуклеиновой кислоты проводят в жестких условиях и зонд на 100% идентичен целевой последовательности. Дуплекс нуклеиновой кислоты или стабильность гибрида выражают как температуру плавления илиTm, которая представляет собой температуру, при которой зонд диссоциирует с ДНК-мишени. Данную температуру плавления используют для определения требуемых условий жесткости. Для последовательностей-мишеней, которые связаны и в существенной мере идентичны соответствующей последовательности SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167 (такой как аллельные варианты и SNP), и не идентичны, эффективно сначала установить самую низкую температуру, при которой происходит только гомологичная гибридизация при определенной концентрации соли (например, SSC или SSPE). Затем, допуская, что 1% ошибочных спариваний дает в результате снижение Tm на 1 С, температуру конечного промывания в реакции гибридизации снижают соответствующим образом (например, если рассматривают последовательности, имеющие идентичность с зондом 95%, конечную температуру промывания снижают на 5 С). Практически изменение Tm может составлять от 0,5 до 1,5 С на 1% ошибочных спариваний. Примеры представленных в изобретении олигонуклеотидов длиной X (в нуклеотидах), как показано с помощью положений полинуклеотидов относительно, например, SEQ ID NO:1, включают те, которые соответствует группам (смысловым и антисмысловым группам) последовательно перекрывающихся олигонуклеотидов длиной X, в которых олигонуклеотиды в каждой последовательно перекрывающейся группе (соответствующей заданному значению X) определяют как ограниченную группу олигонуклеотидов Z из положений нуклеотидовX равно общей длине (в нуклеотидах) каждого олигонуклеотида в группе (например, Х=20 для группы последовательно перекрывающихся 20-меров) и число (Z) последовательно перекрывающихся олигомеров длиной X для заданнойSEQ ID NO длины Y равно Y-(X-1). Например, Z=219909-19=219890 как для смысловой, так и для антисмысловой групп SEQ ID NO:1, в которой Х=20. Предпочтительно, когда группа ограничена теми олигомерами, которые включают по меньшей мере один динуклеотид CpG, TpG или СрА. Примеры представленных в изобретении 20-мерных олигонуклеотидов включают следующую группу из 219890 олигомеров (и комплементарную им антисмысловую группу), указанных положениями полинуклеотидов относительно SEQ ID NO:1:1-20, 2-21, 3-22, 4-23, 5-24 и 219890-219909. Предпочтительно, когда группа ограничена теми олигомерами, которые включают по меньшей мере один динуклеотид CpG, TpG или СрА. Аналогично, примеры представленных в изобретении 25-мерных олигонуклеотидов включают следующую группу 219885 олигомеров (и комплементарную им антисмысловую группу), указанных по положениям полинуклеотидов относительно SEQ ID NO:1:1-25, 2-26, 3-27, 4-28, 5-29 и 219885-219909. Предпочтительно, когда группа ограничена теми олигомерами, которые включают по меньшей мере один динуклеотид CpG,TpG или СрА.- 25013634 Настоящее изобретение охватывает для каждой SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ IDNO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 (смысловой и антисмысловой) множество последовательно перекрывающихся групп олигонуклеотидов или модифицированных олигонуклеотидов длины X, где, например, X=9, 10, 17, 20, 22, 23, 25, 27, 30 или 35 нуклеотидов. Олигонуклеотиды или олигомеры, соответствующие настоящему изобретению, составляют эффективные инструменты, используемые для установления генетических и эпигенетических параметров геномных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167. Предпочтительные группы данных олигонуклеотидов или модифицированных олигонуклеотидов длиной X представляют собой последовательно перекрывающиеся группы олигомеров, соответствующих SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ IDNO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 (и их комплементам). Предпочтительно,когда указанные олигомеры включают по меньшей мере один динуклеотид CpG, TpG или СрА. Особенно предпочтительно, когда олигонуклеотиды или олигомеры, соответствующие настоящему изобретению, представляют собой те, в которых цитозин динуклеотидных последовательностей CpG(или соответствующих конвертированных динуклеотидов TpG или СрА) находится в средней трети олигонуклеотида, т.е. когда длина олигонуклеотида составляет, например, 13 оснований, динуклеотид CpG,TpG или СрА находится в положении от пятого до девятого нуклеотида от 5'-конца. Олигонуклеотиды, представленные в изобретении, могут быть также модифицированы химическим связыванием олигонуклеотида с одной или более групп или конъюгатов с целью повышения активности,стабильности или уровня детекции олигонуклеотида. Данные группы или конъюгаты включают хромофоры, флуорофоры, липиды, такие как холестерин, холевую кислоту, тиоэфир, алифатические цепи,фосфолипиды, полиамины, полиэтиленгликоль (ПЭГ), пальмитиловые группы и другие, как описано,например, в патентах CIIIA5514758, 5565552, 5567810, 5574142, 5585481, 5587371, 5597696 и 5958773. Зонды также могут находиться в форме ПНК (пептид-нуклеиновой кислоты), которая обладает особенно предпочтительными свойствами спаривания. Таким образом, олигонуклеотид может включать другие присоединенные группы, такие как пептиды, и может включать расщепляющие агенты, стимулируемые гибридизацией (см. статью Krol et al., BioTechniques, 6: 958-976, 1988) или интеркалирующие агенты (см. статью Zon, Pharm. Res., 5: 539-549, 1988). В данном случае олигонуклеотид может быть конъюгирован с другой молекулой, например, хромофором, флуорофором, пептидом, поперечносшивающим агентом, стимулируемым гибридизацией, транспортным агентом, расщепляющим агентом,стимулируемым гибридизацией и т.п. Олигонуклеотид может также включать по меньшей мере один признанный в области техники модифицируемый сахар и/или группу основания или может включать модифицированный скелет или неприродную межнуклеозидную связь. Олигонуклеотиды или олигомеры, представленные в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, как правило, используют в "группах", которые включают по меньшей мере один олигомер для анализа каждого из динуклеотидов CpG геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ IDNO:167 и комплементарных им последовательностей или соответствующих динуклеотидов CpG, TpG или СрА в последовательности обработанных нуклеиновых кислот, соответствующих SEQ ID NO:10SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:42-SEQ IDNO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 и комплементарных им последовательностей. Однако предполагают, что ввиду экономических или других факторов может быть предпочтительным анализировать ограниченную выборку динуклеотидов CpG в указанных последовательностях и соответствующим образом изменять содержание группы олигонуклеотидов. Вследствие этого в конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение представляет группу по меньшей мере из двух (2) олигонуклеотидов и/или ПНК-олигомеров, используемых для детекции состояния метилирования цитозина в обработанной геномной ДНК (SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203) или в геномной ДНК (SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167 и комплементарных им последовательностях). Данные зонды дают возможность диагностики, классификации и/или терапии генетических и эпигенетических параметров печеночных и/или колоректальных клеточных пролифератйвных нарушений. Группу олигомеров можно также использовать для детекции полиморфизмов по одному нуклеотиду (SNPs) в обработанной геномной ДНК (SEQ ID NO:10-SEQ IDNO:15 SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:4.-SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203) или в ге- 26013634 номной ДНК (SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167 и комплементарных им последовательностях). В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере один и более предпочтительно все члены группы олигонуклеотидов связаны с твердой фазой. В других вариантах осуществления настоящее изобретение представляет группу по меньшей мере из двух (2) олигонуклеотидов, которые используют в качестве "праймерных" олигонуклеотидов для амплификации последовательностей ДНК одной из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ IDNO:50-SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 и комплементарных им последовательностей или их сегментов. Предусматривают, что олигонуклеотиды могут составлять весь или часть "ряда" "чипа ДНК" (т.е. расположения различных олигонуклеотидов и/или ПНК-олигомера, связанных с твердой фазой). Данный ряд различных олигонуклеотидных и/или ПНК-олигомерных последовательностей можно охарактеризовать, например, тем, что он расположен на твердой фазе в форме прямоугольной или гексагональной решетки. Твердофазная поверхность может состоять из силикона, стекла, полистирола, алюминия, стали,железа, меди, никеля, серебра или золота. Можно также использовать нитроцеллюлозу, а также пластики, такие как нейлон, который может находиться в форме пеллет или также в виде полимерных матриц. Обзор предшествующего уровня техники в области изготовления олигомерных рядов можно подобрать в специальном издании Natur Genetics (Nature Genetics Supplement, v. 21, January 1999) и в цитированной в нем литературе. Зонды с флуоресцентной меткой часто используют для сканирования рядов иммобилизованной ДНК. Простое присоединение красителей Су 3 и Су 5 к 5'-О специфического зонда особенно подходит для флуоресцентных меток. Детекцию флуоресценции гибридизованных зондов можно осуществить, например, с помощью конфокального микроскопа. Красители Су 3 и Су 5, кроме многих других,являются коммерчески доступными. Предусматривают также, что олигонуклеотиды или их определенные последовательности могут составлять полностью или частично "действительный ряд", в котором олигонуклеотиды или их определенные последовательности используют, например, как "спецификаторы" в качестве части или в комбинации с разнородной популяцией уникально меченых зондов для анализа сложной смеси аналитов. Данный метод, например, описан в US 2003/0013091 (США 09/898743, опубликовано 16 января 2003 г.). В данных методах генерируют достаточно меток, так что каждая нуклеиновая кислота в сложной смеси (т.е. каждый аналит) может быть уникально связана уникальной меткой и, таким образом, определена (каждую метку непосредственно подсчитывают, что в результате дает цифровое показание для каждой молекулярной группы в смеси). Особенно предпочтительно, когда олигомеры, представленные в изобретении, используют по меньшей мере для одного из следующего: выявление, выявление и дифференцировка между или среди подклассов, диагностика, прогноз, лечение, мониторирование печеночных и/или колоректальных клеточных пролиферативных нарушений. Это осуществляют при использовании указанных групп для выявления или выявления и дифференцировки одного или более из следующих классов тканей: колоректальная карцинома, аденома толстой кишки, воспалительная ткань толстой кишки, дисплазия 2-й степени,аденома толстой кишки менее 1 см, дисплазия 3-й степени, аденома толстой кишки более 1 см, здоровая ткань, отличная от толстой кишки, и нераковая ткань толстой кишки. Особенно предпочтительными являются группы олигомеров, соответствующие примерам. В наиболее предпочтительном варианте осуществления способа определяют присутствие или отсутствие клеточного пролиферативного нарушения, наиболее предпочтительно неопластическую клеточную пролиферацию или ее дифференцировку из доброкачественных нарушений. Этого достигают посредством анализа статуса метилирования по меньшей мере одной целевой последовательности,включающей по меньшей мере одно положение CpG, причем указанная последовательность включает или гибридизуется в жестких условиях по меньшей мере с 16 следующими друг за другом нуклеотидами последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167 и их комплементов. Настоящее изобретение далее представляет способ установления генетических и/или эпигенетических параметров геномной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159SEQ ID NO:167, в организме пациента посредством анализа метилирования цитозина и полиморфизмов по одному нуклеотиду. Указанные способы заключаются в контактировании нуклеиновой кислоты,включающей SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159-SEQ ID NO:167,в биологическом образце, полученном от данного пациента, по меньшей мере с одним реагентом или серией реагентов, причем указанный реагент или серия реагентов дают возможность определить различия между метилированными и неметилированными динуклеотидами CpG в целевой нуклеиновой кислоте.- 27013634 В предпочтительном варианте осуществления указанный способ включает следующие стадии. На первой стадии получают образец ткани, предназначенный для анализа. Источником может быть любой подходящий источник, такой как клеточные линии, гистологические срезы, биоптаты, ткань, заключенная в парафин, жидкости тела, кал, истечения из толстой кишки, моча, плазма крови, сыворотка крови, цельная кровь, выделенные клетки крови, клетки, выделенные из крови, и все их возможные комбинации. Предпочтительно, когда указанными источниками ДНК являются кал или жидкости тела, выбранные из группы, состоящей из истечений из толстой кишки, мочи, плазмы крови, сыворотки крови,цельной крови, выделенных клеток крови, клеток, выделенных из крови. Затем геномную ДНК выделяют из образца. Геномную ДНК можно выделит любыми средствами,стандартными в области техники, включая использование коммерчески доступных наборов. Вкратце,когда ДНК, представляющая интерес, инкапсулирована в клеточной мембране, биологический образец необходимо разрушить и лизировать ферментативными, химическими или механическими средствами. Раствор ДНК затем можно очистить от белков и других примесей, например, расщеплением протеинкиназой K. Затем геномную ДНК выделяют из раствора. Это можно осуществить с помощью ряда методов,включая высаливание, экстракцию органическими материалами или связывание ДНК с твердофазным носителем. На выбор метода будет влиять ряд факторов, в том числе время, стоимость и необходимое количество ДНК. Когда образец ДНК не заключен в мембране (например, циркулирующая ДНК из образца крови),можно использовать методы, стандартные в области техники, предназначенные для выделения и/или очистки ДНК. Данные методы включают использование реагента, разлагающего белок, например хаотропной соли, например гуанидина гидрохлорида или мочевины, или детергента, например додецилсульфата натрия (SDS), цианогенбромида. Альтернативные методы включают, но без ограничения перечисленным, осаждение этанолом или осаждение пропанолом, вакуумную концентрацию в числе других с помощью центрифуги. Компетентный специалист в области техники может также использовать устройства, такие как фильтровальные устройства, ультрафильтрацию, поверхности мембран из кремнезема,магнитные частицы, полистироловые частицы, положительно заряженные частицы и положительно заряженные мембраны, заряженные мембраны, заряженные поверхности, заряженные переключающие мембраны, заряженные переключающие поверхности. После экстракции нуклеиновых кислот геномную двунитевую ДНК используют для анализа. На второй стадии способа образец геномной ДНК обрабатывают таким образом, что цитозиновые основания, которые являются неметилированными в 5'-положении, превращают в урацил, тимин или другое основание, которое отличается от цитозина в отношении гибридизационного поведения. Это следует понимать как "предварительную обработку" или "обработку" в данном контексте. Предпочтительно, когда этого достигают посредством обработки бисульфитным реагентом. Термин"бисульфитный реагент" относится к реагенту, включающему бисульфит, дисульфит, сульфит водорода или их комбинации, используемые, как описано в данном контексте, для определения различий между метилированными и неметилированными динуклеотидными последовательностями CpG. Методы данной обработки известны в области техники (например, PCTVEP2004/011715, которая включена в виде ссылки во всей своей полноте). Предпочтительно, когда обработку бисульфитом проводят в присутствии денатурирующих растворителей, таких как, но без ограничения перечисленным, н-алкиленгликоль, в частности диметиловый эфир диэтиленгликоля (DME), или в присутствии диоксана или производных диоксана. В предпочтительном варианте осуществления денатурирующие растворители используют в концентрациях от 1 до 35% (об./об.). Предпочтительно также, когда реакцию с бисульфитом проводят в присутствии поглотителей, таких как, но без ограничения перечисленным, хромановые производные, например 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман 2-карбоновая кислота или тригидроксибензойная кислота или ее производные, например галловая кислота (см. РСТ/ЕР 2004/011715, которая включена в виде ссылки во всей своей полноте). Бисульфитное превращение предпочтительно проводят при температуре реакции от 30 до 70 С, причем температуру повышают более чем до 85 С на короткие периоды времени в процессе реакции (см. РСТ/ЕР 2004/011715, которая включена в виде ссылки во всей своей полноте). Предпочтительно, когда обработанную бисульфитом ДНК очищают перед количественной оценкой. Это можно осуществить любыми средствами, известными в области техники, такими как, но без ограничения перечисленным, ультрафильтрация, предпочтительно проводимая с помощью колонок Microcon (производимых фирмой Millipore). Очистку осуществляют согласно модифицированному протоколу изготовителя (см. РСТ/ЕР 2004/011715, которая включена в виде ссылки во всей своей полноте). На третьей стадии способа амплифицируют фрагменты обработанной ДНК, используя наборы праймерных олигонуклеотидов, соответствующих настоящему изобретению, и фермента для амплификации. Амплификацию нескольких сегментов ДНК проводят одновременно в одной и той же реакционной емкости. Как правило, амплификацию осуществляют с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Предпочтительно, когда длина указанных продуктов амплификации составляет 100-2000 пар оснований, набор праймерных олигонуклеотидов включает по меньшей мере два олигонуклеотида, которые обратно комплементарны, идентичны или гибридизуются в жестких или очень жестких условиях с- 28013634 сегментом по меньшей мере из 16 пар оснований последовательностей одной из SEQ ID NO:10-SEQ IDNO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 и комплементарных им последовательностей. В альтернативном варианте осуществления способа статус метилирования предварительно выбранных положений CpG по меньшей мере в одной из последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:159SEQ ID NO:167, можно определить при использовании специфических в отношении метилирования праймерных олигонуклеотидов. Данный метод (MSP) описан в патенте США 6265171, выданныйHerman. Использование праймеров, специфических в отношении статуса метилирования, для амплификации обработанной бисульфитом ДНК дает возможность определения различий между метилированными и неметилированными нуклеиновыми кислотами. Пары праймеров для MSP включают по меньшей мере один праймер, который гибридизуется с обработанным бисульфитом динуклеотидом CpG. Вследствие этого последовательность указанных праймеров включает по меньшей мере один динуклеотид CpG. Праймеры для MSP, специфические в отношении неметилированной ДНК, включают "Т" в положении С-положения в CpG. Предпочтительно, вследствие этого, когда требуется, чтобы последовательность оснований данных праймеров включала последовательность, имеющую длину по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая гибридизуется с обработанной последовательностью нуклеиновой кислоты, соответствующей одной из SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ IDNO:31, SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:168-SEQ ID NO:203 и комплементарным им последовательностям, причем последовательность оснований данных олигомеров включает по меньшей мере один динуклеотид CpG. Следующий предпочтительный вариант осуществления способа включает использование блокирующих олигонуклеотидов (анализ HeavyMethyl). Использование блокирующих олигонуклеотидов описано в статье Yu etal., BioTechniques 23:714-720, 1997. Блокирующие олигонуклеотиды зондов гибридизуются с обработанной бисульфитом нуклеиновой кислотой конкурентно в ПЦР-праймерами. ПЦР-амплификацию нуклеиновой кислоты заканчивают в 5'-положении блокирующего зонда, так что амплификация нуклеиновой кислоты подавляется, когда присутствует последовательность, комплементарная блокирующему зонду. Можно разработать зонды для гибридизации с обработанной бисульфитом нуклеиновой кислотой, специфическим в зависимости от статуса метилирования образом. Например, для детекции метилированных нуклеиновых кислот в популяции неметилированных нуклеиновых кислот подавление амплификации нуклеиновых кислот, которые являются неметилированными в рассматриваемом положении, следует осуществлять при использовании блокирующих зондов, включающих "СрА" или "ТрА" в рассматриваемом положении, в противоположность "CpG", если требуется подавление амплификации метилированных нуклеиновых кислот. Для методов ПЦР с использованием блокирующих олигонуклеотидов эффективное нарушение амплификации, опосредованной полимеразой, требуется, чтобы блокирующие олигонуклеотиды не элонгировались полимеразой. Предпочтительно, когда этого достигают при использовании блокаторов, которые представляют собой 3'-дезоксиолигонуклеотиды или олигонуклеотиды, дериватизированные в 3'-положении группой, отличной от "свободного" гидроксила. Например, 3'-О-ацетилолигонуклеотиды представляют собой предпочтительный класс блокирующей молекулы. Кроме того, следует предотвратить опосредованное полимеразой разложение блокирующих олигонуклеотидов. Предпочтительно, когда данное предотвращение включает либо использование полимеразы с отсутствием активности 5'-3'-экзонуклеазы, либо применение модифицированных блокирующих олигонуклеотидов, имеющих, например, тиоатные мостики на 5'-концах, которые делают блокирующую молекулу устойчивой к нуклеазе. Конкретные варианты применения могут не требовать 5'-модификаций блокатора. Например, если сайты связывания блокатора и праймера перекрываются, предотвращая тем самым связывание праймера (например, при избытке блокатора), разложение блокирующего олигонуклеотида будет в значительной мере предотвращено. Это обусловлено тем, что полимераза не будет удлинять праймер в направлении и через (в 5'-3' направлении) блокатор способом, который в норме приводит к разложению гибридизованного блокирующего олигонуклеотида. Особенно предпочтительный вариант осуществления блокатора/ПЦР для целей настоящего изобретения и осуществляемый в данном контексте включает применение олигомеров пептид-нуклеиновой кислоты (ПНК) как блокирующих олигонуклеотидов. Данные блокирующие олигомеры ПНК идеально подходят, поскольку они не разлагаются и не удлиняются полимеразой. Предпочтительно, вследствие этого, когда требуется, чтобы последовательность оснований данных блокирующих олигонуклеотидов включала последовательность длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов,которая гибридизуется с обработанной последовательностью нуклеиновой кислоты, соответствующей одной из SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31 SEQID NO:42-SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:38-SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:168SEQ ID NO:203 и комплементарным им последовательностям, причем последовательность оснований данных олигонуклеотидов включает по меньшей мере один динуклеотид CpG, TpG или СрА.- 29013634 Фрагменты, полученные посредством амплификации, могут нести непосредственно или опосредованно определяемую метку. Предпочтительными являются метки в форме флуоресцентных меток, радионуклидов или определяемых фрагментов молекул, имеющих характерную массу, которую можно определить с помощью масс-спектрометра. Указанные метки представляют собой метки массы, предпочтительно когда меченые продукты амплификации имеют один положительный или отрицательный сетевой заряд, обеспечивающий улучшенную определяемость с использованием масс-спектрометра. Детекцию можно осуществить или визуализировать посредством, например, лазерной десорбции с использованием матрицы/ионизационной масс-спектрометрии (MALDI) или при использовании электроспрей масс-спетрометрии (ESI). Лазерная десорбция с использованием матрицы/ионизационная масс-спектрометрия (MALDI-TOF) представляет собой очень эффективную разработку анализа биомолекул (см. статью KarasHillenkamp,Anal Chem., 60: 2299-301, 1988). Аналит погружают в поглощающую свет матрицу. Матрицу испаряют с помощью коротких лазерных импульсов, перенося, таким образом, молекулу аналита в паровую фазу нефрагментированным образом. Аналит ионизируют при столкновениях с молекулами матрицы. Приложенное напряжение ускоряет ионы в трубке для полета с отсутствием поля. Вследствие разных масс ионы ускоряются в различной степени. Более мелкие ионы достигают детектора быстрее, чем более крупные. MALDI-TOF-спектрометрия вполне подходит для анализа пептидов и белков. Анализ нуклеиновых кислот до некоторой степени более труден (см. статью GutBeck, Current Innnovations and FutureTrends, 1:147-57, 1995). Чувствительность в плане анализа нуклеиновых кислот приблизительно в 100 раз ниже, чем пептидов, и уменьшается непропорционально увеличению размера фрагмента. Более того, для нуклеиновых кислот, имеющих скелет с множеством отрицательных зарядов процесс ионизации посредством матрицы значительно менее эффективен. При MALDI-TOF-спектрометрии выбор матрицы играет в высшей степени важную роль. Для разложения пептидов найден ряд очень эффективных матриц, которые дают очень мелкую кристаллизацию. В настоящее время имеется несколько чувствительных матриц для ДНК, однако разница в чувствительности между пептидами и нуклеиновыми кислотами не сократилась. Однако данную разницу в чувствительности можно уменьшить путем химической модификации ДНК таким образом, чтобы она стала более близкой к пептиду. Например, фосфоротиоатные нуклеиновые кислоты, в которых обычные фосфаты скелета замещены тиофосфатами, можно превратить в ДНК с нейтральным зарядом, используя простые химические методы алкилирования (см. статью GutBeck,Nucleic Acids Res., 23: 1367-73, 1995). Связывание заряженной метки с данной модифицированной ДНК приводит в результате к повышению чувствительности MALDI-TOF до того же уровня, который показан для пептидов. Следующим преимуществом мечения зарядом является повышенная стабильность анализа в отношении примесей, которая делает детекцию немодифицированных субстратов более сложной. На четвертой стадии способа продукты амплификации, полученные на третьей стадии способа, анализируют с целью установления статуса метилирования динуклеотидов CpG перед обработкой. В вариантах осуществления, когда продукты амплификации получают посредством MSPамплификации, присутствие или отсутствие продукта амплификации само по себе показывает состояние метилирования положений CpG, покрываемых праймером, в соответствии с последовательностями оснований указанного праймера. Амплификации, полученные посредством как стандартной, так и специфической в отношении метилирования ПЦР, можно далее анализировать с помощью обоснованных методов, таких как, но без ограничения перечисленным, технология чипов и технологии на основе зондов, а также посредством таких методов, как секвенирование и направляемое матрицей удлинение. В одном варианте осуществления способа продукты амплификации, синтезированные на третье стадии, последовательно гибридизуют с чипом или группой олигонуклеотидов и/или ПНК-зондов. В данном контексте гибридизация происходит следующим образом: набор зондов, используемый во время гибридизации предпочтительно состоит по меньшей мере из 2 олигонуклеотидов или ПНК-олигомеров; в способе продукты амплификации служат в качестве зондов, которые гибридизуются с олигонуклеотидами,предварительно связанными с твердой фазой; затем негибридизованные фрагменты удаляют, указанные олигонуклеотиды включают по меньшей мере одну последовательность оснований, имеющую длину по меньшей мере 9 нуклеотидов, которые обратно комплементарны или идентичны сегменту последовательностей оснований, описанных в настоящем Перечне последовательностей, и указанный сегмент включает по меньшей мере один динуклеотид CpG, TpG или СрА. Гибридизующаяся часть гибридизующихся нуклеиновых кислот, как правило, составляет в длину по меньшей мере 9, 15, 20, 25, 30 или 35 нуклеотидов. Однако более длинные молекулы имеют изобретательское применение, и, таким образом,они входят в объем настоящего изобретения. В предпочтительном варианте осуществления данный динуклеотид находится в центральной трети олигомера. Например, когда олигомер включает один динуклеотид CpG, предпочтительно указанный динуклеотид является пятым-девятым нуклеотидом от 5'-конца 13-мера. Имеется один олигонуклеотид для анализа каждого динуклеотида CpG в последовательности, выбранной из группы, состоящей из