Мутации рецептора эпидермального фактора роста

013617 Область, к которой относится изобретение Настоящая заявка относится к мутациям рецептора эпидермального фактора роста ("EGFr"), к полинуклеотидам, кодирующим мутантные EGFr полипептиды, к векторам, содержащим эти полипептиды,клеткам, экспрессирующим эти полипептиды, и антителам, которые связываются с этими полипептидами. Настоящая заявка относится также к мутациям фосфатидилинозит-3-киназы ("PI3K"), к полинуклеотидам, кодирующим мутантные PI3K полипептиды, к векторам, содержащим эти полинуклеотиды, и к антителам, которые связываются с этими полипептидами. Настоящая заявка также относится к мутациям В-Raf, к полинуклеотидам, кодирующим мутантные В-Raf полипептиды, к векторам, содержащим эти полипептиды, клеткам, экспрессирующим эти полипептиды, и антителам, которые связываются с этими полипептидами. Настоящая заявка относится также к способам диагностики рака; способам лечения рака с применением соединений, реакционноспособных (реактивных) в отношении мутантных EGFr полипептидов, мутантных PI3K полипептидов, мутантных В-Raf полипептидов; и к способам и наборам для прогнозирования применимости анти-EGFr специфических связывающих агентов, анти-PI3K специфических связывающих агентов, анти-В-Raf специфических связывающих агентов при лечении опухолей. Предпосылки создания изобретения Некоторые применения моноклональных антител в терапии рака основаны на способности антитела специфически доставлять к раковым тканям цитотоксические эффекторные функции, такие как повышающие иммунитет изотипы, токсины или лекарства. Альтернативным методом является применение антител для того, чтобы непосредственно влиять на жизнеспособность опухолевых клеток, лишать их необходимых внеклеточных сигналов пролиферации, таких как сигналы, опосредуемые факторами роста через их клеточные рецепторы. Одной из привлекательных мишеней при таком подходе является рецептор эпидермального фактора роста (EGFr), который связывает EGF и трансформирующий фактор ростаal., Curr. Opin. Oncol. 10: 67-73, 1998). Связывая EGF или TGF с EGFr, трансмембранный гликопротеин клеточной поверхности 170 кДа включает каскад клеточных биохимических событий, в том числе аутофосфорилирование и интернализацию EGFr, которая достигает высшей точки при клеточной пролиферации (см., например, Ullrich et al., Cell 61: 203-212, 1990). Некоторые наблюдения позволяют связать EGFr непосредственно с содействием развитию и прогрессированию человеческих солидных опухолей. Показано, что EGF-r сверхэкспрессируется на многих типах солидных опухолей (см., например, Mendelsohn Cancer Cells 7: 359 (1989), Mendelsohn Cancer Biology 1: 339-344 (1990), Modjtahedi and Dean Int'l J. Oncology 4: 277- 296 (1994. Например, сверхэкспрессия EGF-r наблюдалась при некоторых злокачественных опухолях лгкого, молочной железы, толстой кишки, желудка, мозга, мочевого пузыря, головы и шеи, яичника и простаты (см., например, Modjtahediand Dean Int'l J. Oncology 4: 277-296 (1994. Сообщалось, что повышение уровней рецептора ассоциируется с плохим клиническим прогнозом (см., например, Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994;Rev. Oncol. Hematol. 19: 183-232, 1995). Показано, что как эпидермальный фактор роста (EGF), так и трансформирующий фактор роста-альфа (TGF-) связываются с EGF-r и управляют клеточной пролиферацией и ростом опухоли. Во многих случаях повышенная экспрессия поверхностного EGFr сопровождается продуцированием опухолевыми клетками TGF или EGF, что наводит на мысль о вовлечении аутокринной регуляции роста (см., например, Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64: 127- 154, 1994; Mendelsohn et al., Biologic Therapy of Cancer pp. 607-623, Philadelphia: J.B. Lippincott Co., 1995; Modjtahedi et al.,Intl. J. of Oncology 4: 277-296, 1994; Salomon et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 19: 183-232,1995). Поэтому некоторые группы (исследователей) предположили, что антитела против EGF, TGF- иEGF-r могут применяться в терапии опухолей, экспрессирующих или сверхэкспрессирующих EGF-r (см.,например, Mendelsohn Cancer Cells 7: 359 (1989); Mendelsohn Cancer Biology 1: 339- 344 (1990); Modjtahedi and Dean Int'l J. Oncology 4: 277-296 (1994); Tosi et al. Int'l J. Cancer 62: 643-650 (1995. Действительно, было показано, что, очевидно, антитела против EGF-r, блокирующие связывание EGF и TGF- с рецептором, ингибируют пролиферацию опухолевых клеток. Однако в то же время антитела против EGF-r,по-видимому, не ингибируют независимый от EGF и TGF- рост клеток (Modjtahedi and Dean Int'l J. Oncology 4: 277-296 (1994. Моноклональные антитела, специфические к человеческому EGFr, способные нейтрализовать связывание EGF и TGF с опухолевыми клетками и ингибировать опосредованную лигандами пролиферацию клеток in vitro, получают из мышей и крыс (см., например, Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: 127154, 1994; Mendelsohn et al., в Biologic Therapy of Cancer 607-623, Philadelphia: J.B. Lippincott Co., 1995;Fan et al., Curr. Opin. Oncol. 10: 67-73,1998; Modjtahedi et al., Intl. J. Oncology 4: 277-296, 1994). Некоторые из этих антител, такие как такие как мышиные 108, 225 (см., например, Aboud-Pirak et al., J. Natl. CancerICR16, ICR62 и ICR64 (см., например, Modjtahedi et al., Intl. J. Oncology 4: 277-296, 1994; Modjtahedi et al.,Br. J. Cancer 67: 247-253, 1993; Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 67: 254-261, 1993) моноклональные антитела, оценивали исключительно по их способности влиять на рост опухоли у мышиных моделей ксенотрансплантата. Большинство моноклональных антител против EGFr эффективно предупреждали образование опухоли у бестимусных мышей при введении вместе с человеческими опухолевыми клетками(Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 67: 254-261, 1993). После инъекции мышам, несущим установленные человеческие опухолевые ксенотрансплантаты, мышиные моноклональные антитела 225 и 528 вызывали частичный рецидив опухоли, и для ликвидации опухолей требовалось совместное введение химиотерапевтических агентов, таких как доксорубицин или цисплатин (Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., в Biologic Therapy of Cancer 607623, Philadelphia: J.B. Lippincott Co., 1995; Fan et al., Cancer Res. 53: 4637-4642, 1993; Baselga et al., J. Natl.Cancer Inst. 85: 1327-1333, 1993). Химерный вариант моноклонального антитела 225 (С 225), в котором вариабельные области мышиного антитела связаны с человеческими константными областями, проявляет повышенную in vivo противоопухолевую активность, но только в высоких дозах (см., например, Goldstein et al., Clinical Cancer Res. 1: 1311-1318, 1995; Prewett et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19: 419-427, 1996). Крысиные антитела ICR16, ICR62 и ICR64 вызывали регрессию установленных опухолей, а не их полное уничтожение (Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 67: 254-261, 1993). Эти результаты доказали, что EGFr является перспективной мишенью терапии с применением антител против экспрессирующих EGFr солидных опухолей, и привели к клиническим испытаниям на людях моноклонального антитела С 225 для различных видах солидного рака (см., например, Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., Biologic Therapy of Cancer pp. 607-623, Philadelphia: J.B. Lippincott Co.,1995; Modjtahedi et al., Intl. J. of Oncology 4: 277-296, 1994). Некоторые достижения в биологических областях сделали возможным получить полностью человеческое антитело против EGFr. Используя мышей, трансгенных вследствие генов человеческого иммуноглобулина (Xenomouse technology, Abgenix, Inc.), создают человеческие антитела, специфические к человеческому EGFr (см., например, Mendez, Nature Genetics, 15: 146-156, 1997; Jakobovits, AdvancedDrug Delivery Reviews, 31(1-2): 33- 42,1998; Jakobovits, Expert Opinion on Investigational Drugs, 7(4): 607614,1998; Yang et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38(1): 17-23, 2001; Международные патентные заявки WO 98/24893; WO 98/50433). Показано, что одно такое антитело, моноклональное человеческое IgG2 антитело с аффинностью 510-11 М к человеческому EGFr, блокирует связывание EGF с EGFr, блокирует передачу сигнала от рецептора и ингибирует активацию и пролиферацию in vitro опухолевых клеток (см.,например, Международная патентная заявка WO 98/50433; патент США 6235883). Исследования на бестимусных мышах показали, что панитумумаб также обладает in vivo активностью, не только предупреждая образование ксенотрансплантатов эпидермоидной карциномы человека линии А 431 у бестимусных мышей, но также уничтожая уже установленные опухолевые ксенотрансплантаты линии А 431(см., например, Yang et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38(1): 17-23, 2001; Yang et al., Cancer Res. 59(6): 1236-43, 1999). Рассматривалось применение панитумумаба для лечения, наряду с другими, рака почки,колоректальной аденокарциномы, рака простаты и немелкоклеточного плоскоклеточного рака лгкого(см., например, опубликованную патентную заявку США 2004/0033543), а в настоящее время проводятся клинические испытания этого антитела. В некоторых типах клеток связывание факторов роста, таких как EGFr, предупреждает апоптоз за счт стимуляции фосфатидилинозит-3-киназы ("PI3K") и В-Raf. Активация PI3K включает молекулярный каскад, что приводит к даунрегуляции (отрицательной модуляции) центральных метаболических путей, контролирующих запрограммированную гибель клеток (Yao, R., Science 267: 2003-2006, 1995). Члены семейства Raf были также идентифицированы как регуляторы запрограммированной гибели клеток у млекопитающих (Hunter, Cell 80: 225-236, 1995). При нокаутировании по Raf у мышей, у которых отсутствует B-Raf, наблюдается нарушение жизнеспособности клеток, тогда как у мышей, у которых отсутствуют Raf-1 или A-Raf, не наблюдается таких нарушений (см., например, Pritchard, Curr. Biol. 6: 614-617, 1996; Wojnowski, Nat. Genet. 16: 293-297, 1997), это показывает, что B-Raf может обладать специфическими функциями в регуляции гибели клеток. Как PI3K, так и B-Raf играют важную роль в нарушениях клеточной пролиферации, в частности в случае рака. Сущность изобретения В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полипептид,состоящий, по меньшей мере, из одной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную изSEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9,SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, состоящий по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полипептид, состоящий по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную изSEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, состоящий по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полипептид, состоящий по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 19 и SEQ IDNO: 20. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную изSEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, состоящий по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах изобретения предусматривается вектор, содержащий по меньшей мере один выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах изобретения предусматривается клетка-хозяин, содержащая этот вектор. В некоторых вариантах изобретения предусматривается клетка, трансформированная по меньшей мере одним выделенным полинуклеотидом, кодирующим полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8,SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ IDNO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения полипептида. Способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, который заключает в себе по меньшей мере один выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, в условиях, эффективных для продуцирования полипептида. Способ включает культивирование клетки, содержащей по меньшей мере один выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, в условиях, эффективных для продуцирования полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ дополнительно включает выделение полипептида. В некоторых вариантах изобретения предусматривается полипептид, полученный этим способом. В некоторых вариантах изобретения предусматривается слитый белок, содержащий выделенный полипептид, включающий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную изNO: 19 и SEQ ID NO: 20, слитую с гетерологичным полипептидом. В некоторых вариантах изобретения предусматривается специфический связывающий агент, способный связываться с выделенным полипептидом, содержащим по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ IDNO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах изобретения специфический связывающий агент выбирают по меньшей мере из одной молекулы, выбранной из: антитела, антитела, в котором тяжлая цепь и лгкая цепь связаны линкером, одно- Fv антитела, иммунологически функционального фрагмента иммуноглобулина, Fab антитела, Fab' антитела, F(ab')2 антитела, моноклонального антитела, поликлонального антитела, антиидиотипического антитела, полностью человеческого антитела, гуманизированного антитела, химерного антител, CDR-привитого антитела и антитела,которое ингибирует связывание EGF с выделенным полипептидом, содержащим по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ-3 013617 В некоторых вариантах изобретения предусматривается получение антитела, способного связываться по меньшей мере с одним полипептидом, содержащим по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ IDNO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах изобретения способ включает введение животному по меньшей мере одного полипептида, содержащего по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ IDID NO: 13. В некоторых вариантах изобретения способ дополнительно включает получение антитела,способного связывать по меньшей мере один полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, из организма животного. В некоторых вариантах изобретения предусматривается трансгенное нечеловеческое животное, содержащее по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ IDNO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ IО NO: 20. В некоторых вариантах изобретения предусматривается полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ IDID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, связанную с тврдой подложкой (носителем). В некоторых вариантах изобретения предусматривается полипептид,содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2,SEQ IО NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ IDNO: 20, связанную с тврдой подложкой (носителем). В некоторых вариантах изобретения предусматривается ряд полинуклеотидов, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах изобретения предусматривается ряд полипептидов, включающий по меньшей мере один полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах изобретения предусматривается нуклеотидный зонд, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного EGFr. В некоторых вариантах изобретения область содержит по меньшей мере одну EGFr мутацию, выбранную из L688P, Q701H, K745N, C781R, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т 790 М, L828stop, Q849R, F910L и V948A. В некоторых вариантах изобретения нуклеотидный зонд гибридизуется с комплементом полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более EGFr мутаций в субъекте. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики чувствительности к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более EGFr мутаций в субъекте. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение наличия экспрессии или количественное определение экспрессии полипептида, содержащего по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQID NO: 12 и SEQ ID NO: 13 в образце от субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ дополнительно включает диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более EGFr мутаций на основании определения наличия экспрессии или количественного определения экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ определения наличия или отсутствия полинуклеотида, кодирующего мутантный EGFr полипептид в образце. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ определения наличия или отсутствия мутантного EGFr полипептида в образце. В некоторых вариантах изобретения способ включает экспозицию образца с зондом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного EGFr полипептида, причм эта область содержит по меньшей мере одну EGFr мутацию, выбранную из L688P, Q701H, K745N, C781R, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т 790 М, L828stop, Q849R, F910L и V948A. В некоторых вариантах изобретения способ дополнительно включает определение наличия или отсутствия полинуклеотида, кодирующего мутантный EGFr полипептид в образце. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение наличия или отсутствия мутантного EGFr полипептида в образце для анализа, взятом у субъекта.-4 013617 В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики у субъекта рака, связанного с EGFr. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного мутантного EGFr полипептида, содержащего по меньшей мере одну мутацию, выбранную из L688P, Q701H, K745N, C781R, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т 790 М, L828stop, Q849R, F910L и V948A, в образце для анализа, взятом у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного мутантного EGFr полинуклеотида, кодирующего полипептид, содержащий по меньшей мере одну мутацию, выбранную из: L688P, Q701H, K745N, C781R, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т 790 М, L828stop, Q849R, F910L и V948A, в образце для анализа, взятом у субъекта. В некоторых вариантах изобретения присутствие по меньшей мере одного мутантного EGFr полипептида позволяет диагностировать у субъекта рак, связанный с EGFr. В некоторых вариантах изобретения присутствие по меньшей мере одного мутантного EGFr полинуклеотида позволяет диагностировать у субъекта рак, связанный с EGFr. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ определения вероятности развития рака, связанного с EGFr, у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного мутантного EGFr полипептида, содержащего по меньшей мере одну мутацию, выбранную из: L688P, Q701H, K745N, C781R, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т 790 М, L828stop, Q849R, F910L и V948A, в образце для анализа, взятом у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного мутантного EGFr полинуклеотида, кодирующего полипептид, содержащий по меньшей мере одну мутацию, выбранную из: L688P, Q701H, K745N, C781R, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т 790 М, L828stop, Q849R, F910L и V948A, в образце для анализа, взятом у субъекта. В некоторых вариантах изобретения присутствие, по меньшей мере, мутантного EGFr полипептида является показателем вероятности развития у субъекта рака, связанного с EGFr. В некоторых вариантах изобретения присутствие по меньшей мере одного мутантного EGFr полинуклеотида является показателем вероятности развития у субъекта рака, связанного с EGFr. В некоторых вариантах изобретения рак, связанный с EGFr, является немелкоклеточным раком лгкого. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ скрининга на модулятор активности, по меньшей мере, одного мутантного EGFr полипептида, содержащего, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из: L688P, Q701H, K745N, C781R, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т 790 М, L828stop, Q849R, F910L и V948A. В некоторых вариантах изобретения способ включает контактирование клетки с тестируемым соединением и определение, действительно ли тестируемое соединение модулирует активность мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения предусматривается соединение, идентифицируемое этим способом. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ лечения заболевания или состояния, связанного по меньшей мере с однойEGFr мутацией, выбранной из L688P, Q701H, K745N, C781R, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т 790 М, L828stop, Q849R, F910L и V948A. В некоторых вариантах изобретения способ содержит введение соединения субъекту, нуждающемуся в лечении от заболевания или состояния, связанного по меньшей мере с одной EGFr мутацией. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ лечения субъекта от заболевания или состояния, связанного по меньшей мере с одной EGFr мутацией. В некоторых вариантах изобретения способ включает детектирование по меньшей мере одной EGFr мутации в полинуклеотиде субъекта,причм обнаружение по меньшей мере одной EGFr мутации показывает, что пациент обладает повышенной чувствительностью к развитию заболевания или состояния, связанного по меньшей мере с однойEGFr мутацией. В некоторых вариантах изобретения способ включает детектирование по меньшей мере одной EGFr мутации в полинуклеотиде субъекта, причм обнаружение по меньшей мере одной EGFr мутации показывает, что у пациента наблюдается заболевание или состояние, связанного по меньшей мере с одной EGFr мутацией. В некоторых вариантах изобретения способ дополнительно включает введение субъекту антитела, которое специфически связывает мутантный EGFr полипептид. В некоторых вариантах изобретения антитело является человеческим антителом. В некоторых вариантах изобретения антитело представляет собой панитумумаб или его антиген-связывающая область. В некоторых вариантах изобретения EGFr мутацию выбирают из L688P, Q701H, K745N, C781R, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т 790 М, L828stop, Q849R, F910L и V948A. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное по меньшей мере с одной EGFr мутацией является немелкоклеточным раком лгкого. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ лечения заболевания или состояния,связанного по меньшей мере с одной EGFr мутацией. В некоторых вариантах изобретения этот способ включает введение полинуклеотида, антисмыслового по отношению к полинуклеотиду, кодирующему по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20,-5 013617 субъекту, нуждающемуся в таком лечении. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ установления профиля мутантной популяции EGFr в специфической популяции индивидуумов. В некоторых вариантах изобретения этот способ включает определение наличия по меньшей мере одной EGFr мутации в генетическом профиле индивидуумов в популяции. В некоторых вариантах изобретения способ дополнительно включает установление соотношения между мутантным EGFr генетическим профилем и специфическими характеристиками индивидуума. В некоторых вариантах изобретения специфические характеристики индивидуума включают проявление заболевания или состояния, связанного с EGFr мутацией. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ прогнозирования эффективности лечения гефитинибом заболевания или состояния у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение присутствия или отсутствия EGFr мутации Т 790 М в мутантном EGFr полипептиде субъекта. В некоторых вариантах изобретения присутствие EGFr мутации Т 790 М в мутантных EGFr полипептидах указывает на резистентность к лечению гефитинибом. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ определения восприимчивости к лечению с помощью антитела против EGFr у субъекта, страдающего раковым заболеванием. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение присутствия или отсутствия EGFr мутации Т 790 М у субъекта. В некоторых вариантах изобретения антитело представляет собой панитумумаб или цетуксимаб. В некоторых вариантах изобретения предусматривается набор для обнаружения полинуклеотида,кодирующего мутантный EGFr полипептид у субъекта. В некоторых вариантах изобретения набор содержит зонд, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного EGFr полипептида, причм эта область содержит по меньшей мере одну EGFr мутацию, выбранную из L688P,Q701H, K745N, C781R, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т 790 М, L828stop, Q849R,F910L и V948A. В некоторых вариантах изобретения набор дополнительно содержит два или более праймера для амплификации. В некоторых вариантах изобретения набор дополнительно содержит детектирующий компонент. В некоторых вариантах изобретения набор дополнительно содержит компонент для выборки нуклеотидов. Краткое описание фигур На фиг. 1 представлена таблица, на которой показан мутационный анализ образцов опухолей немелкоклеточного рака лгких ("NSCLC") двадцати пациентов, на основании исследования, описанного в примере 1. EGFr экзоны 18, 19, 20, 21 и 23, PI3K экзоны 9 и 20 и В-Raf экзон 15 из геномной ДНК каждой опухоли амплифицировали, секвенировали и сравнивали с последовательностью дикого типа EGFr,PI3K или В-Raf. На фиг. 2 представлена таблица, на которой показан мутационный анализ образцов опухолей колоректальной аденокарциномы ("CRC") двадцати пациентов, на основании исследования, описанного в примере 1. EGFr экзоны 18, 19, 20, 21 и 23, PI3K экзоны 9 и 20 и В-Raf экзон 15 из геномной ДНК каждой опухоли амплифицировали, секвенировали и сравнивали с последовательностью дикого типа EGFr,PI3K или В-Raf. На фиг. 3 представлена таблица, на которой показан мутационный анализ образцов опухолейNSCLC тридцати девяти пациентов, на основании исследования, описанного в примере 2. EGFr экзоны 18, 19, 20, 21 и 23, и В-Raf экзоны 11 и 15 из геномной ДНК каждой опухоли амплифицировали, секвенировали и сравнивали с последовательностью дикого типа EGFr или В-Raf. На фиг. 4 показан результат анализа методом радиоактивного гель-электрофореза ингибирующей активности гефитиниба и панитумумаба в отношении аутофосфорилирования дикого типа и Т 790 М EGFr на основании исследования, описанного в примере 3. На фиг. 5 показано выравнивание некоторых мутантных EGFr полинуклеотидных и полипептидных последовательностей и некоторых PI3K полинуклеотидных и полипептидных последовательностей с соответствующими последовательностями дикого типа. На фиг. 6 показаны полинуклеотидные и полипептидные последовательности дикого типа и EGFr мутантных молекул. На фиг. 7 показаны полинуклеотидные и полипептидные последовательности дикого типа и PI3K мутантных молекул. На фиг. 8 показаны полинуклеотидные и полипептидные последовательности дикого типа и В-Raf мутантных молекул. Подробное описание изобретения Определения Если не указано иначе, научные и технические термины, употребляемые применительно к настоящему изобретению, имеют значения, понятные всем специалистам в данной области техники. Кроме того, если не требуется по контексту, термины, относящиеся к единственному числу, включают множество,а термины, относящиеся к множественному числу, включают единственное число. В основном номенклатура и методы, употребляемые применительно к клетке и клеточной культуре,молекулярной биологии и химии и гибридизации белков и олиго- или полинуклеотидов по данному опи-6 013617 санию являются обычной номенклатурой и обычными методами в данной области техники. Стандартные методы применяются для синтеза рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидов и культивирования и трансформации тканевой культуры (например, электропорация, липофекция). Ферментативные реакции и методы очистки осуществляют по описаниям производителя, или так, как это принято в уровне техники,или по данному описанию. Вышеуказанные операции и процедуры обычно осуществляют общепринятыми методами, хорошо известными в уровне техники и описанными в различных общих и более специальных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в настоящем описании. См., например, Sambrook etal. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y. (1989, учебник, который вводится в данное описание в качестве ссылки. Номенклатура и лабораторные процедуры и методы, используемые применительно к аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии по данному описанию, являются общеизвестной и обычной номенклатурой и общеизвестными и обычными методами в данной области техники. Стандартные методы применяются для химических синтезов, химических анализов, приготовления и доставки фармацевтических препаратов и лечения пациентов. В данной заявке, если не указано иначе, союз "или" означает "и/или". Кроме того, термин "включая", а также другие формы, такие как "включает" и "включительно", не являются ограничивающими. Также, если не указано иначе, термины, такие как "элемент" или "компонент", охватывают как элементы и компоненты, содержащие одну единицу, так и элементы и компоненты, которые содержат более одной субъединицы. Если не указано иначе, то следует понимать, что нижеприведнные термины, применяемые в соответствии с настоящим раскрытием, имеют следующие значения. Термины "выделенный полинуклеотид" и "выделенная нуклеиновая кислота" применяются взаимозаменяемо и при использовании в данном описании означают полинуклеотид геномного, кДНК или синтетического происхождения, или их некую комбинацию, который, вследствие своего происхождения (1) не ассоциируется с целым полинуклеотидом или с частью полинуклеотида, в котором "выделенный полинуклеотид" находится в природе, (2) функционально связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или (3) не встречается в природе как часть большей по размеру последовательности. Термины "выделенный белок" и "выделенный полипептид" применяются на равных основаниях и в данном описании означают белок, соответствующий кДНК, рекомбинантной РНК или синтетического происхождения, или некую их комбинацию, который вследствие своего происхождения или источника,из которого он получен, (1) не ассоциируется с белками, обнаруженными в природе, (2) не содержит других белков из того же источника, например, не содержит мышиных белков, (3) экспрессируется в клетке отличного вида, или (4) не встречается в природе. Термины полипептид и белок используются в данном описании взаимозаменяемо в качестве родового термина в отношении нативного белка, фрагментов, пептидов или аналогов полипептидной последовательности. Следовательно, нативный белок, фрагменты и аналоги являются видами рода полипептидов. Выражение "XY" в контексте мутации в полипептидной последовательности является общепризнанным в уровне техники, где указывает на локализацию мутации с точки зрения номера аминокислоты полипептида, "X" указывает на аминокислоту, находящуюся в этом положении в дикого типа аминокислотной последовательности, а "Y" указывает на мутантную аминокислоту в этом положении. Например, изображение "L688P" по отношению к EGFr полипептиду показывает, что лейцин находится в положении аминокислоты 688 последовательности EGFr дикого типа и что лейцин заменн на пролин в мутантной EGFr последовательности. Выражения "мутантный EGFr полипептид" и "мутантный EGFr белок" применяются равноправно и относятся к EGFr полипептиду, содержащему по меньшей мере одну EGFr мутацию, выбранную изL688P, Q701H, K745N, C781R, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т 790 М, L828stop,Q849R, F910L и V948A. Некоторые типичные мутантные EGFr полипептиды включают, но без ограничения, аллельные варианты, варианты, полученные при сплайсинге, варианты, являющиеся производными, варианты, полученные в результате замен, варианты, полученные в результате делеции и/или инсерции, слитые полипептиды, ортологи и межвидовые гомологи. В некоторых вариантах изобретения мутантный EGFr полипептид включает дополнительные остатки на С- или N-конце, такие как, но без исключения, остатки лидерной последовательности, нацеливающие остатки, метиониновые остатки на аминоконце, остатки лизина, метки и/или остатки слитого белка. Выражения "мутантный PI3K полипептид" и "мутантный PI3K белок" применяются равноправно и относятся к PI3K полипептиду, содержащему по меньшей мере одну PI3K мутацию, выбранную из Е 524 К, Е 545 А и H1047L. Некоторые типичные мутантные PI3K полипептиды включают, но без ограничения, аллельные варианты, варианты, полученные при сплайсинге, варианты, являющиеся производными, варианты, полученные в результате замен, варианты, полученные в результате делеции и/или инсерции, слитые полипептиды, ортологи и межвидовые гомологи. В некоторых вариантах изобретения мутантный PI3K полипептид включает дополнительные остатки на С- или N-конце, такие как, но без исключения, остатки лидерной последовательности, нацеливающие остатки, метиониновые остатки на-7 013617 аминоконце, остатки лизина, метки и/или остатки слитого белка. Выражения "мутантный B-Raf полипептид" и "мутантный B-Raf белок" применяются равноправно и относятся к B-Raf полипептиду, содержащему по меньшей мере одну B-Raf мутацию, выбранную изV600E и K601 Е. Некоторые типичные мутантные B-Raf полипептиды включают, но без ограничения,аллельные варианты, варианты, полученные при сплайсинге, варианты, являющиеся производными, варианты, полученные в результате замен, варианты, полученные в результате делеции и/или инсерции,слитые полипептиды, ортологи и межвидовые гомологи. В некоторых вариантах изобретения мутантныйB-Raf полипептид включает дополнительные остатки на С- или N-конце, такие как, но без исключения,остатки лидерной последовательности, нацеливающие остатки, метиониновые остатки на аминоконце,остатки лизина, метки и/или остатки слитого белка. Выражение "мутантный EGFr слитый белок" относится к слиянию одной или более аминокислот(таких как гетерологичный полипептид) на амино- или карбоксиконце мутантного EGFr полипептида. Выражение "мутантный PI3K слитый белок" относится к слиянию одной или более аминокислот(таких как гетерологичный полипептид) на амино- или карбоксиконце мутантного PI3K полипептида. Выражение "мутантный В-Raf слитый белок" относится к слиянию одной или более аминокислот(таких как гетерологичный полипептид) на амино- или карбоксиконце мутантного В-Raf полипептида. Термин "природный" ("встречающийся в природе") по данному описанию в применении к объекту относится к тому факту, что объект может встречаться в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), которую можно выделить из природного источника и которая не была умышленно модифицирована человеком в лаборатории, или иначе встречается в природе. Выражение "функционально связанный" по данному описанию относится к позиционированию,расположению компонентов таким образом, что они связаны так, что это позволяет им функционировать заданным образом. Контрольная последовательность, "функционально связанная" с кодирующей последовательностью, лигируется таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, сходных с условиями для контрольных последовательностей. Термин "контрольная последовательность" по данному описанию относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для того, чтобы влиять на экспрессию и процессирование кодирующих последовательностей, к которым они лигированы. Природа таких контрольных последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контрольные последовательности обычно включают промотор, сайт связывания рибосом и последовательности терминации транскрипции; в эукариотах такие контрольные последовательности обычно включают промотор и последовательности терминации транскрипции. Предполагается, что термин "контрольная последовательность" включает, как минимум, все компоненты, присутствие которых необходимо для экспрессии и процессирования, и может также включать дополнительные компоненты, присутствие которых предпочтительно, например, лидерные последовательности и последовательности партнров по слиянию. Термин "полинуклеотид" по данному описанию означает полимерную форму нуклеотидов длиной по меньшей мере 10 оснований, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов, или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Термин включает одно- или двухцепочечные формы ДНК. Термин "олигонуклеотид" по данному описанию включает природные или модифицированные нуклеотиды, связанные вместе природными или неприродными олигонуклеотидными связями. Олигонуклеотиды представляют собой субпопуляцию полинуклеотидов, обычно имеющих длину 200 оснований или менее. Предпочтительно, олигонуклеотиды имеют длину (протяжнность) 10-60 оснований, и наиболее предпочтительно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-40 оснований в длину. Олигонуклеотиды обычно являются одноцепочечными (однотяжевыми), например, для зондов, хотя олигонуклеотиды могут быть двухцепочечными, например, для применения в конструкции мутанта гена. Олигонуклеотиды по изобретению могут быть либо смысловыми, либо антисмысловыми олигонуклеотидами. Выражения "мутантный EGFr полинуклеотид", "мутантный EGFr олигонуклеотид" и "мутантнаяEGFr нуклеиновая кислота" применяются взаимозаменяемо и относятся к полинуклеотиду, кодирующему EGFr полипептид, содержащий по меньшей мере одну EGFr мутацию, выбранную из L688P, Q701H,K745N, C781R, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т 790 М, L828stop, Q849R, F910L иPI3K полипептид, содержащий по меньшей мере одну PI3K мутацию, выбранную из Е 524 К, Е 545 А иB-Raf нуклеиновая кислота" применяются взаимозаменяемо и относятся к полинуклеотиду, кодирующему B-Raf полипептид, содержащий по меньшей мере одну B-Raf мутацию, выбранную из V600 Е иK601 Е. Термин "природные нуклеотиды" по данному описанию включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Термин "модифицированные нуклеотиды" по данному описанию включает нуклеотиды с-8 013617 модифицированными или замещнными углеводными группами и т.п. Термин "олигонуклеотидные связи" по данному описанию включает олигонуклеотидные связи, такие как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная, фосфороселеноатная, фосфородиселеноатная, фосфороанилотиоатная, фосфороамидатная связь и т.п. См., например, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6: 539University Press, Oxford England (1991; Stec et al. патент США No. 5151510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990), раскрытие которых вводится в данное описание в качестве ссылки. При желании олигонуклеотид может включать метку для обнаружения. Выражение "селективно гибридизуется" по данному описанию означает "детектируемо и специфически связывается". Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты селективно гибридизуются с нуклеотидными нитями в условиях гибридизации и отмывания, которые сводят к минимуму ощутимые количества детектируемого связывания с неспецифическими нуклеиновыми кислотами. Условия высокой жсткости можно использовать для достижения условий селективной гибридизации, известных в технике и обсуждаемых в данном описании. Как правило, гомология нуклеотидных последовательностей между полинуклеотидами, олигонуклеотидами и фрагментами и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью составляет по меньшей мере 80%, и более характерно, с предпочтительно повышенными гомологиями по меньшей мере 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 и 100%. Две аминокислотные последовательности являются гомологичными, если между их последовательностями существует частичная или полная идентичность. Например, гомология 85% означает, что 85% аминокислот являются идентичными,когда две последовательности выравниваются с целью максимальной совместимости. Для достижения максимальной совместимости разрешены гэпы (щели) (в каждой из двух выравниваемых последовательностей); предпочтительно, длина гэпов составляет 5, более предпочтительно 2 или менее. Или же, и предпочтительно две белковые последовательности (или полипептидные последовательности, образованные из них, длиной по меньшей мере 30 аминокислот) являются гомологичными, по данному описанию, если их показатель выравнивания более 5 (в единицах стандартной девиации) при использовании программы ALIGN с матрицей данных для мутаций и значениями для гэпов, по умолчанию, б или более. См. Dayhoff, M.O., в Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101- 110 (Volume 5, National BiomedicalResearch Foundation (1972 и Дополнение (Supplement) 2 к этому тому, 1-10. Две последовательности или их части являются более предпочтительно гомологичными, если их аминокислоты на 50% или более, чем на 50%, идентичны при оптимальном выравнивании с применением программы ALIGN. Выражение "соответствует (чему-либо)" по данному описанию означает, что полинуклеотидная последовательность гомологична (т.е. идентична, не строго эволюционно связана) цельной эталонной полинуклеотидной последовательности или е части, или что полипептидная последовательность идентична эталонной полинуклеотидной последовательности. В отличие от этого, выражение "комплементарный (чему-либо)" по данному описанию означает, что комплементарная последовательность гомологична всей или части эталонной полинуклеотидной последовательности. В качестве иллюстрации, нуклеотидная последовательность "ТАТАС" соответствует эталонной последовательности "ТАТАС" и комплементарна эталонной последовательности "GTATA". Нижеприведенные термины применяются для описания взаимоотношений между двумя или более полинуклеотидными или аминокислотными последовательностями: "эталонная (стандартная) последовательность", "интервал сравнения", "идентичность последовательностей", "процент (процентное содержание) идентичности последовательностей" и "практическая идентичность". "Эталонная последовательность" представляет собой определнную последовательность, используемую в качестве базы, основы для сравнения последовательностей; эталонная последовательность может быть из субпопуляции большей по размеру последовательности, например, в качестве сегмента полноразмерной последовательности кДНК или гена, данной в списке последовательностей, или может содержать полную последовательность кДНК или гена. Как правило, эталонная имеет 18 нуклеотидов или 6 аминокислот в длину, часто по меньшей мере 24 нуклеотида или 8 аминокислот в длину, и часто по меньшей мере 48 нуклеотидов или 16 аминокислот в длину. Так как две полинуклеотидных или аминокислотных последовательности могут, каждая, (1) содержать последовательность (т.е. часть полной полинуклеотидной или аминокислотной последовательности), аналогичную для двух молекул, и (2) могут дополнительно содержать последовательность, расходящуюся между двумя полинуклеотидными или аминокислотными последовательностями, сравнение последовательностей между двумя (или более) молекулами обычно проводят, сравнивая последовательности двух молекул посредством "интервала (окна) сравнения" для идентификации и сравнения локальных областей подобия (аналогии) последовательностей. "Интервал сравнения" по данному описанию относится к смысловому (концептуальному) сегменту по меньшей мере из 18 непрерывных нуклеотидных положений или 6 аминокислот, где полинуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью по меньшей мере из 18 непрерывных нуклеотидов или 6 аминокислот и где часть полинуклеотидной последовательности в интервале (окне) сравнения) может содержать 20 процентов или менее добавлений, делеций, замен и т.п. (т.е. гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений-9 013617 или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей с целью выравнивания интервала (окна) сравнения можно проводить с применением алгоритма локальной гомологии Смита-Ватермана Adv. Appl, Math. 2: 482 (1981), алгоритма построения глобального выравнивания Нидельмана-Вунша J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), поиском подобия по методу Пирсона и Липмана Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988), с помощью компьютерной реализации этого алгоритма (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в программе Wisconsin Genetics SoftwareGeneworks или MacVector) или с помощью инспекции, и выбирают наилучшее выравнивание (т.е. с наивысшим процентным содержанием гомологии в интервале (окне) сравнения), полученное различными методами. Термин "идентичность последовательностей" означает, что две полинуклеотидные или аминокислотные последовательности являются идентичными (т.е. при сравнении нуклеотида-за-нуклеотидом и аминокислоты-за-аминокислотой) при использовании интервала (окна) сравнения. "Процент идентичности последовательностей" рассчитывают путм сравнения двух оптимально выравненных последовательностей с помощью окна (интервала) сравнения, определяя число положений, в которых в обоих последовательностях находится идентичное нуклеотидное основание (например, А, Т, С, G, U или I) или остаток, получают число совпадающих положений, и число совпадающих положений делят на общее число положений в интервале (окне) сравнения (т.е. на размер окна) и полученный результат умножают на 100, получают процентное содержание (процент) идентичности последовательностей. Выражение"значительная (заметная, практическая) идентичность" по данному описанию означает характеристику полинуклеотидной или аминокислотной последовательности, причм полинуклеотид или аминокислота содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности последовательностей по сравнению с эталонной последовательностью (по меньшей мере на 85% идентичную эталонной последовательности) предпочтительно по меньшей мере 90-95% идентичности последовательностей по сравнению с эталонной последовательностью (по меньшей мере на 90-95% идентичную эталонной последовательности), более обычно по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичности последовательностей по сравнению с эталонной последовательностью (по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную эталонной последовательности) по сравнению с эталонной последовательностью с помощью окна сравнения(интервала сравнения) по меньшей мере из 18 нуклеотидных (6 аминокислотных) положений, часто с помощью окна сравнения (интервала сравнения), по меньшей мере из 24-48 нуклеотидных (8-16 аминокислотных) положений, где процент идентичности последовательностей рассчитывают, сравнивая эталонную последовательность с последовательностью, которая может включать делеции или добавления,составляющие в целом 20% или менее от эталонной последовательности в окне (интервале) сравнения. Эталонная последовательность может быть субпопуляцией большей последовательности. В данном описании названия двадцати обычных аминокислот и их сокращения следуют общепринятым правилам. См. монографию Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds.,Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991. Термин "аминокислота" или "аминокислотный остаток" по данному описанию относится к природным L аминокислотам или к D аминокислотам. В данном описании употребляются обычно используемые одно- или трхбуквенные сокращения (Bruce Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., New York (4th ed. 2002. Стереоизомеры (например, Dаминокислоты) двадцати обычных аминокислот, неприродных аминокислот, таких как ,дизамещнные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нетрадиционные аминокислоты могут также быть подходящими компонентами для полипептидов по настоящему изобретению. Примеры нетрадиционных аминокислот включают 4-гидроксипролин, -карбоксиглутамат, N,N,N-триметиллизин, -N-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3 метилгистидин, 5-гидроксилизин, -N-метиларгинин и другие аналогичные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). При изображении полипептидов в данном описании направление влево представляет собой направление к аминоконцу, а направление вправо представляет собой направление к С-концу, в соответствии со стандартным применением и обозначением. Аналогично, если не указано иначе, левый конец одноцепочечных полинуклеотидных последовательностей представляет собой 5' конец; левое направление двухцепочечных полинуклеотидных последовательностей называется 5' направление. Направление добавления 5'-3' образующихся РНК транскриптов называют направлением транскрипции. Области последовательности на нити ДНК, которые имеют ту же последовательность, что и РНК, и находятся 5' к 5' концу РНК транскрипта, называются "апстрим(3'-5', в обратном направлении) последовательностями". Области последовательности на нити ДНК, которые имеют ту же последовательность, что и РНК, и находятся 3' к 3' концу РНК транскрипта, называются "даунстрим (5'-3', в прямом направлении) последовательностями". В применении к полипептидам термин "значительная (практическая) идентичность" означает, что две пептидные последовательности, будучи оптимально выравнены, например, с помощью программGAP или BESTFIT с применением, по умолчанию, средневзвешенных гэпов (пробелов), по меньшей мере на 80% идентичны, предпочтительно по меньшей мере на 90% идентичны, более предпочтительно по- 10013617 меньшей мере на 95, 96, 97 или 98% идентичны, и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентичны. Предпочтительно положения остатков, которые не является идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Как обсуждается в данном описании, минорные вариации в аминокислотных последовательностях молекул антител или иммуноглобулина рассматриваются как охватываемые настоящим изобретением, при условии, что варианты в аминокислотной последовательности сохраняют по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80, 90, 95% и наиболее предпочтительно 99%. Консервативные аминокислотные замены представляют собой такие замены, которые имеют место в семействе аминокислот с родственными боковыми цепями. Генетически кодированные аминокислоты обычно делятся на семейства: (1) кислые = аспартат, глутамат; (2) основные = лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные = аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин,триптофан; и (4) незаряженные полярные = аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин, тирозин. Более предпочтительными семействами являются серии и треонин представляют семейство алифатических гидроксикислот; аспарагин и глутамин представляют семейство амидсодержащих аминокислот; аланин,валин, лейцин и изолейцин входят в семейство алифатических аминокислот; фенилаланин, триптофан и тирозин входят в семейство ароматических аминокислот, а цистеин и метионин представляют семейство аминокислот с серосодержащей боковой цепью. Например, логично ожидать, что изолированная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серии или аналогичная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту не окажет основного влияния на связывание или свойства полученной молекулы, в особенности если замена не включает аминокислоту в каркасном сайте. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются: валин-лейцинизолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутаминовая кислота-аспарагиновая кислота, цистеин-метионин и аспарагин-глутамин. Предпочтительными аминокислотными заменами являются такие замены, которые (1) снижают восприимчивость к протеолизу, (2) снижают восприимчивость к окислению; (3) изменяют аффинность связывания для образования белковых комплексов; (4) изменяют аффинности связывания; (5) придают или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства таких аналогов. Аналоги могут включать различные мутеины последовательности, отличающейся от последовательности природного пептида. Например, единичная или множественные аминокислотные замены (предпочтительно,консервативные аминокислотные замены) можно сделать в природной последовательности (предпочтительно, на участке полипептида вне домена (доменов), образующего (образующих) межмолекулярные контакты. Консервативная аминокислотная замена не должна заметно менять структурные характеристики исходной последовательности (например, замена аминокислоты не должна нарушать спирали,встречающейся в исходной последовательности, или разрушать другие типы вторичной структуры, характерные для исходной последовательности). Примеры признанных в уровне техники вторичной и третичной структур описаны в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman andCompany, New York (1984; Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991; и Thornton et at. Nature 354: 105 (1991), которые ссылкой вводятся в данное описание. Термин "аналог" по данному описанию относится к полипептидам, которые состоят по меньшей мере из 25 аминокислот, которые практически идентичны части аминокислотной последовательности природного полипептида и которые имеют по меньшей мере одну из активностей природного полипептида. Обычно полипептидные аналоги содержат консервативную аминокислотную замену (или добавление, или делецию) относительно природной последовательности. Обычно аналоги имеют длину по меньшей мере 20 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 50 аминокислот или больше, и могут часто иметь такую же длину, что и полноразмерный природный полипептид. Пептидные аналоги обычно применяются в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарств со свойствами, аналогичными свойствам матричного пептида. Эти типы непептидного соединения называются "миметики пептида" или "пептидомиметики". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29(1986); Veber and Freidinger TINS р.392 (1985); и Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), которые вводятся в данное описание в качестве ссылки. Такие соединения часто получают с помощью компьтерного молекулярного моделирования. Пептидомиметики, аналогичные по структуре применимым в терапии пептидам, можно использовать для получения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта. Обычно пептидомиметики аналогичны по структуре эталонному полипептиду (т.е. полипептиду, который обладает биохимическим свойством и фармакологической активностью), такому как человеческое антитело, но одна или более пептидных связей замещены в них связью, выбранной из группы,состоящей из: -CH2NH-, -CH2S-, - СН 2- СН 2-, -СН=СН-(цис и транс), -СОСН 2-, -СН(ОН)СН 2- и - CH2SO-,методами, общеизвестными в уровне техники. Системная замена одной или более аминокислот консенсусной последовательности D-аминокислотой того же типа D-аминокислотой того же типа (например, Dлизином вместо L-лизина) можно использовать для получения более устойчивых пептидов. Кроме того,(пространственно) затрудннные пептиды, содержащие консенсусную последовательность или вариант,практически идентичный консенсусной последовательности, можно получать методами, известными в уровне техники (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992), вводится в данное описание в каче- 11013617 стве ссылки); например, добавляя внутренние цистеиновые остатки, способные образовывать внутримолекулярные дисульфидные мостики, которые циклизуют пептид. Предпочтительные амино- и какрбоксиконцы фрагментов или аналогов наблюдаются близ границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены можно идентифицировать, сравнивая данные нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности с общедоступными или запатентованными базами данных. Предпочтительно, компьютерные методы сравнения используют для идентификации мотивов последовательности или белковых доменов с предсказанной конформацией, которые встречаются в других белках с известной структурой и/или функцией. Известны методы идентификации белковых последовательностей, которые скручиваются в известную трхмерную структуру (см. Bowie etal. Science 253: 164 (1991. Специалисты в данной области техники могут узнать мотивы последовательности и структурные конформации, которые можно использовать для определения структурных и функциональных доменов по изобретению. Термин "специфически связывающий агент" относится к природной или неприродной молекуле,которая специфически связывается с целью (мишенью). Примеры специфически связывающих агентов включают, но без ограничения, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды и низкомолекулярные соединения. В некоторых вариантах изобретения специфически связывающий агент представляет собой антитело. В некоторых вариантах изобретения специфически связывающий агент представляет собой антиген-связывающую область. Выражение "агент, специфически связывающийся с мутантным EGFr полипептидом" относится к специфически связывающему агенту, который специфически связывает любой участок мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения агент, специфический связывающийся с мутантнымEGFr полипептидом, представляет собой антитело к EGFr полипептиду. В некоторых вариантах изобретения агент, специфически связывающийся с мутантным EGFr полипептидом, представляет собой антиген-связывающую область. Выражение "агент, специфически связывающийся с мутантным PI3K полипептидом" относится к специфически связывающему агенту, который специфически связывает любой участок мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения агент, специфически связывающийся с мутантнымPI3K полипептидом, представляет собой антитело к PI3K полипептиду. В некоторых вариантах изобретения агент специфически связывающийся с мутантным PI3K полипептидом, представляет собой антиген-связывающую область. Выражение "агент, специфически связывающийся с мутантным B-Raf полипептидом" относится к специфически связывающему агенту, который специфически связывает любой участок мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения агент, специфически связывающийся с мутантным BRaf полипептидом, представляет собой антитело к B-Raf полипептиду. В некоторых вариантах изобретения агент, специфически связывающийся с мутантным B-Raf полипептидом, представляет собой антиген-связывающую область. Выражение "специфически связывается" относится к способности специфического связывающего агента связываться с мишенью с более высокой аффинностью, чем он связывается с "не-мишенью". В некоторых вариантах изобретения специфическое связывание относится к связыванию с мишенью с аффинностью по меньшей мере в 10, 50, 100, 250, 500 или 1000 раз более высокой, чем аффинность к "немишени". В некоторых вариантах изобретения аффинность определяют методом анализа аффинностиELISA. В некоторых вариантах изобретения аффинность определяют методом анализа BIAcore. В некоторых вариантах изобретения аффинность определяют кинетическим методом. В некоторых вариантах изобретения аффинность определяют методом равновесия в растворе. В некоторых вариантах изобретения говорят, что антитело специфически связывает антиген, когда константа диссоциации антитела и одного или более его распознаваемых эпитопов равна 1 мкМ, предпочтительно 100 нМ и наиболее предпочтительно 10 нМ."Нативные антитела и иммуноглобулины" обычно представляют собой гетероароматические гликопртеины около 150000 Да, состоящие из двух идентичных лгких (L) цепей и двух идентичных тяжлых (Н) цепей. Каждая лгкая цепь связана с тяжлой цепью одной ковалентной дисульфидной связью,тогда как число дисульфидных связей между тяжлыми цепями различных изотипов иммуноглобулина меняется. Каждая тяжлая и лгкая цепь также содержит регулярно расположенные внутрицепные дисульфидные мостики. Каждая тяжлая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует несколько константных доменов. Каждая лгкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце(VL) и константный домен на другом конце; константный домен лгкой цепи выравнивается с первым константным доменом тяжлой цепи, а вариабельный домен лгкой цепи выравнивается с вариабельным доменом тяжлой цепи. Полагают, что конкретные аминокислотные остатки образуют границу раздела(область контакта) между вариабельными доменами лгкой и тяжлой цепи (Clothia et al. J. Mol. Biol. 186: 651 (1985); Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 4592 (1985); Clothia et al., Nature 342: 877-883 (1989. Термин "антитело" относится как к интактному антителу, так и к его антиген-связывающему фраг- 12013617 менту, который конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание. "Его антигенсвязывающий фрагмент" относится к участку или фрагменту молекулы интактного антитела, причм фрагмент сохраняет антиген-связывающую функцию. Связывающие фрагменты получают методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных антител, например,расщеплением папаином. Связывающие фрагменты включают Fab, Fab', F(ab')2, Fv, одноцепочечные антитела ("scFv"), Fd' и Fd фрагменты. Способы получения различных фрагментов из моноклональных антител хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, Pluckthun, 1992, Immunol. Rev. 130: 151-188). Понятно, что все сайты связывания антитела, отличного от "биспецифического" или "бифункционального" антитела, идентичны. Антитело практически (значительно) ингибирует адгезию рецептора к "противорецептору", если избыток антитела снижает количество рецептора, связанного с "противорецептором", по меньшей мере, примерно на 20, 40, 60 или 80% и более, обычно более чем,примерно на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% (по определению in vitro методом конкурентного связывания)."Выделенное" ("изолированное") антитело представляет собой антитело, идентифицированное и выделенное и/или извлечнное из компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой материалы, которые могут мешать применению антитела в диагностике или терапии, они могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворнные вещества. В предпочтительных вариантах изобретения антитело очищают (1) более чем до 95 вес.% антитела по определению методом Лоури, и секвенированием концевых и внутренних аминокислот на секвенаторе с вращающейся чашкой, или (2) до гомогенности с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях, используя окрашивание Кумасси синим или предпочтительно серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, не содержащее по меньшей мере один компонент природного окружения (среды) антитела. Обычно, однако,выделенное антитело получают с помощью по меньшей мере одной стадии очистки. Термин "вариабельный" относится к тому факту, что последовательности некоторых участков вариабельных доменов антител очень различаются и используются для связывания каждого конкретного антитела с конкретным антигеном и для специфичности каждого конкретного антитела к конкретному антигену. Однако, вариабельность (изменчивость) не равномерно распределена среди вариабельных доменов антител. Она сосредотачивается в трх сегментах, называемых областями, определяющими комплементарность (CDR), или гипервариабельными областями, в вариабельных доменах как лгкой, так и тяжлой цепи. Более высококонсервативные участки вариабельных доменов называются каркасом (скелетом) (FR). Вариабельные домены нативных тяжлой и лгкой цепей, каждый, содержат четыре FR области, имеющие, преимущественно, -складчатую конфигурацию, связанные с помощью трх CDR, которые образуют петли, связывающие -складчатую структуру, а в некоторых случаях образующие е часть. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости с помощью FR областей и, с CDR другой цепи, участвуют в образовании антиген-связывающего сайта антител (см. Kabat et al.(1991). Константные домены непосредственно не участвуют в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности."Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания антигена. В двухцепочечных образцах Fv эта область состоит из димера вариабельного домена одной лгкой и одной тяжлой цепи в тесной нековалентной связи. В одноцепочечныхFv вариабельный домен одной тяжлой и одной лгкой цепи может быть ковалентно связан гибким пептидным линкером таким образом, что лгкая и тяжлая цепи могут связываться в "димерную" структуру,аналогичную структуре двухцепочечных Fv разновидностей. Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют для определения антиген-связывающего сайта на поверхности VH+VL димера. Совместно шесть CDR сообщают антителу антиген-связывающую специфичность. Однако, даже единичный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая три CDR, специфических к антигену) способен распознавать и связывать антиген, хотя с меньшей аффинностью, чем целый сайт связывания. Термин "гипервариабельная область" по данному описанию относится к аминокислотным остаткам антитела, отвечающим за связывание антигена. Гипервариабельная область обычно содержит аминокислотные остатки из "области, определяющей комплементарность", или "CDR" (например, остатки 24-34(L1), 50-62 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене лгкой цепи и 31-55 (H1), 50- 65 (Н 2) и 95-102 (Н 3) в вариабельном домене тяжлой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991, и/или остатки из "гипервариабельной петли" (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене лгкой цепи и 26-32 H1), 53-55 (Н 2) и 96-101 (Н 3) в вариабельном домене тяжлой цепи; Chothia and Lesk J.Mol. Biol 196: 901-917 (1987. Остатки "каркасной области" или "FR" представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области по данному описанию. Выражение "гипервариабельные области" или "CDR" по данному описанию относится к участкам иммунологических рецепторов, которые осуществляют контакт со специфическим лигандом и опреде- 13013617 ляют его специфичность. Области CDR иммунологических рецепторов являются наиболее вариабельной частью рецепторного белка, придающие рецепторам их разнообразие, которое возникает на шести петлях в дистальном конце вариабельных доменов рецептора, по три петли от каждого из двух вариабельных доменов рецептора."Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" и "АЗКЦТ" ("ADCC") относятся к опосредованной клетками реакции, при которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc рецепторы (FcRs) (например, природные (нормальные) киллерные (NK) клетки (природные киллеры), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки для опосредования АЗКЦТ (ADCC), NK клетки, экспрессируют только FcyRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Fc экспрессия на гемопоэтических клетках суммирована в табл. 3 на стр. 464 обзора Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Для оценки АЗКЦТ (ADCC) активности молекулы, представляющей интерес,можно провести in vitro ADCC анализ, такой, который описан в патентах США No. 5500362 или 5821337. Пригодные для таких анализов эффекторные клетки включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные киллерные (NK) клетки. Или же, или кроме того, ADCC активность представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, на животной модели, такой, которая раскрывается в Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1988). Термин "эпитоп" включает любую белковую (антигенную) детерминанту, способную к специфическому связыванию с иммуноглобулином и/или Т-клеточным рецептором. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно имеют специфические трхмерные структурные характеристики, а также специфически заряд. Термин "агент" по данному описанию обозначает химическое соединение, смесь химических соединений, биологическую макромолекулу или экстракт из биологических материалов. Термины "метка" или "меченый" по данному описанию относятся к введению детектируемого маркера, например, путм введения меченной радиоактивной меткой аминокислоты или присоединения к полипептиду биотинильных групп, которые можно обнаруживать с помощью меченого авидина (например, стрептавидина, содержащего флуоресцентный маркер, или ферментативную активность, которую можно детектировать оптическими или колориметрическими методами). В некоторых случаях метка или маркер могут также иметь терапевтические свойства. Можно использовать различные методы мечения полипептидов и гликопротеинов, известные в уровне техники. Примеры меток для полипептидов включают, но без ограничения, следующие: радиоизотопы или радионуклиды (например, 3 Н, 14 С, 15N, 35S, 90Y,99 Тс, 111In, 125I, 131I), флуоресцентные метки (например, FITC, родамин, лантаниды с фосфором), ферментные метки (например, пероксидаза хрена, -галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные группы, биотинильные группы и заданные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортром (например, пара последовательностей "лещиновой застжки-молнии", сайты связывания вторичных антител, металл-связывающие домены, эпитопные метки). В некоторых вариантах изобретения метки присоединяются с помощью плеч спейсера различной длины, уменьшая возможные пространственные затруднения. Выражение "фармацевтический агент или лекарство" по данному описанию относится к химическому соединению или к композиции, способной, после введения пациенту соответствующим образом,вызывать заданный терапевтический эффект. Другие химические термины употребляются в соответствии с обычным применением в уровне техники, описанным в словаре The McGraw-Hill Dictionary ofChemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985, который вводится в данное описание в качестве ссылки). Термин "противоопухолевый агент" по данному описанию относится к агентам, которые обладают функциональным свойством ингибировать развитие или прогрессирование опухоли у человека, в особенности злокачественное (раковое) изменение, такое как карцинома, саркома, лимфома или лейкоз. Ингибирование метастаз часто является свойством противоопухолевых агентов. Выражение "практически чисты" по данному описанию означает, что целевой вид является преобладающим присутствующим видом, (т.е. в расчте на моли его в композиции больше, чем любого другого отдельного вида), и, предпочтительно, практически очищенная фракция представляет собой композицию, в которой содержится по меньшей мере 50% (в расчте на моли) целевого вида. Обычно практически чистая композиция содержит более 80% от всех имеющихся в композиции высокомолекулярных соединений (макромолекул), более предпочтительно примерно более 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Более предпочтительно целевой вид очищают до значительной (практической) гомогенности (загрязняющие примеси нельзя обнаружить в композиции обычными методами обнаружения), причм композиция состоит практически из единственного вида макромолекул. Термин "пациент" включает человека и животных. Термины "млекопитающее" и "животное" для лечения (обработки) относится к любому животному,относящемуся к классу млекопитающих, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных,и животных в зоопарке, спортивных животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Пред- 14013617 почтительно, млекопитающим является человек. Выражение "болезненное состояние" относится к физиологическому состоянию клетки или целого млекопитающего, при котором наблюдается прерывание, прекращение или нарушение клеточных функций или функций организма, систем или органов. Термины "лечить" или "лечение" относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным (превентивным) мерам, когда целью является предупреждение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического состояния или нарушения, например, развития или распространения рака. Для целей данного изобретения благотворные или желательные клинические результаты включают, но без ограничения, частичное снятие симптомов, уменьшение степени заболевания, стабильное (т.е. не ухудшающееся) состояние заболевания, приостановку или замедление прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию (частичную или полную), детектируемую или недетектируемую. "Лечение" может также означать пролонгированную продолжительность жизни по сравнению с предполагаемой продолжительностью жизни в отсутствие лечения. Нуждающиеся в лечении включают тех, у кого уже наблюдается состояние или нарушение, а также тех, кто склонен к этому состоянию или нарушению, или тех, у кого следует предупредить это состояние или нарушение."Нарушение" ("расстройство") представляет собой состояние, на которое оказывает благотворное воздействие один или более видов лечения. Сюда входят хронические и острые нарушения (расстройства) или заболевания, включая такие патологические состояния, которые провоцируют у млекопитающего рассматриваемое нарушение. Неограничивающие примеры нарушений, которые можно лечить по данному описанию, включают доброкачественные и злокачественные опухоли, лейкозы и злокачественные заболевания лимфоидной ткани, в частности, рак молочной железы, рак прямой кишки, рак яичника,желудка, эндометриальный рак, рак слюнной железы, почки, толстой кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы, простаты или мочевого пузыря. Предпочтительно по настоящему изобретению следует лечить злокачественную опухоль, такую как цервикальная карцинома, почечноклеточный рак(RCC), опухоли пищевода и клеточные линии раковых клеток."Заболевание или состояние, связанное с мутантным EGFr полипептидом" включает одно или более из следующих заболеваний или состояний: заболевание или состояние, вызванное мутантным EGFr полипептидом; заболевание или состояние, которому способствует мутантный EGFr полипептид; заболевание или состояние, которое является причиной мутантного EGFr полипептида; и заболевание или состояние, ассоциированное с присутствием мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным EGFr полипептидом, может существовать в отсутствие мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным EGFr полипептидом, может ухудшаться в присутствии мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантнымEGFr полипептидом, представляет собой рак. Типичные виды рака включают, но без ограничения, немелкоклеточный рак лгкого, рак молочной железы, толстой кишки, желудка, мозга, мочевого пузыря,головы и шеи, яичника и простаты."Заболевание или состояние, связанное с мутантным PI3K полипептидом" включает одно или более из следующих заболеваний или состояний: заболевание или состояние, вызванное мутантным PI3K полипептидом; заболевание или состояние, которому способствует мутантный PI3K полипептид; заболевание или состояние, которое является причиной мутантного PI3K полипептида; и заболевание или состояние, ассоциированное с присутствием мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным PI3K полипептидом, может существовать в отсутствие мутации. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным PI3K полипептидом, может ухудшаться в присутствии мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантньм PI3K полипептидом, представляет собой рак. Типичные виды рака включают, но без ограничения, немелкоклеточный рак лгкого,рак молочной железы, толстой кишки, желудка, мозга, мочевого пузыря, головы и шеи, яичника и простаты."Заболевание или состояние, связанное с мутантным B-Raf полипептидом" включает одно или более из следующих заболеваний или состояний: заболевание или состояние, вызванное мутантным B-Raf полипептидом; заболевание или состояние, которому способствует мутантный B-Raf полипептид; заболевание или состояние, которое является причиной мутантного B-Raf полипептида; и заболевание или состояние, ассоциированное с присутствием мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным B-Raf полипептидом, может существовать в отсутствие мутации. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным B-Raf полипептидом, может ухудшаться в присутствии мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным B-Raf полипептидом,представляет собой рак. Типичные виды рака включают, но без ограничения, немелкоклеточный рак лгкого, рак молочной железы, толстой кишки, желудка, мозга, мочевого пузыря, головы и шеи, яичника и простаты.- 15013617 При "комбинированной терапии" пациентов лечат специфическим агентом, связывающим целевой антиген, в комбинации с химиотерапевтическим или противоопухолевым агентом и/или с лучевой терапией. Рак лечат по протоколу добавления специфического связывающего агента к мутантному EGFr полипептиду, специфического связывающего агента к мутантному РБК полипептиду и/или специфического связывающего агента к мутантному B-Raf полипептиду к стандартной терапии первой и второй линии. План протокола рассматривает эффективность как показатель, оцениваемый уменьшением массы опухоли, а также способностью снижать обычные дозы стандартной химиотерапии. Это снижение дозы позволяют проводить дополнительную и/или продолжительную терапию за счт снижения связанной с дозой токсичности химиотерапевтического агента."Монотерапия" относится к лечению нарушения с помощью иммунотерапии пациентов, в отсутствие химиотерапевтического и противоопухолевого агента. Полипептиды, фрагменты и слитые белки В некоторых вариантах изобретения вариант с делецией является фрагментом полноразмерного мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент соответствует эпитопу мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент является природным(например, вследствие in vivo протеазной активности). В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент синтезирован химическими методами. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент может быть связан с полипептидом, образуя слитый белок мутантного EGFr. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент имеет протяжнность по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент имеет протяжнность по меньшей мере 14, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 70 аминокислот. В некоторых вариантах изобретения предусматривается вариант с делецией, который является фрагментом полноразмерного мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент соответствует эпитопу мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент является природным (например, вследствие in vivo протеазной активности). В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент синтезирован химическими методами. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент может быть связан с полипептидом, образуя слитый белок мутантного PI3K. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент имеет протяжнность по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент имеет протяжнность по меньшей мере 14, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 70 аминокислот. В некоторых вариантах изобретения предусматривается вариант с делецией, который является фрагментом полноразмерного мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент соответствует эпитопу мутантного В-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент является природным (например, вследствие in vivo протеазной активности). В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент синтезирован химическими методами. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент может быть связан с полипептидом, образуя слитый белок мутантного BRaf. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент имеет протяжнность по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент имеет протяжнность по меньшей мере 14, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 70 аминокислот. В некоторых вариантах изобретения мутантный полипептид может быть связан по меньшей мере с одной небелковой группой. Такие группы включают, но без ограничения, N-связанные или О-связанные углеводные цепи, водорастворимые полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ, PEG) и его производные (см., например, патент США 4179337). Другие химические модификации, подпадающие под этот термин, включают, но без ограничения, сополимеры этиленгликоля с пропиленгликолем, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт и родственные молекулы. В некоторых вариантах изобретения мутантный EGFr полипептид может быть модифицирован в произвольных положениях внутри молекулы, или в заданных положениях внутри молекулы, и может включать одну, две, три или более присоединнные химические группы. В некоторых вариантах изобретения мутантный EGFr полипептид может также быть модифицирован в заданных положениях в полипептиде, таких как аминоконец или выбранный лизиновый или аргининовый остаток внутри полипептида. Другие химические модификации включают, но без ограничения, детектируемую метку, такую как ферментная, флуоресцентная, изотопная или аффинная метка, способствующие обнаружению и выделению мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный PI3K полипептид может быть модифицирован в произвольных положениях внутри молекулы, или в заданных положениях внутри молекулы, и может включать одну, две, три или более присоединнные химические группы. В некоторых вариантах изобретения мутантный PI3K полипептид может также быть модифицирован в заданных положениях в полипептиде, таких как аминоконец или выбранный лизиновый или аргининовый остаток внутри полипептида. Другие химические модификации включают, но без ограничения, детектируемую метку, такую как ферментная, флуоресцентная, изотопная или аффинная метка, способствующие обнаружению и выделению мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный B-Raf полипептид может быть модифицирован в- 16013617 произвольных положениях внутри молекулы, или в заданных положениях внутри молекулы, и может включать одну, две, три или более присоединнные химические группы. В некоторых вариантах изобретения мутантный В-Raf полипептид может также быть модифицирован в заданных положениях в полипептиде, таких как аминоконец или выбранный лизиновый или аргининовый остаток внутри полипептида. Другие химические модификации включают, но без ограничения, детектируемую метку, такую как ферментная, флуоресцентная, изотопная или аффинная метка, способствующие обнаружению и выделению мутантного В-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения предусматривается слитый белок мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный EGFr полипептид может быть слит с гомологичным полипептидом с образованием гомодимера или с гетерологичным полипептидом с образованием гетеродимера. Типичные гетерологичные полипептиды и пептиды включают, но без ограничения эпитоп, способствующий детектированию и/или выделению слитого белка; трансмембранный рецепторный белок или его участок, такой как внеклеточный домен, трансмембранный домен или внутриклеточный домен; лиганд или его участок, который связывается с трансмембранным рецепторным белком; фермент или его каталитически активный участок; полипептид, промотирующий олигомеризацию, включая, но без ограничения, домен лейциновой "застжки-молнии"; полипептид, который повышает стабильность слитого белка, включая, но без ограничения, константную область иммуноглобулина; и полипептид, обладающий каталитической активностью, отличной от терапевтической активности мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный EGFr полипептид или слитый белок мутантного EGFr может быть связан с N-концевым метионином, который может содействовать экспрессии в прокариотических клетках, таких как Е. coli. В некоторых вариантах изобретения предусматривается слитый белок мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный PI3K полипептид может быть слит с гомологичным полипептидом с образованием гомодимера или с гетерологичным полипептидом с образованием гетеродимера. Типичные гетерологичные полипептиды и пептиды включают, но без ограничения: эпитоп, способствующий детектированию и/или выделению слитого белка; трансмембранный рецепторный белок или его участок, такой как внеклеточный домен, трансмембранный домен или внутриклеточный домен; лиганд или его участок, который связывается с трансмембранным рецепторным белком; фермент или его каталитически активный участок; полипептид, промотирующий олигомеризацию, включая, но без ограничения, домен лейциновой "застжки-молнии"; полипептид, который повышает стабильность слитого белка, включая, но без ограничения, константную область иммуноглобулина; и полипептид, обладающий каталитической активностью, отличной от терапевтической активности мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный PI3K полипептид или слитый белок мутантного PI3K может быть связан с N-концевым метионином, который может содействовать экспрессии в прокариотических клетках, таких как Е. coll. В некоторых вариантах изобретения предусматривается слитый белок мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный B-Raf полипептид может быть слит с гомологичным полипептидом с образованием гомодимера или с гетерологичным полипептидом с образованием гетеродимера. Типичные гетерологичные полипептиды и пептиды включают, но без ограничения эпитоп,способствующий детектированию и/или выделению слитого белка; трансмембранный рецепторный белок или его участок, такой как внеклеточный домен, трансмембранный домен или внутриклеточный домен; лиганд или его участок, который связывается с трансмембранным рецепторным белком; фермент или его каталитически активный участок; полипептид, промотирующий олигомеризацию, включая, но без ограничения, домен лещиновой "застжки-молнии"; полипептид, который повышает стабильность слитого белка, включая, но без ограничения, константную область иммуноглобулина; и полипептид, обладающий каталитической активностью, отличной от терапевтической активности мутантного В-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный В-Raf полипептид или слитый белок мутантного В-Raf может быть связан с N-концевым метионином, который может содействовать экспрессии в прокариотических клетках, таких как Е. coli. В некоторых вариантах изобретения гетерологичный или гомологичный полипептид слит с аминоконцом мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения гетерологичный или гомологичный полипептид слит с карбоксиконцом мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения один или более гетерологичных или гомологичных полипептидов или пептидов слиты как с амино-, так и с карбоксиконцом мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения полипептид слит непосредственного с мутантным EGFr полипептидом. В некоторых вариантах изобретения полипептид слит с мутантным EGFr полипептидом с помощью линкерной или адаптерной молекулы,известной в уровне техники. В некоторых из таких вариантов изобретения линкерная или адаптерная молекула создана таким образом, что она содержит сайт расщепления протеазами, позволяющий разделять слитые полипептиды. В некоторых вариантах изобретения гетерологичный или гомологичный полипептид слит с аминоконцом мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения гетерологичный или гомологичный полипептид слит с карбоксиконцом мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изо- 17013617 бретения один или более гетерологичных или гомологичных полипептидов или пептидов слиты как с амино-, так и с карбоксиконцом мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения полипептид слит непосредственного с мутантным PI3K полипептидом. В некоторых вариантах изобретения полипептид слит с мутантным PI3K полипептидом с помощью линкерной или адаптерной молекулы,известной в уровне техники. В некоторых из таких вариантов изобретения линкерная или адаптерная молекула создана таким образом, что она содержит сайт расщепления протеазами, позволяющий разделять слитые полипептиды. В некоторых вариантах изобретения гетерологичный или гомологичный полипептид слит с аминоконцом мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения гетерологичный или гомологичный полипептид слит с карбоксиконцом мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения один или более гетерологичных или гомологичных полипептидов или пептидов слиты как с амино-, так и с карбоксиконцом мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения полипептид слит непосредственного с мутантным B-Raf полипептидом. В некоторых вариантах изобретения полипептид слит с мутантным В-Raf полипептидом с помощью линкерной или адаптерной молекулы, известной в уровне техники. В некоторых из таких вариантов изобретения линкерная или адаптерная молекула создана таким образом, что она содержит сайт расщепления протеазами, позволяющий разделять слитые полипептиды. Векторы, клетки-хозяева, трансгенные животные и получение и очистка белков В некоторых вариантах изобретения предусматривается вектор, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий мутантный EGFr полипептид. В некоторых вариантах изобретения мутантный EGFr полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ IDNO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах изобретения мутантныйEGFr полипептид содержит по меньшей мере одну EGFr мутацию, выбранную из: L688P, Q701H, K745N,C781R, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т 790 М, L828stop, Q849R, F910L и V948A. В некоторых вариантах изобретения вектор представляет собой экспрессирующий вектор (вектор экспрессии). В некоторых вариантах изобретения предусматривается вектор, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий мутантный PI3K полипептид. В некоторых вариантах изобретения мутантный PI3K полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах изобретения мутантныйPI3K полипептид содержит по меньшей мере одну PI3K мутацию, выбранную из Е 542 К, Е 545 А иH1047L. В некоторых вариантах изобретения вектор представляет собой экспрессирующий вектор (вектор экспрессии). В некоторых вариантах изобретения предусматривается вектор, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий мутантный B-Raf полипептид. В некоторых вариантах изобретения мутантный B-Raf полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах изобретения мутантный B-Raf полипептид содержит по меньшей мере одну B-Raf мутацию, выбранную из: V542E и К 545 Е. В некоторых вариантах изобретения вектор представляет собой экспрессирующий вектор (вектор экспрессии). В некоторых вариантах изобретения экспрессирующий вектор может содержать промотор, который распознатся организмом-хозяином и функционально связывается с нуклеотидной молекулой, кодирующей мутантный EGFr. В некоторых вариантах изобретения нативный или гетерологичный промотор можно использовать в зависимости от клетки-хозяина, используемой для экспрессии и получения заданного белка. Типичные промоторы для применения с прокариотическими хозяевами включают, но без ограничения, промоторные системы бета-лактамазы и лактозы; щелочной фосфатазы; промоторную систему триптофана (trp); и гибридные промоторы, такие как tac промотор. В некоторых вариантах изобретения можно использовать другие бактериальные промоторы. Последовательности известных бактериальных промоторов опубликованы, это позволяет специалисту в данной области техники лигировать их к заданной(ым) нуклеотидной(ым) последовательности(ям), используя линкеры или адаптеры, необходимые для введения любых заданных сайтов рестрикции. Подходящие промоторы для применения с дрожжами-хозяевами также хорошо известны в уровне техники. В некоторых вариантах изобретения энхансеры дрожжей, предпочтительно, применяются с промоторами дрожжей. Подходящие промоторы для применения с клетками-хозяевами млекопитающих хорошо известны. Типичные промоторы для применения с клетками-хозяевами млекопитающих включают, но без ограничения, промоторы, полученные из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус птичьей оспы, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус бычьей папилломы, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и, наиболее предпочтительно, вирус обезьян (зелной мартышки) 40 (SV40). Типичные промоторы млекопитающих включают, но без ограничения, гетерологичные промоторы млекопитающих. Типичные гетерологичные промоторы млекопитающих включают, но без ограничения, промоторы теплового шока и промотор актина.- 18013617 Типичные промоторы, которые можно использовать для экспрессии мутантных EGFr полинуклеотидов, включают, но без ограничения, область раннего промотора SV40 (Benoist and Chambon (1981),Nature, 290: 304-310); промотор CMV; промотор, содержащийся в 3' длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (Yamamoto et al. (1980), Cell, 22: 787-97); промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wagner et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78: 1444-5); регуляторные последовательности гена металлотионина (Brinster et al. (1982), Nature, 296: 39-42); векторы экспрессии прокариот, такие как промотор бета-лактамазы (Villa-Kamaroff et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75: 3727- 31); и tac промотор (DeBoer, et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-25). В некоторых вариантах изобретения энхансерная последовательность может быть включена в вектор для повышения транскрипции в эукариотических клетках-хозяевах. Типичные энхансерные последовательности из генов млекопитающих включают, но без ограничения, глобин, эластазу, альбумин, альфафетопротеин и инсулин. В некоторых вариантах изобретения применяют энхансер вируса. Типичные энхансерные последовательности для активации эукариотических промоторов включают, но без ограничения, энхансер SV40, ранний промотор/энхансер цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы и энхансеры аденовирусов. В некоторых вариантах изобретения энхансер может быть сплайсирован в вектор в положение 5' или 3' к кодирующей области полипептида. В некоторых вариантах изобретения энхансер расположен в сайте 5' от промотора. В некоторых вариантах изобретения энхансер расположен в сайте 3' от конца кодирующей области полипептида. В некоторых вариантах изобретения векторами являются такие векторы, которые совместимы по меньшей мере с одной из клеток-хозяев: бактериальной, насекомого или млекопитающего. Примеры векторов включают, но без ограничения, pCRII, pCR3 и pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, CA),pBSII (Stratagene Company, La Jolla, CA), pET15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacII; Invitrogen), pDSR-альфа (опубликованная патентная заявка РСТ No. WO90/14363) и pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, NY). Примеры векторов включают, но без ограничения, космиды, плазмиды и модифицированные вирусы, совместимые с выбранной клеткой-хозяином. В некоторых вариантах изобретения векторы могут включать плазмиды, в том числе, но без ограничения, производные плазмиды Bluescript (высококопийная фаг(е)мида на основе ColE1, Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla CA), плазмиды для ПЦРклонирования, созданные для клонирования Taq-амплифицированных продуктов ПЦР (например, набор ТОРО ТА Cloning Kit, производные плазмиды PCR2.1, Invitrogen, Carlsbad, CA), и векторы млекопитающих, дрожжевые или вирусные векторы, такие как бакуловирусная система экспрессии (производные плазмиды рВасРАК, Clontech, Palo Alto, CA). В некоторых вариантах изобретения рекомбинантные молекулы можно вводить в клетки-хозяева с помощью трансформации, трансфекции, инфицирования,электропорации или другими известными методами. Термин "трансфекция" относится к приобретению клеткой-хозяином вектора экспрессии, вне зависимости от того, экспрессируются ли на самом деле какие-либо кодирующие последовательности. Рядовым специалистам в данной области техники известно множество способов трансфекции, включая, но без ограничения, осаждение с помощью СаРО 4 и электропорацию. В некоторых вариантах изобретения трансфекцию считают успешной, когда в клетке-хозяине наблюдается любой показатель функционирования трансфецированного вектора. В некоторых вариантах изобретения клетки-хозяева могут быть прокариотическими клеткамихозяевами (такими как Е. coli) или эукариотическими клетками-хозяевами (такими как клетка дрожжей,клетка насекомого или клетка позвоночного). В некоторых вариантах изобретения прокариотические клетки-хозяева, такие как Е. coli, продуцируют негликозилированный белок; например негликозилированный shBCMA и негликозилированный shTACI, которые могут иметь преимущество перед гликозилированными эукариотическими молекулами. В некоторых вариантах изобретения клетка-хозяин, будучи культивирована в подходящих условиях, экспрессирует полипептид по изобретению, который можно затем собрать из культуральной среди (если клетка-хозяин секретирует его в среду) или непосредственно из клетки-хозяина, продуцирующей его (если он не секретируется). В некоторых вариантах изобретения при выборе подходящей клетки-хозяина принимают во внимание различные факторы, такие как нужный уровень экспрессии, модификации полипептидов, желательные или необходимые для активности, такие как гликозилирование или фосфорилирование, и/или простота фолдинга (скручивания) в биологически активную молекулу. Ряд подходящих клеток-хозяев известен в уровне техники и многие имеются в Американской коллекции типовых культур (АТСС), Manassas, VA. Примеры клеток-хозяев включают, но без ограничения,клетки млекопитающих, такие как клетки яичников китайского хомячка (СНО) (АТСС No. CCL61), клетки СНО DHFR (Urlaub et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 4216-20), человеческие эмбриональные почечные клетки (НЕК) 293 или 293 Т (АТСС No. CRL1573) и клетки 3 Т 3 cells (АТСС No. CCL92). Селекция подходящих клеток-хозяев млекопитающих и методы трансформации, культивирования, амплификации, скрининга и продуцирования и очистки продукта известны в уровне техники. Примеры клетокхозяев включают, но без ограничения линии клеток обезьян COS-1 (ATCC No. CRL1650) и COS-7 (ATCCNo. CRL1651), и линия клеток CV-1 (ATCC No. CCL70). Примеры клеток-хозяев млекопитающих включают, но без ограничения, клеточные линии приматов и клеточные линии грызунов, включая трансформированные линии клеток. Примеры клеток-хозяев включают, но без ограничения, нормальные диплоидные клетки, клеточные штаммы, полученные из in vitro культуры первичной ткани, клеточные линии стволовых клеток и первичные эксплантаты. В некоторых вариантах изобретения клетки-кандидаты могут быть генотипически дефицитными по гену селекции, или могут содержать доминантный ген селекции. Примеры клеток-хозяев включают, но без ограничения, клетки мышиной нейробластомы N2A,клетки HeLa, мышиные L-929 клетки, 3 Т 3 линии Swiss, Balb-с или NIH мышей, клеточные линии хомяка ВНК или НаК, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур, Manassas, VA). Каждая из этих клеточных линий известна и доступна специалистам в области экспрессии белков. В некоторых вариантах изобретения клетки-хозяева могут быть бактериальными клетками. Примеры бактериальных клеток включают, но без ограничения, различные штаммы Е. coli (например, НВ 101,(ATCC No. 33694) DH5a, DH10 и МС 1061 (ATCC No. 53338. Примеры клеток-хозяев включают, но без ограничения, различные штаммы Pseudomonas spp., В. subtilis, других Bacillus spp., и Streptomyces spp. Многие штаммы клеток дрожжей, известные специалистам в данной области техники, также доступны в качестве клеток-хозяев для экспрессии полипептидов. В некоторых таких вариантах изобретения используются продажные системы экспрессии, например, система экспрессии Pichia Expression System(Invitrogen, San Diego, CA), в соответствии с инструкциями производителя. В некоторых вариантах изобретения такая система основана на пре-про-альфа последовательности для управления экспрессией. В некоторых вариантах изобретения транскрипция инсерта (вставки) запускается промотором алкоголь оксидазы (АОХ 1) при индукции метанолом. В некоторых вариантах изобретения клетка-хозяин может представлять собой Saccharomyces cerivisae. В некоторых вариантах изобретения в качестве клеток-хозяев могут использоваться системы растительной клетки. В некоторых таких вариантах изобретения системы используются растительной клетки,трансфецированной при использовании экспрессирующих векторов вирусов (например, вирус мозаики цветной капусты, CaMV или вирус табачной мозаики). В некоторых вариантах изобретения полинуклеотид, кодирующий мутантный EGFr полипептид,мутантный PI3K полипептид и/или мутантный В-Raf полипептид, клонируют в экспрессирующий вектор бакуловируса, такой как pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). В некоторых вариантах изобретения такой вектор можно использовать в соответствии с указаниями производителя (PharMingen) для инфицирования клеток Spodoptera frugiperda в sF9 в безбелковых средах и для продуцирования рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный EGFr полипептид, мутантный PI3K полипептид и/или мутантный В- Raf полипептид очищают и концентрируют из таких сред на колонке с гепарин-сефарозой (Pharmacia). В некоторых вариантах изобретения в качестве клеток-хозяев могут использоваться системы клеток насекомого. Некоторые такие системы описаны, например, в Kitts et al. (1993), Biotechniques, 14: 810-7,Lucklow(1993), Curr. Opin. Biotechnol, 4: 564-72, и Lucklow et al. (1993), J. Virol, 67: 4566-79. Примеры клеток насекомых включают, но без ограничения, Sf-9 и Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA). В некоторых вариантах изобретения трансформацию или трансфекцию полинуклеотида, кодирующего мутантный EGFr полипептид, мутантный PI3K полипептид и/или мутантный В-Raf полипептид в выбранную клетку-хозяина можно осуществлять общеизвестными методами, включая такие методы как применение хлористого кальция, электропорация, микроинъекция, липофекция или метод с DEAEдекстраном. В некоторых вариантах изобретения выбранный метод частично зависит от типа используемой клетки-хозяина. Эти методы и другие подходящие методы хорошо известны специалистам и представлены, например, в Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989. Клетки-хозяева, содержащие (введнные трансформацией или трансфекцией) экспрессирующий вектор, кодирующий мутантный EGFr полипептид, мутантный PI3K полипептид и/или мутантный В-Raf полипептид, можно культивировать, используя стандартные среды, хорошо известные опытным специалистам. В некоторых вариантах изобретения среды могут содержать все питательные вещества, необходимые для роста и жизнеспособности клеток. В некоторых вариантах изобретения клетки Е. coli можно культивировать в бульоне Луриа (LB) и/или в среде Terrific Broth (ТВ). Примеры сред для культивирования эукариотических клеток включают, но без ограничения, среды RPMI1640, MEM, DMEM, каждая из которых может быть дополнена сывороткой и/или факторами роста в соответствии с конкретной культивируемой клеточной линией. В некоторых вариантах изобретения клетки насекомого можно культивировать в среде Грейса, дополненной дрожжевым экстрактом, гидролизатом лактальбумина и/или фетальной телячьей сывороткой. В некоторых вариантах изобретения в качестве дополнения к средам добавляют антибиотик или другое соединение, пригодное для селективного роста трансфецированных или трансформированных клеток. В некоторых вариантах изобретения соединение для применения выбирают с учтом селективного маркерного элемента, присутствующего на плазмиде, с помощью которой была трансформирована клетка-хозяин. В некоторых вариантах изобретения, в которых селективный маркерный элемент нест- 20013617 устойчивость к канамицину, соединением, добавляемым к культуральной среде, является канамицин. Примеры соединений для селективного роста включают, но без ограничения, ампициллин, тетрациклин и неомицин. В некоторых вариантах изобретения количество мутантного EGFr полипептида, мутантного PI3K полипептида и/или мутантного B-Raf полипептида, продуцированного в клетке-хозяине, можно оценивать стандартными методами, известными в уровне техники. Примеры методов включают, но без ограничения, Вестерн-блот анализ, электрофорез в SDS в полиакриламидном геле, электрофорез в неденатурирующем геле, разделение методом ВЭЖХ, иммунопреципитацию и анализ активности. В некоторых вариантах изобретения мутантные EGFr полипептиды, мутантные PI3K полипептиды и/или мутантные В-Raf полипептиды, которые экспрессируются в прокариотических клетках-хозяевах,могут присутствовать в растворимом виде либо в периплазматическом пространстве, либо в цитоплазме,или в нерастворимом виде как часть внутриклеточных тел включения. В некоторых вариантах изобретения мутантные EGFr полипептиды, мутантные PI3K полипептиды и/или мутантные B-Raf полипептиды могут экстрагироваться из клетки-хозяина любым стандартным методом, известным специалистам. В некоторых вариантах изобретения клетки-хозяева могут лизироваться с целью высвобождения содержимого периплазмы/цитоплазмы френч-прессом, гомогенизацией и/или ультразвуком с последующим центрифугированием. В некоторых вариантах изобретения растворимые формы мутантных EGFr полипептидов, мутантных PI3K полипептидов и/или мутантных B-Raf полипептидов, либо присутствующие в цитоплазме, либо высвобождающиеся из периплазматического пространства, можно дополнительно очищать методами,известными в уровне техники. В некоторых вариантах изобретения мутантные EGFr полипептиды, мутантные PI3K полипептиды и/или мутантные B-Raf полипептиды высвобождаются из бактериального периплазматического пространства методами осмотического шока. Если мутантный EGFr полипептид, мутантный PI3K полипептид и/или мутантный В-Raf полипептид образует тела включения, они часто могут связываться с внутренней и/или наружной клеточными мембранами и, следовательно, после центрифугирования, в основном находятся в материале осадка (пеллет). В некоторых вариантах изобретения материал осадка можно затем обрабатывать при экстремальных значениях рН или хаотропным агентом, таким как детергент, гуанидин, производные гуанидина, мочевина или производные мочевины в присутствии восстановителя, такого как дитиотреитол, при щелочном рН, или трискарбоксиэтилфосфина при кислом рН, для высвобождения, разрушения и солюбилизации тел(ец) включения. В некоторых вариантах изобретения мутантный EGFr полипептид, мутантный PI3K полипептид и/или мутантный ВRaf полипептид можно затем анализировать, применяя гель-электрофорез, иммунопреципитацию и т.п В некоторых вариантах изобретения мутантный EGFr полипептид, мутантный PI3K полипептид и/или мутантный В-Raf полипептид можно выделять традиционными методами, такими как методы, представленные ниже и в Marston et al. (1990), Meth. Enz., 182: 264-75. В некоторых вариантах изобретения мутантный EGFr полипептид, мутантный PI3K полипептид и/или мутантный B-Raf полипептид после выделения может быть биологически неактивным. В некоторых вариантах изобретения для восстановления биологической активности можно применять методы"рефолдинга" или превращения структуры полипептида в третичную и образования дисульфидных связей. В некоторых вариантах изобретения биологическую активность можно восстанавливать обработкой солюбилизированного полипептида, обычно, при значении рН выше 7, хаотропом с конкретной концентрацией. Хаотроп выбирают совершенно так же, как для солюбилизации тел(ец) включения, но, в некоторых вариантах изобретения, хаотроп применяют в более низкой концентрации, и необязательно применяют те же хаотропы, что и для солюбилизации. В некоторых вариантах изобретения раствор для рефолдинга/окисления также содержит партнр-восстановитель или партнр-восстановитель плюс его окисленная форма в специальном соотношении для того, чтобы создать конкретный редокс-потенциал,способствующий перегруппировке дисульфидных связей с образованием в белке дисульфидного(ых) мостика(ов). Примеры редокс-пар включают, но без ограничения, цистеин/цистамин, глутатион(GSH)/дитиобис GSH, хлорид меди, дитиотреитол(DTT)/дитиан DTT и 2-меркаптоэтанол(bME)/дитиоb(МЕ). В некоторых вариантах изобретения для повышения эффективности рефолдинга можно использовать или может быть необходим сорастворитель, и примеры сорастворителей (сопартнров), применяемые для этой цели, включают, но без ограничения, глицерин, полиэтиленгликоль различной молекулярной массы, аргинин и родственные молекулы. В некоторых вариантах изобретения мутантные EGFr полипептиды, мутантные PI3K полипептиды и/или мутантные B-Raf полипептиды можно получать синтетическими химическими методами. В некоторых вариантах изобретения метод химического синтеза может включать твердофазный пептидный синтез. В некоторых вариантах изобретения в методах химического синтеза могут использоваться методы, известные в уровне техники, такие, которые представлены в Merrifield et al. (1963), J. Am. Chem. Soc,85: 2149; Houghten et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5132; и Stewart and Young (1984), SolidPhase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. В некоторых вариантах изобретения полипептиды можно синтезировать с метионином или без метионина на аминоконце. В некоторых вариантах изобретения синтезированные химическими методами мутантные EGFr полипептиды, мутантные PI3K- 21013617 полипептиды и/или мутантные B-Raf полипептиды можно окислять методами, представленными в этих ссылочных материалах, с образованием дисульфидных мостиков. В некоторых вариантах изобретения полученные таким образом мутантные EGFr полипептиды, мутантные PI3K полипептиды и/или мутантные B-Raf полипептиды сохраняют по меньшей мере одну биологическую активность, ассоциированную с нативным или полученным методами рекомбинантной ДНК мутантным EGFr полипептидом, мутантным PI3K полипептидом и/или мутантным В-Raf полипептидом. В некоторых вариантах изобретения для экспрессии мутантных EGFr полипептидов, мутантныхPI3K полипептидов и/или мутантных B-Raf полипептидов можно использовать трансгенных животных. В некоторых вариантах изобретения можно использовать трансгенное млекопитающее животное (например, корову или козу) и получать гликозилированный мутантный EGFr полипептид, гликозилированный мутантный PI3K полипептид и/или гликозилированный мутантный В-Raf полипептид в молоке животного. В некоторых вариантах изобретения для получения гликозилированного мутантного EGFr полипептида, гликозилированного мутантного PI3K полипептида и/или гликозилированного мутантного BRaf полипептида можно использовать растения, известные в уровне техники. В некоторых вариантах изобретения мутантный EGFr полипептид очищают до практически чистого состояния. В некоторых вариантах изобретения мутантный PI3K полипептид очищают до практически чистого состояния. В некоторых вариантах изобретения мутантный B-Raf полипептид очищают до практически чистого состояния. Специалистам в данной области техники известны конкретные методы очистки белков. В некоторых вариантах изобретения очистка белка включает предварительное отделение полипептидных фракций от неполипептидных фракций. В некоторых вариантах изобретения полипептиды очищают методами хроматографии и/или электрофореза. Примеры методов очистки включают, но без ограничения, преципитацию (осаждение) сульфатом аммония; ПЭГ-преципитацию; иммунопреципитацию; тепловую (термическую) денатурацию с последующим центрифугированием; хроматографию,включая, но без ограничения, аффинную хроматографию (например, на протеин-А-сефарозе), ионообменную хроматографию, эксклюзионную хроматографию и обращнно-фазовую хроматографию; гельфильтрацию; хроматографию на гидроксилапатите; изоэлектрическое фокусирование; электрофорез в полиакриламидном геле; и комбинации этих и других методов. В некоторых вариантах изобретения полипептид очищают быстрой жидкостной хроматографией белков или жидкостной хроматографией высокого давления (ЖХВЭ). В некоторых вариантах изобретения стадии очистки можно изменять или некоторые стадии можно опускать и вс равно способ остатся подходящим для получения практически чистого полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный EGFr полипептид, мутантный PI3K полипептид и/или мутантный B-Raf полипептид можно получать с одной или более аффинных меток, таких как гексагистидин или другой малый пептид, такой как FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) или myc(Invitrogen), по карбоксильному или по аминоконцу, и очищать в одну стадию на аффинной колонке. В некоторых вариантах изобретения полигистидин с высокой аффинностью и специфичностью связывается с никелем, поэтому для очистки меченных полигистидином партнров по специфическому связыванию можно использовать колонку для никель-аффинной хроматографии (такую как Qiagen). См., например, Ausubel et al., eds. (1993), Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John WileySons, New York. В некоторых вариантах изобретения можно использовать более одной стадии очистки. В некоторых вариантах изобретения рассчитывают степень очистки полипептидного препарата. Специалистам в данной области техники известны конкретные методы расчта степени очистки. Некоторые типичные способы включают, но без ограничения, определение специфической связывающей активности препарата и оценку количества полипептида в препарате методом SDS/PAGE. Некоторые типичные способы оценки степени очистки полипептидного препарата включают расчт связывающей активности препарата и сравнение е со связывающей активностью начального экстракта. В некоторых вариантах изобретения результаты такого расчта выражаются как "кратность очистки". Единицы, применяемые для того, чтобы представить величину связывающей активности, зависят от конкретного анализа. В некоторых вариантах изобретения полипептид очищают частично. В некоторых вариантах изобретения частичную очистку можно проводить, используя меньше стадий или применяя другие формы той же общей схемы очистки. Например, в некоторых вариантах изобретения катионообменная колоночная хроматография на ЖХВЭ хроматографе обычно дат более высокую "кратность очистки", чем тот же метод с применением системы хроматографии низкого давления. В некоторых вариантах изобретения способы, дающие более низкую степень очистки, могут способствовать более высокому общему выходу полипептида и сохранению связывающей активности полипептида. В некоторых примерах электрофоретическая миграция полипептида может меняться, иногда заметно, в различных условиях SDS/PAGE. См., например, Capaldi et al. Biochem. Biophys/Res Comm, 16: 425(1977). Понятно, что в различных условиях электрофореза средние (кажущиеся) молекулярные массы очищенного или частично очищенного полипептида могут быть различными. Трансгенные животные В некоторых вариантах изобретения предусматривается трансгенные животные, содержит один или более полинуклеотидов, кодирующие один или более мутантных EGFr полипептидов, один или более- 22013617 мутантных PI3K полипептидов и/или один или более мутантных В-Raf полипептидов. В некоторых вариантах изобретения трансгенные животные включают, но без ограничения, грызунов, таких как мыши или крысы, кроликов, коз, овец и других сельскохозяйственных животных. Некоторых трансгенных животных можно получать общеизвестными методами, включая, но без ограничения, методы, описанные в патенте США 5489743 и в Международной патентной заявке WO 94/28122. В некоторых вариантах изобретения для создания трансгенных животных можно использовать области транскрипционного контроля животных, которые проявляют тканевую специфичность. Типичные области транскрипционного контроля для применения в случае тканеспецифической экспрессии в трансгенных животных включают, но без ограничения контрольную область гена эластазы I, активную в панкреатических ацинарных клетках (Swift et al. (1984), Cell, 38: 639-46; Ornitz et al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald (1987), Hepatology, 7: 425-515); контрольную область гена инсулина, активную в панкреатических бета клетках (Hanahan (1985), Nature, 315: 115-122); контрольную область гена иммуноглобулина, активную в лимфоидных клетках (Grosschedl et al. (1984), Cell, 38: 64758; Adames et al. (1985), Nature, 318: 533-8; Alexander et al. (1987), Mol. Cell. Biol, 7: 1436-44); контрольную область вируса опухоли молочной железы мышей, активную в клетках яичек, молочной железы,лимфоидных и тучных клетках (Leder et al. (1986), Cell, 45: 485-95); контрольную область гена альбумина, активную в печени (Pinkert et al. (1987), Genes and Devel., 1: 268-76); контрольную область гена альфа-фетопротеина, активную в печени (Krumlauf et al. (1987), Mol. Cell. Biol., 5: 1639-48; Hammer et al.(1987), Science, 235: 53-58); контрольную область гена альфа-1-антитрипсина, активную в печени (Kelseyet al. (1987), Genes and Devel., 1: 161-171); контрольную область гена бета-глобина, активную в миелоидных клетках (Mogram et al. (1985), Nature, 315: 338-340; Kollias et al. (1986), Cell, 46: 89-94); контрольную область гена основного белка миелина, активную в олигодендроцитах в мозге (Readhead et al. (1987),Cell, 48: 703-712); контрольную область гена лгкой цепи-2 миозина, активную в скелетных мышцах(Sani (1985), Nature, 314: 283-286); и контрольную область гена гонадотропин-высвобождающего гормона, активную в гипоталамусе (Mason et al. (1986), Science, 234: 1372-8). В некоторых вариантах изобретения предусматривается животное, у которого разорван (т.е. "нокаутирован") полинуклеотид, кодирующий EGFr полипептид дикого типа, и заменн одним или более полинуклеотидов, кодирующих мутантный EGFr полипептид, так что уровень экспрессии EGFr полипептида дикого типа значительно снижается или полностью аннулируется в организме животного, и в его организме экспрессируется мутантный EGFr полипептид. В некоторых таких вариантах изобретения животных могут получать, используя такие методы и примы, которые описаны в патенте США 5557032, или другие методы, хорошо известные в уровне техники. В некоторых вариантах изобретения предусматривается животное, у которого модулируется активность промотора в отношении одного или более мутантных EGFr полипептидов (например, с помощью известных в уровне техники методов гомологичной рекомбинации) с целью изменения уровня экспрессии одного или более мутантных EGFr полипептидов. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии мутантного EGFr полипептида повышается. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии мутантного EGFr полипептида понижается. В некоторых вариантах изобретения предусматривается животное, у которого разорван (т.е. "нокаутирован") полинуклеотид, кодирующий PI3K полипептид дикого типа, и заменн одним или более полинуклеотидов, кодирующих мутантный PI3K полипептид, так что уровень экспрессии PI3K полипептида дикого типа значительно снижается или полностью аннулируется в организме животного, и в его организме экспрессируется мутантный РI3K полипептид. В некоторых таких вариантах изобретения животных могут получать, используя такие методы и примы, которые описаны в патенте США 5557032, или другие методы, хорошо известные в уровне техники. В некоторых вариантах изобретения предусматривается животное, у которого модулируется активность промотора в отношении одного или более мутантных PI3K полипептидов (например, с помощью известных в уровне техники методов гомологичной рекомбинации) с целью изменения уровня экспрессии одного или более мутантных PI3K полипептидов. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии мутантного РБК полипептида повышается. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии мутантного РБК полипептида понижается. В некоторых вариантах изобретения предусматривается животное, у которого разорван (т.е. "нокаутирован") полинуклеотид, кодирующий B-Raf полипептид дикого типа, и заменн одним или более полинуклеотидов, кодирующих мутантный B-Raf полипептид, так что уровень экспрессии B-Raf полипептида дикого типа значительно снижается или полностью аннулируется в организме животного, и в его организме экспрессируется мутантный B-Raf полипептид. В некоторых таких вариантах изобретения животных могут получать, используя такие методы и примы, которые описаны в патенте США 5557032,или другие методы, хорошо известные в уровне техники. В некоторых вариантах изобретения предусматривается животное, у которого модулируется активность промотора в отношении одного или более мутантных В-Raf полипептидов (например, с помощью известных в уровне техники методов гомологичной рекомбинации) с целью изменения уровня экспрессии одного или более мутантных В-Raf полипептидов. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии мутантного В-Raf полипептида- 23013617 повышается. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии мутантного В-Raf полипептида понижается. В некоторых вариантах изобретения трансгенное животное можно использовать для скрининга с целью определения подходящего лекарства. В некоторых вариантах изобретения определяют действие предполагаемого (подходящего, лекарства-кандидата) лекарства на трансгенное животное. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать экспрессию мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать экспрессию мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать активность мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность возможного лекарства понижать или предупреждать активность мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать активацию мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать активацию мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать аутофосфорилирование мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать аутофосфорилирование мутантного EGFr полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать связывание одного или более специфических связывающих агентов (агентов для специфического связывания) с мутантным EGFr полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать связывание одного или более специфических связывающих агентов (агентов для специфического связывания) с мутантным EGFr полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства уменьшать интенсивность заболевания или состояния, связанного с мутантным EGFr полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства уменьшать интенсивность рака, связанного с мутантным EGFr полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать экспрессию мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать экспрессию мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать активность мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность возможного лекарства понижать или предупреждать активность мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать активацию мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать активацию мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать аутофосфорилирование мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать аутофосфорилирование мутантного PI3K полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать связывание одного или более специфических связывающих агентов (агентов для специфического связывания) с мутантным PI3K полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать связывание одного или более специфических связывающих агентов (агентов для специфического связывания) с мутантным PI3K полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства уменьшать интенсивность заболевания или состояния, связанного с мутантным PI3K полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства уменьшать интенсивность рака, связанного с мутантным PI3K полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать экспрессию мутантного B-Raf полипептида. В некоторых; вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать экспрессию мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать активность мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность возможного лекарства понижать или предупреждать активность мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать активацию мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать активацию мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать аутофосфорилирование мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать аутофосфорилирование мутантного B-Raf полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать- 24013617 или предупреждать связывание одного или более специфических связывающих агентов (агентов для специфического связывания) с мутантным B-Raf полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать связывание одного или более специфических связывающих агентов (агентов для специфического связывания) с мутантным B-Raf полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства уменьшать интенсивность заболевания или состояния, связанного с мутантным B-Raf полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства уменьшать интенсивность рака, связанного с мутантным B-Raf полипептидом. Специфические связывающие агенты (агенты для специфического связывания) и антитела В некоторых вариантах изобретения предусматривается агент для специфического связывания с мутантным EGFr полипептидом. В некоторых вариантах изобретения предусматривается агент для специфического связывания с мутантным PI3K полипептидом. В некоторых вариантах изобретения предусматривается агент для специфического связывания с мутантным B-Raf полипептидом. В некоторых таких вариантах изобретения специфические связывающие агенты представляют собой антитела или их антиген-связывающие фрагменты. В некоторых вариантах изобретения моноклональные антитела можно получать методом гибридом,впервые описанным Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975). В некоторых вариантах изобретения моноклональные антитела можно получать методами рекомбинантной ДНК (патент США 4816567). В некоторых вариантах изобретения, относящихся к методу гибридом, мышь или другое подходящее животное-хозяина, включая, но без ограничения, хомяка или макака, иммунизируют таким образом,чтобы извлечь лимфоциты, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, специфически связывающиеся с белком, применяемым для иммунизации. В некоторых вариантах изобретения лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. В некоторых вариантах изобретения лимфоциты, или лимфоциты, обогащенные В клетками, сливают с клетками миеломы в модуле для слияния клеток в электрическом поле или применяя подходящий фузогенный (сливающий) агент, такой как полиэтиленгликоль, с образованием гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103,[Academic Press, 1996]). В некоторых вариантах изобретения гибридомные клетки засевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых, родительских клеток миеломы. В некоторых вариантах изобретения, если в родительских миеломных клетках отсутствует фермент гипоксантин гуанин фосфорибозилтрансфераза(HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом обычно включает гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), это вещества, которые предупреждают рост HGPRT-дефицитных клеток. В некоторых вариантах изобретения выбирают такие миеломные клетки, которые эффективно сливаются, поддерживают устойчивое продуцирование высокого уровня антител в выбранных антителопродуцирующих клетках и восприимчивы к среде, такой как среда HAT. Типичные линии миеломных клеток включают, но без ограничения, линии клеток мышиной миеломы, такие как клетки опухолей мышей МОР-21 и МС-11, имеющиеся в Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, и SP-2 или X63-Ag8-653 клетки, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур, Rockville, MarylandUSA. В некоторых вариантах изобретения для продуцирования человеческих антител используют линии клеток человеческой миеломы и/или гетеромиеломы мышь-человечек (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001(1984); Brodeur et ah, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, [1987]). В некоторых вариантах изобретения культуральную среду, в которой выращивают гибридомные клетки, анализируют на продуцирование моноклональных антител, специфических к антигену. В некоторых вариантах изобретения специфичность связывания моноклональных антител, продуцированных гибридомными клетками, определяют иммунопреципитацией или in vitro анализом связывания. Примеры анализов связывания включают, но без ограничения, радиоиммуноанализ (RLA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и анализ Скетчарда по Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220 (1980). В некоторых вариантах изобретения после того, как идентифицированы гибридомные клетки, которые продуцируют антитела заданной специфичности, аффинности и/или активности, клетки можно субклонировать методом ограниченных разведений и выращивать стандартными методами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1996). Примеры культуральных сред для этой цели включают, но без ограничения, среду DMEM и RPMI-1640. В некоторых вариантах изобретения гибридомные клетки можно выращивать in vivo в виде асцитных опухолей у животного. В некоторых вариантах изобретения моноклональные антитела, секретированные субклонами, соответствующим образом выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки традиционными методами очистки иммуноглобулинов, например, такими как разделение на протеин Асефарозе, хроматографией на гидроксилапатите, гель-электрофорезом или аффинной хроматографией. В некоторых вариантах изобретения полинуклеотид, кодирующий моноклональные антитела, легко выделять и секвенировать традиционными методами (например, с применением олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжлые и лгкие цепи монокло- 25013617 нальных антител). В некоторых таких вариантах изобретения гибридомные клетки служат в качестве предпочтительного источника такого полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения выделенный полинуклеотид можно помещать в экспрессирующие векторы. В некоторых таких вариантах изобретения экспрессирующие векторы трансфецируют в клетки-хозяева с целью синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Примеры клеток-хозяев включают, но без ограничения, клетки Е.coli, клетки COS зелной мартышки, клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы,которые иначе не продуцируют иммуноглобулиновый белок. В некоторых вариантах изобретения полинуклеотид может модифицироваться, например, ковалентным связыванием с последовательностью, кодирующей иммуноглобулин, целой или части последовательности, кодирующей неиммуноглобулиновый полипептид, при этом образуется "химерное" или "гибридное" антитело. В некоторых вариантах изобретения неиммуноглобулиновые полипептиды заменяются на константные домены антитела. В некоторых вариантах изобретения неиммуноглобулиновые полипептиды заменяются на один антиген-связывающий сайт вариабельных доменов антитела с образованием химерного бивалентного антитела, содержащего один антиген-связывающий сайт, обладающий специфичностью к целевому антигену, и другой антиген-связывающий сайт, обладающий специфичностью к другому антигену. В некоторых вариантах изобретения химерные или гибридные антитела можно получать in vitro,используя методы, известные в химии синтетических белков, включая, но без ограничения, методы с применением сшивающих агентов. В некоторых таких вариантах изобретения можно создавать иммунотоксины по реакции дисульфидного обмена или с образованием тиоэфирной связи. Примеры реагентов для этой цели включают, но без ограничения, иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются человеческие антитела к целевому антигену. В некоторых вариантах изобретения гибридомную технологию применяют для создания человеческих антител с использованием в качестве партнров по слиянию гетеромиелом (человек х мышь гибридных миелом) (см., например, Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur, et al., Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987). В некоторых вариантах изобретения клетки, секретирующие человеческие антитела, можно иммортализовать, инфицируя вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ, EBV) (James and Bell, J. Immunol. Methods 100: 5-40 [1987]). В некоторых вариантах изобретения иммортализация человеческих В клеток достигается введением определнной комбинации трансформирующих генов (Harm et al., Nature 400: 464-468 [1999]). В некоторых вариантах изобретения для получения человеческих антител используют трансгенные животные (например, мыши), способные, после иммортализации, продуцировать спектр человеческих антител, не продуцируя эндогенный иммуноглобулин (см., например, Jakobovits et al., Nature 362: 255258 [1993]; Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13: 65- 93 [1995]; Fishwild et al., Nat. Biotechnol. 14: 845-851 [1996]; Mendez et al., Nat. Genet. 15: 146-156 [1997]; Green, J. Immunol Methods 231: 11-23 [1999];Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727 [2000]; обзор в Little et al., Immunol. Today 21: 364370 [2000]). Было описано, что гомозиготная делеция гена соединительной области тяжлой цепи (JH) антитела у химерных и зародышевой линии мутантных мышей приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенос енного антитела (Jakobovits et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 2551-2555 [1993]). Перенос спектра генов зародышевого человеческого иммуноглобулина в таких зародышевой линии мутантных мышей приводит к продуцированию человеческих антител при антигенной стимуляции (Jakobovits et al., Nature 362: 255- 258 [1993]).Mendez et al. (Nature Genetics 15: 146-156 [1997]) получили линию трансгенных мышей, названных"Xenomouse II", которые, при антигенной стимуляции, генерируют высокоаффинные полностью человеческие антитела. Это достигается интеграцией локусов с большим числом оснований человеческой тяжлой цепи и лгкой цепи зародышевой линии в мышей с делецией в эндогенном JH сегменте. МышьXenoMouse II включает локус человеческой тяжлой цепи из 1020 т.н.о., содержащий около 66 VH генов, целые DH и JH области и три различных константных области (,и ), а также включает 800 т.н.о. человеческого к локуса, содержащего 32 гена V, J сегмента и C гена. В некоторых вариантах изобретения антитела, продуцированные в этих мышах, во всех отношениях очень напоминают антитела человека, включая реаранжировку, сборку и спектр генов. В некоторых вариантах изобретения человеческие антитела экспрессируются преимущественно по сравнению с эндогенными антителами вследствие делеции в эндогенном JH сегмента, которая предупреждает реаранжировку гена в мышином локусе. В некоторых вариантах изобретения трансгенное животное, содержащее гены человеческого иммуноглобулина (например, Xenomouse II (Abgenix, Inc., могут быть иммунизированы антигеном, представляющим особый интерес, таким как мутантный EGFr полипептид, мутантный PI3K полипептид и/или мутантный В-Raf полипептид. В некоторых вариантах изобретения сыворотки этих иммунизированных животных подвергают скринингу на реактивность антител против первичного антигена. В некоторых вариантах изобретения лимфоциты выделяют из лимфатических узлов или клеток селезнки, и их далее можно обогащать В клетками селекцией CD138-негативных и CD19+ клеток. В некоторых вариантах изобретения такие В клеточные культуры (ВСС) сливают с клетками миеломы, получая гибридомы,- 26013617 подробно описанные выше. В некоторых вариантах изобретения такие культуры В клеток подвергают дополнительному скринингу на реактивность против первичного антигена. Такой скрининг включает, но без ограничения, ELISA, конкурентный анализ с известными антителами, которые связывают нужный антиген, и in vitro связывание с транзиторно трансфецированными СНО клетками, экспрессирующими антиген. В некоторых вариантах изобретения единичные В клетки, секретирующие нужные антитела,идентифицируются с помощью специфического анализа на гемолитические бляшки. В некоторых вариантах изобретения клетки, нацеленные на лизис, представляют собой эритроциты овцы (SRBC), покрытые антигенами. В некоторых таких вариантах изобретения образование бляшек указывает на специфический опосредованный антигеном лизис клеток-мишеней и, тем самым, на присутствие культуры В клеток, секретирующих нужный иммуноглобулин и комплемент. В некоторых таких вариантах изобретения единичную антиген-специфическую плазматическую клетку в центре бляшки можно выделить и использовать для выделения мРНК. В некоторых вариантах изобретения полинуклеотид, кодирующий вариабельную область секретированного антитела, можно клонировать методом ПЦР обратной транскриптазой. В некоторых вариантах изобретения клонированный полинуклеотид далее встраивают в подходящий экспрессирующий вектор,такой как векторная кассета, такая как пкДНК (pcDNA) или вектор пкДНК, содержащий константные домены тяжлой и лгкой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах изобретения полученный вектор трансфецируют в клетки-хозяева (т.е. СНО клетки) и культивируют в традиционных питательных средах, подходящих для индукции промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов, кодирующих заданные последовательности. В некоторых вариантах изобретения технологию фагового дисплея используют для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro с помощью спектра генов вариабельного (V) домена иммуноглобулина иммунизированных доноров (см., например, McCafferty et al., Nature 348: 552-553[1990]; обзор в Kipriyanov and Little, Mol Biotechnol. 12: 173-201 [1999]; Hoogenboom and Chames, Immunol. Today 21: 371-378 [2000]). В некоторых вариантах изобретения гены V домена антитела клонируют в рамке считывания в ген либо основного, либо минорного оболочечного белка нитевидного бактериофага,такого как М 13 или fd, и визуализуют в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговой частицы. В некоторых вариантах изобретения нитевидная частица содержит копию одноцепочечной ДНК фагового генома, а селекции на основании функциональных свойств антитела также приводят к селекции гена, кодирующего антитело, проявляющее эти свойства. Фаговый дисплей можно осуществлять в различных форматах, включая, но без ограничения, форматы, определнные в следующих документах: Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3: 564- 571 [1993)]; Winter et al., Annu.Hoogenboom and Chames, Immunol. Today 21: 371-378 [2000]. Источники сегментов V-гена для фагового дисплея включают, но без ограничения, малую статистическую (случайную) комбинаторную библиотекуV генов из селезнки иммунизированной мыши (Clackson et al., (Nature 352: 624-628 [1991]) и набор V генов неиммунизированных человеческих доноров (Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), илиGriffiths et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993. В некоторых вариантах изобретения при естественном иммунном ответе гены антитела аккумулируют мутации с высокой скоростью (соматическая гипермутация). В некоторых вариантах изобретения ряд введнных изменений придат повышенную аффинность. В некоторых вариантах изобретения высокоаффинный поверхностный иммуноглобулин, предпочтительно, реплицируется и дифференцируется в процессе последующей антигенной стимуляции. В некоторых вариантах изобретения этот естественный процесс можно имитировать, используя метод, называемый "перетасовкой цепи" ("chain shuffling")(Marks et al., Bio/Technol. 10: 779-783 [1992]). В некоторых вариантах изобретения аффинность "первичных" человеческих антител, полученных фаговым дисплеем, можно повысить последовательной заменой генов V области тяжлой и лгкой цепей набором природных вариантов (спектром) генов V домена, полученных от неиммунизированных доноров, что способствует продуцированию антител и фрагментов антител с аффинностью в нМ интервале. В некоторых вариантах изобретения конструируют очень большой спектр фаговых антител (также называемый "родоначальницей-всех-библиотек"), описанный Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266 (1993). В некоторых вариантах изобретения высокоаффинное человеческое антитело выделяют непосредственно из большой фаговой библиотеки (см., например, Griffiths et al., EMBO J. 13 Ж 3245-3260 (1994. В некоторых вариантах изобретения для получения человеческих антител из антител грызунов, когда аффинности и специфичности человеческого антитела и исходного антитела грызуна аналогичны, можно использовать перетасовку генов. В некоторых таких вариантах изобретения ген V домена тяжлой или лгкой цепи антител грызунов, полученных методом фагового дисплея, заменяют спектром человеческих генов V домена, создавая химеры грызун-человек (также в данном описании называемые "эпитопным импринтингом"). В некоторых вариантах изобретения селекция вариабельных областей с помощью антигена приводит к выделению человеческих вариабельных областей, способных восстанавливать функциональный антиген-связывающий сайт, т.е. эпитоп определяет (делает отпечаток) выбор партнра. В некоторых вариантах изобретения, когда процесс повторяется для того, чтобы заменить остальной V домен грызуна, получают человеческое антитело, которое не со- 27013617 держит каркасных или CDR остатков, происходящих от грызуна (см. патентную заявку РСТ WO 93/06213, опубликованную 1 апреля 1993 г.). Биочипы (наборы) В некоторых вариантах изобретения предусматриваются (микро)биочипы, содержащие один или более полинуклеотидов, кодирующих один или более мутантных EGFr полинуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более полинуклеотидов,комплементарных одному или более полинуклеотидов, кодирующих один или более мутантных EGFr полинуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более полинуклеотидов, кодирующих один или более мутантных PI3K полинуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более полинуклеотидов,комплементарных одному или более полинуклеотидов, кодирующих один или более мутантных PI3K полинуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более полинуклеотидов, кодирующих один или более мутантных В-Raf полинуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более полинуклеотидов,комплементарных одному или более полинуклеотидов, кодирующих один или более мутантных B-Raf полинуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения присутствие или отсутствие одного или более мутантных EGFr полинуклеотидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых вариантах изобретения количество одного или более мутантных EGFr полинуклеотидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых таких вариантах изобретения клетку или ткань обрабатывают перед определением и оценивают также способность обработки влиять на количество одного или более мутантных EGFr полинуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения присутствие или отсутствие одного или более мутантных PI3K полинуклеотидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых вариантах изобретения количество одного или более мутантных PI3K полинуклеотидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых таких вариантах изобретения клетку или ткань обрабатывают перед определением и оценивают также способность обработки влиять на количество одного или более мутантных PI3K полинуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения присутствие или отсутствие одного или более мутантных ВRaf полинуклеотидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых вариантах изобретения количество одного или более мутантных B-Raf полинуклеотидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых таких вариантах изобретения клетку или ткань обрабатывают перед определением и оценивают также способность обработки влиять на количество одного или более мутантных В-Raf полинуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения присутствие или отсутствие одного или более мутантных EGFr полипептидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых таких вариантах изобретения сначала из образца клеток или ткани экстрагируют мРНК, а затем превращают в кДНК, которую гибридизуют с биочипом. В некоторых таких вариантах изобретения присутствие или отсутствие кДНК, которая специфически связывается с биочипом, является показателем присутствия или отсутствия мутантного EGFr полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии одного или более мутантных EGFr полипептидов оценивают, вычисляя количество кДНК, которая специфически связывается с биочипом. В некоторых таких вариантах изобретения клетку или ткань обрабатывают перед определением и оценивают также способность обработки влиять на экспрессию одного или более мутантных EGFr полипептидов. В некоторых вариантах изобретения присутствие или отсутствие одного или более мутантных PI3K полипептидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых таких вариантах изобретения сначала из образца клеток или ткани экстрагируют мРНК, а затем превращают в кДНК, которую гибридизуют с биочипом. В некоторых таких вариантах изобретения присутствие или отсутствие кДНК, которая специфически связывается с биочипом, является показателем присутствия или отсутствия мутантного PI3K полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии одного или более мутантных PI3K полипептидов оценивают, вычисляя количество кДНК, которая специфически связывается с биочипом. В некоторых таких вариантах изобретения клетку или ткань обрабатывают перед определением и оценивают также способность обработки влиять на экспрессию одного или более мутантных PI3K полипептидов. В некоторых вариантах изобретения присутствие или отсутствие одного или более мутантных ВRaf полипептидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых таких вариантах изобретения сначала из образца клеток или ткани экстрагируют мРНК, а затем превращают в кДНК, которую гибридизуют с биочипом. В некоторых таких вариантах изобретения присутствие или отсутствие кДНК, которая специфически связывается с биочипом, является- 28013617 показателем присутствия или отсутствия мутантного В-Raf полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии одного или более мутантных В-Raf полипептидов оценивают, вычисляя количество кДНК, которая специфически связывается с биочипом. В некоторых таких вариантах изобретения клетку или ткань обрабатывают перед определением и оценивают также способность обработки влиять на экспрессию одного или более мутантных В-Raf полипептидов. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более мутантных EGFr полипептидов (см., например, McBeath et al., Science, 289: 1760- 1763, 2000). В некоторых вариантах изобретения предполагаемые специфически связывающиеся с одним или более мутантныхEGFr полипептидов агенты подвергаются скринингу с применением биочипа с мутантными EGFr полипептидами. В некоторых вариантах изобретения соединения, предполагаемые для модуляции активности мутантного EGFr полипептида, подвергаются скринингу с применением биочипа с мутантными EGFr полипептидами. В некоторых таких вариантах изобретения оценивается способность соединенийкандидатов понижать или предупреждать аутофосфорилирование мутантных EGFr полипептидов. В некоторых таких вариантах изобретения оценивается способность соединений-кандидатов повышать аутофосфорилирование мутантных EGFr полипептидов. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более мутантных PI3K полипептидов (см., например, McBeath et al., Science, 289: 1760-1763, 2000). В некоторых вариантах изобретения предполагаемые специфически связывающиеся с одним или более мутантныхPI3K полипептидов агенты PI3K подвергаются скринингу с применением биочипа с мутантными PI3K полипептидами. В некоторых вариантах изобретения соединения, предполагаемые для модуляции активности мутантного PI3K полипептида, подвергаются скринингу с применением биочипа с мутантнымиPI3K полипептидами. В некоторых таких вариантах изобретения оценивается способность соединенийкандидатов понижать или предупреждать аутофосфорилирование мутантных PI3K полипептидов. В некоторых таких вариантах изобретения оценивается способность соединений-кандидатов повышать аутофосфорилирование мутантных PI3K полипептидов. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более мутантных B-Raf полипептидов (см., например, McBeath et al., Science, 289: 1760-1763, 2000). В некоторых вариантах изобретения предполагаемые специфически связывающиеся с одним или более мутантных BRaf полипептидов агенты подвергаются скринингу с применением биочипа с мутантными B-Raf полипептидами. В некоторых вариантах изобретения соединения, предполагаемые для модуляции активности мутантного B-Raf полипептида, подвергаются скринингу с применением биочипа с мутантными B-Raf полипептидами. В некоторых таких вариантах изобретения оценивается способность соединенийкандидатов понижать или предупреждать аутофосфорилирование мутантных B-Raf полипептидов. В некоторых таких вариантах изобретения оценивается способность соединений-кандидатов повышать аутофосфорилирование мутантных B-Raf полипептидов. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более агентов, специфически связывающихся с мутантными EGFr полипептидами. В некоторых таких вариантах изобретения оценивают присутствие или отсутствие одного или более мутантных EGFr полипептидов в клетке или ткани. В некоторых таких вариантах изобретения оценивают количество одного или более мутантных EGFr полипептидов в клетке или ткани. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более агентов, специфически связывающихся с мутантными PI3K полипептидами. В некоторых таких вариантах изобретения оценивают присутствие или отсутствие одного или более мутантных PI3K полипептидов в клетке или ткани. В некоторых таких вариантах изобретения оценивают количество одного или более мутантных PI3K полипептидов в клетке или ткани. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более агентов, специфически связывающихся с мутантными B-Raf полипептидами. В некоторых таких вариантах изобретения оценивают присутствие или отсутствие одного или более мутантных В-Raf полипептидов в клетке или ткани. В некоторых таких вариантах изобретения оценивают количество одного или более мутантных В-Raf полипептидов в клетке или ткани. Некоторые методы В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантный EGFr полипептид. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантныйPI3K полипептид. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела,способного связывать по меньшей мере один мутантный В-Raf полипептид. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантный EGFr полипептид, содержащий введение по меньшей мере одного мутантного EGFr полипептида животному и получение антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантный EGFr полипептид животного. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантный PI3K полипептид, содержащий введение по меньшей мере одного мутантного PI3 К полипептида животному и получение антитела, способного- 29013617 связывать по меньшей мере один мутантный PI3K полипептид животного. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантный B-Raf полипептид, содержащий введение по меньшей мере одного мутантного B-Raf полипептида животному и получение антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантный ВRaf полипептид животного. В некоторых таких вариантах изобретения антитело представляет собой человеческое антитело. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ IDNO: 19 и SEQ ID NO: 20, включающий введение животному по меньшей мере одного полипептида, содержащего по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQNO: 20; и предусматривается получение из организма животного антитела, способного связывать по меньшей мере один полипептид, содержащий по меньшей мере одну последовательность, выбранную изNO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20. В некоторых таких вариантах изобретения антитело представляет собой человеческое антитело. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ IDNO: 19 и SEQ ID NO: 20, включающий введение животному по меньшей мере одного фрагмента, по меньшей мере одного полипептида, содержащего по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, где по меньшей мере один фрагмент содержит по меньшей мере одну мутацию; и предусматривается получение из организма животного антитела, способного связывать по меньшей мере один полипептид, содержащий по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8,SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ IDNO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20. В некоторых таких вариантах изобретения антитело представляет собой человеческое антитело. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более EGFr мутаций у субъекта. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более PI3K мутаций у субъекта. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более В-Raf мутаций у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более EGFr мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени экспрессии мутантного EGFr полипептида в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более EGFr мутаций, на основании наличия или степени экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более EGFr мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени транскрипции или трансляции мутантного EGFr полинуклеотида в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более EGFr мутаций, на основании наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние представляет собой рак. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более EGFr мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени экспрессии полипептида, содержащего по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8,SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более EGFr мутаций, на основании наличия или степени экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более EGFr мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое