Рекомбинантные штаммы bcg, обладающие повышенной способностью к высвобождению из эндосомы

012434 Предшествующий уровень техники Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к штаммам Mycobacterium, обладающим повышенной способностью вырабатывать иммунный ответ. В экспериментах in vivo была продемонстрирована, например, выработка CD8+-Т-клеточного иммунного ответа, рестриктированного главным комплексом гистосовместимости (MHC) класса I. В частности, настоящее изобретение относится к штаммам Mycobacterium,экспрессирующим белок перфринголизин О (PfoA), который способствует высвобождению Mycobacterium из эндосом, а также к вакцинным препаратам, содержащим указанные штаммы Mycobacterium. Предшествующий уровень техники Бактерией Mycobacterium tuberculosis (M. tb) инфицирована одна треть населения всего мира, и эти инфекции вызывают активную форму заболевания у 8 млн человек, из которых каждый год умирает 1,62,2 млн человек, причем большинство из них проживает в развивающихся странах. Туберкулез (ТБ) представляет собой эпидемическое заболевание глобального масштаба, причем заболеваемость туберкулезом и смертность от этого заболевания все возрастает, поскольку его распространенность становится сравнимой с распространенностью ВИЧ-инфекций. ТБ является главной причиной смертности больных СПИДом. Бацилла Кальмета-Герена (BCG), представляющая собой аттенуированный штамм Mycobacteriumbovis и широко используемая в настоящее время вакцина против ТБ, была разработана 80 лет назад, и,как показали испытания, уровень ее эффективности против туберкулеза легких широко варьируется,причем эта вакцина оказалась неэффективной в большинстве испытаний в условиях практической работы, проводимых в последнее время в Индии (Fine et al., Vaccine, 16(20): 1923-1928; 1998; Anonymous,Indian J Med Res., Aug; 110: 56-69; 1999). Тем не менее, в настоящее время Всемирная Организация Здравоохранения рекомендует BCG-вакцинацию всех детей при рождении или при первом посещении патронажной службы (за исключением детей с симптомами ВИЧ-инфекции/СПИД) в странах с высоким риском заболеваемости туберкулезом. Такая тактика основана на полученных данных, свидетельствующих о том, что BCG обеспечивает защиту от тяжелых форм детского ТБ (Lanckriet et al., Int J Epidemiol, 24(5): 1042-1049; 1995; Rodrigues et al., J Epidemiol Community Health 45(1): 78-80; 1991). Иммунизация противотуберкулезной вакциной BCG детей далеко не раннего возраста является предметом обсуждения, поскольку в настоящее время имеется лишь ограниченное число данных, дающих противоречивые результаты. Однако высокая заболеваемость туберкулезом у детей и взрослых в развивающихся странах, где широко практикуется BCG-иммунизация, указывает на то, что применяемая в настоящее время вакцинаBCG не очень эффективна, и уже в течение многих лет люди, проживающие в этих странах, подвержены высокому риску заболевания ТБ. Поэтому очевидно, что BCG не обеспечивает адекватную защиту человека от заболевания ТБ и не является средством борьбы против заражения ТБ. Приблизительно 70% людей, контактирующих с микроорганизмами, вызывающими ТБ, и имеющих нормальную иммунную систему, не подвергаются инфицированию, и лишь у 5% из всех инфицированных индивидуумов развивается заболевание в первые два года. У большинства инфицированных индивидуумов наблюдается подавление инфекции, ассоциированное с продуцированием стойкого клеточного иммунного ответа против антигенов M. Tb, а у еще 5% индивидуумов наблюдаются рецидивы этого заболевания при снижении иммунитета. Как первичное заболевание, так и рецидивы этого заболевания наблюдаются, главным образом, у людей, страдающих ВИЧ-инфекциями/СПИД, что еще раз подтверждает важную роль, которую играет иммунитет в предупреждении и устранении инфекции. Поскольку организм большинства людей способен бороться с ТБ, т.е. все основания надеяться, что индуцирование стойкого иммунитета определенного типа позволит разработать эффективные вакцины,предупреждающие возникновение первичной инфекции после контакта с микроорганизмами, вызывающими эту инфекцию, и раннее прогрессирование заболевания, а также предупреждающие реактивацию при латентном состоянии и возникновение рецидивов после лечения. И наконец, может быть использована комбинации системного введения вакцины и проведения химиотерапии, которые, в конечном счете,будут способствовать уничтожению микроорганизма M. tb, являющегося патогеном для человека. Исходя из того факта, что вакцинация BCG в детстве играет решающую роль для предупреждения развития острой формы ТБ, очевидно, что замена BCG на новую вакцину против ТБ в испытаниях, проводимых для оценки кандидатов на вакцину против ТБ, не может быть осуществлена без получения огромного количества данных, свидетельствующих о том, что такая новая вакцина является в высокой степени эффективным продуктом. Однако проблема заключается в том, что M. tb является, главным образом, возбудителем инфекций у человека, и животные-модели лишь частично имитируют взаимодействие хозяина с патогеном. Таким образом, окончательные данные, подтверждающие повышенную эффективность новой вакцины ТБ, могут быть получены только в контролируемых испытаниях в условиях практической работы с участием человека. Исходя из этих соображений, многие исследователи пришли к выводу, что ключевой стадией в создании улучшенной вакцины против ТБ является усиление иммуногенности BCG. Одним из примеров такой стратегии является повышение способности BCG индуцировать или активировать Т-клетки для усиления иммунного ответа. Решающая роль CD8+-Т-клеток, рестриктирован-1 012434 ных главным комплексом гистосовместимости класса I, в выработке иммунитета к M. tb была продемонстрирована неспособностью мышей, дефицитных по 2-микроглобулину (2m), к выработке иммунитета против экспериментальной инфекции M. tb (Flynn et al., PNAS USA, 89(24): 12013-12017; 1992). Решающая роль CD8+-Т-клеток, рестриктированных комплексом гистосовместимости класса I, была убедительно продемонстрирована неспособностью мышей, дефицитных по 2-микроглобулину (2m), к выработке иммунитета против экспериментальной инфекции M. tuberculosis (Flynn et al., см. выше, 1992). Поскольку эти мутантные мыши не содержат комплекса гистосовместимости класса I, то не могут вырабатываться функциональные CD8+-Т-клетки. В отличие от мышей, инфицированных M. tuberculosis, 2mдефицитные мыши являются толерантными к некоторым инфекционным дозам вакцинного штамма BCG(Flynn et al., см. выше, 1992; Ladel C.H., et al., Eur J Immunol, 25: 377-384; 1995). Кроме того, BCGвакцинация 2m-дефицитных мышей приводит лишь к увеличению продолжительности их жизни после инфицирования M. tuberculosis, тогда как BCG-иммунизованные мыши C57BL/6 являются резистентными к M. tuberculosis (Flynn et al., см. выше, 1992). Такую дифференциальную CD8+-Т-клеточную зависимость между M. tuberculosis и BCG можно объяснить следующим образом: антигены M. tuberculosis являются более доступными для цитоплазмы,чем антигены BCG, что обеспечивает более выраженную презентацию молекул комплексом гистосовместимости класса I (Hess and Kaufmann, FEMS Microbiol. Immunol 7: 95-103; 1993). Поэтому более эффективный CD8-Т-клеточный ответ генерируется M. tuberculosis. Эта точка зрения была недавно подтверждена повышенным уровнем презентации нерелевантного антигена, овальбумина, комплексом гистосовместимости класса I при одновременном инфицировании антигенпрезентирующих клеток (APC) штаммом M. tuberculosis, не являющимся BCG (Mazzaccaro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Oct. 15: 93(21): 11786-91; 1996). Таким образом, антигены M. tb поступают в цитоплазму клетки-хозяина быстрее, чем антигеныBCG, что приводит к повышению уровня презентации комплекса гистосовместимости класса I (Hess etal., см. выше, 1993) и к усилению CD8+-T-клеточного ответа на M. tb. Кроме того, M. tb стимулирует антигенспецифические CD4+-Т-хелперные клетки, рестриктированные комплексом гистосовместимости класса II, а также цитотоксические CD8+-Т-клетки, рестриктированные комплексом гистосовместимости класса I, у мышей и у человека (Kaufmann, Annu Rev Immunol 11: 129-163; 1993). В более широком смысле это означает, что M. tb-инфицированные клетки могут распознаваться цитотоксическими CD8+Т-клетками, рестриктированными комплексом гистосовместимости класса I. Учитывая тот факт, что 70% иммунокомпетентных индивидуумов, контактирующих с микроорганизмами M. tb, не подвергаются инфицированию, следует отметить, что иммунитет, индуцируемый M. tb-инфекцией, в подавляющем большинстве случаев является достаточно эффективным в выработке иммунитета против этого микроорганизма. Поэтому очевидно, что эффективность имеющегося вакцинного штамма BCG против ТБ может быть увеличена путем повышения способности BCG индуцировать иммунный ответ посредством продуцирования цитотоксических CD8+-Т-клеток, рестриктированных комплексом гистосовместимости классаI (Kaufmann, Fundamental Immunology, 1997). Как правило, антигены, экспрессируемые патогенами, которые являются связанными с фагосомой,презентируются, главным образом, молекулами комплекса гистосовместимости класса II на CD4+-Тклетках, но они плохо распознаются CD8+-Т-клетками, которые обычно распознают антигены, презентируемые в ассоциации с молекулами комплекса гистосовместимости класса I (Kaufmann, см. выше, 1997). В противоположность этому, внутриклеточные бактерии, такие как Listeria monocytogenes (например,ATCC13932), которые высвобождаются из фагосомы и реплицируются в цитоплазме клеток-хозяев,являются эффективными в отношении пути презентации антигена комплекса гистосовместимости классаI и выработке CD8+-Т-клеточных ответов (Berche et al., J Immunol, 138: 2266-2276; 1987). Такая способность бактерии Listeria monocytogenes высвобождаться из эндосомы недавно была сообщена аттенуированной Salmonella, которая обычно находится в фагосоме, путем введения последовательностей, кодирующих листериолизин (Llo); при этом было показано, что полученные штаммы способны высвобождаться из эндосомы и являются более эффективными в индуцировании CD8+-Т-клеточных ответовHess et al., Host Response to Intracellular Pathogens, 75-90; 1997). Позже сообщалось, что этот подход применим и к BCG; а поэтому для повышения способности BCG индуцировать иммунные ответы, рестриктированные комплексом гистосовместимости класса I, были сконструированы штаммы rBCG, секретирующие Llo (Hess et al., PNAS USA, 95(9): 5299-5304; 1998). Хотя полученные ранее данные свидетельствуют о том, что штамм rBCG-Llo+ более эффективен в продуцировании CD8+-Т-клеток, однако было установлено, что этот штамм не способен высвобождаться из эндосомы. Таким образом, недостаток такого подхода состоит в том, что гемолитическая функция Llo, необходимая для высвобождения из эндосомы, является полностью активной при рН 5,5 и почти не обладает активностью при рН 7,0. Поскольку в микобактериях рН эндосомы поддерживается приблизительно при 7,0, то логично предположить, чтоLlo в штаммах rBCG-Llo, как уже давно сообщалось, не является функциональным, поскольку окружение, в котором он экспрессируется, является субоптимальным для достижения соответствующей величи-2 012434 ны гемолитической активности (Geoffroy et al., Infect Immun 55(7): 1641-1646; 1987). Поэтому при данном подходе эффект усиления иммунитета не может быть реализован до тех пор, пока не будет разработана стратегия, обеспечивающая функционирование Llo в BCG-модифицированных эндосомах. Таким образом, в предшествующих работах вообще отсутствуют какие-либо подтверждения того,что rBCG обладает повышенной способностью к высвобождению из эндосомы, а значит и того, что он может способствовать индуцированию, например, цитотоксических CD8+-Т-клеточных ответов, рестриктированных комплексом гистосовместимости класса I. Описание сущности изобретения В своем репрезентативном аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантным штаммамBCG (rBCG), которые обладают повышенной способностью вырабатывать CD8+-Т-клеточный иммунный ответ, рестриктированный главным комплексом гистосовместимости (MHC) класса I. Эти новые штаммыrBCG были генетически сконструированы так, чтобы они экспрессировали функциональный эндосомолитический белок, который является биологически активным при значениях рН, близких к нейтральным(например, при рН примерно 6-8 или примерно 6,5-7,5). Поэтому эндосомолитический белок является активным в Mycobacteria-содержащих эндосомах, которые обычно имеют внутренний рН, близкий к нейтральному. Активность эндосомолитического белка, продуцируемого штаммом rBCG, приводит к разрушению эндосомы, что позволяет штамму rBCG высвобождаться из эндосомы и поступать в цитоплазму клетки. Таким образом, rBCG является доступным для цитоплазмы и вырабатывает сильный Тклеточный ответ, а в частности сильный МНС-I-рестриктированный цитотоксический CD8+-Т-клеточный ответ. В одном из вариантов изобретения эндосомолитическим белком, вводимым в rBCG методами генной инженерии, является перфринголизин О (PfoA), происходящий из Clostridium perfringens. Настоящее изобретение также относится к Mycobacterium, которая была генетически сконструирована так, чтобы она экспрессировала и секретировала функциональный эндосомолитический белок, который является активным при нейтральном рН. В некоторых вариантах изобретения указанным функциональным эндосомолитическим порообразующим белком является PfoA или мутантный PfoA, кодируемый SEQ ID NO: 3 (обозначаемый далее PfoAG137Q). Экспрессия указанного функционального эндосомолитического белка микобактерией приводит к высвобождению rBCG из эндосом. Генетически сконструированная таким образом Mycobacterium может представлять собой аттенуированную микобактерию, такую как BCG. Настоящее изобретение также относится к Mycobacterium, генетически сконструированной для экспрессии и секреции PfoA; и к Mycobacterium, генетически сконструированной для экспрессии и секреции PfoAG137Q, кодируемого SEQ ID NO: 3. Настоящее изобретение также относится к способу индуцирования высвобождения производногоMycobacterium из эндосом. Указанный способ включает стадию генетического конструирования Mycobacterium так, чтобы она содержала, экспрессировала и секретировала функциональный эндосомолитический белок, такой как PfoA или PfoAG137Q, кодируемый SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах изобретения указанной Mycobacterium является аттенуированная Mycobacterium, такая как BCG. Настоящее изобретение также относится к вакцинному препарату, содержащему Mycobacterium,которая была генетически сконструирована так, чтобы она экспрессировала и секретировала функциональный эндосомолитический белок, который является активным при нейтральном рН. Указанным функциональным эндосомолитическим белком может быть, например, PfoA или PfoAG137Q, кодируемыйSEQ ID NO: 3. Экспрессия указанного функционального эндосомолитического фермента микобактерией позволяет этой рекомбинантной Mycobacterium высвобождаться из эндосом. В некоторых вариантах изобретения указанной Mycobacterium является аттенуированная Mycobacterium, такая как BCG. Краткое описание графического материала Фиг. 1. Карта вектора-"самоубийцы" pAF102. Каждый из сегментоЕ ДНК имеет следующие обозначения: L-flank и R-flank означают левый и правый "фланги" гена ureC соответственно; pfoA означает ген,кодирующий мутантную форму перфринголизина О (Genbank, инвентарный номер ВА 000016) с одной аминокислотной заменой в положении 137G(Q); LPPAg85B означает ДНК-последовательность, кодирующую пептид лидерной последовательности антигена 85 В (т.е. Rv1886c); PAg85A означает промоторную последовательность гена антигена 85 А (т.е. Rv3804c); aph означает ген аминогликозидфосфотрансферазы(Genbank, инвентарный номер Х 06402), который сообщает плазмиде резистентность к канамицину; OriE означает ориджин репликации pUC (Genbank, инвентарный номер AY234331); Ble означает ген(Genbank, инвентарный номер L36850), который сообщает данной плазмиде резистентность к зеоцину;SacB означает ген (Genbank, инвентарный номер Y489048), кодирующий левансахаразу, которая сообщает бактерии восприимчивость к сахарозе; Phsp60 означает промоторную последовательность гена белка теплового шока (т.е. Rv0440); MCS означает сайты множественного клонирования для указанных рестриктирующих ферментов. При этом следует отметить, что кластер, расположенный между двумя PacIсайтами, может быть заменен, если это необходимо, другими генами эндосомолитических ферментов. Фиг. 2 А и В. А - генная последовательность PfoA, происходящая из Clostridium perfringens (SEQ IDNO: 1); В - последовательность белка PfoA, происходящая из Clostridium perfringens (SEQ ID NO: 2). Фиг. 3. Генная последовательность предпочтительного мутанта PfoAG137Q (SEQ ID NO: 3). Фиг. 4. Блок-схема основных стадий аллельного обмена.-3 012434 Фиг. 5. Рестрикционная карта плазмиды pAF102 для аллельного обмена. Дорожка 1: 1 т.п.н. + ДНКледдер. Дорожка 2: плазмида pAF102, гидролизованная рестриктирующим ферментом EcoRI. Дорожка 3: плазмида pAF102, используемая в качестве негидролизованного контроля. Дорожка 4: плазмидный вектор pAF100, не содержащий вставки PFO-кластера и гидролизованный рестриктирующим ферментомEcoRI. Дорожка 5: плазмидный вектор pAF100, не содержащий вставки PFO-кластера и используемый в качестве негидролизованного контроля. На этой фигуре плазмида pAF100 линеаризована рестриктирующим ферментом EcoRI с продуцированием, как и предполагалось, одной полосы размером 4,4 т.п.н. Плазмида pAF102, гидролизованная рестриктирующим ферментом EcoRI, давала, как и предполагалось,две полосы размером 2,3 т.п.н. и 6,0 т.п.н. соответственно. Фиг. 6. ПЦР-анализ отобранных колоний с генотипом ureCpfoA. ПЦР осуществляли, как описано в разделе "Материалы и методы". ПЦР-продукт анализировали с помощью гель-электрофореза в 1,2% агарозном геле. Используемый ДНК-леддер представляет собой 1 т.п.н. плюс ДНК-стандарт и был закуплен у фирмы Invitrogen. Дорожки 1-6: ПЦР для колоний 105-1 - 105-6 соответственно. Дорожка 7 и дорожка 8: ПЦР для колоний 142-7 и 142-10 соответственно. Дорожка 9: ПЦР для штамма BCG Дания 1331. Фиг. 7. Рост бактерии AFV102 и ее чувствительность к канамицину. Меродиплоидные конструкции,полученные из бактерий AFV102, BCG Дания 1331 и PfoA (Pfol05 MI), инокулировали в культуральную среду 7 Н 9 и рост каждого штамма сравнивали между собой путем измерения оптической плотности при 600 нм в различные периоды времени. Для проведения теста на чувствительность к канамицину, в среду добавляли антибиотик до конечной концентрации 50 мкг/мл, и рост бактерий оценивали, как описано выше. Сокращения в надписях на фигуре означают: Ctrl -контрольная среда, не инокулированная бактериями; +Kan или -Kan: присутствие или отсутствие канамицина в данной среде. Фиг. 8. Тест на цитотоксичность для AFV102 в клетках J774A.1. Эти клетки инфицировали либоAFV102, либо штаммом BCG Дания 1.331. Через указанное время после инфицирования жизнеспособность клеток определяли, как описано в разделе "Материалы и методы" путем сравнения с неинфицированным контролем. Фиг. 9. Тест на выживаемость бактерии AFV102 в макрофагах. Клеточные монослои J774A.1 инфицировали AFV102 или штаммом BCG Дания 1331, и через указанное время после инфицирования, внутриклеточные бактерии подсчитывали как описано в разделе "Материалы и методы". Фиг. 10. Тест на способность AFV102 секретировать белок Pfo с гемолитической активностью, не зависимой от рН. Культуру AFV102 получали, как описано ранее, и супернатант анализировали на его способность лизировать эритроциты при рН 7,0 и 5,5. Гемолизиновую активность определяли, как описано в разделе "Материалы и методы". Фиг. 11 А-D. Схематическое представление результатов примера 3. А, бактерия (зачерненные овалы) проникает в макрофаг (серый овал), находящийся в клетке (шестиугольник), что способствует образованию ранних эндосом; В, BCG останавливает созревание эндосом и BCG сохраняется внутри ранней эндосомы; С, PfоА-экспрессирующие бактерии AFV102, после их проникновения, сначала находятся в ранних эндосомах, однако затем они начинают секретировать PfoA и покидают эндосому; D, PfoAэкспрессирующие бактерии AFV102 могут высвобождаться из эндосомы или могут находиться в клетке в свободном виде. Фиг. 12. Карта вектора pAF105, сверхэкспрессирующего антиген. Каждый из сегментов ДНК имеет следующие обозначения: PRV3130 означает промоторную последовательность антигена Rv3130c; PAg85B означает промоторную последовательность антигена Rv1886 с. Гены в экспрессионном кластере имеют следующие обозначения: Rv0288; Rv1886c и Rv3804c; aph означает ген аминогликозидфосфотрансферазы (Genbank, инвентарный номер Х 06402), который сообщает плазмиде резистентность к канамицину;OriE означает ориджин репликации pUC (Genbank, инвентарный номер AY234331); leuD означает ген,кодирующий 3-изопропилмалатдегидратазу (т.е. Rv2987c); OriM означает ориджин репликации в Mycobacterium (Genebank, инвентарный номер М 23557). Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения Настоящее изобретение относится к штамму rBCG, способному высвобождаться из эндосом и поступать в цитоплазму инфицированной клетки-хозяина. В результате этого в указанных клетках вырабатывается сильный CD8+-Т-клеточный ответ на rBCG.rBCG был генетически сконструирован так, чтобы он содержал функциональный эндосомолизин,который экспрессируется и секретируется штаммом rBCG и который опосредует высвобождение этого штамма rBCG из эндосомы. Используемый здесь термин "эндосомолизин" означает белок, который способен разрушать эндосомную мембрану на уровне, достаточном для высвобождения бактериальной клетки из эндосомы в цитозоль. Используемый здесь термин "эндосомолитический" относится к белку,обладающему такой разрушающей активностью. Используемый здесь термин "эндосомолизис" означает процесс разрушения эндосомной мембраны, достаточный для высвобождения бактериальной клетки из эндосомы в цитозоль. Эндосомолитический белок является активным в среде с рН, близким к нейтральному, например, в эндосомах клеток, инфицированных микобактериями, и, таким образом, опосредует высвобождение бактерий в цитоплазму.-4 012434 В одном из вариантов изобретения функциональный эндосомолитический белок, который вводят в штаммы rBCG согласно изобретению, представляет собой PfoA Clostridium perfringens или его функциональный вариант. PfoA представляет собой цитолизин, секретируемый Clostridium perfringens и кодируемый геном pfoA (Genebank, инвентарный номер СРЕ 0163). Последовательность этого гена и его белка представлены на фиг. 2 А и В, соответственно. PfoA опосредует высвобождение бактерий из фагосом в Clostridium и в В. subtilis, если он там экспрессируется(Portnoy et al., Infect Immun. Jul; 60(7): 2710-7; 1992). В отличие от Llo, PfoA является активным при рН 5,0 и при рН 7,0, а поэтому он сохраняет свою активность в цитозоле и вызывает повреждение инфицированных клеток-хозяев (Portnoy et al., см. выше, 1992). Таким образом, если в L. monocytogenes вместоLlo экспрессируется PfoA, то это позволяет данному штамму высвобождаться из фагосом (Jones и Portnoy, Infect Immun. Dec; 62(12): 5608-13; 1994). Однако экспрессия этого белка также приводит к повреждению клеток-хозяев. Llo обладает свойствами, аналогичными свойствам PfoA, за исключением того, чтоLlo является оптимально активным при рН 5,5 и обнаруживает незначительную активность при рН 7,0. Таким образом, Llo будет опосредовать высвобождение из эндосомы после того, как рН эндосомы снизится до 5,5, но он не будет воздействовать на клетку-хозяина, поскольку Llo не является активным при рН цитозоля, который близок к нейтральному.Portnoy и др. также продемонстрировали, что если PfoA экспрессируется в L. monocytogenes в мутантной форме с одной аминокислотной заменой, то такая мутантная форма PfoA больше не является токсичной для клеток-хозяев, но все же обладает способностью опосредовать высвобождение бактерии из вакуоли и стимулировать ее внутриклеточный рост (Portnoy et al., см. выше, 1992). Конкретный штаммDP-12791, имеющий мутацию, а именно, замену Gln137 на Gln137 в Pfo (т.е. PfoAG137Q), способен высвобождаться из фагосомы по механизму, аналогичному механизму высвобождения бактерии дикого типа,но он не оказывает токсического действия на клетки-хозяева. Кроме того, PfoAG137Q является активным при рН 5,6 и рН 7,4 и имеет меньшее время полужизни в цитозоле. Генная последовательность PfoAG137Q представлена на фиг. 3 (SEQ ID NO: 3). Экспрессия PfoA способствует высвобождению бактерии из эндосом, поскольку порообразующая активность PfoA приводит к повреждению мембраны эукариотической клетки. PfoA образует поры в холестеринсодержащих мембранах посредством спонтанного встраивания его доменов в бислой. Это происходит посредством связывания с холестерином, который действует как рецептор. После связывания токсин образует пограничную мономер-мономерную область (которая необходима для сборки олигомера), затем подвергается олигомеризации и распределяется по мембране при изменении его структуры, которое зависит от связывания с мембраной. Образование мембраносвязанных олигомеров приводит к повреждению мембраны и, в конечном счете, к лизису клетки (Ramachandran et al., Nature Structure andMolecular Biology, 11(8), 697-705 (1995. PfoAG137Q обладает способностью опосредовать лизис вакуоли аналогичным способом. Предпочтительный PfoAG137Q обладает ограниченной активностью в цитоплазме инфицированной клетки-хозяина, что обусловлено его чувствительностью к протеазам хозяина. В одном из вариантов изобретения указанный функциональный эндосомолитический фермент, который экспрессируется штаммом rBCG, представляет собой PfoA, происходящий или выделенный из С.perfringens. Однако для специалиста в данной области очевидно, что в настоящем изобретении могут быть использованы и другие эндосомолитические белки, которые являются активными при нейтральном рН или при рН, близком к нейтральному. Примерами таких эндосомолитических белков являются, но не ограничиваются ими, пневмолизин (продуцируемый Streptococcus pneumoniae), стрептолизин О (продуцируемый Streptococcus pyogenes), церолизин (продуцируемый Bacilus cereus), -гемолизин (продуцируемый Staphylococcus aureus) и т.п. и их функциональные варианты. Используемые здесь термины "функциональный эндосомолитический белок" или "функциональная форма" белка (или генного продукта гена, который является "функционально экспрессируемым") означает, что форма белка, продуцируемого бактерией rBCG, имеет характерную величину активности, присущей нативному или природному белку ("дикого типа"), присутствующему, как известно, в нативном организме. Величина активности функциональной формы данного белка, продуцируемого штаммом rBCG,составляет, в основном, по меньшей мере примерно 50% от обычной активности белка дикого типа, как показал анализ, проводимый в стандартных условиях, известных специалистам. Величина активности белка может быть определена путем измерения любого физически наблюдаемого параметра, такого как уровень связывания с лигандом, или продуцирования эффекта, такого как высвобождение rBCG из эндосом. При этом предпочтительно, чтобы величина активности составляла по меньшей мере примерно 50,60, 70, 80, 90, 100% или более от стандартной величины активности белка дикого типа, как определено в анализе, проводимом в стандартных условиях, известных специалистам. Под термином "функциональный вариант" белка авторы настоящего изобретения подразумевают полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере примерно на 70% гомологична аминокислотной последовательности "эталонного" белка дикого типа, и который сохраняет величину функциональной активности (как описано выше) белка дикого типа. Аминокислотную последовательность эталонного белка дикого типа обычно используют в качестве исходного материала для осуще-5 012434 ствления мутаций и альтераций, проводимых методами генной инженерии. Предпочтительно функциональным вариантом является полипептид, аминокислотная последовательность которого примерно на 75, 80, 85, 90, 95% или более идентична эталонной аминокислотной последовательности. Такими функциональными вариантами являются, но не ограничиваются ими, полипептидные последовательности, в которых может быть сделана одна или несколько консервативных аминокислотных замен. Консервативные аминокислотные замены хорошо известны специалистам, и такими заменами являются, например, замена одной положительно заряженной аминокислоты другой такой же аминокислотой, одной отрицательно заряженной аминокислоты другой такой же аминокислотой,одной гидрофобной аминокислоты другой такой же аминокислотой, и т.п. Варианты полипептидов могут иметь одну или несколько таких замен при условии, что полученный вариант полипептида сохраняет величину функциональной активности, определенную в настоящем изобретении. Термин "функциональные варианты" также охватывает и другие модификации, которые могут быть внесены в первичную последовательность представляющего интерес полипептида. Примерами таких модификаций являются, но не ограничиваются ими, делеции и добавления аминокислот или замены аминокислот (например, химические модификации, такие как сульфирование, дезамидирование, фосфорилирование, гидроксилирование и т.п.). Такие модификации могут быть осуществлены в эталонной аминокислотной последовательности методами генной инженерии, либо они могут быть осуществлены путем посттрансляционных модификаций белка, либо теми и другими методами. Кроме того, функциональные варианты фермента могут образовываться в результате таких природных мутаций, которые обычно происходят между аналогичными белками, обладающих одинаковой или подобной активностью и выделенных из различных штаммов одного вида или различных видов, или из различных отдельных организмов одного и того же вида. Белки, происходящие от таких природных вариантов, также могут служить в качестве эталонного белка, а аминокислотная последовательность такого природного варианта может служить в качестве эталонной последовательности. В любом случае, все указанные функциональные варианты эталонного белка сохраняют величину активности белка, как описано в настоящем изобретении. Описанные здесь гомологичные и идентичные последовательности не включают гетерологичные аминокислотные последовательности, которые происходят от других источников, не являющихся эталонными последовательностями, и которые присоединены к полипептидной последовательности белка,используемого в различных других целях, или включены в эту полипептидную последовательность. Примерами таких гетерологичных последовательностей являются, но не ограничиваются ими, последовательности, облегчающие выделение полипептидов (например, гистидиновые метки), последовательности, облегчающие секрецию или локализацию полипептида в клетке (например, различные лидерные или нацеливающие последовательности), и последовательности, кодирующие сайты гликозилирования (последовательности гликозилирования), и т.п. В любом случае, указанный функциональный вариант до определенной степени сохраняет величину активности белка, вариантом которого он является, т.е. величина активности этого функционального варианта составляет по меньшей мере примерно 50%, а предпочтительно примерно на 60, 70, 80, 90,100% или более от величины активности белка, вариантом которого он является, как может быть определено в анализе, проводимом в стандартных условиях, известных специалистам. Кроме того, настоящее изобретение также включает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие белки и функциональные варианты белков, используемых в настоящем изобретении. Последовательностями нуклеиновой кислоты могут быть дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды или их любые модифицированные формы, и такие последовательности могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Последовательностями нуклеиновой кислоты согласно изобретению являются любые последовательности, перечисленные в настоящем описании, а также любые их варианты. Так, например,варианты нуклеиновых кислот не могут быть идентичны перечисленным последовательностям, но они могут кодировать идентичную аминокислотную последовательность вследствие избыточности генетического кода. Альтернативно, в последовательности согласно изобретению могут быть внесены некоторые модификации (например, замены, делеции или добавления), которые приводят к изменениям в кодируемой аминокислотной последовательности, при условии, что такая кодируемая аминокислотная последовательность является функциональным вариантом эталонной аминокислотной последовательности, описанной выше. Примерами таких модификаций являются, но не ограничиваются ими, замены, которые приводят к консервативным аминокислотным заменам в ферменте, и замены, которые приводят к неконсервативным аминокислотным заменам, или делеции или добавления в аминокислотных последовательностях. Такие модификации могут быть сделаны в любых целях, например, для введения посттрансляционных модификаций ферментов; для повышения или снижения растворимости; для предотвращения образования или введения стерических затруднений в транслированном полипептиде и т.п. В общих чертах, варианты последовательностей нуклеиновой кислоты согласно изобретению по меньшей мере примерно на 50%, а предпочтительно примерно на 60, 70, 80, 90, 95 или 100% гомологичны эталонным последовательностям, как было определено в соответствии с процедурами сравнения, хорошо известными специалистам. Такие варианты могут быть охарактеризованы по их способности связываться с последовательностями, используемыми в настоящем изобретении, в условиях высокой жесткости. Анализы на-6 012434 связывание в условиях высокой жесткости хорошо известны специалистам и могут быть легко адаптированы для анализа возможных вариантов последовательностей согласно изобретению. Описанные здесь гомологичные последовательности не включают последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гетерологичные аминокислотные последовательности, которые происходят из других источников, не являющихся эталонными аминокислотными последовательностями, и которые присоединены к полипептидной последовательности белка, используемого в различных других целях,либо включены в эту полипептидную последовательность. Так, например, такие последовательности нуклеиновой кислоты могут кодировать гетерологичные аминокислотные последовательности, включая,но не ограничиваясь ими, последовательности, облегчающие выделение полипептидов (например, гистидиновые метки), последовательности, облегчающие секрецию или локализацию полипептида в клетке(например, различные лидерные или нацеливающие последовательности), и последовательности, кодирующие сайты гликозилирования (последовательности гликозилирования), и т.п. Другие варианты последовательностей нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которые входят в объем настоящего изобретения, представляют собой последовательности, которые были модифицированы для удобства осуществления или усовершенствования методов генетического конструирования последовательностей нуклеиновой кислоты или экспрессии кодируемых ими аминокислотных последовательностей. В общих чертах, такие модификации не влияют на последовательность полипептида,которая, в конечном счете, транслируется из последовательности нуклеиновой кислоты, или полипептида, который пока еще удовлетворяет вышеуказанным критериям для вышеуказанного функционального варианта. Примерами модификаций такого типа являются, но не ограничиваются ими, включение подходящих сайтов для рестриктирующих эндонуклеаз в последовательность нуклеиновой кислоты для облегчения модификации этой последовательности (например, для встраивания последовательности в вектор); инсерция, делеция или другая модификация в последовательности или в последовательностях, участвующих в экспрессии аминокислотной последовательности (например, включение любого из различных промоторных и/или энхансерных последовательностей, стоп-сигналов, суперпромоторов, индуцибельных промоторов и различных других последовательностей, которые модифицируют экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты); и включение последовательностей, облегчающих взаимодействие вектора с нуклеиновой кислотой организма-хозяина; и т.п. Кроме того, последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть химически модифицированы или могут включать нетрадиционные основания, введенные в различных целях,хорошо известных специалистам, например, для обеспечения стабильности нуклеиновой кислоты или для придания ей нужной стерической конформации. Под термином "активный при нейтральном рН" и "активный при рН примерно 7,0" авторы настоящего изобретения подразумевают, что данный фермент является активным при рН в пределах примерно от 6,0 до 8,0, а предпочтительно в пределах примерно от 6,5 до 7,5. Настоящее изобретение относится к рекомбинантной бактерии Mycobacteria. B предпочтительном варианте изобретения Mycobacteria представляют собой аттенуированные бактерии, например BCG. Однако специалистам в данной области известно, что в настоящем изобретении могут быть также использованы и другие аттенуированные и неаттенуированные Mycobacteria. Примерами Mycobacteria других типов являются, но не ограничиваются ими, штамм M. tuberculosis CDC1551 (см., например, Griffith etmarinarum (ATCC11566 и 11567) и M. microtti (ATCC11152). Примерами аттенуированных штаммов Mycobacterium являются, но не ограничиваются ими, штаммM. tuberculosis, который является ауксотрофным по пантотенату (Sambandamurthy, Nat. Med. 2002 8(10): 1171; 2002), мутантный штамм M. tuberculosis rpoV (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92(17): 8036; 1995), штамм M. tuberculosis, который является ауксотрофным по лейцину (Hondalus et al., Infect. Immun. 68(5): 2888; 2000), штамм BCG Дания (ATCC35733), штамм BCG Япония (ATCC35737), штаммBCG Чикаго (ATCC27289), штамм BCG Копенгаген (ATCC27290), штамм BCG Пастер (ATCC35734), штамм BCG Глазго (ATCC35741), штамм BCG Коннахт (ATCC35745), штамм BCG Монреаль (ATCC35746). В другом варианте изобретения аттенуированные штаммы Mycobacterium модифицируют для усиления апоптоза, причем указанные штаммы индуцируют сильные клеточные иммунные ответы. Апоптоз представляет собой запрограммированную клеточную гибель, которая, по характеру и по последствиям ее индуцирования, значительно отличается от некротической клеточной гибели. Фактически, механизм, посредством которого апоптоз антигенсодержащих клеток приводит к индуцированию сильного клеточного иммунитета, иногда называют перекрестным примированием (Heath et al., ImmunolRev 199; 2004; Gallucci et al., Nature Biotechnology. 5: 1249; 1999; Albert et al., Nature 392: 86; 1998). Существует несколько механизмов индуцирования апоптоза, который приводит к усилению антигенспеци-7 012434 фического клеточно-опосредуемого иммунитета. Апоптоз, опосредуемый каспазой 8, приводит к вырабатыванию антигенспецифического клеточного иммунитета (Sheridan et al., Science 277: 818; 1997). Поэтому в другом своем варианте настоящее изобретение относится к аттенуированным штаммамMycobacterium, которые обладают улучшенными проапоптотическими свойствами, такими как, но не ограничивающимися ими, secA1-секреция SodA, не содержащего лидерного пептида, происходящего отSalmonella enteriditis (Genbank, инвентарный номер 1068147), Escherichia coli (Genbank, инвентарный номер 1250070) или Shigella flexneri (Genbank, инвентарный номер 1079977) или, альтернативно, продуцирование белка SodA, который в природе является несекретируемым белком, такой как SodA, происходящий из Listeria monocytogenes EGD-e (Genbank, инвентарный номер 986791). Такие аттенуированные штаммы Mycobacterium не продуцируют внеклеточный Sod, а поэтому они не подавляют иммунные ответы у хозяина, но при этом экспрессируют внутриклеточный Sod, что способствует выживанию указанной Mycobacterium (Edwards et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164(12): 2213-9; 2001). Альтернативно,аттенуированные штаммы Mycobacterium, обладающие улучшенными проапоптотическими свойствами,несут инактивированный ген Rv3238c. Альтернативно, экспрессия SopE Salmonella (Genbank, инвентарный номер AAD54239, ААВ 51429 или ААС 02071) или каспазы-8 (Genbank, инвентарный номер AAD24962 или ААН 06737) в цитоплазме клеток-хозяев аттенуированной Mycobacterium согласно изобретению является эффективным средством индуцирования запрограммированной клеточной гибели в присутствии антигенов, экспрессируемых указанной аттенуированной Mycobacterium, продуцирующей высокие уровни антигенспецифического клеточного иммунного ответа. Рецептор-5 гибели клеток (DR-5), также известный как TRAIL-R2 (рецептор 2 TRAIL) или TNFRSF-10B (член суперсемейства факторов некроза опухоли 10 В), также индуцирует апоптоз, опосредуемый каспазой 8 (Sheridan et al., 1997). Индуцируемый реовирусом апоптоз опосредуется TRAIL-DR5 и приводит к последующему выведению вируса (Clarke, J. Virol 74: 8135, 2000). Экспрессия DR-5, такого как человеческий DR-5 (Genbank, инвентарный номер ВАА 33723), гомолог DR-5 герпесвируса-6 (HHV-6)(Genbank, инвентарный номер САА 58423) и т.п. аттенуированным штаммом Mycobacterium согласно изобретению обеспечивает сильное стимулирующее действие, направленное на индуцирование антигенспецифического клеточного иммунного ответа против M. tb-антигенов. Кроме того, антигенпрезентирующие клетки-хозяева (такие как макрофаги и дендритные клетки) могут быть также индуцированы в целях стимуляции апоптоза посредством присоединения Fas, который является сильным стимулятором индуцирования антигенспецифических клеточных иммунных ответовFas/эктодомен CD4, будет индуцировать апоптоз и усиленные антигенспецифические клеточные иммунные ответы. В целом, аттенуированные штаммы Mycobacterium, которые стимулируют индуцирование апоптоза,являются эффективным средством индуцирования клеточных ответов, приводящих к иммуноопосредуемой деструкции M. tb-инфицированных клеток с последующей элиминацией, снижением уровня или предупреждением M. tb-инфекции. В еще одном варианте изобретения двухкомпонентная вакцина против ТБ может включать аттенуированные штаммы Mycobacterium, которые сверхэкспрессируют по меньшей мере один антиген Mycobacterium, включая, но не ограничиваясь ими, Rv0125, Rv0203, Rv0287, Rv0288, Rv0603, Rv1196, Rv1223,Rv1271c, Rv1733c, Rv1738, Rv1804c, Rv1886, Rv2031c, Rv2032, Rv2253, Rv2290, Rv2389c, Rv2626c,Rv2627c, Rv2779c, Rv2873, Rv2875, Rv3017c, Rv3407, Rv3804c, Rv3810 или Rv3841. Альтернативно,сверхэкспрессируемые антигены Mycobacterium могут присутствовать в форме гибридного белка, состоящего из одного или нескольких указанных гибридных белков Mycobacterium, таких как Mtb72f(Dietrich et al., J. Immunol., 174: 6332-6339; 2005) и т.п. Настоящее изобретение может быть использовано в целях разработки вакцин против патогенных видов Mycobacterium и в целях разработки вакцинных векторов для доставки антигена. Вектор Mycobacterium определен в настоящем описании как любой штамм Mycobacterium, сконструированный в целях экспрессии по меньшей мере одной нуклеотидной последовательности-"пассажира" (обозначаемой далее"PNS"), состоящей из ДНК или РНК и кодирующей любую комбинацию антигенов, иммунорегуляторных факторов или адъювантов, описанных ниже. PNS может быть встроена в хромосому или она может быть использована как часть экспрессионного вектора с применением композиций и методов, хорошо известных специалистам (Jacobs et al., Nature 327: 532-535; 1987; Barletta et al., Res Microbiol. 141: 931939; 1990; Kawahara et al., Clin Immunol. 105: 326-331; 2002; Lim et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13: 1573-1581;1997; Chujoh et al., Vaccine, 20: 797-804; 2001; Matsumoto et al., Vaccine, 14: 54-60; 1996; Haeseleer et al., Mol. Biochem. Parasitol., 57: 117-126; 1993). В соответствии с настоящим изобретением вектор Mycobacterium может содержать PNS, кодирующий иммуноген, которым может быть либо чужеродный иммуноген, происходящий от вирусных, бакте-8 012434 риальных и паразитарных патогенов, либо эндогенный иммуноген, такой как, но не ограничивающийся им, аутоиммунный антиген или опухолевый антиген. Такими иммуногенами могут быть, например, полноразмерный нативный белок, химерные гибриды, состоящие из чужеродного иммуногена и эндогенного белка или миметика, или фрагмент или фрагменты иммуногена, происходящего от вирусных, бактериальных и паразитарных патогенов. Используемый здесь термин "чужеродный иммуноген" означает белок или его фрагмент, которые обычно не экспрессируются в клетках или в тканях животного-реципиента, такие как, но не ограничивающиеся ими, вирусные белки, бактериальные белки, паразитарные белки, цитокины, хемокины, иммунорегуляторные агенты или терапевтические средства. Термин "эндогенный иммуноген" означает белок или его часть, обычно присутствующие в клетках или тканях животного-реципиента, такие как, но не ограничивающиеся ими, эндогенный клеточный белок, иммунорегуляторный агент или терапевтическое средство. Альтернативно или дополнительно, такой иммуноген может кодироваться синтетическим геном и может быть сконструирован стандартными методами рекомбинантных ДНК, известными специалистам. Чужеродным иммуногеном может быть любая молекула, которая экспрессируется любым вирусным, бактериальным или паразитарным патогеном, до или в процессе его инвазии или колонизации организма животного-хозяина или репликации в этом организме; при этом вектор Mycobacterium может экспрессировать иммуногены или их части, происходящие от вирусных, бактериальных и паразитарных патогенов. Такие патогены могут быть инфекционными для человека, домашних животных или диких животных. Вирусными патогенами, от которых происходят вирусные антигены, являются, но не ограничиваются ими, ортомиксовирусы, такие как вирус гриппа (Taxonomy ID: 59771); ретровирусы, такие как RSV,HTLV-1 (Taxonomy ID: 39015) и HTLV-II (Taxonomy ID: 11909); герпесвирусы, такие как EBV (Taxonomy ID: 10295); CMV (Taxonomy ID: 10358) или вирус простого герпеса (ATCCVR-1487); лентивирусы, такие как ВИЧ-1 (Taxonomy ID: 12721) и ВИЧ-2 (Taxonomy ID: 11709); рабдовирусы, такие как вирус бешенства; пикорновирусы, такие как полиовирус (Taxonomy ID: 12080); поксвирусы, такие как вирус коровьей оспы (Taxonomy ID: 10245); ротавирус (Taxonomy ID: 10912); и парвовирусы, такие как аденоассоциированный вирус 1 (Taxonomy ID: 85106). Примерами вирусных антигенов могут служить антигены группы, включающей, но не ограничивающейся ими, антигены вируса иммунодефицита человека Nef (National Institute of Allergy and InfectiousMcMichael, AIDS Immunol Lett., 66: 177; 1999; Hanke, et al., Vaccine, 17: 589; 1999; Palker et al., J. Immunol., 142: 3612-3619; 1989), химерные производные Env и gp120 ВИЧ-1, такие как, но не ограничивающиеся ими, гибриды белков gp120 и CD4 (Fouts et al., J. Virol. 2000, 74: 11427-11436; 2000); усеченные или модифицированные производные env ВИЧ-1, такие как, но не ограничивающиеся ими, gp140 (Stamatos et al. J. Virol., 72: 9656-9667; 1998), или производные Env и/или gp140 ВИЧ-1 (Binley, et al. J. Virol., 76: 2606-2616; 2002; Sanders, et al. J. Virol., 74: 5091-5100; 2000; Binley, et al. J. Virol., 74: 627-643; 2000), поверхностный антиген вируса гепатита В (Genbank, инвентарный номер AF043578; Wu et al., Proc. Natl.Acad. Sci., USA, 86: 4726-4730; 1989); ротавирусные антигены, такие как VP4 (Genbank, инвентарный номер AJ293721; Mackow et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 518-522; 1990) и VP7 (GenBank, инвентарный номер AY003871; Green et al., J. Virol., 62: 1819-1823; 1988), антигены вируса гриппа, такие как гемаглютинин (GenBank, инвентарный номер AJ404 627; Pertmer и Robinson, Virology, 257: 406; 1999); нуклеопротеин (GenBank, инвентарный номер AJ28 9872; Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 9654-9658; 2000), антигены вируса простого герпеса, такие как тимидинкиназа (Genbank, инвентарный номер АВ 047378; Whitley et al., New Generation Vaccines, 825-854; 2004). Бактериальными патогенами, от которых происходят бактериальные антигены, являются, но не ограничиваются ими, Mycobacterium spp., Helicobacter pylori, Salmonella spp., Shigella spp., E. coli, Rickettsiaspp., Listeria spp., Legionella pneumoniae, Pseudomonas spp., Vibrio spp. и Borellia burgdorferi. Примерами протективных антигенов бактериальных патогенов являются соматические антигены энтеротоксигенных бактерий E. coli, такие как антиген фимбрий CFA/I (Yamamoto et al., Infect. Immun.,50: 925-928; 1985) и нетоксическая В-субъединица термолабильного токсина (Klipstein et al., Infect. Immun., 40: 888-893; 1983); пертактин Bordetella pertussis (Roberts et al., Vacc, 10: 43-48; 1992), аденилатциклаза-гемолизин В. pertussis (Guiso et al., Micro. Path., 11: 423-431; 1991), фрагмент С столбнячного токсина Clostridium tetani (Fairweather et al., Infect. Immun., 58: 1323-1326; 1990), OspA Borellia burgdorferi(Sikand, et al., Pediatrics, 108: 123-128; 2001; Wallich, et al., Infect. Immun., 69: 2130-2136; 2001), протективные паракристаллические поверхностные белки Rickettsia prowazekii и Rickettsia typhi (Carl, et al.,-9 012434Corthesy-Theulaz, et al., InfectionImmunity 66, 581-6; 1998) и связывающийся с рецептором домен летального токсина и/или протективный антиген Bacillus anthrax (Price, et al., Infect. Immun. 69, 4509-4515; 2001). Паразитарными патогенами, от которых происходят паразитарные антигены, являются, но не ограничиваются ими, Plasmodium spp., такие как Plasmodium falciparum (ATCC30145); Trypanosoma spp.,такие как Trypanosoma cruzi (ATCC50797); Giardia spp., такие как Giardia intestinalis (ATCC30888D); Boophilus spp., Babesia spp., такие как Babesia microti (ATCC30221); Entamoeba spp., такие как Entamoeba histolytica (ATCC30015); Eimeria spp., такие как Eimeria maxima (ATCC40357);Leishmania spp. (Taxonomy ID: 38568); Schistosome spp., Brugia spp., Fascida spp., Dirofilaria spp., Wuchereria spp. и Onchocerea spp. Примерами протективных антигенов паразитарных патогенов являются антигены круглого спорозоита Plasmodium spp. (Sadoff et al., Science, 240: 336-337; 1988), такие как антиген круглого спорозоитаP. bergerii или антиген круглого спорозоита P. falciparum; поверхностный антиген мерозоита PlasmodiumMed., 46: 255-258; 1994); и KLH Schistosoma bovis и S. japonicum (Bashir et al., см. выше, 1994). Как было упомянуто выше, вектор Mycobacterium может содержать PNS, кодирующий эндогенный иммуноген, которым может быть любой клеточный белок, иммунорегуляторный агент или терапевтическое средство, или их части, которые могут экспрессироваться в клетке реципиента, включая, но не ограничиваясь ими, опухолевые иммуногены, иммуногены трансплантатов и аутоиммунные иммуногены или их фрагменты и производные. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением вектор Mycobacterium может содержать PNS, кодирующий опухолевые иммуногены, иммуногены трансплантатов или аутоиммунные иммуногены или их части или производные. Альтернативно, вектор Mycobacterium может содержать синтетический PNS (описанный выше), кодирующий опухолеспецифические антигены,антигены трансплантатов или аутоиммунные антигены или их части. Примерами опухолеспецифических антигенов являются специфический для предстательной железы антиген (Gattuso et al., Human Pathol., 26: 123-126; 1995), TAG-72 и CEA (Guadagni et al., Int. J. Biol.Markers, 9: 53-60; 1994), MAGE-1 и тирозиназа (Coulie et al., J. Iminunothera., 14: 104-109; 1993). Недавно было обнаружено, что у мышей, которые были иммунизованы незлокачественными клетками, экспрессирующими опухолевый антиген, наблюдается вакцинный эффект, а также вырабатывается иммунный ответ, способствующий выведению злокачественных опухолевых клеток, несущих тот же самый антиген(Koeppen et al., Anal. N.Y. Acad. Sci., 690: 244-255; 1993). Примером антигенов трансплантатов является молекула CD3 на Т-клетках (Alegre et al., Digest. Dis.Sci., 40: 58-64; 1995). Было показано, что обработка антителом против рецептора CD3 способствует быстрому выведению циркулирующих Т-клеток и предотвращению клеточно-опосредуемого отторжения трансплантата (Alegre et al., см. выше, 1995). Примером аутоиммунных антигенов является -цепь IAS (Topham et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA,91: 8005-8009; 1994). Было продемонстрировано, что вакцинация мышей пептидом -цепи IAS, состоящим из 18 аминокислот, вызывает у мышей с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом выработку иммунитета к указанному заболеванию и подавление такого заболевания (Topham et al., см. выше, 1994). Векторы Mycobacterium, экспрессирующие адъювант. Могут быть сконструированы векторы Mycobacterium, содержащие PNS, кодирующий иммуноген и адъювант, и такие векторы могут быть использованы для выработки усиленного иммунного ответа у хозяина на указанный вектор и PNS-кодируемый иммуноген. Альтернативно, для усиления ответов у хозяина на иммуногены, кодируемые партнером вектора Mycobacterium, могут быть сконструированы векторы Mycobacterium, содержащие PNS, кодирующий адъювант, которые вводят в комбинации с другими векторами Mycobacterium, содержащими PNS, кодирующий по меньшей мере один иммуноген. Выбор какого-либо конкретного адъюванта, кодируемого PNS в указанном векторе Mycobacterium,не имеет решающего значения для осуществления изобретения, и такими адъювантами могут быть субъединица А холерного токсина (т.е. CtxA; GenBank, инвентарный номер Х 00171, AF175708, D30053,- 10012434D30052) или ее части и/или мутантные производные (например, домен A1 субъединицы A Ctx (т.е.CtxA1; GenBank, инвентарный номер K02679, происходящие от любого классического штамма Vibriocholerae (например, штамма V. cholerae 395, ATCC39541) или штамма E1 Tor V. cholerae (например,штамма V. cholerae 2125, ATCC39050). Альтернативно, вместо CtxA может быть использован любой бактериальный токсин, который является членом семейства бактериальных аденозиндифосфатрибозилирующих экзотоксинов (Krueger and Barbier, Clin. Microbiol. Rev., 8: 34; 1995), например субъединица А термолабильного токсина (называемого далее EltA) энтеротоксигенной бактерии Escherichia coli (GenBank, инвентарный номер М 35581), субъединица S1 коклюшного токсина (например, ptxS1, GenBank,инвентарный номер AJ007364, AJ007363, AJ006159, AJ006157 и т.п.); а в качестве другой альтернативы таким адъювантом может быть один из аденилатциклазогемолизинов бактерий Bordetella pertussis (ATCC8467), Bordetella bronchiseptica (ATCC7773) или Bordetella parapertussis (ATCC15237), например гены суаА В. pertussis (GenBank, инвентарный номер Х 14199), В. parapertussis (GenBank, инвентарный номер AJ249835) или В. bronchiseptica (GenBank, инвентарный номер Z37112). Вектор Mycobacterium, экспрессирующий иммунорегуляторный агент. В еще одном способе может быть использован вектор Mycobacterium, содержащий по меньшей мере один PNS, кодирующий иммуноген и цитокин, и такой вектор может быть использован для выработки усиленных ответов хозяина на указанный вектор Mycobacterium, экспрессирующий PNS-кодируемый иммуноген. Альтернативно, может быть сконструирован вектор Mycobacterium, содержащий PNS, кодирующий указанный отдельно взятый цитокин, и эти векторы могут быть использованы в комбинации по меньшей мере с одним другим вектором Mycobacterium, содержащим PNS, кодирующий иммуноген, для усиления ответа хозяина на PNS-кодируемые иммуногены, экспрессируемые партнером вектора Mycobacterium. Выбор какого-либо конкретного цитокина, кодируемого вектором Mycobacterium, не имеет решающего значения для осуществления изобретения, и такими цитокинами являются, но не ограничиваются ими, интерлейкин-4 (называемый далее "IL-4"; Genbank, инвентарный номер AF352783 (мышиныйNM008351/NM008352 (мышиный IL-12 р 35/40) или AF093065/AY008847 (человеческий IL-12 p35/40,TGF (Genbank, инвентарный номер NM011577 (мышиный TGF1) или М 60316 (человеческий TGF1 и TNF (Genbank, инвентарный номер Х 02611 (мышиный TNF) или М 26331 (человеческий TNF. Выбор какого-либо конкретного метода, применяемого для встраивания гена, кодирующего Pfo, в геном BCG, не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такие методы могут быть выбраны из методов, хорошо известных специалистам (Parish et al., Microbiology, 145: 34973503; 1999). Предпочтительный метод позволяет вводить ген Pfo в локус ureC, что приводит к инактивации последнего гена и к получению маркера для отбора модифицированных штаммов (Qadri et al., JClinic Micro. 20(6), 1198-1199; 1984). Для этого синтетическая плазмида для аллельного обмена, такая как плазмида, описанная ниже в разделе "примеры", может быть модифицирована так, чтобы она содержала 1-т.п.н. последовательности, фланкирующие 5'- и 3'-концы гена ureC (Genome DatabaseMb1881). Затем ген PfoA (Genome DatabaseCPE0163) встраивают между указанными фланкирующими последовательностями под контролем промотора Ag85B. Для секреции белка PfoA, вместо сигнальной последовательности нативного PfoA используют последовательность лидерного пептида Ag85B, которая обеспечивает эффективную секрецию из рекомбинантных штаммов BCG. Выбор метода, посредством которого плазмиды для аллельного обмена могут быть введены в нужные штаммы BCG, не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такой метод может быть осуществлен в соответствии со стандартными протоколами электропорации Mycobacterium. Аналогичным образом, выбор конкретного метода осуществления аллельного обмена и введения аллеля Pfo в локус ureC не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такой метод может быть выбран из методов, хорошо известных специалистам. Использование вектора"самоубийцы", представленного на фиг. 1, является предпочтительным методом, поскольку такая плазмида содержит два маркера для отбора на резистентность к антибиотикам, что позволяет минимизировать отбор спонтанно образующихся мутантов, резистентных к антибиотикам. В процессе аллельного обмена ген ureC заменяется на генный сегмент PfoA в результате гомологичной рекомбинации левой и правой фланкирующих последовательностей, что приводит к стабильной хромосомной интеграции и экспрессии PfoA. Преимущество такого подхода заключается в том, что для сохранения конечного продукта не требуется использования антибиотиков, и в конечном штамме отсутствует генотип или фенотип резистентности к антибиотику. Такие продукты являются предпочтительными для введения человеку(эти продукты далее будут называться "продуктами, не содержащими гена резистентности к антибиоти- 11012434 ку"). UreC-негативный фенотип будет служить показателем того, что данные штаммы были подвергнуты аллельному обмену, при котором ген ureC был заменен геном Pfo, при этом очевидно, что в некоторых вариантах применения изобретения в качестве маркера может также служить UreC-позитивный фенотип. В настоящем изобретении локализация pfoA в BCG не ограничивается локусом ureC. Другими возможными вариантами таких локусов являются, но не ограничиваются ими, pfoA, интегрированный в плазмиду, и attB-сайт на хромосоме. Для специалиста в данной области очевидно, что pfoA может быть интегрирован и экспрессирован и в других возможных сайтах на хромосоме. Настоящее изобретение также относится к вакцинным препаратам, которые могут быть использованы для выработки иммунного ответа против туберкулеза. Такие вакцинные препараты включают по меньшей мере один штамм rBCG, описанный в настоящем изобретении, и фармакологически приемлемый носитель. Получение таких композиций, используемых в качестве вакцины, хорошо известно специалистам. Обычно такие композиции получают в виде жидких растворов или суспензий, однако они могут быть также получены и в виде твердых форм, таких как таблетки, драже, порошки и т.п. Могут быть также получены твердые формы, которые, перед их введением, могут быть растворены или суспендированы в жидкости. Такой препарат может быть также эмульгирован. Активные ингредиенты могут быть смешаны с эксципиентами, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активными ингредиентами. Подходящими эксципиентами являются, например, вода, физиологический раствор, декстроза, раффиноза, глицерин, этанол и т.п., или их комбинации. Кроме того, данная композиция может содержать небольшие количества вспомогательных ингредиентов, таких как смачивающие или эмульгирующие вещества, забуферивающие агенты для коррекции рН и т.п. Кроме того, такая композиция может также содержать и другие адъюванты. Если данную композицию желательно вводить перорально, то в такую композицию могут быть добавлены различные загустители, флаворанты, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие добавки, связующие вещества и т.п. Композиция согласно изобретению может содержать любой из указанных дополнительных ингредиентов при условии, что данная композиция будет иметь форму, пригодную для введения. Конечное количество бактерий rBCG в данных композициях может варьироваться. Однако в основном, это количество будет составлять примерно 1-99%. Вакцинные препараты согласно изобретению могут также включать адъюванты, подходящими примерами которых являются, но не ограничиваются ими, Seppic, Quil A, Alhydrogel и т.п. Кроме того, вакцинные препараты согласно изобретению могут содержать rBCG одного типа. Альтернативно, данная вакцина может включать rBCG более одного типа. Настоящее изобретение также относится к способам выработки иммунного ответа против туберкулеза и к способам вакцинации млекопитающих против туберкулеза. Под термином "выработка иммунного ответа" авторы настоящего изобретения подразумевают, что введение вакцинного препарата согласно изобретению, которое приводит к синтезу специфических антител (с титром в пределах от 1 до 1106,предпочтительно 1103, более предпочтительно в пределах примерно от 1103 до 1106, а еще более предпочтительно до более 1106) и/или к пролиферации клеток, измеренной, например, по включению 3 Н-тимидина. Указанные методы включают введение млекопитающему композиции, содержащей штаммrBCG согласно изобретению в фармакологически приемлемом носителе. Вакцинный препарат согласно изобретению может быть введен любыми подходящими способами, известными специалистам, включая,но не ограничиваясь ими, инъекции, пероральное введение, интраназальное введение, прием пищевого продукта, содержащего rBCG, и т.п. В предпочтительном варианте изобретения таким способом введения является подкожное или внутримышечное введение. Нижеследующие примеры приводятся в целях иллюстрации различных аспектов настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничение осуществления изобретения. При этом следует отметить, что в настоящем изобретении могут быть использованы различные альтернативные материалы, условия и процедуры, которые являются очевидными для специалиста в данной области, но которые не должны выходить за рамки общего объема изобретения, представленного в его описании. Примеры Ранее была продемонстрирована решающая роль, которую играют CD8+-Т-клетки, рестриктированные MHC класса I, в вырабатывании иммунитета против туберкулеза (Flynn et al., см. выше, 1992). Для улучшения CD8-Т-клеточного ответа был сконструирован рекомбинантный штамм BCG, который экспрессирует листериолизин Listeria monocytogenes. Однако этот рекомбинантный штамм BCG (rBCG) не обладал повышенной способностью к высвобождению из эндосомы, а поэтому он не обладал повышенной способностью к индуцированию, например, цитотоксического CD8+-Т-клеточного ответа, рестриктированного MHC класса I. Результаты анализа показали, что этот штамм способен к высвобождению из эндосомы на уровне менее 1%. Это не удивительно, если учесть, что активность листериолизина в высокой степени чувствительна к рН, а поэтому этот фермент фактически не активен при рН эндосомы. Несмотря на этот недостаток, протективные свойства и безопасность указанного рекомбинантного штамма значительно улучшились. Исходя из этих наблюдений, авторами настоящего изобретения был сконструирован новый штамм rBCG путем введения PfoAG137Q, происходящего от Clostridium perfringens, в- 12012434 хромосому BCG. PfoAG137Q имеет одну аминокислотную замену G на Q в положении 137. Эта одна аминокислотная замена приводит к потере токсичности PfoA в клетках млекопитающих, но при этом указанный фермент сохраняет свою эндосомолитическую функцию. На мышиных моделях было показано,что полученный штамм является безопасным и иммуногенным. Материалы и общие методы. В каждом эксперименте, описанном в нижеследующих разделах, рестриктирующие эндонуклеазы(обозначаемые здесь "REs"); (New England Biolabs Beverly, MA), ДНК-лигаза Т 4 (New England Biolabs,Beverly, MA) и полимераза Taq (Life Technologies, Gaithersburg, MD) были использованы в соответствии с протоколами производителей. Плазмидную ДНК получали с использованием наборов для лабораторной очистки (Qiagen MiniprepR kit, Santa Clarita, CA) или для крупномасштабной очистки (QiagenMaxiprepR kit, Santa Clarita, CA) плазмидных ДНК в соответствии с протоколами производителей (Qiagen,Santa Clarita, CA). Воду milli-Q, не содержащую нуклеазы и очищенную до чистоты, требуемой для проведения молекулярно-биологических экспериментов; трис-HCl (рН 7,5), ЭДТА, рН 8,0, 1 M MgCl2, 100%(об./об.) этанол, сверхчистую агарозу и буфер для электрофореза в агарозном геле закупали у фирмы LifeTechnologies, Gaithersburg, MD. Гидролиз рестриктирующими ферментами, ПЦР, реакции лигирования ДНК и электрофорез в агарозном геле проводили в соответствии с хорошо известными процедурамиUSA. Mar; 87(5) 1889-93; 1990). Секвенирование нуклеотидов для подтверждения последовательности ДНК каждой рекомбинантной плазмиды, описанной в нижеследующих разделах, проводили в соответствии со стандартными автоматизированными методами секвенирования ДНК с использованием автоматического секвенатора Applied Biosystems, модели 373 А. ПЦР-праймеры закупали у коммерческих фирм-поставщиков, таких как Sigma (St. Louis, MO), или синтезировали с использованием ДНК-синтезатора Applied Biosystems (модель 373A). ПЦР-праймеры использовали при концентрации 150-250 мкМ, а температуру отжига для ПЦР-реакций определяли с помощью компьютерной программы Clone manager software version 4.1 (Scientific and Educational SoftwareInc., Durham NC). ПЦР проводили в автоматизированном термоциклере Strategene Robocycler, модель 400880 (Strategene, La Jolla, CA). ПЦР-праймеры для амплификации конструировали с помощью компьютерной программы Clone Manager software version 4.1 (Scientific and Educational Software Inc., DurhamNC). Эта программа позволяет конструировать ПЦР-праймеры и идентифицировать рестрикционные сайты, совместимые со специфическими ДНК-фрагментами, подвергаемыми модификации. ПЦР проводили в термоциклере, таком как автоматизированный термоциклер Strategene Robocycler, модель 400880(Strategene), а время отжига, удлинения и денатурации праймеров в ПЦР устанавливали в соответствии с протоколами стандартных процедур (Straus et al., см. выше, 1990). Затем гидролиз рестриктирующими ферментами и ПЦР анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле стандартными методами(Straus et al., см. выше, 1990; и Sambrook et al., см. выше, 1989). Положительный клон определяли как клон, который обнаруживал соответствующую рестрикционную карту и/или картину ПЦР. Плазмиды,идентифицированные указанным способом, могут быть дополнительно оценены в соответствии со стандартными процедурами секвенирования ДНК, описанными выше. Штаммы Escherichia coli, такие как DH5 и Sable2R, закупали у фирмы Life Technologies (Gaithersburg, MD), и эти штаммы служили в качестве исходного хозяина для рекомбинантных плазмид. Рекомбинантные плазмиды вводили в штаммы E. coli путем электропорации с применением электроимпульсного устройства высокого напряжения, такого как Gene Pulser (BioRad Laboratories, Hercules, CA), с установленными параметрами 100-200 Ом, 15-25 мкФ и 1,0-2,5 кВ, как описано в литературе (Straus et al.,см. выше, 1990). Оптимальные условия электропорации идентифицировали путем определения параметров, которые дают максимальную скорость трансформации на мкг ДНК/бактерию. Бактериальные штаммы культивировали на трипсинизированном соевом агаре (Difco, Detroit, MI) или в трипсинизированном соевом бульоне (Difco, Detroit, MI), которые приготавливали в соответствии с инструкциями производителя. Если это не оговорено особо, то все бактерии культивировали при 37 С в 5% СО 2 (об./об.) при легком помешивании. Если необходимо, то в указанные среды добавляли антибиотики (Sigma, St. Louis, MO). Бактериальные штаммы хранили при -80C и суспендировали в среде Difco,содержащей 30% (об./об.) глицерина (Sigma, St. Louis, MO), при плотности примерно 109 колониеобразующих единиц (далее обозначаемых "к.о.е.") на 1 мл. Аллельный обмен в BCG. Ранее были описаны методы введения модифицированных аллелей в штаммы Mycobacterium, и эти методы могут быть адаптированы и применены специалистами в данной области (Parish et al., Microbiology 146: 1969-1975; 2000). Новый метод генерирования плазмиды для аллельного обмена предусматривает использование синтезированной ДНК. Преимущество такого метода заключается в том, что о данном плазмидном продукте, полученным таким методом, может быть дана полная информация, а поэтому на его применение должно быть получено разрешение регуляторных органов, тогда как применяемые ранее методы, хотя и являются эффективными, очень плохо задокументированы с точки зрения протоколов проведения лабораторного культивирования, а поэтому на осуществление этих методов может быть не- 13012434 получено разрешения. Если данный продукт используется для введения человеку, то в соответствии с существующими нормами, на его применение должно быть получено разрешение регуляторных органов США и Европейских стран. Вектором-"самоубийцей" для аллельного обмена в Mycobacterium является плазмида, которая способна реплицироваться в штаммах E. coli, но не способна реплицироваться в штаммах Mycobacteriumspp., таких как M. tb и BCG. Выбор того или иного конкретного вектора-"самоубийцы" для его использования в процедурах аллельного обмена не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такой вектор может быть выбран из векторов, полученных в научно-исследовательских лабораториях (Parish et al., см. выше, 2000) или являющихся коммерчески доступными. Предпочтительная конструкция плазмиды-"самоубийцы" для аллельного обмена представлена на фиг. 1. Эта плазмида состоит из нижеследующих ДНК-сегментов: последовательности oriE для репликации данной плазмиды в E. coli (GenBank, инвентарный номер L09137); последовательности гена резистентности к канамицину для отбора в E. coli и в Mycobacterium (GenBank, инвентарный номер ААМ 97345); и вспомогательного маркера для отбора на резистентность к антибиотику, например, гена резистентности к зеоцину (GenBank, инвентарный номер AAU06610), который находится под контролем промотора Mycobacterium (например, промотора hsp60). Указанный второй маркер для отбора на резистентность к антибиотику не является обязательным, и он был включен для осуществления двойного отбора в целях предотвращения чрезмерного роста резистентных к канамицину изолятов, спонтанно образующихся в процессе аллельного обмена. Конструирование таких векторов-"самоубийц" может быть осуществлено стандартными методами рекомбинантных ДНК, описанных в настоящем изобретении. Однако современные стандарты, разработанные регуляторными органами, требуют обратить внимание на угрозу попадания прионовых частиц,образующихся в продуктах, обработанных коровьими продуктами, содержащими BSE-инфицированный материал. Поэтому во избежание попадания этих материалов (например, последовательностей ДНК) в нужный штамм неизвестного происхождения, предпочтительно, чтобы все ДНК в векторе-"самоубийце" были синтезированы с использованием коммерческих источников (например, Picoscript, Inc.). B соответствии с этим, предпочтительным методом конструирования векторов-"самоубийц" является разработка протокола получения последовательностей ДНК с помощью компьютерной программы для конструирования ДНК (например, Clone Manager), с последующим синтезом ДНК коммерческой фирмойпоставщиком (например, Picoscript Inc.), предоставляющей такие услуги за соответствующую плату. Этот метод был использован для конструирования и продуцирования вектора-"самоубийцы", используемого в экспериментах, описанных в разделе "Примеры". Конфигурация вектора-"самоубийцы", описанного выше (фиг. 1), имеет те преимущества, что он содержит два маркера для отбора на резистентность к антибиотикам, что позволяет минимизировать отбор спонтанных мутантов, обнаруживающих резистентность к одному антибиотику, и присутствующих в отношении примерно 1/108 на генерацию. Спонтанная резистентность к двум антибиотикам встречается крайне редко и наблюдается только примерно в 1 случае на 1016-генерацию. Таким образом, вероятность появления штаммов, обладающих такой двойной резистентностью, в культурах, используемых для проведения процедуры аллельного обмена, составляет менее 1/106. Для негативного отбора в процессе аллельного обмена был включен ген sacB (геномная последовательность SEQ IDNT01BS4354), который сообщает фенотип чувствительности к сахарозе, в целях обогащения культуры штаммами, которые были подвергнуты конечной стадии рекомбинации ДНК и в которых была завершена процедура аллельного обмена. Культивирование штаммов Mycobacterium. Выбранные штаммы BCG культивировали в жидкой среде, такой как среда Middlebrook 7H9 или синтетическая среда Saulton, предпочтительно при 37C. Эти штаммы могут храниться в виде стационарной или перемешиваемой культуры. Кроме того, скорость роста BCG может быть увеличена путем добавления олеиновой кислоты (0,06% об./об.; Research Diagnostics Cat.01257) и детергентов, таких как тилоксапол (0,05% об./об.; Research Diagnostics Cat.70400). Чистота культур BCG может быть оценена путем равномерного посева 100 мкл аликвот культуры BCG, серийно разведенной (например,10-кратно разведенной чистой культуры (Neat) - 10-8) в забуференном фосфатом физиологического растворе (далее обозначаемом PBS), на 3,5-дюймовых чашках, содержащих 25-30 мл твердой среды, такой как среда Middlebrook 7 Н 10. Кроме того, чистота указанной культуры может быть дополнительно оценена с использованием коммерчески доступных наборов, таких как наборы, содержащие тиогликолят натрия (Science Lab, номер по каталогу 1891) и соевую среду с казеином (BD, номер по каталогу 211768). Посевные лоты BCG хранили при -80C при плотности 0,1-2107 к.о.е./мл. Жидкие культуры обычно собирали при оптической плотности (600 нм), составляющей 0,2-4,0 по отношению к стерильному контролю; и эти культуры высевали в центрифужные пробирки соответствующего размера, а затем микроорганизмы подвергали центрифугированию при 8000g в течение 5-10 мин. Супернатант отбрасывали,и микроорганизмы ресуспендировали в растворе для хранения, состоящем из среды Middlebrook 7H9,содержащей 10-30% (об./об.) глицерина при плотности 0,1-2107 к.о.е./мл. Эти суспензии в аликвотах по- 14012434 1 мл распределяли по стерильным 1,5-миллилитровым боросиликатным сосудам для глубокого замораживания, а затем хранили при -80C. Пример 1. Конструирование штаммов rBCG-PfoA, способных высвобождаться из эндосомы. Конструирование штаммов rBCG-PfoA, способных высвобождаться из эндосомы, осуществляли посредством аллельного обмена областей, фланкирующих ген ureC. B результате этого ген ureC был заменен на генный сегмент PfoA, что приводило к стабильной экспрессии гена PfoA в хромосоме. Эта процедура подробно описана ниже. Конструирование плазмиды для аллельного обмена. Плазмида для аллельного обмена состояла из следующих ДНК-сегментов: последовательности oriE для репликации данной плазмиды в E. coli; последовательности гена резистентности к канамицину для отбора в E. coli и в Mycobacterium; и вспомогательного маркера для отбора на резистентность к антибиотику (например, гена резистентности к зеоцину), который экспрессируется под контролем промотора Hsp60. Указанный второй маркер используется для осуществления двойного отбора в целях предотвращения исключения резистентных к канамицину штаммов, спонтанно образующихся в данном процессе. Для негативного отбора в процессе аллельного обмена был использован ген, чувствительный к сахарозе. И наконец, между левой и правой 1-т.п.н. последовательностями, фланкирующими ген ureC в нужном штамме BCG Дания 1331, был включен генPfoA. Ген PfoA экспрессировался под контролем промотора Ag85B. Для секреции PfoA вместо его природной секреторной последовательности была использована последовательность лидерного пептидаAg85B. И наконец, синтез и сборка всех этих компонентов были осуществлены Picoscript Inc (Houston,TX). Полученная плазмида представляет собой бактериальный вектор-"самоубийцу", и карта, полученная для этой плазмиды, представлена на фиг. 1. Полученная плазмидная конструкции имеет подтвержденную структуру, показанную на фиг. 5. Введение плазмиды для аллельного обмена в штамм BCG Дания 1331 Mycobacterium bovis. Процесс аллельного обмена схематически продемонстрирован на фиг. 4, где указаны главные стадии этой процедуры. Подробное описание этих стадий приводится ниже. Штамм BCG Дания 1331 культивировали в среде 7 Н 9, в которую были добавлены 10% OADC(олеиновая кислота-альбумин-декстрозо-каталаза) (BD Gibco) и 0,05% (об./об.) тилоксапола (Научноисследовательская и диагностическая лаборатория). При достижении культурой логарифмической стадии роста, бактерии собирали и приготавливали для введения путем электропорации, как описано в литературе (Sun et al., 2004). В свежеприготовленные электрокомпетентные клетки вводили 5 мкг плазмиды для аллельного обмена в соответствии со стандартной методикой. Плазмиду для аллельного обмена, сконструированную, как описано выше, вводили в штамм M. bovis BCG Дания 1331 в соответствии со стандартным протоколом электропорации, разработанным для введения микобактерий. После электропорации клетки культивировали в течение ночи на среде 7 Н 9, в которую были добавлены 10% (об./об.) OADC и 0,05% (об./об.) тилоксапола. Затем эти клетки высевали на чашки со средой 7 Н 10, содержащей 50 мкг/мл канамицина и зеоцина. Полученные колонии собирали и культивировали в среде 7 Н 9, содержащей 10% (об./об.) сахарозы. Затем полученную культуру высевали на чашки со средой 7 Н 10 для клонирования и получали отдельные колонии, которые были идентифицированы на присутствие гена PfoA вместо гена ureC. Ha диаграмме, представленной на фиг. 4, описаны главные стадии этой процедуры, а в табл. 1 описан вектор-"самоубийца", pAF 102, который также изображен на фиг. 1. Таблица 1 Вектор-"самоубийца", используемый в настоящем изобретении В примере 1 показано, что штамм BCG Mycobacterium является генетически сконструированным так, что он экспрессирует выбранный эндосомолитический белок, который является активным при нейтральном рН и позволяет данной микобактерии высвобождаться из эндосомы в цитоплазму клетки. Пример 2. Тестирование штамма rBCG-PfoA. Материалы и методы для примера 2. Культивирование Mycobacterium. Для проведения последующих экспериментов, штаммы BCG культивировали при 37C в среде Middlebrook 7H9 (BD biosciences), в которую были добавлены 10%OADC. Для диспергирования бактерий использовали тилоксапол (0,05% об./об., Research Diagnostics Cat.70400). В экспериментах, проводимых для сравнения различных штаммов, оптическую плотность(600 нм) измеряли в различное время после инокуляции. Для оценки на чувствительность к канамицину штаммы культивировали и рост культур оценивали, как описано выше, за исключением того, что канамицин добавляли до конечной концентрации 50 мкг/мл. Если для культивирования бактерий использовали твердую среду, то в этих целях применяли агар Middlebrook 7H10 (BD biosciences). При необходимости, канамицин добавляли до конечной концентрации 50 мкг/мл, а сахарозу добавляли до конечной кон- 15012434 центрации 3%. Тест на уреазную активность. Колонии, полученные на чашках с сахарозой, как описано выше в примере 1, сначала скринировали на отсутствие уреазной активности с использованием тест-набора на уреазную активность (BD Difico) в соответствии с инструкциями производителя. Короче говоря, петлю с бактериальной культурой ресуспендировали в коммерчески доступном тест-буфере в прозрачных пробирках. В качестве уреазного позитивного контроля использовали штамм BCG Дания 1331. В качестве негативного контроля использовали лишь один буфер. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, и полученный результат оценивали в соответствии с инструкциями производителя. Генотипический анализ штаммов rBCG, несущих ureC: pfoA. Для амплификации ДНКпоследовательности для Pfo-специфической инсерции аллеля и геномных ДНК-последовательностей[acggctaccgtctggacat] (SEQ ID NO: 4) и обратного праймера [cgatggcttcttcgatgc] (SEQ ID NO: 5). ПЦР осуществляли в следующем режиме: стадия 1: при 95C, 4 мин, один цикл; стадия 2: при 95C, 1 мин, при 60C, 1 мин, а затем при 72 С, 1 мин, всего 30 циклов; стадия 3: при 72C, 10 мин, один цикл; стадия 4: хранение при 4C. Полученные ПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле, секвенировали на автоматическом секвенаторе с применением дидезокси-метода секвенирования, и подтверждали присутствие полноразмерного гена PfoA вместо гена ureC (т.е. ureCPfoA). Рост AFV102 на микрофагах. Рост штамма AFV102 rBCG in situ оценивали в макрофаг-подобных клетках J774A.1 путем измерения микобактериальных колониеобразующих единиц (к.о.е.) в инфицированных макрофагах. Эффективность фагоцитоза микобактерий определяли путем оценки числа внутриклеточных к.о.е. через три часа после инфицирования клеток J774A.1. Последующую продолжительность жизни бактерий определяли путем лизиса клеток с высвобождением внутриклеточных бактерий для подсчета числа к.о.е. после их пятикратного промывания PBS, как описано в литературе (Sun et al.,2004). Анализ на гемолитическую активность Pfo, экспрессированного в AFV102. Для оценки секрецииPfoA из AFV102 этот штамм культивировали до середины фазы логарифмического роста, как описано выше. Затем собирали супернатанты культуры. Бактериальный осадок AFV102 ресуспендировали в 100 мкл PBS (рН 7,0), содержащего 0,1% BSA, в 96-луночном планшете с V-образным дном. Для того чтобы определить, секретируется ли белок PfoA в супернатант культуры, жидкую культуру центрифугировали, и супернатант подвергали тестированию. Для оценки экспрессированного PfoA на его рНнезависимую гемолитическую активность, получали образцы, как описано выше, за исключением того,что в качестве реакционного буфера использовали буфер PBS с различными значениями рН. При этом в каждую лунку также добавляли 100 мкл 1% промытых овечьих эритроцитов. Реакционную смесь слегка размешивали и инкубировали при 37C в течение 1 ч при перемешивании. В качестве негативного гемолитического контроля использовали бактерии штамм BCG Дания 1331. В качестве позитивного гемолитического контроля использовали серийные разведения -гемолизина (Sigma) с известной гемолитической активностью. По окончании инкубирования реакционную смесь собирали путем центрифугирования при 500g в течение 15 мин, после чего супернатант из планшета с V-образным дном переносили в эквивалентные лунки в плоскодонный 96-луночный планшет и измеряли оптическую плотность (оптическая плотность при 450 нм минус оптическая плотность при 540 нм). Гемолитическую активность количественно оценивали по изменению окраски после лизиса эритроцитов путем измерения оптической плотности. Интенсивность окраски соответствует уровню лизиса эритроцитов, который, в свою очередь,соответствует количеству гемолизина. Затем соответствующие величины для образцов вычисляли по стандартной кривой, построенной с использованием известных стандартов. Единицы гемолитической активности определяли как разведение образца, при котором наблюдается лизис 50% всех овечьих эритроцитов. Цитотоксичность AFV102 по отношению к макрофагам. Цитотоксичность рекомбинантного штамма на макрофагах J774A.1 (ATCCA TIB-67) определяли путем измерения уровня лактатдегидрогеназы (LDH), высвобождаемой из инфицированных клеток, с использованием набора "Cell Titer 96 AqueousOne Solution Cell Proliferation Assay" (Promega, номер по каталогу G3580) в соответствии с инструкциями производителя. Короче говоря, клетки инфицировали бактерией AFV102 при множественности заражения 10. Через различные промежутки времени после инфицирования супернатант оценивали на количество LDH, высвобождающееся из клеток, которое затем сравнивали с количеством LDH, высвобождающимся из штамма BCG Дания 1331. В качестве негативного контроля использовали нормальные неинфицированные клетки. Процент жизнеспособных клеток подсчитывали, исходя из количества LDH, высвобожденного из инфицированных клеток, по отношению к количеству LDH, высвобождаемому из клеток негативного контроля (100% жизнеспособность клеток). Результаты эксперимента, описанного в примере 2. Конструирование AFV102. В процессе конструирования AFV102, отобранные меродиплоидные бактерии, которые в своей хромосоме содержали полноразмерную дефектную плазмиду, полученную- 16012434 посредством замены аллеля в ее гомологичном ДНК-сегменте на аллель, присутствующий на дефектной плазмиде, культивировали на чашках со средой Middlebrook 7H10, содержащей сахарозу, для осуществления конечной аллельной замены гена ureC экспрессионным кластером PfoA. Было обнаружено, что из всех колоний, продуцированных на чашках с сахарозой, одна колония Pfo-105-5 (названная AFV102) была негативной по уреазе, что позволяет предположить, что ген ureC был заменен экспрессионным кластером PfoA. Затем эту бактериальную колонию подвергали генотипическому анализу с помощью ПЦР на генотип ureCpfoA. Полученную ПЦР-реакционную смесь анализировали путем электрофореза на 1,2% агарозном геле, и результаты этого анализа представлены на фиг. 6. Как можно видеть, при ПЦР,проводимой с использованием этой бактерии в качестве матрицы, продуцировался ПЦР-продукт предполагаемого размера, который превышал размер продукта, полученного с использованием родительского штамма BCG Дания 1331. Ожидаемый размер ДНК-полосы для генотипа ureCpfoA составлял 2180 п.н., тогда как родительский штамм имел размер 1967 п.н. ПЦР-продукт для колоний 105-5 был дополнительно очищен и секвенирован в коммерческой лаборатории при Университете Джона Хопкинса (Baltimore, MD). Результат секвенирования показал, что эта колония имеет ожидаемый генотипureCpfoA. Кроме того, при проведении ПЦР для амплификации гена резистентности к канамицину и гена sacB, происходящего от штамма AFV102, не продуцировался какой-либо ПЦР-продукт (данные не приводятся). Эти данные дают основание предположить, что AFV102 был подвергнут конечной стадии аллельного обмена и имеет нужный генотип ureCpfoA. Тест для характеризации роста и чувствительности к канамицину для AFV102. Исходя из результатов теста на уреазную активность и генотипирования, был сделан вывод, что клон 105-5 (названныйAFV102) имел ожидаемый фенотип и желательный генотип ureCpfoA. Затем штамм AFV102 был дополнительно проанализирован на его способность к росту на среде 7 Н 9 по сравнению с ростом родительского штамма BCG Дания 1331. Результат этого анализа представлен на фиг. 7. Как можно видеть на этой фигуре, конструкция AFV102 имеет кривую пролиферации на культуральной среде 7 Н 9, аналогичную кривой роста, полученной для родительского штамма. Кроме того, в присутствии канамицина ростAFV102 замедлялся до уровня, сравнимого с уровнем роста родительского штамма BCG Дания 1331, что дает основание предположить, что, как и ожидалось, AFV102 обладает чувствительностью к канамицину, аналогичной чувствительности родительского штамма. Цитотоксичность AFV102. Сообщалось, что одна аминокислотная замена в белке PfoA (мутация в кодоне 137 с заменой gga, кодирующего Gly, на сад, кодирующего Gln) приводит к потере его токсичности для клеток млекопитающих. При этом указанный белок сохраняет способность опосредовать высвобождение бактерии из вакуоли (Portnoy, см. выше, 1996). Токсичность белка, экспрессированного вAFV102, оценивали путем инфицирования клеток J7741A бактерией AFV102. При сравнении с неинфицированными нормальными контрольными клетками в различные промежутки времени после инфицирования было обнаружено, что AFV102 не вызывает более высокого уровня гибели клеток, чем уровень гибели клеток, вызываемый штаммом BCG Дания 1331, широко используемым в качестве вакцины (фиг. 8). Выживание клеточной линии в альвеолярных макрофагах. Для того чтобы определить, является ли данная конструкция жизнеспособной в макрофагах, для инфицирования альвеолярных макрофаговJ774A.1 были использованы бактериальные культуры, достигшие середины логарифмической фазы роста. Эти клетки инфицировали при множественности заражения (MOI) 1: 1. Мониторинг выживания Mycobacterium в указанных клетках проводили путем подсчета бактерий на чашках через различные промежутки времени после инфицирования. Как можно видеть на фиг. 9, конструкция AFV102 обнаруживала устойчивый фенотип, аналогичный фенотипу родительского штамма, что позволяет предположить об отсутствии какого-либо нарушения в способности этой конструкции выживать в клетках J774A.1. Секреция белка PfoA конструкцией AFV102. Секрецию белка PfoA бактерией, содержащей конструкцию AFV102, оценивали путем анализа супернатанта бактериальной культуры на усиление гемолитической активности по сравнению с активностью штамма BCG Дания 1331. Супернатанты культур дляAFV102 и штамма BCG Дания 1331 собирали при той же оптической плотности и сравнивали на их способность лизировать эритроциты. Полученные результаты представлены на фиг. 10. В соответствии с предыдущими результатами супернатант BCG-культуры обнаруживал фоновый уровень гемолитической активности, индуцированной в результате высвобождения бактериальных метаболитов в процессе роста,которые могут приводить к лизису эритроцитов (Grode et al., Journal of Clinical Investigation, 115: 24722479; 2005). В противоположность этому, супернатант культуры AFV102 обнаруживал значительно более высокий уровень гемолитической активности, сравнимый с активностью штамма BCG Дания 1331 и соответствующий секреции молекул PfoA в супернатант культуры. Кроме того, был проведен анализ на рН-независимую гемолитическую активность PfoA при рН 5,5 и 7,0, и полученные результаты представлены на фиг. 10. Как можно видеть на этой фигуре, супернатант от AFV102 обнаруживал аналогичную гемолитическую активность при рН 5,5 и 7,0, что позволяет предположить, что гемолитическая активность секретированного белка PfoA, как и ожидалось, не зависит от рН. В примере 2 показано, что сконструированный штамм обладает предсказанной биологической ак- 17012434 тивностью, и что Pfo, продуцируемый этим штаммом, обладает способностью секретироваться, и его активность не зависит от рН. Пример 3. Высвобождение rBCG-PfoA из эндосомы и тест на иммуногенность у животных. Главная парадигма патогенеза Mycobacterium tuberculosis заключается в прекращении созревания фагосом. Armstrong и Hart (1971) показали, что фагосомы M. tuberculosis не смешиваются с меченными ферритином лизосомами, что объясняется ингибированием образования гибридов фагосомы-лизосомы. Было также обнаружено, что вакцинный штамм M. bovis (BCG) присутствует только в фагосомном компартменте, изолированном от конечных эндоцитарных органелл (Clemens and Horwitz, 1995; Hasan et al.,1997; Via et al., 1997). Clemens и Howitz (1995) обнаружили, что микобактериальные фагосомы приобретают устойчивую окраску в присутствии трансферринового рецептора (TfR) при плотности, аналогичной его плотности на плазматической мембране. Обычно рецептор трансферрина быстро высвобождается(t=1/2 минуты) из эндосом и переносится обратно в плазматическую мембрану; однако, в микобактериальных фагосомах, этот процесс прекращается, и трансферриновый рецептор остается в фагосомах. Этот феномен позволяет визуализировать фагосомы, содержащие микобактерии. Фагосомы были помечены антителами против трансферринового рецептора. В то же самое время микобактерии были окрашены флуоресцентным красителем, который позволяет проводить визуальный мониторинг поведения бактерий после их проникновения в фагосому. Полученные результаты показали, что конструкция rBCG-Pfo способна высвобождаться из эндосомы после инфицирования клеток. Материалы и методы для проведения теста на высвобождение из эндосомы. Бактерии и клетки. Штамм BCG Дания 1331 и rBCG-ureCpfoAG137Q (AFV102) культивировали в среде 7 Н 9, в которую были добавлены 10% (об./об.) OADC и 0,05% (об./об.) тилоксапола (среда для культивирования) до OD600 примерно 0,8-1,0. Перед инфицированием бактериальные клетки метили сукцинимидиловым эфиром Alexa Fluor 568 (Molecular Probes, Eugene, OR) в PBS при комнатной температуре в течение 1-1,5 ч в соответствии с инструкциями производителя. Этот краситель образует очень стабильные амидные связи с первичными аминами, имеющимися в белках на поверхности бактерий. Вкратце, 10 мл бактериальной культуры осаждали и ресуспендировали в 25 мл 0,625 мкг/мл Alexa Fluor 568 вPBS (рН 7,2) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1-1,5 ч для мечения бактерий. Затем меченые бактериальные клетки три раза промывали PBS и ресуспендировали в культуральной среде 7 Н 9,а затем хранили в течение ночи в холодильнике. Клетки J774A.1 культивировали в среде DMEM, как описано в литературе (Sun et al., 2004), в 6-луночных планшетах для культивирования клеток на покровных стеклах, покрытых человеческим фибронектином. Клетки высевали при плотности 3106 клеток/лунку и культивировали в течение 2 дней в инкубаторе при 37 С в атмосфере повышенной влажности с 5% СО 2. В процессе инфицирования меченые бактерии осаждали и ресуспендировали в средеDMEM+10% FBS и непосредственно добавляли в клетки J774A.1 при множественности заражения (MOI) 10 на каждую клетку. Через 20 мин, 8 ч и 24 ч клетки промывали при комнатной температуре (к.т.) забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS, рН 7,2). Затем клетки фиксировали в течение 20 мин при комнатной температуре 2% параформальдегидом в PBS (рН 7,2). После этого фиксированные клетки делали более проницаемыми путем обработки 0,1% Triton X-100 в PBS (рН 7,2) в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем два раза промывали PBS (рН 7,2). Блокирование проводили по меньшей мере в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 С путем обработки 3% альбумином бычьей сыворотки (BSA), 5% нормальной козьей сывороткой (NGS) и 0,5% азидом натрия вPBS (рН 7,2). Затем блокирующий буфер удаляли и добавляли ФИТЦ-конъюгированное крысиное антитело против мышиного трансферринового рецептора (US Biological, Swampscott, MA) при разведении 1:50 в PBS (рН 7,2), содержащем 1% BSA, 3% NGS и 0,5% азида натрия с последующим инкубированием при комнатной температуре по меньшей мере в течение 1 ч. Затем клетки 2-3 раза промывали PBS, помещали на покровные стекла и заливали заливочной средой Вектшельда. Анализ проводили при увеличении 1500 на инвертированном микроскопе Nikon TE2000, снабженным цифровой камерой Retiga EXIMono с 12-разрядной глубиной представления цвета с ИК-фильтром. Результат. При исследовании под микроскопом было обнаружено, что обе бактерии BCG и rBCGPfoA интернализуются клетками-хозяевами через 15 мин после инфицирования. Однако через 8 ч после инфицирования было обнаружено, что бактерии rBCG-PfoA высвобождались из эндосом, в отличие от бактерий BCG, которые локализовались, главным образом, в фагосоме хозяина. Эти результаты схематически проиллюстрированы на фиг. 11 А-D, где продемонстрирована бактериальная инвазия макрофаговAVF102 высвобождались из эндосомы (72%) через 8 ч после инфицирования, тогда как из фагосомы высвобождались только 29 из 100 BCG (26%). Анализ бактерий через 24 ч после инфицирования образца дал аналогичные результаты. Эти результаты показали, что экспрессия PfoA повышает уровень высвобождения AVF102 из фагосом. Дополнительное подтверждение этого результата проводили с использованием другой системы, в- 18012434 которой для мечения эндосом и лизосом (Lysotracker-Red, Molecular probes, номер по каталогу L-7528) использовали чувствительный к рН краситель в аналогичных экспериментальных условиях и в соответствии с процедурой, описанной выше. Бактерии визуализировали при излучении на длине волны 568, а фагосомы визуализировали при излучении на длине волны 488. Полученный результат совпадал с наблюдениями, описанными выше. В примере 3 показано, что рекомбинантный штамм AVF102 способен высвобождаться из эндосомы,а штамм BCG обладал гораздо меньшей способностью к такому высвобождению. Таким образом, штаммAVF102 должен индуцировать иммунный ответ в ассоциации с молекулами гистосовместимости классаI, с гораздо большей вероятностью, чем BCG, а поэтому он должен быть более эффективным в качестве вакцины. Библиография для примера 3.set. Mol. Microbiol., 52(1): 25-38. Пример 4. Стратегия изготовления вакцины и вакцинации. Стратегия изготовления вакцины основана на исследованиях, проводимых в целях определения максимальной жизнеспособности и стабильности этой вакцины в процессе ее изготовления. Такая стратегия включает оценку максимальной жизнеспособности данного микроорганизма (времени жизни) в процессе культивирования с использованием различных сред, обычно применяемых для культивирования Mycobacteria, с добавлением глицерина, сахаров, аминокислот, детергентов или солей. После культивирования клетки собирают путем центрифугирования или фильтрации в тангенциальном потоке и ресуспендируют в стабилизирующей среде для защиты клеток во время замораживания или лиофилизации. Обычно используемыми стабилизирующими агентами являются глутамат натрия, аминокислоты или их производные, глицерин, сахара или обычно используемые соли. Конечная композиция должна содержать микроорганизмы, которые являются достаточно жизнеспособными для ее доставки путем внутрикожного введения, чрескожного введения, вливания или перорального введения, и достаточно стабильными при ее хранении, при этом указанная композиция должна иметь адекватный срок годности для ее доставки и применения. Преклиническая оценка вакцин против ТБ. Общая процедура испытания на безопасность. Мышей BALB/с, по 6 животных в группе, внутрибрюшинно инфицировали 2106 к.о.е. представляющего интерес штамма(ов) rBCG и аналогичных родительских штаммов. Мониторинг общего состояния животных и их массы тела проводили в течение 14 дней после инфицирования. Животные, которым вводили штаммы BCG и rBCG, оставались здоровыми,и за время обследования у них не наблюдалось снижения массы тела и не обнаруживалось каких-либо явных признаков заболевания. Вирулентность новых штаммов rBCG у иммунокомпетентных мышей. Иммунокомпетентных мышей BALB/с, в группах по 15 животных, внутривенно инфицировали 2106 rBCG и родительского штамма BCG, соответственно. На 1-й день после инфицирования трех мышей в каждой группе умерщвляли и оценивали к.о.е. в селезенке, легких и печени для подтверждения того, что каждое животное получило одну и ту же дозу заражения. Через 4, 8, 12 и 16 недель после инфицирования трех мышей в каждой группе умерщвляли и оценивали к.о.е. в селезенке, печени и легких для анализа роста штаммов rBCG invivo по сравнению с ростом родительского штамма BCG. Строгий тест на безопасность, проводимый на мышах с иммунодефицитом. Мышей с иммунодефицитом SCID (с тяжелым комбинированным иммунодефицитом), распределенных на группы по 10 животных в каждой, внутривенно инфицировали 2106 к.о.е. штамма rBCG и родительского штамма BCG, соответственно. На день 1 после инфицирования трех мышей в каждой группе умерщвляли и оценивали к.о.е. в селезенке, печени и легких для подтверждения доз заражения. Остальных семь мышей в каждой группе подвергали мониторингу на их общее состояние и массу тела. Затем оценивали выживаемость этих мышей, и в течение всего периода наблюдения показатели выживаемости rBCG-инфицированных мышей сравнивали с показателями выживаемости животных, которые были инфицированы родительским штаммом.- 19012434 Тест на безопасность для морских свинок. Безопасность штаммов rBCG по сравнению с вакцинойBCG, полученной на основе родительского штамма и имеющей хорошо установленный профиль безопасности для человека, также оценивали на морских свинках, используемых в качестве модели. Сначала оценивали влияние вакцины на общее состояние здоровья животных, включая прирост массы тела. Морских свинок внутримышечно иммунизировали 107 (100 дозой вакцинации) к.о.е. рекомбинантного и родительского штаммов, и проводили мониторинг общего состояния здоровья животных и их массы тела в течение шести недель. Животных, которые погибали до завершения этого шестинедельного периода времени, подвергали паталогоанатомическому исследованию. По истечении шести недель после инфицирования всех животных умерщвляли и проводили макроскопический патологический анализ. Результаты теста считались удовлетворительными, если после введения rBCG-Pfo-вакцины у животных не наблюдалось какой-либо потери массы тела и какого-либо аномального поведения, и при аутопсии, проводимой через 6 недель, все органы были нормальными, и/или если не наблюдалось какого-либо ухудшения состояния животных, а прирост массы rBCG-Pfo-вакцинированных животных оставался на нормальном уровне по сравнению с животными, инокулированными родительским штаммом. Одновременно с этим проводили мониторинг уровней бактерий в органах животных. Морских свинок, иммунизованных вакциной, полученной на основе либо родительского, либо рекомбинантного штамма, подвергали эвтаназии через различные промежутки времени после инокуляции, а затем легкие,селезенку и региональные (паховые) лимфоузлы анализировали на уровень к.о.е. BCG или rBCG. Тест на токсичность. Для оценки токсичности штаммов rBCG, морских свинок (по 12 животных в каждой группе) внутрикожно вакцинировали одной дозой, которая была в 4 раза выше или в 4 раза ниже разовой дозы штаммов rBCG, родительского штамма BCG или физиологического раствора, вводимых человеку. На 3-й день после вакцинации шесть животных умерщвляли для оценки быстроты действия данной вакцины у этих животных. Через 28 дней после вакцинации шесть оставшихся животных умерщвляли для оценки продолжительности действия этих вакцин у животных. В обоих случаях одновременно регистрировали массу тела каждого животного и осуществляли исследование на наличие макропатологий, а также проводили осмотр участков тела в месте инъекции. Затем брали кровь для биохимического анализа и проводили гистопатологический анализ внутренних органов и участков тела в месте инъекции. Исследование иммунитета у мышей. Мышей С 57 В 1/6 (самок в возрасте 5-6 недель), по 13 животных в каждой группе, подкожно иммунизировали 106 к.о.е. rBCG, родительского BCG или физиологического раствора. Другую группу здоровых мышей использовали в качестве нормального контроля. Через восемь недель после иммунизации мышей инокулировали штаммом M. tb Эрдмана (или резистентным к канамицину штаммом H37Rv) путем аэрозольной ингаляции из 10-миллилитровой моноклеточной суспензии, содержащей всего 107 к.о.е. штамма для инокуляции, т.е. в дозе, доставляющей 100 живых бактерий в легкие каждого животного, как описано выше (Brodin et al., J Infect Dis. 190(1): 115-122; 2004). Мониторинг выживаемости инокулированных животных проводили одновременно с мониторингом выживаемости неинокулированных животных. После инокуляции животных также обследовали на потерю массы и на общее состояние. На 1-й день после инокуляции трех мышей в каждой группе умерщвляли и проводили анализ на уровни к.о.е. в легких для подтверждения дозы инокуляции, а одну мышь умерщвляли для проведения гистопатологического анализа селезенки и легких. Через пять недель после инокуляции девять животных в каждой группе умерщвляли и проводили гистопатологический и микробиологический анализ каждого животного. Ткани легких и селезенки, взятых у шести мышей, оценивали на уровни к.о.е. (для идентификации вакцинного штамма от инокулирующего штамма использовали планшеты, в которые добавляли селективные маркеры). Если инокуляцию проводили резистентным к канамицину штаммом H37Rv, то для идентификации инокулирующего штамма от вакцинного штамма использовали Kan или TCH (гидразид тиофен-2-карбоновой кислоты). Если инокуляцию проводили штаммом M. tb Эрдмана, то для идентификации вакцинного штамма от инокулирующего штамма использовали TCH (BCG является восприимчивым штаммом, a M. tb обычно является резистентным). Индуцирование кожной гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Морских свинок, не имеющих каких-либо обнаружимых патогенов (SPF), внутрикожно иммунизировали 103 штамма rBCG или родительского штамма BCG. Через девять недель после иммунизации спинки животных выбривали и чрескожно инъецировали 10 мкг PPD (очищенного белкового деривата) в 100 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора. Через 24 ч измеряли диаметр твердого уплотнения (ГЗТ). ШтаммыrBCG должны индуцировать ГЗТ, равную или превышающую ГЗТ, индуцируемую родительскими штаммами BCG. Исследование путем инокуляции морских свинок. Для определения эффективности rBCG-вакцин против инокулирующего патогена M. tb, морских свинок (молодых взрослых животных SPF Hartley, массой 250-300 г, самцов), по 12 животных в группе, иммунизировали rBCG, родительским штаммом BCG или физиологическим раствором. Вакцины и контроль вводили внутрикожно в дозе 106 к. о. е. Через 10 недель после иммунизации животных, иммунизованных штаммом rBCG, штаммом BCG и ложноиммунизованных животных заражали путем ингаляции аэрозоля, содержащего патоген M. tb и генерируемого из 10-миллилитровой моноклеточной суспензии, содержащей всего 107 к. о. е. M. tb; и эта процеду- 20012434 ра позволяет вводить 100 живых бактерий в легкие каждого животного, как было описано ранее (Brodinet al., 2004). После инокуляции проводили мониторинг выживаемости, потери массы тела и общего состояния животных одновременно с мониторингом здоровых животных в группах, которые не были подвергнуты вакцинации и заражению. Через 10 недель после инокуляции шесть животных в каждой группе умерщвляли, а остальные шесть животных в каждой группе через 70 недель после инокуляции подвергали продолжительному обследованию. Одновременно проводили гистопатологический и микробиологический анализы каждого животного. Ткани легких и селезенки подвергали гистопатологическому анализу и анализу на уровни к.о.е. (для идентификации вакцинного штамма от инокулирующего штамма использовали планшеты, в которые были добавлены селективные маркеры). Если инокуляцию проводили резистентным к канамицину штаммом H37Rv, то для идентификации инокулирующего штамма от вакцинного штамма использовали Kan или TCH. Если инокуляцию проводили штаммом M. tb Эрдмана, то для идентификации вакцинного штамма от инокулирующего штамма использовали TCH (BCG является восприимчивым, a M. tb обычно является резистентным). Исследование с применением инокуляции можно считать успешным в том случае, если ложноиммунизованные животные погибали вскоре после заражения, а rBCG-иммунизованные животные жили дольше, чем животные, иммунизованные родительским штаммом BCG. Исследования безопасности вакцин и картины заражения у приматов. Совсем недавно оценку эффективности вакцины против M. tb проводили на приматах, не являющихся человеком. Эволюционное родство между человеком и другими приматами и аналогичные клинические и патологические симптомы туберкулеза у этих видов делают указанных приматов, не являющихся человеком, привлекательной моделью для экспериментальных исследований заболеваний ТБ и эффективности вакцин против ТБ. Эта модель, характеризующаяся образованием каверн в легких, может быть, очевидно, использована для исследования развития ТБ у человека. За процессом инфицирования и развития заболевания наблюдали путем проведения рентгеновского анализа и оценки потери массы тела, а также путем проведения различных гематологических анализов, включая анализ на скорость оседания эритроцитов (СОЭ),анализ на пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) и продуцирование цитокинов, анализ на активность цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и анализ на гуморальные ответы. После инфицирования у собакоподобных обезьян развивалась патология легких с характерными поражениями, и в течение четырех-шести месяцев после инфицирования, в зависимости от дозы заражения,животные погибали от острой инфекции дыхательных путей. Более низкие дозы инфицирования могут приводить к возникновению хронических инфекций без развития заболевания, как это часто наблюдается у людей. В этом исследовании проводили прямое сравнение различных доз родительского штамма BCG с дозами рекомбинантного BCG, вводимых отдельно, или с последующим введением двух бустер-доз вакцины, содержащей последовательности, сверхэкспрессирующиеся rBCG-конструкциях. Последние дозы могут быть введены любыми способами, без каких-либо ограничений, например, в виде рекомбинантного белка в подходящей адъювантной композиции, в виде ДНК-конструкции или в виде Ad35 конструкции. В первом исследовании оценивали протективную эффективность родительского штамма BCG по сравнению с rBCG-конструкциями, вводимыми без последующего применения бустер-инъекций. Это исследование, в котором участвовали три группы животных (по 10 животных в каждой группе), проводили в соответствии со следующим протоколом: одному животному из каждой группы вводили BCG,rBCG и физиологический раствор. Двух животных из каждой группы подвергали кожному тесту на сверхэкспрессию антигенов в rBCG-конструкциях, а также тесту с использованием стандартного PPD и физиологического раствора в качестве контроля. Явные и более крупные уплотнения у мышей rBCGгруппы, наблюдаемые по сравнению с мышами BCG-группы, указывали на то, что данная вакцина функционировала in vivo и вырабатывала иммунный ответ. Остальных восемь животных из каждой группы инокулировали аэрозолем, содержащим низкую дозу штамма M. tb Эрдмана, а уровень иммунного ответа определяли по снижению бактериальной нагрузки через 16 недель после заражения или по выживаемости как конечной цели исследования. Протокол эксперимента по введению первичной дозы BCG был, по существу, аналогичен описанному выше, за исключением того, что животных сначала вакцинировали штаммом BCG, штаммом rBCG и физиологическим раствором, а затем вводили две бустер-дозы со сверхэкспрессированными антигенами. Для изучения иммунобиологических и иммунопатологических аспектов туберкулеза у макак проводили исследования иммуногенности и иммунитета у приматов-моделей, не являющихся человеком, в целях оценки эффективности rBCG-конструкций. Перед началом эксперимента, неполовозрелых животных или молодых взрослых животных, содержащихся в неволе и имеющих среднюю массу 2-3 кг, подвергали длительной адаптации к условиям эксперимента. Исследования путем предварительной инокуляции предусматривали проведение основных анализов крови, которые включают рутинные гематологические анализы, анализы на скорость оседания эритроцитов, а также анализы на пролиферацию лимфоцитов. Перед инфицированием проводили кожные тесты с использованием PPD для подтверждения от- 21012434 сутствия у животного чувствительности к туберкулину и рентгеновский анализ грудной клетки. Период иммунизации продолжался всего 21 неделю, в течение которых проводили первичную вакцинацию штаммом BCG или rBCG, на неделю = 0, и бустер-инъекции антигенов на недели 12 и 16. Антигенспецифический иммунитет оценивали путем определения уровня пролиферации и секреции интерферона у(IFN) в тестах на стимуляцию лимфоцитов. Уровень продуцирования IFN лимфоцитами определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISPOT) или клеточного сортинга с активацией флуоресценции (FACS). Для этой цели брали пробы крови на недели 0, 4, 8, 12, 16 и 20 после первичной вакцинации. Через четыре-шесть недель после последней иммунизации животных инокулировали путем интратрахеального введения 3 мл (1000 к. о. е.) штамма M. tuberculosis Эрдмана в один и тот же день и одного и того же препарата. За процессом инфицирования наблюдали по потере массы, температуре, повышенной скорости оседания эритроцитов (СОЭ), РГЗТ в ответ на PPD, пролиферативному ответу in vitro МКПК,стимулированных PPD и по уровню антигенов, сверхэкспрессируемых в rBCG, с последующим измерением, уровней продуцирования IFN. Для детекции патологий, ассоциированных с туберкулезом легких,проводили рентгеновский анализ грудной клетки, и наконец, через 12-16 недель после инокуляции, животных подвергали аутопсии. Клиническая оценка ТБ-векторов и вакцин против ТБ. Исследования на безопасность и токсичность. Преклинические исследования на безопасность и токсичность, разрешенные Федеральными Регуляторными органами, проводили аналогично преклиническим исследованиям на безопасность и токсичность, описанным выше. После этих исследований проводили исследования вакцин на безопасность для человека. Эти исследования сначала проводили с участием здоровых взрослых индивидуумов с отрицательным результатом теста на квантиферон, а затем аналогичные исследования проводили с участием детей и новорожденных. Исследования на иммуногенность. Исследования на иммуногенность у мышей и приматов могут быть проведены стандартными методами оценки клеточного иммунитета, такими как, но не ограничивающимися ими, оценка уровней IFN, ELISPOT, проточная цитометрия с кратковременной и длительной стимуляцией антигеном или пептидом и т.п. Аналогичные методы были применены для оценки ответов у человека. Для оценки CD4- и CD8-ответов после вакцинации человека проводили исследования с использованием тетрамеров. Оптимизация стратегий комбинированной иммунизации "прайм-буст". Штамм rBCG является достаточно эффективным при его использовании в качестве отдельно взятой вакцины против ТБ или других заболеваний, для борьбы с которыми он был сконструирован, где указанный штамм экспрессирует соответствующие антигены. Описанный здесь rBCG, служащий в качестве вакцины против ТБ или экспрессирующий антигены для выработки иммунитета против других заболеваний, также является исключительно эффективным для примирования иммунной системы в целях бустер-иммунизации рекомбинантными белками, смешанными с адъювантами или вирусными или бактериальными векторными антигенами. В преклинических исследованиях на животных и в исследованиях с участием человека, первичное введение BCG с последующей бустер-инъекцией рекомбинантного белка/адъюванта или вектора оптимизировали в отношении схемы и дозы введения. Эти "прайм-буст" стратегии являются наиболее сильным средством для индуцирования иммунитета у человека, что обусловлено эффективностью первичного введения BCG, описанного в настоящем изобретении, а также локализацией и усилением бустерответа иммунной системы на введение рекомбинантного белка или вектора. Исследование действия терапевтической вакцины у животных после их заражения. Для выявления латентной инфекции использовали мышей C57BL/6 (но могут быть использованы и другие животные),которым вводили терапевтические вакцины на той стадии, когда M. tb-специфический иммунитет, индуцированный низкой дозой инфекции, вырабатывался лишь на очень незначительном уровне, и на более поздней стадии, когда индуцированный M. tb-специфический иммунитет был пониженным, и основную его часть составляли лишь Т-клетки памяти. Затем, через 2 и 5 месяцев после введения последней терапевтической вакцины эту терапевтическую вакцину оценивали на терапевтическую эффективность путем подсчета числа к.о.е. в легких и селезенке отдельных мышей. Число к.о.е. в группах мышей анализировали стандартными статистическими методами, и полученные результаты использовали для того, чтобы определить, приводит ли терапевтическая вакцинация к значительному снижению латентной M. tbинфекции у мышей. Аналогичные методы, если это необходимо, могут быть применены для оценки иммунных ответов у других животных. Клиническая оценка BCG-векторов: пероральное введение rBCG-вакцин. Пероральная вакцинация нужного животного штаммом rBCG согласно изобретению может быть проведена описанными ранее методами (Miller et al., Can Med Assoc J 121(1): 45-54; 1979). Количество перорально вводимого rBCG согласно изобретению может варьироваться в зависимости от вида индивидуума, а также от заболевания или состояния, подвергаемого лечению. В общих чертах, используемая доза содержит примерно 1031011 жизнеспособных микроорганизмов, а предпочтительно примерно 105-109 жизнеспособных микроорганизмов.rBCG обычно вводят вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Выбор какого-либо конкретного фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения. Примерами разбавителей являются забуференный фосфатом физиологический раствор, буфер для забуферивания против действия кислоты желудочного сока, образующегося в желудке, такой как цитратный буфер (рН 7,0), содержащий сахарозу, отдельно взятый бикарбонатный буфер (рН 7,0) (Levine et al., J. Clin. Invest., 79: 888-902; 1987; и Black et al., J. Infect. Dis, 155: 1260-1265; 1987) или бикарбонатный буфер (рН 7,0), содержащий аскорбиновую кислоту,лактозу, и необязательно, аспартам (Levine et al., см. выше, 1989; Lancet II: 467-470; 1988). Примерами носителей являются белки, например белки, содержащиеся в сепарированном молоке, сахара, например сахароза или поливинилпирролидон. Обычно эти носители используются в концентрации, составляющей примерно 0,1-90% (мас./об.), а предпочтительно в пределах 1-10% (мас./об.). Пример 5. Безопасность для мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID). Как упоминалось ранее, экспрессия Llo в BCG является относительно неэффективной при стимуляции высвобождения из эндосомы, что, вероятно, обусловлено низкой активностью Llo при нейтральном рН микроокружения модифицированной эндосомы, в которой присутствует BCG (Hess, et al., Proc. Natl.Acad. Sci. 95: 5299; 1998; Grode et al., J. Clin. Invest, J. Clin. Invest. 115(9): 2472; 2005). Тем не менее, экспрессия Llo, очевидно, приводит к модификации эндосомы, достаточной для снижения вирулентностиBCG-Llo+ у мышей SCID (Grode et al., 2005). Это наблюдение позволяет предположить, что направленный транспорт BCG в цитоплазму клеток-хозяев может повышать иммуногенность и безопасность этой давно известной живой вакцины против ТБ. Поэтому целью данного исследования является оценка безопасности высвобождаемого из эндосомы штамма AFV102, который экспрессирует PfoAG137Q у мышейSCID. Для этой цели родительские штаммы BCG Дания 1331 (BCG1331) и производный штамм BCG1331,которые экспрессируют PfoAG137Q, a также штамм AFV102 культивировали в 2-литровых колбах при перемешивании (150 об/мин) до достижения поздней логарифмической фазы (оптическая плотность при 540 нм = 6,5-7,5). Затем бактерии собирали путем центрифугирования и хранили при 1,5109 к.о.е./мл при -80C в физиологическом растворе + 0,05% (об./об.) тилоксапола + 10% (об./об.) глицерина. Инокуляты получали путем оттаивания вышеуказанных заполненных сосудов на льду и приготовления серий серийных разведений в нормальном физиологическом растворе (0,85% мас./об. NaCl), не содержащем эндотоксина (0,05 ЭЕ/мл). Эти разведения использовали для подкожной инокуляции групп, состоящих из 6 мышей SCID, соответствующими дозами, указанными в табл. 2, суспендированными в объеме 0,1 мл. Таблица 2 Протокол исследования на безопасность для мышей SCID После инокуляции проводили мониторинг выживаемости мышей в течение 100 дней после заражения. Результаты этих исследований показали, что мыши, инокулированные штаммом AFV102, жили дольше, чем мыши, которым была введена аналогичная доза BCG1331. Недавно внимание исследователей было обращено на использование гетерологичной бустервакцины для усиления иммунитета, вырабатываемого вакциной BCG. Таким образом, у BCGпримированных лабораторных животных и людей вырабатывались сильные клеточные иммунные ответы после введения им гетерологичной бустер-вакцины, состоящей из модифицированной вакцины "Анкара" (MVA), кодирующей антиген 85 А M. tb (обозначаемой здесь "Ag85A", также известной, какRv3804c; Vordemeier et al., Immunol. 112(3): 461; 2004; McShane et al., Nature Med. 10(11): 1240; 2004); в отличие от относительно слабых ответов на вектор MVA-Ag85A, которые вырабатывались у непримированных индивидуумов (McShane et al., 2004). Кроме того, независимые исследования показали, что у лабораторных животных, которые были примированы BCG и которым была введена бустер-доза либоMVA-Ag85A (Williams et al., Infect Immun. 73(6): 3814; 2005), либо субъединичной вакцины Mtb72f(Brandt et al., Infect. Immun. 72(11): 6622; 2004), вырабатывались более высокие уровни резистентности к заражению M. tb, чем это было достигнуто путем вакцинации одной вакциной BCG, используемой для- 23012434 дополнительного подтверждения этого подхода. Хотя эти исследования не установили четкой корреляции для такой защиты, однако очевидно, что стратегии гетерологичной "прайм-буст"-вакцинации являются эффективным средством для вырабатывания иммунитета против M. tb. Поэтому в этом и в следующем примере проиллюстрированы исследования, целью которых была оценка высвобождаемого из эндосомы штамма AFV102 в схеме "прайм-буст"-вакцинации. Целью данного эксперимента, описанного в этом примере, является оптимизация интервалов времени в схеме "праймбуст"-вакцинации, при которой высвобождаемый из эндосомы штамм AFV102 используется для первичной иммунизации, а вакцинный вектор серотипа 35, полученный на основе дефицитного по репликации аденовируса (Vogels et al., J. Virol. 77(15): 8263-71; 2003; Barouch et al., J. Immunol. 172(10): 6290; 2004), и содержащей экспрессионный кластер, кодирующий гибридный белок, состоящий из генов Rv3804cRv188 6-Rv0288 M. tb под контролем раннего промотора цитомегаловируса (Vogels et al., J. Virol. 77(15): 8263-71; 2003), используется для бустер-иммунизации. Бустер-дозу вводили интраназально (i.n.), поскольку аденовирусы, экспрессирующие антигены ТБ, являются более эффективными при введении именно этим методом, а не стандартным парентеральным способом введения (Wang et al., J. Immunol. 173(10): 6357; 2004). В соответствии с этим животные группы, состоящие из 10 самцов морских свинок SPF Hartley (250300 г), были иммунизованы, как описано в табл. 3, и их обследование проводили через 14, 18 и 21 неделю после "прайм-буст"-иммунизации. Таблица 3 Протокол исследования, проводимого на морских свинках Примечание: Ad35-TBS означает вакцинный вектор серотипа 35, полученный на основе дефицитного по репликации аденовируса (Vogels et al., J. Virol., 77(15): 8263-71; 2003; Barouch et al., J. Immunol.,172(10): 6290; 2004), и содержащий экспрессионный кластер, кодирующий гибридный белок, состоящий из генов Rv3804c-Rv1886-Rv0288 M. tb под контролем раннего промотора цитомегаловируса (Vogels etal., J. Virol., 77(15): 8263-71; 2003). Первичные дозы вводили внутрикожно (i.d.) в количестве 106 к.о.е. в 0,1 мл 10% глицерина. Контрольным мышам внутрикожно вводили только 0,1 мл 10% глицерина. Через 14 недель после введения первичной дозы морским свинкам вводили бустер-дозу, содержащую Ad35-TBS, и интраназально вводили дозу 109 бляшкообразующих единиц (Vogels et al., 2003; Barouch et al., 2004), суспендированных в 10 мкл PBS. Через 14 недель после введения бустер-дозы животных инокулировали аэрозолем, содержащим штамм M. tb Эрдмана, и генерируемым из 10-миллилитровой моноклеточной суспензии, содержащей всего 107 к.о.е. M. tb; эта процедура позволяет вводить 100 живых бактерий в легкие каждого животного, как описано ранее (Brodin et al., 2004). Через 5 недель после инокуляции животных в каждой группе умерщвляли и брали легкие и селезенку для проведения гистологического и микробиологического анализа. В последнем случае ткани легких и селезенки морских свинок оценивали на уровни к.о.е. Поскольку для инокуляции был использован штамм M. tb Эрдмана, то в эту среду добавляли TCH для идентификации вакцинного штамма, восприимчивого к TCH, от инокулирующего штамма. Результаты данного исследования позволяют идентифицировать оптимальный интервал времени между введением первичной дозы rBCG и бустер-дозы Ad35-TBS. Пример 6. Повторная иммунизация. Для определения эффективности штамма AFV102 как вакцины-канцитата против M. tb-заражения,группы из 8 морских свинок (молодых взрослых морских свинок SPF Hartley, массой 250-300 г) иммунизировали, как описано в табл. 4.- 24012434 Таблица 4 Протокол исследования путем инокуляции морских свинок Примечание: 1. n означает интервал времени между введением первичной дозы и бустер-дозы, величина которого определена в предыдущем примере. 2. Ad35-TBS означает вакцинный вектор серотипа 35, полученный на основе дефицитного по репликации аденовируса (Vogels et al., J. Virol. 77(15): 8263-71; 2003; Barouch et al., J. Immunol. 172(10): 6290; 2004), и содержащий экспрессионный кластер, кодирующий гибридный белок, состоящий из геновRv3804c-Rv1886-Rv0288 M. tb под контролем раннего промотора цитомегаловируса (Vogels et al., J.Virol. 77(15): 8263-71; 2003). Эти первичные дозы в группах 4 и 5 вводили внутрикожно в количестве 106 к.о.е. в 0,1 мл 10% глицерина. Контрольным мышам в группах 1 и 3 внутрикожно вводили только 0,1 мл 10% глицерина. Контрольным мышам в группе 2 вводили 10 к.о.е. BCG штамма Дания 1331 в 0,1 мл 10% глицерина. Через 14 недель после введения первичной дозы морским свинкам вводили бустер-дозу. Животным группы 5 вводили бустер-дозу, содержащую AFV102, и внутрикожно вводили дозу 106 к.о.е. в 0,1 мл 10% глицерина. Животным в группах 4 и 6 вводили бустер-дозы, содержащие Ad35-TBS, и интраназально вводили дозу 109 бляшкообразующих единиц (Vogels et al., 2003; Barouch et al. 2004), суспендированых в 10 мкл PBS. Через 14 недель после последней иммунизации животных инокулировали аэрозолем, содержащимM. tb; эта процедура позволяет вводить 100 живых бактерий в легкие каждого животного, как описано ранее (Brodin et al., 2004). После инокуляции проводили мониторинг выживаемости животных, а также проводили наблюдение за здоровыми животными в невакцинированной, неинокулированной группе. Этих животных также обследовали на потерю массы и на общее состояние. Результаты данного исследования продемонстрировали, что ложноиммунизованные животные очень быстро погибали после инокуляции; при этом животные, внутрикожно вакцинированные штаммомBCG без введения бустер-инъекции, погибали только через определенное время после инокуляции, а животные, иммунизованные AFV102 с последующей интраназальной бустер-иммунизацией Ad35-TBS,имели наибольшую продолжительность жизни. Пример 7. Апоптоз. Апоптоз представляет собой запрограммированную клеточную гибель, которая, по характеру и по последствиям ее индуцирования, значительно отличается от некротической клеточной гибели. Апоптоз клеток, содержащих чужеродные антигены, представляет собой известный мощный стимулятор развития клеточного иммунитета против таких антигенов. Механизм, посредством которого апоптоз антигенсодержащих клеток приводит к вырабатыванию клеточного иммунитета, иногда называют перекрестным примированием 1, 2, 3. Существует несколько механизмов индуцирования апоптоза, которые приводят к усилению антигенспецифического клеточно-опосредуемого иммунитета. Опосредуемый каспазой 8 апоптоз приводит к вырабатыванию антигенспецифического клеточноопосредуемого иммунного ответа 4. Продуцирование каспазы 8 в цитоплазме клеток рекомбинантным штаммом BCG, который высвобождается из эндосомы, представляет собой дополнительный эффективный метод индуцирования запрограммированной клеточной гибели в присутствии чужеродных антигенов, экспрессируемых рекомбинантным штаммом BCG, антигенов против BCG и других туберкулезных антигенов, сверхэкспрессируемых рекомбинантным штаммом BCG, а также против самих антигеновBCG; и этот метод позволяет вырабатывать высокие уровни антигенспецифического клеточного иммунитета. Рецептор-5 гибели клеток (DR-5), также известный, как TRAIL-R2 (рецептор 2 TRAIL) илиTNFR-SF-10B (член суперсемейства факторов некроза опухоли 10 В), также индуцирует опосредуемый каспазой 8 апоптоз 4. Индуцируемый реовирусом апоптоз опосредуется TRAIL-DR5 и приводит к последующему выведению вируса 5. Экспрессия DR-5 рекомбинантным штаммом BCG, который высвобождается из эндосомы, должна обеспечивать сильное стимулирующее действие, направленное на индуциро- 25012434 вание антигенспецифического клеточного иммунитета против rBCG-экспрессируемых антигенов. Апоптоз антигенэкспрессирующих клеток также может быть индуцирован посредством присоединения Fas,который является сильным стимулятором индуцирования антигенспецифических клеточных иммунных ответов 6. Рекомбинантный BCG, высвобождающийся из эндосомы и экспрессирующий Fas или гибридный белок, содержащий цитоплазматический домен Fas/эктодомен CD4, индуцирует апоптоз и антигенспецифические клеточные иммунные ответы. Усиление клеточного иммунитета под действием штаммов rBCG, высвобождающихся из эндосомы,или штаммов rBCG, которые высвобождаются из эндосомы и которые продуцируют дополнительные стимуляторы апоптоза, описанные выше, не ограничивается сверхэкспрессией только антигенов BCG или антигенов, специфически кодируемых в rBCG, и оно может быть вызвано сверхэкспрессией любого антигена, присутствующего в эукариотической клетке, которая может быть инфицирована вышеупомянутым штаммом rBCG. Так, например, если такой штамм rBCG ввести в опухолевые клетки, апоптоз которых он индуцирует, то это будет приводить к вырабатыванию клеточного иммунитета против важных опухолевых антигенов с последующей элиминацией, подавлением или предотвращением роста опухоли и/или возникновения метастазов. Такой противоопухолевый эффект может быть продуцирован в дополнение к общему противоопухолевому эффекту, который вырабатывается штаммом BCG при его местном введении, например, при раке мочевого пузыря. В другом варианте настоящего изобретения rBCG высвобождаемый из эндосомы, или rBCG, высвобождаемый из эндосомы и стимулируемый посредством продуцирования специфических медиаторов апоптоза, доставляемых внутрь опухоли или других клеток, где указанный rBCG также продуцирует чужеродные антигены, против которых будут вырабатываться сильные клеточные иммунные ответы, будет индуцировать вырабатывание сильных клеточных ответов против этих опухолевых клеток или других эукариотических клеток, содержащих эти антигены. Такие клеточные ответы будут приводить к иммуноопосредуемой деструкции опухолевых клеток, а также к перекрестному примированию и индуцированию клеточного иммунного ответа против опухолевых или других важных антигенов с последующим уничтожением опухоли и/или метастазов или подавлением или предупреждением развития этой опухоли и/или метастазов. Примером такого чужеродного антигена является антиген HLA, отличающийся отHLA клеток-хозяев, против которого вырабатывается сильный гетерологичный клеточный ответ. Штамм rBCG, который высвобождается из эндосомы, или rBCG, который высвобождается из эндосомы, и способность которого к индуцированию апоптоза усиливается путем экспрессии специфических медиаторов апоптоза, также экспрессирующих специфические опухолевые антигены, будет индуцировать сильные антигенспецифические клеточные ответы против этих опухолевых антигенов, включая подавление, до некоторой степени, толерантности к этим антигенам, что будет приводить к уничтожению опухоли и/или метастазов или к подавлению или предупреждению развития опухоли и/или метастазов, и не требует прямой доставки rBCG в саму опухоль. Апоптоз, вызываемый разрушением ДНК или действием каспазы 9, индуцирует толерантность к некоторым антигенам. Индуцирование толерантности играет важную роль в лечении или предупреждении аутоиммунных заболеваний, таких как, но не ограничивающихся ими, диабет, ревматоидный артрит, болезнь Крона,воспалительное заболевание кишечника и рассеянный склероз. Продуцирование каспазы 9 или других белков, индуцирующих опосредуемую апоптозом толерантность, штаммом rBCG, высвобождающимся из эндосомы, в клетках, таких как, но не ограничивающихся ими, панкреатические -клетки, клетки ободочной кишки и нервные клетки, будет приводить к ограниченному апоптозу, который будет индуцировать толерантность к антигенам-мишеням, индуцирующим аутоиммунитет в этих клетках, и тем самым благоприятствовать лечению или предупреждению аутоиммунных заболеваний. Идентификация специфических антигенов, участвующих в аутоиммунных реакциях, позволяет индуцировать толерантность к этим аутоиммунным антигенам-мишеням посредством продуцирования штаммом rBCG, высвобождающимся из эндосомы, этих антигенов и каспазы 9 или других молекул, способных индуцировать опосредуемую апоптозом толерантность. Такой rBCG может быть использован для лечения и/или предупреждения указанных аутоиммунных заболеваний. Ссылки к примеру 7. 1. W.R. Heath, G.T. Belz, G.M. Behrens, C.M. Smith, S.P. Forehan, I.A. Parish, G.M. Davey, N.S. Wilson, F.R. Carbone, and J.A. Villandangos, 2004. Cross-presentaion, dentritic cell subsets, and the generation ofHerrath, A. Lehuen, and N. Glaichenenhaus, 2002. Tolerance to islet antigens and prevention from diabetes induced by limited apoptosis of pancreatic beta cells. Immunity, 16: 169. Пример 8. Сверхэкспрессия вакцинных антигенов в штамме rBCG, способном высвобождаться из эндосомы. Для сверхэкспрессии ТБ-антигенов в штамме rBCG AFV102, последовательности, кодирующие промотор Rv3031, функционально присоединенный к последовательностям, кодирующим Rv3804c (также известный, как Ag85A), Rv1886 (также известный, как Ag85B) и Rv0288 (также известный, как ТВ 10.4), встраивали в PacI-сайт pAF100. Затем полученную плазмиду pAF105 (фиг. 12) гидролизовали рестриктирующей эндонуклеазой NdeI для удаления репликона E. coli и гена резистентности к канамицину, и подвергали рециркуляризации путем лигирования с лигазой Т 4. Полученную ДНК (1-2 мкг) встраивали в штамм rBCG AFV102 путем электропорации. Бактерии культивировали в 8,75-см планшетах, содержащих 25-30 мл твердой среды (среда Middlebrook 7H10). После предварительного скрининга с помощью ПЦР для детекции колоний, содержащих антигенэкспрессирующую плазмиду, выбраннуюrBCG-колонию, которая была PfoA-позитивной и содержала кластер, экспрессирующий ТБ-антиген, обозначали AFV112 и доводили до объема 500 мл в перемешиваемой жидкой среде (среда Middlebrook 7 Н 9) при 37C. После того как культура достигала поздней логарифмической фазы роста, к 500 мл этой культуры добавляли глицерин до конечной концентрации 10% (об./об.), и маточный посевной материал хранили в 5-мл аликвотах при -80C. Чистота культур BCG и rBCG может быть оценена путем равномерного посева 100-мкл аликвот культуры BCG, серийно разведенной (например, 10-кратно разведенной чистой культуры (Neat) - 10-8) в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), на 8,75-см чашках, содержащих 25-30 мл твердой среды, (среда Middlebrook 7H10). Для подтверждения присутствия нужного генотипа в каждом изоляте rBCG проводили ПЦР и анализ плазмидной ДНК с использованием рестриктирующей эндонуклеазы. Кроме того, для подтверждения присутствия полноразмерных генов, ПЦР-генерированные ДНКфрагменты секвенировали на автоматическом секвенаторе методом обрыва дедезоксинуклеотидной цепи. Для оценки секреции PfoA штаммами AFV102 и AFV112, содержащими плазмиду, экспрессирующую антиген ТБ, оба штамма культивировали до середины фазы логарифмического роста, как описано выше. Затем супернатанты этих культур собирали и фильтровали через мембранные 0,2-мм фильтры, как описано в литературе (Hess et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95: 5299-304; 1998). Затем белки фильтрата культуры оценивали на гемолитическую активность, как описано выше. Полученные результаты показали,что штаммы AFV102 и AFV112 обнаруживают аналогичные уровни гемолитической активности, и что штамм AFV112 сохраняет аллель ureCpfoAG137Q и экспрессирует функциональный белок PfoA. И наконец, экспрессию ТБ-антигенов оценивали в белках супернатантов культуры, выделенных с помощью электрофореза в 10-15% ПААГ с ДСН. Результаты указывали на повышенный уровень экспрессии Rv3804c и Rv1886. Поскольку не было высказано каких-либо предположений относительно сверхэкспрессии Rv0288 в супернатанте данной культуры, то вывод о сверхэкспрессии этого 10 кДа белка, который экспрессируется из той же мРНК, что и Rv3804c и Rv1886, был сделан, исходя из наблюдения сверхэкспрессии Rv3804c и Rv1886. В целом, этот пример продемонстрировал, что может быть генерирован штамм rBCG, который будет экспрессировать PfoA и сверхэкспрессировать ТБ-антигены. Такой штамм может служить в качестве вакцины против ТБ второго поколения. Хотя настоящее изобретение подробно описано со ссылками на конкретные варианты его осуществления, однако, для специалиста в данной области очевидно, что в настоящее изобретение могут быть внесены различные замены и модификации, не выходящие за рамки существа и объема изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Микобактерия (Mycobacterium), генетически сконструированная так, что она включает экспрессируемый и секретируемый функциональный эндосомолитический белок, который является активным при рН 6-8, где указанным экспрессируемым и секретируемым функциональным эндосомолитическим белком является перфринголизин О из Clostridium или его мутант. 2. Микобактерия по п.1, где аминокислотная последовательность указанного экспрессируемого и секретируемого функционального эндосомолитического белка представлена последовательностью SEQ- 27012434 3. Микобактерия по п.1, где указанный экспрессируемый и секретируемый функциональный эндосомолитический белок кодируется генной последовательностью, специфичной для перфринголизина или его мутанта. 4. Микобактерия по п.3, где указанная генная последовательность выбрана из группы, состоящей изSEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3. 5. Микобактерия по п.1, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза. 6. Микобактерия по п.5, где указанный апоптотический белок или указанный функциональный энхансер гена апоптоза выбран из группы, состоящей из каспазы 8, рецептора гибели-5, Fas и гибридного белка, состоящего из цитоплазматического домена Fas и эктодомена CD4. 7. Микобактерия по п.1, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует представляющий интерес ген. 8. Микобактерия по п.1, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза и представляющий интерес ген. 9. Микобактерия, генетически сконструированная так, что она включает экспрессируемый и секретируемый функциональный эндосомолитический белок, который является активным при значении рН в эндосомах клеток, инфицированных указанной микобактерией. 10. Микобактерия по п.9, где указанным экспрессируемым и секретируемым функциональным эндосомолитическим белком является перфринголизин или его функциональный вариант. 11. Микобактерия по п.9, где аминокислотная последовательность указанного экспрессируемого и секретируемого функционального эндосомолитического белка представлена последовательностью SEQID NO: 2. 12. Микобактерия по п.9, где указанный экспрессируемый и секретируемый функциональный эндосомолитический белок кодируется генной последовательностью, специфичной для перфринголизина или его мутанта. 13. Микобактерия по п.12, где указанная генная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3. 14. Микобактерия по п.9, где указанной микобактерией является BCG. 15. Микобактерия по п.9, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза. 16. Микобактерия по п.15, где указанный апоптотический белок или указанный функциональный энхансер гена апоптоза выбран из группы, состоящей из каспазы 8, рецептора гибели-5, Fas и гибридного белка, состоящего из цитоплазматического домена Fas и эктодомена CD4. 17. Микобактерия по п.9, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует представляющий интерес ген. 18. Микобактерия по п.9, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза и представляющий интерес ген. 19. Способ индуцирования высвобождения микобактерии из эндосом, включающий стадию генетического конструирования указанной микобактерии так, чтобы она содержала, экспрессировала и секретировала функциональный эндосомолитический белок, где указанным функциональным эндосомолитическим белком является перфринголизин О из Clostridium или его мутант. 20. Способ по п.19, где указанным функциональным эндосомолитическим белком является мутантный перфринголизин О, кодируемый SEQ ID NO: 3. 21. Способ по п.19, где указанной микобактерией является аттенуированная микобактерия. 22. Способ по п.21, где указанной аттенуированной микобактерией является BCG. 23. Способ по п.19, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза. 24. Способ по п.23, где указанный апоптотический белок или указанный функциональный энхансер гена апоптоза выбран из группы, состоящей из каспазы 8, рецептора гибели-5, Fas и гибридного белка,состоящего из цитоплазматического домена Fas и эктодомена CD4. 25. Способ по п.19, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует представляющий интерес ген. 26. Способ по п.19, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза и представляющий интерес ген. 27. Вакцинный препарат, включающий микобактерию, генетически сконструированную так, что она экспрессирует и секретирует функциональный эндосомолитический белок, который является активным при нейтральном рН, где указанным функциональным эндосомолитическим белком является перфринголизин О из Clostridium или его мутант. 28. Вакцинный препарат по п.27, где указанным функциональным эндосомолитическим белком яв- 28012434 ляется мутантный перфринголизин О, кодируемый SEQ ID NO: 3. 29. Вакцинный препарат по п.27, где экспрессия указанного функционального эндосомолитического белка указанной микобактерией способствует высвобождению указанной рекомбинантной микобактерии из эндосом. 30. Вакцинный препарат по п.27, где указанной микобактерией является аттенуированная микобактерия. 31. Вакцинный препарат по п.30, где указанной аттенуированной микобактерией является BCG. 32. Вакцинный препарат по п.27, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза. 33. Вакцинный препарат по п.32, где указанный апоптотический белок или указанный функциональный энхансер гена апоптоза выбран из группы, состоящей из каспазы 8, рецептора гибели-5, Fas и гибридного белка, состоящего из цитоплазматического домена Fas и эктодомена CD4. 34. Вакцинный препарат по п.27, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует представляющий интерес ген. 35. Вакцинный препарат по п.27, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза и представляющий интерес ген.