Бактериофаг- и профаг-специфические протеины в генной терапии рака

012120 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к применению полипептида, обладающего активностью, ингибирующей пролиферацию, или активностью, вызывающей смерть клеток у животных. Кроме того, изобретение предоставляет средства и способы применения указанного полипептида и соответствующей последовательности нуклеиновых кислот, содержащей кодирующие области указанного полипептида. Изобретение дополнительно относится к векторам экспрессии указанного полипептида, к фармацевтическим композициям и терапевтическим способам лечения пролиферативных нарушений или заболеваний, подобных раку. Наконец, в последнем, но не менее важном аспекте, изобретение предоставляет способ генно-терапевтического подхода к использованию указанного полипептида, обладающего активностью, ингибирующей пролиферацию, или активностью, вызывающей смерть клеток у животных. Предшествующий уровень техники Развитие рака как причины смерти представляет собой серьезную проблему в странах с хорошей системой здравоохранения и высоким процентом пожилых людей. До настоящего времени для лечения рака или излечения пациентов существовали ограниченные возможности, такие как хирургия или хемои радиотерапия. Это является одной из причин пристального внимания, уделяемого генно-терапевтическим подходам к лечению рака. В одном подходе генной терапии используются так называемые суицидальные гены. Суицидальный ген означает ген, экспрессия которого в клетке является летальной для этой клетки. Большинство суицидальных генов опосредуют убивающий клетку эффект путем кодирования вирусных, бактериальных, грибковых, растительных или человеческих ферментов, которые превращают химическое соединение с низкой собственной токсичностью в цитотоксичное соединение [1]. Этот подход также называется пролекарственной терапией генетически направленного фермента (GDEPT) или пролекарственной терапией вирусно направленного фермента (VDEPT), если для подачи гена используются вирусные векторы. Большинство ферментов, кодированных такими суицидальными генами, превращающими пролекарство или условно токсичные суицидальные гены, опосредуют токсичность посредством нарушения репликации ДНК, в то время как продукт экспрессии суицидального гена вызывает превращение пролекарства в токсичные метаболиты, которые затем воздействуют на репликацию ДНК [1, 6]. Некоторые наиболее хорошо исследованные ферменты представляют собой тимидинкиназу симплексного вируса герпеса (HSV)-I [2], цитозиндеаминазу [3] из бактерий или дрожжей, бактериальную нитроредуктазу [56] и ферментный цитохром Р 450 печени человека [4, 5]. Когда эти ферменты экспрессированы в клетке мишени, соответствующее пролекарство (ганцикловир, флуороцитозин, СВ 1954 и циклофосфамид или ифосфамид, соответственно) можно использовать системно, и они будут активироваться только в клетках, которые несут и экспрессируют соответствующий суицидальный ген. В другом подходе растительный ферментный ген, линамараза (Hs) гидролизует цианогенный глюкозидный субстрат, линамарин (Nn), в глюкозу и цитотоксичный цианид [57]. Недостатком этих подходов является систематическая подача пролекарств, что подразумевает введение больших доз, которые могут провоцировать побочные эффекты, особенно в случае цитохрома Р 450, который является физиологически экспрессированным преимущественно в клетках печени. Другой недостаток можно усмотреть в развитии резистентности раковых клеток, которая распространяется или на пролекарство, или на гибель клеток, которая в этом виде терапии обычно вызвана апоптозом [7, 8], и таким образом, к истощению клеток, несущих соответствующий суицидальный ген. При другой стратегии используются гены, кодирующие цитотоксичные протеины, которые оказывают прямой летальный эффект на клетки, такие как фузогенные мембранные протеины, подобные гликопротеину вируса везикулярного стоматита (VSV), или обволакивающие протеины вируса человекообразного гиббона (GALV) [9-11]. Фузогенные мембранные протеины, как только они экспрессированы в клетках мишени, вызывают мембранные слияния соседних клеток, что приводит к образованию больших многоядерных синцитий, которые, в конечном счете, погибают за счет или апоптоза, или некроза [12-14]. Другие токсины, которые были исследованы по поводу прямой гибели клеток, представляют собой, например, Corynebacterium дифтеритный токсин А [15-18], холерный токсин В [19, 20], токсин сибирской язвы (Bacillus anthracis) [21-24], синегнойный токсин (Pseudomonas aeruginosa) [58] или рицин (Ricinuscommunis) [58]. Еще в одном подходе используются так называемые индукторы апоптоза с целью активации апоптозных маршрутов и для того, чтобы вызвать смерть клеток. Используемые в этих исследованиях гены представляют собой, например, каспаз-1/интерлейкин-1-превращающий фермент (ICE) [59], каспаз 3/СРР 32 [60], каспаз-6 [61], каспаз-8 [62], Fas-ассоциированный протеин с доменом гибели (FADD) [63] и Bax [64]. Суицидальные гены должны быть введены в клетки таким образом, чтобы обеспечить их поглощение и экспрессию в возможно большем количестве клеток мишени и в то же время ограничить их экспрессию в клетках, не являющихся мишенями. В идеале, для суицидальной генной терапии рака требуется вектор, обладающий способностью различать клетки мишени и клетки, не являющиеся мишенями. При рассмотрении вирусных векторов (см. обзор [25]) требуется строго контролируемая система-1 012120 получения, когда кодируются токсичные гены с целью защиты соответствующих упаковочных клеток[26] от преждевременной гибели. Хотя уже известно несколько цитотоксичных суицидальных генов, еще существует потребность в дополнительных и альтернативных суицидальных генах, имеющих выгодные характеристики, особенно обладающих способностью убивать или истреблять клетки мишени, особенно раковые клетки пациента. Таким образом, цель настоящего изобретения заключается в разработке нового ряда цитотоксичных суицидальных генов и их соответствующих цитотоксичных протеинов или полипептидов, обладающих активностью ингибирования клеточного роста и/или вызывающих смерть клеток в эукариотических клетках, особенно в клетках животных или млекопитающих, в том числе человеческих клетках. Подробное описание изобретения Авторы изобретения показали, что протеины бактериофагного и профагного происхождения, образующие канал типа альфа-спирали, в частности холиновые протеины, которые обычно вызывают лизис прокариотических клеток путем образования пор в мембране цитоплазмы, вызывают значительную активность ингибирования клеточного роста или даже активность, приводящую к смерти клеток, когда они введены и/или экспрессированы в эукариотических клетках, в том числе в клетках животных или человека. В контексте настоящего изобретения термин "животное" или "клетки животного" используется для организма или клеток организма, принадлежащего к миру животных, согласно существующей системе классификации пяти миров (MargulisSchwartz, 1998. Five Kingdoms. An Illustrated Guide to the Phyla ofLife on Earth, W.H. Freeman, New York), которая включает в себя животный мир, растительный мир, простейшие одноклеточные организмы, грибы и бактерии (включая прокариотические бактерии и цианобактерии). Соответственно, термин "клетки животного" также включает в себя "человеческие" клетки. Однако по причинам интенсификации в некоторых случаях при использовании дополнительно упоминаются человеческие клетки. В контексте изобретения "клетки животного или человека" могут быть расположены внутри ткани или внутри организма животного или человека ("in-vivo") или могут быть выделены из их естественного окружения, например клеточных линий, первичных клеток ("in-vitro"). Термин "пролиферативное заболевание" или "пролиферативное нарушение", характеризующий болезненную пролиферацию клеток, используется в описании в широком смысле для того, чтобы включить любое нарушение, для которого требуется контроль клеточного цикла, например рак и лейкемию, но также сердечнососудистые нарушения, такие как рестеноз и кардиомиопатия, аутоиммунные нарушения, такие как гломерулонефрит и деформирующий артрит, дерматологические нарушения, такие как псориаз, противовоспалительные, противогрибковые, противопаразитарные нарушения, такие как малярия, эмфизема и облысение. При таких нарушениях протеин, произведенный бактериофагом, предпочтительно холин настоящего изобретения, может быть использован для того, чтобы индуцировать смерть клеток, или для поддержания стаза внутри популяции клеток мишени. Произведенные бактериофагом "холины" принадлежат к функциональному надсемейству, состоящему по меньшей мере из 16 отдельных семейств протеинов, которые проявляют общие структурные и функциональные характеристики. Более конкретно, кодированные бактериофагом холины являются представителями протеинов, образующих канал типа альфа-спирали, и они требуются для лизиса инфицированных бактериальных клеток и, в качестве следствия, для выделения частиц бактериофага. Однако представители этого семейства не проявляют статистически значимую аналогичность или гомологичность последовательности. В контексте настоящего изобретения термин "бактериофаг" включает в себя собственно бактериофаги, а также профаги, которые представляют собой бактериофаги, которые находятся в состоянии покоя или которые даже являются дефектными. Геном бактериофага является либо объединенным с геномом микроорганизма хозяина, либо подвергается автономной репликации. Холины кодируются генами профагов грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также бактериофагами, ассоциированными с этими организмами [28]. Оказалось, что первичная функция холинов заключается в транспорте муреиновых гидролаз через цитоплазматическую мембрану к стенке клетки, где эти ферменты гидролизуют связи в пептидогликановом полимере стенки клетки в качестве предварительной стадии лизиса клетки. Поэтому при хромосомном кодировании эти ферменты представляют собой аутолизины. Кроме того, холины могут облегчать утечку электролитов и питательных веществ из клеточной цитоплазмы и, тем самым, способствовать смерти клеток. В муреиновых гидролазах не хватает N-терминальных сигнальных последовательностей, и поэтому полагают, что они не могут транспортироваться по основному секреторному маршруту. Холины, несомненно, образуют олигомерные комплексы, которые порождают поры в цитоплазматической мембране. Считают, что эти поры обеспечивают пассивный транспортый маршрут для их субстратных протеинов. Довольно неожиданно авторы изобретения обнаружили, что такие холины, когда они экспрессированы в клетках человека или животного, вызывают гибель клеток или подавляют клеточный рост в этих клетках. Эти результаты были особенно неожиданными, поскольку обмен веществ в эукариотических клетках полностью отличается от метаболизма бактериальных систем. Кроме того, дополнительно по структуре и организации эукариотические клетки совершенно отличаются от бактериальных клеток, и,сверх того, эукариотические клетки не являются хозяевами для бактериофагов. Следовательно, нельзя-2 012120 было предсказать, могут ли холины экспрессироваться в клетках животного или клетках человека, какие маршруты они будут использовать, соответственно, в каких клеточных отделениях такие протеины могут быть локализованы, будут ли их функциональные свойства законсервированы или модифицированы,будет ли задействован или активирован клеточный метаболизм, и последний, но не менее важный вопрос, к каким эффектам могут привести введение и экспрессия таких холинов в эукариотические клетки. При поиске ответов на эти и дополнительные вопросы базового исследования авторам изобретения удалось разработать средства и способы применения произведенных бактериофагом холинов для лечения пролиферативных заболеваний и рака. В частности, авторы разработали средства и способы для генно-терапевтического подхода к лечению рака. В предпочтительном варианте осуществления изобретения произведенные бактериофагом протеины представляют собой протеины, образующие канал типа альфа-спирали. Эти протеины выбирают из(но не ограничиваются указанными) двухцепочечных ДНК бактериофагов, одноцепочечных ДНК бактериофагов или одноцепочечных РНК бактериофагов, более предпочтительно их выбирают из группы, состоящей из протеина лямбда S105 и лямбда S107 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 03705), протеинаPhi29 GP 14 (Swiss-Prot, инвентарный номер P11188), протеина фагового Т 4 иммунитета (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 08986), фагового Р 22 протеина 13 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 09962), фагового Р 2 ТМ протеина Y (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 51773), М протеина фага PRD1 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 27389), холинового протеина фага А 118 (Swiss-Prot, инвентарный номер Q37975), холинового протеина фага А 500 (Swiss-Prot, инвентарный номер Q37977), DPH холинового протеина фагаDp-1 (Swiss-Prot, инвентарный номер 003978), холинового протеина фага НР 1 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 51727), холинового протеина фага rlt (Swiss-Prot, инвентарный номер Q38134), лизисного протеина 17.5 фагов Т 7 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 03802) и T3 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 10307), NucE холинового протеина фага Р 2 Ogr (Swiss-Prot, инвентарный номер Q54418), холинового протеина, выделенного из Haemophilus somnus (Swiss-Prot, инвентарный номер Q48281), Р 10 протеина фага Phi-6 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 11127), протеина rV фага Т 4 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 06808), холина стафилококкового фага Phi-11 (Swiss-Prot, инвентарный номер Q38020) и холинаLactococcus фага Tuc2009 (Swiss-Prot, инвентарный номер Q38613). Наиболее предпочтительно эти протеины выбирают из группы, имеющей идентификационный номер последовательности SEQ ID7, SEQ ID8 и SEQ ID9. Кроме того, в это изобретение входят "аналоги" холиновых протеинов. Аналогами, которые в значительной степени соответствуют холинам, являются полипептиды, имеющие консервативные изменения или в которых одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности холина замещена другой аминокислотой, исключена и/или вставлена, при условии, что полученный протеин проявляет в значительной степени ту же самую или даже повышенную биологическую активность, что и холин, которому он соответствует."Консервативные" изменения означают те изменения, от которых нельзя ожидать изменений активности, заряда или конфигурации протеина и, таким образом, нельзя ожидать изменений его биологических свойств. Консервативные замещения включают "аналоги", в которых по меньшей мере один аминокислотный остаток в полипептиде консервативно замещен другой аминокислотой. Подходящие замещения могут быть определены с помощью обычных экспериментов для того, чтобы синтезированный полипептид обладал модифицированными структурными и функциональными характеристиками и, в то же время, сохранил биологическую активность холинового протеина. Предпочтительно можно создать одно или несколько замещений в соответствии со следующим перечнем: Ala (Gly, Ser); Arg (Lys); Asn (Gln,His); Asp (Glu); Cys (Ser); Gln (Asn); Glu (Asp); Gly (Ala, Pro); His (Asn, Gln); Ne (Leu, Val); Leu (Lie, Val);Val (Lie, Leu). На генетическом уровне эти аналоги обычно получают с помощью сайт-специфического мутагенеза нуклеотидов в ДНК, которая кодирует холиновый протеин, как описано, например, в книге Sambrook etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, CSH Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Бактериофаги с двухцепочечной ДНК (dsДНК), такие как фаг лямбда, используют сдвоенную систему для лизиса клеток хозяина, состоящую из: (i) стеночного фермента или эндолизина, обладающего ферментативной активностью относительно гликозидных, амидных или пептидных связей пептидогликана, и (ii) порообразующего холина, который дает возможность эндолизину, в котором отсутствуют какие-либо секреторно-сигнальные последовательности и который накапливается в цитоплазме, получить нормированный по времени доступ к пептидогликану, что, в конечном счете, приводит к смерти клетки[28, 29]. Функция холина не является специфичной для эндолизина, поскольку было продемонстрировано, что искусственные системы лизиса, состоящие из холина и эндолизина, произведенные из индивидуальных бактериофагов, являются вирулентно дееспособными [29]. Кроме того, это демонстрирует функциональная гомологичность различных холиновых протеинов, имеющих индивидуальные аминокислотные последовательности и, таким образом, не обнаруживающих никакой гомологичности на уровне ДНК или аминокислот. Хотя холины, кодированные dsДНК бактериофагами, являются дивергентными, обычно для них характерны общие признаки: (i) небольшие размеры (60-145 аминокислот), (ii) два, три или-3 012120 четыре домена, распространяющиеся между мембранами, (iii) гидрофильный N-конец и (iv) сильно полярный домен С-конца с большим зарядом. Известно, что гидрофильные isl- и С-концевые домены функционируют во время холинопосредованного каналообразования [30, 31]. Несмотря на эти общие признаки, dsДНК бактериофагов могут быть сгруппированы в два общих класса. Холины класса I, прототипом которых является S бактериофаг(лямбда) (S), в общем, имеют размер около 95 аминокислотных остатков или длиннее и дают убежище трем сильным доменам, распространяющимся на мембраны. Холины класса Il, такие как S21 фага 21, обычно имеют меньший размер, в диапазоне между 65 и 95 аминокислотных остатков, и содержат только два домена, распространяющихся между мембранами. Холины dsДНК бактериофагов образуют олигомерные комплексы [32, 33]. Для лизиса бактериальных клеток являются необходимыми только немногие холиновые молекулы. Было показано для S, что холин является летальным для клетки Е. coli при концентрации 1-3103 молекул на клетку [34]. Обычно лизогенная бактериальная культура подвергается растворению клеток через несколько минут от начала процесса. Вероятно, такое точное временное регулирование включает в себя энергетическое состояние мембраны, так как достаточно позднее добавление энергетического токсина, такого как цианид или динитрофенол, в инфекционном цикле может немедленно инициировать преждевременный лизис клеток,инфицированных бактериофагомили другими бактериофагами [29]. Для бактериофагаточное согласование во времени лизиса клеток хозяина контролируется молярным соотношением между фактическим холином и холиновым ингибитором (обычно около 2:1) [35]. Оба протеина кодируются одинаковой открытой рамкой считывания (ORF). Фактический холин (S105) происходит от трансляционного инициирования при кодоне номер 3. Холиновый ингибитор (S107) имеет только на два аминокислотных остатка больше и представляет собой продукт трансляционного инициирования при кодоне номер 1. Этот двойной пусковой мотив (то есть два внутрирамочных ATG пусковых кодона, отделенных одним или двумя кодонами, из которых по меньшей мере один является положительно заряженным [35]) обнаружен не только в S ORF, но также в ряде других холиновых генов. Наличие пары холин/холин-ингибитор было экспериментально продемонстрировано не только для S, но также и для других систем лизиса, кодируемых фагами [30, 36, 37], которые введены в описание как ссылки. На основе бактериального клеточного лизиса, в наиболее привлекательной модели [38] холины существуют в цитоплазматической мембране в двух конформационных состояниях: "до образования отверстия", в котором холин накапливается в мембране, и состоянии "отверстия", в котором фактически сформировалось отверстие. Когда в мембране возрастает количество холиновых протеинов, накапливаются димеры холина, которые представляют собой строительный материал для олигомеров высшего порядка, которые, в конечном счете, сливаются в небольшие холиновые островки. Эти холиновые цепочки представляют собой нестабильные области в мембране, и полагают, что в некоторый момент за счет термической флуктуации внутри холиновых цепочек открывается отверстие, приводящее к локальной деполяризации мембраны. Затем эта локальная деполяризация инициирует конформационное изменение окружающих холиновых протеинов из состояния до образования отверстия в состояние отверстия, что приводит к укрупнению отверстий и к полному исчезновению мембранного потенциала. В цепной реакции разрушение мембранного потенциала будет инициировать конформационные изменения все большего числа холиновых протеинов в активную конформацию, что, в конечном счете, приведет к формированию больших отверстий в цитоплазматической мембране. Было показано, что само отверстие имеет неправильную форму, но должно быть, по меньшей мере, достаточно большим, чтобы обеспечить проход эндолизина через мембрану. В работе Wang и др. было показано, что S отверстие в цитоплазматической мембране Е. coli является достаточно большим,чтобы обеспечить даже выделение протеина слияния эндолизина/LacZ размером 480 тыс.ед. Дальтона(кДа) [39]. В отличие от dsДНК бактериофагов, простые литические бактериофаги, такие как dsДНК бактериофаги (представленные как Х 174, 3, G4, S13) и ssPHK бактериофаги (представленные как MS2, GA,Q, SP), дают убежище только единственному лизисному гену, кодирующему небольшой интеграционный мембранный протеин. Было продемонстрировано, что продукты лизиса этих бактериофагов свободны от какой-либо муралитической ферментативной активности и для аминокислотных последовательностей известных холинов из этих бактериофагов вовсе не обнаружена такая функция. Экспрессия кодированного плазмидом Х 174 лизисного гена Е в одном Е. coli является достаточной для эффективного клеточного лизиса [40-42]. Однако в этом случае клеточный лизис зависит от активно растущих клеток [43,44]. Более того, было показано, что бактериальный ген хозяина slyD, кодирующий пептидил-пролиновую цис-транс-изомеразу (PPIase), является абсолютно необходимым для клеточного лизиса под действием протеина Е дикого типа [45]. Вероятно, SlyD вовлечен в корректное свертывание и стабилизацию протеина Е или его подачу в цитоплазматическую мембрану [46]. В настоящем изобретении описан токсичный эффект холиновых протеинов бактериофага, иллюстративно с использованием S105 протеина, кодированного фагом , при экспрессировании в клетках животного, в том числе в человеческих клетках, например клеточной линии карциномы человеческой шейки (HeLa), клеточной линии аденокарциномы молочной железы (MCF7), клеточной линии почки человеческого эмбриона (HEK 293) и аденокарциномы клеток молочной железы мыши (TS/A) [72]. Таким обра-4 012120 зом, в настоящем изобретении продемонстрирован цитотоксичный эффект протеина S105 путем описания морфологических изменений клеток после индуцирования экспрессии S105, цитотоксичное влияние на целостность мембраны (т.е. с помощью окрашивания трипановым синим, окрашивания аннексином VPE/7AAD) и цитотоксичное влияние на клеточный метаболизм (т.е. измерение концентраций NADPH или NADH, порожденных дегидрогеназами, или мембранного потенциала митохондрий). С помощью дифференциального фракционирования клеток, флуоресцентной иммуноцитохимии и трансмиссионной электронной микроскопии продемонстрировано, что протеин лямбда-105 накапливается предпочтительно в митохондриях и в эндоплазматической сети (ER), что приводит к разрушению ультраструктуры митохондрий и индуцированию смерти клеток. Показано, что экспрессия холиновых протеинов бактериофага индуцирует активность, ингибирующую клеточный рост и эффект уничтожения клеток животных, особенно человеческих клеток in-vitro, а также in-vivo, что обнаружено при исследовании на животных с использованием опухолевых клеток,произведенных из ксенотрансплантатов. Эта активность, ингибирующая клеточный рост и эффект уничтожения клеток животных, особенно применима для ограничения активности роста раковых клеток или для истребления раковых клеток у пациента и, таким образом, для лечения рака и других пролиферативных заболеваний. Для применения согласно настоящему изобретению необходимо, чтобы произведенные бактериофагом протеины, например холины, были экспрессированы в эукариотической, особенно в животной или человеческой клетке. С этой целью необходимо, чтобы последовательность нуклеиновой кислоты, например ДНК, кДНК, РНК протеинов, произведенных фагом, или их функциональных фрагментов, или продукта их экспрессии были пересажены в клетку. В качестве альтернативы необходимо, чтобы последовательность нуклеиновой кислоты, например РНК или мРНК, кодирующая холины, была непосредственно синтезирована внутри клетки. В другом подходе произведенный бактериофагом протеин или протеин слияния, состоящий из произведенного бактериофагом протеина или его биологически активной части и челночного протеина, может быть пересажен в клетку мишени."Последовательность нуклеиновой кислоты" согласно настоящему изобретению включает в себя любую последовательность нуклеиновой кислоты, например ДНК, кДНК, РНК, мРНК, которая кодирует протеины или полипептиды, произведенные бактериофагом, имеющие холиноподобную функцию, например холины или их биологически активные фрагменты. Кроме того, это определение охватывает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие аналогичный полипептид или протеин, но отличающиеся от природной последовательности за счет изменений, допущенных известной вырожденностью генетического кода. Это определение также включает те нуклеиновые кислоты, которые способны к гибридизации, в обязательных условиях гибридизации, в заявленные последовательности нуклеиновой кислоты, в том числе мРНК, кДНК, геномную ДНК и их функциональные фрагменты. Конкретно, в это определение также включена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая протеин слияния,состоящий из холина или его биологически активной части и челночного протеина (например, ВИЧ-1Tat, HBV-PreS2-TLM, Sox10, VP22). Согласно настоящему изобретению термин "производительная клетка" определяется как рекомбинантная клетка, которая модифицирована для того, чтобы экспрессировать произведенные бактериофагом протеины, например холины, их "аналоги", их функциональные фрагменты или "протеины слияния",кодированные "последовательностью нуклеиновой кислоты". Использованный в описании термин "обязательные условия гибридизации" относится к условиям гибридизации и промывания, при которых нуклеотидные последовательности обычно остаются гибридизованными относительно друг друга. Такие обязательные условия известны специалистам в этой области техники, и их описание можно найти, например, в книге Current Protocols in Molecular Biology, JohnWileySons, N.Y. (1989), 6.3.1. ff. Может быть проведено множество модификаций в ДНК и РНК, и поэтому термин "нуклеиновая кислота" также охватывает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы. Следует понимать, что "нуклеиновая кислота", которая гибридизована только с полиА+ последовательностями, наподобие любого 31 терминального полиА+ тракта кДНК, или с комплементарным удлинением Т (или U) остатков, не будет включена в определение "нуклеиновая кислота," поскольку такая нуклеиновая кислота может гибридизоваться с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей поли(А) удлинение или его комплемент. Для передачи последовательностей нуклеиновой кислоты в клетку могут быть использованы несколько известных векторных систем, вирусных векторов или, кроме того, открытая ДНК. Вообще, векторами согласно настоящему изобретению являются носители ДНК линеаризованной или кольцевой структуры, такие как плазмиды, космиды или искусственные хромосомы, которые дополнительно к желательной последовательности нуклеиновой кислоты содержат регулятивные последовательности, необязательно селективные маркерные гены и необязательно репликоны, обеспечивающие автономную репликацию вектора. Известно несколько способов, которые могут быть использованы для передачи последовательностей нуклеиновых кислот в клетки мишени для генерации кратковременно или стабильно зараженных клеток. Эти способы включают физические и химические способы, такие как электрофорез, микроинъек-5 012120 ция, бомбардировка микроснарядами, передача ДНК, опосредованная антителом или лигандом, декстраном, липосомно, виросомно, фосфатом кальция, заряженным полимером или заряженным липидом. Химические модификации, например дериватизация пептидов, протеинов и олигонуклеотидов с липофильными структурами, также могут быть использованы для того, чтобы усилить поглощение в клетках мишени. Например, последовательность известного мембранотропного пептида может сливаться с последовательностью упомянутой выше нуклеиновой кислоты или могут быть осуществлены химические модификации в холинах, известные специалистам в этой области техники, такие как добавление лауроильных производных, или окисление метиониновых остатков, чтобы образовались сульфоксидные группы,или замена пептидной связи на кетометиленовые изоэфиры для того, чтобы увеличить проницаемость мембраны. В качестве альтернативы молекулы, которые, как известно, присоединяются к поверхности клеточных рецепторов, могут быть спарены с такими полипептидами, протеинами или последовательностями нуклеиновой кислоты. Подходящие примеры представляют собой сахара, витамины, гормоны,цитокины, трансферрин, азиагликопротеин, как описано в патенте США 5108921, введенном в описание как ссылка. Согласно предпочтительному варианту осуществления в настоящем изобретении разработаны и применяются вирусные векторные системы для трансдукции кодирующей информации от произведенных фагом холинов или их биологически активных фрагментов в эукариотическую клетку. Обычно согласно настоящему изобретению может быть использована любая вирусная векторная система, которая обеспечивает передачу и последующую экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты. Особенно полезными являются векторы экспрессии вируса оспы, векторы аденовирусной экспрессии, системы экспрессии вируса герпеса, векторы аденоассоциированного вируса, векторы альфавируса, векторыSV40, векторы вируса везикулярного стоматита, векторы вируса кори, векторы вируса sindbis, векторы вируса бешенства, а также лентивирусные и ретровирусные векторные системы. В более предпочтительном варианте осуществления используются ретровирусные векторные системы. Такие ретровирусные векторные системы основаны или на репликационно компетентных (например, как описано в документе WO 018240), или на репликационно недостаточных ретровирусных векторных системах. Хотя репликационно компетентная ретровирусная векторная система обладает преимуществом высокой степени трансдукции, для нее также существует риск неспецифической трансдукции. Следовательно, необходимо контролировать специфичность генной экспрессии с помощью специальных регулятивных элементов, таких как клеточно-специфичные промоторы. В сравнении с этим репликационно недостаточные ретровирусные векторные системы, наподобие вектора промотора превращения (ProCon), как описано в ЕР 0779929, или воспроизводящего вирусного(ReCon) вектора, как описано в WO 99/35280 (оба документа введены в описание как ссылки), демонстрируют высокую клеточную специфичность, но обладают меньшей эффективностью трансдукции клеток. Поскольку различные ретровирусные векторные системы детально описаны в уровне техники, специалист в этой области техники может легко выбрать подходящую векторную систему. Обычно ретровирусные векторные системы состоят из двух компонентов, посредством чего первый компонент, собственно ретровирусный вектор, представляет собой модифицированный ретровирус (векторная плазмида), в котором гены, кодирующие вирусные протеины, замещаются рассматриваемой последовательностью нуклеиновой кислоты, необязательно включающей маркерные гены, которые будут передаваться эукариотической клетке. Поскольку замещение генов, кодирующих вирусные протеины,эффективно повреждает вирус, его необходимо восстановить с помощью второго компонента системы,который кодирует отсутствующие вирусные протеины. Этот второй компонент представляет собой клеточную линию, которая продуцирует большие количества вирусных структурных и ферментативных протеинов, однако, он не обладает способностью продуцировать репликационно компетентный вирус. Эта клеточная линия известна как упаковочная клеточная линия и состоит из клеточных линий, кратковременно или стабильно зараженных одной или несколькими плазмидами, несущими гены, обеспечивающие упаковку модифицированного ретровирусного вектора. Эти плазмиды направляют синтез необходимых вирусных протеинов, которые требуются для продуцирования вириона. Для генерации вирусных частиц или упакованных векторов первый компонент, или векторная плазмида, переносится в упаковочную клеточную линию. В этих условиях модифицированный ретровирусный геном, включающий вставки терапевтических и необязательных маркерных генов, транскрибируется из векторной плазмиды и упаковывается в модифицированные ретровирусные частицы (рекомбинантные вирусные частицы). Клетка, инфицированная такой рекомбинантной вирусной частицей, не может продуцировать новый векторный вирус, так как в этих клетках отсутствуют вирусные протеины. Однако присутствует вектор, несущий терапевтические и маркерные гены, и теперь они не могут быть экспрессированы в инфицированной клетке. В другом предпочтительном варианте может быть использован воспроизводящий ретровирусный вектор, как описано в документе WO 99/35280, который введен в описание как ссылка. В этой векторной системе в ходе вирусного жизненного цикла используется генетическая перестановка, допускающая воспроизведение кассет функциональной экспрессии из выделенных элементов исключительно в преобразованных клетках мишени [52]. С этой целью гетерологичный регулятивный элемент или промотор встав-6 012120 ляют в инверсной ориентации в однозначную 5' область (U5) длинного терминального повтора (5' LTR) ретровирусного вектора. Терапевтически токсичный ген вставляют в реверсивной ориентации в однозначную 3' область (U3) 3' длинного терминального повтора (3' LTR). После реверсивной транскрипции обе однозначные области дублируются, воспроизводя две функциональные и активные кассеты экспрессии внутри каждого из ретровирусных повторов LTR. Применение тканеспецифических промоторов может обеспечивать экспрессию преобразованного гена только или преимущественно в соответствующих клетках мишени или клетках специфических тканей. Все промоторы дополнительно могут быть или конститутивно, или условно активными и иметь вирусное или невирусное происхождение. Используемый в описании термин "регулятивный элемент" означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая служит в качестве промотора, т.е. регулирует экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, реально связанной с промотором. Такие "регулятивные элементы" или "промоторы" могут регулировать экспрессию связанных последовательностей нуклеиновой кислоты или конститутивно, или индуцибельно. Примерами индуцибельных промоторов являются тетрациклинзависимые регулятивные системы (см. обзор [66]), регулятивные системы теплового удара, гормонов (например, экдизон,доксицилин, рифампицин) или ионы металлов. Многие системы проявляют значительный уровень основной экспрессии. Эта "текучесть" затрудняет применение промоторов для экспрессии цитотоксичных генов. "Текучие промоторы" согласно настоящему изобретению представляют собой индуцибельно регулятивные элементы, которые проявляют основную экспрессию связанной нуклеиновой кислоты, без индуцирования. Термин "тканеспецифический промотор" (TSP) означает регулятивный элемент, который является, главным образом, активным или только в специальных клетках, или в специфических клетках ткани (например, промотор пробазина, промотор человеческой телломеразы реверсивной транскриптазы, промотор человеческого поверхностно-активного протеина А 1, промотор Ksp-кадхерина(Cadherin 16), промотор вирусной опухоли молочной железы мыши (MMTV-LTR), промотор сывороточного кислотного протеина (WAP. В другом предпочтительном варианте может быть использован вектор промотора превращения(ProCon), как описано в документе ЕР 0779929, введенном в описание как ссылка. В соответствии с принципом ProCon создается ретровирусный вектор, в котором изменяется 3' U3 область, но сохраняется нормальная 5' U3 структура; причем вектор может нормально транскрибироваться в РНК, используя нормальный ретровирусный промотор, расположенный внутри 5' U3 области. Однако произведенный РНК будет содержать только измененную 3' U3 структуру. В инфицированной клетке мишени после реверсивной транскрипции эта измененная U3 структура будет расположена на обоих концах ретровирусной структуры. Если измененная область несет, например, полилинкер вместо U3 области, тогда легко можно вставить любой промотор, включая те, что направляют тканеспецифическую экспрессию. Затем этот промотор будет использоваться исключительно в клетке мишени для экспрессии связанных генов, перенесенных ретровирусным вектором. По желанию, промотор может быть единственным промотором в векторе. Дополнительные сегменты ДНК, гомологичные одной или нескольким клеточным последовательностям,могут быть вставлены в полилинкер с целью позиционирования гена. В упаковочной клеточной линии экспрессия ретровирусного вектора регулируется нормальным ретровирусным промотором с неселективной активностью. Однако, как только вектор входит в клетку мишени, возникает промотор превращения и терапевтические гены экспрессируются из выбранного тканеспецифического промотора, введенного в полилинкер. В сущности, не только любой тканеспецифический промотор может быть введен в систему, обеспечивая селективное позиционирование большого множества клеток различных типов, но дополнительно, после события превращения, структура и свойства ретровирусного вектора уже не имеют сходства со структурой и свойствами вируса. Разумеется, это имеет исключительно важные последствия с точки зрения безопасности, так как обычные или ретровирусные векторы уровня техники легко подвергаются генетической рекомбинации упаковочным вектором для того, чтобы продуцировать потенциально болезнетворные вирусы. Векторы промотора превращения(ProCon) не имеют сходства с ретровирусами, потому что после превращения они уже не несут ретровирусные промоторы U3, таким образом, снижается вероятность генетической рекомбинации. Кроме того,векторы ProCon, в отличие от обычных векторов уровня техники, менее вероятно подвергаются активации клеточными генами поблизости от центров интеграции. В контексте настоящего изобретения, чтобы сделать возможной оценку потенциально токсичного эффекта экспрессированного гена, используется строго контролируемая система генной экспрессии. Строгий контроль экспрессии токсичного гена является особенно важным при использовании систем вирусных векторов, в которых необходимо, чтобы вирусный вектор был упакован с помощью упаковочной клетки, и, разумеется, экспрессия токсичного гена в упаковочной клетке могла бы уничтожить указанную клетку. Только после того, как вирусный вектор упакован внутри вирусной частицы, и только после того, как вирусная частица инфицировала клетку хозяина, предпочтительно эукариотическую клетку, более предпочтительно клетку животного, конкретно клетку млекопитающего или человека, токсичный ген должен быть экспрессирован в клетке хозяина. Это может быть выполнено, например, путем использования строго контролируемых индуцибель-7 012120 ных промоторов, реально связанных с цитотоксичным геном. В строго контролируемой системе экспрессия гена может быть индуцирована путем добавления индуктора. В отсутствие индуктора система не будет проявляться и экспрессия гена не происходит. Следовательно, путем добавления индуктора только после того, как вирусная частица инфицировала клетку хозяина, можно быть уверенным, что экспрессия токсичного гена происходит только в клетке хозяина. Примерами индуцибельных промоторов являются lac репрессор/оператор, FK506/рапамицин, индуцибельный экдизон, RU486/мифепристон и тетрациклин (Тс)индуцибельные системы [68, 69] или промотор вирусной опухоли молочной железы мыши (MMTV-LTR). В последующем варианте осуществления настоящего изобретения устанавливается ценность XS105, -S107 и Ф 29-GP14 в качестве токсичных протеинов для генной терапии рака с использованием:(i) системы экспрессии гормон-индуцибельного гена на основе ретровирусных векторов, используя промотор вирусной опухоли молочной железы мыши (MMTV), который может быть активирован глюкокортикоидами [65], и (ii) тетрациклин/доксициклин индуцибельной системой генной экспрессии на основе двух различных плазмидных векторов [67, 68]. С использованием этих индуцибельных систем генной экспрессии для индуцирования существенный эффект экспрессии S105 может быть продемонстрирован на примере морфологии, на цельности мембраны (т.е. с помощью окрашивания трипановым синим, окрашивания аннексином V-PE/7AAD) и на клеточном метаболизме (т.е. измерении концентраций NADPH или NADH, порожденных дегидрогеназами, или измерении мембранных потенциалов) или клеток HeLa,клеток MCF-7 или клеток HEK 293 (см. примеры). В дальнейшем, с помощью флуоресцентной иммуноцитохимии и дифференциального фракционирования клеток было показано, что при экспрессировании внутри клетки X-S105, -S107 и Ф 29-GP14 накапливаются преимущественно в митохондриях, а также в эндоплазматической сети клеток, что приводит к быстрой деструкции мембранного потенциала митохондрий. С использованием моделей животных ксенотрансплантатов было продемонстрировано, что экспрессия произведенных бактериофагом протеинов приводит к существенному снижению скоростей роста опухолей по сравнению с необработанной контрольной группой, в которой отсутствует экспрессия терапевтического холина, произведенного бактериофагом. Таким образом, неожиданно было показано,что экспрессия произведенных бактериофагом холинов в человеческих клетках приводит к ослаблению клеточного роста, а также к специфическому уничтожению эукариотических клеток, особенно клеток животного или более конкретно клеток млекопитающего, в том числе человеческих клеток in vitro, а также in vivo. В соответствии с другим вариантом осуществления также могут быть использованы традиционные регулятивные элементы. Основная транскрипция от текучих регулятивных элементов может быть подавлена за счет экспрессии внутри упаковочной системы последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, частично комплементарной транскрипту цитотоксичного гена (антисмысловая РНК), но еще способной эффективно связываться с транскриптом цитотоксичного гена и, следовательно, подавлять трансляцию цитотоксичного гена таким образом, что продолжается, по меньшей мере, жизнеспособность упаковочной системы и продуцируется достаточное количество вирусных векторных частиц. В соответствии с дальнейшим вариантом осуществления изобретение предоставляет способ для введения и экспрессии протеина, произведенного бактериофагом, или протеина слияния, который индуцирует активность, ингибирующую рост клеток, или эффект, уничтожающий клетки или, по меньшей мере, функциональную часть протеина в эукариотических клетках. С этой целью в эукариотическую клетку вводится последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая произведенный бактериофагом протеин или протеин слияния, функциональную часть протеина или его аналоги и реально связанный регулятивный элемент, где в последующем она будет экспрессирована в условиях контроля соответственно связанным регулятивным элементом. Для поглощения эукариотической клеткой указанная последовательность нуклеиновой кислоты может быть представлена в виде открытой ДНК, причем эта клетка в определенной степени будет поглощать последовательность нуклеиновой кислоты и экспрессировать кодированный протеин. С целью увеличения эффективности плазмиды или другие векторы ДНК могут быть заражены в клетках с использованием хорошо известных систем трансфекции, например таких как фосфат кальция. Вирусные векторы, которые могут представлять собой или рекомбинантные вирусы,или вирусные частицы, будут использоваться для заражения эукариотической клетки, и, таким образом,будет осуществлена передача последовательности нуклеиновой кислоты в указанные клетки. В соответствии с настоящим изобретением "протеин слияния" состоит из первого и, по меньшей мере, второго полипептида, которые все эффективно связаны между собой, и в то же время каждый полипептид сохраняет свои специальные функции. В вариантах осуществления, в которых протеин слияния предназначается для проникновения в клетку мишени из внеклеточной среды, например, выделенной из композиций или капсул, произведенный бактериофагом протеин может быть связан с доменом трансдукции протеина (PTD) или, другими словами, с челночным протеином, который легко поглощаетсяклеткой. Примерами таких доменов трансдукции являются домен VP22 вируса простого герпеса, PTD домен протеина Antennapedia, домен трансдукции протеина PDX-1 или домен трансдукции протеина вируса иммунодефицита человека-8 012120 В предпочтительном варианте осуществления 11-аминокислотные остатки, которые составляют домен трансдукции ВИЧ Tat протеина, связаны с NH2-концом или из произведенного бактериофагом протеина, или из холина, или предпочтительно из протеина фага лямбда S105, протеина фага лямбдаS107 или протеина фага Phi29 GP14. В вариантах осуществления, в которых протеины слияния выделяются из производительной клетки во внеклеточную среду, полинуклеотидная последовательность, которая кодирует или произведенный бактериофагом протеин, или протеин слияния, состоящий из домена трансдукции протеина и произведенного бактериофагом холина, связана с полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует расщепляемую сигнальную пептидную последовательность. Сигнальная последовательность протеина слияния направляет транслокацию протеина слияния через клеточную мембрану. Некоторые природные сигнальные пептиды различных протеинов не являются гомологичными в последовательности, но обычно они включает в себя несколько, предпочтительно от 4 до 12, гидрофобных остатков, которые являются существенными для скрещивания эндоплазматической сети, и, таким образом, допускается транспорт протеина в комплекс Гольджи или тела внеклеточного выделения. Обычно основной остаток дополнительно располагается за несколько остатков до гидрофобной последовательности сигнального пептида. В предпочтительном варианте осуществления изобретения сигнальный пептид эффективно связан сN-концом произведенного бактериофагом протеина, более предпочтительно с протеином слияния, состоящим из домена трансдукции протеина и произведенного бактериофагом холина, и, кроме того, предпочтительно домен трансдукции протеина состоит из 11-аминокислотных остатков ВИЧ Tat, причем холин выбирают или из фага лямбда S105, фага лямбда S107, или из Phi29 GP14. Расщепляемые сигнальные пептиды, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, могут быть выбраны, например, из препроальбумина, легкой цепи преиммуно-гамма-глобулина (IgG), прелизозима,препролактина, препенициллиназы, гликопротеина превезикулярного вируса стоматита или прелипопротеина. Кроме того, предпочтительно используется сигнальный пептид остеонектина/SPARC/ВМ 40."Протеин слияния" в соответствии с настоящим изобретением может продуцироваться с помощью способов, уже известных из уровня техники. Эти способы включают, например, технические приемы invitro рекомбинантной ДНК, химические методики и in vivo рекомбинацию/генетическую рекомбинацию. Кроме того, синтез ДНК и РНК может быть осуществлен с использованием автоматизированного синтезатора (который описан, например, в работе Sambrook et al., 1989). Получение такого протеина слияния обычно влечет за собой приготовление первой и второй ДНК кодирующей области и функциональное лигирование или соединение таких областей в рамке, чтобы приготовить одинарную кодирующую область, которая кодирует желательный протеин слияния. В контексте настоящего изобретения последовательность ДНК, кодирующая произведенный бактериофагом протеин, предпочтительно холин, еще более предпочтительно протеин лямбда S105, объединяется в рамке с последовательностью ДНК, кодирующей челночный протеин (например, ВИЧ-1-Tat, HBV-PreS2TLM, Sox10 или VP22). Обычно считают, что не является весьма существенным, какая часть терапевтического агента-позиционирующего агента приготовлена в качестве N-концевой области или в качестве С-концевой области. В зависимости от использованного челночного протеина, в качестве части протеина слияния, возможно, будет необходимо предоставить пептидный спейсер для соединения двух частей протеина слияния. Эти пептидные спейсеры могут быть или расщепляемыми, или нерасщепляемыми. Такие рекомбинантно продуцированные протеины слияния могут быть очищены и составлены в рецептуре для приема человеком. В качестве альтернативы нуклеиновые кислоты, кодирующие протеины слияния, могут быть доставлены с помощью генной терапии. Хотя может быть использована открытая рекомбинантная ДНК или плазмиды, применение липосом или векторов является предпочтительным. В качестве альтернативы могут быть использованы сшивающие реагенты с целью образования молекулярных мостиков, которые химически связывают вместе функциональные группы двух различных молекул. Для поэтапного связывания двух различных протеинов предпочтительными являются гетеробифункциональные сшивающие реагенты, которые исключают нежелательное образование гомополимера. Гетеробифункциональные сшивающие реагенты содержат две реакционноспособные группы: одна обычно взаимодействует с первичной аминогруппой (например, N-гидроксисукцинимид (NHS, и другая группа обычно взаимодействует с тиоловой группой (например, пиридилдисульфид, малеинимид,галогены и др.). Благодаря реакционноспособной первичной аминогруппе сшивающий реагент может взаимодействовать с остатком (остатками) лизина одного протеина, а за счет тиоловой реакционноспособной группы сшивающий реагент, уже связанный с первым протеином, взаимодействует с цистеиновым остатком (свободная сульфгидрильная группа) другого протеина. Поэтому полипептиды или протеины обычно имеют (или их дериватизируют, чтобы они имели) функциональную группу, доступную с целью сшивания. Это требование не рассматривается как ограничение, в связи с тем, что в этом методе может быть использован широкий набор групп. Например, для связывания или сшивания могут быть использованы первичные или вторичные аминогруппы, гидразидные или гидразиновые группы, карбоксиспирты, фосфатные или алкилирующие группы. Спейсерный участок между двумя реакционноспособными группами сшивающих реагентов может иметь различные длину и химический состав. Более длинный спейсерный участок обеспечивает боль-9 012120 шую гибкость спаренных компонентов, хотя некоторые конкретные компоненты в мостике (например,бензольная группа) могут придавать повышенную стабильность реакционноспособной группе или повышенную резистентность химической связи к действию различных агентов, например дисульфидная связь обладает стойкостью к восстанавливающим агентам. Кроме того, рассматривается применение пептидных спейсеров, таких как L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala. Является предпочтительным, чтобы использовался сшивающий реагент, обладающий приемлемой стабильностью в крови или в других жидкостях тела. Известны многочисленные типы линкеров, содержащих дисульфидную связь, которые могут быть успешно использованы. Примеры гетеробифункциональных сшивающих реагентов представляют собой SMPT, SPDP, LC-SPDP, сульфо-LC-SPDP, SMCC,сульфо-SMCC, MBS, сульфо-MBS, SIAB, сульфо-SIAB, SMPB, сульфо-SMPB, EDC/сульфо-NHS или АВН. Продемонстрировано, что линкеры, которые содержат стерически затрудненную дисульфидную связь, могут дать повышенную стабильность in vivo, предотвращая выделение агента до связывания на месте действия. Таким образом, эти линкеры являются одной предпочтительной группой связывающих агентов. Одним из дополнительно предпочтительных используемых сшивающих реагентов является SMPT,который представляет собой бифункциональный сшивающий реагент, содержащий дисульфидную связь,которая "стерически затруднена" соседним бензольным кольцом и метильными группами. Полагают, что стерическое затруднение дисульфидной связи выполняет функцию защиты связи от атаки тиолатными анионами, такими как глутатион, который может присутствовать в тканях и крови, и, таким образом,способствует предотвращению развязывания конъюгата до подачи прикрепленного агента в место мишени, например в опухоль. Сшивающий реагент SMPT, как и многие другие известные сшивающие реагенты, обладает способностью сшивать функциональные группы, такие как -SH в цистеине или первичные амины (например,эпсилон-аминогруппа в лизине). Другие возможные типы сшивающих реагентов включают гетеробифункциональные фотореактивные фенилазиды, содержащие расщепляемую дисульфидную связь, такие как сульфосукцинимидил-2-(п-азидосалициламидо)этил-1,31-дитиопропионат. Группа N-гидроксисукцинимидила взаимодействует с первичными аминогруппами, и фенилазид (при фотолизе) неселективно взаимодействует с любым аминокислотным остатком. Кроме затрудненных сшивающих реагентов, согласно изобретению также могут быть использованы незатрудненные линкеры. Другие применяемые сшивающие реагенты, которые не рассматриваются как содержащие или порождающие защищенный дисульфид, включают в себя SATA, SPDP и 2-иминотиолан. Применение таких сшивающих реагентов хорошо известно из уровня техники. После спаривания конъюгат отделяют от неспаренных компонентов и от других примесей. Существует большое число технических приемов очистки, которые применяются для получения конъюгатов достаточной степени чистоты для того, чтобы передавать их для клинического применения. Обычно наиболее часто применяются способы очистки, основанные на разделении по размеру, такие как гельфильтрационная, гель-проникающая хроматография или жидкостная хроматография высокого разрешения (ЖХВР). Кроме того, могут быть использованы другие технические приемы хроматографии, такие как разделение с помощью Blue-Sepharose. В соответствии с изобретением "фармацевтическая композиция" может включать в себя, кроме терапевтически эффективного количества вектора экспрессии, последовательность нуклеиновой кислоты,вирусные частицы, эукариотические упаковочные клетки, производительные клетки, протеины, произведенные бактериофагом, например холин и/или протеин слияния, обычно один или несколько фармацевтически приемлемых и/или физиологически приемлемых носителей, добавок, антибиотиков, предохранители, вспомогательные вещества, разбавители и/или стабилизаторы. Выражение "фармацевтически или физиологически приемлемый" относится к молекулярным объектам и композициям, которые при приеме внутрь не дают вредной, аллергической или другой неблагоприятной реакции у животного или человека, по обстановке. Используемый в описании термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает в себя любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и поглощающие задерживающие агенты и т.п. Кроме того, такими вспомогательными веществами могут быть вода, солевой раствор, глицерин, этанол, смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-буферные соединения или т.п. Подходящие носители обычно представляет собой крупные,медленно усваиваемые молекулы, такие как протеины, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты или т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных соединений хорошо известно из уровня техники. Для внутреннего приема человеком препараты должны соответствовать необходимым стандартам стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты Управления по контролю за продуктами и лекарствами (FDA), Бюро биологических стандартов (США) или в соответствии с правиламиEudraLex, контролирующими лекарственные продукты в Евросоюзе. В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество вектора экспрессии,последовательность нуклеиновой кислоты, вирусные частицы, эукариотический производитель, или упа- 10012120 ковочные клетки, и/или произведенный бактериофагом протеин, или протеин слияния могут быть герметично упакованы (инкапсулированы) в проницаемые или полупроницаемые мембраны. Термин "инкапсулированный" означает, что биоматериалы содержатся в биологически совместимом устройстве или "капсуле", которые иммунологически изолируют эти материалы от окружающей среды и обеспечивают возможность выделения из капсулы вектора экспрессии, последовательности нуклеиновой кислоты, вирусных частиц и/или произведенного бактериофагом протеина, например холина. Поэтому биосовместимый материал, используемый для инкапсулирования, должен иметь следующие ниже основные характеристики: (i) существенно не активирует комплементную систему; (ii) обеспечивает возможность прохода небольших молекул, таких как кислород, питательные вещества и отработанные продукты, внутрь капсулы и/или из нее; (iii) делает возможным выделение продукта (вектора экспрессии,последовательности нуклеиновой кислоты, вирусных частиц и/или произведенного бактериофагом протеина, например холина) из капсулы и (iv) существенно предотвращает вход компонентов иммунной системы хозяина внутрь капсулы. Для инкапсулирования могут быть использованы различные биосовместимые искусственные полимеры (или сополимеры), например произведенные из целлюлозы, декстрана, полиамида, полиуретана,акрилонитрила, найлона, альгинат-поли-L-лизина, гидроксиэтилметакрилата (НЕМА), AN69 (полиакрилонитрил (ПАН)-металлилсульфоната), гидроксиэтилметакрилат-метилметакрилата (НЕМА-ММА), полиамидов, полиэфирсульфонов (PES), сульфатхитозана, ПАН/ПВХ или альгинатполистиролагарозы. Предпочтительно полупроницаемые мембраны образуются с помощью электролитных комплексов, наиболее предпочтительно сульфата целлюлозы и хлористого полидиметилдиаллиламмония. Биосовместимое устройство может иметь различные формы, например полых волокон, листов или подушек. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения капсула представляет собой сферу и может иметь переменный диаметр между 0,01 и 5 мм, предпочтительно между 0,1 и 2 мм. В качестве примера могут быть использованы микрокапсулы, которые описаны в документах ЕР 0835137 или ЕР 0892852, введенных в описание как ссылки. Для инкапсулирования смешивают вектор экспрессии, последовательность нуклеиновой кислоты,вирусные частицы, производительные клетки, упаковочные клетки и/или произведенный бактериофагом протеин, например холин, с полианионным компонентом (например, сульфат целлюлозы) в подходящей среде. Затем эту смесь добавляют по каплям в полимеризационную ванну, содержащую поликатионный компонент (например, хлористый полидиаллилдиметиламмоний, хлористый поливинилбензилтриметиламмоний), получая капсулы, обладающие стабильной мембраной, образовавшейся за счет электролитного комплекса и окружающей жидкое ядро не заполимеризовавшегося полианиона. Для приготовления таких микрокапсул известны несколько способов получения (например, способ с воздушным жиклером, вибрационный способ, способ режущей струи). После образования капсул биоматериал улавливается внутри ядра капсулы. Для приготовления фармацевтической композиции необходимо отделить капсулы от полимеризационной среды, используя дополнительные стадии промывки и/или фильтрации. Предпочтительно композиция, содержащая капсулы, составлена в рецептуры для парентерального приема, например, путем инъекции внутривенным, внутриартериальным, внутримышечным или любым другим способом, в том числе прямым капельным введением в опухоль или место заболевания (внутриполостное введение) животного или человека, нуждающегося в лечении. Фармацевтические формы, подходящие для применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии; рецептуры, включающие кунжутное масло, арахисовое масло или водный пропиленгликоль; и стерильные порошки для немедленного приготовления препарата стерильных растворов или дисперсий для инъекции. Среды, удовлетворяющие требованиям использования для человека in vivo, представляют собой, например, растворы NaCl или лактатные растворы Ringer. Во всех случаях, эти формы должны быть стерильными и текучими в степени, обеспечивающей введение шприцем. Формы должны быть стабильными в условиях производства и хранения и должны быть предохранены от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Капсулы могут быть составлены в рецептуру в подходящих контейнерах, таких как стеклянные ампулы или шприцы. Кроме того, рецептуры, содержащие инкапсулированные клетки, могут содержать криозащитное вещество (например, ДМСО, глицерин) и/или дополнительные добавки. Концентрация криозащитных веществ может быть снижена за счет или разбавления, или дополнительных стадий промывки до использования для пациента. Более того, в соответствии с дополнительными вариантами осуществления настоящего изобретения произведенный бактериофагом протеин, холин или протеин слияния могут быть объединены в наборе с другими фармацевтически приемлемыми рецептурами. Эти другие рецептуры могут быть предназначены или для диагностики/визуализации, или для комбинированной терапии. Например, такие наборы могут содержать любой один или несколько из ряда хемотерапевтических или радиотерапевтических лекарственных препаратов; антиангиогенных агентов; антител противоопухолевых клеток и/или противоопухолевой сосудистой сети или цитотоксинов. Наиболее вероятно, протеины, произведенные бактериофагом, или протеины слияния настоящего изобретения будут составлены в рецептуре для парентерального приема внутрь, например составлены в- 11012120 рецептуре для инъекции внутривенным, внутримышечным, подкожным, трансдермальным или любым другим способом, в том числе перистальтическим введением или прямым капельным введением в опухоль или место заболевания (внутриполостное введение). Фармацевтические формы, подходящие для применения в инъекции, включают стерильные водные растворы или дисперсии; рецептуры, включающие кунжутное масло, арахисовое масло или водный пропиленгликоль; и стерильные порошки для немедленного приготовления препарата стерильных растворов или дисперсий для инъекции. Во всех случаях, эти формы должны быть стерильными и текучими в степени, обеспечивающей введение шприцем. Формы должны быть стабильными в условиях производства и хранения и должны предохраняться от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Фармацевтические композиции могут быть составлены в рецептуре стерильного водного состава в нейтральной или солевой форме. Растворы терапевтических агент-позиционирующих реагентов в виде свободного основания или физиологически приемлемых солей могут быть приготовлены в воде, соответственно смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Фармацевтически приемлемые соли включают кислые аддитивные соли (образовавшиеся с участием свободных аминогрупп протеина) и соли, которые образовались с неорганическими кислотами, например такими как хлористо-водородная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, трифторуксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образовавшиеся с участием свободных карбоксильных групп, также могут быть произведены из неорганических оснований, например таких как гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. Подходящие носители включают в себя растворители и дисперсионные среды, содержащие, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, и жидкий полиэтиленгликоль, и т.п.),соответствующие их смеси и растительные масла. Во многих случаях может быть предпочтительным введение изотонических агентов, например сахаров или хлористого натрия. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, за счет применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания заданного размера частиц в случае дисперсии и/или путем применения поверхностно-активных веществ. В дополнительных вариантах осуществления протеин, произведенный бактериофагом, например холин или протеин слияния, может быть заключен в липосомы, и/или наночастицы, и/или другие материалы оболочки. Образование и применение липосом, в принципе, известно специалистам в этой области техники. Обычно липосомы формируются из фосфолипидов, которые диспергированы в водной среде и самопроизвольно образуют многоламеллярные концентрические двухслойные везикулы (также называются мультиламеллярными везикулами (MLV. Обычно MLV имеют диаметр от 25 нм до 4 мкм. Обработка MLV звуком приводит к образованию малых моноламеллярных везикул (SUV) с диаметром в диапазоне от 200 до 500 , содержащих водный раствор в ядре. Липосомы взаимодействуют с клетками по различным механизмам, например эндоцитоз посредством фагоцитоза или слияние с плазменной мембраной клетки путем включения липидного двойного слоя липосомы внутрь плазменной мембраны с одновременным выделением содержимого липосом в цитоплазму клетки мишени. Нанокапсулы или другие материалы оболочки в соответствии с этим аспектом изобретения обычно могут захватывать соединения стабильным и воспроизводимым способом. Во избежание побочных эффектов, вызванных перегрузкой внутриклеточным полимером, такие капсулы должны быть выполнены с использованием полимеров, которые предпочтительно могут разлагаться in vivo, например с использованием биоразлагаемых полиалкилцианоакрилатов. Терапевтически эффективное количество протеина, произведенного бактериофагом, или протеина слияния в дозе может находиться в диапазоне приблизительно от 5 до 100 мг, приблизительно 10-80 мг,приблизительно 20-70 мг, предпочтительно около 25-60 мг или более предпочтительно около 30-50 мг. Следует понимать, что меньшие дозы могут быть более подходящими в сочетании с другими агентами и что повышенные дозы, больше чем 100 мг, еще могут быть допустимыми. Согласно другим аспектам настоящего изобретения разработаны способы получения композиции,содержащей и сохраняющей инфекционные вирусные частицы или рекомбинантные вирусы. Вкратце,инфекционные вирусные частицы или рекомбинантные вирусы, которые были очищены или концентрированы, могут быть сохранены за счет первоначального добавления достаточного количества буфера рецептуры в среду, содержащую рекомбинантный вирус, для того, чтобы образовалась водная суспензия. Этот буфер рецептуры представляет собой водный раствор, который содержит полисахарид, высокомолекулярную структурную добавку и буферный компонент в воде. Следует понимать, что использованные в контексте настоящего изобретения термины "буферное соединение" или "буферный компонент" относятся к соединению, функцией которого является поддержание заданного значения рН водной суспензии. Кроме того, водный раствор может содержать одну или несколько аминокислот и/или необязательно клеточный фактор роста. Инфекционные вирусные частицы или рекомбинантные вирусы также могут быть сохранены в очищенном виде. Более конкретно, до добавления рецептурного буфера исходное сырье может быть очищено путем пропускания через фильтр с последующим концентрированием, например, в системе концентрирования с поперечным потоком (фирма Filtron Technology Corp., Nortborough,- 12012120MA). В одном варианте осуществления в концентрат добавляют ДНК для того, чтобы гидролизовать экзогенную ДНК. Затем гидролизат подвергают диафильтрации для того, чтобы удалить избыточные компоненты среды и создать более желательный буферный раствор для инфекционных вирусных частиц или рекомбинантного вируса. Затем продукт диафильтрации пропускают через колонку с гелем Sephadex S500 и элюируют очищенные частицы или вирус. Добавляют достаточное количество рецептурного буфера к полученному элюату, чтобы получить желательную конечную концентрацию компонентов и минимально разбавить рекомбинантный вирус, и затем водную суспензию подвергают хранению, предпочтительно при -70 С, или незамедлительно высушивают. Как указано выше, рецептурный буфер представляет собой водный раствор, который содержит сахарид, высокомолекулярную структурирующую добавку и буферный компонент в воде. Кроме того, водный раствор может содержать одну или несколько аминокислот и/или необязательно клеточный фактор роста. Кроме того, исходное сырье инфекционных вирусных частиц или рекомбинантного вируса может быть очищено на стадии ультрацентрифугирования при наличии градиента плотности сахарозы. Этот способ известен как стандартная методика очистки вируса. В общем, исходное сырье может быть очищено с использованием того факта, что молекулы веществ конкретной плотности центрифугируют в растворе переменной плотности (например, 20-60 вес./об.% сахарозы в 0,1 М растворе Tris-ЭДТУК при pH 9,5) будут стремиться образовать полосу в той области, в которой точно равны величины плотности (молекул) вещества и плотности раствора. После центрифугирования различные фракции отбираются через отверстие на дне пробирки для центрифугирования. Избыточная сахароза вымывается при центрифугировании в буферный раствор, а инфекционные вирусные частицы или рекомбинантные вирусы повторно суспендируют в желательном буферном растворе. Затем к очищенному рекомбинантному вирусу добавляют достаточное количество рецептурного буфера, как рассмотрено выше, и водную суспензию или незамедлительно высушивают, или подвергают хранению, предпочтительно при -70 С. Водная суспензия в сыром или очищенном виде может быть высушена путем лиофилизации или испарения при температуре окружающей среды. Конкретно, лиофилизация включает в себя стадии охлаждения водной суспензии ниже температуры стеклования или ниже температуры эвтектики водной суспензии и удаления воды из охлажденной суспензии за счет сублимации с образованием лиофилизированного вируса. Вкратце, аликвоты рекомбинантного вируса, составленного в рецептуре, помещают в холодильную камеру Edwards (3 полки RC3S модуля), связанную с сублимационной сушилкой (Supermodulyo 12K). Для лиофилизации составленного в рецептуре рекомбинантного вируса используется многоступенчатая методика сублимационной сушки, которая описана в работе Phillips и др. (Cryobiology, т. 18,с. 414, 1981), предпочтительно при температуре от -40 до -45 С. Конечная композиция содержит меньше чем 10% воды от массы лиофилизированного вируса. Будучи лиофилизированным, рекомбинантный вирус является стабильным, и его можно хранить при температуре от -20 до 25 С, как рассмотрено ниже более подробно. Использованные для составления рецептуры водные растворы, как описано выше, состоят из сахарида, высокомолекулярной структурной добавки, буферного компонента и воды. Кроме того, раствор может включать одну или несколько аминокислот. Комбинация этих компонентов позволяет сохранить активность инфекционных вирусных частиц или рекомбинантного вируса при замораживании и лиофилизации или сушке посредством испарения. Хотя предпочтительным сахаридом является лактоза, могут быть использованы другие сахариды, такие как сахароза, маннит, глюкоза, трегалоза, инозит, фруктоза,мальтоза или галактоза. Кроме того, могут быть использованы сочетания сахаридов, например лактоза и маннит или сахароза и маннит. Особенно предпочтительная концентрация лактозы составляет 3-4 мас.%. Предпочтительная концентрация сахарида находится в диапазоне от 1 до 12 мас.%. Функцией аминокислот, если они присутствуют, является дополнительное предохранение вирусной инфекции при охлаждении и оттаивании водной суспензии. Кроме того, аминокислоты дополнительно предохраняют вирусную инфекцию в ходе сублимации охлажденной водной суспензии, и когда она находится в лиофилизированном состоянии. Предпочтительной аминокислотой является аргинин, однако,также могут быть использованы другие аминокислоты, такие как лизин, орнитин, серин, глицин, глутамин, аспарагин, глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота. Особенно предпочтительная концентрация аргинина составляет 0,1 мас.%. Предпочтительно концентрация аминокислоты находится в диапазоне от 0,1 до 10 мас.%. Кроме того, может быть выгодным использовать водные растворы, содержащие известные компоненты, которые усиливают активность клеток, подлежащих инфицированию. Факторы роста или комбинация факторов роста, если они присутствуют в фармацевтической композиции, способны регулировать физиологические процессы в клетках и поэтому, в контексте настоящего изобретения, способствуют поглощению и дальнейшей интеграции рекомбинантного ретровирусного вектора. Характерные примеры включают эпидермический фактор роста (EGF), гормон, стимулирующий меланоцит (MSH), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и различные цитокины наподобие интерлейкинов-2, -4 или -10, альфа- или гамма-интерферонов. Буферный компонент позволяет поддерживать в растворе относительно постоянное значение рН. Может быть использовано множество буферов, в зависимости от желаемого диапазона,предпочтительным является диапазон рН между 7,0 и 7,8. Подходящие буферные компоненты включают- 13012120 фосфатный буфер и цитратный буфер. Особенно предпочтительным значением рН для рецептуры рекомбинантного вируса является 7,4, и предпочтительным буфером является трометамин. Кроме того, является предпочтительным, чтобы водный раствор содержал нейтральную соль, которая используется для установления соответствующей изоосмотической концентрации соли в окончательно составленной рецептуре вируса. Подходящие нейтральные соли включают в себя хлористый натрий, хлористый калий или хлористый магний. Предпочтительной солью является хлористый натрий. Водные растворы, содержащие желательные концентрации описанных выше компонентов, могут быть приготовлены в виде концентрированных исходных растворов. Особенно предпочтительный способ сохранения рекомбинантных вирусов в лиофилизированном состоянии для последующего воспроизведения включает в себя стадии: (а) объединение инфекционного рекомбинантного вируса с водным раствором с образованием водной суспензии, причем эта водная суспензия содержит 4 мас.% лактозы, 0,1 мас.% альбумина человеческой сыворотки, 0,03 мас.% или меньшеNaCl, 0,1 мас.% аргинина и эффективное количество трометаминового буфера для того, чтобы обеспечить значение рН водной суспензии, приблизительно равное 7,4, тем самым, стабилизируется инфекционный рекомбинантный вирус; (b) охлаждение суспензии до температуры от -40 до -45 С для того, чтобы образовалась замороженная суспензия; и (с) удаление воды из замороженной суспензии путем сублимации с образованием лиофилизированной композиции, содержащей меньше чем 2% воды от массы лиофилизированной композиции, причем эта композиция при ее воспроизведении способна инфицировать клетки млекопитающего. Является предпочтительным, чтобы рекомбинантный вирус был репликационно компетентным, и более предпочтительно, чтобы рекомбинантный вирус при воспроизведении являлся репликационно дефектным и подходящим для приема внутрь человеком. Для специалистов в этой области техники будет очевидно, при наличии раскрытия, приведенного в описании, что может быть предпочтительным применять определенные сахариды в водном растворе,когда лиофилизированный вирус предназначается для хранения при комнатной температуре. Более конкретно, является предпочтительным применение дисахаридов, таких как лактоза или трегалоза, особенно для хранения при комнатной температуре. Лиофилизированные или дегидратированные вирусы настоящего изобретения могут быть воспроизведены при использовании множества соединений, но предпочтительно они воспроизводятся с использованием воды. В определенных случаях также могут быть использованы разбавленные растворы солей,которые доводят окончательную рецептуру до изотонического состояния. Кроме того, может быть выгодным использовать водные растворы, содержащие известные компоненты, которые увеличивают активность воспроизведенного вируса. Такие компоненты включают в себя цитокины, такие как IL-2, поликатионы, такие как сульфат протамина, или другие компоненты, которые усиливают эффективность трансдукции воспроизведенного вируса. Лиофилизированный или дегидратированный рекомбинантный вирус может быть воспроизведен путем добавления любого подходящего объема воды или указанных выше воспроизводящих агентов, что делает возможной существенную и предпочтительно полную солюбилизацию лиофилизированного или дегидратированного образца. В соответствии с настоящим изобретением описанные выше композиции особенно пригодны для лечения рака у пациентов, нуждающихся в лечении. С этой целью композиции настоящего изобретения могут быть введены непосредственно в опухоль или в большое множество расположений, в том числе,например, в такие места, как церебрально-спинная жидкость, костный мозг, суставы, артериальные эндотелиальные клетки, прямая кишка, буккально/под язык, во влагалище, в лимфатическую систему, в орган, выбранный из группы, состоящей из легких, печени, поджелудочной железы, селезенки, кожи, крови и мозга, или в место, выбранное из группы, состоящей из опухолей и внутритканевого пространства. В других вариантах осуществления композиция может быть введена внутрь глаза, в носовую полость, под язык, орально, местно, внутрь пузырьков, интратекально, внутривенно, внутриартериально, например во внутрипеченочную артерию, внутрибрюшинно, внутрь черепа, внутримышечно, внутрисуставно или подкожно. Другие типичные способы введения включают в себя гастроскопию, ECRP и колоноскопию,для которых не требуется полная операционная процедура и госпитализация, но может потребоваться присутствие медицинского персонала. Ниже следует обсуждение способов введения композиций настоящего изобретения. Оральное введение является легким и удобным, экономичным (стерильность не требуется), безопасным (в большинстве случаев может применяться повышенная дозировка), и оно обеспечивает контролируемое выделение активного компонента композиции (рекомбинантного вируса). Напротив, при этом может иметь место локальное раздражение, такое как тошнота, рвота или диарея, непостоянное поглощение для плохорастворимых лекарственных препаратов, причем рекомбинантный вирус может подвергаться эффекту "первого прохода" за счет печеночного метаболизма и разложения под действием желудочной кислоты и ферментов. Кроме того, при этом может иметь место медленное начало действия,может не достигаться эффективное содержание в плазме, требуется сотрудничество с пациентом и пища может влиять на поглощение. Буквально/подъязычное введение представляет собой удобный способ приема внутрь, который обеспечивает быстрое начало действия активного компонента (компонентов) композиции и исключает- 14012120 метаболизм первого прохода. Таким образом, отсутствует разложение под действием желудочной кислоты и ферментов и поглощение рекомбинантных вирусов является осуществимым. Имеется высокая степень биоаккумулирования, и, в сущности, возможно немедленное прекращение лечения. Напротив, такой способ введения ограничен относительно низкими дозировками (обычно приблизительно 10-15 мг), и при этом нельзя одновременно есть, пить или проглатывать. Ректальное введение обеспечивает не пренебрежимо малый эффект метаболизма при первом проходе (существует хорошая подача в кровеносные сосуды/лимфу, и поглощенные материалы непосредственно просачиваются в нижнюю полость вены), причем этот способ подходит для детей, пациентов с рвотной реакцией и пациентов без сознания. В этом способе исключается разложение под действием желудочной кислоты и ферментов, и степень ионизация композиции не будет изменяться, поскольку ректальная жидкость не обладает буферной емкостью (рН 6,8; лучше всего поглощаются заряженные композиции). Напротив, в этом случае возможно медленное, слабое или непостоянное поглощение, раздражение, разложение бактериальной флорой и имеется малая поверхность поглощения (приблизительно 0,05 м 2). Более того, для поглощения ректальной слизистой оболочкой предпочтительными являются липидофильные и водорастворимые соединения, причем могут быть необходимы усилители поглощения(например, соли, ЭДТУК, NSAID). Многие пути приема внутрь, приведенные в описании (например, в церебрально-спинную жидкость(CSF), в костный мозг, внутривенно, внутриартериально, внутрь черепа, внутримышечно, подкожно,внутрь различных органов, внутрь опухоли, внутрь тканевого пространства, внутрибрюшинно, внутрилимфатически или внутрь капиллярного ложа), могут быть выполнены просто прямым введением с использованием иглы, катетера или родственного устройства. В частности, в пределах определенных вариантов изобретения одну или несколько дозировок можно вводить непосредственно указанным ниже образом: в церебрально-спинную жидкость - при дозировках, больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109,1010 или 1011 колониеобразующих единиц (КОЕ); в костный мозг - при дозировках, больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; внутрисуставно - при дозировках, больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; внутривенно - при дозировках, больше чем или равных 108, 109,1010 или 1011 КОЕ; внутриартериально - при дозировках, больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109,1010 или 1011 КОЕ; внутрь черепа - при дозировках, больше чем или равных 109, 1010 или 1011 КОЕ; внутримышечно - при дозировках, больше чем или равных 1010 или 1011 КОЕ; внутрь глаза - при дозировках,больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; внутрь легкого - при дозировках, больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; назально - при дозировках, больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; под язык - при дозировках, больше чем или равных 105, 106,107, 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; ректально - при дозировках, больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109,1010 или 1011 КОЕ; орально - при дозировках, больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; местно - при дозировках, больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; вагинально - при дозировках, больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; подкожно - при дозировках, больше чем или равных 109, 1010 или 1011 КОЕ; внутрь пузырьков - при дозировках, больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; внутрь органа, такого как легкие, печень, селезенка, кожа, кровь или мозг - при дозировках, больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; внутрь опухоли - при дозировках, больше чем или равных 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; внутрибрюшинно - при дозировках, больше чем или равных 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; в тканевое пространство при дозировках, больше чем или равных 1010 или 1011 КОЕ; внутрилимфатически - при дозировках,больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; внутрь капиллярного ложа - при дозировках, больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ; или интратекально - при дозировках, больше чем или равных 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или 1011 КОЕ. Рекомбинантный вирус может быть доставлен к мишени из места за пределами тела (как при амбулаторной процедуре) или как хирургическое вмешательство, когда вектор вводится как часть процедуры другого назначения или в качестве процедуры, выполненной специально для того, чтобы ввести вектор. Другие пути и способы введения включают в себя непарентеральные пути, а также введение сквозь многочисленные места. В качестве альтернативы вирусы, вирусные векторные частицы или упаковочные клетки могут быть герметизированно упакованы в биосовместимые устройства, например в описанные выше капсулы. Такие биосовместимые устройства могут быть использованы в форме композиций, содержащих указанные биосовместимые устройства, и составлены в рецептуру, предназначенную предпочтительно для парентерального приема животным, в том числе человеком, нуждающимся в лечении. Краткое описание чертежей На фиг. 1 приведена схема экспрессии векторов pMMTV-холин и рМ MTVb. LTR: bla, ген -лактамазы; MMTV LTR, 3' LTR вируса опухоли молочной железы мыши; -S105, бактериофагген S, кодирующий -холиновый протеин (кодоны от 3 до 107); SV40 ori, SV40 начало репликации; pSV40, SV40 промотор; neo, ген резистентности к неомицину; pUC19 ori, начало или репликация из плазмиды pUC19. На фиг. 2 продемонстрирована экспрессия -S105 в HeLa клетках, стабильно зараженных pMMTV- 15012120 холином после стимулирования дексаметазоном в течение 24, 48, 72, 96 и 120 ч, что определено с помощью Вестерн блоттирования. Окрашенный -, S105, кодирующий холиновый протеин, показан стрелкой. Величины молекулярных масс стандарта приведены слева в тыс.ед. Дальтона (кДа); -dex - обработка дексаметазоном отсутствует; bact. lysate - продукт лизиса клеток Е. coli, индуцибельно экспрессирующий -S105. Фиг. 3 демонстрирует морфологические изменения клеток HeLa, стабильно зараженных pMMTVхолином после индуцированной дексаметазоном экспрессии -S105. (А) клетки HeLa, стабильно зараженные pMMTVb.LTR и выдержанные с дексаметазоном в течение указанного времени. (В) клеткиHeLa, стабильно зараженные pMMTV-холином и выдержанные с дексаметазоном (+dex) в течение указанного времени: -dex, обработка дексаметазоном отсутствует. Стрелками показаны ядра многоядерных клеток. На фиг. 4 показан эффект индуцированной дексаметазоном экспрессии -S105 на жизнеспособностьHeLa клеток, которую определяют по измерению метаболической активности с использованием теста МТТ вHeLa клетках, стабильно зараженных pMMTV-холином, и (О) в HeLa клетках, стабильно зараженных pMMTVb.LTR в качестве контроля, или с помощью анализа исключения трипанового синего вpMMTVb.LTR в качестве контроля, или с помощью окрашивания аннексином V/7AAD (v) HeLa клеток,стабильно зараженных pMMTV-холином, и вHeLa клетках, стабильно зараженных pMMTVb.LTR в качестве контроля. На фиг. 5 приведена схема Tet-регулированной экспрессии векторов pUHD10.3-холин-Hygr иpUHD10.3-Hygr. SV40 поли (А), сигнал полиаденилирования вируса Simian 40; промотора SV40, промотора вируса Simian 40; CoIEI ori, начало репликации; ampr, ген ампициллиновой резистентности; hygror,ген гигромициновой резистентности; MCS, центр множественного клонирования; 7tetO+mCMV, 7 повторов элемента тетрациклинового оператора, сопряженного с минимальным промотором человеческого цитомегаловируса; -S105, ген, кодирующий -холиновый протеин бактериофага; Pvull, Sacll, Xbal, центры связывания рестрикционной эндонуклеазы. На фиг. 6 показана экспрессия -S105 в (А) клоне CI24 клеток HeLa (дорожки 5-9), клоне CI35 (дорожки 10-14), клоне CI36 (дорожки 15-19) и (В) клоне CU клеток 293 (дорожки 24-26), клоне CI6 (дорожки 27-29), клоне CI3 (дорожки 30-32), стабильно зараженным pTet-On (BD Biosciences Clontech), и вектора экспрессии pUHD10.3-холин-Hygr после стимулирования доксициклином, что определяется с помощью Вестерн блоттирования. Окрашенный -S105 кодированный холиновый протеин показан стрелкой. Величины молекулярных масс протеинового стандарта приведены слева в кДа. Нумерация дорожек: (1,20) продукт лизиса Е. coli индуцибельной экспрессии -S105 протеина; (2, 22) экстракты HeLa клеток,стабильно зараженных pMMTV-холином и обработанных дексаметазоном в качестве контроля; (3, 21) стандарт молекулярной массы протеина; (4, 23) экстракты незараженных HeLa клеток; (5, 10, 15, 25, 27,30) pTet-On/pUHD10.3-холин-Hygr-зараженные клетки, не выдержанные с доксициклином; (6, 11, 16, 26,28, 31); дважды зараженные клетки, выдержанные с доксициклином в течение 24 ч, (7, 12, 17, 24, 29, 32) в течение 48 ч, (8, 13, 18) - 72 ч и (9, 14, 19) в течение 96 ч. На фиг. 7 показан эффект доксициклининдуцированной -S105 экспрессии на жизнеспособность клеток в (A) HeLa и (В) клонах клеток 293, стабильно зараженных pTet-On, и на экспрессионный векторpUHD10.3-холин-Hygr, который определен путем измерения метаболической активности с использованием МТТ анализа. (А) незараженные HeLa клетки; клон 24 клеток HeLa; s клон 35 клеток HeLa; 6 клон 36 HeLa клеток. (В) незараженные клетки 293; клон 3 клеток 293; s клон 6 клеток 293; 6 клон 1 клеток 293. На фиг. 8 показан эффект доксициклининдуцированной -S105 экспрессии на жизнеспособность клеток (A) HeLa и (В) клонов клеток 293, стабильно зараженных pTet-On и pUHD10.3-холин-Hygr, который определен путем эксклюзионного анализа трипанового синего. (А) незараженные HeLa клетки; клон 24 клеток HeLa; s клон 35 клеток HeLa; 6 клон 36 клеток HeLa. (В) незараженные клетки 293; клон 3 клеток 293; s клон 6 клеток 293; 6 клон 1 клеток 293. На фиг. 9 показан ретровирусный вектор, кодирующий компоненты комбинированной регулятивной системы Tet on/Tet off [68]. Вектор pLib-rtTA-M2-IRES-TRSID-IRES-Puror основан на вирусе мышиной лейкемии (MLV). LTR, MLV длинный терминальный повтор; IRES, место входа внутренней рибосомы; Puror, ген пуромициновой резистентности; +, MLV упаковочный сигнал; rtTA-M2, вариант реверсивного Tet-регулированного трансактиватора (rtTA) высокой аффинности; TRSID, протеин гистондезацетилаза-рекрутмент Tet-репрессора. Фиг. 10 демонстрирует эффект доксициклининдуцированной экспрессии -S105 в клетках HeLa,293 и MCF-7, стабильно инфицированных pLib-rtTA-M2-IRES-TRSID-IRES-Puror и стабильно зараженных с помощью pUHD10.3-холин-Hygr, который определен путем измерения жизнеспособности клеток с использованием МТТ и эксклюзионного анализа трипанового синего, о незараженные клетки MCF-7; m незараженные HeLa клетки; 0 незараженные клетки 293; s зараженные/инфицированные MCF-7 клетки,экспрессирующие -S105; 6 зараженные/инфицированные HeLa клетки, экспрессирующие -S105; + зараженные/инфицированные клетки 293, экспрессирующие -S105.- 16012120 На фиг. 11 показан эффект -S105 холинового протеина на ксенотрансплантаты, произведенные из клеток опухоли человеческой молочной железы в иммунонекомпетентных SCID/бежевых мышах. Вводят подкожную инъекцию клеток MCF-7, которые дают убежище тетрациклиновой регулятивной системе и заражены pUHD10.3-холин-Hygr или pUHD10.3-Hygr, SCID/бежевым мышам. Когда опухоли выросли до пальпируемого размера, мышам давали или доксициклин в концентрации 2 мг/мл (группа обработки),или давали пить чистую воду (группа без обработки). Были сопоставлены скорости роста опухоли животных, обработанных доксициклином и не обработанных доксициклином. Эти различия считались статистически существенными, когда р 0,05. (А) Анализ скорости роста опухоли, полученной на MCF-7 клетках, зараженных pUHD10.3-холин-Hygr. Статистическая оценка показывает существенное различие(р=0,0424) скоростей роста опухоли у обработанных (+dox) и необработанных (-dox) мышей. (В) Сопоставление скоростей роста опухоли, полученной на MCF-7 клетках, зараженных pUHD10.3-Hygr. He обнаружено существенное различие (р=0,9014) между обработанными (о +dox) и необработанными (n -dox) животными. На фиг. 12 показан эффект -S105 экспрессии на рост опухоли ксенотрансплантатов, произведенных из раковых клеток мышиной молочной железы, в иммунокомпетентной модели изогенных мышей. Клетки аденокарциномы мышиной молочной железы (TSA) были инфицированы pLib-rtTA-M2-IRESTRSID-IRES-Puror с последующей трансфекцией с pUHD10.3-холин-Hygr. Смесь выбранных клонов была использована для создания подкожных опухолей ксенотрансплантата у изогенных Balb/c мышей. Кроме того, вводили инъекции инфицированных клеток, зараженных pUHD10.3-Hygr. Разделяли мышей на группы по 20 мышей в каждой и затем обрабатывали доксициклином (50 мг/кг, внутрибрюшинно) или не обрабатывали. Регистрировали рост опухоли и статистически оценивали скорости роста. (А) Рост опухоли ксенотрансплантатов, произведенных из TSA клеток, зараженных pUHD10.3.-Hygr, у не обработанных доксициклином (о) и у обработанных доксициклином мышей ; и из TSA клеток, зараженныхpUHD10.3-холин-Hygr, у не обработанных доксициклиноми у обработанных доксициклином мышей. (В) Сопоставление и статистическая оценка (непарный f-критерий Стьюдента) средних скоростей роста опухоли ксенотрансплантатов, произведенных из pUHD10.3-холин-Hygr-зараженных (о) илиpUHD10.3.-Hygr зараженных (v) TSA клеток мышей, обработанных доксициклином. Обнаружено, что различие является весьма существенным (р=0,0012). На фиг. 13 показаны результаты анализа Вестерн блоттирования субклеточных фракций клеточных экстрактов, приготовленных из HeLa клеток, инфицированных pLib-rtTA-M2-IRES-TRSID-IRES-Puror и зараженных pUHD10.3-холин-Hygr. Клетки были выдержаны с доксициклином в течение 48 ч для того,чтобы индуцировать экспрессию -S105 гена. Получают суммарный продукт лизиса клеток (Т) и подвергают его дифференциальному центрифугированию, чтобы фракционировать цитоплазму (С), ядра (N) и митохондрии (М). Фракционированные протеины анализируют методом Вестерн блоттирования на наличие органелло-специфичных маркерных протеинов, таких как оксидаза цитохрома с (В), калнексин(С), нуклеопорин (D) и интегрин (Е). Присутствие протеина -S105 (А) обнаружено в митохондриях и в эндоплазматической сети, на что указывает совместное расположение с оксидазой цитохрома с и калнексином. Слева приведены значения молекулярных масс протеиновых стандартов (в тыс.ед. Дальтона). Следующие примеры служат для иллюстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Примеры Пример 1. Функциональность вектора экспрессии S105 протеина фага лямбда (K). В этом примере определяется функциональность вектора, использованного для экспрессии -S105 в клетках HeLa. Части открытой рамки считывания (ORF) S, кодирующей аллель -S105 (кодоны от 3 до 107; нуклеотиды от 45192 до 45509 генома бактериофага(инвентарный номер NC001416 в Генетическом банке, амплифицируют за счет полимеразной цепной реакции из плазмиды pVIII- S105 [53], используя праймеры V13 и W13 (табл. 1), ограниченные Xba и Sacll и лигированные вектором pMMTVGFP(табл. 1), который также был ограничен Xba и Sacll, что приводит к вектору pMMTV-холина (фиг. 1). Родительский вектор pMMTV-холина, pMMTVGFP, конструируют следующим образом: NruBamH фрагмент рсДНК 3, содержащий промотор вируса CMV (табл. 1), замещают Nru-BamH фрагментом вектора pLTR.stp (табл. 1), содержащим длинный терминальный повтор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV LTR), что приводит к вектору pMMTVb.LTR (табл. 1). Ген eGFP вырезают изNot, приводя к pMMTVGFP. Клетки E.coli DH 10 В (Invitrogen) трансформируют pMMTV-холином и выделяют клоны, стойкие к ампициллину. Корректность конструкции вектора pMMTV-холина подтверждается анализом рестрикционного фермента полученной плазмиды ДНК, причем цельность гена -S105 доказана путем секвенирования ДНК с использованием праймера Seq-RC-MMTV-1-R (табл. 1). Клетки HeLa были стабильно заражены pMMTV-холином с использованием способа соосаждения с фосфатом кальция в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen), и анализируют индивидуальные клоны, устойчивые к Geneticin G418 (Invitrogen), на экспрессию -S105 путем Вестерн блоттирования, используя антисыворотку, выращенную против пептида, расположенного в части С-конца -S105,- 17012120 кодирующего холиновый протеин. Вектор pMMTV-холина обеспечивает возможность глюкокортикоидиндуцибельной экспрессии -S105 из MMTV промотора, расположенного в области U3 в MMTV LTR. Для скрининга клеток, зараженных pMMTV-холином, индуцируется экспрессия путем добавления 1 мкмоль/л (мкМ) дексаметазона (Sigma-Aldrich, Vienna, Austria) в культуральную среду за 48 ч до сбора клеток. Клеточный клон (клон 12), выявляющий индуцибельный синтез протеина -S105, после обработки дексаметазоном исследуется дополнительно. Следовательно, высевают 1105 клеток клона 12 или, в качестве контроля, клетки HeLa, стабильно зараженные pMMTVb.LTR, в 6-лунные планшеты и культивируют в течение 120 ч. В различные моменты времени добавляют в культуральную среду 1 мкМ дексаметазона и клетки дополнительно выдерживают в течение 24, 48, 72, 96 и 120 ч в присутствии гормона. Для клеток, которые были обработаны дексаметазоном больше чем в течение 48 ч, в культуральную среду добавляют свежий дексаметазон на каждые вторые сутки. В момент времени 120 ч все клетки одновременно собирают, повторно суспендируют в буфере образца додецилсульфата натрия-Laemmli (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany) и равные количества протеина анализируют путем Вестерн блоттирования, используя стандартные технические приемы. Синтез кодированного -S105 холинового протеина может быть детектирован впервые спустя 24 ч выдерживания с дексаметазоном (фиг. 2). После этого уровни экспрессии оставались приблизительно постоянными в течение 96 ч. В качестве контроля использовался продукт лизиса клеток Е. coli, индуцибельно экспрессирующий -S105 (фиг. 2, бакт. лизат). Цельность гена -S105, объединенного в хромосомной ДНК стабильно зараженных клеток HeLa,была подтверждена путем амплификации кодирующей последовательности с помощью полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров холин-F2 и HoNn-RI (табл. 1), которые оба связываются, соответственно, выше и ниже -S105 ORF, и последующего секвенирования фрагмента праймерами холин-F2 и холин-R2 (табл. 1). Пример 2. Морфологические изменения клеток HeLa после экспрессии -S105, индуцированной дексаметазоном. В этом примере исследованы морфологические изменения клеток HeLa после экспрессии -S105,индуцированной дексаметазоном. Вкратце, высевают 1104 клеток HeLa, стабильно зараженныхpMMTV-холином или, в качестве контроля, pMMTVb.LTR, в камеры камерных кассет с 8-лунками и культивируют в течение 120 ч. В различные заданные моменты времени в культуральную среду добавляют 1 мкМ дексаметазона и клетки дополнительно выдерживают в течение 24, 48, 72, 96 и 120 ч в присутствии гормона. Для клеток, которые были обработаны дексаметазоном больше чем в течение 48 ч, в культуральную среду добавляют свежий дексаметазон на каждые вторые сутки. Клетки фиксируют в буферном растворе формалина и в течение 2 мин подвергают противоокрашиванию в растворе квасцового гематоксилина (Fluka, Seelze, Germany). Кассеты анализируют с помощью стандартного оптического микроскопа (Zeiss Axiovert 200 М, Carl Zeiss GmbH, Vienna, Austria) и фотографируют. Хотя в морфологии клеток, зараженных pMMTVb.LTR, не наблюдаются какие-либо существенные изменения после обработки дексаметазоном (фиг. 3A), со временем дексаметазониндуцированная экспрессия -S105 вpMMTV-холинзараженных клетках HeLa провоцирует нечто вроде "набухания", что, в конечном счете,приводит к громадным, часто многоядерным клеткам (фиг. 3B, стрелки). Кроме того, по сравнению с соответствующими контрольными клетками, стабильно зараженными рМ MTVb.LTR (фиг. 3A), число клеток непрерывно снижается в системе pMMTV-холинзараженных клеток, начиная с 48 ч после индуцирования экспрессии -S105 (фиг. 3B, 48 ч +dex, 72 ч +dex, 96 ч +dex, 120 ч +dex). Пример 3. Влияние дексаметазониндуцированной экспрессии -S105 на клеточный метаболизм. В этом примере описан эффект дексаметазониндуцированной экспрессии -S105 в клетках HeLa на клеточный метаболизм, который определяется по измерениям относительных концентраций NADH иNADPH, с использованием МТТ анализа (Sigma-Aldrich, Vienna, Austria). Вкратце, высевают 1105 клеток HeLa, стабильно зараженных pMMTV-холином или в качестве негативного контроля pMMTVb.LTR, в планшеты с 6-лунками и культивируют в течение 120 ч. В различные заданные моменты времени в культуральную среду добавляют 1 мкМ дексаметазона и клетки выдерживают в течение 24, 48, 72, 96 и 120 ч в присутствии гормона. Для клеток, которые были обработаны дексаметазоном больше чем в течение 48 ч, в культуральную среду добавляют свежий дексаметазон на каждые вторые сутки. В момент времени 120 ч все клетки одновременно собирают и подвергают МТТ анализу с целью определения относительных количеств NADH и NADPH в качестве индикатора клеточного метаболизма, который, в свою очередь, является показателем жизнеспособности клеток. Для клетокHeLa, стабильно зараженных pMMTV-холином, инкубирование с дексаметазоном в течение 120 ч приводит к существенному снижению жизнеспособных клеток, на 74%, по сравнению с клетками, которые не были обработаны дексаметазоном (фиг. 4, зачерненные круги). С целью исключения негативного эффекта самого дексаметазона на клеточный рост и жизнеспособность клетки HeLa, стабильно зараженныеpMMTVb.LTR, в которых отсутствует кодирующая -S105 область, также были выдержаны с дексаметазоном в течение 120 ч (фиг. 4, пустые круги). Когда число жизнеспособных клеток HeLa, стабильно зараженных pMMTV-холином и выращиваемых в течение 120 ч, но без выдержки с дексаметазоном (за- 18012120 черненные круги в момент времени 0 ч на фиг. 4), принимается за 100% и сравнивается с числом клетокHeLa, стабильно зараженных рМ MTVb.LTR, но обработанных иначе таким же образом (пустые круги в момент времени 120 ч на фиг. 4), очевидно, что дексаметазон не оказывает негативного действия на клеточный рост. Напротив, для клеток HeLa, в которых отсутствует -S105 ген, обнаружено повышенное число жизнеспособных клеток (110%) по сравнению с клетками, которые дают убежище гену (100%). Этот эффект можно объяснить просачиванием системы MMTV промотора и конститутивно низким уровнем экспрессии -S105 в клетках, зараженных pMMTV-холином, даже в отсутствие дексаметазона или благодаря низкому уровню глюкокортикоидов, присутствующих в среде клеточной культуры. В совокупности, эти результаты демонстрируют, что экспрессия -S105 оказывает выраженный негативный эффект на жизнеспособность клеток, на что указывает снижение клеточного метаболизма. Пример 4. Влияние дексаметазониндуцированной экспрессии -S105 на цельность мембраны. В этом примере описан эффект дексаметазониндуцированной экспрессии -S105 в HeLa клетках на цельность мембраны, которую определяли с применением эксклюзионного анализа трипанового синего. Текучесть цитоплазматической мембраны представляет собой хорошо известный индикатор смерти клеток за счет апоптоза или некроза. Засевают 1105 клеток HeLa, стабильно зараженных pMMTV-холином или в качестве контроля pMMTVb.LTR, в планшеты с 6-лунками и культивируют в течение 120 ч. В различные определенные моменты времени добавляют 1 мкМ дексаметазона в культуральную среду и клетки дополнительно выдерживают в течение 24, 48, 72, 96 и 120 ч в присутствии гормона. Для клеток, которые были обработаны дексаметазоном больше чем в течение 48 ч, в культуральную среду добавляют свежий дексаметазон на каждые вторые сутки. В момент времени 120 ч все клетки одновременно собирают и подвергают окрашиванию трипановым синим для того, чтобы определить количество жизнеспособных клеток с неповрежденными мембранами. Эксклюзионный анализ с трипановым синим проводят в соответствии с инструкциями производителя (Sigma-Aldrich, Vienna, Austria). Для клеток HeLa, стабильно зараженных pMMTV-холином, инкубирование дексаметазоном в течение 120 ч приводит к существенно меньшему числу клеток с неповрежденной (исключающей трипановый синий) мембраной (30%) по сравнению с клетками, которые не были обработаны дексаметазоном и число которых принято за 100% (фиг. 4, зачерненные треугольники). Для того, чтобы исключить негативный эффект самого дексаметазона на цельность мембраны, HeLa клетки, стабильно зараженные -S105, в котором отсутствуетpMMTVb.LTR, также были выдержаны с дексаметазоном в течение 120 ч. Поскольку количество неотягощенных HeLa клеток, стабильно зараженных pMMTV-холином, который выращивали в течение 120 ч,но не выдерживали с дексаметазоном (100%; зачерненный треугольник в момент времени 0 ч на фиг. 4),становится сопоставимо с количеством HeLa клеток, стабильно зараженных pMMTVb.LTR, но обработанных иначе таким же образом (пустой треугольник в момент времени 120 ч на фиг. 4), очевидно, что сам дексаметазон не вызывает повреждения мембраны. Напротив, в HeLa клетках, в которых отсутствует ген -S105, обнаружено повышенное количество жизнеспособных клеток с неповрежденной цитоплазматической мембраной (106%) по сравнению с клетками, которые дают убежище этому гену (100%). Как уже упоминалось в примере 3, этот эффект наиболее вероятно вызван текучестью системы MMTV промотора. В совокупности, результаты, описанные в этом примере, еще раз демонстрируют вредное действие протеина -S105, кодирующего холин, на клеточную жизнеспособность, на что указывает потеря цельности цитоплазматической мембраны. Пример 5. Влияние дексаметазониндуцированной экспрессии -S105 на цитоплазматическую мембрану. В этом примере описан эффект дексаметазониндуцированной экспрессии протеина -S105 на цитоплазматическую мембрану, который определяется по окрашиванию аннексином V-PE/7AAD. АннексинV представляет собой партнер для естественного связывания с фосфатидилсерином (PS), расположенным в листочках внутренней мембраны, которые покрывают цитозол. Однако в ходе апоптоза клеток PS выходит на поверхность клетки, и поэтому его можно детектировать аннексином V, добавленным из внешнего источника. Связывание аннексина V с клетками является индикатором апоптоза, а также некроза,поскольку клетки с отягощенными мембранами дают возможность аннексину V проникнуть и связать PS изнутри (55). 7-Аминоактиномицин D (7AAD) интеркалируется в двойную спираль нуклеиновых кислот. Это соединение не допускается в жизнеспособные клетки с неповрежденными мембранами, но может проникать в клеточные мембраны клеток на стадии позднего апоптоза и/или некроза. Высевают 1105 клеток HeLa, стабильно зараженных pMMTV-холином или pMMTVb.LTR, в котором отсутствует -S105 кодирующая область, в планшеты с 6-лунками и культивируют в течение 120 ч. В различные определенные моменты времени добавляют в культуральную среду 1 мкМ дексаметазона и клетки дополнительно выдерживают в течение 24, 48, 72, 96 и 120 ч в присутствии гормона. Для клеток,которые были обработаны дексаметазоном больше чем в течение 48 ч, в культуральную среду добавляют свежий дексаметазон на каждые вторые сутки. В момент времени 120 ч все клетки одновременно собирают и подвергают окрашиванию аннексином V-PE/7AAD в соответствии с инструкциями производителя (BD Biosciences, Heidelberg, Germany). Когда количество клеток, которые не были обработаны дексаметазоном и не дают окрашивания с аннексином V-PE/7AAD (следовательно, они считаются живыми- 19012120 клетками), принято за 100% и сопоставляется с количеством аннексии V-PE/7AAD-негативных клеток всей совокупности клеток, которые были обработаны дексаметазоном в течение 120 ч, становится очевидным, что жизнеспособным является гораздо меньшее количество клеток (32%, фиг. 4). Для того, чтобы исследовать возможный эффект самого дексаметазона на цельность мембраны, HeLa клетки, стабильно зараженные pMMTVb.LTR, в котором отсутствует -S105 ген, также были выдержаны с дексаметазоном в течение 120 ч. Поскольку количество HeLa клеток, стабильно зараженных pMMTV-холином, которые выращивали в течение 120 ч, но не выдерживали с дексаметазоном (100%; зачерненные квадраты в момент времени 0 ч на фиг. 4), является сопоставимым с количеством HeLa клеток, стабильно зараженных pMMTVb.LTR, но обработанных иначе таким же образом (пустые квадраты в момент времени 120 ч на фиг. 4), очевидно, что сам дексаметазон не вызавает повреждения мембраны. Как было также указано в примерах 3 и 4, в HeLa клетках, в которых отсутствует -S105 ген, обнаружено повышенное количество жизнеспособных клеток после обработки в течение 120 ч дексаметазоном (111%) по сравнению с клетками, которые дают убежище этому гену (100%). И в этом случае указанный эффект наиболее вероятно обусловлен текучестью системы MMTV промотора (см. пример 3). В совокупности, данные этого примера демонстрируют сильный эффект уничтожения клеток протеином -S105, когда он экспрессирован в HeLa клетках. Пример 6. Оценка векторной системы, индуцированной доксициклином. В этом примере описан эффект экспрессии -S105 в клетках HeLa и 293 с использованием системы экспрессии доксициклин-индуцибельного Tet-On гена (BD Biosciences, Heidelberg, Germany). С этой целью клетки были стабильно заражены pTet-On с последующей трансфекцией соответствующим протеином -S105, кодирующим вектор Tet-отклика pUHD10.3-холин Hygr или родственный вектор pUHD10.3Hygr (фиг. 5). Плазмида тетрациклинового отлика pUHD-10.3-холин была сконструирована путем вставки амплифицированного фрагмента ДНК длиной 318 пар оснований (bp), содержащего область, кодирующую протеин -S105 (инвентарный номер в генетическом банке NCBI J02459; нуклеотиды 4519245509), в плазмиду pUHD-10.3 rhttp://www2.cbm.uam.es/bc-015/sequences/pUHD10-3.htmll. Праймеры,использованные для амплификации (V13 и W13 (табл. 1, включают в себя Sacll и Xbaцентры для ферментативного дигерирования и лигирования полученного фрагмента с помощью Xba и Sacll центров фрагмент вектора pUHD-10.3 размером 3150 пар оснований. Кассету экспрессии гена гигромициновой резистентности (2300 bp) получают из рсДНК 3-Hygr (Invitrogen LT, Lofer, Austria) путем дигерирования ферментом рестрикции cFVuII. Фрагмент 2300 bp лигируют с помощью FVuII-линеаризированного вектора pUHD-10.3-холин и pUHD-10.3, соответственно, давая векторы pUHD-10.3-холин-Hygr и pUHD10.3Hygr (фиг. 5). Стабильно зараженные клеточные клоны были проанализированы на доксициклин-индуцибельную экспрессию протеина -S105 с помощью Вестерн блоттирования с использованием антисыворотки, выращенной против пептида, расположенного в С-концевой части протеина -S105, кодирующего холин. Среди клонов экспрессии -S105 в дальнейшем были проанализированы клоны, демонстрирующие самый высокий уровень экспрессии. Клетки HeLas культивируют в присутствии 5 мкг/мл доксициклина в течение 24, 48, 72 и 96 ч. Клетки 293 культивируют только в течение 24 и 48 ч, так как после этого периода инкубирования все клетки были мертвы. На фиг. 6 А и 6 В показана экспрессия -S105 в клонах 24,35, 36 HeLa клеток и в клонах 1, 3 и 6 клеток 293, соответственно. Хотя фоновая экспрессия отсутствовала (фиг. 6, дорожки 5, 15, 27, 30) или была очень низкой (фиг. 6, дорожки 10, 25) в клетках HeLa и в контрольных клетках 293, которые не были выдержаны с доксициклином, уже через 24 ч после добавления доксициклина в культуральную среду наблюдалась очень высокая экспрессия (фиг. 6, дорожки 6, 11, 16,26, 28, 31). В качестве контроля использовался тот же самый продукт лизиса клеток Е. coli, экспрессирующих -S105, который описан в примере 1 (фиг. 6, дорожки 1 и 20), а также клеточный экстракт HeLa клеток, стабильно экспрессирующих -S105 из вектора pMMTV-холин (фиг. 6, дорожки 2 и 22; см. пример 1). По сравнению с дексаметазониндуцируемыми клетками HeLa, экспрессирующими -S105 из вектора pMMTV-холин (фиг. 6 В, дорожка 22), уровень экспрессии резко увеличивается за счет экспрессии-S105 с векторной системой Tet-On. Малое количество -S105 холинового протеина, детектированного в экстрактах клона 3 клеток 293, после 48 ч инкубирования с доксициклином, с помощью Вестерн блоттирования (фиг. 6 В, дорожка 32), обусловлено тем фактом, что к этому моменту времени большинство клеток уже погибло. Увеличенная окрашенная полоса протеина на дорожке 20 (фиг. 6 В), содержащая продукт бактериального лизиса, наиболее вероятно, представляет собой олигомерную форму -S105,тогда как меньшие полосы протеинов (фиг. 6 В, дорожки 24, 25, 26, 28), детектированные за полосой окрашенного -холинового протеина (помечены стрелкой), могут указывать на частичное разложение S105 холинового протеина в клетках 293. Пример 7. Эффект доксициклининдуцированной экспрессии -S105 на клеточный метаболизм. В этом примере описан эффект доксициклининдуцированной экспрессии -S105, регулированнойTet, в клетках HeLa и 293 на клеточный метаболизм, который определяется по измерению относительных концентраций NADH и NADPH в качестве индикаторов жизнеспособности клеток, с использованием- 20012120 МТТ анализа. Клоны 24, 35, 36 стабильно зараженных HeLa клеток и клоны 1, 3 и 6 клеток 293, которые дают убежище -S105, содержащему Tet-регулированный вектор pUHD10.3-холин-Hygr экспрессии,культивируют в присутствии 5 мкг/мл доксициклина в течение 24, 48, 72 и 96 ч (клоны HeLa клеток) или 24 и 48 ч (клоны клеток 293) для того, чтобы индуцировать экспрессию -S105, причем кодированный S105 синтез холина был подтвержден путем Вестерн блоттирования (см. пример 6). Клетки подвергают МТТ анализу (см. пример 3) для определения жизнеспособности клеток (фиг. 7). Жизнеспособность незараженных клеток HeLa (фиг. 7 А) и клеток 293 (фиг. 7 В), в которых отсутствует вектор (фиг. 7, черные ромбы), не ухудшилась, это свидетельствует о том, что сам доксициклин не оказывает негативного действия на клетки. Однако экспрессия -S105 в pUHD10.3-холин-Hygr-зараженных клетках 293 и клонахHeLa клеток (фиг. 7, зачерненные квадраты, треугольники, кресты) приводит к значительной гибели клеток: от 94 до 98% спустя 48-96 ч инкубирования с доксициклином. Пример 8. Эффект доксициклининдуцированной экспрессии -S105 на цельность цитоплазматической мембраны. В этом примере описан эффект доксициклининдуцированной экспрессии -S105 в клетках HeLa и 293 на цельность цитоплазматической мембраны как индикатора жизнеспособности клеток, которую определяют по окрашиванию трипановым синим. Протеин -S105 экспрессируют, используя систему экспрессии доксициклин-индуцибельного Tet-On гена (см. пример 7). Были исследованы клоны 24, 35, 36 клеток HeLa и клоны 1, 3 и 6 клеток 293, которые дают убежище Tet-регулированному вектору экспрессии pUHD10.3-холин-Hygr. Экспрессия -S105 индуцируется путем добавления 5 мкМ доксициклина, и клетки культивируют в присутствии доксициклина в течение 24, 48, 72 и 96 ч (клоны HeLa клеток) или 24 и 48 ч (клоны клеток 293). Экспрессия протеина -S105 была подтверждена Вестерн блоттированием(см. пример 6). Окрашивание трипановым синим (см. пример 4) проводится в соответствии с инструкциями производителя (Sigma-Aldrich, Vienna, Austria). Для клеток HeLa (фиг. 8 А) и клеток 293 (фиг. 8 В),стабильно зараженных pUHD10.3-холин-Hygr, инкубирование с доксициклином в течение 96 ч приводит к снижению жизнеспособности клеток на 97-100% (фиг. 8, зачерненные квадраты, треугольники, кресты), в то время как для клеток HeLa и 293, в которых отсутствует вектор (фиг. 8. зачерненные ромбы), не обнаружена потеря жизнеспособности после обработки доксициклином. Это очевидное повреждение цитоплазматической мембраны, на которое указывает неспособность эксклюзии трипанового синего, может быть вызвано или апоптозом или некротической смертью клеток, опосредованной экспрессией -S105. Пример 9. Оценка эффекта Tet on/off регулированной экспрессии -S105 на жизнеспособность клеток эукариотических клеточных линий рака. Для того, чтобы получить совершенно строго регулируемую систему экспрессии для синтеза холинового протеина -S105 в эукариотических клетках рака, была разработана система Tet on/off вектора. С этой целью был создан ретровирусный вектор pLib-rtTA-M2-IRES-TRSID-IRES-Puror (фиг. 9), который основан на вирусе мышиной лейкемии (MLV), как описано в [68]. Вкратце, реверсивный Tet-регулированный трансактиватор (rtTA), вариант rtTA2-M2 с высокой степенью сродства, клонируют в модифицированный ретровирусный вектор pLIB (BD Biosciences, Heidelberg), который в последующем кодирует протеин Tet-репрессора, пополняющий гистондезацетилазу (TRSID) и ген пуромициновой резистентности (Puror). Каждая кодирующая область отделяется местом внутреннего входа рибосомы (IRES), что обеспечивает возможность одновременной трансляции всех трех протеинов из одной мРНК, которая запускается из ретровирусного промотора, расположенного в длинном терминальном повторе 5' (LTR). Векторы, сочетающие вариант rtTA высокой степени сродства (rtTA2-M2) с протеином TRSID, демонстрируют сильно сниженную текучесть, что делает их особенно пригодными для строго контролируемой экспрессии цитотоксичных генов. Клеточные линии карциномы шейки (HeLa) и молочной железы (MCF-7) человека, а также зародышевые клетки (293) почек были инфицированы вирусами рекомбинантных векторов, порожденных из амфотропных упаковочных клеточных линий, произведенных клетками 293 [71]. Выбранные популяции клеток были дополнительно заражены вектором pUHD10.3-холин-Hygr (фиг. 5), и в дальнейшем были исследованы одинарные клоны, экспрессирующие -S105 при стимулировании доксициклином. С этой целью высевают 3105 клеток MCF-7, или 1105 HeLa, или 2105 клеток 293 в каждую лунку/планшет с 6-лунками. На следующие сутки в среду клеточной культуры добавляют 5 мкг/мл доксициклина. Для клеток, которые были обработаны дексаметазоном больше чем в течение 24 ч, в культуральную среду ежедневно добавляют свежий дексаметазон и клетки выдерживают дополнительно в течение 24, 48, 72, 96 и 120 ч. В момент времени 144 ч все клетки одновременно собирают. Всплывающие и прилипшие клетки из каждой пробы объединяют и собирают вместе. Общее число клеток в лунке определяют, используя счетчик клеток CasyTT (Scharfe System GmbH, Reutlingen, Germany). Для оценки эффектов индуцированного синтеза -холинового протеина на жизнеспособность клеток осуществляют анализ МТТ (фиг. 10, верхняя панель) и эксклюзионный анализ с трипановым синим (фиг. 10, нижняя панель) (см. примеры 7 и 8). Долю погибших клеток (% жизнеспособности) определяют как отношение между доксициклининдуцированными и неиндуцированными клетками. В обоих анализах обнаружено сильное уменьшение жизнеспособности клеток при стимулировании экспрессии гена -S105 доксициклином во всех трех клеточных линиях (фиг. 10). Когда незасаженные клетки были обработаны доксицик- 21012120 лином, цитотоксичный эффект не был отмечен (фиг. 10, открытые символы). В зависимости от клеточных линий, наблюдается 90% смертность клеток между 48 и 96 ч экспрессии -S105, индуцированной доксициклином. Пример 10. Оценка влияния экспрессии гена -S105 на рост ксенотрансплантатов клеток опухоли человеческой молочной железы в иммунонекомпетентных SCID/бежевых мышах. Для оценки цитотоксичной активности кодированного -S105 холинового протеина in vivo вводят подкожную инъекцию 5106 клеток MCF-7, которые дают постоянное убежище Tet-регулированной плазмиде pUHD10.3-холин-Hygr кодирующей -холин, или соответствующий основной векторpUHD10.3-Hygr, в жировое тело молочной железы самок SCID/бежевых мышей (C.B-17/lcrHsdPrkcdsc/Lyst; Harlan-Winkelmann, Bochen, Germany). Величину опухоли измеряют калибром дважды в неделю в двух направлениях и объем опухоли рассчитывают в соответствии с формулой [1ww/2]. Через 37 суток после имплантации, когда объем опухоли вырос приблизительно до 50 мм 3, каждой мыши имплантируется таблетка, из которой в течение 90 суток медленно выделяются 1,7 мг 17-эстрадиола(Е 2) (Innovative Research, FL, USA), для того, чтобы дополнительно увеличить рост опухоли. После того,как опухоли выросли до пальпируемого размера (200 мм 3), животных разделили на две группы. Одной группе мышей давали орально доксициклин, растворенный в питьевой воде, содержащей 5% сахарозы,до конечной концентрации 2 мг/мл, в то время как другой группе давали питьевую воду, обогащенную сахарозой и не содержащую доксициклин. Животных лечили доксициклином в течение 32 суток. В конце эксперимента, или когда размер опухоли превышал 1800 мм 3, мышей умерщвляли и вскрывали. Скорости роста опухоли рассчитывали по среднему наклону кривых роста опухоли каждого индивидуального животного (фиг. 11). Существенное снижение скорости роста опухоли наблюдалось при сопоставлении обработанных доксициклином мышей, несущих pUHD10.3-холин-Hygr-зараженные клетки MCF-7, с животными, не обработанными доксициклином (фиг. 11 А. р=0,0424). Напротив, не наблюдались различия скоростей роста опухоли у животных, несущих MCF-7 клетки, зараженные родительским векторомpUHD10.3-Hygr в ответ на обработку доксициклином (фиг. 11 В). Пример 11. Эффект доксициклининдуцированной экспрессии гена -S105 на рост опухоли в изогенной модели аденокарциномы молочной железы мыши. Для оценки противоонкогенного потенциала -S105 кодированного холинового протеина в иммунокомпетентной модели были разработаны клетки аденокарциномы мышиной молочной железы (TSA),содержащие Tet on/off регулированную систему экспрессии pUHD10.3-холин-Hygr или родительский вектор pUHD10.3-Hygr. В жировое тело молочной железы изогенных мышей Balb/c вводили подкожную инъекцию 1106 клеток. Спустя 7 суток мышам ежедневно делали прививку доксициклина (50 мг/кг массы тела, внутрибрюшинно). Контрольные группы, состоящие из произвольно выбранных мышей, не получали доксициклин. Рост опухоли у всех животных регистрировали 2 раза в неделю и рассчитывали объем опухоли в соответствии с формулой [1ww/2] (фиг. 12 А). Как показано на фиг. 12 В, наблюдалось весьма существенное снижение роста опухоли (р=0,0012) при сравнении обработанных доксициклином животных, в которых нашли убежище клетки TSA, экспрессирующие -S105 (белый столбец), с животными, содержащими pUHD10.3-Hygr-зараженные клетки (черный столбец). Пример 12. Определение внутриклеточной локализации холинового протеина, кодированного S105, в эукариотических клетках с помощью субклеточного фракционирования. Для исследования субклеточной локализации -холинового протеина 1107 клеток HeLa, которые постоянно дают убежище Tet on/off регулированному вектору экспрессии pUHD10.3-холин-Hygr, выдерживают в течение 24 ч с 5 мкг/мл доксициклина. После обработки клетки осторожно соскребают из колбы с культурой и собирают путем центрифугирования с ускорением 250 g в течение 5 мин. Субклеточное фракционирование проводят, как описано в работе [70], с небольшими модификациями. Вкратце,клетки повторно суспендируют в 5 объемах ледяного буфера А, содержащего 20 ммоль/л (мМ) HepesKOH, рН 7,5, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТУК, 1 мМ EGTA, 1 мМ дитиотреитола (DTT), смесь ингибитора протеазы (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany) и 250 мМ сахарозы. После выдерживания клеток в течение 10 мин с целью набухания их подвергают лизису путем 15-20 проходов через иглу 25-го калибра и продукт гомогенизации промывают 5 раз ледяным буфером А за счет центрифугирования при 1000 g в течение 10 мин при 4 С, чтобы выделить ядра (фракция N). Жидкость над осадком центрифугируют при 10000 g в течение 15 мин при 4 С. Окончательные обогащенные митохондриями таблетки(фракция М) промывают 5 раз ледяным буфером А. Конечную жидкость над осадком используют в качестве цитозольной фракции (С). Разделяют 15-30 мкг клеточного экстракта цельного протеина (Т) и субклеточные фракции в пробе буфера Laemmli, содержащего 10% -меркаптоэтанола (Sigma-Aldrich,Deisenhofen, Germany), с помощью гель-электрофореза с додецилсульфатом натрия-полиакриламидом и анализируют путем Вестерн блоттирования (фиг. 13). Мембраны зондируют или поликлональной кроличьей антихолиновой антисывороткой, или антителами, обнаруживающими органелло-специфические маркерные протеины, такие как оксидаза цитохрома с (Cox IV) (1:50) (Eubio, Vienna, Austria), калнексин(1:50) (Becton Dickinson, Vienna, Austria), нуклеопорин (1:50) (Becton Dickinson, Vienna, Austria) и интегрин ос 2 (1:25) (Becton Dickinson, Vienna, Austria). В конечном счете, протеины детектируются по увели- 22012120 ченной хемилюминесценции (Amersham Biosciences). Было показано, что -холиновый протеин (фиг. 13 А) располагается в субклеточных фракциях, содержащих Сох IV (фиг. 13 В) и калнексин (фиг. 13 С), что указывает на его присутствие в митохондриях и эндоплазматической сети, соответственно. Во фракциях,содержащих ядра или цитоплазматические мембраны, не был обнаружен протеин HoNn, что определяется по наличию нуклеопорина (фиг. 13D) и интегрина ос 2 (фиг. 13 Е), соответственно. Цитированные ссылки 1 Aghi M., Hochberg F., Breakefield X.O.: Prodrug activation enzymes in cancer gene therapy. J. GenepTet-On - BD Biosciences-Clontech, pLTR-stp - [64], pVIII-S105 - [53], pLS105 - [54], pLib-rtTA-M2IRES-TRSID-IRES-Puror - [68], pcDNA3-hygr - Invitrogen, pEGFP-1 - BD Biosciences, pUHD-10.3 http://www2.cbm.uam.es/bc-015/sequences/pUHD/10-3.html, pUHD-10.3-холин - настоящего изобретения,pUHD-10.3-hygr - настоящего изобретения, pUHD-10.3-холин-hygr - настоящего изобретения, pMMTVхолин - настоящего изобретения, рМ MTVb.LTR - настоящего изобретения, pMMTVGFP - настоящего изобретения Нуклеотидная последовательность праймеров, идентификационный номер последовательности- 25012120 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение выделенного протеина, произведенного бактериофагом, в качестве лекарственного препарата для лечения пролиферативных заболеваний или нарушений, в котором произведенный бактериофагом протеин индуцирует активность, ингибирующую рост клеток или создающую эффект уничтожения клеток, в эукариотических клетках. 2. Применение в соответствии с п.1, в котором произведенный бактериофагом протеин представляет собой протеин, образующий канал типа альфа-спирали или, по меньшей мере, его функциональную часть или аналоги. 3. Применение в соответствии с п.1 или 2, в котором произведенный бактериофагом протеин представляет собой холин. 4. Применение в соответствии с пп.1-3, в котором произведенный бактериофагом протеин выбирают из группы, состоящей из протеина лямбда S105 и лямбда S107 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 03705), протеина Phi29 GP 14 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 11188), иммунитетного протеина фага Т 4 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 08986), протеина 13 фага Р 22 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 09962), протеина Y фага Р 2 ТМ (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 51773), М протеина фага PRD1 (SwissProt, инвентарный номер Р 27389), холинового протеина фага А 118 (Swiss-Prot, инвентарный номерQ37975), холинового протеина фага А 500 (Swiss-Prot, инвентарный номер Q37977), DPH холинового протеина фага Dp-1 (Swiss-Prot, инвентарный номер 003978), холинового протеина фага НР 1 (Swiss-Prot,инвентарный номер Р 51727), холинового протеина фага rlt (Swiss-Prot, инвентарный номер Q38134), лизисного протеина 17.5 фагов Т 7 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 03802) и T3 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 10307), NucE холинового протеина фага Р 2 Ogr (Swiss-Prot, инвентарный номер Q54418), холинового протеина, выделенного из Haemophilus somnus (Swiss-Prot, инвентарный номер Q48281), Р 10 протеина фага Phi-6 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 11127), протеина rV фага Т 4 (Swiss-Prot инвентарный номер Р 06808), Staphylococcus фага Phi-11 холина (Swiss-Prot, инвентарный номер Q38020) и холинаLactococcus фага Tuc2009 (Swiss-Prot, инвентарный номер Q38613). 5. Применение в соответствии с пп.1-4, в котором эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего и/или человека. 6. Применение в соответствии с пп.1-5, в котором произведенный бактериофагом протеин преобразуется в эукариотическую клетку с помощью вектора эукариотической экспрессии. 7. Применение в соответствии с п.6, в котором вектор эукариотической экспрессии представляет собой вирусный вектор, в частности ретровирусный вектор, более конкретно компетентный ретровирусный вектор репликации, ProCon или ReCon вектор. 8. Вирусный вектор экспрессии в соответствии с п.6 или 7, заключающий в себе и экспрессирующий из реально связанного регуляторного элемента последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую произведенный бактериофагом протеин, который индуцирует активность, ингибирующую рост клеток или создающую эффект уничтожения клеток, в эукариотических клетках, в котором произведенный бактериофагом протеин выбирают из группы, состоящей из протеина лямбда S105 и лямбда S107(Swiss-Prot, инвентарный номер P03705), протеина Phi29 GP 14 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 11188),иммунитетного протеина фага Т 4 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 08986), протеина 13 фага Р 22 (SwissProt, инвентарный номер Р 09962), протеина Y фага Р 2 ТМ (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 51773), М протеина фага PRD1 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 27389), холинового протеина фага А 118 (SwissProt, инвентарный номер Q37975), холинового протеина фага А 500 (Swiss-Prot, инвентарный номерQ37977), DPH холинового протеина фага Dp-1 (Swiss-Prot, инвентарный номер 003978), холинового протеина фага НР 1 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 51727), холинового протеина фага rlt (Swiss-Prot, инвентарный номер Q38134), лизисного протеина 17.5 фагов Т 7 (Swiss-Prot, инвентарный номер P03802) иT3 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 10307), NucE холинового протеина фага Р 2 Ogr (Swiss-Prot, инвентарный номер Q54418), холинового протеина, выделенного из Haemophilus somnus (Swiss-Prot, инвентарный номер Q48281), Р 10 протеина фага Phi-6 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 11127), протеина rV фага Т 4 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 06808), Staphylococcus фага Phi-11 холин (Swiss-Prot, инвентарный номер Q38020) и холина Lactococcus фага Tuc2009 (Swiss-Prot, инвентарный номер Q38613). 9. Вирусный вектор экспрессии, заключающий в себе и экспрессирующий из реально связанного регуляторного элемента протеин слияния с протеином, произведенным бактериофагом, который индуцирует активность, ингибирующую рост клеток или создающую эффект уничтожения клеток, в эукариотических клетках, в котором произведенный бактериофагом протеин выбирают из группы, состоящей из протеина лямбда S105 и лямбда S107 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 03705), протеина Phi29 GP 14(Swiss-Prot, инвентарный номер Р 11188), иммунитетного протеина фага Т 4 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 08986), протеина 13 фага Р 22 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 09962), протеина Y фага Р 2 ТМ(Swiss-Prot, инвентарный номер Р 51773), М протеина фага PRD1 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 27389), холинового протеина фага A118 (Swiss-Prot, инвентарный номер Q37975), холинового протеина фага А 500 (Swiss-Prot, инвентарный номер Q37977), DPH холинового протеина фага Dp-1 (Swiss-Prot,инвентарный номер 003978), холинового протеина фага НР 1 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 51727),- 26012120 холинового протеина фага rlt (Swiss-Prot, инвентарный номер Q38134), лизисного протеина 17.5 фагов Т 7(Swiss-Prot, инвентарный номер Р 03802) и T3 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 10307), NucE холинового протеина фага Р 2 Ogr (Swiss-Prot, инвентарный номер Q54418), холинового протеина, выделенного изHaemophilus somnus (Swiss-Prot, инвентарный номер Q48281), Р 10 протеина фага Phi-6 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 11127), протеина rV фага Т 4 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 06808), Staphylococcus фага Phi-11 холина (Swiss-Prot, инвентарный номер Q38020) и холина Lactococcus фага Tuc2009 (SwissProt, инвентарный номер Q38613). 10. Вирусный вектор экспрессии в соответствии с п.8 или 9, в котором вектор представляет собой вирусный вектор, в частности ретровирусный вектор, более конкретно компетентный ретровирусный вектор репликации, ProCon или ReCon вектор. 11. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая все элементы, маркеры, гены и включающая вирусный вектор экспрессии, в котором произведенный бактериофагом протеин выбирают из группы, состоящей из протеина лямбда S105 и лямбда S107 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 03705),протеина Phi29 GP 14 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 11188), иммунитетного протеина фага Т 4 (SwissProt, инвентарный номер Р 08986), протеина 13 фага Р 22 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 09962), протеина Y фага Р 2 ТМ (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 51773), М протеина фага PRD1 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 27389), холинового протеина фага А 118 (Swiss-Prot, инвентарный номер Q37975), холинового протеина фага А 500 (Swiss-Prot, инвентарный номер Q37977), DPH холинового протеина фагаDp-1 (Swiss-Prot, инвентарный номер 003978), холинового протеина фага НР 1 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 51727), холинового протеина фага rlt (Swiss-Prot, инвентарный номер Q38134), лизисного протеина 17.5 фагов Т 7 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 03802) и T3 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 10307), NucE холинового протеина фага Р 2 Ogr (Swiss-Prot, инвентарный номер Q54418), холинового протеина, выделенного из Haemophilus somnus (Swiss-Prot, инвентарный номер Q48281), Р 10 протеина фага Phi-6 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 11127), протеина rV фага Т 4 (Swiss-Prot, инвентарный номер Р 06808), Staphylococcus фага Phi-11 холина (Swiss-Prot, инвентарный номер Q38020) и холина Lactococcus фага Tuc2009 (Swiss-Prot, инвентарный номер Q38613). 12. Вирусная частица, содержащая вирусный вектор экспрессии в соответствии с любым из пп.8-10. 13. Эукариотическая клетка, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с пп.8-11. 14. Эукариотическая клетка в соответствии с п.13, способная продуцировать вирусные частицы в соответствии с п.12. 15. Способ введения последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с п.11 в эукариотическую клетку, причем указанный способ включает стадию трансдукции эукариотической клетки вирусным вектором по любому из пп.8-10; или инфицирования эукариотической клетки вирусной частицей по п.12. 16. Композиция, содержащая терапевтически эффективное количество вектора экспрессии в соответствии с любым из пп.8-10 и фармацевтически приемлемый носитель. 17. Композиция, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты по п.11 и фармацевтически приемлемый носитель. 18. Композиция, содержащая вирусную частицу по п.12 и фармацевтически приемлемый носитель. 19. Композиция, содержащая эукариотическую клетку по пп.13-14 и фармацевтически приемлемый носитель. 20. Композиция, содержащая выделенный протеин, произведенный бактериофагом, и/или протеин слияния с протеином, произведенным бактериофагом, который индуцирует активность, ингибирующую рост клеток или создающую эффект уничтожения клеток, и фармацевтически приемлемый носитель. 21. Композиция, содержащая вектор экспрессии в соответствии с любым из пп.8-10, капсулированный в пористой мембране, которая после приема внутрь пациентом обеспечивает выделение терапевтически эффективного количества указанного вектора экспрессии из капсулы, и фармацевтически приемлемый носитель. 22. Композиция, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты по п.11, капсулированную в пористой мембране, которая после приема внутрь пациентом обеспечивает выделение терапевтически эффективного количества указанной последовательности нуклеиновой кислоты из капсулы, и фармацевтически приемлемый носитель. 23. Композиция, содержащая вирусную частицу по п.12, капсулированную в пористой мембране,которая после приема внутрь пациентом обеспечивает выделение терапевтически эффективного количества указанной вирусной частицы из капсулы, и фармацевтически приемлемый носитель. 24. Композиция, содержащая эукариотическую клетку по пп.13-14, капсулированную в пористой мембране, которая после приема внутрь пациентом обеспечивает выделение терапевтически эффективного количества указанной эукариотической клетки из капсулы, и фармацевтически приемлемый носитель. 25. Композиция, содержащая выделенный протеин, произведенный бактериофагом, и/или протеин слияния с протеином, произведенным бактериофагом, капсулированный в пористой мембране, которая после приема внутрь пациентом обеспечивает выделение терапевтически эффективного количества ука- 27012120 занного выделенного протеина, произведенного бактериофагом, и/или указанного протеина слияния с протеином, произведенным бактериофагом, из капсулы, и фармацевтически приемлемый носитель. 26. Применение вектора экспрессии в соответствии с любым из пп.8-10, последовательности нуклеиновой кислоты по п.11, вирусной частицы по п.12, эукариотической клетки по пп.13-14, выделенного протеина, произведенного бактериофагом, протеина слияния с протеином, произведенным бактериофагом, который индуцирует активность, ингибирующую рост клеток или эффект уничтожения клеток,и/или композиции по пп.16-20 в качестве лекарственного препарата или для получения лекарственного препарата при лечении раковых заболеваний. 27. Способ лечения рака, который включает прием субъектом внутрь композиции по пп.16-25 в терапевтически эффективном количестве. Список последовательностей