Респираторно-синцитиальный вирус с перекрёстно компенсированным геномным дефицитом
Формула / Реферат
1. Вирион пневмовируса, включающий в себя вирусный геном, который имеет мутацию в гене, кодирующем белок прикрепления G или белок слияния F, или мутацию в обоих генах, причем указанные белки необходимы для инфекционности пневмовируса, причем мутация включает делецию последовательности, кодирующей указанный белок, или инактивацию указанного гена или такова, что указанный кодируемый белок является биологически неактивным, и вирион включает в себя указанный нативный белок в форме и в количестве, требуемых для инфекционности вириона.
2. Вирион по п.1, где пневмовирус представляет собой респираторно-синцитиальный вирус.
3. Вирион по п.1 или 2, в котором ген кодирует белок прикрепления G.
4. Вирион по любому из пп.1-3, в котором мутация приводит к тому, что вирус, продуцируемый только из вирусного генома, не имеет белка.
5. Вирион по п.1, в котором мутация включает в себя делецию последовательности, кодирующей белок.
6. Способ продуцирования пневмовирусного вириона, как он определен в любом из пп.1-5, где способ включает в себя стадии:
(a) инфицирования культуры первой клетки-хозяина пневмовирусом, содержащим вирусный геном, имеющий мутацию, как она идентифицирована в любом из пп.1-5, причем клетка-хозяин включает в себя экспрессирующий вектор, который направляет в клетке-хозяине экспрессию указанного нативного белка, как он определен в любом из пп.1-5; и
(b) получения вирионов из инфицированной культуры клеток-хозяев.
7. Способ по п.6, в котором продуцируется пневмовирус, применяемый для инфицирования культуры первой клетки-хозяина, где способ включает в себя стадии:
(а) предоставления второй клетке-хозяину одного или нескольких экспрессирующих векторов, которые направляют в клетке-хозяине экспрессию:
i) вирусной геномной РНК, имеющей мутацию в гене, кодирующем белок, необходимый для инфекционности (in vivo) пневмовируса, причем мутация приводит к тому, что вирус, продуцируемый только из вирусного генома, не имеет инфекционности, где мутация и белок являются теми, что определены в любом из пп.1-5;
ii) пневмовирусного полимеразного ферментного комплекса и, необязательно, одного или нескольких дополнительных вирусных белков; и
(b) культивирования второй клетки-хозяина, за счет чего продуцируются вирионы.
8. Способ по п.7, который дополнительно включает в себя амплификацию вирионов, продуцируемых второй клеткой-хозяином, путем одной или нескольких стадий дальнейшего инфицирования клеток, с использованием клеток-хозяев, которые являются такими же, что и вторая клетка-хозяин, или отличны от нее.
9. Способ по п.7 или 8, в котором вирусная геномная РНК транскрибируется с копии вирусной ДНК, которая находится под контролем промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага, и при этом предоставляется клетка-хозяин с экспрессирующим вектором, который направляет экспрессию ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага в клетке-хозяине.
10. Способ по п.9, в котором ДНК-зависимая РНК-полимераза бактериофага представляет собой полимеразу Т7, Т3 или SP6.
11. Способ по любому из пп.7-10, в котором ферментный комплекс пневмовирусной полимеразы, по меньшей мере, включает в себя белки L, Р, N.
12. Способ по пп.7-11, в котором один или несколько дополнительных вирусных белков являются мембранным белком матрикса пневмовируса, предпочтительно белком М2-1.
13. Способ по любому из пп.6-12, в котором пневмовирус является респираторно-синцитиальным вирусом.
14. Способ по любому из пп.6-13, в котором ген, кодирующий белок, необходимый для инфекционности, представляет собой ген, кодирующий белок прикрепления G.
15. Композиция, содержащая эффективное количество вириона по любому из пп.1-5 или вирион, который можно получить способом по любому из пп.6-14, и фармацевтически приемлемый носитель, такой как вода или буферный солевой раствор, в качестве лекарственного средства для предотвращения или лечения пневмовирусной инфекции.
16. Применение вириона по любому из пп.1-5 для производства лекарственного средства для профилактики или лечения пневмовирусной инфекции.
17. Применение по п.16, в котором лекарственное средство представляет собой препарат для интраназального введения.
18. Способ профилактики или лечения пневмовирусной инфекции, предусматривающий стадию введения субъекту композиции, содержащей вирион по любому из пп.1-5 в количестве, эффективном для профилактики или лечения инфекции.
19. Способ по п.18, в котором композицию вводят интраназально.
Текст
011878 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к области вакцинации, и более конкретно к вакцинам против заболевания, вызванного пневмовирусами, такими, например, как респираторно-синцитиальный вирус(RSV). Изобретение относится к вирионам RSV, несущим геном RSV, в котором инактивирован ген, существенный для инфекционности, в то время как соответствующий продукт гена дикого типа перекрестно дополняет вирион. Изобретение далее относится к способам продукции таких вирионов RSV и к их применению в вакцинах и способах вакцинации против пневмовирусов. Предшествующий уровень техники Респираторно-синцитиальный вирус человека классифицирован как род Pneumovirus, семействоParamyxoviruses. Он является основной причиной тяжелого заболевания нижних дыхательных путей детей, пожилых людей и субъектов с иммунодефицитом. Он также является важным фактором заболевания верхних дыхательных путей у старших детей и взрослых. В настоящее время в данной области нет доступной эффективной вакцины против h-RSV.RSV представляет собой оболочечный РНК-вирус, который экспрессирует два основных антигена на своей поверхности: белок прикрепления G и белок слияния F. Оба белка, как оказывается, индуцируют защитные антитела. G является детерминантой двух известных подгрупп h-RSV А и В. В двух группах имеется антигенное различие. G-белок характеризуется высокой степенью вариации лишь с 53% аминокислотной гомологией между группами А и В и до 20% различий в последовательностях белка G в пределах группы A (Mufson, 1988; Cane, 1991). Пассивная иммунизация обогащенным RSV иммуноглобулином (Respigam) или синтетическими гуманизированными моноклональными антителами против F (Palivizumab) в настоящее время применяется для лечения и защиты новорожденных при определенной предрасположенности (например, недоношенности) к инфекции RSV (Robinson, 2000, Greenough, 2000). Патология RSV имеет два основных аспекта: повреждение клеток, вызванное самим вирусом, и повреждение ткани, вызванное избыточной реакцией иммунной системы. Последнее является сильно осложняющим фактором при конструировании вакцин. Инфекции RSV являются сезонными, ограниченными зимним периодом и с пиком в северном полушарии примерно в конце года. RSV инфицирует каждого ребенка до 2 лет, во многих случаях дважды. Пожилые субъекты в среднем инфицируются раз в 2 года, в зависимости от условий; люди в близком контакте с младенцами и маленькими детьми имеют 50%-й риск. Вирус распространяется контактным путем, капельным путем или через контаминированные поверхности. RSV неэффективно распространяется через аэрозоли; вирусные частицы относительно нестабильны. Внутреннее распространение вируса из верхних дыхательных путей (URT) в нижние дыхательные пути (LRT) происходит преимущественно путем ингаляции вирусных частиц, продуцируемых в эпителии URT во время первичной инфекции. Распространение путем образования синцития (одного из патологических свойств вируса, откуда и происходит его название) не следует сбрасывать со счета, и оно может играть вторичную роль при инфекцииLRT. Обычно патология RSV начинается в URT; входными воротами являются нос и, в меньшей степени,глаза, а не рот. Когда заболевание ограничено тканями URT, оно ограничено обычной простудой, хотя у взрослых иногда и весьма тяжелой. Однако, когда вирус достигает LRT, у незащищенных субъектов могут развиться бронхиолит и пневмония. У маленьких детей это может представлять угрозу жизни, примерно 1/100 требуют госпитализации и механической вентиляции, из них 1% может погибнуть. У пожилых индуцированное RSV заболевание LRT может представлять собой основную причину госпитализации; полагают, что RSV вызывает 25% гриппоподобных заболеваний. Иммунный ответ в отношении RSV является комплексным. Обычно воздействие h-RSV создает ответ, который защищает от заболевания LRT. Данный ответ убывает в пожилом возрасте, вызывая более высокую чувствительность к RSV у пожилого населения. Эффективная длительная защита против заболевания URT оказывается невозможной: повторная инфекция обычна, даже в течение одного сезона, и это не вызвано изменчивостью вируса. В защите против инфекции RSV используются антитела против вирусных белков F и G, циркулирующие в крови, которые могут предотвращать заболевание LRT. Инфекция URT может контролироваться антителами против F и G, находящимися в слизистой, но они имеют ограниченное время жизни.CD8+ Т-клетки против не идентифицированных на данный момент вирусных белков требуются для удаления вируса из инфицированных тканей, но они оказываются короткоживущими или неэффективно рекрутируются из своих резервуаров. Более вероятно, это вызвано экспрессированными RSV факторами,возможно, кодируемыми G-геном (Srikiatkhachorn, 1997a). Важным аспектом заболевания RSV является иммунное усиление патологии. В ограниченных случаях клеточный иммунный ответ может обострять заболевание RSV под действием цитокинов, высвобождающихся из привлекаемых в избытке гранулоцитов, на инфицированные ткани. В данную реакцию вовлечена предрасположенность хозяина, но, возможно, также и время возникновения первой инфекцииRSV после рождения. Неожиданно ранние испытания вакцин с инактивированным формалином RSV показали, что в данных условиях вакцинации преобладала иммунно усиленная патология по сравнению с-1 011878 инфекцией дикого типа (Kim, 1969). Факторы, содержащиеся в RSV, как оказывается, ответственны за данный феномен и явно высвобождаются при обработке формалином. В течение 40 лет после этого было постепенно показано, что вирусный белок G является преобладающим медиатором данных проблем, но механизм остается неясным (Srikiatkhachorn, 1997b). В любом случае, вакцинация белком G без контекста вириона (т.е. в препаратах инактивированного вируса, в виде экспрессирующего продукта, надлежащим образом не встроенного в мембрану или в виде пептидов), как кажется, вызывает иммунное усиление в модельных системах. Таким образом, хотя G в некоторый степени вносит вклад в иммунитет против RSV, его свойства также осложняют конструирование вакцины. Первые живые вакцины-кандидаты против RSV включали в себя пассированные на холоде или чувствительные к температуре мутанты. Первые были аттенуированы путем культивирования при сниженной температуре, что приводит к зависимости от низких температур для роста, в то время как последние мутанты были получены, так что они зависят от специфичной, обычно высокой, температуры для репликации путем химического или радиационного мутагенеза. Такие живые вирусные вакцины-кандидаты оказываются либо недостаточно аттенуированными, либо чрезмерно аттенуированными (Crowe, 1998). Субъединичные вакцины-кандидаты происходят из RSV-F или из G-белка, причем они являются основными мишенями для нейтрализующих антител. Субъединичная вакцина-кандидат PFP2, очищенный F-белок, является безопасной для RSV-серопозитивных пациентов, но не обеспечивает полной защиты против инфекции LRT и ассоциированного заболевания (Gonzalez, 2000). Другим подходом к субъединичной вакцине является BBG2Na, которая состоит из полипептида, содержащего аминокислоты 130-230 h-RSV-G, слитого с альбуминсвязывающим доменом стрептококкового белка G (Power, 1997).BBG2Na индуцирует ответ Т-хелперов типа 2 у новорожденных мышей и не характеризуется иммунопатологией легких (Siegrist, 1999). Пока не имеется данных по протекции. Применение новых адъювантов для сбалансированного гуморального и клеточного иммунного ответа в настоящее время исследуется на экспериментальных животных (Plotnicky, 2003). Применение векторов на основе плазмидной ДНК, кодирующих антигены RSV-F и -G, в качестве вакцин-кандидатов исследовано на экспериментальных животных. Данные вакцины индуцируют протективные реакции у грызунов (Li, 2000), но в одном исследовании мыши, иммунизированные ДНК-вакциной-кандидатом на основе RSV-F, характеризовались слегка усиленной воспалительной реакцией в легких после стимуляции вирусом дикого типа (Bembridge, 2000). Возможность применения плазмидных ДНК-вакцин у людей пока не известна, и, вероятно, потребуется по меньшей мере 15 лет до того, как данный подход будет достаточно исследован и, что более важно, принят, особенно для новорожденных. Вакцины-кандидаты, основанные на векторных системах доставки, сконструированы из живых рекомбинантных векторов, экспрессирующих белки RSV. Например, рекомбинантный вирус коровьей оспы, экспрессирующий RSV-F и -G, обеспечивал защиту у мышей, но не имел данного эффекта у шимпанзе(Collins, 1990). Вопрос в том, безопасны ли данные системы (в частности, вирус коровьей оспы) и могут ли они использоваться в свете существующих (материнских) антител против поксвирусов в популяции при том, что основной целевой группой являются новорожденные. Некоторые вакцины-кандидаты основаны на рекомбинантном живом RSV, полученном путем обратной генетики. Одно из направлений исследований сконцентрировано на аттенуировании данных вирусов путем введения отдельной или комбинированных мутаций, ответственных за адаптацию к холоду и чувствительность к температуре рекомбинантного вируса. Ни одна из данных вакцин не была подходящей из-за избыточного или недостаточного аттенуирования. Другое направление исследований сконцентрировано на делеции одного или нескольких вирусных неструктурных генов. Доступны ограниченные данные по поведению данных вирусов в модельных системах (Jin, 2003). Альтернативным подходом к разработке вакцин против RSV является применение бычьего RSV. Химерный бычий RSV с человеческим F-белком или с человеческими белками F и G оценивали на предмет его эффективности у шимпанзе. Данная вакцина-кандидат была ограничена по репликации до такой степени, что животные оказывались незащищенными после стимуляции h-RSV дикого типа (Buchholtz,2000). Таким образом, в настоящее время не имеется эффективной вакцины против h-RSV, доступной в данной области. Все вакцины-кандидаты против RSV, которые были тестированы на экспериментальных животных, не могут быть использованы на человеке. Так, в данной области имеется длительная потребность в вакцинах RSV, которые эффективны и безопасны, и целью настоящего изобретения является предоставление таких вакцин. Описание изобретения Определения В данном документе и в формуле изобретения "включать в себя" означает, что объекты, следующие за этим выражением, включены, в то время как объекты, не указанные конкретно, не исключены. Кроме того, ссылка на единственное число не исключает возможности присутствия нескольких элементов, кроме случаев, когда контекст явно требует, чтобы элемент присутствовал в единственном числе. Таким образом, единственное число обычно означает "по меньшей мере один". Используемый здесь термин "вирион" относится к вирусной частице, которая содержит нуклеокап-2 011878 сидный белок, вирусный геном и репликазный комплекс в липидной оболочке, который содержит вирусные структурные гликопротеины. Термины "инфекционность вируса", "инфекционный вирус", "инфекционная вирусная частица" или"инфекционный вирион" означают вирусы, вирусные частицы или вирионы, которые способные проникать в подходящие клетки-хозяева и инициировать цикл репликации вируса, независимо от того, приводит ли это к продукции инфекционного вируса или нет. Подробное описание изобретения В первом аспекте настоящее изобретение относится к вириону пневмовируса. Вирион включает в себя вирусный геном, который имеет мутацию в гене, кодирующем белок, необходимый для инфекционности пневмовируса, при этом мутация приводит к тому, что вирус, продуцируемый только из вирусного генома, не характеризуется инфекционностью, и при этом вирион содержит данный белок в форме и количестве, которое требуется для инфекционности вириона. Пневмовирус предпочтительно представляет собой респираторно-синцитиальный вирус (RSV), более предпочтительно человеческий или бычий RSV. Человеческий RSV может быть вирусом подгруппы А или В и предпочтительно представляет собой клинический изолят, более предпочтительно изолят, который не подвергался интенсивному пассированию in vitro (предпочтительно пассирован менее 10, 8, 6 или 5 раз, как описано в примерах). Поэтому любой штамм или изолят RSV может использоваться в контексте настоящего изобретения, при этом понятно, что изобретение лишь иллюстрируется посредством конкретного человеческого изолята RSV 98-25147-Х, обозначенного как изолят RSV X. Далее предпочтительно, чтобы вирус представлял собой недавний клинический изолят, причем недавний определяется как впервые выделенный менее чем 10, 8, 6, 4, 3 или 2 года тому назад. Следует понимать, что, хотя нуклеотидные последовательности в вирионе не обязательно должны соответствовать недавнему изоляту,предпочтительно, чтобы аминокислотные последовательности белков, присутствующих в вирионе согласно изобретению, были идентичны белкам, встречающимся в недавнем клиническом изоляте. Вирусный геном включает в себя по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном вирусном гене, кодирующем белок, необходимый для инфекционности пневмовируса, при этом инфекционность вируса определяется, как определено выше. Таким образом, белок, необходимый для инфекционности пневмовируса, представляет собой белок, необходимый для способности вириона согласно изобретению проникать в подходящую клетку-хозяин и инициировать цикл репликации вируса, при этом цикл репликации не обязательно приводит к продукции новых инфекционных вирионов. В предпочтительных вирионах согласно изобретению мутация вызывает неспособность вирионов к инфекционностиin vivo, т.е. в подходящем организме-хозяине, при этом вирионы могут оставаться инфекционными для подходящих клеток-хозяев, культивируемых in vitro. В предпочтительном вирионе согласно изобретению мутантный ген, кодирующий белок, необходимый для инфекционности пневмовируса, представляет собой ген, кодирующий структурный белок вируса. Структурный белок пневмовируса понимается здесь как белок, который присутствует в вирионах инфекционного вируса дикого типа. Предпочтительные гены, кодирующие структурные белки, подлежащие мутации в вирионах согласно изобретению, представляют собой гены, кодирующие белок присоединения G и/или белок слияния F, причем белок G является наиболее предпочтительным. Делеция и/или функциональная инактивация гена, кодирующего белок G, служит нескольким целям и предотвращает некоторое количество проблем и осложнений современных вакцин-кандидатов против RSV. Одной из целей является безопасность вакцины: RSV без белка G является высокоаттенуированным в своем хозяине (Karron, 1997; Schmidt, 2002), поскольку он не будет иметь возможности эффективно инфицировать клетки-хозяева. Одним из осложнений является то, что белок G сильно вовлечен в индукцию нежелательных иммунологических реакций, включая усиление иммунопатологии (Alwan, 1993,Srikiatkhachorn, 1997b) и возможное смещение иммунного ответа в направлении состояния аллергии (и астмы) при некоторой генетической предрасположенности (Openshaw, 2003; Peebles, 2003). Это может предотвращаться делецией или инактивацией гена G. Пневмовирусный вирион согласно изобретению,включающий в себя вирусный геном, который имеет инактивирующую мутацию в гене, кодирующем белок присоединения G, и включающий в себя белок присоединения G в форме и в количестве, которые требуются для инфекционности вириона, обозначается как "G+G" (пневмо)вирус или вирион. Сходным образом, вирион, который имеет инактивирующую мутацию в гене, кодирующем белок присоединенияG, но который перекрестно не компенсирован функциональным количеством белка G, обозначается как"G" (пневмо)вирус или вирион. Таким образом, пневмовирусные вирионы согласно изобретению временно и функционально восстанавливаются кодируемым вне вируса белком, который необходим для инфекции. Предпочтительно,если кодируемый вне вируса белок, необходимый для инфекции, представляет собой белок присоединения G и/или белок слияния F, при этом белок G наиболее предпочтителен. Предпочтительно, чтобы кодируемый вне вируса белок, необходимый для инфекции, соответствовал по вирусной подгруппе (А или В) гену, который присутствует в вирионе. Более предпочтительно, если кодируемый вне вируса белок,необходимый для инфекции, гомологичен геному, который присутствует в вирионе, при этом подразу-3 011878 мевается, что белок имеет ту же аминокислотную последовательность, что и аминокислотная последовательность, кодируемая в геноме вируса перед его инактивацией. Альтернативно, это может означать, что кодируемый вне вируса белок имеет ту же аминокислотную последовательность, которая присутствует в вирионах дикого типа, в которых аминокислотные последовательности с одним или несколькими кодируемыми внутри них белками имеют 100% идентичность в отношении соответствующих им белков в вирионе согласно изобретению. В вирионах согласно изобретению мутация в гене необходимого структурного белка представляет собой мутацию, которая приводит к тому, что вирус, продуцируемый только из одного вирусного генома, не имеет данного белка или экспрессирует биологически неактивированный белок. Продукция вируса только из вирусного генома, как понимается, означает вирус, продуцируемый исключительно из вирусного генома, присутствующего в вирионах и в отсутствие какой-либо кодирующей последовательности, перекрестно дополняющей вирусный геном. Вирусный геном, присутствующий в вирионах, таким образом, не может направлять экспрессию необходимого вирусного белка. Это может достигаться различными путями, известными специалисту, включая, например, инактивацию кодона инициации трансляции, введение стоп-кодонов вблизи N-конца кодируемого белка, одну или несколько мутаций со сдвигом рамки считывания, делецию из гена одного или нескольких фрагментов. Предпочтительно, когда ген инактивируется делецией по меньшей мере 10, 20, 50, 75, 90 или 95% последовательности, кодирующей необходимый структурный белок. Наиболее предпочтительным, однако, является вирион, в котором мутация включает в себя делецию (целой) последовательности, кодирующей белок. В объем изобретения однозначно включены вирионы, в которых присутствует более одной мутации. В частности, несколько генов, кодирующих вирусный белок, могут включать в себя мутации, которые инактивируют или изменяют функцию интересующего белка или которые вызывают отсутствие белка в вирионах, как описано выше. Например, мутации, связанные с пассированием на холоде или чувствительностью к нагреванию, известные в данной области, могут комбинироваться с инактивацией необходимых структурных белков, описанных согласно изобретению выше. Клиренс пневмовирусов, подобных RSV, из инфицированного организма-хозяина требует надлежащего клеточного иммунитета, который не сможет эффективно развиться без инфицирования эпителиальных клеток вирусом. Однако мутантные пневмовирусы согласно изобретению не имеют генетической информации для белка, необходимого при инфекции клеток-хозяев in vivo. Поэтому настоящее изобретение относится к способам продукции мутантных пневмовирусов, которые включают в себя репликацию мутантных пневмовирусов в клетках, которые компенсируют (перекрестно) отсутствие белка, необходимого для инфекции. Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к способу продуцирования определяемых выше мутантных пневмовирусных вирионов. Способ представляет собой способ продуцирования пневмовирусных вирионов, при этом вирионы включают в себя вирусный геном, который имеет мутацию в гене, кодирующем белок, необходимый для инфекционности (in vivo) пневмовируса, при этом мутация приводит к тому, что вирус, продуцируемый только из вирусного генома, не характеризуется инфекционностью, и при этом вирион содержит данный белок в форме и количестве, которое требуется для инфекционности вириона. Способ включает в себя стадии: (а) инфицирования культуры первой клеткихозяина пневмовирусом, содержащим вирусный геном, который имеет определенную выше мутацию,при этом клетка-хозяин включает в себя экспрессирующий вектор, который временно или постоянно направляет экспрессию в клетке-хозяине белка в форме и в количестве, которое требуется для инфекционности вириона; и (b) получения вирионов из инфицированной культуры клетки-хозяина. Получение вирионов из инфицированной культуры клетки-хозяина может включать в себя получение из культуральной среды, или получение из клеток, или и то, и другое. Первая клетка-хозяин может представлять собой любую клетку-хозяин, в которой пневмовирус способен к репликации, с одновременной перекрестной экспрессией белка, который требуется для инфекционности вириона. Подходящие клетки-хозяева для данной цели представляют собой, например,клеточные культуры почки африканской зеленой мартышки (такие, например, как Vero, лот ЕСАСС 1087, 134 пассаж, 1990, одобренные ЕМЕА). В предпочтительном способе изобретения пневмовирус, который применяется для инфицирования культуры первой клетки-хозяина, продуцируют способом, включающим в себя стадии: (а) предоставления второй клетке-хозяину одного или нескольких экспрессирующих векторов, которые направляют в клетке-хозяине экспрессию (i) вирусной геномной РНК, которая имеет мутацию в гене, кодирующем белок, необходимый для инфекционности пневмовируса (in vivo), при этом мутация приводит к тому, что вирус, продуцируемый только из вирусного генома, не характеризуется инфекционностью, и (ii) пневмовирусного полимеразного ферментного комплекса и необязательно одного или нескольких дальнейших вирусных белков; и (b) культивирования второй клетки-хозяина, за счет чего продуцируются вирионы. В предпочтительном способе вирионы, продуцируемые второй клеткой-хозяином, амплифицируют одной или несколькими дальнейшими стадиями инфекции клеток с использованием клеток-хозяев, таких же или отличающихся от вторых клеток-хозяев. Вторая клетка-хозяин может представлять собой любую клетку-хозяин, в которой пневмовирус-4 011878 способен к репликации с одновременной перекрестной экспрессией белка, который требуется для инфекционности вириона, или без нее. Подходящие для данной цели клетки-хозяева представляют собой,например, клеточные культуры почки африканской зеленой мартышки (такие, например, как клеткиVero, лот ЕСАСС 10-87, 134 пассаж, 1990, одобренные ЕМЕА) или клетки Нер-2. Вторая клетка-хозяин может быть такой же, как и первая клетка-хозяин, или может отличаться от нее. В способах согласно изобретению вирусная геномная РНК транскрибируется из копии вирусной ДНК, которая находится под контролем промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага, и за счет этого (второй) клетке-хозяину предоставляется экспрессирующий вектор, который направляет экспрессию в данной клетке-хозяине ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага. Предпочтительно,когда ДНК-зависимая РНК-полимераза бактериофага представляет собой полимеразу Т 7, Т 3 или SP6. Ферментный комплекс пневмовирусной полимеразы, который экспрессируется из одного или нескольких экспрессирующих векторов во второй клетке-хозяине, по меньшей мере, включает в себя белкиL, P, N, экспрессированные с их соответствующих генов или кДНК, в экспрессирующих векторах. Для усиленной эффективности вирусной сборки и упаковки голой вирусной геномной РНК один или несколько дальнейших вирусных белков необязательно экспрессируются во вторых клетках-хозяевах. Предпочтительные вирусные белки для данной цели включают в себя белки вирусной матриксной мембраны, из которых белок М 2-1 является особенно предпочтительным. Белки L, P, N, M2-1, G или F предпочтительно происходят из вирусного генома вирусного изолята, который введен и экспрессирован в клетке-хозяине, но альтернативно также могут использоваться гомологичные белки из других гетерологичных вирусных или невирусных источников. Специалисту в данной области понятно, что различные экспрессирующие векторы и регуляторные последовательности (такие, как промоторы) доступны в данной области для экспрессии вирусной геномной РНК, ДНК-зависимой РНК-полимеразы, ферментного комплекса пневмовирусной полимеразы и необязательных дальнейших вирусных белков, а также необходимого структурного белка, в первых и/или вторых клетках-хозяевах (см., например, Sambrook and Russell (2001) "Molecular Cloning: A LaboratoryManual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Для обратной генетики РНК-вирусов, т.е. экспрессии рекомбинантного РНК-вируса, такого как вирионы согласно изобретению, кДНК-копию вирусной геномной РНК клонируют в плазмиды и помещают под контроль последовательностей, которые обеспечат синтез РНК с ДНК в некоторых условиях. Обычно промоторную последовательность РНК-полимеразы бактериофага (например, РНК-полимеразы Т 7) помещают выше ДНК-копии РНК-генома, в то время как подходящий терминатор для РНК-полимеразы помещают ниже генома. Последовательности саморасщепляющегося рибозима помещают выше терминаторных последовательностей для обеспечения синтеза РНК с правильными терминальными нуклеотидами. Правильные терминальные последовательности, в основном, требуются для высвобождения вируса из синтетической РНК. Для несегментированных РНК-вирусов с отрицательной цепью совместная экспрессия полимеразного ферментного комплекса (белки N, Р и L для парамиксовирусов) с геномной или антигеномной РНК требуется для получения рекомбинантного вируса (подвергнуто обзору Neumann,2002, и иллюстрировано здесь примерами). Другие предпочтительные способы могут включать в себя любую дальнейшую стадию выделения и/или очистки вирионов согласно изобретению и/или составление с использованием данных вирионов фармацевтических композиций. Способы выделения и/или очистки вирионов хорошо известны специалистам-вирусологам. Такие способы, например, включают в себя различные способы центрифугирования(например, дифференциальное центрифугирование или центрифугирование в градиенте плотности) или способы хроматографии. Способ введения вирионов согласно изобретению в фармацевтическую композицию, по меньшей мере, включает в себя стадию смешивания вирионов с фармацевтически приемлемым носителем, определяемым ниже. В дальнейшем аспекте изобретение относится к композиции, содержащей описанный выше вирион или вирион, полученный определяемым выше способом, и фармацевтически приемлемый носитель. Композиция предпочтительно представляет собой фармацевтическую композицию, которая предпочтительно подходит для применения в качестве вакцины, т.е. композиция предпочтительно представляет собой вакцину. Еще в одном аспекте изобретение относится к фармацевтическому препарату, содержащему в качестве активного ингредиента вирион согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые стабилизирующие средства, осмотические средства, буферные средства,диспергирующие средства и т.п. также могут включаться в фармацевтические композиции. Предпочтительная форма зависит от предназначенного пути введения и терапевтического применения. Фармацевтический носитель может представлять собой любое совместимое нетоксичное вещество, подходящее для доставки восстановленных вирусных мембран пациенту. Примерами фармацевтически приемлемых носителей для интраназальной доставки являются вода, буферные солевые растворы, глицерин, полисорбат 20, кремофор EL и водная смесь каприлового/капринового глицерида и может забуфериваться с предоставлением окружающей среды с нейтральным рН. Для введения путем ингаляции фармацевтические композиции согласно изобретению подходящим-5 011878 образом доставляются в виде аэрозольного спрея из упаковок под давлением, или небулайзера, где вирионы присутствуют в носителе, как описано для интраназальной доставки, но с применением подходящей сжатой жидкости для распыления, например дихлордифторметана, трихлортрифторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением дозированная единица может определяться предоставлением клапана для доставки отмеренного количества. Способы получения интраназальной или ингалируемой композиции хорошо известны в данной области и более подробно описаны в различных источниках, включая, например, Remington's PharmaceuticalScience (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980) (включен сюда полностью в качестве ссылки). Вирионы могут, таким образом, вводиться в качестве активных компонентов в любой препарат для вакцинации, который может, например, включать в себя носители, адъюванты, стабилизаторы, солюбилизаторы, консерванты и другие наполнители, известные в данной области, для обеспечения или для способствования эффективному введению препарата для вакцинации субъектов, предпочтительно человека и домашних или сельскохозяйственных животных (таких, как коровы, свиньи, лошади, козы, овцы). В дальнейшем аспекте изобретение относится к способу вакцинации против пневмовирусной инфекции или для профилактики или терапии (профилактика или лечение) путем введения терапевтически или профилактически эффективного количества вирионов (или фармацевтической композиции, содержащей вирионы) согласно изобретению, описанных выше, или вирионов, которые можно получить, как описано выше, субъекту нуждающемуся в профилактике или терапии. Предпочтительно, если вирионы вводят интраназально. Изобретение, сходным образом, относится к описанным выше вирионам согласно изобретению или к вирионам, которые можно получить, как описано выше, для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно средства для вакцинации против пневмовирусной инфекции или для ее профилактики или лечения. Изобретение далее относится к применению вирионов согласно изобретению в производстве лекарственного средства для вакцинации против пневмовирусной инфекции или для ее профилактики или лечения. Предпочтительно, когда лекарственное средство представляет собой препарат для интраназального введения. Композиции, включающие в себя вирионы согласно изобретению, для вакцинации предпочтительно вводятся интраназально подходящим хозяевам. В одном из вариантов осуществления телят следует защитить от инфекции b-RSV. Еще в одном варианте осуществления людей, предпочтительно детей и пожилых лиц или лиц с иммунодефицитом, защищают от инфекции h-RSV. Препараты предпочтительно включают в себя препараты, подходящие для введения в виде интраназальных капель или спрея, предпочтительно назального спрея. G+G-пневмовирусные частицы в композиции инфицируют эпителиальные клетки верхних дыхательных путей только один раз, поскольку вирионы второго поколения, продуцируемые из исходно инфицированных эпителиальных клеток URT, не имеют белок присоединения G,кодирующая последовательность которого была удалена из генома. Поэтому данные G-вирионы не являются инфекционными in vivo в организмах-хозяевах. Однако исходный единичный цикл инфекции обеспечивает развитие соответствующего клеточного иммунитета, который способен к ответу и клиренсу инфекции дикого типа, которые развиваются против пневмовируса, или против RSV, в частности, в то время как защитные антитела против F, т.е. антитела, которые будут предотвращать инфекцию нижних дыхательных путей, будут индуцироваться вакциной и неинфекционным потомством. Антитела против F эффективны в ограничении инфекции RSV, как показано за счет эффективности лечения Palivimuzab,который представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против F. Это является основой эффективности рекомбинантных живых аттенуированных пневмовирусных вакцин согласно изобретению. Данные живые вирусные вакцины решают несколько проблем, ассоциированных с современными вакцинами-кандидатами против пневмовирусов. Присутствие G-белка в его природном контексте в вирионе обеспечивает развитие подходящего клеточного иммунитета, в то время как нежелательные эффекты иммунитета против выделенного G-белка, который большей частью отвечает за усиление иммунного ответа при патологии b-RSV и h-RSV у крупного рогатого скота и человека, соответственно, предотвращаются. Описание фигур Фиг. 1. Диаграмма конструирования pRSVXG. Верхняя линия соответствует геномной РНК-изоляту RSV X с указанными генами. Нижние четырехугольники соответствуют продуктам ОТ-ПЦР и олигонуклеотидным дуплексам, использованным для конструирования. Числа внутри четырехугольников означают номера олигонуклеотидов. Указаны включенные для клонирования сайты рестрикции. Окончательная схема клонирования приведена ниже: окружности - это плазмиды, а стрелки показывают последовательность клонирования. Фиг. 2. Выравнивания показывают различия между последовательностями изолята RSV X иpRSVXG. Последовательности показаны как выравнивание геномного направления. Для pRSVXG показаны нуклеотидные отличия только от изолята RSV X. Подобные последовательности показаны точками (.) и пробелами (-). Сигналы генного старта подчеркнуты одной линией, гены стоп-сигналов подчеркнуты двойной линией, и гены указаны в заголовках. Контуры четырехугольников включали участки-6 011878 узнавания рестриктаз, полученных из нуклеотидных замен. Фиг. 3. Определение маркеров последовательностей в продуктах амплификации RSV с помощью ОТ-ПЦР с расщеплением: a) MluI, b) XmaI, c) SexA-I, d) SnaB-I. Фиг. 4. Графики роста изолята RSV X и изолята G-RSV X. Vero (сплошные линии) и Нер-2 (пунктирные линии) клетки инфицировали вирусом с MOI=0,1 и инкубировали при 37 С. За указанное время колонии клеток собрали и определили титры CCID50 в клетках Vero. Табл. 1. Праймеры, использованные для диагностической ОТ-ПЦР на РНК из RSV, инфицировавшего Vero клетки. Табл. 2. Результаты экспериментов иммунизации хлопковых крыс, защита против инфицированияRSV и RSV-индуцированной патологии с помощью иммунизации изолятом G-RSV X. Примеры Данное изобретение проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами, которые применяются для иллюстрации конкретных вариантов изобретения и не предназначены для ограничения общего объема или какого-либо аспекта изобретения. Пример 1. Вирусный изолят, выделение, размножение и хранение вируса. Основой для рекомбинантного клона h-RSV является клинический изолят RSV, полученный из диагностической лаборатории Медицинского Центра Лейденского Университета. Этот вирус, названный 98-25147-Х, закодированный после пациента, от которого он был выделен, получили в диагностическом тесте на клетках Нер-2 за период 21-24 декабря 1998. Впоследствии его определили как изолят подтипа А и назвали изолят RSV X. Вирус пересаживали 4 раза на клетках Нер-2 во флаконах Т 75 в DMEM(Gibco), 10% FCS, pen/strep/glu и затем 5 раз на клетках Vero во флаконах Т 75 на DMEM (Gibco), 10%FCS, pen/strep/glu. Полученный вирусный изолят RSV X использовали как рабочий маточный раствор и хранили при -135 С в 25 или 45% сахарозе. Пример 2. Конструирование кДНК RSV-X, кодирующей вирусный геном. Общую РНК получили с помощью экстракции фенолгуанидинизотиоцианатом (Trizol, Invitrogen) матричного изолята RSV X, инфицировавшего Vero клетки. кДНК получили с помощью обратной транскрипции, используя Thermoscript (Invitrogen) обратную транскриптазу с применением случайных гексамерных праймеров. Эту кДНК использовали как матрицу для ПЦР с применением высокоточной Taq полимеразы (Invitrogen), используя специфические праймеры, содержащие участки узнавания рестриктаз. Праймеры конструировали на основании опубликованных последовательностей RSV-A2 (инвентарный номер Genbank M74568) and RSV-RSS2 (инвентарный номер Genbank U39662). Продукты ПЦР вначале были по отдельности клонированы в различные векторы: пары праймеров,векторы, участки распознавания рестриктаз и названия полученных векторов приведены ниже.RSV014/RSV015: PUC21, Kpn I/Mlu I, pUK2 (L область). Секвенировали по меньшей мере два отдельных клона, полученных из двух независимых матриц кДНК; участки, содержащие отличия между двумя клонами, секвенировали в третьем клоне. При необходимости клоны восстанавливали, используя стандартные молекулярно-биологические технологии, известные специалистам в данной области. Были получены и секвенированы дополнительные ПЦР-продукты, покрывающие участки связывания праймеров, использованных для клонирования. 5'-геномные концы определяли с помощью полиаденилирования геномной РНК, следующей за ОТ-ПЦР с олиго(d)Т, содержащей праймер ALG018: TTAAAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT, и NS1 генный праймер RSV 126:AATTCTGCAGGCCCATCTCTAACCAAAGGAGT. Этот фрагмент клонировали в pUC21, используя HindIII/PstI. 3'-Конец определили с помощьюRACE (быстрая амплификация концов кДНК) лигирующей ПЦР. Все последовательности собрали для получения согласованной последовательности RSV-X (Seq ID No. 1). Все последовательности были подтверждены с помощью секвенирования путем циклов ПЦР с использованием набора BigDye terminator (Applied Biosystems) и проанализированы с помощью генетического анализатора ABI Prism310. Пример 3. Конструирование полноразмерной плазмиды изолята G-RSV X. Полноразмерная кДНК, охватывающая весь геном изолята RSV X, была сконструирована с помощью последовательного лигирования ПЦР-фрагментов (фиг. 1). "Trailer" конец начинали с промотора для полимеразы Т 7 бактериофага. Для получения корректного 3'-конца "лидирующий" конец кДНК соединяли с рибозимом вируса гепатита дельта (HDVR), следующим за терминатором транскрипции Т 7 РНК полимеразы (см. фиг. 1). Во-первых, два положения комплементарных олигомеров, кодирующих HDVR, и Т 7 терминаторные RSV026/RSV027 олигомеры и RSV028/029 олигомеры фосфорилировали Т 4 ДНК киназой, гибриди-7 011878 зовали и лигировали в клон pUK1 (содержащий гены NS1/NS2) с помощью RsrII/NotI, дающего плазмидуXma I/SexA I. Эта плазмида (pUK6) содержит область от гена N до 3'-лидирующей последовательности,соединенной с HDVR и Т 7 терминатором. Во-вторых, Xma I/Eco RV фрагмент плазмиды рСАР 3 вставили в плазмиду pUK5, используя Xma I и заполненный Hind III участок. В результате получили плазмиду pUK8. Затем pUK 8 расщепили BssH II и BsiW I, концы были заполнены полимеразой Klenow и вновь лигированы. Эта плазмида содержит гены М 2-2, М 2-1, F, SH, М и Р и называется pUK9. Для синтеза низкокопийного количества вектора для кДНК изолята RSV X два комплементарных олигомера RSV011: AGCTTGCGGCCGCGTCGACCCGGGACGCGTCGATCGGGTACCAT, и RSV012:CGATGGTACCCGATCGACGCGTCCCGGGTCGACGCGGCCGCA, фосфорилировали Т 4 ДНК киназой,гибридизовали и вставили в плазмиду pACYC184 (New England Biolabs), обработанную щелочной фосфатазой и расщепленную Cla I/Hind III. Полученную плазмиду назвали pACYC18 4-MCS. Затем вставили фрагмент Mlu I-Knp I плазмиды pUK2, содержащий Т 7 промотор и L ген, эту промежуточную плазмиду назвали pACYC1. Затем область от N гена до 3'-лидирующей последовательности, включающую соединенные HDVR и Т 7 терминаторную последовательность pUK6, добавили к pACYC1, используя Xma I/Not I. Получилась промежуточная плазмида pACYC2. В завершение, Xma I/Mlu I фрагмент pUK9, содержащий М 2-2, М 2-1, F, SH, М и Р гены, вставили в pACYC2, получив плазмиду pACYC3, включающую целый геном RSV штамма X без G гена. Анализ последовательности последней плазмиды выявил делецию вHDVR области, которая была репарирована, и полученную плазмиду назвали pRSVXG. В дополнение к конструированию pRSVXG, сконструировали pACYC24, в которой вставку геномного изолята RSV X комплементарно перевернули с помощью обратной ПЦР. Из этой конструкции может быть синтезирована антигенная RSV РНК. В pACYC24 T7 промотор предваряет 3'-лидирующую последовательность, в то время как HDVR и Т 7 терминатор присоединены к 5'-trailer последовательности. Все участки узнавания рестриктаз, использованные для конструирования pRSVXG, локализованы внутри RSV интергенных областей и не изменяют кодирующие последовательности или affect сигналы транскрипции (как показано на фиг. 2). Пример 4. Конструирование вспомогательных плазмид. Вспомогательные плазмиды, экспрессирующие несколько белков RSV, были сконструированы, как следует далее. Все требуемые гены были получены из лабораторного штамма RSV-A2 (АТСС VR1302). Вирус очистили на Нер-2 клетках методом бляшек и затем использовали для заражения Vero клеток. Общую РНК выделили из этих клеток с помощью экстракции фенолгуанидинизотиоцианатом (Trizol,Invitrogen) и подвергли ОТ-ПЦР, используя высокоточную Taq-полимеразу (Invitrogen) и положение праймеров, специфичных к RSV-генам L, Р, N и М 2-1, соответственно. Впоследствии ПЦР-продукты клонировали в экспрессирующие плазмиды пкДНК 3, пкДНК 6 или pCI, используя участки узнавания рестриктаз. Клонированные последовательности подтвердили с помощью секвенирования путем циклов ПЦР, используя набор терминаторов BigDye (Applied Biosystems), и проанализировали на генетическом анализаторе ABI Prism310. Пример 5. Конструирование линий G-продуцирующих клеток Vero. Клеточные линии, продуцирующие RSV-G белок, были сконструированы с использованием различных способов. В способе 1 G ген либо из RSV-A2, либо из изолята RSV X, или G ген из RSV-A2, в котором внутренний инициирующий трансляцию кодон был поврежден с помощью модификации, используя праймеры RSV033 и RSV 034, клонировали в экспрессирующий вектор пкДНК 3 или пкДНК 6 (Invitrogen) с применением ОТ-ПЦР на РНК из RSV-A2 или изолята RSV X, инфицировавшего клетки Vero, используя праймеры. Плазмиды ввели в Vero клетки, используя химические агенты CaCl2, соосаждение, основанное на липосомах, или электропорацию (Ausubel, 1989). Были применены два способа для выделения стабильных клеточных линий. В первом способе через 72 ч после трансфекции клетки были разделены с использованием различных разведений в свежей среде, содержащей селективную среду, зеоцин для пкДНК 3 и бластицидин для пкДНК 6. Клетки получали питание через селективную среду каждые 3-4 дня до тех пор, пока не идентифицировали фокусы образования клеток. Единичные колонии собирали и переносили на 96-луночную плашку или засевали в различных разведениях для получения единичных клеток на 96-луночной плашке. Антибиотикорезистентные колонии тестировали на экспрессию RSV-G с помощью иммуноокрашивающих технологий или FACS, используя RSV G-специфические антитела. Колонии, экспрессирующие G, пересаживали и классифицировали как стабильные клеточные линии, экспрессирующие G. Второй способ включает FACS сортировку с использованием RSV-G специфических антител через 72 ч после трансфекции. RSV-G экспрессирующие клетки засевали в последовательном разведении для получения единичных клеток в 96-луночную плашку и культивировали в селективной среде. Единичные клеточные колонии пересаживали на селективную среду и затем снова тестировали на экспрессию RSV-G, полученного в клеточных линиях, экспрессирующих RSV-G. В способе 2 Flp-In система (Invitrogen) использовалась для получения Vero клеток с сайтами инсер-8 011878 ции генов-мишеней в хромосомных положениях, которые обеспечивают различные уровни экспрессии гена мишени. Ген RSV-G, полученный из плазмид в способе 1, но с модификацией (включала использование праймера RSV151) близлежащей последовательности G кодона, инициирующего трансляцию, для обеспечения более высоких уровней трансляции, был введен в каждую из этих клеточных линий с использованием общего для данной системы способа, с получением в клеточных линиях Vero стабильно экспрессирующих различных уровней G белка. В способе 3 в клетках Vero временно экспрессировали G белок с помощью трансфекции экспрессирующими плазмидами, содержащими G ген по способу 1, или с помощью инфицирования модифицированным вирусом коровьей оспы Ankara (MVA) (Sutter, 1992) или вирусами чумы птиц (Spehner, 1990),экспрессирующими G белок. Пример 6. Конструирование клеточных линий бактериофагов, продуцирующих Т 7-полимеразу. Ген Т 7-полимеразы бактериофага амплифицировали путем ПЦР из плазмиды pPRT7 (van Gennip,1997), содержащей этот ген, используя праймеры ALG022 и ALG023. Продукты ПЦР клонировали в пкДНК 6b-вектор с применением Hind III/Xba I, получая плазмиду pc6T7pol. Клетки Vero трансфицировали, используя липофектамин 2000, как рекомендовано разработчиками (Invitrogen). Через 72 ч после трансфекции клетки разделяли и выращивали в свежей среде, содержащей бластицидин. Клетки подкармливали свежей средой каждые 3-4 дня и дважды разделяли для получения наибольших объемов культуры. Через 20 суток после трансфекции бластицидин-резистентные клетки трансфицировали репортерной плазмидой pT7-IRES2-EGFP, используя липофектамин 2000. Для конструирования плазмидыGATCACGCGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATT). Затем сконструировали плазмиду pT7-IRES2-EGFP с помощью клонирования фрагмента Т 7-EGFP плазмиды pT7-EGFP в плазмиду p-IRES2-EGFP посредством XmaI-NotI. Клетки, экспрессирующие EGFP, фракционировали с помощью FACS и выращивали в ограничивающем разведении для получения единичных клеточных колоний. Единичные колонии, экспрессирующие Т 7 РНК-полимеразу, тестировали на стабильность, выращивали до наибольшего объема культуры и сохраняли. Пример 7. Способ получения рекомбинантного вирусного изолята G-RSV X. Нер-2 клетки культивировали в DMEM+10% FCS (бычья эмбриональная сыворотка)+пенициллин/стрептомицин/глутамин, тогда как клетки Vero и их производные культивировали в М 199+5%FCS+pen/strep/glu. Клетки выращивали в течение ночи до 80% слияния в 10 мм 2 чашках при 37 С. ДляVero и Нер-2 клеток клетки заражали модифицированным вирусом Ankara-T7 (MVA-T7) (Sutter, 1992;Wyatt, 1995) или fowlpox-T7 вирусом (Britton, 1996) с MOI=3 (множественность инфекции 3) и инкубировали при 32 С 60 мин перед трансфекцией, давая возможность экспрессии Т 7 полимеразы бактериофага. Клетки (Нер-2, Vero или Vero-T7) отмывали в среде Optimem (Optimem 1 с глютамаксом, Invitrogen) и затем трансфицировали вспомогательными плазмидами, кодирующими гены N, P, L и М 2.1 RSV и плазмидой pRSVXG, используя липофектамин 2000 (Invitrogen) в Optimem (общий объем 500 мкл). Были добавлены следующие количества плазмид: 1,6 мкг pRSVXG, 1,6 мкг пкДНК 6-А 2-N, 1,2 мкг пкДНК 3-Р,0,4 мкг пкДНК 6-A2-L, 0,8 мкг пкДНК 6-А 2-М 2.1. Через 3-4 ч инкубации при 32 С добавили 500 мкл средыOptimem с 2% FCS и инкубировали клетки 3 дня при 32 С. Затем клетки соскребали и смесь снятых клеток и среды, содержащей высвобожденный вирус, использовали для заражения свежих культур Vero или Нер-2 клеток, выращенных в DMEM+2% FCS+pen/strep/glu. Последнюю процедуру повторяли 4-5 раз для получения матричного вируса в высоком титре. Идентификацию изолята G-RSV X подтвердили с помощью ОТ-ПЦР на РНК, выделенной из изолята G-RSV X, заразившего Vero клетки, и расщепления полученных продуктов уникальными рестриктазами, у которых участки узнавания были включены в pRSVXG (фиг. 2). Изолят RSV X использовали в качестве контроля. Для идентификации маркеров последовательности в RSV клетки Vero инфицировали изолятом RSVX или изолятом G-RSV X с MOI=0,1. Через 72 ч после заражения из культуральной надосадочной жидкости выделяли РНК и использовали как матрицу для ОТ-ПЦР. Праймеры конструировали так, чтобы они фланкировали вставленные маркеры последовательности в вирусе рекомбинантного изолята GRSV X. Полученные после ОТ-ПЦР продукты расщепляли соответствующими рестриктазами. Были получены следующие продукты рестрикции (фиг. 3): а) ПЦР с праймером RSV065 (GTCCATTGTTGGATTTAATC) и RSV093 (CAAGATAAGAGTGTACAATACTGTC) и рестрикция Mlu-I давали ожидаемые фрагменты 937 п.н. для изолята RSV X и 459 и 478 п.н. для изолята G-RSV X;b) ПЦР с праймерами RSV105 (GTTGGATTGAGAGACACTT) и RSV113 (AGTATTAGGCAATGCTGC) с последующим расщеплением Xma-I давала ожидаемые фрагменты 880 п.н. для изолята RSV X и 656 и 224 п.н. для изолята G-RSV X;CACAACCCACAATGA) и рестрикция SexA-I давали ожидаемые фрагменты 694 п.н. для изолята RSV X и 492 и 202 п.н. для изолята G-RSV X;d) ПЦР с праймерами RSV098 (TGGTAGTTCTCTTCTGGCTCG) и RSV114 (ATCCCCAAGTCATTGTTCA) с последующим расщеплением SnaB-I давала ожидаемые фрагменты 1820 п.н. для изолята RSV X и 507 и 387 п.н. для изолята G-RSV X. Ростовые характеристики изолята G-RSV X в сравнении с изолятом RSV X определяли на клеткахVero и Нер-2 (фиг. 4). Таблица 1 Праймеры, использованные для диагностической ОТ-ПЦР на РНК из RSV,инфицировавшего клетки Vero Пример 8. Способ получения рекомбинантного вирусного изолята G+G-RSV X. Вирусный изолят G-RSV X, полученный из трансфицированных клеток Vero, пересаживали несколько раз для получения титров не менее 105 КОЕ/мл (колониеобразующие единицы на мл). Затем различные moi этого вируса использовали для заражения Vero клеток, продуцирующих RSV-G белок. Полученный изолят G+G-RSV X собирали со среды и/или из клеток и анализировали на наличие белка G в вирионах с помощью иммунодетектирующих технологий. Титры заражения определяли на клетках Vero или Нер-2 и чистоту G генома определяли, используя ОТ-ПЦР на вирусной РНК, экстрагированной из клеток, зараженных вирусом изолята G+G-RSV X. Вирус хранили при -135 С в 25 или 40% сахарозе. Пример 9. Способ защиты в модели на хлопковых крысах против RSV-инфекции и RSV-индуцированной патологии с помощью иммунизации изолятом G-RSV X. Протекционные эксперименты были выполнены на хлопковых крысах (Sigmodon hispidus, в возрасте 5-6 недель, 4-6 животных обоего пола на группу). В предварительных экспериментах было показано,что это животное является чувствительным к RSV-инфекции и дает тяжелую вакцин-опосредованную легочную патологию, как описано Prince, 2001, что очень похоже на ситуацию с человеком. После интраназальной аппликации RSV легочная патология характеризовалась наличием воспалительного инфильтрата внутри и вокруг бронхов/бронхиол и гиперплазией эпителия. Более тяжелую патологию увидели при внутримышечной иммунизации формалин-инактивированным RSV-A2 с последующим интраназальным введением RSV-A2. В дополнение к вышеупомянутой патологии наблюдались периваскулярный и перибронхиолярный инфильтрат и альвеолит, характеризующие иммунно-опосредованную патологию. Эти наблюдения использовали как "внутренний" контроль для всей иммунизации и экспериментов с загрузкой антигеном. Заражение и иммунизацию хлопковых крыс RSV-вакцинами осуществляли интраназально в обе ноздри. Патологию в легких хлопковых крыс определяли с помощью световой микроскопии и титры вируса определяли за различные отрезки времени после загрузки антигеном или после заражения/иммунизации на клетках Vero, используя серийные разведения легочных гомогенатов, RSVспецифической ELISA для получения CCID50 титров и иммуноокрашиванием с применением RSV-специфических антител для получения КОЕ-титров. После двукратной иммунизации изолятом G-RSV X хлопковые крысы были полностью защищены против инфекции и патологии в легких, обусловленных изолятом RSV X. Результаты нескольких экспериментов суммированы в табл. 2. Логарифм титра вируса КОЕ/мл. Объем в мкл на животное, по половине этого объема в каждую ноздрю. 3 Логарифм титра вируса на грамм легкого, предел детекции 102 CCID50. 2polymerase for transient gene expression in mammalian cells. Virology. 1995, 210 (1): 202-5. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Вирион пневмовируса, включающий в себя вирусный геном, который имеет мутацию в гене, кодирующем белок прикрепления G или белок слияния F, или мутацию в обоих генах, причем указанные белки необходимы для инфекционности пневмовируса, причем мутация включает делецию последовательности, кодирующей указанный белок, или инактивацию указанного гена или такова, что указанный кодируемый белок является биологически неактивным, и вирион включает в себя указанный нативный белок в форме и в количестве, требуемых для инфекционности вириона. 2. Вирион по п.1, где пневмовирус представляет собой респираторно-синцитиальный вирус. 3. Вирион по п.1 или 2, в котором ген кодирует белок прикрепления G. 4. Вирион по любому из пп.1-3, в котором мутация приводит к тому, что вирус, продуцируемый- 12011878 только из вирусного генома, не имеет белка. 5. Вирион по п.1, в котором мутация включает в себя делецию последовательности, кодирующей белок. 6. Способ продуцирования пневмовирусного вириона, как он определен в любом из пп.1-5, где способ включает в себя стадии:(a) инфицирования культуры первой клетки-хозяина пневмовирусом, содержащим вирусный геном,имеющий мутацию, как она идентифицирована в любом из пп.1-5, причем клетка-хозяин включает в себя экспрессирующий вектор, который направляет в клетке-хозяине экспрессию указанного нативного белка,как он определен в любом из пп.1-5; и(b) получения вирионов из инфицированной культуры клеток-хозяев. 7. Способ по п.6, в котором продуцируется пневмовирус, применяемый для инфицирования культуры первой клетки-хозяина, где способ включает в себя стадии:(а) предоставления второй клетке-хозяину одного или нескольких экспрессирующих векторов, которые направляют в клетке-хозяине экспрессию:i) вирусной геномной РНК, имеющей мутацию в гене, кодирующем белок, необходимый для инфекционности (in vivo) пневмовируса, причем мутация приводит к тому, что вирус, продуцируемый только из вирусного генома, не имеет инфекционности, где мутация и белок являются теми, что определены в любом из пп.1-5;ii) пневмовирусного полимеразного ферментного комплекса и, необязательно, одного или нескольких дополнительных вирусных белков; и(b) культивирования второй клетки-хозяина, за счет чего продуцируются вирионы. 8. Способ по п.7, который дополнительно включает в себя амплификацию вирионов, продуцируемых второй клеткой-хозяином, путем одной или нескольких стадий дальнейшего инфицирования клеток,с использованием клеток-хозяев, которые являются такими же, что и вторая клетка-хозяин, или отличны от нее. 9. Способ по п.7 или 8, в котором вирусная геномная РНК транскрибируется с копии вирусной ДНК, которая находится под контролем промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага, и при этом предоставляется клетка-хозяин с экспрессирующим вектором, который направляет экспрессию ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага в клетке-хозяине. 10. Способ по п.9, в котором ДНК-зависимая РНК-полимераза бактериофага представляет собой полимеразу Т 7, Т 3 или SP6. 11. Способ по любому из пп.7-10, в котором ферментный комплекс пневмовирусной полимеразы,по меньшей мере, включает в себя белки L, Р, N. 12. Способ по пп.7-11, в котором один или несколько дополнительных вирусных белков являются мембранным белком матрикса пневмовируса, предпочтительно белком М 2-1. 13. Способ по любому из пп.6-12, в котором пневмовирус является респираторно-синцитиальным вирусом. 14. Способ по любому из пп.6-13, в котором ген, кодирующий белок, необходимый для инфекционности, представляет собой ген, кодирующий белок прикрепления G. 15. Композиция, содержащая эффективное количество вириона по любому из пп.1-5 или вирион,который можно получить способом по любому из пп.6-14, и фармацевтически приемлемый носитель,такой как вода или буферный солевой раствор, в качестве лекарственного средства для предотвращения или лечения пневмовирусной инфекции. 16. Применение вириона по любому из пп.1-5 для производства лекарственного средства для профилактики или лечения пневмовирусной инфекции. 17. Применение по п.16, в котором лекарственное средство представляет собой препарат для интраназального введения. 18. Способ профилактики или лечения пневмовирусной инфекции, предусматривающий стадию введения субъекту композиции, содержащей вирион по любому из пп.1-5 в количестве, эффективном для профилактики или лечения инфекции. 19. Способ по п.18, в котором композицию вводят интраназально.
МПК / Метки
МПК: A61K 39/155, A61K 35/76, C12N 7/04, C07K 14/135
Метки: дефицитом, вирус, респираторно-синцитиальный, компенсированным, перекрёстно, геномным
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-11878-respiratorno-sincitialnyjj-virus-s-perekryostno-kompensirovannym-genomnym-deficitom.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Респираторно-синцитиальный вирус с перекрёстно компенсированным геномным дефицитом</a>
Предыдущий патент: Способ культивирования микроорганизмов рода thraustochytriales
Следующий патент: Молекулы с модифицированным fс фрагментом
Случайный патент: 1',3'-двузамещенные-4-фенил-3,4,5,6-тетрагидро-2н,1'н-[1,4']бипиридинил-2'-оны