Молекулы-антагонисты цитокинов

010420 Настоящее изобретение относится к новым белкам (обозначенным INSP052 и INSP055), идентифицированным в настоящей заявке как молекулы распознавания клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, а также к использованию этих белков и нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих эти белки, для диагностики, предупреждения и лечения заболеваний, например для диагностики, предупреждения и лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний,кожных болезней, заболеваний печени или печеночной недостаточности. Все цитированные в настоящем описании публикации, патенты и патентные заявки приведены в качестве ссылки в полном объеме. Предшествующий уровень техники В настоящее время в области разработки лекарственных средств произошел крутой перелом, который положил начало новой эре функциональной геномики, пришедшей на смену старым методам. Термин "функциональная геномика" применяется к способам использования средств биоинформатики для приписывания функций последовательностям белков, представляющих интерес для специалистов. Такие средства становятся все более необходимыми, и это связано с тем, что оснащение научноисследовательских лабораторий, занимающихся определением функций последовательностей этих белков, пока не дает возможности быстро обрабатывать все нарастающий поток данных для этих последовательностей. Поскольку эффективность и точность методов биоинформатики возрастает, то эти методы быстро вытесняют стандартные методы биохимической характеризации. Действительно, современные средства биоинформатики, используемые для идентификации белков согласно изобретению, позволяют получать окончательные результаты с достаточно высокой степенью достоверности. Различные институты и коммерческие организации занимаются обработкой непрерывно поступающих данных о последовательностях, и на основе полученных результатов они приходят к важным открытиям. Однако необходимость в идентификации и характеристике других генов и полипептидов,кодируемых этими генами, в целях их дальнейшего исследования и поиска новых лекарственных средств, все еще остается актуальной. Недавно заявителем согласно изобретению был разработан превосходный способ оценки последовательностей с неизвестной функцией. Этот способ представляет собой систему генерирования базы данных, называемую поисковой базой данных Biopendium, которая рассматривается в WO 01/69507. Эта система базы данных состоит из общего источника данных, созданного с использованием запатентованной технологии, и содержащего информацию, полученную в результате всестороннего сравнения всех имеющихся последовательностей белков или нуклеиновых кислот. Помимо объединения данных об этих последовательностях, взятых из отдельных источников, необходимо также объединить как можно больше данных, относящихся как к самим последовательностям,так и к соответствующей информации для каждой последовательности, в один общий источник. Для этого все имеющиеся данные, относящиеся к каждой последовательности, включая данные о трехмерной структуре кодированного белка, если они имеются, суммируют в одно целое, что позволяет наилучшим образом использовать данные, имеющиеся для каждой последовательности, и таким образом, дает возможность сделать в высокой степени обоснованный прогноз, исходя из сравнения этих последовательностей. Комментарии, которые имеются в указанной базе данных и приводятся для каждой последовательности, дают информацию о данных последовательностях в нужном биологическом аспекте. Такой источник данных дает возможность точно предсказать функцию белка, исходя из отдельно взятой последовательности. С использованием стандартной технологии можно проводить оценку лишь тех белков, последовательности которых в высокой степени идентичны (выше примерно 20-30% идентичности) последовательностям других белков одного и того же функционального семейства. При этом невозможно предсказать функции белков, которые имеют очень низкую степень гомологии с последователями других родственных белков с известной функцией. Белки, содержащие сигнальный пептид Способность клеток продуцировать и секретировать внеклеточные белки является главным фактором во многих биологических процессах. Ферменты, факторы роста, белки внеклеточного матрикса и молекулы, передающие сигналы, секретируются клетками. Это происходит в результате слияния секреторной везикулы с плазматической мембраной. В большинстве случаев, но не всегда, белки транспортируются в эндоплазматический ретикулум и в секреторные везикулы посредством сигнального пептида. Сигнальные пептиды представляют собой цис-активные последовательности, которые влияют на транспорт полипептидных цепей из цитоплазмы в мембраносвязанный компартмент, такой как секреторная везикула. Полипептиды, которые доставляются в секреторные везикулы, либо секретируются во внеклеточный матрикс, либо удерживаются в плазматической мембране. Полипептиды, которые удерживаются в плазматической мембране, имеют один или несколько трансмембранных доменов. Примерами сигнального пептида, который играет главную роль в функционировании клеток, являются цитокины, гормоны, белки внеклеточного матрикса, адгезивные молекулы, рецепторы, протеазы и факторы роста и дифференцировки.-1 010420 Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены Было показано, что молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, играют определенную роль в различных физиологических функциях, и многие из них могут играть определенную роль в патологических процессах. Изменение их активности означает изменение фенотипа заболевания, поэтому такая идентификация новых молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены, является крайне необходимой, поскольку указанные молекулы могут играть определенную роль во многих заболеваниях, в частности, в воспалительных, онкологических и в сердечно-сосудистых заболеваниях. Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, участвуют в различных биологических процессах, включая эмбриогенез (Martin-Bermudo, M.D. et al., Development. 2000 127 (12): 2607-15;Darribere, Т., et al., Biol Cell. 2000 92(1): 5-25), сохранение целостности тканей (Eckes, В., et al., J Cell Sci. 2000 113(Pt 13): 2455-2462; Buckwalter, J.A., et al., Instr Course Lect. 2000 49: 481-9; Frenette, P.S., et al., JBeckerath, N., et al., Blood. 2000 95(11): 3297-301; Topol, E.J., et al., Am Heart J. 2000 139(6): 927-33; Kroll,H., et al., Thromb Haemost. 2000 83(3): 392-6) и инвазию бактериальных патогенов в клеткухозяина/адгезию бактериальных патогенов к клетке-хозяину (Dersch P, et al. EMBO J 1999 18(5): 11991213). Подробная характеристика структуры и функции нескольких семейств молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены, послужила стимулом для создания различными фармацевтическими компаниями программ по разработке модуляторов, которые могут быть использованы в целях лечения заболеваний, включая воспалительные, онкологические, нервные, иммунные и сердечно-сосудистые заболевания. Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, участвуют фактически в каждой биологической функции, начиная с эмбриогенеза и кончая апоптозом. Они играют важную роль в обеспечении структурной целостности или гомеостаза большинства тканей. Поэтому не удивительно, что дефекты в молекулах распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены, приводят к развитию заболеваний, и что многие заболевания возникают в результате модуляции молекул распознавания на клеточной по-2 010420 верхности, содержащих иммуноглобулиновые домены. Члены этого семейства описаны ниже в табл. 1. Действительно, семейство молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены, включает несколько отдельных семейств. Некоторые из этих семейств представляют особый фармацевтический интерес, который обусловлен тем, что малые молекулы легко поддаются модуляции. Эти семейства включают: 1. Адгезивные молекулы иммуноглобулина, представляющие собой контррецепторы для интегринов, например, внеклеточные адгезивные молекулы (ICAM) и васкулярные клеточно-адгезивные молекулы (VCAM). Члены этого семейства состоят из различного числа глобулярных, иммуноглобулинподобных внеклеточных доменов. Некоторые члены этого семейства, например, PECAM-1 (CD31) иNCAM, опосредуют гомотипическую адгезию. Другие члены этого семейства, например ICAM-1 иVCAM-1, опосредуют адгезию посредством взаимодействия с интегринами. 2. Рецепторы клеточной поверхности для факторов роста. Факторы роста являются внеклеточными молекулами, и они взаимодействуют со специфическими высокоаффинными рецепторами, локализованными на плазматических мембранах клеток-мишеней, с продуцированием биологического эффекта. Молекулярная характеризация различных рецепторов факторов роста показала, что они принадлежат к определенным семействам, а именно, к семейству тирозинкиназных рецепторов, к ассоциированным с Gбелком семидоменным трансмембранным рецепторам, и к серин/треонинкиназным рецепторам. Примерами тирозинкиназных рецепторов фактора роста являются VEGFR, PDGFR, FGFR, CSF-1R и c-KIT, которые также содержат иммуноглобулиновые домены во внеклеточной части. Dys-регуляция функции факторов роста приводит ко многим патологиям различных фенотипов, включая, но не ограничиваясь ими, онкологические заболевания (Bartucci M. et al. (2001) Cancer Res. Sep. 15; 61 (18): 6747-54, Dias S. etJ.D. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(18): 10439-44, Fahnestock M. et al. (2001) Mol. Cell. Neurosci. 18 (2) :210-20) и метаболизм (Vickers M.H. et al. (2001) Endocrinology 142(9):3964-73). Таблица 1 Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены Таким образом, было показано, что молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, играют определенную роль в различных физиологических функциях,многие из которых могут играть определенную роль в различных патологических процессах. Изменение их активности влечет за собой изменение патологического фенотипа, а поэтому идентификация новых молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены, является в высокой степени необходимой, поскольку эти молекулы могут играть определенную роль в развитии-4 010420 многих заболеваний, а особенно иммунных заболеваний, воспалительных заболеваний, онкологических заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, расстройств центральной нервной системы и инфекций. Описание изобретения Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что белки INSP052 и INSP055 функционируют как молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, а более конкретно, как антагонисты цитокинов. Примеры таких молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены, приводятся в табл. 1. В одном из вариантов своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который(i) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ(ii) представляет собой фрагмент указанной последовательности, который обладает активностью полипептида (i) или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (i), или(iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii). Используемый авторами термин "активность полипептида по п. (i)", означает активность молекулы распознавания, расположенной на клеточной поверхности и содержащей иммуноглобулиновые домены. Используемый авторами термин "активность молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащей иммуноглобулиновые домены," относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность или структурные особенности, которые могут быть идентифицированы как консервативные признаки, присущие семейству молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены. Это определение также включает антагонистическую активность по отношению к цитокинам. Термин "антагонист цитокина" означает, что полипептид, его фрагмент или функциональный эквивалент ингибирует активность по меньшей мере одного цитокина. Предпочтительно антагонисты цитокина согласно изобретению могут ингибировать активность цитокина посредством ингибирования экспрессии и/или секреции цитокина. Антагонисты цитокинов, которые ингибируют экспрессию цитокина посредством других механизмов, например посредством связывания с цитокином или цитокиновым рецептором, также входят в объем настоящего изобретения. Антагонисты цитокинов согласно изобретению предпочтительно обладают способностью ингибировать активность более чем одного цитокина. Антагонисты цитокинов согласно изобретению предпочтительно обладают иммуномодуляторной активностью. Термин "иммуномодуляторная активность" означает любую активность, детектируемую in vitro илиin vivo, которая влияет на иммунный ответ. Примерами иммуномодуляторной активности являются иммуносупрессорная активность, противовоспалительная активность, проапоптотическая активность, антиапоптотическая активность и противоопухолевая активность. Цитокинами, которые могут ингибироваться антагонистами цитокинов согласно изобретению, являются: TGF-альфа; EGF; члены семейства цитокинов, имеющих структурный мотив в виде пучка из четырех спиралей (такие как IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-13, G-CSF, GM-CSF, CNTF, OSM,EPO, IL-10, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма и M-CSF); члены семейства цитокинов, имеющие структуру с цистиновыми узлами (такие как NGF, TGF-бета, PDGF и VEGF); хемокины (такие как IL-8, MIP-1 альфа, MIP-1-бета, MIP-2, PF-4, PBP, I-309/TCA-3, МСР-1, МСР-2, МСР-3 и IP-10), члены семейства цитокинов TNF (таких как TNF-альфа, TNF-бета и LT-бета) и члены семейства цитокинов, имеющие бетаконформацию типа "клеверный лист", включая FGF-альфа, FGF-бета, IL-1-альфа, IL-1-бета и IL-1ra). Предпочтительные антагонисты цитокинов согласно изобретению ингибируют активность TNF-альфа,IL-4 и/или IL-2. Цитокины образуют гетерогенное семейство секретируемых полипептидов с относительно низкой молекулярной массой, действующих как регуляторы клеточных взаимодействий со стимуляторами различных типов, в частности, взаимодействий, связанных с воспалительными и иммунными реакциями, а также взаимодействий, связанных с клеточной пролиферацией, репарацией, межклеточными взаимодействиями и дифференцировкой клеток. Цитокины представлены, главным образом, неферментными гликопротеинами, которые были исторически разделены на несколько групп в соответствии с такими критериями, как гомология последовательностей, структурные элементы, экспрессирующие клетки и/или активность связывания. Примерами таких семейств последовательностей являются интерлейкины, лимфокины, монокины и интерфероны, а также и многие другие последовательности, которые были в последние годы охарактеризованы как молекулы, которые обладают цитокиновой активностью (такие как некоторые факторы роста или хемокины), что затрудняет их исчерпывающую классификацию (Haddad J.J. 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun. 297:700-13). Цитокины продуцируются, главным образом, моноцитами, макрофагами и лимфоцитами, а также клетками других типов (такими как лейкоциты, остеобласты, клетки гладкой мышцы, эпителиальные клетки, нейроны, эндотелиальные клетки или фибробласты), но обычно они не продуцируются конститу-5 010420 тивно. Цитокины обычно секретируются иммунными клетками в ответ на действие аллергенов (например, бактерий, вирусов или других патогенов), которые могут стимулировать их экспрессию de novo и секрецию из клеток с последующим изменением либо их собственных функций (аутокринных/интракринных эффектов) или функций смежных клеток и локального микроокружения (паракринных/юкстакринных эффектов). Цитокины действуют на клетки-мишени посредством рецепторов, которые стимулируют различные пути передачи клеточных сигналов (Ishiara K.Hirano Т. 2002, Biochim Biophys. Acta. 1592:281-296). Обычно действие цитокинов является плейотропным (один цитокин может обладать несколькими физиологическими эффектами) и избыточным (различные цитокины могут быть ответственны за аналогичные физиологические эффекты), и оно может быть направлено на различные и перекрывающиеся популяции клеток-мишеней. Наблюдаемые физиологические эффекты цитокинов обусловлены тем фактом, что цитокины, в сочетании с воспалительным ответом, приводящим к мобилизации и агрегации клеток, могут индуцировать(или подавлять) продуцирование многих белков координированным образом, включая продуцирование других цитокинов и/или рецепторов цитокинов. Таким образом, многие физиологические ответы (при физиологических и патологических состояниях) являются результатом взаимосвязанной избыточной сети синергических или антагонистических взаимодействий между цитокинами. Клонирование и биологические анализы цитокинов и их рецепторов позволяют в общих чертах понять молекулярные механизмы, лежащие в основе их плейотропности и избыточности. Это свойство часто приписывают составу комплексов цитокиновых рецепторов, включающих передающую сигнал рецепторную субъединицу, которая используется всеми членами семейства цитокинов, и связывающую субъединицу, которая является специфичной для каждого цитокина. Таким образом, индуцированный цитокинами каскад передачи сигналов представляет собой механизм, конечный результат которого для конкретной клетки или ткани определяется числом различных сигналов, передаваемых одновременно на клеточную поверхность. Конкретные детали функционирования цитокиновой сети пока еще точно не известны, но уже очевидно, что цитокины являются важными медиаторами и участвуют в патогенезе различных заболеваний,прямо или опосредованно ассоциированных с природными или адаптивными иммунными ответами. В частности, главные патофизиологические эффекты цитокинов являются результатом их избыточного продуцирования или их продуцирования в нежелательном месте и приводят к индуцированию воспалительного состояния, негативно влияющего на здоровье пациента. Поэтому, в общих чертах, можно сделать вывод, что любой механизм, эффективно ингибирующий один или несколько цитокинов, в частности, провоспалительных цитокинов, может иметь позитивный эффект в лечении человеческих заболеваний, благодаря подавлению неблагоприятного каскада клеточных событий, ассоциированных с нежелательным или пролонгированным продуцированием конкретных цитокинов. В настоящее время в литературе описан широкий ряд стратегий и соединений, используемых в методах генерирования и/или введения антагонистов цитокинов, блокирующих их воспалительную активность. Неисчерпывающий список таких методов включает использование растворимых вариантов человеческих цитокиновых рецепторов, цитокин-специфических антител, цитокинов, связывающихся с вирусными белками, и небольших молекул, ингибирующих продуцирование цитокинов. Однако существует совсем немного антагонистов цитокинов, доступных для их использования в лечении заболеваний человека. Однако возможное применение других соединений, обладающих фармакологическим действием на клеточно-опосредованные воспалительные процессы посредством модуляции внеклеточных или внутриклеточных путей передачи сигналов, пока еще не подвергалось тщательному исследованию, которое осуществляется в рамках программ поиска лекарственных средств (Stevceva L. 2002, Curr. Med.Chem. 9: 2201-7; Inagaki-Ohara K. et al. 2003, Curr. Opin. Pharmacol. 3:435-42). Из представленных ниже примеров очевидно, что внеклеточный домен INSP052 (также называемыйINSP052EC) ингибирует секрецию TNF-альфа, IL-4 и IL-2 in vitro в анализе с использованием стимулированных конканавалином А (СопА) человеческих мононуклеарных клеток периферической крови(hPBMC) и в аналогичном анализе с использованием CD4+-Т-клеток. Кроме того, было обнаружено, что доставка кДНК INSP052EC в in vivo модель молниеносного гепатита приводит к снижению уровнейTNF-альфа и m-IL-6 в сыворотке и оказывает значительное влияние на снижение уровней трансаминаз в сыворотке. Этот эффект был подтвержден путем подкожных инъекций белка INSP052EC. Снижение уровней аспартат-аминотрансферазы (ASAT) и аланин-аминотрансферазы (ALAT) может быть обусловлено снижением уровней TNF-альфа и IL-4. TNF-альфа и IL-4 представляют собой цитокины, играющие важную роль в разрушении печени, индуцированном инъекцией ConA. В этой мышиной модели гепатита TNF-альфа продуцируется, главным образом, макрофагами печени, так называемыми клетками Купфера, a IL-4 продуцируется NK-T-клетками (природными киллерами Т) печени. Было показано, что антитела против TNF-альфа обеспечивают иммунитет против данного заболевания (Seino et al. 2001, Annals of surgery 234, 681), и было показано, что ингибирование продуцирования IL-4 NKTклетками оказывает гепато-протективное действие при Т-клеточноопосредованном гепатите у мышей(CHS) на мышиной модели воспалительного заболевания кожи. Авторами настоящей заявки было показано, что INSP052EC способствует значительному и дозозависимому уменьшению опухлости уха у мышей, что позволяет предположить о снижении степени инфильтрации лейкоцитов и последующего воспаления и указывает на то, что INSP052EC может быть использован для лечения Т-клеточноопосредуемого воспаления кожи, такого как аллергический контактный дерматит и псориаз. В настоящем описании со всей очевидностью продемонстрировано, что выделенный внеклеточный домен INSP052 (INSP052EC) может быть использован (как таковой или как вариант или гибридный белок, содержащий последовательность этого белка, или полноразмерный белок) для модуляции цитокиновой активности, поскольку он может функционировать, в частности, как антагонист секреции и/или экспрессии цитокинов, и может играть терапевтическую роль в лечении заболеваний, прямо или опосредованно ассоциированных с природными и адаптивными иммунными ответами. Эти результаты, полученные с использованием внеклеточного домена INSP052, позволили авторам сделать вывод, что другие варианты полипептида INSP052, а также полипептид с полноразмерной последовательностью, вероятно,имеют общие функции, эквивалентные продемонстрированным функциям. В соответствии с этим считается, что INSP052, INSP052EC (SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:22) и родственные функционально эквивалентные белки могут быть использованы для лечения аутоиммунных заболеваний, вирусных заболеваний или острых заболеваний печени, а также алкогольной печеночной недостаточности. Они могут быть также эффективными для лечения других воспалительных заболеваний. Ингибирующие активности в определенном интервале, обнаруживаемые тестируемой молекулой на основе INSP052EC в различных клеточных анализах и у животных с моделью заболевания, подтверждают, что патофизиологические эффекты цитокинов, являющиеся результатом их избыточного продуцирования или продуцирования в нежелательном месте, могут быть блокированы этой молекулой. Ингибирование клеточных процессов, ассоциированных с пролонгированным продуцированием провоспалительных цитокинов, может быть достигнуто с помощью молекул, содержащих INSP052EC, а поэтому эти молекулы могут быть использованы для ослабления аномальных воспалительных состояний, ассоциированных, в частности, с аутоиммунными и воспалительными заболеваниями, поражающими различные ткани и органы (например, печень, кожу, легкие и центральную нервную систему); причем такое использование откроет новые возможности для терапевтического лечения онкологических, нервных, сердечнососудистых и инфекционных заболеваний. Другие клинические применения молекул на основеINSP052EC могут быть найдены с помощью цитокиновых анализов, которые позволяют выявить избыточную экспрессию и/или секрецию цитокинов в образцах, взятых у пациентов, страдающих другими заболеваниями (Wong С.K. and Lam C.W. Adv. Clin. Chem. 2003, 37:1-46; Whiteside T.L., Biotechniques,2002, Oct. Suppl: 4-8, 10, 12-5), а затем оценивать терапевтическую эффективность молекулы INSP052EC как антагониста цитокинов. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, будет далее называться "полипептидом экзона 1 INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную вSEQ ID NO:4, будет далее называться "полипептидом экзона 2 INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:6, будет далее называться "полипептидом экзона 3INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:8, будет далее называться "полипептидом экзона 4 INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, будет далее называться "полипептидом экзона 5 INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:12, будет далее называться "полипептидом экзона 6INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, будет далее называться "полипептидом экзона 7 INSP052". В результате объединения последовательностей SEQ IDNO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:14 получают последовательность, обозначенную SEQ ID NO:16. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, будет далее называться "полипептидом INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, указанную в SEQ ID NO:20, представляет собой внеклеточный домен INSP052. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:22, будет далее называться внеклеточным доменом зрелого полипептида INSP052. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:24, будет далее называться зрелым полипептидом экзона 2 INSP052. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:26, будет далее называться зрелым полипептидом INSP052. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:29,будет далее называться гистидин-меченым внеклеточным доменом зрелого INSP052. Полипептид,имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:30, будет далее называться Fc-гибридом внеклеточного домена зрелого INSP052. Полипептид, имеющий последовательность, представленную вSEQ ID NO:31, будет далее называться фрагментом INSP052, содержащим домены Ig (INSP052Ig2). Используемый здесь термин "полипептиды экзонов INSP052" означает полипептиды, содержащие-7 010420 или состоящие из них, описанные здесь полипептидные последовательности, включая полипептид экзона 1 INSP052, полипептид экзона 2 INSP052, полипептид экзона 3 INSP052, полипептид экзона 4 INSP052,полипептид экзона 5 INSP052, полипептид экзона 6 INSP052, полипептид экзона 7 INSP052, полипептидINSP052, внеклеточный домен INSP052, внеклеточный домен зрелого INSP052, полипептид экзона 2 зрелого INSP052, зрелый полипептид INSP052, меченный гистидином внеклеточный домен зрелогоINSP052, Fc-гибрид внеклеточного домена зрелого INSP052 и фрагмент INSP052, содержащий домен Ig. В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид согласно этому варианту состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:16 (полипептида INSP052), или он представляет собой его фрагмент или функциональный эквивалент. В другом варианте осуществления изобретения указанный полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 илиSEQ ID NO:14, или представляет собой ее вариант. В другом варианте своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который:(i) содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:22;(ii) представляет собой ее фрагмент, обладающий активностью полипептида (i), или содержащий общую антигенную детерминанту с полипептидом (i); или(iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii). Аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID NO:20, представляет собой внеклеточный домен INSP052 и соответствует аминокислотам 1-240 полноразмерного белка (см. раздел "Примеры"). SEQ ID NO:22 представляет собой внеклеточный домен зрелого INSP052. См. также фиг. 7, относящуюся к внеклеточному домену INSP052. Существует высокая вероятность того, что внеклеточный домен будет иметь правильную укладку и будет обладать биологической активностью в том случае, если в полипептидном фрагменте будут присутствовать другие остатки у С- и/или N-конца границ полипептидных последовательностей. Например,дополнительные 5, 10, 20, 30, 40, 50 или даже 100 аминокислотных остатков полипептидной последовательности INSP052 или гомологичной последовательности могут быть включены у С- или у N-конца или у обоих концов границ домена, связывающегося с рецептором, при условии, что они не будут негативно влиять на способность данного полипептидного фрагмента к "правильной" укладке и на его биологическую активность. Из-за присутствия крупных петель между вторичными структурными элементами может оказаться необходимым удлинение, составляющее по меньшей мере 100 или 200 остатков. В усеченных вариантах внеклеточного домена INSP052 один или несколько аминокислотных остатков (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или более) могут быть делетированы у С- или у N-конца или у обоих концов этого домена без какого-либо негативного воздействия на биологическую активность. Предпочтительным усеченным вариантом внеклеточного домена INSP052 является фрагментNO:31. Настоящее изобретение относится к полипептиду, который:(i) содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:31;(ii) представляет собой ее фрагмент, обладающий активностью полипептида по (i) или содержащий общую антигенную детерминанту с полипептидом по (i); или(iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii). Как обсуждается ниже, полипептиды согласно изобретению могут быть получены в форме гибридного белка или в виде "свободного" белка. В соответствии с этим, в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к полипептиду, состоящему из внеклеточного домена INSP052. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к полипептиду, состоящему из INSP052 (полноразмерного белка или его внеклеточного домена, включая его зрелый вариант и усеченные варианты), присоединенного по меньшей мере к другому полипептиду, вместе с которым он образует гибридный белок. В соответствии с этим, в других своих вариантах настоящее изобретение относится к полипептиду,содержащему две последовательности (а) и (b) или состоящему из них, где указанный полипептид: а) представляет собой аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична:(ii) представляет собой ее фрагмент, обладающий активностью полипептида по (i) или имеющий общую антигенную детерминанту с полипептидом по (i); или(iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii); иb) представляет собой гетерологичную аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из сигнальной последовательности, метки для очистки; внеклеточного домена мембраносвязанного белка; секретированного белка; инициирующего метионина; линкерной области, содержащей сайт узнавания для эндопептидазы; или Fc-области, происходящей от молекулы иммуноглобулина.-8 010420 Такие гибридные белки могут быть получены путем клонирования полинуклеотида, кодирующего полипептид, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 90%, а предпочтительно по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологична любой из вышеуказанных последовательностей полипептида INSP052 по всей длине данного полипептида, и находящегося в одной и той же рамке считывания с последовательностями, кодирующими гетерологичную последовательность белка. Используемый здесь термин "гетерологичный" относится к любому полипептиду, отличающемуся от человеческого полипептида INSP052. Примерами гетерологичных последовательностей, которые могут присутствовать в гибридных белках у N- или у С-конца, являются внутриклеточные домены мембраносвязанного белка, константные области иммуноглобулина (Fc-области), домены мультимеризации,домены внеклеточных белков, сигнальные последовательности, секреторные последовательности и последовательности, облегчающие очистку аффинной хроматографией. Многие из этих гетерологичных последовательностей являются коммерчески доступными как последовательности, присутствующие в экспрессионных плазмидах, поскольку включение этих последовательностей в гибридные белки придает им дополнительные свойства и не оказывает значительного влияния на специфическую биологическую активность присоединенных к ним белков (Terpe K. 2003, Appl.Microbiol. Biotechnol, 60:523-33). Примерами таких дополнительных свойств этих белков являются их более длительное время полужизни в физиологических жидкостях, более легкая процедура их очистки, наличие дополнительного сайта связывания, способность к созреванию посредством эндопротеолитического гидролиза, повышенная стабильность во время рекомбинантного продуцирования или внеклеточная локализация. Последний признак является особенно важным, поскольку он позволяет полипептидам локализоваться в пространстве, из которого более легко осуществить выделение и очистку этих полипептидов. Конструирование молекул, лигандов и линкеров, а также методы и стратегии конструирования,очистки, детекции, созревания и применения гибридных белков подробно описаны в литературе (NilssonJ. et al., Protein Expr. Purif. 11:1-16, 1997; "Applications of Chimeric genes and Hybrid proteins" Methods Enzymol. Vol. 326-328, Academic Press, 2000). Если это необходимо, то гетерологичная последовательность может быть элиминирована путем протеолитического расщепления после очистки белка или in vivo. Это может быть достигнуто, например,путем встраивания сайта протеолитического расщепления между белком и гетерологичной последовательностью, и обработки этого гибридного белка соответствующей эндо/экзопептидазой. Эти свойства облегчают продуцирование гибридных белков и их применение для получении фармацевтических композиций. Например, гетерологичная последовательность может быть присоединена к белку посредством линкерной последовательности, содержащей сайт распознавания для эндопептидазы (такой как каспаза),которая может быть использована для отделения нужного белка от гетерологичной последовательностиin vivo или in vitro. Альтернативно, если экспрессируемый белок не содержит инициирующего метионина (например,если он представляет собой зрелую последовательность без сигнального пептида), то эта гетерологичная последовательность может иметь инициирующий метионин, обеспечивающий соответствующую экспрессию в клетке-хозяине. Эта дополнительная аминокислота может быть затем элиминирована под действием экзопептидазы, такой как метионин-аминопептидаза, в соответствии с методами, описанными в литературе (Van Valkenburgh H.A.Kahn R.A. Methods Enzymol. 344:186-193, 2002; Ben-Bassat A., BioProccess Technol, 12:147-159, 1991). Гетерологичные последовательности, к которым могут быть присоединены полипептиды согласно изобретению, могут состоять из последовательностей, облегчающих секрецию белка, таких как сигнальные пептиды и сигналы секреции (Rapoport Т.A. et al., Annu. Rev. Biochem. 1996; 65:271-303). Альтернативно, гетерологичная последовательность в гибридном белке может облегчать очистку этого белка. Например, полипептид INSP052 может быть очищен с помощью гекса-гистидинового пептида, присоединенного у С-конца INSP052. Пример такого гибридного полипептида представлен в SEQID NO:29. Этот гексагистидиновый пептид образует так называемую "гистидиновую" метку, которая облегчает очистку (Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-4). Вместо гистидиновой метки могут быть использованы "НА"-метка, эпитоп, происходящий от белка гемагглютинина вируса гриппа(Wilson et al., 1994, Cell, 37:767-78), или другие метки для аффинной очистки, такие как GST, FLAG или МВР. Гетерологичная последовательность гибридного белка может обладать дополнительной функциональной активностью. Например, внеклеточный домен INSP052, который обладает цитокинантагонистической активностью, может быть присоединен к гетерологичной последовательности, которая также обладает противовоспалительной или, по существу, иммуномодуляторной активностью, такой как последовательность других антагонистов цитокинов, агентов, связывающихся с коллагеном II (таких как агенты, описанные в WO 01/37861), и самих цитокинов (таких как цитокины, описанные в WO 03/095488, WO 03/014359 и WO 03/035105).-9 010420 Гетерологичная последовательность может обеспечивать более высокую стабильность, более длительное время полужизни полипептида согласно изобретению и, тем самым, увеличение его терапевтической активности. Например, полипептиды могут быть присоединены к альбумину человеческой сыворотки или к другим последовательностям, которые связываются с альбумином человеческой сывороткиWO 01/77137). Альтернативно, такая дополнительная последовательность может обеспечивать доставку в конкретно локализованную область, такую как головной мозг (WO 03/32913). Гетерологичная последовательность может улучшать стабильность посредством образования мультимеров белка. Примерами гетерологичных последовательностей, стимулирующих мультимеризацию,являются домены, выделенные из белков, таких как hCG (WO 97/30161), коллаген X (WO 04/33486),C4 ВР (WO 04/20639), белки Erb (WO 98/02540) или суперспирализованные пептиды (WO 01/00814). В предпочтительном варианте изобретения указанный полипептид присоединен к константной области молекулы Ig. Пример такого полипептида представлен в SEQ ID NO:30. Указанный полипептид,предпочтительно, присоединяют к области тяжелой цепи, такой как, например, домены CH2 и СН 3 человеческого IgG1. Для продуцирования гибридных белков согласно изобретению могут быть также использованы и другие изоформы молекул Ig, такие как изоформы IgG2 или IgG4, или изоформы Ig других классов, такие как, например, IgM или IgA. Указанная константная область улучшает стабильность посредством стимуляции мультимеризации. Гибридные белки могут быть мономерными или мультимерными, либо гетеро- или гомомультимерными. Примеры стратегий для генерирования гибридных белков, содержащих белок и иммуноглобулиновый фрагмент, описаны в литературе (WO 91/08298; WO 96/08570; WO 93/22332; WO 04/085478; WO 01/03737, WO 02/66514). Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен зрелогоINSP052, может быть клонирована в экспрессионном векторе, присоединенном к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальную последовательность исходного INSP052 (или любую другую соответствующую сигнальную/секреторную последовательность) на своем 5'-конце, и к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей константную область тяжелой цепи лямбда человеческого иммуноглобулина IgG1 (NCBI Acc.CAA7 5302; сегмент 246-477) у его 3'-конца. Полученный вектор может быть использован для трансформации клеточной линии хозяина СНО или НЕК 293, и могут быть отобраны клоны, стабильно экспрессирующие и секретирующие рекомбинантный гибридный белок, имеющий внеклеточный домен INSP052 у N-конца и последовательность IgG1 у С-конца. Затем этот клон может быть использован для повышения уровня продуцирования и для улучшения очистки рекомбинантного гибридного белка из культуральной среды. Альтернативно, положение нуклеиновой кислоты, кодирующей константную область тяжелой цепи лямбда человеческого иммуноглобулина IgGl и внеклеточный домен INSP052 может быть изменено, и полученный белок может быть экспрессирован и секретирован с использованием исходной сигнальной последовательности INSP052, или другой соответствующей сигнальной/секреторной последовательности. Могут быть также генерированы гетеродимеры с использованием этой технологии путем коэкспрессии конструкций, кодирующих два различных гибридных белка в одной и той же клетке (WO 00/18932). Например, клетка может экспрессировать первый гибридный белок, содержащий внеклеточный домен INSP052, присоединенный к Fc-домену, и второй гибридный белок, содержащий Fc-домен,присоединенный к белку с другой активностью, такому как другой антагонист цитокинов, агент, связывающийся с коллагеном II (такой как агент, описанный WO 01/37861), и/или сам цитокин (такой как цитокин, описанный в WO 03/095488, WO 03/014359 и WO 03/035105). Если данный гибридный белок содержит область иммуноглобулина, то такое присоединение может быть осуществлено непосредственно или посредством короткого линкерного пептида, который может иметь длину по меньшей мере 1-3 аминокислотных остатка или более, например, 13 аминокислотных остатков. Указанным линкером может быть трипептид, имеющий последовательность, например, E-F-M(Glu-Phe-Met), или линкерную последовательность, состоящую из 13 аминокислот и содержащую последовательность Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, введенную между последовательностью соединения согласно изобретению и последовательностью иммуноглобулина. Полученный гибридный белок обладает улучшенными свойствами, такими как более длительное время пребывания в физиологических жидкостях (т.е. повышенное время полужизни), повышенная специфическая активность, повышенный уровень экспрессии или способность облегчать очистку этих гибридных белков. В другом предпочтительном варианте изобретения по меньшей мере одна молекула присоединена к одной или нескольким функциональным группам в полипептиде согласно изобретению, которые присутствуют в виде одной или нескольких боковых цепей на аминокислотных остатках. Такой молекулой предпочтительно является стабилизирующий полимер, позволяющий образовывать конъюгаты и комплексы (Harris J.M.Chess R.B. Nat. Rev. Drug. Discov. 2:214-221, 2003; Greenwald R.B. et al., Adv. Drug.Deliv. Rev. 55:217-250, 2003; Pillai 0.Panchagnula R. Cur. Opin. Chem. Biol. 5:447-451, 2001). Данный полимер может быть продуцирован после сайт-направленной модификации соответствующего остатка во внутреннем или в концевом положении. Аминокислотные остатки в полипептиде или в гибридном белке- 10010420 могут быть использованы для присоединения, при условии, что они имеют боковую цепь, способную присоединяться к полимеру (то есть боковую цепь аминокислоты, несущей функциональную группу,например, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, гистидина и т.п.). Альтернативно, остаток в этих сайтах может быть заменен другой аминокислотой, имеющей боковую цепь, способную присоединяться к полимеру. Например, дополнительный цистеин, позволяющий осуществлять прямое ПЭГилирование, может быть присоединен у N- или С-конца внеклеточного домена INSP052. Альтернативно, цистеин может быть включен в данный белок путем замены остатка, например, в соответствии с сайтом гликозилирования. Кроме того, боковые цепи генетически кодируемых аминокислот могут быть химически модифицированы для присоединения к полимеру, либо могут быть использованы неприродные аминокислоты с функциональными группами соответствующих боковых цепей. Полимеры могут быть также присоединены к углеводу или к другой молекуле, которая присоединена к боковой цепи аминокислоты в нужном положении. Полимеры, подходящие для этих целей, являются нетоксичными для биологических систем. Такие полимеры могут быть гидрофобными или гидрофильными по природе, биологически разлагаемыми или биологически неразлагаемыми, либо они могут обладать комбинацией этих свойств. Такими полимерами являются природные полимеры (такие как коллаген, желатин, целлюлоза, гиалуроновая кислота), в также синтетические полимеры (такие как сложные полиэфиры, сложные полиортоэфиры, полиангидриды). Примерами гидрофобных неразлагаемых полимеров являются полидиметилсилоксаны, полиуретаны,политетрафторэтилены, полиэтилены, поливинилхлориды и полиметилметакрилаты. Примерами гидрофильных неразлагаемых полимеров являются поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поливиниловый спирт,поли(N-винилпирролидон), полиалкилены, полиакриламид и их сополимеры. Предпочтительные полимеры содержат в качестве повторяющегося звена этиленоксид, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Предпочтительный метод присоединения предусматривает использование комбинированного метода пептидного синтеза и химического лигирования. Присоединение водорастворимого полимера может быть осуществлено посредством биологически разлагаемого линкера, в частности, в аминоконцевой области белка. В результате такой модификации продуцируется белок в форме предшественника (или"пролекарства"), из которой после расщепления линкера высвобождается белок, не модифицированный полимером. Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид согласно первому аспекту изобретения. Указанная очищенная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит или состоит из них: последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:1 (кодирующую полипептид экзона 1 INSP052); последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:3 (кодирующую полипептид экзона 2 INSP052); последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:5 (кодирующую полипептид экзона 3 INSP052); последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:7 (кодирующую полипептид экзона 4 INSP052); последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:9 (кодирующую полипептид экзона 5 INSP052); последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:11 (кодирующую полипептид экзона 6 INSP052); последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:13 (кодирующую полипептид экзона 7 INSP002); последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:15 (кодирующую полипептид INSP052); или последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID N0:17 (кодирующую полипептид INSP055), SEQ ID NO:20 (кодирующую внеклеточный домен полипептидаINSP052), SEQ ID No:22 (кодирующую внеклеточный домен зрелого полипептида INSP052), SEQ IDNO:24 (кодирующую экзон 2 зрелого полипептида INSP052), SEQ ID NO:26 (кодирующую зрелый полипептид INSP052), или избыточный эквивалент или фрагмент любой из этих последовательностей. При объединении последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ IDNO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:13, продуцируется последовательность, представленная в SEQ ID NO:25. В одном из вариантов своего второго аспекта настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который включает внеклеточный домен INSP052 (SEQ IDNO:20) или состоит из этого домена. Указанная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно содер- 11010420 жит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID N0:19, или состоит из нее. Эта последовательность также представлена на фиг. 7 одновременно рассматриваемой патентной заявки WO 03/093316, хотя эти последовательности включают гистидиновые остатки, присоединенные у С-конца. В одном из вариантов своего второго аспекта настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который включает внеклеточный домен зрелого INSP052 (SEQID NO:22) или состоит из этого домена. Указанная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:21, или состоит из нее. Эта последовательность также представлена на фиг. 7 одновременно рассматриваемой патентной заявкиWO 03/093316, хотя эти последовательности включают гистидиновые остатки, присоединенные у Сконца. В одном из вариантов своего второго аспекта настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, содержащий вариант внеклеточного домена зрелогоINSP052 или состоящий из этого варианта, который представляет собой фрагмент INSP052, содержащий домен Ig (SEQ ID NO:31). В своем третьем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту изобретения. В своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения. В своем пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированному вектором согласно четвертому аспекту изобретения. В своем шестом аспекте настоящее изобретение относится к лиганду, который специфически связывается с полипептидом согласно первому аспекту изобретения и который предпочтительно ингибирует активность указанного полипептида. Специалисту в данной области очевидно, что термин "лиганд" охватывает любую молекулу, которая специфически связывается с полипептидом согласно первому аспекту изобретения, включая, например, антитела и рецепторы-"сироты". Используемый авторами термин "активность полипептида согласно изобретению" и аналогичные понятия означают активность, присущую молекулам распознавания на клеточной поверхности, содержащим иммуноглобулиновые домены. В частности, этот термин также включает антагонистическую активность, направленную против цитокинов и определенную выше, в частности, активность, направленную на ингибирование экспрессии и/или секреции цитокинов, в частности, цитокинов TNF-альфа, IL-4 иIL-2. Антагонисты цитокинов согласно изобретению предпочтительно обладают иммуномодуляторной активностью. Примером такого применения полипептидов согласно изобретению является их использование для лечения Т-клеточно-опосредуемого воспаления кожи, такого как аллергический контактный дерматит и псориаз. Методы идентификации лигандов согласно шестому аспекту настоящего изобретения подробно описаны ниже. В частности, настоящее изобретение относится к способу идентификации соединения,которое представляет собой лиганд, специфически связывающийся с полипептидами SEQ ID NO:20 илиSEQ ID NO:22, где указанный способ включает контактирование полипептида согласно первому аспекту настоящего изобретения с одним или несколькими соединениями, которые, как предполагается, обладают аффинностью связывания с указанным полипептидом; и отбор соединения, специфически связывающегося с указанным полипептидом. Лиганды полипептидов согласно изобретению, идентифицированные такими способами, могут быть использованы для идентификации других антагонистов цитокинов. Например, методы скрининга могут включать контактирование, осуществляемое для идентификации соединений, связывающихся с указанными лигандами, такими как антитела, которые могут также действовать, как антагонисты цитокинов. В своем седьмом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, которое является эффективным с точки зрения изменения экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или с точки зрения регуляции активности полипептида согласно первому аспекту изобретения. Соединение согласно седьмому аспекту изобретения может либо повышать (служить агонистом),либо снижать (служить антагонистом) уровень экспрессии гена или активности полипептида. Важно отметить, что идентификация функции полипептидов INSP052 и INSP055 дает возможность разработать способы скрининга, позволяющие идентифицировать соединения, эффективные для лечения и/или диагностики заболеваний. Лиганды и соединения согласно шестому и седьмому аспекту изобретения могут быть идентифицированы с использованием таких способов. Эти способы также являются аспектами настоящего изобретения. В представленных ниже примерах со всей очевидностью продемонстрировано, что внеклеточный домен INSP052 может быть использован для лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, кожных болезней, заболеваний печени и печеночной недостаточности. В соответствии с этим получение соединения согласно седьмому аспекту настоящего изобретения, которое имитирует конфор- 12010420 мацию внеклеточного домена INSP052, или представляет собой агонист внеклеточного домена INSP052,является особенно предпочтительным, поскольку оно может найти свое применение для предупреждения или лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, заболеваний печени и печеночной недостаточности. В своем восьмом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду согласно первому аспекту изобретения или к молекуле нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или к вектору согласно четвертому аспекту изобретения, или к клетке-хозяину согласно пятому аспекту изобретения, или к лиганду согласно шестому аспекту изобретения, или к соединению согласно седьмому аспекту изобретения, которые могут быть использованы для лечения или диагностики предпочтительно воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, кожных болезней, заболеваний печени (включая вирусные и острые заболевания печени) и печеночной недостаточности (включая алкогольную печеночную недостаточность). Соединения согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения могут быть также использованы в целях изготовления лекарственного препарата для предупреждения или лечения заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, клеточно-пролиферативные расстройства, аутоиммунные/воспалительные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, неврологические и психические расстройства, нарушения развития, генетические нарушения, метаболические расстройства, инфекции и другие патологические состояния. Такими заболеваниями предпочтительно являются неоплазма, рак, опухоль головного мозга, глиома, опухоль кости, опухоль легких, опухоль молочной железы, опухоль предстательной железы, опухоль толстой кишки, гемангиома, миелопролиферативное расстройство, лейкоз, гематологическое заболевание, нейтропения, тромбоцитопения, нарушения ангиогенеза, кожное заболевание, старение, раны, ожоги, фиброз, сердечно-сосудистые заболевания, рестеноз, болезнь сердца, заболевание периферических сосудов, ишемическая болезнь сердца, отеки, тромбоэмболия, дисменорея, эндометриоз, преэклампсия,болезнь легких, ХОБЛ (хроническая обструктивная болезнь легких), астма, заболевание костей, почечное заболевание, гломерулонефрит, заболевание печени, болезнь Крона, гастрит, язвенный колит, язва, иммунное расстройство, аутоиммунное заболевание, артрит, ревматоидный артрит, псориаз, буллезный эпидермолиз, системная красная волчанка, анкилозирующий спондилит, болезнь Лайма, рассеянный склероз, нейродегенеративное расстройство, инсульт, повреждение головного мозга/спинного мозга, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, "болезни мотонейрона" (общее название группы заболеваний,характеризующихся поражением периферических мотонейронов), нервномышечное заболевание, ВИЧинфекции, СПИД, цитомегаловирусные инфекции, грибковые инфекции, глазные болезни, дегенерация желтого пятна, глаукома, диабетическая ретинопатия, повышенное глазное давление и другие состояния,в которых участвуют молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, в частности антагонисты цитокинов. Соединения согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения особенно предпочтительно использовать в целях изготовления лекарственного средства для лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, кожных болезней, заболеваний печени(включая вирусные и острые заболевания печени) и печеночной недостаточности (включая алкогольную печеночную недостаточность). Соединения согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения могут быть использованы в комбинации с другими терапевтическими средствами для лечения заболеваний, перечисленных выше. В частности, полипептиды согласно изобретению (включая гибридные белки), которые обладают антицитокиновой активностью, могут быть использованы в комбинации с другим терапевтическим средством. Поэтому настоящее изобретение относится к использованию (i) соединения согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения, в частности полипептида или гибридного белка, содержащего внеклеточный домен INSP052, и (ii) другого терапевтического средства в целях изготовления лекарственного средства для лечения заболеваний или состояний, в патогенезе которых участвуют предпочтительно цитокин TNF, IL-2 и/или IL-4. Такое заболевание или состояние предпочтительно выбирают из воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, кожных болезней,заболеваний печени (включая вирусные и острые заболевания печени) и печеночной недостаточности(включая алкогольную печеночную недостаточность). Другое терапевтическое средство может ингибировать такой же цитокин, как и полипептиды согласно изобретению, либо оно может ингибировать другую молекулу данного физиологического пути,вызывающую указанное заболевание, либо оно может ослаблять симптомы данного заболевания. Таким терапевтическим средством предпочтительно является антагонист цитокина (предпочтительно антагонист TNF, IL-2 и/или IL-4) или противовоспалительное средство. Примерами антагонистов цитокинов, которые могут быть использованы в качестве других терапевтически средств, являются антагонисты TNF-альфа, такие как этанерцепт, инфликсимаб (ингибитор TNFальфа-конвертирующего фермента, ингибитор ТАСЕ), и лефлуномид, используемый для лечения ревматоидного артрита; и антагонисты IL-2, такие как базилимаб и даклизумаб, используемые для предупреж- 13010420 дения отторжения трансплантата. Другим терапевтическим средством может быть также противовоспалительное средство, такое как стероидное или нестероидное противовоспалительное средство, либо другое средство, уже используемое для лечения аутоиммунного заболевания, кожной болезни, заболевания печени или печеночной недостаточности. Дополнительное терапевтическое средство может быть введено пациенту одновременно с соединением согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения, т.е. в виде смеси. Альтернативно, соединение согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения может быть введено пациенту, которому уже было введено терапевтическое средство, либо указанное терапевтическое средство может быть введено пациенту, которому уже было введено соединение согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения. Таким образом, указанное терапевтическое средство и указанное соединение, используемые в данной комбинации, могут быть введены одновременно, последовательно или отдельно. В своем девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболеваний у пациента, предусматривающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или оценку уровня активности полипептида согласно первому аспекту изобретения в ткани указанного пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, который отличается от указанного контрольного уровня,является показателем заболевания. Такой способ предпочтительно осуществляют in vitro. Аналогичные способы могут быть использованы для мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, где изменение уровня экспрессии или активности полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты в течение определенного периода времени по сравнению с контрольным уровнем служит показателем рецидива заболевания. Предпочтительный способ детекции полипептидов согласно первому аспекту изобретения включает стадии: (а) контактирования лиганда согласно шестому аспекту изобретения, такого как антитело, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (b) детекции указанного комплекса. Что касается девятого аспекта настоящего изобретения, то каждому читателю известно, что для детекции аномальных уровней белка существуют различные методы, такие как методы гибридизации нуклеиновой кислоты с короткими зондами, методы анализа на точковую мутацию, метод амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методы с использованием антител. Аналогичные методы могут применяться в течение коротких или продолжительных периодов времени, что позволяет наблюдать за терапевтическим лечением заболевания у пациента. Настоящее изобретение также относится к набору, который может быть использован в указанных методах диагностики заболевания. Заболеванием, диагностируемым способом в соответствии с девятым аспектом настоящего изобретения, является заболевание, в котором участвуют описанные выше молекулами распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены. Предпочтительным заболеванием, диагностируемым способом в соответствии с девятым аспектом настоящего изобретения, является воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание, кожная болезнь, заболевание печени (включая вирусное и острое заболевание печени) и печеночная недостаточность (включая алкогольную печеночную недостаточность). В своем десятом аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептидов согласно первому аспекту изобретения в качестве молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены. Важная роль Ig-доменов в рецепторах клеточной поверхности описана Lokker N.A. et al., "Functional importance of platelet-derived growth factor (PDGF) receptor extracellularimmunoglobulin-like domains. Identification of PDGF binding site and neutralizing monoclonal antibodies",J.Biol.Chem. 1997 Dec. 26; 272 (52) :33037-44. Настоящее изобретение также относится к использованию полипептидов согласно первому аспекту изобретения в качестве антагонистов цитокинов, описанных выше, в частности, антагонистов секрецииTNF-альфа, IL-4 и IL-2. В соответствии с этим полипептиды согласно изобретению могут действовать как антагонисты цитокинов посредством снижения уровней экспрессии цитокинов, уровней цитокиновой активности, уровней секреции цитокинов и т.п. Настоящее изобретение также относится к использованию молекулы нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения для экспрессии белка, обладающего активностью молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены. Настоящее изобретение также относится к способу стимуляции активности молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены, где указанный способ предусматривает использование полипептида согласно первому аспекту изобретения. В своем одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции,содержащей полипептид согласно первому аспекту изобретения или молекулу нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или вектор согласно четвертому аспекту изобретения,или клетку-хозяина согласно пятому аспекту изобретения, или лиганд согласно шестому аспекту изобретения, или соединение согласно седьмому аспекту изобретения в сочетании с фармацевтически прием- 14010420 лемым носителем. В соответствии с одним из вариантов одиннадцатого аспекта настоящего изобретения фармацевтическая композиция согласно изобретению может дополнительно содержать другое терапевтическое средство. Указанное другое терапевтическое средство может ингибировать такой же цитокин, как и полипептиды согласно изобретению, либо оно может ингибировать другую молекулу в данном физиологическом пути, вызывающую данное заболевание, либо оно может ослаблять симптомы данного заболевания. Таким терапевтическим средством предпочтительно является антагонист цитокина (предпочтительно антагонист TNF, IL-2 и/или IL-4) или противовоспалительное средство. Примерами антагонистов цитокинов, которые могут быть использованы в качестве других терапевтических средств, являются антагонисты TNF-альфа, такие как этанерцепт, инфликсимаб (ингибиторTNF-альфа-конвертирующего фермента, ингибитор ТАСЕ) и лефлуномид, используемый для лечения ревматоидного артрита; и антагонисты IL-2, такие как базилимаб и даклизумаб, используемые для предупреждения отторжения трансплантата. Другим терапевтическим средством может быть также противовоспалительное средство, такое как стероидное или нестероидное противовоспалительное средство,либо другое средство, уже используемое для лечения аутоиммунного заболевания, кожной болезни, заболевания печени или печеночной недостаточности. В своем двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду согласно первому аспекту изобретения или к молекуле нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или к вектору согласно четвертому аспекту изобретения, или к клетке-хозяину согласно пятому аспекту изобретения, или к лиганду согласно шестому аспекту изобретения, или к соединению согласно седьмому аспекту изобретения, которые могут быть использованы в целях изготовления лекарственного средства для диагностики или лечения заболеваний. Эти молекулы могут быть также использованы в целях изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, клеточно-пролиферативные расстройства, аутоиммунные/воспалительные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, неврологические и психические расстройства, нарушения развития, генетические нарушения, метаболические расстройства, инфекции и другие патологические состояния. Такими заболеваниями, предпочтительно, являются неоплазма, рак, опухоль головного мозга, глиома, опухоль кости, опухоль легких, опухоль молочной железы, опухоль предстательной железы, опухоль толстой кишки, гемангиома, миелопролиферативное расстройство, лейкоз, гематологическое заболевание, нейтропения, тромбоцитопения, нарушения ангиогенеза, кожное заболевание, старение,раны, ожоги, фиброз, сердечно-сосудистые заболевания, рестеноз, болезнь сердца, заболевание периферических сосудов, ишемическая болезнь сердца, отеки, тромбоэмболия, дисменорея, эндометриоз, преэклампсия, болезнь легких, ХОБЛ, астма, заболевание костей, почечное заболевание, гломерулонефрит,заболевание печени, болезнь Крона, гастрит, язвенный колит, язва, иммунное расстройство, аутоиммунное заболевание, артрит, ревматоидный артрит, псориаз, буллезный эпидермолиз, системная красная волчанка, анкилозирующий спондилит, болезнь Лайма, рассеянный склероз, нейродегенеративное расстройство, инсульт, повреждение головного мозга/спинного мозга, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, "болезни мотонейрона", нервномышечное заболевание, ВИЧ-инфекции, СПИД, цитомегаловирусные инфекции, грибковые инфекции, глазные болезни, дегенерация желтого пятна, глаукома, диабетическая ретинопатия, повышенное глазное давление и другие состояния, в которых участвуют молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены. Соединения согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения особенно предпочтительно использовать в целях изготовления лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, заболевания печени или печеночной недостаточности. В своем тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у пациента, предусматривающему введение указанному пациенту полипептида согласно первому аспекту изобретения или молекулы нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения,или вектора согласно четвертому аспекту изобретения, или клетки-хозяина согласно пятому аспекту изобретения, или лиганда согласно шестому аспекту изобретения или соединения согласно седьмому аспекту изобретения. В случае заболеваний, при которых уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или активность полипептида согласно первому аспекту изобретения ниже, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, указанные полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединение, вводимые данному пациенту, должны обладать агонистическими свойствами. И наоборот, в случае заболеваний, при которых уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или активность полипептида согласно первому аспекту изобретения выше, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, указанный полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединения, вводимые данному пациенту, должны обладать антагонистическими свойствами. Примерами таких антагонистов являются молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты, рибозимы и лиганды, такие как антитела.- 15010420 Предпочтительным заболеванием является заболевание, в котором участвуют молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены. Особенно предпочтительным заболеванием является воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание, заболевание печени или печеночная недостаточность. В своем четырнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным животным или к животным, дефицитным по полипептиду согласно первому аспекту изобретения, которые не являются человеком и которые были трансформированы так, что они экспрессируют более высокие или более низкие уровни такого полипептида или вообще не экспрессируют указанного полипептида. Такие трансгенные животные являются наиболее подходящими моделями для исследования заболеваний и могут быть также использованы в способах скрининга в целях идентификации соединений, которые являются эффективными для лечения или диагностики такого заболевания. Таким заболеванием предпочтительно является заболевание, которое ассоциировано с вышеописанными молекулами распознавания на клеточной поверхности, содержащими иммуноглобулиновые домены. Особенно предпочтительным заболеванием является воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание, заболевание печени или печеночная недостаточность. При этом следует отметить, что объем охраны для рассматриваемых полипептидов и нуклеиновых кислот согласно изобретению не распространяется на нуклеиновые кислоты или полипептиды, присутствующие в их природных источниках. Точнее говоря, полипептиды и нуклеиновые кислоты, заявленные в настоящем изобретении, могут рассматриваться как "выделенные" или "очищенные". Используемые здесь термины "выделенный" и "очищенный" относятся к нуклеиновой кислоте или полипептиду, выделенным по меньшей мере из одного другого компонента (например, нуклеиновой кислоты или полипептида), присутствующего вместе с нуклеиновой кислотой или с полипептидом в их природном источнике. Например, полипептид, содержащийся в экстракте ткани, может быть компонентом "выделенного" или"очищенного" полипептида, а также компонентом синтетически или рекомбинантно продуцированного полипептида. В одном из вариантов нуклеиновая кислота или полипептид присутствуют (если вообще присутствуют) только в растворителе, буфере, вместе с ионами или с другим соединением, обычно присутствующим в растворе указанных соединений. При этом следует отметить, что термины "выделенный" и "очищенный" не означают метод, с помощью которого были получены указанный полипептид или нуклеиновая кислота, или уровень чистоты этого препарата. Например, такие выделенные или очищенные молекулы могут быть продуцированы рекомбинантным способом, могут быть выделены непосредственно из нужной клетки или ткани, либо они могут быть продуцированы путем синтеза на основе определенных последовательностей. Краткое описание стандартных способов и процедур, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения, приводится ниже. Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретно описанными способами, протоколами, клеточными линиями, векторами и реагентами. Следует также отметить, что используемая здесь терминология приводится лишь в целях описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. Изобретательский уровень настоящего изобретения ограничивается лишь прилагаемой формулой изобретения. В этом описании используются стандартные сокращения, принятые для обозначения нуклеотидов и аминокислот. Если это не оговорено особо, то для осуществления настоящего изобретения могут быть использованы стандартные методы молекулярной биологии и микробиологии, методы рекомбинантных ДНК и методы иммунологии, которые хорошо известны специалистам в этой области. Более полное описание таких методов можно найти в литературе. Например, наиболее подходящее описание, которое может быть использовано в качестве консультации, приводится в следующих работах:(Springer Verlag, N.Y.); и Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and С. С Blackwell eds. 1986). Используемый здесь термин "полипептид" включает любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидными изостерами. Этот термин относится как к коротким цепям (пептидам или полипептидам), так и к более длинным цепям (белкам). Полипептид согласно изобретению может присутствовать в форме зрелого белка либо он может- 16010420 присутствовать в виде пре-, про- или препробелка, который может быть активирован путем отщепления пре-, про- или препрочасти этого белка с продуцированием активного зрелого полипептида. В таких полипептидах пре-, про- или препропоследовательность может представлять собой лидерную или секреторную последовательность либо она может представлять собой последовательность, используемую для очистки зрелой полипептидной последовательности. Полипептид согласно первому аспекту изобретения может образовывать часть гибридного белка. Например, часто оказывается предпочтительным, чтобы данный полипептид включал одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут содержать секреторную или лидерную последовательности, пропоследовательности, последовательности, облегчающие очистку, или последовательности, сообщающие белку более высокую стабильность, например, во время рекомбинантного продуцирования. Альтернативно или дополнительно, зрелый полипептид может быть присоединен к другому соединению, например к соединению, увеличивающему время полужизни указанного полипептида (например, к полиэтиленгликолю). Такие гибридные белки могут быть получены путем клонирования полинуклеотида, кодирующего полипептид, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 85% гомологична последовательности полипептида INSP052, в одной рамке считывания с последовательностями, кодирующими гетерологичную последовательность белка. Используемый здесь термин "гетерологичный" относится к любому полипептиду, отличающемуся от человеческого полипептида INSP052. Примеры гетерологичных последовательностей, которые могут присутствовать в гибридных белках у N- или С-конца, описаны выше, и такими примерами являются внеклеточные домены мембраносвязанного белка, константные области иммуноглобулина (Fc-области),домены мультимеризации, домены внеклеточных белков, сигнальные последовательности, секреторные последовательности и последовательности, облегчающие очистку аффинной хроматографией. Если это необходимо, то такая гетерологичная последовательность может быть элиминирована посредством протеолитического расщепления, как описано выше. В предпочтительном варианте изобретения указанный белок присоединен к константной области молекулы Ig. Такой белок предпочтительно присоединен к областям тяжелой цепи, таким как, например,домены СН 2 и СН 3 человеческого IgG1. Для продуцирования гибридных белков согласно изобретению могут быть также использованы и другие изоформы молекул Ig, такие как изоформы IgG2 или IgG4, или изоформы Ig других классов, такие как, например, IgM или IgA. Гибридные белки могут быть мономерными или мультимерными, либо гетеро- или гомомультимерными. В другом предпочтительном варианте изобретения функциональное производное содержит по меньшей мере одну молекулу, присоединенную к одной или нескольким функциональным группам, которые присутствуют в виде одной или нескольких боковых цепей на аминокислотных остатках. Предпочтительной молекулой является молекула полиэтиленгликоля (ПЭГ). ПЭГилирование может быть осуществлено известными методами, такими как, например, методы,описанные в WO 99/55377. Полипептиды могут содержать аминокислоты, которые отличаются от 20 аминокислот, кодируемых генами, и которые являются модифицированными либо в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, либо в результате применения химических методов модификации,хорошо известных специалистам. Примерами известных модификаций, которые могут быть осуществлены в полипептидах согласно изобретению, являются гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гамма-карбоксилирование, например, остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование иADP-рибозилирование. Другими возможными модификациями являются ацетилирование, ацилирование,амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное сшивание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей,образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, образование GPI-якоря, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование,пренилирование, рацемизация, селеноилирование, присоединение аминокислот к белкам, опосредуемое переносом РНК, такое как аргинилирование; и убихитинизация. В частности, аминокислотное производное может содержать замещенные или незамещенные алкильные группы, которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими, и могут включать один или несколько гетероатомов. Аминокислотные производные могут быть получены de novo, либо они могут быть получены из коммерчески доступных источников (Calbiochem-Novabiochem AG, Switzerland; Bachem, USA). Указанные модификации осуществляют для получения полипептидов согласно изобретению, которые могут быть легко очищены и которые обладают повышенной эффективностью и/или улучшенными фармакокинетическими свойствами. Например, если пептид является восприимчивым к расщеплению пептидазами после его инъекции индивидууму, то эта проблема может быть решена путем замены особенно чувствительной пептидной связи нерасщепляемым пептидным миметиком, в результате чего мож- 17010420 но получить более стабильный пептид, который является более подходящим для использования в качестве терапевтического средства. Аналогично, замена L-аминокислотного остатка является стандартным способом получения пептида, менее чувствительного к протеолизу, и, в конечном счете, соединения,более похожего на органические соединения, а не на пептиды. Для модификации полипептидов согласно изобретению могут быть также использованы аминоконцевые блокирующие группы, такие как третбутилоксикарбонил, ацетил, теил, сукцинил, метоксисукцинил, суберил, адипил, азелаил, данзил, бензилоксикарбонил, флуоренилметоксикарбонил, метоксиазелаил, метоксиадипил, метоксисуберил и 2,4 динитрофенил. Специалистам известны и многие другие модификации, способствующие повышению эффективности, увеличению активности, облегчению очистки и/или увеличению времени полужизни, а также методы синтеза и получения пептидных миметиков, которые описаны в литературе (WO 02/10195; Villain M.A. et al., Curr. Opin. Drug. Discov. Devel. 4:428-34, 2001). (Dougherty D.A. Curr. Opin. Chem. Biol. 4:645-52,2000). Модификации могут присутствовать в любом участке полипептида, включая пептидный остов,аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксиконцы. Действительно, блокирование амино- или карбоксиконца в полипептиде, либо того и другого, посредством ковалентной модификации является обычным процессом, происходящим в природных и синтетических полипептидах, и такие модификации могут присутствовать в полипептидах согласно изобретению. Модификации, которые присутствуют в полипептиде, в большинстве случаев будут зависеть от способа получения данного полипептида. Для полипептидов, полученных рекомбинантным методом,природа и степень модификации по большей части будет определяться способностью к посттрансляционной модификации конкретной клетки-хозяина и присутствием сигналов модификации в аминокислотной последовательности рассматриваемого полипептида. Например, характер гликозилирования может варьироваться у клеток-хозяев различного типа. Полипептиды согласно изобретению могут быть получены любым подходящим способом. Такими полипептидами являются выделенные природные полипептиды (например, выделенные из клеточной культуры), полипептиды, продуцированные рекомбинантным методом (включая гибридные белки), синтетические полипептиды или полипептиды, продуцированные с использованием комбинации этих методов. Функционально эквивалентные полипептиды согласно первому аспекту изобретения могут представлять собой полипептиды, гомологичные полипептидам INSP052 и INSP055, а предпочтительно внеклеточный домен INSP052 (т.е. SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:22). Два полипептида могут быть определены используемым здесь термином "гомологичные", если последовательность одного из этих полипептидов имеет достаточно высокую степень идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида. Термин "идентичность" означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей, эти две последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки. Термин"сходство" означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей, эти две последовательности имеют аминокислотные остатки аналогичного типа. Степень идентичности и сходства может быть легко определена. (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed. Oxford UniversitySequence Analysis Primer, Gribskov, M.,Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991). Поэтому гомологичными полипептидами являются природные биологические варианты (например,аллельные варианты или варианты полипептидов, образовавшиеся в результате географических изменений видов, от которых они происходят), и мутанты (такие как мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции или делеции) полипептидов INSP052 и INSP055, предпочтительно внеклеточного домена INSP052. Такими мутантами могут быть полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком), и таким замененным аминокислотным остатком может быть, а может и не быть, остаток, кодируемый генетическим кодом. Обычно такими заменами являются замены между Ala, Val, Leu и Ile; между Ser и Thr; между кислотными остатками Asp и Glu; между Asn и Gln; между основными остатками Lys и Arg; или между ароматическими остатками Phe иTyr. Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько, т.е. от 5 до 10, от 1 до 5, от 1 до 3, от 1 до 2 аминокислот или только одна аминокислота являются замененными, делетированными или добавленными в любой комбинации. Особенно предпочтительными являются "молчащие" замены,добавления и делеции, которые не влияют на свойства и активность указанного белка. Также предпочтительными являются консервативные замены. Такими мутантами также являются полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков включают группу-заместитель. Обычно считается, что два полипептида, имеющие идентичность более чем на 30%, являются функционально эквивалентными. Предпочтительно, чтобы последовательности функционально эквива- 18010420 лентных полипептидов согласно первому аспекту изобретения были более чем на 80% идентичны полипептидам INSP052 и INSP055 или их активных фрагментов. Более предпочтительными являются полипептиды, имеющие идентичность более 85, 90, 95, 98 или 99% соответственно. Функционально эквивалентными полипептидами согласно первому аспекту изобретения могут быть также полипептиды, которые были идентифицированы с применением одного или нескольких методов сопоставления первичных последовательностей путем их выравнивания. Например, технология информационной обработки потока данных для генома (Inpharmatica Genome Threader), которая является одним из аспектов способов поиска, используемых для генерирования базы данных поиска Biopendium, может быть применена (см. международную патентную заявкуPCT/GB 01/01105, опубликованную как WO 01/69507) для идентификации полипептидов с неизвестными функциями, в отношении которых, несмотря на их низкую степень идентичности по сравнению с полипептидами INSP052 иINSP055, высказывается предположение, что они представляют собой молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, где указанный способ предусматривает использование полипептида согласно первому аспекту изобретения и где указанное предположение основано на их значительной структурной гомологии с последовательностями полипептидов INSP052 иThreader позволяет предсказать, что два указанных белка имеют структурную гомологию с достоверностью по меньшей мере на 10%, а более предпочтительно по меньшей мере на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,90% и выше. Полипептиды согласно первому аспекту изобретения также включают фрагменты полипептидовINSP052 и INSP055, и фрагменты функциональных эквивалентов полипептидов INSP052 и INSP055, при условии, что эти фрагменты сохраняют активность молекул распознавания на клеточной поверхности,содержащих иммуноглобулиновые домены, или имеют общую антигенную детерминанту с полипептидами INSP052 и INSP055. Используемый здесь термин "фрагмент" означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является идентичной части, но не всей, аминокислотной последовательности полипептидов INSP052 и INSP055, либо одному из их функциональных эквивалентов. Эти фрагменты должны содержать по меньшей мере n смежных аминокислот данной последовательности, и в зависимости от конкретной последовательности n предпочтительно равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Небольшие фрагменты могут образовывать антигенную детерминанту. Указанные фрагменты могут присутствовать в "свободной форме", т.е. не являться частью другого полипептида или не быть присоединенными к другим аминокислотам или полипептидам, либо они могут входить в состав более крупного полипептида, часть или область которого они образуют. Если фрагмент согласно изобретению входит в состав более крупного полипептида, то наиболее предпочтительно, чтобы такой фрагмент образовывал одну непрерывную область. Например, некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к фрагменту, имеющему пре- и/или прополипептидную область, присоединенную к аминоконцу указанного фрагмента, и/или дополнительную область, присоединенную к карбоксильному концу этого фрагмента. Однако несколько фрагментов могут входить в состав одного более крупного полипептида. Полипептиды согласно изобретению или их иммуногенные фрагменты (содержащие по меньшей мере одну антигенную детерминанту) могут быть использованы для генерирования лигандов, таких как поликлональные или моноклональные антитела, которые обладают иммуноспецифичностью к таким полипептидам. Указанные антитела могут быть использованы для выделения или для идентификации клонов, экспрессирующих полипептиды согласно изобретению, или для очистки данных полипептидов аффинной хроматографией. Как совершенно очевидно для любого читателя, такие антитела, помимо других применений, могут быть также использованы в качестве диагностических или терапевтических средств. Термин "иммуноспецифический" означает, что данные антитела имеют в основном более высокую аффинность к полипептидам согласно изобретению, чем к другим родственным полипептидам, описанным ранее. Используемый здесь термин "антитело" означает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как Fab, F(ab')2 и Fv, которые способны связываться с рассматриваемой антигенной детерминантой. Такие антитела связываются с полипептидами согласно первому аспекту изобретения. Под понятием "значительно более высокая аффинность" авторы подразумевают заметно повышенную аффинность к полипептиду согласно изобретению по сравнению с аффинностью известных молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены. При этом, предпочтительно, чтобы аффинность по отношению к полипептиду согласно изобретению по меньшей мере в 1,5, 2, 5, 10, 100, 103, 104, 105 или 106 раз превышала аффинность по отношению к известным молекулам распознавания на клеточной поверхности, содержащим иммуноглобулиновые домены. Если желательно использовать поликлональные антитела, то выбранное млекопитающее, такое как мышь, кролик, коза или лошадь, может быть иммунизовано полипептидом согласно первому аспекту изобретения. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен методами- 19010420 рекомбинантных ДНК, либо он может быть синтезирован методом химического синтеза. Если необходимо, то данный полипептид может быть конъюгирован с белком-носителем. Обычно используемыми носителями, к которым могут быть химически присоединены данные полипептиды, являются альбумин бычьей сыворотки, тироглобулин и гемоцианин лимфы улитки. Затем связанный полипептид может быть использован для иммунизации животного. Сыворотку, взятую у иммунизованного животного, собирают и обрабатывают известными методами, например иммуноаффинной хроматографией. Моноклональные антитела против полипептидов согласно первому аспекту изобретения могут быть легко продуцированы средним специалистом. Общая методика получения моноклональных антител с использованием гибридомной техники хорошо известна специалистам (см., например, Kohler G.Milstein, С. Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72(1983); Cole et al., 77-96, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985. Панели моноклональных антител, продуцированных против полипептидов согласно первому аспекту изобретения, могут быть скринированы на различные свойства, т.е. на изотип, эпитоп, аффинность и т.п. Моноклональные антитела являются особенно подходящими для очистки отдельных полипептидов,против которых они направлены. Альтернативно, гены, кодирующие нужные моноклональные антитела,могут быть выделены из гибридом, например, методами ПЦР, известными специалистам, а также они могут быть клонированы и экспрессированы в соответствующих векторах. Могут быть также использованы химерные антитела, в которых нечеловеческие вариабельные области соединены или лигированы с человеческими константными областями (см., например, Liu et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 (1987. Эти антитела могут быть модифицированы так, чтобы они были менее иммуногенными для индивидуума, например, путем их "гуманизации" (см. Jones et al., Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al., J. Immunol., 147, 1709 (1991); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA,86, 10029 (1989); Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 34181 (1991) and Hodgson et al.,Bio/Technology, 9, 421 (1991. Используемый здесь термин "гуманизованное антитело" означает молекулы антитела, в которых аминокислоты CDR и другие выбранные аминокислоты в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей нечеловеческого донорного антитела были заменены эквивалентными аминокислотами человеческого антитела. Таким образом, гуманизованное антитело имеет близкое сходство с человеческим антителом, но при этом оно обладает способностью связываться с донорным антителом. В другом альтернативном варианте изобретения таким антителом может быть "биспецифическое" антитело, т.е. антитело, имеющее два различных антиген-связывающих домена, каждый из которых обладает специфичностью к различным эпитопам. Для отбора генов, кодирующих антитела, обладающие способностью связываться с полипептидами согласно изобретению, либо из репертуара ПЦР-амплифицированных V-генов лимфоцитов человека,скринированных на способность вырабатывать соответствующие антитела, либо из библиотеки "необученных" лимфоцитов, может быть использована техника фагового представления (McCafferty J. et al.,(1990), Nature 348, 552-554; Marks J. et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). Аффинность этих антител может быть также увеличена путем перестановки цепей (Clackson Т. et al. (1991) Nature 352, 624-628). Антитела, генерированные вышеописанными методами, независимо от того, являются ли они поликлональными или моноклональными, обладают и другими ценными свойствами, т.е. они могут быть использованы в качестве реагентов в иммуноанализах, радиоиммуноанализах (РИА) или твердофазных иммуноферментных анализах (ELISA). Для использования в этих целях антитела могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоизотоп, флуоресцентная молекула или фермент. Предпочтительными молекулами нуклеиновой кислоты согласно второму и третьему аспекту изобретения являются молекулы, которые кодируют полипептидные последовательности, представленные вID NO:24 или SEQ ID NO:26, и функционально эквивалентные полипептиды, например варианты внеклеточного домена INSP052, такие как фрагмент INSP052, содержащий домен Ig (SEQ ID NO:31), или гибридные белки, состоящие из внеклеточного домена INSP052, или их варианты, присоединенные к одной или нескольким дополнительным полипептидным последовательностям. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы в способах и в целях, описанных в настоящей заявке. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению предпочтительно содержат по меньшей мере n смежных нуклеотидов в описанных здесь последовательностях, где n, в зависимости от конкретной последовательности, равно 10 или более (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или более). Молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению также являются последовательности,комплементарные последовательностям молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше (например,используемые в качестве антисмысловых последовательностей или в качестве зондов). Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут присутствовать в форме РНК, такой как мРНК, или в форме ДНК, включая, например, кДНК, синтетическую ДНК или геномную ДНК. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами клонирования, химического синтеза или их комбинации. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены, например, методом химического- 20010420 синтеза таким, как твердофазный фосфорамидитный химический синтез, из геномных или кДНКбиблиотек или путем выделения из микроорганизма. РНК-молекулы могут быть в основном генерированы путем in vitro- или in vivo-транскрипции ДНК-последовательностей. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Одноцепочечной ДНК может быть кодирующая цепь, также известная, как смысловая цепь, либо некодирующая цепь, также называемая антисмысловой цепью. Термин "молекула нуклеиновой кислоты" также охватывает аналоги ДНК и РНК, такие как аналоги,содержащие модифицированные остовы и связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (PNA). Используемый здесь термин "PNA" означает антисмысловую молекулу или антиген, который содержит олигонуклеотид, состоящий по меньшей мере из пяти нуклеотидов, и присоединенный к пептидному остову из аминокислотных остатков, которые предпочтительно заканчиваются лизином. Этот концевой лизин сообщает данной композиции растворимость. PNA могут быть ПЭГилированы для продления их времени жизни в клетке, где они, предпочтительно, связываются с комплементарной одноцепочечной ДНК и РНК и приостанавливают элонгацию транскрипта (Nielsen P.E. et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63). Эти молекулы могут также иметь различные последовательности, которые вследствие вырожденности генетического кода, кодируют полипептид SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 и/или SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:18, или внеклеточный домен INSP052 или его варианты, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:31. Такими молекулами могут быть, но не ограничиваются ими, кодирующая последовательность для отдельного зрелого полипептида; кодирующая последовательность для зрелого полипептида и дополнительные кодирующие последовательности, такие как последовательности, кодирующие лидерную или секреторную последовательность, такую как про-, пре- или препро-полипептидную последовательность; кодирующая последовательность зрелого полипептида с вышеупомянутыми дополнительными кодирующими последовательностями или без них, либо вместе с дополнительными некодирующими последовательностями, включая некодирующие 5'- и 3'-последовательности, такие как транскрибированные нетранслированные последовательности, которые играют определенную роль в транскрипции (включая сигналы терминации), в связывании с рибосомой и в обеспечении стабильности мРНК. Молекулами нуклеиновой кислоты могут быть также вспомогательные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, такие как аминокислоты, обладающие дополнительными функциональными свойствами. Молекулы нуклеиновой кислоты второго и третьего аспектов настоящего изобретения могут также кодировать фрагменты или функциональные эквиваленты полипептидов и фрагментов согласно первому аспекту изобретения. Такая молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой природный вариант, такой как природный аллельный вариант, либо указанной молекулой может быть вариант, не встречающийся в природе. Указанные неприродные варианты молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами мутагенеза, включая методы, применяемые к молекулам нуклеиновой кислоты, к клеткам или к организмам. Среди рассматриваемых вариантов имеются варианты, которые отличаются от вышеупомянутых молекул нуклеиновой кислоты тем, что они имеют нуклеотидные замены, делеции или инсерции. Такие замены, делеции или инсерции могут быть сделаны в одном или нескольких нуклеотидах. Указанные варианты могут быть модифицированы в кодирующей или в некодирующей области или в той и другой областях. Альтерации в кодирующих областях могут приводить к консервативным или неконсервативным аминокислотным заменам, делециям или инсерциям. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть также сконструированы методами, в основном известными специалистам, включая в зависимости от ряда факторов модификацию клонирования, процессинга и/или экспрессии генного продукта (полипептида). Перестановка ДНК путем рандомизированной фрагментации и повторной сборки генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов с помощью ПЦР представляет собой технологию, которая может быть использована для конструирования нуклеотидных последовательностей. Сайт-направленный мутагенез может быть использован для введения новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтительности кодонов, продуцирования вариантов сплайсинга, введения мутаций и т.п. Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид согласно первому аспекту изобретения, могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью так, чтобы полученная комбинированная молекула нуклеиновой кислоты кодировала гибридный белок. Такие комбинированные молекулы нуклеиновой кислоты входят во второй или третий аспект настоящего изобретения. Например, для скрининга пептидных библиотек на ингибиторы активности указанного полипептида с использованием такой комбинированной молекулы нуклеиновой кислоты может оказаться полезным экспрессировать гибридный белок, который может распознаваться коммерчески доступным антителом. Гибридный белок может быть также сконструирован так, чтобы он содержал сайт расщепления, расположенный между последовательностью полипептида согласно изобретению и последовательностью гетерологичного белка, и чтобы такой полипептид мог быть отщеплен и выделен из указанного гетерологичного белка. Молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть также антисмысловые молекулы, которые являются частично комплементарными молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим- 21010420 полипептиды согласно изобретению, а поэтому они гибридизуются с кодирующими молекулами нуклеиновой кислоты (гибридизация). В соответствии с методами, хорошо известными специалистам, указанные антисмысловые молекулы, такие как олигонуклеотиды, могут быть сконструированы так, чтобы они распознавали нужную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид согласно изобретению, специфически связывались с этой нуклеиновой кислотой и предупреждали ее транскрипцию (см., например,Cohen J.S., Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J. Neurochem 56, 560 (1991); Lee et al., Nucleic Acids Res 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991. Используемый здесь термин "гибридизация" означает присоединение двух молекул нуклеиновой кислоты друг к другу посредством водородных связей. Обычно одна молекула может быть фиксирована на твердом носителе, а другая молекула может находиться в растворе в свободном состоянии. Затем эти две молекулы могут быть подвергнуты контакту друг с другом в условиях, благоприятствующих образованию водородной связи. Факторами, влияющими на образование таких связей, являются тип и объем растворителя; температура реакции; время гибридизации; перемешивание; присутствие агентов, блокирующих неспецифическое связывание молекулы в жидкой фазе с твердым носителем (реагента Денхардта или BLOTTO); концентрация молекул; использование соединений, повышающих скорость ассоциации молекул (сульфата декстрана или полиэтиленгликоля); и жесткость условий промывки после гибридизации (Sambrook et al., [см. выше]). Ингибирование гибридизации полностью комплементарной молекулы с молекулой-мишенью может быть оценено с использованием гибридизационного анализа, известного специалистам (Sambrook etal. [см. выше]). Следует отметить, что молекула со значительной степенью гомологии будет затем конкурировать с полностью гомологичной молекулой за связывание с молекулой-мишенью и ингибировать это связывание в различных условиях жесткости, как описано у Wahl G.M. и S.L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) и Kimmel A.R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511). Термин "жесткость" означает условия реакции гибридизации, которые благоприятствуют ассоциации в высокой степени гомологичных молекул, но не благоприятствуют ассоциации отличающихся молекул. Условия гибридизации высокой жесткости определяются как условия инкубирования в течение ночи при 42 С в растворе, содержащем 50% формамид, 5 SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрийцитрат),50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5 раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1 SSC приблизительно при 65 С. Условия гибридизации низкой жесткости предусматривают реакцию гибридизации, осуществляемую при 35 С (Sambrook et al. [см. выше]). Предпочтительными условиями гибридизации являются условия гибридизации высокой жесткости. В предпочтительных вариантах этого аспекта настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые по всей своей длине по меньшей мере на 70% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды INSP052 или INSP055 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ IDNO:17, или последовательности нуклеиновой кислоты, представленной на фиг. 7, или кодирующей части последовательности нуклеиновой кислоты, представленной на фиг. 7 (т.е. SEQ ID NO:19 или SEQ IDNO:21), SEQ ID NO:23 или SEQ ID NO:25), и к молекулам нуклеиновой кислоты, которые в основном комплементарны указанным молекулам нуклеиновой кислоты. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала область, которая по всей своей длине по меньшей мере на 80% идентична кодирующей последовательности для SEQ IDNO:2, представленной в SEQ ID NO:1; кодирующей последовательности для SEQ ID NO:4, представленной в SEQ ID NO:3; кодирующей последовательности для SEQ ID NO:6, представленной в SEQ ID NO:5; кодирующей последовательности для SEQ ID NO:8, представленной в SEQ ID NO:7; кодирующей последовательности для SEQ ID NO:10, представленной в SEQ ID NO:9; кодирующей последовательности дляSEQ ID NO:12, представленной в SEQ ID NO:11; кодирующей последовательности для SEQ ID NO:14,представленной в SEQ ID NO:13; кодирующей последовательности для SEQ ID NO:16, представленной вSEQ ID NO:15; кодирующей последовательности для SEQ ID NO:18, представленной в SEQ ID NO:17,кодирующей последовательности для SEQ ID NO:24, представленной в SEQ ID NO:23; кодирующей последовательности для SEQ ID NO:26, представленной в SEQ ID NO:25, либо чтобы эта молекула представляла собой комплементарную им молекулу нуклеиновой кислоты. Особенно предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота по всей своей длине была по меньшей мере на 80% идентична кодирующей последовательности для внеклеточного домена INSP052 (внеклеточного домена зрелого INSP052 или внеклеточного домена INSP052, содержащего сигнальный пептид), представленного на фиг. 7. При этом особенно предпочтительно, чтобы молекулы нуклеиновой кислоты по всей своей длине были по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, а особенно предпочтительно по меньшей мере на 98 или 99% идентичны указанным последовательностям. Предпочтительными вариантами этого аспекта являются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, которые обладают в основном такой же биологической функцией или активностью, как и полипептиды INSP052 и INSP055.- 22010420 Настоящее изобретение относится к способу детекции молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, включающему стадии: (а) контактирования нуклеотидного зонда согласно изобретению с биологическим образцом в условиях гибридизации, способствующих образованию дуплексов; и (b) детекции любого из таких образованных дуплексов. Как будет дополнительно обсуждаться ниже в связи с анализами, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты, описанная выше, может быть использована в качестве гибридизационного зонда для РНК, кДНК или геномной ДНК в целях выделения полноразмерных кДНК и геномных клонов, кодирующих полипептиды INSP052 и INSP055, и в целях выделения кДНК и геномных клонов гомологичных и ортологичных генов, имеющих высокую степень сходства с генами, кодирующими этот полипептид. В этой связи, наряду с другими известными методами могут применяться обсуждаемые здесь методы, которые описаны ниже в качестве иллюстрации. Методы секвенирования и анализа ДНК хорошо известны и в основном доступны специалистам и могут реально применяться для осуществления многих вариантов настоящего изобретения, обсуждаемых в настоящей заявке. В указанных методах могут использоваться ферменты, такие как фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I, секвеназа (US BiochemicalCorp., Cleveland, ОН), полимераза Taq (Perkin Elmer), термостабильная полимераза Т 7 (Amersham, Chicago, IL) или комбинация таких полимераз и корректирующие экзонуклеазы, такие как экзонуклеазы,присутствующие в ELONGASE Amplification System, и поставляемые Gibco/BRL (Gaithersburg, MD). Способ секвенирования может быть, предпочтительно, автоматизирован с использованием устройств,таких как аппарат Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), термоячейка Peltier Thermal Cycler(Perkin Elmer). Одним из методов выделения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с функцией, эквивалентной функции полипептидов INSP052 и INSP055, является зондирование библиотеки геномных ДНК или кДНК природным или искусственно сконструированным зондом с использованием стандартных процедур, известных специалистам (см., например, "Current Protocols in Molecular Biology",Ausubel et al. (eds). Greene Publisching Associates and Wiley Interscience, New York, 1989, 1992). Особенно подходящими являются зонды, содержащие по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 30,а более предпочтительно по меньшей мере 50 непрерывно следующих друг за другом оснований, которые соответствуют или комплементарны последовательностям нуклеиновой кислоты, происходящим от соответствующего кодирующего гена (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ IDID NO:23, SEQ ID NO:25). Для облегчения идентификации такие зонды могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом. Подходящими реагентами являются, но не ограничиваются ими, радиоизотопы, флуоресцентные красители и ферменты, способные катализировать образование детектируемого продукта. С использованием этих зондов средний специалист может самостоятельно выделить комплементарные копии полинуклеотидов геномной ДНК, кДНК или РНК, кодирующих представляющие интерес белки, происходящие от различных источников, например, человека, млекопитающего или других животных, и скринировать эти источники на присутствие родственных последовательностей, например, других членов семейства, типа и/или подтипа. Во многих случаях выделенные кДНК-последовательности будут неполными, т.е. в этих последовательностях область, кодирующая полипептид, будет сильно обрезана, обычно у 5'-конца. Для получения полноразмерных кДНК или для удлинения коротких кДНК существует несколько методов. Такие последовательности можно удлинить с использованием неполной нуклеотидной последовательности и с применением различных известных методов детекции расположенных выше последовательностей, таких как промоторы и регуляторные элементы. Например, одним из методов, который может быть использован в данном случае, является метод быстрой амплификации кДНК-концов (RACE; см., например, Frohman etal., PNAS USA 85, 8998-9002, 1998). Недавно разработанные модификации этой технологии, проиллюстрированные, например, Marathon T.M. (Clontech Laboratories Inc.), значительно упростили поиск более длинных кДНК. Для поиска неизвестной последовательности нуклеиновой кислоты, которая является смежной с известным локусом, может быть использован слегка модифицированный метод, который называется "сайт-рестрикционной" ПЦР и предусматривает использование универсальных праймеров(Sarkar G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322). Для амплификации или для удлинения последовательностей с использованием различных праймеров, полученных на основе известной области, может быть также использована обратная ПЦР (Triglia T. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186). Другим методом,который может быть использован в данном случае, является ПЦР "с захватом", которая представляет собой ПЦР-амплификацию ДНК-фрагментов, смежных с известной последовательностью в искусственной хромосомной ДНК человека и дрожжей (Lagerstrom M. et al., (1991) PCR Methods Applic. 1, 111-119). Другим методом, который может быть использован для поиска неизвестных последовательностей, является метод Parker J.D. et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060). Кроме того, можно использовать ПЦР, "гнездовые" праймеры и библиотеки PromoterFinderTM для "прогулки" по геномной ДНК(Clontech, Palo Alto, CA). Этот способ позволяет избежать необходимости скрининга библиотек и может- 23010420 быть использован для обнаружения участков стыка интрон/экзон. При скрининге на полноразмерные кДНК предпочтительно использовать библиотеки, которые были отобраны по размерам и содержат более крупные кДНК. Предпочтительными также являются библиотеки рандомизированных праймеров, которые могут включать дополнительные последовательности,содержащие 5'-области генов. Использование библиотеки рандомизированных праймеров может оказаться особенно предпочтительным в том случае, если библиотека oligo-d(T) не дает полноразмерной кДНК. Геномные библиотеки могут быть использованы для удлинения последовательности с получением 5'-нетранскрибированных регуляторных областей. В одном из вариантов осуществления изобретения молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть использованы для определения локализации в хромосоме. В этом методе молекула нуклеиновой кислоты может быть нацелена на конкретный участок, либо она может быть гибридизована с конкретным участком на отдельной хромосоме человека. В соответствии с настоящим изобретением картирование релевантных последовательностей в хромосомах является важным звеном в подтверждении корреляции этих последовательностей с геноассоциированным заболеванием. После картирования последовательности с определением ее точной локализации, физическое положение последовательности на хромосоме может быть сопоставлено с данными генетической карты. Эти данные можно найти, например, в работе V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (имеющейся в настоящее время в библиотеке Уэлльского медицинского университета Джона Хопкинса) (John Hopkins University Welch MedicalLibrary). Взаимосвязь между генами, которые могут быть картированы на одной и той же области хромосомы, и заболеваниями, ассоциированными с ними, затем идентифицируют с помощью анализа на сцепление генов (совместное наследование физически смежных генов). Это позволяет исследователям получить ценную информацию, которая может быть использована для поиска генов, ассоциированных с данным заболеванием, с применением метода позиционного клонирования или других методов обнаружения генов. После предварительного определения локализации генов, ассоциированных с данным заболеванием или синдромом, путем анализа на сцепление генов с конкретной областью генома, любое картирование последовательностей на данном участке может дать информацию об ассоциированных или регуляторных генах, которая может быть использована для последующих исследований. Молекула нуклеиновой кислоты может быть также использована для детекции различий в хромосомной локализации, обусловленных транслокацией, инверсией и т.п., у нормальных индивидуумов, индивидуумов-носителей и у индивидуумов с заболеванием. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению также являются ценным материалом для определения локализации в тканях. Такие методы позволяют определять характер экспрессии полипептида в тканях путем детекции мРНК, которая их кодирует. Такими методами являются методы гибридизации in situ и методы амплификации нуклеотидов, такие как ПЦР. Результаты этих исследований позволяют получить определенные сведения относительно нормальных функций данного полипептида в организме. Кроме того, в этих исследованиях сравнение нормального характера экспрессии мРНК с экспрессией мРНК, кодируемой мутантным геном, позволяет получить важную информацию о роли мутантных полипептидов в данном заболевании. Такая аномальная экспрессия может иметь кратковременную, пространственную или количественную природу. Для ингибирования эндогенной экспрессии гена, кодирующего полипептид согласно изобретению,могут быть также использованы методы "отключения" гена. Одним из методов, который может быть использован для "отключения" последовательность-специфического посттрансляционного гена, является интерференция РНК (RNAi) (Elbashir S.M. et al., Nature 2001, 411, 494-498). Короткие дцРНКолигонуклеотиды синтезируют in vitro и вводят в клетку. Последовательность-специфическое связывание этих дцРНК-олигонуклеотидов запускает процесс деградации мРНК-мишени, что приводит к снижению уровня или к отмене экспрессии целевого белка. Эффективность методов "отключения" гена, описанных выше, может быть оценена путем определения уровня экспрессии полипептидов (например, с помощью Вестерн-блоттинга), а на РНК-уровне,она может быть оценена с помощью методики, основанной на TaqMan. Векторы согласно изобретению содержат молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению и могут представлять собой клонирующие или экспрессирующие векторы. Клетки-хозяева согласно изобретению, которые могут быть трансформированы, трансфицированы или трансдуцированы векторами согласно изобретению, могут быть прокариотическими или эукариотическими. Полипептиды согласно изобретению могут быть получены в рекомбинантной форме посредством экспрессии кодирующих эти полипептиды молекул нуклеиновой кислоты в векторах, содержащихся в клетке-хозяине. Такие методы экспрессии хорошо известны специалистам, и многие из них подробно описаны у Sambrook et al. (см. выше) и FernandezHoeffler (1998, eds. "Gene expression systems. Usingnature for the art of expression". Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto). Для продуцирования полипептида в нужном хозяине могут быть использованы в основном любые системы или любые векторы, подходящие для поддержания, амплификации или экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Подходящая нуклеотидная последовательность может быть встроена в экспресси- 24010420 онную систему любым из хорошо известных и рутинных методов, таких как методы, описанные у Sambrook et al. (см. выше). В общих чертах кодирующий ген может быть помещен под контроль регуляторного элемента, такого как промотор, сайт связывания с рибосомой (для экспрессии в бактериях), и необязательно, оператор, так, чтобы ДНК-последовательность, кодирующая нужный полипептид, транскрибировалась в РНК в трансформированной клетке-хозяине. Примерами подходящих экспрессионных систем являются, например, хромосомная, эписомная и вирусная системы, включая, например, векторы, происходящие от бактериальных плазмид, бактериофага, транспозонов, дрожжевых эписом, инсерционных элементов, дрожжевых хромосомных элементов,вирусов, таких как бакуловирус, паповавирусы, такие как SV40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы,вирусы оспы домашней птицы, псевдорабивирусы и ретровирусы, или их комбинации, а также векторы,происходящие от плазмидных и бактериофаговых генетических элементов, включая космиды и фагмиды. Для доставки более крупных фрагментов ДНК, чем те, которые могут содержаться и экспрессироваться в плазмиде, могут быть также использованы искусственные человеческие хромосомы (НАС). Особенно подходящими экспрессионными системами являются микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными ДНКэкспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными экспрессирующими векторами (например,бакуловирусом); клеточные системы растений, трансформированные вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом мозаики табака, TMV) или векторами для экспрессии в бактериях (например, плазмидами Ti или pBR322); или клеточные системы животных. Для продуцирования полипептидов согласно изобретению могут быть также использованы бесклеточные системы трансляции. Введение молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид согласно изобретению, в клетки-хозяева, может быть осуществлено методами, описанными во многих известных лабораторных руководствах, таких как руководство Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) и Sambrook et al.[см. выше]. Особенно подходящими методами являются трансфекция с использованием фосфата кальция; трансфекция, опосредованная DEAE-декстраном; трансфекция; микроинжекция; трансфекция, опосредованная катионным липидом; электропорация; трансдукция; загрузка путем соскоба; введение методом биобаллистики или инфицирование (смотрите, Sambrook et al.,1989, [см. выше], Ausubel et al., 1991[см. выше], Spector, GoldmanLeinwald, 1998). В эукариотических клетках, экспрессионные системы могут быть, при необходимости, либо временными (например, эписомными), либо перманентными (хромосомная интеграция). Кодирующая молекула нуклеиновой кислоты может включать, а может и не включать, последовательность, кодирующую регуляторную последовательность, такую как сигнальный пептид или лидерная последовательность, если это необходимо, например, для секреции транслируемого полипептида в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное пространство. Эти сигналы могут быть эндогенными по отношению к полипептиду, либо они могут быть гетерологичными. Лидерные последовательности могут быть удалены бактериальным хозяином при посттрансляционном процессинге. Помимо обычных регуляторных последовательностей может оказаться желательным добавление регуляторных последовательностей, которые обеспечивают регуляцию экспрессии полипептида в зависимости от роста клетки-хозяина. Примерами таких регуляторных последовательностей являются последовательности, которые обеспечивают увеличение или снижение уровня экспрессии гена в ответ на химическую или физическую стимуляцию, включая присутствие регуляторного соединения, или в ответ на различные температурные или метаболические условия. Регуляторными последовательностями являются нетранслируемые области вектора, такие как энхансеры, промоторы и 5'- и 3'-нетранслируемые области. Эти последовательности взаимодействуют с клеточными белками хозяина, в результате чего осуществляется транскрипция и трансляция. Такие регуляторные последовательности могут варьироваться по своей длине и специфичности. В зависимости от выбранной векторной системы и выбранного хозяина могут быть использованы любые подходящие транскрипционные и трансляционные элементы, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Например, для клонирования в бактериальных системах,могут быть использованы индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор lacZ фагмидыBlueScript (Stratagene, LaJolla, CA) или плазмиды pSportl (Gibco BRL) и т.п. В клетках насекомых может использоваться бакуловирусный промотор полиэдрина. Промоторы или энхансеры, происходящие от геномов растительных клеток (например, гена белка теплового шока, RUBISCO и гена запасных белков) или от вирусов растений (например, вирусных промоторов или лидерных последовательностей),могут быть клонированы в указанный вектор. В клеточных системах млекопитающих предпочтительными являются промоторы, происходящие от генов млекопитающих или от вирусов млекопитающих. Если необходимо генерировать клеточную линию, содержащую множество копий данной последовательности,то могут быть использованы векторы на основе SV40 или EBV с соответствующим селективным маркером. Экспрессионный вектор конструируют так, чтобы в этом векторе конкретная кодирующая последо- 25010420 вательность нуклеиновой кислоты присутствовала вместе с соответствующими регуляторными последовательностями и чтобы положение и ориентация кодирующей последовательности по отношению к регуляторным последовательностям позволяли такой кодирующей последовательности транскрибироваться под "контролем" регуляторных последовательностей, т.е. так, чтобы РНК-полимераза, которая связывается с ДНК-молекулой у регуляторных последовательностей, осуществляла транскрипцию кодирующей последовательности. В некоторых случаях может оказаться необходимым модифицировать указанную последовательность так, чтобы она могла присоединяться к регуляторным последовательностям в соответствующей ориентации, т.е. с сохранением рамки считывания. Указанные регуляторные последовательности и другие регуляторные последовательности могут быть лигированы с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты перед встраиванием в вектор. Альтернативно, такая кодирующая последовательность может быть клонирована непосредственно в экспрессирующий вектор, который уже содержит регуляторные последовательности и соответствующий рестрикционный сайт. Для длительного высокоэффективного продуцирования рекомбинантного полипептида предпочтительной является стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют нужный полипептид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов,которые могут содержать вирусные сайты инициации репликации и/или эндогенные экспрессионные элементы и выбранный маркерный ген, присутствующий на том же самом или на отдельном векторе. После введения этого вектора клетки могут быть оставлены на 1-2 дня для роста в обогащенной среде,которую затем заменяют селективной средой. Селективный маркер необходим для сообщения резистентности для отбора, и его присутствие позволяет культивировать и выделять клетки, успешно экспрессирующие введенные последовательности. Резистентные клоны стабильно трансформированных клеток могут быть подвергнуты пролиферации методами культивирования ткани, подходящими для клеток данного типа. Клеточные линии млекопитающих, подходящие в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны специалистам, и такими клеточными линиями являются многие иммортализованные клеточные линии,имеющиеся в Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими,клетки яичника китайского хомячка (СНО), HeLa, почек детенышей хомячка (ВНК), почек обезьяны(COS), C127, ЗТ 3, ВНК, НЕК 293, меланомы Боуэса, гепатоцеллюлярной карциномы человека (например,Hep G2) и ряд других клеточных линий. Что касается бакуловирусной системы, то материалы для получения экспрессионных систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными и поставляются в наборах, inter alia, отInvitrogen, San Diego CA (набор "МахВас"). В общих чертах эти методы известны специалистам и подробно описаны у SummersSmith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin1555 (1987). Клетками-хозяевами, особенно подходящими для использования в данной системе, являются клетки насекомых,такие как клетки Drosophila S2 и клетки Spodoptera Sf9. Специалистам известно множество систем экспрессии генов в клеточных культурах растений и в целых растениях. Примерами подходящих систем экспрессии генов в клетках растений являются системы, описанные в патентах США 5693506, 5659122 и 5608143. Другие примеры экспрессии генов в клеточных культурах растений описаны Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3863 (1991). В частности, можно использовать любые растения, из которых могут быть выделены и культивированы протопласты с последующим генерированием из них целых регенерированных растений, которые содержат перенесенный ген. Из культивируемых клеток или тканей могут быть регенерированы практически все растения, включая, но не ограничиваясь ими, все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых, а также овощных растений. Примерами особенно предпочтительных бактериальных клеток-хозяев являются клетки стрептококков, стафилококков, Е. coli, Streptomyces и Bacillus subtilis. Примерами особенно подходящих клеток-хозяев для экспрессии в грибах являются дрожжевые клетки (например, S. cerevisiae) и клетки Aspergillus. Любые системы отбора, которые могут быть использованы для выделения трансформированных клеточных линий, известны специалистам. Примерами являются гены тимидинкиназы (Wigler M. et al.(1977) Cell 11:223-32) и аденин-фосфорибозилтрансферазы вируса простого герпеса (Lowy I. et al. (1980)Cell 22:817-23), которые могут быть использованы в tk- или aprt-клетках соответственно. Кроме того, в качестве основы для отбора могут быть использованы гены резистентности к антиметаболиту, антибиотику или к гербициду, например ген дигидрофолат-редуктазы (DHFR), который сообщает резистентность к метотрексату (Wigler M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); ген npt, который сообщает резистентность к аминогликозидам, неомицину и к G-418 (Colbere-Garapin F. et al.(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14), и гены als или pat, которые сообщают резистентность к хлорсульфурон- и фосфинотрицин-ацетилтрансферазе соответственно. Были описаны и другие селективные гены, примеры которых хорошо известны специалистам. Хотя присутствие или отсутствие экспрессии маркерного гена позволяет предположить, что присутствует также и нужный ген, однако, его присутствие и экспрессия еще нуждаются в подтверждении.- 26010420 Например, если соответствующая последовательность была встроена в последовательность маркерного гена, то трансформированные клетки, содержащие соответствующие последовательности, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген может находиться в тандеме с последовательностью, кодирующей полипептид согласно изобретению, находящийся под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индуцирование или отбор обычно указывает также на экспрессию гена в этом тандеме. Альтернативно, клетки-хозяева, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид согласно изобретению, и которые экспрессируют указанный полипептид, могут быть идентифицированы различными методами, известными специалистам. Такими методами являются,но не ограничиваются ими, ДНК-ДНК или ДНК-РНК-гибридизация и биоанализы на присутствие белка,например, сортировка клеток по интенсивности флуоресценции (FACS) или иммуноанализы (такие как твердофазный иммуноферментный анализ [ELISA] и радиоиммуноанализ [РИА]), которые предусматривают использование мембран, растворов или чипов для детекции и/или количественной оценки нуклеиновой кислоты или белка (см. Hampton R. et al. (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APSPress, St Paul, MN) и Maddox D.E. et al., (1983) J. Exp. Med. 158, 1211-1216). Существует широкий ряд методов мечения и конъюгирования, известных специалистам, и эти методы могут быть использованы в различных анализах на присутствие нуклеиновых кислот и аминокислот. Методами, используемыми в целях продуцирования меченых зондов для гибридизации или ПЦРзондов для детекции последовательностей, родственных молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды согласно изобретению, являются мечение олигонуклеотидами, ник-трансляция, мечение по концам или ПЦР-амплификация с использованием меченого полинуклеотида. Альтернативно, последовательности, кодирующие полипептид согласно изобретению, могут быть клонированы в вектор для продуцирования мРНК-зонда. Такие векторы известны специалистам, являются коммерчески доступными и могут быть использованы для синтеза РНК-зондов in vitro путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, такой как Т 7, Т 3 или SP6, и меченых нуклеотидов. Эти процедуры могут быть проведены с использованием различных коммерчески доступных наборов (PharmaciaUpjoin (Kalamazoo,MI); Promega (Madison WI) и U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH. Подходящими репортерными молекулами или метками, которые могут быть использованы для облегчения детекции, являются радионуклиды, ферменты и флуоресцентные, хемилюминисцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть также использованы для генерирования трансгенных животных, в частности, грызунов. Такие трансгенные животные входят в дополнительный аспект настоящего изобретения. Это генерирование может быть осуществлено путем локальной модификации соматических клеток или манипуляций с зародышевыми линиями для введения наследуемых модификаций. Такие трансгенные животные могут быть, в частности, использованы для генерирования животных-моделей в целях поиска молекул лекарственных средств, которые являются эффективными в качестве модуляторов полипептидов согласно изобретению. Полипептид может быть выделен и очищен из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными методами, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиаппатитах и хроматографию на лектине. Для очистки наиболее подходящей является высокоэффективная жидкостная хроматография. В случае, если данный полипептид был денатурирован в процессе выделения и/или очистки, то для восстановления активной конформации может быть использована хорошо известная техника рефолдинга белков. Если необходимо, то для облегчения очистки белков могут быть также использованы специальные векторные конструкции, полученные путем присоединения последовательностей, кодирующих полипептиды согласно изобретению, к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидный домен,который облегчает очистку растворимых белков. Примерами таких доменов, облегчающих очистку белков, являются пептиды, образующие хелатные комплексы с металлами, такие как гистидинтриптофановые модули, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованных металлах; домены белка А, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине; и домен, используемый в системе удлинения/аффинной очистки FLAGS (Immunex Corp., Seattle, WA). Для облегчения очистки между доменом для очистки и полипептидом согласно изобретению могут быть включены расщепляемые линкерные последовательности, такие как последовательности, специфичные к фактору ХА или энтерокиназе (Invitrogen, San Diego, CA). Один из таких экспрессионных векторов обеспечивает экспрессию гибридного белка, содержащего полипептид согласно изобретению, присоединенный к нескольким гистидиновым остаткам, за которыми следуют тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы. Гистидиновые остатки облегчают проведение очистки с помощью IMAC (аффинной хроматографии на иммобилозованном ионе металла, описанной Porath J. et al. (1992), Prot. Exp. Purif. 3:263-281),тогда как тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы позволяют выделять полипептид из гибридного белка. Обсуждение векторов, содержащих гибридные белки, можно найти у Kroll D.J. et al.(1993; DNA Cell Biol. 12:441-453). Если экспрессируемый полипептид используется в аналитическом скрининге, то обычно предпочтительно, чтобы он был продуцирован на поверхности клетки-хозяина, в которой он экспрессируется. В этом случае клетки-хозяева могут быть собраны до их использования в скрининг-анализе, например, таким методом, как сортировка клеток с возбуждением флуоресценции (FACS) или иммуноаффинным методом. Если полипептид секретируется в среду, то такая среда может быть восстановлена для выделения и очистки экспрессированного полипептида. Если полипептид продуцируется внутри клетки, то перед выделением полипептида эти клетки должны быть сначала подвергнуты лизису. Полипептид согласно изобретению может быть использован для скрининга библиотек соединений в любом из различных методов скрининга, применяемых для поиска лекарственных средств. Такие соединения могут стимулировать (служить агонистами) или ингибировать (служить антагонистами) экспрессию гена или активность полипептида согласно изобретению, а поэтому они составляют дополнительный аспект настоящего изобретения. Предпочтительными соединениями являются соединения, способные влиять на экспрессию природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или регулировать активность полипептида согласно первому аспекту изобретения. Соединения-агонисты или соединения-анатагонисты могут быть выделены, например, из клеток,бесклеточных препаратов, химических библиотек или смесей природных продуктов. Такими агонистами или антагонистами могут быть природные или модифицированные субстраты, лиганды, ферменты, рецепторы, либо структурные или функциональные миметики. Подходящее описание таких методов скрининга можно найти в работе Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2):Chapter 5 (1991). Соединения, которые могут рассматриваться как наиболее вероятные кандидаты на хорошие антагонисты, представляют собой молекулы, которые связываются с полипептидом согласно изобретению,но не индуцируют каких-либо биологических эффектов полипептида после связывания с ним. Потенциальными антагонистами являются небольшие органические молекулы, пептиды, полипептиды и антитела, которые связываются с полипептидом согласно изобретению и, тем самым, ингибируют или подавляют его активность. Таким образом, связывание полипептида с нормальными связывающимися клеточными молекулами может ингибироваться так, чтобы подавлялась нормальная биологическая активность такого полипептида. Полипептид согласно изобретению, который используется в таком методе скрининга, может находиться в растворе в свободном состоянии, может быть иммобилизован на твердом носителе или может присутствовать на клеточной поверхности, либо он может быть локализован внутри клетки. В основном такие процедуры скрининга могут предусматривать использование соответствующих клеток или клеточных мембран, экспрессирующих полипептид, который контактирует с тестируемым соединением, что приводит к связыванию, либо к стимуляции или ингибированию функционального ответа. Функциональный ответ клеток, контактируемых с тестируемым соединением, сравнивают с ответами контрольных клеток, которые не контактировали с этим тестируемым соединением. С помощью подходящей системы детекции такой анализ позволяет определить, может ли в присутствии тестируемого соединения продуцироваться сигнал, генерируемый активацией указанного полипептида. Ингибиторы активации обычно анализируют в присутствии известного агониста, и оценивают влияние этого агониста на активацию в присутствии тестируемого соединения. Предпочтительный способ идентификации соединения, являющегося агонистом или антагонистом по отношению к полипептиду согласно изобретению, включает:(a) контактирование клетки, экспрессирующей на своей поверхности полипептид согласно первому аспекту изобретения, где указанный полипептид ассоциирован со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, и где указанное соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом; и(b) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом, либо его активации или ингибирования путем измерения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия указанного соединения с указанным полипептидом. Еще более предпочтительный способ идентификации агониста или антагониста полипептида согласно изобретению включает:(a) контактирование клетки, экспрессирующей на своей поверхности полипептид, где указанный полипептид ассоциирован со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, и где указанное соединение скринируют в условиях,стимулирующих связывание с указанным полипептидом; и(b) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом, либо его активации или ингибирования путем сравнения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия указанного соединения с указанным полипептидом, с уровнем сигнала, полученного в отсутствие указанного соединения. В других предпочтительных вариантах изобретения общие методы, описанные выше, могут, кроме того, включать осуществление идентификации агониста или антагониста в присутствии меченого или немеченного лиганда для полипептида. Термин "лиганд" понятен любому специалисту, и этот термин- 28010420 охватывает любую молекулу, которая специфически связывается с полипептидом согласно первому аспекту изобретения, включая, например, антитела и рецепторы-"сироты". В другом варианте изобретения способ идентификации агониста или антагониста полипептида согласно изобретению включает определение факта ингибирования связывания лиганда с клетками, которые содержат полипептид согласно изобретению на своей поверхности, или с клеточными мембранами,содержащими такой полипептид, в присутствии соединения-кандидата в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом, и определение количества лиганда, связанного с указанным полипептидом. Считается, что соединение, способное приводить к снижению уровня связывания с лигандом,является агонистом или антагонистом. При этом предпочтительно, чтобы указанный лиганд был меченым. Более конкретно способ скрининга соединения, являющегося агонистом или антагонистом по отношению к полипептиду, включает стадии:(a) инкубирования меченого лиганда с целой клеткой, экспрессирующей полипептид согласно изобретению на своей поверхности, или с клеточной мембраной, содержащей полипептид согласно изобретению;(b) измерения количества меченого лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной;(c) добавления соединения-кандидата к смеси меченого лиганда и целой клетки или клеточной мембраны стадии (а) и доведения этой смеси до состояния равновесия;(d) измерения количества меченого лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной, после проведения стадии (с); и(e) сравнения различия в количествах связанного меченого лиганда стадий (b) и (d), где соединение,вызывающее снижение уровня связывания в стадии (d), считается агонистом или антагонистом. В описанных выше анализах было обнаружено, что эти полипептиды могут обеспечивать дозозависимую модуляцию ряда физиологических и патологических процессов. Таким образом, понятие "функциональные эквиваленты" полипептидов согласно изобретению включает полипептиды, которые обладают любой аналогичной и дозозависимой модулирующей активностью, обнаруживаемой в вышеописанных анализах. Хотя степень такой дозозависимой активности необязательно должна быть идентичной степени активности полипептидов согласно изобретению, однако, предпочтительные "функциональные эквиваленты" обладают дозозависимой активностью, в основном аналогичной активности полипептидов согласно изобретению, обнаруживаемой в вышеописанном анализе на активность. В некоторых описанных выше вариантах настоящего изобретения могут быть использованы простые анализы на связывание, в которых адгезию тестируемого соединения на поверхности, несущей данный полипептид, детектируют с помощью метки, непосредственно или опосредованно ассоциированной с тестируемым соединением, или с помощью анализа на конкуренцию с меченым соединениемконкурентом. В другом варианте осуществления изобретения могут быть использованы конкурентные анализы на скрининг лекарственных средств, в которых нейтрализующие антитела, способные связываться с данным полипептидом, специфически конкурируют за связывание с тестируемым соединением. Таким образом, указанные антитела могут быть использованы для детекции на присутствие любого тестируемого соединения, обладающего специфической аффинностью связывания с указанным полипептидом. Каждый специалист может самостоятельно разработать анализы для идентификации модуляторов полипептида согласно изобретению. В этой связи особый интерес представляет работа Lokker N.A. et al.,J.Biol.Chem. 1997 Dec. 26; 272 (52) :33037-44, в которой описан пример анализа для идентификации антагонистов (в данном случае, нейтрализующих антител). Могут быть также разработаны анализы для детекции влияния добавленных тестируемых соединений на продуцирование мРНК, кодирующей указанный полипептид, в клетках. Например, анализ ELISA может быть разработан так, чтобы можно было измерить секретированные или клеточноассоциированные уровни полипептида с использованием моноклональных или поликлональных антител стандартными методами, известными специалистам, и этот анализ может быть использован для поиска соединений, которые могут ингибировать или усиливать продуцирование полипептида из соответствующим образом модифицированных клеток или тканей. Затем может быть определен уровень образования связывающих комплексов между полипептидом и тестируемым соединением. Аналитическими способами, которые также входят в объем настоящего изобретения, являются способы, предусматривающие использование генов и полипептидов согласно изобретению в анализах на сверхэкспрессию или в анализах на исключение. Такие анализы предусматривают манипуляцию с уровнями указанных генов/полипептидов в клетках и оценку влияния этой манипуляции на физиологию модифицированных клеток. Например, такие эксперименты позволяют точно выявить пути передачи сигнала и метаболические пути, в которых участвуют конкретные гены/полипептиды, а также получить информацию относительно идентичности полипептидов, с которыми взаимодействуют исследуемые полипептиды, и найти ключ к разгадке механизмов, с помощью которых регулируются родственные гены и белки.- 29010420 Другой метод, который может быть использован для скрининга лекарственных средств, дает возможность осуществлять высокоэффективный скрининг соединений, обладающих подходящей аффинностью связывания с нужным полипептидом (см. международную патентную заявку WO 84/03564). В этом методе большое число различных небольших тестируемых соединений синтезируют на твердом субстрате, который затем может быть подвергнут реакции с полипептидом согласно изобретению и промывке. Одним из способов иммобилизации полипептида является использование ненейтрализующих антител. Связанный полипептид может быть затем детектирован методами, хорошо известными специалистам. Очищенный полипептид также может быть непосредственно нанесен на планшеты для последующего использования в вышеупомянутых способах скрининга на лекарственные средства. Полипептид согласно изобретению может быть использован для идентификации мембраносвязанных или растворимых рецепторов с помощью стандартной техники связывания с рецептором, известной специалистам, такой как анализы на связывание и перекрестное сшивание с лигандом, в которых данный полипептид метят радиоактивным изотопом, химически модифицируют или присоединяют к пептидной последовательности, которая облегчает его детекцию или очистку, и инкубируют с источником предполагаемого рецептора (например, с композицией клеток, клеточными мембранами, клеточными супернатантами, тканевыми экстрактами или с физиологическими жидкостями). Эффективность связывания может быть определена биофизическими методами, такими как поверхностный плазмонный резонанс и спектроскопия. Анализы на связывание могут быть использованы для очистки и клонирования рецептора, но они могут быть также использованы и для идентификации агонистов и антагонистов указанного полипептида, которые конкурируют с указанным полипептидом за связывание с рецептором. Стандартные методы проведения скрининг-анализов хорошо известны специалистам. Настоящее изобретение также относится к набору для скрининга, используемому в методах идентификации агонистов, антагонистов, лигандов, рецепторов, субстратов и ферментов, описанных выше. Настоящее изобретение также относится к агонистам, антагонистам, лигандам, рецепторам, субстратам, ферментам и к другим соединениям, модулирующим активность или антигенность полипептида согласно изобретению в соответствии с описанными выше механизмами. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение согласно изобретению в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем. Эти композиции могут быть использованы в качестве терапевтических или диагностических реагентов, в качестве вакцин или в качестве других иммуногенных композиций,подробно описанных ниже. В соответствии с используемой здесь терминологией композиция, содержащая полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение [X], считается "в основном не содержащей" примесей [здесь,Y], если по меньшей мере 85 мас.% от всего количества X+Y в данной композиции составляет X. Предпочтительно X составляет по меньшей мере примерно 90% от общей массы X+Y в данной композиции, а более предпочтительно по меньшей мере примерно 95, 98 или даже 99 мас.%. Фармацевтические композиции предпочтительно должны содержать терапевтически эффективное количество полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты, лиганда или соединения согласно изобретению. Используемый здесь термин "терапевтически эффективное количество" означает количество терапевтического агента, необходимого для лечения, ослабления или предупреждения рассматриваемого заболевания или состояния, или для достижения детектируемого терапевтического или профилактического эффекта. Для каждого соединения терапевтически эффективная доза может быть сначала оценена либо в анализах клеточной культуры, например, опухолевых клеток, либо на животных-моделях, обычно на мышах, кроликах, собаках или свиньях. Животное-модель может быть также использовано для определения соответствующего интервала концентраций и способа введения. Такая информация может быть затем использована для определения подходящих доз и способов их введения человеку. Точное эффективное количество соединения для введения человеку будет зависеть от тяжести патологического состояния, общего состояния здоровья индивидуума, его возраста, веса, пола и режима питания, от времени и частоты введения лекарственного средства, а также от комбинации(й) лекарственных средств, чувствительности данного индивидуума к реакции и его переносимости/восприимчивости к данной терапии. Такое количество может быть определено путем рутинного экспериментирования и может быть установлено врачом-клиницистом. В общих чертах эффективная доза может составлять от 0,01 до 50 мг/кг, предпочтительно от 0,05 до 10 мг/кг. Композиции могут быть введены пациенту либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами, лекарственными средствами или гормонами. Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель,подходящий для введения терапевтического средства. Такими носителями являются антитела и другие полипептиды, гены и другие терапевтические средства, такие как липосомы, при условии, что этот носитель сам по себе не индуцирует вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию, и что этот вводимый носитель не является чрезмерно токсичным. Подходящими носителями могут быть крупные макромолекулы с замедленным метаболизмом, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы.