Слитые белки аналогов glp-1

008831 Область изобретения Настоящее изобретение относится к аналогам глюкагонподобного пептида, слитым с белками, которые обладают эффектом продления периода полужизни пептидов in vivo. Эти слитые белки могут быть использованы для лечения диабета, а также целого ряда других состояний или расстройств. Уровень техники Аналоги и производные глюкагонподобного пептида-1 (GLP-1) хорошо показали себя в клинических испытаниях при лечении диабета II типа. GLP-1 стимулирует многочисленные биологические эффекты, такие как стимулирование секреции инсулина, ингибирование секреции глюкагона, ингибирование опорожнения желудка, ингибирование моторики желудка или моторики кишечника и стимулирование снижения массы тела. Существенной характеристикой GLP-1 является его способность стимулировать секрецию инсулина в отсутствие связанной с этим опасности гипогликемии, которая наблюдается при проведении инсулинотерапии или некоторых видов лечения полости рта, которые действуют за счет повышения экспрессии инсулина. Методы лечения с применением пептидов GLP-1 ограничены тем, что GLP-1(1-37) проявляет слабую активность, а два встречающихся в природе усеченных пептида, GLP-1(7-37)ОН и GLP-1(7-36)NH2,быстро очищаются in vivo и имеют чрезвычайно короткий период полужизни in vivo. Известно, что полученная эндогенно дипептидил-пептидаза IV (DPP-IV) инактивирует циркуляцию пептидов GLP-1 за счет удаления N-концевых остатков гистидина и аланина и является основной причиной короткого периода полужизни in vivo. Предлагались различные методы продления периода полувыведения пептида GLP-1 из плазмы или выведения пептида из организма при одновременном сохранении биологической активности. Один из таких подходов заключается в слиянии пептида GLP-1 с частью Fc иммуноглобулина. Как правило, иммуноглобулины обладают длительным периодом полужизни in vivo. Например, молекулы иммуноглобулина G могут иметь период полужизни в человеческом организме до 23 дней. За эту устойчивость in vivo частично отвечает часть Fc иммуноглобулина. Слитые белкиGLP-1-Fc обладают устойчивостью, которая также обеспечивается частью Fc иммуноглобулина, сохраняя при этом биологическую активность молекулы GLP-1. Хотя этот метод осуществим при терапии с применением GLP-1 (см. публикацию WO 02/46227),существует проблема, связанная с антигенными свойствами различных слитых белков при многократном введении препаратов в течение продолжительных периодов времени. Эта проблема особенно актуальна при терапии слитыми белками GLP-1-Fc, поскольку пациент, страдающий диабетом, должен проходить курс лечения на протяжении всей своей жизни после того, как поставлен диагноз болезни. Кроме того,терапия слитыми белками Fc может вызвать нежелательный эффект, если часть Fc сохраняет функции эффектора. Сущность изобретения Целью настоящего изобретения является решение проблем, связанных с потенциальной иммуногенностью и активностью эффектора, которые обусловлены введением вставок GLP-1-Fc, путем идентификации специфических слитых белков GLP-1-Fc, у которых снижена способность вызывать иммунный ответ после их многократного и продолжительного введения и которые не обладают функцией эффектора. Эти специфичные слитые белки имеют замены в различных положениях в части GLP-1, а также частиFc молекулы. Описываемые здесь замены приводят к получению повышенной эффективности, повышенной устойчивостью in vivo, устраняют функцию эффектора и снижают вероятность того, что молекула будет распознаваться адаптивными элементами иммунной системы. Соединения согласно настоящему изобретению включают в себя гетерологичные слитые белки, содержащие аналог GLP-1, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из где Хаа в положении 16 означает Pro или Glu; Хаа в положении 17 означает Phe, Val или Ala; Хаа в положении 18 означает Leu, Glu или Ala; Хаа в положении 80 означает Asn или Ala и Хаа в положении 230 означает Lys либо отсутствует. С-конец части аналога GLP-1 и N-конец части Fc гетерологичных слитых белков по изобретению предпочтительно подвергают слиянию при помощи 1, 1,5 или 2 повторов G-богатого пептидного линкера, имеющего последовательность Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQID NO: 8). В настоящем изобретении также описаны полинуклеотиды, кодирующие гетерологичные слитые белки по изобретению, а также векторы и клетки-хозяева, содержащие такие полинуклеотиды. Методы лечения пациентов, страдающих инсулиннезависимым сахарным диабетом, а также инсулинзависимым сахарным диабетом, ожирением и различными иными нарушениями и состояниями, которые заключаются во введении описываемых здесь гетерологичных слитых белков, также охватываются настоящим изобретением. Гетерологичные слитые белки по изобретению содержат часть аналога GLP-1 и часть Fc. Часть аналога GLP-1 и часть Fc содержат замены по отношению к последовательности нативного GLP-1 и последовательности человеческого IgG4 соответственно, которые приводят к получению белка с повышенной активностью и устойчивостью in vivo по сравнению с нативным GLP-1 или аналогами GLP-1 analogs, не-2 008831 слитыми с последовательностью Fc, при этом снижающие возможность стимулировать образование антител после продолжительного и многократного введения в человеческий организм. Нативный GLP-1 обрабатывают in vivo так, что первые шесть аминокислот отщепляются от молекулы. Таким образом, как хорошо известно из уровня техники, аминоконцу GLP-1 присваивается номер 7, а карбоксильному концу - номер 37. Другие аминокислоты в полипептиде нумеруются последовательно, как показано в SEQ ID NO: 9. Например, положение 8 представляет собой аланин, а положение 22 глицин. Обработанный пептид можно подвергнуть дальнейшей модернизации in vivo так, что остаток Сконцевого глицина удаляется и замещается амидной группой. Таким образом, GLP-1(7-37)ОН и GLP-1(736)амид представляют собой две нативные формы молекулы. GLP-1(7-37)ОН имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9: Часть аналога GLP-1 гетерологичного слитого белка включает в себя три первичных замены в положениях 8, 22 и 36 относительно нативного GLP-1(7-37). Замена в положении 8 понижает скорость, при которой эндогенный фермент дипептидил-пептидаза IV (DPP-IV) инактивирует аналог. DPP-IV расщепляет нативный GLP-1 между 2 и 3 аминокислотами (между положением 8 и 9), и полученная молекула является менее активной. Поэтому гетерологичные слитые белки в соответствии с настоящим изобретением резистентны к DPP-IV. Замена в положении 22 снижает вероятность того, что молекула образует агрегаты, и повышает активность молекулы. Замена в положении 36 в контексте аналога с изменениями в положении 8 и 22, а также в контексте целого слитого белка снижает опасность того, что слитый белок будет вызывать нейтрализующий иммунный ответ после многократного и продолжительного введения в человеческий организм. Центральным событием в генерации как гуморальных, так и клеточно-опосредованных иммунных ответов является активация и клональное расширение Т-клеток-хелперов (ТН). Активация клеток ТН начинается посредством взаимодействия комплекса рецептора Т-клеток (TCR)-CD3 с обработанным антигенным пептидом, связанным с молекулой главной тканевой совместимости (МНС) II класса, в присутствии антиген-презентирующей клетки (АПК). Взаимодействие клетки ТН с антигеном инициирует каскад биохимических событий, которые вызывают состояние покоя клетки ТН для вхождения в клеточный цикл (переход от G0 к G1). Активированная Т-клетка проходит клеточный цикл, размножаясь и дифференцируя в клетки памяти или эффекторные клетки. Для идентификации потенциальных эпитопов (антигенных детерминант) анализировали следующую последовательность: Эта последовательность представляет собой последовательность аналога GLP-1 с изменениями в положениях 8 и 22 относительно нативной последовательности с последующими 2 копиями G-богатой линкерной последовательности, за которой следуют первые 10 аминокислот области Fc, полученные от человеческого иммуноглобулинa G4. Эпитоп, как используется в данном описании, относится к области молекулы белка, с которой может связываться антитело. Иммуногенный эпитоп определяется как часть белка, которая выявляет иммунный ответ, когда целый белок представляет собой иммуноген. Картирование эпитопов заключается в сканировании последовательностей окна сравнения с девятью аминокислотами с использованием методики статистического анализа, позволяющей получать информацию, содержащуюся в этих образцах. Для анализа последовательности и идентификации пептидов, которые, весьма вероятно, провоцируют иммунный ответ в присутствии Т-клеток, используют пакет программ, известный как EpiMatrix. При анализе на взаимодействие с рецептором МНС II класса используют восемь общих аллелей. Эти аллели включают DRB10101, DRB10301, DRB10401, DRB10701, DRB10801,DRB11101, DRB11301 и DRB11501. Прогнозируют, что сильный эпитоп находится в месте соединения С-конца части аналога GLP-1 и начала линкера. Последовательность этого эпитопа представляет собой Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-GlyGly-Gly (SEQ ID NO: 11), которая взаимодействует с DRB10801. В настоящем изобретении решается задача обнаружения способности этого эпитопа элиминировать путем изменения С-конца аналога GLP-1 на одну из следующих последовательностей: Гетерологичные слитые белки по изобретению содержат часть Fc, взятую из человеческого IgG4,при этом содержат одно или несколько замещений по сравнению с человеческой последовательностью дикого типа. В соответствии с настоящим описанием часть Fc иммуноглобулина имеет значение, общепринятое в области иммунологии. Конкретно этот термин относится к фрагменту антитела, который не содержит две антигенсвязующие области (фрагмента Fab) из антитела. Часть Fc состоит из постоянной области антитела, состоящей как из тяжелых цепей, которые ассоциируются через посредство нековалентных взаимодействий, так и дисульфидных связей. Часть Fc может включать шарнирные области и простираться через домены СН 2 и СН 3 до С-конца антитела. Часть Fc может также включать один или несколько сайтов гликозилирования. Существует пять типов человеческих иммуноглобулинов с различными эффекторными функциями и фармакокинетическими свойствами. IgG является наиболее устойчивым из пяти типов, имеющим период полужизни в сыворотке человека около 23 дней. Существует четыре подкласса IgG (G1, G2, G3 иG4), каждый из которых имеет разные биологические функции, известные как эффекторные функции. Эти эффекторные функции обычно опосредованы взаимодействием с рецептором Fc (FcR) или посредством комплемента связи Clq и фиксации. Связывание с FcR может привести к антителозависимому комплементопосредованному цитолизу, тогда как связывание с комплементными факторами может привести к лизису клеток. При конструировании гетерологичных слитых белков Fc, в которых часть Fc используется исключительно благодаря ее способности продлевать период полужизни, важно минимизировать эффекторную функцию. Поэтому гетерологичные слитые белки по изобретению получают из области Fc человеческого IgG4 благодаря ее слабой способности связываться с FcR и комплементными факторами по сравнению с другими подтипами IgG. Однако IgG4 продемонстрировал способность элиминировать клетки-мишени у человека [Issacs et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 106:427-433]. Поскольку гетерологичные слитые белки по изобретению инициируют бета-клетки в поджелудочной железе на стимулирование экспрессии инсулина, используя IgG4-производную область в слитом белке Fc, можно инициировать иммунный ответ на панкреатическую бета-клетку посредством взаимодействия слитого белка с рецептором GLP-1, присутствующим в панкреатических бета-клетках. Таким образом, область Fc IgG4,представляющая собой часть гетерологичных слитых белков по изобретению, содержит замещения, устраняющие эффекторную функцию. Область Fc IgG4 гетерологичных слитых белков по изобретению может содержать одно или несколько следующих замещений: замена глутамата на пролин в остатке 233,фенилаланина на аланин или валин в остатке 234 и лейцина на аланин или глутамат в остатке 235 (нумерация в соответствии с директивой Европейского союза; Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD, NIH Publication no. 91-3242). Эти остатки соответствуют положениям 16, 17 и 18 в последовательности SEQ ID NO: 7. Кроме того, удаление N-связанного сайта гликозилирования в области Fc иммуноглобулина G4 путем заменыAsn на Аlа в положении остатка 297 (нумерация в соответствии с директивой Европейского союза), который соответствует положению 80 последовательности SEQ ID NO: 7, представляет собой другой способ обеспечения того, что остаточная активность эффектора устраняется в контексте гетерологичного слитого белка. Помимо этого часть Fc IgG4 гетерологичных слитых белков по изобретению содержит замену, которая стабилизирует образование димера тяжелой цепи и препятствует образованию полу-Fc IgG4 цепей. Гетерологичные слитые белки по изобретению предпочтительно существуют в виде димеров, соединенных друг с другом дисульфидными связями и различными нековалентными взаимодействиями. IgG4 дикого типа содержит звено Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys (SEQ ID NO: 18), начинающееся у остатка 224 (нумерация в соответствии с директивой Европейского союза). Это звено в простой цепи аналога GLP-1 и Fc образует дисульфидные связи с соответствующим звеном в другой цепи аналога GLP-1 и Fc. Однако присутствие серина в звене вызывает образование одноцепочечных слитых белков. Настоящее изобретение охватывает гетерологичные слитые белки Fc, в которых последовательность IgG4 подвергается дальнейшему видоизменению так, что серин в положении 228 (нумерация в соответствии с директивой Европейского союза) заменен на пролин (аминокислотный остаток 11 в последовательности SEQ ID NO: 7). С-концевой остаток лизина, присутствующий в нативной молекуле, может быть удален в части производного Fc IgG4 гетерологичных слитых белков, описанных в настоящем изобретении (положение 230 в последовательности SEQ ID NO: 7; удаленный лизин упомянут как des-K). Слитые белки, экспрессируемые в некоторых клеточных типах (таких как клетки NS0), в которых лизин кодируется Сконцевым кодоном, являются гетерологичными в том смысле, что определенная часть молекулы имеет-4 008831 лизин в виде С-концевой аминокислоты, а в другой части лизин удален. Делеция обусловлена действием протеазы во время экспрессии в некоторых типах клеток млекопитающих. Поэтому во избежание этой гетерогенности предпочтительно, чтобы в конструкциях экспрессии слияния Fc отсутствовал С-концевой кодон для лизина. Предпочтительно, чтобы С-концевая аминокислота части аналога GLP-1, обсуждаемого в данном описании, сливалась с N-концом части аналога Fc IgG4 посредством линкера, богатого глицином. Функция и устойчивость in vivo гетерологичных слитых белков по изобретению могут быть оптимизированы путем добавления небольших пептидных линкеров с целью предотвращения потенциально нежелательных взаимодействий доменов. Кроме того, линкер, богатый глицином, предоставляет некоторую структурную гибкость так, что часть аналога GLP-1 может эффективно взаимодействовать с рецептором GLP1 в клетках-мишенях, таких как -клетки поджелудочной железы. Однако эти линкеры могут значительно повышать опасность того, что слитый белок будет иммуногенным in vivo. Поэтому предпочтительно,чтобы его длина не была больше необходимой для предотвращения нежелательных взаимодействий доменов и/или оптимизации биологической активности и/или устойчивости. Предпочтительный линкер,богатый глицином, содержит последовательность Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-GlyGly-Ser (SEQ ID NO: 8). Хотя в гетерологичных слитых белках по изобретению можно использовать больше копий этого линкера, предпочтительно, чтобы использовалась одна копия этого линкера для минимизации опасности иммуногенности, связанной с продолжительным и повторным введением в организм. Предпочтительные гетерологичные слитые белки GLP-1-Fc настоящего изобретения включают следующие белки: а также Val8 и формы des-K всех вышеприведенных белков. Терминология, используемая в данном описании в отношении конкретных гетерологичных слитых белков, определяется следующим образом. Специфические замены в части GLP-1 слитого белка указываются с использованием конкретной заменяемой аминокислоты с последующим номером остатка. GLP1(7-37) указывает, что часть GLP-1 зрелого слитого белка начинается с His в положении 7 и заканчивается Gly в положении 37. L относится к линкеру с последовательностью Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-GlyGly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 8). Число, непосредственно предшествующее L, относится к числу линкеров, отделяющих часть GLP-1 от части Fc. Линкер, указанный как 1.5L, относится к последовательности Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-SerSEQ ID NO: 7. Замены в части Fc IgG4 гетерологичного слитого белка заключены в скобки. Аминокислоту дикого типа определяют с помощью ее общепринятого сокращения с последующим номером положения в контексте всей последовательности IgG4, используя систему нумерации в соответствии с директивой Европейского союза, за которым следует аминокислота, замещенная в этом положении, которая определяется с помощью ее общепринятого сокращения. Хотя гетерологичные слитые белки по изобретению могут быть получены с помощью целого ряда различных методов, по причине размера слитого белка предпочтительны рекомбинантные методы. Для целей настоящего изобретения, которое раскрывается и заявляется в данном описании, ниже определены следующие общие термины и сокращения в области молекулярной биологии."Пара нуклеотидов" или "п.н.", как используется в данном описании, относится к ДНК или РНК. Сокращения A, C, G и Т соответствуют 5'-монофосфатным формам дезоксирибонуклеозидов (дезокси)аденозина, (дезокси)цитидина, (дезокси)гуанозина и тимидина соответственно, когда они встречаются в молекулах ДНК. Сокращения U, C, G и А соответствуют 5'-монофосфатным формам рибонуклеозидов-5 008831 уридина, цитидина, гуанозина и аденозина соответственно, когда они встречаются в молекулах РНК. В двухцепочечной ДНК пара нуклеотидов может относиться к партнерству А с Т или С с G. В ДНК/РНК гетеродуплексная пара нуклеотидов может относиться к партнерству А с U или С с G (см. определение"Расщепление" или "рестрикция" ДНК относится к каталитическому расщеплению ДНК ферментом рестрикции (рестриктазой), который действует только в некоторых последовательностях ДНК ("эндонуклеазы, специфические к последовательностям"). Различные ферменты рестрикции, используемые в данном описании, доступны для приобретения, и условия их реакции, кофакторы и другие требования были использованы, как если бы были известны среднему специалисту в данной области. Соответствующие буферные растворы и количества субстратов для конкретных ферментов рестрикции определены изготовителем или могут быть без труда найдены в литературе."Лигирование" относится к процессу образования фосфодиэфирных связей между двумя двухцепочечными фрагментами нуклеиновой кислоты. Если не указано иное, лигирование можно осуществлять,используя известные буферные растворы и условия, с ДНК-лигазой, такой как ДНК-лигаза Т 4."Клонирующий вектор рекомбинантной ДНК", как используется в данном описании, относится к любому автономно реплицирующемуся агенту, включая (но не ограничиваясь) плазмиды и бактериофаги, включающему молекулу ДНК, к которой могут быть или были добавлены один или несколько дополнительных ДНК-сегментов."Экспрессирующий вектор рекомбинантной ДНК", как используется в данном описании, относится к любому клонирующему вектору рекомбинантной ДНК, в который введен промотор в целях управления транскрипцией вставленной ДНК."Транскрипция" относится к способу, посредством которого информация, содержащаяся в нуклеотидной последовательности ДНК, передается комплементарной последовательности РНК."Трансфекция" относится к поглощению экспрессирующего вектора клеткой-хозяином, независимо от того, экспрессируются или нет в действительности любые кодирующие последовательности. Специалистам в данной области известны многочисленные методы трансфекции, например соосаждение в фосфате кальция, липосомная трансфекция и электропорация (электрошоковое открытие клеточных пор). Успешная трансфекция как правило признается в случае, если любое указание действия этого вектора имеет место в пределах клетки-хозяина."Трансформация" относится к введению ДНК в организм так, что ДНК имеет возможность реплицироваться или как внехромосомный элемент, или под действием интеграции хромосом. В данной области хорошо известны методы трансформации бактериальных и эукариотических хозяев, и многие из этих методов, таких как ядерная инъекция, слияние протопластов или кальциевая обработка с использованием хлористого кальция, суммированы в работе J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,(1989). Как правило, при введении ДНК в дрожжи термин трансформация используется как противопоставление термину трансфекция."Трансляция", как используется в данном описании, относится к способу, посредством которого генетическая информация матричной (информационной) РНК (мРНК) используется для конкретизации и направления синтеза полипептидной цепи."Вектор" относится к соединению нуклеиновой кислоты, используемому для трансфекции и/или трансформации клеток в манипулировании генами с полинуклеотидными последовательностями, соответствующими подходящим молекулам белка, который при объединении с соответствующими регулярными последовательностями придает специфические свойства трансфицируемой и/или трансформируемой клетке-хозяину. Пригодными векторами являются плазмиды, вирусы и бактериофаг. Искусственные векторы строят путем разрезания и соединения молекул ДНК из различных источников с использованием ферментов рестрикции и лигаз. Термин "вектор", как используется в данном описании, включает клонирующие векторы рекомбинантной ДНК и экспрессирующие векторы рекомбинантной ДНК."Комплементарный" или "комплементарность", как используется в данном описании, относится к парам оснований (пуринам и пиримидинам), которые образуют ассоциации посредством водородных связей в двухцепочечной нуклеиновой кислоте. Комплементарными являются следующие пары оснований: гуанин и цитозин; аденин и тимин и аденин и урацил."Праймер" относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который функционирует в качестве инициирующего субстрата для ферментативной или синтетической элонгации."Промотор" относится к последовательности ДНК, которая направляет транскрипцию ДНК в РНК."Зонд" относится к соединению нуклеиновой кислоты или его фрагменту, который гидролизуется с другим соединением нуклеиновой кислоты."Лидерная последовательность" относится к последовательности аминокислот, которая может быть ферментативно или химически удалена с получением желательного полипептида."Сигнальная последовательность секреции" относится к последовательности аминокислот, как правило, присутствующей в N-конечной области более крупного полипептида, функционирующая в целях-6 008831 инициации связывания этого полипептида с отделениями клеточной мембраны наподобие эндоплазматического ретикулума и секреции этого полипептида по мембране плазмы. Белки человеческого иммуноглобулинa G4 дикого типа можно получить из целого ряда источников. Например, эти белки можно получить из библиотеки кДНК, полученной из клеток, которые экспрессируют мРНК на обнаруживаемом уровне. Библиотеки можно скринировать с помощью зондов, построенных с использованием опубликованной последовательности ДНК или белка, для конкретного белка. Например, постоянные области легких или тяжелых цепей иммуноглобулина описаны в работах Adams, etProc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6027-6031; Rice et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7862-7862; Falkner,et al. (1982) Nature 298:286-288 и Morrison, et al. (1984) Ann. Rev. Immunol. 2:239-256. Скрининг кДНК или геномной библиотеки с помощью отобранного зонда можно осуществлять с использованием стандартных методик, таких, которые описаны в работе Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989). Альтернативным способом выделения гена, кодирующего иммуноглобулиновый белок, является использование методологии PCR (полимеразно-цепьевая реакция) [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1995)]. Праймеры PCR можно построить на основании опубликованных последовательностей. Обычно последовательности дикого типа, имеющие полную длину, которые клонированы из определенной библиотеки, могут служить в качестве матрицы для создания фрагментов аналога Fc IgG4 согласно изобретению, которые сохраняют способность придавать аналогу GLP-1 более длительный период полувыведения из плазмы, причем указанный аналог GLP-1 является частью слитого белка. Фрагменты аналога Fc IgG4 могут быть получены с использованием методик PCR с помощью праймеров, построенных для гибридизации с последовательностями, соответствующими желательным концам фрагмента. Праймеры PCR также могут быть спроектированы для создания сайтов ферментов рестрикции, способствующих клонированию в экспрессирующие векторы. ДНК, кодирующую аналоги GLP-1 по изобретению, можно получить различными способами,включая методы клонирования, наподобие тех, которые описаны выше, а также с помощью химически синтезированной ДНК. Химический синтез может быть привлекательным, учитывая незначительную длину кодируемого пептида. Аминокислотная последовательность GLP-1 опубликована наряду с последовательностью гена препроглюкагона [Lopez, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80:5485-5489; Bell,et al. (1983) Nature, 302:716-718; Heinrich, G., et al. (1984) Endocrinol, 115:2176-2181; Ghiglione, M., et al.(1984) Diabetologia 27:599-600]. Поэтому праймеры можно строить на основе нативной последовательности с получением ДНК, кодирующей описываемые здесь аналоги GLP-1. Ген, кодирующий слитый белок, можно затем построить путем лигирования ДНК, кодирующей аналог GLP-1 внутри рамки считывания, с ДНК, кодирующей белок Fc IgG по изобретению. ДНК, кодирующая GLP-1 дикого типа, и фрагменты Fc IgG4 можно мутировать либо перед лигированием, либо в контексте кДНК, кодирующей целый слитый белок. В данной области техники хорошо известны разнообразные методики мутагенеза. Ген, кодирующий аналог GLP-1, и ген, кодирующий фрагмент аналогаFc IgG4, можно также соединить в рамке считывания посредством ДНК, кодирующей G-обогащенный линкерный пептид. Предпочтительная последовательность ДНК, кодирующей один из предпочтительных гетерологичных слитых белков по изобретению, Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P,F234A, L235A, des K), представлена в виде SEQ ID NO: 20:-7 008831 Клетки-хозяева трансфицируют или трансформируют с помощью описываемых здесь экспрессирующих или клонирующих векторов в целях производства и культивирования гетерологичных слитых белков в традиционных питательных средах, модифицированных надлежащим образом для индуцирования промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности. Условия культивирования, такие как среды, температура, рН и подобное, могут быть легко выбраны средним специалистом в данной области техники. Принципы, протоколы и практические методики максимального повышения продуктивности клеточных культур можно найти в работах MammalianCell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) и Sambrook, et al., выше. Методы трансфекции известны среднему специалисту, например, СаРO4 и электропорация. Общие аспекты трансформаций системы млекопитающая клетка-хозяин описаны в патенте США 4399216. Трансформации в дрожжи обычно осуществляют в соответствии с методом van Solingen et al., J Bact. 130(2): 946-7(1977) и Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(8): 3829-33 (1979). Тем не менее, можно использовать другие методы введения ДНК в клетки, такие как ядерная микроинъекция, электропорация, слияние бактериальных протопластов с интактными клетками или поликатионами, например полибреном или полиомитином. В отношении различных методик трансформации клеток млекопитающих см. Keown, et al.,Methods in Enzymology 185: 527-37 (1990) и Mansour, et al., Nature 336 (6197): 348-52 (1988). Клетки-хозяева, пригодные для клонирования или экспрессии нуклеиновой кислоты (например,ДНК) в векторах, включают дрожжи или высшие эукариотические клетки. Эукариотические микробы, такие как нитевидные грибки и дрожжи, являются пригодными клонирующими или экспрессирующими хозяевами для векторов слитых белков. Saccharomyces cerevisiae является обычно используемым низшим эукариотическим микроорганизмом-хозяином. Другие включаютniger [Kelly and Hynes, EMBO J. 4(2): 475-9 (1985)]. Метилотропные дрожжи выбирают из видов, состоящих из Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis и Rhodotoruia. Перечень конкретных видов, представляющих этот класс дрожжей, можно найти в работе С. Antony, The Biochemistry ofMethylotrophs 269 (1982). Клетки-хозяева, пригодные для экспрессии слитых белков по изобретению, получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки насекомых, такие как DrosophilaS2 и Spodoptera Sp, Spodoptera high5, а также клетки растений. Примеры пригодных линий клеток-хозяев млекопитающих включают клетки миеломы NSO, яичника китайского хомячка (СНО), SP2 и клеткиCOS. Более конкретные примеры включают линию почек обезьяны CV1, трансформированную с помощью SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); линию почек человеческого зародыша [клетки 293 или 293, субклонированные для выращивания в суспензионной культуре, Graham, et al., J. Gen Virol., 36(1): 59-74(1977)]; клетки яичника китайского хомячка/-DHFR [СНО, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77(7): 4216-20 (1980)]; клетки сертоли мыши [ТМ 4, Mather, Biol. Reprod. 23(1):243-52 (1980)]; клетки человеческого легкого (W138, АТСС CCL 75); клетки человеческой печени (Нер G2, НВ 8065) и клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС CCL51). Предпочтительной линией клеток для продукции слитых белков Fc по изобретению является линия клеток миеломы NSO, имеющаяся в Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС, каталог 85110503) и описанная в работах Galfre, G. andand Procedures, Academic Press, N.Y., N.Y.). Слитые белки по изобретению могут быть получены рекомбинантными методами непосредственно или в виде белка, имеющего сигнальную последовательность или другие дополнительные последовательности, которые создают специфическое место расщепления у N-конца зрелого слитого белка. Сигнальная последовательность может быть компонентом вектора или частью ДНК, кодирующей слитый белок, которая вставлена в вектор. Для секреции дрожжей сигнальная последовательность может быть,например, лидером инвертазы дрожжей, лидером альфа-фактора (включая лидеры сс-фактора Saccharomyces и Kluyveromyces, причем последние описаны в патенте США 5010182), или лидером кислотной фосфатазы, лидером глюкоамилазы С. albicans (EP 362,179), либо сигналом, описанным в WO 90/13646. При экспрессии клеток млекопитающих сигнальные последовательности млекопитающих могут быть-8 008831 использованы для направления секреции белка, например, сигнальные последовательности из секретированных полипептидов того же или родственного вида, а также лидеры вирусной секреции. Экспрессирующие и клонирующие векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты,которая дает возможность вектору реплицироваться в одном или нескольких выбранных клеткаххозяевах. Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат ген селекции, также называемый селектируемым маркером. Типичные гены селекции кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например неомицину, метотрексату или тетрациклину, (b) комплементируют автотрофные недостатки или (с) поставляют жизненно важные питательные вещества,недоступные из сложных сред, например, ген, кодирующий D-аланин рацемазу для Bacilli. Примерами селектируемых маркеров для клеток млекопитающих являются гены, которые обеспечивают идентификацию клеток, отвечающих за принятие нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, такой как DHFR или тимидин-киназа. Подходящей клеткой-хозяином при использовании DHFR дикого типа является линия клеток СНО с отсутствующей активностью DHFR, полученная и размноженная в соответствии с описанием [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7): 4216-20 (1980)]. Пригодным геном селекции для использования в дрожжах является ген trpl, присутствующий в дрожжевой плазмиде YRp7 [Stinchcomb, et al., Nature 282(5734): 39-43 (1979); Kingsman, et al., Gene 7(2): 141-52(1979); Tschumper, et al., Gene 10(2): 157-66 (1980)]. Ген trpl предоставляет маркер селекции для мутантного штамма дрожжей с отсутствующей способностью расти в триптофане, например АТСС No. 44076 или РЕРС 1 [Jones, Genetics 85: 23-33 (1977)]. Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, для направления синтеза мРНК. Промоторы, распознаваемые разнообразными потенциальными клетками-хозяевами, хорошо известны в данной области техники. Примеры пригодных промотирующих последовательностей для использования в дрожжевых хозяевах включают промоторы для 3-фосфоглицерат-киназы [Hitzeman, et al.,J. Biol. Chem. 255(24): 12073-80 (1980)] или другие гликолитические ферменты [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry 17(23): 4900-7 (1978)], такие как энолаза, глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкоза-6 фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируват киназа, триозефосфатизомераза, фосфоглюкозаизомераза и глукокиназа. Другие дрожжевые промоторы, которые являются индуцируемыми промоторами,имеющими дополнительное преимущество транскрипции, регулируемой условиями роста, включают промоторные области для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, разлагающихся ферментов, ассоциированных с азотным метаболизмом, металлотионеина, глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за использование мальтозы и галактозы. Пригодные векторы и промоторы для использования при экспрессии в дрожжах описаны в ЕР 73,657. Транскрипцией мРНК, кодирующей слитые белки, из векторов в клетки-хозяева млекопитающих можно управлять,например, при помощи промоторов, полученных из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы домашней птицы, аденовирус (такой как Аденовирус 2), вирус бычьей папилломы, вирус птичьей саркомы, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и вирус обязьян (SV40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, например, промотора актина или промотора иммуноглобулина, и из промоторов теплового шока, при условии, что такие промоторы совместимы с системами клеток-хозяев. Транскрипцию полинуклеотида, кодирующего слитый белок, посредством высших эукариотов можно повысить путем вставки последовательности энхансера в вектор. Энхансерами являются цисдействующие элементы ДНК, обычно имеющие от 10 до 300 пар нуклеотидов, которые воздействуют на промотор, повышая его транскрипцию. В настоящее время известны многие последовательности энхансера из генов млекопитающих (глобин, эластаза, альбумин, а-кетопротеин и инсулин). Однако обычно используют энхансер от вируса эукариотической клетки. Примеры включают энхансер SV40 на поздней стороне начала репликации (100-270 пар нуклеотидов), энхансер раннего промотора цитомегаловируса,энхансер вируса полиомы на поздней стороне начала репликации и энхансеры аденовируса. Энхансер можно подвергнуть сплайсингу в вектор в положении 5' или 3' к последовательности, кодирующей слитый белок, однако, он предпочтительно расположен на участке 5' от промотора. Экспрессирующие векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (клетки дрожжей,грибков, насекомых, растений, животных, людей или нуклеиновые клетки из других многоклеточных организмов), также содержат последовательности, необходимые для завершения транскрипции и стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доставляются из 5' и в ряде случаев 3' нетранслированных областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибированные в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслированной области мРНК, кодирующей слитый белок. Различные формы слитого белка можно восстановить из культуральной среды или из лизатов клеток-хозяев. Если они связаны посредством мембраны, их можно высвободить из мембраны с использованием пригодного раствора детергента (например, Тритон-Х 100) или посредством ферментативного гидролиза. Клетки, используемые при экспрессии слитого белка, можно разрушить при помощи различ-9 008831 ных физических или химических средств, таких как цикл замораживания-оттаивания, воздействие ультразвуком, механическое разрушение или с помощью агентов клеточного лизиса. После экспрессии гетерологичных слитых белков по изобретению в подходящей клетке-хозяине аналоги можно выделить и очистить. Следующие процедуры являются примерами методик очистки: фракционирование на карбоксиметилцеллюлозе; гель-фильтрация, такая как Сефадекс G-75; анионообменная смола, такая как DEAE или Mono-Q; катионообменная смола, такая как СМ или Mono-S; металлохелатные колонки для связывания эпитоп-меченых форм полипептида; обращенно-фазовая жидкостная хроматография высокого разрешения (ЖХВР); хроматофокусирование; силикагель; осаждение этанолом и осаждение сульфатом аммония. Можно использовать различные методы очистки белков, и такие методы известны в данной области техники и описаны, например, в работах Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) и Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982). Стадия (стадии) очистки зависит от характера производственного процесса и конкретного слитого белка. Например, слитые белки, содержащие фрагмент Fc, могут быть эффективно очищены с использованием аффинной матрицы протеина А или протеина G. Буферные растворы с низким или высоким рН могут быть использованы для элюирования слитого белка из аффинной матрицы. Мягкие условия элюирования содействуют предотвращению необратимой денатурации слитого белка. Гетерологичные слитые белки по изобретению могут приготовляться с содержанием одного или нескольких наполнителей. Слитые белки по изобретению могут быть объединены с фармацевтически приемлемым буферным раствором, а величина рН отрегулирована для получения допустимой устойчивости и величины, приемлемой для введения, такого как парентеральное введение. По выбору можно добавлять одно или несколько фармацевтически приемлемых противомикробных средств. Предпочтительными противомикробными средствами являются мета-крезол и фенол. Для регулирования ионной силы или тоничности можно добавлять одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. Для регулирования изотоничности состава можно добавлять один или несколько наполнителей. Глицерин является примером наполнителя, регулирующего изотоничность. Фармацевтически приемлемые средства, предназначенные для введения людям и животным, не содержат токсичных элементов или нежелательных загрязнителей и не сказываются на активности активных соединений. Гетерологичные слитые белки по изобретению можно приготавливать в виде раствора или лиофилизированного порошка, который можно восстанавливать с помощью подходящего растворителя. Лиофилизированная лекарственная форма представляет собой форму, в которой слитый белок устойчив, обладает или не обладает буферной способностью для поддержания рН раствора на протяжении предполагаемого периода полужизни восстановленного продукта. Предпочтительно, чтобы раствор, содержащий описываемые здесь гетерологичные слитые белки, перед лиофилизацией был, по существу, изотоническим, что способствует образованию изотонических растворов после восстановления. Настоящее изобретение включает форму фармацевтически приемлемой соли гетерологичных слитых белков. Кислоты, обычно используемые для образования кислых аддитивных солей, являются неорганическими кислотами, такими как хлористо-водородная кислота, бромисто-водородная кислота, йодисто-водородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и так далее, а также органическими кислотами, такими как р-толуолсульфокислота, метансульфокислота, щавелевая кислота, рбромфенилсульфокислота, угольная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота,уксусная кислота и так далее. Предпочтительными кислыми аддитивными солями являются такие, которые образуются с минеральными кислотами, такими как хлористо-водородная кислота и бромистоводородная кислота. Основные аддитивные соли включают такие, которые происходят от неорганических оснований,таких как аммоний или щелочные гидроксиды земельных металлов, углекислые соли, бикарбонаты или двууглекислые соли и тому подобное. Такие основы используются для приготовления солей настоящего изобретения, включая, каустическую соду, гидроксид калия, гидроксид аммония, карбонат калия и тому подобное. Гетерологичные слитые белки по изобретению проявляют биологическую активность. Биологическая активность относится к способности слитого белка связываться с рецептором GLP-1, активировать его in vivo и вызывать ответ. Ответы включают (однако, не ограниваются) секрецию инсулина, подавление глюкагона, ингибирование аппетита, потерю веса, индуцирование инсулина, ингибирование апоптоза, индукцию размножения панкреатических -клеток и дифференциацию панкреатических -клеток. Показательное число слитых белков GLP-1 испытывали на активность in vitro, а также in vivo. В примерах 1 и 2 представлена активность in vitro на основе способности слитого белка взаимодействоватьс рецептором человеческого GLP-1 и активировать последний. В обеих сериях экспериментов использовали клетки НЕК 293, сверхэкспрессирующие рецептор человеческого GLP-1. Активация рецептора GLP-1 в этих клетках вызывает активацию аденилилциклазы, которая в свою очередь индуцирует экспрессию гена-репортера, движимую элементом ответа циклического АМФ (CRE). В примере 1 (табл. 1) приведены данные, причем геном-репортером является -лактамаза, а в примере 2 (табл. 2) приведены данные,- 10008831 причем геном-репортером является люцифераза. В примере 3 приводятся данные, полученные после введения крысам одного из гетерологичных слитых белков по изобретению. Вместе эти данные показывают,что слитые белки способны связываться с рецептором GLP-1 и активировать его, причем они являются более сильными in vitro, чем Val8-GLP-1 (7-37)ОН. Кроме того, данные, полученные после введения крысам, показывают, что слитые белки активны in vivo и имеют более длительный период полужизни, чем нативный GLP-1. Введение гетерологичных слитых белков по изобретению можно осуществлять любым способом,известным врачу, обладающему средними познаниями в данной области. Одним таким способом является периферическое парентеральное введение. В медицинской литературе под парентеральным введением обычно понимается инъекция лекарственной формы с помощью стерильного шприца или какого-то другого механического устройства, например инфузионного насоса. Периферические парентеральные способы могут включать внутривенный, внутримышечный, подкожный и внутрибрюшинный способы введения. Гетерологичные слитые белки по изобретению могут также подлежать введению пероральным,ректальным, назальным или низшим респираторным способами, которые являются не парентеральными способами введения. Среди этих не парентеральных способов предпочтительны низший респираторный и пероральный способы. Слитые белки по изобретению могут использоваться при лечении широкого круга заболеваний. Слитые белки по изобретению главным образом проявляют свои биологические эффекты, действуя на рецептор, упоминаемый как рецептор GLP-1. Пациенты, на состоянии которых благоприятно отражается стимуляция рецепторов GLP-1 или введение соединений GLP-1, могут проходить курс лечения с использованием слитых белков GLP-1 по изобретению. Можно сказать, что эти пациенты "нуждаются в лечении соединениями GLP-1" или "нуждаются в стимулировании рецептором GLP-1". Среди таких пациентов люди, страдающие инсулиннезависимым сахарным диабетом, инсулинзависимым сахарным диабетом, ожирением (см. публикацию WO 00/16797), инфарктом миокарда (см. публикацию WO 98/08531), ожирением (см. публикацию WO 98/19698), катаболическими изменениями после хирургии(см. патент США 6006753), функциональной диспепсией и синдромом раздраженной толстой кишки(слизистый колит) (см. публикацию WO 99/64060). В такой же степени это относится к пациентам, нуждающимся в профилактическом лечении соединением GLP-1, например, пациенты группы риска в отношении развития инсулиннезависимого сахарного диабета (см. публикацию WO 00/07617). Пациенты с нарушенной толерантностью к глюкозе или нарушенным уровнем глюкозы натощак, пациенты, чей вес превышает на 25% нормальный вес тела по причине роста и телосложения, пациенты с резекцией поджелудочной железы, пациенты, имеющие одного или несколько родителей, страдающих инсулиннезависимым сахарным диабетом, пациенты, которые страдали сахарным диабетом, обусловленным беременностью, и пациенты, которые страдали острым или хроническим панкреатитом, относятся к группе риска в отношении развития инсулиннезависимого сахарного диабета. Эффективным является количество описываемых здесь слитых белков GLP-1-Fc, которое приводит к получению желательного терапевтического и/или профилактического эффекта при отсутствии побочных эффектов при введении пациенту, нуждающемуся в стимулировании рецептора GLP-1. "Желательный терапевтический эффект" заключается в следующем: 1) менее выраженное проявление симптомов заболевания или состояния; 2) более редкое проявление симптомов заболевания или состояния; 3) возросшая продолжительность жизни при проведении лечения и 4) более высокое качество жизни при проведении лечения. Например, "эффективное количество" слитого белка GLP-1-Fc для лечения сахарного диабета представляет собой количество, которое привело бы к повышенному контролю за концентрацией глюкозы в крови, результатом чего является задержка диабетических осложнений, таких как ретинопатия, невропатия или заболевание почек. "Эффективное количество" слитого белка GLP-1-Fc для предотвращения сахарного диабета представляет собой количество, которое привело бы к задержке, повышения уровней глюкозы в крови, что требует лечения с помощью таких противогипогликемических препаратов, как сульфонил-мочевины, тиазолидиндионы, инсулин и/или бисгуанидины. Доза слитого белка, эффективная для нормализации глюкозы в крови пациента, зависит от ряда факторов, среди которых пол, вес и возраст пациента, степень неспособности регулировать уровень глюкозы в крови, способ введения и биологическая доступность, фармакокинетический профиль слитого белка, действенность и рецептура. Диапазон дозы может составлять от 0,01 до 1 мг/кг веса тела, предпочтительно от 0,05 до 0,5 мг/кг веса тела. Предпочтительно вводить слитые белки по изобретению или один раз каждые две недели, или раз в неделю. В зависимости от заболевания может возникнуть необходимость введения слитого белка чаще,например 2-3 раза в неделю. Настоящее изобретение поясняется приведенными ниже примерами, которые не ограничивают объем изобретения.- 11008831 Примеры Пример 1. Анализ активации рецептора GLP-1 in vitro. Используя систему CRE-BLAM, клетки НЕК-293, экспрессирующие рецептор человеческого GLP1, высевают с интенсивностью 20000-40000 клеток на лунку в 100 мкл среды DMEM с помощью 10% сыворотки плода коровы (FBS) в черный планшет из 96 лунок с прозрачным дном и покрытием из полиd-лизина. Через день после высевания среду удаляют и добавляют 80 мкл среды DMEM, не содержащей плазму. На третий день после высевания в каждую лунку добавляют 20 мкл среды DMEM, не содержащей плазму, вместе с 0,5% бычьим сывороточным альбумином (BSA), содержащим различные концентрации гетерологичного слитого белка GLP-1-Fc, в целях получения кривой доза-эффект. Как правило,для получения кривой доза-эффект используют 14 разведений с содержанием 3-30 нмоль гетерологичного слитого белка GLP-1-Fc, и на основе этой кривой определяют значения EC50. Через 5 ч инкубации со слитым белком в среду добавляют 20 мкл субстрата на основе -лактамазы (CCF2/AM, PanVera LLC) и инкубацию продолжают в течение 1 ч, за это время флуоресценцию определяют на цитофлуорографе. Анализ также описан в работе Zlokarnik, et al. (1998), Science, 278:84-88. Исследуют различные слитые белки GLP-1-Fc, и значения EC50 представлены в табл. 1. Значения соотносятся со значениями, определенными для соединения Val8-GLP-1(7-37)ОН, которое используют в качестве внутреннего контроля при проведении каждого эксперимента. Таблица 1 Пример 2. Анализ активации рецептора GLP-1 in vitro. Используя систему CRE-люцифераза, клетки НЕК-293, устойчиво экспрессирующие рецептор человеческого GLP-1, высевают в планшет из 96 лунок с интенсивностью 30000 клеток на лунку в 800 мкл среды DMEM F12 с низким содержанием сыворотки. Через день после высевания 20 мкл аликвоты исследуемого белка, растворенного в 0,5% BSA, смешивают и инкубируют с клетками в течение 5 ч. Как правило, для получения кривой доза-эффект используют 12 разведений с содержанием от 3 пмоль до 3 нмоль гетерологичного слитого белка GLP-1-Fc при концентрации 5 Х для каждого исследуемого белка перед его добавлением в клетки и на основе этой кривой определяют значения EC50. После инкубации 100 мкл реагента люциферазы добавляют непосредственно в каждый планшет и осторожно перемешивают в течение 2 мин. Планшеты помещают в люминометр Tri-lux и производят расчет мощности света в результате экспрессии люциферазы. Исследуют различные слитые белки GLP-1-Fc, и значения EC50 представлены в табл. 2. Значения соотносятся со значениями, определенными для соединения Val8-GLP1(7-37)ОН, которое используют в качестве внутреннего контроля при проведении каждого эксперимента. Поскольку исследуемые слитые белки являются димерами, значения корректируют с учетом 2-кратной разницы в молярности. Таблица 2 Пример 3. Исследование толерантности к внутривенному введению глюкозы крысам. Слитый белок Fc, Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), оценивают при исследовании толерантности к внутривенному введению глюкозы крысам (IVGTT). В каждой из трех групп исследуются по меньшей мере четыре крысы. Крысы в группе I получают носитель (табл. 3), крысы в группе II получают 1,79 мг/кг Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) в форме однократной подкожной инъекции (табл. 4) и крысы в группе III получают 0,179 мг/кг Gly8-Glu22-Gly36GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) в форме однократной подкожной инъекции (табл. 5). Подкожную инъекцию крысам осуществляют утром 1 дня. Через 24 ч после первой инъекции проводят ин- 12008831 фузию 1 мкл глюкозы (D50) на 1 г массы тела в форме шарика. Пробы крови отбирают через 2, 4, 6, 10,20 и 30 мин после проведения инфузии глюкозы. Таблица 3 Пример 4. Фармакокинетическое исследование после проведения однократной подкожной инъекции обезьянам Cynomolgus. Исследование проводят с целью получения характеристики фармакокинетики (ФК) слитого белкаFc, Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) при введении самцам обезьян cynomolgus в форме подкожной инъекции (ПИ) в количестве 0,1 мг/кг. Антитело радиоиммуноанализа (РИА) является специфическим относительно средней части GLP. Твердофазный иммуноферментный анализ(ELISA) основан на использовании иммобилизованного антитела, специфического к N-концу, и идентифицирующего антитела, специфического к Fc. Полученные концентрации плазмы в результате проведения и ELISA, и РИА используют для определения представленных значений фармакокинетических параметров. Значения полученных ФК параметров сведены в табл. 6. ФК однократной ПИ в результате РИА ассоциируется со средним Сmах, равным 446,7 нг/мл, при соответствующем Тmах, равным 17,3 ч. Средний период полувыведения из плазмы составляет примерно 79,3 ч (3,3 дня). ФК в результате ELISA ассоциируется со средним Cmах, равным 292,2 нг/мл, при соответствующем Тmах, равным 16,7 ч. Средний период полувыведения из плазмы составляет примерно 51,6 ч (2,2 дня). Таблица 6 Максимальная концентрация плазмы. Время максимальной концентрации плазмы.c Площадь под кривой зависимости концентрации плазмы от времени, измеренная от 0 до бесконечности.d Период полувыведения из плазмы. е Общее очищение организма в зависимости от биологической доступности.f Объем распределения в зависимости от биологической доступности. СО = стандартное отклонение. Пример 5. Оценка потенциального образования антител после проведения повторных подкожных инъекций. Определенные пробы сыворотки от обезьян cynomolgus исследуют на образование антител противGly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), используя прямой формат ELISA. Планшеты микротитратора покрывают Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) при концентрации 0,1 мкг/мл. Пробы сыворотки обезьян разбавляют 50, 500, 1000 и 5000 раз в блокирующем растворе и пробы в количестве 0,05 мл на лунку инкубируют приблизительно один час. Вторичное антитело,козлиную человеческую Fab'2-пероксидазу (имеющая 75% перекрестную реактивность в отношении человека), разбавляют 10000 раз в блокирующем растворе, добавляют в количестве 0,05 мл на лунку и инкубируют приблизительно 1 ч. Проявление цвета при использовании субстрата тетраметилбензидин(ТМБ) считывают при оптической плотности 450-630 нм. Сдвоенные показания усредняют. АнтителоGLP-1 используют в качестве положительного контрольного значения и конъюгат козлинаякроличья(H+L)-пероксидаза используют для определения в качестве вторичного антитела. Точечные пробы сыворотки собирают перед дозированием, через 24 ч после введения второй дозы и через 168 ч после введения первой и второй подкожных доз для оценки потенциальной иммуногенности. Присутствие титров антитела к G8E22-CEX-L-hIgG4 интерпретируют путем сравнения с пробами сыворотки перед дозированием (ПД) и положительным контрольным значением. Соответствующие результаты приведены в табл. 7. Пример 6. Фармакодинамическое исследование после однократной подкожной инъекции обезьянамCynomolgus в состоянии натощак и во время постепенной внутривенной инфузии глюкозы. В фазе 1 (первый день исследования) осуществляют подкожную инъекцию носителя. Затем сразу после инъекции носителя осуществляют постепенную внутривенную инфузию глюкозы (20% декстроза) со скоростью 5, 10 и 25 мг/кг/мин. В фазе 2 (третий день исследования) осуществляют подкожную инъекцию слитого белка GLP-1 (0,1 мг/кг). В фазе 3 постепенную внутривенную инфузию глюкозы осуществляют приблизительно через 96 ч после инъекции слитого белка GLP-1. Процедуры постепенной внутривенной инфузии глюкозы осуществляют на седативных обезьянах после 16-часового ночного голодания. Для обоих внутривенных инфузии глюкозы каждые 10 мин на 20 мин отбирают базисные пробы для определения исходных данных. Ступенчатую инфузию глюкозы начинают через каждые 20 мин со скоростью 5 мг/кг/мин с последующей инфузией со скоростью 10 и 25 мг/кг/мин. Каждую инфузию осуществляют в течение 20 мин. Пробы крови отбирают с 10-минутными интервалами для измерения глюкозы, инсулина и глюкагона. Приблизительно 1,0 мл крови собирают в промежутках, равных -20, -10, 0 (предглюкозная инфузия) и 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин, после инфузии глюкозы для фаз 1 и 3. Соответствующие данные приведены в табл. 8. Уровни глюкагона не имели статистического различия на примере обезьян, получивших дозу носителя и слитого белка GLP-1. Пример 7. Фармакодинамическое исследование после однократной подкожной инъекции трех различных доз крысам в состоянии натощак и во время постепенной внутривенной инфузии глюкозы. Хронически канюлированных крыс распределяют либо по контрольной группе с носителем (солевой раствор), либо по одной из трех лечебных групп (слитый белок GLP-1; 0,0179 мг/кг, 0,179 мг/кг или 1,79 мг/кг). Слитый белок GLP-1 и носитель вводят путем подкожной инъекции. Через 24 ч после лечения крыс, подвергнутых ночному голоданию (16 ч), подвергают исследованию на постепенное внутривенное вливание глюкозы. Исследование на постепенное внутривенное вливание глюкозы заключается в проведении инфузии базового солевого раствора (20 мин) с последующими двумя 30-минутными инфузиями глюкозы со скоростью 5 и 15 мг/кг/мин соответственно. Пробы плазмы собирают в промежутках,равных -20, -10, 0 (предглюкозная инфузия) и 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин. Соответствующие данные приведены в табл. 9. Таблица 9- 17008831 Хаа в положении 17 означает Phe, Val или Ala; Хаа в положении 18 означает Leu, Glu или Ala; Хаа в положении 80 означает Asn или Ala и Хаа в положении 230 означает Lys либо отсутствует. 2. Гетерологичный слитый белок по п.1, отличающийся тем, что С-концевой остаток глицина аналога GLP-1 слит с N-концевым остатком аланина части Fc посредством пептидного линкера, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из: 3. Гетерологичный слитый белок по п.2, отличающийся тем, что линкер содержит последовательность SEQ ID NO:8. 4. Гетерологичный слитый белок по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что Хаа в положении 8 аналога GLP-1 представляет собой Gly. 5. Гетерологичный слитый белок по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что Хаа в положении 8 аналога GLP-1 представляет собой Val. 6. Гетерологичный слитый белок по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что аналог GLP-1 содержит последовательность SEQ ID NO:1. 7. Гетерологичный слитый белок, выбранный из группы, состоящей из: 9. Применение гетерологичного слитого белка по любому из пп.1-8 в качестве лекарственного средства. 10. Применение гетерологичного слитого белка по любому из пп.1-8 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения инсулиннезависимого сахарного диабета.- 18008831 11. Применение гетерологичного слитого белка по любому из пп.1-8 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения ожирения или стимулирования снижения массы тела у пациента с избытком массы тела. Список последовательностей