Изолированные рекомбинантные кишечные симбиотические бактерии и их применение

ИЗОЛИРОВАННЫЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ КИШЕЧНЫЕ СИМБИОТИЧЕСКИЕ БАКТЕРИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Обеспечиваются созданные методами генной инженерии клетки и микроорганизмы для предотвращения или облегчения течения заболеваний посредством передачи сигналов генетически модифицированной совокупностью бактерий. Также обеспечены способы терапии с применением указанных клеток и микроорганизмов для предотвращения или облегчения течения заболеваний. Указанные клетки или микроорганизмы можно модифицировать с применением генной инженерии с тем, чтобы они экспрессировали белок или пептид и их можно было применять для прерывания связанной с передачей сигналов вирулентности инвазивного патогена. Указанные клетки или микроорганизмы можно применять для обеспечения сигнал-зависимой экспрессии желаемого гена для того, чтобы прервать, предотвратить и/или облегчить течение заболевания у млекопитающего,например заболевания, вызванного паразитами, инфекционного заболевания, аутоиммунного заболевания и генетического нарушения. Перекрестная ссылка на родственные заявки Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании родственной предварительной заявки на патент США серийный No. 61/043426, поданной 9 апреля 2008, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Область техники Настоящее изобретение относится к микроорганизмам, полученным методами генетической инженерии (например, бактериям), с модифицированной способностью к передаче сигнала, и к применению таких модифицированных методами инженерии микроорганизмов, (или рекомбинантных клеток, полученных из них) для стимулирования или обеспечения экспрессии целевых генов в организме хозяина. Настоящее изобретение также относится к симбиотическим бактериям, модифицированным методами инженерии с тем, чтобы они экспрессировали сигнальные молекулы, делающие возможной коммуникацию или с клетками хозяина, или с другими бактериями, которые присутствуют в указанном хозяине или внедряются в указанного хозяина. Уровень техники Патогены, передающиеся через воду, по оценкам убивают 1,7 млн человек ежегодно и создают серьезную угрозу национальной безопасности США и развитию международной экономики (Ashbolt NJ. 2004. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology 198(l3):229-38; Leclerc H, Schwartzbrod L, Dei-Cas E. 2002. Microbial agents associated with waterborne diseases.Crit Rev Microbiol 28(4):371-409). Такое заболевание кишечника, как холера затрагивает развивающиеся страны во всем мире, особенно страны с теплым климатом, например Бангладеш (Guerrant RL., CarneiroFilho В A, Dillingham RA. 2003. Cholera, diarrhea, and oral rehydration therapy: triumph and indictment. ClinInfect Dis 37(3):398-405). Заболевание, вызываемое морской бактерией Vibrio cholerae, характеризуется диареей и тяжелым обезвоживанием. По общим оценкам, ежегодно от холеры умирает не менее 120,000200,000 человек (Sanchez J., Holmgren J. 2005. Virulence factors, pathogenesis and vaccine protection in cholera and ETEC diarrhea. Current Opinion in Immunology 17(4): 388-398). Большой масштаб, относительная бедность регионов вспышек заболеваний и недостаток специфичности вариантов лечения препятствует эффективному предотвращению указанных и других кишечных заболеваний, в частности, если для борьбы с инфекцией V. cholerae используют антимикробные средства широкого спектра действия, это делает возможным заселение желудочно-кишечного тракта оппортунистическими патогенами, например, Clostridium difficile. ЖКТ является местом обитания по меньшей мере для 395 филотипов бактерий (Eckburg PB, Bikthe human intestinal microbial flora. Science 308(5728): 1635-8). Эти симбиотические бактерии (пробиотики) эволюционировали вместе с хозяином для снабжения его питательными веществами, защиты от патогенов и помощи в развитии кишечника (Holzapfel WH, Haberer P., Snel J., Schillinger U., Huis in't VeldJH. 1998. Overview of gut flora and probiotics. Int J Food Microbiol 41(2):85-101). Как известно, и патогенные и непатогенные бактерии в желудке используют зависимую от плотности передачу сигналов (сигналлинг) от клетки к клетке, (восприятие кворума) для координации роста и вирулентности (Kaper JB,Sperandio V. 2005. Bacterial cell-to-cell signaling in the gastrointestinal tract. Infect Immun 73(6):3197-209). Соответственно, восприятие кворума, дает огромные возможности для контроля роста патогенов в кишечнике и других местах. Несмотря на то, что использование восприятия кворума для борьбы с патогенными бактериями имело некоторый успех (March JC, Bentley WE. 2004. Quorum sensing and bacterialwith AI-2-mediated bacterial cell-cell communication. Nature 437(7059):750-3), использованию полного потенциала этого метода препятствует недостаток знаний о функции восприятия кворума и о способах применения тех знаний, которые существуют. Также были предприняты успешные попытки применения симбиотических бактерий для предотвращения заболевания холерой посредством механизмов, отличных от связанных с восприятием кворума (Focareta A., Paton JC., Morona R., Cook J., Paton AW. 2006. A recombinant probiotic for treatment and prevention of cholera. Gastroenterology 130(6): 1688-95). Однако еще никому не удалось показать успешное применение сигналлинга от клетки к клетке для того, чтобы помешать внедрившемуся патогену проявить вирулентность.V. cholerae использует восприятие кворума для согласования инфекции ЖКТ человека (Miller MB,Skorupski K, Lenz DH, Taylor RK, Bassler BL. 2002. Parallel quorum sensing systems converge to regulatevirulence in Vibrio cholerae. Cell 110(3): 303-14). При низкой плотности V. cholerae экспрессирует факторы вирулентности: токсин-корегулируемые пили адгезии (TCP) и холерный токсин (СТ). TCP позволяют проникающей V. cholerae прикрепиться к внутренней поверхности ЖКТ (Taylor RK., Miller VL., Furlongwith cholera toxin. Proc Natl Acad Sci USA 84(9):2833-7), СТ вызывает диарею и обезвоживание посредством стимуляции аденилатциклазы (Moss J, Vaughan M. 1979. Activation of adenylate cyclase by choleragen.Annu Rev Biochem 48:581-600) (FIG.1B). При высокой плотности клеток экспрессия TCP и СТ снижается,и начинают экспрессироваться протеазы, которые разрушают матрикс прикрепления, через пути, которые регулируют восприятие кворума (Zhu J., Miller MB., Vance RE., Dziejman M., Bassler BL., MekalanosUSA 99(5): 3129-34). Несмотря на то, что значение этого механизма полностью не известно, предположили, что такая синхронизация вирулентности способствует откреплению или перемещению внутри или выходу из хозяина, если популяция достигла высокой плотности (Zhu J, Miller MB, Vance RE, Dziejman M, Bassler BL,Mekalanos JJ. 2002. Quorum-sensing regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc NatlAcad Sci U S A 99(5): 3129-34) (FIG. 1A). Фиг. 1 демонстрирует схему инфекционного цикла V. cholerae's и цикл событий, связанных с восприятием кворума. При низкой плотности в кишечнике (фиг. 1 А), V. cholerae (VC, эллипсы) экспрессирует факторы вирулентности холерный токсин (СТ, пятигранник) и токсин-корегулируемые пили адгезии (TCP, цепи), которые инфицируют эпителиальные клетки хозяина (эпителий, прямоугольники) и позволяют VC прикрепляться к эпителию, соответственно. При высокой плотности в кишечнике VC перестает экспрессировать гены вирулентности и поэтому может открепляться и покидать хозяина с током жидкости. С контролем восприятия кворума у V. cholerae обнаружили связь двух молекул автоиндукторов: холерногоавтоиндуктора 1(CAI-1) и автоиндуктора 2 (AI-2). На фиг. 1 В показана схема восприятия кворума V. cholerae: CqsA дает сигнал автоиндуктора CAI-1 и LuxS дает сигнал автоиндуктора AI-2. Эти системы пересекаются с System 3 через Lux О для обеспечения отрицательной обратной связи регуляции экспрессии генов вирулентности при высокой плотности. Высокая плотность клеток приводит к накоплению CAI-1 и AI-2 и переключает сигнальный каскад с киназной на фосфатазную активность, подавляя транскрипцию малых РНК, которые отвечают за развитие вирулентности. (ОМ=наружная мембрана,IM=внутренняя мембрана). Существует третий компонент регуляции пути восприятия кворума у V. cholerae (System 3), но показано, что он действует внутри клетки без внешнего сигнала (Miller MB, Skorupski K, Lenz DH, TaylorRK, Bassler BL. 2002. Parallel quorum sensing systems converge to regulate virulence in Vibrio cholerae (Cell 110(3):303-14. CAI-1 кодируется геном cqsA у V. cholerae, AI-2 кодируется геном luxS. Серотипы V. cholerae El Tor являются причиной вспышек холеры в развивающихся странах. У некоторых штаммов V. cholerae инфекционный цикл согласуется, по меньшей мере, частично, с восприятием кворума. Это означает, что экспрессия генов вирулентности зависит от концентрации автоиндукторовV. cholerae холерногоавтоиндуктора 1 (CAI-1) и автоиндуктора 2 (AI-2). Недавно было показано, что высокие концентрации CAI-1 и AI-2 подавляют экспрессию генов вирулентности. Поэтому в данной области существует потребность в разработке способов применения межклеточного сигналлинга для предотвращения проявления вирулентности инвазивного патогена. Также в данной области существует потребность в создании рекомбинантных микроорганизмов, которые модифицированы с применением генной инженерии с тем, чтобы они экспрессировали сигнальные молекулы, которые способствуют коммуникации либо с клетками хозяина, либо с другими бактериями, присутствующими в хозяине или внедрившимися в него. Цитирование или указание любой ссылки в разделе 2 или другом разделе данной заявки не следует рассматривать в качестве признания того, что такая ссылка рассматривается в качестве прототипа настоящего изобретения. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение обеспечивает измененные методами инженерии симбиотические бактерии,полученные из них изолированные рекомбинантные клетки, которые экспрессируют сигнальные молекулы, которые способствуют коммуникации с клетками хозяина или с другими бактериями, присутствующими в хозяине или проникающими в него. Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает изолированную рекомбинантную кишечную симбиотическую бактерию, стимулирующую продукцию инсулина в ответ на глюкозу в организме млекопитающего-хозяина и содержащую рекомбинантную нуклеиновую кислоту,которая кодирует белок или пептид , включающий пептид млекопитающего, стимулирующий секрецию инсулина, выбранный из группы, состоящей из глюкагоноподобного пептид а 1 (GLP-1), желудочного ингибиторного пептид а (GIP) и панкреатического и дуоденального гомеобоксного пептид а (PDX-1),причем указанный указанный белок или пептид может экспрессироваться указанной кишечной симбиотической бактерией и стимулировать продукцию инсулина в ответ на глюкозу клетками кишечного эпителия в организме млекопитающего-хозяина. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид секретируется клеткой, и секреция клеткой находится под контролем стимула из окружающей среды. Согласно другому варианту реализации нестоящего изобретения указанный белок или пептид стимулирует или ингибирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Согласно другому варианту реализации указанный стимул из окружающей среды секретируется патогеном или наличие стимула из окружающей среды указывает на присутствие патогена. Согласно другому варианту реализации указанный патоген представляет собой инвазивный патоген и указанный белок или пептид ингибирует или нарушает патогенность или вирулентность указанного инвазивного патогена. Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота контролирует патогенез или вирулентность указанного патогена. Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота кодирует фактор вирулентности инвазивного патогена. Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота экспрессируется млекопитающим. Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота кодирует фактор млекопитающего. Фактор млекопитающего может, например, обеспечивать нормальное функционирование физиологического процесса у указанного млекопитающего, или эффективно предотвращает начало, развитие или распространение неинфекционного заболевания у млекопитающего. Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота кодирует причинный фактор,связанный с началом неинфекционного заболевания у млекопитающего. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный микроорганизм представляет собой бактерию. Бактерия может представлять собой, например, кишечную бактерию или симбиотическую бактерию. Согласно одному варианту реализации симбиотическая бактерия представляет собой штамм бактерии Escherichia coli. Согласно частному варианту реализации штамм Escherichia coli представляет собой штамм Nissle 1917Escherichia coli. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид предотвращает, распознат, облегчает или лечит заболевание или нарушение у человека или животного. Животное, в качестве примера, может представлять собой Хордовое, например, млекопитающее или человека, или насекомое. Согласно другому варианту реализации белок или пептид стимулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид включает кворумный белок или пептид . Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный инвазивный патоген представляет собой простейшее, патогенную бактерию, гриб или вирус. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный инвазивный патоген представляет собой Vibrio cholerae. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид содержит антимикробный пептид или молекулу. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид конститутивно экспрессируется клеткой. Согласно другому варианту реализации экспрессия рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок или пептид , находится под контролем индуцибельного промотора. Согласно другому варианту реализации рекомбинантная клетка дополнительно содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантную молекулу ответа, отличающуюся тем,что указанная рекомбинантная молекула ответа распознает молекулу, представленную в хозяине. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения заболевание представляет собой диабет. Согласно этому варианту реализации указанный белок или пептид может включать Glp-1, PDX-1 или GIP. Стимул из окружающей среды может представлять собой глюкозу или сахар, который стимулирует выделение инсулина у здорового человека. Согласно отдельному варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид включает кворумный белок или пептид холерного автоиндуктора 1 Vibrio cholerae (CAI-1), рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный сигнал, содержит ген cqsA Vibrio cholerae, кодирующий CAI-1, целевая нуклеиновая кислота представляет собой холерный токсин Vibrio cholera (CT), и экспрессия CAI-1 ингибирует экспрессию CT Vibrio cholerae. Согласно другому отдельному варианту реализации указанный белок или пептид включает кворумный белок или пептид холерного автоиндуктора 2 Vibrio cholerae (AI-2), рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный сигнал, содержит ген luxS Vibrio cholerae, кодирующий AI-2, целевая нуклеиновая кислота представляет собой корегулируемые токсином пили адгезии (TCP) Vibrio cholerae, и экспрессия AI-2 ингибирует экспрессию TCP Vibrio cholerae. Согласно другому отдельному варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид включает стимулирующий секрецию инсулина пептид млекопитающего, указанный белок или пептид регулирует экспрессию инсулина инсулин-секретирующими клетками млекопитающего, и экспрессия указанного сигнала в клетке стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу у млекопитающего пациента, например, человека. Согласно этому варианту реализации настоящего изобретения указанная рекомбинантная клетка также содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантную молекулу ответа, отличающуюся тем, что рекомбинантная молекула ответа распознат молекулу, представленную в организме млекопитающего. Пептид млекопитающего, который стимулирует секрецию инсулина, может представлять собой, например, глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1) или панкреатический или дуоденальный гомеобоксный ген 1 (PDX-1). Инсулин-секретирующие клетки млекопитающего могут представлять собой клетки кишечного эпителия. Настоящее изобретение также обеспечивает способ регуляции экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в организме хозяина. Указанный способ включает получение изолированной рекомбинантной клетки согласно настоящему изобретению (или микроорганизма, содержащего указанную клетку или состоящего из клетки согласно настоящему изобретению) и введение указанной клетки (или микроорганизма, содержащего указанную клетку или состоящего из такой клетки) в организм хозяина при условиях, которые делают возможной экспрессию указанного сигнала в организме хозяина, благодаря чему регулируется сигнал-зависимая экспрессия целевой нуклеиновой кислоты в организме хозяина. Согласно одному варианту реализации указанный белок или пептид предотвращает, выявляет, облегчает или лечит заболевание или нарушение у человека или животного или в полученных из них клетках. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид стимулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Согласно особому варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид включает кворумный сигнальный белок или пептид. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид содержит антимикробный пептид или молекулу. Целевая нуклеиновая кислота может кодировать фактор вирулентности инвазивного патогена. Инвазивный патоген может представлять собой, например, простейшее, патогенную бактерию, гриб или вирус. Согласно другому отдельному варианту реализации указанный инвазивный патоген представляет собой Vibrio cholerae. Согласно отдельному варианту реализации способа согласно настоящему изобретению указанный белок или пептид включает кворумный сигнальный белок или пептид холерного автоиндуктора 1 (CAI1) Vibrio cholerae, рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая сигнал, содержит ген cqsA Vibriocholerae, кодирующий CAI-1, целевая нуклеиновая кислота представляет собой холерный токсин (СТ)Vibrio cholerae, и экспрессия CAI-1 ингибирует экспрессию СТ Vibrio cholerae. Согласно другому отдельному варианту реализации белок или пептид включает кворумный сигнальный белок или пептид холерного автоиндуктора 2 (AI-2) Vibrio cholerae, рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая сигнал, содержит ген luxS Vibrio cholerae, кодирующий AI-2, целевая нуклеиновая кислота представляет собой токсин-корегулируемые пили адгезии (TCP), Vibrio cholerae, и экспрессия AI-2 ингибирует экспрессию TCP Vibrio cholerae. Согласно другому отдельному варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид включает пептид млекопитающего, стимулирующий секрецию инсулина, указанный белок или пептид регулирует экспрессию инсулина в инсулин-секретирующих клетках млекопитающего, и экспрессия сигнала клеткой стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу в организме млекопитающего хозяина. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения рекомбинантная клетка содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантную молекулу ответа, причм указанная рекомбинантная молекула ответа распознат молекулу, присутствующую в организме млекопитающего хозяина, например человека. Согласно одному варианту реализации инсулин-секретирующие клетки млекопитающего представляют собой клетки кишечного эпителия. Согласно одному варианту реализации стимулирующий секрецию инсулина пептид млекопитающего может представлять собой, например, глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1), который стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу в организме млекопитающего. Согласно другому варианту реализации стимулирующий секрецию инсулина пептид млекопитающего представляет собой панкреатический и дуоденальный гомеобоксный ген 1 (PDX-1), который стимулирует конститутивную продукцию инсулина в организме млекопитающего. Согласно другому варианту реализации стимулирующий секрецию инсулина пептид млекопитающего представляет собой GIP пептид , который стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу в организме млекопитающего. Настоящее изобретение также обеспечивает способ предотвращения или облегчения симптоматики инфекционного или неинфекционного заболевания у млекопитающего пациента. Указанный способ включает обеспечение изолированной рекомбинантной клетки согласно настоящему изобретению (или микроорганизма, включающего указанную клетку или состоящего из клетки согласно настоящему изобретению), и введение указанной клетки (или микроорганизма, включающего такую клетку или состоящего из клетки согласно настоящему изобретению) млекопитающему пациенту в условиях, которые эффективны для стимуляции экспрессии фактора, предотвращающего заболевание, или подавления экспрессии фактора, который является причиной заболевания, благодаря чему предотвращается развитие или облегчается указанное заболевание. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения неинфекционное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание, например диабет 1 типа. Согласно другому отдельному варианту реализации указанный белок или пептид включает PDX-1,фактор, предотвращающий развитие заболевания, представляет собой инсулин, и PDX-1 стимулирует конститутивную продукцию инсулина у млекопитающего пациента. Согласно другому особенному варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид включает Glp-I, фактор, предотвращающий развитие заболевания, представляет собой инсулин и Glp-I стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу у млекопитающего пациента. Согласно другому особенному варианту реализации указанный белок или пептид включает GIP, фактор, предотвращающий развитие заболевания, представ-4 023069 ляет собой инсулин, и GIP стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу у млекопитающего пациента. Согласно другому варианту реализации изобретение обеспечивает применение действующего вещества, выбранного из группы, состоящей из сигнала, его фрагмента, производного, комплекса или аналога указанного сигнала, экспрессируемой нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное действующее вещество или его фрагмент или производное, где указанный белок или пептид регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты; и непатогенного микроорганизма, содержащего нуклеиновую кислоту и способного экспрессировать указанный сигнал, для лечения заболевания или расстройства человека или животного. Согласно одному варианту реализации указанный белок или пептид ингибирует или нарушает патогенность или вирулентность инвазивногопатогена. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид предотвращает, выявляет, облегчает или лечит заболевание или расстройство человека или животного. Согласно другому варианту реализации указанное заболевание представляет собой инфекционное или неинфекционное заболевание. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения лечение осуществляют посредством введения изолированного и очищенного действующего вещества в составе фармацевтической композиции. Согласно другому варианту реализации указанное действующее вещество вводят в дозе, достаточной для лечения болезненного состояния или его предотвращения, для остановки прогрессирования заболевания или облегчения его симптоматики. Согласно другому варианту реализации настоящего указанное действующее вещество вводят пациенту орально, ректально, парентерально, в виде инъекций, инфузии, спрея или ингалятора. Согласно другому варианту реализации непатогенный микроорганизм способен продуцировать указанное действующее вещество до, во время или после введения человеку или животному, и выделять выработанное действующее вещество после введения в клетки или ткани пациента. Согласно другому варианту реализации непатогенный микроорганизм представляет собой симбиотическую бактерию или гриб человека или животного. Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм принадлежит к естественной кишечной флоре человека или животного. Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм представляет собой аэробную или анаэробную грамотрицательную бактерию кишечной флоры. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанная грамотрицательная бактерия принадлежит роду Escherichia, Pseudomonas, Bacteroides, Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus илиProteus. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанная грамотрицательная бактерия представляет собой Escherichia coli (Nissle 1917). Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм представляет собой аэробную или анаэробную грамположительную или грамотрицательную бактерию кишечной флоры. Согласно другому варианту реализации указанная грамположительная бактерия принадлежит родуBifidobacterium, Streptococcus, Staphylococcus или Corynebacterium. Согласно другому варианту реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный белок или пептид или его фрагмент или производное, вставляют в вектор. Согласно другому варианту реализации указанный вектор представляет собой плазмиду, космиду,бактериофаг или вирус. Согласно другому варианту реализации указанная нуклеиновая кислота, встроенная в вектор, находится под функциональным контролем по меньшей мере одного регуляторного элемента, который обеспечивает транскрипцию указанной нуклеиновой кислоты в транслируемую РНК или трансляцию РНК в белок до, во время или после введения. Согласно другому варианту реализации указанный по меньшей мере один регуляторный элемент представляет собой промотор, сайт связывания рибосомы, сигнальную последовательность или 3'-терминатор транскрипции. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный промотор представляет собой индуцибельный промотор. Согласно особому варианту реализации, указанный индуцибельный промотор индуцируется сигнальным каскадом, включающим по меньшей мере один элемент, в ответ на стимул или стимулы из окружающей среды. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения сигнальная последовательность представляет собой сигнальную последовательность гриба или бактерии, которая обеспечивает секрецию белка из цитоплазмы микроорганизма в периплазматическое пространство или в окружающую микроорганизм среду. Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм включают в фармацевтическую или пищевую композицию. Согласно другому варианту реализации указанное действующее вещество вводят орально, ректаль-5 023069 но, парентерально, в виде инъекции, инфузии, спрея или ингалятора пациенту. Обеспечивается фармацевтическая или пищевая композиция. Композиция может содержать по меньшей мере одну клетку непатогенного микроорганизма, способного продуцировать действующее вещество, и содержащего экспрессируемую нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или пептид или его фрагмент или производное. Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм представляет собой аэробную или анаэробную, грамотрицательную или грамположительную бактерию кишечной флоры. Согласно другому варианту реализации указанный микроорганизм представляет собой симбиотическую бактерию человека или животного. Согласно другому варианту реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или пептид или его фрагмент или производное, вставляют в вектор экспрессии, и при этом экспрессия указанной нуклеиновой кислоты находится под контролем по меньшей мере одного регуляторного элемента, таким образом, что указанное действующее вещество экспрессируется до, во время или после введения указанной фармацевтической или пищевой композиции и высвобождается в клетки или ткани человека или животного хозяина после введения указанной фармацевтической или пищевой композиции. Обеспечивается способ производства фармацевтической или пищевой композиции. Указанный пособ включает:(а) выделение или синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей действующее вещество, причм указанное действующее вещество выбирают из группы, состоящей из белка или пептид а, его фрагмента,комплекса, производного и аналога, экспрессируемой нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное действующее вещество или его фрагмент или производное;(б) клонирование нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок или пептид , в микробный вектор экспрессии;(в) трансформацию указанного рекомбинатного вектора экспрессии, полученного на стадии (б), в клетку микроорганизма хозяина, причм указанная клетка микроорганизма хозяина представляет собой симбиотическую бактерию человека или животного хозяина;(г) размножение трансформированных клеток микроорганизма хозяина;(д) получение иммобилизированного, лиофилизированного, жидкого препарата или суспензии трансформированных клеток микроорганизма-хозяина и(е) смешивание иммобилизированного, лиофилизированного, жидкого препарата или суспензии трансформированных клеток микроорганизма хозяина, полученных на стадии (е) с физиологически приемлемыми наполнителями, стабилизаторами, загустителями, разделителями, любрикантами, эмульгирующими агентами и т.п. материалами для получения фармацевтической или пищевой композиции. Краткое описание фигур Настоящее изобретение описывается со ссылкой на сопутствующие фигуры, на которых одинаковые обозначения относятся к одинаковым элементам на нескольких изображениях. Следует понимать,что в некоторых случаях различные аспекты настоящего изобретения могут быть подчеркнуты или расширены для облегчения понимания изобретения. Фиг. 1 содержит изображение инфекционного цикла V. cholerae и схему восприятия кворума (для дополнительной информации, см. раздел 6.1). Фиг. 2 иллюстрирует экспрессию автоиндукторов симбиотической бактерией, полученной с помощью генной инженерии (для дополнительной информации см. раздел 6.1). Фиг. 3 иллюстрирует вирулентность V. cholerae в культуральной среде (для дополнительной информации см. раздел 6.1). Фиг. 4 иллюстрирует прекращение вирулентности V. cholerae в совместных культурах (для дополнительной информации см. раздел 6.1). Фиг. 5 иллюстрирует плазмиды, сконструированные для исследования, описанного в разделе 6.2. Для исследования промоторов Р 0/Р 1 из Е. coli DH5a сконструировали две плазмиды (pFDl и pFD2). pFDl кодировала полный участок Р 0/Р 1 для запуска экспрессии ускоренного зеленого флуоресцентного белка(EGFP). pFD2 кодировала только участок Р 0 промотора апстрим EGFP. Для тестирования эффективности секреции инсулинотропного белка из рекомбинантной бактерии для стимуляции секреции инсулина в клетках Сасо-2, создали плазмиды pFD-PDX, pFD-GLP и pFD-20, как описано в разделе 6.2. Фиг. 6 иллюстрирует ответ Р 0 и Р 0/Р 1 на глюкозу. Для измерения ответа промоторов Р 0 и/или Р 1 в зависимости от различных условий среды использовали экспрессию EGFP. Р 0=Р 0 только; Р 0+Р 1=Р 0 и фланкирующий участок Р 1; DH5 а=контроль lac оперона (для дополнительной информации см. раздел 6.2.) Фиг. 7 иллюстрирует секрецию рекомбинантного инсулинотропного белка Е. coli Nissle 1917 (для дополнительной информации см. раздел 6.2). Фиг. 8 иллюстрирует стимуляцию секреции инсулина в эпителиальных клетках (для дополнительной информации см. раздел 6.2). Подробное описание изобретения Обеспечиваются измененные клетки и микроорганизмы, для предотвращения или облегчения (например, лечения) заболеваний посредством измененного сигналлинга. Также обеспечиваются терапевти-6 023069 ческие способы применения указанных клеток и микроорганизмов для предотвращения или облегчения заболеваний. Указанные клетки (или микроорганизмы), полученные методами генетической инженерии,можно сконструировать таким образом, что они экспрессируют важный белок или пептид для инвазивных патогенов, других симбиотических микроорганизмов или хозяина. Во всех случаях полученный с помощью генной инженерии симбиотический микроорганизм изменн таким образом, что он испускает и/или воспринимает сигналы вместо хозяина. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный генетически измененный микроорганизм можно использовать для обеспечения кворум-зависимой экспрессии желательного гена для предотвращения, прекращения и/или облегчения заболевания млекопитающего, включая, но не ограничиваясь, человека. Согласно частному варианту реализации соответствующие заболевания, которые можно прекращать, предотвращать и/или облегчать с помощью рекомбинантных клеток или микроорганизмов согласно настоящему изобретению, могут включать, но не ограничиваться, паразитарными заболеваниями, инфекционными заболеваниями, аутоиммунными заболеваниями и генетическими нарушениями. В настоящем описании под термином "инфекционное заболевание" понимают заболевания, которые вызываются патогенами млекопитающих, включая, без ограничения, такие патогены, как бактерии, вирусы, грибы и простейшие. Частный пример бактериального заболевания человека, которое можно прерывать, предотвратить и/или облегчить с помощью измененных клеток или микроорганизмов согласно настоящему изобретению, включает, но не ограничивается, холеру (вызываемую бактерией Vibrio cholerae). В частности, рекомбинантную клетку или микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть изменена таким образом, что это регулирует или влияет на кворум-зависимую экспрессию факторов вирулентности Vibrio cholerae. Соответствующие примеры факторов вирулентности Vibriocholerae, которые можно ингибировать или нарушать их работу с помощью рекомбинантных клеток или микроорганизмов согласно настоящему изобретению, могут включать, но не ограничиваются, холерный токсин (СТ) и токсин-корегулируемые пили адгезии (TCP). Соответствующие примеры генов, которые можно вставлять в рекомбинантную клетку или микроорганизм согласно настоящему изобретению (например, симбиотическую бактерию Escherichia coli Nissle 1917) для подавления или нарушения экспрессии СТ или TCP, могут включать, но не ограничиваются, автоиндукторы Vibrio cholerae, известные как холерный автоиндуктор 1 (CAI-1) (кодируемый геном cqsA) и/или автоиндуктор 2 (AI-2) (кодируемый геном luxS). Частный пример аутоиммунного заболевания человека, которое можно прекратить, предотвратить и/или облегчить с помощью генетически измененной клетки или микроорганизма согласно настоящему изобретению включает, но не ограничивается, диабет 1 типа. Более конкретно, в отношении диабета 1 типа, указанные рекомбинантную клетку или микроорганизм согласно настоящему изобретению (например, симбиотическую бактерию Nissle 1917 Escherichia coli) можно изменить таким образом, чтобы это стимулировало продукцию инсулина и/или транскриптов инсулина у человека. Примеры продуктов генов, которые могут стимулировать выработку инсулина, включают, но не ограничиваются, PDX-1, GIP и Glp-1 млекопитающих. Показано, что PDX-1 стимулирует конститутивную выработку инсулина в эпителии. Показано, что Glp-1 стимулирует выработку инсулина эпителием в ответ на глюкозу. Показано, что GIP стимулирует конститутивную выработку инсулина в -клетках поджелудочной железы. Поэтому согласно одному варианту реализации настоящего изобретения симбиотическую бактерию, например, Escherichia coli Nissle 1917, можно изменить для обеспечения ею синтеза пептид ов PDX-1, GIP и/или Glp-I: любого из этих трех пептидов или одного из трех пептидов в сочетании со всеми другими пептидами. Настоящее изобретение предлагает создание и применение микроорганизмов, например, клеточных линий симбиотических бактерий, которые согласно одному варианту реализации могут воспринимать условия организма хозяина (например, млекопитающего, человека) и отвечать соответствующим образом или оказывать терапевтический эффект, или выделять специфическую сигнальную молекулу вместо хозяина. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения указанные микроорганизмы могут не воспринимать условия в организме хозяина, но могут коснтитутивно обеспечивать желаемый терапевтический ответ. Частные примеры клеточных линий симбиотических бактерий и их применение приведены ниже в целях иллюстрации, но не ограничения области охвата настоящего изобретения. В целях ясности, но не ограничения, подробное описание изобретения разделено на подразделы,представленные ниже. Рекомбинантные клетки Настоящее изобретение обеспечивает изолированные рекомбинантные клетки, содержащие рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или пептид, причем указанная клетка получена из первого организма, который представляет собой микроорганизм,указанный белок или пептид может экспрессироваться в клетке и указанный белок или пептид регулирует сигнал-зависимую экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Согласно одному варианту реализации указанная нуклеиновая кислота представляет собой реком-7 023069 бинантную нуклеиновую кислоту восприятия кворума. Согласно другому варианту реализации указанная рекомбинантная клетка дополнительно содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантную молекулу ответа, причем указанная рекомбинантная молекула ответа распознат молекулу, присутствующую в хозяине. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид секретеруется клеткой и секреция клеткой находится под контролем стимула из внешней среды. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид стимулирует или ингибирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Стимул из внешней среды может секретироваться патогеном или наличие внешнего стимула может указывать на присутствие патогена. Согласно частному варианту реализации, согласно которому рекомбинантную клетку используют для лечения диабета, указанный белок или пептид может включать Glp-1, PDX-1 или GIP, и внешний стимул может представлять собой глюкозу или сахар, который стимулирует выделение инсулина у здорового человека. Согласно другому варианту реализации указанный патоген представляет собой инвазивный патоген, и белок или пептид ингибирует или нарушает патогенность или вирулентность указанного инвазивного патогена Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота контролирует патогенез или вирулентность патогена. Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота кодирует фактор вирулентности инвазивного патогена. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения целевая нуклеиновая кислота экспрессируется млекопитающим. Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота кодирует фактор млекопитающего. Фактор млекопитающего может, например, обеспечивать нормальное функционирование физиологического процесса в организме млекопитающего или быть эффективным для предотвращения начала, формирования или распространения неинфекционного заболевания у млекопитающего пациента. Согласно другому варианту реализации указанная целевая нуклеиновая кислота кодирует причинный фактор, ассоциированный с началом неинфекционного заболевания млекопитающего. Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный микроорганизм (одноклеточный или многоклеточный), который включает одну или более рекомбинантную клетку, которая содержит рекомбинантную кворумную нуклеиновую кислоту. Согласно частному варианту реализации указанную рекомбинантную кворумную нуклеиновую кислоту получают из второго организма, который экспрессирует кворумный сигнальный белок или пептид (также известный как сигнал восприятия кворума). Указанный кворумный сигнал регулирует кворум-зависимую экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. При объединении с организмом хозяина (например, симбиотическим хозяином) указанная рекомбинантная клетка (или микроорганизм, содержащий такую клетку) регулирует кворум-зависимую экспрессию представляющего интерес генов организма хозяина или экзогенного (например, патогенного) организма. Рекомбинантный микроорганизм (или полученная из него рекомбинантная клетка) может представлять собой бактерию, вирус, архею, дрожжи, гриб или клетку млекопитающего. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный рекомбинантный микроорганизм представляет собой непатогенный микроорганизм, например, микроорганизм, который принадлежит к природной кишечной флоре человека или животного. Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм представляет собой аэробную или анаэробную грамотрицательную бактерию кишечной флоры. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения грамотрицательная бактерия принадлежит роду Escherichia, Pseudomonas, Bacteroides, Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus или Proteus. Согласно другому варианту реализации указанная грамотрицательная бактерия представляет собойEscherichia coli (Nissle 1917). Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм представляет собой аэробную или анаэробную грамположительную или грамотрицательную бактерию кишечной флоры. Согласно другому варианту реализации грамположительная бактерия принадлежит роду Bifidobacterium, Streptococcus, Staphylococcus или Corynebacterium. Согласно частным вариантам реализации указанная бактерия представляет собой кишечную бактерию (например, Escherichia coli, Lactobacillis), симбиотическую бактерию (например, штамм Escherichiacoli). Согласно другому частному варианту реализации бактерия представляет собой Escherichia coli Nissle 1917. Штаммы бактерий можно легко получить с помощью стандартных способов, известных в данной области. Например, симбиотическую бактерию такую, как Nissle 1917 Escherichia coli, можно получить из коммерческого препарата пробиотика Mutaflor. Бактерии можно культивировать с помощью стандартных способов, известных в данной области. Согласно другому частному варианту реализации, согласно которому заболевание, которое необходимо предотвратить или облегчить, представляет собой диабет 1 типа, обеспечивается изолированная рекомбинантная клетка, содержащая рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид млекопитающего, стимулирующий секрецию инсулина. Указанную рекомбинантную клетку можно получить из микроорганизма, например, кишечной бактерии или симбиотической бактерии кишечника. Согласно этому варианту реализации стимулирующий секрецию инсулина пептид млекопитающего регулирует экспрессию инсулина в инсулин-секретирующих клетках-мишенях млекопитающего. Экспрессия пептида млекопитающего, стимулирующего секрецию инсулина, указанной рекомбинантной клеткой стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу у млекопитающего. Пептид млекопитающего, стимулирующий секрецию инсулина, может представлять собой, например, глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1), желудочный ингибиторный пептид (GIP) или панкреатический или дуоденальный гомеобоксный ген 1 (PDX-1). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения инсулин-секретирующие клетки мишени млекопитающего представляют собой клетки кишечного эпителия. Рекомбинантную симбиотическую бактерию согласно настоящему изобретению можно изменить способами генной инженерии,чтобы она для придания стимулировала секрецию инсулина клетками кишечного эпителия в ответ на глюкозу. Согласно одному варианту реализации способами инженерии можно получить бактерию, которая секретирует инсулинотропный GLP-1, GIP и/или PDX-1. Патогены Согласно одному варианту реализации целевая нуклеиновая кислота может экспрессироваться инфекционным или инвазивным патогеном, включая, но, не ограничиваясь, инфекционную бактерию, простейшее, гриб или вирус. Рекомбинантную симбиотическую бактерию согласно настоящему изобретению можно изменить таким образом, что она воспринимает молекулу мишень, которая может представлять собой, но не ограничиваться им, кворумный сигнал, и отвечает на указанную молекулу посредством секреции антипатогенного пептид а (например, антимикробного, противогрибного и т.д.). Антипатогенный пептид может иметь широкий спектр действия (например, действует на несколько видов бактерий) или иметь высокую специфичность к одному виду патогена. В данной области известно множество инфекционных патогенов. Инфекционная бактерия может представлять собой, например, Е. coli, Pseudomonas or Staphylococcus. Гриб может представлять собой,например, Cryptococcus neoformans. Вирус может представлять собой, например, вирус гриппа птиц(H5N1). Согласно частному варианту реализации указанный инвазивный патоген представляет собой Vibriocholerae. Целевые нуклеиновые кислоты Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения целевая нуклеиновая кислота(которая также в данном описании обозначается термином "экзогенная" целевая нуклеиновая кислота) может кодировать фактор инфекционного патогена, например фактор вирулентности. Согласно частным вариантам реализации указанный фактор инфекционного патогена представляет собой молекулу токсина. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения целевая нуклеиновая кислота кодирует фактор млекопитающего. Фактор млекопитающего может способствовать, например, нормальному функционированию физиологического процесса у млекопитающего пациента, или он может быть эффективным для предотвращения начала, формирования или распространения неинфекционного заболевания у млекопитающего пациента. Согласно частным вариантам реализации указанный фактор млекопитающего представляет собой PDX-1, GLP-1 или GIP. Согласно другому варианту реализации указанный сигнал восприятия кворума регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Например, указанный кворумный сигнал может стимулировать или подавлять экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение также обеспечивает способ регуляции экспрессии целевой нуклеиновой кислоты. Указанный способ включает обеспечение изолированной рекомбинантной клетки согласно настоящему изобретению (или микроорганизма, который содержит или состоит из клетки согласно настоящему изобретению) и введение указанной клетки (или микроорганизма, содержащего или состоящего из клетки согласно настоящему изобретению) пациенту хозяину при условиях, при которых может осуществляться экспрессия указанного сигнала в пациенте хозяине, что регулирует сигнал-зависимую экспрессию целевой нуклеиновой кислоты в указанном хозяине. Сигналы и нуклеиновые кислоты, которые их кодируют Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения белок или пептид предотвращает,распознат, облегчает или лечит заболевание или нарушение человека или животного или клетки, полученной из них. Указанный белок или пептид может секретироваться, испускаться, выделяться или продуцироваться рекомбинантной клеткой или микроорганизмом согласно настоящему изобретению. Такая секреция,испускание, выделение или продукция клеткой может контролироваться стимулом из внешней среды. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид может контролировать, например стимулировать или подавлять экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид включает антимикробный пептид или молекулу. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид включает антимикробный пептид или молекулу. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид включает антимикробный пептид или молекулу. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид экспрессируется клеткой конститутивным образом. Согласно другому варианту реализации экспрессия рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный сигнал, находится под контролем индуцибельного промотора. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид включает стимулирующий секрецию инсулина млекопитающего, указанный белок или пептид регулирует экспрессию инсулина в инсулин-секретирующих клетках млекопитающего, и экспрессия указанного сигнала клеткой стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу в организме млекопитающего,например человека. Согласно этому варианту реализации изобретения рекомбинантная клетка также может содержать рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантную молекулу ответа,причм указанная рекомбинантная молекула ответа распознат молекулу, присутствующую в млекопитающем хозяине. Пептид млекопитающего, стимулирующий секрецию инсулина, может представлять собой, например, глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1) или панкреатический или дуоденальный гомеобоксный ген 1 (PDX-1). Инсулин-секретирующие клетки млекопитающего могут представлять собой клетки кишечного эпителия. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид включает кворумный сигнал. Квормуные сигналы (также известные как сигналы восприятия кворума) используются микроорганизмом для межклеточного сигналлинга в зависимости от плотности клеток (восприятие кворума) для координации их роста и вирулентности. Такие сигналы хорошо известны в данной области. Например, известно,что как патогенные, так и непатогенные бактерии кишечника используют сигналы восприятия кворума(Kaper JB, Sperandio V. 2005. Bacterial cell-to-cell signaling in the gastrointestinal tract. Infect Immun 73(6):3197-209). Согласно частному варианту реализации, согласно которому инфекционный патоген представляет собой Vibrio cholerae, сигнал восприятия кворума представляет собой холерный автоиндуктор l(CAI-l)Vibrio cholerae или автоиндуктор 2 (AI-2). Кворумная нуклеиновая кислота может включать гены Vibriocholerae cqsA и/или luxS, кодирующие CAI-1 и AI-2 соответственно. Согласно этому варианту реализации целевые нуклеиновые кислоты (нуклеиновые кислоты-мишени) кодируют холерный токсин (СТ) и токсин-корегулируемые пили адгезии (TCP) Vibrio cholerae и экспрессия CAI-1 и AI-2 рекомбинантными клетками будет подавлять экспрессию СТ и TCP Vibrio cholerae. Рекомбинантную клетку или микроорганизм согласно настоящему изобретению можно генетически изменить с применением способов, известных в данной области техники таким образом, чтобы она экспрессировала сигнал восприятия кворума под контролем промотора (например, индуцибельного или конститутивного промотора). Клетку или микроорганизм можно трансформировать, например, плазмидой, несущей кворумный ген для того, чтобы обеспечить экспрессию сигнала кворума на высоком уровне. Гены, кодирующие кворумные сигналы, можно получить стандартными способами амплификации нуклеиновых кислот, известными в данной области техники, например высокоточная ПЦР с праймерами,подходящими для желаемой амплификации. Амплифицированную последовательность можно стандартными способами вставить в соответствующий вектор. Такие векторы хорошо известны в данной области и коммерчески доступны (например, вектор pUC19 (New England Biolabs. Вектор может быть трансформирован в клетку или микроорганизм любыми способами, известными в данной области техники,например электропорацией. Клонирование можно проводить стандартными способами, известными в данной области техники (См., например, Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular cloning: a laboratorymanual. Cold Spring Harbor N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 v. p). Согласно частному варианту реализации методами генетической инженерии можно получить симбиотическую бактерию Е. coli Nissle 1917 (Nissle), которая экспрессирует CAI-1 под контролем fliC или другого конститутивного промотора. Демонстрация терапевтической полезности Рекомбинантные клетки или микроорганизмы согласно настоящему изобретению предпочтительно проверяют in vitro, а затем in vivo на наличие желаемой терапевтической или профилактической активности перед применением на людях. Например, анализы in vitro можно применять для определения того, показано ли введение специфической рекомбинантной клетки или микроорганизма. Такие анализы могут представлять собой, например, анализ клеточных культур in vitro, в котором образец ткани пациента выращивают в культуре и его подвергают действию или вводят в него рекомбинантную клетку или микроорганизм, и наблюдают за действием, которое оказывает такая рекомбинантная клетка или микроорганизм на указанный образец ткани. Высокий уровень желательного действия или низкий уровень нежелательного действия указывают на то, что рекомбинантная клетка или микроорганизм являются эффективными для лечения заболевания пациента. В качестве альтернативы вместо культивирования клеток пациента можно проанализировать рекомбинантную клетку или микроорганизм с помощью клеточной линии злокачественной опухоли. Для определения уровней желательного или нежелательного воздействия можно применять множество стандартных способов, известных в данной области техники. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения можно определять активность рекомбинантной клетки или микроорганизма, чтобы модулировать (например, способствовать, ингибировать или оказывать антагонистическое воздействие) уровень и/или активность нуклеиновых кислотмишеней. Уровни белков и мРНК, кодируемых целевой целевой нуклеиновой кислотой, и активность целевой нуклеиновой кислоты можно определять любыми известными в данной области техники способами. Например, уровни белка можно количественно определять известными способами иммунной диагностики, например иммунопреципитацией с вестерн-блоттингом с применением любого антитела против этого белка (например, коммерчески доступных антител). мРНК можно количественно определять способами, известными в данной области техники, например нозерн-блоттингом, анализом защиты от РНКаз, ПЦР с обратной транскрипцией и т.д. Активность целевой нуклеиновой кислоты можно также определить любым способом, известным в данной области техники. Вещества, предназначенные для применения в терапии, можно тестировать на соответствующих животных моделях перед тестированием на человеке, включая, но не ограничиваясь, крыс, мышей, цыплят, коров, обезьян, кроликов и т.д. Для проверки влияния экспрессии сигнала восприятия кворума на вирулентность представляющего интерес патогена можно создать совместные культуры эпителия человека, генетически измененных симбиотических бактерий и патогенных бактерий. В таких совместных культурах указанные генетически модифицированные симбиотические бактерии сначала культивируют с клетками эпителия человека, или сначала культивируют указанные генетически модифицированные симбиотические бактерии, а затем продукты их секреции (бесклеточная среда, CFM) культивируют совместно с эпителием человека. После того, как указанные генетически модифицированные симбиотические бактерии некоторым образом культивировали совместно с эпителием (добавляя их к эпителию или добавляя их CFM к эпителию), указанный эпителий можно проконтактировать с патогеном для оценки реакции эпителия на патоген. Можно провести анализ для определения активности сигнала восприятия кворума в рекомбинантной клетке или организме методами иммунного окрашивания (например, ИФА), биологическими способами анализа (например, люминесценция) или другими химическими методами в жидких средах (например, жидкостная аффинная хроматография высокого разрешения (HPLC. В одном примере можно использовать биологические способы анализа для исследования CAI-1 и AI-2 Vibrio cholerae. В этом тесте методами генетической инженерии получают мутантный по тестируемому соединению штамм Vibrio,который люминесцирует в присутствии тестируемого соединения (AI-2 или CAI-1). Интенсивность люминесценции тестируемого штамма указывает на количество целевого соединения, продуцируемого тестируемым штаммом Vibrio cholerae. Способы регуляции сигнал-зависимой экспрессии целевой нуклеиновой кислоты Настоящее изобретение обеспечивает способ регуляции сигнал-зависимой экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в организме. Согласно одному варианту реализации указанный способ включает обеспечение рекомбинантной клетки согласно настоящему изобретению и введение указанной клетки в организм при условиях, эффективных для обеспечения экспрессии указанно сигнала в организме, посредством чего регулируется сигнал-зависимая экспрессия целевой нуклеиновой кислоты в указанном организме. Согласно одному варианту реализации указанный организм представляет собой млекопитающее. Согласно другому варианту реализации указанное млекопитающее представляет собой человека. Согласно другому варианту реализации указанный микроорганизм представляет собой бактерию,например кишечную бактерию или симбиотическую бактерию. Согласно частному варианту реализации указанная нуклеиновая кислота кодирует пептид PDX-1,который эффективно стимулирует конститутивную продукцию инсулина у млекопитающего. Согласно другому варианту реализации указанная нуклеиновая кислота кодирует пептид Glp-1, который эффективно стимулирует продукцию инсулина у млекопитающего в ответ на глюкозу. Способы предотвращения или облегчения заболеваний или нарушений Настоящее изобретение обеспечивает способы предотвращения, облегчения, лечения и/или профилактики посредством введения пациенту эффективного количества рекомбинантной клетки или микроорганизма согласно изобретению. Согласно одному варианту реализации обеспечивается способ предотвращения или облегчения инфекционного или неинфекционного заболевания у млекопитающего пациента. Указанный способ включает обеспечение изолированной рекомбинантной клетки согласно настоящему изобретению (или мик- 11023069 роорганизма, содержащего указанную клетку или состоящего из такой клетки согласно настоящему изобретению), и введение указанной клетки (или микроорганизма, содержащего указанную клетку или состоящего из такой клетки) млекопитающему пациенту при условиях, эффективных для стимулирования экспрессии фактора, предотвращающего развитие заболевания, или подавления экспрессии фактора, который является причиной заболевания, в результате чего предотвращается или облегчается заболевание. Согласно одному варианту реализации указанное неинфекционное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание, например диабет 1 типа. Согласно частному варианту реализации указанный белок или пептид включает PDX-1, фактор,предотвращающий развитие заболевания, представляет собой инсулин и PDX-1 стимулирует конститутивную продукцию инсулина у млекопитающего пациента. Согласно другому особенному варианту реализации указанный белок или пептид включает Glp-I, фактор, предотвращающий развитие заболевания,представляет собой инсулин и Glp-I стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу у млекопитающего пациента. Согласно другому частному варианту реализации указанный белок или пептид включает GIP, фактор, предотвращающий развитие заболевания, представляет собой инсулин и GIP стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу у млекопитающего пациента. Согласно другому варианту реализации обеспечивается способ облегчения или предотвращения инфекционного заболевания у млекопитающего пациента. Указанный способ может включать обеспечение рекомбинантной клетки или микроорганизма, содержащего рекомбинантную клетку согласно настоящему изобретению (или рекомбинантного одноклеточного организма, содержащего указанную клетку), причем указанный белок или пептид ингибирует экспрессию фактора вирулентности инфекционного патогена. Рекомбинантную клетку (или рекомбинантный микроорганизм, содержащий клетку, или рекомбинантный одноклеточный микроорганизм) можно вводить млекопитающему пациенту при условиях, при которых эффективно ингибируется экспрессия фактора вирулентности у млекопитающего пациента. Согласно другому варианту реализации указанное инфекционное заболевание связано с фактором вирулентности инфекционного патогена. Поэтому введение рекомбинантной клетки или микроорганизма может предотвратить или облегчить указанное инфекционное заболевание, связанное с фактором вирулентности инфекционного патогена. Согласно частному варианту реализации указанный инфекционный патоген представляет собой Vibrio cholerae, и указанное инфекционное заболевание представляет собой холеру. Сигналы могут представлять собой холерный автоиндуктор 1 (CAI-1) и/или автоиндуктор 2 (AI-2)Vibrio cholerae. Указанная нуклеиновая кислота может сдержать ген cqsA Vibrio cholerae, кодирующий CAI-1 и/или ген luxS, кодирующий AI-2. Нуклеиновые кислоты-мишени могут представлять собой холерный токсин (СТ) и/или токсин-корегулируемые пили адгезии(ТСР) Vibrio cholerae и экспрессия CAI-1 и/или AI-2 ингибирует экспрессию СТ и/или TCP инфекционного патогена. Настоящее изобретение также обеспечивает способ предотвращения или облегчения инфекционного или неинфекционного заболевания у млекопитающего пациента. Указанный способ включает обеспечение генетически модифицированного микроорганизма, содержащего рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая кодирует сигнальный белок или пептид, причм указанный сигнальный белок или пептид стимулирует экспрессию фактора, предотвращающего развитие заболевания, или ингибирует экспрессию фактора, который является причиной заболевания; и введение указанного микроорганизма млекопитающему пациенту при условиях, эффективных для предотвращения или облегчения заболевания млекопитающего пациента. Экспрессию указанного сигнального белка может вызывать сигнал, который присутствует в среде, в которую помещают указанный полученный методами инженерии микроорганизм. Неинфекционное заболевание может представлять собой, например, аутоиммунное заболевание,например, диабет 1 типа или другое неинфекционное заболевание, наличие которого отражается на биохимическом составе среды, в которую можно поместить полученную методами инженерии бактерию. Согласно частному варианту реализации указанный сигнальный пептид содержит PDX-1, фактор,предотвращающий развитие заболевания, представляет собой инсулин, и PDX-1 стимулирует конститутивную продукцию инсулина у млекопитающего пациента. Здесь запускающим сигналом является глюкоза, которая стимулирует экспрессию и секрецию PDX-1 из полученного методами инженерии микроорганизма. PDX-1 стимулирует секрецию инсулина у млекопитающего пациента. Согласно другому особенному варианту реализации указанный сигнальный пептид представляет собой Glp-I, фактор, предотвращающий развитие заболевания, представляет собой инсулин, и Glp-I стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу у млекопитающего пациента. Согласно другому особенному варианту реализации пусковым сигналом является оксид азота, который указывает на наличие множественного склероза у пациента человека. Согласно этому варианту реализации генетически модифицированный микроорганизм воспринимает высокие уровни оксида азота и отвечает флуоресценцией или люминесценцией. Это обеспечивает определение повышенного уровня оксида азота и служит способом ранней диагностики рассеянного склероза. Можно определять флуоресценцию или люминесценцию генетически модифицированного микроорганизма в образце стула или кро- 12023069 ви человека хозяина в зависимости от молекулы, секретируемой указанным модифицированным микроорганизмом, и/или от того, где указанный организм был индуцирован в организме человека (например,кровь, желудок и т.д.). Настоящее изобретение также обеспечивает применение действующего вещества, выбранного из группы, состоящей из сигнала, его фрагмента, комплекса,производного и аналога указанного сигнала, экспрессируемой нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное действующее вещество, или его фрагмен,т или производное, причм указанный белок или пептид регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты; и непатогенного микроорганизма, содержащего указанную нуклеиновую кислоту, и способного экспрессировать указанный сигнал,для лечения заболевания или нарушения у человека или животного. Согласно одному варианту реализации указанный белок или пептид ингибирует или нарушает патогенность или вирулентность инвазивного патогена. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид предотвращает, выявляет, облегчает или лечит заболевание или нарушение у человека или животного пациента. Согласно другому варианту реализации указанное заболевание представляет собой инфекционное или неинфекционное заболевание. Согласно другому варианту реализации лечение осуществляют посредством введения изолированного и очищенного действующего вещества в составе фармацевтической композиции. Согласно другому варианту реализации указанное действующее вещество вводят в дозе, достаточной для лечения или предотвращения болезненного состояния, остановки развития заболевания или облегчения его симптоматики. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанное действующее вещество вводят пациенту орально, ректально, парентерально, в виде инъекции, инфузии, спрея или ингалятора. Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм может продуцировать указанное действующее вещество до, во время или после введения человеку или животному пациенту и выделять указанное продуцированное действующее вещество после введения в клетки или ткани пациента. Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм представляет собой симбиотическую бактерию или гриб человека или животного. Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм принадлежит естественной кишечной флоре человека или животного. Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм представляет собой аэробную или анаэробную грамотрицательную бактерию кишечной флоры. Согласно другому варианту реализации указанная грамотрицательная бактерия принадлежит родуEscherichia, Pseudomonas, Bacteroides, Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus или Proteus. Согласно другому варианту реализации указанная грамотрицательная бактерия представляет собойEscherichia coli (Nissle 1917). Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм представляет собой аэробную или анаэробную грамположительную или грамотрицательную бактерию кишечной флоры. Согласно другому варианту реализации указанная грамположительная бактерия принадлежит родуBifidobacterium, Streptococcus, Staphylococcus или Corynebacterium. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нуклеиновую кислоту, кодирующую сигнал, его фрагмент или производное, вставляют в вектор. Согласно другому варианту реализации указанный вектор представляет собой плазмиду, космиду,бактериофаг или вирус. Согласно другому варианту реализации нуклеиновая кислота, встроенная в вектор, находится под функциональным контролем по меньшей мере одного регуляторного элемента, который обеспечивает транскрипцию указанной нуклеиновой кислоты в транслируемую РЕК или трансляцию РНК в белок до,во время или после введения. Согласно другому варианту реализации указанный по меньшей мере один регуляторный элемент представляет собой промотор, сайт связывания с рибосомой, сигнальную последовательность или 3'-терминатор транскрипции. Согласно другому варианту реализации указанный промотор представляет собой индуцибельный промотор. Согласно частному варианту реализации настоящего изобретения указанный индуцибельный промотор индуцируется сигнальным каскадом, включающим по меньшей мере один элемент в ответ на стимул или стимулы из окружающей среды. Согласно другому варианту реализации сигнальная последовательность представляет собой последовательность бактерии или гриба, которая способствует секреции указанного белка из цитоплазмы микроорганизма в периплазматическое пространство или в среду, внешнюю для указанного микроорганизма. Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм содержится в фармацевтической или пищевой композиции. Согласно другому варианту реализации указанное действующее вещество вводят пациенту орально,- 13023069 ректально, парентерально, в виде инъекции, инфузии или ингалятора. Терапевтическое/профилактическое введение и композиции Настоящее изобретение обеспечивает способы облегчения, предотвращения, лечения и/или профилактики посредством введения пациенту эффективного количества рекомбинантной клетки или микроорганизма согласно изобретению. Согласно предпочтительному аспекту изобретения рекомбинантная клетка или микроорганизм согласно настоящему изобретению являются, по существу, очищенными. Предпочтительно пациент представляет собой животное без ограничения, включая коров, свиней, лошадей, цыплят, собак, кошек и т.д., и предпочтительно представляет собой млекопитающее, наиболее предпочтительно человека. Согласно частному варианту реализации указанный пациент представляет собой отличающееся от человека млекопитающее. Известны различные системы доставки для введения рекомбинантных клеток или микроорганизмов согласно настоящему изобретению (например, жидкие суспензии, суспензии в пище, лиофилизированные порошки, таблетки, капсулы, инкапсулированные в липосомах, микрочастицы, микрокапсулы). Способы введения включают внутрикожный, внутримышечный, интраперитонеальный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и оральный. Указанные рекомбинантные клетки или микроорганизмы можно вводить любым удобным способом, например проглатыванием, и можно вводить вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или локальным. Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции. Такие композиции могут содержать терапевтически эффективное количество рекомбинантной клетки или микроорганизма согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно частному варианту реализации термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренный регулирующим ведомством федерального правительства и правительства штата или внесенный в список Фармакопеи США или другой признанной фармакопеи для применения на животных и, в частности, на человеке. Термин "носитель" относится к растворителю, наполнителю, носителю, адъюванту, с которым вводят рекомбинантную клетку или микроорганизм. Указанная композиция также может содержать незначительные количества увлажняющих или эмульгирующих агентов или буферных агентов. Эти композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, лекарственных форм с постоянным высвобождением и т.д. Примеры соответствующих фармацевтических носителей описаны E.W.Martin в "Remington's Pharmaceutical Sciences". Такие композиции будут содержать терапевтически эффективно количество рекомбинантной клетки или микроорганизма, предпочтительно в очищенном виде,совместно с соответствующим количеством носителя для обеспечения формы для надлежащего введения пациенту. Лекарственная форма должна соответствовать способу введения. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения композицию составляют согласно рутинным процедурам, поскольку фармацевтическую композицию адаптируют для орального введения человеку. Количество рекомбинантной клетки или микроорганизма согласно изобретению, которое будет эффективным для лечения конкретного нарушения, будет зависеть от природы нарушения или состояния, и его можно определить стандартными клиническими методами. Дополнительно можно использовать анализы in vitro для определения оптимальных границ дозы. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых зависимости от доз, полученных из тестовых систем in vitro или животных моделей. Обычно суппозитории содержат активный ингредиент в количестве от 0,5 до 10% по весу, оральные лекарственные формы предпочтительно содержат от 10 до 95% активного ингредиента. Также настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую упаковку или набор, включающий один или более контейнеров, наполненных одним или более ингредиентом фармацевтических композиций согласно изобретению. Согласно частному варианту реализации обеспечивается фармацевтическая или пищевая композиция. Композиция может содержать по меньшей мере одну клетку непатогенного микроорганизма, способного продуцировать действующее вещество и содержащего экспрессируемую нуклеиновую кислоту,кодирующую белок или пептид или его фрагмент или производное. Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм представляет собой анаэробную или аэробную, грамотрицательную или грамположительную бактерию кишечной флоры. Согласно другому варианту реализации микроорганизм представляет собой симбиотическую бактерию человека или животного. Согласно другому варианту реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный белок или пептид или его фрагмент или производное, встраивают в вектор экспрессии, и при этом экспрессия нуклеиновой кислоты находится под контролем по меньшей мере одного регуляторного элемента таким образом, что указанное действующее вещество экспрессируется до, во время или после введения указанной фармацевтической или пищевой композиции, и высвобождается в клетки или ткани человека или животного хозяина после введения указанной фармацевтической или пищевой композиции. Обеспечивается способ получения фармацевтической или пищевой композиции. Указанный способ включает:(а) выделение или синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей действующее вещество, где указанное действующее вещество выбрано из группы, состоящей из белка или пептида, его фрагмента, комплекса указанного белка или пептида, производного указанного белка или пептида и аналога указанного белка или пептида, экспрессируемой нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное действующее вещество или его фрагмент или производное;(б) клонирование указанной нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок или пептид, в микробный вектор экспрессии;(в) трансформацию рекомбинантного вектора экспрессии, полученного на стадии (б) в клетку микроорганизма-хозяина, при этом указанная клетка микроорганизма-хозяина представляет собой симбионта человека или животного;(г) размножение указанных трансформированных клеток микроорганизма-хозяина;(д) получение иммобилизированного, лиофилизированного, жидкого препарата или суспензии указанных трансформированных клеток микроорганизма-хозяина; и(е) смешивание указанного иммобилизированного, лиофилизированного, жидкого препарата или суспензии трансформированных клеток микроорганизма-хозяина, полученных на стадии (е), с физиологически приемлемыми наполнителями, стабилизаторами, загустителями, разделителями, лубрикантами и подобными материалами для получения фармацевтической или пищевой композиции. Приведенные ниже примеры представлены исключительно с целью иллюстрации, но не ограничения объема настоящего изобретения. Примеры Пример 1. Прекращение инфекции Vibrio cholerae в клетках эпителия человека с помощью модифицированной передачи сигналов симбиотическими бактериями Введение. Серотипы V. cholerae El Tor отвечают за вспышки холеры в развивающихся странах. У некоторых штаммов V. cholerae инфекционный цикл координируется, по меньшей мере, в некоторой степени посредством восприятия кворума. То есть, экспрессия генов вирулентности зависит от концентрации автоиндукторов V. Cholerae: автоиндуктора 1 (CAI-1) и автоиндуктора 2 (AI-2). Недавно показано, что высокие концентрации CAI-1 и AI-2 подавляют экспрессию генов вирулентности. Этот пример показывает,что методами генной инженерии можно получить симбиотическую бактерию Е. coli Nissle 1917 (Nissle),которая экспрессирует CAI-1 (в естественных условиях Nissle экспрессирует AI-2) и эффективно нарушает вирулентность V. Cholerae. Методами генетической инженерии получили штамм Nissle, который экспрессирует CAI-1 под контролем промотора lac оперона и этот штамм продемонстрировал подавление экспрессии холерного токсина (СТ) V. cholerae (на что указывало присутствие субъединицы В СТ(СТВ, и токсин-корегулируемых пилей адгезии - TCP (на что указывает относительная транскрипция субъединицы A TCP (TCPA как в монокультурах V. Cholerae, так и при совместном культивированииNissle и V. cholerae с эпителиальными клетками. На модельной системе клеток эпителия Сасо-2, которые инкубировали с V. cholerae, было показано, что совместное культивирование с бактериями Nissle, экспрессирующими CAI-1, снижало связывание СТВ с клетками Сасо-2 на 63% по сравнению с совместными культурами со штаммом Nissle дикого типа. Также в культурах с Nissle, экспрессирующей CAI-1, была сравнительно низкая транскрипция ТСРА, чем в контролях со штаммом Nissle дикого типа. Эти результаты представляют собой значительный прогресс в направлении профилактического способа борьбы с кишечными заболеваниями посредством генетически модифицированного сигналлинга восприятия кворума у штамма симбиотической бактерии. Материалы и методы Плазмиды Было показано, что CAI-1 V. harveyi стимулирует восприятие кворума у V. cholerae тем же образом,что и CAI-1 V. cholerae (Henke JM, Bassler BL. 2004. Three parallel quorum-sensing systems regulate geneexpression in Vibrio harveyi. J Bacteriol 186(20):6902-14). Поэтому получили ген cqsA (который кодируетCAI-1) V. cholera (VCA 0532) (Miller MB, Skorupski K, Lenz DH, Taylor RK, Bassler BL. 2002. Parallel quorum sensing systems converge to regulate virulence in Vibrio cholerae. Cell 110(3):303-14) способом высокоточной ПЦР (Stratagene) с праймерами: 5' CTG CAG (сайт Pst I) ATG AAC AAG CCT CAA CTT С 3' и 5'(New England Biolabs). E. coli Nissle 1917 (Nissle-cqsA) трансформировали в с помощью электропорации новым вектором (pCAI-1). В качестве контроля Е. coli Nissle 1917 также трансформировали UC19 отдельно (получив вектор Nissle). Клонирование проводили стандартным способом, описанным ранееSpring Harbor Laboratory Press. 3 v. p). Штаммы бактерий Штамм Nissle 1917 Е. coli получили из коммерческого препарата пробиотика Mutaflor. ШтаммNissle 1917 выращивали на агаре МакКонки и верифицировали с помощью серий анализов ПЦР (использованные праймеры представляли собой pMut 5/6, 7/8, 9/10 из Blum-Oehler G, Oswald S, Eiteljorge К, Sonnenborn U, Schulze J, Kruis W, Hacker J. 2003. Development of strain-specific PCR reactions for the detection встряхивании при 225 об/мин. Во всех экспериментах по вирулентности и инфекционности использовали стрептомицин-устойчивый штамм V. cholerae El Tor C6706 (любезно предоставленный Ronald Taylor,Dartmouth Medical School). V. cholerae культивировали при 30 С без встряхивания либо в среде LB, либо в среде AKFD (15 г/л пептона, 4 г/л экстракта дрожжей, 10 г/л хлорида натрия, рН 7.4). V. harveyi strainsBB120 (дикого типа) и ВВ 170 (luxS) использовали в качестве положительного контроля и штамма сравнения в анализах AI-2 соответственно. Оба штамма выращивали в среде АВ (0.3 М NaCl, 0.05M MgSO4,0.2% казаминовых кислот без витаминов (Difco), доведенной до рН 7.5 без KOH). Среду стерилизовали и затем добавляли 10 мл 1 М фосфата калия (рН 7.0), 10 мл 0,1 М L-аргинина, 20 мл глицерола, 1 мл 10 мкл мл-1 рибофлавина и 1 мл 1 мг мл-1 тиамина из расчета на литр (Greenberg ЕР, Hastings JW, Ulitzur S. 1979.Induction of Luciferase Synthesis in Beneckea-Harveyi by Other Marine-Bacteria. Archives of Microbiology 120(2):87-91) при 30 С при встряхивании при 225 об/мин. V. cholerae MM920 (V. cholerae El Tor C6706 strcqsA luxQ pBBl (luxCDABE от V. harveyi использовали в качестве штамма сравнения для CAI-1 и культивировали в среде LB при 37 С при встряхивании при 225 об/мин . Эпителий Клетки эпителия Сасо-2 (АТСС CRL-2102) культивировали в модифицированной по способу Дальбекко среде Игла (DMEM, Cellgro) с добавлением 10% FBS (Cellgro) при 37 С в инкубаторе с 5% СО 2- Сасо-2 клетки также культивировали в среде AKFD с добавлением 10% FBS при 37 С в инкубаторе с 5% СО 2 в течение до 7 дней для определения жизнеспособности в этой среде. Все эксперименты по совместному культивированию проводили в среде AKFD с добавлением 10% FBS с клетками Сасо-2 15 и 22 пассажа. Условия совместного культивирования Конфлюэнтные культуры клеток Сасо-2 (15-22 пассажа) в 96-луночных планшетах, обработанных коллагеном, промывали свежей AKFD с 10% FBS и инкубировали в течение ночи при 37 С в инкубаторе при 5% СС 2. Для определения влияния экспрессии CAI-1 от Nissle на вирулентность V. cholerae, проводили совместное культивирование клеток Сасо-2 и V. cholerae либо в бесклеточной среде (CFM) от штаммов Nissle или со штаммами Nissle как показано ниже.CFM из вектора Nissle и Nissle-cqsA получали способом, описанным ниже ("приготовление CFM"). Конфлюэнтный монослой клеток Сасо-2 в 96-луночных планшетах промывали один раз AKFD и добавляли 200 мкл 30% CFM в AKFD с 10% FBS. Культуры V. cholerae (OD600=1) разводили 1:1,000 в лунках 96-луночных планшетов, содержащих Сасо-2 и CFM, которые инкубировали при 37 С, 5% СО 2 в течение 3 ч. Из 96-луночных планшетов удаляли жидкость, измеряли OD600 и центрифугировали (12,000g, в течение 10 мин). В супернатант добавляли Лейпептин (10 нг/мл) и непродолжительное время выдерживали при 4 С перед анализом субъединицы В холерного токсина (СТВ). Измерения нормализовали поOD600 жидкости, которую отбирали из лунок. В случае совместного культивирования штаммов Nissle, V. cholerae и клеток Сасо-2, клетки Сасо-2 в 96-луночных планшетах промывали один раз AKFD перед добавлением приблизительно 200 мкл AKFD с 10% FBS в каждую лунку. Nissle, Nissle-вектор и Nissle-cqsA разводили 1:1,000 (начиная с OD600=1) перед совместной инкубацией с клетками Сасо-2 в течение 3 ч. 1 мМ IPTG добавляли в среду с Nissleвектором и Nissle-cqsA. Через 3 ч в каждую лунку добавляли разведения V. cholerae 1:1,000 (начиная сOD600=1) перед инкубацией в течение еще 3 ч. После этого из лунок удаляли жидкость и центрифугировали (12,000g, в течение 10 мин). После центрифугирования супернатант нормализовали по OD600 и в него добавляли Лейпептин (10 нг/мл ) (для подавления протеаз) и непродолжительное время выдерживали при 4 С перед анализом СТВ, как описано в разделе "Измерения липосомной СТВ". Один раз СТВ анализировали, как описано в разделе "Измерения на клетках". Получение бесклеточной среды (CFM)DH5, Nissle, Nissle-вектор, Nissle-cqsA культивировали в AKFD с 50 нг/мл ампициллина при 37 С и встряхивании при 225 об/мин в течение 8 ч. V. cholerae культивировали в AKFD с 10 мкг/мл стрептомицина при 30 С при встряхивании при 225 об/мин, и V. harveyi BB120 (АТСС Accession No. BAA-1116) культивировали в среде АВ при встряхивании при 225 об/мин и 30 С, обе культуры культивировали в течение 8 ч. Через 8 ч все бактерии откручивали на центрифуге и трижды промывали соответствующей питательной средой. Все культуры приводили к одной OD600 и инокулировали равный объем питательной среды. После инокуляции DH5, Nissle, Nissle-вектор, Nissle-cqsA выращивали в течение ночи вAKFD при 37 С и встряхивании при 200 об/мин. 1 мМ IPTG добавляли в питательную среду Nissleвектора и Nissle-cqsA. После инокуляции V. cholerae культивировали в течение ночи при 30 С и встряхивании при 200 об/мин в AKFD, и V. harveyi BB120 культивировали при 30 С при встряхивании при 200 об/мин в среде АВ. После культивирования в течение 14-16 ч культуры центрифугировали при 4,000g в течение 30 мин при 4 С. Супернатант пропускали через фильтр (0.2 мм, PALL life sciences). Бесклеточную среду(CFM) разводили до плотности OD600=1 AKFD и добавляли 10 нг/мл лейпептина для подавления протеаз перед хранением при 4 С. Анализ активности AI-2V. harveyi BB170 (АТССдоступа ВАА-1117) культивировали в течение ночи в среде АВ и разводили в отношении 1:3,000 средой АВ. Ночные культуры штаммов, которые необходимо было протестировать на активность AI-2, центрифугировали (4,000g) и 10 мкл полученных супернатантов добавляли к 90 мкл разведенной V. harveyi BB170 в стерильном 96-луночном планшете и инкубировали при 30 С при встряхивании при 225 об/мин. Люминисценцию репортерного штамма измеряли на считывающем устройстве (ридере) для микротитровальных планшетов (FLX800, BIO-ТЕК Instruments, Inc., Winooski,VT) каждые полчаса, пока увеличивалась люминисценция в контроле. В качестве контроля тестировали штамм Е. coli DH5 (мутантный штамм AI-2 (Surette MG, Miller MB, Bassler BL. 1999. Quorum sensing inEscherichia coli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harveyi: a new family of genes responsible for autoinducer production. Proc Natl Acad Sci USA 96(4): 1639-44), у которого нет активности CAI-1) и V. harveyiBB120 (у которого есть активность CAI-1 и AI-2). Анализ активности CAI-1V. cholera MM920 культивировали до высокой плотности в течение ночи и разводили 1:10 средойLB с 5 мкг/мл тетрациклина. Ночные культуры штаммов, которые необходимо было протестировать на активность CAI-1, центрифугировали (4,000g ) и 30 мкл бесклеточного супернатанта добавляли к 70 мкл разведенного репортерного штамма V. cholera MM920 (разведенного в LB) в стерильном 96 луночном планшете и инкубировали при 30 С при встряхивании при 225 об/мин. Люминисценцию измеряли на ридере для микротитровальных планшетов (FLX800, BIO-ТЕК Instruments, Inc., Winooski, VT) каждые полчаса до тех пор, пока снижалась люминисценция. В качестве контроля тестировали штаммы Е. coli DH5 (мутантный штамм AI-2 у которого нет активности CAI-1) и V. harveyi BB120 у которого есть активность CAI-1 и AI-2). ПЦР-РВ для экспрессии ТСРА Бесклеточную среду (CFM) от Nissle, Nissle-вектора, Nissle-cqsA и V. cholerae получали, как описано выше ("Получение бесклеточной среды"). V. Cholerae C6706 str2 (стрептомицин-устойчивый) культивировали в течение ночи на AKI со стрептомицином при 30 С в присутствии CFM либо от Nissle, Nissleвектора, Nissle-cqsA, V. cholerae С 6707 str2 или только в среде LB (без CFM). Ночные культуры разводили в отношении 1:10,000 от OD600=1 в среде 5AKFD, содержащей соответствующую CFM, со стрептомицином и культивировали в течение 3-5 ч до тех пор, пока OD600 достигает 0,2-0,25. Культуры центрифугировали (4,000g ) и выделяли общую РНК с помощью PHKqueous (Ambion, Houston, TX) согласно инструкции изготовителя, которая включает обработку ДНКазой для удаления любой контаминирующей ДНК. Ген tcpA представляет собой ген, который кодирует субъединицу A TCP, и использовали уровень транскрипта tcpA в качестве относительного показателя количества экспрессированного белка ТСРА. Для определения относительного количества мРНК tcpA для каждого образца проводили ПЦР-РВ с 100 нг общей РНК и обратной транскриптазы Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA) для синтеза первой цепи согласно инструкции производителя. Последующие реакции ПЦР проводили с использованием набора Mastermix (Promega, Madison, WI) и следующих праймеров: tcpA прямой: 5'GGTTTGGTCAGCCTTGGTAA-3'9 [SEQ ID NO:1], обратный: 5'-TGTGAATGGAGCAGTTCCTG-3' [SEQID NO:2]; 16s РНК прямой: 5'-CAGCCACACTGGAACTGAGA-3' [SEQ ID NO:3], обратный: 5'GTTAGCCGGTGCTTCTTCTG-3'[SEQ ID NO:4]. Измерение липосомной СТВ Липосомы, встраивающие ганглиозид GM1 в липидный бислой и инкапсулирующие сульфородамин В (SRB) (липосомы), применяли для обнаружения и количественного определения субъединицы Б холерного токсина (СТВ, в качестве индикатора СТ) как в супернатантах культур, так и на поверхности эпителиальных клеток Сасо-2. Измерения CFMCFM получали, как описано выше ("Получение CFM"). Определение СТВ в CFM проводили, как описано ранее (Edwards KA, March JC. 2007. GM(l)-functionalized liposomes in a microtiter plate assay for холерный токсин in Vibrio cholerae culture samples. Anal Biochem 368(l):39-48). Кратко: СТВ определяли с помощью микротитровального сэндвич-анализа. Микротитровальные планшеты со связанным нейтравидином Reacti-bind (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) промывали 3200 мкл промывочного буфера(состоящего из 0.05% (v/v) Tween-20, 0.01% сывороточного бычьего альбумина (BSA. Добавляли 100 мкл биотинилированного антитела против СТВ (10 мкг/мл в промывочном буфере, United States Biological, Swampscott, MA) и инкубировали в течение 2 ч при 23 С. Несвязавшиеся иммобилизованные антитела удаляли, лунки осушали и тщательно промывали 3x200 мкл промывочного буфера. Стандарты, состоящие из очищенного СТВ (EMD Bioscience) в AKFD, LB, или супернатанта культур V. cholerae, которые выращивали в AKFD или LB, разводили в отношении 1:1 промывочным буфером и инкубировали(100 мкл на образец на лунку) в планшетах, конъюгированных с анти-СТВ, при комнатной температуре в темноте без встряхивания в течение 2 ч. Планшеты дважды промывали 200 мкл промывочного буфера и один раз 200 мкл 1Hepes с сахарозой на физиологическом растворе (HSS: 10 мМ HEPES, 150 мМ натрия хлорида, 200 мМ сахарозы, рН 7.5) перед нанесением 100 мкл липосом, разведенных в HSS до концентрации 0.2 мМ фосфолипидов, и инкубацией при комнатной температуре в темноте без встряхивания в течение часа. Затем планшеты встряхивали в течение 10 мин при 18 Гц в флуоресцентном планшетном ридере (FLX800, BIO-ТЕК Instruments, Inc., Winooski, VT). Несвязавшиеся липосомы удаляли из планшетов с помощью 3200 мкл HSS. Интактные связавшиеся липосомы лизировали 50 мкл 30 мМ n-октил-D-глюкопиранозида (OG) на лунку и измеряли флуоресценцию в каждой лунке (возбуждения=540 нм,испускания=590 нм). Данные соотносили с 4-параметровой логистической моделью (формула 1): где "х" представляет собой концентрацию СТВ (масса 1),"а" представляет собой ответ при нулевой концентрации (RFU),"b" представляет собой ответ при максимальной концентрации (RFU),"с" представляет собой концентрацию, при которой получается 50% ответ (масса-1), и"d" представляет собой угловой коэффициент (бесконечно малая величина) (Gottschalk PG, Dunn JR. 2005. The five-parameter logistic: a characterization and comparison with the four-parameter logistic. Anal Biochem 343(l):54-65). Измерения на клетках СТВ, связавшийся с монослоем клеток Сасо-2, визуализировали и количественно определяли, как описано в других источниках (Edwards and March, Anal Biochem. 2008 Sep l;380(l):59-67.). Кратко: получали стандартные кривые посредством инкубации клеток Сасо-2 с различными разведениями СТВ вAKFD с 10% FBS в течение 30 мин при 37 С с 5% СО 2 без встряхивания. Затем клетки дважды промывали ледяной AKFD с 10% FBS и однократно промывали ледяным HSS с 10% FBS перед добавлением липосом и инкубацией (при 4 С без CO2) в течение часа. Лишние липосомы удаляли из клеток, промывая их трижды HSS с 10% FBS. Отмытые клетки исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа(Leica, Basal, Switzerland) и фотографировали или лизировали 30 мМ OG и определяли оптическую плотность на флуоресцентном ридере микротитровальных планшетов (FL800, Biotek Instruments). Для определения СТВ, связавшейся с монослоем Сасо-2 в совместных культурах, после инкубации бактерии дважды промывали от клеток Сасо-2 ледяной AKFD с 10% FBS и ледяным HSS с 10% FBS перед определением количества связанного СТВ с липосомами по сравнению со стандартной кривой чистой СТВ, как описано выше. Микроскопия Монослои клеток Сасо-2 визуализировали при увеличении 40 с помощью стандартного флуоресцентного светового микроскопа (Leica, Basel, Switzerland). Изображения были получены с помощью монохромной камеры (Retiga 4000R, Qimaging, Inc., Surrey, ВС, Canada). Результаты и обсуждение Трансформация Е. coli Nissle 1917 геном cqsANissle трансформировали плазмидой, несущей кворумный ген V. cholerae cqsA (получая штамм Nissle-cqsA) для обеспечения высокого уровня экспрессии сигнала кворума V. cholerae, CAI-1. Для определения проявляет ли Nissle активность CAI-1 и AI-2 проводили биологический анализ. На фиг. 2 показана экспрессия автоиндуктора у генетически модифицированной симбиотической бактерии. Штамм Nissle 1917 Е. coli (Nissle) трансформировали пустым вектором (Nissle-вектором) или вектором, несущим ген cqsA (Nissle-cqsA). Клетки проверяли на способность экспрессировать (A) AI-2 или (В) CAI-1. DH5 E. coli (DH5), V. cholerae (VC) и V. harveyi (BB120) использовали в качестве контроля. DH5 представляет собой мутанта по активности AI-2. Величина ошибки показывает одно стандартное отклонение для трех повторений эксперимента. Результаты показывают, что Nissle обладает такой же активностью AI-2, как и V. cholerae (FIG. 2A), и при трансформации pUCl9-cqsA проявлял активность CAI-1 того же порядка, что и V. cholerae после стимуляции IPTG (фиг. 2 В). Прерывание вирулентности V. cholerae в монокультурах с CFM Для определения способности трансформированного Nissle подавлять вирулентность V. cholerae, V.cholerae инкубировали с CFM от Nissle, Nissle-вектора, Nissle-cqsA и исключительно средой LB. Из культур выделяли общую РНК через 3-5 ч и определяли транскрипт гена tcpA с помощью ПЦР-РВ и 100 нг общей РНК на образец (фиг. 3 А). Фиг. 3 иллюстрирует нарушение вирулентности V. cholerae в питательной среде. Е. coli Nissle 1917(Nissle) трансформировали пустым вектором (Nissle-вектором) или вектором, несущим ген cqsA (NisslecqsA). V. cholerae культивировали в бесклеточной среде (CFM) от каждого из штаммов или в CFM от V.tcpA V. cholerae анализировали с помощью ПЦР-РВ (фиг. 3 А). Транскрипты tcpA использовали в качестве показателя относительного количества экспрессированного белка ТСРА. Результаты нормировали по количеству транскриптов 16s pPHK. Экспрессию СТВ наблюдали после инкубации V. cholerae с CFM от указанных штаммов (фиг. 3 В). В качестве положительного контроля в экспериментах ТСРА и СТВ V.cholerae инкубировали в свежей среде без CFM. Величина ошибки показывает одно стандартное откло- 18023069 нение для трех повторений эксперимента. Величину р определяли с помощью Т-критерия Стьюдента. Гели сканировали и анализировали с использованием программного обеспечения Image J (NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD) для определения относительного количества присутствующих в них транскриптов. 16s pPHK использовали для нормирования результатов. Наблюдали, что CFM от NisslecqsA оказывала то же действие на экспрессию ТСРА, что CFM от V. cholerae. Такие результаты ожидались, поскольку уже установлено, что экспрессия ТСРА зависит от восприятия кворума. Для определения может ли CFM от Nissle-cqsA подавлять экспрессию СТ V. cholerae в культуре,анализировали экспрессию субъединицы В СТ (СТВ) с применением GM1 ганглиозидфункционализированных липосом, как описано ранее (Edwards KA, March JC. 2007. GM(l)-functionalizedliposomes in a microtiter plate assay for cholera toxin in Vibrio cholerae culture samples. Anal Biochem 368(l):39-48). Результаты (Фигура ЗВ) показали, что уровень СТ можно существенно снизить в монокультурах V. cholerae, которые культивируют в CFM от Nissle, Nissle-вектора и Nissle-cqsA. Результат оказался неожиданным, принимая во внимание результаты анализа ТСРА, в котором снижение, совпадающее с CFM V. cholerae, наблюдали только в случае с CFM от Nissle-cqsA. Это наблюдали на протяжении нескольких повторяющихся экспериментов (данные не показаны). Несмотря на то, что уровень СТ в среднем был ниже, что у Nissle-cqsA, не ожидали, что уровень экспрессии СТ будет ниже в случае инкубации CFM с Nissle и Nissle-вектором, чем в CFM от V. cholerae. Этот результат можно объяснить активностью AI-2 в CFM от Nissle и остаточным уровнем СТ в CFM от V. cholerae. Нарушение вирулентности V. cholerae в совместных культурах с клетками эпителия Для определения, сможет ли Nissle-cqsA предотвратить инфекцию эпителия V. cholerae, разработали простую модель культуры, которая состояла из эпителиальных клеток Сасо-2, V. cholerae и или штаммов Nissle, или CFM Nissle. Поскольку V. cholerae не продуцирует СТ в существенном количестве вtoxin in Vibrio cholerae culture samples. Anal Biochem 368(l):39-48), определили, что клетки Сасо-2 могут продолжать расти, по меньшей мере, в течение недели в AKFD с 10% FBS (данные не показаны). Поэтому все эксперименты по совместному культивированию проводили в AKFD с 10% FBS. Результаты экспериментов по культивированию клеток Сасо-2 в CFM от Nissle-вектора или NisslecqsA и затем совместным культивированием с V. cholerae обобщены на фиг. 4. Фиг. 4 демонстрирует прекращение вирулентности V. cholerae в совместных культурах. Клетки Nissle 1917 Е. coli (Nissle) трансформировали либо пустым вектором (Nissle-вектор) либо вектором, несущим ген cqsA (Nissle-cqsA). Эпителиальные клетки Сасо-2 инкубировали либо с CFM из различных штаммов Nissle (фиг. 4 А) или непосредственно со штаммами Nissle (фиг. 4B-4D) и с V. cholerae перед анализом на СТВ либо в супернатанте (фиг. 4 А) или (фиг. 4 В), либо прикрепленного к клеткам Сасо-2(фиг. 4 С) и (фиг. 4D). Количество СТВ определяли из контролен известного количества СТВ, нанесенного на клетки Сасо-2. Величина ошибки показывает одно стандартное отклонение для трех повторений эксперимента. Величинуопределяли на основе Т-критерия Стьюдента. Панельные фотографии на фиг. 4D сделаны на обычном флуоресцентном микроскопе. Флуоресценция показывает СТВ, связавшийся с клетками Сасо-2. После инкубации V. cholerae с клетками Сасо-2 в течение 3 ч определяли количество СТ в питательной среде (фиг. 4 А). Количество СТ в супернатанте культуры определенно уменьшалось в присутствии Nissle-cqsA по сравнению с контролем. Затем проверяли, приводит ли совместное культивирование штаммов Nissle с клетками Сасо-2 к такому же результату. Штаммы Nissle-вектор и Nissle-cqsA культивировали с клетками Сасо-2 в течение 3 ч перед культивированием с V. cholerae в течение 3 ч. Снова измеряли СТ в питательной среде (фиг. 4 В) и СТ, прикрепленный к клеткам Сасо-2 (фиг. 4 С). Клетки Сасо 2 исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа для визуализации связывания СТ (фиг. 4D). По результатам этих экспериментов сделал вывод, что уровень экспрессии СТ и связывание с клетками Сасо-2 значительно различалось между клетками, обработанными Nissle-cqsA и обработанными Nissleвектором, несущим пустой вектор. Присутствие Nissle-cqsA снижало экспрессию СТ в штамме V. cholerae и приводило к меньшему связыванию СТ с клетками Сасо-2. Выводы На основе представленных выше результатов in vitro можно ожидать, что профилактическое применение Nissle-cqsA может ограничить колонизацию ЖКТ человека V. cholerae. Принимая во внимание использованное количество бактерий (соотношение симбиотических бактерий и V. cholerae приблизительно 1:1), затраченное время (3 ч для заселения симбиотическими бактериями эпителиального слоя),результаты указывают на то, что если принимать симбиотические бактерии, описанные в данном примере, в качестве профилактики, количество симбиотических бактерий, заселивших ЖКТ (1011 КОЕ г-1 содержимого кишечника, (Schultz M., Watzl S., Oelschlaeger ТА., Rath НС., Gottl С., Lehn N., Scholmerich J.,Linde HJ. 2005. Green fluorescent protein for detection of the probiotic microorganism Escherichia coli strainNissle 1917 (EcN) in vivo. J Microbiol Methods 61(3):389-98), существенно превысит количество V. cholerae в контаминированном образце воды (104-108 КОЕ мл-1, (Baselski VS., Medina RA., Parker CD. 1978. Поэтому ожидается, что вирулентность V. cholerae ослабится до такой же степени, что и в случае чистых ночных культур (фиг. 3). Такое подавление похоже на то, которое можно ожидать, когда V. cholerae достигает высокой плотности в хозяине и прекращает проявлять вирулентность. Этот пример показывает, что можно сконструировать штамм симбиотической бактерии (Е. coli Nissle 1917), который будет служить профилактическим средством для холеры. Полученные методами генетической инженерии симбиотические бактерии имеют огромный потенциал для применения в качестве средств доставки лекарственного препаратов, особенно в развивающихся странах, где барьеры для получения лекарственных препаратов потенциально выше, чем барьеры при получении помощи в виде продуктов питания. Этот пример показывает, что методами генетической инженерии можно получить коммерчески доступные штаммы симбиотических бактерий человека для имитации сигналлинга инвазивного патогена таким образом, чтобы нарушать вирулентность. Это является ключевым отличием от других работ в относительно новой области создания методами генетической инженерии симбиотических бактерий. С помощью приведенного выше способа методами генетической инженерии можно получить штаммы симбионтов, которые служат важными сигнальными переключателями, экспрессирующими патоген-специфичный бактериальный кворумный сигнал таким образом, чтобы предотвратить экспрессию факторов вирулентности внутри организма хозяина. С помощью этого подхода методами генетической инженерии можно получить симбиотические штаммы для коммуникации с другими инвазивными видами или даже с видами, которые уже заселяют ЖКТ. Аспекты метаболизма могут быть изменены в ответ на специфические изменения биохимии ЖКТ. Хотя применение рекомбинантных организмов в этом отношении (то есть, в человеке) может вызвать вопросы, симбиотические штаммы (которые обычно признаются безопасными Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA можно безопасно применять для экспрессии экзогенных генов. Мало того, что вероятность горизонтального переноса генов ниже для симбиотических штаммов по сравнению с аденовирусами так, как аденовирусы облегчают ядерную инкапсуляцию гетерологичных генов, но в случае симбиотических бактерий можно также применять антибиотики для полного их удаления из ЖКТ. Поэтому эта технология считается безопасной или более безопасной, чем способы, уже одобренные для применения на людях. Пример 2. Секреция инсулинотропных белков симбиотическими бактериями: переключение кишечника для лечения диабета Краткое описание Пример 1 (выше) показал, что методами генетической инженерии можно получить штамм Е. coliNissle 1917 (продаваемый без рецепта пробиотический штамм Nissle), который экспрессирует сигнал восприятия кворума Vibrio cholerae, создавая потенциальное профилактическое средство против холеры(Duan, F., and J. С. March. 2008. Interrupting Vibrio cholerae infection of human epithelial cells with engineered commensal bacterial signaling. Biotechnol Bioeng. 101(l):128-134, DOI: 10.1002/bit.21897). Настоящий пример показывает, что симбиотические бактерии могут стимулировать секрецию инсулина клетками кишечного эпителия в ответ на глюкозу. Методами генетической инженерии получили симбиотический штамм Nissle 1917 Е. coli, который секретирует инсулинотропные белки GLP-1 и PDX-1. Эпителиальные клетки, стимулированные полученными методами инженерии штаммами, секретировали до 1 нг мл-1 инсулина без значительной фоновой секреции. Введение Недавно было показано, что два белка: глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1) и панкреатический или дуоденальный гомеобоксный ген 1 (PDX-1), стимулируют синтез инсулина клетками кишечного эпителия в ответ на глюкозу (Suzuki A., H. Nakauchi and Н. Taniguchi. 2003. GLP-1 (1-37) converts intestinal epithelial cells into insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci USA 100:5034-9) и независимо от уровня глюкозы (Yoshida S., Y. Kajimoto, Т. Yasuda, H. Watada, Y. Fujitani, H. Kosaka, T. Gotow, T. Miyatsuka, Y.insulin-producing cells. Diabetes 51:2505-2513), соответственно. GLP-1 секретируется клетками кишечного эпителия дистального отдела тонкой кишки в ответ на глюкозу и другие питательные вещества (Baggio,L. L., and D. J. Drucker. 2007. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology 132:2131-57). Он имеет очень короткий период полураспада, и его разрушение дипептидилпептидазой IV (DPP-IV) происходит в кровеносных сосудах, дренирующих слизистую кишечника (Hansen L., С. F. Deacon С. Orskov and J. J.Hoist. 1999. Glucagon-like peptide-l-(7-36)amide is transformed to glucagon-like peptide-l-(9-36)amide by dipeptidyl peptidase IV in the capillaries supplying the L cells of the porcine intestine. Endocrinology 140:535663). GLP-1 активирует синтез инсулина в р-клетках поджелудочной железы, связываясь с мембранным рецептором, GLP-1R, в связи с этим предложили применять GLP-1 в качестве лекарственного средства для лечения диабета 1 типа (Suzuki, A., H. Nakauchi and H. Taniguchi. 2003. GLP-1 (1-37) converts intestinalSuzuki с коллегами показали, что клетки кишечного эпителия у новорожденных и взрослых крыс,которым интраперитонеально вводили GLP-1, превращаются в инсулин-секретирующие клетки, отвечающие на глюкозу (Suzuki A., H. Nakauchi and H. Taniguchi. 2003. GLP-1 (1-37) converts intestinal epithe- 20023069lial cells into insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci U S A 100:5034-9). Дополнительно они обнаружили, что хирургическая имплантация мышам эпителиальных клеток, стимулированных in vitro GLP-1,приводила к обращению сахарного диабета у мышей, получивших имплантаты. Показано, что активатор транскрипции PDX-1 стимулирует секрецию инсулина как -клетками, так и клетками кишечного эпителия (Koizumi M., R. Doi, K. Fujimoto, D. Ito, E. Toyoda, Т. Mori, К. Kami, Y.of PDX-1 induces insulin production in intestinal epithelia. Surgery 140:273-280). Koizumi с коллегами показал, что если клетки эпителия поджелудочной железы трансфецировать с помощью вирусов геном pdx-1 и при этом стимулировать экзогенным GLP-1, они становятся инсулин-секретирующими клетками (Koizumi, M., R. Doi, К. Fujimoto, D. Ito, Е. Toyoda, Т. Mori, K. Kami, Y. Kawaguchi, G. К. Gittes and M. Imamura. 2005. Pancreatic epithelial cells can be converted into insulin-producing cells by GLP-1 in conjunctionwith virus-mediated gene transfer of pdx-1. Surgery 138:125-133). Та же группа показала, что клетки кишечного эпителия (петли подвздошной кишки мыши) экспрессируют инсулин, если их трансфицировать геном pdx-1, хотя в этой работе не были представлены данные относительно добавления GLP-1 к этим клеткам (Koizumi, M., К. Nagai, A. Kida, К. Kami, D. Ito, К. Fujimoto, Y. Kawaguchi, and R. Doi. 2006.Forced expression of PDX-1 induces insulin production in intestinal epithelia. Surgery 140:273-280). Вспомогательные бактерии кишечника широко доступны в качестве "пробиотиков" и обычно считаются безопасными (GRAS) Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (Ahmed, F. Е. 2003. Genetically modified probiotics in foods. Trends in Biotechnology 21:491-497). Возможные преимущества применения симбиотических штаммов для экспрессии рекомбинантных геновin vivo включают их совместимость с хозяином (в частности с иммунной системой хозяина), их контролируемую персистенцию в кишечники и возможность их орального введения. Сообщали об экспрессии симбиотическими бактериями различных рекомбинантных цитокинов и антигенов на мышиной моделиby Lactobacillus casei. Microb Cell Fact. 2007; 6: 12. doi: 10.1186/1475-2859-6-12). Материалы и методы Создание плазмид Вс клонирование проводили способами, описанными ранее (Sambrook J.Russell D.W. Molecularcloning: a laboratory manual, Edn. 3rd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; 2001). Фигура 5 иллюстрирует схематическую плазмиду, использованную в данном исследовании. Для анализа промоторов Р 0/Р 1 из Е. coli DH5 создали две плазмиды (pFDl и pFD2). pFDl кодировала целый участок Р 0/Р 1 для запуска экспрессии зеленого флуоресцентного белка с усиленной флуоресценцией (EGFP).pFD2 кодировала только участок Р 0 промотора апстрим EGFP. Для исследования эффективности секреции инсулинотропного белка рекомбинатными бактериями для стимуляции секреции инсулина клетками Сасо-2 сконструировали плазмиды pFD-PDX, pFD-GLP и pFD-20, как описано в настоящем изобретении. Фиг. 6 иллюстрирует ответ на глюкозу Р 0 и Р 0/Р 1. Использовали экспрессию EGFP для определения ответа промотора Р 0 и/или Р 1 на различные условия среды. Р 0=Р 0 только; Р 0+Р 1=Р 0 и фланкирующий участок Р 1; DH5 а=контроль lac оперона. Для исследования эффективности продуцирования рекомбинантных белков в ответ на глюкозу промоторной системой, отвечающей на глюкозу, два отрезка промоторного участка, отвечающего на глюкозу, Е. coli DH5 клонировали методом ТА клонирования в pGlow- GFP апстрим и в рамке считывания с GFP (результаты представлены на фиг. 6). Две конструкции состояли из промоторам Р 0 или участка, перекрывавшего промоторы Р 0 и P1 (Ryu, S.Garges, S. Promoter Switch in the Escherichia-Coli PtsGFP. Кратко, участок Р 0 клонировали из геномной ДНК Е. coli DH5 в pGLOW-GFP (Invitrogen,Carlsbad, CA) для получения (pFD2). Участок Р 0/Р 1 клонировали в pGLOW-GFP для получения pFDl. Для экспрессии гена PDX-1 млекопитающего в Nissle сконструировали плазмиду pFD-PDX, как описано ниже. Получили кассету 6XHis-Xpress-EK-PDX-l-CPP с помощью двух циклов ПЦР с высокой точностью (Stratagene, La Jolla, CA). Полноразмерный FLIC получили от DH5 ПЦР с высокой точностью. Эти два фрагмента клонировали в pBluescript-KS для получения 6XHis-Xpress-EK-PDX-7-CPPFLIC. Фрагмент The 6XHis-Xpress-EK-PDX-1-CPP-FLIC затем клонировали в pGLOW-PO-GFP для полу- 21023069 чения вектора (pFD-PDX), который использует Р 0 промотор Е. coli для запуска экспрессии 6XHis-XpressEK-PDX-1-CPP-FLIC. Для конститутивной экспрессии белка GLP-1 в Nissle сконструировали плазмиду pFD-GLP, как указано ниже. Синтетическим путем (IDT, Coralville, IA) получили последовательность 6XHis-Xpress-EKGLP-l(1-37). Этот фрагмент вставляли с помощью ПЦР с высокой точностью в pBluescript-KS для получения pBluescript-GLP. Для клонирования последовательности 5'UTR-FLIC20 из pKS104 в pBluescriptGLP для получения pBluescipt-20-GLP использовали ПЦР с высокой точностью. Полученный вектор содержал последовательность: 5'UTR-FLIC20-6XHis-Xpress-EK-GLP-1(1-37). Эту последовательность клонировали в pKS121 (содержащей 3'UTR FLIC) для получения конструкции: 5'UTR-FLIC20-6XHis-XpressEK-GLP-l(l-37)-3'UTR с помощью ПЦР с высокой точностью. Для получения pFD-20 использовали ПЦР с высокой точностью для клонирования последовательности 5'UTR-FLIC20-6XHis-Xpress-EK из pFD-GLP. ПЦР-фрагмент клонировали в pKS121 для получения конструкции: 5'UTR-FLIC20-6XHis-Xpress-EK. Получили pKS104 и pKS121 из Университета Хельсинки, Финляндия, лаборатория Benita Westerlund-Wikstrom). Штаммы бактерий Е. coli Nissle 1917 получали из коммерческого препарата пробиотиков Mutaflor, как описано ранее (Duan, F., and J. С. March. 2008. Interrupting Vibrio cholerae infection of human epithelial cells with engineered commensal bacterial signaling. Biotechnol Bioeng. 101(l):128-134, DOI: 10.1002/bit.21897). Nissle 1917 и все другие штаммы Е. coli культивировали в среде LB при 37 С при встряхивании при 225 об/мин. В экспериментах по совместному культивированию Nissle 1917 культивировали в F-12K (Cellgro, Manassas, VA), дополненной 0,4% глицеролом или 0,4% глюкозой при 37 С при встряхивании при 225 об/мин или без встряхивания. Условия культивирования клеток Клетки эпителия Сасо-2 (АТСС CRL-2102, Manassas, VA) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Cellgro, Herndon,VA), с 10% FBS (эмбриональная бычья сыворотка)(Cellgro) при 37 С в инкубаторе при 5% СО 2. Клетки Сасо-2 также культивировали в F-12K с 10% FBS при 37 С в инкубаторе при 5% СО 2. Все эксперименты по совместному культивированию проводили в F12K с 10% FBS с клетками Сасо-2 15-22 пассажа. Условия культивирования CFM Получали CFM от Nissle, несущей pFD-20 (Nissle-вектор), pFD-PDX (Nissle-PDX-1) и pFD-GLP(Nissle-GLP-1), как описано ниже ("Получение CFM"). Для совместного культивирования монослои клеток Сасо-2 приблизительно 80% конфлюэтности в 12-луночных планшетах промывали свежей F-12K с 10% FBS и покрывали 1 мл 50% CFM в F-12K с 10% FBS и инкубировали при 37 С при 5% СО 2. Добавляли 200 нМ GLP-1 (1-37) (Bachem, King of Prussia, PA) в лунки положительного контроля. Через 16 ч инкубации клеткам добавляли еще 1 мл 50% CFM в F-12K с 10% FBS или 1 мл F-12K с 10% FBS и 200 нМ GLP-l(l-37), дополненной 0,4% глюкозой или 0,4% глицеролом перед инкубацией в течение еще 2 ч. Отбирали среду с клеток, добавляли в нее лейпептин (10 нг/мл), 0,2 мМ PMSF и апротинин (10 нг/мл),центрифугировали (12,000 об/мин ) (Effendorf 5804R, Westbury, NY) и непродолжительное время выдерживали при 4 С перед анализом экспрессии инсулина с помощью ИФА (см. раздел "Иммуноблоттинг" и "ИФА". Непосредственно после удаления среды проводили ПЦР-РВ для определения экспрессии инсулина, как указано ниже (см. раздел "ПЦР-РВ для определения экспрессии инсулина). Получение CFMNissle-вектор и Nissle-GLP-1 культивировали в F-12K с 0,4% глицерола и Nissle-PDX-1 культивировали в F-12K с 0,4% глюкозы при 37 С при встряхивании при 225 об/мин в течение 24 ч. Через 24 ч все бактерии разводили F-12K до OD600 = 1, центрифугировали и утилизировали. Супернатант пропускали через фильтр (0,2 мкм, PALL Life Sciences,Cornwall,UK). В бесклеточную среду (CFM) добавляли 10 нг/мл лейпептина 200 мкМ PMSF и 5 нг/мл апротинина для подавления протеаз перед хранением при 4 С. ПЦР-РВ Из клеток Сасо 2 выделяли общую ДНК в конце каждого эксперимента с использованием RNAqueous (Ambion, Houston, TX) согласно инструкциям производителя, которые включали обработку ДНКазой для удаления любой контаминирующей ДНК. Для определения относительного количества мРНК инсулина, проводили ПЦР-РВ для каждого образца с 500 нг общей РНК и обратной транскриптазой Superscript Ш (Invitrogen, Carlsbad, CA) для синтеза первой цепочки согласно инструкциям производителя. Последующие реакции ПЦР проводили с использованием Quick Load Taq 2X Master Mix (NEB) и со следующими праймерами: для инсулина человека прямой: 5'-AGCACATCACTGTCCTTCTGCCAT-3' Осаждение секретируемых белков и приготовление лизатов клетокNissle-вектор и Nissle-GLP-7 культивировали в F-12K с 0,4% глицеролом, Nissle-PDX-1 культивировали в F-12K с 0,4% глюкозой или 0,4% глицеролом при 37 С при встряхивании при 225 об/мин в течение 24 ч. Через 24 ч бактерии центрифугировали. Супернатант пропускали через фильтр (0,2 мкм,PALL Life Sciences). Бесклеточную среду (CFM) разводили F-12K до такой же оптической плотностиOD600 и добавляли 10 нг/мл лейпептина, PMSF и 5 нг/мл апротинина для подавления протеаз. Очищенный супернатант (14 мл) осаждали 10% трихлоруксусной кислотой (TCA, VWR) в течение 30 мин на льду и дважды промывали осадок ледяной смесью этанол/эфира (1:1). Супернатант осадка высушивали под вакуумом, растворяли в 50 мкл буфера для образца (2% SDS, 50 мМ Tris, pH 6,8, 20% глицерол, 10% меркаптоэтанол, бромфеноловый синий) и кипятили в течение 5 мин при 95 С. Осадок с клетками ресуспендировали (из 14 мл культуры) при комнатной температуре в BugBuster Master Mix при мягком вортексировании с использованием 500 мкл BugBuster Master Mix с ингибиторами протеаз (10 нг/мл лейпептина, 200 мкМ PMSF и 5 нг/мл апротинина). Суспензию клеток инкубировали на вращающейся платформе (VWR, Bristol, CT) в медленном перемешивании в течение 10-20 мин при комнатной температуре. В каждый образец добавляли 125 мкл 5 Х буфера образца перед кипячением в течение 10 мин при 95 С. Иммуноблоттинг и ИФА Для определения экспрессии и секреции GLP-1 и PDX-1 использовали стандартный метод вестернблоттинга (Sambrook J.Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual, Edn. 3rd. Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; 2001). Кратко: на полиакриламидный гель наносили по 50 мкл образцов и переносили их на гибридизационную мембрану Immobilon-PSQ. Membranes were probed with 1:1,000 for mouse anti-his (GE health, Piscataway, NJ). Мембраны инкубировали с HRP-конъюгированными анти-мышиными IgG (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA), проявляли посредством повышенной хемилюнимисценции (Pierce, Rockford, IL) и переносили на рентгеновскую пленку (Phoenix, Candler, NC). Пленки сканировали и анализировали плотность пикселей блот на изображениях с помощью программного обеспечения Image J software (NCBI). Для определения количества секретированного инсулина клетками Сасо-2 анализировали бесклеточные супернатанты (полученные, как описано в "Условия культур CFM") с помощью стандартных методов ИФА (Sambrook J.Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual, Edn. 3rd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; 2001) с захватывающими антителами (Е 86802 М 5 мкг/мл ) и биотинилированными распознающими антителами (Е 86306 В 1 мкг/мл ) Biodesign (Saco, ME) в планшетах Nunc Immobilizer Amino (Rochester, NY). Для определения после обработки биотинилированными определяющими антителами обрабатывали образцы пероксидазой хрена, конъюгированной со стрептавидином (1:5,000). Субстрат представлял собой реагент Amplex Ultra-Red (Invitrogen, Carlsbad, CA),который использовали согласно инструкции изготовителя. Флуоресценцию измеряли с помощью планшетного ридера FLX-800 Biotek, Burlington, VT) при =540 нм (возбуждение) и =590 нм (испускание). Стандарты человеческого инсулина (Sigma, St. Louis, МО) от 0 до 2 нг мл-1 готовили в пяти репликатах для каждого планшета для обеспечения точности. Для обеспечения аналитической точности каждый образец определяли в пяти отдельных лунках. Вычисления для масштабирования инсулинового ответа целого организма Для экстраполяции ответа модели культуры клеток на то, что возможно в теле, предположили, что будет стимулироваться секреция инсулина только в тонкой кишке. Работа Rao и сотрудников продемонстрировала, что выживаемость Nissle в кишечнике мышей составляла 10 КОЕ/г ткани через 3 дня (Rao S.peptide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 11993-11998). Несмотря на это, Westendorf и сотрудники обнаружили, что в фекалиях мышей концентрация рекомбинантных Nissle на три порядка больше, чем в работе Rao, что указывает на то, что вероятно есть вариация в выживаемости в зависимости от секретируемых белков (Westendorf A.M. et al. 2005. Intestinal immunity of Escherichia coli NISSLE 1917: a safe carrier for therapeutic molecules. Ferns Immunology and Medical Microbiology 43, 373-384). Westendorf не приводил величины выживаемости Nissle в тонком кишечнике. Предполагая, что выживаемость в системе органов человека (откуда выделяли Nissle) или откудалибо составляет от 10 до 10 КОЕ мл (10 КОЕ мл -1 соответствует OD600 = 1 в наших экспериментах), количество инсулина, которые можно поступать в кровоток, если наши бактерии колонизировали тонкий кишечник, представлено ниже. Количество секретированного инсулина в этих экспериментах (1 нг/мл х 1 мл/лунка 1 лунка/491 мм 2 составляет 0.002 нг/мм 2) умножали на площадь поверхности слизистой тонкого кишечника (2 м 2, Wilson J.P. 1967 Surface Area of Small Intestine in Man. Gut 8, 618) для получения величины разброса концентрации инсулина в крови (объем которой составляет 4.7 л) 164 фмоль л-1 164 пмоль л-1 при выживаемость Nissle от 10 до 10 КОЕ мл-1 соответственно. Концентрации инсулина в сыворотке после приема пищи могут достигать 400 пмоль л-1 у взрослых, не страдающих диабетом (Basu,R. et al. 2006. Effects of age and sex on postprandial glucose metabolism: differences in glucose turnover, insulin secretion, insulin action, and hepatic insulin extraction. Diabetes 55, 2001-2014). Результаты и обсуждения Методами генетической инженерии получили Nissle, секретирующую GLP-1 (аминокислоты от 1 до 37), или полноценный PDX-1, с помощью метки секреции fliC (Majander, K., L. Anton, J. Antikainen, H.PDX-1 секретировался в виде рекомбинантных конструкций с пенетрирующим в клетки пептид ом(СРР) (Liang J. F. and V. С. Yang. 2005. Insulin-cell penetrating peptide hybrids with improved intestinal absorption efficiency. Biochemical and Biophysical Research Communications 335:734-738) для ускорения быстрого проникновения в эпителий после секреции. Результаты вестерн-блоттинга секретированных в супернатант Nissle (который обозначен в виде фракции "М") и в осадок Nissle (который обозначен как фракция "С") GLP-1 и PDX-1-CPP показаны на фиг. 7. Фиг. 7 демонстрирует секрецию рекомбинантных инсулинотропных белков Е. coli Nissle 1917. Методами генетической инженерии получили Nissle, который секретирует GLP-1 под контролем промотора fliC или PDX-1-CPP под контролем элемента, отвечающего на глюкозу. Показаны результаты вестерн-блоттинга секретированных белков GLP-1 (верхний блот) и PDX-1-CPP (нижний блот). Клетки культивировали в течение 6-8 ч, нормализовали относительно OD600=1 и центрифугировали. Осадки лизировали и определяли количество каждого белка (фракция "С"). Сохраняли супернатант и анализировали аналогичным образом (фракция "М"). В случае клеток, экспрессирующих PDX-1-CPP, сравнивали клетки, растущие на среде, содержащей глюкозу (0,4%) или глицерол (0,4%). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, экспрессирующие пустую плазмиду (обозначенную "20"). Представленные данные показали, что секретировались оба белка. PDX-1 секретировался под контролем промоторного элемента, отвечающего на глюкозу, для которого не характерна "растекающаяся" экспрессия (фиг. 7). Для проверки, способны ли полученные методами генетической инженерии штаммы Nissle вызывать секрецию инсулина клетками эпителия у человека, клетки Сасо-2 культивировали в бесклеточной среде (CFM) ночных культур штаммов Nissle, экспрессирующих PDX-1-CPP, GLP-1 или метку из 20 аминокислот (образцы, обозначенные "20") в качестве отрицательного контроля. Ночные культуры выращивали в среде F-12K (Mediatech, Manassas, VA) без глюкозы (кроме штаммов PDX-1, которым необходима глюкоза для продукции PDX-1). Культивирование клеток Сасо-2 в смеси 1:1 свежей среды F-12K без глюкозы и CFM ночных культур Nissle, секретировавших PDX-1-CPP, GLP-1, 20, или смесь из половины PDX-1-CPP CFM и половины GLP-1 CFM, проводили в течение 16 ч перед удалением среды и культивированием клеток Сасо-2 в среде либо с глюкозой (0,4%) либо глицеролом (0,4%) в течение 2 ч. После введения глюкозы в каждом образце определяли секрецию инсулина и транскрипт инсулина. В качестве положительного контроля клетки Сасо-2 инкубировали в свежей среде F-12K (без глюкозы) и приобретенном GLP-1 (аминокислоты 1-37, образцы обозначали "37") в течение тех же 16 ч перед культивированием с глюкозой (0,4%) или глицеролом (0,4%) в течение 2 ч. Для секреции пептидов Е. coli применяли конструкцию fliC (Majander K., L. Anton, J. Antikainen, H.using a modified Escherichia coli flagellar secretion apparatus. Nature Biotechnology 23:475-481). Данные транскрипции и ИФА показали, что инкубация эпителии человека с CFM от GLP-1 и PDX1-CPP вместе или по отдельности стимулирует продукцию клетками инсулина (фиг. 8). Фиг. 8 иллюстрирует стимуляцию секреции инсулина клетками эпителия. Клетки эпителия Сасо-2 инкубировали с бесклеточной средой (CFM) ночных культур Е. coli Nissle 1917, экспрессировавшихGLP-1 (G), PDX-1-CPP (Р), оба GLP-1 и PDX-1-CPP (GP) или контрольную плазмиду ("20") или синтезированный GLP-1 (аминокислоты 1-37, "37") в течение 6 ч перед добавлением глюкозы или глицерола. а) ПЦР-РВ клеток Сасо-2, инкубированных с CFM указанной клеточной линии или с белком, и последующая стимуляция глюкозой (обозначено "g") или глицеролом. б) ИФА секреции инсулина стимулированными клетками Сасо-2. Величина ошибки показывает одно стандартное отклонение для трех повторений эксперимента. Значениеопределяют по Т-критерию Стьюдента (n=3). Наибольшую продукцию инсулина постоянно наблюдали при инкубации с GLP-1 CFM или 37.PDX-1-CPP CFM стимулировали секрецию инсулина в ответ на глюкозу как при добавлении только веществ, так и при добавлении с GLP-1. Секреция инсулина, опосредованная GLP-1- и PDX-1, происходила в ответ на глюкозу. Отрицательный контроль эпителия, культивированный с CFM ночных культур с меткой последовательности 20 аминокислот, не проявлял продукции инсулина в ответ на глюкозу (фиг. 8). Оказалось неожиданным, что обработка PDX-1-CPP приводила к секреции инсулина в ответ на глюкозу клетками Сасо-2 (фиг. 8). Yoshida с сотрудниками сообщил, что PDX-1 стимулирует конститутивную продукцию инсулина клетками эпителия крыс IEC-6, но только, если эти клетки также обрабатывали бетацеллюлином (Yoshida S., Y. Kajimoto, Т. Yasuda, H. Watada, Y. Fujitani, H. Kosaka, Т. Gotow, Т.Miyatsuka, Y. Umayahara, Y. Yamasaki, and M. Hori. 2002. PDX-1 induces differentiation of intestinal epithelioid IEC-6 into insulin-producing cells. Diabetes 51:2505-2513). Более новая работа Koizumi, в которой показано, что мыши, трансфицированные PDX-1, in vivo экспрессировали инсулин в тонкой кишке, но авторы не определили, какие конкретно клетки отвечают за секрецию и не определили их способность отвечать на глюкозу (Koizumi ML, K. Nagai, A. Kida, K. Kami, D. Ito, K. Fujimoto, Y. Kawaguchi and R.Doi. 2006. Forced expression of PDX-1 induces insulin production in intestinal epithelia. Surgery 140:273-280). Представленные результаты наводят на мысль, что существует определенное различие между клетками эпителия человека и крысы в отношении ответа на PDX-1. Определили (вычисления приведены выше), что концентрация инсулина в крови составит 164 фмоль л-1-164 фмоль л-1 при выживаемости Nissle от 106 до 109 КОЕ мл -1 соответственно. Принимая во внимание, что концентрация инсулина в сыворотке после приема пищи может достигать 400 фмоль л-1 у взрослых, не страдающих диабетом (Basu R., С. Dalla Man, M. Campioni, A. Basu, G. Klee, G. Toffolo, Сturnover, insulin secretion, insulin action, and hepatic insulin extraction. Diabetes 55:2001-14), то неоптимизированные, полученные методами инженерии бактерии могут стимулировать выделение инсулина, по меньшей мере, того же порядка, который необходим для нормального обмена веществ, кажется очень воодушевляющим. Эти результаты показывают, что можно разработать очень перспективный и осуществимый способ лечения диабета 1 типа на основе представленных выше способов. С учетом простого орального введения, отсутствия заметной фоновой экспрессии и наличия чувствительности к глюкозе применение рекомбинантных штаммов симбионтов может заметно снизить или даже устранить необходимость инъекций инсулина и поможет снизить долгосрочные осложнения, которые наблюдаются у диабетиков, с помощью замены синтеза инсулина хозяина. Настоящее изобретение не ограничивается рамками приведенных вариантов реализации. Действительно, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к тем, описанные в данной заявке, станут очевидным для специалиста в данной области из предыдущего описания. Такие модификации должны находиться в пределах приложенной формулы изобретения. Все ссылки, приведенные в настоящем описании, включены в полном объеме и во всех отношениях в той же степени, как если бы было указано, что каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент включены посредством ссылки в полном объеме во всех отношениях. Цитирование любой публикации приведено для ее раскрытия до даты подачи и не должно быть истолковано, как признание того, что настоящее изобретение не дает право учитывать задним числом такую публикацию после приоритета настоящего изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Изолированная рекомбинантная кишечная симбиотическая бактерия, стимулирующая продукцию инсулина в ответ на глюкозу в организме млекопитающего-хозяина и содержащая рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок или пептид, включающий пептид млекопитающего, стимулирующий секрецию инсулина, выбранный из группы, состоящей из глюкагоноподобного пептида 1 (GLP1), желудочного ингибиторного пептида (GIP) и панкреатического и дуоденального гомеобоксного пептида (PDX-1),при этом указанный белок или пептид может экспрессироваться указанной кишечной симбиотической бактерией и стимулировать продукцию инсулина в ответ на глюкозу клетками кишечного эпителия в организме млекопитающего-хозяина. 2. Изолированная рекомбинантная кишечная симбиотическая бактерия по п.1, отличающаяся тем,что экспрессия указанной рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или пептид, находится под контролем индуцибельного промотора. 3. Изолированная рекомбинантная кишечная симбиотическая бактерия по п.1, дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую сигнальную последовательность, которая обеспечивает секрецию указанного белка или пептида из цитоплазмы рекомбинантной кишечной симбиотической бактерии. 4. Изолированная рекомбинантная кишечная симбиотическая бактерия по любому из пп.1-3, принадлежащая к роду, выбранному из группы, состоящей из Escherichia, Pseudomonas, Bacteroides, Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, Proteus, Bifidobacterium, Streptococcus, Staphylococcus и Corynebacterium. 5. Изолированная рекомбинантная кишечная симбиотическая бактерия по п.4, представляющая собой штамм бактерии Escherichia coli. 6. Изолированная рекомбинантная кишечная симбиотическая бактерия по п.5, представляющая собой штамм Nissle 1917 Escherichia coli. 7. Изолированная рекомбинантная кишечная симбиотическая бактерия по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что указанный белок или пептид представляет собой глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1). 8. Применение рекомбинантной кишечной симбиотической бактерии по п.1 для предотвращения или облегчения диабета у млекопитающего-хозяина. 9. Применение рекомбинантной кишечной симбиотической бактерии по п.8 для лечения диабета. 10. Применение по любому из пп.8-9, отличающееся тем, что указанный микроорганизм принадле- 25023069 жит к роду, выбранному из группы, состоящей из Escherichia, Pseudomonas, Bacteroides, Lactobacillus,Lactococcus, Bacillus, Proteus, Bifidobacterium, Streptococcus, Staphylococcus и Corynebacterium. 11. Применение по любому из пп.8-10, отличающееся тем, что указанный белок или пептид представляет собой глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1).