Изоформа человеческой альфа-енолазы, антитело к указанной изоформе и способы их применения

Изобретение относится к новым фосфорилированным изоформам -енолазы в трансформированных клеточных линиях панкреатического происхождения и антителам,связывающим такие изоформы, которые обнаруживаются в сыворотках пациентов с аденокарциномой панкреатического протока человека (PDA). Указанные изоформы и антитела могут использоваться для диагностики и лечения PDA и других видов рака.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: РИБОВАКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ СА (CH); БИОЛИНЕ ДИАНЬОСТИЧИ СРЛ (IT) 016731 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к новым способам диагностики и лечения рака человека, в частности рака панкреатического происхождения. Предпосылки создания изобретения Аденокарцинома панкреатического протока (PDA) представляет собой наиболее распространенный вид рака поджелудочной железы и является четвертой причиной смертности от рака в Соединенных Штатах и Европе. Большинство пациентов умирает в течение 12 месяцев и лишь 2% доживает до 5 лет после постановки этого диагноза. Основным подходом в ведении пациентов с PDA является панкреатэктомия и химиотерапия, однако они обеспечивают лишь незначительный эффект с точки зрения выживания пациентов (Laheru D. and Jaffee M., 2005; Kleef J. et al., 2006). Несмотря на усовершенствование способов хирургического и терапевтического ведения указанных больных (включая использование моноклональных антител, вакцин и химиотерапии), для целей ранней диагностики PDA имеется все еще немного маркеров, которые к тому же являются и малонадежными. Наиболее широко используемым серологическим маркером для диагностики рака поджелудочной железы является сиалилированный групповой антиген крови Lewis CA19-9, но его использование в основном направлено на мониторинг ответа организма на терапию, а не на диагностику PDA. Фактически, этот антиген может также присутствовать в повышенных концентрациях в сыворотке больных, пораженных доброкачественными заболеваниями поджелудочной железы (например, в случае хронического панкреатита или обструкции желчных путей), что может давать ложные позитивные результаты, и, соответственно, не всегда может использоваться, поскольку он совсем не экспрессируется у 5-10% населения(Okusaka T. et al., 2006). В этой связи проводятся интенсивные разработки альтернативных биомаркеров с целью оценки возможности их использования для диагностики PDA, с тем чтобы можно было ограничить применение таких инвазивных процедур, как биопсия и гистопатологический анализ (Bouvet M., 2004; Brand R., 2001;Goggins M., 2005; Leung T. et al., 2005), а также для оценки предлагаемых для лечения лекарственных средств (Cohen S. and Meropol N., 2002; Jimeno A. and Hidalgo M., 2006). В последнее время использовались различные методики для идентификации предполагаемых биомаркеров PDA, с использованием крупномасштабного анализа экспрессии белков (на основе оценки уровня РНК или белка). В частности, использовались протеомические методики для выявления антигенов, которые проявляют гуморальный ответ в сыворотках пациентов с PDA, при сравнении белков, которые разделяются двумерным гель-электрофорезом (2-DE), распознаваемых сывороточными антителами от раковых больных и идентифицируемых с использованием масс-спектрометрии (Gorg A. et al., 2004;Graham D. et al., 2005). Варианты такого подхода для выделения, отбора и характеристики белков описаны в литературе различными авторами, например SERPA (Klade C. et al., 2001), PROTEOMEX(Lichtenfels R. et al., 2003) или SPEAR (Unwin R. et al., 2003). В основе всех этих методик лежит один общий подход, заключающийся в признании того факта,что за счет характеристики B-клеточного репертуара против антигенов, специфически экспрессируемых злокачественными опухолями (так называемая раковая иммунома человека), будет возможно определить специфические мишени, которые вовлекаются в процессы иммунологического надзора и иммунологической коррекции при раке, и понять механизмы, ведущие к неконтролируемой клеточной пролиферации и метастазированию (Drake C. et al., 2006; Dunn G. et al., 2004). Предполагалось, что иммунотерапия может предоставить ценный подход для лечения рака поджелудочной железы (Laheru D. and Jaffee M., 2005). Фактически, был составлен перечень возможных PDAспецифических белков на основе данных об их повышенной экспрессии на уровне РНК (WO 04/55519) или по результатам крупномасштабного протеомического анализа образцов сыворотки и/или панкреатических образцов (Bhattacharyya S. et al., 2004; Cao D. et al., 2005; Cecconi D. et al., 2003; Chen R. et al.,2005; Gronborg M. et al., 2006; Honda K. et al., 2005; Koomen J. et al., 2005; Rodriguez J. et al., 2005; Shen J.et al., 2004; Rosty С. and Goggins M., 2005; Sinha P. et al., 1999; Yu Y. et al., 2005). Предполагаемые для диагностики PDA белки сыворотки представляют собой гамма-фибриноген (Bloomston M. et al., 2006),белок DEAD-box 48 (Xia Q. et al., 2005), MIC-1 (Koopmann J. et al., 2004), РТН-родственный белок(Bouvet M. et al., 2001) и кальретикулин (Hong S. et al., 2004). Однако все еще имеется потребность в надежных биомаркерах для раннего выявления PDA и ее дифференцированной диагностики от других патологий поджелудочной железы или других видов рака.-1 016731 Описание изобретения Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что сыворотки от пациентов с PDA, в сравнении с сыворотками от здоровых индивидуумов или от индивидуумов, пораженных другими патологиями, содержат антитела, направленные против специфических белков, которые экспрессируются в клеточной линии, происходящей из панкреатического рака. Присутствие этих белков было подтверждено с использованием очищенных антител, специфичных к таким белкам в экстрактах, полученных из нормальных тканей поджелудочной железы и тканей поджелудочной железы с PDA. Основным объектом настоящего изобретения являются новые PDA-ассоциированные изоформы человеческой альфа-енолазы (ENOA), которые фосфорилированы по меньшей мере в трех положениях и которые были также выявлены в одной из новых изоформ альфа-енолазы. Другим объектом настоящего изобретения являются антитела, связывающие эти фосфорилированные изоформы ENOA и, соответственно, позволяющие дифференцировать их от других изоформ ENOA. Указанные антитела могут быть представлены в любом подходящем формате, таком как моноклональные антитела (в частности, человеческие моноклональные антитела) и фрагменты антител. Белки, которые были определены как PDA-ассоциированные согласно настоящему изобретению, и связывающие их антитела (а также любые другие специфические средства для их детекции) могут использоваться в способах диагностики PDA, а также для идентификации агентов для лечения PDA. В частности, основанная на антителах детекция PDA-ассоциированных фосфорилированных изоформ ENOA в биологических образцах (таких как сыворотка или биопсийные образцы), получаемых от пациента,может использоваться в способах диагностики PDA, для оценки прогрессирования заболевания или для оценки эффективности лекарственных средств для лечения PDA. Другие объекты настоящего изобретения включают наборы для диагностики PDA, для оценки прогрессирования заболевания или для оценки эффективности лекарственных средств для лечения PDA, а также наборов, включающих по меньшей мере один из PDA-ассоциированных белков согласно настоящему изобретению и/или связывающих их антител. Другие объекты настоящего изобретения, включающие те объекты, которые имеют отношение к определению и использованию специфических анти-альфа-енолазных антител в диагностике и лечении рака поджелудочной железы, приведены в представленном ниже описании. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Схематическая иллюстрация метода SERPA, применяемого для характеристики PDAассоциированных белковых антигенов и антител с использованием CF-PAC-1 клеток (опухолевые клетки) и сывороток от пациентов с PDA (опухоль) или контрольных доноров (здоровых доноров). Фиг. 2A. 2-DE гель, полученный с использованием белкового экстракта из клеток клеточной линииCF-PAC-1, в рамках теста на выявление PDA-ассоциированной экспрессии белка. Белки указанного клеточного экстракта разделяют в геле на основании их молекулярной массы и показателя pI и далее визуализируют с использованием окрашивания серебром. На чертеже показано положение пятен, выявляемых методом вестерн-блоттинга в сыворотке пациентов с PDA, но не выявляемых в контрольных сыворотках(наименование конкретного белка, соответствующее каждому из приведенных номеров, представлено в табл. 1). Фиг. 2B. Гистограммы, показывающие процент сывороток от пациентов (где их число в каждой группе обозначено показателем n), пораженных хроническим панкреатитом (CP) или PDA на разных стадиях заболевания (II, III, IV), которые содержат антитела, распознающие указанные PDAассоциированные белки. Полное наименование белков, соответствующих приведенным сокращениям,приведено в табл. 1. Фиг. 3. Сопоставление (выравнивание) белковых последовательностей человеческой альфа-енолазыSWISSPROT, номер доступа Р 09104; SEQ ID NO:2) (аминокислоты, которые идентичны в обоих белках,помечены ":", тогда как те аминокислоты, которые являются консервативными, помечены "."). Подчеркнуты те пептидные последовательности, которые были идентифицированы методами массспектрометрии в соответствующих пятнах в 2-DE геле и которые были использованы для отнесения определенных изоформ ENOA к таким пятнам. Фиг. 4. Положения сайтов фосфорилирования (выделены жирным шрифтом, с подчеркиванием) в белковой последовательности человеческой альфа-енолазы (ENOA), предсказанные на основе различных алгоритмов и/или идентифицированные экспериментально (см. описание соответствующих ссылок, для приведенных под белковой последовательностью малых букв). Пептиды, идентифицированные в ENOA как фосфорилированные в ENOA изоформе 3, показаны в виде прямоугольника, обозначенного сплошной линией. Пептиды, идентифицированные как нефосфорилированные в ENOA изоформе 3, показаны в виде прямоугольника, обозначенного пунктирной линией. Фиг. 5A. Выявление шести изоформ альфа-енолазы (ENOA 1, 2, 3, 4, 5, 6) разными способами. Положения ENOA 1/2 и 3 показаны белыми стрелками. Фиг. 5B. Выявление шести изоформ альфа-енолазы (ENOA 1, 2, 3, 4, 5, 6) в белковых экстрактах из ткани нормальной поджелудочной железы или из ткани поджелудочной железы пациента с PDA, кото-2 016731 рые были перенесены на мембрану и затем протестированы методом вестерн-блоттинга с использованием анти-ENOA, в качестве первичного антитела. Положения ENOA 1/2 изоформ показаны белыми стрелками. Для целей контрольной оценки количества белка, содержащегося в геле и перенесенного на мембрану, указанную мембрану зондируют кроличьим поликлональным антителом против актина человека(разбавление 1:10000, Sigma Chemical Co.). Фиг. 6. Выявление шести изоформ альфа-енолазы (пятна 1, 2, 3, 4, 5, 6) в экстрактах клетокCF-PAC-1 с использованием 2-DE геля и вестерн-блоттинга на основе (в качестве первичного антитела) пула сывороток от пациентов с PDA, с или без предварительной адсорбции с рекомбинантной человеческой альфа-енолазой (+rENOA или -rENOA). Альтернативно, мембрану подвергают предварительной обработке фосфатазой (+PP-аза) перед проведением вестерн-блоттинга с использованием (в качестве первичного антитела) пула из сывороток от пациентов с PDA. Подробное описание изобретения Комбинированное использование биохимических и протеомических подходов может позволить идентификацию и оценку индивидуальных белков, присутствующих в биологических образцах, отобранных в состоянии болезни. В данном случае этот тип анализа первоначально был направлен на рак(PDA) и были использованы два источника ассоциированных с болезнью молекул: клеточная линия(CF-PAC-1), полученная на основе клеток аденокарциномы панкреатического протока (PDA) человека и сыворотки человека, полученной из большой панели, пациентов с PDA, которые потенциально содержат антитела, ассоциированные с PDA-онкогенезом и/или его прогрессированием. Профиль иммунореактивных белков, выявленных в экстрактах CF-PAC-1 вестерн-блоттингом указанных сывороток, сравнивали с результатами, полученными с использованием сывороток от разных контрольных популяций (здоровые субъекты, пациенты с опухолями, отличными от PDA, пациенты с хроническим панкреатитом), с тем чтобы установить PDA-ассоциированные антитела-кандидаты и родственные антигены в CF-PAC-1 протеоме (фиг. 1). Было показано, что антитела против ограниченного числа белков, обладающих вполне определенной биологической активностью (включая метаболические ферменты и цитоскелетные белки), присутствуют селективно в сыворотке пациентов с PDA, указывая на то, что эти белки являются PDAассоциированными и индуцируют образование in vivo антител у пациентов с PDA, но не у здоровых субъектов и не у пациентов с другими, отличными от PDA видами рака. Белки и антитела, которые определяются как PDA-ассоциированные, согласно настоящему изобретению (и любые другие специфические средства их выявления) могут использоваться в способах PDAдиагностики, а также для идентификации агентов для лечения PDA. Была определена панель PDA-ассоциированных человеческих белков (включающих альфа-енолазу,триосефосфатизомеразу, дегидрогеназу-1 сетчатки, глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназу, фактор элонгации Tu и изоцитратдегидрогеназу, цитоскелетный кератиновый белок 10 типа 1, Кофилин 1; фиг. 2B и табл. 1) с использованием 2-DE и масс-спектрометрии для разделения и анализа белков в качестве антигенов для антител, специфически присутствующих в сыворотке пациентов с PDA. Кроме того, очищенные антитела против данных антигенов подтвердили их дифференциальную экспрессию и в этой связи применимость любого основанного на этих белках способа для их детекции (включая сыворотки, полностью или частично очищенные антитела, препараты поликлональных антител и пептиды) с целью ранней диагностики PDA и для оценки прогрессирования этого вида рака у пациентов. Указанные белки могут использоваться, по отдельности или в сочетании, в качестве биомаркеров для ранней диагностики PDA и для оценки прогрессирования этого вида рака у пациентов. Среди указанных биомаркеров ENOA 1/2 (альфа-енолаза, изоформа 1 и изоформа 2) и COF1 (Кофилин 1), идентифицированные с использованием 2-DE и вестерн-блоттинга, являются, по всей видимости, самыми надежными PDA-ассоциированными белковыми антигенами. Как показано в приведенных примерах, антитела, связывающие такие PDA-ассоциированные антигены, могут использоваться для перечисленных выше целей. Таким образом, способы, включающие детекцию таких антигенов и/или антител в биологическом образце (таком как сыворотка, биоптат или белковые экстракты клеток/тканей), могут использоваться для ранней диагностики PDA и оценки прогрессирования PDA у пациентов. Характеристика PDA-ассоциированных антигенов, за исключением одного описанного ниже случая, не может быть распространена на любую посттрансляционную модификациюPDA-ассоциированных белков. Полученные данные позволяют полагать, что любое антитело или пептид, специфически связывающиеся либо с эпитопом, общим для всех изоформ данного антигена (как в случае очищенных антител, показанных в табл. 1, правая колонка), либо только с одной или несколькими изоформами, содержащими PDA-ассоциированную посттрансляционную модификацию (как модификации, присутствующие в сыворотке пациентов с PDA и выявляемые в ходе прогрессирования PDA; см. фиг. 2B), могут использоваться для постановки диагноза PDA и оценки прогрессирования этого заболевания.-3 016731 В связи с поставленной задачей создания новых терапевтических соединений для лечения PDA способы, включающие детекцию PDA-ассоциированных антигенов и антител (а также их связывающие свойства) в биологических образцах, могут также использоваться с целью оценки разрабатываемых лекарственных средств для лечения PDA. Этот подход может быть применен в тестах, в которых присутствие PDA-ассоциированных белков и/или антител может сравниваться с изоформами ENOA (ENOA 1/2),как показано в примерах. Изменения в указанных свойствах, которые могут быть установлены с использованием биохимических и протеомических технологий, описанных в приведенных ниже примерах и представленных в литературе и которые включают воздействие исследуемым соединением, могут указывать на наличие биологического пути, ведущего к PDA-онкогенезу и метастазированию. Так, например, возможно подтвердить наличие PDA-специфической активности соединения по исчезновению первичных антител противPDA-ассоциированных антигенов сыворотки у пациентов или на животных моделях, а также по снижению количества пятен, выявляемых вестерн-блоттингом в клеточных экстрактах с использованием антигенспецифических антител. Исследуемые соединения могут быть направлены на любую потенциальную терапевтическую мишень PDA, включая те из них, которые были определены в рамках настоящего изобретения какPDA-ассоциированные белки (такие как COF 1 или ENOA 1/2). Так, например, указанные соединения могут быть представлены в форме антител, связывающихся с ними (в целом или с определенными изоформами), или в виде малых молекул, меняющих их экспрессию или посттрансляционную модификацию, за счет модуляции активности ферментов, модифицирующих их. Кроме того, было обнаружено, что антитела, связывающие человеческую альфа-енолазу, такие как мышиные моноклональные антитела,ингибируют in vitro рост и пролиферацию трансформированных клеточных линий панкреатического происхождения, презентирующих шесть изоформ альфа-енолазы (в частности, включающих ENOA 1/2,выявленную по методу вестерн-блоттинга в сыворотке пациентов с PDA). Указанный ингибирующий эффект на рост и пролиферацию in vitro наблюдается также в случае трансформированной клеточной линии не панкреатического происхождения, презентирующей шесть таких изоформ альфа-енолазы, за исключением одного: они презентируют только три нефосфорилированные указанные изоформы (пример 3; фиг. 5B; таблица IV), что, предположительно, указывает на возможность использования антиENOA антител для лечения PDA. Такие потенциальные терапевтические свойства могут быть далее оценены в рамках любого теста на пролиферацию панкреатических клеток с использованием клеточных линий или животных моделей для подтверждения эффекта разных соединений, таких как пептиды, пептидные аналоги и малые молекулы, с точки зрения их воздействия на сигнальную трансдукцию (Baker C. et al., 2002; Bauer T. etYezhelyev M. et al., 2004; Rubio-Viqueira B. et al., 2006). Кроме того, была продемонстрирована возможность использования сочетаний соединений, направленных против разных молекулярных мишеней, для лечения рака поджелудочной железы более эффективно, чем это было ранее. Так, например, введение химиотерапевтического агента вместе с ингибиторами киназ, специфичных для рецепторов клеточной мембраны, приводит к ингибированию роста при раке поджелудочной железы человека в эксперименте и к значительному пролонгированию выживания, как показано на модели животных (Yokoi N. et al., 2005). Альтернативно, было показано, что в том случае, когда два или более антител, направленных на вирусную или человеческую мишень, объединяют в фармацевтической композиции, полученная композиция может демонстрировать улучшенную терапевтическую и/или диагностическую эффективность, демонстрируя не только аддитивный, но также и синергический эффект (Logtenberg T., 2007). Фармацевтическая композиция, включающая антитела против PDA-ассоциированных белков (таких как ENOA 1/2), может вводиться людям с терапевтической и диагностической целью. Таким образом,способы лечения или диагностики PDA могут включать введение фармацевтических композиций, содержащих антитела против PDA-ассоциированных белков (таких как ENOA 1/2). Указанные композиции могут включать стандартные фармацевтические наполнители и могут вводиться в виде однократной дозы или множественных доз и/или с использованием подходящих устройств,различными способами введения: внутримышечно, внутривенно, подкожно, местно, через слизистую, в составе неразлагаемых/биодеградируемых матричных материалов или с использованием систем доставки лекарственных средств в форме частиц. В частности, указанная композиция может позволять эффективное введение в поджелудочную железу или в любые другие ткани, где присутствуютPDA-ассоциированные белки. Фармацевтическая композиция должна обеспечивать доставку терапевтически или профилактически эффективного количества соединения субъекту, что позволит данному соединению проявлять свою активность в течение достаточного периода времени. Желаемый эффект заключается в улучшении состояния пациента с PDA за счет контроля роста и пролиферации PDA путем снижения по меньшей мере одного из клинических проявлений PDA. Так, например, указанная композиция должна вводиться в эффективном количестве от примерно 0,005 до примерно 50 мг/кг/вес тела, в зависимости от способа введения и от состояния индивидуума.-4 016731 В случае композиций, применяемых с диагностической целью, указанное соединение должно выявляться с использованием методик, обычно установленных в клинических и исследовательских лабораториях для выявления вирусов в биологических образцах (таких как, например, ELISA или другие методы серологического анализа) или в случае введения субъекту in vivo по меньшей мере через 1, 2, 5, 10, 24 ч или более после введения. Указанная детекция PDA-ассоциированных белков и/или антител может быть выполнена с использованием PDA-ассоциированных белков и/или антител согласно настоящему изобретению, с проведением впоследствии или в сочетании с ней известных методик и процедур, которые были установлены для диагностики PDA. Клиническая разработка и использование антител для терапии и/или диагностики PDA должны основываться на данных оценки фармакокинетики и фармакодинамики антител (Lobo E. et al., 2004), а также на результатах исследования их доклинической и клинической безопасности (Tabrizi M. and Riskos L.,2007) и соответствия международным требованиям по производству и контролю качества моноклональных антител для терапевтического и диагностического использования in vivo на людях (Harris R. et al. 2004). Наборы для PDA-диагностики у пациента могут включать один или несколько определенных вышеPDA-ассоциированных белков и/или антител, а также любое другое соединение, позволяющее их детектировать, согласно настоящему изобретению. Указанные наборы могут включать немеченные/меченые антигены, антитела или субстраты, которые модифицируются после взаимодействия с таким антигеном(например, в случае соединений, идентифицированных как обладающих ферментативной активностью). В числе мишеней гуморальной реакции на PDA особый интерес представляет тот факт, что новые фосфорилированные изоформы альфа-енолазы распознаются PDA-сывороткой. Новые изоформы человеческой альфа-енолазы (ENOA) подвергаются фосфорилированию по меньшей мере в трех положениях,всего было идентифицировано семь сайтов фосфорилирования (фиг. 4). Значимость этих данных подтверждается фактом выявления двух высокофосфорилированных изоформ ENOA (ENOA 1/2) с использованием сыворотки, полученной от пациентов с PDA, или тканей поджелудочной железы, также полученных от пациентов с PDA (фиг. 2B, 5 и 6; табл. I и II). При этом, как показано, пациенты с PDA имеют антитела, которые способны специфически связывать высокофосфорилированные изоформы ENOA согласно настоящему изобретению. Приведенные примеры показывают, что, несмотря даже на то что в последовательности ENOA могут быть фосфорилированы несколько положений, фактически существенно фосфорилирование вполне определенного сочетания остатков треонина, серина и тирозина, в обоих клеточных линиях и в PDAтканях, выявляемое человеческими антителами, продуцируемыми у пациентов с PDA. В частности, фосфорилирование в положениях треонина 55, тирозина 57, тирозина 200, тирозина 236, треонина 237, тирозина 257 и серина 419 присутствует в изоформе ENOA 3, которая демонстрирует, как и ENOA 1/2, профиль белкового фосфорилирования, меняющийся при обработке фосфатазами. Аналогичные изменения в фосфорилировании белка могут использоваться для диагностики PDA и для оценки прогрессирования этого заболевания с использованием биологических образцов, получаемых от пациента. В варианте подхода, альтернативного относительно полных ENOA 1/2 изоформ, возможно создавать полученные из ENOA одиночные пептиды, включающие их белковые последовательности, или библиотеки и их сочетания, которые содержат такие же фосфорилированные остатки, что и ENOA 1/2, как показано на фиг. 4 (см. приведенные в рамке последовательности). Способы создания и использования таких фосфорилированных белков и пептидов описаны в литературе (Conrads T. et al., 2002; US 5763164;WO 97/30097). Количество и эффект посттрансляционных модификаций в изоформах альфа-енолазы (в частности,в ENOA 1/2) могут быть также подтверждены с использованием известных процедур (Kalume D. et al.,2003; Machida K. et al., 2003; Mann M. et al., 2002; Rush J. et al., 2005; Molina H. et al., 2007; Schmelzle K.and White F., 2006; Wu J. et al., 2005) в PDA-ассоциированных и контрольных образцах. B ENOA 1/2 могут присутствовать дополнительные фосфорилированные положения и/или дополнительные модификации, известные для ENOA (табл. III), которые релевантны для антигенности и биологической активности этих изоформ, а также для целей их детекции изоформ-специфическими антителами. Посттрансляционная модификация, ассоциированная со специфическим стадиями/типами заболевания, может быть выявлена с помощью нескольких способов, включающих непосредственный анализ различающихся изоформ белков или антител, содержащих специфические модификации, как было показано для других белков(Edberg D. et al., 2005; Mandell J., 2003). Антитела, в частности моноклональные антитела, которые определяются согласно их связыванию с белковыми изоформами, дифференциально экспрессируемыми в не-PDA/PDA белковых экстрактах в рамках 2-DE-процедуры и вестерн-блоттинга, могут использоваться при лечении тех видов рака, которые имеют анлогичный профиль, по данным анализа в 2-DE и вестерн-блоттинга. Так, антитела, связывающие альфа-енолазу (в целом, или ее специфические фосфорилированные изоформы, в частности), могут использоваться при изготовлении фармацевтических композиций для лечения PDA и в терапевтических стратегиях, используемых применительно к пациентам с PDA или раковым больным, которые демонстрируют аналогичный профиль экспрессии альфа-енолазы (т.е. экспрессируют новые изоформы человече-5 016731 ской альфа-енолазы согласно настоящему изобретению, которые фосфорилированы по меньшей мере в 3 положениях). Антитела могут использоваться для детекции или лечения тех видов рака (например, PDA), которые характеризуются присутствием в сыворотке пациентов фосфорилированных изоформ альфа-енолазы. Такие антитела могут быть получены при использовании любой известной в данной области методики идентификации, характеристики и продукции антител для терапевтических или диагностических целей(Jain M. et al., 2007; Laffly E. and Sodoyer R., 2005). Указанные антитела могут быть получены в любом белковом формате, соответствующем функциональным антителам, а именно: в виде полноразмерных антител (таких как моноклональные антитела, в частности человеческие или гуманизированные моноклональные антитела), в виде фрагментов антител, антигенсвязывающих белков и других сконструированных белков и пептидов слияния на основе антител, которые описаны в литературе под разными наименованиями, такими как Scfv (одноцепочечный фрагмент вариабельного участка), Fab (гетеродимер тяжелой/легкой цепи вариабельного участка), димерные антитела, выделенные тяжелые или легкие цепи,пентамерные антитела или биспецифические антитела. Антитела согласно настоящему изобретению могут быть улучшены, применительно к определенным свойствам, путем конъюгации (с использованием химических линкеров или полимеров) или слияния с терапевтическими, стабилизирующими агентами, метками или диагностическими агентами. Примерами таких агентов являются детектируемые меченые молекулы (например, радиоактивный изотоп,флуоресцентное соединение, токсин, атом металла, хемилюминесцентное соединение, биолюминесцентное соединение, биотин, субстрат фермента или фермент), которые могут присоединяться. ENOAспецифическая активность также может быть повышена путем слияния с другим терапевтическим белком, таким как белок или полимер, меняющий метаболизм и/или стабильность в рамках диагностического или терапевтического применения. Способы отбора и конструирования белковых фрагментов, лигандов и соответствующих линкеров,а также процедуры и стратегии конструирования, очистки, детекции и использования белков слияния описаны в литературе (Nilsson et al., 1997; "Applications Of Chimeric Genes And Hybrid Proteins". MethodsEnzymol. Vol. 326-328, Academic Press, 2000; WO 01/77137) и доступны в клинических и исследовательских лабораториях. Так, например, указанный белок слияния может содержать последовательности, распознаваемые антителами, доступными в коммерческом варианте (включая фрагменты, такие как полигистидин, FLAG, c-Myc или HA фрагменты), которые могут облегчать идентификацию in vivo и/или invitro белка слияния или его очистку. Другие белковые последовательности могут быть легко идентифицированы по процедуре прямого флуоресцентного анализа (как в случае зеленого флуоресцентного белка) или с использованием специфических субстратов или ферментов (например, с использованием сайтов протеолитического расщепления). Антитела, распознающие PDA-спедифические белковые последовательности (такие как ENOA 1/2),или любые другие белковые последовательности, полученные на основе таких антител, могут быть экспрессированы в виде рекомбинантного белка с использованием соответствующих векторов для трансформации клеток-хозяев, где указанные клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими, и которые будут позволять секрецию желательного рекомбинантного белка. Способы получения таких белков включают культивирование клеток-хозяев, трансформированных векторами экспрессии, включающими кодирующие последовательности, в условиях, подходящих для экспрессии белка, и восстановление белка из культуры клеток-хозяев. Векторы, используемые для экспрессии в прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах,описаны в соответствующих руководствах и обзорах, где, в частности, уделяется внимание способам клонирования и получения рекомбинантных белков (в частности, это работы из серии "A PracticalApproach", опубликованной Оксфордским Университетом (Oxford Univ. Press) ("DNA Cloning 2:"Protein Purification Techniques", 2001. Могут быть добавлены дополнительные белковые последовательности к желательной форме антитела (Scfv, Fab, фрагмент антитела, полноразмерное человеческое антитело и т.п.) или это может быть вставка, замещение или удаление одной или нескольких внутренних аминокислот. Указанные методики могут также использоваться для дальнейшей структурной и функциональной характеристики и оптимизации трапевтических свойств белков, в целом, и антител, в частности (Kim S. et al., 2005). Ниже настоящее изобретение описывается с использованием соответствующих примеров, которые не следует трактовать как ограничивающие каким-либо образом настоящее изобретение.-6 016731 Примеры Пример 1. Детекция PDA-ассоциированных гуморальных антигенов в протеоме клеточной линии CP-PAC-1. Материалы и методы. Человеческая сыворотка. Образцы сыворотки выделяют из венозной крови пациентов, при наличии информированного согласия таких пациентов, и от здоровых доноров в соответствии с протоколом, разрешенным Этическим Комитетом для применения в клинических институтах. Образцы хранят при температуре -80C до использования. Сыворотку получают от 70 пациентов с PDA (31 мужчина, 39 женщин; в возрасте 32-86 лет; средний возрастстандартное отклонение: 6711), которые были объединены в группы, на основании выявленных у них клинических стадий, при оценке стадий согласно общепринятой классификации (Faria S. etal., 2004) и классификации UICC (Union International Contre le Cancer), следующим образом: 17 человек на стадии II (отсутствие метастаз, отмечается умеренная дифференцировка), 17 человек на стадии III (отсутствие метастаз, слабая дифференцировка) и 36 человек на стадии IV (наличие удаленных метастаз,недифференцированная ткань). Реактивность указанных образцов сыворотки сравнивают с результатами ее оценки у 40 здоровых субъектов, которые были использованы в качестве контролей и которые не имели в анамнезе рака или аутоиммунного заболевания (14 мужчин, 26 женщин; возраст в диапазоне 57-77; средний возрастстандартное отклонение: 707). Дополнительно, реактивность этих образцов сыворотки сравнивают с результатами ее оценки у 30 пациентов с раком, отличным от PDA (9 пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой, 12 пациентов с раком молочной железы, 8 пациентов с раком толстой кишки и 1 пациент с раком яичника; 11 мужчин, 19 женщин; возрастной диапазон 44-79; средний возрастстандартное отклонение 6610) и у 15 пациентов с хроническим панкреатитом (9 мужчин, 6 женщин, возрастной диапазон 49-76; средний возрастстандартное отклонение: 598). По возрасту и распределению по половому признаку в различных группах пациентов, у которых отбирались образцы сыворотки, не было выявлено статистически значимых различий, как следовало из оценки в рамках непарного 2-параметрового т-теста Стьюдента. И только в группе пациентов с хроническим панкреатитом распределение по возрасту (но не по полу) в двух указанных группах существенно различалось, поскольку это заболевание в основном поражает людей в более молодом возрасте (в среднем, в возрасте около 44 лет), чем PDA. Клеточные линии и получение клеточных экстрактов. Клетки (107) из клеточной линии CF-PAC-1 (ECACC, кат.91112501), полученные из аденокарциномы панкреатического протока (Schoumacher R. et al., 1990), собирают и промывают сбалансированным солевым раствором Хэнкса (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Осадок подвергают лиофильной сушке в течение ночи и хранят при температуре -80C. Далее полученный осадок ресуспендируют в 200 мкл регидратирующего буфера [5 М мочевина, 2 М тиомочевина, 4% (вес./об.) CHAPS (Sigma(Sigma Chemical Co.)] и следовые количества бомфенолового синего (Sigma Chemical Co.). Концентрацию белка определят по методу Брэдфорда (Bio-Rad Laboratories). Двумерный гель-электрофорез (2-DE). 100 мкг белкового экстракта из клеток линии CF-PAC-1 наносят, при регидратации геля, на IPG полосы размером 7 см (pH 3-10 NL), применяемые в гелях для аналитического и препаративного электрофореза. Изоэлектрофокусирование (IEF) проводят в системе IPGphor IEF (GE Healthcare Bio-Sciences),используя градиент напряжения до 5000 В, и всего 16000 Вч. Перед проведением ДСН-ПААГ, IPG полосы уравновешивают в течение 15 мин раствором, содержащим Трис/HCl-6 уфер (50 мМ; рН 8,8), мочевину (6 М), глицерин (30 об.%), ДСН (2% (вес./об. и ДТТ (2% (вес./об. и затем в течение еще 5 мин в том же буфере, но содержащем иодацетамид (2,5% (вес./об. и бромфеноловый синий, вместо ДТТ. Для проведения электрофореза во втором направлении используют полосы размером 7 см на основе малоразмерных NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Zoom сформованных гелей (Invitrogen, Groningen, theNetherlands) с использованием системы Novex X-Cell II Mini-cell (Invitrogen) при постоянном напряжении 200 В и затем переносят на нитроцеллюлозную мембрану Hybond ECL (GE Healthcare Bio-Sciences) с использованием модуля для блоттинга Novex X-Cell II (Invitrogen) или процедуры серебряного окрашивания для дальнейшего масс-спектрометического анализа (Shevchenko A. et al., 1996). Значения pI в полученных пятнах белков определяют с учетом их положения на 2-DE геле при использовании pH-градиентных калибровочных кривых, предоставляемых GE Healthcare Bio-Sciences. Молекулярный вес белков рассчитывают, сравнивая их миграцию с миграцией соответствующих стандартовSeeBlue Plus2 Prestained (Invitrogen) с известным молекулярным весом. Снимки картины, получаемой в 2DE гелях, делают с помощью "ImageScanner" (GE Healthcare Bio-Sciences) и записывают в формате TIFF в рамках программного обеспечения "ImageMaster Labscan Ver 3.00" (GE Healthcare Bio-Sciences).TBS с содержанием 5% обезжиренного сухого молока, после чего инкубируют в течение 4 ч с сывороткой (1:200, делают рабочее разбавление с использованием TBS, содержащего 0,05% Твин 20 и 5% обезжиренного сухого молока). После промывки мембраны инкубируют с конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) кроличьим антителом против человеческого иммуноглобулина G (IgG) (Santa CruzBiotechnology) в разбавлении 1:1000 в течение 90 мин при комнатной температуре. Альтернативно, для целей вестерн-блот анализа с использованием очищенных первичных антител нитроцеллюлозные мембраны подвергают блоттингу в рамках процедуры с использованием 2-DE гелей и затем зондируют антителами в разбавлении 1:1000, используя либо мышиное антитело [такое как моноклональные антитела против енолазы 19/128 (субклон, полученный из клона 19/12, описанный Moscato S.International), против фактора элонгации tu (Abnova Corporation)], либо кроличье антитело [такое как поликлональные антитела против альдегиддегидрогеназы 1 (Chemicon International), против глюкозо-6 фосфат-1-дегидрогеназы (Bethyl laboratories), против изоцитратдегидрогеназы (Biogenesis Ltd) и против кофилина 1 (Cell Signaling)] в течение 1 ч при температуре 25C. Далее, указанные мембраны инкубируют в течение 1 ч со специфическим вторичным HRP-конъюгированным кроличьим антителом, либо против мышиного IgG, либо против кроличьего IgG (Santa Cruz Biotechnology) в соответствии с инструкциями производителя. Вестерн-блот анализ панкреатических тканей проводят с использованием в совокупности 30-50 мг свежезамороженной ткани, которая была гомогенизирована (Т 18 basic UltraTurrax) на льду в 400 мкл лизирующего буфера, содержащего 50 мМ Трис/HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1% NP40, 1% Тритон X-100,1 мМ ДТТ, 10 мкл/мл ингибирующего коктейля, 1 мМ PMSF (где все реагенты получены от компанииSigma Chemical Co.) и 10 мкл/мл смеси нуклеаз (GE Healthcare Bio-Sciences). После озвучивания в ультразвуковом дезинтеграторе (Hielscher UP200S, 340 с, с амплитудой до 40%, цикл 0,5) указанную смесь центрифугируют (13000 об/мин, при температуре 4C в течение 30 мин). 20 мкг белкового экстракта,отобранного из супернатанта, после оценки уровня белка по методу Брэдфорда (Bio-Rad Laboratories) разделяют на малых пластинах NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris со сформованным гелем (Invitrogen) и переносят на нитроцеллюлозную мембрану, как было описано выше. Для иммунодетекции используют ECL (Enhanced Chemiluminescence, GE Healthcare Bio-Sciences) и далее проводят ауторадиографию на пленке (Hyperfilm) (GE Healthcare Bio-Sciences). Снимки обработанных пленок делают с использованием "ImageScanner" (GE Healthcare Bio-Sciences), записывают в формате TIFF в рамках программного обеспечения "ImageMaster Labscan Ver 3.00" (GE Healthcare Bio-Sciences) и анализируют с использованием программного обеспечения Image Master 2D Elite, версия 3.1 (GEHealthcare Bio-Sciences). Идентификация белка масс-спектрометрией (MS). Для проведения MS-анализа соответствующие пятна в препаративных 2-DE гелях вырезают и анализируют по методу ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы/времяпролетного анализа частиц (MALDI-TOF) и, при необходимости, проводят также оценку по методу ионизации электронапылением (ESI). Белки обесцвечивают, выдерживая в течение ночи с раствором 25 мМ бикарбоната аммония и 50% ацетонитрила, и затем расщепляют в геле трипсином (Promega, Madison, WI, USA) согласно описанной ранее процедуре (Hellman U. et al., 1995). В случае анализа в формате MALDI-TOF MS 0,5 мкл каждой из пептидных смесей наносят на целевой диск и высушивают на воздухе. Затем к высушенному образцу добавляют 0,5 мкл матричного раствора (1% (вес./об.) -циано-4-гидроксикоричной кислоты в 30% ацетонитриле, 0,1% ТФУ) и снова все высушивают. Спектры регистрируют с использованием спектрометраBruker Reflex III MALDI-TOF. Интрепретацию MS-спектров продуктов расщепления белка проводят по методу оценки "пептидных отпечатков" (PMF) с использованием программного обеспечения MS-Fit(http://prospector.ucsf.edu; Chamrad D. et al., 2004). В рамках MS/MS экспериментов смесь пептидов после трипсиновой обработки подвергают обессоливанию и концентрируют с использованием устройства ZipTipC18 (Millipore). После элюции с использованием 60% метанола плюс 1% муравьиной кислоты, 4,5 мкл пептидной смеси после трипсиновой обработки вводят в боросиликатный капилляр с золотым покрытием (Proxeon Biosystems) и анализируют с использованием масс-спектрометрической ионной ловушки LCQ Thermo (ThermoFinnigan), соединенной с источником ESI. Подачу напряжения на капилляр устанавливают на уровне 46 В и напряжение в процедуре распыления поддерживают на уровне 1,8 кВ. Самые стабильные сигналы, получаемые в ходе масс-спектрального сканирования в полном диапазоне, улавливаются и фрагментируются в рамках низкоэнергетической диссоциации, вызванной столкновением (CID), при нормализации энергии столкновения в диапазоне от 22 до 24%.-8 016731 Некоторые белки идентифицируют также по процедуре LC-MS/MS с использованием массспектрометрической ионной ловушки LCQ DECA XP Plus (ThermoFinnigan), снабженной источником ионов для ESI. Хроматографическое разделение и затем MS-анализ проводят на колонке C18 Luna, с размерами 1502,0 мм (Phenomenex) с использованием апаратной части Surveyor (аутосэмплер и насос)(ThermoFinnigan), рассчитанной на инъецируемый объем 10 мкл и скорость течения 200 мкл/мин. Для анализа всех данных, полученных в формате MS/MS, используют программное обеспечениеBioworks 3.0 (ThermoFinnigan) и полученные последовательности сравнивают с последовательностями человеческих белков, имеющимися в базах данных EBI, с использованием программного обеспеченияFASTA (http://www.ebi.ac.uk/fasta33/; Johnson R. et al., 2005). Статистический анализ. Все статистические данные обрабатывают с использованием программного обеспечения GraphPadPrism Software. Приведенные данные представляют собой среднее значениеSEM (статистическая ошибка среднего значения). Используют неспареный 2-параметровый t-тест для оценки значимости экспрессии разных белков в тканях, отобранных из организма с PDA, и в нормальных панкреатических тканях. Двустороннее значение показателя P0,05 рассматривают как статистически значимое. Результаты. Протеома на основе клеточной линии CF-PAC-1, которая часто используется в качестве моделиet al., 2005), была использована для идентификации присутствия белков и антител, которые ассоциированы с PDA, при использовании сыворотки от пациентов с PDA в качестве источника первичных антител. Белковые экстракты из указанной клеточной линии анализируют в формате 2-DE, определяя репрезентативную двумерную карту при проведении окрашивания серебром. Этот подход позволяет отделить белки, содержащиеся в данном экстракте в качестве "пятен", которые могут быть отнесены в нужную группу, согласно их интенсивности и положению в 2-DE геле, и в случае которых могут быть приблизительно определены количество, молекулярный вес и pI соответствующих белков. Далее, 2-DE гели переносят на мембрану для их последующего анализа по процедуре вестернблоттинга с использованием панели сывороток, взятых либо от пациентов с PDA, либо от пациентов безPDA (включая здоровых субъектов, пациентов, пораженных другими видами рака, а также пациентов с хроническим панкреатитом). Сравнение разных картин полученных пятен (а также между снимками пятен после окрашивания серебром и соответствующими пятнами после вестерн-блоттинга в 2-DE гелях) позволяет идентифицировать PDA-ассоциированные пятна, которые могут быть впоследствии охарактеризованы, например, в рамках масс-спектрометрического анализа белковых фрагментов, экстрагированных из таких пятен с использованием ферментов, осуществляющих расщепление белков в контролируемых условиях (фиг. 1). На основе данного подхода отобрали десять пятен, которые были охарактеризованы как соответствующие белкам, которые уникально распознаются сывороточными антителами от пациентов с PDA(фиг. 2A). Указанный анализ был ограничен человеческими IgG антителами, поскольку вторичные антитела, которые при этом использовались, специфичны именно для данного изотипа. Указанные десять пятен вырезали из препаративных гелей и анализировали в рамках процедуры MALDI-TOF MS для идентификации, каким человеческим белкам они соответствуют. При использовании данного подхода девять разных белков были идентифицированы как PDA-ассоциированные антигены. Две пары пятен соответствовали изоформам одного белка, а одно пятно содержало последовательности, принадлежавшие к двум разным белкам, которые были недостаточно полно разделены в рамках 2-DE. И все такие пятна отсутствовали или были практически невыявляемыми в вестерн-блоттинге, проводимом с использованием контрольных сывороток. Первичные антитела, связывающие один или несколько белков из указанных пятен,были идентифицированы в большом проценте сывороток, полученных от пациентов с PDA (табл. I). Среди PDA-ассоциированных антигенных белков может быть проведено разграничение между двумя категориями белков в соответствии с типом биологической активности, по которой они идентифицируются, согласно литературным данным. Первая группа белков включает метаболические ферменты: альфа-енолазу (присутствует в двух пятнах, где каждое соответствует специфической изоформе), триосефосфатизомеразу (присутствует в двух пятнах, где каждое соответствует специфической изоформе),дегидрогеназу-1 сетчатки, глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназу, фактор элонгации Tu и изоцитратдегидрогеназу. Вторая группа белков была охарактеризована как преимущественно скелетно-мышечные белки: скелетно-мышечный кератин 10 типа I и кофилин 1. В дополнение к результатам, полученным использованием клеток CF-PAC-1 и человеческих сывороток, провели сравнение в рамках вестерн-блоттинга панкреатических экстрактов, которые были получены от здоровых субъектов и пациентов с PDA, с использованием для анализа очищенных антител против указанных выше белков (но не человеческой сыворотки) в качестве первичных антител. Анализ такого рода позволяет провести количественное определение суммарного белка (а не только определенных изоформ), и его результаты показывают, что эти белки подвергаются суперэкспрессии, в разной степени,в панкреатических тканях, полученных из биоптатов от пациентов с PDA (табл. I).-9 016731 Диагностическую ценность указанных белков (и присутствие в PDA сыворотке специфических белков против них) далее оценивали путем дифференцированного выявления присутствия пятен для каждого из белков в сыворотках, полученных от пациентов с PDA, но сгруппированных в соответствии со стадией заболевания, а также с использованием сывороток от больных с хроническим панкреатитом, в качестве контролей. Результаты вестерн-блот анализа показали, что присутствие и количество аутоантител против разных белков неравномерно распределяется у пациентов на разных стадиях PDA (фиг. 2B). Аутоантитела против большинства белков отсутствуют в контрольных сыворотках, тогда как частота выявления содержащих их PDA сывороток повышается у пациентов с PDA на стадии II, для большинства исследованных белков (ниже 25%), за единственным исключением ENOA 1/2. Указанная частота проявления в профиле продукции аутоантител подтверждается для большинства развитых стадий заболевания, где снова аутоантитела против изоформ альфа-енолазы представляли особый интерес, поскольку демонстрировали постоянное повышение частоты выявления на стадии III и стадии IV PDA. Выводы. Серологический подход, объединяющий метод оценки профиля экспрессии в рамках 2-DE для клеточной линии клеток опухоли поджелудочной железы человека (CF-PAC-1) и вестерн-блот анализ (при использовании, в качестве первичных антител, человеческого IgG из сыворотки от пациентов с PDA),позволяет идентифицировать ограниченное число человеческих белков и их изоформ, против которых у пациентов с PDA развивается специфический гуморальный ответ. При наличии единственного исключения (AL1A1) экспрессия этих белков подвергается позитивной регуляции в оцениваемых биоптатах от пациентов с PDA. Кроме того, образование антител против указанных PDA-ассоциированных белков, по всей видимости, по меньшей мере для некоторых антигенов, значительно повышается на развитых стадиях заболевания. Приведенные результаты демонстрируют применимость серологических подходов в поиске и идентификации возможных маркеров для ранней диагностики PDA, которые, в данном случае, преимущественно являются внутриклеточными. Механизм, посредством которого иммунная система взаимодействует с внутриклеточными белками, неизвестен, но он может зависеть от уникального окружения, создаваемого опухолью, так что данное окружение может, в свою очередь, менять локализацию внутриклеточных ферментов в опухолевых клетках. Кофилин 1 (COF1) играет роль в ремоделировании актина, подвижности и при раке, за счет активности в качестве как актин-деполимеризующего фермента вовлекается в формирование инвадоподиума(Yamaguchi H. et al., 2005) и, возможно, требуется для направления опухолевой клетки в ответ на хемотаксическую стимуляцию или стимуляцию ростовыми факторами (Mouneimne G. et al., 2004). Суперэкспрессия COF1 ранее выявлялась на моделях животных с PDA (Cecconi D. et al., 2003; Sinha P. et al., 1999). Альфа-енолаза представляет собой высококонсервативный метаболический фермент, обладающий множеством свойств и выявляемый в разных контекстах (Pancholi V., 2001; Piast M. et al., 2005; Terrier B.et al., 2007). Этот фермент может экспрессироваться на поверхности клеток в качестве рецептора плазминогена (Lopez-Alemany R. et al., 2003) и далее распознаваться B-клетками, действуя как потенциальный активатор B-клеток (Babu J. et al. 2002). Были выявлены две ее изоформы при аденокарциноме панкреатического протока, но не были описаны их молекулярные свойства с точки зрения посттрансляционных модификаций (Shen J. et al., 2004). Аутоантитела против альфа-енолазы, существующие в виде одной изоформы или множества изоформ (но без доказательства наличия специфической экспрессии фосфорилированных изоформ ENOA),были идентифицированы на многих биологических моделях и при использовании определенных моделей заболеваний, таких как ассоциированная с раком ретинопатия (Adamus G. et al., 1998; Adamus G. et al.,1996), немелкоклеточный рак легкого и другие виды рака, кроме панкреатического рака (WO 07/072219;US 20070172487: He P. et al., 2007), цирроз печени (Akisawa N. et al., 1997), энцефалопатии (Fujii A. et al.,2005) и аутоиммунные заболевания (Ballot E. et al., 2003; Bogdanos D. et al., 2004; Gitlits V. et al., 2001). Свойства альфа-енолазы и специфичных для альфа-енолазы антител или аутоантител исследовались с использованием методики проявления фагов (Arza В. et al., 1997; Kemp E. et al., 2002) или соответствующих пептидов (Adamus G. et al., 1998; Sato N. et al., 2000; Walter M. et al., 1995; Fujii A. et al., 2005). Результаты данного исследования показывают, что специфические изоформы альфа-енолазы и антитела для их выявления являются особенно полезным инструментом для диагностики PDA, ввиду частоты и специфичности продукции аутоантител против двух специфических изоформ этого белка (ENOA 1/2) в сыворотке пациентов с PDA (табл. I и фиг. 2B). Указанные антитела могут быть специфичными для эпитопа, который является общим для всех или, чаще, для определенных изоформ (как в случае очищенных антител, использованных в эксперименте) или эпитопа, отличающего PDA-ассоциированные изоформы от других изоформ (которые, например, присутствуют в PDA сыворотке). Кроме того, прогрессирование PDA от II стадии к IV стадии характеризуется очень существенным повышением продукции аутоантител против ENOA 1/2, что указывает на возможную прямую корреляцию с размером опухоли и ее способностью к росту.- 10016731 Более детальный анализ таких изоформ важен не только для установления прогностической ценности аутоантител для диагноза PDA, но также для более глубокого понимания молекулярных механизмов,связывающих их с PDA, а также возможных терапевтических подходов в случае данного рака. Пример 2. Анализ изоформ альфа-енолазы, выявленных с помощью аутоантител в клетках CF-PAC-1. Материалы и методы.MS-анализ. Пятна вырезают из препаративных 2-DE гелей и анализируют с использованием процедуры ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы/времяпролетного анализа частиц (MALDI-TOF). Белки обесцвечивают при выдерживании в течение ночи в растворе 0,025 моль/л бикарбоната аммония и 50% ацетонитрила и затем расщепляют в геле при обработке трипсином (Promega, Madison, WI), как было описано ранее (Hellman U. et al., 1995). Для проведения процедуры MALDI-TOF MS по 0,5 мкл каждой пептидной смеси наносят на целевой диск и оставляют для сушки на воздухе. Затем к высушенному образцу добавляют 0,5 мкл матричного раствора (1% (вес./об.) -циано-4-гидроксикоричная кислота в 30% ацетонитриле, 0,1% ТФУ) и снова все высушивают. Спектры регистрируют с использованием спектрометра Bruker Reflex III MALDI-TOF (Bremen, Germany). Интерпретацию MS-спектров продуктов расщепления белка проводят при анализе "пептидных отпечатков пальцев" (PMF) с использованием программного обеспечения MS-Fit. Анализ фосфорилирования. Анализ белковой последовательности человеческой альфа-енолазы проводят с использованием следующих продуктов программного обеспечения,доступного через Интернет:al., 2005)]. Фосфатазную обработку проводят с использованием PP-азы (New England Bio labs Inc.), как описали Ямагата с соавт. (Yamagata A. et al., 2002), при внесении в указанную процедуру следующих изменений. Осажденные клетки CF-PAC-1 (30106) ресуспендируют в течение 15 ч в 1 мл лизирующего буфера (1% (вес./об.) NP-40, 1% (вес./об.) ДСН, 50 мМ Трис, pH 7,6 и 150 мМ NaCl-протеазного ингибирующего коктейля). Полученный лизат (120 мкл, соответствующий 2 мг белка) доводят до конечного объема 1240 мкл деионизированной водой, затем добавляют 20 мкл 20 мМ раствора MgCl2 и 20 мкл PPазного буфера. После каждого добавления раствор осторожно перемешивают. Далее смесь разделяют на аликвоты и к каждой аликвоте добавляют по 600 единиц PP-азы. После перемешивания аликвоты инкубируют в течение 15 ч при температуре 30C. Белки осаждают ацетоном и хлороформом и проводят анализ в 2-DE (см. пример 1). Выявление фосфопротеинов на основе красителя проводят в 2-DE гелях с использованием флуоресцентного красителя для фосфопротеинов ProQ (Molecular Probes), а также с помощью окрашивания по процедуре Sypro Ruby (Bio-Rad) с целью выявления суммарных белков, в соответствии с инструкциями производителя и с литературными данными (Wu J. et al., 2005). В общих чертах, процедура состоит в том, что после 2-DE проводят окрашивание Pro-Q, вначале фиксируя гели в смеси 50% метанола/10% уксусной кислоты в течение 30 мин. Затем гель промывают дистиллированной водой и подвергают окрашиванию Pro-Q Diamond красителем на фосфопротеины в течение 4 ч. Удаление окрашивания проводят путем последовательной промывки 50 мМ ацетатом натрия, pH 4,0, содержащим 20% ацетонитрил,перед окрашиванием флуоресцентным красителем Sypro Ruby (в течение ночи). Анализ экспрессии изоформ ENOA в биоптатах панкреатической ткани. Панкреатические ткани получают путем отбора биопсийных образцов либо от здоровых индивидуумов, либо от пациентов с PDA (стадия II) и далее гомогенизируют (Т 18 basic UltraTurrax, IKA) на льду, в 400 мкл лизирующего буфера, содержащего 5 моль/л мочевины, 2 моль/л тиомочевины, 4%(ДТТ), 10 мкл/мл нуклеазной смеси и следовые количества бромфенолового синего красителя. После озвучивания в ультразвуковом дезинтеграторе (Hielscher UP200S, 340 с, амплитуда 40%, цикл 0,5Hielscher Ultrasonics GmbH), полученную смесь центрифугируют (13000 об/мин, 30 мин при температуре 4C) с белковым раствором, содержащимся в супернатанте. Концентрацию белка определяют по методу Брэдфорда. 30 мкг белкового экстракта разделяют на малых пластинах NuPAGE Novex 4-12% Бис-Трис со сформованным гелем, переносят на нитроцеллюлозную мембрану, инкубируют в течение ночи при температуре 4C с моноклональным антителом против альфа-енолазы 19/128 (Moscato S. et al., 2000) и выявляют по процедуре вестерн-блоттинга, описанной в примере 1.- 11016731 Получение рекомбинантной формы ENOA с гистидиновым фрагментом (rENOA). Рекомбинантный белок выделяют и очищают из клеток E.coli, трансфицированных плазмидой, которая кодирует последовательность человеческой ENOA (при отсутствии лишь первых девяти аминокислот), слитую с гистидиновым фрагментом. В общих чертах, процедура состоит в том, что бактериальные клетки собирают из 1 л культуры путем центрифугирования и осадок ресуспендируют в 20 мл нативного связующего буфера (NBB, 20 мМ фосфат натрия и 500 мМ хлорид натрия, pH 7,8) при добавлении лизоцима (100 мкг/мл) и 0,7% саркозила. Суспензию помещают на медленную качалку при температуре 4C на 15 мин. Клеточный лизат озвучивают на льду с десятью 40-секундными паузами, при высокой интенсивности. Далее, лизат центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 15 мин при температуре 4C для осаждения нерастворимой фракции, которую ресуспендируют в 10 мл гуанидинового лизирующего буфера (6 М гидрохлорид гуанидина, 20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, pH 7,8), обогащенного ингибиторами протеаз, в течение 10 мин при комнатной температуре. Указанный лизат вносят в предварительно уравновешенную колонку (колонка с Ni-NTA-агарозой, Invitrogen) и оставляют для связывания со смолой на 30 мин при температуре 4C при слабом вращении. После этого смолу промывают два раза NBB и два раза нативным промывочным буфером (NWB; NBB при pH 6,0). Элюцию проводят с использованием 10 мл имидазольного элюирующего буфера (350 мМ, pH 6) для получения рекомбинантной ENOA с гистидиновым фрагментом (rENOA). Элюированные фракции диализуют в стерильной воде и далее лиофилизируют и ресуспендируют в стерильном апирогенном фосфатнобуферном растворе Дульбекко (DPBS, Sigma). Аликвоты хранят при температуре -20C. Уровень эндотоксинов составляет менее 0,03 МЕ/мл, по данным лимулюс-теста на лизат (Pyrogent; Bio Whittaker). Анализ экспрессии изоформ ENOA в CF-PAC-1 с использованием сывороток пациента и процедур вестерн-блоттинга. 2-DE гели с CF-PAC-1 переносят путем электроблоттинга на нитроцеллюлозную мембрану HybondECL (GE Healthcare), как описано выше. После блокирования в течение 1 ч с использованием TBS, содержащего 5% обезжиренного сухого молока, блоты инкубируют с пулом из трех сывороток пациентов сENOA 1/2+ (в разбавлении 1:100 в TBS) в разных условиях. В серии экспериментов указанный пул сывороток вначале инкубируют в течение 15 ч при температуре 4C на качалке с 20 мкг/мл рекомбинантной альфа-енолазы (rENOA) перед инкубацией с мембраной. В другой серии экспериментов мембрану вначале инкубируют с 2 мл ФБР, содержащего 600 единицPP-азы, 40 мкл 20 мМ раствора MnCl2 и 40 мкл PP-азного буфера в течение 15 ч при температуре 30C. Мембраны снова блокируют в течение 1 ч, промывают три раза в течение 15 мин TTBS и инкубируют с пулом сывороток (разбавление 1:100). Связывание антител в сыворотке с изоформами ENOA выявляют с использованием противочеловеческих антител по процедуре вестерн-блоттинга, как было описано в примере 1. В качестве контрольной процедуры для оценки количества иммобилизованного ENOA мембрану подвергают повторному зондированию мышиными моноклональными антителами против енолазы 19/128 (см. пример 1). Результаты. После демонстрации того факта, что две изоформы человеческой альфа-енолазы специфически выявляются антителами в сыворотке пациентов с PDA, были исследованы свойства, характерные для таких изоформ (и любой другой изоформы этого белка, которая присутствует в клетках CF-PAC-1) с использованием разных подходов. Результаты, полученные при сравнении вестерн-блотов, полученных с использованием очищенного антитела против альфа-енолазы или сывороток от разных пациентов с PDA, при проведении серебряного окрашивания 2-DE гелей и масс-спектрометрического анализа показали наличие 4 дополнительных пятен, соответствующих дополнительным формам изоформам альфа-енолазы, не ассоциированных с PDA,в 2-DE гелях, которые имеют такой же молекулярный вес, но при создании экспериментальных условий со сниженными значениями pI, в сравнении с вариантом ENOA 1/2 (табл. II). Эти данные были получены с использованием клеточных экстрактов из клеток CF-PAC-1 или MiaPaCa-2 при анализе в 2-DE гелях. Пептиды, полученные из таких пятен, были идентичны фрагментам ENOA (и четко отличались от высоко аналогичной человеческой гамма-енолазы; фиг. 3), подтверждая данные о том, что пятна, выявляемые при вестерн-блоттинге, должны соответствовать изоформам ENOA, где только ENOA 1/2 ассоциированы с PDA. Посттрансляционные модификации представляют собой такие свойства, которые зачастую отличают одну изоформу от другой. Предварительный анализ, исключавший, по всей видимости,гликозилирование (ввиду ограниченных изменений в молекулярном весе), показал возможность модификаций путем фосфорилирования (на основании выявленного снижения показателя pI). Последовательность человеческой альфа-енолазы содержит несколько остатков тирозина, серина и треонина, которые являются потенциальными мишенями для фосфорилирования различными киназами. Эта гипотеза была протестирована путем экспозиции белкового экстракта с фосфатазой, характеризующейся широким диапазоном активности, перед разделением в 2-DE, с тем чтобы определить, выявляются ли какие-либо изменения в интенсивности пятен с использованием независимых от фосфорилирования антител, как это было описано для других белков (Kumar Y. et al., 2004). Фактически, интенсивность пя- 12016731 тен ENOA, соответствующих самым кислым изоформам (которыми являются PDA-ассоциированныеENOA 1/2 и ENOA изоформа 3; табл. II), четко снижается в клеточных экстрактах CF-PAC-1 при их предварительной обработке фосфатазой. Кроме того, масс-спектрометрический анализ ENOA изоформы 3 (более распространенной, чем ENOA 1/2) показывает, что остатки 55, 57, 200, 236, 237, 257 и 419 фосфорилированы в этой изоформе (фиг. 4). В предшествующих работах по фосфорилированию альфа-енолазы in vivo или in vitro (Cooper J. etH. et al., 2007) не указывалось, что, например, в целом, по меньшей мере три специфических остатка могут быть одновременно фосфорилированы и что, в частности, остатки 55, 57, 200, 236, 237, 257 и 419 могут быть выявлены в изоформах ENOA в фосфорилированном состоянии. Кроме того, сочетание фосфорилированных остатков в ENOA изоформе 3 трудно прогнозировать в рамках компьютеризированного анализа белковой последовательности ENOA из-за большого числа возможных сайтов для фосфорилирования (фиг. 4). Однако нельзя исключать возможность того, что ENOA изоформа 3 может содержать дополнительные сайты, не выявляемые на данной стадии масс-спектрометрическим анализом, но ENOA 1/2 должна содержать модифицированные в посттрансляционном режиме остатки (вероятнее всего, также фосфорилированные, что следует из значения pI и результатов обработки фосфатазой), которые будут отличать ее от ENOA изоформы 3. Следует также отметить, что более чем один из пептидов, полученных из ENOA изоформы 3, для которых определялось наличие фосфорилирования и которые содержат возможные сайты фосфорилирования, не демонстрируют такой модификации. Так, например, тирозин 44, специфически идентифицированный, по имеющимся в литературе сообщениям, как фосфорилированный в установленной лейкозной линии T-клеток (Rush J. et al., 2005), не был выявлен в фосфорилированном состоянии в ENOA изоформе 3. Аналогично, остаток 57 был идентифицирован как фосфорилированный в сочетании с остатком 63(Molina H. et al., 2007), но не с остатком 55, как в ENOA изсформе 3 (фиг. 4). Последующий анализ фосфорилирования изоформ ENOA был проведен с использованием PDAсывороток и ENOA-специфических антител при сравнении снимков, полученных по процедуре вестернблоттинга, со снимками, сделанными в 2-DE геле с использованием красителей на суммарный белок (окрашивание серебром или красителем Sypro Ruby) или специфического окрашивания на фосфопротеины(Pro-Q Diamond). Результаты указанного анализа подтвердили, что только ENOA 1/2 и 3 фосфорилируются в клетках CF-PAC-1 (фиг. 5A; табл. II). Экспрессия ENOA была протестирована по процедуре вестерн-блоттинга с использованием тканей,полученных от пациентов с PDA после хирургии (стадия II; n=7), и нормальной панкреатической ткани(n=1) с использованием антитела против енолазы, связывающегося со специфическим эпитопом, общим для всех шести изоформ, выявляемых в сыворотке пациентов с PDA. В шести из семи биопсийных образов от пациентов с PDA были выявлены все шесть изоформ ENOA, тогда как в нормальной панкреатической ткани четко выявлялись только четыре изоформы (ENOA 3, 4, 5 и 6) (фиг. 5B). Таким образом,можно сделать вывод, что только у пациентов с PDA образуются антитела против ENOA 1/2 и что также эти формы подвергаются в значительной мере суперэкспрессии в панкреатических тканях при PDA. Реактивность сывороток от пациентов с PDA против фосфорилированной ENOA далее исследовали с использованием экстрактов клеток CF-PAC-1 при проведении 2-DE и вестерн-блоттинга, с тем чтобы прояснить, направлена ли данная реактивность специфически против фосфорилированных изотопов. Поскольку сыворотки от пациентов с PDA взаимодействовали со всеми шестью изоформами, они могут содержать антитела, реактивные как с фосфорилированными, так и с нефосфорилированными эпитопами. В первой серии экспериментов сыворотки подвергают предварительной инкубации с рекомбинантной человеческой ENOA, которая не содержит фосфорилированных остатков, с тем чтобы посмотреть,будет ли экспозиция с ENOA антигенами менять способность сыворотки распознавать изофсрмы ENOA в эталонной панкретической клеточной линии. Фактически, 2-DE в рамках вестерн-блот анализа выявил,что в случае нефосфорилированной ENOA значительно снижается реактивность только для изоформ 3, 4,5 и 6, но не затрагивается реактивность ENOA 1/2 изоформ. Эти данные были подтверждены в другой серии экспериментов, где мембрану преинкубировали с фосфатазой (PP-аза), с тем чтобы показать, что исследуемые сыворотки пациентов содержат антитела, которые специфически реагируют с фосфорилированными изоформами ENOA 1/2. В отсутствие PP-азы исследуемые сыворотки распознавали все изоформы ENOA, тогда как PP-азная обработка заметно снижала реактивность сывороток с ENOA 1/2(фиг. 6). Тот факт, что моноклональное антитело против ENOA выявляется во всех изоформах, и в обработанных, и в необработанных мембранах (данные не приведены), указывает на то, что антитела в сыворотках от пациентов с PDA специфически взаимодействуют с фосфорилированными изоформами ENOA 1/2.- 13016731 Выводы. При использовании различных протеомических подходов было идентифицировано множество изоформ ENOA и антител против них (Adamus G. et al., 1998; Adamus G. et al., 1996; Akisawa N. et al., 1997;Ballot E. et al., 2003; Bryborn M. et al., 2005; Lubec G. et al., 2003; O'Dwyer D. et al., 2002). Однако в этих сообщениях не приводится четкого подтверждения наличия ассоциации между состоянием фосфорилирования и способностью к продукции аутоантител против специфических изоформ в ходе прогрессирования PDA. В других статьях приводятся данные об изменении интенсивности и/или числа выявляемых пятен,соответствующих альфа-енолазе, при использовании, например, вестерн-блоттинга в 2-DE гелях для анализа сывороток от пациентов, ассоциированных с конкретной обработкой клеток (Baty J. et al., 2005; Bottalico L. et al., 1993; Kanamoto T. et al., 2002) или с определенными заболеваниями (Byrjalsen I. et al., 1999;Clauser K. et al., 1995; Nakanishi T. et al., 2006; Tanaka Y. et al., 2006; US 20070172487), что, предположительно, указывает на вовлечение в процесс посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование. В других сообщениях человеческая альфа-енолаза рассматривается как один из нескольких белков,которые подвергаются суперэкспрессии в PDA-образцах при анализе с использованием 2-DE гелей, что подтверждается на уровне мРНК и результатами иммуногистохимического анализа, однако в указанных работах не рассматривается фосфорилирование, как специфическая модификация, характеризующая изоформы альфа-енолазы, ассоциированные с PDA (WO 04/55548; Shen J. et al., 2004; Nakanishi T. et al.,2006; Mikuriya K. et al., 2007). Среди большого числа посттрансляционных модификаций, выявленных в альфа-енолазе (табл. III),фосфорилирование представляет собой такую модификацию, которая была выявлена как in vivo, так и invitro, согласно приведенным ранее сообщениям (Cooper J. et al., 1984; Coussens P. et al., 1985; EigenbrodtE. et al., 1983; Golden A. et al., 1986). Однако в последнее время были обнаружены две фосфорилированные изоформы альфа-енолазы при использовании 2D-гелей и коммерчески доступного антитела против фосфотирозина (клон 4G10, код 05-321; Biomol), а также при масс-спектометрическом анализе, в тромбоцитах человека (Marcus K. et al., 2000). Один фосфорилированный вариант альфа-енолазы был обнаружен в клетках, обработанных TGFbeta 1 (клеточная линия MCF-7), с использованием 2D-гелей, радиоактивной метки и масс-спектрометрии (Stasyk T. et al., 2005) или в клетках MIAPaCa (клеточная линия рака поджелудочной железы), где фосфорилирование енолазы снижалось после обработки флавоноидами(Lee L. et al., 2002). Кроме того, два сайта фосфорилирования локализованы в тирозиновых остатках (44 и 286; Rush J. et al., 2005) или в остатках тирозина и серина (57 и 63; Molina H. et al., 2007). Однако ни в одном из этих документов не указывается о наличии ассоциации PDA с дополнительным фосфорилированием изоформ альфа-енолазы, которая уже была фосфорилирована по меньшей мере в трех положениях, а также не рассматриваются в этом контексте связывающие их антитела. Пример 3. Эффекты антител, связывающихся с альфа-енолазой, на рост и пролиферацию трансформированных клеточных линий, экспрессирующих фосфорилированные изоформы альфа-енолазы. Материалы и методы. Тест на пролиферацию клеточных линий. Тест in vitro на клеточную пролиферацию проводят с использованием указанных клеточных линий при высеве 2-10103 клеток/ячейку в 96-ячеечных микропланшетах в полной культуральной среде для клеток (RPMI-1640 с добавкой 10% фетальной сыворотки теленка), при наличии или в отсутствие моноклонального антитела против альфа-енолазы 72/1 (Moscato S. et al., 2000) или мышиного IgG1 изотипа,соответствующего контрольного моноклональному антителу (RD Systems), используемого в качестве отрицательного контроля. Через 44 или 68 ч к каждой ячейке добавляют 20 мкл раствора метилтетразолия (МТТ; 5 мг/мл) и все выдерживают еще в течение 4 ч при температуре 37C. Затем среду отбирают и клетки растворяют в ДМСО. Планшеты анализируют, определяя на спектрофотометре поглощение при длине волны 540 нм. Результаты. Эффекты антитела против альфа-енолазы на рост клеточных линий, демонстрирующих разный профиль экспрессии альфа-енолазы, по данным анализа в 2-DE и вестерн-блоттинга, тестируют при измерении уровня включения MTT, соединения, которое включается в жизнеспособные клетки и коррелирует с активным клеточным ростом, метаболизмом и пролиферацией. С использованием колориметрического теста, основанного на оценке включения MTT, было продемонстрировано выраженное ингибирование клеточной пролиферации в трансформированных клеточных линиях, которые экспрессируют все шесть изоформ, независимо от их происхождения, панкреатического или из другого источника, отличного от поджелудочной железы. Показано, что в случае использования контрольного моноклонального антитела, соответствующего IgG1 изотипу, или клеточной линии, не экспрессирующей указанные три фосфорилированные изоформы ENOA, эффект является минимальным- 14016731 Таким образом, анти-альфа-енолазные антитела способны ингибировать (по меньшей мере, частично) рост и пролиферацию клеточных линий, характеризующихся специфическим профилем фосфорилирования альфа-енолазы, выявляемой в PDA-ассоциированных биологических образцах (таких как сыворотки или биопсийные ткани). Выводы. альфа-енолаза, несмотря на то что она считается цитоплазматическим белком, может экспрессироваться в виде биологически активного белка на поверхности клеток (Arza B. et al., 1997; Bergman A. et al.,1997; Moscato S. et al. 2000; Lopez-Alemany R. et al., 2003), а также в виде растворимого фактора (Babu J.et al., 2002; Demir A. et al., 2005). Данные тестирования in vitro показывают, что рост трансформированных клеточных линий замедляется при связывании антител с эпитопами, присутствующими в изоформах альфа-енолазы, экспрессируемых во внеклеточном пространстве (в виде рецептора клеточной поверхности и/или в виде растворимого белка), только в том случае, если клеточные линии экспрессируют фосфорилированные изоформы альфа-енолазы. Таким образом, моноклональное антитело, которое специфически связывается с клетками, презентирующими фосфорилированные изоформы альфа-енолазы, может ингибировать пролиферацию трансформированных клеточных линий. Указанный механизм контроля клеточной пролиферации функционирует, по всей видимости, не только при PDA, но также в случае других видов рака, демонстрирующих такие молекулярные характеристики, и может рассматриваться за счет действия соответствующих моноклональных антител в контексте терапевтического применения в случае рака, такого как изготовление лекарственных средств для лечения PDA и способы диагностики и лечения пациентов с PDA. Таблица I Белки, распознаваемые сыворотками от пациентов с PDA как антигеныa Определены при окрашивании серебром и по процедуре вестерн-блоттинга в 2-DE гелях как PDA-специфические (см. положение пятен с соответствующими номерами, показанное на фиг. 1B).b Вестерн-блоттинг проводят с антителами, специфичными для каждого белка. Интенсивность линий, указывающих реактивность, выражена в произвольных единицах нормализованной интенсивности линий (среднее значение результатов трех экспериментовSEM).c Статистическую значимость нормализованной интенсивности линий для выбранных белков оценивают с использованием парного двустороннего критерия Стьюдента.- 15016731 Таблица II Идентификация изоформ ENOA, распознаваемых сыворотками от пациентов с PDAc Суммарный балльный показатель для ионов от всех недуплицированных пептидов. Таблица III Выбранные литературные данные, относящиеся к описанию посттрансляционных модификаций альфа-енолазы, кроме фосфорилирования ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Изоформа человеческой альфа-енолазы, отличающаяся тем, что она имеет SEQ ID NO: 1 и фосфорилирована по меньшей мере в 3 положениях, выбранных из треонина 55, тирозина 57, тирозина 200,тирозина 236, треонина 237, тирозина 257 и серина 419. 2. Антитело, которое специфически связывается с изоформой альфа-енолазы по п.1. 3. Антитело по п.2, отличающееся тем, что оно представляет собой моноклональное антитело или фрагмент антитела. 4. Антитело по п.2 или 3, отличающееся тем, что оно слито или конъюгировано с молекулой, содержащей выявляемую метку. 5. Применение изоформы человеческой альфа-енолазы по п.1 или антитела по пп.2-4 для диагностики аденокарциномы панкреатического протока. 6. Способы диагностики аденокарциномы панкреатического протока (PDA), включающие детекцию изоформы человеческой альфа-енолазы по п.1 и/или детекцию антитела по пп.2-4. 7. Наборы для диагностики аденокарциномы панкреатического протока (PDA), включающие изоформу человеческой альфа-енолазы по п.1 и/или антитело по пп.2-4. 8. Применение антитела по пп.2-4 для получения фармацевтических композиций для лечения аденокарциномы панкреатического протока. 9. Фармацевтическая композиция для лечения аденокарциномы панкреатического протока, включающая антитело по пп.2-4.