Композиции 24-c-метилтрансферазы стерина leishmania для профилактики, лечения и диагностики лейшманиоза

(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ИНФЕКШЕС ДИЗИЗ РИСЕРЧ ИНСТИТЬЮТ (US) Предпосылки изобретения Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение в целом относится к композициям для профилактики, лечения и выявления лейшманиоза у пациентов. Предпочтительнее изобретение относится к композициям, содержащим полипептиды 24-с-метилтрансферазы стерина Leishmania (SMT), к слитым полипептидам, а также к полинуклеотидам, кодирующим такие полипептиды и слитые полипептиды. Уровень техники Лейшманиоз человека представляет собой спектр заболеваний, вызванных простейшими паразитами рода Leishmania. Лейшманиозы приблизительно классифицируют на три типа заболеваний: кожный лейшманиоз (CL), лейшманиоз слизистых оболочек (ML) и висцеральный лейшманиоз (VL), в соответствии с клиническими проявлениями. Висцеральный лейшманиоз, как правило, вызываемый видами комплекса L. donovani, т.е. L. donovani и L. Infantum (chagasi), представляет собой наиболее тяжелую форму ежегодно регистрируемых новых случаев, количество которых составляет приблизительно 500000 (информация Всемирной Организации Здравоохранения: www.who.int/leishmaniasis/en/). Активный VL характеризуется патологией системы крови, а также патологией печени и селезенки и, при отсутствии правильного лечения, как правило, заканчивается смертью. Паразиты Leishmania передаются укусами мошек, и инфицирующие промастиготы дифференцируются и реплицируются в виде амастигот внутрь макрофагов млекопитающего-хозяина. Как в случае других внутриклеточных патогенных микроорганизмов, клеточные иммунные ответы играют главную роль для защиты против лейшманиоза. Иммунные ответы Th1 играют важную роль в опосредовании защиты против Leishmania, включая роль CD4+ и CD8+ T-клеток, IFN-, IL-12, TNF- и NO, учитывая информацию об ингибирующих эффектах IL-10 и TGF- (Engwerda et al. (1998), Eur. J. Immunol. 28:669-680; Murphy et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:2848-2856; Murray and Nathan. (1999), J. Exp. Med 189:741-746;Stern et al. (1988), J. Immunol. 140:3971-3977; и Wilson et al. (1998), J. Immunol. 161:6148-6155). Иммунизацию против лейшманиоза на экспериментальных моделях у животных можно осуществить доставкой кодирующих антиген ДНК векторов (Gurunathan et al. (1997), J. Exp Med 186:1137-1147; Piedrafita et al.(1999), J. Immunol. 163:1467-1472; и Mendez et al. (2001), J. Immunol. 166:5122-5128) или введением композиций белков и индуцирующих Th1 адъювантов, включая IL-12 (Afonso et al. (1994), Science 263:235237; Stobie et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:8427-8432; и Kenney et al. (1999), J. Immunol. 163:4481-4488), или лигандов TLR, таких как олигонуклеотиды CpG (Rhee et al. (2002), J. Exp. Med. 195:1565-1573; Stacey and Blackwell. (1999), Infect Immun. 67:3719-3726; и Walker et al. (1999), Proc. Natl.Acad. Sci. USA 96:6970-6975) и монофосфориловый липид A (Coler et al. (2002), Infect. Immun. 70:42154225 и Skeiky et al. (2002), Vaccine 20:3292-3303). Несмотря на данные о том, что субъединичные вакцины могут быть эффективны на моделях VL(2001), Vaccine 20:59-66; Wilson et al. (1995), Infect Immun. 63:2062-2069; Tewary et al. (2005), J. Infect Dis 191:2130-2137; Aguilar-Be et al. (2005), Infect Immun. 73:812-819; и Rafati et al. (2006), Vaccine 24:21692175), не было достигнуто прогресса в отношении определения кандидатов на роль настоящего антигена,эффективного против VL in vivo. Несколько антигенов L. infantum были идентифицированы серологическим скринингом с использованием сывороток, полученных из хомячков, инфицированных L. infantum(Goto et al. (2006), Infect. Immun. 74:3939-3944). 24-с-Метилтрансфераза стерина (SMT), один из известных активных антигенов, представляет собой фермент, участвующий в биосинтезе эргостерина, который представляет собой молекулу-мишень для лейшманицидного и фунгицидного амфотерицина В (Pourshafie et al. (2004), Antimicrob Agents Chemother 48:2409-2414). Амфотерицин В оказывается селективную киллирующую активность в отношении некоторых простейших паразитов и грибов, но эргостерин не обнаружен в клетках млекопитающих. Аналогичным образом, SMT был найден у некоторых паразитов,грибов и растений, но отсутствует у млекопитающих. Стратегии с использованием вакцин, состоящих из цельных организмов, для профилактики или лечения лейшманиоза, были неэффективны у людей. Соответственно остается существенная потребность в иммуногенных композициях и вакцинах, которые могут быть эффективны для профилактики и/или лечения лейшманиоза у людей и других млекопитающих (например, собак). Настоящее изобретение удовлетворяет эти потребности и имеет другие связанные с этим преимущества. Сущность изобретения Коротко, настоящее изобретение относится к композициям и способам профилактики, лечения и выявления лейшманиоза. В одном из аспектов в композициях по изобретению используются полипептиды, содержащие, по меньшей мере, иммуногенную часть полипептида 24-с-метилтрансферазыLeishmama (SMT), или ее вариант, где часть или вариант сохраняет желательные иммуногенные свойства полноразмерного полипептида SMT. В конкретном варианте осуществления полипептид SMT Leishmania содержит аминокислотную последовательность полипептида SMT L. donovani, L. infantum, L. major илиL. braziliensis. В еще одном специфичном варианте осуществления полипептид SMT содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1, 3, 5 или 11. В другом аспекте изобретение относится к композициям, содержащим полинуклеотиды, кодирующие указанные выше полипептиды, а также к рекомбинантным векторам экспрессии, содержащим эти полинуклеотидные последовательности, и к клеткам-хозяевам, трансформированным или трансфецированным такими векторами экспрессии. В конкретном варианте осуществления полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид SMT L. donovani, L. infantum, L.major или L. braziliensis. В другом специфическом варианте осуществления полинуклеотид SMT содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную как SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 12. В другом аспекте настоящее изобретение относится к слитому полипептиду, содержащему, по меньшей мере, иммуногенную часть антигена SMT Lelshmania, дополнительно содержащему один или более гетерологичных партнеров слияния. В соответствующем аспекте изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим такие слитые белки. В еще одном аспекте изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат один или более полипептидов и/или слитых полипептидов, раскрытых в настоящем изобретении, или полинуклеотид, кодирующий такие полипептиды, в сочетании с физиологически приемлемым носителем. В другом аспекте изобретение относится к композициям вакцин, которые содержат один или более полипептидов и/или слитых полипептидов, раскрытых в настоящем изобретении, или полинуклеотид,кодирующий такие полипептиды, в сочетании с иммуностимулятором. В конкретном варианте осуществления иммуностимулятор представляет собой адъювант, который преимущественного индуцирует иммунный ответ типа Th1. В другом аспекте изобретение относится к способам стимуляции клеточного и/или гуморального иммунного ответа у пациента, включающим введение пациенту описанной выше фармацевтической композиции или вакцины. В другом аспекте изобретение относится к способам индукции защитного иммунитета против лейшманиоза у пациента, включающим введение пациенту описанной выше фармацевтической композиции или вакцины. В соответствующем аспекте изобретение относится к способам лечения пациента, пораженного лейшманиозом, включающим введение пациенту описанной выше фармацевтической композиции или вакцины. Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут очевидны из следующего подробного описания и прилагаемых чертежей. Все ссылки, указанные в настоящем описании, включены в него в качестве ссылки в полном объеме, как если бы каждая из них была включена самостоятельно. Краткое описание чертежей На фиг. 1 А, 1 В показано выравнивание аминокислотных последовательностей SMT L. infantum(SEQ ID NO: 1), L. donovani (SEQ ID NO: 3), L. major (SEQ ID NO: 5), T. cruzi (SEQ ID NO: 7) и L. braziliensis (SEQ ID NO: 11), как вычислено из их соответствующих последовательностей ДНК. Остатки,совпадающие с SMT L. Infantum, показаны в рамках. На фиг. 2 показаны SDS/4-20% полиакриламидные гели, окрашенные Кумасси синим, не индуцированных лизатов Е.coli (полоса 1), индуцированных лизатов (полоса 2) и очищенных SMT L. infantum (полоса 3). Размеры показаны в кДа слева. На фиг. 3 показана экспрессия SMT проматиготами L. donovani (Ld), L. infantum (Li) и L. major(Lm). На фиг. 4 показаны реакции антител пациентов с VL на SMT. А и В: в сыворотках пациентов с VL(n=21), пациентов с болезнью Чагаса (Cha: n=10), эндемических здоровых контролей (ЕС: n=10) и не эндемических здоровых доноров (n=6) тестировали реактивность общего IgG на rK39 (A) rSMT (В), используя ELISA, и для каждого индивида показаны величины OD (оптической плотности). Полосы представляют средние величины каждой группы. С и D: показана реактивность подкласса IgG пациентов сVL (n=21) и эндемических здоровых контролей (n=3) на rK39 (С) и rSMT (D). Показаны средние величины и SEM (стандартная ошибка средней) каждой группы. На фиг. 5 показаны реакции антител иммунизированных мышей на SMT. Уровни анти-SMT IgG1 иIgG2a мышей, которым инокулировали физиологический раствор, только MPL-SE, только rSMT или ны OD 0,1 в качестве границы. В группе было три мыши и показаны средние величины и SEM конечных титров каждой группы. На фиг. 6 показана продукция цитокина иммунизированными мышами при стимуляции лейшманиевыми антигенами. Клетки селезенки мышей, которым вводили только физиологический раствор,только MPL-SE, только SMT или SMT плюс MPL-SE, стимулировали in vitro одной средой, конкавалином A, rSMT или SLA. Супернатанты культур собирали после 72 ч стимуляции, и уровни IFN- (А) и IL10 (В) в супернатантах измеряли сандвич ELISA. На вставке показаны реакции IFN- при стимуляцииSLA с использованием другой шкалы. Показана средняя величина и SEM трех мышей в каждой группе. На фиг. 7 показаны результаты проточного цитометрического анализа SMT-специфических Tклеток. (А) Характерные данные проточной цитометрии. (В) Продукция TNF-, IL-2 и IFN- T-клеткамиCD4+ и CD8+ в ответ на SMT. Клетки селезенки мышей, которым вводили физиологический раствор,только MPL-SE, только rSMT и rSMT плюс MPL-SE, инкубировали только со средой или в присутствииrSMT, и продукцию цитокина анализировали проточной цитометрией. (С) Анализ одиночных T-клетокCD4+ (слева) и CD8+ (справа), продуцирующих множественные цитокины типа Th1. На фиг. 8 показана защита против инфекции L. infantum при иммунизации SMT. Мышам после введения физиологического раствора, MPL-SE или rSMT + MPL-SE проводили контрольное заражениеL. infantum, и количества паразитов в селезенке (А) и печени (В) измеряли через 4 недели после инфекции. Показаны средние величины и SEM пяти мышей в каждой группе. P0,05 и p0,01 непарным tкритерием сравнивали и с группой, получавшей физиологический раствор, и группой, получавшейMPL-SE. Это характерный пример трех независимых экспериментов с аналогичными результатами. На фиг. 9 показана защита против инфекции L. major при иммунизации SMT. У мышей, которым вводили физиологический раствор или rSMT + MPL-SE, проводили контрольное заражение L. major в ухо. (А) Развитие повреждения в участке инфекции контролировали в течение восьми недель. Показаны средние величины и SEM пяти мышей в каждой группе. (В) Через 8 недель после инфекции количество паразитов в инфицированных ушах оценивали анализом ограничивающего разведения. Полосы представляют средние величины отдельных групп. Этот эксперимент является характерным для трех независимых экспериментов с аналогичными результатами. Описание идентификаторов последовательностейSEQ ID NO: 1 представляет аминокислотную последовательность 24-с-метилтрансферазы стеринаSEQ ID NO: 2 представляет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептидSEQ ID NO: 3 представляет аминокислотную последовательность 24-с-метилтрансферазы стеринаSEQ ID NO: 4 представляет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептидSEQ ID NO: 5 представляет аминокислотную последовательность 24-с-метилтрансферазы стеринаSEQ ID NO: 6 представляет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептидSEQ ID NO: 7 представляет аминокислотную последовательность 24-с-метилтрансферазы стеринаSEQ ID NO: 8 представляет аминокислотную последовательность 24-с-метилтрансферазы стеринаSEQ ID NO: 9-10 представляют затравки, используемые для амплификации открытой рамки считывания из SMT L. infantum.SEQ ID NO: 11 представляет аминокислотную последовательность 24-с-метилтрансферазы стеринаSEQ ID NO: 12 представляет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид Подробное описание изобретения Как отмечено выше, настоящее изобретение в целом относится к композиции и способам профилактики, лечения и выявления лейшманиоза. Композиции по изобретению включают, например, полипептиды, которые содержат, по меньшей мере, иммуногенную часть полипептида 24-сметилтрансферазы стерина (SMT) Leishmania или вариант такого полипептида, где часть или вариант сохраняют, по существу, такие же или аналогичные иммуногенные свойства, как и полноразмерный полипептид SMT. Как продемонстрировано ниже в настоящем описании, подходы иммунизации с использованием композиций по изобретению обеспечивают значительную защиту in vivo против L. infantum,возбудителя VL у людей и собак. Кроме того, профилактический эффект, достигаемый при применении композиций по изобретению, имеет существенные усовершенствования и преимущества по сравнению с ранее известными вакцинными стратегиями. Используемый в настоящем описании термин "полипептид" включает аминокислотные цепи любой длины, включая полноразмерные белки, в которых аминокислотные остатки соединены ковалентными связями. Полипептид, содержащий иммуногенную часть полипептида SMT, может состоять исключительно из иммуногенной части, может содержать две или более иммуногенные части и/или может содержать дополнительные последовательности. Дополнительные последовательности могут быть получены из полипептида SMT нативной Leishmania или они могут быть гетерологичными, и такие гетерологичные последовательности могут (но не обязательно) быть иммуногенными. Иммуногенная часть полипептида SMT Leishmania представляет собой часть, которая способна индуцировать иммунный ответ (т.е. клеточный и/или гуморальный) у пациента, в настоящее время или ранее инфицированного Leishmania (такого как человек или собака), и/или в культурах клеток лимфоузлов или мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученных у индивидуумов, в настоящее время или ранее инфицированных Leishmania. Клетки, в которых индуцирована реакция, могут содержать смесь типов клеток или могут содержать выделенные клеточные компоненты (включая без ограничения T-клетки, NK клетки (натуральные киллеры), макрофаги, моноциты и/или В клетки). В конкретном варианте осуществления иммуногенные части способны вызывать пролиферацию T-клеток и/или главным образом реакцию цитокина типа Th1 (например, продукцию IL-2, IFN- и/или TNF- T-клетками и/или NK клетками; и/или продукцию IL-12 моноцитами, макрофагами и/или В клетками). Иммуногенные части антигенов, описанных в настоящем патенте, могут быть, как правило, идентифицированы с использованием методик, известных средним специалистам в данной области, включая способы, представленные в настоящем описании в качестве примеров. Иммуногенные части полипептида SMT могут быть, по существу, любой длины при условии, что они сохраняют одну или несколько из иммуногенных областей SMT, которые ответственны и/или вносят вклад в защиту in vivo, обеспечиваемую против лейшманиоза полноразмерным полипептидом SMT, как описано в настоящем патенте. В одном из вариантов осуществления способность иммуногенной части взаимодействовать с антигенспецифическими антисыворотками может быть усилена или неизменна по сравнению с нативным белком или может быть снижена менее чем на 50%, а предпочтительно менее чем на 20% по сравнению с нативным белком. Примерами таких частей являются части предпочтительно с длиной по меньшей мере 10, 15, 25, 50 или 100 аминокислот или более длины полноразмерного полипептида SMT включительно. В конкретном варианте осуществления иммуногенная часть полипептида SMT способна обеспечить защиту, например, в описанном в настоящем патенте анализе in vivo против видовLeishmania комплекса L. donovani, т.е. L. donovani и/или L. infantum, которые известны как возбудителиVL у людей и собак. Композиции и способы по настоящему изобретению также включают варианты указанных выше полипептидов. Используемый в настоящем описании термин "вариант" полипептида представляет собой полипептид, который отличается от нативного белка одной или более заменой, делециями, добавлениями и/или вставками, так, чтобы желательная иммуногенность вариантного полипептида по сравнению с нативным полипептидом SMT не снижалась. В одном из вариантов осуществления способность варианта взаимодействовать с антиген-специфическими антисыворотками может быть повышена или оставаться неизменной по сравнению с нативным белком или может быть снижена менее чем на 50%, а предпочтительно менее чем на 20% по сравнению с нативным белком. В конкретном варианте осуществления вариант полипептида SMT представляет собой вариант, способный обеспечить защиту, например, в анализе in vivo, как описано в настоящем патенте, против видов Leishmania комплекса L. donovani, т.е. L. donovani и/или L. infantum. Варианты могут быть идентифицированы модификацией одной из указанных выше полипептидных последовательностей и оценкой реактивности модифицированного полипептида антигенспецифическими антителами или антисыворотками, как описано в настоящем патенте, или проведением анализа защиты in vivo, как описано в настоящем изобретении. Варианты полипептида, как правило, включают в себя варианты, которые по меньшей мере примерно на 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более (например, как определено в соответствии с описанным ниже) идентичны полипептиду SMT, описанному в настоящем патенте. В определенных вариантах осуществления вариант содержит консервативные замены. "Консерва-4 017958 тивная замена" представляет собой замену аминокислоты на другую аминокислоту с аналогичными свойствами, так чтобы специалист в области пептидной химии мог ожидать, что вторичная структура и гидропатическая природа полипептида, по существу, сохранятся неизменными. Аминокислотные замены могут в целом проводиться на основании подобия полярности, заряда, растворимости, гидрофобности,гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; аминокислоты с незаряженными полярными головными группами,имеющими одинаковые величины гидрофильности, включают лейцин, изолейцин и валин; глицин и аланин; аспарагин и глутамин; серин, треонин, фенилалнин и тирозин. Другие группы аминокислот, которые могут представлять консервативные изменения, включают: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr;(2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his и (5) phe, tyr, trp, his. Вариант может также,или альтернативно, содержать неконсервативные изменения. В конкретном варианте осуществления вариантные полипептиды отличаются от нативной последовательности заменой, делецией или добавлением пяти или менее аминокислот. Варианты могут также (или альтернативно) могут быть модифицированы, например, делецией или добавлением аминокислот, которые оказывают минимальное влияние на иммуногенность, вторичную структуру и гидропатическую природу полипептида. Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, которая кодирует белок или его часть) или может содержать вариант или биологический или антигенный функциональный эквивалент такой последовательности. Варианты полинуклеотида могут содержать одну или более замен, добавлений, делеций и/или вставок, как далее описано ниже, предпочтительно, с тем, чтобы, по существу, не уменьшалась иммуногенность кодируемого полипептида относительно нативного опухолевого белка. Воздействие на иммуногенность кодируемого полипептида может в целом оцениваться, как описано в настоящем патенте. При сравнении полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, две последовательности считаются "идентичными", если последовательность нуклеотидов или аминокислот у двух последовательностей одинакова при выравнивании для максимального соответствия, как описано ниже. Сравнения двух последовательностей обычно выполняются сравнением последовательностей в окне сравнения для идентификации и сравнения локальных областей подобия последовательностей. Используемый в настоящем описании термин "окно сравнения" относится к отрезку, состоящему по меньшей мере примерно из 20 соседних положений, обычно от 30 до примерно 75, от 40 до примерно 50, в котором последовательность можно сравнить с эталонной последовательностью такого же числа соседних положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Выравнивание последовательностей для сравнения может проводиться с использованием, например, программы Megalign в комплекте Lasergene биоинформационных программных обеспечений(DNASTAR, Inc., Madison, WI) с использованием параметров по умолчанию. Эта программа осуществляет несколько схем выравнивания, описанных в следующих ссылках: Dayhoff, M.О. (1978), A model ofUSA 80:726-730. Альтернативно, выравнивание последовательностей для сравнения может проводиться алгоритмом локальной идентичности Smith and Waterman (1981), Add. APL Math 2:482, алгоритм выравнивания идентичности Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443, поиском способов подобия Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, компьютеризированными осуществлениями этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), или проверкой. Одним из примеров алгоритмов, которые подходят для определения идентичности последовательностей в процентах, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны соответственно в публикациях Altschul et al. (1977), Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 и Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403410. Алгоритмы BLAST и BLAST 2.0 можно использовать, например, с параметрами, описанными в настоящем патенте, для определения идентичности последовательностей в процентах для полинуклеотидов и полипептидов по изобретению. Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации. В одном из иллюстративных примеров суммарные оценки могут быть рассчитаны с использованием для нуклеотидных последовательностей параметров М (премия пары совместимых остатков; всегда 0) и N (штраф несовместимых остатков; всегда 0). Для аминокислотных последовательностей матрицу балльной оценки можно использовать для расчета суммарной балльной оценки. Удлинение "слова" в каждом направлении прекращается,если суммарная балльная оценка выравнивания попадает на величину X максимальной достигнутой ве-5 017958 личины; суммарная балльная оценка доходит до нуля или ниже из-за накопления одного или более отрицательных балльных оценок при выравнивании; или достигается конец любой последовательности. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) используются в качестве величин по умолчанию длина волн (W) 11, ожидание (Е) 10 и выравнивания матрицы балльной оценки BLOSUM62 (см.Henikoff and Henikoff (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915), (B) 50, ожидание (Е) 10, M=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Предпочтительно "процент идентичности последовательностей" определяется путем сравнения двух оптимально выравненных последовательностей по окну сравнения по меньшей мере 20 положений,где часть полинуклеотида или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) 20% или менее, обычно от 5 до 15% или от 10 до 12% по сравнению с эталонными последовательностями (которые не содержат добавления или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процентная доля рассчитывается определением числа положений, в которых идентичные основания нуклеиновой кислоты или аминокислотные остатки встречаются в обеих последовательностях, для получения числа выдержавших сравнение положений, путем деления числа выдержавших сравнение положений на общее число положений в эталонной последовательности(т.е. размер окна) и умножением результатов на 100 для получения процента идентичности последовательностей. Таким образом, настоящее изобретение относится к полинуклеотидным и полипептидным последовательностям, имеющим существенную идентичность с последовательностями, описанными в настоящем описании, например, последовательностям, которые идентичны последовательности по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% или выше полинуклеотидным или полипептидным последовательностям по настоящему изобретению, с использованием способов, описанных в настоящем патенте(например, анализом BLAST с использованием стандартных параметров, как описано ниже). Специалисту в данной области понятно, что эти величины могут быть соответствующим образом доведены для определения соответствующей идентичности белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, путем учета вырожденности кодона, подобия аминокислот, расположения рамки считывания и тому подобных параметров. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам и полипептидам, содержащим различные длины соседних отрезков последовательности,идентичных или комплементарных одной или более последовательностям, раскрытых в настоящем описании. Например, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, которые содержат по меньшей мере 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 или 1000 или более соседних нуклеотидов одной или более последовательностей, раскрытых в настоящем описании, а также имеют промежуточную длину. Очевидно, что термин "промежуточная длина" в настоящем контексте означает любую длину между указанными величинами, такую как 16, 17, 18, 19 и т.д.; 21, 22, 23 и т.д.; 30, 31, 32 и т.д.; 50, 51, 52, 53 и т.д.; 100, 101, 102, 103 и т.д.; 150, 151, 152, 153 и т.д.; включая все целые числа с 200 по 500; с 500 по 1000 и т.п. Полинуклеотиды по настоящему изобретению или их фрагменты, независимо от длины самой кодирующей последовательности, могут комбинироваться с другими последовательностями ДНК, такими как промотеры, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты рестрикционных ферментов, множественные сайты клонирования, другие кодирующие сегменты и т.п., так что их общая длина может значительно изменяться. Поэтому следует учесть, что может использоваться фрагмент нуклеиновой кислоты почти любой длины, причем общая длина предпочтительно ограничивается легкостью получения и использования в предполагаемой методике рекомбинантной ДНК. Например, следует учесть, что характерные сегменты ДНК с общей длиной примерно 10000, примерно 5000, примерно 3000, примерно 2000, примерно 1000, примерно 500, примерно 200, примерно 100, примерно 50 пар оснований и т.п.(включая все промежуточные длины) могут использоваться во многих вариантах осуществлениях настоящего изобретения. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, которые способны гибридизироваться в условиях умеренной жесткости с полинуклеотидной последовательностью, представленной в настоящем описании, или ее фрагментом, или ее комплементарной последовательностью. Методики гибридизации хорошо известны в области молекулярной биологии. В целях иллюстрации, подходящие умеренно жесткие условия для тестирования гибридизации полинуклеотида по настоящему изобретению с другими полинуклеотидами включают предварительное промывание в растворе 5SSC (раствора тринатрий цитрата и хлорида натрия), 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоты) (pH 8,0); гибридизация при 50-65C, 5SSC в течение ночи; с последующим двукратным промыванием при 65C в течение 20 мин с каждым из 2, 0,5 и 0,2SSC, содержащим 0,1%SDS. Кроме того, среднему специалисту в данной области понятно, что в результате вырожденности генетического кода существует большое число нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид, как описано в настоящем патенте. Некоторые из этих полинуклеотидов имеют минимальную гомологию с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Тем не менее, полинуклеотиды, которые применяются из-за различий использования кодона, предусмотрены настоящим изобретением. Кроме того, аллели генов, содержащих представленные в настоящем описании полинуклеотидные последовательности, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Аллели представляют собой эндогенные гены, которые изменены в результате одной или нескольких мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Полученные мРНК и белок могут, но необязательно,иметь измененную структуру или функцию. Аллели могут быть идентифицированы с использованием стандартных методик (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение с базой данных о последовательностях). В другом аспекте изобретение относится к слитым полипептидам, которые содержат, по меньшей мере, иммуногенную часть полипептида SMT, и, кроме того, содержат гетерологичный партнер слияния,а также полинцуклеотиды, кодирующие такие конденсированные полипептиды. Например, в одном из вариантов осуществления слитый полипептид содержит одну или более иммуногенных частей полипептида SMT и одну или более дополнительных иммуногенных последовательностей Leishmania, которые соединены через пептидную связь в одну аминокислотную цепь. В другом варианте осуществления слитый полипептид может содержать множественные антигенные эпитопы Leishmania, где по меньшей мере один из эпитопов происходит из полипептида SMT. Используемый в настоящем описании термин "эпитоп" представляет часть антигена, которая взаимодействует с образцами крови от индивидуумов, инфицированных Leishmania, т.е. эпитоп специфически связан одним или более антител и/или T-клетками,присутствующими в таких образцах крови. В другом варианте осуществления гетерологичный партнер слитой конструкции содержит последовательность, которая способствует обеспечению Т-хелперных эпитопов (иммунологического партнера слияния), предпочтительно Т-хелперных эпитопов, распознаваемых людьми, или которая содействует экспрессии белка (усилитель экспрессии) с более высоким выходом, чем нативный рекомбинантный белок. Определенные предпочтительные партнеры слитой конструкции включают как иммунологические,так и усиливающие экспрессию слитые партнеры. Другие слитые партнеры могут быть выбраны так,чтобы увеличить растворимость белка или обеспечить возможность нацеливания белка на желательные внутриклеточные компартменты. Другие партнеры слитой конструкции включают метки сродства, которые облегчают очистку белка. В пределах конкретного варианта осуществления иммунологический слитый партнер содержит последовательность, полученную из белка D, поверхностного белка грамотрицательной бактерии Haemophilus influenza В (WO 91/18926). Например, производное белка D содержит приблизительно первую треть белка (например, первые N-концевые 100-110 аминокислот) и производное белка D может быть липидировано. В пределах определенных вариантов осуществления первые 109 остатков партнера слитой конструкции липопротеина D включены на N-конце для предоставления полипептида с дополнительными экзогенными Т-клеточными эпитопами и для увеличения уровня экспрессии E.coli (таким образом, функционируя в качестве усилителя экспрессии). Липидный хвост обеспечивает оптимальную презентацию антигена антиген-презентирующим клеткам. Другие характерные партнеры слитой конструкции включают не структурный белок вируса гриппа, NS1 (гемагглютинин). Обычно, используют 81N-концевую аминокислоту, хотя также можно использовать другие фрагменты, которые включают Тхелперные эпитопы. В другом конкретном варианте осуществления иммунологический слитый партнер содержит аминокислотную последовательность, полученную из белка, известного как LYTA, или его части (предпочтительно, С-концевой части). LYTA получен из Streptococcus pneumoniae, которая синтезирует N-ацетилL-аланин-амидазу, известную как амидаза LYTA (кодируемая геном LytA; Gene (1986), 43:265-292).LYTA представляет собой аутолизин, который специфически разрушает определенные связи в основной цепи пептидогликана. С-концевой домен белка LYTA ответствен за сродство с холином или с некоторыми аналогами холина, такими как DEAE. Это свойство использовалось для создания плазмид, экспрессирующих C-LYTA E.coli, которые могут использоваться для экспрессии слитых белков. Была описана очистка гибридных белков, содержащих фрагмент C-LYTA на аминоконце (см. Biotechnology (1992),10:795-798). В пределах конкретного варианта осуществления часть повтора LYTA может быть включена в слитый белок. Часть повтора обнаруживается в С-концевой области, начиная с остатка 178. Более конкретная часть повтора включает остатки 188-305. Слитые последовательности могут быть соединены непосредственно (т.е. без промежуточных аминокислот) или могут быть соединены посредством линкерной последовательности (например, Gly-CysGly), которая значимо не уменьшает иммуногенные свойства компонентных полипептидов. Полипептиды, образующие конденсированный белок, представляют собой обычно С-конец, соединенный с Nконцом, С-конец с С-концом, N-конец с N-концом или N-конец с С-концом. Полипептиды слитого белка могут располагаться в любом порядке. Полипептиды слитой конструкции или слитые белки могут также включать консервативно модифицированные варианты, полиморфные варианты, аллели, мутанты, субпоследовательности, межвидовые гомологи и иммуногенные фрагменты антигенов, которые составляют слитый белок. Слитые полипептиды могут быть в целом получены с использованием стандартных методик, включая рекомбинантную технологию, рекомбинантных ДНК, химическое слияние и т.п. Например, последовательности ДНК, кодирующие полипептидные компоненты слияния, могут собираться отдельно и лигироваться в соответствующий вектор экспрессии. Конец 3' последовательности ДНК, кодирующей один полипептидный компонент, лигируется пептидным линкером или без него с концом 5' последовательности ДНК, кодирующей второй полипептидный компонент с тем, чтобы рамки считывания последовательностей находились в рамке. Это обеспечивает возможность трансляции в один слитый полипептид,который сохраняет биологическую активность компонентных полипептидов. Пептидная линкерная последовательность может использоваться для разделения компонентов слияния на расстояние, достаточное для того, чтобы каждый полипептид укладывался в желательные вторичные и/или третичные структуры. Такие пептидные линкерные последовательности могут быть включены в слитый полипептид с помощью стандартных методик, хорошо известных в данной области. Подходящие пептидные линкерные последовательности могут быть выбраны, например, на основании одного или более из следующих факторов: (1) их способности принять гибкую удлиненную конформацию; (2) их неспособности принять вторичную структуру, которая может взаимодействовать с функциональными эпитопами на первом и втором полипептидах; и (3) отсутствие гидрофобных или заряженных остатков, которые могут взаимодействовать с полипептидными функциональными эпитопами. Определенные предпочтительные пептидные линкерные последовательности содержат остатки Gly, Asn и Ser. В линкерной последовательности могут использоваться другие почти нейтральные аминокислоты, такие как Thr и Ala. Аминокислотные последовательности, которые могут эффективно использоваться в качестве линкеров, включают последовательности, которые описаны в публикациях Maratea et al. (1985),Gene 40:39-46; Murphy et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:8258-8262; патенте США 4935233 и патенте США 4751180. Длина линкерной последовательности в целом может составлять от 1 до примерно 50 аминокислот. Линкерные последовательности не требуются, если первый и второй полипептиды имеют области ненезаменимых N-концевых аминокислот, которые могут использоваться для разделения функциональных доменов и предотвращения стерического вмешательства. Лигированные последовательности ДНК функционально связаны с подходящими транскрипционными или трансляционными регуляторными элементами. Регуляторные элементы, ответственные за экспрессию ДНК, локализуются на конце 5' последовательности ДНК, кодирующей первые полипептиды. Аналогичным образом, терминирующие кодоны, требуемые для окончания трансляции, и сигналы терминации транскрипции присутствуют только на конце 3' последовательности ДНК, кодирующей второй полипептид. В целом, полипептиды и слитые полипептиды (а также их кодирующие полинуклеотиды) являются выделенными. "Выделенный" полипептид или полинуклеотид представляет собой полипептид или полинуклеотид, который выделен из первоначального окружения. Например, природный белок является выделенным, если он отделен от некоторых или всех сосуществующих материалов в природном окружении. Предпочтительно такие полипептиды имеют чистоту по меньшей мере 90%, предпочтительнее по меньшей мере чистоту 95%, а наиболее предпочтительно по меньшей мере чистоту 99%. Полинуклеотид считается выделенным, если, например, он клонирован в вектор, который не является частью естественной среды. Полипептиды и полинуклеотиды SMT Leishmania по изобретению могут быть получены с использованием любой процедуры и с использованием любого из разнообразных видов Leishmania, включая без ограничения, L. donovani, L. chagasi, L. infantum, L. major, L. amazonensls, L. braziliensis, L. panamensis, L.mexicana, L. tropica и L. guyanensis. Такие виды имеются, например, в Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), Rockville, MD. Независимо от способа получения полипептиды SMT, описанные в настоящем патенте, являются предпочтительно иммуногенными. Другими словами, полипептиды (и их иммуногенные части) способны вызывать иммунный ответ в культурах клеток лимфоузлов и мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), выделенных у индивидуумов, в настоящее время или ранее инфицированныхLeishmania. Конкретнее, антигены и их иммуногенные части способны вызвать T-клеточную пролиферацию и/или вызвать преобладающую цитокиновую реакцию типа Th1 (например, продукцию IL-2, IFNи/или TNF- T-клетками и/или NK клетками; и/или продукцию IL-12 моноцитами и/или В клетками) в клетках, выделенных у индивидуумов, в настоящее время или ранее инфицированных Leishmania. Индивидуум, инфицированный Leishmania, может быть поражен некоей формой лейшманиоза (такой как субклиническая, кожная, слизистая или активная висцеральная) или может иметь бессимптомную форму лейшманиоза. Такие индивидуумы могут быть идентифицированы с использованием способов, хорошо известных средним специалистам в данной области. Индивидуумы с лейшманиозом могут быть идентифицированы на основании клинических данных, связанных по меньшей мере с одним из следующих факторов: выделение паразита из поражений, положительная кожная проба с лизатом Leishmania или положительная серологическая проба. Бессимптомными индивидуумами являются инфицированные ин-8 017958 дивидуумы, у которых нет признаков или симптомов заболевания. Такие индивидуумы могут быть идентифицированы на основании положительной серологической пробы и/или кожной пробы с Leishmania. Термин "РВМС", который относится к препарату имеющих ядра клеток, состоящих, в первую очередь, из лимфоцитов и моноцитов, которые присутствуют в периферической крови, охватывает смеси клеток и препараты одного или более очищенных типов клеток. РВМС могут быть выделены центрифугированием по плотности через, например, Ficoll (Winthrop Laboratories, New York). Культуры лимфоузлов могут быть в целом получены иммунизацией мышей BALB/c (например, в подушечку задней лапы) промастиготами Leishmania, эмульгированными в полном адъюванте Фрейнда. Дренирующие лимфоузлы могут быть иссечены после иммунизации и T-клетки могут быть очищены в колонке антимышиного Ig для удаления В-клеток, а затем пропущены через колонку с Stphadex G10 для удаления макрофагов. Аналогичным образом, клетки лимфоузлов могут быть выделены у человека после биопсии или хирургического удаления лимфоузла. Способность полипептида SMT Leishmania или его части, варианта или продукта его слияния вызывать реакцию в культурах клеток РВМС или лимфоузлов можно оценить, например, контактом клеток с полипептидом и измерением подходящей реакции. В целом, 2105 клеток находится в диапазоне примерно от 10 нг до примерно 100 мкг, а предпочтительно составляет примерно 1-10 мкг. Инкубация полипептида с клетками обычно выполняется при 37C в течение примерно 1-3 дней. После инкубации с полипептидом, клетки анализируются для выявления соответствующей реакции. Если реакция представляет собой пролиферативную реакцию, то может использоваться любая из разнообразных методик, хорошо известных средним специалистам в данной области. Например, на клетки можно воздействовать импульсом радиоактивного тимидина и измерить включение метки в клеточную ДНК. В целом, полипептид,который приводит по меньшей мере к троекратному увеличению пролиферации выше фонового уровня(т.е. пролиферации, наблюдаемой для клеток, культивированных без полипептда), считается способным вызвать пролиферацию. Альтернативно, подлежащая измерению реакция может представлять собой секрецию одного или более цитокинов (такого как интерферон- (IFN-), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-12 (p70 и/илиp40), интерлейкин-2 (IL-2) и/или фактор опухолевого некроза- (TNF- или изменение уровня мРНК,кодирующей один или более специфических цитокинов. Например, секреция интерферона-, интерлейкина-2, фактора опухолевого некроза- и/или интерлейкина-12 указывает на реакцию Th1, который ответствен за защитный эффект против Leishmania. Анализы любого из указанных выше цитокинов могут в целом выполняться с использованием способов, известных среднему специалисту в данной области, таких как ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA). Подходящие антитела для использования в таких анализах могут быть получены из разнообразных источников, таких как Chemicon, Temucula, CA иPharMingen, San Diego, CA, и могут в целом использоваться в соответствии с инструкциями изготовителя. Уровень мРНК, кодирующей один или более специфических цитокинов, может оцениваться, например, амплификацией полимеразной реакцией синтеза цепи (PCR). В целом, полипептид, который способен в препарате примерно 1-3105 клеток вызвать продукцию 30 пкг/мл IL-12, IL-4, IFN-, TNF- или IL12 р 40 или 10 пкг/мл IL-12 р 70, считается способным стимулировать продукцию цитокина. Иммуногенные части полипептида SMT Leishmania могут быть получены и оценены с использованием хорошо известных методов, таких как методы, суммированные в публикации Paul, FundamentalImmunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993) и в приведенных в ней ссылках. Такие методики включают скрининг полипептидов, полученных из нативного антигена, для выявления иммуногенных свойств с использованием, например, характерных методик, описанных в настоящем патенте. Кроме экспрессии рекомбинантного полипептида полипептиды SMT, их части и варианты могут быть получены синтетическими или рекомбинантными средствами. Синтетические полипептиды,имеющие менее чем примерно 100 аминокислот, и в целом менее чем примерно 50 аминокислот, могут быть получены с использованием методик, хорошо известных средним специалистам в данной области. Например, такие полипептиды могут быть синтезированы с использованием любой из выпускаемой промышленностью твердофазных методик, таких как способ твердофазного синтеза Merrifield, где аминокислоты последовательно добавляются к растущей аминокислотной цепи; см. Merrifield (1963), J. Am.Chem. Soc. 85:2149-2146. Оборудование для автоматизированного синтеза полипептидов имеется в продаже от таких поставщиков, как Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA, и его работа может осуществляться в соответствии с инструкциями изготовителя. Рекомбинантные полипептиды, содержащие части и/или варианты нативного полипептида SMT,могут быть легко получены из последовательности ДНК, кодирующей антиген, с использованием хорошо известных и установленных методик. Например, супернатанты от подходящих систем хозяина/вектора, которые секретируют рекомбинантный белок, в культуральную среду, могут сначала концентрироваться с использованием имеющегося в продаже фильтра. После концентрации концентрат может наноситься на подходящую матрицу очистки, такую как матрица сродства или ионообменная смола. В целом, для экспрессии рекомбинантных полипептидов по настоящему изобретению может использоваться любой из разнообразия векторов экспрессии, известных среднему специалисту в данной области. Экспрессия может быть достигнута в любой из соответствующих клеток-хозяев, которые были трансформированы или трансфецированы вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, который кодирует рекомбинантный полипептид. Подходящие клетки-хозяева включают прокариотические,дрожжевые и высокоорганизованные эукариотические клетки. Предпочтительно используемыми клетками-хозяевами являются E.coli, дрожжи или линии клеток млекопитающих, такие как COS или СНО. Последовательности ДНК, экспрессируемые таким образом, могут кодировать природные антигены, части природных антигенов или другие их варианты. Например, варианты нативного антигена могут быть, как правило, получены с использованием стандартных методик мутагенеза, таких как направленный на олигонуклеотид сайт-специфический мутагенез, и отрезки последовательности ДНК могут быть удалены для обеспечения возможности получения усеченных полипептидов. В определенных аспектах полипептиды, полинуклеотиды, части, варианты, конденсированные полипептиды и т.п., как описано в настоящем патенте, входят в состав фармацевтических композиций или вакцин. Фармацевтические композиции, как правило, содержат один или несколько полипептидов, полинуклеотидов, частей, вариантов, слитых полипептидов и т.п., как описано в настоящем патенте, в комбинации с физиологически приемлемым носителем. Вакцины, также называемые иммуногенными композициями, как правило, содержат один или несколько полипептидов, полинуклеотидов, частей, вариантов,слитых полипептидов и т.п., как описано в настоящем патенте, в сочетании с иммуностимулятором, таким как адъювант. Иммуностимулятор может представлять собой любое вещество, которое усиливает или стимулирует иммунный ответ (опосредованный антителом и/или клеточно опосредованный) на экзогенный антиген. Примеры иммуностимуляторов включают адъюванты, биологически разлагаемые микросферы (например, полимолочный галактид) и липосомы (в которые включено соединение; см., например, Fullerton,патент США 4235877). Получение вакцин описано, например, в публикации PowellNewman, eds.,Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach) (1995). В вакцинах по настоящему изобретению может использоваться любой из многочисленных иммуностимуляторов. Например, в вакцины может быть введен адъювант. Многие адъюванты содержат вещество, предназначенное для защиты антигена от быстрого катаболизма, такое как гидроксид алюминия или минеральное масло, и стимулятор иммунных ответов, такой как липид А (натуральный или синтетический), белки, полученные из Bortadella pertussis или видов Mycobacterium или Mycobacterium. Подходящие адъюванты имеются в продаже, такие как, например, неполный адъювант Фрейнда и полный адъювант Фрейнда (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); адъювант Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway,N.J.); AS-2 и их производные (GlaxoSmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.); CWS, TDM, Leif, соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацилированные сахара; катионно или анионно дериватизированные полисахариды; полифосфазены; биоразлагаемые микросферы; монофосфорильный липид А и производное сапонина Quil А. Цитокины, такие как GM-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов) или интерлейкин-2, -7 или -12, могут также использоваться в качестве адъювантов. Другие примеры адъювантов, которые можно использовать в контексте изобретения, включают агонисты Toll-подобных рецепторов, такие как агонисты TLR7, агонисты TLR7/8 и им подобные. Еще одни пример адъювантов включает имихимод, гардихимод, ресихимод и родственные соединения. В определенных предпочтительных вакцинах используются адъювантные системы, предназначенные для индукции иммунного ответа преимущественно типа Th1. Высокие уровни цитокинов типа Th1(например, IFN-, TNF-, IL-2 и IL-12) имеют тенденцию благоприятствовать индукции клеточно опосредованных иммунных ответов на введенный антиген. Напротив, высокие уровни цитокинов типа Th2(например, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10) имеют тенденцию благоприятствовать индукции гуморальных иммунных ответов. После использования вакцины, описанной в настоящем описании, пациент поддерживает иммунный ответ, который вызывает ответы типа Th1 и типа Th2. В пределах предпочтительного варианта осуществления, при котором преобладает ответ типа Th1, уровень цитокинов типа Th1 увеличивается в большей степени, чем уровень цитокина типа Th2. Уровни этих цитокинов можно легко оценить стандартными анализами. Обзор семейств цитокинов можно найти в публикации Mossman and Coffman (1989), Ann. Rev. Immunol. 7:145-173. Определенные адъюванты для индукции ответа преимущественно типа Th1 включают, например,комбинацию монофосфорилового липида А, предпочтительно 3-де-О-ацилированного монофосфорилового липида A, (3D-MPL), вместе с солью алюминия (патенты США 4436727; 4877611; 4866034 и 4912094). Содержащие CpG олигонуклеотиды (в которых динуклеотид CpG является не метилированным) также вызывают ответ преимущественно типа Th1. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в WO 96/02555, WO 99/33488 и патентах США 6008200 и 5856462. Иммуностимулирующие последовательности ДНК также описаны, например, Sato et al. (1996), Science 273:352. Другой иллюстративный адъювант содержит сапонин, такой как Quil А, или его производные, включая QS21 и QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, Mass.); эскин; дигитонин; или сапонины Gypsophila или Chenopodium quinoa. Другие иллюстративные составы включают более одного сапонина в адъювантных композициях по настоящему изобретению, например, комбинации по меньшей мере двух из следующих групп, включающих QS21, QS7, Quil A, -эскин или дигитонин. В конкретном варианте осуществления адъювантная система включает комбинацию монофосфорилового липида А и производное сапонина, такую как комбинация QS21 и адъюванта 3D-MPL, как описано в WO 94/00153, или менее реактогенную композицию, где QS21 гасится холестерином, как описано в WO 96/33739. Другие составы содержат эмульсию масла в воде и токоферол. Другой адъювантный состав, использующий QS21, адъювант 3D-MPL и токоферол в эмульсии масла в воде, описан вWO 95/17210. Другая усиленная адъювантная система включает комбинацию содержащего CpG олигонуклеотида и производного сапонина, как описано в WO 00/09159. В определенных предпочтительных вариантах осуществления адъювант, используемый в настоящем изобретении, представляет собой адъювант в виде глюкопиранозилового липида A (GLA), как описано в рассматриваемой заявке на патент США 20080131466, описание которой полностью включено в настоящее изобретение путем ссылки. Другие иллюстративные адъюванты включают Montanide ISA 720 (Seppic, France), SAF (Chiron,Calif, USA), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), серию адъювантов SBAS (например, SBAS-2, AS2', AS2",SBAS-4, или SBAS6, выпускаемые SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium), Detox, RC-529 (Corixa, Hamilton, Mont.) и 4-фосфаты другие аминоалкилглюкозаминида (AGPs), такие как те, которые описаны в рассматриваемой заявке на патент США под серийными номерами 08/853826 и 09/074720, описания которых полностью включены в настоящее изобретение в качестве ссылки, и адъюванты в виде простого эфира полиоксиэтилена, такие как те, которые описаны в документе WO 99/52549 A1. Композиции по изобретению могут также, или альтернативно, содержать T-клетки, специфичные в отношении антигена SMT Leishmania. Такие клетки могут быть в целом получены in vitro или ex vivo с использованием стандартных процедур. Например, Т-клетки могут быть выделены из костного мозга,периферической крови или фракции костного мозга или периферической крови пациента. Альтернативно, T-клетки могут быть получены от родственных или не родственных людей, млекопитающих, кроме человека, из линий или культур клеток.T-клетки могут стимулироваться полипептидом по изобретению, полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид, и/или представляющей антиген клеткой (АРС), которая экспрессирует такой полипептид. Такая стимуляция выполняется в условиях и в течение времени, достаточного для обеспечения возможности генерирования T-клеток, которые специфичны для полипептида. Предпочтительно полипептид или полинуклеотид присутствует внутри носителя доставки, такого как микросфера, для облегчения генерирования специфических T-клеток.T-клетки считаются специфичными для полипептида по изобретению, если T-клетки специфически пролиферируют, секретируют цитокины или уничтожают клетки-мишени, покрытые полипептидом, или экспрессирующие ген, кодирующий полипептид. Специфичность T-клеток можно оценить с использованием любой из разнообразия стандартных методик. Например, в пределах анализа высвобождения хрома или анализа пролиферации, индекс стимуляции, увеличивающийся вдвое или более при лизисе и/или пролиферации, по сравнению с отрицательными контролями, указывает на специфичность T-клеток. Такие анализы могут выполняться, например, как описано в публикации Chen et al. (1994), Cancer Res. 54:1065-1070). Альтернативно, выявление пролиферации T-клеток может осуществляться разнообразием известных методик. Например, пролиферация T-клеток может быть выявлена измерением увеличенной скорости синтеза ДНК (например, культурами с импульсной меткой T-клеток насыщенным тритием тимидином и измерением количества насыщенного тритием тимидина, включенного в ДНК). Контакт с полипептидом по изобретению (100 нг/мл-100 мкг/мл, предпочтительно 25 нг/мл-25 мкг/мл) в течение 37 дней, должен привести по меньшей мере к двукратному увеличению пролиферации T-клеток. Описанный выше контакт в течение 2-3 ч должен привести к активации T-клеток, по данным измерения с использованием стандартных анализов цитокинов, при которых двукратное увеличение высвобождение цитокина (например, TNF или IFN-) указывает на активацию Т-клеток (см. Coligan et al. (1998) CurrentProtocols in Immunology, vol. 1). T-клетки, которые были активированы в ответ на полипептид, полинуклеотид или экспрессирующий полипептид, могут представлять собой CD4+ и/или CD8+. Специфичные для белка T-клетки могут увеличиваться в количестве с использованием стандартных методик. В пределах предпочтительных вариантов осуществления T-клетки получают у пациента, родственного донора или неродственного донора и вводятся пациенту после стимуляции и увеличения количества. В композициях по изобретению составление фармацевтически приемлемых эксципиентов и растворов носителя хорошо известно специалистам в данной области, как и разработка подходящих схем введения и лечения для применения конкретных композиций, описанных в настоящем патенте, включая,например, пероральное, парентеральное, внутривенное, интраназальное и внутримышечное введение и составление лекарственных форм. При определенных видах применения композиции, описанные в настоящем патенте, могут быть доставлены посредством перорального введения индивиду. Таким образом, такие композиции могут быть составлены с инертным разбавителем или с усваиваемым съедобным носителем или они могут быть включены в твердые или мягкие желатиновые капсулы, или они могут быть спрессованы в таблетки, или они могут быть включены непосредственно в пищу рациона. В определенных обстоятельствах будет желательна доставка композиций, описанных в настоящем патенте, парентерально, внутривенно, внутримышечно или даже внутрибрюшинно, как описано, например, в патенте США 5543158; патенте США 5641515 и патенте США 5399363 (каждый из которых специально включен в настоящее описание путем ссылки в полном объеме). Растворы активных соединений в виде свободного основания или фармакологически приемлемых солей могут быть получены в воде, подходящим образом смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии могут быть также получены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях и в маслах. В обычных условиях хранения и применения эти препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов. Фармацевтические формы, подходящие для применения в виде инъекций, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления ex tempore стерильных растворов или дисперсий для инъекций (патент США 5466468, специально полностью включенный в настоящее описание путем ссылки). Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой в той степени, в которой сохраняется легкость набора в шприц и выталкивания из него. Она должна быть устойчивой в условиях изготовления и хранения и должна быть защищена против загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой среду в виде раствора или дисперсии, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, полизтиленгликоль и жидкий полиэтиленглоль и т.п.), их подходящие смеси и/или растительные масла. Нужная текучесть может поддерживаться, например, использованием покрытия, такого как лицитин, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и использованием поверхностно-активных веществ. Предотвращению действия микроорганизмов могут способствовать различные антибактериальные и противогрибковые агенты, например парабены, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота, тимеросал и т.п. Во многих случаях будет предпочтительным включение изотонических агентов, например, сахаров или хлорида натрия. Длительная абсорбция инъецируемых композиций может быть обеспечена использованием в композициях агентов, задерживающих абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина. Для парентерального введения в водном растворе, например, раствор должен быть соответствующим образом забуферен и жидкому разбавителю сначала должна быть придана изотоничность достаточным количеством физиологического раствора или глюкозы. Эти конкретные водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В этой связи стерильная водная среда, которую можно использовать, будет известна специалистам в данной области в свете настоящего описания. Например, одна дозировка может быть растворена в 1 мл раствораNaCl и или добавлена к 1000 мл жидкости для введения в подкожную клетчатку, или инъекции в предложенный участок вливания (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, p. 10351038 и 1570-1580). Некоторое изменение дозировки обязательно произойдет в зависимости от состояния индивида, получающего лечение. Лицо, ответственное за введение, в любом случае определит соответствующую индивидуальную дозу для отдельного индивида. Кроме того, для введения людям препараты должны соответствовать стандартам стерильности, пирогенности и общей безопасности, в соответствии с требованиями Ведомства Биологических стандартов FDA (Администрации пищевых продуктов и лекарственных средств США). Стерильные растворы для инъекций получают включением активных соединений в требуемом количестве в соответствующий растворитель при необходимости с различными другими ингредиентами,перечисленными выше, с последующей фильтрационной стерилизацией. В целом, дисперсии получают включением различных стерилизованных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду, и требуемые другие ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами получения являются методики вакуумной сушки и лиофилизации, которые дают порошок активного ингредиента плюс любых желательных ингредиентов из растворов, предварительно стерилизованных фильтрацией. Композиции, раскрытые в настоящем описании, могут быть составлены в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образованные со свободными аминогруппами белка) и те, которые образованы с неорганическими кислотами, такими как,например, хлористо-водородная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут быть также получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или трехвалентного железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. После составления растворы вводятся таким образом,- 12017958 который совместим с лекарственной формой, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Препаративные формы легко вводятся в разнообразных лекарственных формах, таких как растворы для инъекций, капсулы, высвобождающие лекарственное средство, и т.п. Используемый в настоящем описании термин "носитель" включает любой и все растворители, дисперсионные среды, наполнители, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты, буферы, несущие растворы, суспензии, коллоиды и т.п. Использование таких сред и агентов для фармацевтики активных веществ хорошо известно в данной области. В терапевтических композициях предусматривается использование обычных сред или агентов, за исключением случаев, когда они несовместимы с активным ингредиентом. В композиции могут быть также включены дополнительные активные ингредиенты. Фраза "фармацевтически приемлемые" относится к молекулярным химическим соединениям и композициям, которые не вызывают аллергической или подобной нежелательной реакции при введении человеку. Получение водной композиции, которая содержит белок в качестве активного ингредиента,находит понимание в настоящей области. Обычно, такие композиции получают в виде инъецируемых форм, или в форме жидких растворов, или суспензий; могут быть также получены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препарат может быть также эмульгирован. В определенных вариантах осуществления композиции могут быть доставлены интраназальными спреями, ингаляцией и/или другими носителями для доставки аэрозоля. Способы доставки генных, полинуклеотидных и пептидных композиций в легкие посредством интраназальных аэрозольных спреев были описаны, например, в патенте США 5756353 и в патенте США 5804212 (каждый из которых специально полностью включен в настоящее описание путем ссылки). Аналогичным образом, доставка лекарственных средств с использованием интраназальных смоляных микрочастиц (Takenaga et al., 1998) и соединений лизофосфатидилглицерина (патент США 5725871, специально полностью включенный в настоящее описание путем ссылки) также хорошо известны в фармацевтических областях. Аналогичным образом, доставка лекарственных средств в форме матрицы подложки из политетрафторэтилена описана в патенте США 5780045 (специально полностью включенном в настоящее описание путем ссылки). В определенных вариантах осуществления доставка может происходить путем использования липосом, наночастиц, микрочастиц, микросфер, липидных частиц, пузырьков и т.п., для внедрения композиций по настоящему изобретению в подходящие клетки-хозяева. В частности, композиции по настоящему изобретению могут составляться для доставки инкапсулированными или в липидную частицу, липосому, пузырек, наносферу, наночастицу или т.п. носитель. Составление и применение таких носителей доставки может осуществляться с использованием известных и обычных методик. Фармацевтическая или иммуногенная композиция может альтернативно содержать иммуностимулятор и молекулу ДНК, кодирующую один или более полипептидов или конденсированных белков, описанных выше, так, чтобы желательный полипептид генерировался in situ. В таких композициях ДНК может присутствовать внутри любой из разнообразия систем доставки, известных средним специалистам в данной области, включая экспрессионные системы нуклеиновых кислот, экспрессионные системы бактерий и вирусов. Соответствующие экспрессионные системы нуклеиновых кислот содержат последовательности ДНК, необходимые для экспрессии у пациента (такие как подходящий промотер и терминирующий сигнал). Бактериальные системы доставки включают введение бактерии (такой как BacillusCalmette-Guerrin (БЦЖ, которая экспрессирует иммуногенную часть полипептида на ее клеточной поверхности. В конкретном варианте осуществления ДНК может быть внедрена с использованием вирусной системы экспрессии (например, вируса коровьей оспы или другого поксвируса, ретровируса или аленовируса), которое может включать использование непатогенного (дефективного), репликационно компетентного вируса. Методики включения ДНК в экспрессионные системы хорошо известны средним специалистам в данной области. ДНК может также быть "депротеинизированной", как описано, например, в публикации Ulmer et al. (1993), Science 259:1745-1749 и в обзоре Cohen (1993), Science 259:16911692. Захват депротеинизированной ДНК может быть увеличен нанесением ДНК в виде покрытия на биологически разлагаемые гранулы, которые эффективно транспортируются в клетки. Фармацевтические композиции и вакцины по изобретению могут использоваться, например, для индукции защитного иммунитета против Leishmania у пациента, такого как человек или собака, для предотвращения лейшманиоза или уменьшения его тяжести. Композиции и вакцины могут также использоваться для стимуляции иммунного ответа, который может быть клеточным и/или гуморальным, у пациента для лечения уже инфицированного индивидуума. В одном варианте осуществления для пациентов,инфицированных Leishmania, генерированные иммунные ответы включают предпочтительный иммунный ответ Th1 (т.е. ответ, характеризуемый продукцией цитокинов интерлейкин-1, интерлейкин-2, интерлейкин-12 и/или интерферн-, а также фактор опухолевого некроза-). В другом варианте осуществления для инфицированных пациентов иммунный ответ включает продукцию интерлейкина-12 и/или интерлейкина-2, или стимуляцию гамма дельта T-клеток. У другой категории пациентов стимулированный ответ может включать продукцию IL-12. Такие ответы могут быть также вызваны в биологических образцах РВМС или их компонента, полученных у индивидуумов, не инфицированных Leishmania. Как отмечено выше, анализы любого из указанных выше цитокинов, а также других известных цитокинов могут в целом выполняться с использованием способов, известных средним специалистам в данной области, таких как ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA). Соответствующие дозы и способы введения по этим назначениям могут быть легко определены специалистом в данной области с использованием доступных в данной области сведений и/или обычных методик. Пути и частота введения, а также дозировка для указанных выше аспектов настоящего изобретения будут варьироваться от индивидуума к индивидууму и могут использоваться наряду с теми, которые используются в настоящее время при иммунизации против других инфекций, включая инфекции простейшими паразитами, вирусами и бактериями. Например, в одном варианте осуществления от 1 до 12 доз вводятся в течение периода 1 года. Повторные вакцинации могут затем производиться периодически по необходимости или желанию. Конечно, для отдельных пациентов могут быть целесообразны альтернативные протоколы. В конкретном варианте осуществления подходящая доза представляет собой количество полипептида или ДНК, которое при введении, как описано выше, способно вызвать иммунный ответ у иммунизированного пациента, достаточный для защиты пациента от лейшманиоза в течение по меньшей мере 1-2 лет. В целом, количество полипептида, присутствующего в дозе (или продуцируемого in situ ДНК в дозе), находится в диапазоне примерно от 100 нг до примерно 1 мг на 1 кг хозяина,обычно примерно от 10 до примерно 100 мкг. Подходящие размеры доз будут варьироваться в зависимости от параметров тела пациента, но обычно будет находиться в диапазоне примерно от 0,1 до примерно 5 мл. Композиции SMT, слитые полипептиды и полинуклеотиды могут также использоваться в качестве диагностических реагентов для выявления и/или мониторинга инфекции Leishmania у пациента. Например, композиции, слитые полипептиды и полинуклеотиды по изобретению могут использоваться в анализах in vitro и in vivo для выявления гуморальных антител или клеточно опосредованного иммунитета против Leishmania для диагностики инфекции, мониторинга прогрессирования заболевания или оценки тестов излечения. В диагностических способах и наборах предпочтительно используется полипептид, часть, вариантSMT или подобная структура, необязательно, в комбинации с одном или более других антигеновLeishmania. В определенных вариантах осуществления будет предпочтительно использование множественных антигенов, как описано в настоящем патенте, например 3 или более, 4 или более, 5 или более, 6 или более и т.д., в диагностическом способе по изобретению. Антигены могут использоваться, по существу, в любом желательном формате анализа, например в виде отдельно анализируемых отдельных антигенов, в виде одновременно анализируемых множественных антигенов, в виде антигенов, иммобилизованных на твердой подложке, такой как чип или т.п. В одном варианте осуществления предоставляются диагностические наборы для выявления инфекции Leishmania в биологическом образце, содержащие (а) полипептид, содержащий, по меньшей мере,иммуногенную часть полипептида SMT, описанную в настоящем патенте, и (b) реагент выявления. В одном варианте осуществления предоставляются диагностические наборы для выявления инфекции Leishmania в биологическом образце, содержащие (а) антитело или его связывающий антиген фрагмент, который является специфичным для полипептида, содержащего, по меньшей мере, иммуногенную часть полипептида SMT, описанную в в настоящем патенте, и (b) реагент выявления. В другом варианте осуществления предоставляются способы для выявления присутствия инфекцииLeishmania в биологическом образце, включающие (а) контакт биологического образца с моноклональным антителом, которое связывается с описанным в настоящем патенте полипептидом SMT; и (b) выявление в биологическом образце присутствия белков Leishmania, которые связывается с моноклональным антителом. Имеются разнообразные форматы анализов, известные средним специалистам в данной области использования очищенного антигена или слитого полипептида для выявления антител в образце. См., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. В одном варианте осуществления анализ включает использование полипептида, иммобилизованного на твердой подложке, для связывания с антителом и удалением его из образца. Затем связанное антитело может быть выявлено с использованием реагента выявления, который связывается с комплексом антитела/пептида и содержит выявляемую информационную группу. Подходящие реагенты выявления включают антитела, которые связываются с комплексом антитела/пептида, и свободный пептид, меченный информационной группой (например, в полуконкурентном анализе). Альтернативно, может использоваться конкурентный анализ, при котором антитело, которое связывается с полипептидом, метится информационной группой, и ему предоставляется возможность связываться с иммобилизованным антигеном после инкубации антигена с образцом. Степень, с которой компоненты образца ингибируют связывание меченого антитела с полипептидом, указывает на реактивность образца с иммобилизованным полипептидом. Твердая подложка может представлять собой известный средним специалистам в данной области твердый материал, к которому может быть присоединен антиген. Например, твердая подложка может представлять собой лунку для тестирования в титровочном микропланшете, или микроцеллюлозу, или другую подходящую мембрану. Альтернативно, подложка может представлять собой шарик или диск,такой как стекло, стекловолокно, латекс, или пластический материал, такой как полистирол или поливинилхлорид. Подложка может также представлять собой магнитную частицу или волоконно-оптический датчик, такой как те, которые раскрыты, например, в патенте США 5359681. Полипептид может быть связан с твердой подложкой с использованием любой из разнообразных методик, известных и доступных в данной области. Термин "связанный" относится и к не ковалентной ассоциации, такой как адсорбция, и ковалентной ассоциации (которая может представлять собой прямую связь между антигеном и функциональными группами на подложке, или может представлять собой связь посредством поперечной сшивающего агента). Предпочтительно связывание адсорбцией с лункой в титровочном микропланшете или с мембраной. В таких случаях адсорбция может достигаться путем контакта полипептида в подходящем буфере с твердой подложкой в течение подходящего количества времени. В определенных вариантах осуществления используемый диагностический анализ представляет собой ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA). Этот анализ может выполняться сначала контактом полипептидного антигена, который был иммобилизован на твердой подложке, обычно, лунке титровочного микропланшета с образцом с тем, чтобы обеспечить возможность связывания антител к полипептиду внутри образца с иммобилизованным полипептидом. Затем не связанный образец удаляется из иммобилизованного полипептида, и добавляется реагент выявления, способный связываться с иммобилизованным комплексом антитела-полипептида. Затем количество реагента выявления, который остается связанным с твердой подложкой, определяется с использованием способа, целесообразного для определенного реагента выявления. После иммобилизации полипептида на подложке обычно блокируются остающиеся участки связывания белка. Может использоваться любой подходящий блокирующий агент, известный средним специалистам в данной области, такой как бычий сывороточный альбумин или Tween 20 (Sigma ChemicalCo., St. Louis, MO). Затем иммобилизованный полипептид инкубируется с образцом и антителу (если оно присутствует в образце) предоставляется возможность связывания с антигеном. Образец перед инкубацией может быть разбавлен подходящим разбавителем, таким как физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS). В целом, соответствующее время контакта (т.е. время инкубации) представляет собой тот период времени, который достаточен для выявления присутствия антитела к Leishmania внутри инфицированного образца. Предпочтительно время контакта достаточно для достижения уровня связывания, который составляет по меньшей мере 95% связывания, достигаемого при равновесии между связанным и не связанным антителом. Средним специалистам в данной области будет понятно, что время,необходимое для достижения равновесия, можно легко определить анализом уровня связывание, которое происходит в течение периода времени. При комнатной температуре в целом достаточно время инкубации примерно 30 мин. Затем несвязанный образец может быть удален промыванием твердой подложки соответствующим буфером, таким как PBS, содержащим 0,1% Tween 20. Затем на твердую подложку может добавляться реагент выявления. Целесообразным реагентом выявления является любое соединение, которое связывается с иммобилизованным комплексом антитела-полипептида и которое может быть выявлено любым из разнообразия средств, известных специалистам в данной области. Реагент выявления в целом содержит связывающий агент (такой как, например, белок А, белок G, иммуноглобулин, лектин или свободный антиген), сопряженно связанный с информационной группой. Иллюстративные информационные группы включают ферменты (такие как пероксидаза хрена), субстраты, кофакторы, ингибиторы, красители, радионуклиды, люминесцентные группы, флуоресцентные группы и биотин. Сопряженное связывание связывающего агента с информационной группой может быть достигнуто с использованием стандартных способов, известных средним специалистам в данной области. Затем реагент выявления инкубируется с иммобилизованным комплексом антитела-полипептида в течение период времени, достаточного для выявления связанного антитела. Целесообразный период времени может быть в целом определен по инструкциям изготовителя или анализом уровня связывания,которое происходит в течение периода времени. Затем не связанный реагент удаляется, и реагент выявления выявляется с использованием информационной группы. Способ, используемый для выявления информационной группы, зависит от природы информационной группы. Для радиоактивных групп в целом целесообразны способы подсчета сцинтилляций или авторадиографии. Спектроскопические способы могут использоваться для выявления красителей, люминесцентных групп и флуоресцентных групп. Биотин может быть выявлен с использованием авидина, соединенного с другой информационной группой (обычно радиоактивной или флуоресцентной группой или ферментом). Ферментные информационные группы могут быть в целом выявлены добавлением субстрата (в целом, в течение определенного периода времени), с последующим спектроскопическим или другим анализом продуктов реакции. Для определения присутствия или отсутствия антител против Leishmania в образце сигнал, выявленный от информационной группы, которая остается связанной с твердой подложкой, в целом сравни- 15017958 вается с сигналом, который соответствует заданной величине отсечки. Эта величина отсечки представляет собой предпочтительно средний по величине сигнал, полученный, когда иммобилизованный антиген инкубируется с образцами от неинфицированного пациента. В целом, образец, генерирующий сигнал,который на 3 стандартных отклонения выше средней величины, считается положительным для антител против Leishmania и инфекции Leishmania. В другом варианте осуществления величина отсечки определяется с использованием Receiver Operator Curve (кривой оператора примника) в соответствии со способом Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, p. 106-7 (Little Brown andCo., 1985). Вкратце, в этом варианте осуществления величина отсечки может быть определена по графику пар действительных положительных частот (т.е. чувствительности) и ложно положительных частот(100%-специфичность), которая соответствует каждой возможной величине отсечки для результата диагностического теста. Величина отсечки на графике, которая находится ближе всего к левому верхнему углу (т.е. величина, которая охватывает самую большую область), представляет собой самую точную величину отсечки, и образец, генерирующий сигнал, который выше, чем величина отсечки, определенная этим способом, может считаться положительной. Альтернативно, величина отсечки может быть смещена влево по графику для минимизации ложно положительной частоты, или вправо для минимизации ложно отрицательной частоты. В целом, образец, генерирующий сигнал, который выше, чем величина отсечки,определенная этим способом, считается положительным в отношении инфекции Leishmania. В другом варианте осуществления диагностический анализ может выполняться в формате проточного теста или теста на полоске, где антиген или слитый полипептид иммобилизован на мембране, такой как нитроцеллюлоза. В проточном тесте антитела внутри образца связываются с иммобилизованным полипептидом при прохождении образца через мембрану. Реагент выявления (например, белок Аколлоидное золото) затем связывается с комплексом антитела-полипептида, по мере того как раствор,содержащий реагент выявления, течет через мембрану. Затем может производиться выявление связанного реагента выявления, как описано выше. В формате теста на полоске один конец мембраны, с которой связан полипептид, погружается в раствор, содержащий образец. Образец мигрирует по мембране через область, содержащую реагент выявления, и зону иммобилизованного полипептида. Концентрация реагента выявления у полипептида указывает на присутствие антител против Leishmania в образце. Такие тесты могут обычно выполняться с очень небольшим количеством (например, одной каплей) сыворотки или крови пациента. В еще одном варианте осуществления предоставляются способы для выявления Leishmania в биологическом образце с использованием антител (которые могут быть поликлональными или моноклональными) и/или T-клеток, специфичных для одного или более антигенов, слитых полипептидов и/или иммуногенными частями по изобретению. Все публикации и патентные заявки, приведенные в настоящем описании, включены в него путем ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была специально и индивидуально указана как включенная путем ссылки. Хотя представленное изобретение было описано в некоторых деталях путем иллюстрации и примера в целях ясности и понимания, для среднего специалиста в данной области будет вполне очевидно, в свете положений настоящего описания, что в него могут быть внесены определенные изменения и модификации без отхода от сущности и объема прилагаемой формулы изобретения. Следующие примеры приведены только в качестве иллюстрации, а не для ограничения. Специалисты в данной области легко распознают разнообразные не имеющие решающего значения параметры, которые могут быть изменены или модифицированы для получения по существу похожих результатов. Примеры Пример 1. Защитная иммунизация против висцерального лейшманиоза с использованием 24-Сметилтрансферазы Leishmania, включенной в препаративную форму с адъювантом. А. Материалы и методы. 1. Животные и паразиты. Самок мышей C57BL/6 закупали в Charles River Laboratories (Wilmington, MA) и содержали в условиях отсутствия специфического патогенного микроорганизма. Использовали мышей в возрасте 8-12 недель в начале эксперимента. Промастиготы L. infantum (MHOM/BR/82/BA-2) культивировали в средеMEM (Invitrogen, Carlsbad, СА) с добавлением 0,5 MEM раствора незаменимых аминокислот (Invitrogen), 0,1 мМ MEM ненезаменимых аминокислот (Invitrogen), 1 мМ пирувата натрия, 25 мМ HEPES, 8,3 мМ глюкозы, 26 мМ бикарбоната натрия, 1 мкг/мл парааминобензойной кислоты, 50 мкг/мл гентамицина, 10% инактивированной нагреванием бычьей сыворотки и 6 мкг/мл гемина. Промастиготы L. donovani и L. Major (MHOM/IL/80/Friedlin) были любезно предоставлены доктором Дэвидом Саксом из Национальных Институтов здоровья и культивировались в среде 199, как описано ранее (Belkaid et al. (2002), J.Immunol. 168:3992-4000). Промастиготы в поздней логарифмической или стационарной фазе использовали для инфекций или получения антигена. 2. Клонирование SMT L. infantum и получение рекомбинантного белка. Открытую рамку считывания SMT L. infantum амплифицировали PCR с использованием геномной ДНК L. infantum с набором затравок, 5' САА ТТА CAT ATG ТСС GCC GGT GGC CGT G (SEQ ID NO: 9),3' САА ТТА AAG СТТ СТА AGC CTG CTT GGA CGG (SEQ ID NO: 10). Продукт, амплифицированныйPCR, вставляли в рамку с меткой 6His в вектор рЕТ-28 а (EMD Biosciences, San Diego, CA) и проводили секвенирование вставки. Выведенную аминокислотную последовательность SMT L. infantum сравнивали с аминокислотными последовательностями SMTs от L. donovani ( доступа AAR92098), L. major(CAJ09196), Trypanosoma cruzi (EAN81270) и Candida albicans (AAC26626), которые были получены из базы данных NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), с использованием пакета программного обеспечения (DNASTAR Inc., Madison, WI) способом Clustal. Вектор рЕТ-28 а, клонированный по SMT L. infantum, трансформировали в E.coli Rosetta. Экспрессию рекомбинантного белка вызывали культивированием с IM изопропилD-тиогалактозида. ЗатемrSMT очищали в виде белков, меченных 6His, с использованием Ni-NTA агарозы (Qiagen Inc., Valencia,СА). Концентрацию очищенного белка измеряли анализом белка ВСА (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL). Чистоту белков оценивали окрашиванием Кумасси-синим после SDS-PAGE (электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Уровень эндотоксина белка измеряли тестом с лизатом амебоцита Limulus (Cambrex Corporation, East Rutherford, NJ) и было показано, что он составляет ниже 10 единиц активного фермента/мг белка. 3. Иммунизация мышей. Мышей иммунизировали 10 мкг rSMT плюс 20 мкг MPL-SE (GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensant, Belgium) в объеме 0,1 мл. Другой группе мышей вводили 10 мкг одной rSMT. Контрольные группы получали или физиологический раствор, или один MPL-SE. Мышей иммунизировали три раза с трехнедельными интервалами подкожным введением в подушечку правой задней лапы и в основание хвоста. 4. Вестерн блоттинг. Образцы для иммуноблоттинга получали суспендированием промастигот в буфере образца SDS с последующим кипячением в течение 5 мин. Образцы, содержащие 5105 промастигот, отделяли SDSPAGE и подвергали блоттингу на мембранах из поливинилидендифторида. Поликлональные Ab, полученные у мышей, иммунизированных rSMT плюс MPL-SE, использовали для вестерн блоттинга. Сыворотки от нативных мышей использовали при таком же разведении, как контроль. Затем мембраны тестировали сопряженно связанным с HRP (пероксидазой хрена) козьим антимышиным IgG (Rockland Immunochemicals, Inc., Gilbertsville, PA). Проявление осуществляли с использованием набора ChemiluminescentrSMT разбавляли в буфере покрытия ELISA и 96-луночный планшет покрывали 200 нг/лунку антигена с последующим блокированием физиологическим раствором с фосфатным буфером, содержащим 0,05% Tween-20 и 1% альбумина бычьей сыворотки. Затем планшеты инкубировали с сыворотками от пациента с бразильским VL (n=21), а также с сыворотками от пациентов с болезнью Шагаса (n=10), эндемических здоровых доноров (n=10) и не эндемических здоровых доноров (n=6) в разведении 1:200. Для определения общего IgG, сопряженно связанный с HRP античеловеческий IgG (Rockland Immunochemicals) использовали в качестве вторичного Ab. Для анализа подклассов IgG использовали сопряженно связанные с HRP анти-человеческие IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 (Invitrogen). Планшеты проявляли субстратом тетраметилбензидинпероксидазой (KirkegaardPerry Laboratories, Gaithersburg, MD) и считывали считывающим устройством для микропланшет при 450 нм (эталон 570 нм). 6. ELISA для мышей anti-SMT IgG. Протокол ELISA был аналогичен протоколу, описанному выше, но использовались первичные и вторичные антитела. У трех мышей на группу проводили кровопускание через 1 неделю после последней иммунизации для ELISA Ab. Образцы мышиной сыворотки разбавляли 1:100 и наносили на планшеты в пятикратных серийных разведениях. Затем планшеты инкубировали с сопряженно связанными с HRP козьими антимышиными IgG1 или IgG2a (Southern Biotech, Birmingham, AL). Планшеты проявляли субстратом и считывали считывающим устройством для микропланшет при длине волн 450 нм. Конечные титры рассчитывали компьютерным обеспечением GraphPad Prism с использованием величины OD (оптической плотности) 0,1 в качестве отсечки. 7. Анализ цитокинов с использованием клеток селезенки. Селезенки брали у трех мышей на группу через 2 недели после последней иммунизации. 2105 спленоцитов в полной среде RPMI (RPMI с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) на лунку наносили на 96-луночный планшет и затем стимулировали 3 мкг/мл конкавалина А, 100 мкг/мл растворимого лизата антигена L. infantum (LiSLA), 10 мкг/мл rSMT или одной средой. Супернатанты культур собирали после 72 ч культивирования и тестировали уровни IFN- и IL-10 сандвич ELISA. 8. Внутриклеточное окрашивание и проточная цитометрия. Селезенки брали у трех мышей на группу через 2 недели после последней иммунизации. 1106 Спленоциты в 100 мкл полной среды RPMI на лунку наносили в 96-луночный планшет с круглым дном и затем стимулировали РМА (форболммеристатацетатом)/иономицином, 10 мкг/мл rSMT или одной сывороткой. К среде добавляли антитела совместной стимуляции анти-CD28 (eBioscience, San Diego, CA) и aHTH-CD49d (eBioscience) для достижения конечной концентрации 1 мкг/мл в ячейке во время стимуляции. После инкубации в течение 2 ч при 37C в лунки добавляли брефелдин A (GolgiPlug: BD Biosciences, San Jose, CA) и инкубацию возобновляли еще на 12 ч при 37C. Клетки блокировали анти-CD 16/32 (eBioscience) 1:50 в 50 мкл и затем окрашивали AlexaFluor 700-анти-CD3 (eBioscience), PerCP-анти-CD4 (BD Biosciences), РЕ-анти-CD8 (BD Biosciences). Затем клетки фиксировали с использованием набора Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences). Клетки снова блокировали анти-CD 16/32 и тем окрашивали FITC-анти-TNF- (eBioscience), Тихоокеанским синим-анти-IL-2 (eBioscience) и РЕ-Су 7-анти-IFN- (BD Biosciences). Клетки анализировали аппаратомLSRII FACS (BD Biosciences) и программным обеспечением DIVA. 9. Контрольное заражение мышей L. infantum. У 7 мышей на группу проводили контрольное заражение L. infantum через 3 недели после последней иммунизации. 5106 промастиготов Z. infantum суспендировали в сбалансированном солевом растворе Хэнкса и внутривенно инъецировали в хвостовую вену мыши. Через 4 недели после контрольного заражения мышей умерщвляли для взятия селезенки и печени для определения количеств паразитов в этих тканях анализом ограничивающего разведения. Ткани гомогенизировали станком для шлифования стекла и суспензии двукратно серийно разводили полной средой НОМЕМ в 96-луночном микропланшете с кровяным агаром NNN. Каждую лунку исследовали на присутствие паразитов через 10 дней после нанесения на планшет и количества паразитов в первоначальных тканях рассчитывали на основании фактора разведения последней положительной лунки. В. Результаты. 1. SMT экспрессируется видом Leishmania. Открытую рамку считывания SMT клонировали из общей ДНК L. infantum амплификацией PCR с использованием специфических затравок. Размер составлял 1062 пар основания и последовательность на 100% соответствовала последовательности в базе данных (LinJ36.4930; 1062 п.о., 353 аминокислот, 39,8 кДа, полученной из генного банка GeneDB: www.genedb.org). Анализ последовательности с использованием базы данных NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) выявил, что SMT L. infantum имеет идентичность 99,6,96,6, 81 и 66,0% соответственно с SMT их L. donovani, L. major, L. braziliensis и Т. cruzi (фиг. 1 А, 1 В).rSMT была экспрессирована и очищена у Е.coli (фиг. 2). Видимая молекулярная масса белка была такой, как прогнозировалось (42 кДа). Мышиное поликлональное Ab, выработанное против rSMT, использовали для выявления нативной SMT у вида Leishmania анализом вестерн блоттинга. Анти-SMT Ab выявило полосу с видимыми молекулярными размерами 38 кДа, что находится в том же диапазоне прогнозируемого размера у всех тестированных видов Leishmania, т.е. L. donovani, L. infantum и L. major,тогда как интенсивность полос была различной (фиг. 3). Эти полосы не выявлялись, когда сыворотки от незараженных мышей использовали в качестве первичного Ab. 2. Сыворотки пациентов с VL распознают rSMT. Для определения антигенности SMT Leishmania у людей исследовали распространенность антител кrSMT и rK39 у пациентов с VL ELISA с использованием сывороток от 21 пациента с бразильским VL.rK39 представляет собой серодиагностический антиген и присутствие антител к антигену указывает на активный VL (Burns et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:775779). У 19 из 21 проявлялись сильные реакции Ab к rK39 и эти реакции были специфичными у пациентов с VL (фиг. 4 А). Эти сыворотки проявили реактивность на rSMT от умеренной до сильной и представлялось, что эти реакции Ab специфичны у пациентов с VL, тогда как у одного не эндемического здорового донора проявилась умеренная реакция (фиг. 4 В). rSMT распознавалась у пациентов с суданским VL, инфицированных L. donovani (данные не показаны), свидетельствуя о том, что SMT яваляется антигенной у пациентов, инфицированных иL. donovani и L. infantum. Далее сыворотки исследовали для определения подклассов их IgG. Реакции IgG1, IgG2 и IgG3 наrK39 были выявлены в сыворотках пациентов с VL, и IgG1 был преобладающим подклассом (фиг. 4 С). Также преобладающей была реакция IgG1 на rSMT, несмотря на то что титры были ниже титров к rK39(фиг. 4D). Некоторые реакции IgG2 наблюдались в сыворотках пациентов с VL на rSMT, но это не было специфичным для VL, поскольку у здоровых доноров проявилась реакция IgG2 на этот антиген. Небольшие реакции IgG4 были выявлены или на rK39, или на rSMT. 3. rSMT плюс MPL-SE вызывают иммунные ответы с характеристиками Th1. Поскольку вакцина rSMT плюс MPL-SE вызывала защиту против VL у мышей, заявители далее оценили иммунные ответы, вызванные вакциной. У мышей, иммунизированных rSMT плюс MPL-SE,проявились активные гуморальные реакции на rSMT, характеризовавшиеся высокими уровнями антигенспецифического IgG1 и IgG2a (фиг. 5). Напротив, иммунизация одной rSMT привела к IgG1 доминантным реакциям Ab. У мышей, которым инъецировали физиологический раствор или один адъювант, не проявились реакции Ab на rSMT. Для исследования клеточных реакций, вызванных иммунизацией, измеряли продукцию цитокинов клетками селезенки при стимуляции rSMT или LiSLA. Клетки селезенки от мышей, иммунизированныхrSMT плюс MPL-SE, продуцировали высокий уровень IFN- в ответ на rSMT (фиг. 6 А). Эти мыши также реагировали на стимуляцию LiSLA; хотя величина продукции IFN- была гораздо ниже, чем величина продукции при стимуляции rSMT. Напротив, клетки селезенки от мышей, иммунизированных однойrSMT, продуцировали лишь низкий уровень IFN- в ответ на rSMT. По сравнению с введением одной(фиг. 6 В). В группах введения физиологического раствора или одного адъюванта при стимуляции rSMT или LiSLA не была обнаружена выявляемая продукция цитокинов. 4. rSMT плюс MPL-SE индуцируют CD4+ и CD8+ клетки, экспрессирующие множественные цитокины типа Th1. Для дальнейшего исследования клеточных реакций, вызванных вакцинацией rSMT плюс MPL-SE,выполняли проточный цитометрический анализ продукции цитокинов типа Th1 CD4+ и CD8+ Tклетками. Клетки селезенки, которые собирали после культивации in vitro с SMT или без нее, дифференцированно пропускали на основании сначала направленного вперед или бокового рассеивания, затем экспрессии CD3 (фиг. 7 А). Клетки CD4+ или CD8+ далее дифференцированно пропускали из популяцииCD3+. Эти популяции анализировали для выявления частоты клеток, продуцирующих TNF-, IL-2 илиIFN-. Данные FACS показывают, что антиген-специфические клетки CD4+ и CD8+ были индуцированы вакцинацией rSMT плюс MPL-SE (фиг. 7 В). Клетки CD4+, продуцирующие TNF-, IL-2 или IFN- при стимуляции rSMT, были обнаружены только у той группы мышей. Антиген-специфические клетки CD8+ были также обнаружено у мышей после введения rSMT плюс MPL-SE, и частота тех клеток, которые продуцировали TNF- или IFN-, была высокой. Когда клетки CD4+ и CD8+ далее делили на 7 различных популяций на основании типов экспрессииTNF-, IL-2 или IFN- на уровне одиночной клетки, было выявлено, что многие из антигенспецифических T-клеток, продуцирующих множественные цитокины, были индуцированы rSMT плюсrSMT, тогда как клеток, экспрессирующих только IFN-, было мало. Большинство антигенспецифических T-клеток CD4+, продуцирующих IFN-, совместно экспрессировали TNF- или и TNF-,и IL-2. Также, многие из антиген-специфических T-клеток CD8+ продуцировали и TNF-, и IFN-. 5. Мыши, вакцинированные rSMT, устойчивы против инфекции. L. infantum. Для оценки защитной эффективности вакцинации rSMT плюс MPL-SE против VL проводили контрольное заражение мышей внутривенной инъекцией 5106 промастиготами L. infantum. Во время инфекции L. infantum у мышей C57BL/6 проявилась пиковая паразитарная нагрузка в печени примерно на 4-й неделе инфекции (данные не показаны). Таким образом, заявители выбрали 4 недели, как точку времени для определения числа паразитов в селезенке и печени мышей, подвергнутых контрольному заражению. Значительное снижение количества паразитов наблюдалось у мышей, иммунизированных rSMT плюс MPL-SE, по сравнению с мышами из групп физиологического раствора или одного адъюванта(фиг. 8). У иммунизированных мышей проявилось снижение в 43 раза и 55 раз числа паразитов в селезенке, снижение в 111 раз и 117 раз - в печени по сравнению с группами соответственно физиологического раствора или одного адъюванта. Не наблюдалось значимого различия между группами физиологического раствора и одного адъюванта. Эта защита у мышей, иммунизированных SMT, повторно наблюдалась с одинаковой величиной. С. Обсуждение. Иммунизация SMT L. infantum значительно защищала мышей от L. infantum, возбудителя VL у людей и собак, и этот профилактический эффект был существенно лучше, чем при любой вакцинекандидате, о котором сообщалось ранее. Имелось ограниченное число вакцин-кандидатов, которые, как было показано, вызывают защиту против VL, на экспериментальных моделях (Basu et al. (2005), J. Immunol. 174:7160-7171; Ghosh et al. (2001), Vaccine 20:59-66; и Rafati et al. (2006), Vaccine 24:2169-2175). При большинстве кандидатов наблюдавшиеся уровни защиты были минимальными, часто обеспечивая лишь двукратное снижение паразитарной нагрузки. У мышей количества паразита в печени проявляют максимум примерно через четыре недели после инфекции и затем снижаются. Напротив, в селезенке обнаруживается стойкая инфекция паразитов. Настоящим изобретением была достигнута более высокая степень защиты иммунизацией SMT по сравнению с антигенам, о которых сообщалось ранее, и защита наблюдалась и в селезенке, и в печени. Кроме того, SMT экспрессируется и L. infantum, и L. donovani, двумя возбудителями VL, а также L.major, возбудителем CL, и L. braziliensis, возбудителем и CL, и диссеминированного лейшманиоза (DL). Этот тип экспрессии SMT свидетельствует о том, что антиген может также использоваться при других формах лейшманиоза. Кроме того, ожидается, что отсутствие гомологии с белками млекопитающих обеспечивает преимущества безопасности при вакцинации SMT. SMT также обнаруживается в других патогенных микроорганизмах, включая паразитов и грибов, таких как Trypanosoma spp. (Zhou et al.Chemother 42:1160-1167) и Pneumocystis carinii (Kaneshiro et al. (2001), J. Eukaryot Microbiol Suppl:144S146S). Таким образом, SMT представляет кандидата вакцины для лечения состояний, отличных от VL. Пример 2. Мыши, иммунизированные RSMT, защищены от инфекции L. major. Мышей BALB/c mice (Charles River Laboratories) содержали в определенных лишенных патогенных микроорганизмов условиях. В начале экспериментов, возраст мышей составлял от 8 до 12 недель. Промастиготы L. major (MHOM/IL/80/Friedlin) выращивали при 25C в среде 199 с добавлением 20% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД пенициллина на 1 мл, 100 мкг стрептомицина на 1 мл, 2 мМ L-глутамина, 0,1 мМ аденина, 40 мМ HEPES, 0,25 мг гемина на 1 мл и 0,31 мг 6 биотина на 1 мл. Промастиготы на поздней логарифмической или стационарной фазе использовали для инфекций или препаратов антигена. Иммунизировали группы по пять мышей. Первую группу иммунизировали физиологическим раствором в качестве отрицательного контроля. Вторую группу иммунизировали 10 мкг rSMT плюс 20 мкгMPL-SE (GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensant, Belgium) в объеме 0,1 мл. В качестве контрольного заражения 2000 промастигот L. major суспендировали в 10 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером и инъецировали внутридермально и в левое, и в правое ухо. Мышей инфицировали через 3 недели после завершения протокола иммунизации. Развитие инфекции контролировали еженедельно в течение 8 недель измерением штангенциркулем диаметра индурации ушного поражения (фиг. 9 А). Через 8 недель после контрольного заражения ушную ткань брали для определения количеств паразитов анализом ограничивающего разведения. Ткань гомогенизировали аппаратом для растирания и суспензии двукратно серийно разбавляли полной средой 199 в 96-луночных микропланшетах с кровяным агаром NNN. Каждую лунку исследовали на присутствие паразитов через 10 дней после нанесения и количества паразитов в первоначальных тканях рассчитывали на основании фактора разведения последней положительной лунки (фиг. 9 В). Результаты этого эксперимента продемонстрировали, что мыши, иммунизированные rSMT, были существенно защищены против L. major, возбудителя кожного лейшманиоза. Эти результаты свидетельствуют о том, что иммунизация rSMT может быть эффективной для защиты против различных патогенных микроорганизмов Leishmania, которые являются возбудителями висцерального, кожного, слизистого и диссеминированного лейшманиоза. Различные варианты осуществления, описанные выше, могут комбинироваться для обеспечения других вариантов осуществления. Все патенты США, публикации заявок на патенты США, заявки на патенты США, патенты других стран, заявки на патенты других стран и не патентные публикации, приведенные в качестве ссылок в настоящем описании, и/или перечисленные в листе данных по заявке, полностью включены в настоящее описание путем ссылки. Аспекты вариантов осуществления могут при необходимости модифицироваться для использования концепций различных патентов, заявок и публикаций с целью предоставления еще одних вариантов осуществления. Эти и другие изменения могут быть внесены в варианты осуществления в свете приведенного выше детального описания. В целом, в следующей формуле изобретения используемые термины не следует рассматривать как ограничивающие формулу изобретения определенными вариантами осуществлениями, раскрытыми в описании и формуле изобретения, но их следует рассматривать как включающие все возможные варианты осуществления наряду с полным объемом эквивалентов, к которым относятся такие притязания. Соответственно формула изобретения не ограничивается описанием. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Композиция для индукции иммунитета против лейшманиоза, содержащая полипептид 24-сметилтрансферазы (SMT) стерина Leishmania, включающий аминокислотную последовательность SEQID NO: 1 или ее вариант, который по меньшей мере на 90% идентичен последовательности SEQ ID NO: 1, или его иммуногенную часть, в диапазоне от около 100 нг до около 1 мг в сочетании с эффективным количеством иммуностимулятора. 2. Композиция по п.1, где количество пептида SMT в композиции составляет от около 10 до 100 мкг. 3. Композиция по п.1, где полипептид SMT имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1. 4. Композиция по п.1, где полипептид SMT содержит аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 1. 5. Композиция по п.1, где иммуногенная часть полипептида способна обеспечить защиту противL. infantum в анализе in vivo. 6. Композиция по п.1, где вариант полипептида способен обеспечить защиту против L. infantum в анализе in vivo. 7. Композиция, содержащая слитый полипептид, содержащий по меньшей мере один полипептид по п.1 и по меньшей мере один гетерологичный партнер слияния, в сочетании с иммуностимулятором. 8. Композиция, содержащая выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, охарактеризованный в п.1, в комбинации с иммуностимулятором. 9. Композиция, содержащая выделенный полинуклеотид, кодирующий слитый полипептид, охарактеризованный в п.7, в комбинации с иммуностимулятором. 10. Композиция по любому из пп.1, 7, 8 или 9, где иммуностимулятор выбран из группы, состоящей из олигонуклеотида, содержащего CpG, синтетического липида А, MPL, 3D-MPL, сапонинов, миметиков сапонинов, AGPs, агонистов Toll-подобных рецепторов или их комбинации. 11. Композиция по любому из пп.1, 7, 8 или 9, где иммуностимулятор представляет собой MPL в устойчивой эмульсии. 12. Способ стимуляции иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение композиции по любому из пп.1, 7, 8 или 9. 13. Способ индукции защитного иммунитета против лейшманиоза у млекопитающего, включающий введение композиции по любому из пп.1, 7, 8 или 9.