Мультиплексный способ выявления инфекции

МУЛЬТИПЛЕКСНЫЙ СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИ Изобретение относится к способу диагностического выявления in vitro инфицирования микроорганизмом, предусматривающему размещение биологического образца в одном аналитическом сосуде, в присутствии частиц, несущих по меньшей мере один специфичный выявляемый физический параметр и принадлежащих по меньшей мере двум различным группам, одна из групп несет иммобилизованное антитело против IgM, а другая группа несет иммобилизованный антиген, полученный из указанного микроорганизма. 017206 Изобретение относится к in vitro выявлению инфекции инфекционным, в частности вирусным, микроорганизмом. Изобретение относится к способу одновременного выявления суммарных иммуноглобулинов и иммуноглобулинов М, направленных против одного и того же инфекционного микроорганизма. Настоящее изобретение более конкретно относится к одновременному выявлению суммарных иммуноглобулинов и иммуноглобулинов М, направленных против вируса гепатита человека. Инфекции, вызванные микроорганизмами, в частности вирусами, такими как, например, вирус гепатита у людей, представляют в большинстве случаев вызывающую опасение проблему со здоровьем,признанную в течение долгого времени, в частности при переливании крови и в диагностике. В основном для предотвращения бесконтрольного распространения инфекционного агента, в частности вируса гепатита, необходимо определить как можно раньше, заражен ли этим агентом или вирусом образец, полученный от пациента, или мешок для переливания крови. Более того, также важно иметь возможность следить за иммунным статусом пациента на протяжении всей инфекции для того, чтобы определить, начал ли пациент выздоравливать или нет, и, следовательно, применить соответствующие терапевтические шаги и/или иммунизацию, в тех случаях, когда имеет место последнее. Способы для in vitro выявления этого типа инфекции чаще всего основаны на выявлении с помощью иммуноанализа (или количественного иммунологического определения) антител, направленных против инфекционных агентов. Иммуноглобулины М ("IgM"), которые появляются рано или транзиторно, являются отличительным признаком ранней острой или первичной инфекции. Суммарные иммуноглобулины, группа которых совместно с различными изотипами иммуноглобулинов (IgM, IgG и IgA) являются отличительным признаком хронизации или длительности инфекции на протяжении периода времени, или же фазы выздоровления пациента. Значительное время после острой инфекции суммарные иммуноглобулины состоят преимущественно из IgG, чтобы поддерживать длительный иммунитет (Hollinger et al., Fields Virology, p. 735-785, 1996). По этой причине на протяжении инфекции у пациента важно иметь возможность провести дифференцировку между IgM и суммарными иммуноглобулинами. Это самая общая ситуация в серологии in vitro. Проблема этого типа, в частности, обнаруживается в случае инфекций, вызванных вирусами гепатита у людей: инфекция вирусом гепатита А, называемым HAV; инфекция вирусом гепатита В, называемым HBV, и т.д. Сопоставимая ситуация обнаруживается с другими вирусами крови у людей: HSV (вирусами простого герпеса), CMV (цитомегаловирусами), вирусом денге, другими флавивирусами (такими,как вирусом лихорадки западного Нила), вирусом краснухи, вирусом гриппа, VZV (вирус ветряной оспы) и т.д. с различными бактериями (Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi, т.д.) и с различными одноклеточными паразитами (Toxoplasma gondii, например). Выявление общих иммуноглобулинов в непрямом формате (взаимодействие образца на твердой фазе, несущей антиген-мишень, затем визуализация меченым антителом против иммуноглобулина человека) уже известно в течение многих лет, среди прочих, с первыми патентами ELISA в 1970-х. Однако этот формат не является предпочтительным, поскольку касается неспецифического взаимодействия, среди прочего, с ревматоидным фактором, потенциально присутствующем в исследуемом образце. Кроме того, F.X. Heinz, et al. "Comparison of two different enzyme immunoassays for detection of tickborne encephalitis virus in serum and cerebrospinal fluid" (Journal of Clinical Microbiology, 14: p. 141-146,(1981, отмечали наличие, в непрямом EIA анализе (иммуноферментном анализе) для выявления IgM,конкуренции между IgM и IgG, которая влияет на чувствительность и специфичность конечного выявления. Выявление общих иммуноглобулинов с помощью формата "двойного антигенного сэндвича" (взаимодействие образца, несущего выявляемые иммуноглобулины, с твердой фазой, несущей антиген, затем визуализация вторым антигеном, который детектируемо мечен) известно с 1978 (Maiolini, R. et al.; Journal of Immunological Methods, 20 (1978), p. 25-34; а также опубликованная французская патентная заявка,FR 2383446). Выявление класс-специфичных иммуноглобулинов с помощью формата "иммуносорбции" само по себе уже известно в течение многих лет. Оно было описано в 1979 г. авторами Duermeyer W. et al. (Journal of Medical Virology 4 (1979): p. 25-32) для специфического выявления анти-HAV IgM с помощьюELISA (также см. патент США 4292403). Принцип этого анализа основан на применении лунок микропланшета, покрытых антителами против IgM человека, к которым добавляют образцы крови, содержащие выявляемые IgM. После периода инкубирования лунки микропланшета промывали и добавляли антиген HAV в известном количестве, а затем инкубировали. Наконец, после дополнительной промывки любой антиген, связавшийся с лункой, затем выявляли посредством конечной инкубации, проводимой в присутствии антитела (F(ab')2), направленного против антигена HAV и меченного ферментом. В патенте США 4273756 тем же путем описываются класс-специфичные форматы "иммуносорбции" для выявленияIgA, IgD, IgE, IgG и IgM, направленных против различных вирусов гепатита (HAV, HBV). В основном и после диагностики, касающейся только HAV, разумеется, были предприняты попытки, по очевидным причинам стоимости и простоты, разработать способ одновременного выявления ранних IgM и поздних IgG (которые главным образом составляют большинство суммарных иммуноглобу-1 017206 линов). По сообщениям Olli Meurman ("Detection of antiviral IgM antibodies and its problems - A review", вELISA for hepatitis A") (Journal of Medical Virology 4 (1979): p. 25-32 - выше), предпринятые попытки требовали много времени и были слишком трудоемкими. Это произошло вследствие того, что предусматривали предварительную стадию разделения различных типов иммуноглобулинов либо зональным ультрацентрифугированием, либо в градиенте сахарозы, или посредством гель-фильтрации, или путем адсорбции IgG стафилококковым белком А или же с анти-Fc гамма антителом, или же расщеплением IgM меркаптоэтанолом. Другой альтернативой является объединение двух различных визуализаций. Angarano et al. (Journalof Clinical Microbiology, June 1984, p. 905-910) предлагает систему для одновременного выявления антиНВс IgM и суммарных Ig (главным образом IgG), называемую RIELISA (радиоиммунный твердофазный иммуноферментный анализ), который объединяет конкурентный радиоиммуноанализ для выявления всех анти-НВс иммуноглобулинов (CORAB анализ от Abbott Laboratories) с непрямым иммуноанализомELISA для выявления анти-НВс IgM. В двух анализах один и тот же антиген (рекомбинантный антиген НВс) адсорбируют на одной и только твердой фазе (полистироловые бусы, расположенные в лунках), но,с одной стороны, антитело, направленное против антигена НВс и радиоактивно меченное (йод 125), используют для выявления всех иммуноглобулинов против НВс, а, с другой стороны, ферментативно меченое (пероксидазой) антитело против IgM используют для выявления IgM против-НВс. Angarano et al.(выше) указывает, что единственным необходимым моментом является то, что мечение антигенспецифичного антитела должно быть отличным и не должно препятствовать мечению иммуноглобулинкласс-специфичного антитела. Очевидно, что система Angarano et al., с ее двумя обязательными различными сигнальными системами (т.е. с двумя детектируемыми метками) является далеко не простой: после первой иммунологической стадии, проводимой одновременно для двух анализов, сигналы должны измеряться отдельно и последовательно сложным способом. В действительности, этот способ начинается с измерения первого радиоактивного сигнала, связанного с твердой фазой, таким образом, отражая титры суммарных антиНВс иммуноглобулинов, а затем на второй стадии меченное пероксидазой антитело против IgM добавляют к бусам, затем после инкубирования путем добавления смеси субстрат (Н 2 О 2)+хромоген (OPD). После инкубирования и развития окраски эту конечную реакцию останавливают соляной кислотой и измеряют полученную конечную оптическую плотность, которая отражает титры анти-НВс IgM. Кроме того, как может быть отмечено, сложная система Angarano et al., которая, к ее чести, проводит отчетливую дифференцировку между титрами суммарных иммуноглобулинов против НВс и титрами анти-НВс IgM, тем не менее подразумевает, что особые меры предосторожности предпринимаются вследствие рисков, связанных с применением радиоактивных соединений (т.е. иода 125). Наконец, в методике Angarano et al. все же требуется прибегать к предварительному устранению влияния ревматоидного фактора (характерно для системы непрямого иммуноанализа, используемой для выявления IgM) путем добавления агрегированного нагреванием иммуноглобулина G в буфере для разведения. Все это делает методику Angarano et al. относительно невыгодной. Обычно, выявление IgM и IgG, направленных против одного и того же вируса, главным образом,выполняют, проводя два иммуноанализа на отдельных сторонах фаз, так, чтобы избежать какого-либо возможного взаимодействия между двумя иммуноанализами и для получения отчетливо различимых сигналов IgM и IgG. Таким образом, применение осуществлялось в обычном формате "иммуносорбции" двух различных твердых фаз, например двух лунок микропланшета в соответствии с Duermeyer W. et al. (выше) или двух нитроцеллюлозных полосок в соответствии с методикой Venture Technologies Malaxsie (Medecines etmaladies infectieuses [Medicines and infectious diseases], 33, 2003, p. 396-412). Одна покрыта антителами против IgM, а другая - антителами против IgG и образец добавляют в каждый из этих анализов. Таким образом, для этих методик требуется проводить два различных теста, и, следовательно, они являются сравнительно невыгодными. Более того, можно использовать множество типов методик для выявления иммуноглобулинов с помощью иммуноанализа: помимо ELISA и радиоиммуноанализа, упомянутого выше, существуют методики посредством иммунофлуоресценции, иммунолюминесценции, и т.д., в гетерогенной или гомогенной фазе, и т.д. Также существуют методики, основанные на иммуноагглютинации частиц, конечный сигнал которой может быть определен визуально или количественно, используя показывающий прибор, среди прочего, используя инструмент для выявления с помощью проточной цитометрии. Одним из хорошо известных преимуществ измерения проточной цитометрии является то, что представляет собой быстрый и чувствительный способ выявления аналита. Проточная цитометрия основана на переносе суспензии микрочастиц в виде потока, перед лучом света. Электрооптические сенсоры следят за тем, чтобы отдельная частица в данный момент времени проходила перед лучом света. Сигнал, вызванный резким отклонением луча света при прохождении час-2 017206 тицы, затем определяется и записывается. В патенте США 6872578 В 2, в частности, описывается мультиплексная иммуноаналитическая система (т.е. иммуноаналитическая система с одновременным выявлением нескольких аналитов в одном образце). Эта система объединяет в гетерогенном иммуноанализе применение проточной цитометрии и нескольких групп твердых частиц. Эти частицы являются магнитными и каждая имеет специфический детектируемый параметр (т.е. физическую характеристику, например, такую как размер, уникальный цвет или же специфическую флуоресценцию). Каждая группа микрочастиц содержит ряд величин для дифференцирования частиц на несколько неперекрывающихся групп, различаемых способами автоматической детекции, подходящими для рассматриваемых параметров. Все эти частицы несут связанные с поверхностью различные аналитические реагенты от одной группы к другой. Все частицы одной и той же группы несут одинаковые реагенты. Магнитная характеристика этих частиц позволяет автоматизировать разделения твердой и жидкой фаз во время промывания. В патенте США 6872578 В 2 описывается, среди прочего, пример одновременного выявления антител различных классов иммуноглобулинов (IgG и IgM), направленных против антигена вируса краснухи. В этом примере IgG и IgM иммунологически очищены с помощью первой магнитной частицы, сенсибилизированной антигеном, специфичным в отношении определяемых IgG и IgM. После первого инкубирования неспецифические иммуноглобулины удаляются во время промывания. Специфические иммуноглобулины, которые захватываются антигеном, адробированным на частице, затем высвобождаются в супернатант путем добавления уксусной кислоты. Этот супернатант затем переносят в другую пробирку и IgG и IgM анализируют посредством сэндвич-формата, используя фазы и конъюгаты, состоящие из антител против IgM человека и против IgG человека. Эта методика является трудоемкой, поскольку требуется предварительная обработка образца, чтобы сохранить только антиген-специфичные Ig. Также можно использовать, так же, как и систему "Multimetrix Borrelia IgG- or IgM-assay" от компании Multimetrix GmbH (Heidelberg, Germany), смесь частиц, покрытых различными рекомбинантными антигенами Borrelia, и дифференциальное выявление IgM и IgG посредством непрямого формата, используя анти-IgG антитела и анти-IgM антитела, меченные флуоресцентной меткой (фикоэритрин). Флуоресценцию конечного комплекса каждой бусины измеряют проточной цитометрией, используя анализатор, от компании Luminex Corporation. Стадии промывания не требуется, что делает это исследование упрощенным иммуноанализом. Однако протокол требует наличия нескольких реакционных пробирок и нескольких реактивов, продаваемых в различных наборах. Эта система представлена, согласно полученной коммерческой брошюре, как чувствительная и надежная. Принцип выявления анти-EBV IgG иIgM антител на Bioplex 2200, описанный в публикации Klutts et al. (Journal of Clinical Microbiology, November 2004, p. 4996-5000), является идентичным. Как описано выше, требуется два различных реактива и иммунологические реакции проводят в двух различных реакционных пробирках. В этих двух EBV исследованиях используют смесь частиц, покрытых различными антигенами EBV, и дифференциальное выявление IgM и IgG посредством непрямого формата, используя анти-IgG антитела и анти-IgM антитела, меченные флуоресцентной меткой (фикоэритрином), используя два различных набора. Флуоресценцию конечного комплекса каждой частицы измеряют проточной цитометрией, используя детектор от компании Luminex Corporation. Таким образом, существует реальная потребность в способе, который является простым для выполнения, быстрым, чувствительным, специфичным, количественным или полуколичественным и воспроизводимым и который может быть автоматизирован - в целях скрининга на всем протяжении инфекционного процесса, а также в период пре- и постиммунизационного контроля - для выявления и дифференцирования IgM и общих иммуноглобулинов (суммарных Ig), полностью одновременно, т.е. используя один и единственный предварительно необработанный образец, в одном и единственном сосуде для исследования, в том же числе инкубаций, используя систему одиночного сигнала, и в одном и единственном времени считывания сигнала. Краткое изложение сущности изобретения Таким образом, авторы настоящего изобретения постарались решить изложенную выше проблему,для этого, чтобы разработать альтернативный способ одновременного выявления IgM и общих иммуноглобулинов, направленных против одного и того же антигена в одном единственном сосуде, и используя один единственный биологический образец, предпочтительно предварительно не обработанный. Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ диагностического выявления инфекции микроорганизмом in vitro, предусматривающий одновременное выявление иммуноглобулиновG или суммарных иммуноглобулинов и иммуноглобулинов М, направленных против указанного микроорганизма, присутствующего в биологическом образце, указанный способ включает следующие стадии: а) размещения биологического образца в одном аналитическом сосуде в присутствии частиц, несущих по меньшей мере один специфически выявляемый физический параметр и принадлежащих по меньшей мере двум различным группам, одной из групп, несущей иммобилизованное антитело противIgM, и другой группе, несущей иммобилизованный антиген, полученный из указанного микроорганизма;b) инкубирования смеси в условиях, дающих возможность образованию иммунокомплексов на ка-3 017206 ждой группе частиц;c) элиминации иммуноглобулинов, которые не связались с частицами;d) инкубирования смеси со стадии b) по меньшей мере с одним меченым конъюгатом, указанным по меньшей мере одним конъюгатом, состоящим исключительно из детектируемого антигена, полученного из указанного микроорганизма;e) элиминации детектируемого антигена, несвязавшегося с иммунокомплексами со стадии b);f) одновременного выявления, с помощью детектора, способного различать две группы частиц,упомянутых выше, иммунокомплексы со стадии d) на каждой частице, посредством чего обнаруживается наличие или отсутствие иммуноглобулинов G или суммарных иммуноглобулинов и/или иммуноглобулинов М, направленных против указанного микроорганизма. В соответствии с особым вариантом осуществления группы указанных частиц отличаются одна от другой с помощью флуорохромов, выявляемых подходящим детектором. Предпочтительно подходящий детектор связан с проточным цитометром. Мечение детектируемого антигена может быть прямым или опосредованным. Например, детектируемый антиген может нести биотин, который определяется добавлением меченного авидина или стрептавидина. Предпочтительно микроорганизм представляет собой вирус человека, в частности вирус гепатита человека. Объектом изобретения также является диагностический набор или комплект реактивов для проведения способа выявления, содержащий, в частности, частицы, несущие по меньшей мере один специфически выявляемый физический параметр и принадлежащие по меньшей мере двум различным группам,одной из групп, несущей иммобилизованное антитело против IgM, и другой группе, несущей иммобилизованный антиген, полученный из детектируемого микроорганизма. Подробное описание изобретения Для решения указанной проблемы авторы изобретения прежде всего провели мультиплексный анализ для одновременного выявления в одном сосуде анти-HAV IgG и IgM в образце (сыворотке или плазме), объединяя два формата путем иммунологического захвата (см. подробное описание протокола и результаты в экспериментальной части, сравнительный пример 1 и аналитические форматы на фиг. 1): первый с суперпарамагнитными частицами, несущими антитела против IgG человека; второй с суперпарамагнитными частицами, несущими антитела против IgM человека. После инкубирования (захвата IgG и IgM образца и образования первых иммунных комплексов) и первого промывания добавляют антиген HAV. После второго инкубирования антиген HAV (Ag HAV) был связан с двумя типами образованных иммунных комплексов. После второго промывания две реакции выявляли путем добавления моноклонального антитела против HAV (Mab), соединенного с флуорохромом (фикоэритрином, обозначенным РЕ). После инкубирования этого конъюгата и третьего промывания сигнал считывали с помощью проточной цитометрии с каждой частицы. Результаты для IgM и IgG получали отдельно посредством считывания сигналов двумя соответствующими пучками лазерного излучения проточного цитометра. Выявление IgM достигало приемлемой чувствительности даже при низких концентрациях, что представляет вполне обычную ситуацию после HAV инфекции. Чувствительность выявления IgG была, с другой стороны, явно недостаточной, в этой конфигурации, вследствие большой природной распространенности IgG (все антигенные специфичности включены) в образце. Действительно, анти-IgG суперпарамагнитные частицы очень быстро насыщались IgG,неспецифичными для HAV, присутствующими в образце, и они больше не захватывали достаточно антиHAV IgG, особенно при низких концентрациях анти-HAV IgG. В результате это приводит к недостаточной аналитической чувствительности. Это в точности случай при выявлении суммарных анти-HAV иммуноглобулинов, для которых существует порог клинической чувствительности, необходимый для антител против HAV в контексте последующей постиммунизационной защиты. Этот защитный порог был фиксирован, по общему согласию,на значении 20 мМЕ/мл в отношении анти-HAV стандарта ВОЗ (97/646). Ниже этой величины индивидуум не защищен; выше этой величины титр IgG является достаточным для обеспечения защиты индивидуума против вируса. Таким образом, авторы настоящего изобретения создали другие аналитические форматы для решения этой проблемы недостаточной "IgG чувствительности", описанной в приведенном выше исследовании. Совершенно неожиданно, авторы настоящего изобретения показали, что мультиплекс, объединяющий два формата, описанный далее в примере 2 (см. подробное описание протокола и результаты в экспериментальном разделе примера 2 и аналитические форматы на фиг. 2), способен одновременно выявлять в одном сосуде низкие концентрации IgG, не снижая чувствительности выявления IgM, и, более того, делает возможным дифференцировать полностью чувствительным и специфичным образом антиHAV IgM антитела и суммарные анти-HAV иммуноглобулины. Таким образом, указанный способ для одновременного выявления в одном сосуде анти-HAV IgG иIgM в образце (сыворотке или плазме) [способ, который, следовательно, представляет собой способ по настоящему изобретению] объединяет два аналитических формата (аналитический форма "ловушки для иммуноглобулинов" по Duermeyer W. et al., для IgM и аналитический формат "двойного антигенного сэндвича" по Maiolini R. et al., для IgG): первый с суперпарамагнитными частицами, несущими антитела против IgM человека,второй с суперпарамагнитными частицами, несущими иммобилизованный антиген HAV. После инкубирования (захвата IgG и IgM из образца и образования первых иммунных комплексов) и первого промывания добавляют биотинилированный антиген HAV. После второго инкубирования антиген HAV связывается с двумя типами образованных комплексов. После второго промывания две реакции проявляют путем добавления стрептавидина, соединенного с флуорохромом (фикоэритрином). После инкубирования и промывания сигнал считывают с помощью проточной цитометрии на каждой частице. Результаты для IgM и IgG получают отдельно посредством считывания сигналов двумя соответствующими пучками лазерного излучения проточного цитометра. Настоящее изобретение, результатом которого является чувствительное и дифференцированное выявление анти-HAV IgM и суммарных Ig, является совершенно неожиданным: поскольку существовал высокий риск, с объединением в одном сосуде двух форматов в соответствии со способом по настоящему изобретению, что могла быть конкуренция за анти-HAV IgM образца между иммобилизованным антигеном HAV и иммобилизованным анти-IgM антителом. Другими словами, вследствие одновременного выполнения описанных выше двух форматов в одном и том же сосуде существовал риск того, что некоторые из анти-HAV IgM образца будут захвачены (как показано заштрихованной стрелкой на фиг. 2) суперпарамагнитными частицами, несущими антиген HAV, используемыми именно для захвата IgG, и больше не будут выявлены как IgM. Такая конкуренция неизбежно привела бы к полностью непригодному выявлению IgM ответа (недостаточной чувствительности) и, следовательно, к невозможности выявлять IgM на раннем этапе. Специалисты в данной области целиком и полностью осознали бы размер этого риска и, следовательно, очевидно отговорили бы от внедрения этого сочетания (мультиплекса) в соответствии с настоящим изобретением. Авторы настоящего изобретения аналогично использовали мультиплексный способ по настоящему изобретению для одновременного выявления антител IgG и IgM, направленных против капсида вируса гепатита В (выявление НВ ядерных IgG и IgM антител). В этом отношении см. экспериментальный раздел, пример 3, и аналитические форматы на фиг. 3. Исходя из этого, авторы изобретения предлагают способ общего выявления IgG и IgM в мультиплексном формате, который может быть приспособлен для многих микроорганизмов, для которых это имеет большое значение с диагностической точки зрения, для выявления IgG и IgM. В разделе, приведенном ниже, представлено несколько определений, используемых для понимания настоящего изобретения. Определения. В контексте настоящего изобретения "биологический образец" предпочтительно состоит из биологической жидкости, такой как кровь, плазма, сыворотка, моча, спинно-мозговая жидкость, слюна и т.д.,предпочтительно образец представляет собой плазму или сыворотку. Исследуемый образец предпочтительно получен от человека, но также может происходить от животного, для которого необходимо выявление микробиологической инфекции. Термин "мультиплексное выявление" относится в контексте настоящего изобретения к одновременному выявлению по меньшей мере двух типов антител, направленных против одного и того же или нескольких инфекционных микроорганизмов и выбранных из группы, состоящей из иммуноглобулинов М, G, A, D и Е и суммарных иммуноглобулинов в крови. Термин "антитело" относится к любому целому антителу или функциональному фрагменту антитела, содержащему или состоящему по меньшей мере из одного сайта соединения с антигеном, позволяющего указанному антителу связываться по меньшей мере с одной антигенной детерминантой антигенного вещества. В качестве примера фрагментов антитела можно упомянуть фрагменты Fab, Fab' и F(ab')2, а также цепи scFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент), цепи dsFv (двухцепочечный вариабельный фрагмент) и т.д.; эти функциональные фрагменты, в частности, могут быть получены методами генной инженерии. Термин "антигенный фрагмент" или "антиген" означает весь или часть природного или рекомбинантного белка инфекционного микроорганизма, такого как вирус гепатита А, способный индуцировать синтез антител у зараженного пациента или у иммунизированного животного. В частности, выражение "антиген, полученный из микроорганизма" для иммобилизации или выявления означает любой антиген, выбранный из группы, состоящей из лизата указанного микроорганизма,одного из его природных антигенов, который был полуочищен или очищен, рекомбинантного белка, его фрагмента или синтетического пептида. Термин "иммобилизованный антиген" означает антигенный фрагмент, присоединенный к твердой фазе, который может распознаваться антителами, направленными против микроорганизма, такими как анти-HAV антитела, и позволяющий аффинно связываться с последними.-5 017206 Термин "иммобилизованное антитело" означает антитело или часть антитела, присоединенное к твердой фазе, способное удерживать по меньшей мере одну антигенную детерминанту антигенного соединения, находящегося в биологическом образце, путем аффинного связывания. Анти-IgM иммобилизованные антитела и иммобилизованные антигены могут быть присоединены к частицам с помощью любой подходящей методики. Они могут быть присоединены непосредственно ковалентно, или нековалентно, в частности, посредством аффинности. Непосредственное ковалентное присоединение может осуществляться путем активации карбоксильных групп, находящихся на частицах,включая связывание через гидроксисукцинимид или карбодиимид, например. Термин "детектирующий антиген" означает меченый антиген, который дает возможность либо выявлять антитела IgM с помощью способа иммунологического захвата, либо выявлять антитела IgG с помощью традиционного сэндвич-способа антиген-антитело-антиген, также называемого способом "двойного антигенного сэндвича" (Maiolini et al. (1978. Детектирующий антиген может быть идентичным иммобилизованному антигену или отличаться от него. Термин "меченый" относится как к прямому мечению (посредством флуорохромов, люминесцентных соединений и т.д.), так и к непрямому мечению (например, посредством антител или антигенов, самих непосредственно меченых, или используя реагенты меченой "пары аффинности", например, но не исключительно, меченой авидин-биотиновой пары и т.д.). Получение моноклональных антител или поликлональных антител, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, является результатом общепринятых методик. Моноклональные антитела могут быть получены в соответствии с общепринятым способом слияния лимфоцитов и гибридомной культуры, описанной Kohler и Milstein (Nature, 256, p. 495-497(1975. Также известны другие способы получения моноклональных антител (Harlow et al. editors, Antibodies ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988. Моноклональные антитела могут быть получены путем иммунизации млекопитающего (например, мыши, крысы, кролика или даже человека и т.д.) и путем использования методики слияния лимфоцитов, которые продуцируют гибридомы (Khler и Milstein, 1975, выше). Существуют методики, альтернативные этой общепринятой методике. Например, моноклональные антитела могут быть получены путем экспрессии нуклеиновой кислоты, клонированной из гибридомы. Антитела также могут быть получены с помощью технологии фагового дисплея, путем введения в векторы кДНК антител, которые обычно представляют собой нитевидные фаги (например, Fuse5 для E.coli,Scott et al. (Science, 249, p. 386-390 (1990. Последние составляют библиотеки и демонстрируют на своей поверхности фрагменты scFv. Протоколы для конструирования этих антительных библиотек описаны уMarks et al. (1991) (J. Mol. Biol., 222, p. 581-597 (1991. Поликлональные антитела могут быть получены из сыворотки животного, иммунизированного против антигена пептидной природы, в соответствии с обычными протоколами. В основном полипептид, в частности рекомбинантный полипептид, или олигопептид, может быть использован, например, в качестве иммуногена. В соответствии со стандартным протоколом кроликов иммунизируют эквивалентом 1 мг пептидного иммуногена в соответствии с процедурой, описанной Benoit et al. [PNAS USA, 79, p. 917-921 (1982)]. Животным вводят инъекции 20,0 мкг антигена с четырехнедельными интервалами и берут кровь спустя 10-14 дней. После третьей инъекции оценивают способность антисыворотки связываться с антигенным пептидом, меченным йодом, полученным с помощью способа хлорамин-Т. Затем очищают с помощью хроматографии на ион-обменной колонке, состоящей из карбоксиметилцеллюлозы (CMC). Молекулы антитела, собранные путем элюции, затем доводят до желаемой концентрации, способами, хорошо известными специалистам в данной области, например, используя DEAE Sephadex для получения фракции IgG. Термин "частицы" означает любые частицы, предпочтительно приблизительно сферической формы(затем их в основном называют бусами), имеющие размеры, которые могут быть от 0,3 до 100 мкм в диаметре, предпочтительно от 0,5 до 40 мкм. Такие частицы производятся, например, компаниями Luminex, Merck или Dynal. Частицы предпочтительно состоят из полимеров, которые являются инертными в отношении составляющих биологических образцов; они являются твердыми и нерастворимыми в образцах. Используемые полимеры могут представлять собой сложные полиэфиры, простые полиэфиры, полиолефины,полиамиды, полисахариды, полиуретаны или целлюлозы. Также могут быть использованы связующие для придания частицам целостности и структуры. Функциональные группы могут быть включены с этими полимерами для того, чтобы дать возможность для присоединения или соединения макромолекул, представляющих биологический интерес (белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот). Эти функциональные группы, известные специалистам в данной области, могут представлять собой аминные функциональные группы (-NH2) или аммонийные функциональные группы (-NH3+ или -NR3+), спиртовые функциональные группы (-ОН), карбоксильные функциональные группы (-СООН) или изодианатные функциональные группы (-NCO). Мономеры, наиболее часто используемые для введения функциональных групп СООН в полиолефины, представляют-6 017206 собой акриловую кислоту или метакриловую кислоту. Присоединение реактивов к поверхности частиц можно осуществлять с помощью электростатического притяжения, аффинных взаимодействий, гидрофобных взаимодействий или ковалентного присоединения. Ковалентное присоединение является предпочтительным. Частицы, используемые в настоящем изобретении, могут различаться тем, что они несут специфические детектируемые физические параметры, т.е. дифференциальные маркеры для того, чтобы отличить их друг от друга с помощью проточной цитометрии. Предпочтительно используют по меньшей мере два типа различных меток или параметров. Например, частицы могут быть пропитаны одним или несколькими красителями (например, флуоресцентным, люминесцентным и т.д.), когда это целесообразно, с различными концентрациями, или меткой радиоизотопного, ферментного и т.д. типа (Venkatasubbarao S.(2004), 100:252-266). Альтернативно, могут быть использованы частицы различных размеров. В предпочтительном варианте осуществления различимые частицы испускают люминесцентные или флуоресцентные сигналы. Например, могут быть использованы суперпарамагнитные флуоресцентные бусы от фирмы Luminex. Эти физико-химические свойства также могут дать возможность во время реакции с биологическим образцом отделить фракции, захваченные этими микрочастицами, от тех, которые являются несвязанными. Это разделение может быть выполнено, среди прочего, путем центрифугирования, фильтрации или намагничивания. Разделение намагничиванием является предпочтительным, для этого могут быть использованы бусы, содержащие парамагнитные, ферромагнитные, ферримагнитные и метамагнитные компоненты. Парамагнитные компоненты являются предпочтительными, например железо, кобальт, никель или оксиды металлов, такие как Mn2O3, Cr2O или Fe3O4. Количество магнитных компонентов может составлять от 2 до 50 мас.%, предпочтительно примерно от 3 до 25%. В предпочтительном варианте осуществления в настоящем изобретении используют метод иммуноанализа, в котором объединяется проточная цитометрия с применением корпускулярной, предпочтительно суперпарамагнитной подложки в качестве твердой фазы (используя, в одном и том же сосуде,несколько категорий или групп различных частиц). Каждая группа частиц специфична для иммунологической реакции и может отличаться от других частиц физико-химическими свойствами (размером, гранулометрическим составом, флуоресценцией и/или оптической плотностью). Это свойство суперпарамагнитных частиц облегчает разделение между твердой и жидкой фазами на стадиях промывания и позволяет автоматизировать исследования. Однако,необязательно, чтобы используемые бусы были суперпарамагнитными. В качестве суперпарамагнитных бус, которые могут быть использованы, можно, в частности, упомянуть бусы, описанные в патенте США 6872578. Конечная фаза выявления в соответствии со способом по настоящему изобретению в основном предусматривает:i) одновременное считывание с помощью детектора, способного дифференцировать сигналы от двух групп частиц, упомянутых выше, меченных иммунных комплексов со стадии с) на каждой частице;ii) отдельное получение результатов для каждой группы частиц иiii) интерпретацию результатов, как показатель наличия или отсутствия суммарных иммуноглобулинов (суммарных Ig) и/или иммуноглобулинов М, направленных против указанного микроорганизма. Частицы предварительно подвергают определению с помощью проточной цитометрии, как описано, например, в патентной заявке Luminex WO 97/14028. Таким образом, подгруппы частиц, несущих реагент (антитело или антиген), подвергают действию биологического образца, каждая подгруппа имеет один или несколько классификационных параметров, которые делают возможным различать частицы одной подгруппы от другой подгруппы. Частицы, таким образом, подвергающиеся воздействию образца,затем проходят в зону контроля (т.е. цитометр), где собираются данные, касающиеся классификационных параметров (например, интенсивностей эмиссии флуоресценции), и предпочтительно также данные,касающиеся наличия или отсутствия комплекса, сформированного между реагентом и аналитом, представляющим интерес. Таким образом, в том случае, когда частицы испускают флуоресцентные сигналы, после добавления анализируемого образца и специфических конъюгатов (меченных, например, флуоресцентной меткой),флуоресцентные сигналы, испускаемые иммунными комплексами, образованными на каждой частице,измеряют, используя корпускулярный проточный цитометр с лазерным ридером (например, аппарат типаLuminex). Флуоресценция, специфичная для каждой частицы, регистрируется по отдельности, но одновременно для всех частиц. Полностью отдельный и различимый сигнал наконец получают для каждой группы частиц. Таким образом, настоящее изобретение дает возможность получить, с помощью простого и автоматизируемого протокола, два отдельных и чувствительных измерения, одно для IgM, другое для суммарных иммуноглобулинов, направленных против одного и того же инфекционного микроорганизма. Настоящее изобретение описано ниже более конкретно в отношении одновременного выявленияIgM и IgG (или суммарных Ig) против вируса гепатита А и против вируса гепатита В, и для одновременного выявления IgM и IgG (или суммарных Ig) в отношении Treponema pallidum, инфекционного бактериального агента, вызывающего сифилис. Однако само собой разумеется, что настоящее изобретение применяется широко ко всем вирусам(HSV, вирусу Денге, другим флавивирусам, таким как вирус лихорадки Западного Нила; вирусам краснухи и гриппа, VZV, CMV, и т.д.), ко всем бактериям (Treponema pallidum, Borrelia burgdorfen, и т.д.) и/или ко всем паразитам (Toxoplasma gondu, и т.д.), при которых также существует необходимость одновременного выявления IgM и IgG (или суммарных иммуноглобулинов) в одном и том же сосуде для исследования, без какой-либо потери чувствительности. В способе по настоящему изобретению образец не нужно подвергать предварительной обработке,такой как ферментативная реакция, расщепление или модификация, или такой как химическая реакция или модификация, или подобное и т.д. (например, с помощью зонального ультрацентрифугирования или ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы, гель-фильтрации, адсобрции IgG посредством стафилококкового белка А, или посредством анти-гамма Fc антитела или иного расщепления IgM с помощью меркаптоэтанола). Однако можно осуществлять способ по настоящему изобретению с образцом, который подвергался такой предварительной обработке. Сосуд может представлять собой любой твердый контейнер, например пробирку, лунку микропланшета или реакционную кювету, изготовленную из полипропилена. Удаление несвязавшихся реагентов можно осуществить с помощью любой методики, известной специалистам в данной области, такой как промывание, посредством повторных стадий центрифугирования, или используя преимущество суперпарамагнитной природы бус, применяя магниты. В особом варианте осуществления способа по настоящему изобретению микроорганизм выбирают из группы, состоящей из вирусов человека, бактерий и паразитов, предпочтительно одноклеточных паразитов. В предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению микроорганизм выбирают из группы, состоящей из вирусов человека. В особенно предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению микроорганизм выбирают из группы, состоящей из вирусов гепатита человека, таких как вирусы HAV и HBV. В предпочтительном варианте осуществления указанный микроорганизм представляет собой вирус гепатита А человека (HAV), для которого затем возможно получить более низкий предел чувствительности для суммарных анти-HAV иммуноглобулинов приблизительно 20 мМЕ/мл. Объектом настоящего изобретения также является набор реагентов для осуществления способа по настоящему изобретению. Объектом настоящего изобретения также является набор реагентов для осуществления способа по настоящему изобретению. Тип одновременного и объединенного выявления IgM, направленных против инфекционного микроорганизма и IgG антител или суммарных Ig против того же инфекционного организма, в контексте настоящего изобретения называется "мультиплексным выявлением" в отличие от "симплексного выявления" (в котором выявления IgM и IgG или суммарных Ig осуществляют независимо, т.е. не объединено). Настоящее изобретение также направлено на и охватывает все варианты одновременного способа выявления, эти варианты могут быть получены способами, известными по существу, или могут быть получены специалистами в данной области, не отклоняясь от сущности настоящего изобретения. Настоящее изобретение теперь будет пояснено более подробно следующими примерами. Следующие фигуры и примеры иллюстрируют изобретение, не ограничивая его объем. Описания фигур На фиг. 1 представлена схема, демонстрирующая выявление анти-HAV IgG и IgM с помощью формата двойной иммуносорбции (предшествующий уровень техники). На фиг. 2 представлена схема, демонстрирующая способ по изобретению для выявления суммарных анти-HAV Ig в сэндвич-формате и анти-HAV IgM путем иммуносорбции. На фиг. 3 представлена схема, демонстрирующая способ по изобретению для выявления суммарных анти-НВс Ig в сэндвич-формате и анти-НВс IgM путем иммуносорбции. На фиг. 4 представлен график, демонстрирующий сравнение стандартных интервалов для суммарных анти-HAV Ig, исследованных с помощью единичного формата IgG (иммуносорбции), и с помощью единичного сэндвич-формата суммарных Ig. На фиг. 5 представлен график, демонстрирующий сравнение стандартных интервалов для суммарных анти-HAV Ig, исследованных с помощью единичного сэндвич-формата и с помощью мультиплексного. На фиг. 6 представлена схема, демонстрирующая способ по изобретению для выявления суммарных-8 017206 Экспериментальный раздел. Пример 1. Способ в соответствии с предшествующим уровнем техники. Принцип этого исследования в соответствии с предшествующим уровнем техники проиллюстрирован на фиг. 1. Материалы и методы. Материалы. 1. Аналитическая система: Анализатор BioPlex 2200 (Bio-Rad, Marnes la Coquette, France) использовали в соответствии с инструкциями производителя. Это автоматизированное иммуноаналитическое устройство содержит проточный цитометр и детектор Luminex 100 (Luminex Corp., Austin, Texas, United States) и использует гетерогенный набор суперпарамагнитных частиц. Каждая группа частиц, состоящая из полистирола и метакриловой кислоты (функциональная группа СООН) и имеющая размер 8 мкм в диаметре, производится с различным процентным содержанием флуорохромов (CL1 и CL2), продуцирующих уникальный идентификационный код, присвоенный каждой группе частиц и детектируемый лазером детектора Luminex 100 (Luminex Corp., Austin, Texas, United States). После иммунологической реакции бусы проходят одна за другой через проточную кювету в центре жидкого матрикса, таким образом, чтобы одновременно возбуждались и считывались двумя отдельными лазерами. Измерения проводят при прохождении бус. 638 нм красный лазер возбуждает идентифицирующие флуорохромы (CL1 и CL2), находящиеся на поверхности каждой частицы, и составной сигнал интерпретируется таким образом, чтобы идентифицировать аналит частицы. Путем идентификации категории частицы этот лазер, таким образом, служит для идентификации проводимого исследования. 532 нм зеленый лазер возбуждает флуоресцентный зонд (конъюгат, меченный фикоэритрином(РЕ, и испускаемая флуоресценция пропорциональна конъюгату, присоединенному к частице. Следовательно, этот лазер служит для измерения реакционной способности аналита, иммобилизованного на указанной частице. Система программного обеспечения преобразует сигнал конъюгата в величину относительной интенсивности флуоресценции (RFI). Затем сигналы сравнивают со стандартной кривой, специфичной для этого исследования для определения концентрации аналита. Соотношение также может быть рассчитано для качественной классификации результата, как положительного или отрицательного. 2. Твердая фаза. Использовали две различные группы суперпарамагнитных частиц Luminex (Luminex Corp., Austin, Texas, United States). Каждая группа частиц покрыта лигандом, специфичным для конкретного исследования. Каждый лиганд соединен с помощью гетеробифункционального реагента. Группа 1: мышиное моноклональное антитело против IgM человека (Hytest, Финляндия), иммобилизованное с концентрацией 10 мкг/мг частиц. Группа 2: мышиное моноклональное антитело против IgG человека (Fc гамма; Jackson Immuno Research, Соединенные Штаты), иммобилизованное с концентрацией 20 мкг/мл частиц. 3. Антиген HAV.HAV антиген от Viral Antigen, Memphis, Tennessee, Соединенные Штаты. 4. Флуорохром. Фикоэритрин от Cyanotech, Hawaii, Соединенные Штаты. 5. Конъюгат. Мышиное моноклональное антитело против HAV (Bio-Rad, Marnes la Coquette, Франция), соединенное с фикоэритрином (РЕ) с помощью гетеробифункционального реагента, по существу, известного специалистам в данной области. 6. Разбавители. 6.1. Разбавители суперпарамагнитных частиц. Раствор 20 мМ цитратного буфера, рН 5,6, содержащий 116 мМ NaCl, 5,6 мМ EDTA, 2% Тритон,10% сыворотку барана, 0,5 г/л мышиного IgG, 0,5% Proclin 300 (товарный знак компании Supelco), 25% коровьего молока (100% обезжиренное), 0,13% IgG BS3. 6.2. Разбавители для антигена HAV и для конъюгата. Раствор 50 мМ фосфатного буфера, рН 7,1, содержащий 150 мМ NaCl; 0,1% NaN3, 1% BSA, 2,75% ПЭГ 6000, 0,1% Tween20 (товарный знак компании), 1% сыворотки барана, 1 г/л мышиного IgG. 6.3. Разбавители для стадии 1 или промывочный раствор. Фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 150 мМ NaCl, 0,1% Tween 20 (товарный знак компанииSxgma), 0,034% Proclin 300 (товарный знак компании Supelco), 0,095% NaN3. 7. Реакционные кюветы. Иммунологические реакции проводили в полипропиленовой реакционной кювете объемом 1 мл.-9 017206 8. Стандарты. Стандарт ВОЗ суммарных иммуноглобулинов против HAV (код 97/646) воспроизводили в соответствии с рекомендациями и разбавляли таким образом, чтобы получить следующие стандартные точки: 0; 20; 80; 160; 320 и 640 мМЕ/мл. Методы Протокол исследования. Стадия 1. 1. Следующее последовательно помещали в каждую реакционную кювету: 5 мкл образца или стандарта + 250 мкл разбавителей для стадии 1,10 мкл иммунологически реактивных частиц (50:50 смесь частиц групп 1 и 2) + 250 мкл разбавителей для стадии 1. 2. После гомогенизации смесь инкубируют в течение 40 мин при 37 С. 3. Затем проводят стадии промывания: разделение твердой и жидкой фаз путем намагничивания и три последовательных промывания по меньшей мере 300 мкл промывочного раствора. При окончательном промывании частицы ресуспендируют. Стадия 2. 4. 50 мкл раствора антигена HAV (Ag HAV) помещают в каждую реакционную кювету. 5. После гомогенизирования смесь инкубируют в течение 15 мин при 37 С. 6. Затем проводят стадии промывания (упомянутый ранее п.3). Стадия 3. 7. 50 мкл конъюгата (анти-HAV антитело-фикоэритрин, т.е. Mab-PE) помещают в каждую реакционную кювету. 8. После гомогенизации смесь инкубируют в течение 15 мин при 37 С. 9. Затем проводят стадии промывания (упомянутый выше п.3). 10. Частицы каждой лунки ресуспендируют путем добавления к ним 35 мкл промывочного раствора со встряхиванием. 11. Суспензию частиц каждой лунки извлекают с помощью проточного цитометра. 12. Суспензию частиц каждой кюветы считывают, используя два лазерных луча. 13. Результаты считываний непосредственно обрабатывают с помощью проточного цитометра и регистрируют в относительных единицах интенсивности флуоресценции (единицы RFI). 14. Для интерпретации результатов для каждой стандартной точки (или образца) соотношение рассчитывают относительно значения величины отсечки. Относительно суммарных анти-HAV Ig, величина отсечки соответствует величине RFI стандартной точки при 20 мМЕ/мл, считающейся величиной отсечки защитной величины. Таким образом, соотношение образцов рассчитывают следующим образом: Образцы, соотношение которых превышает 1, признают положительными, образцы, для которых соотношения ниже 1, признают отрицательными.все исследования образцов, полученных от человека, проводят дважды (в виде двух повторов), и используемые результаты RFI исходят от среднего этих двух повторов. Результаты исследований, проводимых в стандартном интервале. Выявление IgM с помощью иммуносорбции не вызывало никаких проблем. В частности, внимание было обращено на формат иммуносорбции анти-HAV IgG для достижения аналитической чувствительности 20 мМЕ/мл. Однако в проводимых исследованиях формат иммуносорбции для выявления анти-HAV IgG демонстрирует явную недостаточную чувствительность (см. табл. 1 и графу 1). Это происходит вследствие того, что соотношения, рассчитанные для стандартов между 0 и 80 мМЕ/мл, существенно не отличаются один от другого и они находятся слишком близко к соотношению стандарта 20 мМЕ/мл (соотношение=1,0), чтобы быть достоверно выделенными. Эти соотношения только начинают повышаться и, следовательно, являются отражением суммарного выявления Ig для стандартов между 160 и 640 мМЕ/мл.- 10017206 Таблица 1 Исследование стандартного диапазона суммарных анти-HAV Ig Эта недостаточная чувствительность происходит вследствие того факта, что используемая твердая фаза (частицы против IgG человека) не дают возможности специфически захватывать IgG, направленные против аналита. Следовательно, твердая фаза насыщается всеми другими IgG в сыворотке. Этот феномен не наблюдается в формате иммуносорбции для IgM, поскольку редко одновременно имеется несколько инфекций и в сыворотке имеются IgM, направленные против различных инфекционных агентов во время острой инфекции. Этот формат иммуносорбции, следовательно, рассматривался для выявления IgM, но отвергнут для выявления IgG и заменен сэндвич-форматом. Результаты, полученные для последнего формата, будут описаны ниже. Пример 2. Способ выявления по настоящему изобретению, применяемый для выявления суммарных Ig и IgM против HAV. Способ мультиплексного выявления в соответствии с настоящим изобретением описан ниже и на фиг. 2. Материалы и методы. Материалы. Материал, по существу, идентичен материалу, используемому в примере 1, кроме исключений, указанных ниже. 1. Аналитическая система: см. описание примера 1. 2. Твердая фаза. Используют две различные группы суперпарамагнитных частиц Luminex (Luminex Corp., Austin,Texas, Соединенные Штаты). Группа 1: мышиное моноклональное антитело против IgM человека (Hytest, Finland), иммобилизованное при концентрации 10 мкг/мл частиц. Группа 2: антиген HAV (Viral Ag, Memphis, Tennessee, United States), иммобилизованный при концентрации 2,5 мкг/мг частиц. 3. Конъюгат 1.(сокращенно "РЕ") от Cyanotech, Hawaii, United States. 5. Разбавители. Разбавители для бус и для конъюгатов 1 и 2, разбавитель для стадии 1 и промывочный раствор идентичны таковым примера 1. 6. Стандарты. Стандарт ВОЗ суммарных иммуноглобулинов против HAV (код 97/646) идентичен стандарту, используемому в примере 1. 7. Образцы. Исследуемые образцы, полученные от человека, представляют собой образцы плазмы или сыворотки, которые являются положительными или отрицательными в отношении суммарных иммуноглобулинов против HAV и/или IgM. Эти образцы получают из внутренних библиотек образцов, составленных из образцов, продаваемых следующими компаниями:Life Sera - 780 Park North Blvd, Suite 100, Clarkston, GA 30021, United States. Исследуемые образцы, полученные от человека, могут быть подразделены на: 30 образцов, отрицательных в отношении суммарных иммуноглобулинов и IgM против HAV (двойные отрицательные); 26 образцов, положительных в отношении суммарных иммуноглобулинов против HAV и отрицательных в отношении анти-HAV IgM; 15 образцов, положительных в отношении анти-HAV IgM и отрицательных в отношении суммарных иммуноглобулинов против HAV. Способы. Протоколы исследования. В описанных далее исследованиях осуществляют три протокола исследования. Мультиплексный протокол в соответствии с настоящим изобретение (т.е. протокол для суммарныхIg + протокол для IgM) и два единичных протокола (протокол для суммарных Ig и протокол для IgM). Эти три протокола идентичны, за исключением стадии добавления используемых иммунологически реактивных суперпарамагнитных частиц. В мультиплексном протоколе используют две группы бус, а в каждом единичном протоколе используют одну группу бус. Количество частиц группы 1 (несущих антиIgM антитела), используемых в единичном протоколе для IgM, и мультиплексный протокол остается таким же. Аналогично, количество частиц группы 2 (несущих антиген HAV), используемых в единичном протоколе для суммарных Ig, и в мультиплексном протоколе остается таким же. А. Единичный протокол для выявления суммарных анти-HAV Ig. Стадия 1. 1. Следующее последовательно помещают в каждую реакционную кювету: 25 мкл образца или стандарта + 225 мкл разбавителей для стадии 1; 10 мкл иммунологически реактивных частиц группы 2 (HAV антиген) + 250 мкл разбавителей для стадии 1. 2. После гомогенизации смесь инкубируют в течение 40 мин при 37 С. 3. Затем проводят стадии промывания: упомянутый ранее п.3 примера 1. Стадия 2. 4. 50 мкл раствора конъюгата 1 (биотинилированный антиген HAV, т.е. "Ag HAV биотин") помещают в каждую реакционную кювету. 5. После гомогенизации смесь инкубируют в течение 15 мин при 37 С. 6. Затем проводят стадии промывания: упомянутый ранее п.3. Стадия 3. 7. 50 мкл конъюгата 2 (стрептавидин-фикоэритрин, т.е. "Strepta-PE") помещают в каждую реакционную кювету. 8. После гомогенизации смесь инкубируют в течение 15 мин при 37 С. 9. Затем проводят стадии промывания: упомянутый ранее п.3. 10. Частицы каждой реакционной кюветы ресуспендируют добавлением к ним 35 мкл промывочного раствора путем встряхивания. 11. Суспензию частиц каждой реакционной кюветы извлекают с помощью проточного цитометра. 12. Суспензию частиц каждой кюветы считывают, используя два лазерных луча. 13. Результаты считываний непосредственно обрабатывают с помощью проточного цитометра и регистрируют в относительных единицах интенсивности флуоресценции (единицы RFI). 14. Для интерпретации результатов для каждой стандартной точки (или образца) соотношение рассчитывают относительно значения величины отсечки. Относительно суммарных анти-HAV Ig величина отсечки соответствует величине RFI стандартной точки при 20 мМЕ/мл, считающейся величиной отсечки защитной величины. Соотношение образцов рассчитывают следующим образом: Образцы, соотношение которых превышает 1, признают положительными, образцы, для которых соотношения ниже 1, признают отрицательными.все исследования образцов, полученных от человека, проводят дважды (в виде двух повторов), и используемые результаты RFI исходят от среднего этих двух повторов. В. Единичный протокол для выявления анти-HAV IgM. Стадия 1. 1. Следующее последовательно помещают в каждую реакционную кювету: 25 мкл образца или стандарта + 225 мкл разбавителей для стадии 1;- 12017206 10 мкл иммунологически реактивных частиц группы 1 (анти-IgM антитела) + 250 мкл разбавителей для стадии 1. Все остальные стадии (2-13) единичного протокола для IgM строго идентичны стадиям 2-13 единичного протокола для суммарных Ig. 14. Для расчета соотношения образцов в отношении HAV IgM величина отсечки представляет собой среднее RFI отрицательных образцов + 12 стандартных отклонений. Соотношение образцов рассчитывают, следовательно, следующим образом: Образцы, соотношение которых превышает 1, признают положительными, образцы, для которых соотношения ниже 1, признают отрицательными.все исследования образцов, полученных от человека, проводят дважды (в виде двух повторов), и используемые результаты RFI исходят от среднего этих двух повторов. С. Мультиплексный протокол в соответствии с настоящим изобретением (одновременное выявление суммарных Ig против HAV и IgM). Стадия 1. 1. Следующее последовательно помещают в каждую реакционную кювету: 25 мкл образца или стандарта + 225 мкл разбавителей для стадии 1; 10 мкл иммунологически реактивных частиц (50:50 смесь частиц групп 1 и 2) + 250 мкл разбавителей для стадии 1. Все другие стадии (2-14) мультиплексного протокола строго идентичны стадиям 2-14 единичных протоколов для суммарных Ig и IgM. Полученные результаты. 1. Диапазоны значений измеряемой величины. 1.1. Стандартный диапазон суммарных анти-HAV Ig, исследуемых с помощью единичного сэндвича. Результаты, полученные со стандартным диапазоном (от 0 до 640 мМЕ/мл), выполняемые с помощью единичного сэндвича, показали, что сэндвич-формат для суммарных Ig является гораздо более чувствительным, чем формат иммуносорбции IgG из примера 1 (см. табл. 2 и фиг. 4). Таблица 2 Сравнение стандартного диапазона суммарных анти-HAV Ig, исследуемых с помощью формата единичной иммуносорбции IgG (пример 1) и с помощью единичного сэндвич-формата для суммарных Ig (пример 2) 1.2. Стандартный диапазон суммарных анти-HAV Ig, исследованных с помощью мультиплексного способа. Результаты, полученные со стандартным диапазоном, выполненные с помощью сэндвича в соответствии с мультиплексным протоколом по настоящему изобретению, представлены в табл. 3 и на фиг. 5.- 13017206 Таблица 3 Сравнение стандартных диапазонов суммарных Ig с помощью единичного сэндвич-формата и с помощью мультиплексного формата Отмечается, что чувствительность мультиплексного сэндвич-формата для суммарных Ig остается неизменной относительно чувствительности, полученной с единичным сэндвич-форматом. 2. Образцы. 2.1. Исследование образцов для суммарных анти-HAV Ig с помощью единичного сэндвича и мультиплексного сэндвича. Результаты, полученные с образцами от человека для суммарных анти-HAV Ig, приведены в табл. 4. Таблица 4 Сравнение исследования образцов на суммарные анти-HAV Ig посредством единичного сэндвичформата и посредством мультиплексного формата в соответствии с настоящим изобретением Очень хорошее различие отмечается между отрицательными образцами (n=30) и положительными образцами (n=26) в сэндвич-исследовании суммарных анти-HAV Ig независимо от того, проводилось ли оно посредством единичного формата или посредством мультиплексного в соответствии с настоящим изобретением. Следовательно, эти результаты показывают, что чувствительность выявления суммарных антиHAV Ig не снижается в мультиплексном способе в соответствии с настоящим изобретением. Все положительные образцы действительно найдены положительными способом по настоящему изобретению, который, таким образом, дает возможность также получать хорошую клиническую чувствительность. 2.2. Исследование образцов на анти-HAV IgM посредством единичного и мультиплексного формата иммуносорбции. Результаты, полученные с образцами от человека в отношении анти-HAV IgM, представлены в табл. 5. Таблица 5 Сравнение исследования образцов на анти-HAV IgM посредством единичного формата иммуносорбции и мультиплексного формата иммуносорбции в соответствии с настоящим изобретением Очень хорошее различие отмечается между образцами, отрицательными по анти-HAV IgM(n=30+26), и образцами, положительными по анти-HAV IgM (n=15) в исследовании анти-HAV IgM посредством иммуносорбции, независимо от того, проводилось ли оно посредством единичного формата или посредством мультиплексного в соответствии с настоящим изобретением. Эти результаты показывают, что чувствительность выявления IgM с помощью иммуносорбции не снижается объединением с сэндвич-анализом в мультиплексном способе по настоящему изобретению.- 15017206 Все положительные образцы действительно найдены положительными с помощью способа по настоящему изобретению, который, таким образом, также делает возможным получать хорошую клиническую чувствительность. Пример 3. Способ выявления в соответствии с настоящим изобретением, применяемый для выявления суммарных Ig и IgM против НВс. Мультиплексный способ выявления по настоящему изобретению также был использован для исследования суммарных Ig и IgM против НВс. Этот способ проиллюстрирован на фиг. 3 и описан ниже. Материалы и методы. Материалы. Используемые материалы эквивалентны материалам примера 2, за исключением частиц, биотинилированного конъюгата 1 и тестируемых образцов. 1. Твердая фаза. Используют две различные группы суперпарамагнитных частиц Luminex (Luminex Corp., Austin,Texas, United States). Группа 1: козье поликлональное антитело против IgM человека (Bio-Rad, Marnes la Coquette), иммобилизованное при концентрации 10 мкг/мг частиц. Группа 2: рекомбинантный антиген НВ (Virogen, Watertown, MA, United States), иммобилизованный при концентрации 10 мкг/мл частиц. 2. Конъюгат 1. Рекомбинантный антиген НВс (Biokit, Barcelona, Spain), меченный биотином (Pierce, Rockford, IL,United States). 3. Образцы. Исследуемые образцы, полученные от человека, представляют собой образцы плазмы или сыворотки, которые являются положительными или отрицательными в отношении суммарных иммуноглобулинов против НВс и/или IgM против НВс. Эти образцы поступают из внутренних библиотек образцов из образцов, продаваемых компаниями:Zeptometrix Corporation - 872 Main St., Buffalo, NY 14202, United States. Исследуемые образцы, полученные от человека, могут быть подразделены на: 10 образцов, отрицательных по суммарным иммуноглобулинам против НВс и IgM против НВс(двойные отрицательные); 10 образцов, положительных по суммарным иммуноглобулинам против НВс и отрицательных по анти-НВс IgM; 10 образцов, положительных по анти-НВс IgM и отрицательных по суммарным иммуноглобулинам против НВс. Методы. Протоколы исследования. Используемые протоколы идентичны протоколам А, В и С, описанным выше в примере 2, за исключением используемого объема образцов, используемого на стадии 1, который составляет 5 + 250 мкл разбавителя для стадии 1. Другие стадии являются идентичными, в том числе стадия интерпретации. Для исследования суммарных анти-НВс Ig и анти-НВс IgM величина отсечки представляет собой среднее RFI отрицательных образцов + 12 стандартных отклонений. Вычисленное соотношение образцов относительно величины отсечки таким образом представляет собой следующее: Образцы, соотношение которых превышает 1, признают положительными, образцы, для которых соотношения ниже 1, признают отрицательными.все исследования образцов, полученных от человека, проводят дважды (в виде двух повторов), и используемые результаты RFI исходят от среднего этих двух повторов.- 16017206 Полученные результаты. Таблица 6 Сравнение исследования образцов на суммарные анти-НВс Ig посредством единичного сэндвич-формата и посредством мультиплексного формата в соответствии с настоящим изобретением Очень хорошее различие отмечается между отрицательными образцами (n=10) и положительными образцами (n=20) в сэндвич-исследовании суммарных анти-НВс Ig, независимо от того, проводилось ли оно посредством единичного формата, или посредством мультиплексного формата в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, эти результаты показывают, что чувствительность выявления суммарных анти-НВсIg не снижается в мультиплексном способе по настоящему изобретению. Все положительные образцы действительно найдены положительными с помощью способа по настоящему изобретению, который, следовательно, дает возможность также получать хорошую клиническую чувствительность.- 17017206 Таблица 7 Сравнение исследования образцов на анти-НВс IgM посредством единичного формата иммуносорбции и посредством мультиплексного формата иммуносорбции в соответствии с настоящим изобретением Очень хорошее различие отмечается между образцами, отрицательными в отношении анти-НВсIgM (n=10+10), и образцами, положительными в отношении анти-НВс IgM (n=10) в анализе иммуносорбции анти-НВс IgM, независимо от того, проводится ли посредством единичного формата или посредством мультиплексного формата в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, эти результаты показывают, что чувствительность выявления IgM посредством иммуносорбции не снижается путем объединения с сэндвич-анализом в мультиплексном способе в соответствии с настоящим изобретением. Все положительные образцы действительно найдены положительными с помощью способа по настоящему изобретению, который, следовательно, дает возможность также получать хорошую клиническую чувствительность. Пример 4. Способ выявления по изобретению, применяемый для выявления суммарных Ig и IgM против сифилиса. Мультиплексный способ выявления по настоящему изобретению также был использован для исследования суммарных Ig против Treponema pallidum и IgM против Treponema pallidum, Treponema pallidum,являющейся инфекционным бактериальным агентом, вызывающим сифилис. Этот способ проиллюстрирован на фиг. 6 и описан ниже. Материалы и методы. Материалы. Используемые материалы эквивалентны материалам примеров 2 и 3, за исключением частиц, биотинилированного конъюгата 1 и тестируемых образцов. 1. Твердая фаза. Используют две различные группы суперпарамагнитных частиц Luminex (Luminex Corp., Austin,Texas, United States). Группа 1: мышиное моноклональное антитело против IgM человека (Hytest, Finland), иммобилизованное при концентрации 2,5 мкг/мг частиц. Группа 2: рекомбинантные антигены TpN17 и TpN47 Treponema pallidum (New Market LaboratoriesLtd, Kentford, England), иммобилизованные соответственно при концентрации 5 мкг/мг и 1,25 мкг/мг частиц.- 18017206 2. Конъюгат 1. Рекомбинантные антигены TpN17 и TpN47 (New Market Laboratories Ltd, Kentford, England), меченные биотином (Pierce, Rockford, IL, United States). 3. Образцы. Исследуемые образцы, полученные от человека, представляют собой образцы плазмы или сыворотки, которые положительны или отрицательны по суммарным иммуноглобулинам против Treponema pallidum и/или IgM против Treponema pallidum. Эти образцы получают из внутренних библиотек образцов.SeraCare Life Science - 375 West Street, West Bridgewater, MA 02379, United States. Исследуемые образцы, полученные от человека, могут быть подразделены на: 35 образцов, отрицательных в отношении суммарных иммуноглобулинов против Treponema pallidum и IgM против Treponema pallidum (двойные отрицательные); 3 образца, положительных в отношении суммарных иммуноглобулинов против Treponema pallidum и отрицательных в отношении IgM против Treponema pallidum (образцы 1, 2, 3); 4 образца, положительных в отношении IgM против Treponema pallidum и отрицательных в отношении суммарных иммуноглобулинов против Treponema pallidum (образцы 4, 5, 6, 7). Методы. Протоколы исследования. Используемые протоколы идентичны протоколам А, В и С, описанным выше в примере 2, за исключением объемов на стадии 1, которые составляют 100 мкл для образца и 100 мкл для бус, и на стадии 2, который составляет 100 мкл раствора конъюгата 1 (биотинилированные антигены Treponema pallidum). Другие стадии идентичны, в том числе стадия интерпретации. Интерпретация результатов. Для исследования суммарных Ig против Treponema pallidum и IgM против Treponema pallidum величина отсечки составляет среднее значение RFI отрицательных образцов, деленное на 0,3. Вычисленное соотношение образцов относительно величины отсечки таким образом представляет собой следующее: Образцы, соотношение которых превышает или равно 1, признают положительными, образцы, для которых соотношения меньше 1, признают отрицательными.все исследования образцов, полученных от человека, проводят в трех повторах, и используемые результаты RFI исходят от среднего этих трех повторов. Полученные результаты: Таблица 8 Сравнение исследования образцов на суммарные Ig против Treponema pallidum посредством единичного сэндвич-формата и посредством мультиплексного формата в соответствии с настоящим изобретением- 19017206 Очень хорошее различие отмечается между отрицательными образцами (n=35) и положительными образцами (n=3) в сэндвич-анализе суммарных Ig против Treponema pallidum, независимо от того, проводится ли посредством единичного формата или мультиплексного формата в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, эти результаты показывают, что чувствительность выявления суммарных Ig противTreponema pallidum не снижается в мультиплексном способе по настоящему изобретению. Все положительные образцы действительно найдены положительными с помощью способа по настоящему изобретению, который, таким образом, дает возможность также получить хорошую клиническую чувствительность. Таблица 9 Сравнение исследования образцов на IgM против Treponema pallidum с помощью единичного формата иммуносорбции и с помощью мультиплексного формата иммуносорбции в соответствии с настоящим изобретением Очень хорошее различие отмечается между образцами, отрицательными в отношении IgM противTreponema pallidum (n=35+3), и образцами, положительными в отношении IgM против Treponema pallidum (n=3) в исследовании IgM против Treponema pallidum посредством иммуносорбции, независимо проводилось ли посредством единичного формата или мультиплексного формата в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, эти результаты показывают, что чувствительность выявления IgM посредством иммуносорбции не снижается путем объединения с сэндвич-исследованием в мультиплексном способе по настоящему изобретению. Все положительные образцы действительно найдены положительными с помощью способа по настоящему изобретению, который, таким образом, делает возможным также получить хорошую клиническую чувствительность. В заключение, результаты, полученные в примерах 2, 3 и 4, используя мультиплексный способ по настоящему изобретению, который объединяет выявление IgM посредством иммуносорбции и выявление суммарных Ig посредством сэндвич-анализа, отчетливо демонстрируют, что способ по настоящему изобретению дает возможность осуществлять чувствительное выявление и дифференцирование антител класса суммарных Ig или IgG и IgM, направленных против одного и того же микроорганизма. Специалисты в данной области на основании этого без труда сделают вывод, что этот способ мультиплексного выявления IgG и IgM по настоящему изобретению действительно представляет собой способ общего применения, который может быть адаптирован для многих микроорганизмов, для которых это имеет большое значение с диагностической точки зрения для выявления суммарных Ig и IgM.- 20017206 Более того, способ по настоящему изобретению может быть без труда автоматизирован посредством использования автоматического устройства, например, такого как BioPlex 2200 от Bio-Rad, который позволяет осуществлять протоколы исследования одновременно и быстро в одном сосуде и считывать сигналы на одной стадии. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ in vitro диагностического выявления инфицирования микроорганизмом, предусматривающий одновременное выявление i) иммуноглобулинов G или суммарных иммуноглобулинов, направленных против указанного микроорганизма, и ii) иммуноглобулинов М, направленных против указанного микроорганизма, присутствующих в биологическом образце, указанный способ включает следующие стадии:a) размещение биологического образца в одном аналитическом сосуде в присутствии частиц, несущих по меньшей мере один специфический детектируемый физический параметр и принадлежащих по меньшей мере двум различным группам, одной из групп, несущей иммобилизованное антитело противIgM, для того, чтобы захватывать иммуноглобулины М, направленные против указанного микроорганизма, и другой группе, несущей иммобилизованный антиген, полученный из указанного микроорганизма, для того, чтобы захватить иммуноглобулины G или суммарные иммуноглобулины, направленные против указанных микроорганизмов;b) инкубирование смеси в условиях, которые дают возможность образования иммунологических комплексов, с одной стороны, между иммобилизованным анти-IgM антителом и антителами IgM и, с другой стороны, между иммобилизованным антигеном, полученным из указанного микроорганизма, иIgG или суммарными иммуноглобулинами, на каждой группе частиц;c) выведение иммуноглобулинов, которые не связались с частицами;d) инкубирование смеси, полученной после выведения не связавшихся иммуноглобулинов, как указано в стадии с), по меньшей мере с одним меченым конъюгатом, указанный по меньшей мере один конъюгат состоит исключительно из выявляющего антигена, полученного из указанного микроорганизма, для того, чтобы определить иммунокомплексы между иммобилизованным антигеном, полученным из указанного микроорганизма, и IgG или общими иммуноглобулинами;e) выведение выявляющего антигена, не связавшегося с иммунными комплексами со стадии b);f) одновременное выявление с помощью детектора, способного дифференцировать две группы частиц, упомянутых выше, иммунных комплексов со стадии d) на каждой частице, посредством чего обнаруживается присутствие или отсутствие иммуноглобулинов G или суммарных иммуноглобулинов и/или иммуноглобулинов М, направленных против указанного микроорганизма. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что антиген, полученный из микроорганизма, выбран из группы, состоящей из лизата указанного микроорганизма, одного из его природных антигенов, который был полуочищен или очищен, рекомбинантного белка, его фрагмента и синтетического пептида. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что группы указанных частиц отличаются одна от другой посредством флуорохромов, выявляемых подходящим детектором. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором подходящим детектором является проточный цитометр. 5. Способ по любому из пп.1-4, в котором выявляющий антиген несет биотин, который обнаруживается добавлением меченого авидина или меченого стрептавидина. 6. Способ по любому из пп.1-5, в котором биологический образец представляет собой плазму или сыворотку. 7. Способ по любому из пп.1-6, в котором биологический образец получен от человека. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из вирусов, бактерий и одноклеточных паразитов. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из вирусов гепатита человека. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из вируса гепатита А человека (HAV) и вируса гепатита В человека (HBV). 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный микроорганизм представляет собой вирус гепатита А человека (HAV) и что получают нижний предел определения для суммарных иммуноглобулинов против HAV приблизительно 20 мМЕ/мл. 12. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный микроорганизм представляет собой Treponema pallidum. 13. Способ по любому из пп.1-12, в котором частицы представляют собой суперпарамагнитные частицы. 14. Набор реагентов для проведения способа выявления по любому из пп.1-13, содержащий частицы, несущие по меньшей мере один специфический детектируемый физический параметр и принадлежащие по меньшей мере двум различным группам, одной из групп, несущей иммобилизованное антитело против IgM, и другой группе, несущей иммобилизованный антиген, полученный из выявляемого микро- 21017206 организма. 15. Набор по п.14, отличающийся тем, что указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из вирусов, бактерий и одноклеточных паразитов. 16. Набор по п.15, отличающийся тем, что указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из вирусов гепатита человека. 17. Набор по п.16, отличающийся тем, что указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из вируса гепатита А человека (HAV) и вируса гепатита В человека (HBV). 18. Набор по п.15, отличающийся тем, что указанный микроорганизм представляет собой Treponema pallidum.