Способ выявления туберкулезной инфекции

009817 Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к способам микробиологической диагностики туберкулеза. Для диагностики туберкулеза, как правило, используют методы, включающие отбор и посев биоматериала на питательные среды, культивирование и идентификацию выросших культур по морфологическим, культуральным, биохимическим, антигенным, патогенным и другим свойствам (И.Р. Дорожкова,С.А. Попов, В.А. Пузанов, Л.П. Мартынова, Микробиологические исследования при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза. Ч. 3. М., 2000, 119 с; Микробиологическая диагностика туберкулеза и микобактериозов, в кн.: Туберкулез. Под ред. А.Г. Хоменко. М., Медицина, 1996; Наставление по диагностике туберкулеза животных, утв. ГУВ Госагропрома СССР 25.02.1986 г.; патент 2193068 С 2. RU,опубл. 20.11.2002 г., бюл.32). Недостатками указанных методов являются их низкая чувствительность, значительные затраты времени (до 3 месяцев) и низкая эффективность при исследовании олигобациллярного материала, наличии в нем измененных форм возбудителя. Кроме того, идентификация изолятов общепринятыми методами дорога, трудоемка и требует сложного оборудования. Применение наиболее простого метода идентификации выделенных культур в реакции агглютинации ограничивается видами нетуберкулезных микобактерий, дающих стойкую суспензию бактериальной массы. Способ согласно патенту 2193068 RU не применим к возбудителям туберкулеза млекопитающих, образующих сухие, трудно диспергируемые колонии. Наибольшую надежность продемонстрировал способ диагностики туберкулеза, являющийся прототипом заявляемого изобретения (патент UA43467 от 17.12.2001 г.). Сущность данного способа состоит в том, что биологический материал подготавливают для посева и высевают на питательную среду. Биологический материал обрабатывают стимулятором роста 24-48 ч при температуре 36-38 С, после чего вместе со стимулятором роста высевают на питательную среду,включающую ферментативный пептон, картофельный крахмал, агар-агар, двууглекислый натрий, стимулятор кальцийзависимых ферментов, причем питательную среду готовят непосредственно перед высевом. Недостатками известного способа являются сложности и ошибки диагностики, обусловленные трудностями идентификации возбудителя туберкулеза, так как по морфологии, культуральным, биохимическим и патогенным свойствам изоляты со среды ВКГ не только трудно определить как возбудитель туберкулеза, но и отнести их к роду Mycobacterium. Для верификации результатов необходима обработка культуры 10% едким натрием, пересев на среду Левенштейна-Йенсена без малахитового зеленого с последующим 1-2-месячным культивированием и идентификацией выросшей культуры в биопробе, по биохимическим тестам или методом ПНР (5). Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, является создание способа, позволяющего упростить, удешевить, сократить время анализа и повысить точность выявления возбудителя туберкулеза. Поставленная задача решается в способе выявления туберкулезной инфекции путем инкубации биоматериала в стимуляторе роста ВКГ, его посева на питательную среду ВКГ и культивирования, после которого выросшую культуру смешивают с антисывороткой к антигенам возбудителя туберкулеза млекопитающих и отрицательной контрольной сывороткой для проведения реакции агглютинации и по образованию характерного агглютината судят о принадлежности культуры к возбудителям туберкулеза млекопитающих, причем в способе антисыворотка получена путем инъекций животным дезинтегрированных без нагревания микобактерий туберкулеза с последующей адсорбцией ее культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ, или она может быть получена путем инъекций животным возбудителя туберкулеза млекопитающих, выращенного на питательной среде ВКГ, с последующей адсорбцией культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенных на питательной среде ВКГ. Кроме того, предметом данного изобретения является способ выявления туберкулезной инфекции путем инкубации биоматериала в стимуляторе роста ВКГ, его посева на питательную среду ВКГ и культивирования, в котором после культивирования выросшую культуру смешивают на предметных стеклах с очищенными антителами к антигенам возбудителя туберкулеза млекопитающих, выделенными из антисыворотки, и отрицательной контрольной сывороткой для проведения реакции агглютинации и по образованию характерного агглютината судят о принадлежности культуры к возбудителям туберкулеза млекопитающих, причем антисыворотка получена путем инъекций животным дезинтегрированных без нагревания микробактерий туберкулеза с последующей адсорбцией ее культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ, или антисыворотка может быть получена путем инъекций животным возбудителя туберкулеза млекопитающих, выращенного на питательной среде ВКГ, с последующей адсорбцией ее культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ. Пример Для осуществления способа штамм M. bovis Vallee выращивают на среде Сотона 6 недель. Для инактивации в посевы добавляют фенол до концентрации 3-5%. Через 48 ч взвесь бактериальной массы в культуральной жидкости 15-20 мин обрабатывают ультразвуком (15-35 кГц, до 100 Вт/см). Дезинтеграт в соотношении 1:3 смешивают с неполным адъювантом Фрейнда и в дозе 300-500 мкг/кг (по белку антиге-1 009817 на) вводят овцам или молодняку крупного рогатого скота в 2-3 точки подкожно. Инъекции повторяют до 11 раз с интервалом 12-14 суток. Через 8-10 суток после последнего введения у животных общепринятым способом получают кровь и сыворотку. Полученную антисыворотку проверяют на активность и специфичность. В качестве отрицательного контроля используют сыворотку здорового животного. Для этого культуры микобактерий M. bovis Vallee,M. bovis 8, БЦЖ-1, M. tuberculosis H37Rv, M. avium 1603, M. foruitum 342, Staph, aureus Cowan 1, E. coli смешивают в стерильных флаконах со стимулятором роста ВКГ из расчета 1 мг на 1 мл стимулятора. Смесь инкубируют 48 ч при 37 С и высевают на питательную среду ВКГ, разлитую в чашки Петри. Чашки инкубируют при 37 С до появления колоний. На стеклянную пластинку с гладкой обезжиренной поверхностью наносят по 20 мкл антисыворотки и отрицательной контрольной сыворотки. К ним добавляют по 1 бактериологической петле бактериальной массы колоний указанных штаммов и тщательно перемешивают. За ходом реакции следят путем просмотра пластинки с помощью нижней подсветки осветителя ОИ-19 (табл. 1). Таблица 1 Специфичность антисыворотки в РА- четкая агглютинация с образованием крупно- или мелкохлопьевого агглютината с просветлением жидкости и образованием характерной картины после высушивания и окрашивания;+ - образование небольших хлопьев без просветления жидкости. Из-за наличия агглютинации со штаммами нетуберкулезных микобактерий, а также немикобактериальной флорой антисыворотку и отрицательную сыворотку адсорбируют культурами, дающими агглютинацию. Для этого колонии соответствующих культур снимают в питательной среде ВКГ бактериологической петлей и суспендируют на 24 ч в 3% водном растворе фенола из расчета 5-10 мг/мл. После инактивации культуры осаждают центрифугированием при 3000 g в течение 10-15 мин. Надосадочную жидкость удаляют. Бактериальную массу культуры вносят в антисыворотку из расчета 2-10 мг/мл. Смесь инкубируют 1 ч при 37 С и 10-12 ч при 3-10 С. Бактериальную массу удаляют центрифугированием при 3000 g в течение 10-15 мин, антисыворотку проверяют в реакции агглютинации (табл. 2). Таблица 2 Специфичность истощенных сывороток в РА- четкая агглютинация с образованием крупно- или мелкохлопьевого агглютината с просветлением жидкости и образованием характерной картины после высушивания и окрашивания;+ - образование небольших хлопьев без просветления жидкости.-2 009817 При необходимости процесс адсорбции повторяют. Готовые сыворотки лиофилизируют или консервируют общепринятыми способами. Для выявления туберкулезной инфекции стерильную кровь смешивают в равных объемах со стимулятором роста ВКГ, и инкубируют 48 ч при 37 С, и высевают на свежеприготовленную среду ВКГ, разлитую по 15 мл в чашки Петри и по 5,5 мл в короткие пробирки с резиновыми пробками. Посевы помещают в термостат при 37 С. При наличии туберкулезной инфекции через 2-5 суток на поверхности среды ВКГ регистрируют рост росинчатых или восковидных колоний. В мазках, окрашенных по Циль-Нильсену, обнаруживают полиморфные палочки и кокки, ветвящиеся и шарообразные структуры синего цвета. Для идентификации изолятов антисыворотку и контрольную отрицательную сыворотку наносят по 20 мкл на стеклянную пластинку с обезжиренной поверхностью. Бактериальную массу исследуемой колонии смешивают с антисывороткой и отрицательной контрольной сывороткой. Реакцию учитывают через 5-7 мин, пользуясь нижней подсветкой ОИ-19. В табл. 3 приведены результаты посева крови 20 коров, реагировавших на туберкулин неблагополучного по туберкулезу стада и исследования в РА изолятов. Таблица 3 Полученные результаты показывают инфицированность животных возбудителем туберкулеза даже при отсутствии на убое видимых туберкулезных изменений. При посеве материала в чашки Петри рост возбудителя получают в 60%, пророст посторонней микрофлоры - в 20% и отрицательный результат - в 20%. При посеве материала на пробирки рост возбудителя получают в 85%, пророст посторонней микрофлоры - в 5% и отрицательный результат - в 10%. Для облегчения учета результатов реакции агглютинации к смеси культуры с сыворотками добавляют по 10 мкл раствора бриллиантового синего R-250 с рН 7. В случае отрицательной реакции краска быстро расходится по капле, при этом интенсивность окрашивания уменьшается. При положительной реакции интенсивность окрашивания не изменяется, а агглютинат окрашивается в синий цвет; предметные стекла, на которых ставилась реакция, высушивают на воздухе, 1-2 с фиксируют над пламенем, окрашивают карболовым фуксином (1:5) в течение 3-5 мин, обесцвечивают 3% соляно-кислым спиртом в течение 30-60 с, промывают дистиллированной водой и высушивают. При положительной реакции на предметном стекле остается окрашенная поверхность по контуру капли с характерными разрывами, идущими от центра. При отрицательной реакции окраска отсутствует, сохраняется контур капли или она гомогенная без разрыва (фигура).-3 009817 Таким образом, проведенные исследования подтверждают возможность повышения эффективности бактериологической диагностики туберкулеза, о чем свидетельствуют корректности методик и технических решений, положенных в основу заявляемого способа. Способ прошел успешную проверку областных ветеринарных лабораториях Республики Беларусь, в баклабораториях противотуберкулезных учреждений г. Киева. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ выявления туберкулезной инфекции путем инкубации биоматериала в стимуляторе роста ВКГ, посева на питательную среду ВКГ и культивирования, отличающийся тем, что после культивирования выросшую культуру смешивают с антисывороткой к антигенам возбудителя туберкулеза млекопитающих и отрицательной контрольной сывороткой для проведения реакции агглютинации и по образованию характерного агглютината судят о принадлежности культуры к возбудителям туберкулеза млекопитающих. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что антисыворотка получена путем инъекций животным дезинтегрированных без нагревания микобактерий туберкулеза с последующей адсорбцией культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что антисыворотка получена путем инъекций животным возбудителя туберкулеза млекопитающих, выращенного на питательной среде ВКГ с последующей адсорбцией ее культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ. 4. Способ выявления туберкулезной инфекции путем инкубации биоматериала в стимуляторе роста ВКГ, посева на питательную среду ВКГ и культивирования, отличающийся тем, что после культивирования выросшую культуру смешивают на предметных стеклах с очищенными антителами к антигенам возбудителя туберкулеза млекопитающих, выделенными из антисыворотки, и отрицательной контрольной сывороткой для проведения реакции агглютинации, и по образованию характерного агглютината судят о принадлежности культуры к возбудителям туберкулеза млекопитающих. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что антисыворотка получена путем инъекций животным дезинтегрированных без нагревания микобактерий туберкулеза с последующей адсорбцией ее культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ. 6. Способ по п.4, отличающийся тем, что антисыворотка получена путем инъекций животным возбудителя туберкулеза млекопитающих, выращенного на питательной среде ВКГ с последующей адсорбцией ее культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ. Положительный, сомнительный и отрицательный результаты реакции агглютинации с изолятами микобактерий со среды ВКГ