Способ производства сульфата целлюлозы с улучшенными характеристиками

012450 Изобретение относится к способу производства региоселективно замещенного сульфата натрийцеллюлозы (НСЦ) с улучшенными характеристиками, а также к применению этого улучшенного НСЦ для микрокапсулирования биологически активных веществ. Эти виды микрокапсул, также известные как симплексные микрокапсулы, изготовлены путем введения по каплям водного раствора улучшенного сульфата целлюлозы в водный раствор поликатиона, предпочтительно ПДАДМА (поли(диаллилдиметилхлорид аммония или аналоги. Сульфат натрий-целлюлозы (НСЦ) - это давно известный растворимый в воде полимер сложного полуэфира серной кислоты и целлюлозы. НСЦ образуется путем этерификации гидроксильных групп целлюлозы сульфирующим агентом, например, ангидридом серной кислоты, серной кислотой или их производными, с последующим превращением сложного кислотного полуэфира в нейтральную натриевую соль. Известны основные способы производства НСЦ, в ходе которых сульфирование может осуществляться в гетерогенной фазе без растворения полимера (гетерогенный) или в гомогенной фазе; либо одновременно с растворением полимера (квазигомогенный), либо после предварительного растворения полимера (гомогенный).Lukanoff, В. and Dautzenberg, H. (1994, Das Papier, Heft 6, 287-298) дополнительно улучшили хорошо известный гетерогенный способ производства (US 2539451; US 2969355) путем использования серной кислоты и пропанола в качестве реакционной среды и сульфирующего агента. Для этого типа гетерогенного способа производства, как у Bohlmann et al. (2002, Chemie Ingenieur Technik, 74, 359-363) сначала приготавливают реакционную среду из 96% серной кислоты и изопропанола при молярном отношении 1,8:1. Сульфирование целлюлозы при этом осуществляют при -5 С в течение 150 мин. Чтобы прекратить реакцию, реакционную смесь удаляют из сложного полуэфира серной кислоты и целлюлозы с помощью спирта и вымывают. Наконец промытый продукт переводят в натриевую соль путем использования гидроксида натрия. Фундаментальным недостатком этого гетерогенного способа сульфирования целлюлозы является тот факт, что в нем происходит трудно контролируемая экзотермическая реакция, которая неизбежно ведет к нерегулярностям в распределении заместителей вдоль и внутри полимерной цепи и поэтому отрицательно влияет на растворимость и степень полимеризации полученного сульфата целлюлозы. Другим досадным недостатком этого гетерогенного способа производства следует считать быструю и эффективную деградацию целлюлозной цепи во время предшествующего сульфирования. Чтобы снизить деградацию целлюлозы на стадиях отмывки, что соответственно удаляет тепло и тем самым предотвращает дополнительный подъем температуры, реакцию сульфирования завершают. Однако способ диффузии и происхождение, также как морфологическая структура целлюлозы, имеют значительное влияние на ход реакции, поскольку реакция происходит в целом с сохранением фиксированной физической структуры целлюлозы. Чтобы получить полную растворимость в воде произведенного гетерогенным способом сульфата целлюлозы без отделения нерастворимой части в диапазоне степени замещения (С 3)0,8, в DD 295858 А 5 и DE 4019116 А 1 рекомендуется предварительная активация целлюлозы, причем получаются только продукты с очень низкой вязкостью, максимум 8,5 мПас в 1% водном растворе. При внедрении этого сульфата целлюлозы в производство симплексных микрокапсул следует отметить, что образуются только микрокапсулы с очень узким диапазоном по механической устойчивости. Согласно DE 4021049 сульфат целлюлозы с высокой вязкостью может быть выделен из образовавшихся реакционных продуктов, причем на дополнительных стадиях способа могут быть отделены нерастворимые в воде частицы, а содержащиеся растворимые частицы с очень низкой вязкостью могут быть отмыты (см. Lukanoff, В. und Dautzenberg, H.: 1994, Das Papier, Heft 6, 287-298). В результате гетерогенный способ производства, делая целлюлозу полностью растворимой в воде,ведет к продуктам с относительно высокими степенями замещения (минимум С 3=0,7) и, следовательно,к негомогенному распределению заместителей, несмотря на применение исходной высокомолекулярной целлюлозы с низкой вязкостью. Гомогенное сульфирование целлюлозы обычно ведет к образованию промежуточного целлюлозного продукта, растворимого в органических веществах, благодаря чему может быть подавлена в приемлемых пределах деградация целлюлозной цепи в ходе реакции сульфирования. Поскольку сульфирование осуществляется после или одновременно с полным растворением твердофазной структуры в полярном апротонном растворителе, происходит соответствующий обмен заместителей. Конечный продукт с величиной С 3, равной 0,25, имеет более высокую вязкость раствора, и он уже отчасти явно растворим в воде. Например, используя ацетат целлюлозы с относительно низкой СП (Cuoxam-СП примерно 250, С 3=2,4) получают вязкость раствора синтезированного НСЦ в диапазоне 10 мПас (измерение в 2% растворе 2NNaOH на вискозиметре Ubbelohde) (см. DE 4435180). Путем дополнительных модификаций способа производства, основанного на гомогенной этерификации частично замещенных ацетатов целлюлозы, можно получить региоселективное замещение ОН групп по различным С атомам ангидроглюкозной субъединицы целлюлозы. Wagenknecht et al. (DE-1 012450 4435082; DE 4435180 и Das Papier, 1996, 712-720) описали региоселективное сульфирование по позиции С 2/С 3 или С 6, причем в качестве исходного полимера использован растворимый в органических веществах ацетат целлюлозы. Фундаментальными недостатками являются низкая степень полимеризации коммерчески доступного ацетата целлюлозы (СП Cuoxam - примерно от 200 до 350), так что согласно имеющемуся состоянию техники ацетат целлюлозы не может дать сульфата целлюлозы с вязкостью раствора выше, чем примерно 10 мПас в 1% водном растворе. Остается желательным модулирование диапазона желательной вязкости раствора полученного НСЦ относительно данной исходной СП ацетата целлюлозы. Ацетосульфирование природной целлюлозы как базовый принцип производства сульфата-ацетата целлюлозы, ацетата целлюлозы или сульфата целлюлозы путем смешанной этерификации известно с давних пор. Так, серная кислота вводится как реагент с ангидридом уксусной кислоты в ледяную уксусную кислоту в качестве реакционной среды (US 2683143; US 2969356; US 3086007; US 3075963; US 4005251). Вместо серной кислоты также может быть использован хлорсульфонат натрия (US 2969355). В результате испытаний, проведенных Chauvelon (Chauvelon, G. et al, Carbohydrate Research 338 (2003) 743750) для производства растворимого в воде сульфата-ацетата целлюлозы, стала очевидной значительная неудовлетворительность этой гетерогенной реакции, так как конечный продукт может быть получен только путем фракционирования. Более того, известно, что ацетосульфирование целлюлозы возможно при растворении образовавшегося сложного эфира сульфоацетилцеллюлозы путем применения N,N-диметилформамида в качестве реакционной среды. В этом случае уксусный ангидрид/триоксид серы (Wagenknecht, W. et al, "Cellulosics:materials for selective separations and other technologies", Kennedy, Phillips, Williams, Horwood (1993) 205211) или уксусный ангидрид/хлорсульфоновая кислота (Wagenknecht, W., Das Papier 50 (1996) 12, 712720) могут быть использованы в качестве реакционной смеси. После щелочного удаления нестабильных ацетильных групп получена С 3 сульфата до примерно 0,8 исключительно в С 6-позиции в субъединице ангидроглюкозы замещенного растворимого в воде сульфата целлюлозы. Недостатки сульфата целлюлозы, синтезированного по этому способу, состоят в асимметрии распределения замещения при С 30,6, что ведет к гетерогенности в водном растворе и поэтому к бесполезности для производства симплексных мембран. НСЦ как полианион, который должен был бы удовлетворять потребностям по изобретению для автоматизированного производства сферических симплексных микрокапсул определенного размера, достаточной механической прочности и длительной стабильности, должен удовлетворять ряду требований: растворимость в водной среде без остатка; устанавливаемая вязкость раствора с данной концентрацией; низкая структурная вязкость, чтобы сохранять правильные микрокапсулы даже в случае высокой скорости просачивания; устанавливаемая С 3 сульфата в диапазоне от 0,3 до 0,7 для образования стабильного симплекса; региоселективное сульфирование в позиции С 6; возможность стерилизовать водный раствор при величине рН 7; биологическая совместимость, например, стерильность и отсутствие эндотоксинов, низкое содержание тяжелых металлов. Самым большим недостатком гетерогенного, так же как и гомогенного способа производства является неконтролируемая деградация длины цепи в ходе реакции сульфирования. В результате этой деградации длины цепи до сих пор было невозможно производить НСЦ, который был бы полностью растворим в воде при С 3 от 0,3 до почти 1, предпочтительно от 0,3 до 0,6, и для которого в ходе реакции ацетосульфирования вязкость 1% раствора лежала бы в узком диапазоне, т.е. от 15 до 60 мПас. Достаточно высокая, устанавливаемая вязкость раствора растворенного НСЦ представляет особенный интерес, когда НСЦ используют для капсулирования биологически активного материала и когда в используемом для этого способе суспензию биологически активного материала в водном растворе НСЦ вводят по каплям из форсунки в раствор противоиона. Образование капли, гомогенность капель и воспроизводимость размера капель прямо зависят от вязкости раствора растворенного НСЦ. С другой стороны, толщина и прочность стенок капсул зависят от степени полимеризации и концентрации НСЦ. Хотя очень низкая вязкость раствора позволяет осуществить образование капли и тем самым потенциально капсулирование биологического материала, она же ведет к нерегулярностям в упомянутом образовании капель и микрокапсул. Такого рода нерегулярности проявляются в недостатке однородности, неравномерном распределении по размеру, отсутствии стабильности и нерегулярном окружении биологических материалов. Очень низкая вязкость раствора НСЦ, растворенного в воде, является, таким образом, досадным недостатком промышленно приготовленного НСЦ и всех полученных из него продуктов. Этот недостаток, а именно, очень низкая вязкость раствора, частично вызван ограниченностью различных способов производства по использованию данного целлюлозного сырья. Обычно применяемый коммерчески доступный ацетат целлюлозы (2,5-ацетат целлюлозы) имеет в среднем 250-270 полимерных-2 012450 единиц (СП). Только на этом пределе СП не может быть получен НСЦ высокой вязкости. В ходе производства НСЦ, особенно в ходе сульфирования сильно кислотными реагентами, это ведет к дополнительной деградации цепи, из-за которой вязкость раствора дополнительно снижается. Как правило, достигается вязкость раствора ниже 10 мПаc (см., например, DE 4435180). Древесная целлюлоза, которую иногда используют как сырье, имеет величину СП около 600. Использование древесной целлюлозы в хорошо известных способах производства, описанных выше, ведет к явной деградации цепи и, соответственно, конечному продукту с очень низкой вязкостью раствора. В идеале следует превращать в НСЦ природную высокомолекулярную целлюлозу, такую как хлопковый пух, с высоким значением СП, примерно 1250-1400 полимерных единиц, чтобы получить самые длинные возможные полимерные цепи и тем самым высокую вязкость раствора. Хлопковый пух используют как сырье в гетерогенном сернокислотном/ пропаноловом способе, однако этот способ производства, как уже упомянуто, ведет к значительному числу разрывов цепи, так что продукты, получающиеся после синтеза, демонстрируют лишь низкую вязкость раствора. Поскольку гетерогенный способ производства также не позволяет достигнуть равномерного распределения сульфатных групп, то отрицательное влияние сказывается на характеристике продукта, например, на растворимость НСЦ в воде. Поэтому цель этого изобретения состоит в том, чтобы обеспечить дополнительный улучшенный способ производства региоселективно замещенного НСЦ, который не имел бы недостатков нынешней технологии и который позволял бы устанавливать требуемую вязкость раствора при полной растворимости конечного продукта в воде, при данной СП используемого целлюлозного сырья. Цель достигается путем осуществления стадий способа согласно п.1 формулы изобретения. Особые воплощения описаны признаками зависимых пунктов формулы изобретения. Для этого способа целлюлозу, предпочтительно хлопковый пух, переводят путем квази-гомогенной реакции в полярном растворителе посредством смешанной этерификации смесью реагентов, состоящей из ацетилирующего агента и сульфирующего агента, в смешанный сложный эфир ацетилсульфоцеллюлозы. Целесообразно дать целлюлозе сначала набухнуть в реакционной среде при повышенной температуре, предпочтительно в диапазоне от 30 до 100 С, длительный период времени, предпочтительно от 0,5 до 12 ч, при постоянном перемешивании и оставить при комнатной температуре для дополнительного набухания. В конце концов при непрерывном перемешивании добавляют предварительно приготовленную смесь реагентов, предпочтительно содержащую ацетилирующий агент, сульфирующий агент и полярный растворитель определенного состава. Степени частичного замещения - С 3 сульфата и С 3 ацетата - могут быть отрегулированы способом, известным специалистам в технологии,вплоть до максимального общего значения С 3=3, используя для этого молярное соотношение реагентов и их молярное отношение к целлюлозе. Реакция ацетосульфирования происходит предпочтительно в температурном диапазоне от 30 до 80 С, в результате чего приготовленный сульфат-ацетат целлюлозы растворяется в реакционной системе с получением вязкого раствора. Если поддерживается преимущественно постоянный предварительно заданный уровень температуры, то вязкость полимерного раствора убывает в продолжение реакции, так что эту вязкость можно устанавливать на предварительно заданном уровне. В соответствии с изобретением важно, чтобы дальнейшая деградация прекратилась при определенной нейтрализации, и таким образом фиксировались бы уровень полимеризации и вязкость раствора сульфата целлюлозы, который получен после переработки. Для нейтрализации сульфатные группы сложного полуэфира превращаются без удаления ацетильных групп, предварительного или альтернативного, также одновременно с осаждением в форме его натриевой соли. При условиях, в соответствии с изобретением, кроме этого, сульфатные группы сложного полуэфира тщательно нейтрализуют, во всяком случае, без разрушения ацетильных групп, перед или,альтернативно, также одновременно с осаждением с помощью основного нейтрализатора, предпочтительно NaOH, растворенного в подходящем нейтрализаторе и/или осадителе. Впоследствии сложный смешанный эфир сульфоцеллюлозы, который, предпочтительно, был осажден в данной форме, промывают подходящей промывной средой, предпочтительно, этанолом, содержащим ацетат натрия или смесью этанола и воды. Обработку конечного продукта затем осуществляют путем щелочного гидролиза ацетильных групп в гетерогенной фазе с помощью этанольного NaOH, обратной нейтрализации до рН близкого к 7, повторных промывок, предпочтительно, водным этанолом до свободной соли и последующей сушки сульфата натрий-целлюлозы в вакууме примерно при 40 С. После этого способа синтеза может быть получен не содержащий осадка, растворимый до прозрачности сульфат натрий-целлюлозы с СЗ выше или равной 0,3, что демонстрирует очень благоприятный,равномерный и региоселективный обмен заместителей в группах сульфата сложного полуэфира в С 6 позиции, и идентифицируется по вязкости раствора, устанавливаемой в диапазоне от 10 до 500 мПа с,предпочтительно от 15 до 400 мПас, дополнительно предпочтительно от 20 до 300 мПас, более предпочтительно от 15 до 100 мПас, дополнительно более предпочтительно от 20 до 60 мПас при заданной 1%-3 012450 концентрации в воде. Поскольку полученные продукты по существу чистые, нет необходимости дополнительно их чистить путем диализа или ультрацентрифугирования. В то время как в прежде известных способах нейтрализацию проводили в конце, после стадии отмывки и/или деацетилирования, изобретатели показывают, что когда нейтрализацию осуществляют непосредственно в конце стадии сульфирования и без предварительных стадий деацетилирования или отмывки, то качество приготовленного НСЦ явно лучше. Удовлетворительно хорошие результаты могут также быть достигнуты, когда нейтрализацию проводят одновременно с осаждением. Для нейтрализации в соответствии со способом по изобретению основной или щелочной раствор,предпочтительно NaOH, добавляют к реакционной смеси, при этом устанавливают правильное соотношение основного, щелочного раствора или NaOH и сульфирующего реагента. Например, 1 моль трехосновной кислоты, такой как хлорсульфоновая кислота, нейтрализуют 3 молями NaOH, a 1 моль двухосновной кислоты, такой как серная кислота, нейтрализуют 2 молями NaOH. При нейтрализации желательно работать быстро, поскольку полимерные цепи всегда подвергаются атаке и деградируют в кислотных средах, и поэтому сокращение времени, расходуемого на нейтрализацию, снижает деградацию длины полимерной цепи. При осуществлении стадий способа, касающихся способа производства НСЦ, в соответствии с изобретением, и проводя заранее нейтрализацию в кислотной системе, можно контролировать способ производства в отношении деградации длины полимерной цепи. НСЦ, выработанный в соответствии с изобретением, не имеет или имеет очень низкую структурную вязкость в 1% водном растворе при 25 С, и в то же время вязкость его раствора устанавливается в диапазонах от 10 до 500 мПас, предпочтительно от 15 до 400 мПас, дополнительно предпочтительно от 20 до 300 мПас, более предпочтительно от 15 до 100 мПас, дополнительно более предпочтительно от 20 до 60 мПас, при измерении в 1% водном растворе при 25 С. Более того, НСЦ, приготовленный в соответствии со способом по изобретению, растворим в воде без остатка и имеет величину С 3, начиная от 0,25 в отличие от такового, приготовленного гетерогенным способом с использованием реакции H2SO4/изопропанол, поэтому не приходится удалять нерастворимые в воде компоненты путем дополнительной обработки. В соответствии со способом по изобретению можно использовать в качестве исходного материала целлюлозу различного происхождения и с разными величинами С 3. Предпочтительно можно использовать высокомолекулярную целлюлозу, особенно, ультрачистый и по существу не содержащий тяжелых металлов хлопковый пух. Причем степень полимеризации ограничивает устанавливаемые диапазоны вязкости. В одном из воплощений способа в соответствии с изобретением, целлюлозу подвергают набуханию в полярном растворителе, таком, например, как N,N-диметилацетамид (ДМАА), N-метилпирролидон(МП), диметилсульфоксид (ДМСО) или N,N-диметилформамид (ДМФ). Предпочтительно используют ДМФ. Кроме того, способ по изобретению может быть осуществлен, когда для получения смешанной этерификацией сульфата-ацетата целлюлозы, растворимого в органических растворителях и имеющего общую величину С 3 до 3, в качестве сульфирующего агента используют серную кислоту, амидосерную кислоту, триоксид серы, сульфурилхлорид или хлорсульфоновую кислоту. Предпочтительно в качестве сульфирующего агента используют хлорсульфоновую кислоту. Способ по изобретению может быть осуществлен, когда для получения смешанной этерификацией сульфата-ацетата целлюлозы, растворимого в органических растворителях и имеющего общую величину С 3 до 3, в качестве ацетилирующего агента используют ацетилхлорид или уксусный ангидрид. Предпочтительно в качестве ацетилирующего агента используют уксусный ангидрид. Производства НСЦ в соответствии с изобретением должно предпочтительно осуществляться в условиях, описанных ниже. Сначала осуществляют набухание природной целлюлозы при температуре, повышенной до 150 С,предпочтительно от 30 до 100 С, дополнительно предпочтительно от 40 до 80 С, в течение до 24 ч, предпочтительно до 12 ч, дополнительно предпочтительно от 3 до 8 ч, а в последующий период при комнатной температуре, так что дополнительное охлаждение и набухание осуществляется при комнатной температуре (КТ) в течение до 48 ч. Во время набухания суспензию предпочтительно перемешивают. Во время дополнительного набухания при КТ перемешивание более не нужно. Затем сульфирующий агент и ацетилирующий агент добавляют к набухшей целлюлозе при постоянном перемешивании и при температуре реакции от 0 до 110 С, причем предпочтительно от 20 до 80 С,дополнительно предпочтительно от 30 до 70 С, более предпочтительно от 40 до 65 С, дополнительно более предпочтительно от 50 до 60 С. При постоянном перемешивании полученный сложный полуэфир сульфоацетилцеллюлозы будет полностью растворен и вязкость медленно снижается до желательной, и достигается заданная текучесть полимерного раствора, которая может быть определена экспериментально.-4 012450 Непосредственно последующую нейтрализацию предпочтительно проводят при постоянном тщательном перемешивании при комнатной температуре (КТ), в результате чего полимерный раствор может оставаться теплым по сравнению с температурой реакции, т.е. реакцию, например, проводят при 50 С, и после того как она немного остыла, добавляют в нейтрализационную/осадительную ванну, пока она еще теплая. Отношение нейтрализационой/осадительной ванны к полимерному раствору составляет от 3 до 10, предпочтительно от 3 до 5. НСЦ, приготовленный в соответствии со способом производства, должен быть в основе своей стерилен, не содержать эндотоксинов и/или тяжелых металлов. Для этого способ реализуют в стерильных условиях и, особенно, в свободных от микробов условиях. В частности, условия и сырье должны быть выбраны так, чтобы в конечном продукте не выявлялись плесень, аэробные бактерии, сальмонеллы, Е. coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и т.д. Содержание эндотоксина в конечном продукте лежит в диапазоне от 0,02 до 0,11 м.е/мл и определяется по LAL[Lumulus amebocytelysatej-тесту в соответствии с European pharmacopoeia Ph. Eur. 4,00, Способ С (турбидиметрическокинетический) с 1% водным раствором НСЦ. Кроме того, следует уделить внимание тому, чтобы используемое сырье также не содержало таких тяжелых металлов, как, например, Cd, Pb, Hg, Fe, Ni, Ti, Mn, Zn и Cu, чтобы для произведенного из него НСЦ не были превышены следующие пороговые величины: Общее содержание тяжелых металлов без учета железа:10 ч./млн,Содержание железа:20 ч./млн,причем общее содержание тяжелых металлов без учета железа включает сумму всевозможных тяжелых металлов. Для этого предпочтительно, чтобы в реакциях использовались только материалы и аппараты, которые не выделяют определимых количеств ни одного из упомянутых тяжелых металлов. Согласно дополнительному воплощению НСЦ, приготовленный по этому способу, должен быть региоселективно замещенным. Предпочтительно иметь эксклюзивный гомогенный обмен заместителей в С 6-позиции или, альтернативно, обмен до 30% сульфатных групп сложного эфира в С 2/3 позиции. Используемые реагенты контролируют желательное региоселективное сульфирование в соответствии с состоянием способов по технологии (Wagenknecht et ah, 1996). НСЦ в соответствии с изобретением особенно подходит для применения в микрокапсулировании биологических материалов. Благодаря регулируемой вязкости его раствора можно легко установить диапазоны вязкости от 10 до 50 мПа с, от 40 до 70 мПа с, от 60 до 100 мПа с, от 80 до 200 мПа с, от 150 до 300 мПас или от 250 до 500 мПас (при измерении в 1% водном раствор на вискозиметре Ubbelohde), по существу, без изменения концентрации полимерного раствора. Поэтому этот НСЦ обеспечивает нетрудное обращение с ним и поразительно высокую рабочую скорость при капсулировании биологического материала. В противоположность этому, среди многочисленных способов производства растворимого в воде сульфата целлюлозы, имеются лишь очень ограниченные описания таких, которые можно использовать для производства микрокапсульных продуктов, имеющих значительную механическую прочность и отвечающих биохимическим требованиям для потенциального использования в медицине. Так в DD 218734 А 4 и DE 3306259 С 2 были представлены способы производства микрокапсул,причем была описана иммобилизация жизнеспособных биологических объектов. Используемый НСЦ приготовлен с применением способа N2O4/SO2/ДМФ. Применение высокотоксичного клейкого оксида является фундаментальным недостатком этого способа, в котором сначала в ходе восстановления образуется смешанный нитритсульфатный эфир, растворимый в диметилформамиде (ДМФ). После отделения нестабильных нитритных групп сложного эфира целлюлозы, полученные в результате токсичные побочные продукты, особенно канцерогенный диметилнитрозоамин, должны быть удалены из сульфата целлюлозы, прежде чем его можно будет использовать с живыми биологическими объектами, особенно когда его используют для биомедицинского назначения. Однако микрокапсулы, приготовленные по способу изобретения, подходят для медицинского применения. В DE 4021050 А 1 и ЕР 0892852 описано производство НСЦ с использованием гетерогенногоH2SO4/пропанольного способа. Сейчас пытаются использовать этот НСЦ для производства симплексных микрокапсул с целью применения и иммобилизации жизнеспособных биологических объектов. Из-за деградации длины цепи и нерегулярного сульфирования в ходе производства НСЦ нельзя избежать выделения не растворимых в воде частиц и/или удаления высокозамещенных низкомолекулярных частиц. Микрокапсулы, изготовленные с НСЦ таким способом, менее стабильны и очень неоднородны. Они не подходят для медицинских применений, например, в виде инъекций.DD 298643 A5 и DD 299313 A5 описан способ производства сульфата целлюлозы региоселективно замещенного по позиции С 6, который осуществляют с использованием растворимой в неорганических растворителях триалкилсилил целлюлозы и который ведет к продуктам с широким диапазоном вязкости раствора. Дополнительно упомянуто, что эти продукты могут быть использованы в области биотехнологии, фармакологии и медицины. Однако эти потенциальные области применения не подтверждены какими-либо экспериментальными данными. Как серьезный недостаток этой технологии рассматривается тот-5 012450 факт, что, по-видимому невозможно установить желательную вязкость раствора, хотя СЗ поддерживается стабильной, и то, что вязкость раствора, очевидно, зависит от СП исходного материала и от уровня сульфирования (Philipp et al., Das Papier 49 (1995) 2, 58-64).DE 19837673 A1, DE 19838535 A1 и WO 2000010694 A1 описывают использование сложного анионного эфира сульфоалкилцеллюлозы в качестве анионного симплексного компонента для производства плоских мембран. Производство симплексных плоских мембран фундаментально отличается от производства капсул. Поэтому нельзя сделать выводов об использовании НСЦ для производства микрокапсул. Также у Richau, К. et al, J Membr. Sci 1996, 113, 31-41 и в DD 298790 A5 было описано, что НСЦ с низкой вязкостью, приготовленный из коммерчески доступного 2,5-ацетата целлюлозы, может быть использован для производства симплексных плоских мембран (Cellulose Chem. Technol. 25(1991) 343-354). Производство симплексных плоских мембран фундаментально отличается от производства капсул, и нельзя сделать выводов об использовании НСЦ для производства микрокапсул, особенно для производства микрокапсул, используемых в области биомедицины.Wagenknecht et al. (DE 4435180 Cl; Das Papier 50 (1996) 12, 712-720) описали синтез и использование НСЦ для симплексных плоских мембран, которые изготавливают из ацетата целлюлозы. НСЦ при этом изготовлен гомогенным сульфированием преимущественно 2,5-ацетата низкомолекулярной целлюлозы в N,N-диметилформамиде разными сульфирующими агентами с последующим разложением ацетильных групп, в результате чего переработку осуществляют без соли. Вязкость раствора НСЦ, приготовленного таким образом, неудовлетворительно низкая, хотя этот НСЦ может быть пригоден для производства симплексных плоских мембран, которые могут быть использованы для отделения растворителей. Микрокапсулы, которые изготовлены из НСЦ, приготовленного таким способом, менее стабильны и очень неоднородны. Они поэтому непригодны для медицинского использования, например, в виде инъекций. НСЦ низкой вязкости, как описано в DE 4435180, также подходит, например, для отделения растворителей без дистилляции путем перфузии. НСЦ, описанный в DE 4435180, изготовлен сульфированием коммерчески доступного ацетата целлюлозы и демонстрирует укороченные полимерные цепи, а также низкую вязкость раствора. Микрокапсулы, приготовленные из такого рода НСЦ, редко бывают стабильны и формируются неоднородно. Они поэтому не подходят для медицинских применений, например, в виде инъекций, и для воспроизводимого высвобождения фармацевтических веществ. В общем, установлено, что известны многочисленные способы производства НСЦ, которые, однако, все дают конечные продукты, либо имеют очень низкую вязкость раствора, нерегулярное распределение заместителей, состоят полностью или преимущественно из коротких волокон из-за многочисленных деградаций цепи, или загрязнены из-за использования токсичных реагентов. Также, когда такие НСЦ используют на лабораторном уровне, для микрокапсулирования биологических материалов, то капсулы оказываются нестабильными, а также неоднородными по размеру и толщине мембраны. Значительные отрицательные эффекты были замечены также из-за обусловленной способом производства токсической нагрузки на жизнеспособность задействованной клетки, или, скорее, на биосовместимость капсул. Другая цель настоящего изобретения, поэтому состоит в том, чтобы производить из природной целлюлозы несомненно, растворимый сульфат-ацетат целлюлозы с определенной молекулярной структурой, а также производить из него полностью растворимый в воде, биологически совместимый НСЦ с улучшенными характеристиками растворимости, который можно было бы использовать как вспомогательный материал для биологических и медицинских применений, и в частности можно было бы использовать для иммобилизации активных биологических объектов в микрокапсулах из симплексных мембран. В отличие от ранее описанного способа производства и конечных продуктов НСЦ, приготовленный в соответствии с изобретением, отличается, например, определенным устанавливаемым диапазоном вязкости раствора, который можно достигнуть путем применения исходного материала с адекватно высокой величиной степени полимеризации (СП) и регулирования медленной деградации цепи в гомогенной фазе в процессе производства. НСЦ, который приготовлен по описываемому способу, благодаря этим характеристикам решает прежде описанные проблемы, возникающие при микрокапсулировании биологических материалов. В основном микрокапсулы можно разделить на три категории: твердые сферы, сферы с покрытием и полые сферы. Сплошные сферы могут быть получены, когда желатинизирующие вещества (например, агароза,желатин) распределяются в виде капель в совокупности текучей среды и охлаждаются до температуры ниже их точки плавления для отвердевания. Матрица, используемая для сплошных сфер, представляет собой сочетание, например, альгината и хлорида кальция (CaCl2) или других поливалентных ионов металлов. Полые сферы могут быть приготовлены аналогично сплошным сферам путем введения по каплям полимерного раствора в ванну с противоположно заряженными ионами. Используемые противоположно заряженные ионы не должны проникать в капли, которые погружаются в них, вследствие диффузионных ограничений. Поэтому реакция связывания происходит только на верхней поверхности капли,-6 012450 из которой вокруг жидкого ядра развивается стабильная мембрана. Растворяя связанные ядра или растворяя ядро сплошной сферы, можно получить полые сферы. Сферы с покрытием могут быть приготовлены из сплошных или полых сфер путем нанесения одного или нескольких дополнительных слоев из комплексообразующих веществ, которые состоят из противоположно заряженных поливалентных ионов(например, ПLЛ (поли-L-лизин), Chitosan). НСЦ, приготовленный по изобретению, особенно подходит для производства полых сфер или сфер с покрытием. Существует множество способов и соответствующих технических вариаций, известных в производстве микрокапсул. В простейшем случае капсулы получают простым введением по каплям текучей среды, протекающей сквозь канюлю. Размер вводимых капель определяют сила тяжести и произведение межфазного натяжения на наружный диаметр канюли. Эта процедура применима только к капсулам больше 1 мм, но имеет лишь ограниченную производительность. Согласно так называемому воздушно-струйному способу, или также аэрационному способу, гравиметрически выталкиваемая капля текучей среды поступает в конец подающего концентрического капилляра сквозь ламинарный газовый поток, протекающий вокруг капилляра. При таком способе можно уменьшить диаметр капли. По способу воздушного шабера в форсунке выталкиваемая текучая среда разделяется на мелкие капельки турбулентным воздушным вихрем. Оба способа, однако, имеют низкую производительность: примерно 0,1-2 мл/мин. В отличие от воздушно-струйного способа, в котором каплеобразование осуществляется чисто гравиметрически и поэтому не подходит для растворов с высокой вязкостью, способ сечения струи дает постоянный поток текучей среды с данным давлением. Струя текучей среды рассеивается механически с применением вращающейся проволоки. Сферические частицы создаются из отдельных цилиндриков жидкости в зависимости от поверхностного натяжения жидкости в соответствующем пути падения. Недостатком этого способа являются связанные с этой системой потери при разрезании и разбрызгивании. При электростатически поддерживаемом каплеобразовании каплеобразование в капилляре ускоряют посредством наложения сильного электрического поля между капилляром и общей ванной, причем,как и в случае гравиметрического введения по каплям из капилляра, падают преимущественно мелкие капли. В способе каплеобразования с помощью вращающегося диска водная жидкость вводится вблизи средней точки быстро вращающегося диска и затем вытекает под действием центробежной силы, создающейся на краю диска. На краях диска пленка текучей среды распадается на мелкие капельки. Каплеобразование улучшают наложением колебаний на жидкость. В способе каплеобразования с вращающимся цилиндром водная жидкость протекает сквозь вращающийся цилиндр с определенными отверстиями. Центробежная сила облегчает каплеобразование на краю цилиндра, где жидкость распадается на мелкие капельки. Каплеобразование из струй жидкости позволяет увеличить объемный поток и, следовательно, производительность. Здесь можно различить 3 основных способа: В случае способа погруженной струи поток текучей среды впрыскивается на высокой скорости в другую жидкость. Из-за высокой силы сдвига струя разбивается на мелкие капельки, однако, с большим разбросом по размеру. В случае вибрационного способа наложение синусоидальных колебаний с подходящей частотой рассеивает ламинарную струю жидкости, извергаемую из форсунки. Принцип восходит к лорду Релею(Proc. London Math. Soc. 10 (4), 4-13, 1878), который выделял поток не очень вязкой текучей среды, для которого цилиндр текучей среды разрушается при возрастании длины волны вращательносимметричных колебаний, как и области невозмущенной струи. Оптимальная длина волны зависит от диаметра, динамической вязкости, плотности и поверхностного натяжения текучей среды. Кроме того, существуют другие многочисленные способы и модификации способов, описанных выше. Renken и Hunkeler дают обзор этих способов (Renken А. и Hunkeler D., Microencapsulation: A Review of Polymers and Technologies with a Focus on Bioartificial Organs, Polimery, 43 (9), 530-537 (1998. Все эти способы, как описано выше, подходят для производства микрокапсул, как заявлено в этом изобретении. Машины для капсулирования (IE-50R) производства компании Inotech (Dottikon, Швейцария) были использованы для производства микрокапсул, именно из капель НСЦ с равномерным распределением по размеру. Их работа базируется на колебательном способе, описанном выше. Для биомедицинских применений все стадии способа, упомянутые в этом описании, могут также осуществляться в стерильных условиях. Описание такой капсулирующей машины и ее функционирования можно найти, например, в ЕР 1062032 BI. Согласно лорду Рэлею, в способе капсулирования водный раствор НСЦ подают в контейнер хранения через форсунку с помощью постоянного давления воздуха или с помощью шлангового насоса или линейного двигателя, чтобы создать постоянную струю текучей среды. Таким образом, можно отрегулировать постоянную объемную скорость и, как следствие, можно получить одинаковый размер капсул. В-7 012450 зависимости от растворимости и вязкости раствора, которые обусловлены химическими характеристиками НСЦ по изобретению, которые свободно регулируются для данной форсунки в широком диапазоне,возможна высокая рабочая скорость. Объемная скорость лежит в диапазоне 1-15 мл/мин, предпочтительно можно использовать 6-9 мл/мин в зависимости от выталкивающего капилляра. В зависимости от назначения водный раствор НСЦ может содержать дополнительные компоненты в разных долях. Поэтому, в первую очередь, значение имеет капсулируемый материал. Кроме того, дополнительные компоненты могут быть добавлены в варьируемых пропорциях (например, субстрат антифриз (например, глицерин, ДМСО), протеины, растворители или соль, как, например, 0,9% NaCl) или же НСЦ может прямо быть растворен в специальных растворах (например в среде клеточной культуры). Передатчик колебаний создает и передает вертикальное синусоидальное колебание в текучей среде,вытекающей через форсунку, в переменном диапазоне от 100 до 4000 Гц. Для производства микрокапсул предпочтительно использовать частоты в диапазоне от 600 до 3000 Гц. Кроме частоты могут также варьироваться амплитуды колебаний от 0 до 100%. Если создано такое вертикальное колебание, то может быть достигнуто рассеивание выталкиваемой струи жидкости на капельки одинакового объема. В принципе с помощью вертикального синусоидального колебания может быть создано производство капсул определенного размера. Чтобы избежать столкновения капелек в фазе полета создают зарядное смещение в выталкиваемой струе текучей среды путем приложения высокого напряжения, в диапазоне от 0,8 до 1,5 кВ, между форсункой и положительно заряженным электродом (анодом). Когда пропускают ток через консоль напряжения, то отрицательно заряженные капельки, которые отрицательно поляризованы на форсунке, оттягиваются в направлении анода и потому направляются горизонтально. Полученные в результате анионные капельки образуют на своей поверхности скорлупообразную симплексную мембрану, окружающую ядро из не подвергшейся комплексообразованию текучей среды; скорлупа образуется путем комплексообразования анионного полиэлектролита, содержащегося в капельках, с катионным полиэлектролитом (например, ПДАДМА), содержащимся в ванне комплексообразования на границе фазового раздела капель. Толщина мембраны увеличивается со временем ее пребывания в водном растворе полимерного катиона. Ванна комплексообразования состоит из водного раствора полимерных катионов с разными молекулярными массами. Стабильность образующейся симплексной мембраны поэтому определяется химическими характеристиками (функциональные группы, число и распределение заместителей). Например,додециламин, этилендиамин, пиперазин, метиленовый синий, аргинин, поли(аллиламингидрохлорид),триэтилтетрамин или спермин подходят для способа капсулирования. Предпочтительно использовать полимеры с четвертичными аммонийными группами, более предпочтительно соли поли(диаллилдиметиламмония) или поли(винилбензилтриметиламмония),предпочтительно поли(диаллилдиметилхлорид аммония) (ПДАДМА) или поли(винилбензилтриметилхлорид аммония). Уровень интеграции, а именно стабильность изготовленных микрокапсул коррелируют дополнительно с длиной цепи используемого поликатиона. Средняя молекулярная масса может лежать в диапазоне от 10000 до 500000, предпочтительно от 15000 до 50000 в случае ПДАДМА. Подходящая для капсулирования концентрация ПДАДМА лежит в диапазоне 0,5-5% (мас./об.), предпочтительно, в диапазоне 0,8-2% (мас./об.). Водный раствор поликатиона может содержать дополнительные компоненты в варьируемых пропорциях, зависящих от назначения, например, вещество, которое снижает поверхностное натяжение водного раствора, органические растворители, антифризы (глицерин, ДМСО) или соль, такую, например,как 0,9% NaCl, или же поликатионы могут прямо быть растворены в специальных растворах (например,среда культуры). В ванне комплексообразования имеется магнитная мешалка, которая создает вертикальный ток капель в направлении движения капель и поэтому переносит капельки, образовавшиеся вне зоны, где падают новые капли, чтобы свести к минимуму риск агрегации не полностью образовавшихся микрокапсул. Более того, мешалка поддерживает плавучие капельки, что благоприятствует конвекции реакции строительства мембраны, а также последующей стадии отмывки. Для производства микрокапсул по изобретению следует сначала приготовить водный раствор НСЦ. Раствор НСЦ должен иметь концентрацию от 1 до 4% (мас./об.), предпочтительно от 1,5% (мас./об.) до 3% (мас./об.). В зависимости от силы сдвига подходящие параметры можно найти на диаграмме вязкости. Поэтому, например, 1% раствор НСЦ по изобретению должен иметь вязкость раствора в диапазоне от 10 до 500 мПас, предпочтительно от 10 до 200 мПас, дополнительно предпочтительно от 15 до 80 мПас, более предпочтительно от 20 до 50 мПас или от 40 до 60 мПас. Согласно воплощению, НСЦ,приготовленный в соответствии с изобретением, образуется, в основном, в виде сферических частиц, а именно микрокапсул по изобретению, имеющих диаметр 0,1-50 мкм, 1-100 мкм, 50-250 мкм, 50-500 мкм,100-250 мкм, 100-500 мкм, 250-500 мкм, 250-700 мкм, 500-1000 мкм, 700-1500 мкм, 1000-2500 мкм, 15003000 мкм, 2500-4000 мкм, 3000-5000 мкм. Микрокапсулы предпочтительно имеют диаметр 200-1500 мкм, дополнительно предпочтительно 600-800 мкм.-8 012450 Для биомедицинских применений раствор НСЦ, приготавливаемый из НСЦ, сделанного в соответствии с изобретением, можно стерилизовать имеющимися способами, например, радиоактивным облучением. Стабильность НСЦ, приготовленного в соответствии с изобретением, доказана при стерилизации паром в течение 30 мин при 121 С. НСЦ, приготовленный в соответствии с изобретением, особенно подходит для производства более стабильных и более однородных микрокапсул. Такие микрокапсулы подходят, чтобы заключать биологические объекты, например, бактерии, вирусы, дрожжи, клетки и ткань для биомедицинских применений, но также для производства фармакологически активных ингредиентов в биотехнологической отрасли. Они могут также быть использованы для иммобилизации фармакологически активных ингредиентов,например, порошковых катализаторов, коллоидов, комплексов металлов, энзимов, антител, красителей и пигментов для технического использования. Капсулы, приготовленные в соответствии с изобретением, поэтому особенно подходят для использования в ветеринарии и медицине человека, так как они удовлетворяют высоким требованиям, как объяснено ниже. Для использования микрокапсул в кровеносной системе или в тканях животного или человека, а именно, в их органах, например, для лечения рака, необходимо, чтобы микрокапсулы были соответственно однородными и воспроизводимыми во множестве размеров, так чтобы, с одной стороны, можно было избежать закупорки/блокады вводного канала и/или кровеносных сосудов. Далее, может быть гарантировано применение постоянного количества капсулированных агентов на капсулу (например, фармакологически активных ингредиентов, энзимов, число клеток на капсулу). Сферическая геометрия капсул гарантирует хорошую скорость, например, в катетерах, и равномерное во всех направлениях идеальное высвобождение фармакологически активных ингредиентов. Более того, легкая сжимаемость капсул оказывается полезна, потому что это снижает вероятность застревания капсулы и поэтому блокирования,например, катетера сжатыми капсулами. Ничтожная липкость верхней поверхности капсулы, особенно в биологических жидкостях, предотвращает агломерацию капсул. НСЦ, приготовленный по способу, описанному выше в изобретении, на базе раствора с устанавливаемой вязкостью, обеспечивает простоту обращения и неожиданно высокую скорость работы при капсулировании биологических материалов, это особенно благоприятно в промышленном производстве фармацевтических веществ на основе микрокапсул. Дополнительные преимущества и применения упомянутого выше изобретения описаны ниже на примерах, которые были реализованы в соответствии с приложенными чертежами. Фиг. 1 показывает измерение посредством микроскопа распределения размеров НСЦ капсул, с различными желательными размерами (фиг. 1A-D), изготовленных в различных партиях с использованием капсулатора Inotech IE-50R и Zeiss Axiovert для определения распределения капсул по размеру. В каждом случае раствор НСЦ, также как раствор ПДАДМА, содержал 1% NaCl (мас./об.). Амплитуда колебаний форсунок каждый раз доходила до 100%. Другие варьируемые параметры регулировали, как указано ниже. Таблица 1 Выбирая подходящие параметры для производства капсул, можно получить широкий диапазон размеров приготовленных микрокапсул. Ширина полосы колеблется от 10 до 5000 мкм в зависимости от регулируемой вязкости раствора НСЦ, приготовленного в соответствии с изобретением. Приготовленные микрокапсулы всех протестированных размеров имели почти совершенно идеальную сферическую геометрию и высокий уровень воспроизводимости. Фиг. 2, см. фиг. 2 а и 2b, показывает рост клеток НЕК 293 в НСЦ капсулах в различные моменты времени. Здесь капсулы культивировали в среде МДСИ (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла) с 4,5% глюкозы (мас./об.) (Gibco, Глазго) и 10% сыворотки телячьего эмбриона (СТЭ) (Gibco, Глазго) в течение 36 дней. Аликвоты отбирали в разное время. Фиг. 2 а качественно показывает, начиная слева наверху и кончая справа внизу, увеличение числа клеток в микрокапсулах, причем образцы отбирали в 1, 2, 3, 7, 14 и 21 дни после капсулирования. Водный раствор НСЦ (2% мас./об.), использованный для капсулирования, сначала содержал 2106 клеток/мл и, кроме того, 1% NaCl (мас./об.). Другие параметры капсулирования описаны ниже.-9 012450 Концентрация ПДАДМА раствора: 1,1% (мас./об.). Желательный диаметр капсул: 600 мкм. Диаметр форсунок: 200 мкм. Объемная скорость: 6,1 мл/мин. Амплитуда: 100%. Частота: 900 Гц и дисперсионное напряжение: 1100 V. Фиг. 2b показывает рост капсулированных леток НЕК 293 в капсулах с желательным диаметром от 600 до 1200 мкм при использовании МТТ-теста (Roche, Мангейм) для живой, иммобилизованной клетки. Для этого капсулы культивировали в колбах с клеточной культурой Т 75 в течение 36 дней. Параметры капсулирования в 600 мкм капсулах (- -) соответствуют указанным под фиг. 2 а. Для капсулирования в 1200 мкм капсулах (- -) были использованы следующие параметры: 2% раствор НСЦ, использованный для капсулирования, сначала содержал 1,5106 клеток/мл и, кроме того, 1% NaCl (мас./об.). Другие параметры капсулирования описаны ниже. Концентрация ПДАДМА раствора: 2,5% (мас./об.). Диаметр форсунок: 300 мкм. Объемная скорость: 12,9 мл/мин. Амплитуда: 100%. Частота: 600 Гц и дисперсионное напряжение: 1200 В. Две кривые нельзя сравнивать напрямую, но обе они показывают идеально логарифмический рост клеток НЕК 293. С первого взгляда видно, что ни повергшийся, ни неподвергшийся комплексованию НСЦ внутри капсулы не имел цитотоксического воздействия или негативного влияния на капсулированные клетки. Фиг. 3 показывает полученное с помощью микроскопа изображение НСЦ капсул, которые содержат клетки НЕК 293 после глубокой заморозки и оттаивания. Капсулы культивировали 21 день в среде МДСИ с 4,5 г/л глюкозы (Gibco, Глазго) и 10% сыворотки телячьего эмбриона (Gibco, Глазго) перед глубокой заморозкой. Глубокую заморозку осуществляли в среде МДСИ с 10% ДМСО (об./об.). После инкубационного периода 2 ч капсулы охладили до -80 С. Размораживание осуществили при легком перемешивании при 37 С на водяной бане. Для дополнительной культивации среду ДМСО повторно заменили свежей МДСИ средой, чтобы удалить избыток ДМСО. С помощью МТТ-теста можно установить, что иммобилизованные клетки пережили процедуру замораживания и оттаивания, несмотря на высокую плотность клеток в капсуле, и что их можно культивировать дополнительно. После размораживания макроскопическая структура мембраны и геометрия капсулы остались без изменений. Фиг. 4 показывает 13 С ЯМР спектр партии b2 из примера 1b2. В результате региоселективного замещения гидроксильной группы сульфатной группой в С 6 позиции, сигнал сдвинулся с 60 до 67 частей/миллион. Не удалось обнаружить ацетатных групп или замещения сульфатных групп в позициях С 2 или С 3. Определенная величина С 3 (С 3 с 6 = 0,4) демонстрирует хорошее согласие с С 3 величиной, рассчитанной из определения серы. Следующие воплощения или примеры приведены не с целью ограничения изобретения. Дополнительно в контексте описания примеров или воплощений открыто учитывались такие вариации, элементы и комбинации, которые в своем сочетании или модификации имели характеристики, содержащиеся в общем описании, например, формулы или диаграммы, даже если эти комбинации характеристик или изменений явным образом не показаны и не описаны в воплощении, но ведут к изменению объекта или к новым стадиям в способе, а именно к новой последовательности стадий способа. Примеры Пример 1. Производства сульфата натрий-целлюлозы (НСЦ) Пример 1 а: 10,7 г целлюлозы с сухим содержанием 93,73% (хлопковый пух с Cuoxam-СП 1230) ввели в 333 мл диметилформамида (ДМФ). Целлюлоза набухала при комнатной температуре в течение примерно 14 ч. Смешанную этерификацию начинали после успешного набухания, добавив реакционную смесь, которая приготовлена из 8 моль/моль единиц ангидроглюкозы (АГЕ) ангидрида уксусной кислоты (47 мл) в качестве ацетилирующего агента и 0,7 моль/моль АГЕ хлорсульфоновой кислоты (2,9 мл) в качестве сульфирующего агента, а также из 100 мл ДМФ. Синтез проводили при температуре 50 С. Целлюлоза начинает растворяться и после примерно 3 ч получается прозрачный полимерный раствор. Через 5 ч провели нейтрализацию/осаждение при постоянном перемешивании, медленно приливая полимерный раствор (в течение примерно 15 мин) в нейтрализационную/осадительную среду, которая была приготовлена из 42,9 г гидроксида натрия (NaOH), 80 г Н 2 О и 20 г ацетата натрия, дополненных до 1,5 л этанолом, и предпочтительно при комнатной температуре. После того как полимерный раствор был полностью вылит в нейтрализационную/осадительную среду его перемешивали еще 1 ч. Затем его профильтровали и трижды промыли, каждый раз 600 мл промывного раствора, состоящего из 4%(масс/масс) ацетата натрия в смеси этанол-вода (1:1, мас./мас.). Затем провели деацетилирование, добавив 333 мл деацетилирующего реагента (13 г NaOH, 27 г Н 2 О дополненные 333 мл этанола). Смесь перемешивали примерно 1 ч и оставили стоять примерно 12 ч. Нейтрализацию смеси провели, доведя величину рН до 8,0 с помощью смеси уксусная кислота -этанол (1:1,мас./мас.). Затем ее трижды промыли 1 л этанола и высушили при 40 С в вакууме. Доля и количество использованных ацетилирующего и сульфирующего агентов зависят от желательного региоселективного замещения по позициям С 2, С 3 и С 6. Подходящие пропорции смеси известны специалистам в этой технологии. Полученный НСЦ полностью растворим в воде и имеет С 3 = 0,33 и- 10012450 вязкость 25 мПас в 1% водном растворе. Для аналитической характеристики сульфата целлюлозы по изобретению использовали следующие способы:A. Определение серы элементным анализом. После количественного сжигания образцов НСЦ, определили элементы С, Н, N и S в % с помощью устройства для элементного анализа (оборудование фирмы Carlo Erba), где степень замещения сульфатных эфирных групп рассчитана из содержания серы (с учетом содержания влаги в препарате) в соответствии с выражением: С 3 сульфат = 162%S/(3200 - 102%S)B. Анализ следов металлов с применением оптической эмиссионной спектрометрии: Анализ проведен после специального измельчения целлюлозы и производных целлюлозы с помощью ICP-OES (Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry; Perkin-Elmer) (Оптическая эмиссионная плазменная спектрометрия с индуктивной связью, Perkin-Elmer).C. Общая С 3, частичная С 3 в позиции С 6, определение полного удаления ацетилгрупп с помощью жидкофазного 13 С ЯМР. Частичная степень замещения в отдельных позициях АГЕ рассчитана из жидкофазных 13 С ЯМР спектров растворов сульфата натрий-целлюлозы в D2O при интегрировании площадей сигналов и сравнивая интегральные площади для замещенных и незамещенных НСЦ. Спектры были сняты с применением спектрометра Bruker MSL 400 с частотой 100,63 МГц, причем в качестве стандарта для химического сдвига был использован тетраметилсилан.D. Явная растворимость водных растворов сульфата целлюлозы. Кроме оптической оценки 1% водных растворов сульфата натрий-целлюлозы, была измерена с помощью турбидиметра типа 2100AN(Hach-Lange GmbH, Дюссельдорф, Германия) величина мутности под углом 90 в НЕМ (нефелометрическая единица измерения мутности). Е. Вязкость раствора: кинематическая вязкость 1% водных растворов сульфата натрий-целлюлозы измерена при 25 С в автоматическом капиллярном вискозиметре Viscoboy 2 + SAE/KM2 (Лауда, Германия). Вязкость приведена в мПа с после конверсии с применением плотности. Пример 1.b1 и 1.b2. 21,1 г хлопкового пуха (сухое содержание 94,86 %, СП = 1264) медленно добавили к 550 мл ДМФ(диметилформамид) при постоянном перемешивании при 80 С в течение 8 ч, охладили до комнатной температуры (КТ) и перемешивали дополнительно 12 ч. После набухания начали смешанную этерификацию путем добавления смеси реагентов, состоящей из 8 моль/моль ангидроглюкозных единиц (АГЕ) ангидрида уксусной кислоты (93 мл) и 0,9 моль/моль АГЕ хлорсульфоновой кислоты (7,4 мл), доведя общий объем до 200 мл с помощью ДМФ. Затем смесь реагентов быстро добавили к раствору целлюлозы при 50 С при быстром перемешивании. В результате образования сульфата-ацетата целлюлозы примерно через 1,5 ч был получен желтоватый прозрачный раствор полимера. Через 4,5 ч партию разделили на две порции. Половину раствора полимера удалили и добавили к нейтрализующей и осаждающей среде,состоящей из 42,9 г NaOH, 80 г Н 2 О и 20 г ацетата натрия, доведенной до объема 1,5 л с помощью этанола (b1). Другую половину (b2) перемешивали дополнительно 3,5 ч при 50 С и затем добавили к нейтрализующей и осаждающей среде. После осаждения обе партии раздельно отфильтровали и трижды промыли 600 мл промывного раствора (4% ацетат натрия (мас./мас.) в смеси этанол-вода (1:1, мас./мас Деацетилирование начали добавлением 333 мл деацетилирующего реагента (13 г NaOH, 27 г Н 2 О, доведенных до объема 333 мл этанолом). Обе партии перемешивали 1 ч и оставили примерно на 12 ч при комнатной температуре. рН отрегулировали с применением смеси уксусная кислота-этанол (1:1,мас./мас.). Оба препарата сульфата целлюлозы затем трижды промыли, каждый в 1 л этанола, и высушили при 40 С в вакууме. Свойства полученного НСЦ приведены в табл. аа. Фиг. 4 показывает 13 С ЯМР спектр партии b2. В результате региоселективного замещения гидроксильной группы на сульфатную группу в позиции С 6 сигнал сдвинулся с 60 до 67 ч./млн. Не было зарегистрировано ни ацетатных групп,ни какого-либо замещения сульфатных групп в позициях С 2 или С 3. Определенная величина С 3 (С 36 = 0,4) хорошо согласуется с величиной С 3, рассчитанной из определения серы. Пример 1.с 1 и 1.с 2. Как описано в примере 1b, были приготовлены два различных состава НСЦ с использованием различных исходных химикатов. В партии с 1 не обращали внимания на содержание металла в исходных химикатах. Взвешивание или добавление химикатов осуществляли с использованием металлических шпателей. Для осаждения использовали металлическую мешалку. В партии с 2 использовали только химикаты с чрезвычайно низким содержанием металла. Кроме того, в ходе синтеза избегали любого контакта с металлсодержащим оборудованием, таким как мешалки, шпатели и т.д. Анализ содержания тяжелых металлов в обоих препаратах дан в табл. bb. Таблица bb Пример 1.d1 Использована та же процедура, что в примере 1b, за исключением того, что вместо хлопкового пуха взяли порошок целлюлозы Arbocell M80 от Rettenmayer (Германия). Конверсию 21,2 г Cuoxam (СП = 750, содержание сухого вещества= 94,16%) провели с использованием 11 моль/моль ангидроглюкозных единиц (АГЕ) ангидрида уксусной кислоты и 1 моль/моль АГЕ хлорсульфоновой кислоты в 200 мл ДМФ. После деацетилирования полученный продукт очистили диализом и затем осушили вымораживанием. Прозрачный растворимый сульфат натрий-целлюлозы (НСЦ), полученный в воде, имеет С 3 = 0,49,а его 1% водный раствор имеет вязкость 15 мПас. Пример 1.d2 Использован хлопковый пух как в примере 1 а, но вместо 11 моль/моль ангидроглюкозных единиц(АГЕ) ангидрида уксусной кислоты использованы 1,1 моль/моль АГЕ хлорсульфоновой кислоты в 200 мл ДМФ. Прозрачный растворимый сульфат натрий-целлюлозы (НСЦ), полученный в воде, имеет С 3 = 0,57, а его 1% водный раствор имеет вязкость 120 мПас. Пример 1.е 1 и 1.с 2 Сульфат натрий-целлюлозы (НСЦ) приготовлен, как описано в примере 1 а. Дополнительные стадии синтеза после деацетилирования проведены, как это описано в примере а 1, но для примера е 2 это проводили в ламинарном боксе, чтобы сравнить степень загрязнения. Результаты представлены в табл. dd. Тест на стерильность проводили в соответствии с рекомендацией "European Pharmacopoeia 4" в жидкой среде "тиогликолятная среда" для анэробных микроорганизмов и в "триптиказо-соевый бульон" для аэробных микроорганизмов. Кроме того, также использовали низкопитательную жидкую среду "пептонный бульон на экстракте дрожжей, 1/4 крепости". После приготовления питательной среды вливали по 10 мл за раз в бутылочки с завинчивающимися крышками. Затем их обрабатывали в автоклаве при 121 С. В каждую бутылочку долили по 1 мл образца и затем выдержали 14 дней, поддерживая температуру 28 С. Каждый тест проводили с двойным составом. В качестве стерильного контрольного экземпляра использовали две бутылочки для каждой среды без добавок при таких же условиях. Те бутылочки, в которых наблюдалось помутнение или осадок, считались загрязненными. Образец е 2, который был приготовлен в стерильных условиях, не обнаружил ни мутности, ни осадка и его сочли свободным от бактерий. Примечание: - отсутствовал рост после инкубационного периода 14 дней+ рост после инкубационного периода 14 днейсильный рост после 14 дней Пример 1.f. 10,7 г хлопкового пуха (TG = 93,9 %, СП = 1351) добавили к 230 мл ДМФ, как это описано в примере 1 а, и оставили набухать при непрерывном перемешивании в течение 8 ч. Начальную температуру установили 80 С. После охлаждения до комнатной температуры смесь оставили без перемешивания еще на 12 ч. После набухания начали смешанную этерификацию, добавляя смесь реагентов. Смесь реагентов приготовили отдельно, охлаждая и перемешивая при последовательном добавлении 11 моль/моль ангидроглюкозных единиц (АГЕ) ангидрида уксусной кислоты (64 мл) и 1 моль/моль АГЕ сульфурилхлорида(5 мл) к 100 мл ДМФ. Затем к целлюлозе быстро добавили смесь реагентов при непрерывном перемешивании. В последствии температуру реакции доводят до 50 С. После 6 ч производят нейтрализацию и осаждение при медленном (примерно 15 мин) добавлении и при непрерывном перемешивании полимерного раствора в нейтрализационную и осаждающую среду, состоящую из 42,9 г NaOH, 80 г Н 2 О и 20 г ацетат натрия и доведенную до объема 1,5 л с помощью этанола, который предпочтительно имеет комнатную температуру. После того как полимерный раствор был добавлен к нейтрализационной и осаждающей среде, всю смесь перемешивали еще один час. Затем состав профильтровали и трижды промыли,каждый раз используя 600 мл промывного раствора (4% мас./мас.) нитрата натрия в смеси этанол-вода(1:1, мас./мас.). Деацетилирование проводили, в каждом случае добавляя по 333 мл деацетилирующего реагента (13 г NaOH, 27 г Н 2 О, доведенного до объема 333 мл этанолом). Состав перемешивали 1 ч и оставили выстаиваться примерно 12 ч при комнатной температуре. Затем рН довели до 8,0, используя смесь уксусная кислота-этанол (1:1, мас./мас.). Затем состав трижды промыли 1 л этанола и высушили при 40 С под вакуумом. Полученный в результате НСЦ имеет содержание серы 6,49%, которое приводит к степени замещения С 3 = 0,51. Величина С 3, определенная с применением ЯМР (С 3 общая = С 3 с 6) составила 0,55. 1% водный раствор имеет вязкость 40 мПас (мм 2/с). Пример 1g. Следовали той же процедуре, что в примере 1f, за исключением того, что в качестве растворителя использовали 250 мл N-метил-2-пирролидон (МП). Начали смешанную этерификацию после набухания путем добавления реакционной смеси, которая состоит из 11 моль/моль ангидроглюкозный единиц(АГЕ) ангидрида уксусной кислоты (64 мл) в качестве ацетилирующего агента и 0,5 моль/моль АГЕ амидосерной кислоты (2,9 мл) в качестве сульфирующего агента и 100 мл N-метил-2-пирролидона (МП). Синтез проведен при температуре 70 С. Осаждение, деацетилирование, промывка и высушивание продукта проведены так, как это описано для примера 1f. Полученный в результате полностью растворимый в воде НСЦ имеет содержание серы 5,12% (С 3=0,31). Величина С 3, определенная с применением ЯМР(С 3 общая= С 3c6), привела к 0,33. А 1% водный раствор имеет вязкость 12 мПас. Пример 1h. Следовали той же процедуре, что в примере 1f, за исключением того, что в качестве растворителя использовали 350 мл N,N-диметил ацетамида (ДМАА). Начали смешанную этерификацию после набухания путем добавления реакционной смеси, которая состоит из 11 моль/моль ангидроглюкозных единиц(АГЕ) ангидрида уксусной кислоты (64 мл) в качестве ацетилирующего агента и 0,9 моль/моль АГЕ серной кислоты (3 мл, 98% H2SO4) в качестве сульфирующего агента, а также 150 мл ДМАА. Синтез проводили при температуре 70 С. Осаждение, деацетилирование, промывка и высушивание продукта проведены так, как это описано для примера 1f. Полученный в результате полностью растворимый в воде НСЦ имеет содержание серы 6,93% (С 3=0,45). 1% водный раствор имеет вязкость 5 мПас. Пример 1i. Следовали той же процедуре, что в примере 1f, за исключением того, что в качестве растворителя использовали 350 мл N,N-диметилацетамида (ДМАА). Начали смешанную этерификацию после набухания путем добавления реакционной смеси, которая состоит из 6 моль/моль ангидроглюкозных единиц(АГЕ) ацетилхлорида (29 мл) в качестве ацетилирующего агента и 1,5 моль/моль АГЕ серной кислоты(4,9 мл) в качестве сульфирующего агента, а также 150 мл ДМАА. Синтез проводили при температуре- 13012450 70 С. Осаждение, деацетилирование, промывка и высушивание продукта проведены так, как это описано для примера 1f. Полученный в результате полностью растворимый в воде НСЦ имеет содержание серы 10,73% (С 3=0,82). 1% водный раствор имеет вязкость 13 мПас и величину мутности 2,5 НЕМ. Пример 1j. Следовали той же процедуре, что в примере 1f, за исключением того, что в качестве растворителя использовали 350 мл МП. Начали смешанную этерификацию после набухания путем добавления реакционной смеси, которая состоит из 6 моль/моль АГЕ ацетилхлорида (29 мл) в качестве ацетилирующего агента и 1,5 моль/моль АГЕ SO3 /ДМФ комплексов (14 г, коммерчески доступного в виде комплекса 1:1) в качестве сульфирующего агента, а также 150 мл МП. Синтез проводили при температуре 60 С. Осаждение, деацетилирование, промывка и высушивание продукта проведены так, как это описано для примера 1f. Полученный в результате полностью растворимый в воде НСЦ имеет содержание серы 9,83%(С 3=0,72). 1% водный раствор имеет вязкость 12 мПас и величину мутности 6,6 НЕМ. Пример 2. Производство НСЦ микрокапсул из НСЦ по изобретению В соответствии с известными способами (воздушно-струйный способ; способ сечения струи; вибрационный способ) приготовления микрокапсул (Orive et al, 2004, Trends Biotechnol. 10 22 (2): 87-92),раствор сульфата целлюлозы добавляли по каплям, чтобы произвести комплексообразование в поликатионном растворе (например, ПДАДМА) с помощью устройства капсулирования (Inotech, Model IE-50R). Погружение капель сульфата целлюлозы в перемешиваемый водный раствор поликатиона (ПДАДМА) благодаря протеканию спонтанных реакций комплексообразования ведет к образованию на границе фаз полупроницаемой мембраны, которая содержит не подвергшееся комплексообразованию жидкое ядро. С ростом времени реакции прочность мембраны увеличивается из-за диффузии поликатиона в капсульную мембрану, пока плотность образующейся трехмерной сетки не создаст барьер диффузии полиэлектролита. Для изготовления капсул изготавливают гомогенный водный раствор НСЦ с концентрацией сульфата целлюлозы 1,5-3,5% (мас./об.). Используемый для этого НСЦ имел степень замещения (С 3) между 0,3 и 0,99. Этот раствор НСЦ добавляли по каплям в 0,8-2% раствор ПДАДМА (масс/об) со скоростью ламинарного потока 1-15 мл/мин через форсунку 100-300 мкм. Из-за низкой структурной вязкости и в то же время высокого поверхностного натяжения раствора НСЦ по изобретению возможна высокая рабочая скорость. Каплеобразование и размер капли определяются объемной скоростью потока, физическими свойствами жидкости, выбранным диаметром форсунки и, в случае вибрационного способа также частотой возбуждения и частотой амплитуды, которой регулируется распадение жидкой струи на капли. Эту частоту установили 600-1100 Гц, чтобы изготавливать сферические микрокапсулы с диаметром примерно 650-700 мкм. Увеличение частоты ведет к меньшим размерам капсул, и размер становится больше,если частота снижается. Предпочтительно частоту 650 Гц выбирают, чтобы производить капсулы,имеющие средний размер диаметра 700 мкм для форсунки 250 мкм. Частоту 1100 Гц следует выбирать для изготовления капсул со средним размером 500 мкм, а частоту 500 Гц для изготовления капсул со средним размером 800 мкм. Точная настройка возможна путем модулирования других параметров. Дополнительно на размер капсул также влияет реакция сульфата целлюлозы с ПДАДМА. Увеличенное время реакции, высокие концентрации и низкая молекулярная масса ПДАДМА снижают размер капсул. Можно показать, что симплексные микрокапсулы, которые изготовлены из НСЦ по изобретению, демонстрируют воспроизводимость и квазиидеальную сферическую геометрию и в то же время низкий разброс по размерам (фиг. 1) Пример 3. Производство НСЦ-капсул с биологическими объектами Способ производства НСЦ-микрокапсул включает в качестве важных стадий: (а) приготовление НСЦ-раствора, (b) приготовление НСЦ-клеточной суспензии, (с) конверсия капель в капсулы, (d) комплексообразование в ванне комплексообразования и (е) окончание реакции комплексообразования. НСЦ по изобретению сначала растворяют в физиологическом буферном солевом растворе (0,8-1,0%(масс/об до концентрации 1,5-3,5% (мас./об.) при перемешивании при комнатной температуре и доводят величину рН до 7,2 с помощью 0,1N NaOH или 0,1 N HCl. Приготовленный раствор НСЦ обрабатывают в автоклаве при 121 С перед смешиванием с клетками. Приготовление НСЦ-клеточных суспензий Для капсулирования в НСЦ-капсулах использованы, клетки НЕК 293 (АТСС CRL-2828), клетки Jurkat (ATCC TIB-152) или клетки HIT (ATCC CRL-1777). В принципе, однако, могут быть использованы ряд родственных, а также суспензионных клеток. Клеточные культуры экспоненциально размножают по соответствующим, обычным для клеточных культур способам, например, в Т 75-Колбах или в роллерфлаконах и собирают после образования монослоя на 90%. Использованные линии клеток инкубировали в среде МДСИ с 4,5 г/л глюкозы (Gibco, Глазго, Великобритания) с 10% сыворотки телячьего эмбриона(Gibco, Глазго, Великобритания). Высвобожденные клетки перевели в 50 мл трубку Фалкона, центрифугировали 5 мин при 200 g и отбросили надосадочную жидкость. Затем клеточную таблетку тщательно промыли буфером ФБС и в заключение ввели в раствор НСЦ, приготовили гомогенную суспензию в растворе НСЦ, перевели в стерильный шприц и затем присоединили в стерильных условиях к установке- 14012450 капсулирования, оснащенной шланговыми соединителями и сосудами, которая помещена в автоклав. Прямо после этого начинается капсулирование. Конверсия в капли и производство капсул Для капсулирования скорость сначала увеличивали так, чтобы из капилляра вытекал равномерный жидкий поток; затем объемную скорость потока можно было снизить до скорости, оптимальной для осуществления конверсии в капли. Отходы НСЦ-клеточной суспензии, конвертированной к этому времени в капли, перехватывались поворотной дренажной емкостью перед сбросом в закалочную ванну,которую отводят в сторону после образования такой равномерной жидкой струи (стабильная фаза), при которой может происходить образование капсул. Изготовленные микрокапсулы могут непрерывно отсасываться насосом из зоны реакции, и их следует промывать или разбавлять физиологическим буферным солевым раствором, ФБС (соляной раствор с фосфатным буфером) или средой культуры, чтобы удалить не подвергшийся комплексообразованию ПДАДМА. Все стадии могут быть реализованы в стерильных условиях. Затем в стерильном рабочем месте надосадочную текучую среду отбирают из сборного сосуда с помощью пипетки после оседания капсул и заменяют средой культуры. Прямо после этого капсулированные клетки культивировали в Т-колбах или в роллерных бутылях при 37 С, 5% CO2, насыщенной влажности и 2 об./мин. Через 4-8 ч среду снова заменяли, чтобы удалить остаточный ПДАДМА. Во время изготовления капсул следует обращать внимание на стерильность всех компонентов и растворов. Определение жизнеспособности по окрашиванию трипанового синего Определение жизнеспособности по окрашиванию трипанового синего служит для определения общего числа клеток (мертвых и живых клеток). Трипановый синий (0,8 мМ в ФБС (Sigma- Aldrich, Дайзенхофен, Германия) - это отрицательно заряженный краситель, который может селективно диффундировать в клетки с нецелой клеточной мембраной и может придавать синюю окраску их цитоплазме. В результате мертвые клетки кажутся сине-фиолетовыми под оптическим микроскопом, в то время как живые клетки имеют цвет от белого до желтоватого. Число живых и мертвых клеток можно тогда определить микроскопически с помощью счетной камеры Нейбауэра. Определение жизнеспособности с помощью МТТ-теста Определение жизнеспособности с помощью МТТ-теста (MTT-Proliferation Kit, Roche, Мангейм,Германия) включает подсчет только живых клеток, в отличие от описанного выше окрашивания трипанового синего. Этот способ измерения представляет собой калориметрический тест, в котором желтая тетразолиевая соль 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) пассивно абсорбируется живой клеткой и под действием дегидрогеназы осаждается в виде пурпурных кристаллов формазана, не растворимых в воде. Количество образовавшегося формазана пропорционально числу живых клеток при постоянном и достаточно длинном инкубационном периоде. Определение проводят фотометрически при=570 нм после инкубационного периода 4 ч при 37 С. МТТ-тест на жизнеспособность капсулированных клеток Тест МТТ был изначально разработан, чтобы определять число живых клеток в клеточных суспензиях. Количественный МТТ-тест может также быть проведен для неповрежденных капсул. Но для количественного определения клетки из капсул следует растворить путем инкубации капсул в течение 1 ч в 20% растворе НДС (SDS, Sigma-Aldrich, Германия) в ультразвуковой ванне. Оставшиеся капсулы и клеточные фрагменты центрифугируют. МТТ-тест был проведен в соответствии с инструкциями поставщика (MTT-Proliferation Kit, Roche, Мангейм, Германия). МТТ-концентрация измерена спектрофотометрически. Пример 4. Определение воспроизводимости качества капсул с использованием разных партий НСЦпроизводства Для производства 600 мкм капсул приготовили 2% раствор НСЦ (масс/об) с 1% NaCl (масс/об) и 1,0% раствор ПДАДМА (мас./об.) с 1% NaCl (мас./об.). Раствор ПДАДМА выдержали при 30 С. 20 мл НСЦ добавили по каплям к 300 мл перемешанного раствора 1,0% ПДАДМА. Время реакции составило 3 мин. Диаметр форсунки 200 мкм. Объемная скорость потока 6,1 мл/мин. Амплитуда колебаний форсунки установлена на 100%, частота установлена 900 Гц. Дисперсионное напряжение 1100 В. Для производства 600 мкм капсул с иммобилизованными клетками принят способ, описанный в примере 3. Кроме того,клетки, растущие конфлюэнтно до 90%, трипсинизируют в Колбе-Т 75, абсорбируют в среде НМ (МДСИсреда с 4,5 г/л глюкозы + 10%СТЭ (Gibco, Глазго, Великобритания и таблетируют при 200 g в течение 5 мин. Из таблетки снова делают суспензию в ФБС и определяют клеточную концентрацию. Аликвоту клеточной суспензии таблетируют, чтобы получить концентрацию клеток в 2106 клетки/мл НСЦ. Промытую таблетку снова суспендируют в растворе НСЦ и заполняют для введения. Конверсия клеточной суспензии в капли происходит непосредственно после этого. Определение размера капсул Размеры капсул определяют микроскопически в счетной камере Нейбауэра (оптический микроскоп- 15012450 М 200 и программа "Zeiss Imaging Vers. 4" (Carl Zeiss Jena, Йена, Германия) при 4-кратном увеличении. Стабильность измерения микрокапсул Для определения механических свойств НСЦ-микрокапсул использовали измерительный прибор сила-смещение (LUMiTexture, Lerche GmbH, Берлин, Германия). Штамп налагает нагрузку на тестируемый объект с запрограммированной скоростью, причем электронные весы измеряют полученную в результате силу. Из кривой сила-смещение можно определить параметры внутреннего давления и максимальное натяжение, возникающее в симплексной мембране. Измерения стабильности произведены для капсул без иммобилизованных клеток, а также для изучения долгосрочной стабильности капсул с иммобилизованными клетками. Таблица 2 Измерение капсул с одинаковыми параметрами капсулирования, но изготовленных в 4 разных производственных партиях, показывает, что достигнута абсолютно сравнимая стабильность полученных капсул. Средняя стабильность варьируется примерно на 6%. Разброс между индивидуальными партиями ниже, чем стандартное отклонение в соответствующих диапазонах измерения. Этот результат показывает, что реакцию комплексообразования, по которой происходит образование симплекс-мембраны, можно очень хорошо регулировать благодаря воспроизводимому НСЦ-синтезу и организации избранного способа. Постоянно высокая стабильность капсул позволяет оценку пригодности изготовленных капсул для специальных назначений с высокими механическими нагрузками, и поэтому сводит к минимуму риск механического разрушения капсул. Капсулы достаточно стабильны для культивации культуры в покоящихся и в перемешиваемых сосудах, а также для внутривенных инъекций и имплантации в ткани людей и животных. Пример 5. Влияние капсулированной клетки на стабильность капсулы Изготовление капсулы проводили, как это описано в примере 3. Стабильность измерена по способу,упомянутому в примере 4. Сначала капсулы были загружены по 300 клеток/капсулу. Измерение провели через 14 дней. Таблица 3 Если суспендированные клетки лежат на поверхности капелек, то может случиться, что они постоянно фиксируются в мембране во время реакции комплексообразования между НСЦ и ПДАДМА. Измеренная стабильность капсул показывает, что клетки, суспендированные в НСЦ, не оказывают отрицательного влияния на стабильность капсульной мембраны. Это основная предпосылка для иммобилизации нерастворимых твердых частиц, таких как ткани, клетки человеческого или животного происхождения, микроорганизмы, микрочастицы, наночастицы, иммобилизованные энзимы, катализаторы и кристаллические вещества не растворимые в воде. Пример 6. Долгосрочная стабильность НСЦ капсул с иммобилизованными клетками Капсулы готовили и культивировали по способу, описанному в примере 3. Измерение стабильности провели так, как это описано в примере 4. Сначала 300 клеток/капсулу капсулировали и культивировали в течение 60 дней в среде МДСИ с 4,5 г/л глюкозы + 10% сыворотки телячьего эмбриона (Gibco, Глазго,Великобритания) при 37 С и 5% СО 2 в роллерных бутылочках при 2 об./мин. Таблица 4- 16012450 Измерение максимального натяжения капсульной мембраны, которое возникает непосредственно перед разрушением капсул, показывает, что стабильность капсулы падает на 18% за период культивации в течение 60 дней, но еще остается достаточно высокой, чтобы обеспечивать целостность капсул. Образовавшаяся симплексная мембрана устойчива к осмотической, химической и физической нагрузке, которая имеет место при культивации иммобилизованных клеток в среде клеточной культуры. Это делает возможным применение при высоких солевых концентрациях, изменяющихся величинах рН и при постоянной механической нагрузке. Пример 7. Производство и воспроизводимость НСЦ-микрокапсул с заданным диаметром Для приготовления капсул со стандартным диаметром 250 мкм приготовили 1,5% раствор НСЦ(масс/об) с 1% NaCl (мас./об.) и раствор 0,85% ПДАДМА (мас./об.) с 1% NaCl (мас./об.). Раствор ПДАДМА выдержан при 30 С. 10 мл НСЦ по каплям добавили к 300 мл перемешанного раствора 0,85% ПДАДМА. Концентрационное соотношение ПДАДМА к НСЦ составило 17 (г/г). Время реакции составило 2 мин. Устройство для введения оборудовано 10 мл пластиковыми инжекторами. Диаметр форсунки 100 мкм. Объемная скорость потока 1,5 мл/мин. Амплитуда колебаний форсунки 100%, частота установлена 2000 Гц. Дисперсионное напряжение 1300 В. Результаты показаны на фиг. 1A. Для приготовления капсул со стандартным диаметром 520 мкм приготовили 1,8% раствор НСЦ(мас./об.) с 1% NaCl (мас./об.) и 1,0% ПДАДМА (мас./об.) с 1% NaCl (мас./об.). Раствор ПДАДМА выдержан при 30 С. 20 мл НСЦ по каплям добавили к 300 мл перемешанного раствора 1,0% ПДАДМА. Концентрационное соотношение ПДАДМА к НСЦ составило 11,1 (г/г). Время реакции составило 3 мин. Устройство для впрыскивания оборудовано пластиковыми инжекторами. Диаметр форсунки 200 мкм. Объемная скорость потока 6,1 мл/мин. Амплитуда колебаний форсунки 100%, частота установлена 1100 Гц. Дисперсионное напряжение 1100 В. Результаты показаны на фиг. 1 В. Для приготовления капсул со стандартным диаметром 700 мкм приготовили 2,8% раствор НСЦ(масс/об) с 1% NaCl (мас./об.) и 1,5% ПДАДМА (мас./об.) с 1% NaCl (мас./об.). Раствор ПДАДМА выдержан при 30 С. 15 мл НСЦ по каплям добавили к 8,5 мл перемешанного раствора 1,0% ПДАДМА. Концентрационное соотношение ПДАДМА к НСЦ составило 10,7 (г/г). Время реакции составило 3 мин. Устройство для впрыскивания оборудовано пластиковыми инжекторами. Диаметр форсунки 250 мкм. Объемная скорость потока 8,5 мл/мин. Амплитуда колебаний форсунки 100%, частота установлена 700 Гц. Дисперсионное напряжение 1100 В. Результаты показаны на фиг. 1 С. Для приготовления капсул со стандартным диаметром 1200 мкм приготовили 2% раствор НСЦ(масс/об) с 1% NaCl (мас./об.) и 2,5% ПДАДМА (мас./об.) с 1% NaCl (мас./об.). Раствор ПДАДМА выдержан при 30 С. 30 мл НСЦ по каплям добавили к 300 мл перемешанного раствора 1,0% ПДАДМА. Концентрационное соотношение ПДАДМА к НСЦ составило 10,7 (г/г). Время реакции составило 5 мин. Устройство для впрыскивания оборудовано пластиковыми инжекторами. Диаметр форсунки 300 мкм. Объемная скорость потока 12,9 мл/мин. Амплитуда колебаний форсунки 100%, частота установлена 600 Гц. Дисперсионное напряжение 1200 В. Результаты показаны на фиг. 1D. Размеры капсул определяли микроскопически в счетной камере Нейбауэра (оптический микроскоп М 200 и программа "Zeiss Imaging Vers. 4" (Carl Zeiss Jena, Йена, Германия) при 4-кратном увеличении. Определение воспроизводимости размера капсул с использованием различных производственных партий НСЦ Чтобы сравнить воспроизводимость различных производственных партий капсул НСЦ со стандартным диаметром 710 мкм, они приготовлены с использованием раствора НСЦ 1,7% (мас./об.) с 1% NaCl(мас./об.) и 1,5% ПДАДМА (мас./об.) раствора с 1% NaCl (мас./об.). Раствор ПДАДМА выдержан при 30 С. 15 мл НСЦ по каплям добавили при 8,1 мл/мин к 300 мл перемешанного раствора 1,5% ПДАДМА. Концентрационное соотношение ПДАДМА к НСЦ составило 10,7 (г/г). Время реакции составило 3 мин. Устройство для впрыскивания оборудовано пластиковыми инжекторами. Диаметр форсунки 250 мкм. Объемная скорость потока 8,1 мл/мин. Амплитуда колебаний форсунки 100%, частота установлена 750 Гц. Дисперсионное напряжение 1350 В. Результаты показаны в табл. 5. Размеры капсул определяли микроскопически в счетной камере Нейбауэра (оптический микроскоп М 200 и программа "Zeiss Imaging Vers. 4" (Carl Zeiss Jena, Йена, Германия) при 4-кратном увеличении. Дополнительные производственные спецификации соответствуют способу, описанному в примере 2. Примеры, показанные на фиг. 1, иллюстрируют, как могут изготавливаться монодисперсные НСЦмикрокапсулы с различными диаметрами, что открывает широкий спектр возможных применений капсул. Среднеквадратическое отклонение диаметра капсул низкое, в среднем на уровне 4%. Вариация от партии к партии низкая - 3,3% для капсул, имеющих диаметр 710 мкм, поэтому, когда применяют НСЦ,приготовленный по способу изобретения, то достигается высокая воспроизводимость. Это следствие того факта, что струя жидкости, вытекающая из форсунки, имеет постоянную скорость потока, которая возможна лишь с очень гомогенными полимерными растворами. Это особенно существенно для приготовления капсул с меньшими диаметрами, потому что малые изменения скорости потока ведут к большим вариациям в размере капсул. Даже при низком средним диаметре 265 мкм, с НСЦ по изобретению достигается среднеквадратическое отклонение 4% (фиг. 1 а), хотя минимальные изменения объема, вызванные негомогенными растворами НСЦ могут оказать резко негативное влияние на распределение по размеру. Для капсул 520 мкм может реализоваться среднеквадратическое отклонение 2% (фиг. 1b). Монодисперсность изготовленных капсул позволяет очень точное дозирование иммобилизованного материала, потому что поверхность капсул можно точно рассчитать. Иммобилизованные клетки равномерно растут в монодисперсных частицах. В случае перемешиваемых сосудов культивации монодисперсные капсулы гарантируют равномерную дисперсию и, следовательно, оптимальные условия роста для всех культивируемых клеток. Использование микрокапсул с применением канюли возможно только для капсул с низким разбросом по размеру, потому что это сводит к минимуму риск блокировки. Большие диаметры форсунок делают возможной иммобилизацию мелких изолированных тканей с минимальным риском блокировки. С ними также можно изготавливать монодисперсные капсулы (фиг. 1 С). Минимальный размер капсул, которые можно производить, ограничен только выбранным способом каплеобразования, а не используемым раствором НСЦ. Пример 8. Исследование влияния НСЦ капсул на рост клеток Рост клеток НЕК 293 во времени изучен в ходе эксперимента. Кроме того, клетки, растущие конфлюэнтно на 90% трипсинизируют в Колбе-Т 75, абсорбируют в среде НМ (МДСИ-среда с 4,5 г/л глюкозы + 10% СТЭ (Gibco, Глазго, Великобритания и таблетируют при 200 г в течение 5 мин. Для изготовления НСЦ капсул были трипсинизированы делящиеся клетки из Т 75-Колбы со слиянием на 90%, собраны в среде МДСИ и центрифугированы с 200 г в течение 5 мин. Массу вновь суспендировали в ФБС и определили клеточную концентрацию. Аликвоту клеточной суспензии снова таблетировали и довели клеточную концентрацию до 2106 клеток/мл НСЦ. Промытую таблетку вновь суспендировали в растворе НСЦ и ввели в шприц. Сразу после этого произвели конверсию клеточной суспензии в капли. Для производства 600 мкм капсул взяли раствор 2% НСЦ (мас./об.) с 1% NaCl (мас./об.) и 1,1% ПДАДМА (мас./об.) раствор с 1% NaCl (мас./об.). Раствор ПДАДМА выдержали при умеренной температуре 30 С. 20 мл раствора НСЦ вводили по каплям к 300 мл перемешанного раствора 1,1 % ПДАДМА. Время реакции было 3 мин. Диаметр форсунки был 200 мкм. Скорость потока установили 6,1 мл/мин. Амплитуда колебаний форсунки составила 100%, частоту установили 900 Гц. Дисперсионное напряжение было 1100 В. Для производства 1200 мкм капсул взяли раствор 2% НСЦ (мас./об.) с 1% NaCl (мас./об.) и 2,5% ПДАДМА (мас./об.) раствор с 1% NaCl (мас./об.). Раствор ПДАДМА нагрели до 30 С. 30 мл раствора НСЦ вводили по каплям к 300 мл перемешанного раствора 2,5% ПДАДМА. Время реакции было 5 мин. Диаметр форсунки был 300 мкм. Скорость потока установили 12,9 мл/мин. Амплитуда колебаний форсунки составила 100%, частоту установили 600 Гц. Дисперсионное напряжение было 1200 В. На фиг. 2 а от левого края сверху до правого края внизу изображения показано качественное увеличение числа клеток в микрокапсулах, причем тестируемые образцы взяты через 1, 2, 3, 7, 14 и 21 дней после капсулирования. Фиг. 2 а ясно показывает на микрофотографиях хороший клеточный рост иммобилизованных НЕК- 18012450 293 клеток в НСЦ капсулах. Клетки были иммобилизованы как одиночные, неагломерированные клетки,в начале прилипшие к внутренней поверхности капсульной мембраны, а в конце заполнившие капсулу. При этом клетки лежат в плотных подобных ткани клеточных агломератах внутри капсул. На фиг. 2b показана кривая роста иммобилизованных НЕК 293 клеток в капсулах 600 мкм, и/или 1200 мкм. Графики выявляют увеличение заключенных НЕК 293 клеток в течение 36 дней. Капсулы для этого культивировали в Т 175-Колбах с 30 мл среды NM. Счет живых клеток на мл НСЦ раствора определили по МТТ тесту (MTT-Proliferation Kit, Roche, Мангейм, Германия) согласно инструкциям производителя. Фиг. 2b дополнительно показывает фазу логарифмического роста, которая следует за широким промежуточным этапом с пониженной скоростью, зависящей от начального капсулирования, которая переходит в финальный стационарный этап. Даже при использовании статической культивации очень высокие плотности клеток 5,61107 клеток на мл НСЦ были получены с капсулами, имеющими диаметр 600 мкм и 3,1107 клеток на мл НСЦ с капсулами, имеющими диаметр 1200 мкм. Более высокая клеточная плотность в более мелких капсулах пропорциональна увеличенной удельной поверхности обмена,который ограничивает передачу рассеянного материала газов и питательных веществ (табл. 6). Таблица 6 Измеренные времена удвоения (tD) на раннем логарифмическом этапе роста tD600MKM=73 ч иtD1200MKM=86 ч сравнительно высоки, поскольку в это время диффузия не является еще фактором, лимитирующим клеточный рост. Пример 9. Стабильность НСЦ капсул после замораживания и оттаивания Для проведения тестов делящиеся клетки из Т 75-Колбы с 90% конфлюэнтностью были суспендированы в среде МДСИ и центрифугированы при 200 г в течение 5 мин. Таблетку вновь суспендировали в ФБС и определили клеточную концентрацию. Аликвоту клеточной суспензии таблетировали, чтобы отрегулировать концентрацию клеток 2106 клеток/мл НСЦ. Промытую таблетку вновь суспендировали в растворе НСЦ и заполнили шприц. Реализацию способа капсулирования начали непосредственно после этого. Для производства 600 мкм капсул взяли 2% НСЦ (мас./об.) с 1% NaCl (мас./об.) и раствор 1,1% ПДАДМА (мас./об.) с 1% NaCl (мас./об.). Раствор ПДАДМА выдержали при температуре 30 С. 20 мл НСЦ вводили по каплям в 300 мл перемешанного раствора 1,1% ПДАДМА. Продолжительность реакции составила 3 мин. Диаметр форсунки был 200 мкм. Скорость потока установили 6,1 мл/мин. Амплитуда колебаний форсунки была 100%, частоту отрегулировали 900 Гц. Дисперсионное напряжение было 1100 В. Капсулы перед замораживанием культивировали 21 день в Т 175-колбах с 30 мл среды МДСИ с 4,5 г/л глюкоза + 10% СТЭ. Замораживание происходило в среде МДСИ с 4,5 г/л глюкозы + 10% СТЭ, к которой был дополнительно добавлен 10% ДМСО (об./об.). После инкубационного периода 2 ч капсулы охладили до -80 С с постоянной скоростью охлаждения. Капсулы для дальнейшего использования хранили при -80 С. На микроскопическом изображении (фиг. 3) показаны капсулы с иммобилизованными клетками,которые были разморожены и позже культивированы в среде МДСИ 24 ч, после окрашивания живых МТТ-тестом (MTT-Proliferation Kit, Roche, Мангейм, Германия) согласно инструкциям производителя. После размораживания макроскопическая структура мембраны капсул остается полностью без изменения. Капсулы также сохраняли иммобилизованные клетки стабильными после этой процедуры. Как это можно увидеть, применив МТТ-тест, иммобилизованные клетки переживают процедуру замораживания и оттаивания и их можно вновь культивировать, несмотря на очень высокую клеточную плотность внутри капсулы. Мембрана капсулы оказалась полностью непроницаемой. Это дает возможность обеспечить капсулы с высокой концентрацией человеческих клеток, применяя промышленные способы производства. Также при разумных затратах могут быть обеспечены хранение аликвот и криогенная консервация. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения региоселективно замещенного сульфата натрий-целлюлозы (НСЦ), включающий следующие стадии:a) набухание природной целлюлозы в полярном апротонном растворителе;b) добавление в реакционную смесь сульфирующего реагента и ацетилирующего реагента;c) полную нейтрализацию смеси с помощью основания, предпочтительно гидроксида натрия, иd) затем осаждение, деацетилирование, промывку и высушивание НСЦ, причем НСЦ характеризу- 19012450 ется вязкостью раствора, которая составляет более 10 мПас при 1% концентрации в воде. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадию нейтрализации проводят одновременно с осаждением. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что вязкость раствора приготовленного НСЦ устанавливают в диапазоне от 10 до 500 мПас, в частности от 15 до 400 мПас, предпочтительно от 20 до 300 мПас, более предпочтительно от 15 до 100 мПас, еще более предпочтительно от 20 до 50 мПас, в расчете на 1% раствор в воде. 4. Способ по любому из предшествующих пп.1-3, отличающийся тем, что набухание природной целлюлозы осуществляют в полярном растворителе, выбранном из группы, включающей N,Nдиметилацетамид (ДМАА), N-метилпирролидон (МП), диметилсульфоксид (ДМСО) и N,Nдиметилформамид (ДМФ). 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что в качестве сульфирующего реагента используют агент, выбранный из группы, состоящей из серной кислоты, амидосерной кислоты, триоксида серы, сульфурилхлорида и хлорсульфоновой кислоты. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что набухшую целлюлозу ацетилируют ацетилхлоридом или уксусным ангидридом. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что набухание осуществляют при температурах от комнатной температуры до 150 С, в частности от 20 до 100 С или предпочтительно от 40 до 80 С. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что ацетилирование и сульфирование проводят при температурах от комнатной температуры до 110 С, в частности от 20 до 80 С, предпочтительно от 30 до 70 С или более предпочтительно от 40 до 65 С. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что все исходные материалы по существу не содержат тяжелых металлов, таких как Cd, Pb, Hg, Fe, Ni, Ti, Mn, Zn или Cu, содержание железа в приготовленном НСЦ составляет 20 ч./млн, и общее содержание тяжелых металлов без учета железа в приготовленном НСЦ составляет 10 ч./млн. 10. Сульфат натрийцеллюлозы (НСЦ), получаемый способом по одному из пп.1-9, отличающийся тем, что вязкость раствора приготовленного НСЦ установлена в диапазоне от 10 до 500 мПас, в частности от 15 до 400 мПас, предпочтительно от 20 до 300 мПас, более предпочтительно от 15 до 100 мПас,еще более предпочтительно от 20 до 50 мПас, в расчете на 1% раствор в воде. 11. Сульфат натрийцеллюлозы (НСЦ) по п.10, отличающийся тем, что приготовленный НСЦ не содержит тяжелых металлов, таких как Cd, Pb, Hg, Fe, Ni, Ti, Mn, Zn или Cu, содержание железа в приготовленном НСЦ составляет 20 ч./млн и общее содержание тяжелых металлов в приготовленном НСЦ составляет без учета железа 10 ч./млн. 12. Способ получения микрокапсул, включающий следующие стадии:a) приготовление 0,5-10% водного раствора из НСЦ по п.10 или 11;b) приготовление суспензии НСЦ для процесса капсулирования путем добавления материалов для капсулирования к водному раствору НСЦ и, возможно, добавления одного или более дополнительного субстрата, добавки-носителя, консерванта, соли, глицерина или ДМСО;c) введение суспензии со стадии (b) по каплям в ванну комплексообразования иd) комплексообразование с получением капсул в ванне, содержащей полимерный катион в водном растворе. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что капсулируемые материалы имеют биологическое происхождение, в частности, являются природными или модифицированными клетками людей или животных, природными или модифицированными бактериями, природными или модифицированными вирусами, природными или модифицированными дрожжами, изолированными белками или белковыми смесями, антителами или фрагментами антител и/или молекулами нуклеиновых кислот. 14. Способ по п.12 или 13, отличающийся тем, что для введения по каплям используют вибрационный способ и частоту в диапазоне от 100 до 4000 Гц. 15. Способ по любому из пп.12-14, отличающийся тем, что полимерный катион выбран из группы,включающей додециламин, этилендиамин, пиперазин, метиленовый синий, аргинин, триэтилтетрамин,поли(аллиламингидрохлорид), спермин, поли(диаллилдиметиламмонийхлорид) (ПДАДМА), поли(винилбензилтриметиламмонийхлорид) и их смеси. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что в качестве полимерного катиона используют поли(диметилаллиламмонийхлорид) (ПДАДМА), имеющий среднюю молекулярную массу от 10000 до 500000, предпочтительно от 10000 до 50000. 17. Применение НСЦ по п.10 или 11 для микрокапсулирования биологических материалов. 18. Микрокапсулы из НСЦ по п.10 или 11. 19. Микрокапсулы из НСЦ, полученные способом по любому из пп.12-16. 20. Микрокапсулы из НСЦ по п.18 или 19, отличающиеся тем, что они имеют гомогенное распределение по размерам при среднем диаметре 0,1-50, 1-100, 50-250, 50-500, 100-250, 100-500, 250-500, 250700, 200-1500, 500-1000, 600-800, 700-1500, 1000-2500, 1500-3000, 2500-4000 или 3000-5000 мкм.- 20012450 21. Применение микрокапсул из НСЦ, капсулирующих фармакологически активные ингредиенты,по любому из пп.18-20 в качестве лекарственных препаратов. 22. Применение микрокапсул из НСЦ по любому из пп.18-20 для производства лекарственных препаратов для имплантации и/или инъекции.