Способ очистки фсг
Формула / Реферат
1. Способ очистки рекомбинантного ФСГ человека или варианта ФСГ, предусматривающий стадии:
(1) ионообменной хроматографии;
(2) хроматографии с иммобилизованным ионом металла и
(3) гидрофобной хроматографии (HIC).
2. Способ по п.1, где ионообменную хроматографию проводят на сильной анионообменной смоле.
3. Способ п.2, где указанной анионообменной смолой является Q Sepharose FF или смола, имеющая сходные свойства.
4. Способ по любому из пп.1-3, где ионообменную хроматографию проводят с использованием боратного буфера в качестве элюента.
5. Способ по п.4, где боратный буфер имеет рН 8,5 или около 8,5.
6. Способ по любому из пп.1-5, где хроматографию с иммобилизованным ионом металла проводят на смоле, имеющей тридентатные хелатирующие группы.
7. Способ п.6, где указанной хелатирующей группой является иминодиуксусная кислота.
8. Способ по любому из пп.1-7, где хроматографию с иммобилизованным ионом металла проводят на хелатирующей Stpharose FF или на смоле, имеющей сходные свойства.
9. Способ по любому из пп.1-8, где хроматографию с иммубилизованным ионом металла проводят с ионом металла, выбранным из Cu2+, Zn2+, Ni2+, Ca2+, Mg2+ и Со2+.
10. Способ по любому из пп.1-8, где хроматографию с иммобилизованным ионом металла проводят с Сu2+.
11. Способ по любому из пп.1-10, где хроматографию с иммобилизованным ионом металла проводят с использованием ацетата аммония в качестве элюента.
12. Способ по п.11, где содержащий ацетат аммония буфер имеет рН 9 или около 9.
13. Способ по любому из пп.1-12, где гидрофобную хроматографию (HIC) проводят с использованием Phenyl Sepharose FF HS или смолы, имеющей сходные свойства.
14. Способ по любому из пп.1-13, где гидрофобную хроматографию проводят с использованием смеси ацетат аммония (50 мМ)/сульфат аммония (0,25М) в качестве элюента.
15. Способ по любому из пп.1-14, включающий вторую стадию ионообменной хроматографии (2а), проводимую после стадии хроматографии с иммобилизованным ионом металла и перед стадией гидрофобной хроматографии (HIC).
16. Способ по п.15, где вторую стадию ионообменной хроматографии проводят с использованием слабой анионообменной смолы.
17. Способ по п.16, где указанной слабой анионообменной смолой является смола DEAE Sepharose FF или смола, имеющая сходные свойства.
18. Способ по любому из пп.1-17, дополнительно включающий стадию обращенно-фазовой хроматографии (4), проводимую после стадии гидрофобной хроматографии (HIC).
19. Способ по п.18, где обращенно-фазовую хроматографию проводят с использованием в качестве смолы Source 30 RPC или смолы, имеющей сходные свойства.
20. Способ по п.19, где обращенно-фазовую хроматографию проводят с использованием ацетата аммония (50 мМ, рН 7,6 или около 7,6) с 20% (об./об.) 2-пропанолом.
21. Способ по пп.18, 19 или 20, включающий стадию ультрафильтрации (5), проводимую после стадии обращенно-фазовой хроматографии.
22. Способ очистки рекомбинантного ФСГ человека, предусматривающий стадии:
(0) ультрафильтрации;
(1) анионообменной хроматографии на Q Sepharose FF с 50 или около 50 мМ боратом, с 0,13 или около 0,13М NaCl, рН при или около 8,5 в качестве элюента;
(2) аффинной хроматографии с иммобилизованным ионом металла элюата стадии (1) на хелатирующей Sepharose FF, с Cu2+ в качестве иона металла и с 0,75 или около 0,75М ацетатом аммония, рН при или около 9 в качестве элюента;
(2а) анионообменной хроматографии элюата стадии (2) на DEAE Sepharose FF, с 0,11 или около 0,11M ацетатом аммония, рН при или около 8,5 в качестве элюента;
(3) гидрофобной хроматографии элюата стадии (2а) на Phenyl Sepharose FF HS с 50 или около 50 мМ ацетатом аммония, 0,25 или около 0,25М сульфатом аммония, рН при или около 8,25 в качестве элюента;
(4) обращенно-фазовой хроматографии элюата стадии (3) на Source 30 RPC с 50 или около 50 мМ ацетатом аммония, рН при или около 7,6, с 20 или около 20% 2-пропанолом (об./об.);
(5) ультрафильтрации элюата стадии (4) и
(6) нанофильтрации ретентата стадии (5).
Текст
008924 Область техники Данное изобретение относится к области очистки белков, в частности к очистке фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Уровень техники Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) является инъецируемым белком, относящимся к классу гонадотропинов. ФСГ используют в лечении бесплодия и репродуктивных нарушений как в случае пациентов-женщин, так и в случае пациентов-мужчин. В природе ФСГ продуцируется гипофизом. Для фармацевтического применения ФСГ может быть получен рекомбинантным методом (рФСГ) или он может быть выделен из мочи женщин в постклимактерическом периоде (мФСГ). ФСГ используют в случае пациентов-женщин для индукции овуляции (OI) и для регулируемой гиперстимуляции яичников (СОН) для вспомогательных репродуктивных технологий (ART). В типичной схеме лечения для индукции овуляции пациенту вводят 1 раз в день инъекции ФСГ или варианта (примерно 75-300 ME ФСГ/день) в течение периода примерно 6 - примерно 12 дней. В типичной схеме лечения для регулируемой гиперстимуляции яичников пациенту вводят 1 раз в день инъекции ФСГ или варианта (примерно 150-600 ME ФСГ/день) в течение периода примерно 6 - примерно 12 дней. ФСГ используют также для индукции сперматогенеза в случае мужчин, страдающих от олигоспермии. Схема лечения, использующая 150 ME ФСГ 3 раза в неделю в комбинации с 2500 ME хГЧ (хорионического гонадотропина человека), была успешной в достижении улучшения количества сперматозоидов у мужчин, страдающих от гипогонадотропного гипогонадизма (Burguess et al.; Subcutaneus self-administrationHum. Reprod.; 1997, 12, 980-6). Вследствие важности ФСГ в лечении нарушений бесплодия, желательным является обеспечение ФСГ высокой чистоты и высокой удельной активности. Лечение ФСГ требует повторных инъекций. Высокочистые препараты ФСГ могут вводиться подкожно, что делает возможным самовведение пациентом,увеличивая, таким образом, удобство и соблюдение пациентом режима и схемы лечения.hormone; Acta Endocrinologica, 1988, 288, 12-19) описывают способ для очистки гипофизарного ФСГ человека. Этот способ включает анионо- и катионообменную хроматографию и гель-фильтрационную хроматографию. Авторы сообщают, что этот способ приводит к гипофизарному ФСГ, имеющему удельную активность 4990 ME (иммуноанализ)/мг, с 16 МЕ/мг ЛГ (лютеинизирующего гормона). Содержание белка определяли либо по сухому весу, либо в растворе по поглощению при 280 нм (принимая, чтоWO 98/20039 (IBSA Institut Biochimique, SA) описывает способ очистки ФСГ из мочи человека, исходя из экстрактов мочи, называемых менопаузальными гонадотропинами человека (hMG). Этот способ использует ионообменную хроматографию на слабощелочных анионообменных смолах типа ДЭАЭ с последующей аффинной хроматографией на смоле, имеющей в качестве лиганда антрахинон. Сообщается, что этот способ дает ФСГ из мочи, не содержащий ЛГ и имеющий удельную активность 6870 ME(иммуноанализ)/мг. Содержание белка определяли, принимая, что водный раствор 1 мг/мл белка имеет оптическую плотность 0,62 при 277 нм в кварцевых кюветах с длиной пути 1 см.WO 00/63248 (Instituto Massone SA) описывает способ очистки гонадотропинов, в том числе ФСГ,из мочи человека. Этот способ включает следующие стадии: ионообменную хроматографию с сильной катионной смолой типа сульфопропильной, ионообменную хроматографию с сильной анионной смолой и гидрофобную хроматографию (HIC). Сообщается о получении препарата ФСГ, имеющего удельную активность 8400 МЕ/мг (Steelman-Pohley method: Assay of the follicle stimulating hormone based on theaugmentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604-616) и биологическую активность, меньшую, чем 1 ME, ЛГ (способ увеличения массы семенных пузырьков крысы: Van Hell H.,Matthijsen R.G.A. Overbeek; Acta Endocrinol. 1964, 47, 409), на 75 ME ФСГ. Содержание белка определяли по способу Лоури (О.Н. Lowry et al., J. Biol. Chem., 1951, 193, 265). В US 5990288 (Musick et al.) описан способ очистки ФСГ из биологических проб, таких как гипофиз человека или постменопаузальная моча человека. Этот способ использует аффинную хроматографию с красителем. Сообщается, что этот способ приводит к получению ФСГ гипофиза человека, имеющего удельную активность 7066 ME (иммуноанализ)/мг и менее чем 1 ME (иммуноанализ)/мг ЛГ, а мочевой ФСГ имеет удельную активность 6298 ME (иммуноанализ)/мг) и менее чем 3 ME (иммуноанализ)/мг ЛГ. Содержание белка определяли по поглощению при 280 нм (принимая, что A2801 см для 1 г/л равна 1).J., 1997, 44, 205-218) описывают способ очистки гонадотропинов гипофиза собачьих, в том числе ФСГ, с использованием аффинной хроматографии с конканавалином А (СоnА), гидрофобной хроматографии(HIC) и хроматографии с иммобилизованным ионом металла (Сu). Сообщается, что полученный ФСГ имеет удельную активность 2,17 МЕ/г белка с использованием радиорецепторного анализа на ФСГ для измерения биологической активности и набора для анализа белков BioRad (BioRad Laboratories CA USA)-1 008924 для определения содержания белка.WO 88/10270 (Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA) описывает способ очистки ФСГ человека из мочи. Этот способ включает иммунохроматографию с ФСГ-специфическими иммобилизованными моноклональными антителами, связанными с сефарозой 4 В дивинилсульфоном, с последующей обращенно-фазовой ВЭЖХ. Полученный ФСГ не содержит ЛГ и других мочевых белков и имеет удельную активность 6200 МЕ/мг лиофилизированного порошка (способ Steelman-Pohley). Этот препарат ФСГ был первым препаратом ФСГ, пригодным для подкожного введения, вследствие его высокой чистоты. Таким образом, потребность в новых способах очистки ФСГ сохраняется. Сущность изобретения Целью данного изобретения является обеспечение нового способа очистки рекомбинантного ФСГ или варианта ФСГ. В первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ очистки рекомбинантного ФСГ человека или варианта ФСГ, включающий стадии:(3) гидрофобной хроматографии (HIC), которые могут проводиться в любом порядке. Краткое описание графического материала Фиг. 1 показывает технологическую схему очистки рФСГч. Фиг. 2 показывает профиль элюции для хроматографии неочищенного рФСГч на Q-сефарозе FF,определенный посредством OD при 280 нм. Фиг. 3 показывает профиль элюции для IMAC-хроматографии частично очищенного рФСГч, определенный посредством OD при 280 нм. Фиг. 4 показывает профиль элюции для хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе частично очищенного рФСГч, определенный посредством OD при 280 нм. Фиг. 5 показывает профиль элюции для хроматографии на фенилсефарозе частично очищенного рФСГч, определенный посредством OD при 280 нм. Фиг. 6 показывает профиль элюции для RPC-стадии (ОФХ-стадии) с использованием RPC(ОФХ)колонки Source 30. Аббревиатуры Следующие аббревиатуры использовали в описании данного изобретения. ФСГ: фолликулостимулирующий гормон рФСГ: рекомбинантный ФСГ ФСГч: ФСГ человека рФСГч: рекомбинантный ФСГ человекаIRMA: иммунорадиометрический анализ КД или кД: килодальтон НСР: белок клетки-хозяина, белки, возникающие из клетки-хозяина, используемой для экспрессии ФСГQ FF: анионный обмен на Q-сефарозе FF Подробное описание изобретения Данное изобретение обеспечивает способ очистки рекомбинантного ФСГ человека или ФСГ-варианта, предусматривающий стадии:(3) гидрофобной хроматографии (HIC), которые могут проводиться в любом порядке. Способ очистки данного изобретения позволяет получать очищенный ФСГ с чистотой, сравнимой с известными продуктами ФСГ, такими как Gonal-F (Serono) и Metrodin-HP (Serono). Исходным материалом для очистки является рекомбинантный ФСГ. Предпочтительные варианты изобретения Способ очистки данного изобретения включает стадию ионообменной хроматографии. В предпочтительном варианте осуществления стадию ионообменной хроматографии проводят с сильной анионообменной колонкой, особенно предпочтительно со смолой четвертичного аммония, такой как Q-сефарозаFF (Arnersham Biosciences), или со смолой, имеющей сходные характеристики, следующим образом. Тип ионообменника Сильный анион Общая емкость (ммоль/мл) 0,18-0,25-2 008924 Предел исключения (глобулярные белки) Форма гранул Структура гранул рН-стабильность в рабочем режиме рН-стабильность очистки Линейная скорость тока при 25 С, 1 бар,высота слоя 15 см, колонка ХК 50/30 На этой стадии ионообменной хроматографии элюцию предпочтительно проводят с использованием буфера, имеющего слабощелочной рН (например, при или около 7,2 - при или около 9,0 или при или около 8,0 - при или около 9,0, наиболее предпочтительно при или около 8,5). Подходящие буферы включают, например, боратный буфер, триэтаноламин/иминодиуксусную кислоту. Наиболее предпочтительным является боратный буфер при рН при или около 8,5. Концентрация разновидностей элюирующего буфера находится предпочтительно в диапазоне при или около 10 - при или около 100 мМ, более предпочтительно при или около 25 - при или около 75 мМ, наиболее предпочтительно при или около 50 мМ. Перед этой стадией ионообменной хроматографии может быть желательным проведение стадии ультрафильтрации для концентрирования неочищенного ФСГ. Ультрафильтрацию (или диафильтрацию) проводят с использованием мембраны, имеющей предел отсечения при или около 3-10 кД, наиболее предпочтительно 5 кД. Способ данного изобретения включает также стадию хроматографии с иммобилизованным ионом металла. В предпочтительном варианте осуществления стадию хроматографии с иммобилизованным ионом металла проводят с использованием смолы, имеющей тридентатные хелатные группы, такие как,например, иминодиуксусная кислота (IDA), и ион двухвалентного металла, М 2+, такой как Cu2+, Zn2+,Ni2+, Ca2+, Mg2+ и Со 2+, предпочтительно Сu2+. Эта хелатирующая ион металла группа присоединена к подходящему твердому носителю, такому как, например, сефароза. Особенно предпочтительными смолами являются хелатирующая сефароза FF (Amersham Biosciences) или другие смолы, имеющие сходные характеристики, такие как следующие. Состав Сшитая в высокой степени 6% агароза Размер частиц 45-165 мкм Лиганд Группы иминодиуксусной кислоты на спейсере Химия связывания Эпокси Емкость иона металла 30-37 мкмоль Сu2+/мл рН-стабильность (в рабочем режиме) 3-13 рН-стабильность (краткосрочная) 2-14 Давление/свойства потока Матрикс-основа 200-400 см/ч, 1 бар (100 кПа),колонка ХК 50/60, высота слоя 25 см Элюция на этой стадии хроматографии с иммобилизованным ионом металла должна проводиться с использованием буфера, содержащего имидазол, фосфат или ацетат, особенно предпочтительно ацетат,например ацетат аммония. рН элюента предпочтительно должен быть при или около 7,5 - при или около 10, более предпочтительно при или около 8,0 - при или около 9,5, особенно предпочтительно при или около 9. Концентрация буферящих молекул в элюенте предпочтительно должна быть при или около 0,1 при или около 2 М, более предпочтительно при или около 0,5 - при или около 1 М, наиболее предпочтительно при или около 0,75 М. Этот способ включает также стадию гидрофобной хроматографии. В предпочтительном варианте осуществления стадию гидрофобной хроматографии проводят на смоле, такой как фенилсефароза FF HS(Amersham Biosciences), или на смоле, имеющей сходные характеристики, такие как следующие. Матрикс Сшитая в высокой степени 6% агароза Средний размер частиц 90 мкм Гидрофобный лиганд Фенил Плотность лиганда 40 рН-стабильность (краткосрочная) 2-14 рН-стабильность (долгосрочная и рабочий диапазон) 3-13 Элюцию на стадии гидрофобной хроматографии предпочтительно проводят с использованием буфера, имеющего слабощелочной рН (например, при или около 7,2 - при или около 9, более предпочтительно при или около 7,5 - при или около 8,5, наиболее предпочтительно при или около 8,25). Особенно предпочтительным элюентом является ацетат аммония (50 мМ)/сульфат аммония (0,25 М), предпочтительно при или около рН 8,25. После стадии гидрофобной хроматографии можно проводить стадию обращенно-фазовой хроматографии (RPC, (ОФХ. ОФХ предпочтительно проводят с использованием смолы, такой как SOURCE 30RPC (/Amersham Biosciences). Элюцию предпочтительно проводят с использованием буфера, такого как ацетат аммония, предпочтительно при слабощелочном рН, например при или около 7-8,5, более предпочтительно при или около 7,5 или 7,6. Буферный раствор предпочтительно содержит при или около 525% (объем/объем) предпочтительно при или около 10-20% смешивающегося с водой органического растворителя, предпочтительно C1-С 3 спирта, наиболее предпочтительно 2-пропанола (изопропанола). Стадии ионообменной хроматографии, хроматографии с иммобилизованным ионом металла и гидрофобной хроматографии (HIC) могут проводиться в любом порядке, хотя предпочтительно проводят сначала стадию ионообменной хроматографии. Остальные стадии хроматографии с иммобилизованным ионом металла и гидрофобной хроматографии (HIC) могут проводиться в любом порядке, хотя предпочтительным является показанный ниже порядок:(1) ионообменная хроматография,(2) хроматография с иммобилизованным ионом металла и(3) гидрофобная хроматография (HIC). В следующем предпочтительном варианте осуществления между стадией (2) и стадией (3) проводят дополнительную стадию ионообменной хроматографии (2 а), особенно предпочтительно со слабой анионообменной смолой, такой как, например, обменная смола, несущая диаминоэтильные группы, в частности ДЭАЭ-сефароза FF. В особенно предпочтительном варианте осуществления эти стадии проводят в указанном ниже порядке:(1) ионообменная хроматография,(2) хроматография с иммобилизованным ионом металла,(2 а) вторая стадия ионообменной хроматографии и(3) гидрофобная хроматография (HIC). В особенно предпочтительном варианте осуществления способ данного изобретения предусматривает стадии, характеризуемые следующим образом:(1) ионообменная хроматография (предпочтительно на сильной анионообменной смоле, такой какQ-сефароза FF),(2) хроматография с иммобилизованным ионом металла (предпочтительно на хелатирующей сефарозе FF, с использованием Сu2+ в качестве иона металла),(2 а) вторая стадия ионообменной хроматографии (предпочтительно на слабой анионообменной смоле, такой как ДЭАЭ-сефароза FF) и(3) гидрофобная хроматография (HIC) (предпочтительно на фенилсефарозе FF HS). Вторую стадию ионообменной хроматографии (2 а) предпочтительно проводят с использованием буфера, содержащего ацетат аммония, в качестве элюента, предпочтительно при рН при или около 8,5. Предпочтительно аммонийацетатный буфер имеет концентрацию, равную или около 0,05 - равную или около 0,5 М, более предпочтительно равную или около 0,11 М. В следующем предпочтительном варианте осуществления после любой из стадий хроматографии(особенно предпочтительно после стадии обращенно-фазовой хроматографии) пробу ФСГ подвергают концентрированию ультрафильтрацией. Ультрафильтрацию (или диафильтрацию) предпочтительно проводят с использованием мембраны, имеющей предел отсечения молекулярной массы, равный или около 3-10 кД, наиболее предпочтительно равный или около 5 кД. В особенно предпочтительном варианте осуществления проводят следующие стадии в указанном ниже порядке:(0) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей предел отсечения молекулярной массы, равный или около 5 кД),(1) ионообменная хроматография (предпочтительно на Q-сефарозе FF),(2) хроматография с иммобилизованным ионом металла (предпочтительно на хелатирующей сефарозе FF и с Сu2+),(2 а) вторая стадия ионообменной хроматографии (предпочтительно на ДЭАЭ-сефарозе FF),(3) гидрофобная хроматография (HIC) (предпочтительно на фенилсефарозе FF HS),(4) обращенно-фазовая хроматография (ОФХ) (предпочтительно на Source 30 RPC) и(5) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей предел отсечения 5 кД). Может быть желательным проведение нанофильтрации пробы ФСГ для гарантии того, что очищенный препарат ФСГ не содержит вирусов. Нанофильтрация может быть выполнена на любой стадии способа очистки, однако, предпочтительно проводить нанофильтрацию после 2-ой стадии ионообменной хроматографии, или после обращенно-фазовой хроматографии, или после гидрофобной хроматографии. Нанофильтрация может выполняться более чем 1 раз, например она может выполняться дважды. В особенно предпочтительном варианте осуществления способ данного изобретения включает следующие стадии:(0) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей предел отсечения, равный или около 5 кД),(1) ионообменная хроматография (предпочтительно на Q-сефарозе FF),(2) хроматография с иммобилизованным ионом металла (предпочтительно на хелатирующей сефа-4 008924 розе FF и с Сu2+),(2 а) вторая стадия ионообменной хроматографии (предпочтительно на ДЭАЭ-сефарозе FF),(3) гидрофобная хроматография (HIC) (предпочтительно на фенилсефарозе FF HS),(4) обращенно-фазовая хроматография (ОФХ) (предпочтительно на Source 30 RPC) и(5) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей предел отсечения 5 кД),(6) нанофильтрация. Хранение/лиофилизация Жидкая композиция, полученная описанным выше способом очистки и содержащая очищенный ФСГ, может быть заморожена для хранения в таком виде, в каком она получена, или после очистки элюат может быть подвергнут лиофилизации (сушке вымораживанием) для удаления растворителя. Полученные жидкость или лиофилизированный продукт называют общей массой ФСГ. Композиции ФСГ Неочищенные ФСГ или ФСГ-вариант данного изобретения или очищенные в соответствии со способом данного изобретения должны быть подготовлены для инъекции, внутримышечной или подкожной,предпочтительно подкожной. Композиция ФСГ может быть лиофилизированной, и в этом случае ее растворяют в воде для инъекций непосредственно перед инъекцией. Композиция ФСГ может быть также жидкой композицией, и в этом случае она может вводиться непосредственно, без предварительного растворения. Композиция ФСГ может находиться в виде дозы для однократного введения или в виде доз для многократного введения. Если она находится в виде доз для многократного введения, она должна предпочтительно содержать бактериостатический агент, такой как, например, бензиловый спирт, мета-крезол,тимол или фенол, предпочтительно бензиловый спирт или мета-крезол. Композиции однократной дозы могут также содержать бактериостатический агент. ФСГ данного изобретения может быть приготовлен с известными эксципиентами и стабилизаторами, например сахарозой или маннитом. Он может также содержать антиоксидант, такой как метионин. Он может дополнительно содержать поверхностно-активное вещество, такое как Твин (предпочтительно Твин 20) или Плуроник (предпочтительно Плуроник F66). В особенно предпочтительной многодозовой композиции ФСГ, полученный способом данного изобретения, готовят растворением его в воде для инъекций с сахарозой, фосфатным буфером (рН 7), Плуроником F68, метионином и мета-крезолом или бензиловым спиртом. Показания ФСГ данного изобретения пригоден для применения во всех режимах лечения, в которых назначают ФСГ. Он особенно пригоден для подкожного введения в индукции овуляции, регулируемой гиперстимуляции яичников для вспомогательных репродуктивных технологий и в лечении олигоспермии. Он может быть использован вместе с другими гонадотропинами, такими как ЛГ и хГЧ (хорионический гонадотропин человека). Он может быть также использован с соединениями, которые увеличивают реакцию на ФСГ, такими как цитрат кломифена, ингибиторы ароматазы, такие как анастрозол, летрозол,фадрозол и YM-511. ПоследовательностиSEQ ID NO: 5: вариант 3 -субъединицы ФСГч Фолликулостимулирующий гормон, или ФСГ, в данном контексте относится к ФСГ человека(ФСГч), продуцируемому в виде полноразмерного зрелого белка. ФСГ является димером, состоящим из альфа-субъединицы гликопротеина человека и бета-субъединицы ФСГ человека. Последовательность белка альфа-субъединицы ФСГ человека представлена в SEQ ID NO: 1, а последовательность белка бетасубъединицы ФСГ человека представлена в SEQ ID NO: 2. Использование термина рекомбинантный относится к препаратам ФСГ, которые получают с использованием рекомбинантной технологии ДНК (см., например, WO 85/01958). Одним примером способа экспрессии ФСГ с использованием рекомбинантной технологии является трансфекция эукариотических клеток ДНК-последовательностями, кодирующими альфа- и бета-субъединицу ФСГ, независимо от того, обеспечены ли они на одном векторе или на двух векторах, причем каждая субъединица имеет отдельный промотор, как описано в европейских патентах с номерами ЕР 0211894 и ЕР 0 487512. ДНК,кодирующей ФСГ, может быть кДНК, или она может содержать интроны. Другим примером использования рекомбинантной технологии для получения ФСГ является получение с использованием гомологичной рекомбинации для встраивания гетерологичного регуляторного сегмента в функциональной связи в эндогенные последовательности, кодирующие одну или обе субъединицы ФСГ, как описано в европейском патенте с номером ЕР 0505500 (Applied Research Systems ARS Holding NV). Рассматриваются также такие способы, как способы, описанные в WO 99/57263 (Transkaryotic Therapies), в которых одну из этих-5 008924 субъединиц встраивают гетерологично в клетку, а другая субъединица экспрессируется активацией геномных последовательностей встраиванием гетерологичного регуляторного сегмента гомологичной рекомбинацией. Способ данного изобретения может быть использован для очистки ФСГ, экспрессируемого с использованием любого из этих способов. Выражение рекомбинантная клетка относится к клетке, полученной вставкой гетерологичной ДНК, в том числе любым из вышеуказанных способов генетических манипуляций. Предпочтительно ФСГ продуцируется рекомбинантно в клетках яичника китайского хомячка(СНО), трансфецированных вектором или векторами, содержащими ДНК, кодирующую альфа-субъединицу гликопротеина человека и бета-субъединицу ФСГ. ДНК, кодирующая альфа- и бета-субъединицы,может присутствовать на одном и том же или на различных векторах. Выражение ФСГ-вариант включает в себя молекулы, отличающиеся по аминокислотной последовательности, схеме гликозилирования или межсубъединичной связи от ФСГ человека, но проявляющие ФСГ-активность. Примеры включают СТР-ФСГ, продолжительно действующий модифицированный рекомбинантный ФСГ, состоящий из -субъединицы дикого типа и гибридной -субъединицы, в которой карбоксиконцевой пептид хГЧ был сшит с С-концом -субъединицы ФСГ, как описано в LaPolt et al.,Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520; или Klein et al., Development and Characterization of long-actingrecombinant hFSH agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50-56. Включен также одноцепочечный СТР-ФСГ,одноцепочечная молекула, состоящая из следующих последовательностей (от N-конца к С-концу): ФСГ хГЧ-СТР (113-145) ФCГ где ФСГ обозначает -субъединицу ФСГ, хГЧ СТР (113-145) обозначает карбоксиконцевой пептид хГЧ и ФСГ обозначает -субъединицу ФСГ, как описано Klein et al. (Pharmacokinetics and pharmacodynamicscarboxyterminal peptide in the rhesus monkey; FertilitySterility; 2002, 77, 1248-1255). Другие примеры ФСГ-вариантов включают молекулы ФСГ, имеющие дополнительные сайты гликозилирования, включенные в - и/или -субъединицу, как описано в WO 01/58493 (Maxygen), и молекулы ФСГ с межсубъединичными S-S-связями, как описано в WO 98/58957. Дополнительные примеры ФСГ-вариантов включают в себя химерные молекулы, содержащие последовательности из ФСГ и последовательности из хГЧ или ЛГ, такие, как описанные в WO 91/16922 и WO 92/22568. ФСГ-варианты, указанные здесь, включают в себя также делеции карбоксиконца бета-субъединицы, которые являются более короткими, чем полноразмерный зрелый белок SEQ ID NO: 2. Делеции карбоксиконца бета-субъединицы человека обеспечены в SEQ ID NO: 3, 4 и 5. Понятно, что карбоксиконцевые варианты бета-цепи образуют димеры с известной альфа-субъединицей с образованием гетеродимера ФСГ-варианта. В предпочтительном варианте осуществления ФСГ продуцируется рекомбинантно в клетках СНО. В предпочтительном варианте осуществления очищенный ФСГ, полученный в соответствии со способом данного изобретения, является подходящим для подкожного введения, что делает возможным самовведение пациентом. Выражение неочищенный рекомбинантный ФСГ обозначает супернатант культуры клеток от рекомбинантных клеток, экспрессирующих ФСГ, до его очистки на какой-либо хроматографической стадии. Это выражение включает неочищенную форму супернатанта (выделенную из клеток), а также концентрированный, и/или отфильтрованный, и/или ультраотфильтрованный супернатант. Термин биологическая активность в отношении активности ФСГ обозначает способность композиции ФСГ индуцировать биологические реакции, ассоциированные с ФСГ, такие как увеличение массы яичников в анализе Steelman-Pohley (Assay of the follicle stimulating Hormone based on the augmentationwith human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604-616); или рост фолликулов у пациентаженщины. Рост фолликулов у пациента-женщины может быть оценен при помощи ультразвука, например в отношении количества фолликулов, имеющих средний диаметр 16 или около 16 мм в день 8 стимуляции. Биологическую активность оценивают относительно общепринятого стандарта ФСГ. Содержание ЛГ в препарате ФСГ может быть измерено, например, с использованием ЛГ-специфического иммуноанализа, такого как Delfia hLH Spec (Wallac Oy, Turku, Finland). Термин удельная активность, при упоминании в отношении ФСГ, обозначает биологическую активность в ME препарата в общепризнанном биологическом анализе на ФСГ, таком как биоанализ SteelmanPohley, разделенную на количество белка, определенного анализом на содержание общего белка, таким как анализ Лоури (О.Н. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr and R.J. Randall (1951) J. Biol. Chem., 193: 265;Hartree E.E. (1972), Anal. Biochem. 48: 422; J.R. Dulley and P.A. Grieve (1975) Anal. Biochem. 64: 136), анализ Бредфорда (Bredford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248), или по оптической плотности при 280 нм. Предпочтительно ФСГ данного изобретения имеет удельную активность, большую или около 4000 МЕ/мг,более предпочтительно большую или около 6000 МЕ/мг, даже более предпочтительно большую или около 700 МЕ/мг, даже еще более предпочтительно большую или около 8000 МЕ/мг, где биологическую активность измеряют в соответствии с биоанализом Steelman-Pohley и содержание белка измеряют по-6 008924 Примеры Очистка Следующий пример обеспечивает очищенный рФСГч (рекомбинантный ФСГ человека), полученный из концентрированного неочищенного рФСГч, продуцируемого в биореакторах на 15 и 75 л. Технологическая схема процесса очистки, описанная подробно в следующих разделах, представлена на фиг. 1. Полученный очищенный рФСГч назван общей массой рФСГч. Для всех буферов рН и величины проводимости приводятся для +25 С; т.е. определение величины проводимости выполняли с использованием прибора, снабженного датчиком температуры, и полученную величину автоматически компенсировали в отношении разности температур и относили к +25 С. Что касается измерений проводимости, корреляционный коэффициент температуры всегда устанавливали на 2. Стадия 0. Диафильтрация концентрированного неочищенного рФСГч. Оборудование. Система ультрафильтрации типа Pellicon Mini (Millipore или равноценная). Ультрафильтрационная мембрана при пределе отсечения молекулярной массы 5 кД в полиэфирсульфоне типа BIOMAX (Millipore или равноценная), 0,1 м 2. Перистальтический насос (типа Masterflex или равноценный). Материалы. Концентрированный неочищенный рФСГч. Исходное количество: 200-400 мг ФСГ, определенное при помощи иммуноанализа DELFIA на ФСГ(из биореактора на 75 л). Шарики гидроксида натрия - Merck. Очищенная вода (Modulab или равноценная). Борная кислота. Декагидрат тетрабората натрия. Гидроксид натрия (шарики). Боратный буфер (50 мМ борат натрия рН 8,50,1): 3,06 г борной кислоты и 10 г дигидрата тетрабората натрия добавляли к 900 мл очищенной воды при перемешивании и доводили до 1 л. Процедура ультрафильтрации. Все операции выполняли в условиях охлаждения (3-8 С). Концентрированный неочищенный рФСГч (1-1,5 л) ультрафильтровали при следующих условиях. Буфер: 50 мМ борат натрия рН 8,50,1, проводимость 1,90,2 мС/см. Ток пермеата: 15-25 мл/мин. Давление на входе: 1,5-2,2 бар. Трансмембранное давление: 1,5-1,8 бар, где трансмембранное давление (ТМР)=(давление на входе+давление на выходе)/2. Раствор рФСГч концентрировали до объема 1 л. Фракцию ретентата разбавляли 1 объемом очищенной воды и опять концентрировали до 1 л (промывка). Стадию промывки повторяли еще 2 раза. Проводимость пермеата проверяли и, если она была менее чем 1,5 мС/см, эту пробу переводили в следующую стадию, в противном случае стадию промывки повторяли. Проводимость пермеата: 1,5 мС/см. 1 объем фракции ретентата разбавляли до 2 объемов уравновешивающим буфером и опять концентрировали до исходного объема. Эту операцию повторяли еще 2 раза. рН и проводимость пермеата проверяли и, если рН и проводимость этой фракции пермеата были 8,50,1 и 1,90,2 мС/см, соответственно, этот пермеат переводили в следующую стадию, в противном случае эту стадию промывки повторяли. рН пермеата: 8,50,1. Проводимость пермеата: 1,90,2 мС/см. Фракцию ретентата собирали и ультрафильтр промывали тремя аликвотами уравновешивающего буфера, собирая и объединяя промывки с фракцией ретентата таким образом, чтобы иметь конечный собранный объем около 0,6-1,2 л. Собранный объем: 0,6-1,2 л. Эту фракцию обозначали как Исходный материал Q. 5x0,5 мл проб хранили при -20 С для IPC. Объем этой фракции измеряли (ее можно хранить при +53 С в течение не более чем 2 дней). Эти пробы анализировали следующим образом: OD при 280 нм, рН, проводимость и содержание рФСГч при помощи иммуноанализа (DELFIA) и ОФ-ВЭЖХ. Стадия 1. Анионный обмен на Q-сефарозе FF. Оборудование.-7 008924 Хроматографическая колонка ХК 50/20. Перистальтический насос (типа Masterflex или равноценный). Холодная комната. УФ-монитор (длина оптического пути 2,5 мм), снабженный двухканальным самописцем (AmershamBiosciences или равноценный). УФ-спектрофотометр (Shimadzu или равноценный). рН-метр (Metrohm или равноценный). Кондуктометр (Metrohm или равноценный). Весы (MettlerToledo или равноценные). Перистальтический насос (типа Masterflex или равноценный). Материалы. Концентрированный неочищенный рФСГч из стадии ультрафильтрации. Исходное количество: 200-400 мг ФСГ согласно DELFIA. Шарики гидроксида натрия - Merck. Очищенная вода (Modulab или равноценная). Борная кислота. Декагидрат тетрабората натрия. Гидроксид натрия (шарики). Хлорид натрия. Ледяная уксусная кислота. Буферы. Уравновешивающий буфер: 50 мМ борат натрия рН 8,50,1, проводимость 1,90,2 мС/см. Элюирующий буфер: 50 мМ борат натрия, 0,13 М NaCl рН 8,5+0,1, проводимость 161,5 мС/см. Разделяющий раствор: 1,5 М NaCl. Дезинфицирующий раствор 1: 0,1 М уксусная кислота. Дезинфицирующий раствор 2: 0,5 М NaOH. Раствор для хранения: 0,01 М NaOH. Набивка колонки. Колонку набивали смолой Q-Sepharose Fast Flow в соответствии с инструкциями изготовителя. Упакованная колонка имела следующие размеры: Диаметр 5 см Высота слоя 11 см 10% Объем слоя 190-240 мл Процедура очистки. Все процедуры выполняли при следующих условиях: Температура 3-8 С Линейная скорость тока 240-280 см/ч Дезинфицирование колонки. Колонку промывали по меньшей мере 1 BV (объемом слоя колонки) 0,5 М NaOH, затем промывали 3 BV очищенной воды. Уравновешивание колонки. Колонку промывали 6-7 или более BV уравновешивающего буфера, 50 мМ борат натрия рН 8,50,1,проводимость 1,90,2 мС/см. рН и проводимость проверяли и промывание продолжали, пока параметры эффлюента колонки не находились в пределах следующих желаемых величин: рН 8,50,1, проводимость 1,9+0,2 мС/см. Получение исходного материала. Концентрированный и диафильтрованный рФСГч, полученный из стадии ультрафильтрации, оттаивали в количестве, указанном в разделе Материал. рН и проводимость проверяли и пробы сохраняли для IPC (5x0,5 мл). Нанесение. Этот исходный материал наносили на уравновешенную колонку. Промывание. После завершения нанесения пробы колонку промывали 2-3 BV уравновешивающего буфера. Этот объем собирали и регистрировали, и пробы сохраняли для IPC 5x0,5 мл, и эту фракцию выбрасывали. Элюция. Элюцию начинали 50 мМ боратом натрия, 0,13 М NaCl рН 8,50,1, проводимость 161,5 мС/см. рФСГч начинал элюироваться после 0,7-1,0 BV от начала. 4,5 BV элюированной фракции собирали с обнаружением двух пиков согласно хроматографическому профилю, изображенному на фиг. 2. Этот объем регистрировали и пробы сохраняли для IPC (5x0,5 мл). Эта фракция могла храниться при 4 С в течение не более 2 дней. Эта фракция содержит полуочищенный рФСГч.-8 008924 Стадия (2). IMAC на хелатирующей сефарозе FF. Оборудование. Хроматографическая колонка C10/40 (Amersham Biosciences). Перистальтический насос (типа miniplus 2 Gylson или равноценный). УФ-монитор (длина оптического пути 2,5 мм), снабженный двухканальным самописцем (AmershamBioscience или равноценный). Холодная комната. УФ-спектрофотометр (Shimadzu или равноценный). рН-метр (Metrohm или равноценный). Кондуктометр (Metrohm или равноценный). Весы (MettlerToledo или равноценные). Перистальтический насос (типа Masterflex или равноценный). Материалы. рФСГч после Q Sepharose FF. Шарики гидроксида натрия - Merck. Очищенная вода (Modulab или равноценная). Борная кислота. Декагидрат тетрабората натрия. Гидроксид натрия (шарики). Хлорид натрия. ЭДТА. Ацетат аммония. Сульфат меди. 25% раствор аммиака. Буферы. Раствор для загрузки металла: 0,2 М сульфат меди. Подкисленная вода: 1 мл ледяной уксусной кислоты добавляли к 1 л очищенной воды при перемешивании. Уравновешивающий буфер: 50 мМ борат натрия рН 8,250,1, 0,5M NaCl. Элюция: 0,75 М ацетат аммония рН 9,0+0,1, проводимость 0,5 мС/см. Регенерирующий раствор: 0,5 М NaCl, 50 мМ ЭДТА. Дезинфицирующий раствор: 0,5 М NaOH. Раствор для хранения: 0,01 М NaOH. Набивка колонки. Колонку набивали смолой Chelating Sepharose Fast Flow в соответствии с инструкциями изготовителя. Упакованная колонка имела следующие размеры: Диаметр 10 мм Высота слоя 2210% Объем слоя 16-20 мл Процедура очистки. Все процедуры выполняли при следующих условиях: Температура 53 С Линейная скорость тока 240-300 см/ч Дезинфицирование колонки. Колонку промывали по меньшей мере 1 BV (объемом слоя колонки) 0,5 М NaOH, затем промывали 3 BV очищенной воды. Загрузка колонки. Колонку промывали 5-6 или более BV подкисленной воды, пока рН не становился 4,5 (согласно рН-индикатору). Затем колонку промывали 3 BV 0,2 М сульфата меди и опять 4-5 BV подкисленной воды, пока величина оптической плотности (280 нм) не достигала фона. Уравновешивание колонки. Колонку промывали 6 или более BV уравновешивающего буфера, 50 мМ фосфат натрия рН 8,250,1, 0,5 М NaCl, проводимость 505 мС/см. рН и проводимость проверяли и промывание продолжали, если параметры эффлюента колонки находились за пределами следующих желаемых величин: рН 8,250,1, проводимость 505 мС/см. Получение исходного материала. рФСГч, полученный из стадии Q-Sepharose FF, доводили до рН 8,250,1 добавлением 35% ортофосфорной кислоты и проводимость доводили до 505 мС/см добавлением NaCl. Пробы брали для IPC(5x0,5 мл). Нанесение. Исходный материал наносили на колонку, уравновешенную, как описано выше. Промывание.-9 008924 После завершения нанесения пробы колонку промывали 5-10 BV уравновешивающего буфера: 50 мМ фосфат натрия рН 8,251,0, 0,5 М NaCl, проводимость 505 мС/см. Брали пробы (5x0,5 мл) для IPC и эту фракцию выбрасывали. Элюция. Элюцию начинали 0,075 М ацетатом аммония рН 9,00,1, проводимость 7,20,5 мС/см. рФСГч начинал элюироваться в виде основного пика после 0,5 BV от старта. 5-7 BV собирали из основного пика, начиная, когда линия OD круто увеличивалась, приблизительно после того, как выбрасывали первые 0,5 BV. Брали пробы для IPC (5x0,5 мл) и эту фракцию хранили при 3-8 С в течение не более 2 дней. Профиль элюции для IMAC показан на фиг. 3. Эта фракция содержала полуочищенный рФСГч. Стадия (2 а). Анионный обмен на ДЭАЭ-сефарозе FF. Оборудование. Хроматографическая колонка Vantage L 22/40. Перистальтический насос (типа miniplus 2 Gylson или равноценный). Холодная комната. УФ-монитор (длина оптического пути 2,5 мм), снабженный двухканальным самописцем (AmershamBiosciences или равноценный). УФ-спектрофотометр (Shimadzu или равноценный). рН-метр (Metrohm или равноценный). Кондуктометр (Metrohm или равноценный). Весы (MettlerToledo или равноценные). Перистальтический насос (типа Masterflex или равноценный). Материалы. рФСГч после IMAC. Шарики гидроксида натрия - Merck. Очищенная вода (Modulab или равноценная). Гидроксид натрия (шарики). Хлорид натрия. Ацетат аммония. 25% раствор аммиака. Буферы. Уравновешивающий буфер: 0,11 М ацетат аммония рН 8,50,1, проводимость 0,5 мС/см. Регенерирующий раствор: 0,5 М NaCl. Дезинфицирующий раствор: 0,5 М NaOH. Раствор для хранения: 0,01 М NaOH. Набивка колонки. Колонку набивали смолой DEAE Sepharose Fast Flow в соответствии с инструкциями изготовителя. Упакованная колонка имела следующие размеры: Диаметр 22 мм Высота слоя 16-17 см Объем слоя 65-70 мл Процедура очистки. Все процедуры выполняли при следующих условиях: Температура 53 С Линейная скорость тока 240-300 см/ч Дезинфицирование колонки. Колонку промывали по меньшей мере 1 BV (объемом слоя колонки) 0,5 М NaOH, затем промывали 3 BV очищенной воды. Уравновешивание колонки. Колонку промывали 6 или более BV уравновешивающего буфера: 0,11 М ацетат аммония рН 8,50,1, проводимость 10,20,5 мС/см. рН и проводимость проверяли и промывание продолжали, если параметры эффлюента колонки находились за пределами следующих желаемых величин: рН 8,50,1, проводимость 10,50,5 мС/см. Получение исходного материала. рФСГч, полученный из стадии IMAC, доводили до рН 8,50,1 добавлением ледяной уксусной кислоты и проводимость доводили до 10,50,5 мС/см добавлением очищенной воды (1 объем воды является необходимым для доведения проводимости до желаемой величины. Пробы брали для IPC (5x0,5 мл). Нанесение. Исходный материал наносили на колонку, уравновешенную, как описано выше. Промывание. После завершения нанесения пробы колонку промывали 3-6 BV уравновешивающего буфера:- 10008924 0,11 М ацетат аммония рН 8,50,1, проводимость 10,20,5 мС/см. Брали пробы (5x0,5 мл) для IPC и эту фракцию хранили при +53 С в течение не более 2 дней. Профиль элюции для хроматографии на DEAE Sepharose FF показан на фиг. 4. Гидрофобное взаимодействие на Phenyl Sepharose FF HS. Оборудование. Хроматографическая колонка ХК 26/30. Перистальтический насос (типа miniplus 2 Gylson или равноценный). УФ-монитор (длина оптического пути 2,5 мм), снабженный двухканальным самописцем (AmershamBiosciences или равноценный). Холодная комната. УФ-спектрофотометр (Shimadzu или равноценный). рН-метр (Metrohm или равноценный). Кондуктометр (Metrohm или равноценный). Весы (MettlerToledo или равноценные). Перистальтический насос (типа Masterflex или равноценный). Материалы. рФСГч после DEAE. Шарики гидроксида натрия - Merck. Очищенная вода (Modulab или равноценная). Гидроксид натрия (шарики). Хлорид натрия. Ацетат аммония. Сульфат аммония. 25% раствор аммиака. Буферы. Уравновешивающий буфер: 50 мМ ацетат аммония, 1 М сульфат аммония рН 8,250,1, проводимость 1428 мС/см. Промывной буфер: 50 мМ ацетат аммония, 0,9 М сульфат аммония рН 8,250,1, проводимость 1305 мС/см. Элюирующий буфер: 50 мМ ацетат аммония, 0,25 М сульфат аммония рН 8,250,1, проводимость 503 мС/см. Очищающий раствор: очищенная вода. Дезинфицирующий раствор: 0,5 М NaOH. Раствор для хранения: 0,01 М NaOH. Набивка колонки. Колонку набивали смолой Phenyl Sepharose Fast Flow HS в соответствии с инструкциями изготовителя. Упакованная колонка имела следующие размеры: Диаметр 34 мм Высота слоя 14-15 см Объем слоя 125-135 мл Процедура очистки. Все процедуры выполняли при следующих условиях: Температура 53 С Линейная скорость тока 240-300 см/ч Дезинфицирование колонки. Колонку промывали по меньшей мере 1 BV (объемом слоя колонки) 0,5 М NaOH, затем промывали 3-5 BV очищенной воды. Уравновешивание колонки. Колонку промывали 5-6 или более BV уравновешивающего буфера: 50 мМ ацетат аммония, 1 М сульфат аммония рН 8,250,1, проводимость 1408 мС/см. рН и проводимость проверяли и промывание продолжали, пока параметры эффлюента колонки не находились в пределах следующих желаемых величин: рН 8,250,1, проводимость 1408 мС/см. Получение исходного материала. К рФСГч, полученному из стадии DEAE, добавляли 1 М сульфат аммония и рН доводили до 8,250,1 добавлением 25% раствора аммиака. Брали пробы для IPC (5x0,5 мл) и эту фракцию наносили на колонку Phenyl. Нанесение. Исходный материал наносили на колонку, уравновешенную, как описано выше. Промывание после нанесения. После завершения нанесения пробы колонку промывали 3-6 BV уравновешивающего буфера: 0,5 М ацетат аммония, 0,9 М сульфат аммония, рН 8,250,1, проводимость 1305 мС/см. Брали пробы (5x0,5 мл) для IPC и эту фракцию выбрасывали.- 11008924 Элюция. Начинали элюцию элюирующим буфером. рФСГч начинал элюироваться в виде основного пика после 0,5-0,8 BV от старта. 3-4 BV основного пика собирали, начиная при увеличении величины оптической плотности (280 нм), в соответствии с хроматографическим профилем, изображенным на фиг. 5. Брали пробы для IPC (5x0,5 мл) и хранили при +53 С в течение не более 1 дня. Стадия (4). Обращенная фаза на Source 30 RPC. Оборудование. Хроматографическая колонка: Vantage L 22/40. УФ-монитор (длина оптического пути 2,5 мм), снабженный двухканальным самописцем (AmershamBiosciences или равноценный). Перистальтический насос (miniplus 2 Gillson или равноценный). УФ-спектрофотометр (Shimadzu или равноценный). рН-метр (Metrohm или равноценный). Кондуктометр (Metrohm или равноценный). Весы (MettlerToledo или равноценные). Материалы. Промежуточный продукт рФСГч после HIC. Смола Source 30 RPC (Amersham Biosciences). Ацетат аммония - Merck. Ледяная уксусная кислота - Merck. Шарики гидроксида натрия - Merck. 50% раствор NaOH - J.T. Baker. 25% раствор аммиака - Merck. 2-пропанол - Merck. Шарики гидроксида натрия - Merck. Буферы. Базовый буфер: 50 мМ ацетат аммония рН 7,60,2, проводимость 6,50,5 мС/см. Уравновешивающий буфер: 50 мМ ацетат аммония рН 7,60,2, содержащий 13% 2-пропанол(об./об.). Элюирующий буфер: 50 мМ ацетат аммония рН 7,60,2, содержащий 20% 2-пропанол (об./об.). Регенерирующий буфер: 50 мМ ацетат аммония рН 7,60,2, содержащий 35% 2-пропанол (об./об.). Дезинфицирующий раствор: 0,5 М NaOH. Раствор для хранения: 0,01 М NaOH. Набивка колонки. Колонку набивали смолой Source 30RPC в соответствии с инструкциями изготовителя. Упакованная колонка имела следующие размеры: Диаметр 22 мм Высота слоя 13-14 см Объем слоя 49,4-53,2 мл Процедура очистки. Получение исходного материала. Промежуточный продукт после HIC наносили на колонку с 13% (об./об.) 2-пропанола. Все операции выполняли при следующих условиях: Температура Комнатная температура (+205C) Линейная скорость тока 300-450 см/ч Дезинфицирование колонки. Колонку промывали по меньшей мере 1 BV (объемом слоя колонки) 0,5 М NaOH, затем промывали 6 BV очищенной воды. Уравновешивание колонки. Колонку промывали 7-10 или более BV уравновешивающего буфера: 50 мМ ацетат аммония рН 7,60,2, содержащий 13% 2-пропанол (об./об.). Нанесение. Исходный материал рФСГч после HIC, полученный, как описано выше, наносили на эту колонку. Промывание после нанесения. После завершения нанесения пробы колонку промывали 7-10 BV уравновешивающего буфера. Брали пробы (5x0,5 мл) для IPC и эту фракцию выбрасывали. Элюция. Начинали элюцию элюирующим буфером. рФСГч начинал элюироваться в виде основного пика после 0,5-0,8 BV от старта. 5-7 BV основного пика собирали, начиная при увеличении величины оптической плотности (280 нм), в соответствии с хроматографическим профилем, изображенным на фиг. 6. После завершения сбора этот раствор разбавляли- 12008924 1:2 очищенной водой для уменьшения процента 2-пропанола в контакте с рФСГч. Брали пробы для IPC (5x0,5 мл) и хранили при +53 С в течение не более 1 дня. Эта фракция содержала очищенный рФСГч. Регенерация колонки. После завершения элюции колонку промывали по меньшей мере 3 BV регенерирующего буфера. Брали пробы для IPC (5x0,5 мл) и эту фракцию выбрасывали. Дезинфицирование. Колонку промывали по меньшей мере 1-2 BV воды с последующим промыванием 3 BV 0,5 М NaOH,ток прекращали на 1 ч и затем эту колонку промывали 6 BV очищенной воды. Хранение. Колонку промывали по меньшей мере 3 BV раствора для хранения, 0,01 М NaOH и хранили до следующего цикла. Стадия (5). Ультрафильтрация общей массы. Оборудование. 1 Vivaflow 200 PES, RC или Hydrosart, предел отсечения молекулярной массы 5 кД (Sartorius). Перистальтический насос (типа Masterflex или равноценный). УФ-спектрофотометр (типа Shimadzu или равноценный). рН-метр (типа MettlerToledo или равноценный). Кондуктометр (типа Metrohm или равноценный). Материалы. рФСГч - элюат HIC. Шарики гидроксида натрия - Merck (NaOH). Очищенная вода (Modulab или равноценная). Азот (рабочее давление 3 бар) - категории UPP. Буферы. Раствор для диафильтрации: ультрафильтрацию рФСГч проводили с использованием очищенной воды. Дезинфицирующий раствор: 0,5 М NaOH. Раствор для хранения: 0,05 М NaOH. Процедура. Все операции выполняли в холодной комнате (+53 С). Ультрафильтрация. Раствор элюата рФСГч-HIC рециркулировали в системе Vivaflow и концентрировали до объема,меньшего чем 20 мл. Фракцию ретентата разбавляли 4 объемами очищенной воды и концентрировали до 20 мл. Стадию промывки повторяли, как описано, 5-7 или более раз. рН и проводимость пермеата были 7,10,2 и 6,20,5 мС/см, соответственно. Если результаты были вне этих величин, стадию промывания повторяли. рН пермеата: 7,10,2. Проводимость пермеата: 6,20,5 мС/см. Фракцию ретентата собирали в объем, подходящий для получения конечной концентрации рФСГч посредством OD (280 нм) около 0,5-0,7 мг/мл. Брали пробы (10x0,5 мл) для анализа. Как пробы, так и общую массу хранили при -20 С. Стадия (6). Стадия нанофильтрации для удаления вирусов. Материалы и оборудование. Промежуточный раствор рФСГч (после DEAE или подвергнутый ультрафильтрации после RPC). Предварительные фильтры с размером 47 мм типа Fluorodine II FTKDJL (Pall) или VVLP 0,1 мкм(Millipore). Фильтры с размером 47 мм типа NFP (Millipore) или DV20 (Pall). Очищенная вода. Бумажные рН-индикаторы. Гидроксид натрия. Регулируемый источник азота. Изготовленная полностью из нержавеющей стали система фильтрации (Millipore). Кремний- и tygon-содержащая пробирка. Буферы. Дезинфицирующий раствор: 0,5 М NaOH. Процедура. Все операции выполняли при комнатной температуре (+233 С). Нанофильтрация. Эту систему заполняли полученным после DEAE или подвергнутым ультрафильтрации после RPC рФСГ, предварительно отфильтрованным на фильтрах 0,1 мкм. В начале фильтрования источник азота- 13008924 открывали, пока не получали начальное давление 0,5 бар, и вентиляционный клапан, расположенный на держателе (disc-holder), открывали для барботирования этой системы. Как только появлялась первая капля раствора, вентиляционный клапан держателя закрывали и давление азота повышали до 2,3-2,8 бар. Давление азота поддерживали при 2,3-2,8 бар и раствор фильтровали. Рабочие условия суммированы ниже. Биологическая активность проб Биологическую активность очищенного рФСГч измеряли с использованием способа прироста массы яичников Steelman-Pohley. Удельную активность рассчитывали с использованием биологической активности, деленной на содержание белка, определенное по оптической плотности при 280 нм (принимая,что =9,95 М-1 см-1), а также с использованием биологической активности, деленной на содержание белка, определенное по способу Лоури. Удельная активность очищенной массы рФСГч показана в нижеследующей таблице. Удельная активность общего очищенного рФСГч данного изобретения ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ очистки рекомбинантного ФСГ человека или варианта ФСГ, предусматривающий стадии:(2) хроматографии с иммобилизованным ионом металла и(3) гидрофобной хроматографии (HIC). 2. Способ по п.1, где ионообменную хроматографию проводят на сильной анионообменной смоле. 3. Способ п.2, где указанной анионообменной смолой является Q Sepharose FF или смола, имеющая сходные свойства. 4. Способ по любому из пп.1-3, где ионообменную хроматографию проводят с использованием боратного буфера в качестве элюента. 5. Способ по п.4, где боратный буфер имеет рН 8,5 или около 8,5. 6. Способ по любому из пп.1-5, где хроматографию с иммобилизованным ионом металла проводят на смоле, имеющей тридентатные хелатирующие группы. 7. Способ п.6, где указанной хелатирующей группой является иминодиуксусная кислота. 8. Способ по любому из пп.1-7, где хроматографию с иммобилизованным ионом металла проводят- 14008924 на хелатирующей Stpharose FF или на смоле, имеющей сходные свойства. 9. Способ по любому из пп.1-8, где хроматографию с иммубилизованным ионом металла проводят с ионом металла, выбранным из Cu2+, Zn2+, Ni2+, Ca2+, Mg2+ и Со 2+. 10. Способ по любому из пп.1-8, где хроматографию с иммобилизованным ионом металла проводят с Сu2+. 11. Способ по любому из пп.1-10, где хроматографию с иммобилизованным ионом металла проводят с использованием ацетата аммония в качестве элюента. 12. Способ по п.11, где содержащий ацетат аммония буфер имеет рН 9 или около 9. 13. Способ по любому из пп.1-12, где гидрофобную хроматографию (HIC) проводят с использованием Phenyl Sepharose FF HS или смолы, имеющей сходные свойства. 14. Способ по любому из пп.1-13, где гидрофобную хроматографию проводят с использованием смеси ацетат аммония (50 мМ)/сульфат аммония (0,25 М) в качестве элюента. 15. Способ по любому из пп.1-14, включающий вторую стадию ионообменной хроматографии (2 а),проводимую после стадии хроматографии с иммобилизованным ионом металла и перед стадией гидрофобной хроматографии (HIC). 16. Способ по п.15, где вторую стадию ионообменной хроматографии проводят с использованием слабой анионообменной смолы. 17. Способ по п.16, где указанной слабой анионообменной смолой является смола DEAE SepharoseFF или смола, имеющая сходные свойства. 18. Способ по любому из пп.1-17, дополнительно включающий стадию обращенно-фазовой хроматографии (4), проводимую после стадии гидрофобной хроматографии (HIC). 19. Способ по п.18, где обращенно-фазовую хроматографию проводят с использованием в качестве смолы Source 30 RPC или смолы, имеющей сходные свойства. 20. Способ по п.19, где обращенно-фазовую хроматографию проводят с использованием ацетата аммония (50 мМ, рН 7,6 или около 7,6) с 20% (об./об.) 2-пропанолом. 21. Способ по пп.18, 19 или 20, включающий стадию ультрафильтрации (5), проводимую после стадии обращенно-фазовой хроматографии. 22. Способ очистки рекомбинантного ФСГ человека, предусматривающий стадии:(1) анионообменной хроматографии на Q Sepharose FF с 50 или около 50 мМ боратом, с 0,13 или около 0,13 М NaCl, рН при или около 8,5 в качестве элюента;(2) аффинной хроматографии с иммобилизованным ионом металла элюата стадии (1) на хелатирующей Sepharose FF, с Cu2+ в качестве иона металла и с 0,75 или около 0,75 М ацетатом аммония, рН при или около 9 в качестве элюента;(2 а) анионообменной хроматографии элюата стадии (2) на DEAE Sepharose FF, с 0,11 или около 0,11M ацетатом аммония, рН при или около 8,5 в качестве элюента;(3) гидрофобной хроматографии элюата стадии (2 а) на Phenyl Sepharose FF HS с 50 или около 50 мМ ацетатом аммония, 0,25 или около 0,25 М сульфатом аммония, рН при или около 8,25 в качестве элюента;(4) обращенно-фазовой хроматографии элюата стадии (3) на Source 30 RPC с 50 или около 50 мМ ацетатом аммония, рН при или около 7,6, с 20 или около 20% 2-пропанолом (об./об.);(5) ультрафильтрации элюата стадии (4) и(6) нанофильтрации ретентата стадии (5). Технологическая схема способа очистки рФСГч- 15008924 Профиль препаративной хроматографии стадии Q Sepharose FF Фиг. 2 Профиль препаративной хроматографии стадии IMAC- 16008924 Профиль препаративной хроматографии стадии ДЭАЭ Фиг. 4 Профиль препаративной хроматографии стадии PHENYL- 17008924 Профиль препаративной хроматографии стадии обращенно-фазовой хроматографии (RPC)
МПК / Метки
МПК: C07K 14/59
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/22-8924-sposob-ochistki-fsg.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ очистки фсг</a>
Предыдущий патент: Огнезащитная полимерная композиция, содержащая тонкодисперсные включения
Следующий патент: Способ коррекции иммунного состояния организма при сахарном диабете
Случайный патент: Средство защиты растений в виде водного раствора, способ его получения и способ борьбы с нежелательным ростом растений