Новые пептиды и способы их получения и применения

НОВЫЕ ПЕПТИДЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US) Изобретение принадлежит к области лечения диабета и относится к пептидам, которые проявляют активность по отношению как к рецептору глюкозозависимого инсулинотропного пептида (GIP-R),так и к рецептору глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1R), и селективны по отношению к рецептору глюкагона (Gluc-R). В частности, предложены аналоги GIP с введенными заменами аминокислот, обеспечивающими модулирование активности по отношению как к GIP-R, так и кGLP-1R и сохранение селективности по сравнению с Gluc-R. Алсина-Фернандез Джордж, Боквист Кристер Бенгт, Гуо Лили, Майер Джон Филип (US) Лыу Т.Н. (RU) Настоящее изобретение принадлежит к области лечения диабета и относится к пептидам, которые проявляют активность в отношении как рецептора глюкозозависимого инсулинотропного пептида(GIP-R), так и рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1R) и селективны по отношению к рецептору глюкагона (Gluc-R). В частности, предложены аналоги GIP с введенными заменами аминокислот,обеспечивающими модулирование активности в отношении как GIP-R, так и GLP-1R и сохранения селективности по отношению к Gluc-R.GIP, известный как желудочный ингибиторный полипептид или как глюкозозависимый инсулинотропный пептид, представляет собой состоящий из 42 аминокислот регуляторный пептид желудочнокишечного тракта, который, как было показано, стимулирует секрецию инсулина бета-клетками поджелудочной железы в присутствии глюкозы, играя, таким образом, физиологическую роль в гомеостазе глюкозы. GLP-1 представляет собой пептид, состоящий из 37 аминокислот, который защищает бетаклетки поджелудочной железы и ингибирует секрецию глюкагона, опорожнение желудка и потребление пищи, что приводит к снижению веса. GIP и GLP-1 известны как инкретины. Передача сигналов от рецепторов инкретинов оказывает физиологически важное действие, критичное для гомеостаза глюкозы. Глюкагон представляет собой пептид, состоящей из 29 аминокислот, продуцируемый поджелудочной железой. Этот гормон дает сигнал печени на высвобождение глюкозы, что приводит к повышению уровня глюкозы в крови. Таким образом, стимулирование Gluc-R при диабете нежелательно. В отличие от того, что наблюдается у здоровых субъектов, GIP отдельно оказывает очень умеренный эффект снижения уровня глюкозы у людей, страдающих диабетом 2 типа. Тем не менее, после достижения некоторого снижения уровня глюкозы эффективность GIP возрастает и достигает уровня, близкого к наблюдаемому у субъекта с нормальным уровнем глюкозы. С другой стороны, GLP-1 эффективно снижает уровень глюкозы как у здоровых субъектов, так и у субъектов, страдающих диабетом, но он вызывает тошноту, и поэтому полная эффективность GLP-1, возможно, никогда не будет реализована. Дополнительно, как GIP, так и GLP-1 быстро инактивируются протеазой дипептидилпептидазой IV(DPP IV), которая образует пептиды, которые не способны стимулировать секрецию инсулина и, следовательно, их можно применять только для кратковременного метаболического контроля. Некоторые аналоги GIP описаны в WO 2010/016940 и WO 2010/016944. Некоторые аналоги глюкагона описаны в WO 2010/011439 как проявляющие активность и в отношении GIP, и в отношении GLP-1. Современные средства для лечения диабета включают секретагоги инсулина, такие как сульфонилмочевины и глитиниды, которые часто демонстрируют постепенное снижение эффективности и могут вызывать гипогликемию у пациентов с диабетом 2 типа. Соответственно, существует потребность в идентификации новых агентов, которые обеспечивают длительную глюкозозависимую стимуляцию секреции инсулина. Также желательно идентифицировать новые агенты, которые обладают способностьюGLP-1 снижать уровень глюкозы, но не вызывают тошноты, а также новые агенты, которые обладают повышенной метаболической стабильностью. Согласно настоящему изобретению предложены новые высокоактивные и эффективные пептиды с введенными заменами аминокислот, обеспечивающими модулирование активности в отношении какGIP, так и GLP-1, при сохранении селективности по отношению к глюкагону. Настоящее изобретение обеспечивает эффекты GLP-1 по снижению уровня глюкозы и использует эффекты GIP, связанные с секрецией инсулина, стимулируемой глюкозой. Кроме того, некоторые соединения согласно настоящему изобретению обеспечивают эффективные средства снижения массы тела. Согласно настоящему изобретению предложен пептид, включающий последовательность:Xaa2 в положении 43 представляет собой Cys или отсутствует; Хаа 3 в положении 44 представляет собой Cys или отсутствует; С-концевая аминокислота возможно амидирована; в том случае, если Хаа 2 в положении 43 или Хаа 3 в положении 44 представляет собой Cys, то любой из них или оба возможно пегилированы. Один вариант реализации настоящего изобретения относится к пептидам, в которых Хаа 1 представляет собой Phe. Предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения относится к пептидам, в которых Хаа 1 представляет собой Nal. Один вариант реализации настоящего изобретения относится к пептидам, в которых Хаа 2 и Хаа 3 отсутствуют. Предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения относится к пептидам, в которых каждый из Хаа 2 и Хаа 3 представляет собой Cys. В указанном варианте реализации предпочтительно, чтобы карбоксильная группа Cys в положении 44 была амидирована. Дополнительный предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения относится к пептидам, в которых Cys указанного пептида в любом из положений 43 или 44 пегилирован молекулой ПЭГ с молекулярной массой 20 кДа. В указанном варианте реализации предпочтительно, чтобы карбоксильная группа С-концевого Cys была амидирована. Другой предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения относится к пептидам, в которых Cys указанного пептида в обоих положениях 43 и 44 пегилирован молекулой ПЭГ с молекулярной массой 20 кДа. В указанном варианте реализации предпочтительно, чтобы карбоксильная группа С-концевого Cys была амидирована. Один вариант реализации настоящего изобретения относится к пептидам, в которых Хаа 1 представляет собой Phe и Хаа 2 и Хаа 3 отсутствуют. В указанном варианте реализации предпочтительно, чтобы карбоксильная группа С-концевого Gln в положении 42 была амидирована. Предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения относится к пептидам, в которых Хаа 1 представляет собой Nal и Хаа 2 и Хаа 3 отсутствуют. В указанном варианте реализации предпочтительно, чтобы карбоксильная группа С-концевого Gln в положении 42 была амидирована. Более предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения относится к пептидам, в которых Хаа 1 представляет собой Phe; Xaa2 и Хаа 3, оба, представляют собой Cys и оба возможно пегилированы и карбоксильная группа Cys в положении 44 возможно амидирована. Особенно предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения относится к пептидам, в которых Хаа 1 представляет собойNal; Хаа 2 и Хаа 3 представляют собой Cys и любой или оба Cys возможно пегилированы и карбоксильная группа Cys в положении 44 возможно амидирована. Особенно предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения представляет собой и Cys в положении 44 амидирован. Данный пептид называют Aib2, Aib13, Aib29, Cys43 (ПЭГ 20 кДа), Cys44 (ПЭГ 20 кДа)-GIP. Наиболее предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения представляет собой и Cys в положении 44 амидирован. Данный пептид называют Aib2, Aib13, Nal22, Aib29, Cys43 (ПЭГ 20 кДа), Cys44 (ПЭГ 20 кДа)-GIP. Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения сахарного диабета у пациента,включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества пептида согласно настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ лечения инсулиннезависимого сахарного диабета у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества пептида согласно настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ лечения инсулинозависимого сахарного диабета у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества пептида согласно настоящему изобретению. Далее, согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения состояния, выбранного из группы, состоящей из ожирения, метаболического синдрома, ишемической болезни сердца и атеросклероза, путем введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества пептида согласно настоящему изобретению. Далее, согласно настоящему изобретению предложен способ стимулирования снижения веса путем введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества пептида согласно настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения хрупкости или повышения прочности костей путем введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества пептида согласно настоящему изобретению. Дополнительно, согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая пептид согласно настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом. Дополнительно, согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, пригодная для лечения сахарного диабета. Согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, пригодная для лечения инсулиннезависимого сахарного диабета Согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, при-2 022489 годная для лечения инсулинозависимого сахарного диабета. Дополнительно, согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, пригодная для лечения ожирения. Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, пригодная для лечения состояния, выбранного из группы, состоящей из метаболического синдрома, ишемической болезни сердца и атеросклероза. Согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, пригодная для стимулирования снижения веса. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложена фармацевтическая композиция, пригодная для лечения хрупкости или повышения прочности костей. В одном варианте реализации, композиция дополнительно содержит один или более других терапевтических агентов. Согласно настоящему изобретению также предложены фармацевтические композиции, содержащие пептид согласно настоящему изобретению с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами. В одном варианте реализации композиция дополнительно содержит один или более других терапевтических агентов. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены стабильные молекулы, которые менее подвержены быстрой метаболической деактивации под действием DPPIV. Последовательности согласно настоящему изобретению включают стандартные однобуквенные или трехбуквенные коды 20 встречающихся в природе аминокислот. Другие используемые для аминокислот коды определяются следующим образом: Aib = альфа-аминоизомасляная кислота; Nal = 1-нафтилаланин. Термин "С-концевая аминокислота" относится к последней аминокислоте в последовательности пептида, которая содержит свободную карбоксильную группу. С-концевая аминокислота согласно настоящему изобретению может представлять собой Gln в положении 42, Cys в положении 43 или Cys в положении 44. Термин "полиэтиленгликоль" или "ПЭГ" относится к соединению полиалкиленгликоля или его производному со связывающими агентами или без них или дериватизации связывающими или активирующими молекулами. В обычной форме ПЭГ представляет собой линейный полимер с гидроксильными группами на концах и соответствует формуле HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH, где n равен приблизительно 8-4000. МетоксиПЭГ представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль. Поскольку полиэтиленгликоли обычно получают и используют в виде смесей соединений ПЭГ, различающихся до некоторой степени по молекулярной массе, средний специалист в данной области, как правило, описывает молекулярную массу ПЭГ, присоединенного к соединению, путем описания средней молекулярной массы пегилирующего реагента, используемого в реакции пегилирования, в результате которой получили данное пегилированное соединение. В данной области известны многочисленные производные ПЭГ. Молекулярная масса молекул ПЭГ, ковалентно присоединенных к пептидам согласно настоящему изобретению, может составлять приблизительно 10000, 20000, 30000 или 40000 Да. Средняя молекулярная масса молекул ПЭГ предпочтительно составляет от 18000 до 22000 Да. Более предпочтительно средняя молекулярная масса составляет от 19000 до 21000 Да. Наиболее предпочтительно средняя молекулярная масса составляет от 20000 до 21000 Да. Молекулы ПЭГ могут быть линейными или разветвленными и могут присутствовать в единственном числе или в тандеме. Пегилированные пептиды согласно настоящему изобретению предпочтительно содержат расположенные последовательно линейные молекулы ПЭГ, присоединенные к С-концу пептида. В частности, молекулы ПЭГ предпочтительно присоединены к двум остаткам цистеина на С-конце пептида с использованием метокси-ПЭГ-20 кДа-малеимида (метокси-ПЭГ-МАЛ) (I) или метокси-ПЭГ-20 кДа-йодацетамида (II), где n составляет от 10 до 2500. Предпочтительно n составляет от 350 до 600. Более предпочтительно n составляет 425 до 475. Термин "пегилирование" в данном описании означает ковалентное присоединение одной или более молекул ПЭГ, описанных выше, к пептидам согласно настоящему изобретению. Например, пептид согласно настоящему изобретению пегилирован по Cys в положениях 43 и 44 молекулой ПЭГ с молекулярной массой 20 кДа, ковалентно присоединенной к тиольной группе каждого Cys. В данном описании используются следующие сокращения:HBSS - солевой буферный раствор Хэнка;IBMX - 1-метил-3-(2-метилпропил)-7 Н-пурин-2,6-дион; ДМСО - диметилсульфоксид. Синтез пептидов. Все пептиды согласно настоящему изобретению получали путем твердофазного пептидного синтеза на автоматизированном синтезаторе пептидов Symphony от Protein Technologies Inc. Синтез осуществляли на амидполистирольной смоле Fmoc-Rink (Rapp Polymere, Тюбинген, Германия) с заменами, составляющими приблизительно 0,7 ммоль/г. Синтез осуществляли, применяя твердофазный пептидный синтез со стратегией использования защитных групп Fmoc/t-Bu. Используемые производные боковых цепей аминокислот представляли собой: Arg(Pbf), Asp(OtBu), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Trt),Lys(Boc), Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc) и Tyr(tBu). Присоединение осуществляли приблизительно с 6 экв. аминокислоты, активированной диизопропилкарбодиимидом (DIC) и гидроксибензотриазолом (HOBt)(молярное отношение 1:1:1), в диметилформамиде (DMF) в течение 90 мин при комнатной температуре. Для присоединения Fmoc-(1-Nal)-OH в положении 22 использовали следующие условия:Fmoc-Ile-OH (6 экв.), РуВОР (6 экв.) и DIEA (12 экв.) в DMF в течение 10 ч при комнатной температуре. Одновременное отщепление от смолы и снятие защитной группы боковой цепи осуществляли в растворе, содержащем трифторуксусную кислоту (ТФА):триизопропилсилан:1,2 этандитиол:метанол:тиоанизол 90:4:2:2:2 (об./об.) в течение 2 ч при комнатной температуре. Раствор фильтровали и пептиды преципитировали холодным диэтиловым эфиром, повторно растворяли в 30-40 мл 10% ацетонитрила в воде и очищали на колонке С 18 для обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (обычно Waters SymmetryPrep, 7 мкм, 19300 мм) при скорости потока 18 мл/мин. Образцы элюировали двухступенчатым линейным градиентом АВ от 0 до 18% В в течение 5 мин, а затем от 18 до 45% В в течение 110 мин, где А=0,05% ТФА/вода и В=0,05% ТФА/ацетонитрил. Продукт обычно элюировался при 28-35% ацетонитрила. Чистоту и молекулярную массу пептида подтверждали на системе Agilent 1100 Series для ЖХ/МС с одноквадрупольным МСдетектором. Разделение методом аналитической ВЭЖХ осуществляли на колонке Zorbax EclipseXDB-C8, 5 мкм, внутренний диаметр 4,6 мм 15 см, с линейным градиентом АВ от 6 до 60% В, в котором А=0,05% ТФА/Н 2 О и В=0,05% ТФА/ацетонитрил, в течение 15 мин и при скорости потока 1 мл/мин. Все пептиды были очищены до чистоты 95% и подтвердили, что они обладают молекулярной массой, соответствующей рассчитанному значению с точностью до 1 атомной единицы массы (а.е.м.). Пример 1. Пегилирование пептида метокси-ПЭГ-МАЛ-20 кДа. Взвешивали лиофилизированный пептид (обычно 30-50 мг). Взвешивали 2,1-кратный молярный эквивалент метокси-ПЭГ-20 кДа-малеимида (CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)3NHCO(CH2)2-малеимида) (метоксиПЭГ-МАЛ) (NOF SUNBRIGHT ME-200MA) и объединяли с пептидом. Реагенты растворяли в смеси 50/50 (об./об.) воды/ацетонитрила до концентрации пептида равной приблизительно 20 мг/мл. Раствор пептида разбавляли в два раза 100 мМ ацетатом аммония, 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой(EDTA), рН 7. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре. Мониторинг реакционной смеси осуществляли с помощью аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ (разделение путем аналитической ВЭЖХ осуществляли на колонке C18 Waters Symmetry Shield, 3,5 мкм, внутренний диаметр 4,6 мм 10 см при 60 С, с использованием двухступенчатого линейного градиента АВ от 0 до 30% В в течение 5 мин и от 30 до 90% В в течение последующих 30 мин, в котором А=0,05% ТФА/Н 2 О и В=0,05% ТФА/ацетонитрил, и скорость потока составляла 1 мл/мин) и обычно через 1-2 ч реакции наблюдалось почти полное исчезновение пика пептида. Появлялось два пика, обусловленных моно- и дипегилированным пептидом, при этом дипегилированный пептид обычно составлял 90-95% общей площади пиков. Образец затем обычно разбавляли до объема приблизительно 40 мл подкисленной водой (0,05% ТФА/вода) и очищали на колонке C18 для обращенно-фазовой ВЭЖХ (обычно Waters Symmetry Prep,7 мкм, 19300 мм) при скорости потока 10 мл/мин с использованием двухступенчатого линейного градиента АВ от 0 до 25% В в течение 15 мин, а затем от 25 до 55% В в течение 100 мин, где А=0,05% ТФА/вода и В=0,05% ТФА/ацетонитрил. Продукт, как правило, элюировался при 35-40% ацетонитрила. Осуществляли количественный анализ очищенного пептида по поглощению ультрафиолета (УФ) на 280 нм, применяя рассчитанный на основании последовательности пептида молярный коэффициент экстинкции. Выход после очистки обычно составлял около 70% в зависимости от количества исходного пептида. Пример 3. Пример 4. Пептиды из примера 3 и примера 4 пегилировали, применяя метокси-ПЭГ-МАЛ. Пегилирование пептида метокси-ПЭГ-йодацетамидом-20 кДа. Взвешивали лиофилизированный пептид (обычно 30-50 мг). Взвешивали 2,1-кратный молярный эквивалент метокси-ПЭГ-20 кДа-йодацетамида (CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)3NHCOCH2-I) (NOF SUNBRIGHTME-200IA) и объединяли с пептидом. Реагенты растворяли в водном буферном растворе, рН 8,5 (борная кислота, хлористый калий, буфер на основе гидроксида натрия 0,1 М + 10 мМ EDTA) + 20% ацетонитрил(об./об.) до концентрации пептида равной приблизительно 10 мг/мл. Раствор пептида разбавляли в два раза 100 мМ ацетатом аммония, 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA), рН 7. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре. Мониторинг реакционной смеси осуществляли с помощью аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ (разделение путем аналитической ВЭЖХ осущест-5 022489 вляли на колонке C18 Waters Symmetry Shield, 3,5 мкм, внутренний диаметр 4,6 мм 10 см при 60 С с использованием двухступенчатого линейного градиента АВ от 0 до 30% В в течение 5 мин и от 30 до 90% В в течение последующих 30 мин, в котором А=0,05% ТФА/H2O и В=0,05% ТФА/ацетонитрил, и скорость потока составляла 1 мл/мин) и, как правило, через 18 ч реакции наблюдалось почти полное исчезновение пика пептида. Появлялось два пика, обусловленных моно- и дипегилированным пептидом,при этом дипегилированный пептид обычно составлял 90-95% общей площади пиков. Затем обычно образец разбавляли до объема приблизительно 50 мл подкисленной водой (0,05% ТФА/вода) и очищали на колонке C18 для обращенно-фазовой ВЭЖХ (как правило, WatersSymmetryPrep, 7 мкм, 19300 мм) при скорости потока 10 мл/мин с использованием двухступенчатого линейного градиента АВ от 0 до 25% В в течение 15 мин, а затем от 25 до 55% В в течение 100 мин, где А=0,05% ТФА/вода и В=0,05% ТФА/ацетонитрил. Продукт, как правило, элюировался при 35-40% ацетонитрила Осуществляли количественный анализ очищенного пептида по поглощению УФ на 280 нм,применяя рассчитанный на основании последовательности пептида молярный коэффициент поглощения. Выход после очистки обычно составлял около 70% в зависимости от количества исходного пептида. В альтернативном варианте лиофилизированный пептид взвешивали (обычно 30-50 мг). Взвешивали 2,1-кратный молярный эквивалент метокси-ПЭГ-20 кДа-йодацетамида(CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)3NHCOCH2-I) (NOF SUNBRIGHT ME-200IA) и объединяли с пептидом. Реагенты растворяли в водном буферном растворе, рН 8,0 (0,1 М бикарбонатный буфер +10 мМ EDTA) + 20% ацетонитрил (об./об.) до концентрации пептида, равной приблизительно 8 мг/мл. Полученную смесь затем перемешивали при комнатной температуре в темноте. Мониторинг реакционной смеси осуществляли с помощью аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ (разделение путем аналитической ВЭЖХ осуществляли на колонке С 18 Waters SymmetryShield, 3,5 мкм, внутренний диаметр 4,6 мм 10 см при 60 С с использованием двухступенчатого линейного градиента АВ от 0 до 30% В в течение 5 мин и от 30 до 90% В в течение последующих 30 мин, где А=0,05% ТФА/H2O и В=0,05% ТФА/ацетонитрил, и скорость потока составляла 1 мл/мин) и обычно через 3 ч реакции наблюдали почти полное исчезновение пика пептида. Появлялось два пика, соответствующих моно- и дипегилированным пептидам, при этом дипегилированный пептид обычно составлял 90-95% общей площади пиков. Затем обычно образец разбавляли до объема приблизительно 50 мл подкисленной водой (0,05% ТФА/вода) и очищали, как описано выше. Выход после очистки обычно составлял около 70% в зависимости от количества исходного пептида. Пример 5. SEQ ID NO: 3. Пептид из примера 5 пегилировали, применяя метокси-ПЭГ-йодацетамид. ТестыIn vitro. Соединения, приведенные в качестве примеров в данном описании, тестировали, по существу, как описано ниже, и они демонстрировали аффинность связывания (Ki) с GIP-R и GLP-1R меньше 100 нМ, и отношение селективности по отношению к Gluc-R по меньшей мере в 100 раз. Дополнительно, соединения, описанные в данном документе, проявляют отношение активности в тестах на связывание с GIP-R иGLP-1R между 4:1 и 1:2 (GIP-R:GLP-1R) (4:1 указывает на большую активность на рецепторе GIP-R; 1:2 указывает на большую активность на рецепторе GLP-1R). Тест на связывание рецептора глюкозозависимого инсулинотропного пептида (GIP-R). В тесте на связывание рецептора глюкозозависимого инсулинотропного пептида использовалиGIP-R человека (Usdin,T.B., Gruber, C., Modi,W. и Bonner,T.I., GenBank: ААА 84418,1), клонированный в плазмиду pcDNA3,1-NeoR (Promega). Плазмидой GIP-R человека-pcDNA3,1/Neo трансфицировали клетки яичника китайского хомячка, CHO-S, с получением суспензионных культур и осуществляли селекцию в присутствии 500 мкг/мл генетицина (Invitrogen). Неочищенные плазматические мембраны получали из клеток, выращенных в суспензионной культуре. Клетки лизировали на льду в гипотоническом буфере, содержащем 25 мМ Tris HCl, рН 7,5, 1 мМMgCl2, 20 мкг/мл ДНКазы 1 и смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА Complete от Roche. Суспензию клеток гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора Даунса, совершая 25 движений тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугировали при 4 С при 1800g в течение 15 мин. Отбирали супернатант, ресуспендировали осадок в гипотоническом буфере и повторно гомогенизировали. Смесь центрифугировали при 1800g в течение 15 мин. Второй супернатант объединяли с первым супернатантом. Объединенные супернатанты повторно центрифугировали при 1800g в течение 15 мин для осветления. Осветленный супернатант переносили в пробирки для высокоскоростного центрифугирования и центрифугировали при 25000g в течение 30 мин при 4C. Осадок мембран ресуспендировали в буфере для гомогенизирования и хранили в виде замороженных аликвот в морозилке при -80C до использования.GIP метили радиоактивным йодом с использованием процедуры с 125I-лактопероксидазойPerkin-Elmer/NEN (NEX-402). Удельная активность составляла приблизительно 2200 Ки/ммоль. Определение KD осуществляли методом гомологичного конкурирования с использованием холодный GIP человека вместо насыщения связывания. Тест на связывание рецептора осуществляли путем сцинтилляционного анализа сближения (SPA) (Sun, S., Almaden, J., Carlson, T.J., Barker, J. и Gehring, M.R. Assaydevelopment and data analysis of receptor-ligand binding based on scintillation proximity assay. Metab Eng. 7:38-44 (2005 с гранулами, покрытыми агглютинином из проростков пшеницы (WGA) (GE Health Care),предварительно блокированными в 1% БСА, свободном от жирных кислот (Gibco, 7,5% БСА). Буфер для связывания содержал 25 мМ HEPES, рН 7,4, 2,5 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 0,1% свободный от жирных кислот БСА, 0,003% Tween 20 и смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА Complete от Roche. GIP человека и пептидные аналоги растворяли в ФБР и хранили при -80 С. Пептидные аналоги подвергали серийному разведению в буфере для связывания. Затем 10 мкл разбавленного пептида переносили в аналитические планшеты с прозрачным дном Corning 3632, содержащие 40 мкл тестового буфера для связывания или холодного GIP (неспецифичное связывание (НСС) в конечной концентрации 0,1 мкМ). Затем добавляли 90 мкл мембран (4 мкг/лунку), 50 мкл [125I]-GIP (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, в конечной концентрации в реакции 0,15 нМ) и 50 мкл гранул WGA (150 мкг/лунку), планшеты запечатывали и перемешивали опрокидыванием. Планшеты считывали с помощью сцинтилляционного счетчикаMicroBeta после 12 ч отстаивания при комнатной температуре. Результаты рассчитывали в виде процента специфичного связывания меченого 125I GIP в присутствии соединения. Абсолютную концентрацию IC50 соединения получали путем нелинейной регрессии процента специфичного связывания меченого 125I GIP в зависимости от концентрации добавленного соединения. Концентрацию IC50 преобразовывали в Ki, применяя уравнение Ченга-Прусоффа, где KD оценили равной 0,174 нМ (Cheng, Y., Prusoff, W.H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108 (1973. Таблица 1 Полученные результаты демонстрируют, что пептиды из табл. 1 связываются с GIP-R и могут активировать данный рецептор, в свою очередь запуская GIP-зависимые физиологические реакции. Тест на связывание рецептора глюкагоноподобного пептида 1 (GLP-1R). В анализе на связывание рецептора GLP-1 использовали клонированный рецептор глюкагоноподобного пептида 1 человека (GLP-1R человека) (Graziano M.P., Hey P.J., Borkowski D., Chicchi G.G.,Strader C.D., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196(1):141-6, 1993), выделенный из мембран HEK 293. КДНК GLP-1R человека субклонировали в экспрессионную плазмиду phD (Trans-activated expression offully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor Grinnell, B.W., Berg, D.T.,Walls, J. и Yan, S.B. Bio/Technology, 5:1189-1192, 1987). Данной плазмидной ДНК трансфицировали клетки HEK 293 и осуществляли селекцию клеток в 200 мкг/мл гигромицина. Неочищенные плазматические мембраны получали из клеток, выращенных в суспензионной культуре. Клетки лизировали на льду в гипотоническом буфере, содержащем 25 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 1 мМMgCl2, 20 мкг/мл ДНКазы 1 и смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА Complete от Roche. Суспензию клеток гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора Даунса, совершая 25 движений тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугировали при 4 С при 1800g в течение 15 мин. Супернатант отбирали и осадок ресуспендировали в гипотоническом буфере и повторно гомогенизировали. Смесь центрифугировали при 1800g в течение 15 мин. Второй супернатант объединяли с первым супернатантом. Объединенные супернатанты повторно центрифугировали при 1800g в течение 15 мин для осветления. Осветленный супернатант переносили в пробирки для высокоскоростного центрифугирования и центрифугировали при 25000g в течение 30 мин при 4 С. Осадок мембран ресуспендировали в буфере для гомогенизирования и хранили в виде замороженных аликвот в морозилке при -80C до использования. Глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1) метили радиоактивным йодом с использованием процедуры с 125I-лактопероксидазой и очищали путем обращенно-фазовой ВЭЖХ в Perkin-Elmer/NEN (NEX308). Удельная активность составляла приблизительно 2200 Ки/ммоль. Определение KD осуществляли с помощью гомологичного конкурирования вместо насыщения связывания, вследствие высокого содержания пропадала в материале меченого 125I GLP-1. KD оценили равной 0,96 нМ и использовали для расчета значений Ki для всех тестируемых соединений. Тест на связывание рецептора осуществляли, применяя сцинтилляционный анализ сближения (SPA) с гранулами, покрытыми агглютинином из проростков пшеницы (WGA), предварительно блокированными в 1% БСА, свободном от жирных кислот (Gibco). Буфер для связывания содержал 25 мМ HEPES,рН 7,4, 2,5 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 0,1% свободный от жирных кислот БСА, 0,003% Tween 20 и смесь ингибиторов протеаз без ЭДГА Complete от Roche. Глюкагоноподобный пептид 1 растворяли в ФБР до концентрации 1 мг/мл и незамедлительно замораживали при -80C в аликвотах по 30 мкл. Аликвоту глюкагоноподобного пептида-1 разбавляли и использовали в анализах на связывание в течение 1 ч. Пептидный аналог растворяли в ФБР и подвергали серийному разведению в буфере для связывания. Затем 10 мкл разбавленных соединений или ФБР переносили в аналитические планшеты с прозрачным дномCorning 3632, содержащие 40 мкл тестового буфера для связывания или холодного глюкагона (НСС при конечной концентрации 1 мкМ). Затем добавляли 90 мкл мембран (1 мкг/лунку), 50 мкл меченого 125I глюкагоноподобного пептида-1 (конечная концентрация в реакционной смеси 0,15 нМ) и 50 мкл гранулWGA (150 мкг/лунку), запечатывали и перемешивали опрокидыванием. Планшеты считывали с помощью сцинтилляционного счетчика Trilux MicroBeta от PerkinElmer Life and Analytical Sciences после 12 ч отстаивания при комнатной температуре. Результаты рассчитывали в виде процента специфичного связывания меченого 125I глюкагоноподобного пептида-1 в присутствии соединения. Абсолютную концентрацию IC50 соединения получали методом нелинейной регрессии процента специфичного связывания меченого 125I глюкагоноподобного пептида-1 в зависимости от концентрации добавленного соединения. Концентрацию IC50 преобразовывали в Ki, применяя уравнение Ченга-Прусоффа. Таблица 2 Полученные результаты демонстрируют, что пептиды в табл. 2 связываются с GLP-1R и, таким образом, могут активировать данный рецептор, в свою очередь запуская GLP-1-зависимые физиологические реакции. Тест на связывание рецептора глюкагона (Gluc-R человека). В анализе на связывание рецептора глюкагона использовали клонированный рецептор глюкагона человека (Lok S. et al., Gene, 140 (2), 203-209 (1994, выделенный из мембран HEK 293. КДНК Gluc-R человека субклонировали в экспрессионную плазмиду phD (Trans-activated expression of fully gammacarboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, B.W. et al., Bio/Technology,5:1189-1192 (1987. Данной плазмидной ДНК трансфицировали клетки HEK 293 и осуществляли селекцию клеток в 200 мкг/мл гигромицина. Неочищенные плазматические мембраны получали из клеток, которые растили в суспензионной культуре. Клетки лизировали на льду в гипотоническом буфере, содержащем 25 мМ Tris-HCl, рН 7,5,1 мМ MgCl2, 20 мкг/мл ДНКазы 1 и смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА Complete от Roche. Суспензию клеток гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора Даунса, совершая 25 движений тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугировали при 4 С при 1800g в течение 15 мин. Супернатант отбирали, осадок ресуспендировали в гипотоническом буфере и повторно гомогенизировали. Смесь центрифугировали при 1800g в течение 15 мин. Второй супернатант объединяли с первым супернатантом. Объединенные супернатанты повторно центрифугировали при 1800g в течение 15 мин для осветления. Осветленный супернатант переносили в пробирки для высокоскоростного центрифугирования и центрифугировали при 25000g в течение 30 мин при 4 С. Осадок мембран ресуспендировали в буфере для гомогенизирования и хранили в виде замороженных аликвот в морозилке при -80 С до использования. Глюкагон метили радиоактивным йодом с использованием процедуры с 125I-лактопероксидазой и очищали путем обращенно-фазовой ВЭЖХ в Perkin-Elmer/NEN (NEX207). Удельная активность составляла приблизительно 2200 Ки/ммоль. Определение KD осуществляли с помощью гомологичного конкурирования, вместо насыщения связывания, вследствие высокого содержания пропанола в материале меченого 125I глюкагона. KD оценили равной 2,62 нМ и использовали для расчета значений Ki для всех тестируемых соединений. Тест на связывание рецептора осуществляли, применяя сцинтилляционный анализ сближения (SPA) с гранулами, покрытыми агглютинином из проростков пшеницы (WGA), предварительно блокированными в 1% бычьем сывороточном альбумине (БСА), свободном от жирных кислот (Cibco, 7,5% БСА). Буфер для связывания содержал 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту(HEPES), рН 7,4, 2,5 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 0,1% свободный от жирных кислот БСА, 0,003% Tween 20 и смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА Complete от Roche. Глюкагон растворяли в 0,01 н. HCl до концентрации 1 мг/мл и незамедлительно замораживали при -80 С в аликвотах по 30 мкл. Аликвоту глюкагона разбавляли и использовали в анализе на связывание в течение 1 ч. Пептидный аналог растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР) и подвергали серийному разведению в буфере для связывания. Затем 10 мкл разбавленных соединений или ФБР переносили в аналитические планшеты с прозрачным дном Corning 3632, содержащие 40 мкл тестового буфера для связывания или холодного глюкагона(неспецифичное связывание (НСС) при конечной концентрации 1 мкМ). Затем добавляли 90 мкл мембран (3 мкг/лунку), 50 мкл меченого 125I глюкагона (конечная концентрация в реакционной смеси 0,15 нМ) и 50 мкл гранул WGA (150 мкг/лунку), запечатывали и перемешивали опрокидыванием. Планшеты считывали с помощью сцинтилляционного счетчика Trilux MicroBeta от PerkinElmer Life andAnalytical Sciences после 12 ч отстаивания при комнатной температуре. Результаты рассчитывали в виде процента специфичного связывания меченого 125I глюкагона в присутствии соединения. Абсолютную концентрацию IC50 соединения получали с помощью нелинейной регрессии процента специфичного связывания меченого 125I глюкагона в зависимости от концентрации добавленного соединения. Дозу IC50 преобразовывали в Ki, применяя уравнение Ченга-Прусоффа. Таблица 3 Полученные результаты демонстрируют, что пептиды из табл. 3 обладают меньшей селективностью по отношению к Gluc-R и, таким образом, не вызывают опосредуемых Gluc-R физиологических реакций. Функциональная активация клеток с GIP-R человека для продукции внутриклеточного цАМФ. В функциональном анализе цАМФ использовали ту же линию клеток, экспрессируюшую клонированный GIP-R, выделенную для теста на связывание GIP-R человека, описанного выше. Клетки стимулировали пептидами и осуществляли измерение цАМФ, образованного в клетке с использованием набораCisBio cAMP Dynamic 2 HTRF Assay kit. Вкратце, цАМФ, образование которого индуцировали в клетке, детектировали по связыванию с цАМР-d2-захватывающим антителом в присутствии буфера для лизиса клеток. Второе детектирующее антитело к цАМФ, меченное криптатом, добавляли для получения трехслойной структуры, которую затем детектировали с помощью прибора Envision от Perkin-ElmerLife Sciences. Экспрессирующие GIP-R человека клетки CHO-S собирали с чашек с субконфлюэнтной культурой с помощью свободного от ферментов раствора для диссоциации клеток (Specialty Media 5-004-B). Клетки осаждали при низкой скорости и промывали 3 раза аналитическим буфером для теста на цАМФ [25 мМHepes в HBSS с Mg и Ca (Gibco, 14025-092) с 0,1% свободным от жирных кислот БСА (Gibco, 7,5% БСА),500 мкМ IBMX], затем разбавляли до конечной концентрации равной 312000 клеток/мл. GIP человека и пептиды готовили в виде 5 Х концентрированных растворов, которые подвергали серийному разведению в аналитическом буфере для теста на цАМФ, а также получали стандартную кривую цАМФ для замороженных концентрированных 2,848 нМ растворов цАМФ на ФБР, которые хранили при -20 С. Для инициирования теста 40 мкл суспензии клеток переносили в черные, не обработанные для ведения культуры ткани планшеты с половинным объемом лунок (CoStar 3694), а затем добавляли 10 мкл 5 Х разведений пептида. Клетки оставляли при комнатной температуре на 1 ч. Реакцию останавливали добавлением 25 мкл цАМФ-d2-захватывающего антитела (CisBio), разбавленного в лизирующем буфере CisBio, а затем аккуратно перемешивали на качалке Titertek. Через 15 мин лизирования добавляли 25 мкл детектирующего антитела к цАМФ, меченного криптатом (CisBio), и аккуратно перемешивали. Смеси лизированных клеток и антитела считывали через 1 ч нахождения при комнатной температуре, применяяEnvision от Perkin-Elmer. Единицы Envision преобразовывали в нМ цАМФ/лунку, используя стандартную кривую цАМФ. Наномоли цАМФ, образованного в каждой лунке, преобразовывали в процент от максимального ответа, наблюдаемого для контрольного GIP человека. Относительное значение EC50 получали методом нелинейного регрессионного анализа с использованием зависимости процента максимального ответа от добавленной концентрации пептида. Полученные результаты демонстрируют, что пептиды из табл. 4 связывают и активируют GIP-R и,тем самым, могут вызывать опосредованные GIP-R физиологические реакции. Функциональная активация клеток с GLP-1R человека для продукции внутриклеточного цАМФ. В функциональном тесте цАМФ использовали клональную линию экспрессирующих GLP-1R человека клеток, выделенных после трансфекции клеток HEK 293 GLR-1R человека, клонированным вBiophys. Res. Commun. 1993, 15 октября; 196(1):141-6. Клетки, экспрессирующие GLP-1R человека,стимулировали пептидами и осуществляли количественный анализ цАМФ, образованного в клетке, применяя набор CisBio cAMP Dynamic 2 HTRF Assay kit (62 АМ 4 РЕВ). Вкратце, цАМФ, образование которого индуцировали в клетке, детектировали по связыванию с цАМР-d2-захватывающим антителом(CisBio) в присутствии лизирующего клетки буфера. Второе детектирующее антитело к цАМФ, меченное криптатом (CisBio), добавляли для получения трехслойной структуры, которую затем обнаруживали с помощью прибора Envision от Perkin-Elmer. Экспрессирующие GLP-1R человека клетки HEK 293 собирали с чашек с субконфлюэнтной культурой с помощью свободного от ферментов раствора для диссоциации клеток (Specialty Media 5-004-B). Клетки осаждали при низкой скорости и промывали 3 раза тестовым буфером DMEM для цАМФ [10 мМHepes в DMEM (Gibco-31053) с 0,5% эмбриональной бычьей сывороткой (ЭБС), 2 мМ глутамином и 500 мкМ IBMX], затем разбавляли до конечной концентрации равной 50000 клеток/мл. GLP-1 человека и пептиды готовили в виде 5 Х концентрированных растворов, которые подвергали серийному разведению в тестовом буфере DMEM для цАМФ, а также получали стандартную кривую цАМФ для замороженных концентрированных 2,848 нМ растворов цАМФ на ФБР, которые хранили при -20 С. Для инициирования анализа 40 мкл суспензии клеток переносили в черные, не обработанные для ведения культуры ткани планшеты с половинным объемом лунок (CoStar 3694), а затем добавляли 10 мкл 5 Х разведений пептида. Клетки оставляли при комнатной температуре на 1 ч. Реакцию останавливали добавлением 25 мкл цАМФ-d2-захватывающего антитела (CisBio), разбавленного в лизирующем буфере CisBio, a затем аккуратно перемешивали на качалке Titertek. Через 15 мин лизирования добавляли 25 мкл детектирующего антитела к цАМФ, меченного криптатом (CisBio), и аккуратно перемешивали. Смеси лизированных клеток и антитела считывали через 1 ч нахождения при комнатной температуре, применяя Envision отPerkin-Elmer. Единицы Envision преобразовывали в нМ цАМФ/лунку, используя стандартную кривую цАМФ. Нмоли цАМФ, образованного в каждой лунке, преобразовывали в процент от максимального ответа, наблюдаемого для контрольного GLP-1 человека. Относительное значение EC50 получали с помощью нелинейного регрессионного анализа с использованием зависимости процента максимального ответа от добавленной концентрации пептида. Таблица 5 Полученные результаты демонстрируют, что пептиды из табл. 5 связывают и активируют GLP-1R и, таким образом, могут вызывать опосредуемые GLP-1R физиологические реакции.In vivo. Влияние на потребление пищи, массу тела и состав тела мышей с алиментарным ожирением (DIO). Использовали самцов мышей с алиментарным ожирением (DIO) в возрасте от трех до четырех месяцев. Животных поселяли отдельно в помещении с контролируемой температурой (24 С) с 12-часовым циклом света/темноты (свет включали в 22:00) и обеспечивали им свободный доступ к пище и воде. Через 2 недели акклиматизации в помещении мышей произвольно делили на группы лечения(n=8-10/группу) таким образом, что в каждой группе средняя масса тела и масса жира были аналогичны. Перед началом эксперимента мышам инъецировали подкожно (sc) раствор среды и взвешивали их в течение 7 дней, чтобы они адаптировались к процедурам. Среду или пептидный аналог (диапазон доз 10-100 нМ/кг), растворенный в среде, вводили путем подкожной инъекции мышам DIO, которых кормили без ограничения, за 30-90 мин до наступления темного цикла каждый 3 день в течение от 2 до 4 недель. В то же время измеряли массу тела и массу пищи с кормушкой. Количество потребленной за предшествующие 24 ч пищи рассчитывали путем вычитания массы пищи с кормушкой на данный момент из таковой для предыдущего дня. Абсолютные изменения массы тела рассчитывали путем вычитания массы тела данного животного перед первой инъекцией. В дни -1 и 14 измеряли суммарную массу жира методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) с использованием прибора Echo Medical System (Хьюстон, Техас). Безжировую массу рассчитывали путем вычитания массы жира из общей массы тела. Таблица 6 а Изменение массы тела мышей DIO за 14-дневный период лечения Таблица 6b Изменение массы тела мышей DIO за 14-дневный период лечения Результаты, представленные в табл. 6 а и 6b, показали, что пептиды из примеров 3-5 уменьшали совокупное потребление пищи и массу тела в 14-дневных исследованиях на мышах DIO, по сравнению с мышами, которым вводили среду. Уменьшение массы тела, главным образом, происходило за счет уменьшения массы жира. р 0,01, р 0,001 по сравнению со средой (критерий Дуннетта). Влияние на колебания уровня глюкозы в крови при проведении теста на толерантность к глюкозе,вводимой перорально, после 2-недельного лечения мышей DIO. Через 56 ч после последней инъекции соединения в исследовании на мышах DIO, описанном выше,животных подвергали тесту на толерантность к вводимой перорально глюкозе. Вкратце, мышей лишали пищи за 16 ч перед началом теста на толерантность к глюкозе. В момент времени 0 животным давали 2 г декстрозы/кг через желудочный зонд. Кровь отбирали из хвостовой вены через 0, 15, 30, 60 и 120 мин после введения глюкозы. Концентрацию глюкозы измеряли с помощью глюкометра. Таблица 7 а Влияние пептидов из примеров 3 и 4 на колебания уровня глюкозы после пероральной нагрузки глюкозой. Результаты представлены в виде площади под кривой глюкозы (среднеестандартная ошибка среднего) Таблица 7b Влияние пептидов из примеров 4 и 5 на колебания уровня глюкозы после пероральной нагрузки глюкозой. Результаты представлены в виде площади под кривой глюкозы (среднеестандартная ошибка среднего) Результаты, представленные в табл. 7 а и 7b, показали, что пептиды из примеров 3-5 значительно уменьшали колебания уровня глюкозы после пероральной нагрузки глюкозой. Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Дуннетта. Влияние на потребление пищи, массу тела и состав тела крыс Long Evans с алиментарным ожирением (DIO). Использовали самцов крыс Long Evans с алиментарным ожирением в возрасте от четырех до пяти месяцев. Животных поселяли отдельно в помещении с контролируемой температурой (24 С) с 12-часовым светотемновым циклом (свет включали в 22:00) и обеспечивали им свободный доступ к пище (диета TD95217) и воде. Животным позволяли акклиматизироваться в помещении в течение по меньшей мере 2 недель. В день 0 определяли состав тела крыс с помощью количественного ЯМР и крыс произвольно делили на соответствующие группы (n=6/группу) на основании массы тела, % жира и % массы нежировых тканей. Соединение вводили путем подкожной инъекции в дни 1, 4, 8, 11 и 15. В день 14 снова определяли состав тела с помощью количественного ЯМР, а в день 16 животных взвешивали и отбирали кровь из хвостовой вены, чтобы получить образцы для определения концентрации глюкозы, липидов, инсулина, глюкагона и PYY в плазме. После эвтаназии с помощью СО 2 отбирали образцы крови путем сердечной пункции для определения влияния. Введение пептидов из примеров 3 и 4 в течение 16 дней вызывало изменения массы тела и состава тела крыс DIO по сравнению с крысами DIO, которым вводили среду, в виде увеличения процента массы нежировых тканей и снижения процента массы жира. Например, после введения дозы 10 нМ/кг пептида из примера 3 в течение 16 дней масса нежировых тканей увеличилась на 0,6%, а масса жира уменьшилась на 1,3%. Аналогично, после введения дозы 30 нМ/кг пептида из примера 3 в течение 16 дней масса нежировых тканей увеличилась на 1,3% и масса жира уменьшилась на 2,3%. Далее, после введения дозы 30 нМ/кг пептида из примера 4 в течение 16 дней масса нежировых тканей увеличилась на 0,4% и масса жира уменьшилась на 1,8%. Аналогично, после введения дозы 100 нМ/кг пептида из примера 4 в течение 16 дней масса нежировых тканей увеличилась на 1,8% и масса жира уменьшилась на 3,2%. Введение пептидов из примеров 3 и 4 уменьшило количества липидов в плазме, включая триглицериды и общий холестерин, и увеличило количество свободных жирных кислот у крыс DIO по сравнению с крысами, которым вводили среду. Например, после введения дозы 10 нМ/кг пептида из примера 3 содержание триглицеридов и общего холестерина снизилось с 507,3 и 104 мг/дл (среда) до 262,1 и 91 мг/дл соответственно и содержание свободных жирных кислот повысилось с 0,69 до 0,94 мэкв/л. Аналогично,после введения дозы 30 нМ/кг пептида из примера 3 содержание триглицеридов и общего холестерина снизилось с 507,3 и 104 мг/дл (среда) до 233,5 и 94 мг/дл соответственно и содержание свободных жирных кислот повысилось с 0,69 до 1,01 мэкв/л. Далее, после введения дозы 10 нМ/кг пептида из примера 4 содержание триглицеридов и общего холестерина снизилось с 808,1 и 127 мг/дл (среда) до 488,7 и 110 мг/дл соответственно. Аналогично, после введения дозы 30 нМ/кг пептида из примера 4 содержание триглицеридов и общего холестерина снизилось с 808,1 и 127 мг/дл (среда) до 212,2 и 104 мг/дл соответственно и содержание свободных жирных кислот повысилось с 0,67 до 0,82 мэкв/л. Влияние на колебания уровня глюкозы в крови при проведении теста на толерантность к вводимой внутривенно глюкозе у нормальных крыс Данное исследование проводили на самцах нормальных крысах Wistar (225-250 г). Животных произвольно делили на группы на основании массы тела и уровня глюкозы в крови. Животным инъецировали среду или пептидный аналог (доза 3-400 мкг содержания пептида/кг) за 16 ч до начала теста. Пищу убирали во время инъекции. Перед проведением теста животных анестезировали путем интраперитонеального введения 65 мг/кг фенобарбитала и вставляли два катетера: один в яремную вену, а другой в сонную артерию. В момент времени 0 животным вводили 0,5 г глюкозы/кг через катетер в вене. Кровь собирали из сонной артерии в момент времени 0 (перед введением глюкозы) и через 2, 4, 6, 10, 20 и 30 мин после введения глюкозы. Концентрацию глюкозы измеряли с помощью глюкометра. Инсулин измеряли с помощью Mesoscale. Эффективность измеряли как увеличение общей площади под кривой инсулина (= проинтегрированные значения концентрации инсулина в плазме от t+0 до 30 мин), а также площади под кривой глюкозы, которая представляла собой меру колебаний уровня глюкозы после внутривенной провокации глюкозой. Введение пептидов из примеров 3 и 4 увеличило площадь под кривой инсулина и уменьшило площадь под кривой глюкозы по сравнению с крысами, которым вводили среду. Например, после введения пептида из примера 3 в дозе 50 мкг/кг площадь под кривой инсулина увеличилась с 55 нгмин/мл (среда) до 137 нгмин/мл и площадь под кривой глюкозы уменьшилась от 7830 мгмин/дл (среда) до 6780 мгмин/дл. Аналогично, после введения пептида из примера 3 в дозе 200 мкг/кг площадь под кривой инсулина увеличилась с 55 нгмин/мл (среда) до 183 нгмин/мл и площадь под кривой глюкозы уменьшилась от 7830 мгмин/дл (среда) до 7020 мгмин/дл. Далее, после введения пептида из примера 4 в дозе 50 мкг/кг площадь под кривой инсулина увеличилась с 44 нгмин/мл (среда) до 150 нгмин/мл и площадь под кривой глюкозы уменьшилась от 8010 мгмин/дл (среда) до 7730 мгмин/дл. Аналогично, после введения пептида из примера 4 в дозе 200 мкг/кг площадь под кривой инсулина увеличилась с 44 нгмин/мл(среда) до 161 нгмин/мл и площадь под кривой глюкозы уменьшилась от 8010 мгмин/дл (среда) до 7420 мгмин/дл. После введения пептида из примера 5 в дозе 50 мкг/кг площадь под кривой инсулина увеличилась с 41 нгмин/мл (среда) до 133 нгмин/мл и площадь под кривой глюкозы уменьшилась с 7739 мгмин/дл(среда) до 7202 мгмин/дл. Аналогично, после введения пептида из примера 5 в дозе 200 мкг/кг площадь под кривой инсулина увеличилась с 41 нгмин/мл (среда) до 124 нгмин/мл и площадь под кривой глюкозы уменьшилась с 7739 мгмин/дл (среда) до 7351 мгмин/дл. Влияние на скелет. Пептид из примера 4 исследовали на крысах Sprague Dawley в возрасте 6 месяцев с овариэктомией(OvX; см. Endocrinology, 144:2008-2015). Дозы 0, 2,9, 9,7 или 29 нМ/кг вводили крысам ежедневными подкожными инъекциями начиная с дня 9 после хирургического вмешательства. Лечение продолжалось в течение 35 дней, и пептид из примера 4 дозозависимо уменьшал потребление пищи и массу тела до 8% по сравнению с крысами, которым провели ложную операцию овариэктомии. Снижение массы тела происходило за счет уменьшения массы жира и не наблюдалось изменения массы нежировых тканей у крысOvX. Пептид из примера 4 снижал концентрацию глюкозы и триглицеридов в сыворотке, определенную не натощак, у крыс OvX. Указанное соединение дозозависимым образом предотвращало индуцированное овариэктомией уменьшение содержания костных минералов и минеральной плотности костной ткани в поясничных позвонках, но не оказывало влияния на средний кортикальный слой бедренной кости. Пептид из примера 4 не оказывал отрицательного влияния на минеральную плотность костной ткани или содержание костных минералов в бедренной кости и поясничных позвонках крыс OvX. Следует отметить, что снижение массы тела (8% в данном исследовании) может непосредственно влиять на костную массу. Прочность кости зависит от нагрузки, и снижение массы тела приводит к меньшей нагрузке на кости, которые несут вес, и вследствие этого наблюдалось меньшее влияние на скелетные параметры костей, которые несут вес, т.е. на кортикальный слой бедренной кости. Статистическую значимость оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, а затем критерия Дуннетта. Таблица 8 Изменения минеральной плотности костной ткани (МПК) поясничных позвонков Таблица 9 Изменения содержания костных минералов (СКМ) поясничных позвонков Результаты, представленные в табл. 8 и 9, показали, что соединение из примера 4 улучшает СКМ и МПК у крыс OvX. Соединения согласно настоящему изобретению предпочтительно изготавливают в виде фармацевтических композиций, которые вводят различными путями. В наиболее предпочтительном случае такие соединения предназначены для парентерального введения. Такие фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области. См., например, Remington: The Science andPractice of Pharmacy (A. Gennaro et al., ред., 19-е изд., Mack Publishing Co., 1995). Соединения согласно настоящему изобретению в целом эффективны в широком диапазоне дозировок. Например, дозировки для введения раз в неделю находятся в диапазоне от 1 до 24 мг конъюгата пептида или от 0,014 до 0,343 мг/кг массы тела. В некоторых случаях уровни дозировки, которые ниже нижнего предела указанного диапазона, могут быть более чем достаточными, тогда как в других случаях возможно использование даже более высоких доз без возникновения каких-либо нежелательных побочных эффектов и, следовательно, не предполагается, что упомянутый выше диапазон может каким-либо образом ограничивать объем настоящего изобретения. Очевидно, что количество соединения, которое фактически вводят, будет определять лечащий врач с учетом значимых обстоятельств, включая состояние, от которого лечат, выбранный путь введения, конкретное соединение или соединения, которые вводят, возраст, масса тела и ответ конкретного пациента и тяжесть симптомов пациента. Другие модификации настоящего изобретения, не выходящие за пределы объема изобретения, будут очевидны для специалистов в данной области.Xaa2 в положении 43 представляет собой Cys или отсутствует; Хаа 3 в положении 44 представляет собой Cys или отсутствует; С-концевая аминокислота возможно амидирована; если Хаа 2 в положении 43 или Хаа 3 в положении 44 представляют собой Cys, то любой из них или оба возможно пегилированы. 2. Пептид по п.1, в котором Хаа 1 представляет собой Nal. 3. Пептид по п.1, в котором Хаа 1 представляет собой Phe. 4. Пептид по любому из пп.1-3, в котором Хаа 2 и Хаа 3, оба, отсутствуют. 5. Пептид по любому из пп.1-3, в котором каждый из Хаа 2 и Хаа 3 представляет собой Cys. 6. Пептид по любому из пп.1-3 или 5, в котором любой из Cys в положении 43 или Cys в положении 44, оба, пегилированы молекулой ПЭГ массой от 18 до 22 кДа. 7. Пептид по п.6, в котором молекула ПЭГ обладает молекулярной массой от 20 до 21 кДа. 8. Пептид по п.6, в котором молекула ПЭГ обладает молекулярной массой 20 кДа. 9. Пептид по любому из пп.1-3 или 5-8, в котором каждый ПЭГ является линейным. 10. Пептид по любому из пп.1-9, в котором C-концевая аминокислота амидирована. 11. Пептид по любому из пп.1-3 или 5-10, включающий последовательность в которой карбоксильная группа пегилированного Cys в положении 44 амидирована. 12. Пептид по любому из пп.1-3 или 5-10, включающий последовательность в которой карбоксильная группа пегилированного Cys в положении 44 амидирована. 13. Фармацевтическая композиция, содержащая пептид по любому из пп.1-12 с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом. 14. Фармацевтическая композиция по п.13, содержащая один или более других терапевтических агентов. 15. Способ лечения сахарного диабета у пациента путем введения пациенту эффективного количества пептида по любому из пп.1-12. 16. Способ стимулирования снижения веса у пациента путем введения пациенту эффективного количества пептида по любому из пп.1-12.