Моноклональные антитела, имеющие гомоподтип кросс-нейтрализующих свойств против вируса гриппа а подтипа н1

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, ИМЕЮЩИЕ ГОМОПОДТИП КРОССНЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ СВОЙСТВ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА А ПОДТИПА Н 1 Описано моноклональное антитело, направленное против вируса гриппа А, которое способно связывать человеческие и животные изоляты вируса гриппа А, экспрессирующие гемагглютинин подтипа H1. Предпочтительным вариантом осуществления является антитело, названное Fab49,которое демонстрирует нейтрализующую активность против множества изолятов вируса гриппа А,экспрессирующих гемагглютинин подтипа H1, включая изоляты, полученные из животных. Кроме того, описаны антиидиотипические антитела, направленные против моноклонального антитела по изобретению, иммуногенные или вакцинные композиции, содержащие моноклональное антитело по изобретению, а также терапевтическое, профилактическое и диагностическое применение моноклонального антитела по изобретению. Моноклональное антитело по изобретению может также быть использовано для тестирования препаратов антител для применения в качестве вакцин. Изобретение в целом относится к области иммунологии. Конкретнее, изобретение имеет отношение к моноклональному антителу, направленному противH1-подтипа НА (гемагглютинин) антигена вируса гриппа А, которое способно распознавать и нейтрализовать как штаммы, выделенные из людей, так и штаммы, выделенные из животных. Вирусы гриппа способны инфицировать различные виды животных, среди которых, в частности,несколько видов птиц, свиней и лошадей. Только некоторые из этих вирусов оказались успешны в адаптации к человеку, то есть в инфицировании человека и особенно в передаче вируса от человека к человеку. Основной фактор, который делает возможной эту адаптацию, связан с особенностями наиболее важного поверхностного белка вируса-гемагглютинина. В частности, на основании антигенных свойств этого белка различают 16 подтипов (H1-H16), и только три из них (H1, H2 и H3) были успешны в адаптации к человеку, став виновниками трех больших пандемий гриппа на протяжении последнего столетия. В настоящее время среди людей циркулируют два подтипа, которые вызывают сезонные эпидемии гриппа,подтип H1 и подтип H3. Подтип H1, распознающийся антителами, которые являются целью настоящего изобретения, получил распространение среди людей в 1918 году, вызвав ужасную пандемию, называемую "испанский грипп", названную так из-за европейской страны, где было сообщено о первых случаях заболевания. Последние исследования показали, что вирус, ответственный за "испанский грипп", был птичьим вирусом, инфицировавшим птиц, который в результате нескольких мутаций приобрел способность инфицировать человека и распространяться от человека к человеку. Изолят 1918 года является общим предшественником всех вирусов подтипа H1, найденных у человека и других животных, например свиней. Вирусы подтипа H1 были виновниками ежегодной эпидемии гриппа у людей до 1957 года, на протяжении этого года они были замещены вирусом, имеющим гемагглютинин подтипа Н 2, который стал причиной так называемой "азиатской" пандемии. Далее не было описано случаев заболевания, вызванных вирусом подтипа H1, до 1977 года, в течение которого несколько изолятов H1 появились снова в России, по до сих пор не вполне понятным причинам. Так в настоящее время вирусы подтипа H1 все еще циркулируют совместно с вирусами подтипа H3, которые появились у человека с 1967 года. Например,сообщения в Европе для сезона гриппа 2007-2008 свидетельствуют, что в течение периода между 40-й неделей 2007 и 16-й неделей 2008 30% изолятов были ассоциированы с H1 подтипом гемагглютинина(European Influenza Surveillance Scheme - Weekly Electronic Bulletin, 28 апреля 2008). Ежегодная эпидемия вируса гриппа оказывает значительное влияние на службу общественного здравоохранения и на расходы, связанные с ней. В одних только Соединенных Штатах Америки оценивается, что более чем 200000 человек госпитализируются каждый год с совокупностью симптомов, связанных с вирусом гриппа, с примерно 40000 смертельных исходов, более или менее прямо связанными с ним (Thompson et al., JAMA, 2003, 289:179-186). К этим данным мы должны добавить все случаи, экспоненциально более частые, когда инфицированные субъекты не ходят на работу в течение более или менее продолжительного периода времени, что приводит к неизбежным экономическим последствиям из-за уменьшения рабочих дней. В недавней публикации (Molinari et al., Vaccine, 2007, 25: 5086-5096) медицинские расходы, напрямую связанные с ежегодными эпидемиями гриппа, были оценены в 10,4 миллиардов долларов США в год, к которым должны быть добавлены еще 16,3 миллиардов долларов США потерянного заработка из-за отсутствия на работе. Если в подсчетах рассматривать также другие факторы, такие как монетизация экономических потерь, связанных со смертью инфицированных субъектов, то количество возрастает до немыслимой суммы 8 7,1 миллиардов долларов США в год. В настоящее время единственным доступным способом в каком-то роде смело встречать эпидемию гриппа является использование инактивированной тривалентной вакцины, содержащей антигены изолятов вирусов H1- и H3-подтипов (в дополнение к изоляту B-типа), которые предположительно будут ответственны за эпидемию следующего сезона гриппа. Этот способ прогнозирования, основанный на эпидемиологических данных, связанных с ранним выделением вируса в некоторых индикаторных географических регионах, не всегда оказывается точным. Так, существует весьма не пренебрежимо малый риск,который присутствует год за годом, что тривалентная вакцина, разработанная для конкретного сезона гриппа, может оказаться, по существу, неэффективной. В этом случае, также как и в случае новой пандемии, единственным доступным профилактическим/терапевтическим средством будет обращение к двум имеющимся в распоряжении классам противовирусных лекарственным средств: ингибиторов белка M2 (амантадин и римантадин) и ингибиторов нейраминидазы (оселтамивир и занамивир). Однако также и в этой ситуации уже может ожидаться комплекс проблем, связанных как с необходимостью введения антивирусных препаратов на очень ранней стадии инфекции, так и с быстрым возникновением устойчивых изолятов вируса, которое уже однако произошло. Альтернативная эффективная стратегия могла бы быть основана на препаратах нейтрализующих антител, направленных против критических вирусных белков и способных к распознаванию частей таких белков, которые являются общими для различных изолятов вируса гриппа. Для лучшего понимания потенциала подхода, основанного на пассивном введении антител, полезно кратко упомянуть главные структурные особенности вирусов гриппа. Вирусы гриппа принадлежат семьеOrthomyxoviridae и характеризуются наличием оболочки, полученной из мембран инфицированных кле-1 022855 ток, на которой находятся приблизительно 500 выступов, также называемых выростами. Такие выросты состоят из тримеров и тетрамеров из двух важных вирусных поверхностных белков, то есть вышеупомянутого гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA), которые также используются для подтипирования вирусов типа А. Интегральный мембранный белок (M2) также найден на поверхности оболочки, этот белок присутствует в намного более низком количестве по сравнению с гемагглютинином и нейраминидазой, и он также организован в тетрамеры. Вирус гриппа дополнительно характеризуется наличием в пределах сердцевины сегментированного генома, состоящего из 8 одноцепочечных фрагментов РНК. Три известных типа вирусов гриппа различаются на основании особенностей некоторых белков в вирионе (NP и M1): тип А, тип В и тип С. Ответственными за ежегодные эпидемии являются вирусы типа А и типа В. Зато вирусы гриппа С ответственны за менее серьезные синдромы. Роль поверхностных белков важна в вирусном цикле репликации. В частности, гемагглютинин является белком, который позволяет вирусу распознавать сиаловую кислоту, представленную на поверхности некоторых клеток, и заражать их. Вместо этого нейраминидаза работает в конце вирусного цикла репликации, то есть во время высвобождения новых вирусных частиц из инфицированных клеток. Ее функцией является содействие высвобождению гемагглютинина недавно сформированных вирионов с сиаловой кислоты, находящейся на поверхности клетки, которая произвела их. Ключевая роль, играемая этими двумя белками, так же как и их наличие на поверхности вирусов, объясняет, почему они представляют собой главную цель иммунного ответа, и почему они подвержены высокому уровню мутаций. Фактически, ежегодные эпидемии вызваны вирусами, которые в большей или меньшей мере отличаются от вирусов предыдущих лет, и поэтому способны более или менее эффективно избежать иммунного ответа,который они вызвали. Другими словами, прогрессивное накопление точечных мутаций в гемагглютинине (главным образом) и нейраминидазе (во вторую очередь) делает защитные антитела, произведенные в ходе предыдущих эпидемий, в общем и целом, чаще всего неэффективными. Главную защитную роль в антигриппозном иммунном ответе играет гуморальный компонент. Антитела проявляют свою защитную роль, прежде всего препятствуя связыванию гемагглютинина с сиаловой кислотой, таким образом предотвращая инфицирование клеток. Такой селективный отбор определяет высокий показатель мутации в гемагглютинине. В пределах такой высокой изменчивости, однако, были найдены некоторые неизменные аминокислотные остатки, что указывает на их существенную роль в функции белка. Эти участки гемагглютинина представляют собой потенциальную цель для кросснейтрализующего ответа. Однако предсказуемо, что эти участки будут не в состоянии вызвать эффективный антительный ответ у большинства пациентов, так как сокрытие таких целей в иммунологических зонах молчания, конечно, означало очень благоприятный эволюционный шаг для вируса. Принимая во внимание профилактический и терапевтический аспект было бы чрезвычайно полезно получить молекулы антител, способные распознавать такие общие области в пределах одного подтипа. Такие антитела могли бы фактически представить полезный способ профилактики при введении объекту,подвергающемуся риску заражения, поскольку они смогут распознавать широкий диапазон вирусов того же самого подтипа, но эволюционно далеких друг от друга, и, таким образом, будут потенциально в состоянии защитить от большинства вирусов, принадлежащих этому подтипу, включая возможные новые вирусы, которые приобрели способность распространяться от животных к людям. Этот тип иммунитета,который теряется, когда циркулирующие изоляты демонстрируют высокий уровень мутаций по сравнению с таковыми предыдущих лет, известен как иммунитет против гриппа по гомоподтипу. Теперь авторы настоящего изобретения успешно получили моноклинальные антитела с вышеупомянутыми желательными свойствами. Таким образом, первый аспект изобретения - моноклональное антитело, направленное против вируса гриппа А, которое способно связывать множество изолятов вируса гриппа как человеческих, так и животных, которые экспрессируют гемагглютинин подтипа H1. Второй аспект изобретения - моноклональное антитело, направленное против вируса гриппа А, отличающееся тем, что имеет нейтрализующую активность против множества человеческих или животных изолятов вируса гриппа А подтипа H1. Предпочтительно, такое нейтрализующее моноклональное антитело распознает гемагтлютинин (НА) подтипа H1 вируса гриппа А в качестве антигена. Моноклональное антитело по изобретению предпочтительно является человеческим или гуманизированным. Такие антитела представляют собой чрезвычайно важное профилактическое средство, когда вводятся пациентам, подвергающимся риску заражения. Более того, применение человеческих или гуманизированных моноклональных антител у пациентов-людей является дополнительным преимуществом, поскольку человеческие или гуманизированные антитела однозначно более хорошо переносятся. Кроме того, представляя компонент человеческого антительного ответа на этот вирус, моноклональное антитело по изобретению является ключевым фактором для составления новаторских вакцин,которые способны вызывать иммунитет, который является гораздо более эффективным, протективным и имеющим широкий диапазон против вирусов подтипа H1, по сравнению с тем, что вызывается вакцинами, используемыми в настоящее время. Шаги, которые привели к получению моноклонального антитела по изобретению, подробно описаны в следующей ниже экспериментальной части, которая также иллюстрирует его связывающие и нейтрализующие свойства. Моноклональное антитело, полученное способом, подробно описаным в экспериментальной части, является человеческим антителом. Получение гуманизированных антител может быть выполнено, по существу, по любой известной методике, например, по описанной в Васа et al, 1997 J. Biol. Chem 272:10678-84 или Carter et al, 1992,Proc.Natl. Acad. Sci 89:4285. Такие библиографические ссылки представлены исключительно для иллюстрации и не для ограничения. Фактически, другие методики получения гуманизированных антител известны в области техники и могут использоваться в данном изобретении. Получение одного клона (названного INF49), способного продуцировать моноклональные антитела в форме Fab-фрагментов со свойством in vitro связывать множественные человеческие и животные изоляты вируса гриппа А подтипа H1, описано в подробностях в экспериментальной части. Моноклональные антитела, продуцируемые клоном INF49 (называемые Fab49), представляют один предпочтительный вариант осуществления изобретения, поскольку изобретатели экспериментально подтвердили, что эти антитела демонстрируют нейтрализующую активность по отношению к множественным человеческим и животным изолятам вируса гриппа А подтипа H1. Ради краткости, такая иммунологическая отличительная особенность, относящаяся к способности нейтрализовать человеческие или животные изоляты вируса гриппа А подтипа H1, будет иногда здесь называться "гомоподтип с кросснейтрализующей активностью для подтипа H1". Список последовательностей показывает аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (SEQ ID NO:1) и вариабельного домена легкой цепи (SEQ ID NO:2) Fab49 по изобретению. Он дополнительно показывает их соответствующие кодирующие нуклеотидные последовательности, называемые SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 соответственно. В частности, экспериментальная часть описывает производство Fab49 моноклональных антител в виде Fab-фрагментов. Однако подразумевается, что моноклональные антитела могут быть произведены и использованы также и в других формах, таких как, например, целые иммуноглобулины, или в форме других типов фрагментов антител, таких как, например, F(ab')2-фрагменты или фрагменты антител меньшего размера, чем Fab (например, одноцепочечные антитела, однодоменные антитела), также как и в форме пептидов длинной по крайней мере 8 аминокислот, которые имеют те же иммунологические свойства, что и Fab. Одноцепочечные антитела могут быть сконструированы в соответствии со способом, описанным в патенте США Ladner et al.4946778, включенном здесь ссылкой. Одноцепочечные антитела содержат вариабельные участки легкой и тяжелой цепей, связанные гибким линкером. Фрагмент антитела, называемый однодоменное антитело, является еще более маленьким, чем одноцепочечное антитело, поскольку он включает только один отдельный VH домен. В известном уровне техники описаны методики получения однодоменных антител, имеющих, по крайней мере частично, ту же связывающую способность,что и целое антитело. Ward, et al., в "Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin VariableDomains Secreted from Escheria coli," Nature 341:644-646, описывает способ скрининга для получения вариабельного участка тяжелой цепи антитела (антитело с одним доменом VH) с удовлетворительной афинностью к целевому эпитопу для связывания с ним в изолированной форме. В нижеследующем описании термин "антитело" будет использоваться по отношению ко всем вариантам осуществления, упомянутым ранее, включая целые иммуноглобулины, одноцепочечные антитела,однодоменные антитела и так далее. Моноклональные антитела по изобретению могут быть произведены и использоваться в свободной форме или в форме конъюгата с носителем. Носитель является любой молекулой или химическим или биологическим объектом, способным к конъюгации с антителом и делающим его иммуногенным или повышающим его иммуногенность. Неограничивающими примерами носителей являются белки, такие как KLH (гемоцианин лимфы улитки), эдестин, тироглобулин, альбумины, такие как бычий сывороточный альбумин (BSA) или человеческий альбумин сыворотки (HSA), эритроциты, такие как эритроциты овцы (SRBC), столбнячный анатоксин, анатоксин холеры, полиаминокислоты, такие как, например, поли(D-лизин:D-глютаминовая кислота) и так далее. В целях облегчения связывания антитела и носителя может быть модифицирован С-конец или N-конец антитела, например, путем вставки дополнительных остатков аминокислот, например, одного или более остатков цистеина, которые могут формировать дисульфидные мостики. Из-за его характерных особенностей, которые будут более подробно описаны в экспериментальной части, которая следует на основании Fab49, моноклональное антитело по изобретению особенно пригодно для медицинского применения, особенно в изготовлении лекарственных средств для широкого спектра профилактических или терапевтических мер против заболеваний, вызванных подтипом H1 вируса гриппа А. Таким образом, использование моноклонального антитела по изобретению для изготовления лекар-3 022855 ственного средства профилактического или терапевтического лечения патологий, вызванных инфицированием подтипом H1 вируса гриппа А, таких как, например, синдром гриппа, подпадает в границы изобретения. В этом контексте также выражение "антитело Fab49" относится не только к Fab-фрагментам, но и к любой другой форме, в которой может быть приготовлено антитело, например, целые иммуноглобулины,другие виды фрагментов антител, одноцепочечные антитела и так далее. Как описано подробно в экспериментальной части, настоящее моноклональное антитело было получено с использованием молекулярнобиологических техник, начиная с EBV-трансформированных человеческих лимфоцитов, способных продуцировать человеческие кросс-реактивные моноклональные антитела, таким образом способные распознавать клеточные лизаты MDCK (клетки почки собаки Мадин-Дарби) (АТССCCL-34TM), зараженные несколькими человеческими референсными изолятами вируса гриппа А, как упомянуто здесь ниже, которые экспрессируют гемагглютинин подтипа H1:(АТССVR- 98). Антитело, о котором идет речь, также оказалось способным распознавать клеточные лизаты NSK (клетки почки свиньи Ньюборн) (Istituto Zooprofilattico di Brescia), зараженные полученным из животных "полевым" изолятом и, в особенности, полученным из свиньи (SW1), о чем свидетельствует последовательность фрагмента НА 2 подтипа H1 гемагглютинина, экспрессируемого им (SEQID NO:5). Следующей особенно выгодной характерной особенностью моноклонального антитела по изобретению является его способность связывать рекомбинантный НА белок из изолята вируса гриппаA/California/04/2009, недавно идентифицированного как один из изолятов, ответственных за так называемый "свиной грипп", официально называемый WHO "новый грипп". Анализ связывания, проведенный для рекомбинантного НА белка из изолята A/California/04/2009 и рекомбинантного НА белка из изолята A/PR/08/1934, использованного в качестве положительного контроля, описан в нижеследующей экспериментальной части. Анализы показали, что моноклональное антитело Fab49 по изобретению способно связывать оба рекомбинантных НА белка. Проведенные анализы также показали, что моноклональное антитело Fab49 способно нейтрализовать НА белковые псевдочастицы из обоих вышеуказанных изолятов вируса гриппа. В нижеследующей экспериментальной части описаны конкретные способы, использованные для получения трансформированных В-клеточных линий из периферической крови пациентов. Также описаны способы, использованные для клонирования генов, кодирующих Fd участок тяжелой и легкой цепи Fab49 антитела по изобретению, так же, как и способы для их рекомбинантной продукции, как в виде одиночных пептидов, так и в виде Fab-фрагментов. Способности моноклонального антитела по изобретению реагировать с клетками, зараженными различными человеческими и животными изолятами подтипа H1 вируса гриппа А, были проверены методом ELISA и иммунофлюоресценцией. Кроме того, с целью подтверждения in vitro биологической активности антитела был проведен нейтрализационный анализ. В этом анализе антитело Fab49 показало гомоподтип кросс-нейтрализующую активность против человеческих и животных тип А и подтип H1 вирусных изолятов, как обозначено выше. Полученные данные означают, что антитело по изобретению является потенциально эффективным в наделении объекта, которому оно введено в одной из описанных форм, пассивным иммунитетом по отношению к вирусам гриппа А подтипа H1, и свидетельствуют о его применимости в широком спектре профилактических и терапевтических мер для лечения патологий, вызванных заражением вирусом гриппа А подтипа H1, таких как, например, синдром гриппа. Так, еще одним аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество моноклонального антитела по изобретению в качестве действующего вещества, и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель. Эффективное количество - это то количество, которое способно вызвать благоприятный эффект у субъекта, которому введена композиция, например, нейтрализовать вирус гриппа А подтипа H1. В этом контексте термин "субъект" означает любой животный-хозяин, которому может быть введена композиция, включая людей. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей, годных к употреблению в фармацевтической композиции по изобретению, включают стабилизаторы, такие какSPGA, углеводы (например, сорбитол, маннитол, крахмал, сахароза, глюкоза, декстран), белки, такие как альбумин или казеин, белоксодержащие вещества, такие как бычья сыворотка или сухое молоко, и буферные растворы (например, фосфатный буфер). Моноклональное антитело по изобретению может также успешно применяться в качестве диагностического реактива для in vitro способа обнаружения антител против вируса гриппа А подтипа H1 с идентичными или подобными нейтрализующими свойствами в биологическом образце, ранее полученном от пациента (таком как, например, сыворотка, плазма, образец крови или любой другой подходящий биологический материал)."Антитела против вируса гриппа А с идентичными или подобными нейтрализующими свойствами" являются антителами, которые проявляют гомоподтип с кросс-нейтрализующей активностью против человеческого или животного вируса гриппа А подтипа H1. Эти антитела могут быть найдены в биологическом образце от пациента (или животного) как результат предшествующего воздействия вируса гриппа А, или потому, что пациенту ранее были введены моноклональные антитела по изобретению в целях терапии, профилактики или исследования. Способ определения наличия в биологическом образце, ранее полученном от пациента или животного-хозяина, антител против вируса гриппа А, имеющих гомоподтип с кросс-нейтрализующей активностью по отношению к подтипу H1, включающий контактирование упомянутого биологического образца с моноклональным антителом по изобретению в качестве специфического реагента, включен, таким образом, в объем изобретения. Способ может быть качественным или количественным. Обнаружение или определение количества антител против вируса гриппа А подтипа H1, имеющих гомоподтип с кросс-нейтрализующей активностью, может быть проведено, например, способом конкурентного ELISA анализа. Так, диагностический набор, содержащий моноклональное антитело по изобретению в качестве специфического реагента, также находится в объеме изобретения, упомянутый набор разработан в том числе для обнаружения или определения количества антител против вируса гриппа А, имеющих гомоподтип с кросснейтрализующей активностью по отношению к подтипу H1 вируса гриппа А, в биологическом образце,ранее полученном от пациента или животного-хозяина. Подобным образом моноклональное антитело по изобретению может быть использовано в качестве специфического реагента в способе обнаружения или определения количества эпитопов в ранее приготовленных иммуногенных или вакцинных композициях, способных индуцировать у объекта, которому такая композиция была введена, антитела против подтипа H1 вируса гриппа А, имеющих нейтрализующие свойства, идентичные или сходные со свойствами моноклонального антитела по изобретению, а именно кросс-нейтрализующую активность по отношению к подтипу H1 вируса гриппа А. Прогнозируется, что такой способ будет очень полезен для оценки любого препарата для использования в качестве вакцины или иммуногенного препарата, поскольку распознавание моноклонального антитела по изобретению может быть индикатором наличия в иммуногенном препарате и/или вакцине одного или более эпитопов, способных стимулировать выработку клонов антител, способных распознавать предпочтительный эпитоп, такой как, например, эпитоп, способный вызывать иммунитет по подтипу против подтипа H1 вируса гриппа А. В заключение, моноклинальные антитела по изобретению могут быть использованы для получения антиидиотипических антител в соответствии с известными, по существу, способами. Антиидиотипические антитела являются антителами, которые специфически направлены против идиотипа большого числа нейтрализующих антител, использованных для их получения, и таким образом способны имитировать основные эпитопы, которые они распознают. Антиидиотипические антитела, направленные против моноклонального антитела по изобретению,таким образом, являются включенными в объем изобретения. Следующая экспериментальная часть приведена исключительно с иллюстративной, а не ограничивающей, целью. Экспериментальная часть Отбор пациентов. Пациенты, участвующие в исследовании, были отобраны таким образом, чтобы увеличить шансы клонирования кросс-реактивных антител против гриппа, которые являются антителами, способными распознавать и потенциально нейтрализовать различные изоляты вируса гриппа. В частности, описано,что некоторые особи не заражаются этим заболеванием, несмотря на продолжительную экспозицию вирусу гриппа (иногда по профессиональным причинам, такие как терапевты, педиатры, люди, работающие в детских садах и школах). По этой причине они считались наилучшими кандидатами для получения человеческих моноклональных антител. А именно, были соблюдены нижеперечисленные критерии: возраст между 25 и 55 годами; недавняя медицинская история по патологиям, отрицательная по клиническому комплексу симптомов гриппа в течение десяти лет, предшествующих исследованию,титр антител против H1N1-подтипа вирусных изолятов, ответственных за ежегодные эпидемии в течение пяти лет, предшествующих исследованию, более чем 1:1000; детектируемый нейтрализующий титр (IC50=1:20) против двух человеческих референсных изолятов H1N1-подтипа вируса А (A/Puerto Rico/8/34; A/Malaya/302/54); отсутствие предшествующей вакцинации против гриппа; согласие подвергнуться вакцинации против гриппа. В момент вакцинации и примерно 3 недели после вакцинации примерно 20 мл крови было забрано у каждого пациента в гепаринизированные тест-пробирки. Культура референсных вирусных изолятов. В качестве клеточной линии использовались MDCK (клетки почки собаки Мадин-Дарби) клетки(АТССCCL-34TM), культивируемые в Модифицированной Среде Игла (MEM) (GIBCO), дополненной 10% инактивированной (прогретой при 56 С в течение 30 мин) эмбриональной телячьей сывороткой(EuroClone). В случае свиного изолята SW1 (однозначно охарактеризованного последовательностью НА 2 области, прикрепленной к патентной заявке) взамен были использованы клетки NSK (клетки почки свиньи Ньюборн, Istituto Zooprofilattico di Brescia), которые были культивированы тем же образом. Клетки инкубировались при 37 С в атмосфере 5% СО 2 и пассажировались в соотношении 1:3 дважды в неделю. Для экспериментов, описанных в этой патентной заявке, были использованы следующие H1N1-подтипы изолятов вируса гриппа: штамм A/Puerto Rico/8/34 (АТССVR-1469TM); штамм A/Wilson-Smith/33(АТССVR-1520) и штамм А/Ма 1 ауа/302/54 (АТССVR-98). Что касается подтипа H1N1, то также использовался изолят, выделенный из свиньи (SW1), охарактеризованный на основании последовательности части гемагглютинина НА 2 (SEQ ID NO:5). Также использовались три других референсных вирусных изолята, два из которых относятся к типу А подтипа H3N2 (A/Port Chalmers/1/73 - АТССVR-810 и A/Aichi/2/68 - АТССVR-547), и один относится к типу В (B/Lee/40 - АТССVR-101). В качестве ростовой среды для наращивания вируса использовалась MEM, дополненная 1 мкг/мл бессывороточного трипсина (SIGMA). Вирусные стоки были получены из культурального супернатанта как экстраклеточные вирусы. Коротко говоря, после инфицирования клеток монослой осматривали ежедневно с целью обнаружения возникшего цитопатического эффекта. Обычно супернатант собирали на 4 день после инфицирования, центрифугировали при 1000 RCF (относительная центробежная сила) в течение 10 минут для удаления клеточного дебриса и отфильтровывали через 0,22 мкм фильтры (MILLIPORE). Затем супернатант распределяли аликвотами и хранили при -80 С как свободные от клеток вирусы. Отбор моноклинальных антител против вируса гриппа из В-лимфоцитов периферической крови. Продуцирование моноклональных антител из пациентов осуществлялось путем применения способа трансформации посредством инфицирования вирусом Эпштейна-Барр (EBV), ранее описанным в Coleet al, 1984 Cancer Research 22:2750-2753. Супернатант из различных полученных клонов был проверен на наличие антител методом ELISA. Клоны, способные продуцировать IgG антитела в супернатант, которые показали способность реагировать в ELISA против клеточных лизатов, инфицированных вышеперечисленными тремя человеческими изолятами и свиным изолятом SW1 подтипа H1N1, но не против тех, которые были инфицированы двумя изолятами подтипа H3N2 и изолятом В, были отобраны для последующей характеризации. В частности, клетки MDCK были инфицированы вышеупомянутыми изолятами с высоким уровнем множественности заражения. Спустя примерно 48 ч после инфицирования клетки были откреплены от флакона и дважды промыты в PBS. Затем клеточные осадки были ресуспендированы в 300 мкл раствора для лизиса (100 мМ NaCl, 100 мМ Tris pH 8 и 0,5% Triton-X) и инкубированы на льду в течение 20 мин. Клеточный дебрис был отцентрифугирован при 10000g в течение 5 мин, и супернатант хранился при -20 С как белковый экстракт. Для приготовления контрольного антигена неинфицированные клетки были обработаны тем же способом. Концентрация белка в супернатанте была определена в двух параллелях с использованием набора ВСА Protein Assay Kit (Pierce). Коротко говоря,количество белка в образце было определено по стандартной калибровочной кривой, полученной для серии разведений с известной концентрацией бычьего сывороточного альбумина (BSA). Коэффициент адсорбции для каждого образца был измерен на спектрофотометре при длине волны 540 нм. Таким образом полученные лизаты затем были использованы (300 нг на лунку) для покрытияELISA плашки (COSTAR), которая была инкубирована при 4 С в течение ночи. На следующий день чашка была промыта дистиллированной водой и заблокирована PBS/1% BSA (Sigma) в течение 45 мин при 37 С. Затем в каждую лунку были добавлены 40 мкл супернатанта из каждого клона, которые были инкубированы в течение 1 ч при 37 С. После 5 отмывок (WASHER ETI-SYSTEM, DiaSorin) с PBS/0,5%Tween-20 (Sigma) в каждую лунку было добавлено по 40 мкл пероксидаза-конъюгированного античеловеческого Fc (1:4000 в PBS/1% BSA, Sigma), и плашка была инкубирована в течение 1 ч при 37 С. После еще 5 промывок с PBS/0,5% Tween-20 в каждую лунку было добавлено 40 мкл ТМВ субстрата для пероксидазы (Pierce). Примерно через 15 минут ферментативная активность была заблокирована путем добавления 40 мкл H2SO4, и сигнал был измерен на спектрофотометре, установленном на 450 нм. В частности, один клон (называемый cINF49) оказался способным продуцировать антитела, способные распознавать специфическим образом все лизаты, полученные из клеток, инфицированных различными изолятами подтипа H1N1, включая животные изоляты. Зато в культурах, инфицированных двумя вирусами подтипа H3N2, и в культурах, инфицированных В изолятом, детектируемого сигнала не было. Выделение Fab-фрагментов из клона cINF49. Гены, кодирующие цепи Fab49, были клонированы в прокариотический экспрессионный вектор. Это позволяет избежать проблем из-за нестабильности клеточных клонов, продуцирующих антитела, лучше охарактеризовать кодирующие гены с молекулярной точки зрения, с целью получения в распоряжение молекул, которые являются заведомо моноклональными, а также и возросших количеств собственно антител. Матричная РНК (мРНК) была экстрагирована из культивируемого клона cINF49 и обратно транс-6 022855 крибирована с использованием олиго-dT в соответствии с известными в области техники способами. Затем кДНК, кодирующие легкую цепь и Fd фрагмент (то есть вариабельный участок и часть константного участка, находящуюся внутри Fab-фрагмента), были амплифицированы описанными способами (CSHpress, Phage display manual, ed. D.R.Burton, p. Al.6). Полученные таким образом кДНК были затем клонированы в известный, по существу, вектор, называемый RBCaf (Burioni et al, J. Imm. Meth, 1988). Коротко говоря, ген (амплифицированная ДНК), кодирующий Fd участок тяжелой цепи, был подвержен расщеплению рестрикционными ферментами Xhol и Spel (Roche) в течение 1,5 ч при 37 С и в дальнейшем вставлен в сайт клонирования вектора для тяжелых цепей, в свою очередь, ращепленный теми же ферментами. Легкая цепь (амплифицированная ДНК) была подвержена расщеплению ферментами Sacl иXbal (Roche) и клонирована в вектор, расщепленный таким же образом. Полученный таким образом рекомбинантный конструкт был использован для электротрансформации Е. coli штамма XL1 Blue (сделанного компетентным путем промывок в холодном глицероле), в соответствии со стандартизированными протоколами для использования с 0,2 см кюветами (напряжение: 2500 В; емкость: 25 мкФ; сопротивление: 200 Ом). Параллельно были проанализированы последовательности ДНК вариабельного участка легкой цепи и вариабельного участка тяжелой цепи. Эти последовательности предоставлены в Списке Последовательностей. Молекулярный анализ мутационного паттерна показал картину, могущую быть приписанной антиген-индуцированному процессу соматических мутаций. Оценка способом ELISA Fab49, полученного путем клонирования в RBCaf. 40 рекомбинантных бактериальных клонов, трансформированных Fab49 конструктом, были проанализированы на ELISA с использованием неочищенных лизатов, полученных после того, как культуры подвергли тепловому шоку. Более подробно, клоны бактерий, трансформированные конструктом, были инокулированы в 10 мл ростовой среды SB, содержащей ампициллин и тетрациклин в концентрациях 50 мкг/мл и 10 мкг/мл соответственно, и выращивались при встряхивании при 37 С до достижения O.D.600= 1. В дальнейшем был добавлен специфический индуктор (IPTG -изопропилD-тиогалатопиранозид) до конечной концентрации 1 мМ, и культура была оставлена на ночь при 30 С и встряхивании. Клетки были лизированы тепловым шоком (3 цикла замораживания/оттаивания, при -80 С и 37 С соответственно) и затем центрифугированы для отделения клеточного дебриса от Fab-содержащего супернатанта. Полученные растворимые Fab были оценены способом ELISA. 96-луночные титрационные микропланшеты (Nunc) были покрыты лизатами из клеток, зараженных вышеописанными изолятами. Лизаты, полученные из неинфицированных клеток, были использованы в качестве отрицательного контроля. ELISA плашки, покрытые 300 нг лизатов, полученных как описано, были затем оставлены при 4 С на ночь. На следующий день, после удаления несвязавшегося антигена, планшеты были промыты 5 раз PBS, и неспецифические сайты связывания были заблокированы раствором 3% альбумина в PBS в течение 1 ч при 37 С. После удаления блокирующего раствора туда были добавлены супернатанты клеточных культур,приготовленные как описано выше и содержащие растворимые Fab. За этим последовал шаг инкубации при 37 С в течение 2 ч. После 10 отмывочных циклов в PBS/0,05% Tween 20 в лунки было добавлено по 40 мкл разведения в пропорции 1:700 препарата коньюгированных с пероксидазой хрена поликлональных иммуноглобулинов козы (Sigma) против Fab человека в PBS/1% BSA. После 10-часовой инкубации при 37 С и последующей серии из 10 отмывок в лунки был добавлен субстрат (OPD-o-фенилендиамин). Затем планшеты были инкубированы 30 мин при комнатной температуре в темноте. Реакция была остановлена IN серной кислотой, и определена оптическая плотность путем считывания на спектрофотометре при 450 нм. Все проанализированные клоны показали специфическую активность по отношению ко всем лизатам, полученным из клеток, зараженных вирусами подтипа H1N1. Таким образом был отобран один бактериальный клон, трансформированный экспрессионным вектором, содержащим гены легкой цепи и Fd фрагмента тяжелой цепи Fab49. отобранный бактериальный клон был назван INF49. Очистка Fab49 и его оценка способом ELISA в лиэатах зараженных клеток Fab, продуцируемый клоном INF49 (с этого места и далее именуемый равнозначно "клон" либо "Fab"), был, таким образом,очищен способом иммуноаффинной очистки на колонках, состоящих из сефарозной смолы, содержащей протеин G (2 мг/мл), с которой был ковалентно связан препарат поликлональных антител козы, способных связывать человеческие Fab (PIERCE, Illinois). Коротко говоря, одна колония клона INF49 была инокулирована в 10 мл ростовой среды SB, содержащей ампициллин и тетрациклин в концентрациях 50 мкг/мл и 10 мкг/мл соответственно. Культура, которая выращивались при 37 С, была снова инокулирована во флакон с 500 мл среды SB с теми же концентрациями антибиотиков, как и прежде. Клетки, в дальнейшем индуцированные 1 мМ IPTG, были оставлены на ночь при 30 С и встряхивании. Культура затем была отцентрифугирована при 5000 об/мин в течение 25 мин, и ресуспендированый в PBS осадок был обработан ультразвуком. Дополнительное центрифугирование при 18000 об/мин в течение 25 мин было необходимо в целях удаления клеточного дебриса. Супернатант был профильтрован и затем медленно пропущен через вышеописанную сефарозную колонку. После этого смола была промыта 10 объемами PBS, и наконец связавшиеся Fab были элюированы кислым раствором (буфер для элюции Н 2 О/HCl,рН 2,2). Несколько собранных фракций были нейтрализованы подходящим раствором (1 М Tris, рН 9) и сконцентрированы ультрацентрифугированием (Centricon, Millipore). Чистота выделенного Fab была оценена на электрофорезе аликвоты в 12% полиакриламид/додецилсульфат натрия геле (SDS-PAGE). В заключение, последовательные разведения очищенного Fab были оценены способом ELISA, как описано. На каждой планшете в качестве отрицательных контролей содержались препараты моноклональных Fab против HCV E2 гликопротеина. Результаты этого эксперимента подтвердили ранее полученные результаты с бактериальными лизатами, подтверждающими специфическую реактивность клонов по отношению к клеткам, зараженным вирусами подтипа H1N1. Иммунофлуоресцентная оценка Fab49, полученного при клонировании в RBCaf. В целях подтверждения данных, полученных на ELISA, Fab49 также был проанализирован способом иммунофлуоресцентного анализа. Коротко, клетки из культур, зараженных всеми упомянутыми референсными вирусами, были трипсинизированы и, после двух отмывок в PBS, подсчитаны под микроскопом с помощью гемацитометра. Суспензия клеток была использована для приготовления предметных стекол при центрифугировании в цитоцентрифуге (Cytospin4, Shandon Southern Products) при 90g в течение 3 мин. Таким образом приготовленные предметные стекла - каждое содержало всего 2105 клеток. Контрольные предметные стекла были приготовленны тем же образом с незараженными клетками. Затем клетки были зафиксированы и пермеабилизированы при комнатной температуре в метанол-ацетоновом растворе (использовавшемся при температуре -20 С) в течение 10 мин. После 3 отмывок в PBS клетки были инкубированы с Fab49 (100 мкг/мл) в течение 30 мин при 37 С во влажной камере и последовательно отмыты три раза в PBS. Затем клетки были проинкубированы с флуоресцеин-изотиоцианат-коньюгированными Fab козы(Sigma), разведенными 1:200 в Evans Blue, в течение 30 мин при 37 С в темноте во влажной камере. Предметные стекла были исследованы под флуоресцентным микроскопом (Olympus). Коммерчески доступные мышиные моноклональные антитела (Argene), специфические для белка M1 вируса гриппа, были использованы в качестве положительного контроля. Антитела, направленные против Е 2 гликопротеина вируса гепатита С (е 509; Burioni et al, Hepatology, 1998), были использованы в качестве отрицательного контроля. На иммунофлуоресценции Fab49 показал специфическую реактивность для всех клеток, зараженных человеческими изолятами H1N1 подтипа, а именно изолят A/Puerto Rico/8/34, изолят A/WilsonSmith/33 и изолят А/Malaya/302/54. Тот же результат был получен для клеток, зараженных свиным изолятом SW1, использованным в исследовании. Продемонстрированный паттерн флуоресценции был однозначно паттерном цитоплазматического типа. Зато для незараженных клеток, клеток, зараженных вирусом подтипа H3N2, и клеток, зараженных изолятом типа В, флуоресценции не наблюдалось, также, как и для антител отрицательного контроля. Анализ нейтрализации. Чтобы охарактеризовать in vitro биологическую активность отобранных клонов для некоторых референсных вирусных изолятов, использованых в исследовании, был разработан анализ нейтрализации. Вкратце, клетки MDCK (NSK в случае свиного изолята SW1) были высеяны в MEM - 10% FBS на 96 луночную планшету (210 клеток/лунку). Были приготовлены последовательные разведения (от 10-1 до 10-8) исходного вирусного материала, полученного как описано выше, в поддерживающей среде (MEM с 2% FBS). Каждое разведение было приготовлено 6 раз. Когда культивируемые клетки достигли конфлюентности, ростовая среда была удалена, и в каждую лунку было добавлено по 100 мкл каждого разведения вируса. После инкубации в течение 1 ч при 37 С инокулят был удален, и в каждую лунку было добавлено по 200 мкл MEM среды с добавленным 1 мкг/мл трипсином. Вирусный титр, выраженный черезTCID50 (доза, которая заражает 50% клеточной культуры), был вычислен по формуле Reed-Muench: В свете полученных данных исходный вирусный материал был разведен таким образом, чтобы множественность заражения (M.O.I.) в нейтрализационном эксперименте составила примерно 0,01 (1 вирусная частица на 100 клеток). В фактическом анализе нейтрализации клетки были высеяны на 24 луночную чашку, каждая лунка которой содержала стерильное предметное стекло. Эксперимент по нейтрализации был проведен при конфлюентности клеток 80-90%, то есть спустя примерно 48 ч после их высевания. Затем были приготовлены разведения очищенного Fab49 таким образом, что финальные концентрации составили 1, 5, 10 и 20 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля были приготовлены соответствующие разведения е 509 против-HCV антител. Различные концентрации Fab были затем инкубированы с тем же объемом разведенного исходного вирусного материала (M.O.I.: 0,01) в течение 1 ч при 37 С. Следующим шагом 250 мкл смеси вирус-Fab были добавлены в лунки, содержащие клетки. Положительный контроль инфецирования был достигнут путем добавки в культуральную среду исходного вирусного материала самого по себе. Планшету инкубировали в течение 1 ч при 37 С, чтобы позволить не-нейтрализованному вирусу адсорбироваться. Затем инокулят был удален, и клетки дважды отмыты вPBS. В каждую лунку было добавлено 1,5 мл бессывороточной среды с 1 мкг/мл трипсина. После инкубации в течение 6 ч при 37 С клеточный монослой был промыт PBS и зафиксирован холодным раствором метанол-ацетон (соотношение 1:2, хранить при -20 С) в течение 10 мин при комнатной температуре. Зафиксированные клетки были промыты и проинкубированы с 250 мкл коммерчески доступных моно-8 022855 клональных против-М 1 антител (Argene) в течение 30 мин при 37 С во влажной камере. Клетки были промыты PBS и в заключение проинкубированы с флуоресцеин-изотиоцианат-коньюгированными антителами козы против мыши, разведенными в Evans Blue, в течение 30 мин при 37 С в темноте во влажной камере. После 3 отмывок в PBS предметные стекла были исследованы под флуоресцентным микроскопом. Нейтрализующая активность Fab49 была определена путем подсчета единичных положительных клеток и вычисления процентного уменьшения инфицированных клеток по сравнению с положительным контролем, зараженнным одним только вирусом. Нейтрализационный анализ проводился в трех независимых сессиях для каждого изолята, использованного в нейтрализационном анализе (см. фиг. 1-3). В каждом эксперименте различные разведения Fab49 были в трех повторах, также как и отрицательный (FabFab, продуцируемый клоном INF49, показал гомотип с кросс-нейтрализующей активностью против человеческих и животных изолятов подтипа H1N1 вируса А. Напротив, для двух вирусов подтипа H3N2 и вируса типа В, использованных в исследовании, не было детектировано какого-либо снижения в способности инфицировать, что подтверждает специфичность гомоподтип-нейтрализующей активности,наблюдаемой для подтипа H1N1. В частности, Fab, продуцируемый клоном INF49 (названный Fab49),показал IC50 (концентрация Fab, которая при анализе ингибирует 50% инфицирования вирусным изолятом) ниже 5 мкг/мл для каждого проанализированного изолята подтипа H1N1, то есть концентрацию,которую легко можно получить in vivo путем введения молекул, представляющих интерес, не принимая во внимание обычно значительное увеличение нейтрализации биологической активности, наблюдаемое в случае превращения Fabs в форму целого иммуноглобулина, одна из возможных фармацевтических формулировок включена в объем этого изобретения. Фиг. 1-3 суммируют результаты, полученные для Fab, продуцируемого клоном INF49, в разных нейтрализационных сессиях, проведенных для различных изолятов вирусов гриппа подтипа H1N1, использованных в исследовании. Подробно, фиг. 1 является графиком, который иллюстрирует процент нейтрализации вирусаA/Puerto Rico/8/34 различными концентрациями Fab49. Результаты, полученные с человеческим е 509 против-HCV Fab, представлены в качестве отрицательного контроля. Фиг. 2 является графиком, который иллюстрирует процент нейтрализации изолята A/WilsonSmith/33 различными концентрациями Fab49. Результаты, полученные с человеческим е 509 против-HCVFab, представлены в качестве отрицательного контроля. Фиг. 3 иллюстрирует процент нейтрализации полевого свиного изолята SW1, используемого здесь,различными концентрациями Fab49. Результаты, полученные с человеческим е 509 против-HCV Fab,представлены в качестве отрицательного контроля. Характеризация антигена, распознаваемого Fab49. Вестерн-блот для лизатов из зараженных клеток 10 мкг лизата клеток, зараженных изолятомA/Puerto Rico/8/34, проготовленные как описано ранее, были разогнаны в обычных условиях в 10% полиакриламидном геле. При этом образцы разгонялись при 100 В в течение 1 ч в хорошо охлаждаемом резервуаре (BIORAD). После этого гель был вынут из аппарата для электрофореза и инкубирован 10 мин в буфере для переноса (Tris-основание 3 г; глицин 14,41 г, dH2O 800 мл, метанол 200 мл) в целью удаления остатков детергента. Затем был проведен перенос на нироцеллюлозную мембрану (Hybond-ECL; Amersham Biosciences) в течение ночи при 30 В и 90 мА. Затем мембрану блокировали в течение 1 ч в 5% растворе сухого молока в 1 PBS и после этого отмывали 3 раза в 1 PBS-0,1% Tween. В течение каждой отмывки мембрану встряхивали 10 мин на качающейся платформе. После этого различные Fabs, разведенные в PBS с 5% сухим молоком, были добавлены в концентрации 5 мкг/мл. Кроме Fab49, были добавлены следующие контроли: е 509 в качестве отрицательного контроля; коммерчески доступные мышиные против-НА целые IgG1 (COVANCE); коммерчески доступные мышиные против-М 1 целые IgG1(ARGENE); мышиные против-M2 целые IgG1 (ABCAM); человеческая сыворотка, разведенная 1:200. Каждое антитело встряхивали в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого мембрану снова отмывали в PBS, как описано выше. Те же самые вторичные мышиные (1:1000) или человеческие(1:2000) антитела, которые описаны для способа ELISA, были добавлены, в зависимости от источника антител, подлежащих детекции. Для детекции сигнала был приготовлен рабочий раствор путем смешивания двух субстратов SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce) в соотношении 1:1 так, чтобы избежать экспозиции источникам света. Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали 5 мин с рабочим раствором и затем, удалив раствор, помещали в HyperCassette (AMERSHAM). После необходимого времени экспозиции пленку Kodak проявляли в темной комнате. Этот описанный анализ был проведен в двух независимых сессиях, и в каждой из них часть мембраны, инкубированная с Fab49, показала наличие полосы с молекулярным весом слегка меньше 80 кДа, что согласуется с весом незрелой формы вирусного гемагглютинина (НАО). Это было подтверждено появление той же полосы на части мембраны, инкубированной с анти-гемагглютинин контрольными антителами. Аналогичная полоса, более интенсивная, чем другие, была также детектирована на части мембраны, которая инкубировалась человеческой сывороткой. Результат этого эксперимента показывает, что антитело направлено против гемагглю-9 022855 тинина вируса гриппа, что полностью согласуется с данными нейтрализации, поскольку гемагглютинин известен в качестве основной мишени гуморального нейтрализующего ответа. Анализы связывания и нейтрализации для НА из подтипа вируса A (H1N1) (свиной грипп). Белки НА вирусов гриппа A/PR/08/1934 и A/California/04/2009 были амплифицированы, соответственно, из супернатанта зараженных клеток MDCK или синтезированы in vitro (GenART, Ragensburg,Germany) и клонированы в экспрессионные вектора pcDNA3.1 (Invitrogen), посредством этого были получены один конструкт H1 НА (A/PR/08/1934) и один конструкт H1 НА (A/California/04/2009). Последовательности кДНК и аминокислот белков НА двух вышеуказанных изолятов представлены в списке последовательностей как SEQ ID No: 6 (последовательность кДНК белка НА из A/PR/08/1934),SEQ ID No: 7 (аминокислотная последовательность кДНК белка НА из A/PR/08/1934), SEQ ID No: 8 (последовательность кДНК белка НА из A/California/04/2009) и SEQ ID NO: 9 (аминокислотная последовательность кДНК белка НА из A/California/04/2009), соответственно. Клетки 293 Т эпителия почки человека (НЕК) были трансфицированы 3 мкг рекомбинантного вектора pcDNA3.1, содержащего конструкт H1 НА (A/PR/08/1934) или конструкт H1 НА(A/California/04/2009). После центрифугирования и фиксации трансфицированные клетки были проинкубированы с Fab49 (10 мкг/мл). После дальнейших отмывок клетки были проинкубированы с FITCконьюгированными человеческими моноклональными антителами против-Fab и проанализированы методом FACS. Данные были обработаны, как описано в Perotti et al., J Virology, 2008 Jan;82(2): 1047-52. Эксперимент продемонстрировал, что Fab49 распознает клетки 293 Т, трансфицированные любым из этих рекомбинантных векторов. Для нейтрализационного анализа ретровирусные векторы, модифицированные для обеспечения экспрессии НА белков гриппа на их перикапсиде (псевдотипирование), включая репортерный ген Luc,были произведены клетками 293 Т, котрансфецированными FuGene 6 (Roche) и следующими плазмидами: система Luc (5 мкг PCMVAR8.2 и 5,5 мкг pHR'CMV-Luc) плюс 3 мкг конструкта H1 НА(A/PR/08/1934) или H1 НА (A/California/04/2009). Спустя 48 ч после трансфекции супернатанты были собраны, профильтрованы через 0,45 мкм фильтры с низким связыванием белков и немедленно заморожены на -80 С. Титры НА псевдо-типов были измерены на клетках 293 Т и MDCK. Коротко, 48 ч после заражения клеток 100 мкл лентивирусного Luc НА-псевдотипированного вектора (HA-Luc) в различных разведениях клетки были лизированы на 96-луночной планшете в буфере для лизиса для Luc-анализа(luciferase assay reagent, Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Титры псевдо-типов были выражены в относительных единицах люминесценции (RLU/ml). Нейтрализационная активность Fab49 была протестирована в нейтрализационном анализе, основанном на псевдо-частицах гриппа. Этот способ показал, что Fab49 имеет сильную нейтрализационную активность по отношению ко всем псевдочастицам вируса гриппа, полученным с двумя изолятами подтипа H1N1 (A/PR/08/1934 и H1 НА (A/California/04/2009), с [IC50] примерно 2 мкг/мл. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Моноклональное антитело человека, направленное против вируса гриппа А, которое распознает в качестве антигена гемагглютинин и имеет нейтрализующую активность против множества изолятов вируса гриппа А подтипа H1,отличающееся тем, что представляет собой моноклональное антитело человека, содержащее по меньшей мере один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи, где вариабельный домен тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, а вариабельный домен легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, или вариабельный домен тяжелой цепи кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:3, а вариабельный домен легкой цепи кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:4. 2. Моноклональное антитело человека по п.1, где указанное множество изолятов вируса гриппа А подтипа H1 содержит по крайней мере один изолят, выделенный у человека, и один изолят, выделенный у животного. 3. Моноклональное антитело человека по п.1, где указанное множество изолятов вируса гриппа А подтипа H1 содержит, по крайней мере, следующие изоляты: A/Puerto Rico/8/34, A/Wilson-Smith/33 иA/Malaya/302/54. 4. Моноклональное антитело человека по п.1, где указанное множество изолятов вируса гриппа А подтипа H1 содержит, по крайней мере, следующие изоляты: A/Puerto Rico/8/34, A/Wilson-Smith/33,A/Malaya/302/54 и A/California/04/2009. 5. Моноклональное антитело человека по любому из пп.1-4, выбранное из группы, состоящей из целых иммуноглобулинов и фрагментов иммуноглобулинов, содержащее по крайней мере один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи. 6. Моноклональное антитело человека по п.5, где указанные фрагменты иммуноглобулинов выбраны из группы, включающей Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab')2-фрагменты, Fv-фрагменты, одноцепочечные антитела (scFv). 7. Антиидиотипическое антитело, которое специфически направлено против идиотипа моноклонального антитела по любому из пп.1-6. 8. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:3 и SEQ IDNO:4, где последовательность SEQ ID NO:3 кодирует вариабельный домен тяжелой цепи моноклонального антитела человека по п.1, а последовательность SEQ ID NO:4 кодирует вариабельный домен легкой цепи моноклонального антитела человека по п.1. 9. Клетка-хозяин, трансформированная экспрессионным вектором по п.8. 10. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество антитела по любому из пп.1-6 и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель. 11. Применение антитела по любому из пп.1-6 в качестве профилактического или терапевтического лекарственного средства для лечения патологий, вызванных заражением вирусом гриппа А, экспрессирующим гемагглютинин подтипа H1. 12. Применение по п.11, где патология, вызванная заражением вирусом гриппа А, экспрессирующим гемагглютинин подтипа H1, является синдромом гриппа. 13. Применение по п.12, где указанная патология вызвана заражением H1N1 вирусом гриппа А,также называемым вирусом свиного гриппа или новым вирусом гриппа.