Химерная изопреноидсинтаза, последовательность днк, экспрессирующий вектор, линия клеток и способ получения химерной изопреноидсинтазы.

1 Указание на исследование, спонсированное Федеральным правительством Разработка настоящего изобретения была частично финансирована Федеральным правительством, а поэтому Правительство имеет определенные права на это изобретение. Предпосылки создания настоящего изобретения Настоящее изобретение относится к химерной изопреноидсинтазе, к кодирующей ее последовательности ДНК, к экспрессирующему вектору, содержащему указанную последовательность, к линии клеток, трансформированной указанным вектором, и к способу получения химерной изопреноидсинтазы. Используемый термин изопреноид относится к семейству соединений, происходящих от изопренового структурного элемента. В частности, растительные изопреноиды составляют структурно отличающуюся группу соединений,которая может быть подразделена на классы первичных и вторичных метаболитов (фиг. 1). Изопреноидами, составляющими группу первичных метаболитов, являются стеролы, каротеноиды, регуляторы роста и полипреноловые заместители долихолов, хинонов и белков. Эти соединения играют важную роль в сохранении целостности мембраны, защиты от светового излучения (фотозащиты), регуляции программы эволюционного развития организма и основных биохимических функций связывания со специфическими мембранными системами, соответственно. Изопреноидами, классифицированными как вторичные метаболиты, являются монотерпены, сесквитерпены и дитерпены. Известно,что эти соединения опосредуют важные взаимодействия между растениями и окружающей средой. Так, например, специфические терпеноиды коррелируют со взаимодействиями растениерастение (Stevens, Isoprenoids in Plants, Nes,W.D. Fuller, G.,Tsai, L.-S., eds., Marcel Dekker,New York, pp.65-80, 1984), растение-насекомое(GibsonPickett, Nature, 302:608, 1983) и растение-патоген (Stoessal et al., Phytochemistry,15:855, 1976). Общим признаком этого множества соединений является их универсальный структурный элемент, изопрен, состоящий из пяти атомов углерода. Для обоснования биосинтетического происхождения всех терпеноидов, полученных из изопрена, используется биогенное изопреновое правило (правило Ружички) (Ruzicka,Experientia, 10:357, 1953). Посредством полимеризации двух дифосфорилированных изопреновых структурных элементов (например, IPP и диметилаллила) получают геранилдифосфат(GPP), линейное промежуточное соединение с 10 атомами углерода, которое может быть превращено в циклические или линейные конечные продукты, представляющие собой монотерпены,либо это соединение может быть использовано для другого цикла полимеризации. После присоединения третьего изопренового звена к GPP 2 образуется фарнезилдифосфат (FPP), который может быть также превращен в циклические или линейные продукты, представляющие собой соединения класса сесквитерпенов. Последующее продолжение цикла полимеризации и химической дифференциации приводит к продуцированию других классов терпеноидов, называемых в соответствии с числом изопреновых структурных элементов, используемых для их биосинтеза, например, присоединение третьегоIPP к FPP приводит к образованию геранилгеранилдифосфата (GGPP). Эти реакции полимеризации катализируются пренилтрансферазами, которые регулируют действие карбокатиона (атома углерода с недостающим электроном, образующегося в результате потери дифосфатной группы одного субстрата) на электрон-обогащенный атом углерода двойной связи в молекуле IPP (фиг. 2). Известно, что электрофильная природа этих реакций не похожа на более универсальные нуклеофильные реакции конденсации, но эта реакция является, очевидно, характерной реакцией для изопреноидных биосинтетических ферментов, а особенно, тех ферментов, которые участвуют в катализе циклизации изопреноидных промежуточных соединений (GershenzonCroteau, LipidMetabolism in Plants, Moore, T.S., ed., CRC Press,Boca Raton, FL, pp. 340-388). Ферменты, ответственные за циклизацию GPP, FPP и GGPP, относятся к монотерпен-, сесквитерпен- и дитерпен-синтазам или просто синтазам, и осуществляют реакции передачи атома углерода из общего пути метаболизма изопреноидов конечным продуктам класса монотерпенов, сесквитерпенов и дитерпенов, соответственно. Два важных отличительных биохимических признака, существующих между реакциями пренилтрансферазы и синтазы, проиллюстрированы на фиг. 2. Пренилтрансферазы катализируют образование углерод-углеродной связи между двумя молекулами субстрата, тогда как синтаза катализирует образование внутримолекулярной углерод-углеродной связи. Пренилтрансферазы также катализируют реакции с очень небольшим изменением стереохимии или длины образующегося полимера. Пренилтрансферазы отличаются по длине аллиловых субстратов, которые могут участвовать в инициации этих реакций. Синтазы также являются субстрат-специфичными. Однако различные сесквитерпен-синтазы могут, например, использовать один и тот же субстрат для продуцирования различных продуктов реакции. Известно, что биосинтез изопреноидов, таких как циклические терпены, определяется ферментами ключевых точек ветвления, называемыми терпен-синтазами. Реакции, катализируемые терпен-синтазами, являются сложными реакциями внутримолекулярной циклизации,которые могут включать несколько парциальных реакций. Так, например, биоорганический 3 принцип для циклизации FPP двумя сесквитерпен-синтазами, показан на фиг. 3. В стадии 1 за начальной ионизацией FPP следует внутримолекулярное электрофильное взаимодействие между углеродом, несущим дифосфатную часть,и дистальной двойной связью с образованием гермацена А, макроциклического промежуточного соединения. Замыкание внутреннего кольца и образование иона карбония Эвдесмана (Eudesmane) происходит во 2 стадии. Для 5-эпиаристолохен-синтазы табака (TEAS), конечная стадия представляет собой гидридный сдвиг,миграцию метила и депротонирование у С 9, что приводит к образованию 5-эпиаристопохена,как показано в стадии 3 а. Ветиспирадиенсинтаза Hyoscyamus muticus (HVS) (белена) имеет общий механизм в стадиях 1 и 2, но отличается от TEAS в третьей парциальной реакции,в которой из-за альтернативной миграции электронной пары может происходить сокращение кольца циклической структуры. В любом случае, мономерный белок размером приблизительно 64 кДа катализирует полную серию парциальных реакций и не требует других кофакторов кроме Мg+2. Краткое описание изобретения В общих чертах, настоящее изобретение относится к полипептиду химерной изопреноидсинтазы, включающему первый домен от первой изопреноид-синтазы, соединенный со вторым доменом от второй гетерологичной изопреноид-синтазы, в результате чего указанная химерная изопреноид-синтаза способна катализировать продуцирование изопреноидных продуктов реакции, которые не продуцируются в отсутствии второго, домена от второй гетерологичной изопреноид-синтазы. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, химерная изопреноид-синтаза способна катализировать, по крайней мере, два различных изопреноидных продуктов реакции; изопреноидные продукты реакции являются циклическими; второй домен от второй гетерологичной изопреноид-синтазы также определяет соотношение изопреноидных продуктов реакции химерной изопреноид-синтазы; первый домен от первой изопреноид-синтазы происходит от растительной изопреноид-синтазы, и второй домен от второй гетерологичной изопреноид-синтазы также происходит от растительной изопреноидсинтазы. Химерную изопреноид-синтазу выбирают,предпочтительно, из группы, включающей (а) химерную изопреноидсинтазу СН 4 NicotianaHyoscyamus; (б) химерную изопреноидсинтазу СН 10 Nicotiana-Hyos-cyamus; (в) химерную изопреноидсинтазу СН 11 Nicotiana-Hyoscyamus; (г) химерную изопреноидсинтазу СН 12 NicotianaHyoscyamus;(д) химерную изопреноидсинтазу СН 13Nicotiana-Hyoscyamus; и (е) химерную изопреноидсинтазу СН 14 Nicotiana-Hyoscyamus, при 001622 4 чем все указанные ферменты описаны в настоящей заявке. В предпочтительном варианте осуществления изобретения химерная изопреноидсинтаза катализирует продуцирование изопреноидного продукта реакции, имеющего сельскохозяйственное, фармацевтическое или промышленное значение (например, являющегося противогрибковым агентом, антибактериальным агентом или противоопухолевым агентом). В других родственных аспектах настоящее изобретение относится к ДНК, векторам и клеткам (например, E.coli, Saccharomyces cerevisiae,клеткам животных или растений), кодирующим или содержащим полипептид химерной изопреноид-синтазы. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду химерной изопреноид-синтазы, включающему асимметрично расположенный гомологичный домен, благодаря чему химерная изопреноид-синтаза способна катализировать продуцирование изопреноидных продуктов реакции (предпочтительно, циклических продуктов), в том случае,когда в указанном полипептиде изопреноидсинтазы домен расположен в сайте своей природной локализации. В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения полипептида химерной изопреноид-синтазы,предусматривающему:(а) продуцирование клетки, трансформированной ДНК, кодирующей химерную изопреноид-синтазу, предназначенную для экспрессии в клетке; (b) культивирование трансформированной клетки в условиях, благоприятных для экспрессии указанной ДНК; и (с) выделение указанной химерной изопреноид-синтазы. Термин изопреноид-синтаза означает полипептид, который способен катализировать реакцию, приводящую к образованию внутримолекулярной углерод-углеродной связи аллилдифосфатного субстрата (например, С 10, C15 или С 20-аллилдифосфатного субстрата) с изопреноидным продуктом (например, с монотерпеном,дитерпеновым, сесквитерпеновым или стероловым продуктом). Примерами таких изопреноидсинтаз являются, но не ограничиваются ими,монотерпен-синтазы(например,лимоненсинтаза), дитерпен-синтазы (например, касбенсинтаза) и сесквитерпен-синтазы (например, 5 эпи-аристолохен-синтаза,ветиспирадиенсинтаза и кадинен-синтаза), которые ответственны за циклизацию геранилдифосфата (GPP),фарнезилдифосфата (FPP) и геранилгеранилдифосфата (GGPP) соответственно. Был выделен и охарактеризован ряд терпен-синтаз, происходящих от растительных и микробных источниковBiol. Chem., 259:740, 1984). В основном, терпенсинтазы являются растворимыми ферментами,имеющими молекулярные массы от около 40 до 100 кДа. Гены, кодирующие ряд монотерпен-,дитерпен- и сесквитерпен-синтаз, описаны для ряда растений и микробов (см., например, HohnBeremand, Gene 79:131, 1989; ProctorHohn,J. Biol. Chem., 268:4543, 1993; FacchiniChappell, Proc. Natl. Acad. Sci., 89:11088, 1992; BackChappell, J. Biol. Chem., 270:7375, 1995; ColbyCane et al., Biochemistry, 33:5846, 1994). Термин полипептид или белок означает любую цепь аминокислот независимо от ее длины или посттрансляционной модификации(например, гликозилирования или фосфорилирования). Термин соединенный с означает ковалентно связанный прямо или опосредованно(то есть, когда домены разделены промежуточной аминокислотной последовательностью). Такие домены могут быть связаны любым способом, включая такой способ, но не ограничиваясь им, как пептидная связь или химическая связь. Термин домен означает определенный участок аминокислотной последовательности в полипептиде или белке. Термин изопреноид означает соединение, происходящее от изопренового структурного элемента. В частности, изопреноидными соединениями являются, но не ограничиваются ими, монотерпены, дитерпены, сесквитерпены и стеролы. Как описано в настоящей заявке, изопреноиды присутствуют в различных организмах, например, в организмах животных, в грибках или в бактериях. Термин асимметрично расположенный означает локализацию в химерном полипептиде в положении, которое отличается от его положения в природном полипептиде. Термин гетерологичный означает происходящий от другого источника (в данном случае, другие полипептиды). Термин гомологичный означает происходящий от того же самого источника (в данном случае, те же самые полипептиды). Другие отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего описания его предпочтительных вариантов осуществления и из формулы изобретения. 6 Подробное описание изобретения Ниже приводится описание чертежей. Фиг. 1 схематически иллюстрирует каскад реакций биосинтеза изопреноидов в зависимости от типа конечного продукта и их соответствующих физиологических функций. Пунктирные стрелки указывают на множество стадий или реакций. Фиг. 2 схематически иллюстрирует различные реакции, которые катализируются пренил-трансферазами и терпен-синтазами. Фиг. 3 схематически иллюстрирует механизм реакции для синтеза сесквитерпен-синтаз типа эремофилан-синтазы (5-эпи-аристолохенсинтазы, TEAS) и ветиспирадиен-синтазы (ветиспирадиен-синтазы Hyoscyamus, HVS). Рассматриваются парциальные реакции 1 и 2, общие для обоих типов синтаз. Показано, что различия в механизмах парциальных реакций 3 а и 3b достаточны для того, чтобы приводить к продуцированию различных продуктов реакции. Фиг. 4 А схематически иллюстрирует химерные конструкции, используемые для картирования каталитических доменов в сесквитерпен-синтазах. Линейные схемы обозначают сложные диаграммы для генов сесквитерпенсинтаз дикого типа (то есть, TEAS и HVS) и химерных сесквитерпен-синтаз (СН 1-СН 14),которые были сконструированы в бактериальном экспрессирующем векторе pGBT-T19. Генные конструкции были получены с использованием комбинации имеющихся сайтов рестриктирующих эндонуклеаз и путем амплификации выбранных областей с использованием PCR иPCR-праймеров, несущих соответствующие сайты рестриктирующих эндонуклеаз. Показано соответствие между уникальными сайтами рестриктирующих эндонуклеаз и положениями аминокислот. Фиг. 4 В представляет фотографию, полученную в ТСХ-эксперименте и иллюстрирующую активность синтазных ферментов в обработанных ультразвуком лизатах клеток ТВ 1E.coli, экспрессирующих TEAS, HVS и химерные конструкции синтазы (СН 1-СН 14), где указанная активность была измерена с использованием [3H]-FPP. Продукты реакции выделяли посредством тонкослойной хроматографии(ТСХ) с серебрением и оценивали с помощью авторадиографии. Радиоактивность в 0,5 ммсегментах каждой дорожки ТСХ-пластины определяли в сцинтилляционном счетчике, а радиоактивность, ассоциированную с зонамиTEAS- и HVS-специфических продуктов принимали за 100%. Фиг. 5 схематически иллюстрирует соответствие между экзонами и функциональными доменами в изопреноид-синтазах. Верхняя диаграмма представляет организацию экзонов в гене TEAS, которая почти идентична организации энзонов в генах HVS и касбен-синтазы. Нижняя диаграмма представляет сравнение пер 7 вичных структур функциональных доменов с организацией экзонов в генах TEAS и HVS. Номера экзонов показаны в верхней диаграмме, а все другие числа обозначают положения аминокислот, некоторые из которых соответствуют указанным сайтам рестриктирующих эндонуклеаз. Фиг. 6 представляет диаграмму, схематически иллюстрирующую стратегию переключения доменов, используемую для продуцирования заторможенной синтазы (QH1). Введение неактивного домена HVS, соответствующего экзону 4, в СН 3, приводит к продуцированию синтазы, имеющей измененную ферментативную активность. Фиг. 7 представляет диаграмму, схематически иллюстрирующую стратегию переключения доменов, используемую для продуцирования химерной заторможенной касбенсинтазы, и возможных продуктов реакции. Фиг. 8 представляет диаграмму, схематически иллюстрирующую стратегию переключения доменов, используемую для продуцирования химерной заторможенной кадиненсинтазы, и возможных продуктов реакции. Химерные изопреноид-синтезы Плазмиды, предназначенные для экспрессии химерных синтаз, были генерированы путем замены части гена, кодирующего домен от 5 эпи-аристолохен-синтазы табака, на часть гена,кодирующего домен от ветиспирадиен-синтазыHyoscyamus. Эти плазмиды были экспресированы в бактериях, и полученные бактериальные лизаты были проанализированы на сесквитерпен-синтазную активность. Анализ на сесквитерпен-синтазную активность включал анализ,проводимый методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с серебрением, и позволяющий различать аристохоленновые и ветиспирадиеновые продукты реакции (BackChappell, J.Biol. Chem., 270:7375, 1995). Как показано на Фиг. 4 А, было продуцировано 14 химерных конструкций синтазы, которые были проанализированы следующим образом. Полноразмерную кДНК для 5-эпиаристолохен-синтазы (TEAS) и ветиспирадиенсинтазы Hyoscyamus (HVS) клонировали вEcoRI/XhoI-сайты вектора Bluescript SK (Stratagene), в результате чего были сконструированы плазмиды pBSK-TEAS и pBSK-HVS, соответственно (BackChappell, J. Biol. Chem., 270:7375,1995). Ориентация TEAS- и HVS-кДНК-вставок этих экспрессирующих плазмид обеспечивалась их кодонами инициации трансляции, расположенными возле рестрикционного EcoRI-сайта, и их 3'-роlyА-хвостом, фланкированным рестрикционным XhoI-сайтом плазмиды pSK. Химерные синтазы СН 1, СН 2, СН 5 и СН 7 конструировали с использованием консервативных рестрикционных HindIII- и NdeI-сайтов,локализованых между генами Nicotiana (табака) и Hyoscyamus. CH1 получали путем лигирова 001622HindIII-KpnI-фрагменту) в бактериальный экспрессирующий вектор pGBT-T19 (Gold Biotechnology), который был предварительно гидролизован ферментами EcoRI и KpnI. СН 2 получали путем лигирования 5'концевой части гена TEAS (соответствующейNdeI-KpnIфрагменту) в бактериальный экспрессирующий вектор pGBT-T19. СН 5 получали путем лигирования 5'концевой части гена HVS (соответствующейEcoRI-HindIII-фрагменту) с 3'-концевой частью гена TEAS (соответствующей HindIII-KpnIфрагменту) в бактериальный экспрессирующий вектор pGBT-T19. СН 7 получали путем лигирования 5'концевой части гена HVS (соответствующейEcoRI-NdeI-фрагменту) с 3'-концевой частью гена TEAS (соответствующей NdeI-KpnIфрагменту) в бактериальный экспрессирующий вектор pGBT-T19. СН 3, СН 4, СН 12 и СН 13 были сконструированы стандартными методами полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием праймеров, предназначенных для амплификации конкретных сегментов гена HVS. Для облегчения направленного клонирования и сохранения рамки считывания были также сконструированы праймеры, содержащие нужные рестрикционные сайты. СН 3 конструировали следующим образом. Рестрикционный EcoRI/ClaI-фрагмент генаNo:2)-3' в качестве обратного праймера (соответствующего последовательности Т 7, обнаруживаемой в сайте множественного клонирования pBSK), с использованием pBSK-HVS в качестве ДНК-матрицы. Полученный рестрикционный фрагмент лигировали в EcoRI/KpnIсайты вектора pGBT-T19. СН 4 и СН 13 конструировали аналогичным образом, но с использованием прямых праймеров для амплифиации 5'-d(CGAGTCAACATGGTTTATTGAGGGATA; SEQ ID No:3)-3'SEQ ID No:4)-3' (рестрикционный XbaI-сайт подчеркнут), соответственно. СН 12 получали путем лигирования PCRфрагмента, соответствующего первым 1326TEAS в EcoRI/KpnI-сайты вектора pGBT-T19. СН 4-фрагмент получали с использованием прямого праймера для амплификации 5'-d(GGGAGCTCGAATTCCATGGCCTCAGCAGCAGTTGCAAACTAT; SEQ ID No:5)-3' (рестрикционный EcoRI-сайт подчеркнут, а кодон инициации трансляции выделен жирным шрифтом), и обратного праймера 5'-d(GGGATCGATAACTCTGCATAATGTAGCATT;SEQ ID No:6)-3' (рестрикционный ClaI-сайт подчеркнут). Химерные синтазы СН 6, СН 8, СН 9, СН 10,СН 11 и СН 14 были сконструированы следующим образом. В результате лигированияHindIII/KpnI-фрагментом СН 3 получали конструкцию СН 6. СН 8 создавали путем лигированияEcoRI/NdeI-фрагмента HVS с NdeI/KpnIфрагментом СН 3. СН 9 получали путем лигирования EcoRI/NdeI-фрагмента СН 5 с NdeI/KpnIфрагментом HVS. CH10 конструировали путем лигирования EcoRI/HindIII-фрагмента гена HVS с HindIII/KpnI-фрагментом СН 4. СН 11 конструировали путем лигирования EcoRI/NdeIфрагмента HVS с NdeI/KpnI-фрагментом СН 4. А СН 14 конструировали путем заменыEcoRI/NdeI-фрагмента СН 13 соответствующим ДНК-фрагментом pBSK-HVS. Области соединения химерных конструкций подтверждали путем секвенирования двухцепочечной ДНК с использованием набора для дидезокситерминации цепи в соответствии с инструкциями производителей (U.S. Biochemical Corp.). Химерные синтазы экспрессировали в клетках ТВ 1 E.coli. Процедуры культивирования бактериальных клеток, индуцирования экспрессии генов, измерения сесквитерпенсинтазной ферментативной активности, и определения полного белка в бактериальных лизатах осуществляли методами, описаннымиBackChappell (Arch. Biochem. Biophys.,315:527, 1994; J. Biol. Chem., 270:7375, 1995). Продукты реакции выделяли путем проявления ТСХ-пластин, покрытых двуокисью кремния(50:50:1). Для качественной оценки, на ТСХпластины, путем распыления, наносили раствор для высокоэффективной поверхностной флюорографии (Dupont), и экспонировали с пленкойKodak XAR-5 в течение от 2 до 5 дней при -70 С. Для количественной оценки 0,5 мм-зоны всей дорожки ТСХ-пластин соскабливали в сцинтилляционные сосуды и измеряли радиоактивность с использованием сцинтилляционного счетчикаPackard 1500 Liquid Scintillation Counter. Преобладающие продукты реакции, продуцированные благодаря синтазной активности, обусловленной экспрессией конструкций TEAS, HVS, CH4 и СН 14 в бактериальных клетках, были также подтверждены с помощью газовой хроматогра 001622al., Phytochemistry 26:2259, 1987). Кроме того,профили масс-спектров сравнивали с опубликованными профилями для 5-эпи-аристолохена(Anke . Sterner, Planta Med. 57:344, 1991) и предсказанной картиной фрагментации для ветис-пирадиена (Enzell et al., Mass SpectrometryRev. 3:395, 1984). Как показано на фиг. 4 А-В, преобладающим продуктом реакции, продуцируемым в результате экспрессии гена TEAS табака, был 5 эпиаристолохен, а ветиспирадиен был обнаружен как преобладающий продукт, полученный в результате экспрессии гена HVS. Преобладающие продукты реакции, продуцированные в результате экспрессии СН 1 и СН 2, были такжеHVS-специфическими (то есть, ветиспирадиен),при этом, фермент-специфическая активность была аналогична активности фермента HVS,который был экспрессирован в плазмиде pBSKHVS. Эти результаты показали, что аминоконцевая половины TEAS и HVS функционально эквивалентны по отношению к карбоксиконцу HVS, и не вносит какой-либо вклад в специфичность продукта реакции. Конструкция СН 7, имеющая амино-конец HVS и карбоксиконец TEAS, является обращенной конструкцией СН 2, и ожидалось, что полученная в результате синтазная активность приведет к экспрессии TEAS-специфичного продукта (то есть, 5 эпи-аристолохена). Иммунологичесий анализ выявил, что белок синтазы, продуцированной в результате экспрессии СН 7, имел нужный размер и ожидаемую распространенность, однако,ферментативной активности не наблюдалось. Отсутствие ферментативной активности указывает на то, что эта ферментативная активность обеспечивается взаимодействием между карбокси- и аминоконцевыми частями белка. Такая интерпретация, кроме того, подтверждается сравнением специфической активности ферментов, продуцированных в результате экспрессии конструкций СН 5 и СН 6. Конструкция СН 5 приводила к экспрессии продукта, имеющего в 10 раз меньшую специфическую синтазную ферментативную активность, чем другие химерные синтазы, даже несмотря на то, что абсолютный уровень экспрессированного белка был аналогичен уровню других конструкций (как было определено с помощью иммунологического анализа, данные не показаны). Было обнаружено, что замена карбоксиконцевой областиHVS способствует восстановлению специфической активности синтазного фермента, который был генерирован конструкцией СН 6. Сравнение химерных синтаз СН 2 и СН 3 показало, что за специфичность образования специфичного конечного продукта ответственен домен приблизительно 181 аминокислот, соответствующий рестрикционномуNdeI-ClaI 11 фрагменту в генах TEAS и HVS. Экспрессия СН 4 неожиданно приводила к продуцированию химерного белка синтазы, способного генерировать продукты реакции, относящиеся как к ферментам TEAS, так и к ферментам HVS. Мы считаем, что этот результат указывает на то, что аминокислоты 261-379 в 5-эпиаристолохенсинтазе табака являются ответственными заTEAS-специфические продукты (то есть, область, соответствующая NdeI-HincII-фрагменту кДНК), тогда как аминокислоты 379-442 в белкеHVSспецифические продукты (то есть, область, соответствующая HincII-ClaI-фрагменту кДНК). Наша интерпретация была подтверждена путем оценки продуктов экспрессии СН 11 и СН 12. Конструкция СН 11 была получена путем замены NdeI-HincII-фрагмента гена Hyoscyamus соответствующим генным фрагментом гена табака, и продуцировала фермент, имеющий HVSTEAS-специфичность. Конструкция СН 12 была получена путем замены HincII-ClaI-фрагмента гена табака соответствующим генным фрагментом Hyoscyamus и продуцировала фермент,имеющий HVS-TEAS-специфичность. Сравнение СН 11 с СН 13 вносило еще большее уточнение в характеризацию домена фермента табака,ответственного за TEAS-специфические продукты. Было обнаружено, что СН 13 является многофункциональным ферментом, и этот факт указывает на то, что 81 аминокислоты, кодированные ДНК-фрагментом, находящимся между рестрикционными NdeI-XbaI-сайтами кДНК табака, являются достаточными для образования доминирующих TEAS-специфических продуктов. Эта интерпретация подтверждается заменой домена, содержащегося в рестрикционном NdeI/XbaI-фрагменте HVS-кДНК конструкции СН 14, доменом, кодируемым геном TEAS(см. фиг. 4 А). Как показано на фиг. 4 В, преобладающие продукт(ы) реакции TEAS табака и HVS Hyoscyamus дикого типа, экспрессированные в бактериях, мигрированных на ТСХ-пластины, покрытые нитратом серебра, имеют величины Rf = 0,41 и 0,31, которые соответствуют величинам,полученным при проведенной ранее характеризации этих продуктов как 5-эпиаристолохен и ветиспирадиен, соответственно (BackChappell, J. Biol. Chem., 270:7375, 1995; Back et al.,Arch. Biochem. Biophys., 315:527, 1994). ГХ- и ГХ-МС-анализы указывают на то, что преобладающими пpодуктами TEAS-реакции были 5 эпиаристолохен (70% от всех продуктов, исходя из процента всех площадей пиков, полученных в ГХ-анализе) и бициклический сесквитерпен(20%) ([М]+ ион при m/z = 204). Преобладающим продуктом HVS-реакции был ветиспирадиен (90%) (ион [М]+ при m/z = 204 с основным пиком при m/z 41, и серия предсказанных ионов при m/z 175, 108, 94 и 68), а преобладающими продуктами реакции СН 4 были 5-эпи 001622 12 аристолохен (18%), бициклический сесквитерпен (43%) и ветиспирадиен (32%). Кроме того, в исследованиях, проводимых путем аффинной очистки меченых гистидином рекомбинантных синтазных белков, было обнаружено 5 других вспомогательных продуктов реакции, каждый из которых составлял примерно 1% от всех продуктов; при этом, все 5 продуктов были обнаружены при той же самой относительной распространенности во всех реакционных анализах. Соотношение-определяющий домен Другой домен синтазных белков был идентифицирован путем сравнения относительных уровней преобладающих продуктов реакции,продуцированных многофункциональными химерными синтазами (фиг. 4 А). Так, например,продукты реакции, полученные в результате экспрессии конструкций СН 4, СН 10, СН 11 и СН 12, были продуцированы в отношении: 6070% TEAS-специфических ферментов на 3040% HVS-специфических ферментов. В отличие от этого, экспрессия конструкций СН 13 и СН 14 приводила к обратному соотношению продуктов реакции. Этот результат указывает на то,что область,охватываемаяXbaI-HincIIдоменом, влияет на относительный уровень продуктов реакции, продуцируемых многофункциональными химерными синтазами. Эти результаты свидетельствуют о том, что два отдельных и различных домена в пептиде синтазы непосредственно влияют на типы продуцируемых продуктов реакции и прерываются другим доменом, который мы назвали соотношениеопределяющим доменом. (фиг. 5). Сайт-направленный мутагенез Дополнительный анализ специфичности продуктов и соотношение-определяющих доменов был проведен с использованием стандартной методики сайт-направленного мутагенеза. Результаты этого анализа представлены в Таблице I (см. ниже). Так, например, мотивDDXXD,обнаруженный в аристолохенспецифическом домене, представляет собой консервативную последовательность, которая присутствует в ряде терпен-биосинтетических ферментов, включая TEAS и HVS. Известно, что этот кластер аминокислот с кислотными свойствами координирует металлический кофактор,который необходим для нейтрализации дифосфатной группы FPP в том или ином липофильном кармане. Замена первого остатка аспарагиновой кислоты (D301) мотива DDXXD либо остатком глутаминовой кислоты (при сохранении полного заряда), либо валиновым остатком (с полной потерей кислотного заряда)(т.е., D301 Е и D301 V) приводит к образованию инактивированного фермента. Консервативная замена второго остатка аспарагиновой кислоты (D302) остатком глутаминовой кислоты (т.е., D302-E) также снижает ферментативную активность химерной синтазы на 90% и 13 приводит к небольшому изменению распределения продуктов многофункционального фермента. Таблица I Мутация Мутирован- Соотношение про- Специфическая активность целевого ная аминодуктов Аристологена кислота хен Ветиспирадиен (нмоль/мгч-1) СН 4 66% 34% 34 Домен связывания с субстратом (NdeI/XbaI-область) Табак Сайты для направленных замен в соотношение-определяющем домене (то есть, K347-I,H360-S, H364-S) были определены путем анализа работ, в которых были высказаны предположения о важности заряженных аминокислотных остатков (например, гистидина или лизина) в энзимологии синтаз, и эти сайты представляли те аминокислоты, которые обнаруживали наибольшее различие в заряде по сравнению с первичными последовательностями TEAS и HVS. Ни одна из трех проанализированных мутаций не оказывала какого-либо влияния на всю каталитическую активность фермента или на соотношение продуцируемых продуктов. Аминокислотные замены вHVSспецифическом домене были выбраны на основании сравнения предполагаемых вторичных структур белка HVS и белка TEAS. Было показано, что эти мутированные аминокислоты вносят, непропорционально, структурные нарушения в моделях вторичной структуры этих двух белков, что, главным образом, обусловлено зарядом. Однако, как показано в таблице I (см. выше), замены заряженных аминокислотных остатков на незаряженные остатки (то есть, Т 408 А, К 420 М, Н 422 А) или остатки с меньшим зарядом (N436S, A437 Т, V438I) не влияют ни на полную ферментативную активность, ни на уровень синтеза одного или другого продукта. Заторможенные синтазы Для продуцирования заторможенной(quiescent) синтазы неактивный домен, соответствующий экзону 4 HVS заменяют соответствующим активным доменом СН 3, как показано на фиг. 6. СН 3 содержит неактивный домен,соответствующий экзону 6 TEAS, имет стандартные рестрикционные NdeI- и XbaI-сайты для нужных замен и может быть сверхэкспрессирован в бактериях с высокими уровнями про 001622 14 дуцирования. Переключение доменов осуществляли с использованием стандартной молекулярной техники, описанной в настоящей заявке. В одном конкретном примере соответствующую область СН 3 заменяли продуктом PCRамплификации кДНК HVS, соответствующим экзону 4, кодирующему аминокислоты 261-342 и содержащему соответствующие NdeI- и XbaIсайты в праймерах. При создании таких конструкций необходимо, чтобы были сохранены соответствующие аминокислотные остатки и правильная рамка считывания, а также необходимо провести тест на экспрессию конструкций,в котором предусматривается измерение уровня белка в растворимых и нерастворимых фракциях бактериальных лизатов с использованием техники иммуноблоттинга и ферментных анализов. Кроме того осуществляли крупномасштабные ферментативные реакции, продукт (продукты) реакции экстрагировали гексаном, и полученные продукты очищали методами ВЭЖХ. Дополнительную оценку продуктов реакции устойчивого фермента осуществляли с использованием ТСХ, и путем сравнения величин Rf экспериментального образца с величинами Rf продуктов, продуцированных TEAS- и HVSферментами. Время удерживания продуктов реакции (например, гермакрена или гермакренподобного продукта реакции) также прослеживали с помощью ГХ, ГХ-МС и ЯМР в соответствии со стандартными методами. Заторможенная синтаза может быть использована для получения достаточных количеств гермакреновых промежуточных продуктов реакции (или их производных) в целях подтверждения химического обоснования для реакций EAS и VS и получения матричной химерной синтазы, которая может быть использована для введения в новые конечные стадии всей схемы синтазной реакции. Химерные касбен- и кадинен-синтазы Химерные изопреноид-синтазы могут быть также использованы для создания новых макроциклических изопреноидов или изопреноидов,обладающих модифицированными стереохимическими свойствами. Так, например, изопреноид-синтазы, такие как касбен-синтаза, дитерпенсинтаза, катализирующая синтез макроциклических дитерпенов, имеющих циклопропильную боковую группу; и кадинен-синтаза, сесквитерпен-синтаза, катализирующая синтез бициклического сесквитерпена, имеют домены, которые могут быть использованы для конструирования ферментов, способных продуцировать макроциклические изопреноиды или продукты реакции изопреноидов, имеющие измененные стереохимические свойства. Основная схема продуцирования таких химерных синтаз представлена на фиг. 7 и 8. Для конструирования таких химерных касбен- и кадинен-синтаз, неактивные амино 15 концевые домены (и, если необходимо, другие домены синтазы) заменяют доменами от касбени кадинен-синтазы с использованием соответствующих рестрикционных сайтов и с помощьюPCR-амплификации выбранных областей, как описано выше. В этих конструкциях последовательности, соответствующие N-концевой, нацеленной на пластиду, последовательности касбен-синтазы, были делетированы. Химерные конструкции экспрессировали в бактериях, после чего бактериальные лизаты оценивали на активность химерной синтазы, и продукты реакции характеризовали, как описано выше, например, посредством ТСХ с серебрением. При этом считалось, что в настоящем изобретении могут быть использованы конструкции, обнаруживающие высокие уровни синтазной активности в бактериях и/или активности, способствующей продуцированию продуктов реакции,которые мигрируют с различными Rf от аристолохеновых и ветиспирадиеновых стандартов. Продукты реакции также анализировали на время их удерживания при ГХ и, если необходимо, подвергали ГХ-МС и ЯМР. Те домены касбен-синтазы и кадинен-синтазы, которые обеспечивают синтез уникальных продуктов реакции, могут быть также подвергнуты более детальному картированию с использованием стратегии, проиллюстрированной на фиг. 4 А. Продуцирование других химерных изопреноидсинтаз С использованием стандартной молекулярной техники, описанной в настоящей заявке,могут быть легко генерированы другие химерные синтазы, которые включают домены от известных или вновь сконструированных выделенных ферментов синтазы. Такие химерные синтазы могут быть протестированы на активность с использованием, например, любых подходящих ферментных анализов, известных специалистам (например, описанных в настоящей заявке), либо с использованием стандартных иммунологических анализов. Выделение последовательностей, кодирующих другие синтазы, может быть также осуществлено с использованием стандартных методов и схем клонирования, которые хорошо известны специалистам. Так, например, с использованием всей или части аминокислотной последовательности известного полипептида синтазы, могут быть легко сконструированы синтаза-специфичные олигонуклеотидные зонды, включая вырожденные олигонуклеотидные зонды для синтазы (то есть, смесь всех возможных кодирующих последовательностей для данной аминокислотной последовательности). Эти олигонуклеотиды могут быть получены исходя из последовательности любой нити ДНК и любой соответствующей части нуклеотидной последовательности синтазы. Общие методы конструирования и получения таких зондов описаны, например, Ausubel et al., 1996, Current Proto 001622cols in Molecular Biology, Willey Interscience,New York, и BergerKimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press,New York. Эти олигонуклеотиды могут быть использованы для выделения гена синтазы либо посредством использования их в качестве зондов, способных гибридизироваться с комплементарной последовательностью синтазы, либо посредством использования их в качестве праймеров для различных методов амплификации,например, для проведения клонирования с помощью полимеразной цепной реакции (PCR). Техника гибридизации и процедуры скрининга хорошо известны специалистам и описаны, например, Ausubel et al. (см. выше) и BergerKimmel (см. выше); Chen et al., Arch. Biochem.Harbor Laboratory Press, New York. Если необходимо, то может быть использована комбинация различных олигонуклеотидных зондов для скрининга рекомбинантной ДНК-библиотеки. Олигонуклеотиды могут быть помечены обнаружимой меткой с помощью методов, известных специалистам, и использованы для зондирования реплик на фильтрах, полученных от рекомбинантной ДНК-библиотеки. Рекомбинантные ДНК-библиотеки получали методами,хорошо известными специалистам, например,методами, описанными Ausubel et al. (см. выше),либо они могут быть получены в готовом виде из коммерческих источников. Как обсуждалось выше, олигонуклеотиды синтазы могут быть также использованы в качестве праймеров в стратегии клонирования путем амплификации, например, с использованиемPCR. PCR-методы хорошо известны специалистам и описаны, например, в PCR Technology,Erlich ed., Stockton Press, London, 1989; PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications,Innis et al., eds., Academic Press, Inc., New York,1990; и Ausubel et al. (см. выше). Праймеры конструируют, но необязательно, для клонирования амплифицированного продукта в подходящий вектор, например, путем встраивания соответствующих рестрикционных сайтов в 5'- и 3'-концы амплифицированного фрагмента (как описано в настоящей заявке). Если необходимо, то ген синтазы может быть выделен с использованиемPCR-техники RACE или Быстрой амплификации кДНК-концов (Rapid Amplification ofcDNA Ends) (см., например, выше, Innis et al.). С помощью этих методов олигонуклеотидные праймеры, полученные исходя из последовательности синтазы, ориентировали в 3'- и 5'направлениях, и использовали для генерирования перекрывающихся PCR-фрагментов. Эти перекрывающиеся 3'- и 5'-концевые RACEпродукты комбинировали для продуцирования интактной полноразмерной кДНК. Этот метод описан Innis et al. (см. выше); и Frohman et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998, (1988). 17 Используемые последовательности синтазы могут быть выделены из любого подходящего организма. Подтверждение родства последовательностей с полипептидом синтазы может быть получено с использованием ряда стандартных методов, например, путем сравнения последовательностей. Кроме того, активность любого белка синтазы может быть оценена любыми методами, описанными в настоящей заявке. Экспрессия полипептида химерной изопреноидсинтазы Полипептиды химерной синтазы могут быть получены путем трансформации подходящей клетки-хозяина всей или частью ДНК химерной синтазы (например, кДНК химерной синтазы, описанной выше) в подходящем экспрессирующем векторе, или плазмидой, сконструированной для увеличения уровня экспрессии полипептида химерной синтазы in vivo. Специалистам в области молекулярной биологии известно, что для получения рекомбинантного белка могут быть использованы любые экспрессирующие системы широкого ряда. Конкретный вид клетки-хозяина не имеет решающего значения для настоящего изобретения. Химерный синтазный белок может быть продуцирован в прокариотическом хозяине, например, в клетках ТВ 1 E.coli, или в эукариотическом хозяине, например, в Saccharomyces cerevisiae, в клетках млекопитающих (например, в клетках COS 1 или NIH ЗТЗ), либо в любых растительных клетках, включая, но не ограничиваясь ими, клетки водорослей, различных видов деревьев, декоративных видов растений, видов плодовых деревьев умеренного пояса, видов плодовых деревьев тропического пояса, овощных растений, бобовых растений, однодольных растений, двудольных растений, либо в клетках любых растений, имеющих промышленное или сельскохозяйственное значение. Конкретными примерами подходящих растений-хозяев являются, но не ограничиваются ими, хвойные деревья, петуния, томаты, картофель, табак, Arabidopsis (Резушка Таля), салатлатук, подсолнечник, масличный рапс, лен,хлопчатник, сахарная свекла, зерновые культуры, соя, люцерна, Medicago (вид люцерны), лотос, Vigna (вигна), огурец, морковь, баклажан,цветная капуста, хрен, ипомея, тополь, ореховые растения, яблоня, спаржа, рис, кукуруза,просо, лук, ячмень, ежа сборная, овес, рожь и пшеница. Такие клетки могут быть получены из множества источников, включая Американскую коллекцию типовых культур (Rockland, MD); или от любых компаний, занимающихся заготовкой зерна, например, W. Atlee Burpee SeedFraley, Science 244:1293, (1989). Для экспрессии в прокариотических клетках, ДНК, кодирующую химерный полипептид синтазы, вводили в вектор, правильно присоединенный к регуляторной сигнальной последовательности, способной к эффективной экспрессии в прокариотическом хозяине. Если необходимо, то эта кодирующая последовательность может в своем 5'-конце содержать последовательность, кодирующую любую из известных сигнальных последовательностей, обеспечивающих эффективную секрецию экспрессированного белка в периплазматическое пространство клетки-хозяина, что значительно облегчает выделение белка и его последующую очистку. Наиболее часто используемыми прокариотами являются различные штаммы E.coli, однако,могут быть также использованы и другие микробные штаммы. Были использованы плазмидные векторы, которые содержат сайты инициации репликации, селектируемые маркеры и регуляторные последовательности, происходящие от видов, совместимых с микробным хозяином. Примеры таких векторов описаны в работахPouwels et al. (см. выше) или Ausubel et al. (см. выше). В настоящем описании под обычно используемыми прокариотическими регуляторными последовательностями (также называемыми регуляторными элементами) подразумеваются промоторы для инициации транскрипции (необязательно с оператором) вместе с последовательностями сайта связывания с рибосомой. Промоторами, обычно используемыми для направленной экспрессии белка, являются промоторы бета-лактамазы (пенициллиназы),промотор лактозы (lac) (Chang et al., Nature 198:1056 (1977, промотор триптофана (Trp)(Goeddel et al., Nucl. Acids. Res. 8:4057 (1980 и промоторные системы tac, a также происходящий от фага лямбда промотор РL и сайт связывания с рибосомой N-гена (Simatake et al., Nature 292:128 (1981. Одной из конкретных бактериальных систем экспрессии полипептида химерной синтазы является экспрессирующая система рЕТ E.coli(Novagen). В соответствии с этой экспрессирующей системой, ДНК, кодирующую полипептид химерной синтазы, встраивают в вектор рЕТ в ориентации, способствующей экспрессии полипептида. Поскольку ген химерной синтазы находится под контролем регуляторных сигнальных последовательностей Т 7, экспрессия химерной синтазы стимулируется путем индуцирования экспрессии РНК-полимеразы Т 7 в клетке-хозяине. Это обычно достигается с ис 19 пользованием штаммов-хозяев, которые экспрессируют РНК-полимеразу Т 7 в ответ наIPTG-индукцию. После продуцирования рекомбинантный полипептид химерной синтазы выделяют стандартными методами, известными специалистам, например, методами, описанными в настоящей заявке. Другой бактериальной экспрессирующей системой, подходящей для продуцирования полипептида химерной синтазы, является экспрессирующая система pGEX (Pharmacia). В этой системе используется гибридная система генаGST, которая была сконструирована для осуществления высокого уровня экспрессии гена или его фрагмента с образованием гибридного белка с последующей быстрой очисткой и выделением функционального генного продукта. Нужный белок химерной синтазы объединяли с карбоксиконцом белка глутатион-3-трансферазы отSchistosoma japonicum, и легко выделяли из бактериальных лизатов с помощью аффинной хроматографии с использованием глутатионсефарозы 4 В. Гибридные белки могут быть выделены в мягких условиях путем элюции глутатионом. Отщепление глутатион-3-трансферазы от гибридного белка облегчается присутствием сайтов распознавания для сайт-специфических протеаз, расположенных выше этого домена. Так, например, белки, экспрессированные в плазмидах pGEX-2T, могут быть отщеплены тромбином, а белки, экспрессированные в плазмидах pGEX-3 Х, могут быть отщеплены фактором Ха. Для экспрессии в эукариотах способ трансформации или трансфекции, а также выбор вектора для экспрессии полипептида химерной синтазы будет зависеть от выбранной системы хозяина. Методы трансформации и трансфекции многочисленных организмов, например, пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae, описаны, например, в Ausubel et al. (см. выше); WeissbachWeissbach, Methods for Plant(1991); и BioRad (Hercules, CA) Technical Bulletin1687 (Biolistic Particle Delivery Systems). Экспрессирующие векторы могут быть выбраны из векторов, описанных, например, в CloningAlto, CA); и в работах, упомянутых выше. Одной из предпочтительных эукариотических систем экспрессии является клетка-хозяин мышиного фибробласта ЗТЗ, трансфецированная экспрессирующим вектором pMAMneo 20 индуцибельным промотором MMTV-LTR; сайт инициации репликации SV40, который обеспечивает репликацию в системах млекопитающих; селектируемый ген неомицина; и сайты сплайсинга SV40 и полиаденилирования. ДНК, кодирующую полипептид химерной синтазы,встраивают в вектор рМАМnео в ориентации,способствующей экспрессии. Затем рекомбинантный полипептид химерной синтазы выделяют, как описано ниже. Другими предпочтительными клетками-хозяевами, которые могут быть использованы в сочетании с экспрессирующим вектором рМАМnео, являются клетки COS и СНО (АТСС входящиеCRL 1650 и CCL 61, соответственно). Альтернативно, если необходимо, полипептид химерной синтазы продуцируют с помощью стабильно трансфецированной клеточной линии. Ряд векторов, подходящих для стабильной трансфекции клеток млекопитающих,описан и известен специалистам, см., например,Pouwels et al. (см. выше); известны также методы конструирования таких клеточных линий,см., например, в Ausubel et al. (см. выше). В одном примере, кДНК, кодирующую полипептид химерной синтазы, клонируют в экспрессирующий вектор, который включает ген дигидрофолат-редуктазы (DHFR). Интеграцию плазмиды,и, тем самым, гена, кодирующего химерную синтазу, в хромосому клетки-хозяина, идентифицируют по включению 0,01-300 мкМ метотрексата в среде для культивирования клеток(как описано Ausubel et al., см. выше). Такой доминантный отбор может быть осуществлен для большинства типов клеток. Уровень экспрессии рекомбинантного белка может быть увеличен путем DHFR-опосредованной амплификации трансфецированного гена. Методы отбора клеточных линий, несущих амплифицированный ген, описан Ausubel et al. (см. выше); где указанные методы предусматривают, главным образом, выращивание культуры в среде,содержащей возрастающие уровни метотрексата. DHFR-содержащими экспрессирующими векторами, обычно используемыми в этих целях, являются pCVSEII-DHrF иDHFR-селекции стабильно трансфецированной или для DHFR-опосредованной амплификации гена, являются любые клетки-хозяева, описанные выше, или, предпочтительно, DHFRдефицитная клеточная линия СНО (например,клетки DHFRклетки СНО, АТСС вх. CRL 9096). Полипептид химерной синтазы продуцируют, предпочтительно, с использованием стабильно трансфецированной растительной клеточной линии или трансгенного растения. Ряд векторов, подходящих для стабильной трансфекции клеток млекопитающих, описан и известен специалистам, см., например, Pouwels et al.Gelvin et al. (см. выше) . Методы для конструирования таких клеточных линий описаны, например, WeissbachWeissbach (см. выше) иGelvin et al. (см. выше). Обычно растительные экспрессирующие линии включают (1) клонированный ген химерной синтазы, находящийся под транскрипционным контролем 5'- и 3'регуляторных последовательностей; и (2) доминантный селектируемый маркер. Такие растительные селектируемые экспрессирующие векторы могут также, если это необходимо, содержать промоторную регуляторную область (например, область, обеспечивающую индуцибельную или конститутивную экспрессию, либо экспрессию, регулируемую в зависимости от среды или стадии развития, либо экспрессию, индуцируемую патогеном или повреждением, либо клетко- или ткане-специфическую экспрессию),сайт инициации транскрипции, сайт связывания с рибосомой, сигнал РНК-процессинга, сайт терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования. ДНК-последовательность химерной синтазы настоящего изобретения может быть объединена, если необходимо, с другими ДНКпоследовательностями различными путями. ДНК-последовательность химерной синтазы настоящего изобретения может быть использована со всеми генными последовательностями или их частичными последовательностями,обычно ассоциированными с белком синтазы. В этих составляющих частях,ДНКпоследовательность, кодирующую белок химерной синтазы,объединяют в ДНКконструкции, имеющей регуляторную область инициации транскрипции, способную стимулировать транскрипцию и трансляцию в клеткехозяине. В основном эти конструкции включают регуляторные области, которые являются функциональными в растениях и которые обеспечивают продуцирование белка химерной синтазы,описанной в настоящей заявке. Открытая рамка считывания, кодирующая химерный белок синтазы или его функциональный фрагмент, может быть присоединена у своего 5'-конца к регуляторной области инициации транскрипции, такой как последовательность, обычно присутствующая выше (ближе к 5'-концу) области структурного гена синтазы. Существует ряд других областей инициации транскрипции, которые обеспечивают конститутивную или индуцибельную регуляцию. Если необходимо обеспечить экспрессию,регулируемую в зависимости от стадии развития, клетко-специфическую экспрессию, тканеспецифическую экспрессию,гормоноспецифическую экспрессию, экспрессию, регулируемую в зависимости от среды, или экспрессию, индуцируемую патогеном, то соответствующую некодирующую область, расположен 001622 22 ную выше (в направлении 5'), получают от других генов, например, от генов, регулируемых в стадии развития семян, в стадии развития эмбрионов, в стадии развития листьев, или в ответ на патоген. В ДНК-конструкциях настоящего изобретения могут также присутствовать регуляторные области терминации транскрипции. Области терминации транскрипции могут обеспечиваться ДНК-последовательностью, кодирующей белок синтазы, или любой стандартной областью терминации транскрипции, происходящей от различных генных источников. Область терминации транскрипции может, предпочтительно, содержать, по крайней мере, 1-3 т.п.о. последовательности, расположенной от 3'-конца структурного гена, от которого происходит область терминации транскрипции. Такие генетически сконструированные растения могут быть использованы в промышленных или сельскохозяйственных целях, как описано ниже. Важно отметить, что настоящее изобретение может быть применено к голосемянным и покрытосемянным растениям, и может быть легко применено в любых новых или усовершенствованных методах трансформации или регенерации растений. Примером растительного промотора, который может быть использован в настоящем изобретении, является промотор колимовируса,например, промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Эти промоторы обеспечивают высокие уровни экспрессии в большинстве растительных тканей, и активность этих промоторов не зависит от кодируемых вирусом белков.CaMV является источником как для промотора 35S, так и для промотора 19S. В большинстве тканей трансгенных мышей, промотор 35SCaMV является сильным промотором (см., например, Odell et al., Nature 313:810 (1985. Промотор CaMV является также в высокой степени активным в однодольных растениях (см.,например, Dekeyser et al., Plant Cell 2:591 (1990);(1990. Кроме того, активность этого промотора может быть усилена (то есть, в 2-10 раз) путем дублирования промотора 35S CaMV (см.,например, Кау et al., Science 236:1299 (1987);(1987); и Fang et al., Plant Cell 1:141 (1989. Другими эффективными растительными промоторами являются, но не ограничиваются ими, промотор нопалин-синтазы (An et al., PlantPhysiol. 88:547 (1988 и промотор октапинсинтазы (Fromm et al., Plant Cell 1:977 (1989. Для некоторых применений может оказаться желательным продуцировать продукт гена химерной синтазы в соответствующей ткани, на соответствующем уровне или на соответствующей стадии развития. Для этой цели имеется ассортимент генных промоторов, каждый из которых имеет собственные отличительные 23 свойства включения в свои регуляторные последовательности, и регуляция которых, как было показано, зависит от окружающей среды,присутствующих гормонов и/или стадии развития. Такими промоторами являются генные промоторы, которые ответственны за терморегулируемую экспрессию генов (см., например,Callis et al., Plant Physiol. 88:965 (1988); TakahashiKomeda, Mol. Gen. Genet. 219:365 (1989); иTakahashi et al., Plant J. 2:751 (1992, фоторегулируемую экспрессию гена (например,промотор rbcS-3 А гороха, описанный Kuhlemeier et al., (Plant Cell 1:471 (1989); промотор(EMBO J. 4:2723 (1985, гормонорегулируемую экспрессию гена (например, последовательности, восприимчивые к абсцизовой кислоте(АВА), от гена Еm пшеницы, и описанные Marcotte et al. (Plant Cell 1:969 (1989; АВАиндуцибельные промоторы HVA1 и HVA22, и промоторы rd29A для ячменя и Arabidopsis,описанные Straub et al. (Plant Cell 6:617 (1994),Shen et al. (Plant Cell 7:295 (1994, и индуцируемую повреждениями экспрессию гена (например, промотор гена wunI, описанный Siebertz et al. (Plant. Cell 1:961 (1989, или органспецифическую экспрессию гена (например,клубне-специфический промотор гена запасного белка, описанный Roshal et al. (EMBO J., 6:1155Cell 1:839 (1989; и индуцируемую патогеном экспрессию гена, описанную Chappell et al., вUS Ser. Nos. 08/471983, 08/443639 и 08/577483,где указанные работы вводятся в настоящее изобретение посредством ссылки. Растительные экспрессирующие векторы могут также, но необязательно, содержать сигналы РНК-процессинга, например, интроны,которые, как было обнаружено, играют важную роль для эффективного синтеза и аккумуляции РНК (Callis et al., Genes and Dev. 1:1183 (1987. Локализация последовательностей РНКсплайсинга может оказывать существенное влияние на уровень экспрессии трансгена в растениях. Учитывая этот факт, для модуляции уровней экспрессии гена, интрон может быть введен выше или ниже последовательности,кодирующей полипептид химерной синтазы в трансгене. Помимо вышеуказанных 5'-регуляторных последовательностей, экспрессирующие векторы могут также включать регуляторные области, которые, обычно, присутствуют в 3'областях генов растений (Thornburg et al., Proc. 24 область терминатора может быть включена в экспрессирующий вектор для повышения стабильности мРНК. Одна из таких областей терминатора может происходить от области терминатора PI-II картофеля. Кроме того, другие обычно используемые терминаторы происходят от сигнальных последовательностей октопинили нопалин-синтазы. Обычно растительные экспрессирующие векторы также содержат доминирующий селективный маркерный ген, используемый для идентификации тех клеток, которые были трансформированы. Селектируемыми генами, обычно используемыми для растительных систем, являются гены, несущие устойчивость к антибиотикам, например, гены, кодирующие устойчивость к гигромицину, канамицину, блеомицину,G418, стрептомицину или спектиномицину. Гены, необходимые для фотосинтеза, могут быть также использованы в качестве селектируемых маркеров в дефектных по фотосинтезу штаммах. Альтернативно, в качестве селектируемого маркера может быть использован белок, продуцирующий флуоресценцию в зеленом диапазоне света, и происходящий от медузы Aequorea victoria (Sheen et al., Plant J. 8:777 (1995); Chiu et al.,Current Biology 6:325 (1996. И наконец, в качестве селектируемых маркеров могут быть использованы гены, кодирующие устойчивость к гербицидам, где такими генами устойчивости к гербицидам являются ген bar, кодирующий фермент фосфинотрицинацетилтрансферазу и несущий устойчивость к гербицидам широкого спектра Basta (Hoechst AG, Frankfurt, Germany). Эффективное использование селектируемых маркеров облегчается путем определения восприимчивости клетки растения к конкретному селектируемому агенту и путем определения концентрации того агента, который способен эффективно уничтожать, если не все, то большинство трансформированных клеток. Некоторыми эффективными концентрациями антибиотиков для трансформации табака являются, например, 75-100 мкг/мл (канамицина), 25-50 мкг/мл (гигромицина) или 5-10 мкг/мл (блеомицина). Эффективная стратегия для отбора трансформантов на устойчивость к гербицидам описана, например, Vasil et al. (см. выше). Каждому специалисту в области молекулярной биологии, особенно в области молекулярной биологии растений, известно, что уровень экспрессии гена зависит не только от комбинации промоторов, сигналов РНК-процессинга и элементов терминатора, но и также от того, каким образом эти элементы используются для повышения уровней экспрессии селектируемого маркерного гена. Трансформация растений После конструирования растительного экспрессирующего вектора могут быть использованы некоторые стандартные методы введе 25 ния этого вектора в растение-хозяина, в результате чего будет продуцироваться трансгенное растение. Такими методами являются (1) трансформация, опосредованная агробактерией (A.II, D.M. Glover, ed, Oxford, IRI Press, 1985), (2) система доставки частиц (см., например,Gordon-Каmm et al., Plant Cell 2:603 (1990); илиSheen, Plant Cell 6:1665 (1994, и (7) метод интенсивного перемешивания (например, Kindle,см. выше). Метод трансформации не играет решающего значения для настоящего изобретения. Может быть использован любой метод, который приводит к эффективной трансформации. При появлении более новых методов трансформации культур или других клеток-хозяев, эти методы также могут быть непосредственно использованы. Ниже приводится пример одного конкретного метода, а именно, метода трансформации растений с помощью агробактерий. В этом методе основной процесс модификации генов для их переноса в геном растительных клеток осуществляется в две стадии. Сначала осуществляют стадии клонирования и модификации ДНК вE.coli, и плазмиду, содержащую нужную генную конструкцию, переносят путем конъюгации или электропорации в агробактерию (Agrobacterium). Затем, полученный штамм Agrobacterium используют для трансформации растительных клеток. Таким образом, для продуцирования обобщенного растительного экспрессирующего вектора, получают плазмиду, содержащую сайт инициации репликации, который позволяет ей реплицироваться в Agrobacterium с высоким числом копий сайта инициации репликации, и который является функциональным в E.coli. Это позволяет облегчить продуцирование и тестирование трансгенов в E.coli до переноса в Agrobacterium для последующего введения в растения. В этом векторе могут присутствовать гены устойчивости, а именно, один ген, который необходим для отбора в бактерии, например, ген устойчивости к стрептомицину, а другой ген,который функционирует в растениях, например,ген, кодирующий устойчивость к канамицину или гербициду. Кроме того, в этом векторе при 001622 26 сутствуют сайты рестриктирующих эндонуклеаз для встраивания одного или нескольких трансгенов и пограничных направляющих последовательностей Т-ДНК, которые, при распознавании функциями переноса Agrobacterium, определяют границы ДНК-области, которая будет перенесена в растение. В другом примере растительные клетки могут быть трансформированы путем выстреливания в эти клетки вольфрамовых микрочастиц, на которых присутствует осажденная клонированная ДНК. Биобаллистический аппарат(Bio-Rad), используемый для такого выстреливания порохового заряда (заряд для пистолета калибра 22, Power Piston Tool Charge), или воздуходувка, выстреливает пластиковый макроснаряд через дуло пистолета. Aликвоту суспензии вольфрамовых частичек, на которые осаждают ДНК, помещают перед пластиковым макроснарядом. Этот макроснаряд выстреливается в акриловое заграждение в виде пластины,имеющей сквозное отверстие, которое слишком мало для того, чтобы через него мог пройти макроснаряд. В результате этого, пластиковый макроснаряд ударяется о заграждение, и вольфрамовые микрочастицы направляются к своей мишени через отверстие в пластине. Для настоящего изобретения такой мишенью может быть любая растительная клетка, ткань, семя или эмбрион. ДНК, введенная в клетку на макрочастицах, интегрируется либо в ядро, либо в хлоропласт. В настоящее время перенос и экспрессия трансгенов в растительные клетки являются, в основном, стандартными методами, используемыми специалистами в этой области, и, кроме того, существует множество методов для осуществления исследований экспрессии генов в растениях, и для получения улучшенных сортов растений, представляющих агрономический или коммерческий интерес. Регенерация трансгенных растений Растительные клетки, трансформированные эксрессирующими векторами, могут быть регенерированы, например, из одной клетки,ткани каллуса или дисков листьев в соответствии со стандартной техникой культивирования растительной ткани. Каждому специалисту хорошо известно, что различные клетки, ткани и органы почти от любого растения могут быть с успехом культивированы и регенерированы в целое растение, и методы такой регенерации описаны, например, Vasil, см. выше; Green et al.,см. выше, WeissbachWeissbach, см. выше; иGelvin et al., см. выше. В одном из конкретных примеров клонированный полипептид химерной синтазы под контролем промотора EAS4 и терминатора нопалин-синтазы, с селектируемым маркером (например, геном устойчивости к канамицину) трансформируют в Agrobacterium. Трансформацию дисков листьев (например, дисков листьев 27 табака) вектор-содержащей агробактерией осуществляют как описано Horsch et al. (Science 227:1229 (1985. Через несколько недель (например, через 3-5 недель) предполагаемые трансформанты отбирают на среде для культивирования тканей, содержащей канамицин (например, 100 мкг/мл). Затем канамицинрезистентные всходы помещают на среду для культивирования растительной ткани, не содержащую гормонов для инициации роста корней. Затем канамицин-резистентные растения отбирают для выращивания в теплице. Если необходимо, то семена от самоопыляющихся трансгенных растений могут быть засеяны в беспочвенную среду и выращены в теплице. Канамицин-резистентное потомство может быть отобрано путем посева поверхностно стерилизованных семян на среду, содержащую канамицин и не содержащую гормонов. Анализ на интеграцию трансгена осуществляют стандартными методами (например, методами, описаннымиAusubel et al., см выше; Gelvin et al., см. выше). Затем трансгенные растения, экспрессирующие селектируемый маркер, скринируют на передачу трансгенной ДНК с помощью стандартного иммуноблоттинга и стандартными методами детекции ДНК. Каждое положительное трансгенное растение и его трансгенное потомство является уникальным при его сравнении с другими трансгенными растениями, полученными с тем же самым трансгеном. Интеграция трансгенной ДНК в геномную ДНК растения является, в большинстве случаев, произвольной, и сайт интеграции может в значительной степени влиять на уровни экспрессии и характер тканеспецифичности и стадиеспецифичности трансгена. Затем ряд трансгенных линий обычно скринируют для каждого трансгена в целях идентификации и отбора растений с наиболее приемлемыми профилями экспрессии. Трансгенные линии обычно оценивают на уровни экспрессии трансгена. Сначала определяют экспрессию на РНК-уровне для идентификации и количественной оценки положительных по экспрессии растений. Стандартной техникой для РНК-анализа, которая может быть применена для этих целей, являются анализы методомPCR-амплификации с использованием олигонуклеотидных праймеров, сконструированных для амплификации только трансгенных РНКматриц, и анализы методами гибридизации в растворе с использованием трансген-специфических зондов (например, Ausubel et al., см выше). Затем РНК-положительные растения анализируют на экспрессию белка с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием специфических антител против химерной синтазы(например, Ausubel et al., см выше). Кроме того,для определения локализации областей экспрессии в трансгенных тканях, в соответствии со стандартной техникой, могут быть осуществлены in situ-гибридизация и иммуноцитохимиче 001622 28 ский анализ с использованием трансгенспецифических нуклеотидных зондов и антител,соответственно. После экспрессии рекомбинантного белка химерной синтазы в любой клетке или в трансгенном растении (например, описанном выше),этот белок может быть выделен, например, с использованием аффинной хроматографии. В одном из примеров антитело против химерной синтезы (продуцированное, как, например, описано Ausubel et al., см. выше, или любым стандартным способом) может быть связано с колонкой и использовано для выделения полипептида. Перед проведением аффинной хроматографии может быть осуществлен лизис и фракционирование клеток, продуцирующих химерную синтазу, с использованием стандартной техники (например, Ausubel et al., см. выше). После выделения рекомбинантный белок может быть, если необходимо, дополнительно очищен с помощью высокоразрешающей жидкостной хроматографии (см., Fischer, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology,eds., Work and Burdon, Elsevier, 1980). Эти общие методы экспрессии и очистки полипептида могут быть также использованы для продуцирования и выделения нужных фрагментов или аналогов химерной синтазы. Использование Описанное в настоящей заявке изобретение может быть использовано в различных сельскохозяйственных, фармацевтических, промышленных и коммерческих целях. Так, например, методы, ДНК-конструкции, белки и трансгенные микроорганизмы, включая бактерии,дрожжи и растения, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для усовершенствования способов синтеза, промышленного изготовления и продуцирования изопреноидов. Результаты, представленные в настоящей заявке, показали, что можно модулировать активность изопреноид-синтазы путем получения химерных синтаз. В этом способе различные продукты синтазных реакций могут быть модифицированы, проконтролированы и соответствующим образом обработаны, что приводит к увеличению продуцирования различных продуктов синтазных реакций, например, продуцирования монотерпенов, дитерпенов и сесквитерпенов. Эти соединения могут быть использованы в качестве фитоалексинов, инсектицидов,ароматизирующих средств и фармацевтических препаратов, таких как противобактериальные и противогрибковые средства. Может быть сконструирован ряд химерных изопреноид-синтаз, которые могут быть использованы, например, для продуцирования соединений, обладающих противогрибковыми,антибактериальными и противоопухолевыми свойствами. Так, например, для продуцирования химерных синтаз, способных катализиро 29 вать продуцирование противогрибковых изопреноидов, С-концевой домен касбен-синтазы(МаuWest, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8497,1994) присоединяют к N-концу домена TEAS,HVS или СН 9. Для продуцирования химерной синтазы, способно катализировать продуцирование антибактериальных соединений, Сконцевой домен циклофарнезенон-синтазы(Наbtermariam et al., J. Nat. Prod. 56:140, 1993) присоединяют к N-концу домена TEAS, HVS или СН 9. Противомалярийные соединения могут быть продуцированы с использованием химерных синтаз, имеющих С-концевой домен от артемизиан-синтазы (E1-Feraly et al., J. Nat.TEAS, HVS или СН 9. Синтазы, способные продуцировать противоопухолевые соединения,получают путем присоединения С-концевого домена таксадиен-синтазы (Коерр et al., J. Biol.(Lee et al., Science 196:533, 1977) к N-концевому домену TEAS, HVS или СН 9. Настоящее изобретение может быть также использовано для получения химерных синтаз,которые способны продуцировать инсектициды. Такие химерные синтазы могут быть сконструированы путем присоединения С-концевого домена кадинен-синтазы (Chen et al., Arch. Biochem. Biophys. 324:255, 1995) и N-концевому домену TEAS, HVS или СН 9. И наконец, химерные синтазы могут быть также использованы для получения новых отдушек и ароматизирующих средств. В одном из конкретных примеров, для получения новых отдушек и ароматизирующих средств, химерную синтазу конструируют путем присоединения С-концевого домена лимонен-синтазы(Colby et al., J. Biol. Chem., 268:23016, 1993) к Сконцевому домену TEAS, HVS или СН 9. Все публикации и патенты, упомянутые в настоящем описании, вводятся в него во всей своей полноте посредством ссылки так, как если бы каждая конкретная публикация или каждый конкретный патент был указан отдельно. Другие варианты осуществления изобретения Исходя из вышеприведенного описания,каждый специалист легко поймет главные отличительные признаки настоящего изобретения и может внести различные изменения и модификации, адаптированные к различным целям и условиям применения. Таким образом, другие варианты осуществления настоящего изобретения также входят в объем притязаний, сформулированных в нижеследующей формуле изобретения. Список последовательностей 31 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Химерная изопреноидсинтаза, содержащая домен первой изопреноидсинтазы, связанный с доменом второй гетерологичной изопреноидсинтазы, причем указанная химерная изопреноидсинтаза способна катализировать образование изопреноидного продукта реакции, который не образуется в отсутствие домена второй гетерологичной изопреноидсинтазы. 2. Химерная изопреноидсинтаза по п.1, отличающаяся тем, что способна катализировать образование, по крайней мере, двух различных изопреноидных продуктов реакции. 3. Химерная изопреноидсинтаза по п.1, отличающаяся тем, что домен второй гетерологичной изопреноидсинтазы содержит соотношение-определяющий домен указанной химерной изопреноидсинтазы. 4. Химерная изопреноидсинтаза по п.1, отличающаяся тем, что она выбрана из группы,включающей (а) химерную изопреноидсинтазу СН 4 Nicotiana-Hyoscyamus; (б) химерную изопреноидсинтазу СН 10 Nicotiana-Hyoscyamus; (в) химерную изопреноидсинтазу CH11 NicotianaHyoscyamus; (г) химерную изопреноидсинтазу СН 12 Nicotiana-Hyoscyamus; (д) химерную изопреноидсинтазу СН 13 Nicotiana-Hyoscyamus; и(е) химерную изопреноидсинтазу СН 14 Nicotiana-Hyoscyamus. 5. Химерная изопреноидсинтаза по п.1, отличающаяся тем, что катализирует образование противогрибкового агента. 6. Химерная изопреноидсинтаза по п.1, отличающаяся тем, что катализирует образование антибактериального агента. 32 7. Химерная изопреноидсинтаза по п.1, отличающаяся тем, что катализирует образование противоопухолевого агента. 8. Химерная изопреноидсинтаза по п.1, отличающаяся тем, что указанный домен первой изопреноидсинтазы происходит из растительной изопреноидсинтазы, и указанный домен второй гетерологичной изопреноидсинтазы происходит из растительной изопреноидсинтазы. 9. Химерная изопреноидсинтаза по п.3, отличающаяся тем, что указанный соотношениеопределяющий домен указанной химерной изопреноидсинтазы определяет соотношение изопреноидных продуктов реакции указанной химерной изопреноидсинтазы. 10. Последовательность ДНК, кодирующая химерную изопреноидсинтазу по п.1. 11. Экспрессирующий вектор, содержащий последовательность ДНК по п.10. 12. Линия клеток, содержащих последовательность ДНК по п.10, используемая для получения химерной изопреноидсинтазы по п.1. 13. Линия клеток по п.10, отличающаяся тем, что представляет собой линию клеток Escherichia coli. 14. Способ получения химерной изопреноидсинтазы, предусматривающий осуществление следующих стадий:(а) получение линии клеток, содержащих последовательность ДНК по п.10, введенную в указанные клетки для обеспечения экспрессии химерной изопреноидсинтазы;(б) культивирование указанных клеток в условиях, подходящих для экспрессии указанной химерной изопреноидсинтазы; и(в) выделение химерной изопреноидсинтазы из указанных клеток или культуральной среды.