Вакцина против инфекции, вызванной вирусом герпеса, ассоциированным, по существу, с хозяйской клеткой

010721 Настоящее изобретение относится к области вакцинации против так называемого ассоциированного с хозяйской клеткой вируса герпеса, участвующего в таких заболеваниях, как вирусная болезнь Марека птиц (MDV) и вирус ветряной оспы человека (VZV, вызывающий ветряную оспу и опоясывающий лишай после реактивации из латентного периода), и к вакцинам против инфекций, вызванных указанными вирусами, в том числе к болезням птиц, в частности к области вакцинации против болезни Марека. В частности, болезнь Марека стала проблемой в птицеводстве в связи с началом интенсивного производства птичьего мяса. Она является заболеванием, вызываемым вирусом герпеса, которое сопровождается множеством клинических симптомов, начинающихся с иммуносупрессии, неврологических расстройств, анемии и неопределенной апатии и заканчивающихся тяжелыми заболеваниями лимфатических сосудов на более поздних стадиях инфекции. Первоначально при заболевании Марека не проводилось лечения и каких-либо профилактических мероприятий. Позднее из индеек выделили вирус (HVT) апатогенного типа (серотип 3) и использовали его для первоначальной вакцинации. Однако, спустя некоторое время после проведения вакцинации с использованием HVT, болезнь Марека возникла вновь и стало очевидным, что циркулирующие в среде вирусы изменились, обойдя защитный механизм, индуцированный штаммом HVT. В это же время был обнаружен новый апатогенный вирус (штамм Rispens), который в целом имеет тот же серотип, что и вирусы, вызывающие заболевание. Указанный вакцинный штамм был очень быстро выведен на фармацевтический рынок и привел к очень хорошим результатам при вакцинации. Однако примерно через десять лет вновь была отмечена вспышка заболевания, снова циркулирующие в среде вирусы изменились, обойдя защитный механизм, индуцируемый вакцинным штаммом, который использовался в данный момент. После этого для защиты животных использовали комбинацию обеих вакцин (HVT и Rispens), однако, удовлетворительные результаты наблюдались только временно. В настоящее время, несмотря на проведение всех таких вакцинаций, наблюдается новая вспышка заболевания. Причина указанной вспышки до сих пор непонятна, но совершенно очевидна потребность во внедрении новых мощных вакцин. Проблемы, связанные с вакцинацией против болезни Марека, заключаются в том, что независимо от того факта, что вакцины Марека производятся в течение длительного времени, способ получения указанных вакцин не удается усовершенствовать. Причиной этого является, главным образом то, что практически неразрывно связанный с хозяйской клеткой вирус может быть выращен, по существу, только в клетках первичного хозяина, например в случае MDV или HVT, в первичных клетках, таких как фибробласты, получаемые из птиц, таких как цыплята, свободные от патогена, или, в случае вируса ветряной оспы, в клетках (по существу, первичных) человека (также, разумеется, свободных от зараженности патогенами), и не могут или только с большими трудностями могут быть выращены вне пределов специфической клетки соответствующего хозяина. Данное обстоятельство делает производство вакцин, направленных против вирусных инфекций или болезней, вызванных указанными типами вирусов, сложным, если вообще возможным в практическом плане, и, исходя из этого, дорогостоящим. Так например, направленная против болезни Марека вакцина Rispens, которая в настоящее время считается единственной достаточно мощной, является, как и все вирусы Марека серотипа 1, строго связанной с хозяйской клеткой. Инфекционность ассоциированного с клеткой вируса (как, например, в случае серотипов 1 и 2) полностью теряется в ходе нормального процесса замораживания или лиофилизации. В этой связи, приготовление указанной вакцины включает очень сложную и дорогостоящую стадию, на которой целые клетки должны быть заморожены в жидком азоте. При этом вакцина должна храниться и транспортироваться, а в дальнейшем и сохраняться, в жидком азоте до момента использования,что порождает огромные затраты и проблемы в процессе транспортировки. Далее на месте использования при работе с указанной вакциной должны тщательно соблюдаться условия предосторожности, поскольку инфицированные клетки очень чувствительны к факторам окружающей среды. Факторы, такие как повышенная температура, воздействие света и наличие остаточных детергентов в используемой стеклянной посуде, зачастую способны повредить вирус так, что не удается приготовить достаточно жизнеспособную партию вакцины, что ведет к полной неспособности вакцины выполнять свою функцию. Причем, такой неудачный результат может быть распознан лишь в том случае, когда заболевание уже начинает распространяться и пораженные птицы демонстрируют симптомы заболевания. Вкратце, следует отметить, что вплоть до настоящего момента все попытки создать инактивированные, субъединичные или рекомбинантные вакцины для защиты от болезни Марека были неудачны, и в этой связи в настоящее время даже не рассматриваются альтернативы живым ассоциированным с клетками вакцинам, включающим вирусы болезни Марека. С болезнью Марека продолжают бороться путем применения препаратов с инфицированными клетками в качестве вакцины. Указанные препараты не только содержат живые клетки, суспендированные в ДМСО-содержащей среде, и множество клеточных антигенов, они, кроме того, должны сохраняться в жидком азоте. Следовательно, на пути от производства вакцины до потребителя и вплоть до стадии применения вакцины должна обеспечиваться холодовая цепь. Кроме того, после оттаивания вакцина должна быть введена в течение очень короткого периода времени каждой из птиц, подлежащeй инъекции. Некоторые из указанных проблем являются общими-1 010721 для случая получения вакцин против других непосредственно связанных с клетками вирусов герпеса,таких как вирус ветряной оспы. Вирус болезни Марека (MDV) относится к подсемейству Alphaherpesvirinae из семейства Herpesviridae (Lee et al, 2000, Murphy et al., 1995). На основании вирулентности в отношении цыплят и способности индуцировать Т-клеточные лимфомы, MDV подразделяют в основном на три серотипа (MDV-1,MDV-2 и MDV-3). Серотип MDV-3 представлен вирусом герпеса индеек (HVT), который широко используется для вакцинации против заболеваний, связанных с MDV. Однако неудачные результаты вакцинации и усовершенствование так называемого вирулентного и очень вирулентного MDV-1 (Witter, 1985) привели к применению в композициях для вакцинирования ослабленных MDV-2 штаммов и позже ослабленныхMDV-1 штаммов (например, штамма CVI 988 Rispens). В последние годы, причем первое сообщение появилось в Соединенных Штатах Америки, появились даже более вирулентные MDV-1, так называемые очень вирулентные плюс (vv+) варианты MDV-1, и вызвали резкий подъем уровня заболеваемости болезнью Марека и смертности, обусловленной развитием опухоли и иммуносупрессией на ранней стадии после инфекции (Witter, 1997). Один из vv+ штаммов, 584 А, пассировали более 100 раз на эмбриональных фибробластах цыпленка (CEF) и показали потерю его патогенности по отношению к цыплятам (Witter, 1997). Однако молекулярную основу указанного возрастания патогенности vv+ MDV-1 и, соответственно, потери вирулентности очень трудно понять, поскольку молекулярный анализ MDV-1 сложен для проведения. С одной стороны, потомство вируса в культивируемых клетках не высвобождалось вовсе или высвобождалось только в небольших количествах, с другой стороны, образование рекомбинантовMDV-1 представляет собой трудоемкий процесс и, в связи с высокой степенью естественной ассоциированности агента с клеточной культурой, нуждается в многочисленных циклах очистки вирусных рекомбинантов (Cantello et al., 1991; Sakaguchi et al., 1993; Parcells et al., 1994; Schat et al., 1998; Anderson et al.,1998). Но в первую очередь, как уже отмечалось выше, вакцинация не может гарантировать защиту животных от всей совокупности вирусов болезни Марека. Указанный вирус, как все вирусы герпеса, способен находить пути для обхода иммунной реакции, индуцированной указанными вакцинами. В этой связи была бы необходима быстрая адаптация вакцин к складывающейся ситуации. В настоящее время с этой целью проводят выделение набора изолятов (таких как HVT или Rispens) и/или их дальнейшее ослабление in vitro. Само по себе выделение уже порождает огромные проблемы в связи с трудностью получения ассоциированного с клеткой инфекционного вируса вне цыплят и инфицированных клеток в клеточной культуре. Стадии ослабления, которые должны следовать за этим, являются очень трудоемкими и длительными, особенно из-за того, что чрезвычайно сложна очистка бляшек, что опять-таки связано с естественной ассоциированностью вируса с клеткой. Результат ослабления обычно не определяют. В результате этого факта, уже в течение длительного периода времени на фармацевтический рынок не поступали вакцины, которые могли бы обеспечить замену имеющимся в настоящее время вакцинам HVT и Rispens там, где последние не оказывают нужного эффекта. Кроме того, зачастую наблюдается чрезмерное ослабление при производстве вакцины, поскольку вирус пассируют слишком много раз. Последнее обстоятельство дополнительно ухудшает низкую эффективность вакцин типа HVT и Rispens в полевых условиях. Вкратце, следует отметить, что следующие проблемы составляют значительную часть существующего в настоящее время безвыходного положения с контролем MDV. Это низкая репродуктивность производства классической вакцины, наблюдаемое иногда чрезмерное ослабление вакцинного вируса, неопределенное ослабление вакцинного вируса, высокая стоимость производства, высокая стоимость хранения и транспортировки, высокая чувствительность вакцины к факторам окружающей среды и слишком медленная разработка новых вакцинных штаммов, особенно для вирусов, ассоциированных с клеткой. На указанные проблемы накладывается тот факт, что вирусы, циркулирующие в среде в настоящее время, приводят к образованию высоких титров антител в запасах продуктов птицеводства, так что указанные высокие титры антител передаются по линии потомства через материнские антитела в яйцах. Влияние указанных материнских антител в процессе первичной инфекции посредством используемых в настоящее время вирусных вакцин дополнительно снижает эффективность вакцинации против болезни Марека. Настоящее изобретение предлагает вакцину, направленную против инфекции, вызванной вирусом герпеса, который, по существу, ассоциирован с хозяйской клеткой, причем указанная вакцина включает рекомбинантный вирусный геном, полученный из указанного вируса герпеса, при этом указанный геном позволяет осуществлять рекомбинацию практически без наличия указанной хозяйской клетки. В этой связи настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусному геному, полученному из вируса герпеса, который рассматривается как, по существу, ассоциированный с хозяйской клеткой, причем указанный геном предпочтительно способен, по меньшей мере в некоторой степени, к репликации в указанной хозяйской клетке и в то же время позволяет осуществлять рекомбинацию по существу в отсутствие или независимо от указанной хозяйской клетки, то есть гомологичная рекомбинация в эукариотических клетках уже не является необходимой. В приведенном ниже подробном описании предлагается такой-2 010721 геном для случая вируса, подобного вирусу, вызывающему болезнь Марека. В связи с вышесказанным, в качестве примера генома вируса болезни Марека серотипа 1 (MDV-1),штамм 584 Ар 80 С был клонирован в Escherichia coli, которую используют в качестве искусственной бактериальной хромосомы (ВАС). Векторные последовательности ВАС вводили в локус Us2 генома MDV-1 посредством гомологичной рекомбинации после совместной трансфекции эмбриональных фибробластов цыпленка (CEF) вирусной ДНК и рекомбинантной плазмидой pDS-pHA1, которая включает ВАСпоследовательности и ген Eco-gpt взамен Us2-гена MDV-1 и фланкирующие последовательности. Трансфицированное потомство пассируют на клетках CEF в присутствии микофеноловой кислоты и смеси ксантин/гипоксантин. После четырех циклов отбора получают вирусную ДНК и используют ее для трансформации Escherichia coli штамм DH10B. Идентифицируют несколько колоний, несущих полный геном MDV-1. Указанные ВАС, несущие MDV-1, трансфицируют в клетки CEF и, начиная с третьего дня после трансфекции инфекционность MDV-1 восстанавливается. Рост MDV-1, восстановленный посредством различных ВАС, неотличим от роста родительского вируса, на что указывают результаты анализа образования бляшек и определения кривых роста. Таким образом, настоящее изобретение предлагает способ производства или получения рекомбинантного генома вируса герпеса, ассоциированного по существу с хозяйской клеткой, включающего производное (в зависимости от потребности почти полное или полное) нуклеиновой кислоты, полученной на основе изолята MDV и/или VZV. И поскольку по существу полный геном получен без присутствия хозяйских клеток, хотя первоначально считалось, что они тесно ассоциированы, то настоящее изобретение также предлагает геном согласно настоящему изобретению, который позволяет осуществлять в полной мере применение всех рекомбинантных методик, доступных специалисту в данной области молекулярной биологии, например,предлагает также вакцину согласно настоящему изобретению, которая по меньшей мере включает (репликативный) мини-геном. Так, например, настоящее изобретение предлагает мини-геном, который обеспечивает только экспрессию только сцепленных гликопротеинов (таких как gB, gC, gD или их сочетаний), и, например, ICP4 или другой генный продукт, который, как было показано, индуцирует клеточный иммунитет на вирус герпеса. Такой мини-геном, например, служит целям идентификации генов, важных для защиты, если полагать, что репликация генома в (эукариотических) хозяйских клетках больше не происходит. Добавление, например, промотора HCMV или SV40 перед каждым геном или генной конструкцией могло бы обеспечить окончательную идентификацию минимальной защитной единицы. В случае компетентного для репликации мини-генома настоящее изобретение также предлагает возможность удаления полного или основной части US-региона, посредством чего получаемый мини-вирус реплицируется также в хозяйских клетках. В другом варианте настоящее изобретение предлагает такой геном, который включает по существу копию полной длины, полученную из указанного вируса герпеса, при этом термин по существу полной длины указывает на то, что большая часть генов указанного вирусного генома присутствует, за исключением некоторых из них, которые предпочтительно (по меньшей мере функционально) отсутствуют,таких как ген, необходимый для репликации или распространения вируса в хозяйской клетке или в культуре хозяйских клеток, что более детально будет рассмотрено далее в настоящем описании. В этой связи,например, в одном из восстановленных геномов согласно настоящему изобретению последовательности ВАС 20, кодирующие гликопротеин В (gB), были подвергнуты удалению посредством одностадийногоrecE-опосредованного мутагенеза с использованием фрагмента линейной ДНК. Негативные по гликопротеину В MDV-1, восстановленные после трансфекции gB-негативной ВАС 20 ДНК (20DgB), были способны расти только на клетках, обеспечивающих gB in trans (в процессе трансфекции), указывая на то,что дВ необходим для роста MDV-1 в культуре хозяйских клеток. Другие гены, необходимые для роста,и для которых могут быть предусмотрены клетки, которые продуцируют генный продукт in trans, представляют собой gH, ICP4, UL15, UL28 и UL9 или другие гены, считающиеся незаменимыми для роста,такие, как перечисленные ниже. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию генома согласно настоящему изобретению при получении вакцины, причем в одном из вариантов реализации такая вакцина направлена против инфекции, вызываемой вирусом герпеса, ассоциированным по существу с хозяйской клеткой,однако в другом варианте осуществления изобретения такая вакцина может быть использована в качестве векторной вакцины и может включать другие или дополнительные патогены или тяжи нуклеиновой кислоты, кодирующие их. В случае MDV нуклеиновая кислота предпочтительного дополнительного патогена включает нуклеиновую кислоту, полученную, например, из вируса болезни Ньюкастла, Eimeriaspp., Salmonella spp, вируса инфекционной анемии цыплят, вируса гриппа, вируса инфекционного заболевания синовиальной сумки, реовируса или других патогенов, обычно встречающихся в птицеводстве. Таким образом, настоящее изобретение также относится к вакцине, причем указанный геном содержит функциональную делецию в гене, необходимом для репликации и/или для распространения указанного вируса герпеса в хозяйской клетке, или указанный геном вируса включает по существу нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген, который вызывает иммунный ответ (предпочтительно по сущест-3 010721 ву защитный) против инфекции индивидуума указанным вирусом герпеса. Типичный необходимый ген или его фрагмент, который должен быть удален, может представлять собой, например, у MDV гомологUL27 = гликопротеин В; UL28; UL29; UL30; UL52; UL53; ICP4 или гены или их фрагменты, выбранные из US-региона указанного генома (фиг. 1). В предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение относится к вакцине, включающей функциональную маркерную делецию в гене, необходимую для проявления маркерного иммунного ответа, специфичного для указанного вируса герпеса, которая позволяет проводить иммунологическое разделение между результатом вакцинации индивидуума указанной вакциной и результатом, наблюдаемым у индивидуума, инфицированного указанным вирусом герпеса, ассоциированным по существу с клеткой. Реакции предпочтительного маркера направлены, например, на gC, gM, gD или gE, при этом приведенное ниже подробное описание содержит пояснение (в данном варианте для случая gM) относительно делеции в гене, необходимой для проявления маркерного иммунного ответа. Кроме того, настоящее изобретение относится к рассматриваемой в нем вакцине, причем указанный вирусный геном включает, по меньшей мере, нуклеиновую кислоту, кодирующую протеиноподобное вещество, способное к модуляции транскрипции и/или трансляции нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, вызывающий иммунный ответ против инфекции, вызываемой указанным вирусом герпеса. Предпочтительно указанная вакцина включает копию по существу полной длины, полученную из указанного вируса герпеса с целью поддержания такого количества функций, которое требуется для эффективной модуляции транскрипции и/или трансляции генома вакцины в вакцинируемой хозяйской клетке, однако изобретение также относится к вакцинации с использованием мини-генома. Несомненно,предпочтительно осуществлять эффективную модуляцию транскрипции и/или трансляции нуклеиновой кислоты, кодирующей чужеродный патоген или полученное из него антигенное вещество, когда экспрессируется дополнительный патоген или антигенное вещество, полученное на его основе из указанного генома, и можно также полагать, что чужеродные вещества (то есть, регуляторные элементы не из вируса герпеса) снабжены указанным геномом, когда предлагается вакцина по изобретению, дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген другого патогенного организма. В частности, настоящее изобретение предоставляет вакцину согласно настоящему изобретению, в которой указанный вирус герпеса включает вирус, подобный возбудителю болезни Марека. В частности,предпочтительно обеспечить наличие вакцины, в которой указанный вирус, подобный возбудителю болезни Марека, относится к серотипу 1. И кроме того, поскольку методы манипуляций с геномом могут осуществляться вне хозяйской клетки, с которой геном изначально был связан, то предлагаемую вакцину вместо того, чтобы получать ее из нормально ослабленных или авирулентных изолятов вируса, подобного возбудителю болезни Марека, получают из вирулентного, очень вирулентного или очень вирулентного плюс вируса дикого типа, поскольку быстрое выделение инфекционных клонов из полевых изолятов теперь уже стало возможным, что позволяет получить вакцинные ДНК для профилактики болезни Марека у цыплят и индеек, когда мутации в геноме могут быть быстро применены для использования. Сходная система может также использоваться для других по существу ассоциированных с клеткой вирусов герпеса, таких как вирус ветряной оспы. Использование репликативных вирусных геномов в контексте настоящего описания, содержащих части целого и инфекционного геномов вируса болезни Марека (MDV-1), открывает множество новых возможностей для получения более эффективных, биологически безопасных и стабильных вакцин MDV1. В связи с тем фактом, что рекомбинантные MDV-1 восстанавливают из клонированной ДНК, вирусное потомство, получаемое после трансфекции ДНК, может быть лучше охарактеризовано и в этой связи может быть реально избавлено от последствий чрезмерного ослабления вакцинных вирусов. Например, количество повторов 132-bp, которое, по всей видимости, кажется связанным с ослаблением (Maotani et al., 1986), может быть точно определено и, если необходимо, быть снижено или увеличено в соответствии с потребностью, диктуемой требованиями производства вакцины или ситуацией в полевых условиях (см. ниже). Создание мутанта MDV-1 значительно упрощается. Следует напомнить, что мутантыMDV-1 получают с помощью трудоемкого и длительного процесса гомологичной рекомбинации и процедур селекции в эукариотических клетках. Указанные процедуры отбора, как отмечается для других вирусов герпеса, часто приводят к мутациям генома в других, отличных от желаемых, сайтах, особенно поскольку в случае MDV-1 не может быть получен бесклеточный вариант вируса, что делает процедуры отбора, восстановления и размножения мутантов еще более усложненными. И наоборот, настоящее изобретение обеспечивает способ манипуляций с вирусным геномом на основе мутагенеза с использованиемrecE-, recT- и recB/C-супрессирования гена A gam, присутствующего на плазмиде pGETrec (Narayanan etal., 1999). Преимуществами указанной системы являются: (i) то, что только гомологичные участки длиной от 30 до 50 bp требуются для достижения специфической последовательности, подлежащей удалению, то есть удаление любой открытой рамки считывания может быть достигнуто без необходимости клонировать рекомбинационные кассеты, (ii) способ очень быстрый и (iii) то, что вектор pGETrec, определяющий способность системы к мутагенезу и экспрессирующий устойчивость к ампициллину, быстро исчезает из бактериальных клеток в отсутствие ампициллина.-4 010721 При применении мощных технологий, использующих так называемые процедуры Е/Т клонирования, возможно осуществление одностадийной мутации и отбора в Escherichia coli (Muyrers et al., 1999;Narayanan et al., 1999; Zhang et al., 1998). Такая методика позволяет также проводить удаление обязательных генов MDV-1 без необходимости использования дополняющих клеточных линий, поскольку репликация мутировавших геномов MDV-1 согласно настоящему изобретению не требует транскомплементарности в случае удаления необходимого гена. Кроме того, становятся необязательными процедуры клонирования. В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения MDV-1 или других (по существу ассоциированных с клетками вирусов герпеса) вирусных ВАС, включающему трансформацию,например, клеток Escherichia coli DH10B плазмидой pBAD, pGETrec или любой другой плазмидой,которая индуцибельно или стабильно экспрессирует ген recE, recT иgam, с последующим получением кольцевой вирусной ДНК из литически или латентно инфицированных клеток, взятых, например, exvivo, или из клеточных культур. В качестве параллельной или отдельной процедуры также предлагаются линейная ДНК, несущая последовательности ВАС-вектора и последовательности, которые позволяют осуществлять гомологичную рекомбинацию последовательностей ВАС-вектора с вирусной ДНК. Указанная линейная ДНК может быть, например, получена посредством ПЦР или посредством линеаризации плазмидной ДНК. Затем осуществляют экспрессию гена recE, recT иgam в Escherichia coli и получают электрокомпетентные клетки (см, например, Sambrook et al., 1989). Вирусную ДНК затем подвергают электропорации совместно с линейной ДНК, несущей последовательности ВАС-вектора, в компетентные клетки Escherichia coli. Затем для получения колонии или колоний их помещают на агаровые пластинки,содержащие соответствующие антибиотики, и ВАС-ДНК может быть получена как описано, например, в процедуре, приведенной в разделе подробного описания настоящего изобретения. Инфекционность клонированной вирусной ВАС-ДНК контролируют посредством трансфекции чувствительных клеток. Настоящее изобретение, таким образом, предлагает способ генетической рекомбинации генома вируса герпеса, ассоциированного по существу с хозяйской клеткой, который получают из хозяйской клетки или ткани без необходимости проводить (гомологичную) рекомбинацию в эукариотических клетках, что позволяет получать (при необходимости полный или почти полный) инфекционный геном или нуклеиновую кислоту вируса герпеса из полевых изолятов или аналогичных ослабленных изолятов. Способ согласно настоящему изобретению позволяет также дополнительно ослаблять предполагаемую для использования вакцину MDV-1 или получать мутанты MDV-1, несущие гены других важных для цыплят патогенов. Кроме того, возникающие в полевых условиях изоляты MDV-1, несущие, возможно, иные и измененные антигенные свойства, могут быть остановлены с помощью вакцины, построенной на основе обмена соответствующих мутировавших генов между клонированными MDV-1 и возникшим(ми) в полевых условиях изолятом(ами). Такие замены, как указано выше, могут быть проведены с помощью сходной методики Е/Т клонирования, и в этом качестве они обеспечивают возможность очень быстро реагировать на изменения MDV-1 в полевых условиях. Привлекательной особенностью восстановления инфекционных MDV-1 в соответствии с настоящим описанием является, однако, использование рассматриваемого в нем генома в качестве ДНК вакцины. Вплоть до настоящего времени борьба с болезнью Марека проводилась путем применения препаратов с инфицированными клетками. Такие препараты не только содержат живые клетки, суспендированные в ДМСО-содержащей среде,и большой набор клеточных антигенов, они также должны храниться в жидком азоте. Следовательно, на всем пути от стадии производства вакцины до поступления ее к пользователю и вплоть до введения должна постоянно поддерживаться холодовая цепь. Кроме того, после оттаивания вакцина должна быть введена в течение очень короткого периода времени, причем инъецирована каждой птице. В случае ДНК генома MDV-1 в соответствии с настоящим описанием, очистка вакцины (ДНК) легко достижима и воспроизводима. ДНК чрезвычайно стабильна, поддержание холодовой цепи не требуется и инфекционная ДНК может быть введена несколькими способами (внутримышечно, внутрикожно, внутрь яйцеклетки, перорально, респираторным путем и т.п.) и в виде различных композиций (при наличии носителя и без него и т.д.). Кроме того, наличие материнских антител не препятствует первичной инъекции иммуногена. По существу, геномы MDV-1 согласно настоящему описанию впервые дают возможность производить и конструировать высоко эффективные и биологически безопасные вакцины против вызывающих опухоли и экономически значимых заболеваний. Таким образом, настоящее изобретение предлагает способ снижения риска индивидуума в отношении приобретения или полного проявления заболевания, вызываемого инфекцией вирусом герпеса, по существу, ассоциированного с хозяйской клеткой, который включает введение указанному индивидууму, нуждающемуся в этом, вакцины согласно настоящему изобретению или генома согласно настоящему изобретению. Подробное описание Вирус болезни Марека (MDV) является представителем подсемейства Alphaherpesvirinae семействаHerpesviridae (van Regenmortel et al, 1999). На основании вирулентности в отношении цыплят, способно-5 010721 сти индуцировать Т-клеточные лимфомы и антигенных свойств, MDV подразделяются на три серотипа(MDV-1, MDV-2 и MDV-3) (Payne, 1985). Серотип MDV-3 представлен вирусом герпеса, поражающим индеек (HVT), который широко использовался для вакцинации против заболеваний, связанных с MDV. В соответствии с современной номенклатурой, MDV-1 классифицируют как вирус герпеса 2 gallid (GHV2), MDV-2 как GHV-3 и HVT как вирус герпеса meleagrid. Все три вируса принадлежат к новому роду вирусов, подобных вирусу болезни Марека, внутри подсемейства Alphaherpesvirinae. Контроль над инфекцией, связанной с MDV-1, достигается вакцинацией преимущественно HVT,однако после неудач с вакцинацией и описания так называемого очень вирулентного MDV-1 (Witter,1989) в композициях для вакцинации стали применять штаммы MDV-2 и, позднее, ослабленные штаммыMDV-1 (например, штамм CVI 988 Rispens) (Witter, 1985). В последние годы, причем первое сообщение об этом появилось в Соединенных Штатах Америки,появился еще более вирулентный MDV-1, так называемый очень вирулентный плюс (vv+) вариантMDV-1, и вызвал резкий подъем смертности даже среди вакцинированных групп птиц (Witter, 1997). Один из указанных vv+ штаммов, 584 А, был серийно пассирован на эмбриональных фибробластах цыпленка (CEF) , после чего он терял патогенность по отношению к цыплятам (Witter, 1997). Молекулярная основа указанной увеличенной патогенности vv+ MDV-1 и, соответственно, потери вирулентности очень трудно понять, поскольку молекулярный анализ MDV-1 очень сложен для проведения. С одной стороны, никакого потомства вируса не высвобождалось в культивируемых клетках, с другой стороны, получение рекомбинантов MDV-1 представляет собой трудоемкий процесс и, в связи с высокой степенью естественной ассоциированности агента с клеточной культурой in vitro, существует необходимость в многочисленных циклах очистки вирусных рекомбинантов (Cantello et al., 1991; Sakaguchiet al., 1993; Parcells et al., 1994, 1995; Schat et al., 1998; Anderson et al., 1998). Кроме того, для роста MDV1 необходимо использовать первичные клетки (Payne), а это приводит к тому, что анализ основных геновMDV-1 практически невозможен, так как не могут быть получены транс-комплементарные клеточные линии. С использованием указанной методики были клонированы в виде инфекционных ВАС геномы мышиных и человеческих цитомегаловирусов (MCMV и HCMV; Messerle et al., 1997; Borst et al., 1999), вирусы простого герпеса типа 1 (HSV-1; Suter et al., 1998), вирус ложного бешенства (PrV; Smith et al., 1999,2000), и вирус Эпштейна-Барра (EBV; Delecluse et al., 1998). Цель настоящего исследования состояла в создании основы для быстрого и эффективного получения рекомбинантов MDV-1 посредством клонирования полного генома размером 180 тыс. п.н. в Escherichia coli. Инфекционный MDV-1 легко восстанавливали после трансфекции клонированной ДНКMDV-1 ВАС с использованием клеток CEF, при этом MDV-1 ВАС оставались стабильными после нескольких циклов роста бактерий или серии размножений в клетках CEF. И, наконец, в связи с тем, что одностадийная делеция необходимого гена в Escherichia coli стала возможной, указанная система обладает большим потенциалом с точки зрения облегчения дальнейшего анализа обязательных и необязательных генов MDV-1 и может служить в качестве инструмента для получения модифицированных биологически безопасных вакцин на основе живых вирусов и/или ДНК. Материалы и методы Вирусы и клетки. Первичные или вторичные эмбриональные фибробласты цыпленка (CEF) или мышечные клетки перепелки (QM7) поддерживали на модифицированной по Дульбекко основной среде(DMEM), обогащенной 5-10% фетальной сывороткой теленка (FCS). Штамм MDV-1 584 Ар 80 С был любезно предоставлен доктором Рихардом Виттером (Dr. Richard Witter, ADOL, East Lansing, Michigan,США). Штамм 584 Ар 80 С представляет собой пассированного на культуре клеток авирулентного потомка vv+ штамма 584 А (Witter,1997) и выращивается на первичных и вторичных клетках CEF, как было описано ранее (Osterrieder, 1999). Клетки QM7 тестировали на отсутствие последовательностей MDV-1 посредством метода ПЦР и Саузерн-блот гибридизацией, направленной на различные участки генома перед использованием их для размножения MDV-1 (Zelnik and Osterrieder, неопубликованные данные). Кривые роста вируса были построены по описанной ранее методике с небольшими модификациями (Parcells et al., 1994). В основных чертах процедура состоит в том, что 100 бляшкообразующих единиц (БОЕ) используют для инфицирования 2106 свежепосеянных клеток CEF. В различные моменты времени после инфицирования (0, 12, 24, 48, 72, 96, 120 ч) инфицированные клетки обрабатывают трипсином и титруют на свежих клетках CEF. Определяют количество бляшек и результаты выражают в виде среднего значения из двух независимых экспериментов. Клеточная линия QM7, устойчиво экспрессирующая gB MDV-1, была получена путем трансфекции 1106 клеток QM7 с использованием 10 мкг pcMgB (фиг. 1), которая основана на рсДНК 3 (Invitrogen) и содержит gB-ген MDV-1 из штамма Rispens CVI988, под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса. Клетки QM7, содержащие pcMgB, выделяют в присутствии 1 мг/мл G418, и клоны,экспрессирующие gB, идентифицируют с использованием анти-gB моноклональных антител (mab) 2K11(любезно предоставленных д-ром Jean-Francois Vautherot, INRA, Tours, Франция). Полученная при этом клеточная линия, экспрессирующая gB MDV-1, была обозначена как MgB1.-6 010721 Конструирование MDV-1 ВАС. ДНК MDV-1 очищают из инфицированных клеток посредством экстракции смесью додецилсульфат натрия-протеиназа K, как было описано ранее (Morgan et al., 1990). Плазмиду pDS-pHA1 конструируют следующим образом. Фрагменты размером 2,1 и 3,1 тыс. п.н. на любой стороне Us2-гена MDV-1 (фиг. 1) амплифицируют в ходе полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с использованием стандартных праймеров, содержащих подходящие сайты для ферментов рестрикции (табл. 1), и оба фрагмента клонируют в pTZ18R (Pharmacia-Amersham). ВАС-вектор, содержащий ген Eco-gpt под контролем раннего промотора HCMV, высвобождают из плазмиды рНА 1 (любезно предоставленной д-ром M.Messerle, LMU Munich, Германия; Messerle et al., 1997) и вставляют в сайты PacI, представленные в двух фрагментах размером 2,1 и 3,1 тыс. п.н., присутствующих в плазмиде pDS (фиг. 1). Первичные клетки CEF подвергают совместной трансфекции 2 мкг ДНК 584 Ар 80 С и 10 мкг pDSpHA1. На 5 день после трансфекции клетки наслаивают на первичные клетки CEF в присутствии 250 мкг/мл микофеноловой кислоты (МФК), 50 мкг/мл ксантина и 100 мкг/мл гипоксантина. Отбор с использованием смеси МФА/ксантин/гипоксантин повторяют в общей сложности четыре раза. После развития полного цитопатического эффекта (цпэ) в результате четырех циклов селекции, из инфицированных клеток получают вирусную ДНК и 1 мкг инфицирующей клетки ДНК вводят методом электропорации в клетки Escherichia coli DH10B. Колонии регистрируют через 16 ч после трансфекции на чашках с агаром,содержащих 30 мкг/мл хлорамфеникола (Sambrook et al., 1989). Отдельные колонии отбирают и затем выделяют ВАС-ДНК из Escherichia coli с использованием стандартной процедуры щелочного лизиса(Sambrook et al., 1989). Получение ВАС-ДНК в крупных масштабах проводят методом аффинной хроматографии на основе силикагеля с использованием коммерчески доступных наборов (Qiagen, MachereyNagel). Для дальнейшего анализа были отобраны три ВАС-клона 584 Ар 80 С MDV-1 (BAC19, ВАС 20,ВАС 24). Мутагенез ВАС MDV-1. Для мутагенеза клонированной ДНК MDV-1 в Escherichia coli проводят катализируемые recE реакции, ускоряющие гомологичную рекомбинацию между линейными фрагментами ДНК, получившие название Е/Т-клонирования (Zhang et al., 1998; Narayanan et al., 1999). ПлазмидуpGETrec (любезно предоставленную д-ром Panos Ioannou, Murdoch Institute, Melbourne, Австралия), несущую recE, recT и gam-ген бактериофага 1, трансформируют в содержащие ВАС 20 клетки DH10B (Narayanan et al., 1999). После индукции recE, recT и gam посредством добавления 0,2% арабинозы получают электрокомпетентные клетки, по существу так, как было описано Narayanan. Для удаления gB-гена в ВАС 20 с помощью метода ПЦР амплифицируют ген устойчивости к канамицину (kanR) в плазмидеpEGFP-N1 (Clontech). Подготовленные праймеры содержат гомологичные плечи по 50 нуклеотидов, ограничивающие желательную делецию внутри gB и 20 нуклеотидов для амплификации kanR (табл. 1). Полученный фрагмент размером 1,6 тыс. п.н. очищают на агарозном геле (Qiagen) и вводят методом электропорации в клетки с ВАС 20, содержащей pGETrec. Колонии, несущие гены camR и kanR, идентифицируют на чашках, содержащих оба антибиотика (Narayanan et al., 1999) . Анализ ДНК. ДНК ВАС или вирусную ДНК 584 Ар 80 С расщепляют с помощью EcoRI, BamHI, BglII или StuI и разделяют в 0,8% агарозных гелях. Фрагменты ДНК переносят на положительно заряженные нейлоновые мембраны (Pharmacia-Amersham) и проводят Саузерн-блот гибридизацию с использованием меченой дигоксигенином ВАС 19 ДНК или индивидуальных BamHI фрагментов MDV-1 штамма GA (Fukuchi et al., 1991; Osterrieder, 1999). Дополнительно готовят gB-специфичный зонд из плазмиды pcgB и зонд, несущий ген kanR, для анализа gB-негативной ВАС MDV-1. Хемилюминисцентное обнаружение гибридов ДНК с использованием CSPD проводят в соответствии с инструкцией производителя (Roche Biocnemicals). Непрямая иммунофлуоресценция. Для проведения анализов методом непрямой иммунофлуоресценции (НИФ) клетки выращивают на 6- или 24-луночных планшетах (Greiner) или на покровных стеклах и затем инфицируют в нужных вариантах. Клетки фиксируют 90% ацетоном в различные моменты времени после инфицирования или трансфекции и проводят анализ методом НИФ в точном соответствии с описанной методикой (Meindl and Osterrieder, 1999). Образцы анализируют с помощью флуоресцентной микроскопии или конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Используемые антитела представляют собой анти-gB моноклональные антитела 2 К 11, анти-рр 38 моноклональные антитела Н 19 (любезно предоставленные д-ром Lucy Lee, ADOL, East Lansing, MI) или конвалесцентную сыворотку из цыплят, инфицированных MDV-1 (MDSI). Результаты Конструирование и анализ ВАС, содержащих полные геномы MDV-1. Один миллион первичных клеток CEF инфицируют с использованием 1104 БОЕ штамма MDV-1, т.е. инфицированные клетки смешивают с неинфицированными клетками. После достижения полного цитопатического эффекта выделяют ДНК из инфицированных клеток и 2 мкг вирусной ДНК трансфицируют в 1106 первичных клеток CEF совместно с 10 мкг pDS-pHA1 плазмидой ДНК. Через пять дней после трансфекции клетки высевают вместе со свежими CEF и наслаивают сверху селективную питательную среду. Указанную процедуру повторяют в общей сложности четыре раза. В итоге, выделяют ДНК из рекомбинантных MDV-1, которые способны расти в присутствии смеси МФА/ксантин/гипоксантин, и под-7 010721 вергают ее Саузерн-блот анализу с использованием меченой рНА 1 в качестве зонда. Можно показать,что часть вирусной ДНК содержит вставленные в нее последовательности плазмиды F (данные не приведены). Используют один микрограмм указанной вирусной ДНК для трансформации клеток Escherichiacoli DH10B. Трансформированные бактерии помещают на чашки с агаром, содержащие 30 мкг/мл хлорамфеникола и отбирают единичные колонии. ДНК из бактериальных колоний экстрагируют с использованием стандартных процедур получения плазмид (Sambrook et al., 1989) и разгоняют в 0,8% агарозных гелях. Было установлено, что несколько бактериальных колоний содержат высокомолекулярную внехромосомную ДНК, и три из указанных клонов (ВАС 19, ВАС 20 и ВАС 24) были отобраны для дальнейшего анализа (фиг. 2). Для дальнейшей характеристики выделенных ВАС-клонов проводят Саузерн-блот анализы ДНК 584 Ар 80 С и ВАС после расщепления с помощью BamHI или EcoRI, используя в качестве зонда меченую ВАС 19 ДНК. Можно было показать, что ДНК из ВАС 19, ВАС 20 и ВАС 24 образуют практически идентичные фрагменты при расщеплении рестриктазами в сравнении с таковыми, образующимися при расщеплении родительской 584 Ар 80 С (фиг. 3 А и В). Однако отчетливо отмечаются два существенных исключения. Фрагмент BamHI-A размером 20 тыс. п.н., присутствующий в ДНК 584 Ар 80 С, отсутствует во всех проанализированных ВАС-клонах. Вместо этого, в ДНК ВАС 19, ВАС 20 и ВАС 24 обнаружены фрагменты размером 16 и 10 тыс. п.н. (фиг. 3 В). Указанные две полосы соответствуют увеличенному фрагменту BamHI-A, в который посредством вставки плазмиды F и делеции последовательностейUs2 был введен дополнительный сайт BamHI (фиг. 1). В ВАС ДНК, расщепленной EcoRI, обнаруживается одна дополнительная полоса размером 5,8 тыс. п.н. (ВАС последовательности) и небольшие изменения в размерах фрагментов, вызванные делецией гена Us2 (фиг. 1 и 3 В). Правильность вставки ВАС последовательностей в различные клоны далее проверялась в ходе анализа методом Саузерн-блот гибридизации с использованием меченых вставок плазмидыpDS или рНА 1 в качестве зонда, при этом наблюдалась ожидаемая картина реакции в отношении ДНК,расщепленной с помощью BamHI или EcoRI. В ВАС ДНК фрагменты, полученные после расщепленныхBamHI, размером 16 и 10 тыс. п.н. специфически реагируют с pDS зондом, тогда как только один фрагмент размером 10 тыс. п.н. реагирует с зондом, полученным из плазмиды рНА 1 (фиг. 1; фиг. 3 С и D). В ДНК из ВАС 19, ВАС 20 или ВАС 24, расщепленных с помощью EcoRI, фрагменты размером 4,3,2,8 и 1,7 тыс. п.н. специфически реагируют с pDS зондом, тогда как фрагменты размером 5,8 и 1,7 тыс. п.н., специфически гибридизуются с рНА 1 зондом (фиг. 1, фиг. 3 С и D). Указанные фрагменты точно соответствуют тем структурам, которые предсказывались как результат вставки последовательностей рНА 1 (фиг. 1), на основании чего был сделан вывод о том, что последовательности плазмиды F были правильно вставлены вместо ОРС Us2 во все проанализированные ВАС MDV-1. Кроме того, некоторые вариации в характере расположения полос в образцах ВАС 19, ВАС 20 и ВАС 24 были отмечены в ДНК,расщепленной как BamHI, так и EcoRI, например, отмечается дополнительная полоса размером приблизительно 6,2 тыс. п.н. в ВАС 19 ДНК, расщепленной BamHI, или дополнительные полосы в ДНК изBAC20 и BAC24, расщепленных EcoRI (фиг. 2, 3 А и В) . Что касается вопроса о наблюдавшихся вариациях в размерах индивидуальных фрагментов, полученных под действием рестриктаз, то гибридизация с меченым фрагментом BamHI-D имела место, поскольку вариации в размере концевых и внутренних повторов уникального длинного региона (TRL и IRL) были общими. Методом Саузерн-блоттинга было показано, что дополнительные фрагменты, наблюдаемые в расщепленных как BamHI, так и EcoRI ДНК из ВАС 19, ВАС 20 или ВАС 24, действительно были результатом вариаций в TRL и IRL. В то время, как в вирусной ДНК 584 Ар 80 С, расщепленной с помощьюBamHI, обнаруживались две широкие полосы зонда BamHI-D, размеры которых варьировали в пределах приблизительно от 9 до 15 тыс. п.н. и от 4 до 8 тыс. п.н. (что соответствует BamHI-D и -Н фрагментам вирулентного MDV-1, соответственно; фиг. 1), отчетливые, но отличные полосы наблюдались во всех проанализированных ВАС-клонах (фиг. 4). Все другие фрагменты различных ВАС-клонов, полученные под действием рестриктаз, были, скорее всего, идентичными таковым из вирусной ДНК 584 Ар 80 С. Указанный факт был подтвержден с использованием нескольких других меченых фрагментов BamHI в качестве зондов, включая BamHI-A, -В, -С и -I2 фрагменты (данные для зонда BamHI-С в качестве примера приведены на фиг. 4). Восстановление инфекционных MDV-1 из клонированной ДНК. ДНК из ВАС 19, ВАС 20 или ВАС 24 трансфицируют в первичные CEF. На 3-7 день после трансфекции появляются специфичные вирусные бляшки MDV-1, как показал анализ методом НИФ с использованием анти-MDV-1-gB моноклональных антител. MDV-1, оставшийся после трансфекции различными ВАС, был затем высеян совместно со свежими клетками CEF и размеры бляшек были сопоставлены с размерами таковых, индуцированных родительским вариантом 584 Ар 80 С. В качестве примера показаны бляшки, окрашенные на 2 день после инфицирования (п.и.), при этом никаких заметных различий в размерах бляшек между рекомбинантным и родительским вирусом не выявляется (фиг. 5 А). Для дальнейшей характеристики биологических свойств MDV-1, восстановленных после трансфекции ВАС, сравнивают кинетику роста указанных вирусов с родительским вариантом 584 Ар 80 С. В случае ВАС, вирус, восстановленный на 5 день после трансфекции, используют для инфицирования свежих-8 010721 клеток CEF, высеянных на 6-луночные планшеты (используют 50 БОЕ вируса для инфицирования одной ячейки, содержащей 1106 клеток). Аналогично, 50 БОЕ 584 Ар 80 С используют для инфицирования свежих клеток CEF тем же способом. В различные временные точки после инфицирования вирус собирают и титруют посредством совместного посева 10-кратных разведений вируса со свежими клетками CEF. Результаты указанных экспериментов обобщены на фиг. 5 В. Можно показать, что все протестированные ВАС MDV-1 демонстрируют ростовые характеристики,практически идентичные таковым для родительского варианта 584 Ар 80 С (фиг. 5 В). Максимальные титры достигались к 72 ч после инфицирования и оставались фактически постоянными до окончания периода наблюдения, через 120 ч после инфицирования. На основании данных по размерам бляшек и ростовым характеристикам, авторы сделали вывод о том, что биологические свойства MDV-1 in vitro практически неотличимы от таковых родительского штамма. Для того чтобы подтвердить стабильность вирусов, полученных на основе ВАС, потомство, полученное после трансфекции ВАС 19 и ВАС 20, пассируют четыре раза и выделяют вирусную ДНК. Далее вирусную ДНК расщепляют с помощью BamHI или EcoRI, разделяют электрофорезом в 0,8% агарозном геле и переносили на нейлоновые мембраны. Далее проводят гибридизацию с использованием pDS илиpHA1 зонда. Наблюдали фрагменты ДНК, аналогичные описанным ранее, и характер распределения полос, анализируемый с использованием двух проб, не менялся при серийных пассажах трансфицированного потомства (фиг. 6). На основании указанных результатов авторы сделали заключение о том, что последовательности, полученные из плазмиды F, остаются стабильно вставленными в геномы 584 Ар 80 С,восстановленные из индивидуальных ВАС-клонов MDV-1, даже после серийного пассирования в клетках CEF. Однако, как показали гибридизация с фрагментом BamHI-D и ПЦР анализ, вариабельность повторяющихся последовательностей размером 132 п.н. сохраняется и диффузный мазок реактивных полос наблюдается в расщепленных BamHI или EcoRI ДНК трансфицированного потомства уже после первого пассирования вируса (данные не приведены). Мутагенез ВАС 20 и делеция gB-кодирующих последовательностей. В следующих экспериментах был использован разработанный в последнее время метод мутагенеза для удаления участка размером 2,3 тыс. п.н. из gB-гена ВАС 20 размером 2,8 тыс. п.н. (фиг. 7). После трансформации плазмиды pGETrec(Narayanan) в ВАС 20-содержащую DH10B, ген kanR амплифицируют с использованием праймеров, которые позволяли осуществить гомологичную рекомбинацию с gB-последовательностями MDV-1 (табл. 1; фиг. 8), и вводят электропорацией в клетки BAC20-pGETrec. Бактерий помещают на чашки с LB-агаром,содержащим хлорамфеникол и канамицин; и отбирают колонии с двойной устойчивостью. После выделения ДНК из отдельных колоний проводят Саузерн-блот анализ рекомбинантной ВАС 20, несущей делению в gB-гене (20DgB). Зонды, специфичные в отношении kanR и gB, обнаруживают фрагменты 20DgB после ее расщепления с использованием BamHI, EcoRI, Bg1II или StuI, что полностью соответствует результатам, рассчитанным на случай включения гена устойчивости к канамицину (kanR) в gBкодирующие последовательности (фиг. 9). Было отмечено, как сообщалось ранее, что pGETrec, которая придает устойчивость к ампициллину, легко утрачивается клетками Escherichia coli, растущими в отсутствие антибиотика (фиг. 9). Исходя из указанных результатов, авторы сделали вывод о том, что открытая рамка для считывания gB была практически полностью удалена из 20DgB. Анализ gB-негативных MDV-1, восстановленных из 20DgB. Поскольку gB обязателен для роста всех вирусов герпеса, проанализированных к настоящему времени (рассмотренные в обзоре Pereira), была создана клеточная линия QM7, которая экспрессировала gB MDV-1 под контролем очень раннего промотора HCMV. Непрямой иммунофлуоресцентный анализ показал, что фактически каждая клетка клеточной линии MgB1 конститутивно экспрессирует gB MDV-1, что было также продемонстрировано с использованием моноклональных антител 2 К 11 или конвалесцентной сыворотки цыпленка (MDSI) (фиг. 10). Для анализа наращивания ВАС 20 и 20DgB в различных клеточных линиях получают ДНК и затем используют ее для трансфекции клеток CEF, QM7 или MgB1. На 3-5 день после трансфекции вирусные бляшки отмечались во всех клетках, трансфицированных ВАС 20 (фиг. 10). Однако после трансфекции 20DgB ДНК бляшки наблюдаются только в gB-экспрессирующих клетках MgBl (фиг. 11). В клетках CEF и QM7, трансфицированных 20DgB, лишь единичные клетки экспрессируют ранний ген рр 38, как было показано на основании их способности реагировать с моноклональными антителами H19 (Lee et al.), но формирование бляшек ингибируется (фиг. 11). Указанные результаты относительно необходимости gB для распространения MDV-1 из клетки в клетку in vitro подтверждаются при совместном посеве клеток MDV-1, инфицированных 20DgB, и клеток CEF, QM7 или свежих клеток MgB1. Было показано, что после первичной трансфекции образование бляшек наблюдается только после совместного посева с gB-экспрессирующими клетками (табл. 2). Исходя из указанных результатов, авторы сделали вывод о том, что gB MDV-1 обязательно требуется для распространенияMDV-1 из клетки в клетку в культивируемых клетках. Несмотря на то, что вирус болезни Марека представляет собой важный патоген цыплят, вызывающий Т-клеточные опухоли и высокую смертность инфицированных животных, мало известно о функции отдельных генов и генных продуктов в литической, латентной или опухолевой фазе инфекции. Анализ-9 010721 генов и генных продуктов MDV-1 крайне затруднен по двум основным причинам. Во-первых, культивируемые клетки, инфицированные MDV-1, не продуцируют свободный инфицирующий вирус, а вовторых, эффективный рост MDV-1 в культивируемых клетках ограничивается первичными или вторичными эмбриональными фибробластами цыпленка. В этой связи мутагенез с использованием традиционной гомологичной рекомбинации, применяемый для мутагенеза других Alphaherpesvirinae, является трудоемким, затратным по времени и требует постоянного поступления первичных клеток. В то время как мутагенез HSV и PrV явно облегчается за счет использования технологии ВАС, традиционный мутагенез, основанный на гомологичной рекомбинации в эукариотических клетках, представляет собой стандартную методику для указанных двух вирусов, и было получено множество мутантных вирусов. И наоборот, для мутагенеза MDV-1 ВАСклонирование и мутагенез являются наиболее приемлемыми. Поскольку геном MDV-1 клонируют в виде ВАС и он может стабильно поддерживаться в Escherichia coli, генерирование мутантов и анализ основных генов должен быть относительно простым. Фактически, возможно клонировать полный геном штамма 584 Ар 80 С в виде инфицирующего ВАС. Штамм 584 Ар 80 С представляет собой ослабленный вариант очень вирулентного плюс (vv+) MDV-1 штамм 584 А, полученный после 80 серийных пассажей на клетках CEF (Witter, 1997). Анализ клонированных геномов MDV-1, присутствующих в ВАС 19,ВАС 20 и ВАС 24, показывают очевидное наличие вариаций в образцах, получаемых в результате обработки рестриктазами. Указанная гетерогенность может быть объяснена вариациями во фрагментах BamHI-D и -Н. Известно, что в разных штаммах MDV-1 присутствует варьирующее количество тандемных повторов размером 132 п.н. и что число указанных повторов повышается после серийных пассажей на культивируемых клетках (Maotani, Silva, Fukuchi). Кроме того, число тандемных повторов участка 132 п.н. ассоциируется с потерей онкогенности, поскольку в вирулентных штаммах отмечается постоянное число указанных единиц (Fukuchi et al., 1985; Bradley et al., 1989), хотя недавнее исследование на широко используемом вакцинном штамме Rispens CVI 988 указывает на то, что может существовать непрямая корреляция небольшого числа повторов участка 132 п.н. и вирулентности. В случае MDV-1 штамм 584 Ар 80 С гибридизация вирусной ДНК после ее обработки рестриктазой с фрагментом BamHI-D приводит к появлению картины с диффузным распределением полос, указывающей на наличие варьирующего числа повторов в популяции вируса. И, напротив, только простые очень реакционноспособные полосы были идентифицированы в каждом из ВАС-клонов с тем же зондом. Однако размеры реакционноспособных полос после расщепления с помощью BamHI или EcoRI варьируют среди ВАС 19, ВАС 20 и ВАС 24, указывая на то,что были клонированы геномы, содержащие различное число повторов участка 132 п.н. Указанное объяснение было подтверждено результатами анализа методом ПЦР, нацеленного на повторы участка 132 п.н. Тогда как при использовании ДНК 584 Ар 80 С наблюдалась типичная, подобная ступенькам лестницы картина распределения продуктов ПЦР (Becker et al., 1993), в случае ВАС 19, ВАС 20 или ВАС 24 из клонированной вирусной ДНК были амплифицированы четкие полосы. В связи с вышесказанным был сделан вывод о том, что изменения в картине, получаемой после обработки рестриктазами различных ВАС-клонов являются результатом различного количества тандемных повторов участка 132 п.н. в отдельных клонах, которые не влияют на инфекционность клонированной ДНК, поскольку инфекционный вирус восстанавливается после трансфекции ДНК, выделенной из каждого из различных ВАС-клонов. После клонирования полного генома MDV-1 и доказательства инфекционности клонированной ДНК MDV-1, для удаления gB-кодирующих последовательностей из ВАС 20 была использована недавно разработанная система мутагенеза, в которой линейный фрагмент ДНК может быть рекомбинирован в хозяйской бактериальной ДНК, причем указанный процесс катализируется recE (Narayanan, Muyrers). Указанный мутагенез основан на присутствии в плазмиде pGETrec генаgam, супрессирующего recE,recT и recB/С (Narayanan et al., 1999). Большими преимуществами указанной системы, которая была впервые использована для манипуляций с вирусным геномом, являются: (i) то, что только гомологичные плечи размером 30-50 п.н. необходимы для получения специфической последовательности, подлежащей удалению, то есть удаление любой открытой для считывания рамки может быть осуществлено без необходимости клонировать кассеты рекомбинации, (ii) то, что метод очень быстрый, и (iii) то, что вектор pGETrec, несущий систему мутагенеза и экспрессирующий устойчивость к ампициллину, быстро теряется клетками бактерий в отсутствие ампициллина. После электропорации продукта ПЦР с выбитым gB в pGETrec-содержащие клетки ВАС 20 было обнаружено от 10 до 30 колоний с двойной устойчивостью к camR и kanR. Одна из колоний была обозначена как 20DgB-l и отобрана для дальнейшего анализа, поскольку она теряетpGETrec сразу же после помещения на чашку с агаром, содержащим хлорамфеникол и канамицин. Саузерн-блот анализ продемонстрировал успешную делецию гена gB и вставку гена kanR в 20DgB-l.MDV-1, восстановленный после трансфекции клеток CEF с помощью 20DgB-1, был неспособен передаваться от инфицированных клеток окружающим клеткам, и это указывает на то, что gB MDV-1, подобно его дубликатам в других вирусах герпеса, необходим для передачи инфекционного начала от клетки к клетке. Поскольку MDV-1 характеризуется высокой ассоциированностью с клеткой в культивируемых- 10010721 клетках и не высвобождает инфицирующий вирус в культуральную среду, авторы не смогли исследовать возможную роль gB MDV-1 в процессе внедрения вируса. Полученный gB мутант представляет собой первый пример MDV-1 с делецией основного гена и демонстрирует серьезные возможности ВАСклонирования и системы мутагенеза, которые особенно полезны в случае MDV-1. Использование ВАСMDV-1 и постоянной клеточной линии QM7, которая позволяет осуществлять размножение MDV-1 и которая, в отличие от клеточной линии фибробластов перепелки QT35, не несет последовательностейMDV-1 (Zelnik et al., неопубликованные данные), представляет собой великолепный пример комбинации с тщательно проанализированными основными генами MDV-1. Кроме того, сравнительные анализы функций генов у различных Alphaherpesvirinae могут теперь включать MDV-1 и позволяют проводить исследования очень далеко отстоящих представителей, таких как VZV или BHV-4, одного семейства вирусов. Для клонирования геномов, предлагаемых в настоящем описании, приводится ниже подробная дальнейшая оценка литических, латентных и индуцирующих опухоль генов у вируса, в отношении которого использование генетических манипуляций было бы очень ограничено.- 12010721 Таблица 1. Праймеры, используемые для генерирования плазмид pDS и pcMgB и для делеции gB- a Выделенные жирным шрифтом последовательности указывают сайты рестриктазы, последовательности, обозначенные курсивом, обозначают дополнительные основания, не присутствующие в последовательности MDV-1;- b Подчеркнутые последовательности указывают на последовательности из pEGFP-N1, использованной для амплификации гена kanR, последовательности, выделенные жирным шрифтом и подчеркнутые, указывают последовательности gВ, использованной для гомологичной рекомбинации и recE/Tобусловленной делеции gB. Описание схем и чертежей На фиг. 1 приведена схематическая иллюстрация процедуры клонирования с целью получения ВАС, несущих полные геномы MDV- 1. Показана организация генома MDV-1 размером примерно 180 тыс.п.н. (А) и карта рестрикции BamHI (В) в соответствии с данными Fukuchi et al. (11). Показаны также уникальная короткая последовательность (Us) и ОРС, расположенные в Us (С и D). Фрагменты размером 2,1 и 3,1 тыс. п.н., граничащие с геном Us2 (серые прямоугольники) амплифицированы с помощью ПЦР и клонированы в плазмиде pTZ18R с получением рекомбинантной плазмиды pDS. Вас-вектор размером 7,2 тыс.п.н., высвобождаемый из рекомбинантной плазмиды рНА 1 (15) вставляют в pDS с получением плазмиды pDS-pHA1 (E). Сайты рестриктазы в соответствии с (2) имеют следующие сокращенные обозначения: В = BamHI, Е = EcoRI, Р = PstI, Pa = PacI, S = SalI. На фиг. 2 приведена оцифрованная картина сканирования 0,8% агарозного геля, окрашенного этидий-бромидом. ДНК, выделенную из клонов ВАС 19, ВАС 20 и ВАС 24 Escherichia coli DH10B, расщепляют с использованием BamHI и EcoRI и разделяют. Продукты расщепления рестриктазами фланкируют приставкой размером 1 тыс. п.н. (Gibco-BRL). Звездочки указывают дополнительные полосы или вариации в размерах отдельных фрагментов, имеющиеся между тремя ВАС-клонами. На фиг. 3 приведена оцифрованная картина сканирования ДНК из 584 Ар 80 С (V), ВАС 19, ВАС 20 и ВАС 24, расщепленных с использованием BamHI или EcoRI с последующим разделением электрофорезом на 0,8% агарозном геле и окрашиванием этидий-бромидом (левая панель). После Саузерн-переноса фрагментов ДНК на нейлоновые мембраны проводят гибридизацию с дигоксигенин-мечеными фрагментами, выделенными из плазмиды pDS или рНА 1. Приведены размеры маркеров (приставка размером 1 тыс.п.н., Gibco-BRL) и размеры реакционноспособных полос. На фиг. 4 приведены оцифрованные картины сканирования Саузерн-блотов при анализе вариаций размеров ДНК ВАС 19, ВАС 20 и ВАС 24. Вирусную ДНК из штамма 584 Ар 80 С (V) и отдельные ВАС расщепляют с использованием BamHI и EcoRI и переносят на нейлоновые мембраны. Полоски инкубируют с дигокигенин-меченой ДНК ВАС 19 или с мечеными фрагментами BamHI-C или BamHI-D. Приведены размеры маркеров (приставка размером 1 тыс. п.н., Gibco-BRL). Появление полос в виде мазка в случае ДНК 584 Ар 80 С при гибридизации с последовательностями BamHI-D выделены с помощью скобок. Фиг. 5 (А): НИФ анализ бляшек MDV-1 после трансфекции ДНК ВАС 19, ВАС 20 или ВАС 24. На 5 день после трансфекции инфицированные клетки фиксируют и подвергают непрямому иммунофлуоресцентному анализу с использованием анти-gВ моноклональных антител 2 К 11. Обнаружение связанных антител проводят с использованием анти-мышиных Alexa 488 (молекулярные зонды) и ядра контрастно окрашивают пропидий-иодидом. Увеличение = 400x.(В): кривые роста MDV-1 штамм 584 и различных ВАС. После инфицирования клеток CEF с использованием 100 БОЕ 584 Ар 80 С или трансфицированным потомством ВАС 19, ВАС 20 или ВАС 24 определяют титры вируса в указанные моменты времени после инфицирования посредством совместного посева со свежими клетками CEF. Бляшки подсчитывают после иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием моноклональных антител 2 К 11. На фиг. 6 приведены оцифрованные картины Саузерн-блотов при анализе стабильности последовательностей ВАС-векторов в вирусах, восстановленных после трансфекции ВАС 19 и ВАС 20. Трансфицированное потомство пассируют в течение четырех раз и после каждого пассирования выделяют вирус- 13010721 ную ДНК. Вирусную ДНК расщепляют с использованием BamHI или EcoRI, разделяют электрофорезом в 0,8% агарозном геле и переносят на нейлоновые мембраны. Проводят Саузерн-блот гибридизацию с использованием дигоксигенин-меченых фрагментов плазмид pDS или рНА 1. Сокращения: V = 584 Ар 80 С, 19 = ВАС 19, 20 = ВАС 20. Пассажи с 1 по 4 после трансфекции ДНК ВАС 19 указаны номерами от 1 до 4. Пассаж 4 после трансфекции ДНК ВАС 20 помещен в последнюю линию, соответственно, и обозначен номером 4 а. Приведены размеры реактивных фрагментов. Звездочки отмечают реактивную линию маркера размером 1,6 тыс. п.н. (приставка размером 1 тыс. п.н., Gibco-BRL). Фиг. 7 (А): дана схематическая иллюстрация мутагенеза ВАС 20 с целью удаления дВ-кодирующих последовательностей. Рекомбинантную плазмиду pGETrec, кодирующую индуцируемые L-арабинозой recE, recT и gam ген, трансформируют в ВАС 20-содержащие клетки DH10B. После проведения амплификации методом ПЦР гена kanR из плазмиды pEGFP-N1 (Clontech) с помощью праймеров, которые также содержат гомологичные плечи размером 50 п.н., граничащие с делецией gB, ПЦР ампликон размером 1,6 тыс. п.н. вводят электропорацией в клетки DH10B, несущие ВАС 20 и pGETrec. Бактериальные суспензии наслаивают на агар, содержащий 30 мкг/мл канамицина и 30 мкг/мл хлорамфеникола. Отбирают колонии с двойной устойчивостью и подвергают дальнейшему анализу.(В): схематическая иллюстрация расположения гена gB в MDV-1 и делеции, присутствующей в ВАС 20DgB. Фиг. 8 - картина сканирования окрашенного этидиум-бромидом 0,8% агарозного геля, содержащего ДНК ВАС 20 и 20DgB, расщепленные с использованием BamHI, EcoRI, BglI или StuI и разделенные электрофорезом в 0,8% агарозном геле (левая панель). Фрагменты ДНК переносят на нейлоновые мембраны и гибридизуют с дигоксигенин-мечеными kanR- или gB-специфичными зондами. Указаны размеры реакционноспособных фрагментов ДНК. Сокращения: В = BamHI, Е = EcoRI, Bg = BglI, S = StuI. На фиг. 9 показан анализ методом конфокального лазерного сканирования MgB1 клеток, конститутивно экспрессирующих gB MDV-1. Клетки MgBl или QM7 высевают на покровные стекла и инкубируют в присутствии анти-дВ моноклональных антител 2 К 11 или конвалесцентной сыворотки цыпленкаMDSI. Вторичными антителами служили конъюгаты антимышиных или антикуриных IgG Alexa 488(молекулярные зонды). Ядра контрастно окрашивают пропидиум-иодидом. Черта означает 10 мкм. На фиг. 10 приведены результаты анализа методом НИФ клеток MgBl, QM7 или CEF после их трансфекции ВАС 20 (верхние панели) или 20DgB (нижние панели). На 5 день после трансфекции клетки фиксируют ацетоном и инкубируют с анти-рр 38 моноклональными антителами H19. Вторичными антителами служили анти-мышиные IgG Alexa 488 (молекулярные зонды). В то время как после трансфекции ВАС 20 ДНК бляшки MDV-1 наблюдаются на всех клеточных линиях, после трансфекции с использованием 20DgB вирусные бляшки отмечаются только на клетках MgB1. Только отдельные варианты инфицированных клеток наблюдаются на клетках QM7 и CEF (стрелки). Увеличение = 400x. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Вакцина, направленная против инфекции, вызванной вирусом герпеса, ассоциированным, по существу, с хозяйской клеткой, отличающаяся тем, что указанная вакцина включает рекомбинантный геном, полученный из указанного вируса герпеса, так что указанный геном позволяет осуществлять рекомбинацию, по существу, в отсутствие указанной хозяйской клетки, и где указанный геном включает последовательность вектора искусственной бактериальной хромосомы (ВАС). 2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что указанный геном включает функциональную делецию в гене, необходимом для репликации и/или распространения указанного вируса герпеса из хозяйской клетки. 3. Вакцина по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанный геном включает нуклеиновую кислоту,кодирующую антиген, вызывающий иммунный ответ против инфекции, вызванной указанным вирусом герпеса. 4. Вакцина по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что указанный геном включает функциональную маркерную делецию в гене, необходимом для проявления иммунного ответа, специфичного для указанного вируса герпеса, что позволяет провести различие между индивидуумом, вакцинированным указанной вакциной, и индивидуумом, инфицированным указанным вирусом герпеса, ассоциированным, по существу, с клеткой. 5. Вакцина по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что указанный геном включает, по меньшей мере, нуклеиновую кислоту, кодирующую вещество белковой природы, способное модулировать транскрипцию и/или трансляцию нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, способный вызывать иммунный ответ против инфекции, вызванной указанным вирусом герпеса. 6. Вакцина по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что указанный геном является, по существу,геномом полной длины вируса герпеса. 7. Вакцина по любому из пп.1-6, дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, которая кодирует антиген другого патогенного организма.- 14010721 8. Вакцина по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что указанный вирус герпеса представляет собой вирус болезни Марека. 9. Вакцина по п.8, отличающаяся тем, что указанный вирус болезни Марека относится к серотипу 1. 10. Вакцина по п.8 или 9, отличающаяся тем, что указанный вирус болезни Марека получен на основе вирулентного, очень вирулентного или очень вирулентного плюс вируса дикого типа. 11. Рекомбинантный вирусный геном, полученный на основе вируса герпеса, который, по существу,ассоциирован с клеткой, отличающийся тем, что указанный геном позволяет проводить рекомбинацию,по существу, в отсутствие указанной хозяйской клетки, и где указанный геном включает последовательность вектора искусственной бактериальной хромосомы (ВАС). 12. Геном по п.11, включающий, по меньшей мере, репликативный мини-геном. 13. Геном по п.11, отличающийся тем, что указанный геном является, по существу, геномом полной длины вируса герпеса. 14. Применение генома по любому из пп.11-13 для приготовления вакцины, направленной против инфекции, вызванной вирусом герпеса, ассоциированным, по существу, с хозяйской клеткой. 15. Способ ограничения риска приобретения или полного проявления инфекции, вызываемой вирусом герпеса, ассоциированным, по существу, с хозяйской клеткой, включающий введение индивиду, нуждающемуся в этом, вакцины по любому из пп.1-10 или генома по любому из пп.11-13. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный индивид представляет собой птицу.