Способ придания растительной клетке или растению устойчивости к вирусу, содержащему последовательность 3 тройного блока генов (tgb3), и трансгенное растение, устойчивое к указанному вирусу

1 Область изобретения Настоящее изобретение касается способа придания растительной клетке или растению устойчивости к вирусам, в частности, способа придания клетке или растению сахарной свеклы устойчивости к вирусу BNYVV и получения клетки и растения, устойчивых к вирусу. Предпосылки изобретения и уровень техники Широко распространенное вирусное заболевание растения сахарной свеклы (Betavulgaris) под названием ризомания вызывается фуровирусом, вирусом некротического пожелтения жилок свеклы (BNYVV) (23, 24), который передается корням свеклы почвенным грибкомPolymyxa betae (25). Заболевание поражает значительные площади земли в акрах в областях, где растения сахарной свеклы выращивают для промышленного использования в Европе, США и Японии, и распространено в некоторых местностях в Западной Европе (26, 27). Поскольку не существует практического способа эффективного контроля распространения вируса в больших масштабах химическими или физическими средствами (28) ни в растениях, ни в почве, основной целью являлась идентификация природных источников устойчивости в плазме зародыша сахарной свеклы и получение, путем скрещивания, сортов сахарной свеклы, экспрессирующих гены устойчивости. Было идентифицировано множество таких генов толерантности к вирусу,и некоторые гены были удачно использованы в скрещивании коммерческих сортов сахарной свеклы (29, 30, 31). Только использование BNYVV-устойчивых или толерантных сортов позволит фермерам выращивать растения сахарной свеклы в областях, инфицированных BNYVV, где растения сахарной свеклы являются существенным компонентом севооборота и значительно влияют на доход фермеров. Ряд детальных исследований показал, что различие в чувствительности к BNYVV-инфекции среди генотипов или сортов сахарной свеклы отражает в основном различие в проникновении или распространении вируса в тканях корня (32). Однако существуют сообщения, которые четко показывают, что гены толерантности, даже из различных источников плазмы зародыша сахарной свеклы или плазмы зародыша диких родственных культур (33), могут обеспечивать определенные механизмы устойчивости. Это может обеспечить более контролируемую ситуацию для создания стратегий долговременнойBNYVV-устойчивости. С 1986 года в ряде сообщений и публикаций было описано использование изолированных вирусных последовательностей генов, экспрессирующихся в растениях, для получения высокого уровня толерантности против этого вируса или даже широкого спектра устойчиво 004328 2 сти против ряда родственных вирусов (34, 35,36). Одной из наиболее подтвержденных стратегий вирусной устойчивости, основанной на генетической инженерии, у многих культивируемых видов, таких как картофель, тыква, огурец или томат, является использование последовательности вирусного гена, кодирующего белок оболочки вируса-мишени (37), которая под контролем регуляторных элементов растений, будет экспрессироваться в растении. Однако в случае устойчивости, опосредованной белком оболочки, экспрессия определенного уровня устойчивости в трансгенном растении может определяться различными механизмами, такими как ко-супрессия РНК, и необязательно продукцией белковой последовательности. В общем, последовательность вируса будет трансформирована в подходящую культуру клеток или тканей видов растений с использованием системы трансформации, опосредованной агробактериями, или путем прямого переноса генов, в соответствии с ограничениями способа культивирования тканей или клеток, который может успешно применяться для данных видов. Будет регенерировано целое растение и охарактеризована экспрессия трансгена. Хотя сахарная свекла с трудом поддается клеточному культивированию, что ограничивает применение практических методов генетической инженерии для этого вида, имеется ряд сообщений об успешной трансформации и регенерации целых растений (38). Также было опубликовано несколько примеров создания толерантности к вирусу BNYVV путем трансформации и экспрессии последовательности белка оболочки вируса BNYVV в геноме сахарной свеклы (39, WO 91/13159), хотя в них редко сообщаются данные о полностью функционирующих трансгенных растениях сахарной свеклы (40). В частности, в сообщениях демонстрируются ограниченные данные об уровне устойчивости, наблюдаемой в условиях инфицирования у трансгенных растений сахарной свеклы,трансформированных геном, кодирующим последовательность белка оболочки вирусаBNYVV (41, 42) . Полное содержание технологии, включая способ трансформации сахарной свеклы и использование экспрессии последовательности белка оболочки вируса BNYVV в качестве источника устойчивости у трансгенного растения сахарной свеклы, полученного указанным способом трансформации, описано в международной заявке WO 91/13159. На основе опубликованной информации нельзя заключить, что механизм устойчивости,опосредованной белком оболочки, обеспечивает какой-либо потенциал для придания растению сахарной свеклы абсолютного иммунитета кBNYVV-инфекции путем полного ингибирования механизмов размножения и проникновения 3 вируса. Для идентификации механизма устойчивости, который позволяет значительно блокировать распространение вируса на ранней стадии инфекции, основным критерием успеха являлось бы получение такой устойчивости в трансгенном растении, которая была бы сравнима с уровнем устойчивости, известным для генов устойчивости, идентифицированных в зародышевой плазме сахарной свеклы, и могла бы разнообразить имеющиеся механизмы устойчивости. Поскольку показано, что заболевание распространяется во многих странах или областях со скоростью, зависящей от сочетания многих местных факторов окружающей среды и сельского хозяйства, существует большой интерес к обеспечению разнообразия источников механизмов генетической устойчивости, которые могут, по отдельности или в сочетании, предоставить стабильную и долговременную стратегию устойчивости для существующих и будущих сортов растений сахарной свеклы, которые выращивают для промышленного использования. Публикация Xu H. с соавт. (Plant Cell Report, Vol.15, pp. 91-96, 1995) описывает полученную с помощью генетической инженерии конструкцию, обеспечивающую устойчивость к вирусу X картофеля в четырех коммерческих культиварах картофеля. Однако в указанном документе определяются такие клоны трансгенного картофеля, которые включали ген 8KG(конструкция TGB3). Однако когда эти трансгенные растения инфицировали вирусом PVX,то защиты против этого вируса не возникало,что говорит о том, что белок ОК не играет роли в защите против вируса PVX. Цели изобретения Настоящее изобретение имеет целью обеспечение нового способа придания растительной клетке и растению устойчивости к различным вирусам и получение устойчивых к вирусам растительной клетки и растения. Основной целью изобретения является обеспечение нового способа придания растительной клетке и растению устойчивости к вирусу BNYVV и получение устойчивых к вирусу(Beta vulgaris ssp.). Краткое изложение изобретения Настоящее изобретение обеспечивает использование альтернативной последовательности растительного вируса, в частности, вирусаBNYVV, для получения высокого уровня толерантности к вирусной инфекции, в частности,для обеспечения быстрого и полного блокирования механизмов размножения и распространения вируса в растении, в частности, в растении сахарной свеклы (Beta vulgaris), включая кормовую свеклу, листовую свеклу (мангольд) и столовую свеклу, которые также могут быть объектами этой вирусной инфекции. Экспрессия 4 устойчивости будет получена в трансгенных клетке или растении, в частности, в клетках или растениях сахарной свеклы, полученных путем трансформации согласно международной заявкеWO 95/10178 или другими способами трансформации, основанными на использовании бактерий Agrobacterium tumefaciens или на прямом переносе генов. Из-за своей высокой эффективности способ трансформации, как показано вWO 95/10178, делает возможным получение большого количества трансформированных растений, в частности, растений сахарной свеклы, и будет предпочтительным для получения трансгенных растений, которые могут быть проанализированы и охарактеризованы по уровню их устойчивости к вирусу, в частности, устойчивости к вирусу BNYVV, включая их оценку в полевых условиях. Геном вируса некротического пожелтения жилок свеклы (BNYVV) состоит из пяти положительных РНК, две из которых (РНК 1 и 2) кодируют функции, существенные для инфицирования всех растений, тогда как три другие РНК (РНК 3, 4 и 5) вовлечены в векторопосредованное инфицирование корней сахарной свеклы (Beta vulgaris) (1). Движение вирусаBNYVV от клетки к клетке регулируется набором трех последовательных, слегка перекрывающихся вирусных генов на РНК 2, известных как тройной блок генов (TBG) (2), который кодирует по порядку вирусные белки Р 42, Р 13 и Р 15 (генные продукты обозначены в соответствии с их вычисленной молекулярной массой,выраженной в килодальтонах (3. В последующем описании гены TGB и соответствующие белки будут обозначаться следующим образом: TGB1, TGB2, TGB3 или Р 42,Р 13 и Р 15 по номеру кодируемого ими вирусного белка. Аналогичные последовательностиTGB представлены и у других фуровирусов (4,5), и у потекс-, карла- и гордеивирусов (6). В табл. 1 представлены вирусы, имеющие последовательность TGB3, молекулярные массы последовательностей TGB3 указанных вирусов,их хозяева и ссылки. Таблица 1 Размер Вирус ХозяинTGB3 Вирус ямчатости 8 кДа яблоня ствола яблони Изобретатели предлагают здесь новый способ обеспечения вирусной устойчивости к растительным вирусам путем блокирования механизмов размножения и распространения вируса в указанном растении, особенно в ткани его корня. Для демонстрации указанной устойчивости изобретатели описывают ниже влияние сверхэкспрессии последовательностей TGB, по отдельности или в сочетании, на механизмы размножения и проникновения вируса BNYVV в растения С. quinoa, которые также являются хозяевами вируса BNYVV и которые легче поддаются манипуляциям профессионалов в данной области. Изобретатели выполнили эксперименты также на Beta macrocarpa. Эти результаты показали, что растения можно трансформировать также способом согласно данному изобретению и получить экспрессию гена TGB3 с помощью указанных растений. Поэтому, как объясняется в приведенном ниже описании, указанный способ можно использовать для получения устойчивости к различным вирусам в различных видах растений, подверженных инфекции вирусами, характеризующимися наличием последовательности TGB3 в их геноме. Известно, что вирус BNYVV не нуждается в синтезе вирусного белка оболочки для продуцирования местных повреждений на листьях хозяев, таких как Chenopodium quinoa (7), что означает, что образование вириона не требуется для движения вируса от клетки к клетке. Однако способ, с помощью которого компоненты TGB участвуют в процессе движения,не понятен, хотя осуществленное с помощью компьютера сравнение последовательностей обнаружило характерные консервативные последовательности, которые могут обеспечить ключ к разгадке их функций. Таким образом, 5'проксимальный белок TGB (TGB1) неизменно содержит ряд последовательностей, характерных для ATP/GTP-связывающих геликаз, тогда как второй белок (TGB2) всегда имеет два потенциально связывающихся с мембраной гидрофобных домена, разделенных гидрофильной последовательностью, которая содержит высоко консервативную пептидную последовательность неизвестного назначения (6). Последовательность и размер третьего белка TGB (TGB3) являются более вариабельными, хотя N-терминальный участок обычно является гидрофобным. С помощью 5'-концевого картирования в 3'-5' направлении от откры 004328 6 тых рамок считывания (ОРС) последовательностей TGB1 и TGB2 вируса BNYVV (фиг. 1) были обнаружены субгеномные РНК, но такие субгеномные последовательности не были обнаружены в последовательности TGB3 вирусаBNYVV (2) или любых других TGBсодержащих вирусов. В случае вируса X картофеля (PVX; ссылка 8) и вируса полосатой мозаики ячменя (BSMV; ссылка 9), существуют данные, что продукты TGB2 и TGB3 экспрессируются с тех же субгеномных РНК. До настоящего времени не было ни одного сообщения о вирусе, в котором три члена TGB располагались бы иначе на одной и той же РНК или распределялись бы по различным геномным РНК, что означает, что их соединение в определенном порядке может быть важным для регуляции их функции. Настоящее изобретение касается способа придания устойчивости к вирусу, содержащему тройной блок генов (TGB), при условии, что этот вирус не является вирусом X картофеля. Предпочтительней, чтобы указанный вирус был выбран из группы, состоящей из вируса ямчатости ствола яблони, вируса ожога черники, вируса М картофеля, вируса мозаики белого клевера,вируса мозаики орхидеи Cymbidium, вируса полосатой мозаики ячменя и вируса свеклы,передающегося через почву; указанный способ состоит из следующих этапов: получения конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность TGB3 указанного вируса или соответствующую ей кДНК или их варианты, основанные на вырожденности генетического кода, связанные с одной или более регуляторными последовательностями, активными в растении,трансформации растительной клетки конструкцией нуклеиновой кислоты и, при необходимости,регенерации трансгенного растения из трансформированной растительной клетки. Предпочтительней, чтобы растение являлось растением, которое может быть инфицировано описанным выше вирусом, и предпочтительней, чтобы оно было выбрано из группы,состоящей из яблони, черники, картофеля, клевера, орхидеи, ячменя, арахиса и сахарной свеклы. Настоящее изобретение также касается полученной растительной клетки и трансгенного(или трансформированного) растения (полученного из указанной растительной клетки), устойчивых к указанным вирусам и содержащих указанную конструкцию нуклеиновой кислоты. Изобретатели также неожиданно обнаружили, что можно индуцировать устойчивость к вирусу BNYVV в растении способом, который состоит из следующих этапов: получения конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность TGB3, которая заключена между нук 7 леотидами 3627 и 4025 5'-цепи геномной или субгеномной РНК 2 вируса BNYVV, или соответствующую ей кДНК или их варианты, основанные на вырожденности генетического кода,связанную с одной или более регуляторными последовательностями, активными в растении,трансформации растительной клетки указанной конструкцией и, при необходимости,регенерации трансгенного растения из трансформированной растительной клетки. Последовательность нуклеиновой кислоты,которая заключена между нуклеотидами 3627 и 4025 5'-цепи геномной или субгеномной РНК 2,кодирующая белок Р 15, описана на фигуре 6 и в публикации (3). Указанная нуклеотидная последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность представлены ниже в виде SEQ ID NO.1. Другой аспект настоящего изобретения касается растительной клетки и трансгенного растения (полученного из указанной растительной клетки), устойчивых к вирусу BNYVV и содержащих конструкцию нуклеиновой кислоты,имеющую нуклеотидную последовательность,соответствующую, по крайней мере, 70%, предпочтительней, по крайней мере, 90% нуклеотидной последовательности, заключенной между нуклеотидами 3627 и 4025 5'-цепи геномной или субгеномной РНК 2 вируса BNYVV или соответствующей ей кДНК, связанной с одной или более регуляторными последовательностями,активными в растении. Предпочтительней, чтобы указанная растительная клетка или трансгенное растение (полученное из указанных растительных клеток),устойчивые к вирусу BNYVV, были получены способом в соответствии с настоящим изобретением. Варианты нуклеотидной последовательности, описанной как SEQ ID NO.1, содержат вставку, замену или делецию нуклеотидов, кодирующих одинаковые или различные аминокислоты. Поэтому настоящее изобретение также касается указанных вариантов нуклеотидной последовательности SEQ ID NO.1, которые представляют более чем 70% гомологию с указанной нуклеотидной последовательностью, и которые, что предпочтительно, способны гибридизоваться с указанной нуклеотидной последовательностью в жестких или нежестких условиях. Предпочтительней, чтобы указанные последовательности также были способны индуцировать устойчивость к вирусу BNYVV в растении. Термин "придавать растению устойчивость к вирусу" означает индукцию возможного уменьшения или значительного замедления появления симптомов инфекции, размножения вируса или механизмов его распространения в растении, особенно в ткани корня. 8 Регуляторная последовательность (последовательности) указанной нуклеотидной последовательности является промоторной последовательностью (последовательностями) и терминаторной последовательностью (последовательностями), активными в растении. Конструкция нуклеиновой кислоты может также включать ген селективного маркера, который мог бы использоваться для идентификации трансформированных клетки или растения и экспрессировать конструкцию нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением. Предпочтительней, чтобы клетка являлась устьичной клеткой, и растение являлось сахарной свеклой (Beta vulgaris ssp.), полученной из указанных клеток. В соответствии с изобретением, промоторная последовательность является конститутивной или чужеродной растительной промоторной последовательностью, предпочтительно, выбранной из группы, состоящей из промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, промотора полиубиквитина Arabidopsis thaliana (43),промотора, который активен в основном в тканях корня, такого, как промотор par гена гемоглобина Perosponia andersonii (Landsman et al.Mol. Gen. Genet. 214:68-73 (1988 или их смеси. Последний аспект настоящего изобретения относится к ткани трансгенного растения, такой как плод, ствол, корень, клубень, семя трансгенного растения, в соответствии с изобретением или к воспроизводимой структуре (предпочтительно, выбранной из группы, состоящей из каллусов, почек или зародышей), полученных из трансгенного растения или клетки в соответствии с изобретением. Методы трансформации растений, культивирования ткани и регенерации, использованные в способе в соответствии с изобретением,хорошо известны профессионалам в данной области. Предпочтительней, чтобы эти методы соответствовали методам, описанным в международных заявках WO 95/10178 или WO 91/13159, соответствующей заявке ЕР-В 0517833, которые включены здесь посредством ссылки. Предпочтительней, чтобы эти методы использовались для получения трансгенной сахарной свеклы в соответствии с изобретением. Краткое описание рисунков Фиг. 1 представляет структуру РНК 2 вируса BNYVV дикого типа и репликоны, экспрессирующие белки TGB. Фиг. 2 представляет трансляцию in vitro репликонов генов TGB в экстракте зародышей пшеницы. Фиг. 3 представляет амплификацию репликонов, кодирующих белки TGB в протопластах Chenopodium quinoa и экспрессию Р 42. Фиг. 4 представляет комплементацию транскриптов РНК 2, содержащих дефекты в различных генах TGB, с помощью соответст 9 вующих генов дикого типа, полученных из репликона. Фиг. 5 показывает влияние репликонов на инфекцию РНК 1 и 2 вируса BNYVV дикого типа. Фиг. 6 представляет нуклеотидную и аминокислотную последовательность TGB3, кодирующую Р 15 вируса BNYVV. Фиг. 7 показывает присутствие кодирующих районов гена р 15 вируса BNYVV в геноме сахарной свеклы с помощью ПЦР. Фиг. 8 показывает интеграцию гена Р 15 вируса BNYVV в геном сахарной свеклы, определенную с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Описание изобретения Для того чтобы определить потенциальное использование определенных последовательностей генов, выделенных из РНК 2 вирусаBNYVV у сахарной свеклы путем трансформации растений, изобретатели исследовали, может ли осуществляться независимая экспрессия белка TGB вируса BNYVV путем внесения каждой ОРС в вирусный, зависимый от репликации,"репликон", полученный из РНК 3 вирусаBNYVV. Изобретатели показали, что при смешанной инфекции листьев С. quinoa совместно экспрессирующиеся белки TGB1 или TGB2 вируса BNYVV могут комплементировать РНК 2 вируса BNYVV, содержащую мутацию, отменяющую функцию соответствующего белкаTGB. Никакой комплементации не наблюдали с репликон-содержащей последовательностьюTGB3, однако, если только ОРС последовательности TGB3 не была расположена в 5'-3' направлении от ОРС для последовательностиTGB2 в репликоне. При совместной инокуляции с РНК 1 и 2 дикого типа, репликон, экспрессирующий ОРС TGB3 вируса BNYVV, ингибировал инфекцию. Эти данные совпадают с моделью экспрессии белков TGB, в которой трансляция Р 15 с дицистронной субгеномной РНК регулирует уровни экспрессии Р 15 in vivo. Изобретатели также определили, что высокая экспрессия Р 15 обеспечивала быстрое и абсолютное блокирование размножения вируса и механизмов его распространения в растении. Материалы и методы кДНК-клоны Транскрипционными векторами для продукции полноразмерных РНК 1 и 2 вирусаBNYVV дикого типа были рВ 15 (10) и рВ 2-14(11), соответственно. Транскрипционными векторами для предварительно описанных мутантных РНК 2 являлись pB2-14-F, -Н, -I и -J (2) иpB2-14-SN, -S12, - S37, -В 1, -В 2, -В 2,-N и -GAA (11). Делеционный мутант РНК 2 рВ 2-14- НР 1 получали путем удаления последовательности между нуклеотидами 3158 и 3258. Полученный из РНК 3 вируса BNYVV пустой 10 репликон rep0 получали путем транскрипции делеционного мутанта РНК 3 рВ 35 АЕS (12). Последовательности TGB для встраивания вrep0 были амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием праймеров, каждый из которых содержал нематричный сайт BamHI на его 5'-конце. Фрагменты ПЦР, соответствующие гену Р 42(нуклеотиды 2127-3297), гену Р 13 (нуклеотиды 3282-3650), гену Р 15 (нуклеотиды 3627-4025) и обоим генам Р 13 и Р 15 (нуклеотиды 3282-4025),гидролизовали с помощью рестриктазы BamHI и встраивали в расщепленную BamHI рВ 35 АЕS. Полученные конструкции использовали для транскрипции rep42, rep13, rер 15 иrер 1315, соответственно. Репликон, содержащий мутацию со сдвигом рамки в ОРС Р 15 (Rep15X), получали путем заполнения выступов вставкой сайта XbaI (нуклеотид 3948). Введение мутаций со сдвигом рамки в rep13-I, rep1315-I иrep15-J осуществляли, как описано для соответствующих мутаций в полноразмерной РНК 2 (2). Клонированные последовательности, амплифицированные с помощью ПЦР, были проверены на отсутствие ошибок путем секвенирования"Каптированные" транскрипты получали путем run-off транскрипции (10) с помощью полимеразы бактериофага Т 7 плазмидной ДНК,линеаризованной с помощью HindIII для рВ 15 и репликонных конструкций и с помощью SalI для рВ 2-14 и родственных конструкций. Концентрацию и целостность транскрипта оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле. Листья механически инокулировали 50 мкл на лист буфера для инокуляции, содержащего 1 мкг каждого транскрипта (2). В некоторых экспериментах, транскрипты РНК 1 и 2 заменяли 0,025 мкг высокоинфекционной вирусной РНК,очищенной из изолята Stras 12 вируса BNYVV(10). Предварительные эксперименты показали,что такое количество вирусной РНК было приблизительно эквивалентно по эффективности(как измеряли путем анализа локальных повреждений) смеси, содержащей 1 мкг каждого из транскриптов РНК 1 и 2. Для инфицирования протопластов 0,5 мкг вирусных РНК 1 и 2 плюс 3 мкг репликонного транскрипта инокулировали в 2105 протопластов путем электропорации (2). Полученные из репликонов транскрипты подвергали трансляции в экстракте зародышей пшеницы (14) и продукты трансляции, меченые[35S], визуализировали с помощью авторадиографии после электрофореза в ПААГ с SDS (15,16). Радиоактивность, включенную в продукты трансляции, определяли количественно с помощью биоанализатора Fujix MAS1000, и эти значения корректировали для содержания метионина при вычислении относительных уровней трансляции. 11 Определение вирусной РНК и белков Общую РНК экстрагировали (2) из инокулированных листьев на 10 день после инокуляции и из протопластов - через 48 часов после инокуляции. Вирусную РНК определяли с помощью нозерн-гибридизации с антиСмысловыми транскриптами вирусной РНК, мечеными 32 Р, в качестве зондов (17). Проба, специфичная для РНК 1, была комплементарна нуклеотидам 4740-5650, проба, специфичная РНК 2, была комплементарна нуклеотидам 2324-3789, а проба, специфичная для РНК 3, была комплементарна нуклеотидам 1-380. Р 42, Р 14 и белок оболочки определяли вестерн-блотингом тотальных белковых экстрактов инфицированных протопластов, используя кроличью поликлональную сыворотку, специфичную для каждого белка(18). Стабильность мутаций, введенных в РНК 2,тестировали с помощью полимеразной цепной реакции после обратной транскрипции (RTPCR) тотальных экстрактов РНК из инфицированных растений. Обратные транскрипты получали с помощью набора для обратной транскрипции Expand reverse transcription kit(30 с), 50 (30 с), 72 (3 мин). Пары праймеров для ПЦР-амплификации различных участков кДНК РНК 2 соответствовали (или были комплементарны, в случае второго члена каждой пары праймеров) нуклеотидам 1143-1151 и 3393-3412 (ген Р 42), и нуклеотидам 3151-3169 и 4128-4148 (гены Р 13 и Р 15). Праймер, использованный для инициации синтеза кДНК до реакций ПЦР, был комплементарен нуклеотидам 4128-4148. Результаты Репликоны, экспрессирующие белки TGB вируса BNYVV При условии поддержания достаточного количества последовательностей на 3'- и 5'концах, транскрипт РНК 3 вируса BNYVV, из которого был делетирован центральный район,может эффективно реплицироваться в листьях С. quinoa при совместной инокуляции с РНК 1 и 2, и может экспрессировать чужеродный ген,встроенный вместо делетированной последовательности (12, 20). Изобретатели использовали такие "репликоны" на основе РНК 3 для экспрессии каждого из белков TGB вируса BNYVV вне их нормального окружения на РНК 2 и тестировали способность каждого репликона комплементировать мутантную РНК 2, дефектную по соответствующему гену TGB. Использованные в этом исследовании репликоны изображены на фиг. 1. Фиг. 1 представляет собой геномную карту РНК 2. Гены TGB оттенены, и линии над картой указывают протяженность субгеномных РНК 2suba и 2subb. Показаны положения делеций и вставок, индуцирующих сдвиг рамки в РНК 2. 5'-концевая"кэп"-структура РНК обозначена квадратиком. Р 21 является основным вирусным белком оболочки. RT = домен считывания (readthrough domain)(3). (В) - репликоны, полученные из РНК 3 вируса BNYVV, содержащие гены TGB вирусаBamHI в пустом репликоне (rер 0), использованный для вставки последовательностей TGB, амплифицированных с помощью ПЦР. Обозначены положения вставок, индуцирующих сдвиг рамки, в различных мутантных репликонах Р 13 и Р 15. В дополнение к конструкциям rер 42,rер 13 и rep15, каждая из которых содержит генTGB, была получена четвертая конструкция(rер 1315), содержащая оба гена Р 13 и Р 15, расположенных в той же относительной конфигурации, что и в РНК 2. Способность каждого репликона направлять экспрессию встроенного гена или генов тестировали с помощью трансляцииrep15 направлял синтез полноразмерного продукта (фиг. 2 А, дорожка 2; фиг. 2 В, дорожки 2 и 3), который не продуцировался в процессе трансляций, запрограммированных транскриптом, соответствующим пустому репликону, rер 0S35 метионином продукты трансляции пустого репликона rер 0 (дорожка 1) и rер 42 (дорожка 2),продемонстрированные с помощью авторадиографии после электрофореза в ПААГ (15) . Обозначенная полоса была идентифицирована как Р 42 путем сравнения ее подвижности с подвижностью маркеров молекулярных весов (не показаны). На фигуре 2 (В) представлены продукты трансляции, управляемой rер 0 (дорожка 1),rер 13 (дорожка 2), rep15 (дорожка 3) и rер 1315(дорожка 4), показанные с помощью авторадиографии после электрофореза в ПААГ (16). Полосы, предварительно идентифицированные как Р 13 и Р 15, показаны справа. Также была синтезирована фоновая полоса, обозначенная звездочкой, когда в экстракт для трансляции не вводили транскрипт. Относительные подвижности различных продуктов трансляции были такими,как и ожидалось, за исключением того, что предполагаемый Р 13 мигрировал несколько более медленно, чем Р 15, возможно, из-за его нетипичного аминокислотного состава. Дицистронная конструкция rер 1315 направляла синтез как Р 13, так и Р 15 (фиг. 2 В, дорожка 4) в относительных молярных количествах 3:1 (значения скорректированы по различию в содержании метионина в двух белках; если N-концевой метионин каждого белка удаляется после трансляции, молярное соотношение составляет 5:1). Способность репликонов амплифицироваться с помощью вирусной системы репликации in vivo тестировали при совместной иноку 13 ляции репликонных транскриптов в протопластах С. quinoa с РНК 1 и 2 вируса BNYVV. Анализ с помощью нозерн-блотинга общей РНК,экстрагированной из протопластов через 48 ч после инокуляции, выявил, что все репликоны,содержащие гены TGB, эффективно амплифицировались (фиг. 3 А). Фиг. 3(А) представляет определение с помощью нозерн-гибридизации вирусных РНК в протопластах С. quinoa, инокулированных РНК 1 и 2 вируса BNYVV только(дорожка 2) или с добавлением rер 0 (дорожка 3), rep 42 (дорожка 4), rер 13 (дорожка 5),rер 1315 (дорожка 6) и rер 15 (дорожка 7). РНК из мнимо инокулированных протопластов анализировали на дорожке 1. Протопласты собирали через 48 ч после инокуляции и определяли вирусные РНК, используя меченые 32 Р вирусные РНК-специфичные антисмысловые РНК-зонды. Репликоны показаны концами стрелок. Фиг. 3(В) представляет иммунологическое определение Р 42 в тотальных белковых экстрактах протопластов С. quinoa, инокулированных РНК 1 и 2 вируса BNYVV (дорожка 2), транскриптом РНК 1 дикого типа плюс транскриптом РНК 2 мутантного рВ 1-14-Н, который содержит мутацию со сдвигом рамки в гене Р 42 (11) (дорожка 3), РНК 1 и транскриптами рВ 2-14-Н плюс rер 42(дорожка 4). Белок, экстрагированный из мнимо инокулированных протопластов, анализировали на дорожке 1. После электрофореза в ПААГ (15) и электропереноса на нитроцеллюлозу иммунологически определяли Р 42, основной вирусный белок оболочки (СР), и Р 14 смесью антисывороток, специфичных для каждого белка (18). Положения стандартов молекулярных весов помечены в килодальтонах слева от блота. Анализ вестерн-блотингом выявил, что уровень Р 42 в протопластах, инфицированных смесью rер 42 плюс транскрипты РНК 1 и мутанты со сдвигом рамки рВ 2-14-Н, вызванным вставкой сайтаSpeI в ген Р 42 РНК 2 (см. фиг. 1), был примерно в два раза больше, чем в протопластах, инфицированных РНК 1 плюс РНК 2 дикого типа (фиг. 3 В, дорожки 2 и 3). Отмечено, что уровни накопления двух других иммунологически определяемых продуктов гена РНК 2 (основного вирусного белка оболочки и Р 14; фиг. 1) не изменялись в присутствии rep42. P13 и Р 15 в таких экспериментах не могли быть определены иммунологически. Белки TGB вируса BNYVV могут быть комплементированы in trans Способность репликонов, содержащих гены TGB, поддерживать функции движения в целых растениях тестировали путем совместной инокуляции листьев хозяина С. guinea, содержащих местные повреждения, одним из транскриптов РНК 2, содержащих мутацию, исключающую функционирование гена TGB, плюс репликоном, содержащим соответствующий ген дикого типа. Во всех экспериментах инокулят также содержал транскрипт РНК 1 дикого типа в 14 качестве источника РНК-зависимой РНКрепликазы, хотя этот факт ниже не всегда будет подробно упомянут. Для гена Р 42 протестированные мутанты РНК 2 включали мутант со сдвигом рамки (рВ 2-14-Н), вызванным вставкой сайта Spel по нуклеотиду 2280, набор мутантов,содержащих короткие делеции в рамке в различных положениях в ОРС Р 42 (мутанты рВ 214-312, -SN, -В 1, -В 2, -N и -НР 1; фиг. 1 А; также см. ссылку 11), и делеционный мутант (рВ 2-14-F; фиг. 1), где удаление 935 нуклеотидов последовательности в 3'-5' направлении от ОРС Р 42 инактивировало промотор для субгеномной РНК (PHK2suba), ответственный за синтез Р 42. Инокуляты, содержащие транскрипт РНК 1 плюс любой из указанных транскриптов мутантной РНК 2, не продуцировали местные повреждения на С. guinea, и никакого потомства вирусной РНК не определялось в инокулированных листьях через 10 дней после инокуляции(фиг. 4, дорожки 3 и 5; см. ссылку 11 для других мутантов). На фиг. 4 репликон, показанный над каждой дорожкой, инокулировали в листья С.guinea совместно с транскриптом РНК 1 дикого типа плюс либо транскриптом РНК 2 дикого типа (дорожка 2), либо транскриптом мутантной РНК 2, идентифицированными над каждой дорожкой. На дорожках 19 и 20 инокулят содержал rер 42 и rер 15 (дорожка 19) или rер 42 иrер 1315 (дорожка 20), в дополнение к транскриптам РНК 1 и рВ 2-14-НР 1. Дорожка 1 содержит РНК из неинокулированного контрольного растения. Инокулированные листья собирали через 10 дней после инокуляции и тестировали на содержание вирусной РНК нозернгибридизацией, как описано на фиг. 3. Положения репликонов показаны стрелками. Когда транскрипт rер 42 включили в инокулят, на инокулированных листьях появились многочисленные местные повреждения (20-80 на лист), за исключением инокулята, содержащего транскрипт делеционного мутанта рВ 2-14-НР 1 РНК 2,который оставался бессимптомным. Полученные бледно-зеленые повреждения по внешнему виду были похожи на те, которые вызывались инокуляцией РНК 1 плюс РНК 2 дикого типа, за исключением мутанта pB1-14-F РНК 2, где сформировались некротические местные повреждения. В этом последнем случае фенотип некротического повреждения может иметь отношение к продукции укороченной формы белка считывания (RT) мутантом РНК 2 (7). Нозерн-гибридизация инокулированных листьев через 10 дней после инокуляции выявила присутствие потомственной вирусной РНК с длиной, расчитанной для РНК 1, 2 и rер 42 для всех мутантов РНК 2 (фиг. 4, дорожки 2, 4, 7-11),за исключением делеционного мутанта рВ 2-14 НР 1 (фиг. 4, дорожка 13) . Как будет показано ниже, отсутствие комплементации рВ 2-14-ДНР 1 с помощью rер 42 существует вследствие делеции промотора для субгеномной РНК(PHK2subb), который, как полагают, направляет трансляцию нижележащих белков TGB. Сходные эксперименты по комплементации проводили с rep13, rep15 и дицистронной конструкцией rер 1315. Как rер 13, так и rер 1315 обладали способностью комплементировать накопление на листьях (фиг. 4, дорожки 14 и 15) мутанта рВ 2-14-I, в котором ген Р 13 был выведен из строя путем вставки четырех нуклеотидов (вставка создавала сайт XhoI), хотя полученные местные повреждения были некротическими. Некротические местные повреждения получали также во время смешанных инфекций с указанными выше репликонами и РНК 1 и 2 дикого типа (см. ниже), что указывает на то, что симптоматический фенотип, относящийся к репликону, является доминантным по отношению к дикому типу. Новые симптомы могут иметь отношение к различиям в скорости синтеза или в уровне накопления Р 13, когда он экспрессируется скорее из репликона, чем из полноразмерной РНК 2. В экспериментах, которые описаны выше,важно продемонстрировать, что мутация, впервые введенная в ген Р 42 или Р 13 на транскрипте РНК 2, все еще представлена в потомственной РНК 2, что означает, что дефектная копия генаTGB на транскрипте не превращалась в дикий тип путем рекомбинации РНК in planta (21) при помощи копии, представленной на репликоне. Поэтому эксперимент RT-PCR проводили на потомственной вирусной РНК из растения, инфицированного РНК 1, транскриптом рВ 2-14-Нrер 42. Пара праймеров, использованная в RTPCR, гибридизовалась с последовательностями РНК 2, фланкирующими ген Р 42 и, следовательно, амплифицировала копию гена, представленного в РНК 2, но не копию на репликоне, где фланкирующие последовательности отсутствуют. Анализ с помощью ферментов рестрикции выявил, что сайт SpeI отсутствовал в полученном амплифицированном фрагменте ДНК, что ожидалось скорее для мутантной, чем для дикой формы гена TGB. Сходный анализ потомственной вирусной РНК из растений, инфицированных РНК 1, рВ 2-14-I (мутация со сдвигом рамки в гене Р 13, создающая сайт XhoI) и либо rер 13,либо rер 1315, сходным образом продемонстрировал, что мутация, отменяющая функцию копии гена Р 13 на транскрипте РНК 2, сохранялась в потомственной РНК 2. Авторы делают вывод,что rер 42 и rер 13, в действительности, комплементируют функцию Р 42 и Р 13 скорее путем обеспечения продукта гена in trans, чем просто выступая в качестве источника последовательности TGB дикого типа для рекомбинации. Неожиданно было обнаружено, что репликон, экспрессирующий ген Р 15 дикого типа(rер 15), был не способен комплементировать дефектный по Р 15 мутант РНК 2 pB2-14-J при смешанных инокуляциях. На инокулированных 16 листьях через 10 дней после инокуляции местные повреждения не формировались, и в листьях не смогли обнаружить вирусную РНК с помощью нозерн-блотинга (фиг. 4, дорожка 17). С другой стороны, когда транскрипт pB2-14-J совместно инокулировали с rер 1315, появлялись местные повреждения (некротического типа) и легко определялась потомственная вирусная РНК (фиг. 4, дорожка 18). В этом последнем случае анализ продукта RT-PCR, содержащего ген Р 15 в потомственной РНК 2, выявил, что мутация, отменяющая функцию гена, все еще присутствовала. Комплементация pB2-14-J все еще наблюдалась, когда ОРС Р 13 в дицистронном репликоне была нарушена с помощью мутации со сдвигом рамки (rер 1315-I; фиг. 1), что доказывает, что экспрессия полноразмерного Р 13 с первой ОРС дицистронного репликона не требуется для комплементации с помощью нижележащей копии гена Р 15. Доказательство того, что Р 15 экспрессируется с дицистронной субгеномной РНК Субгеномную РНК, полученную из РНК 2(PHK2subb), длиной примерно 1500 нуклеотидов, определяли в ткани, инфицированной вирусом BNYVV (2). 5'-конец этих РНК не был точно картирован, но предполагалось, что он находится недалеко от 5'-конца ОРС Р 13. Не было обнаружено субгеномной РНК с 5'-концом в 3'5' направлении от ОРС Р 15, что увеличивает вероятность того, что, как и в вирусе BSMV (8),Р 13 и Р 15 оба экспрессируются из PHK2subb. Упомянутая выше неспособность rер 42 комплементировать дефектный по Р 42 мутант РНК 2 рВ 2-14-НР 1 может происходить из противоположных эффектов делеции РНК 2 на синтез нижележащих белков TGB, если делеция отменяла функционирование промотора РНК 2subb (правая граница делеции в рВ 2-14 НР 1 находится всего в 30 остатках в 5'-3' направлении от инициирующего кодона Р 13). Для проверки этой гипотезы был проведен эксперимент, в котором транскрипт рВ 2-14-НР 1 был комплементарен как rер 42, так и rер 1315. На листьях, инокулированных этой смесью, развивались местные повреждения и содержались потомственные вирусные РНК (фиг. 4, дорожка 20). Если, с одной стороны, rер 13, но не rер 1315,использовали совместно с rер 42 для комплементации рВ 2-24-НР 1, симптомы не появлялись и потомственные вирусные РНК не определялись нозерн-блотингом (фиг. 4, дорожка 19). Эти наблюдения совпадают с гипотезой, что делеция рВ 2-14- НР 1 препятствует экспрессии нижележащих ОРС TGB, возможно, путем блокирования транскрипции PHK2subb. Далее, тот факт,что комплементация была успешной с rер 1315,но не с rер 13, показывает, что Р 15, как и Р 13,транслируется с PHK2subb. 17 Независимая экспрессия Р 15 ингибирует инфекцию вирусной РНК дикого типа Способность rер 1315, но не rер 15, комплементировать дефектный по Р 15 мутант РНК 2pB2-14-J при инфицировании листьев может означать, что независимая экспрессия Р 15 из моноцистронного репликона препятствует циклу вирусной инфекции путем продукции генного продукта в избыточных по отношению к Р 13 количествах. Для проверки этой гипотезы провели эксперимент, в котором rер 15 инокулировали в листья С. quinoa вместе с вирусными РНК 1 и 2 дикого типа. На инокулированных листьях повреждения не появлялись, даже на поздних стадиях после инфицирования (фиг. 5 А), и никакой вирусной РНК не определялось с помощью нозерн-блотинга (фиг. 5 В, дорожка 6). Фиг. 5 (А) представляет листья С. quinoa, инокулированные РНК 1 и 2 (слева) или РНК 1 и 2 плюс rер 15 (справа). Листья фотографировали через 20 дней после инокуляции, когда местные повреждения на листе слева рапространялись таким образом, что покрывали большую часть поверхности листа. На фиг. 5 (В) представлен анализ с помощью нозерн-блот-гибридизации(как описано на фиг. 3) содержания вирусной РНК в листьях С. quinoa, инокулированных только РНК 1 и 2 вируса BNYVV (дорожка 1) или совместно с rер 0 (дорожка 2), rер 42 (дорожка 3), rер 13 (дорожка 4), rер 1315 (дорожка 5),rер 15 (дорожка 6), rep15-J (дорожка 7), rер 15-Х(дорожка 8) или repPCV-P17 (дорожка 9) . Положения репликонов показаны стрелками. (С) Анализ с помощью нозерн-гибридизации содержания вирусной РНК в инокулированных листьях (дорожки 1, 3 и 5) и корнях (дорожки 2,4 и 6) растения Beta macrocarpa, либо мнимо инокулированных (дорожки 1 и 2), либо инокулированных РНК 1, 2 и 3 вируса BNYVV (дорожки 3 и 4), либо РНК 1, 2 и 3 плюс rер 15 (дорожки 5 и 6). РНК 3 включили в инокулят, так как она необходима для системного движения в В. mасrосаrра (22). При этих условиях листья,инокулированные только РНК 1 и 2, были сильно инфицированы (фиг. 5 А; фиг. 5 В, дорожка 2). Ингибирование вирусной инфекции с помощьюrер 15 было дозозависимым. Добавление к смеси инокулята в десять раз меньшего количестваrep15 все еще приводило к почти полному ингибированию формирования повреждений, но меньшие количества репликона были прогрессивно менее эффективны при блокировании инфекции. Rep15 также блокировал появление потомственной вирусной РНК в инокулированных листьях и корнях Beta macrocarpa, системном хозяине вируса BNYVV (Фиг. 5 С, дорожки 5 и 6). С другой стороны, пустой репликон rер 0 и репликоны, экспрессирующие два других белка TGB (rер 42, rер 13, rер 1315), незначительно ингибировали инфицирование листьев С. quinoa вирусом BNYVV (фиг. 5 В, дорожки 2-5). 18 Поскольку rep15 не препятствовал амплификации РНК 1 и 2 в протопластах С. quinoa(см. фиг. 3), это предполагает, что репликон препятствует движению вируса из начального места инфицирования в соседние клетки (движение от клетки к клетке) во время формирования местных повреждений на листьях. Формирование повреждений не ингибировалось совместной инокуляцией РНК Stras 12 с репликонами rep15-J или rер 15-Х (Фиг. 5 В, дорожки 7 и 8), которые кодируют укороченные формы Р 15 со сдвигом рамки. Эта находка подтверждает,что скорее экспрессия Р 15 из репликона, чем простое присутствие соответствующей последовательности РНК, необходима для ингибирования во время экспериментов со смешанной инфекцией. В присутствии rер 15-Х, однако, полученные местные повреждения имели размер около одной трети диаметра повреждений,сформированных в результате инфекции толькоStras 12 или Stras 12 плюс rep15-J, и содержание потомственной вирусной РНК в инфицированных листьях было значительно ниже (фиг. 5 В,дорожка 8). Этот факт предполагает, что почти полноразмерная молекула Р 15, продуцируемаяrер 15-Х, несмотря на то, что она не способна заменить Р 15 дикого типа в эксперименте по комплементации, может препятствовать движению Р 15 дикого типа, получаемого из РНК 2, от клетки к клетке. Предположительно, полноразмерная и укороченная формы Р 15 конкурируют друг с другом за сайты связывания на другом компоненте (который может иметь либо вирусное, либо клеточное происхождение), вовлеченном в процесс движения. Как указано выше, сравнения последовательностей различных вирусов, обладающихTGB, выявили небольшое сходство последовательностей между различными генами TGB3. Например, белок TGB3 размером 17 кДа (Р 17) фуровируса кустистости арахиса (PCV) не имеет значительного сходства последовательности с Р 15 вируса BNYVV (4), даже несмотря на то,что оба вируса могут инфицировать С. quinoa. Чтобы определить, может ли независимая экспрессия белка TGB3 вируса PCV препятствовать инфицированию вирусом BNYVV путем,аналогичным тому, который наблюдается сrер 15, был сконструирован репликон, полученный из РНК 4 вируса BNYVV, содержащийBNYVV не определялись с помощью нозернблотинга (фиг. 5 А, дорожка 9). Это наблюдение предполагает, что пути, с помощью которых вирусы BNYVV и PCV перемещаются от клетки к клетке в С. quinoa, имеют, по меньшей мере,один общий элемент, который, несмотря на их различие в последовательности, взаимодействует с продуктами TGB3 обоих вирусов. 19 Изобретатели показали, что репликоны,несущие Р 42 и Р 13, могут комплементировать РНК 2 вируса BNYVV, несущую соответствующий дефектный ген, а репликон, несущий Р 15,нет. Однако в последнем случае комплементация может иметь место в том случае, если ген Р 15 выступает в качестве второго гена на дицистронной РНК (rер 1315), несущей ген Р 13 в первом положении. Следует отметить, что относительное расположение генов Р 13 и Р 15 наrер 1315 идентично их расположению наPHK2subb, субгеномной РНК, которая, как полагают, направляет синтез обоих белков в инфекциях дикого типа. Предполагают, что успешное движение BNYVV от клетки к клетке требует присутствия Р 13 и Р 15 в соответствующих относительных количествах и что продукция обоих белков из одной и той же субгеномной РНК представляет механизм для координации их синтеза. Неспособность rер 15 комплементировать Р 15 мутантного транскрипта pB2-14-JPHK2 и его способность ингибировать инфицирование вирусом дикого типа, могла бы иметь место вследствие сверхпродукции Р 15 относительно Р 13, когда первый из названных белков транслируется из репликона, а последний - из РНК 2. С другой стороны, когда Р 15 экспрессируется из дицистронного репликона rер 1315,могут быть получены соответствующие относительные количества P13-P15, делающие возможным движение от клетки к клетке. "Правильные" относительные уровни накопления Р 13 и Р 15 при инфекции вирусом дикого типа неизвестны. Трансляция rер 1315 в экстракте зародышей пшеницы давала превышение количества Р 13 относительно количества Р 15 от трех до пяти раз, но такие эксперименты не обязательно отражают ситуацию in planta, так как скорости метаболизма двух белков могут значительно различаться. Эти результаты показывают, что TGB-опосредованное движение от клетки к клетке является менее чувствительным к сверхэкспрессии Р 42 и Р 13 относительно "правильных" уровней, характерных для нормальной инфекции, поскольку совместная инокуляцияrep42, rep13 или rер 1315 с вирусом дикого типа не ингибировала инфекцию (фиг. 5, дорожки 35), хотя повреждения, формирующиеся в присутствии rер 13 и rер 1315, были некротическими. Данные эксперименты, таким образом, показывают, что экспрессия Р 15 в трансгенных растениях могла бы обеспечить механизм придания этим растениям устойчивости к вирусу BNYVV("патоген-опосредованной устойчивости"; ссылка 23) при условии, что могут достигаться достаточные уровни экспрессии Р 15. Для лучшего понимания того, как относительные уровни Р 13 и Р 15 регулируются в процессе трансляции, необходимо знать, как цистрон Р 15 становится доступным для рибосом наPHK2subb. Инициация трансляции на внутреннем цистроне эукариотической матричной РНК 20 может происходить несколькими путями, включая (i) "leaky" сканирование, когда фракция рибосомальных субъединиц, которые начинают сканирование РНК на 5'-конце, проскакивает через первый (неоптимальный) вышележащийAUG без инициации (24), и (ii) внутренняя инициация, когда рибосомные субъединицы связываются непосредственно со специфической последовательностью на РНК вблизи внутреннего инициирующего кодона (25). Маловероятно, что третий возможный механизм терминацииреинициации (24) может наблюдаться в любом из TGB-содержащих вирусов, поскольку частичное перекрывание между цистронами TGB2 и TGB3 потребует от рибосом обратного сканирования после терминации TGB2 для достижения инициирующего кодона TGB3. Предложили, что белки TGB3 вирусов BSMV и PVX транслируются с помощью механизма "leaky" сканирования (8, 9). Ген Р 15 вируса BNYVV может быть также получен "leaky" сканированием, хотя следует отметить, что контекст инициирующего кодона Р 13 вируса BNYVV(AUAAUGU) является почти оптимальным, и существуют также два нижележащих кодонаAUG, которые сканирующие субъединицы должны пропустить для достижения инициирующего кодона Р 15. Примеры Следующие примеры представляют трансформацию растений, проведенную способом,описанным в международной заявке WO 95/10178, которая включена здесь путем ссылки. Растительный материал и условия выращивания были такими, как описано у Hall с соавт. (Plant Cell Reports 12, pp.339-342, 1993),Pedersen с соавт. (Plant Science 95, pp.89-97,1993), и Hall с соавт. (Nature biotechnology 14,1996, в печати). Плазмидные вектора и получение ДНК Плазмиду рЕТ-Р 15, несущую нуклеотидную последовательность Р 15, обрабатывали рестриктазой по ее единственному сайту дляBamHI и "затупляли" с помощью ДНКполимеразы фага Т 4. После очистки путем электрофореза в 0,8% агарозном геле линеаризованную плазмиду обрабатывали рестриктазой по ее единственному сайту для NcoI. Фрагмент гена Р 15 размером 400 п.о. очищали электрофорезом и встраивали в pMJBX-Ub, несущую полиубиквитиновый промотор из Arabidopsis (Morris etTMV и 3'-терминатор Nos, и обрабатывали рестриктазами NcoI и SmaI. В полученной таким образом плазмиде pMJBX-Ub-P15 нуклеотидная последовательность гена Р 15 поставлена под контроль полиубиквитинового промотора изArabidopsis, за которым следует энхансерная последовательность вируса TMV.Agrevo, Берлин, Германия). В этом EcoRIфрагменте нуклеотидная последовательность гена pat находится под контролем 5' и 3' сигналов экспрессии вируса мозаики цветной капусты. Плазмида pMJBS6, полученная в результате комбинации этого EcoRI-pat-фрагмента и частичного гидролиза плазмиды pMJBX-Ub-P15 рестриктазой EcoRI, содержит и ген pat, и ген Р 15. Эта плазмида pMJBS6 представляет собой высококопийную плазмиду на основе вектораpUC18 и содержит также ген -лактамазы(ampr). В плазмиде pIGPD7, несущей тот же фрагмент гена pat, что и pB235Ack, ген лактамазы был заменен на ген igpd (имидазолглицеролфосфатдегидратазы) из SaccharomycesAcademy of Science USA 73, pp.1471-1475,1976). Селекцию и поддержание плазмиды в клетках Escherichia coli осуществляли путем комплементации ауксотрофного по hisB штаммаSB3930 на минимальной среде в отсутствие антибиотиков. Фрагмент гена Р 15 с его убиквитиновым промотором и терминаторной последовательностью очищали в виде фрагмента размером 2500 п.о., полученного из плазмидыpMJBX-Ub-P15 после ее гидролиза по единственному сайту для рестриктазы HindIII, с последующим частичным гидролизом рестриктазойEcoRI. Этот фрагмент "затупляли" и встраивали в плазмиду pIGPD7 с тупыми концами, разрезанную по единственному сайту NcoI. Полученная плазмида pIGPDS4 содержит как ген pat, так и ген Р 15 в составе вектора без гена лактамазы. Растительный материал Растущие 1 л in vitro культуры получали из проростков сахарной свеклы для обеспечения постоянного и однородного источника стерильного исходного материала и поддерживали с 4 недельным периодом субкультивирования, как описано у Hall с соавт. (Plant Cell Reports 12, pp. 339-342, 1993). Препаративное выделение эпидермиса сахарной свеклы Использовали модифицированную версию способа смешивания по Kruse с соавт. (PlantPhysiology 690, pp. 1382-1386, 1989). Для каждого выделения перемешивали 2 г листьев (с удаленными главными жилками) от 4-недельных проростков в смесителе Waring при максимальной скорости (23000 об/мин) в течение 60 с в металлическом лабораторном стакане на 250 мл,содержащем 50 мл холодной (4 С) среды Ficoll(100 г/л Ficoll, 735 мг/л СаСl22 Н 2O, 1 г/л PVP40,автоклавированной). Фрагменты эпидермиса затем собирали на 297 мкм нейлоновом фильтре и промывали 500 мл стерильной водопроводной воды. Их отмывали с фильтра в чашку Петри диаметром 9 см, используя 10 мл CPW9M, со 004328(Krens et al., Theoretical and Applied Genetics 79,pp. 390-396, 1990). Оставшиеся фрагменты листьев удаляли, и чашки предварительно инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Выделение протопластов замыкающих клеток(из устьиц) из обогащенных эпидермисом фракций Для получения фракции эпидермиса суспензию центрифугировали в течение 1 мин при 55 х g, после чего удаляли супернатант. Осадок ресуспендировали в 50 мл ферментной смеси и аликвоты объемом 5 мл переносили на каждую из 10 чашек Петри диаметром 6 см (Greiner, качество ТС), закрывали парафильмом и инкубировали в течение ночи при 25 С в темноте, осторожно перемешивая. Среда для гидролиза субстрата содержала CPW9M, с добавлением 0,5% (масса/объем) целлюлазы RS и 3% (масса/объем) мацерозима R10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan), pH 5.8. На следующее утро протопласты, в основном, плавали около поверхности гидролизной смеси. После осторожного перемешивания суспензий стерильной пипеткой для высвобождения протопластов, все еще прилипающих к фрагментам кутикулы, гидролизаты объединяли и пропускали через нейлоновые фильтры 297 и 55 мкм. Фильтрат смешивали с равным объемом изоосмотического Percoll, содержащего 15% (масса/объем) сахарозы(Percoll15S), и разделяли на 12 х 12 мл центрифужных пробирок. В каждой пробирке первый 1 мл CPW15S (Krens et al., 1990) и затем 0,5 мл 9% (масса/объем) маннитола, содержащего 1 мМ СаСl2 (9 М), осторожно наслаивали на суспензию протопластов. После центрифугирования при 55 х g в течение 10 мин живые замыкающие клетки были видны в слоях на поверхности раздела CPW15S/9M. Для концентрирования протопластов эти слои собирали и смешивали с Percoll15S для получения конечного объема 16 мл. Затем он был распределен в 2 пробирки для центрифугирования, нанесен слоями, как указано выше, и снова центрифугирован. Осторожное удаление слоев 9 М давало выход обогащенной фракции протопластов замыкающих клеток для последующего подсчета с использованием гемоцитометра. Трансформация протопластов Трансформации осуществляли в центрифужных пробирках объемом 12 мл, каждая из которых содержала 1x106 протопластов, суспендированных в 0,75 мл среды 9 М. Сначала добавляли плазмидную ДНК (50 мкг pMJBX-UbP15 и pIGPDS4) и сразу после перемешивания по каплям добавляли 0,75 мл среды с ПЭГ (40% ПЭГ 6000, растворенный в среде F (Krens et al.,Nature 296, pp. 72-74, 1982). После тщательного перемешивания суспензию выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин с периодическим перемешиванием. Затем с интер 23 валом 5 мин добавляли 4x2 мл среды F. После центрифугирования в течение 5 мин при 55 х g супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в среде 9 М, и снова центрифугировали. Наконец, клетки ресуспендировали в 1 мл среды 9 М для подсчета. Культура протопластов и селекция Протопласты помещали в альгинат Са и культивировали в модифицированной жидкой среде К 8 Р (Hall et al., 1990). Через 7 дней для селекции стабильно трансформированных клеток добавляли активное соединение (гербицид) биалафос (Meiji Seika Ltd, Japan) до получения конечной концентрации 200 мкг/л. На 18-й день альгинатные диски разрезали на кусочки размером 3 мм и переносили на среду PGo (De Greefand Jacobs, Plant Science Letters 17, pp. 55-61,1979), с добавлением 1 мкМ BAP (PG1B) и 250 мкг/л биалафоса, и придавали твердую форму с помощью 0,8% агарозы. Каллусная культура и регенерация Через 21 день кусочки альгината, содержащие невидимые микрокаллусы, переносили на чашки Петри диаметром 9 см, содержащие 20 мл среды К (3% сахарозы, 0,8% агарозы, 1 мкМ ВАР, среда РGо, рН 5,8, автоклавированная). Культивирование проводили в темноте, как описано выше. Рыхлые, водянистые каллусы, достигшие размера примерно 1-2 мм в диаметре, переносили по отдельности на свежую среду К и культивировали группами по 20 каллусов. На этой стадии ПЦР-анализ подтвердил присутствие трансформантов. С интервалом в две недели все каллусы были перенесены на свежую среду. Регенеранты появлялись в течение первых 8 недель культивирования отдельных каллусов. Когда первые растущие культуры становились заметными и достигали размера примерно 2 мм,чашку переносили на свет (3000 люкс), 25 С, с продолжительностью дня 15 ч. Проростки длиной около 4 мм переносили в отдельные культуральные пробирки, содержащие 15 мл cреды К, и затем пересевали на свету, как описано выше. Укоренение и перенос в почву Когда проростки достигали стадии четырех листьев (обычно через 5-6 недель с одним пересевом через 3 недели), их переносили в культуральные пробирки, содержащие 15 мл среды L (3% сахарозы, 0,8% агарозы, 25 мкМ индолмасляной кислоты (ИМК), среда PGo, pH 5,8, автоклавированная), (среда PGo описана уDe Greef W. с соавт., Plants Science Letters 17,pp. 55-61 (1979 и далее культивировали, как описано выше. Когда, по меньшей мере, один корень достигал длины 1 см, проростки удаляли из культуральных пробирок и промывали проточной водопроводной водой для удаления всех фрагмен 004328 24 тов агара, и переносили в почву в теплице в горшки диаметром 9 см. Проростки покрывали прозрачной пластиковой чашкой для обеспечения влажной окружающей среды в течение 7 дней, после чего они могли расти без защиты. Растение, трансформированное последовательностью SEQ ID NO.1 в соответствии с изобретением, выжило и экспрессировало Р 15. Анализ ДНК Геномную ДНК, выделенную из первичных трансформантов, подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле после обработки рестриктазами и переносят на нитроцеллюлозную мембрану, используя стандартные методики в соответствии с рекомендациями производителя. Гибридизацию проводят с ДНК, в виде 32 РdАТР-меченых зондов, чье присутствие желательно устанавливать. Мембраны промывали до конечной чистоты 0,1% х SSC, 0,1% SDS при 60 С. Гибридизованную ДНК визуализировали в темноте при помощи рентгеновской пленки от 24 до 48 ч. Анализ с помощью ПЦР Использовали стандартные методы ПЦР для определения ряда интактных плазмидных последовательностей. Реакции проводили, используя 25 циклов денатурации в течение 1 мин при 94 С, отжига в течение 1 мин; удлинения в течение 2 мин при 72 С с конечным периодом удлинения 5 мин. Температуры отжига оптимизировали для каждой комбинации праймеров. Присутствие кодирующего района гена Р 15 вируса BNYVV в геноме сахарной свеклы подтверждали с помощью ПЦР, используя пару олигонуклеотидов в качестве праймеров:ACTATAGAC-3' (комплементарный нуклеотидам с 369 по 395 на SEQ ID NO1) ]. Этот фрагмент длиной 393 п.о. содержит полный кодирующий район гена Р 15 вируса BNYVV (см. фиг. 7). Фиг. 7: Анализ продуктов ПЦР, полученных с ДНК из Р 15-трансформантов сахарной свеклы (дорожки 5-7) и нетрансформированного растения (дорожка 4). В качестве маркера размера (дорожка 1) использовали лестницу из фрагментов ДНК с низкой массой Low DNA(pMJBS6/pIGPDS4). Стрелка слева показывает положение ожидаемого продукта ПЦР. Анализ с помощью блот-гибридизации по Саузерну Интеграцию гена Р 15 вируса BNYVV в геном сахарной свеклы анализировали с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Выделяли общую ДНК из первичных трансгенных регенерантов, переваривали рестриктазами (PstI, KpnI, 25MOV1-MOV2 (см. фиг. 8). Фиг. 8. Анализ с помощью блотинга по Саузерну. Лямбда ДНК, гидролизованную рестриктазой HindIII, использовали в качестве маркера размера (дорожка 1). Дорожки с 2 по 16,ДНК трансгенных растений: с 2 по 4 - гидролизованная рестриктазой SacI, с 6 по 8 - гидролизованная рестриктазой PstI, с 10 по 12 - гидролизованная рестриктазой NcoI, с 14 по 16 - гидролизованная рестриктазой KpnI. Дорожки 5, 9,13 и 17 соответствуют нетрансформированному растению. Источники информации 1. Richards K.E.Tamada T., Annu. Rev.Microorganisms, Monterey, pp. 129-139 (1994). 43. Norris et al. , Plant Molecular Biology 21,pp. 895-906 (1993). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ придания растительной клетке или растению устойчивости к вирусу, содержащему последовательность 3 из тройного блока генов (TGB3), с условием, что это не вирус X картофеля, состоящий из следующих этапов: 27 получения конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность TGB3 указанного вируса или соответствующую ей кДНК или их варианты, основанные на вырожденности генетического кода, связанные с одной или более регуляторными последовательностями, активными в растении,трансформации растительной клетки, полученной конструкцией нуклеиновой кислоты и,при необходимости,регенерации трансгенного растения из трансформированной растительной клетки. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что вирус выбирают из группы, состоящей из вируса ямчатости ствола яблони, вируса ожога черники, вируса М картофеля, вируса мозаики белого клевера, вируса мозаики орхидеи Cymbidium, вируса полосатой мозаики ячменя, вируса курчавости верхушки картофеля, вируса кустистости арахиса и вируса свеклы, передающегося через почву. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем,что растительной клеткой является устьичная клетка. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что растение выбирают из группы,состоящей из яблони, черники, картофеля, клевера, орхидеи, ячменя или арахиса. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный вирус представляет собой вирус некротических желтых жилок свеклы (BNYVV) с последовательностью TGB3 SEQ ID NO. 1, приведенной на фиг. 6, которая заключена между нуклеотидами 3627 и 4025 5'-цепи геномной или субгеномной РНК 2 вируса BNYVV, а растение является свеклой, предпочтительно сахарной свеклой (Beta vulgaris). 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что регуляторная последовательность представляет собой промоторную последовательность или терминаторную последовательность, активную в растении. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что промоторная последовательность является конститутивной или чужеродной растительной промоторной последовательностью. 8. Способ по п.6, отличающийся тем, что промоторную последовательность выбирают из группы, состоящей из промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и полиубиквитинового промотора Arabidopsis thaliana. 9. Способ по любому из пп.6-8, отличающийся тем, что промоторной последовательностью является промотор, который активен, в основном, в корневых тканях, например, промотор рar гена гемоглобина из Perosponia andersonii. 10. Трансгенное растение, устойчивое к вирусу, полученное способом, охарактеризованным в п.1. 11. Трансгенное растение по п.10, отличающееся тем, что вирус выбирают из группы, 004328 28 состоящей из вируса ямчатости ствола яблони,вируса ожога черники, вируса М картофеля,вируса мозаики белого клевера, вируса мозаики орхидеи Cymbidium, вируса X картофеля, вируса полосатой мозаики ячменя, вируса курчавости верхушки картофеля, вируса кустистости арахиса и вируса свеклы, передающегося через почву. 12. Трансгенное растение по пп.10 и 11,являющееся растением, выбранным из группы,состоящей из яблони, черники, картофеля, клевера, орхидеи, ячменя или арахиса. 13. Трансгенное растение по п.10, отличающееся тем, что оно является свеклой, предпочтительно сахарной свеклой (Beta vulgaris), а вирус представляет собой вирус BNYVV с последовательностью TGB3 SEQ ID NO. 1, приведенной на фиг. 6, которая заключена между нуклеотидами 3627 и 4025 5'-цепи геномной или субгеномной РНК 2 вируса BNYVV. 14. Трансгенное растение по любому из пп.10-13, отличающееся тем, что регуляторная последовательность представляет собой промоторную последовательность или терминаторную последовательность, активную в растении. 15. Трансгенное растение по любому из пп.10-14, отличающееся тем, что промоторная последовательность является конститутивной или чужеродной растительной промоторной последовательностью. 16. Трансгенное растение по п.15, отличающееся тем, что промоторную последовательность выбирают из группы, состоящей из промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и полиубиквитинового промотора Arabidopsisthaliana. 17. Трансгенное растение по п.15 или 16,отличающееся тем, что промоторной последовательностью является промотор, который активен, в основном, в корневых тканях, например промотор par гена гемоглобина из Perosponia